WO2012175164A1 - Stabile, wässrige protein-lösung oder protein-dispersion, verfahren zur herstellung der stabilen, wässrigen lösung oder dispersion und verfahren zur herstellung von form- oder flächengebilden, imprägnierungen oder beschichtungen aus der stabilen, wässrigen protein-lösung oder protein-dispersion sowie deren verwendung - Google Patents

Stabile, wässrige protein-lösung oder protein-dispersion, verfahren zur herstellung der stabilen, wässrigen lösung oder dispersion und verfahren zur herstellung von form- oder flächengebilden, imprägnierungen oder beschichtungen aus der stabilen, wässrigen protein-lösung oder protein-dispersion sowie deren verwendung Download PDF

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    • D01D5/00—Formation of filaments, threads, or the like
    • D01D5/18—Formation of filaments, threads, or the like by means of rotating spinnerets

Definitions

  • Stable, aqueous protein solution or protein dispersion process for the preparation of the stable, aqueous solution or dispersion and
  • Protein solution or protein dispersion and their use
  • the present invention relates to a stable, aqueous solution or a stable, aqueous dispersion with at least one self-assembling protein. Furthermore, the invention relates to a process for the preparation of the stable, aqueous protein solution or protein dispersion, a process for the electrical or rotor spinning of self-assembling protein under
  • shaped or flat structures are here in particular fibers
  • CONFIRMATION COPY Under a fiber structure is here in particular an orderly or disorderly single or multi-layered assembly of a plurality of fibers understood or three-dimensional arrangements of the fibers or a combination with carriers.
  • Preferred fiber structures are nonwovens here.
  • the self-assembling proteins are composed of polypeptides. These are made up of amino acids, especially from the 20 of course
  • the amino acids can be modified, for example acetylated.
  • the self-assembling proteins are in particular intrinsically unfolded proteins or microbead-forming proteins.
  • Exemplary proteins are silk-like proteins, silk proteins or spider silk proteins.
  • the proteins may be of natural origin or synthetic, for example by recombinant production.
  • the self-assembling proteins have the property that they are unstable in concentrated, aqueous solutions or dispersions. Due to the hydrophobic parts, the protein precipitates or the solution gels. As a result, the proteins can not normally be processed without further additives, such as, for example, polymers or spinning auxiliaries, from aqueous solution or dispersion into fiber structures.
  • JP 2010 270426 A a method is described in which
  • Silk proteins of concentrated formic acid, of hexafluoroacetone hydrate or from hexafluoroisopropanol are carried out at elevated temperature to prevent gelling of the spinning solution. However, this may result in prolonged, continuous processing of damage to the protein.
  • organic solvents are from aspects of
  • JP 2010-150712 describes the electrospinning of an aqueous
  • Silkworm silk protein solution with the addition of a nonionic surfactant and a water-soluble polymer.
  • the addition of nonionic surfactant may be of concern to health in medical applications.
  • the object of the present invention has been found to provide or produce a health-safe and / or a particularly environmentally friendly and particularly stable and highly concentrated solution or dispersion of at least one self-assembling protein, the efficient or improved production of pure protein molds or Fabrics, protein impregnations or coatings with a wide range of applications allows.
  • the concentrated protein solution or dispersion should therefore be distinguished by a particularly high concentration and stability.
  • protein foams, gels, films, films or protein impregnations or coatings should be prepared from concentrated, aqueous protein solution or dispersion.
  • Impregnations particularly suitable for the medical field preferably for or as wound dressings, surgical sutures or as a biocompatible coating of surfaces, in particular fibers,
  • Fiber structures such as yarns or nonwovens, fabric constructions or
  • Tissue engineering scaffolds medical textiles, tubes, implants or foams, as hypoallergenic surfaces, for cosmetic products, for hygiene products, for household products and / or for filter applications, for example tobacco and engine filters.
  • the stable protein solution or protein dispersion in an aqueous solution or dispersion comprises at least one self-assembling protein and at least one stabilizing agent for the self-assembling protein, wherein the stabilizing agent comprises at least one amino acid, preferably one or more monomeric amino acid (s).
  • the water base is a particularly environmentally friendly solution.
  • the stable protein solution or protein dispersion according to the invention is understood to mean a stability of at least 5 hours, preferably more than 12 hours, more preferably more than 20 hours or even more than 48 hours.
  • the stabilizing agent is preferably present in a concentration range from 0.01% by weight to 10% by weight, preferably in a concentration range from 0.01% by weight to 5% by weight, very particularly preferably in one
  • the self-assembling protein of the stable, aqueous protein solution or protein dispersion may be of natural origin or synthetic, in particular by recombinant production constructed from repetitive units of a structural protein, in particular an insect protein, preferably resilin, and / or a spider silk protein or the like or protein derived therefrom, in particular with insertion or attachment of oligo-amino acid blocks and / or an intrinsically unfolded protein or a microbead-forming protein.
  • the protein can thus also be a combination of the proteins derived from natural structural protein sequences, in particular a combination of the sequence of one protein with the sequence of another structural protein, particularly preferably a combination of the sequence of a spider silk with the sequence of resilin.
  • the self-assembling protein of the stable, aqueous protein solution or protein dispersion is preferably an R16, R16 Arggs (R16 protein with attached 8 amino acid oligoarginine block), S16 or C16 protein or the natural silk protein of the silkworm Bombyx mori or a natural or synthetic protein derived from the aforementioned proteins.
  • the self-assembling proteins designated R16 and S16 and their preparation are described in detail, for example, in WO 2008/155304.
  • the protein and its production designated C16 are described in detail in WO 2007/082936.
  • amino acid stabilizer can be particularly selected from the amino acid stabilizer.
  • the self-assembling protein is preferably present in a concentration of from 4% by weight to 35% by weight, more preferably in a concentration of from 5% by weight to 30% by weight, most preferably in a concentration of 10% by weight. -% to 25 wt .-% based on the total weight of the stable solution before.
  • the amino acid stabilizer for the self-assembling protein is advantageously selected from arginine, lysine, histidine, phenylalanine,
  • Phenylalanine or glutamine used.
  • arginine also promotes wound healing and thus represents an ideal stabilizer, for example for the subsequent use of the proteins in wound dressings.
  • protein fibers can be spun from the stable protein solution or dispersion, without the need for additional use of, for example, polymers as a spinning auxiliary. As a result, fibers with a particularly high protein content or even pure protein fibers can be achieved.
  • the stable, aqueous protein solution or protein dispersion preferably comprises at least one additive selected from
  • Polymers for example in the form of dispersions, or preferably water-soluble polymers, such as polyalkylene oxides, such as polyethylene oxides, polyethylene glycols or polypropylene glycols, polyvinyl alcohols,
  • Polyethyleneimines polyvinylpyrrolidones, polyvinylamines, polyvinyl acetates, polyacrylates, polyalkylacrylates, such as polymethacrylates,
  • Polyhydroxyalkyl acrylates such as poly (2-hydroxymethacrylates) or poly (2-hydroxyethacrylates), polyvinylformamides, polyacrylamides,
  • Polycarboxylic acids such as polyacrylic acids or polymethacrylic acids, natural polymers, such as galactomannan, chitosan, collagen, albumin, xanthan, alginates, gelatin, cellulose or starch, in particular their water-soluble derivatives, such as, for example, hydroxypropylcellulose, carboxymethyl starch, oxidized starch, carboxymethylcellulose,
  • Carrier-forming polymers preferably combinations of two or
  • Processing aids such as spinning aids, preferably organic
  • Solvents such as alcohols, for example ethanol or butanol, and / or surface-active agents, such as surfactants for adjusting the surface tension or the vapor pressure of the solution or conductive salts for adjusting the conductivity,
  • Crosslinking agents for example as an addition to the spinning solution or for the subsequent crosslinking of fibers,
  • Antiinfectives analgesics or antiviral additives, antiseptics,
  • anti-inflammatory agents for example wound healing agents, hemostatic agents, proteins, protein fragments, peptides and / or peptide sequences, polysaccharides, for example chitosan,
  • Growth factors such as purines or pyrimidines, living cells, ß-tricalcium phosphate, hydroxyapatite, in particular specifically
  • Hydroxyapatite nanoparticles hydroxyapatite nanoparticles, antimicrobial agents, amino acids, enzymes, vitamins, antioxidants,
  • Skin or hair cosmetic agents for example effect pigments, and / or
  • odor adsorbing additives such as activated carbon or cyclodextrins
  • Crown ethers biologically active metals or metal alloys, protein adsorption-preventing substances, such as
  • Polyethylene oxide The abovementioned polymers can be used as homopolymers, as
  • Copolymers for example as block copolymers, graft copolymers, comb or brush copolymers, star polymers, random or alternating
  • additives can be added or adsorbed in pure form, in any mixture with one another and / or in encapsulated form.
  • Polyethylene oxide polyethylene glycol, polyvinyl alcohol and / or
  • Polyvinylpyrrolidone which are dissolved as water-soluble polymers directly in the protein solution and are toxicologically harmless. Further, in view of use in the medical field as additives
  • the additives are present in a concentration range from 0.01% by weight to 40% by weight, preferably in a concentration range from 0.01% by weight to 30% by weight and more preferably in one
  • the pharmacologically active substances or medicaments used as additives preferably also come in smaller amounts
  • the chaotropic salt used is preferably guanidinium thiocyanate, calcium chloride, lithium bromide, urea or an ionic liquid.
  • the self-assembling proteins can be dissolved in the chaotropic salt prior to the addition of at least one amino acid stabilizer and directly, that is, especially when using calcium chloride or an ionic liquid, for example without subsequent dialysis, be spun into protein fibers, as calcium chloride, for example, in contrast to Guanidiniumthiocyanat, is safe for health.
  • Salinity may not fully solidify.
  • a washing step is advantageously carried out.
  • the salt by precipitation for example by pH increase, in the form of a
  • Calcium hydroxide precipitate or ion exchanger or other methods are removed before the spinning process.
  • an amino acid is added to the calcium chloride solution before the precipitation process to stabilize the proteins. This also gives an aqueous protein solution with the stabilizer.
  • the protein solution or dispersion is preferably dialyzed or ultrafiltered, gel-filtered or otherwise by agitation, particularly by stirring, and preferably even at room temperature against an aqueous buffer treated osmotic process, or the chaotropic salt is separated by precipitation.
  • the dialysis is carried out to remove the chaotropic salt from the protein solution preferably against an aqueous buffer having a pH in the range of 4 to 14, more preferably in the pH range of 6 to 14, most preferably in the pH range of 7 to 12 containing the stabilizing agent.
  • Guanidinium thiocyanate almost completely removed from the aqueous protein solution. This gives an aqueous solution of protein, water and the stabilizer, for example L-arginine.
  • the salt for example
  • Guanidinium thiodyanate in the spinning solution could interfere with the spinning process, in particular the electrospinning because of its influence on the conductivity of the spinning solution.
  • the salt could also interfere with the formation and solidification of the fibers during the spinning process.
  • gel filtration or ultrafiltration may be considered, especially for larger batches.
  • aqueous protein solution or dispersion according to the invention or the stable, aqueous protein solution prepared according to the invention can be used directly without or on a sheet carrier.
  • Films, films or foams, or particularly pure protein impregnations or protein coatings can be used directly without or on a sheet carrier.
  • the fibers or fiber structures, in particular nonwovens, are preferably produced by the spinning of the invention or
  • aqueous protein solution or dispersion prepared according to the invention without or onto a shaped or flat carrier to the corresponding protein fibers or fiber structures.
  • shaped or flat structures are here in particular fibers,
  • the protein solution or protein dispersion can thus be applied directly to a carrier, in particular to a shaped or flat structure, for example to a nonwoven fabric or another fiber structure, which or which
  • wound dressing it can be spun onto a gel, film, film, or foam, for example when applied to a polyurethane foam in wound dressings.
  • the stabilization of the protein solution or protein dispersion prior to spinning can be carried out with a health-acceptable and / or a protein-sparing stabilization method.
  • Subsequent spinning is preferably possible at room temperature in a continuous process over an extended period of time without the protein solution or protein dispersion precipitating or gelling or being exposed to a harmful temperature effect.
  • the electro-spun fibers preferably have a fiber diameter of 1 nm to several micrometers, preferably from 10 nm to 2000 nm, more preferably a fiber diameter of 10 nm to 1000 nm and most preferably a fiber diameter of 10 nm to 800 nm.
  • the protein solution or dispersion prepared according to the invention or according to the invention can also be used as impregnation or coating, in particular by spray, dip or spincoating, without or on a sheet carrier, for example fibers or fiber structures, in particular nonwovens.
  • the stable, aqueous protein solution or dispersion according to the invention or prepared according to the invention can be used without or on a sheet carrier, preferably as a coating in gel, film or film form or in the form of patterns, such as dot or striped patterns, for example.
  • protein solution or dispersion according to the invention or prepared according to the invention can be processed without or on a sheet carrier to form protein foams.
  • additives for example those selected from viscosity-adjusting agents, carrier-forming polymers,
  • Spinning aids crosslinking agents, surface-active agents,
  • pharmacological agents drugs, wound healing agents, skin or hair cosmetic agents and / or
  • the stable, aqueous protein solution or dispersion according to the invention finds or find the fabrics produced therefrom.
  • Impregnations or coatings are advantageously used for Cosmetic products, for example for creams, sponges, pads, strips or masks, for hygiene products, such as feminine hygiene, incontinence products, diapers, for household products, such as cleaning utensils, in particular wipes or sponges and / or for filter applications, such as tobacco filters or engine filters.
  • a particularly preferred use is the stable, aqueous protein solution or protein dispersion according to the invention or find the molded or flat structures, impregnations or
  • Coatings for medical products preferably for or as
  • Wound dressings other textiles, tubes, fabric constructions or
  • Tissue engineering scaffolds or implants are Tissue engineering scaffolds or implants.
  • the medical products can at least one
  • Wound contact layer prepared according to a described method, which positively influences the wound healing process or as
  • biocompatible or hypoallergenic coating of surfaces is designed. It is possible that the wound contact layer in contact with the wound may be absorbed by the body and broken down. In addition, it could prevent sticking to the wound. As a result, painful dressing changes are avoided and the newly formed tissue layers in the wound are not destroyed by the change.
  • the abovementioned additives make fiber structures, in particular nonwovens, such as, for example, 3D-modeled nonwovens, gels, films, films or foams, or for the impregnations or coatings described in one of the above examples, for the shaped or flat structures, in particular the fibers Processes are produced, thus opening a particularly diverse scope.
  • nonwovens such as, for example, 3D-modeled nonwovens, gels, films, films or foams, or for the impregnations or coatings described in one of the above examples, for the shaped or flat structures, in particular the fibers Processes are produced, thus opening a particularly diverse scope.
  • the produced protein moldings or surfaces can be aftertreated,
  • R16Args protein (R16 protein with attached 8 amino acid oligoarginine block)
  • Polyethylene oxide (MW 900,000 g / mol) as viscosity-adjusting additive
  • Polyvinylpyrrolidone (MW 90000 g / mol) as an additive for adjusting the viscosity
  • R16 protein (15 g to 20 g) as a recombinant, self-assembling protein is dissolved in a chaotropic salt, in particular guanidinium thiocyanate solution (80 g to 85 g of 6M GuaSCN) with stirring.
  • a chaotropic salt in particular guanidinium thiocyanate solution (80 g to 85 g of 6M GuaSCN) with stirring.
  • the protein solution is transferred to a dialysis tube and this is placed in the buffer solution. During dialysis, the solution is stirred. The dialysis is preferably run for 8 to 14 hours, and the buffer is optionally replaced.
  • R16Arge protein (10 g to 15 g) as a recombinant, self-assembling protein is dissolved in a chaotropic salt, in particular guanidinium thiocyanate solution (85 g of 6M GuaSCN) with stirring.
  • a chaotropic salt in particular guanidinium thiocyanate solution (85 g of 6M GuaSCN) with stirring.
  • the protein solution is transferred to a dialysis tube and this is placed in the buffer solution. During dialysis, the solution is stirred.
  • the Dialysis is preferably run for 8 to 14 hours, and the buffer is optionally replaced.
  • the solution is processed into fibers by means of electrospinning at room temperature (high voltage 35 kV, electrode distance 10 cm).
  • R16 protein (10 g to 15 g) as a recombinant, self-assembling protein is dissolved in a chaotropic salt, in particular calcium chloride solution (85 g), with stirring at 50 ° C to 70 ° C.
  • a chaotropic salt in particular calcium chloride solution (85 g)
  • the solution is processed into fibers by means of electrospinning at room temperature (high voltage 35 kV, electrode distance 10 cm).
  • R16 protein (10 g to 15 g) as a recombinant, self-assembling protein is dissolved in a chaotropic salt, in particular calcium chloride solution (85 g), with stirring at 70 ° C.
  • a chaotropic salt in particular calcium chloride solution (85 g)
  • the salt is precipitated by increasing the pH (with the addition of caustic soda) in the alkaline range as calcium hydroxide. After separating the Precipitation, for example by filtration or centrifuge, a clear yellow solution is obtained.
  • the solution is made into fibers at room temperature with or without the addition of viscosity-increasing agents by means of electrospinning (high voltage 35 kV, electrode spacing 10 cm).
  • the preparation of the protein solution is carried out as in Example 2. Only dialysis is carried out at approx. 50 ° C. Dialysis at about 50 ° C has an additional stabilizing effect on the protein.
  • the solution is further processed into fibers by means of electrospinning at room temperature, as in the abovementioned examples, with or without the addition of viscosity-increasing agents.
  • the electrospun R16 fibers of the aforementioned examples preferably have a fiber diameter of 10 nm to 2000 nm, more preferably a fiber diameter of 10 nm to 1000 nm and most preferably a fiber diameter of 10 nm to 800 nm.
  • R16 protein (15 g to 20 g) as a recombinant, self-assembling protein is dissolved in a chaotropic salt, in particular guanidinium thiocyanate solution (80 g of 6M GuaSCN) with stirring.
  • the protein solution is transferred to a dialysis tube and this is placed in the buffer solution. During dialysis, the solution is stirred. The dialysis is preferably run for 8 to 14 hours, and the buffer is optionally replaced.
  • R16Arge protein (15 g to 20 g) as a recombinant, self-assembling protein is dissolved in a chaotropic salt, in particular guanidinium thiocyanate solution (85 g of 6M GuaSCN) with stirring.
  • the protein solution is transferred to a dialysis tube and this is placed in the buffer solution. During dialysis, the solution is stirred. The dialysis is preferably run for 8 to 14 hours, and the buffer is optionally replaced.
  • the preparation of the protein solution is carried out as in Example 1 or 2 with the optional addition of additives or viscosity-increasing agents.
  • the film or sheet is prepared from the protein solution by, for example, spin coating or doctoring.
  • R16 protein (5 g) as a recombinant, self-assembling protein is dissolved in a chaotropic salt, in particular guanidinium thiocyanate solution (95 g of 6M GuaSCN) with stirring.
  • the protein solution is transferred to a dialysis tube and this is placed in the buffer solution. During dialysis, the solution is stirred. The dialysis is preferably run for 8 to 14 hours, and the buffer is optionally replaced.
  • the protein solution is sprayed evenly onto a viscose nonwoven (spray gun with compressed air).
  • R16 protein (5 g) as a recombinant, self-assembling protein is dissolved in a chaotropic salt, in particular guanidinium thiocyanate solution (95 g of 6M GuaSCN) with stirring.
  • a chaotropic salt in particular guanidinium thiocyanate solution (95 g of 6M GuaSCN) with stirring.
  • a viscose nonwoven fabric is dipped in the protein solution and then dried at room temperature.
  • R16 protein or R16Arge protein R16 protein with attached oligoarginine block
  • the R16Arg 8 protein is said to have special properties in wound healing.
  • the S16 protein or the C16 protein can be used.
  • the protein fibers, films, films or coatings are immersed for about 0.5 to 1 minute in ethanol or methanol and then dried at room temperature and to remove the solvent residues in a vacuum oven.
  • the protein fibers, films, films or coatings are immersed in potassium hydrogen phosphate buffer for about 2 hours and then washed with distilled water and dried at room temperature.

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Abstract

Es soll eine gesundheitlich unbedenkliche und/oder eine besonders umweltfreundliche und besonders stabile sowie hochkonzentrierte Lösung oder Dispersion aus zumindest einem selbstassemblierenden Protein bereitgestellt werden, die eine effiziente bzw. verbesserte Herstellung von reinen Protein-Formgebilden oder -Flächengebilden, Protein-Imprägnierungen oder -Beschichtungen mit einem breiten Anwendungsfeld ermöglicht. Erfindungsgemäß umfasst die stabile Protein-Lösung oder Protein-Dispersion in einer wässrigen Lösung wenigstens ein selbstassemblierendes Protein und wenigstens ein Stabilisierungsmittel für das selbstassemblierende Protein, wobei das Stabilisierungsmittel wenigstens eine Aminosäure umfasst.

Description

Stabile, wässrige Protein-Lösung oder Protein-Dispersion, Verfahren zur Herstellung der stabilen, wässrigen Lösung oder Dispersion und
Verfahren zur Herstellung von Form- oder Flächengebilden, Imprägnierungen oder Beschichtungen aus der stabilen, wässrigen
Protein-Lösung oder Protein-Dispersion sowie deren Verwendung
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine stabile, wässrige Lösung oder eine stabile, wässrige Dispersion mit zumindest einem selbstassemblierenden Protein. Des Weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder Protein-Dispersion, ein Verfahren zur Elektro- oder Rotorverspinnung von selbstassemblierendem Protein unter
Verwendung der stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder Protein-Dispersion, Verfahren zur Herstellung von Form- oder Flächengebilden, von
Imprägnierungen oder von Beschichtungen aus der stabilen, wässrigen Protein- Lösung oder Protein-Dispersion sowie die Verwendung der stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder Protein-Dispersion bzw. der daraus hergestellten Formoder Flächengebilde, Imprägnierungen oder Beschichtungen.
Unter Form- oder Flächengebilden werden hier insbesondere Fasern,
Fasergebilde, Gele, Folien, Filme, Schäume oder Kombinationen daraus verstanden.
BESTÄTIGUNGSKOPIE Unter einem Fasergebilde wird hier insbesondere eine geordnete oder ungeordnete ein- oder mehrlagige Zusammenlagerung einer Vielzahl von Fasern verstanden oder auch dreidimensionale Anordnungen der Fasern oder eine Kombination mit Trägern. Bevorzugte Fasergebilde sind hier Vliesstoffe.
Die selbstassemblierenden Proteine sind aus Polypeptiden aufgebaut. Diese setzen sich aus Aminosäuren, insbesondere aus den 20 natürlich
vorkommenden Aminosäuren, zusammen. Die Aminosäuren können dabei modifiziert sein, zum Beispiel acetyliert sein. Die selbstassemblierenden Proteine sind insbesondere intrinsisch entfaltete Proteine oder Microbead- bildende Proteine. Beispielhafte Proteine sind seidenähnliche Proteine, Seidenproteine oder Spinnenseidenproteine. Die Proteine können natürlichen Ursprungs oder synthetisch, zum Beispiel durch rekombinante Herstellung, sein.
Die selbstassemblierenden Proteine besitzen die Eigenschaft, dass sie in konzentrierten, wässrigen Lösungen oder Dispersionen instabil sind. Durch die hydrophoben Anteile fällt das Protein aus oder die Lösung geliert. Dadurch lassen sich die Proteine normalerweise nicht ohne weitere Zusätze, wie zum Beispiel Polymere oder Spinnhilfsmittel, aus wässriger Lösung oder Dispersion zu Fasergebilden verarbeiten.
Stand der Technik
Aus dem Patent US 6110590 ist das Elektrospinnen von synthetisch
hergestellter Seide aus Hexafluoroisopropanol bekannt.
In der JP 2010 270426 A wird ein Verfahren beschrieben, in denen
Seidenproteine aus konzentrierter Ameisensäure, aus Hexafluoroacetonhydrat oder aus Hexafluoroisopropanol, versponnen werden. Das Elektrospinnen erfolgt dabei bei erhöhter Temperatur, um das Gelieren der Spinnlösung zu verhindern. Dies kann allerdings bei längerer, kontinuierlicher Verarbeitung eine Schädigung des Proteins bedingen.
Der Einsatz von organischen Lösungsmitteln ist aus Aspekten des
Arbeitsschutzes und/oder des Umweltschutzes ebenfalls häufig nicht wünschenswert. Die JP 2010-150712 beschreibt das Elektrospinnen einer wässrigen,
Seidenproteinlösung der Seidenraupe unter Zusatz eines nichtionischen Tensids und eines wasserlöslichen Polymers. Der Zusatz von nichtionischem Tensid kann jedoch im Hinblick auf Anwendungen im medizinischen Bereich gesundheitlich bedenklich sein.
Darstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung hat sich die Aufgabe gestellt, eine gesundheitlich unbedenkliche und/oder eine besonders umweltfreundliche und besonders stabile sowie hochkonzentrierte Lösung oder Dispersion aus zumindest einem selbstassemblierenden Protein anzugeben bzw. herzustellen, die eine effiziente bzw. verbesserte Herstellung von reinen Protein-Formgebilden oder - Flächengebilden, Protein-Imprägnierungen oder -Beschichtungen mit einem breiten Anwendungsfeld ermöglicht.
Die konzentrierte Protein-Lösung oder Dispersion soll sich daher durch eine besonders hohe Konzentration und Stabilität auszeichnen.
So soll insbesondere die Herstellung von Protein-Fasern oder -Fasergebilden, insbesondere von Vliesstoffen, mittels Elektro- oder Rotorspinnverfahren ermöglicht bzw. verbessert werden. Zudem sollen sich Protein-Schäume, -Gele, -Filme, -Folien oder Protein-Imprägnierungen oder -Beschichtungen aus konzentrierter, wässriger Protein-Lösung oder -Dispersion herstellen lassen. Des Weiteren soll die stabile Protein-Lösung oder -Dispersion bzw. sollen die daraus hergestellten Form- oder Flächengebilde, Beschichtungen oder
Imprägnierungen besonders geeignet für den medizinischen Bereich sein, bevorzugt für oder als Wundauflagen, Operationsnahtmaterialien oder als biokompatible Beschichtung von Oberflächen, insbesondere Fasern,
Fasergebilden, wie Garnen oder Vliesstoffen, Gewebekonstruktionen bzw.
Gewebezüchtungen (Tissue Engineering Scaffolds), medizinische Textilien, Schläuche, Implantate oder Schäume, als hypoallergene Oberflächen, für Kosmetikprodukte, für Hygieneprodukte, für Haushaltsprodukte und/oder für Filteranwendungen, zum Beispiel Tabak- und Motorenfilter.
Erfindungsgemäß umfasst die stabile Protein-Lösung oder Protein-Dispersion in einer wässrigen Lösung oder Dispersion wenigstens ein selbstassemblierendes Protein und wenigstens ein Stabilisierungsmittel für das selbstassemblierende Protein, wobei das Stabilisierungsmittel wenigstens eine Aminosäure umfasst, bevorzugt eine oder mehrere monomere Aminosäure(n).
Durch die Wasserbasis liegt eine besonders umweltfreundliche Lösung vor.
Stark hydrophobe Proteine weisen in wässriger Lösung eine sehr schlechte Löslichkeit auf. Ohne Stabilisierung können nur verdünnte, wässrige Protein- Lösungen hergestellt werden. Durch die geringe Konzentration lassen sich diese Lösungen oder Dispersionen beispielsweise nicht ohne weitere Zusätze, wie beispielsweise Polymere oder Spinnhilfsmittel, zu Fasergebilden
verarbeiten. Zudem werden in diesen verdünnten Lösungen größere Mengen an Zusätzen benötigt. Durch die Erfindung können hingegen auch reine, wässrige Protein-Lösungen oder -Dispersionen in sehr hoher Konzentration und mit hoher Stabilität hergestellt werden.
Unter der erfindungsgemäßen stabilen Protein-Lösung oder Protein-Dispersion wird hier eine Stabilität von mindestens 5 Stunden, bevorzugt von mehr als 12 Stunden, besonders bevorzugt von mehr als 20 Stunden oder sogar von mehr als 48 Stunden verstanden.
Diese können mittels Spinnverfahren zu Fasern oder Fasergebilden,
beispielsweise zu Vliesstoffen, verarbeitet werden, insbesondere mittels
Elektro- oder Rotorspinnen. Vorzugsweise liegt das Stabilisierungsmittel in einem Konzentrationsbereich von 0,01 Gew.-% bis 10 Gew.-% vor, bevorzugt in einem Konzentrationsbereich von 0,01 Gew.-% bis 5 Gew.-%, ganz besonderes bevorzugt in einer
Konzentration von 0,01 Gew.-% bis 4 Gew.-%. Durch die Auswahl einer Aminosäure als Stabilisierungsmittel wird eine besonders hohe Stabilität bei hoher Proteinkonzentration erreicht. Aminosäuren sind toxikologisch unbedenklich. Dies ist besonders bedeutsam für die
Anwendung im oben genannten medizinischen Bereich sowie deren Einsatz für Kosmetik-, Hygiene- und/oder Haushaltsprodukte.
Das selbstassemblierende Protein der stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder Protein-Dispersion kann natürlichen Ursprungs oder synthetisch sein, insbesondere durch rekombinante Herstellung, aufgebaut aus repetitiven Einheiten eines Strukturproteins, insbesondere eines Insektenproteins, bevorzugt Resilin, und/oder eines Spinnenseidenproteins oder eines ähnlichen oder davon abgeleiteten Proteins, insbesondere mit Insertion oder Anhängung von Oligoaminosäure-Blöcken und/oder ein intrinsisch entfaltetes Protein oder ein Microbead-bildendes Protein. Das Protein kann somit auch eine Kombination aus den Sequenzen von natürlichen Strukturproteinen abgeleiteten Proteinen sein, insbesondere eine Kombination aus der Sequenz von einem Protein mit der Sequenz eines anderen Strukturproteins, besonders bevorzugt eine Kombination aus der Sequenz einer Spinnenseide mit der Sequenz des Resilins.
Das selbstassemblierende Protein der stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder Protein-Dispersion ist bevorzugt ein R16-, R16Args- (R16-Protein mit angehängtem Oligoarginin-Block mit 8 Aminosäuren), S16- oder C16-Protein oder das natürliche Seidenprotein der Seidenraupe Bombyx mori oder ein von den vorgenannten Proteinen abgeleitetes natürliches oder synthetisches Protein.
Die selbstassemblierenden Proteine mit der Bezeichnung R16 und S16 und deren Herstellung sind beispielsweise ausführlich in der WO 2008/155304 beschrieben. Das Protein und dessen Herstellung mit der Bezeichnung C16 sind beispielsweise ausführlich in der WO 2007/082936 beschrieben.
Durch das Aminosäure-Stabilisierungsmittel können besonders
hochkonzentrierte Protein-Lösungen erreicht werden. Bevorzugt liegt das selbstassemblierende Protein in einer Konzentration vor von 4 Gew.-% bis 35 Gew.-%, besonders bevorzugt in einer Konzentration von 5 Gew.-% bis 30 Gew.-%, ganz besonders bevorzugt in einer Konzentration von 10 Gew.-% bis 25 Gew.-% bezogen auf das Gesamtgewicht der stabilen Lösung vor. Das Aminosäure-Stabilisierungsmittel für das selbstassemblierende Protein ist vorteilhafterweise ausgewählt aus Arginin, Lysin, Histidin, Phenylalanin,
Asparagin, Glutamin, Tryptophan, Leucin, Glutaminsäure und/oder
Asparaginsäure. Besonderes bevorzugt sind Arginin, Lysin, Histidin,
Phenylalanin oder Glutamin eingesetzt.
Insbesondere Arginin wirkt zudem wundheilungsfördernd und stellt somit einen idealen Stabilisator beispielsweise für die spätere Verwendung der Proteine in Wundauflagen dar.
Durch die alleinige Verwendung von Aminosäure als Stabilisierungsmittel können aus der stabilen Protein-Lösung oder -Dispersion Proteinfasern gesponnen werden, ohne dass ein zusätzlicher Einsatz beispielsweise von Polymeren als Spinnhilfsmittel erforderlich ist. Dadurch können Fasern mit besonders hohem Proteinanteil oder auch reine Proteinfasern erreicht werden.
Selbstverständlich können jedoch der Protein-Lösung oder -Dispersion optional auch Additive zugesetzt werden. Die stabile, wässrige Protein-Lösung oder Protein-Dispersion umfasst dabei vorzugsweise zumindest ein Additiv, ausgewählt aus
- Mitteln zur Einstellung der Viskosität, insbesondere wasserunlösliche
Polymere, zum Beispiel in Form von Dispersionen, oder bevorzugt wasserlösliche Polymere, wie Polyalkylenoxide, wie Polyethylenoxide, Polyethylenglykole oder Polypropylenglykole, Polyvinylalkohole,
Polyethylenimine, Polyvinylpyrrolidone, Polyvinylamine, Polyvinylacetate, Polyacrylate, Polyalkylacrylate, wie Polymethacrylate,
Polyhydroxyalkylacrylate, wie Poly(2-hydroxymethacrylate) oder Poly(2- hydroxyethacrylate), Polyvinyformamide, Polyacrylamide,
Polycarbonsäuren, wie Polyacrylsäuren oder Polymethacrylsäuren, natürliche Polymere, wie Galaktomannan, Chitosan, Kollagen, Albumin, Xanthan, Alginate, Gelatine, Cellulose oder Stärke, insbesondere deren wasserlösliche Derivate, wie zum Beispiel Hydroxypropylcellulose, Carboxymethylstärke, oxidierte Stärke, Carboxymethylcellulose,
- Träger-bildenden Polymeren, bevorzugt Kombinationen aus zwei oder
mehreren Polymeren, Homo- und Copolymeren,
- Verarbeitungshilfsmitteln, wie Spinnhilfsmitteln, bevorzugt organische
Lösungsmittel, wie Alkohole, zum Beispiel Ethanol oder Butanol, und/oder oberflächenaktive Agentien, wie Tenside zur Einstellung der Oberflächenspannung bzw. des Dampfdruckes der Lösung oder Leitsalze zur Einstellung der Leitfähigkeit,
- Vernetzungsmitteln, beispielsweise als Zugabe zur Spinnlösung oder zur nachträglichen Vernetzung von Fasern,
- pharmakologischen Wirkstoffen oder Medikamenten, wie Antibiotika,
Antiinfektiva, Analgetika oder antivirale Additive, Antiseptika,
entzündungshemmende Mittel, wundheilungsfördernde Mittel, blutstillende Mittel, Proteine, Proteinfragmente, Peptide und/oder Peptidsequenzen, Polysaccharide, zum Beispiel Chitosan,
Wachstumsfaktoren, wie Purine oder Pyrimidine, lebende Zellen, ß- Tricalciumphosphat, Hydroxyapatit, insbesondere speziell
Hydroxyapatitnanopartikel, antimikrobielle Agentien, Aminosäuren, Enzyme, Vitamine, Antioxidantien,
- Haut- oder haarkosmetischen Wirkstoffen, zum Beispiel Effektpigmente, und/oder
- geruchsadsorbierenden Additiven, wie Aktivkohle oder Cyclodextrine,
Kronenether, biologisch aktive Metalle oder Metalllegierungen, proteinadsorptionsvermeidende Substanzen, wie zum Beispiel
Polyethylenoxid. Die oben genannten Polymere können dabei als Homopolymere, als
Copolymere, zum Beispiel als Blockcopolymere, Pfropfcopolymere, Kammoder Bürstencopolymere, Sternpolymere, statistische oder alternierende
Systeme, oder in jeglicher Mischung untereinander eingesetzt werden.
Die oben genannten Additive können in reiner Form, in jeglicher Mischung untereinander und/oder in verkapselter Form zugesetzt bzw. adsorbiert werden.
Besonders bevorzugt als Mittel zur Einstellung der Viskosität sind
Polyethylenoxid, Polyethylenglykol, Polyvinylalkohol und/oder
Polyvinylpyrrolidon, die als wasserlösliche Polymere direkt in der Protein- Lösung gelöst werden und toxikologisch unbedenklich sind. Ferner sind im Hinblick auf eine Verwendung im medizinischen Bereich als Additive
vorzugsweise Medikamente sowie wundheilungsfördernde Mittel eingesetzt.
Vorteilhafterweise liegen die Additive in einem Konzentrationsbereich von 0,01 Gew.-% bis 40 Gew.-% vor, bevorzugt in einem Konzentrationsbereich von 0,01 Gew.-% bis 30 Gew.-% und besonders bevorzugt in einem
Konzentrationsbereich von 2 Gew.-% bis 25 Gew.-%.
Die als Additive eingesetzten pharmakologischen Wirkstoffe oder Medikamente werden abhängig von der Applikation bevorzugt auch in geringeren
Konzentrationen als den oben genannten eingesetzt. Für das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder -Dispersion wird das wenigstens eine
selbstassemblierende Protein in einer wässrigen Lösung vor der Zugabe der Aminosäure als Stabilisierungsmittel bevorzugt in einem chaotropen Salz als Lösungsvermittler gelöst. Als chaotropes Salz wird vorzugsweise Guanidiniumthiocyanat, Calciumchlorid, Lithiumbromid, Harnstoff oder eine ionische Flüssigkeit eingesetzt.
Die selbstassemblierenden Proteine können vor der Zugabe wenigstens eines Aminosäure-Stabilisierungsmittels in dem chaotropen Salz gelöst werden und direkt, das heißt insbesondere bei Einsatz von Calciumchlorid oder einer ionischen Flüssigkeit beispielsweise ohne anschließende Dialyse, zu Protein- Fasern versponnen werden, da Calciumchlorid, beispielsweise im Gegensatz zu Guanidiniumthiocyanat, gesundheitlich unbedenklich ist.
Bei der Variante ohne Dialyse können sich die Protein-Fasern durch den
Salzgehalt möglicherweise nicht vollständig verfestigen. In diesem Fall wird vorteilhafterweise ein Waschschritt durchgeführt. Optional kann beispielsweise bei dem Einsatz von Calciumchlorid das Salz durch Ausfällen, zum Beispiel durch pH-Wert-Erhöhung, in Form eines
Calciumhydroxid-Niederschlags oder lonentauschers oder andere Verfahren vor dem Spinnprozess entfernt werden. Hierbei wird der Calciumchlorid-Lösung vor dem Ausfällprozess eine Aminosäure zur Stabilisierung der Proteine zugegeben. Dadurch erhält man ebenfalls eine wässrige Protein-Lösung mit dem Stabilisator.
Bei dem verbesserten Verfahren zur Herstellung einer stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder -Dispersion wird die Protein-Lösung oder -Dispersion vorzugsweise unter Bewegung, insbesondere durch Rühren, und bevorzugt sogar bei Raumtemperatur, gegen einen wässrigen Puffer dialysiert oder ultrafiltriert, gelfiltriert oder durch andere osmotische Verfahren behandelt, oder das chaotrope Salz wird durch Fällung abgetrennt. Die Dialyse erfolgt zur Entfernung des chaotropen Salzes aus der Proteinlösung bevorzugt gegen einen wässrigen Puffer mit einem pH-Wert im Bereich von 4 bis 14, besonders bevorzugt im pH-Bereich von 6 bis 14, ganz besonders bevorzugt im pH-Bereich von 7 bis 12, der das Stabilisierungsmittel enthält.
Bei der Variante mit Dialyse wird das chaoptrope Salz, zum Beispiel
Guanidiniumthiocyanat, aus der wässrigen Protein-Lösung nahezu vollständig entfernt. Dadurch erhält man eine wässrige Lösung aus Protein, Wasser und dem Stabilisator, beispielsweise L-Arginin. Das Salz, zum Beispiel
Guanidiniumthiodyanat, in der Spinnlösung könnte den Spinnprozess, insbesondere das Elektrospinnen wegen seines Einflusses auf die Leitfähigkeit der Spinnlösung stören. Das Salz könnte auch die Ausbildung und Verfestigung der Fasern beim Spinnprozess stören. Als Alternative zur Dialyse der Protein-Lösung oder -Dispersion kommt insbesondere für größere Ansätze eine Gelfiltration oder eine Ultrafiltration in Betracht.
Aus der erfindungsgemäßen stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder - Dispersion bzw. der erfindungsgemäß hergestellten stabilen, wässrigen Protein- Lösung können ohne oder auf einen Flächengebilde-Träger direkt besonders reine Protein-Flächengebilde, das heißt Protein-Fasern, -Fasergebilde, Gele, - Folien, -Filme oder -Schäume, oder besonders reine Protein-Imprägnierungen oder Protein-Beschichtungen hergestellt werden.
Die Fasern oder Fasergebilde, insbesondere Vliesstoffe, werden dabei bevorzugt hergestellt durch das Verspinnen der erfindungsgemäßen bzw.
erfindungsgemäß hergestellten stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder - Dispersion ohne oder auf einen Form- oder Flächengebilde-Träger zu den entsprechenden Protein-Fasern oder -Fasergebilden. Unter Form- oder Flächengebilden werden hier insbesondere Fasern,
Fasergebilde, Gele, Folien, Filme, Schäume oder Kombinationen daraus verstanden.
Die Protein-Lösung oder Protein-Dispersion kann somit direkt auf einen Träger, insbesondere auf ein Form- oder Flächengebilde, beispielsweise auf einen Vliesstoff oder ein sonstiges Fasergebilde, welcher bzw. welches
beispielsweise in Wundabdeckungssystemen eingesetzt werden kann, auf ein Gel, einen Film, eine Folie oder auf einen Schaum, zum Beispiel im Falle der Anwendung in Wundauflagen auf einen Polyurethan-Schaum, versponnen werden.
Das Verspinnen der stabilen, wässrigen Lösung oder Dispersion mit
selbstassemblierendem Protein erfolgt vorteilhafterweise durch Elektro- oder Rotorspinnen.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Stabilisierung der Protein- Lösung oder Protein-Dispersion vor dem Spinnen mit einem gesundheitlich unbedenklichen und/oder einem Protein-schonenden Stabilisierungsverfahren erfolgen. Ein nachfolgendes Spinnen ist bevorzugt bei Raumtemperatur in einem kontinuierlichen Prozess über einen längeren Zeitraum möglich, ohne dass die Protein-Lösung oder Protein-Dispersion ausfällt bzw. geliert oder einem schädlichen Temperatureinfluss ausgesetzt ist.
Die elektroversponnenen Fasern weisen bevorzugt einen Faserdurchmesser von 1 nm bis zu mehreren Mikrometern auf, bevorzugt von 10 nm bis 2000 nm, besonders bevorzugt einen Faserdurchmesser von 10 nm bis 1000 nm und ganz besonders bevorzugt einen Faserdurchmesser von 10 nm bis 800 nm. Die erfindungsgemäße oder erfindungsgemäß hergestellte Protein-Lösung oder -Dispersion kann auch als Imprägnierung oder Beschichtung, insbesondere durch Sprüh-, Tauch- oder Rotationsbeschichtung (spincoating), ohne oder auf einen Flächengebilde-Träger eingesetzt werden, beispielsweise von Fasern oder Fasergebilden, insbesondere Vliesstoffen.
Ferner kann die erfindungsgemäße oder erfindungsgemäß hergestellte stabile, wässrige Protein-Lösung oder -Dispersion ohne oder auf einen Flächengebilde- Träger vorzugsweise als Beschichtung in Gel-, Folien- oder Filmform oder in Form von Mustern, wie zum Beispiel Punkt- oder Streifenmustern,
insbesondere durch einen Druck-, Rakel-, Walzen- oder Gießprozess, eingesetzt oder verarbeitet werden.
Des Weiteren kann die erfindungsgemäße oder erfindungsgemäß hergestellte Protein-Lösung oder -Dispersion ohne oder auf einen Flächengebilde-Träger zu Protein-Schäumen verarbeitet werden.
In dem Verfahren zur Herstellung von Flächengebilden, Imprägnierungen oder Beschichtungen aus der erfindungsgemäßen oder erfindungsgemäß
hergestellten stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder -Dispersion können selbstverständlich die oben genannten Additive, beispielsweise ausgewählt aus Mitteln zur Einstellung der Viskosität, Träger-bildenden Polymeren,
Spinnhilfsmitteln, Vernetzungsmitteln, oberflächenaktiven Agentien,
pharmakologischen Wirkstoffen, Medikamenten, wundheilungsfördernden Mitteln, Haut- oder haarkosmetischen Wirkstoffen und/oder
geruchsadsorbierenden Additiven, zugesetzt werden.
Des Weiteren findet die erfindungsgemäße stabile, wässrige Protein-Lösung oder -Dispersion bzw. finden die daraus hergestellten Flächengebilde,
Imprägnierungen oder Beschichtungen vorteilhafterweise Verwendung für Kosmetikprodukte, beispielsweise für Cremes, Schwämme, Pads, Strips oder Masken, für Hygieneprodukte, wie Damenhygiene, Inkontinenzprodukte, Windeln, für Haushaltsprodukte, wie Reinigungsutensilien, insbesondere Tücher oder Schwämme und/oder für Filteranwendungen, wie zum Beispiel für Tabakfilter oder Motorenfilter.
Eine besonders bevorzugte Verwendung findet die erfindungsgemäße stabile, wässrige Protein-Lösung oder Protein-Dispersion bzw. finden die daraus hergestellten Form- oder Flächengebilde, Imprägnierungen oder
Beschichtungen für medizinische Produkte, vorzugsweise für oder als
Wundauflagen, andere Textilen, Schläuche, Gewebekonstruktionen bzw.
Gewebezüchtungen (Tissue Engineering Scaffolds) oder Implantate.
So können die medizinischen Produkte beispielsweise zumindest eine
Wundkontaktschicht, hergestellt nach einem beschriebenen Verfahren, aufweisen, die den Wundheilungsprozess positiv beeinflusst oder als
biokompatible oder hypoallergene Beschichtung von Oberflächen ausgestaltet ist. Möglicherweise kann sich die Wundkontaktschicht in Kontakt mit der Wunde vom Körper resorbiert und abgebaut werden. Zudem könnte sie ein Verkleben mit der Wunde verhindern. Dadurch werden schmerzhafte Verbandwechsel vermieden und die neu ausgebildeten Gewebeschichten in der Wunde werden durch den Wechsel nicht zerstört.
Durch die oben genannten Additive wird für die Form- oder Flächengebilde, insbesondere die Fasern, Fasergebilde, insbesondere Vliesstoffe, wie beispielsweise auch 3D-modellierte Vliesstoffe, Gele, Folien, Filme oder Schäume, oder für die Imprägnierungen oder Beschichtungen, die nach einem der beschriebenen Verfahren hergestellt sind, somit ein besonders vielfältiger Anwendungsbereich eröffnet. Zur Stabilisierung gegenüber wässrigen Lösungen können die hergestellten Protein-Formgebilde oder -Flächengebilde nachbehandelt werden,
beispielsweise durch Tauchen in Ethanol oder Methanol bzw. in
Kaliumhydrogenphosphat-Puffer und Waschen mit destilliertem Wasser sowie anschließendes Trocknen.
Ausführung der Erfindung Der Gegenstand der Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen näher erläutert.
Es werden folgende Materialien verwendet: - R16-Protein als rekombinantes, selbstassemblierendes Protein gemäß WO 2008/155304
- R16Args-Protein (R16-Protein mit angehängtem Oligoarginin-Block mit 8 Aminosäuren)
- L-Arginin
- Natriumhydrogencarbonat-Puffer (10 mM; pH 10 bis 12)
- Guanidiniumthiocyanat-Lösung (6M); GuaSCN als chaotropes Salz
- Calciumchlorid-Lösung (CaCal2 : Wasser : Ethanol = 1 :8:2 molares Verhältnis) als chaotropes Salz
- Polyethylenoxid (MG 900000 g/mol) als Additiv zur Einstellung der Viskosität - Polyvinylpyrrolidon (MG 90000 g/mol) als Additiv zur Einstellung der Viskosität
- Dialyseschlauch (regenerierte Cellulose: MWCO (Molecular Weight Cut Off) von 10000-12000)
- Dialyseschlauchklammern Beispiele zur Herstellung von Fasern aus rekombinanten, selbstassemblierenden Proteinen mittels Elektrospinnen
Beispiel 1
R16-Protein (15 g bis 20 g) als rekombinantes, selbstassemblierendes Protein wird in einem chaotropen Salz, insbesondere Guanidiniumthiocyanat-Lösung (80 g bis 85 g 6M GuaSCN), unter Rühren gelöst.
In einem Becherglas werden 10 I Natriumhydrogencarbonat-Puffer vorgelegt und 10 g L-Arginih (c(Arginin)= 0,1 % (w/v)) darin gelöst.
Die Protein-Lösung wird in einen Dialyseschlauch überführt, und dieser wird in die Pufferlösung gelegt. Während der Dialyse wird die Lösung gerührt. Die Dialyse wird bevorzugt für 8 bis 14 Stunden laufen gelassen, und der Puffer wird gegebenenfalls ausgetauscht.
Anschließend wird die Protein-Lösung aus dem Dialyseschlauch
herausgenommen und mittels Elektrospinnen bei Raumtemperatur zu Fasern verarbeitet (Hochspannung 35 kV, Elektrodenabstand 10 cm).
Beispiel 2
R16Arge-Protein (10 g bis 15 g) als rekombinantes, selbstassemblierendes Protein wird in einem chaotropen Salz, insbesondere Guanidiniumthiocyanat- Lösung (85 g 6M GuaSCN), unter Rühren gelöst.
In einem Becherglas werden 10 I Natriumhydrogencarbonat-Puffer vorgelegt und 10 g L-Arginin (c(Arginin)= 0,1 % (w/v)) darin gelöst.
Die Protein-Lösung wird in einen Dialyseschlauch überführt, und dieser wird in die Pufferlösung gelegt. Während der Dialyse wird die Lösung gerührt. Die Dialyse wird bevorzugt für 8 bis 14 Stunden laufen gelassen, und der Puffer wird gegebenenfalls ausgetauscht.
Anschließend wird die Protein-Lösung aus dem Dialyseschlauch
herausgenommen, und 0,5 Gew.-% bis 3 Gew.-% Polyethylenoxid (MG 900000 g/mol) werden zugegeben und gelöst.
Die Lösung wird mittels Elektrospinnen bei Raumtemperatur zu Fasern verarbeitet (Hochspannung 35 kV, Elektrodenabstand 10 cm).
Beispiel 3
R16-Protein (10 g bis 15 g) als rekombinantes, selbstassemblierendes Protein wird in einem chaotropen Salz, insbesondere Calciumchlorid-Lösung (85 g), unter Rühren bei 50°C bis 70°C gelöst.
0,1 g L-Arginin werden zugegeben und unter Rühren gelöst.
Die Lösung wird mittels Elektrospinnen bei Raumtemperatur zu Fasern verarbeitet (Hochspannung 35 kV, Elektrodenabstand 10 cm).
Beispiel 4
R16-Protein (10 g bis 15 g) als rekombinantes, selbstassemblierendes Protein wird in einem chaotropen Salz, insbesondere Calciumchlorid-Lösung (85 g), unter Rühren bei 70°C gelöst.
0,1 g L-Arginin werden zugegeben und unter Rühren gelöst.
Das Salz wird durch Erhöhung des pH-Wertes (mit Zugabe von Natronlauge) in den alkalischen Bereich als Calciumhydroxid ausgefällt. Nach Abtrennen des Niederschlags, beispielsweise mittels Filtration oder Zentrifuge, wird eine klare gelbe Lösung erhalten.
Die Lösung wird mit oder ohne Zusatz von Viskositätserhöhenden Mitteln mittels Elektrospinnen bei Raumtemperatur zu Fasern verarbeitet (Hochspannung 35 kV, Elektrodenabstand 10 cm).
Beispiel 5
Die Herstellung der Protein-Lösung wird wie in Beispiel 2 durchgeführt. Nur die Dialyse wird bei ca. 50°C durchgeführt. Die Dialyse bei ca. 50°C hat einen zusätzlichen stabilisierenden Effekt auf das Protein.
Anschließend wird die Lösung wie in den vorgenannten Beispielen mit oder ohne Zusatz von Viskositätserhöhenden Mitteln mittels Elektrospinnen bei Raumtemperatur zu Fasern weiter verarbeitet.
Die elektroversponnenen R16-Fasern der vorgenannten Beispiele weisen bevorzugt einen Faserdurchmesser von 10 nm bis 2000 nm auf, besonders bevorzugt einen Faserdurchmesser von 10 nm bis 1000 nm und ganz besonders bevorzugt einen Faserdurchmesser von 10 nm bis 800 nm.
Beispiele zur Herstellung von Fasern aus rekombinanten,
selbstassemblierenden Proteinen mittels Rotorspinnen Beispiel 6
R16-Protein (15 g bis 20 g) als rekombinantes, selbstassemblierendes Protein wird in einem chaotropen Salz, insbesondere Guanidiniumthiocyanat-Lösung (80 g 6M GuaSCN), unter Rühren gelöst. In einem Becherglas werden 10 I Natriumhydrogencarbonat-Puffer vorgelegt und 10 g L-Arginin (c(Arginin)= 0,1 % (w/v)) darin gelöst.
Die Protein-Lösung wird in einen Dialyseschlauch überführt, und dieser wird in die Pufferlösung gelegt. Während der Dialyse wird die Lösung gerührt. Die Dialyse wird bevorzugt für 8 bis 14 Stunden laufen gelassen, und der Puffer wird gegebenenfalls ausgetauscht.
Anschließend wird die Protein-Lösung aus dem Dialyseschlauch
herausgenommen, und 4 Gew.-% Polyethylenoxid (MG 900000 g/mol) als Additiv zur Einstellung der Viskosität werden zugegeben und gelöst.
Die Lösung wird mittels Rotorspinnen zu Fasern verarbeitet. Beispiel 7
R16Arge-Protein (15 g bis 20 g) als rekombinantes, selbstassemblierendes Protein wird in einem chaotropen Salz, insbesondere Guanidiniumthiocyanat- Lösung (85 g 6M GuaSCN), unter Rühren gelöst. In einem Becherglas werden 10 I Natriumhydrogencarbonat-Puffer vorgelegt und 10 g L-Arginin (c(Arginin)= 0,1 % (w/v)) darin gelöst.
Die Protein-Lösung wird in einen Dialyseschlauch überführt, und dieser wird in die Pufferlösung gelegt. Während der Dialyse wird die Lösung gerührt. Die Dialyse wird bevorzugt für 8 bis 14 Stunden laufen gelassen, und der Puffer wird gegebenenfalls ausgetauscht.
Anschließend wird die Protein-Lösung aus dem Dialyseschlauch
herausgenommen, und 15 Gew.- % Polyvinylpyrrolidon (MG 90000 g/mol) als Additiv zur Einstellung der Viskosität werden zugegeben und gelöst. Die Lösung wird mittels Rotorspinnen zu Fasern verarbeitet.
Beispiel zur Film- oder Folienherstellung aus rekombinanten,
selbstassemblierenden Proteinen
Beispiel 8
Die Herstellung der Protein-Lösung wird wie in Beispiel 1 oder 2 durchgeführt mit optionaler Zugabe von Additiven oder Viskositätserhöhenden Mitteln.
Danach wird der Film oder die Folie aus der Protein-Lösung zum Beispiel durch Rotationsbeschichtung (spin coating) oder durch Rakeln hergestellt.
Beispiele zur Herstellung von mit rekombinanten, selbstassemblierenden Proteinen sprühbeschichteten Vliesstoffen Beispiel 9
R16-Protein (5 g) als rekombinantes, selbstassemblierendes Protein wird in einem chaotropen Salz, insbesondere Guanidiniumthiocyanat-Lösung (95 g 6M GuaSCN), unter Rühren gelöst. In einem Becherglas werden 10 I Natriumhydrogencarbonat-Puffer vorgelegt und 10 g L-Arginin (c(Arginin)= 0,1 % (w/v)) darin gelöst.
Die Protein-Lösung wird in einen Dialyseschlauch überführt, und dieser wird in die Pufferlösung gelegt. Während der Dialyse wird die Lösung gerührt. Die Dialyse wird bevorzugt für 8 bis 14 Stunden laufen gelassen, und der Puffer wird gegebenenfalls ausgetauscht.
Anschließend wird die Protein-Lösung aus dem Dialyseschlauch
herausgenommen. Die Protein-Lösung wird auf einen Viskose-Vliesstoff gleichmäßig aufgesprüht (Sprühpistole mit Druckluft).
Beispiele zur Herstellung von mit rekombinanten, selbstassemblierenden Proteinen tauchbeschichteten Vliesstoffen
Beispiel 10
R16-Protein (5 g) als rekombinantes, selbstassemblierendes Protein wird in einem chaotropen Salz, insbesondere Guanidiniumthiocyanat-Lösung (95 g 6M GuaSCN), unter Rühren gelöst.
In einem Becherglas werden 10 I Natriumhydrogencarbonat-Puffer vorgelegt und 10 g L-Arginin (c(Arginin)= 0,1 % (w/v)) darin gelöst. Die Protein-Lösung wird in einen Dialyseschlauch überführt, und dieser wird in die Pufferlösung gelegt. Während der Dialyse wird die Lösung gerührt. Die Dialyse wird bevorzugt für 8 bis 14 Stunden laufen gelassen, und der Puffer wird gegebenenfalls ausgetauscht. Anschließend wird die Protein-Lösung aus dem Dialyseschlauch
herausgenommen.
Ein Viskose-Vliesstoff wird in die Protein-Lösung getaucht und anschließend bei Raumtemperatur getrocknet.
Alle Versuche können mit R16-Protein oder R16Arge-Protein (R16-Protein mit angehängtem Oligoarginin-Block) durchgeführt werden. Dem R16Arg8-Protein werden bezüglich der Wundheilung besondere Eigenschaften zugeschrieben. Alternativ kann auch das S16-Protein oder das C16-Protein eingesetzt werden. Optionale Nachbehandlung der hergestellten Protein-Fasern, Protein- Filme, Protein-Folien oder Protein-Beschichtungen zur Stabilisierung gegenüber wässrigen Lösungen
1. Nachbehandlungsvariante
Die Protein-Fasern, -Filme, -Folien oder -Beschichtungen werden für ca. 0,5 bis 1 Minute in Ethanol oder Methanol getaucht und danach bei Raumtemperatur und zur Entfernung der Lösungsmittelreste im Vakuumschrank getrocknet.
2. Nachbehandlungsvariante
Die Protein-Fasern, -Filme, -Folien oder -Beschichtungen werden für ca. 2 Stunden in Kaliumhydrogenphosphat-Puffer getaucht und danach mit destilliertem Wasser gewaschen und bei Raumtemperatur getrocknet.

Claims

Patentansprüche
1. Stabile, wässrige Protein-Lösung oder Protein-Dispersion, umfassend in einer wässrigen Lösung oder Dispersion wenigstens ein
selbstassemblierendes Protein und wenigstens Stabilisierungsmittel für das selbstassemblierende Protein, wobei das Stabilisierungsmittel wenigstens eine Aminosäure umfasst.
2. Stabile, wässrige Protein-Lösung oder Protein-Dispersion nach Anspruch 1 , wobei das selbstassemblierende Protein natürlichen Ursprungs oder synthetisch ist, insbesondere durch rekombinante Herstellung, aufgebaut aus repetitiven Einheiten eines Strukturproteins, insbesondere eines Insektenproteins und/oder eines Spinnenseidenproteins oder eines ähnlichen oder davon abgeleiteten Proteins, insbesondere mit Insertion oder Anhängung von Oligoaminosäure-Blöcken und/oder ein intrinsisch entfaltetes Protein oder ein Microbead-bildendes Protein.
3. Stabile, wässrige Protein-Lösung oder Protein-Dispersion nach Anspruch 1 oder 2, wobei das selbstassemblierende Protein ein R16-, R16Arge-, S16- oder C16-Protein oder ein davon abgeleitetes Protein ist.
4. Stabile, wässrige Protein-Lösung oder Protein-Dispersion nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das zumindest eine
selbstassemblierende Protein in einer Konzentration von 4 Gew.-% bis 35 Gew.-% vorliegt, bevorzugt in einer Konzentration von 5 Gew.-% bis 30 Gew.-% und besonders bevorzugt in einer Konzentration von 10 Gew.-% bis 25 Gew.-% bezogen auf das Gesamtgewicht der stabilen Lösung. Stabile, wässrige Protein-Lösung oder Protein-Dispersion nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Stabilisierungsmittel ausgewählt ist aus Arginin, Lysin, Histidin, Phenylalanin und/oder Glutamin, bevorzugt aus Arginin.
Stabile, wässrige Protein-Lösung oder Protein-Dispersion nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Stabilisierungsmittel in einer Konzentration von 0,01 Gew.-% bis 10 Gew.-% vorliegt, bevorzugt in einer Konzentration von 0,01 Gew.-% bis 5 Gew.-% und besonders bevorzugt in einer Konzentration von 0,01 Gew.-% bis 4 Gew.-%.
Stabile, wässrige Protein-Lösung oder Protein-Dispersion nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend zumindest ein Additiv, ausgewählt aus Mitteln zur Einstellung der Viskosität, Träger-bildenden Polymeren, Spinnhilfsmitteln, Vernetzungsmitteln, oberflächenaktiven Agentien, pharmakologischen Wirkstoffen, Medikamenten,
wundheilungsfördernden Mitteln, Haut- oder haarkosmetischen
Wirkstoffen und/oder geruchsadsorbierenden Additiven.
Stabile, wässrige Protein-Lösung oder Protein-Dispersion nach Anspruch 7, wobei das Additiv bzw. die Additive in einer Konzentration von 0,01 Gew.-% bis 40 Gew.-% vorliegt bzw. vorliegen, bevorzugt in einer Konzentration von 0,01 Gew.-% bis 30 Gew.-%, besonders bevorzugt in einer Konzentration von 2 Gew.-% bis 25 Gew.-%.
Verfahren zur Herstellung einer stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder Protein-Dispersion nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das wenigstens eine selbstassemblierende Protein in einer wässrigen Lösung vor der Zugabe der Aminosäure in einem chaotropen Salz gelöst wird.
10. Verfahren zur Herstellung einer stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder Protein-Dispersion nach Anspruch 9, wobei als chaotropes Salz
Guanidiniumthiocyanat, Calciumchlorid, Lithiumbromid, Harnstoff oder eine ionische Flüssigkeit eingesetzt wird.
11. Verfahren zur Herstellung einer stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder Protein-Dispersion nach Anspruch 9 oder 10, wobei die Protein-Lösung unter Bewegung gegen einen wässrigen Puffer dialysiert, ultrafiltriert oder gelfiltriert wird oder durch andere osmotische Verfahren behandelt wird oder das chaotrope Salz durch Fällung abgetrennt wird.
12. Verfahren zur Herstellung von Fasern oder Fasergebilden, insbesondere Vliesstoffen, wobei eine stabile, wässrige Protein-Lösung oder Protein- Dispersion nach einem der Ansprüche 1 bis 8 eingesetzt bzw. nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11 hergestellt wird, und anschließend die Protein-Lösung oder -Dispersion zu Protein-Fasern oder -Fasergebilden, insbesondere Vliesstoffen, versponnen wird.
13. Verfahren zur Elektro- oder Rotorverspinnung von
selbstassemblierendem Protein, wobei eine stabile, wässrige Lösung oder Dispersion nach einem der Ansprüche 1 bis 8 eingesetzt bzw. nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11 hergestellt wird, und anschließend die Protein-Lösung oder Protein-Dispersion elektro- oder rotorversponnen wird.
14. Verfahren zur Herstellung von Imprägnierungen, Beschichtungen, Gelen, Folien oder Filmen, wobei eine stabile, wässrige Protein-Lösung oder Protein-Dispersion nach einem der Ansprüche 1 bis 8 eingesetzt bzw. nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11 hergestellt wird, und anschließend die Protein-Lösung oder Protein-Dispersion als Protein-Imprägnierung oder Protein-Beschichtung, insbesondere durch Sprüh-, Tauch- oder Rotationsbeschichtung, von Form- oder
Flächengebilde-Trägern eingesetzt wird oder als Protein-Beschichtung in Gel-, Folien- oder Filmform, insbesondere durch einen Druck-, Rakel-, Walzen- oder Gießprozess, von Form- oder Flächengebilde-Trägern verarbeitet oder eingesetzt wird.
Verfahren zur Herstellung von Form- oder Flächengebilden,
insbesondere Fasern, Fasergebilden, Gelen, Folien, Filmen oder
Schäumen, oder von Imprägnierungen oder von Beschichtungen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Protein-Lösung oder Protein-Dispersion vor dem Verspinnen oder Verarbeiten zumindest ein Additiv nach Anspruch 7 oder 8 zugesetzt wird. 16. Verwendung der stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder Protein- Dispersion bzw. der daraus hergestellten Form- oder Flächengebilde, insbesondere Fasern, Fasergebilde, Gele, Folien, Filme oder Schäume, oder der daraus hergestellten Imprägnierungen oder Beschichtungen nach einem vorhergehenden Ansprüche für medizinische Produkte, bevorzugt für oder als Wundauflagen, Schläuche, Gewebekonstruktionen bzw. Gewebezüchtungen (Tissue Engineering) oder Implantate, für Kosmetikprodukte, für Hygieneprodukte, für Haushaltsprodukte und/oder für Filteranwendungen.
Form- oder Flächengebilde, insbesondere Fasern, Fasergebilde, Gele, Folien, Filme oder Schäume, oder Imprägnierungen oder
Beschichtungen, hergestellt nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 15.
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