WO2012174622A1 - Extrato vegetal obtido de kielmeyera aureovinosa com atividade antibiótica, composto químico isolado, composições compreendendo os mesmos, seus usos e métodos de prevenção e tratamento de infecções bacterianas - Google Patents

Extrato vegetal obtido de kielmeyera aureovinosa com atividade antibiótica, composto químico isolado, composições compreendendo os mesmos, seus usos e métodos de prevenção e tratamento de infecções bacterianas Download PDF

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Otavio PADULA DE MIRANDA
Lisieux DE SANTANA JULIÃO
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Definitions

  • Patent Descriptive Report for: "VEGETABLE EXTRACT OBTAINED FROM KIELMEYERA AUREOVINOSA WITH ANTIBIOTIC ACTIVITY, ISOLATED CHEMICAL COMPOSITION UNDERSTANDING THE SAME, ITS USES AND METHODS OF PREVENTION AND TREATMENT OF INFECTIONS.
  • the present invention relates to plant extracts obtained from the plant species Kyelmeiera aureovinosa, from the Clusiaceae Family, native and collected in Brazil, which has marked antibiotic activity.
  • the present invention also relates to the chemical compound 5-hydroxy-8,8-dimethyl-6- (iso-propyl) -4-aryl-4H-cyclohexene- [2,3-h] chromen-2-one (amarillin) , isolated from Kyelmeiera aureovinosa plant extract, which also has high antibiotic activity as well as variations of it.
  • the present invention further relates to herbal compositions comprising said plant extract of Kyelmeiera aureovinosa.
  • the present invention also provides pharmaceutical or veterinary compositions comprising the active ingredient amarilin.
  • the present invention further provides for the use of said compositions in the prevention or treatment of bacterial infections.
  • the present invention relates to methods for preventing or treating bacterial infections.
  • Herbal medicines are complex mixtures of organic substances that can come from any part of a raw or processed plant, including leaves, stems, flowers, roots and seeds.
  • the flavonoid group is one of the largest and most widely distributed among the botanical families, encompassing various classes of chemical molecules, having in common a basic structure C6 ⁇ C3-C6, and are classified according to the degree of oxidation of the central piranic nucleus 1 , which can also be linear (such as in chalcones) or fused to a furanic ring (as in auronas).
  • a plant-based diet rich in flavonoids is thought to be extremely important for human health as it acts as natural antioxidants, providing protection against cardiovascular disease and certain cancers (DE ICK, PM1997. Medicinal Natural Products - Biosynthetic Approach, John Wiley & Sons Ed., Chichester, England).
  • neoflavonoids molecules composed of 15 carbon atoms, grouped according to their molecular structure and origin.
  • 4-arylcoumarins and dalbergions are examples of compounds in this class.
  • neoflavonoids are known to exhibit antimicrobial, anti-protozoan, cytotoxic, chemopreventive, and type 1 (HIV-1) specific reverse transcriptase inhibitor activity (PATIL, AD, FREYER, AJ, EGGLESTON, DS, HALTIWANGER, R. C., BEAN, M.F., TAYLOR, P.B., CARANFA, MJ, BREEN, AL, BARTUS, H.R., JOHNSONRK, HERTZBERG, RP & WESTLEY, JW 1993.
  • flavonoids are widely distributed among botanical families, among which we can highlight the Clusiaceae family, to which the genus Kielmeyera belongs. This family has about 1000 species distributed in thirty genera found in the pantropical zone. In Brazil, there are eighteen genera and about 150 species (SOUZA V., LORENZI H. 2005. Systematic botany: illustrated guide for identifying angiosperm families of Brazilian flora. S ⁇ o Paulo: Instituto Plantarum, p. 348). Endemic Kielmeyera from South America (BENNETT, GJ & LEE, H.-H. (1989). Xanthones from Guttiferae. Phytochemistry, 28, 967-998). Studies with species of this genus have verified the occurrence of some classes of chemical substances, among them the 4-alkylcoumarins, 4-arylcoumarins (neoflavonoids) and xanthones.
  • Nosocomial infections are considered to be the main factor associated with morbidity and mortality in nosocomial environments in virtually all continents.
  • the bacterial species Staphylococcus aureus has been considered the main etiological agent associated with these infections, which may result in conditions of high morbidity, such as infectious endocarditis and septicemia (SADER, HS; GALES, AC; PFALLER, MA; ZOCCOLI, C ; BARTH, A & JONES, RN Pathogen frequency and resistance patterns in Brazilian hospitals Summary of results from three years of the SENTRY antimicrobial surveillance program Braz J. Infect Dis., 5, 200-214, 1999; ENRIGHT, MC 2003.
  • Curr Opin Pharmacol The evolution of a resistant pathogen - the case of MRSA 3: 474-479; FOWLER,.; WANN, ER; JOH, D .; JOHANSSON, S.; FOSTER, TJ & HOOK, M.
  • Cellular invasion by Staphylococcus aureus involved fibronectin bridge between bacterial fibronectin-binding MSCRAMMS and host cell beta integrins Eur J. Cell Biol., 79, 672-679, 2000; DIEKEMA DJ, PFALLER MA, SCHMITZ FJ, SMAYEVSKY J, BELL J, JONES RN, BEACH M.
  • MRSA Metal-resistant Staphylococcus aureus
  • Resistance to methicillin by a microorganism is an indicator of resistance to all beta-lactam antibiotics, including cephalosporins and carbapenemas. Resistant microorganisms often exhibit cross-resistance to aminoglycosides, lincosamines, macrolides, tetracyclines, trimethoprims and sulfonamides (RIBEIRO, Isabel and CASTANHEIRA, Rui. Treatment and prevention of Staphylococcus aureus infections and colonization. In Rev Port Pneumol IX (5): 395- 409. Porto, 2003).
  • Major risk factors associated with the development of MRSA infections include hospitalization or recent surgery, long-term hospitalization, dialysis, and intravenous drug application (RIBEIRO, I. CASTANHEIRA, RR. Treatment and prevention of Staphylococcus aureus. Port Pneumol. 5: 395-409, 2003).
  • bacteria After contamination, bacteria initially colonize entry sites such as skin, wounds, or interface areas between invasive medical devices and the skin, such as catheters or probes, and thereafter initiate an infectious focus, being carried into the body and may initiate a systemic infection (ENZEL RP, PERL TM: The significance of nasal carriage of Staphylococcus aureus and the incidence of postoperative wound infection J Hosp Infect 31: 13-24, 1995). It is an interesting strategy, therefore, the preventive control of contamination of these sites, through the direct application of topical antimicrobial agents (Ribeiro and Castanheira, 2003).
  • CA-MRSA extremely virulent MRSA strains have migrated into the community (called CA-MRSA), causing severe infections in healthy individuals, such as school-aged children, athletes, Military and Prisoners (LINDENMAYER, JM, SCHOENFELD, S., O'GRADY, R. & CARNEY, J. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a high school wrestling team and the surrounding community.
  • Methicillin-resistant Staphylococcus aureus an emerging pathogen Infect Control Hosp Epidemiol., 24, 451-455, 2003; ELLIS , MW, HOSPENTHAL, DR, DOOLEY, DP, GRAY, PJ, MURRAY, CK, 2004. Clin. Infect Dis. Natural history of community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus colonization and infection in soldiers .39: 971-979; KAZAKOVA, SV; HAGEMAN, JC; MATAVA, M.; SRINIVASAN, A. ; PHELAN, L. ; GARFINKEL, B. ; BOO,.
  • Such strains have been associated with skin and soft tissue infections such as cellulitis and abscesses (HEROLD, BC; IMMERGLUCK, LC; MARANAN, MC; LAUDERDALE, DS; GASKIN, RE; BOYLE-VAVRA, S.; LEITCH, CD & DAUM , RS Community acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus in children with no identified predisposing risk (JAMA, 279, 593-598, 1998).
  • cellulitis and abscesses HEROLD, BC; IMMERGLUCK, LC; MARANAN, MC; LAUDERDALE, DS; GASKIN, RE; BOYLE-VAVRA, S.; LEITCH, CD & DAUM , RS Community acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus in children with no identified predisposing risk (JAMA, 279, 593-598, 1998).
  • Severe community-acquired pneumonia caused by Panton-Valentine leukocidin-positive Staphylococcus aureus first reported case in the United Kingdom Intensive Care Med., 29, 1399, 2003; VAN DER FLIER, M.; VAN DIJK, NB; FLUIT, AC; FLEER, A. WOLFS, TF & VAN GESTEL JP Fatal pneumonia in an adolescent due to community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus positive for Panton-Valentine-leukocidin (Ned. Tijdschr. Geneeskd., 147, 1076-1079, 2003) .
  • glycopeptides such as vancomycin and teicoplanin, which can be administered intravenously only, and are considered ototoxic and nephrotoxic as well as expensive.
  • studies have already compared the activity of topical preparations prepared with plant extracts as opposed to antimicrobial products recommended in clinical practice for the treatment of MRSA infections. For example, Caelli et al. (2000) observed that when considering two distinct groups of patients initially infected with MRSA, one was subjected to the treatment of preparations with plant extracts of Malaleuca sp.
  • the antimicrobial activity of a methanolic methanolic extract obtained from a common South African plant species (Helichrysum pedunculatum) against various pathogenic bacterial species was evaluated.
  • the sample had a MIC value of 5000 ⁇ g / mL against an MRSA strain (Aiyegoro OA, Okoh AI Phytochemical Screening and Polyphenolic Antioxidant Activity of Aqueous Crude Leaf Extract of Helichrysum pedunculatum. International Journal of Molecular Sciences. 2009; 10 (11) : 990-5001).
  • Kielmeyera aureovinosa plant extracts having antibiotic activity are obtained by extraction with organic solvent.
  • Kielmeyera aureovinosa plant extracts having antibiotic activity are extracted with a solvent selected from the group comprising, but not limited to methanol, ethanol, ethyl acetate and hexane.
  • the plant extracts of Kielmeyera aureovinosa whose minimum inhibitory concentration (MIC) in broth microdilution test against Staphylococcus aureus is less than or equal to 1 g / mL.
  • the plant extracts of Kielmeyera aureovinosa of the present invention are characterized by comprising a concentration greater than 60% of the chemical markers mameisin and isomameisin.
  • the minimum inhibitory concentration (MIC) of the amarilin compound in broth microdilution test against Staphylococcus aureus is less than or equal to 1 ⁇ / ⁇ ..
  • the herbal compositions comprising plant extracts of Kielmeyera aureovinosa of the present invention are intended for topical administration.
  • the pharmaceutical form of herbal compositions comprising plant extracts of Kielmeyera aureovinosa for topical use may be selected from the group comprising, but not limited to emulsion, gel-cream, ointment, cream, gel, soap and paste.
  • the herbal compositions comprising plant extracts of Kielmeyera aureovinosa of the present invention are intended for oral administration.
  • the dosage form of herbal composition comprising plant extracts aureovinosa Kielmeyera to 'oral use can be selected from the group comprising, but not limited to dragée, capsule, syrup, solution and suspension tablet.
  • Another object of the invention is to provide pharmaceutical or veterinary compositions comprising 5-hydroxy-8,8-dimethyl-6- (iso-propyl) -4-aryl-4H-cyclohexene- [2,3-h] chromen compound Isolated 2-one (amarillin) and pharmaceutically acceptable excipients.
  • compositions comprising the amarilin compound may be intended for topical administration.
  • the pharmaceutical form of the pharmaceutical or veterinary compositions comprising the amarilin compound for topical use may be selected from the group comprising, but not limited to ointment, cream, gel, soap, lotion, emulsion, gel cream and paste.
  • compositions comprising the amarilin compound may be intended for oral administration.
  • the pharmaceutical form of the pharmaceutical or veterinary compositions comprising the aamariline compound for topical use may be selected from the group comprising, but not limited to, powder, granules, tablets, pills, capsules, solutions, syrups and suspensions.
  • compositions comprising the amarilin compound may be intended for parenteral administration. More particularly, it is an object of the present invention to provide compositions as described above for use in preventing or treating bacterial infections.
  • Another object of the present invention is a method for preventing or treating bacterial infections using Kielmeyera aureovinosa plant extracts, amarilin compound or a composition comprising them for preparing a medicament for preventing or therapy of bacterial infections.
  • Figure 1 presents photographs of the thin layer chromatography (TLC) of the ethanolic extract of Kielmeyera aureovinosa roots under ultraviolet light at wavelengths ⁇ 254 nm and 365 nm, respectively.
  • the eluent used was a 93: 7 toluene: ethyl acetate mixture, which showed the presence of the major substance (at 254 and 365 nm) and coumarins (blue bands at the wavelength of 365 - signaled with ⁇ -).
  • the black and white schemes * highlight the bands to be highlighted.
  • Figure 2 shows a photograph of three CCFs showing the presence of terpenoids (purple bands), flavonoids (yellow bands) and phenols (brown bands) by revelation with sulfuric vanillin, NPPEG and ferric chloride, respectively (which may be
  • the eluent used was a mixture of toluene: ethyl acetate at a ratio of 93: 7.
  • the black and white schemes highlight the bands to be highlighted.
  • Figure 4 shows absorption maxima in (a) ultraviolet absorption spectrum of the chemical marker of the extract. showing maximum absorption values for two wavelengths ( ⁇ max 282 and 335 nm - flagged with i).
  • the structure of the isolated substances as chemical markers can also be found in this figure in (b) mameisin and (c) isomameisin.
  • (d) the novel chemical structure of the compound 5-hydroxy-8,8-dimethyl-6- (iso-propyl) -4-aryl-4H-cyclohexene- [2,3-h] chromen-2- one, called amarilin, which was isolated from the main marker peak of the herbal extract.
  • Figure 6 illustrates assays performed for antimicrobial activity.
  • a culture medium plate is shown where the qualitative aspect was evaluated, using the seeded nutritive agar diffusion methodology (Drop-Test).
  • the top view shows the tubes used in the minimum inhibitory concentration assay of the EXT 13737 extract when tested against ATCC 33591 multidrug resistant MRSA strain.
  • Initial concentration 85C ⁇ g / mL.
  • Result obtained for MIC 0.83 g / mL.
  • EXT 103764 or aureocycline
  • EXT 103764 is a species of the genus not previously described in the literature, harvested under CGEN / MA Special Authorization No. 16/2006, renewed by publication in DOU 15:55, 22 January 2009. According to the rules of the Brazilian Legislation, subsamples of the plant can be found in faithful depositary herbarium (RFA) under number 25756.
  • RFA faithful depositary herbarium
  • Kielmeyera aureovinosa plants of the Clusiaceae family, are monoecious plants having glabrous, latex, thick yellow latex vegetative structures. Plants of this species also have a sparingly fasciculated subterranean system, robust roots, yellowish, defoliating papyraceous bark surface. Arboretum measuring 6 to 8 meters in height, diameter measuring 12 to 20cm, stem and lateral branches developed with satin-metallic luster, vinous with golden transverse bands, defoliation in transverse spiral papyraceous membranes; slender young, cylindrical to triangular-rounded and striated branches.
  • the leaves are whole, alternating spiraled; small, striated, canalicular petiole, 2 to 4 cm long length; obovate to elliptical blade, with acute or coined base, sometimes slightly asymmetrical, obtuse rounded apex, sometimes apiculate, rare acute or emarginated; thin central rib printed on the adaxial face and prominent on the abaxial face; It also has between 15 and 22 secondary ribs on both sides, prominent on both sides; sub-parallel intersecondary ribs and evident cross-linking on both sides; orange marginal rib (in sicco); yellow (in sicco) and ovoid, obloid or spindle-shaped, sparingly distributed segments near the margin.
  • Inflorescences are present in hemispherical pauciflorous corimbiform thymes; articulated, striated branches; striated pedicels 1 to 1.5 cm long.
  • Pentameric flowers actinomorphs; ovoid flower buds, chalice dialisepalc, ovate sepals, acute-rounded apex, ciliated, uneven, with dimensions of 0, 35x0, 55-0, 5x0, 6-0, 5x0, 7cm; dialipetal corolla, oblong-obovate petals, truncated-rounded apex, ciliated, slightly asymmetrical, with dimensions of 1, 4-2x1-1, 5cm; androcyte polystemone, slender fillets, tablets, glabrous, basifix anthers, rimosas, obloids or obovoids, truncated base and apex 0.1 to 0.15 cm in length; gy
  • Plants of the Clusiaceae family are used in folk medicine to treat abdominal disorders, back pain, colds, conjunctivitis, cough, dysmenorrhea, headache, snake bite and scorpion.
  • extract 103764 (aureocycline), extracted from the species Kielmeyera aureovinosa, from the Clusiaceae family, showed the presence of coumarins, terpenoids, fatty acids and flavonoids.
  • the chemical profile developed by CCF indicates the presence of flavonoids in the ethanolic extract, evidenced by the yellow color revealed by the NPPEG reagent (composed of two NP reagents "Naturstoff Reagenz A", 2-amino-ethyl diphenylboric acid ester and PEG (polyethylene glycol 4080
  • NPPEG reagent composed of two NP reagents "Naturstoff Reagenz A", 2-amino-ethyl diphenylboric acid ester and PEG (polyethylene glycol 4080
  • Other groups of chemical substances were identified by TLC through their reactions with specific reagents (10% KOH in ethanol and ferric chloride) whose colorations indicated the presence of coumarins (bluish spots) and
  • the crude alcoholic extract (resubmitted in DMSO) from the sample of Kielmeyera sp. (aureocycline), the plant extract of the present patent application, had a MIC value of 0.83 g / mL.
  • aureocycline the plant extract of the present patent application
  • Such activity is, until now, unprecedented, considering a plant extract gross.
  • mupirocin is currently widely used in the hospital setting as a major topical antistaphylococcal agent, with an estimated MIC value of 0.5yg / mL (FARIAS, WV, SADER, .HS, LEME, I.L., PIGNATARI, AC Rev. Assoe Med.
  • the plant extract of the present invention demonstrated low in vitro cytotoxic activity in mammalian eukaryotic cell cultures (hamster ovary cells - CHO), with an extract concentration of 12 ⁇ g / mL having a cell protection level of 73% on average. .
  • mammalian eukaryotic cell cultures hamster ovary cells - CHO
  • independent cytotoxicity tests conducted in vitro on human fibroblasts and murine fibroblasts (3T3 strain) showed cytotoxic concentrations in the order of 11 ⁇ g / mL for 80% protection.
  • the minimum inhibitory concentration presented by the plant extract of the present invention is in an order of magnitude below these cytotoxic concentrations.
  • the expected high therapeutic index makes the plant extract of the present invention usable for the development of commercial herbal products, as cytotoxicity is an important limiting factor in antimicrobial development.
  • the present invention proposes to assist in the growing demand for active products against pathogenic microorganisms.
  • the present invention relates to a plant extract obtained from Kielmeyera aureovinosa which has antibiotic activity. This extract was named aureocycline.
  • the plant extract may be obtained from any part of the Kielmeyera aureovinosa plant by any organic solvent extraction method.
  • the plant extract of the present invention is obtained from the roots of the Kielmeyera aureovinosa plant.
  • Methods that can be used to obtain Kielmeyera aureovinosa plant extract having antibiotic activity include, but are not limited to, cold methods such as turbolization, maceration and simple or fractional percolation.
  • hot extraction methods may be used in open systems such as infusion, turbolization and decoction, but not limited to them. It is also possible to obtain the plant extract "the present invention by hot extraction methods in closed systems, such as extraction under reflux and solvent extraction using heating.
  • the extraction method used in the present invention consists of a combination of two or more aforementioned methods. More preferably, the extraction method used in the present invention comprises maceration and cold solvent extraction.
  • the extract may be prepared from extractor-dried root dry powder, in which sufficient volume of solvent is added for homogenization of the mixture and complete immersion in the solvent. The mixture kept in the extrotor for a period of 10 to 50 hours, then filtered and rotary evaporated under low pressure.
  • the plant extract may be obtained by any of the above methods using an organic solvent selected from the group comprising, but not limited to oxygenated solvents, hydrocarbon solvents and halogenated or aromatic solvents.
  • oxygenated solvents may be products such as ketones, glycol ethers and alcohol
  • hydrocarbon solvents may be aromatic and aliphatic hydrocarbons, comprising, but not limited to, for example hexane, cyclohexane, toluene, benzene and derivatives. of the same.
  • Halogenated solvents may be derived from any hydrocarbon solvent that has undergone a halogenation process, comprising, but not limited to, aryl halides, alkyl halides and cycloalkyl halides.
  • the plant extract of the present invention has minimal inhibitory concentration (MIC) in broth microdilution test against Staphylococcus aureus less than or equal to 1 ⁇ g / mL.
  • the plant extract of the present invention may be characterized chemically characterized in that it comprises mainly the compounds mameisine and isomameisine.
  • the concentration of the chemical markers mameisine and isomameisine is greater than 60% in the plant extracts of the present invention.
  • the present invention relates to a chemical compound isolated from the aureocycline extract.
  • the compound of the present invention has a molecular structure according to Formula I below:
  • R1 is selected from the group comprising carbon or a heteroatom selected from the group comprising oxygen, nitrogen and sulfur;
  • R 2, R 3, R 4, R 5, R 6 and R 7 are independently selected from the group comprising optionally substituted hydrogen, cyclic or open, aromatic or aliphatic alkyl, optionally substituted cyclic or open, aromatic or aliphatic alkenyl, optionally aromatic or aliphatic substituted, optionally substituted aryl, optionally substituted cyclic or open haloalkyl, oxygen, sulfur, optionally substituted amine, hydroxyl, cyclic or aliphatic alkyloxy, optionally substituted aryloxy, nitro, cyano, optionally substituted sulfonyl, carboxylic acid and amide; and
  • R 6 and R 7 may form an optionally substituted aliphatic or aromatic cycle. More particularly, the compound of the present invention is 5-hydroxy-8,8-dimethyl-6- (iso-propyl) -4-aryl-4H-cyclohexene- [2,3-h] chromen-2-one (amarillin ) of formula I:
  • the chemical compound amarilin is isolated from the aaureocycline extract and, like it, has antibiotic activity. More particularly, the antibiotic activity of the amarilin compound has minimal inhibitory concentration (MIC) in broth microdilution test against Staphylococcus aureus less than or equal to 1 pg / mL.
  • MIC inhibitory concentration
  • the present invention relates to phytotherapeutic compositions comprising plant extracts of Kielmeyera aureovinosa and pharmaceutically acceptable excipients.
  • the term "pharmaceutically acceptable” means a non-toxic, inert solid, semi-solid liquid excipient, diluent, auxiliary formulation of any kind, or simply a sterile aqueous medium such as saline.
  • Examples of materials that may serve as pharmaceutically acceptable carriers are sugars such as lactose, glucose and sucrose, starches such as cornstarch and potato starch, cellulose and derivatives thereof such as sodium carboxymethylcellulose, ethyl cellulose and cellulose acetate, cyclodextrin; oils such as peanut oil, cottonseed oil, sunflower oil, sesame oil, olive oil, corn oil and soybean oil; glycols such as propylene glycol, polyols such as glycerin glycol, sorbitol, mannitol and polyethylene; esters, such as ethyl laurate, ethyl oleate, agar; buffering agents such as aluminum hydroxide and magnesium hydroxide; alginic acid; pyrogen free water; isotonic saline, Ringer's solution; ethyl alcohol and phosphate buffer solutions as well as other compatible non-toxic substances used in pharmaceutical formulations.
  • sugars such as lactose, glucose and sucrose
  • the herbal compositions comprising plant extracts of Kielmeyera aureovinosa of the present invention are intended for topical administration.
  • the pharmaceutical form of the herbal compositions. comprising plant extracts of Kielmeyera aureovinosa for topical use may be selected from the group comprising, but not limited to emulsion, gel-cream, ointment, cream, gel, soap and paste.
  • the herbal compositions comprising plant extracts of Kielmeyera aureovinosa of the present invention are intended for oral administration.
  • the pharmaceutical form of herbal compositions comprising plant extracts of Kielmeyera aureovinosa for oral use may be selected from the group comprising, but not limited to, dragee, capsule, syrup, suspension solution and tablet.
  • compositions comprising 5-hydroxy-8,8-dimethyl-6- (iso-propyl) -4-aryl-4H-cyclohexene- [2,3-h] chromen-2-one compound.
  • compositions comprising the amarilin compound may be intended for topical administration.
  • the pharmaceutical form of the pharmaceutical or veterinary compositions comprising the amarilin compound for topical use may be selected from the group comprising, but not limited to ointment, cream, gel, soap, lotion, emulsion, gel cream and paste.
  • compositions or Veterinary medicinal products comprising the amarilin compound may be intended for oral administration.
  • the pharmaceutical form of the pharmaceutical or veterinary compositions comprising the amarylline compound for topical use may be selected from the group comprising, but not limited to, powder, granules, tablets, drags, capsules, solutions, syrups and suspensions.
  • compositions comprising the amarilin compound may be intended for parenteral administration.
  • compositions of the present invention may comprise any type of excipient used in the manufacture of medicaments in any of the above mentioned pharmaceutical forms, such as absorbents, diluents, binders, disintegrants, lubricants, glidants, plasticizers, coating agents, matrix forming agents. controlled release solvents and co-solvents, wetting agents, emulsifying agents, surfactants, consistency donating agent, tonicity agents, wetting agents, airborne release agents, alkalizing or acidifying agents, preservatives, antioxidants, bactericides, bacteriostats, chelating, coloring and sweetening agents.
  • excipient used in the manufacture of medicaments in any of the above mentioned pharmaceutical forms
  • absorbents such as absorbents, diluents, binders, disintegrants, lubricants, glidants, plasticizers, coating agents, matrix forming agents.
  • controlled release solvents and co-solvents wetting agents, emulsifying agents, surfactants, consistency donating
  • Suitable absorbers for the compositions of the present invention may be any substance added to absorb water present in the extracts or to fix certain volatile compounds, such as essences.
  • Non-limiting examples of such excipients are calcium phosphate, kaolin, magnesium carbonate, bentonite and talc.
  • compositions of the present invention may comprise, as a diluent, any inert product added to the formula to enable tablets or capsules to be filled with adequate volumes and to provide flow and compression properties necessary for production, for example, but not limited to. lactose, tribasic calcium phosphate, starch, mannitol, calcium sulfate, microcrystalline cellulose (Microcel ® , Avicel ® ), dibasic calcium phosphate (Encompress ® , Ditab ® ), magnesium oxide, magnesium carbonate, talc, kaolin, carbonate calcium, dextrose, fructose, lactose, aspartame, cellulose, maltose, mannitol, guar gum, sorbitol, starch and sucrose.
  • lactose tribasic calcium phosphate
  • starch mannitol
  • mannitol calcium sulfate
  • microcrystalline cellulose Microcel ® , Avicel ®
  • Suitable binder substances for the compositions of the present invention may be agents used to promote particle adhesion during granulation and compression of solid dosage forms, they may also be used in the compositions of the present invention, for example carbopol, povidone, xanthan gum, gum arabic, alginic acid, compressible sugar, CMC-Na, ethylcellulose, gelatin, methylcellulose, povidone (PVP), starch, pregelatinized starch and liquid glucose in solution, dispersion or powder form.
  • carbopol povidone
  • xanthan gum gum arabic
  • alginic acid compressible sugar
  • CMC-Na ethylcellulose
  • gelatin methylcellulose
  • povidone (PVP) povidone
  • Suitable disintegrants or disintegrants for the compositions of the present invention may be any component employed to accelerate disintegration and / or dissolution of the pharmaceutical form in biological fluids, for example alginic acid, starch, sodium alginate, CMC-Na, microcrystalline cellulose, croscarmellose sodium (Ac-Di-Sol ® ), starch sodium glycolate (Explotab ® ) and crospovidone (Kollidon CL ® ).
  • Suitable lubricants for the compositions of the present invention may be, for example, magnesium stearate, calcium stearate, stearic acid, talc and hydrogenated vegetable oil (eg Lubritab ® ).
  • Suitable glidants for the compositions of the present invention may be, for example, colloidal silica (Aerosil 200 ® ) and talc.
  • Plasticizers suitable for the compositions of the present invention may be used in conjunction with polymers to modify the transition temperature of phase and facilitate the coalescence of films formed on granules, tablets or pellets.
  • Nonlimiting examples of such agents are glycerine, triethylcitrate, dibutylphthalate, silicone and PPG.
  • Coating agents employed to coat compositions of the present invention in the form of tablets, granules, capsules or pellets may be, for example, cellulose acetophthalate, ethylcellulose, gellan gum, maltodextrin, methacrylates, methylcellulose, microcrystalline cellulose, shellac, gum carrageenan, waxes, shellacs, gelatin, cellulose derivatives (methyl or ethylcellulose, cellulose acetophthalate, hydroxypropyl methylcellulose, cellulose acetate), copolymers of acrylic and methacrylic esters (Eudragit types L100, RS 30D, RS PM, S100, among others), polyvinyl alcohol (PVA) and polyvinyl acetate.
  • PVA polyvinyl alcohol
  • Controlled release matrix forming agents possibly employed in the compositions of the present invention for the purpose of obtaining sustained and / or controlled release of the active ingredient (s) may be HPMC, CMC-Na, xanthan gum, Carbopol ®. , various types of Eudragit ® , agar, polyoxidoethylene derivatives (PEO's), cyclodextrin, nanospheres and nanoparticles of any nature.
  • Solvents and co-solvents such as alcohol, corn oil, cottonseed oil, glycerin, isopropyl alcohol, mineral oil, oleic acid, peanut oil, purified water and water for injection, among others, may also be used in the compositions of the present invention. invention.
  • Suitable wetting agents for the compositions of the present invention may be any substance added for the purpose of decreasing surface tension at the solid / liquid interface, for example sodium lauryl sulfate (LSS), sodium docusate and polysorbates 20, 60, 80 (Tween ( 20, 60, 80).
  • LSS lauryl sulfate
  • Tween 20, 60, 80.
  • Suitable emulsifying agents for the compositions of the present invention may be, for example, glyceryl monostearate, cetyl alcohol and gelatin and auxiliaries such as CMC-Na, MC, alginate and pectin.
  • Surfactants such as benzalkonium chloride, nonoxynol 10, octoxynol 9, polysorbate 80 and sodium lauryl sulfate are also suitable for the compositions of the present invention.
  • Consistency donors suitable for the compositions of the present invention may be any substance used to increase the consistency of ointments, for example cetyl alcohol, white wax, yellow wax, stearyl alcohol, paraffin, microcrystalline wax and cetyl ester wax.
  • Suitable tonicity agents for the compositions of the present invention may be any substance used to obtain solutions with osmotic characteristics similar to those of biological fluids to be administered by ocular, nasal, parenteral routes such as NaCl (0.9%), mannitol (5). , 07%) and dextrose (5.51%).
  • Suitable humectants for the compositions of the present invention may be glycerine, propylene glycol and sorbitol.
  • Suitable lifting agents for the compositions of the present invention may be any liquid used as a facilitating agent in the process of reducing drug particles during the preparation of emulsions, oily bases, among others, for example mineral oil (liquid petroleum jelly), glycerin, propylene glycol , PEG 400, cottonseed oil, castor oil and Polysorbate 80 (Tween ® 80).
  • Air expelling agents suitable for the compositions of the present invention may be employed to expel air from hermetically sealed containers or fluid formulations to increase stability, for example nitrogen (N 2 ) and carbon dioxide (CO 2 ).
  • Alkalizing or acidifying agents such as citric acid, ammonia solution, acetic acid, carbonate ammonium, fumaric acid, diethanolamine, hydrochloric acid (HCl), monoethanolamine, tartaric acid, potassium hydroxide (KOH), boric acid, sodium hydroxide (NaOH), sodium bicarbonate, sodium borate and triethanolamine are also suitable for the compositions. of the present invention.
  • Preservatives that may be used in the compositions of the present invention are, for example, antifungals such as benzoic acid, sodium benzoate, butylparaben, methylparaben (Nipagin ® ), propylparaben (Nipasol ® ), ethylparaben, sodium propionate, and antibacterials such as chloride.
  • antifungals such as benzoic acid, sodium benzoate, butylparaben, methylparaben (Nipagin ® ), propylparaben (Nipasol ® ), ethylparaben, sodium propionate, and antibacterials such as chloride.
  • antifungals such as benzoic acid, sodium benzoate, butylparaben, methylparaben (Nipagin ® ), propylparaben (Nipasol ® ), ethylparaben, sodium propionate
  • antibacterials such as chloride.
  • Suitable antioxidant agents for the compositions of the present invention may be selected from the group comprising butylhydroxyanisol (BHA), butylhydroxytoluene (BHT), ⁇ -tocopherol, ascorbic acid, ascorbyl palmitate, sodium metabisulfite, ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA), citric acid, cysteine, glutathione vitamin C, sodium metabisulphite, cysteine and sodium thiosulphate.
  • BHA butylhydroxyanisol
  • BHT butylhydroxytoluene
  • ⁇ -tocopherol ascorbic acid
  • ascorbyl palmitate sodium metabisulfite
  • EDTA ethylenediamine tetraacetic acid
  • citric acid cysteine
  • glutathione vitamin C sodium metabisulphite
  • cysteine and sodium thiosulphate sodium metabisulphite
  • compositions of the present invention may further comprise, as buffering agents, citrate buffer, buffer phosphate and borate buffer.
  • buffering agents citrate buffer, buffer phosphate and borate buffer.
  • flavorings and flavorings can be used, for example, vanilla, menthol, cinnamon oil, anise oil and cocoa.
  • Sweeteners may be, for example, aspartame, dextrose (glucose), mannitol, sorbitol, saccharin, sodium cyclamate, sugar, potassium acesulfame, sucralose and stevioside.
  • compositions of the present invention may further comprise excipients such as bactericides, bacteriostats, antioxidants, preservatives, buffers, stabilizers, pH adjusters, osmolarity adjusters, antifoam and surfactants, and residues of antigen inactivating or fractionating agents, growth media and solvents commonly used in the production of medicines.
  • excipients such as bactericides, bacteriostats, antioxidants, preservatives, buffers, stabilizers, pH adjusters, osmolarity adjusters, antifoam and surfactants, and residues of antigen inactivating or fractionating agents, growth media and solvents commonly used in the production of medicines. Examples of these types of components can be found in The Handbook of Pharmaceutical Excipients, (RAYMOND C.-ROWE, Publisher The Pharmaceutical Press).
  • compositions described in the present invention are available. The particular mode selected will depend upon the particular active ingredient selected, the dosage required for therapeutic efficacy and the patient to whom the composition will be administered.
  • herbal remedies Pharmaceutical and veterinary medicinal products as described above are provided for use in the prevention or treatment of bacterial infections.
  • Kielmeyera aureovinosa and the isolated amarilin compound thereof is another aspect of the present invention the use of compositions comprising the extract or the isolated compound for the prevention or treatment of bacterial infections in animals.
  • Still another aspect of the present invention is methods of preventing or treating bacterial infections in animals, more particularly in humans, using the aureocycline extract and the amarilin compound as well as compositions comprising them.
  • the methods of the present invention can generally be practiced using any mode of administration.
  • biologically acceptable such as oral, rectal, sublingual, topical, nasal, transdermal, inhalation, or parenteral routes.
  • parenteral includes subcutaneous, intravenous, epidural, irrigation, intramuscular, release, or infusion pumps.
  • topical, oral, parenteral, rectal, ocular and inhalation routes are preferred for administration of the compositions claimed herein.
  • Example 1 Process for obtaining and preparing Klelmeyera aureovinosa extract.
  • the extract was prepared from 75g of dry root powder, packed in an extractor where 750mL of 96 ° ethanol is added, ensuring homogenization of the mixture and complete immersion in the liquid, thus remaining for 8h, when the first change is made. of solvents, and then another 16h until a 24h cycle is complete. This extract is then concentrated in a rotary evaporator at low pressure at a temperature of 50 to 70 ° C to give approximately 6g of extract (8% yield).
  • the plant extract is yellow, soluble in ethanol and has a pH between 6.0 and 7.0.
  • the chromatographic profile of Kielmeyera aureovinosa extract was analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC) technique.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the analysis method included isocratic mobile phase (63% acetonitrile: 37% 0.1% phosphoric acid acidified water), sample concentration was 1.0 mg / mL in the mobile phase, the column used was C18 ACE, with dimensions of 250mm X 4.6mm, 5 ⁇ , the running time was 60 minutes. The major peak with retention time of 50 minutes was considered as a chemical marker of the extract ( Figure 3).
  • Example 5 Mass spectrum of the chemical marker isolated from the ethanolic extract of Klelmeyera sp.
  • EXT 103764 samples were dissolved in 80:20 H20 / ACN to approximately 2 mg / mL and then diluted in water to 0.1 mg / mL. This was identified as a mixture of mameisine and isomameisine, two isomers, whose structures are shown in Figures 4B and 4C, respectively.
  • the quantitative evaluation of antibacterial activity was performed by the broth microdilution methodology to determine the minimum inhibitory concentration (MIC), according to the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2006) manual. From the ethanolic extract at 10mg / mL concentration, resuspended in DMSO, serial dilutions (1: 2 ratio) were made in sterile microtiter plates of 12x8 well geometry. Then, in each well was added 10 ⁇ L of bacterial suspension containing about 7x10 6 cells / mL, prepared from recent growth of MRSA strain ATCC 33591 on nutritive agar.
  • MIC minimum inhibitory concentration
  • the plates were developed by adding 25 ⁇ l of 0.01% rezazurin in each well, followed by incubation at 36 ° C for 30min.
  • the direct visualization of the plaque showed that there was inhibition of bacterial growth up to the concentration of 0.83 g / mL, being considered the MIC of the crude extract for the referred MRSA strain.
  • the experiments were performed in quadruplicate at different periods.
  • TLC molten Tryptcasein Soya Agar
  • Example 8 Evaluation of antibiotic activity against species M. fort itvaa ATCC 6841, M. massiliense CRM0019 and CRM 0270, M. abscessus ATCC 19977 and M. smegmatls INCQS 061.
  • the strains used were standardized and derived from clinically significant specimens, presenting a high degree of multidrug resistance.
  • a strain of M. boyis INCQS 062 was also included, as this species is recommended, according to the technical standards of the National Health Surveillance Agency (Anvisa), for the evaluation of efficacy of hospital disinfectant products.
  • Example 9 Toxicological tests of aureocycline extract a) Acute dermal irritation to aureocycline in rabbits
  • the study plan was based on the Guideline OECD 404 and aimed to evaluate the adverse effects, reversible or not, resulting from acute dermal exposure to aureocycline in rabbits.
  • the method consisted of topically dermal application of the test substance to female Oryctolagus cuniculus, treated with a concentration of 80 g / mL of the test substance.
  • test substance was applied in the proportion of 0.5mL / area treated with appropriate syringe and spatula in a quadrant of approximately 6cm 2 of the previously trichotomized dermis to a group of three test systems.
  • the application site was preserved with dressing for 4 hours.
  • An area equivalent to that of the test substance application was left intact on the opposite antigen to serve as a control.
  • test systems were evaluated for signs of erythema, eschar, and edema 60 minutes, 24 hours, 48 hours, and 72 hours after dressing removal. From the 24-hour evaluation, all test systems showed mild (barely noticeable) erythema with reddened skin throughout the application area. Once a sign of irritation was detected due to the application of the test substance, the assay was extended for 14 days. Thus, it is noted that redness persisted for 10 days after administration of the test substance.
  • Discreet peeling of the treated skin was also detected from day 5 and extended throughout the observation period. Throughout the period of exposure to the test substance and observation of the test systems, no visible sign of edema was detected in the treated area compared to the control area.
  • Table 2 Formation of erythema in the aureocycline-treated group test systems.
  • test substance was applied, with graduated syringe, the test substance in the conjunctival sac of the eye. right, after the smooth removal of the lower eyelid.
  • the collateral (left) eye was used as a negative control.
  • the residue of the applied test substance was carefully removed with the aid of gauze soaked in deionized water.
  • Each test system was evaluated separately for the presence of corneal, iris, and eyelid conjunctival lesions, as well as other severe local and systemic changes.
  • the eyes were examined after 1, 24, 48 and 72 hours after test substance administration and daily during the observation period (6 days). To aid in the assessment of eye reactions, fluorescein eye drops were used at 24, 48 and 72 hours.
  • the assessment of ocular reactions was based on the Draize scale, which describes the gradations attributed to ocular reactions, such as: opacity, corneal area involved, ulceris, hyperemia, chemosis and secretion.
  • the study aimed to evaluate the toxic effects of acute dermal exposure to aureocycline in rats. This trial was based on the Guideline OECD 402 and was conducted according to study plan 42011.
  • the method consisted of topically dermal application of the test substance to a group of male test systems evaluated only at the highest concentration (250 g / mL).
  • a control group received only the placebo of the test substance (Placebo aureocycline).
  • the application site was preserved with a bandage for approximately 24 hours. Body weight and water and feed intake of the test systems were recorded.
  • test systems were euthanized and macroscopically examined. Acute administration of the test substance at all concentrations evaluated, as well as of the Placebo aureocycline in the treated and control group test systems did not induce changes in clinical evaluations, body weight and feed and water consumption that could be related to toxicity or lethality.
  • Table 3 Mean body weight (g) in aureocycline-treated and control groups.
  • Table 4 Average weekly feed intake (g) per test system of control and aureocycline treated groups.
  • Table 5 Average weekly water consumption (mL) per test system of control and aureocycline treated groups.
  • Table 6 Body weight (g) of test systems of control and aureocycline treated groups.
  • 3T3 murine fibroblasts were seeded on two plates 96 wells. One of these plates was used to provide the cytotoxicity curve of the control substance Duodecyl Sodium Sulphate (SDS), and the other provided the first cytotoxicity profile of this cell line at the target substance concentrations used. This first profile provided the range finder where the IC50 can be determined, which is set at a second time (IC 5 the finder).
  • SDS Duodecyl Sodium Sulphate
  • Phase C (*) (lmg / ml of standard extract comprises 60% in marker molecules)

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Abstract

A presente invenção se refere a um extrato vegetal obtido de Kielmeyera aureovinosa que possui acentuada atividade antibiótica. Em uma segunda modalidade, a invenção descreve um novo composto químico isolado do mesmo, bem como variações deste. Em outras modalidades, a presente invenção fornece composições fitoterápicas compreendendo o referido extrato vegetal, assim como composições farmacêuticas veterinárias compreendendo o composto isolado e variações do mesmo. Adicionalmente, são providos usos do extrato vegetal, compostos químicos e composições compreendendo os mesmos para a preparação de medicamentos para tratamento de infecções bacterianas e métodos de prevenção ou tratamento das mesmas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: "EXTRATO VEGETAL OBTIDO DE KIELMEYERA AUREOVINOSA COM ATIVIDADE ANTIBIÓTICA, COMPOSTO QUÍMICO ISOLADO, COMPOSIÇÕES COMPREENDENDO OS MESMOS, SEUS USOS E MÉTODOS DE PREVENÇÃO E TRATAMENTO DE INFECÇÕES BACTERIANAS".
A presente invenção se refere a extratos vegetais obtidos da espécie vegetal Kyelmeiera aureovinosa, da Família Clusiaceae, nativa e coletada no Brasil, que possui atividade antibiótica acentuada.
A presente invenção se refere também ao composto químico 5-hidroxi-8, 8-dimetil-6- (iso-propil) -4-aril-4H- cicloexeno- [2 , 3-h] chromen-2-ona (amarilina) , isolado do extrato vegetal de Kyelmeiera aureovinosa, que também possui alta atividade antibiótica, bem como a variações do mesmo .
A presente invenção se refere ainda a composições fitoterápicas compreendnedo o referido extrato vegetal de Kyelmeiera aureovinosa .
A presente invenção fornece também composições farmacêuticas ou veterinárias compreendendo o princípio ativo amarilina.
A presente invenção prevê ainda o uso das referidas composições na prevenção ou tratamento de infecções bacterianas. Por último, a presente invenção se refere a métodos para prevenir ou tratar infecções bacterianas.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Dos medicamentos fitoterápicos
Atualmente, estima-se que em torno de 25% dos medicamentos produzidos e distribuídos internacionalmente compreendem substâncias de origem vegetal como princípios ativos (Bourgaud, F. ; Gravot, A.; Milesi, S . ; Gontier, E.
(2001), Production of plant secondary metabolites: a historical perspective. Plant science, v.161, p. 839-851). Das 877 novas pequenas moléculas químicas introduzidas como drogas no período de 1981 a 2002, 61% tiveram origem ou foram inspiradas em compostos naturais (NEWMAN, D.J., CRAGG, G.M., SNADER K.M. 2003. Natural Products as Sources of New D^gs over the Period 1981-2002. J. Nat . Prod., 66, 1022-1037), incluindo produtos naturais isolados diretamente (6%), seus derivados semissintéticos (27%), compostos sintéticos com farmacóforos derivados de produtos naturais (5%) e compostos sintéticos modelados com base em moléculas naturais, isto é, mimetizando produtos naturais,
(23%).
O uso de ervas medicinais e produtos derivados das mesmas é bem difundido na medicina tradicional, cuja base é a experiência documentada pelo homem, na terapia e profilaxia de diversas doenças. Tais produtos ganharam popularidade crescente na última década em países desenvolvidos, onde chegam a ser usados por cerca de 20% das respectivas populações. Medicamentos fitoterápicos são misturas complexas de substâncias orgânicas que podem vir de qualquer parte de uma planta bruta ou processada, incluindo folhas, caules, flores, raízes e sementes.
Nos países em desenvolvimento, cerca de 80% da população depende de modalidades tradicionais de terapia, inclusive com medicamentos provenientes de plantas, para manutenção da saúde e para tratamento de doenças (B. VAN BREEMEN, Richard, FONG, Harry H. S. e FARNSWORTH, Norman R., The Role of Quality Assurance and Standardization in the Safety of Botanical Dietary Supplements. Chem Res Toxicol. 2007 April; 20(4): 577-582). Tal realidade é muito comum em países da América Latina e da África, por exemplo. Dos Flavonoides
Entre os grupos de substâncias químicas naturais encontradas nas plantas estão os flavonoides. O grupo dos flavonoides é um dos maiores e mais amplamente distribuídos entre as famílias botânicas, abrangendo várias classes de moléculas químicas, tendo em comum uma estrutura básica C6~ C3-C6, e são classificadas segundo o grau de oxidação do núcleo1 pirânico central, que também pode ser linear (como nas chalconas) ou fundido a um anel furânico (como nas auronas) .
Uma dieta baseada em vegetais é rica em flavonoides, acredita-se que estes sejam extremamente importantes para a saúde humana, pois agem como antioxidantes naturais, oferecendo proteção contra doenças cardiovasculares e certos tipos de câncer (DE ICK, P.M.1997. Medicinal Natural Products - A Biossynthetic Approach, John Wiley & Sons Ed., Chichester, England) .
Uma das classes de substâncias de origem natural pertencentes ao grupo dos flavonoides é a dos neoflavonoides, moléculas compostas por 15 átomos de carbono, agrupadas segundo sua estrutura molecular e origem. Entre os tipos de compostos pertencentes a esta classe estão as 4-arilcumarinas e as dalbergionas .
Sabe-se que certos neoflavonoides apresentam atividade antimicrobiana, anti-protozoária, citotóxica, quimiopreventiva e inibidora de transcriptase reversa especifica para vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) (PATIL, A. D., FREYER, A. J., EGGLESTON, D. S., HALTIWANGER, R. C, BEAN, M. F . , TAYLOR, P. B . , CARANFA, M. J., BREEN, A. L., BARTUS, H. R . , JOHNSONR. K., HERTZBERG, R. P. & WESTLEY, J. W. 1993. The inophyllums, novel inhibitors of HIV-1 reverse transcriptase isolated from the alaysian tree, Calophyllum inophyllum Linn. Journal of medicinal Chemistry, 36, 4131-4137; ITOIGAWA, . , ITO, C, TAN, H . T . , KUCHIDE, M . , TOKUDA, H . , NISHINO, H. & FURUKAWA, H . 2001.Cancer chemopreventive agents, 4- phenylcoumarins from Calophyllum inophyllum. Câncer Letters, 169, 15-19/ B. M. W . OUAHOUO, A. G. B. AZEBAZE, M. MEYER, B. BODO, Z. T. FOMUM and A. E. NKENGFACK . Cytotoxic and antimicrobial coumarins from Mammea africana. Annals of Tropical Medicine & Parasitology, Vol. 98, No. 7, 733-739 (2004)).
Conforme mencionado anteriormente, os flavonoides são amplamente distribuídos entre as famílias botânicas, dentre as quais podemos destacar a família Clusiaceae, à qual pertence o género Kielmeyera. Essa Família apresenta cerca de 1000 espécies distribuídas em trinta géneros encontrados na zona pantropical. No Brasil, existem dezoito géneros e cerca de 150 espécies ( SOUZA V., LORENZI H. 2005. Botânica sistemática: guia ilustrado para identificação de famílias de angiospermas da flora brasileira. São Paulo: Instituto Plantarum, p. 348), sendo o género Kielmeyera endémico da América do Sul (BENNETT, G. J. & LEE, H.-H. (1989). Xanthones from Guttiferae. Phytochemistry, 28, 967-998). Estudos com espécies deste género verificaram a ocorrência de algumas classes de substâncias químicas, entre elas as 4-alquilcumarinas, 4-arilcumarinas (neoflavonoides) e as xantonas .
Das infecções por microrganismos mui irresis tentes
As infecções hospitalares são consideradas o principal fator associado à morbidade e mortalidade em ambientes nosocomiais, em praticamente todos os continentes. Nesse aspecto, a espécie bacteriana Staphylococcus aureus tem sido considerada o principal agente etiológico associado a essas infecções, que podem resultar em condições de alta morbidade, como endocardites infecciosas e septicemias (SADER, H.S.; GALES, A.C.; PFALLER, M.A.; ZOCCOLI, C; BARTH, A & JONES, R.N. Pathogen frequency and resistance patterns in Brazilian hospitais. Summary of results from three years of the SENTRY antimicrobial surveillance program. Braz. J. Infect. Dis., 5, 200-214, 1999; ENRIGHT, M.C. 2003. Curr Opin Pharmacol. The evolution of a resistant pathogen - the case of MRSA. 3: 474-479; FOWLER, . ; WANN, E.R.; JOH, D.; JOHANSSON, S.; FOSTER, T.J. & HOOK, M. Cellular invasion by Staphylococcus aureus involv.es a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMS and host cell betai integrins. Eur. J. Cell Biol . , 79, 672-679, 2000; DIEKEMA DJ, PFALLER MA, SCHMITZ FJ, SMAYEVSKY J, BELL J, JONES RN, BEACH M; SENTRY Participants Group. Survey of infections due to Staphylococcus species: frequency of occurrence and antimicrobial susceptibility of isolates collected in the United States, Canada, Latin America, Europe, and the Western Pacific region for the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program, 1997-1999. Clin Infect Dis. 32 Suppl 2 :S114-32, 2001) .
Têm sido descritos surtos hospitalares pós-operatórios por microrganismos multirresistentes ( CR) associados a procedimentos invasivos, bem como a higienização inadequada da instrumentação e/ou próteses cirúrgicas . A contaminação leva a quadros de infecções cutâneas em feridas operatórias, celulite, abscessos com profundidade variável em sítios anatómicos diversos, pneumonia pós-aspiração, ceratites, otite média e mastoidite, bacteremia, osteomielite, linfadenites, endocardites relacionadas a cirurgias cardíacas e infecções associadas ao sistema nervoso central, como meningites.
As cepas de S. aureus apresentam uma ampla capacidade adaptativa, possuindo diversos fatores de virulência, os quais têm sido associados a sua alta capacidade invasiva e atividade patogênica. Variantes resistentes dessa espécie amplamente disseminadas nos ambientes nosocomiais, denominadas "Methicillin-resistant Staphylococcus aureus" (Staphylococcus aureus resistentes a meticilina - MRSA) , apresentam, geralmente, altos níveis de resistência à maioria das classes de antimicrobianos disponibilizados para uso comercial e hospitalar, resultando, em última análise, na escolha de terapias empíricas inapropriadas, demora na prescrição de antimicrobianos eficazes, bem como no uso de drogas menos eficientes, mais tóxicas e caras. Todos esses fatores contribuem para dificultar o controle epidemiológico e tratamento de infecções associadas a esse agente bacteriano.
A resistência à meticilina por parte de um microrganismo é um indicador de resistência a todos os antibióticos beta-lactâmicos, incluindo cefalosporinas e carbapenemas . Microrganismos resistentes exibem frequentemente resistência cruzada a aminoglicosídeos, lincosaminas, macrolídeos, tetraciclinas, trimetoprimas e sulfonamidas (RIBEIRO, Isabel e CASTANHEIRA, Rui. Tratamento e prevenção das infecções e da colonização por Staphylococcus aureus . In Rev Port Pneumol IX (5): 395-409. Porto, 2003) .
As amostras clínicas de MRSA permaneceram, por muito tempo, sensíveis aos glicopeptídeos (NNISS, 2001) . Porém, desde 1996, casos de resistência intermediária à vancomicina em cepas de S. aureus têm sido relatados (HIRAMATSU, K.; HANAKI, H.; INO, . YABUTA, K. ; OGURI, T. & TENOVER, F.C. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus clinicai strain with reduced vancomycin susceptibiliy . J. Antimicrob. Chemother., 40, 135-136, 1997; SMITH, T.L.; PEARSON, M.L.; WILCOX, K.R.; CRUZ, C; LANCASTER, M.V.; SWANEY SM, AOKI H, GANOZA MC. The oxazolidinone linezolid inhibits initiation of protein synthesis in bactéria. Antimicrb Agents Chemother 1998;42:3251-3255) e mais recentemente, casos esporádicos nos Estados Unidos e no Japão revelaram resistência plena a esse antibiótico (Centers of Diseases Control and Hospital Epidemiology - CDC - Staphylococcus aureus resistant to vancomycin. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep . , 51, 565-567, 2002; CHANG, S ..; SIEVERT, D.M.; HAGEMAN, J.C.; BOULTON, M . L . ; TENOVER, F.C.; DOWNES, F.P.; SHAH, S.; RUDRIK, J.T.; PUPP, G.R.; BROWN, W.J.; CARDO, D. & FRIDKIN, S.K. Brief report : infection with vancomycin-resistant Staphylococcus aureus containing the vanA resistance gene. N. Engl. J. Med., 348, 1342-1347, 2003) . No Brasil, já foram isoladas cepas apresentando resistência intermediária à vancomicina (MAMIZUKA EM, OLIVEIRA GA. Isolamento de cepas de Staphylococcus aureus com sensibilidade reduzida a vancomicina em hospital brasileiro. Pharm Bras 6: 7-8, 2000) .
Sμgere-se que a disseminação de MRSA no ambiente hospitalar ocorre principalmente pela transmissão cruzada entre pacientes infectados ou colonizados e a equipe de saúde atuante (NOGUERAS, M . , MARI SALTA, N . , ROUSSELL, M. & NOTÁRIO, R. Importance of hand germ contamination in health-care orkers as possible carriers of nosocomial infections. Rev. Inst. Med. Trop. S. Paulo. 43: 149-152. 2001, WEBER, S., HERWALDT, L.A., MCNUTT, L.A. An outbreak of Staphylococcus aureus in a pediatric cardiothoracic surgery unit. Infect. Control Hosp. Epidemiol. 23: 77-81, 2002), podendo ocorrer também através da contaminação de fômites de uso comum e superfícies (SCOTT, E. & BLOOMFIELD, S.F. The survival and transfer of microbial contamination via cloths, hands and utensils. J. Appl . Bacteriol. 68: 271-8, 1990; RIBEIRO, I. CASTANHEIRA, R.R. Treatment and prevention of Staphylococcus aureus. Port Pneumol. 5: 395- 409. , 2003) .
Os principais fatores de risco associados ao desenvolvimento de infecções por MRSA incluem a hospitalização ou cirurgia recente, internação por longo período, diálise e aplicação de drogas intravenosas (RIBEIRO, I. CASTANHEIRA, R.R. Treatment and prevention of Staphylococcus aureus. Port Pneumol. 5: 395-409, 2003). Após a contaminação, as bactérias inicialmente colonizam sítios de entrada, tais como a pele, feridas, ou áreas de interface entre dispositivos médicos invasivos e a pele, tais como cateteres ou sondas, e a partir dai iniciam um foco infeccioso, sendo carreadas para o interior do organismo, podendo iniciar uma infecção sistémica ( ENZEL RP, PERL TM: The significance of nasal carriage of Staphylococcus aureus and the incidence of postoperative wound infection. J Hosp Infect 31: 13-24, 1995). É uma estratégia interessante, portanto, o controle preventivo de contaminação desses sítios, através da aplicação direta de agentes antimicrobianos tópicos (Ribeiro e Castanheira, 2003) .
Apesar de serem considerados patógenos essencialmente hospitalares, tem sido observado, de maneira preocupante, que cepas de MRSA extremamente virulentas têm migrado para a comunidade (denominadas CA-MRSA) , ocasionando infecções severas em indivíduos sadios, tais como crianças em idade escolar, atletas, militares e presidiários (LINDENMAYER, J.M., SCHOENFELD, S., 0'GRADY, R. & CARNEY, J. . Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a high school wrestling team and the surrounding community. Arch. Intern. Med . , 158, 895-899, 1998; SAID-SALIM, B . ; MATHEMA, B. & KREISWIRTH B.N. Community-acquired methicillin- resistant Staphylococcus aureus: an emerging pathogen. Infect. Control Hosp. Epidemiol., 24, 451-455, 2003; ELLIS, M.W., HOSPENTHAL, D.R., DOOLEY, D. P., GRAY, P.J., MURRAY, C.K., 2004. Clin. Infect. Dis. Natural history of community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus colonization and infection in soldiers .39 : 971-979; KAZAKOVA, S.V.; HAGEMAN, J.C.; MATAVA, M. ; SRINIVASAN, A . ; PHELAN, L . ; GARFINKEL, B . ; BOO, . ; MCALLISTER, S.; ANDERSON, J. ; JENSEN, B . ; DODSON, D . ; LONSWAY, D. ; MCDOMGAL, L.K.; ARDUINO, . ; FRASER, V.J.; KILLGORE, G . ; TENOVER, F.C.; CODY, S. & JERNIGAN, D.B. A clone of methicillin-resistant Staphylococcus aureus among professional football players. N. Engl. J. Med., 352, 468- 475, 2005/ ROMANO, R.; LU, D. & HOLTON, P. Outbreak of community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus skin infections among a collegiate football team. J. Athl. Train., 41, 141-145, 2006). Verifica-se que a transmissão, nesses casos, ocorre principalmente por contato físico, através de microlesões na pele. Tais cepas têm sido associadas a infecções cutâneas e em tecidos moles, como celulites e abscessos (HEROLD, B.C.; IMMERGLUCK, L.C.; MARANAN, M.C.; LAUDERDALE, D.S.; GASKIN, R.E.; BOYLE-VAVRA, S.; LEITCH, C.D. & DAUM, R.S. Community acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus in children with no identified predisposing risk. JAMA, 279, 593-598, 1998) . No entanto, têm sido descritos casos envolvendo bacteremias e pneumonias letais fulminantes em pacientes jovens e sadios (BOUSSAUD, V.; PARROT, A.; MAYAUD, C; WISLEZ, M .; ANTOINE, M . ; PICARD, C; DELISLE, F.; ETIENNE J. & CADRANEL J. Life-threatening hemoptysis in adults with community-acquired pneumonia due to Panton- Valentine leukocidin-secreting Staphylococcus aureus. Intensive Care Med., 29, 1840-1843, 2003; KLEIN, J.L.; PETROVIC, Z.; TREACHER, D. & EDGE ORTH, J. Severe community-acquired pneumonia caused by Panton-Valentine leukocidin-positive Staphylococcus aureus: first reported case in the United Kingdom. Intensive Care Med., 29, 1399, 2003; VAN DER FLIER, M . ; VAN DIJK, N.B.; FLUIT, A.C.; FLEER, A.; WOLFS, T.F. & VAN GESTEL J.P. Fatal pneumonia in an adolescent due to community-acquired methicillin- resistant Staphylococcus aureus positive for Panton- Valentine-leukocidin . Ned. Tijdschr. Geneeskd., 147, 1076- 1079, 2003) .
Da terapia fitoterápica das infecções
Atualmente, a única alternativa farmacológica comercialmente disponível para o tratamento de infecções complicadas por bactérias multirresistentes são os glicopeptídeos , tais como a vancomicina e a teicoplanina, os quais são passíveis de administração somente por via intravenosa, e são considerados ototóxicos e nefrotóxicos, além de caros. Estudos já abordaram comparativamente a atividade de preparados tópicos elaborados com extratos vegetais em contraposição a produtos antimicrobianos preconizados, na prática clinica, para o tratamento de infecções por MRSA. Por exemplo, Caelli e colaboradores (2000) observaram que, quando considerados dois grupos distintos de pacientes inicialmente infectados por MRSA, sendo um submetido ao tratamento de preparados com extratos vegetais de espécies de Malaleuca sp. (intervenção - aplicação nasal a 4% e banho a 5%) e outro grupo de indivíduos tratados com antimicrobianos tópicos tradicionais, tais como mupirocina a 2% e triclosan (controle) , houve maior percentual de eliminação de MRSA dos pacientes tratados com extratos vegetais. Em extenso trabalho investigativo, Quave e colaboradores (2008), avaliaram 104 espécies de plantas medicinais e não medicinais originárias do sul da Itália, e observaram que a maioria das que apresentaram atividade anti-MRSA foram identificadas como não medicinais, isto é, não utilizadas para esse fim na medicina tradicional. Os valores da concentração inibitória mínima (CIM) dos extratos vegetais obtidos dessas espécies, no entanto, variaram de 256 a 512 yg/mL. No mesmo estudo, quando avaliada a atividade desses extratos contra a formação de biofilmes por MRSA ín vitro, foi observado que dez espécies apresentaram valores de CIM menores que 32 μ /πιΙ
A atividade antimicrobiana de um extrato metanólicos metanólico obtido de uma espécie vegetal comum na África do Sul {Helichrysum pedunculatum) contra várias espécies bacterianas patogênicas foi avaliada. A amostra apresentou valor de CIM igual a 5000 μg/mL contra uma cepa de MRSA (Aiyegoro O.A., Okoh A.I. Phytochemical Screening and Polyphenolic Antioxidant Activity of Aqueous Crude Leaf Extract of Helichrysum pedunculatum. International Journal of Molecular Sciences. 2009; 10 ( 11 ): 990-5001 ) .
Com o intuito de averiguar se os extratos vegetais ou compostos isolados dos mesmos poderiam ser usados como coadjuvantes no tratamento de infecções bacterianas, visando a administração dos fármacos tradicionais em menor concentração, foi avaliada, no mesmo estudo, a ocorrência de sinergismo entre os extratos e antimicrobianos comumente preconizados na prática clinica. Contudo, observou-se que não houve qualquer alteração dos valores normais de CIM contra MRSA para os antimicrobianos testados.
OBJETIVOS DA INVENÇÃO
Constitui um objetivo da presente invenção, fornecer extratos vegetais de Kielmeyera aureovinosa possuindo atividade antibiótica.
Em particular, constitui um objetivo da presente invenção, fornecer extratos vegetais de Kielmeyera aureovinosa possuindo atividade antibiótica obtido das raízes de Kielmeyera aureovinosa.
Especificamente, os extratos vegetais de Kielmeyera aureovinosa possuindo atividade antibiótica são obtidos por extração com solvente orgânico.
Mais especificamente, os extratos vegetais de Kielmeyera aureovinosa possuindo atividade antibiótica são extraídos com um solvente selecionado do grupo compreendendo, mas não limitado a metanol, etanol, acetato de etila e hexano.
Particularmente, os extratos vegetais de Kielmeyera aureovinosa cuja concentração inibitória mínima (CIM) , em teste de microdiluição em caldo, contra Staphylococcus aureus é menor ou igual a 1 g/mL.
Especificamente, os extratos vegetais de Kielmeyera aureovinosa da presente invenção são caracterizados por compreender uma concentração superior a 60% dos marcadores químicos mameisina e isomameisina
Constitui também um objetivo da presente invenção fornecer o composto 5-hidroxi-8 , 8-dimetil-6- ( iso-propil ) -4- aril-4H-cicloexeno- [2, 3-h] chromen-2-ona, denominado amarilina, isolado dos extratos vegetais de Kielmeyera aureovinosa. Particularmente, a concentração inibitória mínima (CIM) do composto amarilina em teste de microdiluição em caldo contra Staphylococcus aureus é menor ou igual a 1 μς/πιΐΐ..
Constitui outro objetivo da presente invenção, o fornecimento de composições fitoterápicas compreendendo extratos vegetais de Kíelmeyera aureovinosa e excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
Particularmente, as composições fitoterápicas compreendendo extratos vegetais de Kielmeyera aureovinosa da presente invenção são destinadas a administração tópica.
Mais particularmente, a forma farmacêutica das composições fitoterápicas compreendendo extratos vegetais de Kíelmeyera aureovinosa, para uso tópico, pode ser seleciOnada do grupo compreendendo, mas não limitado a emulsão, gel-creme, pomada, creme, gel, sabão e pasta.
Particularmente, as composições fitoterápicas compreendendo extratos vegetais de Kielmeyera aureovinosa da presente invenção são destinadas a administração oral.
Mais particularmente, a forma farmacêutica das composições fitoterápicas compreendendo extratos vegetais de Kielmeyera aureovinosa, para 'uso oral, pode ser selecionada do grupo compreendendo, mas não limitado a drágea, cápsula, xarope, suspensão solução e comprimido. Um outro objetivo da invenção é o fornecimento de composições farmacêuticas ou veterinárias compreendendo o composto 5-hidroxi-8, 8-dimetil-6- (iso-propil) -4-aril-4H- cicloexeno- [2 , 3-h] chromen-2-ona (amarilina) isolado e excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
Particularmente, as composições farmacêuticas ou veterinárias compreendendo o composto amarilina podem ser destinados a administração tópica.
Mais particularmente, forma farmacêutica das composições farmacêuticas ou veterinárias compreendendo o composto amarilina, para uso tópico, pode ser selecionada do grupo compreendendo, mas não limitado a pomada, creme, gel, sabão, loção, emulsão, gel-creme e pasta.
Particularmente, as composições farmacêuticas ou veterinárias compreendendo o composto amarilina podem ser destinados a administração oral.
Mais particularmente, forma farmacêutica das composições farmacêuticas ou veterinárias compreendendo o composto aamarilina, para uso tópico, pode ser selecionada do grupo compreendendo, mas não limitado a pó, granulado, comprimido, drágea, cápsula, solução, xarope e suspensão.
Particularmente, as composições farmacêuticas ou veterinárias compreendendo o composto amarilina podem ser destinadas a administração parenteral. Mais particularmente, constitui objetivo da presente invenção fornecer composições conforme as descritas acima para uso na prevenção ou tratamento de infecções bacterianas .
Constitui mais um objetivo da presente invenção o uso dos extratos vegetais de Kielmeyera aureovinosa, do composto amarilina ou de uma composição compreendo os mesmos para preparar um medicamento para prevenção ou terapia de infecções bacterianas.
Outro objetivo da presente invenção consiste em um método para prevenção ou tratamento de infecções bacterianas com o uso dos extratos vegetais de Kielmeyera aureovinosa, do composto amarilina ou de uma composição compreendo os mesmos para preparar um medicamento para prevenção ou terapia de infecções bacterianas.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
As figuras a seguir fazem parte do presente relatório e estão aqui inclusas a fim de ilustrar determinados aspectos da invenção. 0 objeto da presente invenção pode ser melhor entendido com referência a uma ou mais dessas figuras, em combinação com a descrição detalhada da modalidade preferida aqui apresentada.
Na Figura 1 são apresentadas fotografias da cromatografia de camada fina (CCF) do extrato etanólico de raízes de Kielmeyera aureovinosa sob luz ultravioleta nos comprimentos de onda λ 254 nm e 365 nm, respectivamente. 0 eluente usado foi uma mistura tolueno : acetato de etila na proporção de 93:7, onde se pôde evidenciar a presença da substância majoritária (em 254 e 365 nm) e cumarinas (bandas em azul no comprimento de onda de 365 - sinalizadas com ♦-) . Os esquemas em preto e branco* ressaltam as bandas que se deseja evidenciar.
Na Figura 2, é apresentada uma fotografia de três CCF evidenciando a presença de terpenoides (bandas arroxeadas) , flavonoides (bandas amarelas) e fenóis (bandas marrons), através da revelação com vanilina sulfúrica, NPPEG e cloreto férrico, respectivamente (que podem ser evidenciados através da <-. 0 eluente usado foi uma mistura de tolueno : acetato de etila na proporção de 93:7. Os esquemas em preto e branco ressaltam as bandas que se deseja evidenciar.
Na Figura 3, é ilustrado o perfil cromatográfico do extrato de Kielmeyera aureovinosa através da técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) , que apresenta um pico majoritário com tempo de retenção de 50 minutos, considerado como marcador químico do extrato.
A Figura 4 mostra máximos de absorção em (a) espectro de absorção no ultravioleta do marcador químico do extrato mostrando valores máximos de absorção para dois comprimentos de onda (Àmax 282 e 335 nm - sinalizados com i). A estrutura das substâncias isoladas como marcadores químicos também pode ser encontrada nesta figura em (b) mameisina e (c) isomameisina . Em (d), é mostrada a estrutura química inédita do composto 5-hidroxi-8 , 8- dimetil-6- (iso-propil) -4-aril-4H-cicloexeno- [2, 3-h] chromen- 2-ona, denominado amarilina, que foi isolado do pico marcador principal do extrato fitoterápico.
A Figura 5 ilustra o espectro de massas do marcador químico isolado do extrato etanólico de Kielmeyera sp., que apresentou, em modo negativo, um pico do íon molecular em m/z = 405,1713 [M-H] - relativo a fórmula molecular C25H2605 (evidenciado por j. ) .
A Figura 6 ilustra ensaios realizados para atividade antimicrobiana . Em 6A, é mostrada uma placa com meio de cultura onde foi avaliado o aspecto qualitativo, através da metodologia de difusão em ágar nutritivo semeado (Drop- Test) . Em 6B, são mostrados, em vista superior, os tubos usados no ensaio de concentração inibitória mínima do extrato EXT 1Ô3764 quando testado contra cepa multirresistente de MRSA padronizada ATCC 33591. Concentração inicial: 85C^g/mL. Resultado obtido para CIM: 0, 83 g/mL. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A planta da qual foi obtido o extrato da presente invenção, denominado arbitrariamente EXT 103764 ou aureociclina, é uma espécie do género até então não descrita na literatura, colhida sob a Autorização Especial do CGEN/ MA N°16/2006, renovada por publicação no D.O.U. 15:55, de 22 de janeiro de 2009. De acordo com as normas da Legislação Brasileira, subamostras da planta podem ser encontradas em herbário fiel depositário (RFA) sob número 25756.
Descrição botânica da planta Kielmeyera aureovínosa.
Plantas Kielmeyera aureovínosa, da família Clusiaceae, são plantas monóicas possuindo estruturas vegetativas aéreas glabras, com látex escasso, espesso e amarelo. Plantas desta espécie apresentam ainda sistema subterrâneo esparsamente fasciculado, raízes robustas, superfície da casca papirácea, amarelada, desfolhante. Arvoreta medindo 6 a 8 metros de altura, diâmetro medindo 12 a 20cm, caule e ramos laterais desenvolvidos com brilho metálico-acetinado, vinosos com faixas transversais douradas desfolhando-se em membranas papiráceas espiraladas transversais; ramos jovens delgados, cilíndricos a triangular-arredondados e estriados. As folhas são inteiras, alternas espiraladas; pecíolo delgado, estriado, canaliculado, com 2 a 4 cm de comprimento; lâmina obovada a elíptica, com base aguda ou cuneada, às vezes ligeiramente assimétrica, ápice obtuso arredondado, às vezes apiculado, raro agudo ou emarginado; nervura central delgada impressa na face adaxial e proeminente na face abaxial; possui ainda entre 15 e 22 nervuras secundárias em ambos os lados, proeminentes em ambas as faces; nervuras intersecundárias subparalelas e reticulação evidente em ambas as faces; nervura marginal alaranjada (in sicco) ; segmentos translúcidos amarelos {in sicco) e ovóides, oblóides ou fusiformes, esparsamente distribuídos nas proximidades da margem. As inflorescências são presentes em tirsos corimbiformes paucifloros, hemisféricos; ramos articulados, estriados; pedicelos estriados com 1 a 1,5 cm de comprimento. Flores pentâmeras, actinomorfas; botões florais ovóides, cálice dialissépalc, sépalas ovadas, ápice agudo-arredondado, ciliadas, desiguais, com dimensões de 0, 35x0, 55-0, 5x0, 6-0, 5x0, 7cm; corola dialipétala, pétalas oblongo-obovadas, ápice truncado-arredondado, ciliadas, ligeiramente assimétricas, com dimensões de 1 ,4-2x1-1 , 5cm; androceu polistêmone, filetes delgados, comprimidos, glabros, anteras basifixas, rimosas, oblóides ou obovóides, base e ápice truncados com 0,1 a 0,15 cm de comprimento; gineceu 3-carpelar, glabro, ovário súpero, estriado, 3-locular, muitos óvulos em cada lóculo., ca. 0,5cra de comprimento, estilete terminal, ca. 0,6cm de comprimento, papilas estigmáticas ovóides, ca. 0,1 cm de comprimento. Não são observados frutos.
Extrato Vegetal de Planta da Família Clusiaceae
Plantas da família Clusiaceae são utilizadas na medicina popular para tratamento de desordens abdominais, dor nas costas, resfriados, conjuntivite, tosse, dismenorreia, dor de cabeça, picada de cobra e de escorpião.
Através da analise química, o extrato 103764 (aureoçiclina) , extraído da espécie Kielmeyera aureovinosa , da família Clusiaceae, demonstrou a presença de cumarinas, terpenoides, ácidos graxos e flavonoides. 0 perfil químico desenvolvido por CCF indica a presença de flavonoides no extrato etanólico, evidenciados pela coloração amarela revelada através do reagente NPPEG (composto por dois reagentes NP "Naturstoff Reagenz A", éster 2-amino-etílico do ácido difenilbórico e PEG (polietilenoglicol 4080) (Figura 1) . Outros grupos de substâncias químicas foram identificados por CCF através de suas reações com reagentes específicos (KOH 10% em etanol e cloreto férrico) cujas colorações indicaram a presença de cumarinas (manchas azuladas) e fenóis (marrom) (Figura 2) .
A natureza dos marcadores químicos indicando a presença de neoflavonoides foi indicada pelos máximos de absorção em Xmax 282 e 335 nm observados no espectro UV do mesmo (Figura 4a) . Os marcadores químicos apresentaram tempo de retenção de 50 minutos. Seu peso molecular foi determinado pelo espectro de massas de alta resolução como sendo de 406, relativo a fórmula molecular C25H26O5, através da presença do íon molecular em modo negativo m/z = 405.1713 [M-H]- (Figura 5). A identificação de uma mistura das estruturas de dois neoflavonoides ou 4-aril-cumarinas, mameisina (1) e isomameisina (2) (Figuras 4b e c respectivamente), como sendo as substâncias majoritárias foram confirmadas por análises espectroscópicas de Ressonância Magnética Nuclear.
O fracionamento químico aliado aos ensaios biológicos possibilitou a observação da atividade antimicrobiana singular de algumas frações do extrato, as quais apresentaram valores de concentração inibitória mínima (CIM) muito significativos.
Através da metodologia de microdiluição em caldo, o extrato alcoólico bruto (ressupenso em DMSO) da amostra de Kielmeyera sp. (aureociclina) , o extrato vegetal do presente pedido de patente, apresentou valor de atividade antimicrobiana quantitativa CIM de 0,83 g/mL. Tal atividade é, até o presente, inédita, considerando um extrato vegetal bruto. Conforme mencionado, atualmente a mupirocina é amplamente utilizada no ambiente hospitalar como um dos principais agentes tópicos antiestafilocócicos, apresentando valor de CIM estimado em 0,5yg/mL (FARIAS, W.V., SADER, .H.S., LEME, I . L . , PIGNATARI , A.C. Rev . Assoe. Med. Bras. Sensitivity pattern of 117 clinicai isolates of Staphylococcus aureus from 12 hospitais. 43: 971-979, 1997). No entanto, esse é o valor atribuído à molécula pura de mupirocina, cuja obtenção é dependente de processos de extração e purificação relativamente onerosos. Além disso, determinadas características decorrentes da formulação de produtos contendo mupirocina são altamente restritivas ao uso clínico, como a alta nefrotoxicidade dos excipientes utilizados e impossibilidade de uso em áreas de queimaduras.
0 estudo fitoquímico do extrato etanólico da amostra de que trata o presente pleito demonstrou uma composição rica em fenóis, terpenoides e cumarinas (majoritariamente) , que demonstrou CIM menor que 1 g/mL para S. aureus-MRSA através do teste de microdiluição em caldo, enquanto que um antimicrobiano comercial (cloridrato de ciprofloxacino) usado como parâmetro de referência apresenta valores de CIM de l g/mL. A observação num extrato vegetal de atividade antibiótica tão intensa contra S. aureus é inédita até o momento.
Na presente invenção, outras formas de preparação do extrato vegetal também foram apresentadas, já que características de polaridade podem modificar a qualidade e a quantidade de extração de substâncias e consequentemente, a atividade.
O extrato vegetal da presente invenção demonstrou baixa atividade citotóxicà in vitro em culturas de células eucarióticas de mamíferos (células de ovário de hamster - CHO) , com a uma concentração de extrato de 12μg/mL apresentando níveis de proteção celular de 73%, em média. Testes de citotoxicidade independentes conduzidos in vitro sobre fibroblastos humanos e sobre fibroblastos murinos (linhagem 3T3) mostraram concentrações citotóxicas da ordem de 11 μg/mL para uma proteção de 80%.
A concentração inibitória mínima apresentada pelo extrato vegetal da presente invenção está em uma ordem de magnitude abaixo dessas concentrações citotóxicas. O alto índice terapêutico esperado torna o extrato vegetal da presente invenção passível de utilização para o desenvolvimento de produtos fitoterápicos comerciais, já que a citotoxicidade é um importante fator limitante no desenvolvimento de antimicrobianos .
Apesar de terem sido alcançados alguns avanços em termos de atividade de extratos ativos contra RSA, a presente invenção se propõe a auxiliar na demanda crescente de produtos ativos contra microrganismos patogênicos.
Descrição do extrato vegetal (aureociclina)
Em uma primeira modalidade, a presente invenção se refere ao um extrato vegetal obtido de Kielmeyera aureovinosa que possui atividade antibiótica. A este extrato foi dado o nome de aureociclina.
Particularmente, o extrato vegetal pode ser obtido de qualquer parte da planta Kielmeyera aureovinosa, por qualquer método de extração com solvente orgânico.
Preferencialmente, o extrato vegetal da presente invenção é obtido das raízes da planta Kielmeyera aureovinosa.
Métodos que podem ser usados para obter o extrato vegetal de Kielmeyera aureovinosa possuindo atividade antibiótica compreendem, mas não estão limitados a métodos a frio, como a turbolização, maceração e percolação simples ou fracionada. Opcionalmente, podem ser usados métodos de extração a quente em sistemas abertos, como infusão, turbolização e decocção, mas não se limitando aos mesmos. Também é possível obter o extrato vegetal ' da presente invenção por métodos de extração a quente em sistemas fechados, como extração sob refluxo e extração por solvente usando aquecimento.
Preferencialmente, o método de extração usado na presente invenção consiste em uma combinação de dois ou mais métodos acima mencionados. Mais preferencialmente, o método de extração usado na presente invenção compreende maceração e extração por solvente a frio. Por exemplo, o extrato pode ser preparado a partir de pó seco de raízes acondicionadas em extrator, no qual é adicionado volume de solvente suficiente para a homogeneização da mistura e completa imersão no solvente. A mistura mantida no extraotor por um período de 10 a 50 horas, sendo posteriormente filtrada e submetida a evaporador rotatório era baixa pressão.
Particularmente, o extrato vegetal pode ser obtido por qualquer uma dos métodos acima mencionados usando um solvente orgânico selecionado do grupo compreendendo, mas não limitado a solventes oxigenados, solventes hidrocarbonetos e solventes halogenados ou aromáticos.
De acordo com a presente invenção, solventes oxigenados podem ser produtos como cetonas, éteres de glicol e álcool, solventes hidrocarbonetos podem ser hidrocarbonetos aromáticos e alifáticos, compreendendo, mas não se limitando a, por exemplo, hexano, ciclohexano, tolueno, benzeno e derivados dos mesmos. Por sua vez, solventes halogenados podem ser derivados de qualquer solvente hidrocarboneto que passou por processo de halogenação, compreendendo, mas não se limitando a haletos de arila, haletos de alquila e haletos de cicloalquila.
Particularmente, o extrato vegetal da presente invenção apresenta concentração inibitória minima (CIM) em teste de microdiluição em caldo contra Staphylococcus aureus menor ou igual a 1 μg/mL.
Mais particularmente, o extrato vegetal da presente invenção pode ser caracterizado quimicamente caracterizado pelo fato de compreender majoritariamente os compostos mameisina e isomameisina . Preferencialmente, a concentração dos marcadores químicos mameisina e isomameisina é superior a 60% nos extratos vegetais da presente invenção.
Descrição do composto amarilina
Em outra modalidade, a presente invenção se refere a um composto químico isolado do extrado aureociclina . Particularmente, o composto da presente invenção possui uma estrutura molecular conforme a Fórmula I abaixo:
Figure imgf000032_0001
(Fórmula I), na qual:
RI é selecionado do grupo compreendendo carbono ou um heteroátomo selecionado do grupo compreendendo oxigénio, nitrogénio e enxofre;
R2, R3, R4, R5, R6 e R7 são independentemente selecionados do grupo compreendendo hidrogénio, alquila cíclica ou aberta, aromática ou alifática opcionalmente substituída, alquenila cíclica ou aberta, aromática ou alifática opcionalmente substituída, alquinila cíclica ou aberta, aromática ou alifática opcionalmente substituída, arila opcionalmente substituída, haloalquila cíclica ou aberta opcionalmente substitída, oxigénio, enxofre, amina opcionalmente substituída, hidroxila, alquilóxi cíclico ou alifático, arilóxi opcionalmente substituído, nitro, ciano, sulfonila opcionalmente substituída, ácido carboxílico e amida; e
R6 e R7 podem formar um ciclo alifático ou aromático opcionalmente substituído. Mais particularmente, o composto da presente invenção é o 5-hidroxi-8, 8-dimetil-6- (iso-propil)—4-aril-4H- cicloexeno- [2 , 3-h] chromen-2-ona (amarilina) , de fórmula I:
Figure imgf000033_0001
Particularmente, o composto químico amarilina é isolado do extrato aaureociclina e, assim como ele, possui atividade antibiótica. Mais particularmente, a atividade antibiótica do composto amarilina apresenta concentração inibitória mínima (CIM) em teste de microdiluição em caldo contra Staphylococcus aureus menor ou igual a 1 pg/mL.
Descrição das composições
Em outra modalidade, a presente invenção se refere a composições fitoterápicas compreendendo extratos vegetais de Kielmeyera aureovinosa e excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
Conforme usado na presente invenção, o emprego do termo "farmaceuticamente aceitável" significa um sólido não tóxico, inerte, excipiente líquido semissólido, diluente, formulação auxiliar de qualquer tipo, ou simplesmente um meio aquoso estéril, tal como solução salina. Alguns exemplos dos materiais que podem servir como veículos farmaceuticamente aceitáveis são açúcares, tais como lactose, glicose e sacarose, os amidos, tais como amido de milho e o amido de batata, a celulose e os seus derivados, tais como a carboximetilcelulose de sódio, a etilcelulose e o acetato de celulose, ciclodextrina; óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de girasol, óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de milho e óleo de semente de soja; glicóis, tais como propilenoglicol, polióleos, tais como glicerinaglicol, sorbitol, manitol e de polietileno; ésteres, tais como o laurato etílico, oleato etílico, ágár; agentes tamponantes, tais como o hidróxido de alumínio e hidróxido de magnésio; ácido algínico; água livre de pirogênio; salina isotônica, solução de Ringer; soluções tampões de álcool etílico e fosfato, assim como outras substâncias não tóxicas compatíveis usadas em formulações farmacêuticas.
Particularmente, as composições fitoterápicas compreendendo extratos vegetais de Kielmeyera aureovinosa da presente invenção são destinadas a administração tópica.
Mais particularmente, a forma farmacêutica das composições fitoterápicas. compreendendo extratos vegetais de Kielmeyera aureovinosa, para uso tópico, pode ser selecionada do grupo compreendendo, mas não limitado a emulsão, gel-creme, pomada, creme, gel, sabão e pasta.
Particularmente, as composições fitoterápicas compreendendo extratos vegetais de Kielmeyera aureovinosa da presente invenção são destinadas a administração oral.
Mais particularmente, a forma farmacêutica das composições fitoterápicas compreendendo extratos vegetais de Kielmeyera aureovinosa, para uso oral, pode ser selecionada do grupo compreendendo, mas não limitado a drágea, cápsula, xarope, suspensão solução e comprimido.
Em outra modalidade da invenção, são fornecidas composições farmacêuticas ou veterinárias compreendendo o composto 5-hidroxi-8, 8-dimetil-6- (iso-propil) -4-aril-4H- cicloexeno- [2 , 3-h] chromen-2-ona (amarilina) isolado e excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
Particularmente, as composições farmacêuticas ou veterinárias compreendendo o composto amarilina podem ser destinadas a administração tópica.
Mais particularmente, forma farmacêutica das composições farmacêuticas ou veterinárias compreendendo o composto amarilina, para uso tópico, pode ser selecionada do grupo compreendendo, mas não limitado a pomada, creme, gel, sabão, loção, emulsão, gel-creme e pasta.
Particularmente, as composições farmacêuticas ou veterinárias compreendendo o composto amarilina podem ser destinadas a administração oral.
Mais particularmente, forma farmacêutica das composições farmacêuticas ou veterinárias compreendendo o composto amarilina, para uso tópico, pode ser selecionada do grupo compreendendo, mas não limitado a pó, granulado, comprimido, drágea, cápsula, solução, xarope e suspensão.
Particularmente, as composições farmacêuticas ou veterinárias compreendendo o composto amarilina podem ser destinadas a administração parenteral.
Especificamente, as composições da presente invenção podem compreender qualquer tipo de excipiente usado na produção de medicamentos em qualquer uma das formas farmacêuticas acima mencionadas, como absorventes, diluentes, aglutinantes, desintegrantes, lubrificantes, deslizantes, plastificantes, agentes de revestimento, agentes formadores de matrizes para liberação controlada, solventes e cossolventes, agentes molhantes, agentes emulsificantes, agentes surfactantes, agente doador de consistência, agentes de tonicidade, umectantes, agente levigante, gente para expulsão de ár, agentes alcalinizantes ou acidificantes, conservantes, antioxidantes, bactericidas, bacteriostáticos, agentes quelantes, corantes e edulcorantes . Absorventes adequados para as composições da presente invenção podem ser qualquer substância adicionada para absorver água presente nos extratos ou para fixar certos compostos voláteis, como as essências. Exemplos não limitativos de tais excipientes são fosfato de cálcio, caulim, carbonato de magnésio, bentonita e talco.
As composições da presente invenção podem compreender, como diluente, qualquer produto inerte adicionado à fórmula para permitir a obtenção de comprimidos ou o enchimento de cápsulas com volumes adequados e propiciar propriedades de fluxo e compressão necessárias à produção, por exemplo, mas não se limitando a lactose, fosfato de cálcio tribásico, amido, manitol, sulfato de cálcio, celulose microcristalina (Microcel®, Avicel®) , fosfato de cálcio dibásico (Encompress®, Ditab®) , óxido de magnésio, carbonato de magnésio, talco, caolim, carbonato de cálcio, dextrose, frutose, lactose, aspartame, celulose, maltose, manitol, goma de guar, sorbitol, amido e sacarose.
Substâncias aglutinantes adequadas para as composições da presente invenção podem ser agentes usados para promover adesão das partículas durante a granulação e compressão de formas farmacêuticas sólidas, também podem ser usadas nas composições da presente invenção, por exemplo, carbopol, povidona, goma xantana, goma arábica, ácido alginico, açúcar compressível, CMC-Na, etilcelulose, gelatina, metilcelulose, povidona (PVP), amido, amido pré- gelatinizado e glicose líquida em forma de solução, dispersão ou pó.
Desagregantes ou desintegrantes adequados para as composições da presente invenção podem ser qualquer componente empregado para acelerar a desintegração e/ou a dissolução da forma farmacêutica nos fluidos biológicos, por exemplo, ácido alginico, amido, alginato de sódio, CMC- Na, celulose microcristalina, croscarmelose sódica (Ac-Di- Sol®) , glicolato sódico de amido (Explotab®) e crospovidona (Kollidon CL®).
Lubrificantes adequados para as composições da presente invenção podem ser, por exemplo, estearato de magnésio, estearato de cálcio, ácido esteárico, talco e óleo vegetal hidrogenado (ex. Lubritab®) .
Deslizantes adequados para as composições da presente invenção podem ser, por exemplo, sílica coloidal (Aerosil 200®) e talco.
Agentes plastificantes adequados para as composições da presente invenção podem ser usados juntamente com polímeros, para modificar a temperatura de transição de fase dos mesmos e facilitar a coalescência de filmes formados sobre grânulos, comprimidos ou pellets. Exemplos não limitativos de tais agentes são glicerina, trietilcitrato, dibutilftalato, silicone e PPG.
Agentes de revestimento empregados para revestir composições da presente invenção em forma de comprimidos, grânulos, cápsulas ou pellets podem ser, por exemplo, acetoftalato de celulose, etilcelulose, goma gelana, maltodextrina, metacrilatos, metilcelulose, celulose microcristalina, goma laca, goma carragenana, ceras, shellacs, gelatina, derivados da celulose (metil ou etilcelulose, acetoftalato de celulose, hidroxipropilmetilcelulose, acetato de celulose) , copolímeros de ésteres acrílico e metacrílico (Eudragit tipos L100, RS 30D, RS PM, S100, dentre outros), álcool polivinílico (PVA) e acetato de polivinila.
Agentes formadores de matrizes para liberação controlada possivelmente empregados nas cmposições da presente invenção, com a finalidade de se obter liberação prolongada e/ou controlada dos princípio(s) ativo(s), podem ser HPMC, CMC-Na, goma xantana, Carbopol®, diversos tipos de Eudragit®, ágar-ágar, derivados polioxidoetilênicos (PEO's), ciclodextrina, nanoesferas e nanopartículas de qualquer natureza.
Solventes e co-solventes , como álcool, óleo de milho, óleo de algodão, glicerina, álcool isopropilico, óleo mineral, ácido oléico, óleo de amendoim, água purificada e água para injeção, entre outros, também podem ser usados nas composições da presente invenção.
Agentes molhantes adequados para as composições da presente invenção podem ser qualquer substância adicionada com a finalidade de diminuir a tensão superficial na interface sólido/liquido, por exemplo, lauril sulfato de sódio (LSS) , docusato sódico e polissorbatos 20, 60, 80 (Tween® 20, 60, 80) .
Agentes emulsificantes adequados para as composições da presente invenção podem ser, por exemplo, monoestearato de glicerila, álcool cetilico e gelatina e auxiliares, como CMC-Na, MC, alginato e pectina.
Agentes surfactantes comò, por exemplo, cloreto de benzalcônio, nonoxinol 10, octoxinol 9, polissorbato 80 e lauril sulfato de sódio também são adequados para as composições da presente invenção.
Agentes doadores de consistência adequados para as composições da presente invenção podem ser qualquer substância usada para aumentar a consistência de pomadas, por exemplo, álcool cetilico, cera branca, cera amarela, álcool estearílico, parafina, cera microcristalina e cera de ésteres cetilicos.
Agentes de tonicidade adequados para as composições da presente invenção podem ser qualquer substância usada para obtenção de soluções com características osmóticas semelhantes às dos fluidos biológicos para serem administradas pelas vias ocular, nasal, parenteral, como NaCl (0,9%), manitol (5,07%) e dextrose (5,51%).
Umectantes adequados para as composições da presente invenção podem ser glicerina, propilenoglicol e sorbitol.
Agente levigantes adequados para as composições da presente invenção podem ser qualquer líquido usado como agente facilitador no processo de redução de partículas do fármaco durante o preparo de emulsões, bases oleosas, entre outras, por exemplo, óleo mineral (vaselina líquida), glicerina, propilenoglicol, PEG 400, óleo de algodão, óleo de rícino e Polissorbato 80 (Tween ® 80) .
Agentes para expulsão de ar adequados para as composições da presente invenção podem ser empregados para expulsar o ar de recipientes hermeticamente fechados ou de formulações fluidas, para aumentar a estabilidade, por exemplo nitrogénio (N2) e dióxido de carbono (C02) .
Agentes alcalinizantes ou acidificantes, como ácido cítrico, solução de amónia, ácido acético, carbonato de amónio, ácido fumárico, dietanolamina, ácido clorídrico (HC1) , monoetanolamina, ácido tartárico, hidróxido de potássio (KOH) , ácido bórico, hidróxido de sódio (NaOH) , bicarbonato de sódio, borato de sódio e trietanolamina também são adequados para as composições da presente invenção.
Conservantes que podem ser usados nas composições da presente invenção são, por exemplo, antifúngicos , como ácido benzóico, benzoato de sódio, butilparabeno, metilparabeno (Nipagin®) , propilparabeno (Nipasol®) , etilparabeno, propionato de sódio, e antibacterianos, como cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, álcool benzílico, cloreto de cetilpiridínio, clorobutanol e fenol.
Agentes antioxidantes adequados para as composições da presente invenção podem ser selecionados do grupo compreendendo butílhidroxianisol (BHA) , butilhidroxitolueno (BHT) , oc-tocoferol, ácido ascórbico, palmitato de ascorbila, metabissulfito de sódio, ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) , ácido cítrico, cisteína, glutationa vitamina C, metabissulfito de sódio, cisteína e tiossulfato de sódio.
As composições da presente invenção podem compreender ainda, como agentes tamponantes, tampão citrato, tampão fosfato e tampão borato. Como corantes, aromatizantes e flavorizantes podem ser usados, por exemplo, baunilha, mentol, óleo de canela, óleo de anis e cacau. Edulcorantes podem ser, por exemplo, aspartame, dextrose (glicose), manitol, sorbitol, sacarina, ciclamato sódico, açúcar, acesulfame de potássio, sucralose e esteviosídeo .
As composições da presente invenção podem compreender ainda excipientes, como bactericidas, bacteriostáticos, antioxidantes, conservantes, tampões, estabilizantes, ajustadores de pH, ajustadores de osmolaridade, agentes antiespuma e tensoativos, além de resíduos de agentes de inativação ou fracionamento de antígenos, componentes de meios de crescimento e solventes comumente utilizados na produção de medicamentos. Exemplos destes tipos de componentes podem ser encontrados no livro "The Handbook of Pharmaceutical Excipients", (RAYMOND C.- .ROWE, Editora The Pharmaceutical Press) .
Uma variedade de vias de administração das composições descritas na presente invenção está disponível. O modo particular selecionado dependerá do princípio ativo em particular selecionado, a dosagem necessária para eficácia terapêutica e do paciente ao qual será administrada a composição.
Particularmente, as composições fitoterápicas, farmacêuticas e veterinárias conforme descritas acima são fornecidas para uso na prevenção ou tratamento de infecções bacterianas.
Uso do extrato aureociclina e do composto amarilina.
Considerando as propriedades do extrato vegetal de
Kielmeyera aureovinosa e do composto amarilina isolado do mesmo, constitui outro aspecto da presente invenção o uso das composições compreendendo o extrato ou o composto isolado para a prevenção ou tratamento de infecções bacterianas em animais.
Constitui outro aspecto da presente invenção o uso de do extrato vegetal de Kielmeyera aureovinosa e do composto amarilina na produção de uma vacina de medicamentos para prevenção ou tratamento de infecções, particularmente infecções bacterianas.
Métodos para prevenção ou tratamento de infecções bacterianas .
Constitui ainda outro aspecto da presente invenção métodos de prevenir ou tratar infecções bacterianas em animais, mais particularmente em humanos, usando o Extrato aureociclina e o composto amarilina, bem como composições compreendendo os mesmos.
Os métodos da presente invenção, geralmente, podem ser praticados usando qualquer modo de administração biologicamente aceitável, como as vias oral, retal, sublingual, tópica, nasal, transdermal, inalatória ou parenteral. O termo "parenteral" inclui subcutânea, intravenosa, epidural, irrigação, intramuscular, bombas de liberação, ou de infusão. Particularmente, nesta invenção as vias tópica, oral, parenteral, retal, ocular e inalatória são preferidas para administração das composições aqui reivindicadas.
EXEMPLOS
Para permitir uma melhor compreensão da presente invenção e demonstrar claramente os avanços técnicos obtidos, são apresentados abaixo, como exemplos, os resultados dos diferentes ensaios efetuados com relação a esta invenção.
Exemplo 1 : Processo de obtenção e preparação do extrato de Klelmeyera aureovinosa.
0 extrato foi preparado a partir de 75g de pó seco das raízes, acondicionado em extrator onde são adicionados 750mL de etanol 96°, garantindo a homogeneização da mistura e completa imersão do mesmo no líquido, permanecendo assim por 8h, quando é feita a primeira troca de solventes, e depois mais 16h até completar um ciclo de 24h. Este extrato é posteriormente concentrado em evaporador rotativo a baixa pressão na temperatura de 50 a 70°C, obtendo-se aproximadamente 6g de extrato (rendimento de 8%) .
A purificação do extrato foi feita utilizando-se cromatografia em coluna de gel de sílica em hexano. Foram aplicados 5,3g do extrato utilizando uma gradiente de polaridade crescente com acetato de etila até se chegar à proporção de 15%.
Características físicas do extrato:
0 extrato vegetal é de cor amarela, solúvel em etanol e apresenta um pH entre 6,0 e 7,0.
Exemplo 2: Perfil em CLAE do extrato
Obteve-se um perfil cromatográfico (Figura 3) , por CLAE, para o extrato contendo o marcador químico identificado como uma mistura de neoflavonoides . Este apresenta um tempo de retenção de 50 minutos nas condições descritas na listagem de figuras.
Exemplo 3 : Espectro de UV e estrutura dos neoflavonoides
O gráfico de máximos de absorção no espectro Ultra Violeta (Figura 4a) . Os neoflavonoides mameisina (Figura 4b) e isomameisina (Figura 4c) apresentam máximos de absorção no ultravioleta, nos comprimentos de onda de Ámax 282 e 335 nm, conforme pode ser evidenciado no gráfico da Figura 4. A substância inédita (Figura 4d) por sua vez, apresentou máximos de absorção em 233.1 e 286.3.
Exemplo 4: Perfil cromatográfico do extrato de Klelmeyera aureovinosa
O Perfil cromatográfico do extrato de Kielmeyera aureovinosa foi analisado pela técnica de cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE) . O método de análise incluiu fase móvel isocrática (63% de acetonitrila : 37% de água acidificada com ácido fosfórico a 0,1%), a concentração da amostra foi de 1,0 mg/mL na fase móvel, a coluna usada foi C18 ACE, com dimensões de 250mm X 4,6mm, 5μπι, o tempo de duração da corrida foi de 60 minutos. O pico majoritário com tempo de retenção de 50 minutos foi considerado como marcador químico do extrato (Figura 3) . Exemplo 5 : Espectro de massas do marcador químico isolado do extrato etanólico de Klelmeyera sp.
O espectro de massas do marcador químico isolado do extrato etanólico de Kielmeyera sp apresentou, em modo negativo, um pico do íon molecular em m/z = 405,1713 [M-H]- relativo à fórmula molecular C25H26O5 (Figura 5). As amostras foram analisadas por UPLC-E no Synapt no modo de aquisição MSE, usando como fonte de ionização Electronspray (ESI) em modo negativo. As condições de análise incluíram coluna Acquity BEH C18, com dimensões de 2,1x50 mm, 1,7 μπ; fase Móvel: A: H2O/0,l% Ácido Fórmico; B: ACN/0,1% ácido Fórmico; gradiente: 50-95% B em 5 minutos, temperatura da coluna: 40°C, volume de injeção: 7,5 Ι> (modo de injeção Needle Overfill) , com tempo de corrida de 5 min. As condições do espectrômetro de massas foram: voltagem do capilar: 3,5 kV, voltagem do cone: 35 V, temperatura de dessolvatação : 350°C, fluxo do gás de dessolvatação : 750 L/h, fluxo do gás do cone: 30 L/h, energia de colisão (Trap) : 6,0 eV e energia de colisão (Transfer) : 4,0 eV. As amostras do EXT 103764, foram dissolvidas em H20/ACN 80:20 para aproximadamente 2 mg/mL e posteriormente diluídas em água para 0,1 mg/mL. Este foi identificado como uma mistura de mameisina e isomameisina, dois isômeros, cujas estruturas estão ilustradas nas Figuras 4B e 4C, respectivamente.
Exemplo 6: Avaliação da atividade anti-MRSA do extrato principal
A avaliação quantitativa da atividade antibacteriana foi realizada pela metodologia de microdiluição em caldo para a determinação da concentração inibitória mínima (CIM) , conforme manual do Clinicai and Laboratorial Standards Institute (CLSI, 2006) . A partir do extrato etanólico na concentração de lOmg/mL, ressupenso em DMSO, foram elaboradas diluições seriadas (proporção 1:2), em placas de microtitulação estéreis de geometria 12x8 poços. Em seguida, em cada poço foram adicionados 10μL de suspensão bacteriana contendo cerca de 7xl06 células/mL, preparada a partir de crescimento recente da cepa ATCC 33591 de MRSA em ágar nutritivo. Após incubação em estufa bacteriológica a 36°C por 48h, as placas foram reveladas por adição de 25pL de rezazurina a 0,01% em cada poço, seguido de incubação a 36°C por 30min. A visualização direta da placa demonstrou que houve inibição de crescimento bacteriano até a concentração de 0,83 g/mL, sendo esta considerada a CIM do extrato bruto para a referida cepa de MRSA. Os experimentos foram realizados em quadruplicata, em períodos diferentes.
Exemplo 7: Bioautografia
Uma placa de CCF (sílica gel) foi previamente preparada pela eluição do extrato etanólico da amostra de Kielmeyera, e o sistema de solventes utilizado foi tolueno : acetato de etila (93:7). Em seguida, após a secagem da placa, foram vertidos 30,0 mL de suspensão de ágar soja triptcaseína (TSA) fundido, contendo cerca de IO5 células/mL. A placa foi incubada a 36°C por 24h. Em seguida, foram vertidos 5,0 mL de corante de rezazurina a 0,02% por toda a extensão da mesma, seguindo-se nova incubação a 36°C por 30 minutos. Pela leitura da placa, pôde ser observado uma área de inibição de crescimento bacteriano (azulada), correpondente ao Rf = 0,54 cm.
Exemplo 8 : Avaliação de atividade antibiótica contra as espécies M. fort itvaa ATCC 6841, M. massiliense CRM0019 e CRM 0270, M. abscessus ATCC 19977 e M. smegmatls INCQS 061.
As cepas utilizadas foram padronizadas e derivadas de espécimes de significado clinico, apresentando alto grau de multirresistência . Foram incluídas também uma cepa de M. boyis INCQS 062, uma vez que esta espécie é preconizada, segundo as normas técnicas da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa) , para a avaliação de eficácia de produtos desinfetantes de uso hospitalar.
Após uma série de ensaios, que consistiram na avaliação direta de extratos brutos e das frações obtidas pelo fracionamento químico dos extratos, dirigidos por testes de avaliação antimicrobiana, os seguintes resultados foram obtidos:
Tabela 1. CIM de extratos e frações mais ativas observadas para cepas de M. tuberculosas e MCR.
Figure imgf000050_0001
Figure imgf000051_0001
Os resultados demonstram menos duas espécies vegetais apresentam potencial anti-■micobacteriano muito significativo: as frações F151-159 (103.764)
(aureociclina), F55-72+F6783 (103.764) (aureociclina), F60- 89 (103.764) (aureociclina) e os extratos brutos 145.117 - espécie K. aureovinosa e; EE106.087 CF - espécie "B".
Em relação à avaliação da espécie Kielmeyera aureovinosa, foi observado que o extrato bruto proveniente, da raiz da planta (aureociclina) apresentou atividade considerável contra M. tuberculosis e todas as cepas de MCR avaliadas, bem como para M. bovis. As frações deste extrato apresentaram atividades ainda mais significativas. Para M. tuberculosis, o maior valor de MIC encontrado foi de 25 g/mL e menor valor de 6,25μg/mL. Para as MCR, os valores observados foram ainda mais expressivos, variando de 25μg/mL a l,56μg/mL.
Exemplo 9: Testes toxicológicos do extrato aureociclina a) Irritação dérmica aguda para aureociclina em coelhos
O plano de estudos foi baseado no Guideline OECD 404 e teve como objetivo avaliar os efeitos lesivos, reversíveis ou não, decorrentes da exposição dérmica aguda para aureociclina em coelhos. O método consistiu na aplicação tópica da substância teste, por via dérmica, uma única vez, a Oryctolagus cuniculus fêmeas, tratadas com a concentração de 80 g/mL da substância teste.
A substância teste foi aplicada, na proporção de 0,5mL/área tratada com seringa e espátula apropriadas, em um quadrante de aproximadamente 6cm2 da derme previamente tricotomizada a um grupo de três sistemas-teste . O local da aplicação foi preservado com curativo por 4 horas. Uma área equivalente a da aplicação da substância teste foi deixada intacta no antímero oposto para servir como controle.
Todos os sistemas-teste foram avaliados quanto à presença de sinais de eritema, escara e edema 60 minutos, 24 horas, 48 horas e 72 horas após a remoção do curativo. A partir da avaliação de 24 horas, todos os sistemas-teste apresentaram eritema leve (pouco perceptível) com a pele avermelhada em toda a área de aplicação. Uma vez detectado sinal de irritação decorrente da aplicação da substância teste, o ensaio foi estendido por 14 dias. Assim, destaca- se que a vermelhidão persistiu por 10 dias após a administração da substância teste.
Também foi detectada descamação discreta da pele tratada, a partir do quinto dia e estendeu-se por todo o período de observação. Durante todo período de exposição à substância teste e observação dos sistemas teste, não foi detectado sinal visível de edema na área tratada quando comparada à área controle.
A administração dérmica aguda de aureociclina na concentração estudada não induziu mortalidade, tampouco desconforto e/ou dor perceptível durante o ensaio. Ao final do ensaio, os sistemas-teste foram submetidos à eutanásia por aprofundamento anestésico injetável. Concluindo, os resultados obtidos demonstraram que a exposição dérmica aguda de aureociclina na concentração de 80yg/mL a coelhos, da raça Nova Zelândia, fêmeas, não provocou mortes e não induziu alterações clínicas sistémicas.
No entanto, foi constatado sinal de irritação dérmica, caracterizado por eritema persistente por 10 dias após a aplicação da sustância-teste, acompanhado de descamação da área tratada a partir do quinto dia de observação até o final do ensaio (14° dia) .
Tabela 2: Formação de eritema nos sistemas-teste do grupo tratado com aureociclina.
Antímero Direito Antímero Direito
Substância teste Controle aureociclina —
Tempo
Eritrema
KA1/02 KA1/04 KA1/06 KA1/02 KA1/04 KA1/06 liso liso liso liso liso liso lh 0 0 0 0 0 0
1 dia 1 1 1 0 0 0
2 1 1 1 0 0 0 Antímero Direito Antímero Direito
Substância teste Controle
aureociclina —
Tempo
Eritrema
KA1/02 KA1/04 KA1/06 KA1/02 KA1/04 KA1/06 liso liso liso liso liso liso dias
3
1 . 1 1 0 0 0 dias
4
1 1 1 0 0 0 dias
5
1 1 1 0 0 0 dias
6
1 1 1 0 0 0 dias
7
1 1 1 0 0 0 dias
8
1 1 1 0 0 0 dias
9
1 1 1 0 0 0 dias
10
1 1 1 0 0 0 dias Antímero Direito Antimero Direito
Substância teste Controle aureociclina
Tempo
Eritrema
KA1/02 KA1/04 KA1/06 KA1/02 KA1/04 KA1/06 liso liso liso liso liso liso
11
0 0 0 0 0 0
dias
12
0 0 0 0 0 0
dias
13
0 0 0 0 0 0
dias
14
0 0 0 0 0 0
dias b) Irritação ocular aguda para aureociclina em coelhos
O estudo foi baseado no Guideline OECD 405 e teve como objetivo avaliar os efeitos lesivos, reversíveis ou não, decorrentes da exposição ocular aguda para aureociclina em coelhos.
Três coelhos da raça Nova Zelândia, fêmeas, foram tratadas com aureociclina, uma única vez, na concentração de 80pg/mL. O método consistiu na aplicação, com seringa graduada, da substância teste no saco conjuntival do olho direito, após o afastamento suave da pálpebra inferior. O olho colateral (esquerdo) foi utilizado como controle negativo. Ao final do período de exposição, 24 horas, o resíduo da substância teste aplicada foi removido cuidadosamente com auxílio da gaze embebida em água deionizada. Cada sistema-teste foi avaliado separadamente, quanto à presença de lesões na córnea, íris e conjuntiva palpebrais, bem como outras alterações locais e sistémicas graves .
Os olhos foram examinados após 1, 24, 48 e 72 horas após a administração da substância teste e diariamente durante o período de observação (6 dias). Para auxiliar na avaliação das reações oculares, o colírio de fluoresceína foi utilizado nas avaliações de 24, 48 e 72 horas. A avaliação das reações oculares foi baseada na escala de Draize, na qual estão descriminadas as graduações atribuídas às reações oculares, como: opacidade, área de córnea envolvida, irite, hiperemia, quemose e secreção.
A administração ocular de aureociclina na dose avaliada (8C^g/mL) não induziu mortalidade, tampouco alteração dos sinais clínicos. A substância teste apresentou índice de irritação ocular de 0,0 na escala de Draize, sendo considerada, portanto, não irritante quando aplicada na concentração de 80μg/mL por via ocular em coelhos.
Concluindo, os resultados obtidos demonstraram que a exposição ocular aguda de aureociclina na concentração de 8C^g/mL a coelhos adultos, da raça Nova Zelândia, fêmeas, não induziu irritação e/ou corrosão ocular durante o período de observação (6 dias).
c) Toxicidade aguda para aureociclina em ratos.
O estudo teve como objetivo avaliar os efeitos tóxicos decorrentes da exposição dérmica aguda para aureociclina em ratos. Este ensaio foi baseado no Guideline OECD 402 e foi realizado segundo o plano de estudo 42011.
O método consistiu na aplicação tópica da substância teste, por via dérmica, uma única vez, em um grupo de sistemas-teste machos avaliados somente na maior concentração (250 g/mL) . Em paralelo, um grupo controle recebeu apenas o placebo da substância teste (Placebo aureociclina) . O local da aplicação foi preservado com curativo por aproximadamente 24 horas. Foram registrados o peso corporal e os consumos de água e ração dos sistemas teste.
Ao final do período de observação de 14 dias, os sistemas-teste foram submetidos á eutanásia e examinados macroscopicamente. A administração aguda da substância teste em todas as concentrações avaliadas, bem como do Placebo aureociclina nos sistemas-teste do grupo tratados e controle, não induziram alterações nas avaliações clinicas, no peso corporal e no consumo de ração e água passíveis de relação com toxicidade, tampouco letalidade.
Adicionalmente, não foram observadas alterações macro ou microscópicas passíveis de relação com a exposição à substância teste. Concluindo, os resultados obtidos demonstraram que a administração dérmica de aureociclina a Rattus novergicus na concentração de 25C^g/mL não promoveu alterações passíveis de relação com toxicidade.
Tabela 3 : Média de peso corporal (g) nos grupos controles e tratados com aureociclina.
Figure imgf000059_0001
Tabela 4 : Consumo de ração (g) semanal médio por sistema- teste dos grupos controles e tratados com aureociclina.
TEMPO Grupos
Controle 250pg/mL MEDIA D.P. N MEDIA D.P. N
Total 150,40 18, 66 2 171,72 3, 74 2
Tabela 5: Consumo de água (mL) semanal médio por sistema- teste dos grupos controles e tratados com aureociclina.
TEMPO Grupos
Controle 250 g/mL
MEDIA D.P. N MEDIA D.P. N
Total 272, 60 8,64 2 247,22 6, 69 2
Tabela 6: Peso corporal (g) dos sistemas-teste dos grupos controles e tratados com aureociclina.
Figure imgf000060_0001
d) Citotoxidade
Fibroblastos murinos 3T3 foram semeados em duas placas de 96 poços. Uma destas placas foi utilizada para fornecer a curva de citotoxicidade da substância controle Duodecil Sulfato de Sódio (SDS) , e a outra forneceu o primeiro perfil de citotoxicidade desta linhagem celular nas concentrações usadas da substância alvo. Este primeiro perfil forneceu a janela de concentração {range finder) onde o IC50 pode ser determinado, que é definido em um segundo momento (IC5o finder) .
Tabela 7 : Resultado IC50 Finder
Figure imgf000061_0002
índices de citotoxicidade in vitro:
IC20 = 11,00 μq/ml; IC50 = 18,00 ug/ml; IC80 = 20,00 g/ml; LD20= 257,87 mg/kg; LD50= 309,71 mg/kg e LD80= 322,09 mg/kg.
Os resultados acima indicam que a substância tem atividade tóxica muito baixa, sendo recomendado cuidados apenas a partir da concentração de 8
Figure imgf000061_0001
muito acima da concentração inibitória mínima, que é inferior a 1 pg/mL, indicando um alto índice terapêutico.
Exemplo 10 : Composições tópicas de aureociclina
Tabela 8 : Composição creme :
Componente Quantidade
Fase oleosa
Monoestearato de glicerila 5g
Álcool ceto-estearílico lOg
Álcool cetoestearílico etoxilado 2,5g
Petrolato (vaselina sólida) 2g
Etil hexil estearato 3g
Fenoxietanol/metilcloroisotiazolinona 0,4g
Fenoxietanol + Isotiazolinona
Fase aquosa
Propilenoglicol 5g
Água purificada Qsp 100 g
Fase C (*) (lmg/ml do extrato padrão compreende 60% em moléculas marcadoras)
Tabela 9: Composição pomada:
Componente Quantidade
Lanolina anidra 30, Og
Butilhidroxitolueno (BHT) 0, 05g vaselina sólida q.s.p. 100,0 g

Claims

REIVINDICAÇÕES
1. Extrato vegetal caracterizado pelo fato de ser obtido de Kielmeyera aureovinosa e possuir atividade antibiótica.
2. Extrato vegetal, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser obtido das raízes de
Kielmeyera aureovinosa.
3. Extrato vegetal, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de ser um extrato obtido por extração com solvente orgânico.
4. Extrato vegetal, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato do solvente ser um álcool.
5. Extrato vegetal, de acordo com qualquer reivindicação de 1 a 3, caracterizado pelo fato do solvente ser selecionado do grupo compreendendo, mas não limitado a metanol, etanol, acetato de etila e hexano.
6. Extrato vegetal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo de que sua concentração inibitória mínima (CI ) em teste de microdiluição em caldo contra Staphylococcus aureus é menor ou igual a 1 g/mL.
7. Extrato vegetal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de compreender uma concentração superior a 60% dos marcadores químicos mameisina e isomameisina . Composto caracterizado pelo fato de ser de Fórmula
Figure imgf000065_0001
(Fórmula I), na qual:
RI é selecionado do grupo compreendendo carbono ou um heteroátomo selecionado do grupo compreendendo oxigénio, nitrogénio e enxofre;
R2, R3, R4, R5, R6 e R7 são independentemente selecionados do grupo compreendendo hidrogénio, alquila cíclica ou aberta, aromática ou alifática opcionalmente substituída, alquenila cíclica ou aberta, aromática ou alifática opcionalmente substituída, alquinila cíclica ou aberta, aromática ou alifática opcionalmente substituída, arila opcionalmente substituída, haloalquila cíclica ou aberta opcionalmente substitída, oxigénio, enxofre, amina opcionalmente substituída, hidroxila, alquilóxi cíclico ou alifático, arilóxi opcionalmente substituído, nitro, ciano, sulfonila opcionalmente substituída, ácido carboxílico e amida; e
R6 e R7 podem formar um ciclo alifático ou aromático opcionalmente substituído.
9. Composto, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de ser 5-hidroxi-8 , 8-dimetil-6- (iso-propil) -4-aril-4H-cicloexeno- [2, 3-h] chromen-2-ona :
Figure imgf000066_0001
10. Composto, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de possuir atividade antibiótica.
11. Composto, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que sua concentração inibitória mínima (CIM) em teste de microdiluição em caldo contra Staphylococcus aureus é menor ou igual a 1 g/mL.
12. Composição fitoterápica caracterizada pelo fato de compreender um extrato vegetal conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 e excipientes farmaceuticamente ou veterinariamente aceitáveis.
13. Composição, de acordo a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de ser para administração tópica.
14. Composição, de acordo com a reivindicação 13 caracterizada pelo fato de ser selecionada do grupo compreendendo, mas não limitado a emulsão, gel-creme, pomada, creme, gel, sabão e pasta.
15. Composição, de acordo a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de ser para administração oral.
16. Composição, de acordo com a reivindicação 15 caracterizada pelo fato de ser selecionada do grupo compreendendo, mas não limitado a drágea, cápsula, xarope, suspensão solução e comprimido.
17. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 16, caracterizada pelo fato de compreender o extrato vegetal conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 na concentração de 8,0 pg/g a 2 , 5 mg/g .
18. Composição farmacêutica ou veterinária caracterizada pelo fato de compreender o composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 11 e excipientes farmaceuticamente ou veterinariamente aceitáveis.
19. Composição, de acordo a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de ser destinada a administração tópica.
20. Composição, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de ser selecionada do grupo compreendendo, mas não limitado a emulsão, gel-creme, pomada, creme, gel, sabão e pasta.
21. Composição, de acordo a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de ser destinada a administração oral.
22. Composição, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de ser selecionada do grupo compreendendo, mas não limitado a pó, granulado, comprimido, drágea, cápsula, solução, xarope e suspensão.
23. Composição, de acordo a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de ser para administração parenteral.
24. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 23, caracterizada pelo fato de compreender o composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 10 na concentração de 2,0 g/g e 2,0 mg/g.
25. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 24, caracterizada pelo fato de ser para uso na prevenção ou terapia de infecções bacterianas.
26. Uso de extrato vegetal conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 11 ou de uma composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 12 a 24 caracterizado pelo fato de ser para preparar um medicamento para prevenção ou terapia de infecções bacterianas .
27. Método para prevenção ou tratamento de infecções bacterianas em animais caracterizado pelo fato de compreender administrar uma quantidade farmaceuticamente ou veterinariamente eficaz de um extrato vegetal conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, de um composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 11 ou de uma composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 12 a 23.
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