WO2012171231A1 - 顶体蛋白的用途及制备方法 - Google Patents

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WO2012171231A1
WO2012171231A1 PCT/CN2011/076196 CN2011076196W WO2012171231A1 WO 2012171231 A1 WO2012171231 A1 WO 2012171231A1 CN 2011076196 W CN2011076196 W CN 2011076196W WO 2012171231 A1 WO2012171231 A1 WO 2012171231A1
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acrosome
cancer
protein
solution
acid
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李雪刚
李偃
程辉
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陕西精健新星生物医药有限公司
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    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/2101—Acrosin (3.4.21.10)

Definitions

  • the invention relates to the use and preparation method of acrosome protein.
  • tumors are one of the major diseases that currently seriously affect human health and threaten human life. They have become the leading cause of human death. According to statistics, 1.6 million people die of cancer every year in China, and 7.4 million people die of cancer every year in the world. Although the current cancer treatments and treatments are constantly being updated, cancer morbidity and mortality are still increasing. It is estimated that more than 12 million people worldwide will die of cancer by 2030.
  • Cancer is a normal cell of the body that rapidly produces abnormal cells, which metastasize and spread to other organs. At the same time, during abnormal cell proliferation, it absorbs nutrients, destroys human immunity and resistance, causes disorder of the body, loses balance, and eventually leads to death.
  • Patent CN200710017785.3 has described the pharmaceutical application of animal semen medicine in the treatment of various diseases such as tumors and depression, and patent application 201010219062.3 describes a preparation method of animal semen lyophilized powder.
  • the main component of semen is water, which accounts for more than 90%.
  • the mature sperm there are 1% of other cells, such as immature spermatogonia, spermatocytes, and epithelial cells that are shed by reproductive tubes.
  • the use and extraction method of acrosome protein provided by the invention mainly solves the problem that the preparation of animal semen preparation for treating diseases such as tumor and depression is low in purity, the dose to be taken is large, and the non-specific protein in semen is The problem that the impurities such as fat and saccharide interfere with the therapeutic effect; the use and extraction method of the acrosome protein provided by the invention greatly improves the purity and efficacy of the drug, and breaks through the limitations of the prior art.
  • Acrosome proteins can be used to inhibit the spread of cancer cells, especially for inhibiting the spread of MCF-7, Bel7402, BGC823, A2780, A549 or HCT-8 cells.
  • Cancer includes gynecological tumors, digestive tract tumors, lung cancer, liver cancer, leukemia and malignant lymphoma; gynecological tumors include uterine fibroids, ovarian cancer, breast tumors, breast cancer and cervical cancer; digestive tract tumors include esophageal cancer, gastric cancer, and colorectal cancer.
  • Acrosome proteins can be used to prepare capsules, granules, tablets, dropping pills, Chinese and Western medicine preparations, oral solutions or injections.
  • the acrosome protein purification of the present invention is obtained by the following method:
  • animal semen is generally selected from healthy sputum, cattle, sheep or horse semen, of which sputum semen is preferred; a dilute acid solution having a concentration of 1% to 5% is added thereto , adding inorganic acid to adjust the pH to 2 ⁇ 5, centrifuge at 2000r/min ⁇ 8000r/min for 15 ⁇ 30min, then discard the precipitate, preferably in the range of 2500r/min ⁇ 6000r/min, centrifugation time 7 ⁇ 20min; then the obtained supernatant is combined and concentrated; wherein, 1% to 5% of the dilute acid solution may be selected from an acetic acid solution, a formic acid solution, a propionic acid solution, a butyric acid solution, a hydrochloric acid solution, a hydrobromic acid solution, a sulfuric acid solution, a phosphoric acid solution or the like, wherein an acetic acid solution is preferred, the dilute acid solution has a concentration of
  • hydrochloric acid hydrobromic acid or phosphoric acid, wherein hydrochloric acid is preferred;
  • the inorganic acid has a pH adjustment range of 2 to 5, preferably 2.8 to 4.6, and an optimum pH of 3; wherein the mass ratio of animal semen to dilute acid is 1:1.
  • the inorganic ammonium salt comprises ammonium sulfate, ammonium hydrogen sulfate, ammonium carbonate, ammonium hydrogencarbonate, ammonium phosphate, etc., wherein ammonium sulfate is preferred;
  • acetic acid buffer solution is O. lmol / L , pH is 1.8 to 4, preferably in the range of 2 to 3.5, preferably pH 2;
  • the crude protein extract obtained by the treatment of the step 3 is subjected to column chromatography, and the eluate is equilibrated with an acetic acid buffer solution. After the completion of the treatment, the eluate is collected; generally, a dextran gel column, hydroxypropyl glucoside is used.
  • the invention has obtained acrosome protein in the treatment of uterine fibroids, breast tumor, gastric cancer, lung cancer, liver cancer, leukemia, colon cancer, ovarian cancer, breast cancer, cervical cervix through a large number of experimental studies, breaking through the limitations of the prior art application.
  • the acrosome protein content in animal semen is about 0.1% ⁇ 0.4%. After purification, the acrosome protein content is greater than 90%. Compared with animal semen or its lyophilized powder, the drug concentration is greatly improved, and the non-specific proteins, fats and saccharides in semen are eliminated. It improves the anti-tumor activity and reduces the dosage, which is more convenient for clinical application.
  • Acrosome is a biologically active substance that is indispensable for the fertilization of eggs and sperm. Its chemical composition is a serine protein soluble substance that dissolves the egg membrane. When both the egg and the sperm are successfully transported to the fertilization site, once the head of the sperm touches the surface of the egg, the acrosome of one of the organelles at the tip of the head undergoes an acrosome reaction, which is partially extended by the acrosome.
  • acrosome protein dissolves the egg membrane, allowing the sperm head to penetrate the egg's radial crown and zona pellucida, and enter the egg to complete the fertilization process. Therefore, acrosome protein activity is often a quantitative indicator of semen function in semen analysis.
  • Acrosome proteins can be obtained by cryopreserved sperm using detergents, sonication and low pH, and by biochemical techniques such as gel filtration, ion exchange chromatography, isoelectric aggregation, affinity chromatography and electrophoresis. Pure acrosome protein.
  • biochemical techniques such as gel filtration, ion exchange chromatography, isoelectric aggregation, affinity chromatography and electrophoresis.
  • Pure acrosome protein Pure acrosome protein.
  • the molecular weights of acrosome proteins obtained by different mammals and different separation methods are different, such as human acrosomes of 30KD ⁇ 70KD, and pigs of about 41KD ⁇ 56KD.
  • the acrosin molecule consists of three parts: the zymogen region, the catalytic region and the tail region. There are no species differences in the amino acid sequence of the zymogen region and the catalytic region, and there are species differences in the tail region.
  • acrosome protein has inhibitory effects on MCF-7, Bel7402, BGC823, A2780, A549 and HCT-8 six human cancer cell lines, and has obvious inhibitory effect on mouse S180 tumor, and freezes with animal semen. Compared with the powder, the anti-tumor effect is obvious, and the medicinal dose is also significantly reduced. At the same time, the combination of this product and chemotherapy drugs can significantly increase the therapeutic effect of chemotherapy drugs on tumors, suggesting that this product has a broad prospect for the treatment of tumors.
  • the acrosomal protein can be prepared into capsules, granules, tablets, dropping pills, oral liquids, injections and the like for clinical use, preferably capsules, acrosome protein has good stability, and preferred capsules are shielded from light and sealed. It can be stored for 24 months under conditions and can be used stably and effectively in clinical practice. This product can also be used in combination with other drugs to make Chinese and Western medicine compound preparations.
  • the supernatant was added with ammonium sulfate to a saturation of 0.3, and allowed to stand at 4 ° C for 4 hours at 3000 r / min. Centrifuge for 20 min and discard the supernatant. The precipitate is dissolved in 0.1 mol/L (pH 2) acetic acid solution to obtain crude acrosome protein extract.
  • the eluate was centrifuged at 3000 r/min for 10 min, and the supernatant was discarded.
  • the resulting precipitate was washed with pure distilled water and centrifuged again to collect the precipitate, and the acrosome protein was obtained in a yield of 0.133%.
  • the acrosome was determined by ELISA quantitative assay. Protein content, content 92%.
  • the supernatant was added with ammonium sulfate to a saturation of 0.4, placed at 4 ° C for 4 hours, centrifuged at 3500 r / min for 15 min, the supernatant was discarded, and an acetic acid buffer solution of 0.1 mol/L (pH 2.5) was precipitated. Dissolve to obtain crude acrosome protein extract;
  • the eluate was centrifuged at 3000 r/min for 10 min, and the supernatant was discarded.
  • the resulting precipitate was washed with pure distilled water and centrifuged again.
  • the precipitate was collected to obtain acrosome protein in a yield of 2.8%.
  • the acrosome was determined by ELISA quantitative assay. The protein content is greater than 93.7%.
  • the pharmacodynamic experiments of acrosome proteins are as follows:
  • MTT assay MCF-7, Bel7402, BGC823, A2780, A549 and HCT-8 six human cancer cell lines (Shanghai Institute of Chinese Academy of Sciences) were trypsinized, and cell suspension was prepared with RPMI1640 medium containing 10% calf serum. The solution, at a concentration of 10 4 /ml, was inoculated with ⁇ (1000 cells/well) per well in a 96-well culture plate. Dilute the drug with medium, set 6 concentrations: 10, 20, 40, 80, 160, 32 ( ⁇ g/ml, set up three parallel holes in each group, add 0.1ml per well. Set 37.
  • Kunming mice 18 ⁇ 22g, female, 50 were selected and divided into blank control group, animal semen freeze-dried powder group, SJ mgAg Smg-kg- 1 , lOmg.kg- 1 low-medium-high dose group, each group of 10 .
  • the tumor-bearing animals in good general condition were sacrificed, ascites was taken under aseptic conditions, diluted with physiological saline, and 0.2 ml of tumor solution (S180 cells: 1.0 X 10 7 cells/ml) was inoculated under each armpit. Animals were randomized by body weight 24 hours after inoculation.
  • Kunming mice 18 ⁇ 22g, female, 50, set blank control group, cyclophosphamide 20 mg, kg- 1 treatment group, cyclophosphamide 20 mg, kg- 1 treatment group and acrosome protein 2.5mg respectively , kg - 5mg, kg - lOmgAg combined administration group.
  • the tumor-bearing animals with good tumor growth and good systemic condition were sacrificed, ascites was taken under aseptic conditions, diluted with physiological saline, and 0.2 ml of tumor solution was inoculated into each armpit of the mouse (S180 cells: l.Ox lO 7 cells/ml) . 24 hours after inoculation, animals were randomly divided into groups of 10 animals each.
  • Cyclophosphamide was intraperitoneally administered with 20 mg g- 1 , once every other day for a total of 5 times, and the acrosome protein was administered once a day for 10 consecutive days. 24 hours after the second administration, the animals were sacrificed by cervical dislocation, and the body weight and tumor weight were weighed, and the tumor inhibition rate was calculated to evaluate the therapeutic effect.
  • the tumor inhibition rate of cyclophosphamide 20 mg'kg- 1 for 5 times was 19.6% (P>0.05) o cyclophosphamide 20 mg-kg 1 and acrosome 2.5 mg, kg- 1
  • the tumor inhibition rate was 36.6% ((P ⁇ 0.05) o cyclophosphamide 20 mg-kg 1 combined with acrosome protein 5 mg-kg 1 , the tumor inhibition rate was 38.0% (P ⁇ 0.05) o cyclophosphamide 20
  • the tumor inhibition rate was 40.6% (P ⁇ 0.05).
  • the combination of acrosome protein and cyclophosphamide significantly increased the tumor growth of cyclophosphamide. Effect.
  • Cyclophosphamide 20 20mgx5 10/10 1.42 ⁇ 0.15# 36.6 Mg-kg" 1 +2.5mg l0
  • Acrosome protein was applied to patients with tumor outpatients. A total of 300 cases (mainly patients with surgery, radiotherapy, and recurrence of lesions after chemotherapy) were collected. Each patient received oral oral administration of 20 mg of acrosome protein, 3 times a day for 3 months. , physical examination, statistical efficiency reached 87%, significant efficiency reached 59%, the cure rate reached 8%. The acrosome protein was used in 226 cases of randomized statistics of depression. Each patient received oral administration of 20 mg of acrosome protein, 3 times a day for 1 month, with a total effective rate of 89% and a cure rate of 14%.
  • Acrosome protein stability test For uterine fibroids, breast tumors, gastric cancer, lung cancer, liver cancer, leukemia, colorectal cancer, ovarian cancer, breast cancer, cervical cancer, malignant lymphoma and treatment of depression, epilepsy, etc.
  • the disease has clinical application value.
  • Acrosome protein stability test :
  • acrosome protein 20 g was added, 10 g of anhydrous lactose was added, and the mixture was uniformly mixed. The content of acrosome protein was measured, the weight of the agar was calculated, and the capsule was filled under aseptic conditions to prepare 1000 capsules.

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Abstract

本发明提供了一种顶体蛋白用于治疗癌症及抑郁症的用途及其制备方法。所述顶体蛋白分离自动物精液或动物精液冻干粉。

Description

顶体蛋白的 ^途及制备方法
技术领域
本发明涉及顶体蛋白的用途及制备方法。
背景技术
众所周知， 肿瘤是当前严重影响人类健康， 威胁人类生命的主要疾病之 一， 已成为人类致死的首要原因。 据统计， 中国每年有 160万人死于癌症， 世界上每年有 740万人死于癌症。 虽然目前治疗癌症的药物和治疗手段不断 在更新， 但癌症发病率和死亡率仍在不断增加， 预计 2030年全世界将有超过 1200万人死于癌症。
癌是机体正常细胞快速产生异常细胞， 并发生转移， 扩散到其他器官， 同时异常细胞增生过程中， 吸收营养， 破坏人体免疫力和抵抗力， 导致机体 功能紊乱， 失去平衡， 最终导致人死亡。
目前国际上对癌症病因及发病机理尚未完全认识， 对于癌症的治疗， 常 规疗法无外乎手术治疗、 药物化疗、 放射性治疗和以毒攻毒等。 他们对癌症 的治疗虽能起一定作用， 使部分患者病情暂时好转， 但容易再次复发和转移， 同时正常的组织细胞及机体免疫力不可避免地在治疗过程中受损， 给患者带 来难以忍受的痛苦和食欲不振、 呕吐、 发烧、 大小便失禁、 抑郁、 失眠等症 状， 患者生活质量严重降低。 经过传统的化学治疗后， 患者会头发脱落、 骨 瘦如柴， 不能饮食吞咽。 致使许多患者未死于癌症而死于放化疗和手术。 当 这些弊端日益显现时， 一些人进而转向基因和免疫学等途径， 但迄今未取得 实质性的进展。
专利 CN200710017785.3已描述了动物精液药材在治疗肿瘤、抑郁症等多 种疾病中的药物应用， 专利申请 201010219062.3描述了动物精液冻干粉的制 备方法。 但精液的主要成分为水， 约占 90%以上， 在有形成分中， 除成熟精 子外， 尚有 1%的其他细胞， 如未成熟的精原细胞、 精母细胞以及生殖管道脱 落的上皮细胞和少量白细胞， 除细胞外， 精液内还含有脂肪及蛋白质颗粒、 色素颗粒、 前列腺液的磷脂小体， 无机盐、 酶类、 乳酸及果糖等； 现有技术 并未确定动物精液中何种物质起到治疗肿瘤、 抑郁症等疾病的作用， 直接应 用动物精液制备的药物纯度也较低， 因此效用较差， 患者的服用剂量大。 发明内容
本发明提供的顶体蛋白的用途及提取方法， 主要解决了现有应用动物精 液制备治疗肿瘤、 抑郁症等多种疾病中的药物纯度低、 需服用的剂量大及精 液中的非特异性蛋白、 脂肪和糖类化合物等杂质对治疗效果的干扰的问题； 本发明提供的顶体蛋白的用途及提取方法， 极大地提高了药物的纯度和药效， 突破了现有技术的局限性。
本发明的具体技术解决方案如下：
顶体蛋白可以用于抑制癌细胞的扩散，尤其是用于抑制 MCF-7、 Bel7402、 BGC823、 A2780、 A549或 HCT-8细胞的扩散。
顶体蛋白在制备治疗癌症、 抑郁症的药物中的应用。 癌症包括妇科肿瘤、 消化道肿瘤、 肺癌、 肝癌、 白血病和恶性淋巴瘤； 妇科肿瘤包括子宫肌瘤、 卵巢癌、 乳房瘤、 乳腺癌和宫颈癌； 消化道肿瘤包括食道癌、 胃癌、 大肠癌。
顶体蛋白可以用于制备胶囊、 颗粒、 片剂、 滴丸、 中西药复方制剂、 口 服液或注射液。
本发明顶体蛋白提纯通过下述方法得到：
1]取动物精液或复溶的动物精液冻干粉， 动物精液一般选择健康驴、 牛、 羊或马的精液， 其中优选为驴精液； 向其中加入浓度为 1%〜5%的稀酸溶液， 再加入无机酸将 pH调节至 2〜5，以 2000r/min〜8000r/min的转速离心 15〜30min 后弃去沉淀物，较佳范围为离心转速 2500r/min〜6000r/min，离心时间 7〜20min; 然后将得到的上清液合并， 浓縮； 其中， 1%〜5%的稀酸溶液可选醋酸溶液、 甲酸溶液、 丙酸溶液、 丁酸溶液、 盐酸溶液、 氢溴酸溶液、 硫酸溶液、 磷酸 溶液等， 其中优选为醋酸溶液， 稀酸溶液浓度为 1%〜5%， 较佳范围为 1.7%〜4.5%， 优选为 2%; 调节 pH的无机酸为 lmol/L的硫酸、 盐酸、 氢溴酸 或磷酸， 其中优选为盐酸； 无机酸调节 pH范围为 2〜5， 优选为 2.8〜4.6， 最佳 pH为 3; 其中动物精液与稀酸的质量比为 1:1〜1:20， 较佳范围为 1:2〜1:15， 最优比为 1:4; 动物精液冻干粉与复溶溶剂水的质量比为 1:1〜1:20， 较佳范围 为 1:5〜1:15，最优比为 1:10，其中动物精液冻干粉复溶溶液与稀酸的质量比为 1:1〜1:16， 较佳范围为 1:2〜1:12， 最优比为 1:5.5; 2]向歩骤 1处理所得的上清液中加入无机铵盐， 调节饱和度至 0.2-0.5后 在 4°C环境中放置 3-5小时， 饱和度的调节的较佳范围为 0.25-0.48， 优选为 0.3； 再以 2000r/min〜8000r/min 离心 15〜30min， 较佳范围为离心转速 2500r/min〜6000r/min， 离心时间 7〜20min; 然后弃去上清液， 沉淀用醋酸缓冲 溶液溶解后， 得到顶体蛋白粗提物； 无机铵盐包括硫酸铵、 硫酸氢铵、 碳酸 铵、 碳酸氢铵、 磷酸铵等， 其中优选的为硫酸铵； 醋酸缓冲溶液为 O. lmol/L, pH为 1.8〜4， 较佳范围为 2〜3.5， 优选 pH为 2;
3]将经歩骤 3处理所得的蛋白粗提物进行柱层析，用醋酸缓冲溶液平衡洗 脱， 处理完成后收集洗脱液； 一般是用葡聚糖凝胶柱、 羟丙基葡聚糖凝胶柱、 丙烯酰胺凝胶柱或琼脂糖凝胶柱进行柱层析， 其中优选的为葡聚糖凝胶柱和 羟丙基葡聚糖凝胶柱； 醋酸缓冲溶液是 pH=2， O.lmol/L的醋酸缓冲溶液， 醋 酸缓冲溶液平衡洗脱的流速为 0.5ml/min，处理完成后收集在 680nm处有最大 吸收的洗脱液；
4]将洗脱液以 2000r/min〜8000r/min离心 5〜10min， 弃去上清液， 所得沉 淀洗涤后以 2000r/min〜8000r/min继续离心 1〜3次， 每次离心 5〜10min， 收集 沉淀， 即得到顶体蛋白。
本发明的优点在于：
本发明通过大量的实验研究， 突破现有技术应用上的局限性， 获取了顶 体蛋白在治疗子宫肌瘤、 乳房瘤、 胃癌、 肺癌、 肝癌、 白血病、 大肠癌、 卵 巢癌、 乳腺癌、 宫颈癌、 恶性淋巴瘤及治疗抑郁症等疾病的药物中的应用； 极大地提高了该类药物的纯度， 并降低了患者的服用剂量和动物精液冻干粉 中含有的其他物质可能造成的影响。
经检测， 动物精液中顶体蛋白含量约为 0.1%〜0.4%。 经提纯后， 顶体蛋 白含量大于 90%， 与动物精液或其冻干粉相比， 药物浓度得到了很大提高， 并且剔除了精液中的非特异性蛋白、 脂肪和糖类化合物， 从药效上提高抗肿 瘤活性， 并且降低了服用剂量， 更方便临床应用。
可制成可制成胶囊、 颗粒、 片剂、 滴丸、 口服液、 注射液等各种制剂应 用于临床， 优选为胶囊。 本品也可与其他药物制成中西药复方制剂应用。 具体实施方式 顶体蛋白是卵子与精子受精过程中所不可缺少的生物活性物质。 其化学 成分为丝氨酸蛋白溶解类物质， 可溶解卵膜。 当卵子和精子都成功地被输送 到受精部位时， 精子的头部一旦接触到卵子表面时， 位于其头部顶端的细胞 器之一的顶体就随之发生顶体反应， 由顶体部分伸长为顶体丝， 并分泌出多 种酶蛋白， 即顶体蛋白， 顶体蛋白溶解卵膜， 使精子头部穿透卵的放射冠和 透明带， 而进入卵子， 完成受精过程。 因此， 顶体蛋白活性临床上常成为精 液分析评价精子功能的定量指标。
顶体蛋白可通过对冷冻保存的精子使用去垢剂，声处理和低 pH等方法提 取， 并用凝胶过滤， 离子交换层析， 等电聚集， 亲和层析和电泳等生化技术， 可获得纯顶体蛋白。 但不同哺乳动物和采用的不同分离方法所得到的顶体蛋 白分子量差异较大， 如人顶体素为 30KD〜70KD， 而猪的约为 41KD〜56KD。
顶体素分子是由酶原区、 催化区、 尾区三部分组成， 其中酶原区、 催化 区氨基酸序列无种属差异， 尾区有种属差异。
经药效学实验证实， 顶体蛋白对 MCF-7、 Bel7402、 BGC823、 A2780、 A549及 HCT-8六种人癌细胞株有抑制作用，对小鼠 S180肿瘤抑制作用明显， 与动物精液冻干粉相比， 抑瘤作用明显， 同时药用剂量也显著降低。 同时本 品与化疗药物联用能明显增加对化疗药物治疗肿瘤的治疗作用， 提示本品有 应用于治疗肿瘤的广泛前景。 人体临床应用情况表明， 本品治疗癌症有实质 性的临床应用效果； 将动物精液提纯得到顶体蛋白属于重大创新和发明， 有 利于降低患者服药剂量， 为上述疾病的治疗提供了一种新的药用物质。
顶体蛋白可制成胶囊、 颗粒、 片剂、 滴丸、 口服液、 注射液等各种制剂 应用于临床， 优选为胶囊， 顶体蛋白具有较好的稳定性， 优选的胶囊在遮光、 密封条件下可保存 24个月， 可稳定有效的应用于临床。 本品也可与其他药物 制成中西药复方制剂应用。
以下结合实施例进一歩说明本发明， 而非限制本发明：
实施例 1：
向 1kg动物精液中加入 4L的 2%醋酸溶液， 用 lmol/L的盐酸调节 pH为 3， 以 5000r/min转速离心 20min， 弃去沉淀物， 上清液合并， 浓縮；
上清液加硫酸铵至饱和度为 0.3， 于 4°C放置 4小时， 以 3000r/min转速 离心 20min， 弃去上清液。 沉淀用 0.1mol/L (pH 2) 的醋酸溶液溶解即得顶体 蛋白粗提物
柱层析： 将粗提物用 Sephadex G-25凝胶柱进行柱层析， 以 O.lmol/L (pH 2)的醋酸缓冲溶液平衡洗脱， 流速为 0.5ml/min。用紫外分光光度法检测， 收 集按 Lowry法在 680nm处有最大吸收的洗脱液；
将洗脱液以 3000r/min离心 10min， 弃去上清液， 所得沉淀用纯蒸馏水洗 涤后继续离心， 收集沉淀， 即得到顶体蛋白， 收率为 0.133%， 用 ELISA定量 检测法测定顶体蛋白含量， 含量 92%。
实施例 2:
将 50g动物精液冻干粉用 500ml蒸馏水溶化， 加入 3L的 3%醋酸溶液， 用 lmol/L的盐酸调节 pH为 4， 以 6000r/min转速离心 15min， 弃去沉淀物， 上清液合并， 浓縮；
上清液加硫酸铵至饱和度为 0.4， 于 4°C放置 4小时， 以 3500r/min转速 离心 15min， 弃去上清液， 沉淀用 O.lmol/L (pH2.5 ) 的醋酸缓冲溶液溶解即 得顶体蛋白粗提物；
柱层析：将粗提物用 Sephadex LH-20凝胶柱进行柱层析，以 0.1mol/L (pH 2)的醋酸缓冲溶液平衡洗脱， 流速为 0.5ml/min; 用紫外分光光度法检测， 收 集按 Lowry法在 680nm处有最大吸收的洗脱液；
将洗脱液以 3000r/min离心 10min， 弃去上清液， 所得沉淀用纯蒸馏水洗 涤后继续离心， 收集沉淀， 即得到顶体蛋白， 收率为 2.8%， 用 ELISA定量检 测法测定顶体蛋白含量， 含量大于 93.7%。 顶体蛋白的药效学实验如下：
MTT试验： 用胰酶消化 MCF-7、 Bel7402、 BGC823、 A2780、 A549及 HCT-8 六种人癌细胞株 （中国科学院上海细胞所）， 以含 10 %小牛血清的 RPMI1640培养液配制细胞悬液， 浓度为 104/ml， 于 96孔培养板内每孔接种 ΙΟΟμΙ ( 1000个细胞 /孔）。 用培养基稀释药物， 设 6个浓度： 10、 20、 40、 80、 160、 32(^g/ml， 每组设三个平行孔， 每孔加样 0.1ml。 置 37。C、 5 % C02 孵 箱中培养 96小时后弃去培养液， 每孔加入 0.1 ml 0.5% MTT溶液 (RPMI 1640配制）。 37°C保温 4小时，弃上清，每孔加入 DMSO 0.1 ml溶解 Formazan 颗粒， 振荡混匀， 用酶标仪检测 （参比波长 450 nm、 检测波长 570 nm)， 计 算药物对细胞生长的抑制率。
表 1. MTT法观察顶体蛋白对人癌细胞株的生长抑制作用结果 顶体蛋白 抑制率（％：)
剂量
MCF-7 Bel7402 BGC823 A2780 A549 HCT-8
(^g/ml)
400 60.3±2.79 57.7±5.61 62.0±12.69 76.8±11.19 16.2±7.31 40.4±20.5 结果表明， 在本实验条件下， 32(^g/ml 顶体蛋白对 MCF-7、 Bel7402、 BGC823、 A2780有较强的抑制作用， 对 A549及 HCT-8有一定的抑制作用。 这为该药应用于肿瘤的治疗提供了临床前研究基础。
S180移植性肿瘤抑制实验：
选用昆明种小鼠， 18〜22g， 雌， 50只， 分为空白对照组， 动物精液冻干 粉组、 SJ mgAg Smg-kg-1, lOmg.kg-1低中高剂量组， 每组 10只。 将全身状 况良好的荷瘤动物处死， 无菌条件下取出腹水， 以生理盐水稀释， 于每鼠腋 窝下接种 0.2ml瘤液 （S180细胞： 1.0 X 107个 /ml)。 接种后 24小时， 将动物 按体重随机分组。 动物精液冻干粉 64 mg g—1剂量组、 顶体蛋白 2.5 mg，kg— Smg-kg-1, lOmg g-1低中高剂量组每天灌胃给药一次， 连续给药 10天， 末次 给药后 24小时， 颈椎脱臼处死动物， 分别称体重及瘤重,计算肿瘤抑制率， 进 行疗效评价。 并将各组结果进行统计学处理。
表 2. 顶体蛋白对小鼠肉瘤 S180的生长抑制作用 抑制率 组 别 动物数（始 瘤 重（g)
( % ) 空白组 10/10 2.03 ±0.33 动物精液冻干粉组 10/10 1.44±0.26# 29.1 顶体蛋白 S mg'kg—1剂量组 10/10 1.12±0.20# 44.8 顶体蛋白 S.O mg'kg—1剂量组 l.05+0.13# 48.3 顶体蛋白 lO mg'kg—1剂量组 10/10 0.89+0.18# 56.2 表 2 显示， 动物精液冻干粉的抑瘤率为 29.1% (Ρ<0.05) , 顶体蛋白 SJmg'kg-1组为 44.8% (PO.05), 5 mg-kg 组为 48.3%(P<0.05) ， lOmg-kg 组 为 56.2%(P<0.05)。 这表明， 在提纯后， 与动物精液冻干粉相比， 顶体蛋白给 药剂量不但降低， 而且对肿瘤的抑制率也明显增强。 与化疗药物联合用药的增效实验：
选用昆明种小鼠， 18〜22g，雌， 50只，设空白对照组，环磷酰胺 20 mg，kg— 1 治疗组， 环磷酰胺 20 mg，kg— 1治疗组分别与顶体蛋白 2.5mg，kg— 5mg，kg— lOmgAg 联合给药组。 将肿瘤生长良好、 全身状况较好的荷瘤动物处死， 无 菌条件下取出腹水， 以生理盐水稀释， 于每鼠腋窝下接种 0.2 ml瘤液 （S180 细胞： l.Ox lO7个 /ml)。 接种后 24小时， 将动物按体重随机分组， 每组 10只。 环磷酰胺腹腔注射给药 20 mg g—1 , 隔天一次，共计 5次，顶体蛋白每天一次， 连续给药 10天。 次给药后 24小时， 颈椎脱臼处死动物， 分别称体重及瘤重, 计算肿瘤抑制率， 进行疗效评价。
由表 3可见， 环磷酰胺 20mg'kg— 1给药 5次的抑瘤率为 19.6% (P>0.05)o 环磷酰胺 20 mg-kg 1与顶体蛋白 2.5mg，kg— 1合用后，抑瘤率为 36.6% ((P<0.05)o 环磷酰胺 20 mg-kg 1与顶体蛋白 5 mg-kg 1合用后， 抑瘤率为 38.0% (P<0.05)o 环磷酰胺 20 mg，kg— 1与顶体蛋白 10 mg，kg— 1合用后， 抑瘤率为 40.6% (P<0.05)。 顶体蛋白与环磷酰胺合用后能明显增加对环磷酰胺治疗肿瘤的增效作用。
表 3. 顶体蛋白对 S180肉瘤小鼠化疗增效作用
, 。， 剂 量 动物数 1 ^ 抑制率 组 别 ， 瘤重 (g)
(mg-kg-^day) 末) ( %) 空白组 - 10/10 2.24士 0.27
环磷酰胺 20
20mgx5 10/10 1.80士 0.24 19.6 mg-kg"1组
环磷酰胺 20 20mgx5 10/10 1.42士 0.15# 36.6 mg-kg"1 +2.5mg l0
+顶体蛋白 2.5
mg-kg"1组
环磷酰胺 20
mg-kg"1 20mg 5
10/10 1.39±0.18# 38.0. +顶体蛋白 +5mg l0
Smg-kg 1组
环磷酰胺 20
mg-kg"1 20mg 5
10/10 1.33士 0.14# 40.6 +顶体蛋白 10 +10mg l0
mg-kg"1组
注： 与空白组比， # PO.05 临床药效验证：
将顶体蛋白试用于肿瘤门诊患者， 共收集病例 300例（主要为手术、放疗、 化疗后病灶转移复发的患者)， 每例患者均口服 20mg顶体蛋白， 每日 3次， 服 用 3个月， 査体检査， 经统计有效率达到 87%， 显效率达到 59%， 治愈率达到 8%。将顶体蛋白试用于 226例抑郁症随机统计，每例患者均口服 20mg顶体蛋白， 每日 3次， 试用 1个月， 总有效率 89%, 治愈率 14%。
由此可见， 动物精液提纯物一顶体蛋白对子宫肌瘤、 乳房瘤、 胃癌、 肺 癌、 肝癌、 白血病、 大肠癌、 卵巢癌、 乳腺癌、 宫颈癌、 恶性淋巴瘤及治疗 抑郁症、 癫痫等疾病有临床应用价值。 顶体蛋白稳定性实验：
取顶体蛋白 20g， 加入无水乳糖 10g， 混合均匀， 测定顶体蛋白含量， 计 算粒重， 无菌条件下灌装胶囊， 制成 1000粒。 取灌装的 3批胶囊， 模拟市售 包装， 以顶体蛋白含量、 水分、 微生物限度 （仅在 0月和 24个月测定） 为检 査指标在温度 40°C±2°C、 相对湿度 75%±5%条件下进行 0、 1、 2、 3、 6个月 加速实验， 在温度 25°C±2°C、 相对湿度 60%±10%条件下进行 0、 3、 6、 9、 12、 18、 24个月长期实验， 并将结果与 0月比较， 可确定产品有效期为 24 个月。 结果见表 4。
表 4. 顶体蛋白稳定性实验结果
Figure imgf000010_0001
090401 2.1 94.6
3月 090402 1.8 95.0 1 1 1
090403 2.0 95.3
090401 2.3 94.3
6月 090402 2.0 94.7 1 1 1
090403 2.3 94.9
090401 2.3 94.1
9月 090402 2.2 94.4 1 1 1
090403 2.4 94.5
090401 2.5 93.9
12月 090402 2.4 94.2 1 1 1
090403 2.7 94.0
090401 2.8 93.5
18月 090402 2.7 93.9 1 1 1
090403 3.0 93.9
090401 3.2 93.0
24月 090402 3.0 93.2 30 30 未检出
090403 3.4 93.2
迄今为止， 国内外尚未有顶体蛋白治疗各种肿瘤及疾病的药物文献报道， 是医药技术领域有价值的新发明， 为国内外首先发现和揭示。

Claims

权利要求书
1、 顶体蛋白用于抑制癌细胞的扩散。
2、顶体蛋白用于抑制 MCF-7、 Bel7402、 BGC823、 A2780、 A549或 HCT-8 细胞的扩散。
3、 顶体蛋白在制备治疗癌症的药物中的应用。
4、 顶体蛋白在制备治疗抑郁症的药物中的应用。
5、 根据权利要求 3所述的顶体蛋白， 其特征在于： 所述癌症包括妇科肿 瘤、 消化道肿瘤、 肺癌、 肝癌、 白血病和恶性淋巴瘤。
6、 根据权利要求 5所述的顶体蛋白， 其特征在于： 所述妇科肿瘤包括子 宫肌瘤、 卵巢癌、 乳房瘤、 乳腺癌和宫颈癌； 所述消化道肿瘤包括食道癌、 胃癌、 大肠癌。
7、 根据权利要求 3至 6任一所述的顶体蛋白， 其特征在于： 所述顶体蛋 白用于制备胶囊、 颗粒、 片剂、 滴丸、 中西药复方制剂、 口服液或注射液。
8、 一种顶体蛋白的制备方法， 其特殊之处在于， 包括以下歩骤：
1]取动物精液或复溶的动物精液冻干粉， 向其中加入浓度为 1%〜5%的稀 酸溶液，再加入无机酸将 pH调节至 2〜5， 以 2000r/min〜8000r/min的转速离心 15〜30min后弃去沉淀物， 将得到的上清液合并， 浓縮； 选取动物精液时， 动 物精液与稀酸的质量比为 1 : 1〜1 :20；选取动物精液冻干粉时，动物精液冻干粉 与复溶溶剂水的质量比为 1 : 1〜1 :20，动物精液冻干粉复溶溶液与稀酸的比例为 质量比为 1 : 1〜1 : 16；
2]向歩骤 1处理所得的上清液中加入无机铵盐， 调节饱和度至 0.2-0.5后 放置 3-5小时， 再以 2000r/min〜8000r/min离心 15〜30min， 弃去上清液， 沉淀 用醋酸缓冲溶液溶解后， 得到顶体蛋白粗提物；
3]将经歩骤 3处理所得的蛋白粗提物进行柱层析，用醋酸缓冲溶液平衡洗 脱， 处理完成后收集洗脱液；
4]将洗脱液以 2000r/min〜8000r/min离心 5〜10min， 弃去上清液， 所得沉 淀洗涤后以 2000r/min〜8000r/min继续离心 1〜3次， 每次离心 5〜10min， 收集 沉淀， 即得到顶体蛋白。
9、 根据权利要求 8所述的顶体蛋白的制备方法， 其特征在于： 所述歩骤 1中， 稀酸溶液是浓度为 1.7%〜4.5%的醋酸溶液、 甲酸溶液、 丙酸溶液、 丁酸 溶液、 盐酸溶液、 硫酸溶液或磷酸溶液， 调节 pH的无机酸为 lmol/L的硫酸、 盐酸、 氢溴酸或磷酸， 调节 pH至 2.8〜4.6； 动物精液与稀酸的质量比为 1 :4; 选取动物精液冻干粉时， 动物精液冻干粉与复溶溶剂水的质量比为 1 : 10， 动 物精液冻干粉复溶溶液与稀酸的比例为质量比为 1 :5.5; 所述歩骤 2中无机铵 盐是硫酸铵、 硫酸氢铵、 碳酸铵、 碳酸氢铵或磷酸铵， 调节饱和度至 0.3后在 4°C环境中放置 3-5小时； 所述醋酸缓冲溶液是 pH=2， O. lmol/L的醋酸缓冲溶 液； 所述歩骤 3 中， 是用葡聚糖凝胶柱、 羟丙基葡聚糖凝胶柱、 丙烯酰胺凝 胶柱或琼脂糖凝胶柱进行柱层析， 所述醋酸缓冲溶液是 pH=2， O.lmol/L的醋 酸缓冲溶液， 醋酸缓冲溶液平衡洗脱的流速为 0.5ml/min， 处理完成后收集在 680nm处有最大吸收的洗脱液； 所述歩骤 4中， 洗涤沉淀使用纯蒸馏水； 所 述歩骤 1至 4中的离心转速为 2500r/min〜6000r/min。
10、 根据权利要求 9所述的顶体蛋白， 其特征在于： 所述动物精液冻干粉 为健康驴、 牛、 羊或马的精液冻干粉。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1232252A1 (en) * 1999-11-13 2002-08-21 Bayer Corporation Reversibly inactivated acidified plasmin
EP1551456A1 (en) * 2002-09-30 2005-07-13 Kowa Company Ltd. Pharmaceutical composition for prevention and treatment of kidney diseases
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1232252A1 (en) * 1999-11-13 2002-08-21 Bayer Corporation Reversibly inactivated acidified plasmin
EP1551456A1 (en) * 2002-09-30 2005-07-13 Kowa Company Ltd. Pharmaceutical composition for prevention and treatment of kidney diseases
CN101297818A (zh) * 2007-04-30 2008-11-05 李偃 一种动物精液药材及其在治疗肿瘤、抑郁症等多种疾病药物中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DA LAI ET AL.: "Purification and some properties of donkey acrosin", ACTA SCIENTIARUM NATURALIUM UNIVERSITATIS INTRAMONGOLICAE, vol. 17, no. 4, December 1986 (1986-12-01), pages 741 - 747 *
YANG TONGCHENG ET AL.: "Studies of acrosin from human sperm", JOURNAL OF FUJIAN NORMAL UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE), vol. 7, no. 2, June 1991 (1991-06-01), pages 56 - 59 *

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