WO2012147327A1 - 抗新型インフルエンザウイルス剤 - Google Patents

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extract
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karin
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清水　一史
玲子 黒田
成瀬　敦
桜井　孝治
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株式会社ロッテ
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    • A61K2236/39—Complex extraction schemes, e.g. fractionation or repeated extraction steps

Definitions

  • the present invention relates to an anti-new influenza virus agent, a novel influenza virus hemagglutination inhibitor, and a novel influenza virus adsorption inhibitor to cells, which comprises a plant-derived extract having an action of inhibiting infection of the novel influenza virus as an active ingredient.
  • the influenza virus that causes the influenza epidemic is an RNA virus having an envelope membrane with a diameter of about 1 / 10,000 mm. Although it is classified into three types, A, B, and C, due to the difference in antigenicity, it is A type and B type that show a trendy spread. Two types of glycoproteins, hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA), protrude in the form of spikes on the surface of these virus particles, and gene RNA segmented into 8 segments exists inside. HA and NA on the surface of the virus frequently mutate within the same subtype, and new antigenic variants appear every year.
  • HA hemagglutinin
  • NA neuraminidase
  • Influenza virus released by cough droplets enters from the human nose and mouth, adsorbs to the mucosal epithelial cells of the upper respiratory tract by the spike-like glycoprotein HA on the surface of the virus, and begins to proliferate after entering the cells.
  • Recent research has revealed the mechanism of viral infection.
  • the virus binds to a receptor consisting of a sugar chain on the surface layer of human target cells, is taken into the endosome, enters the cell by fusion of the viral membrane and endosomal membrane, undergoes shelling and translocation, and the expression of the viral gene Replication occurs, and finally progeny virus particles are formed and propagated by budding from the host cell membrane.
  • influenza virus causes symptoms such as sudden fever, headache, joint pain, general malaise in a few days, followed by respiratory symptoms such as cough, sore throat, runny nose and stuffy nose. Unlike the so-called cold, it is highly infectious and causes an explosive epidemic in a short period of time.
  • the structure of the HA protein of influenza virus repeats mutations every year, and the fact that antibodies produced by past infections are not very useful is also a factor that spreads infection.
  • antiviral drugs such as amantadine, rimantadine, and zanamivir have been developed, but side effects such as hypersensitivity, neuropsychiatric symptoms, digestive system symptoms, and autonomic nervous system symptoms have been reported. Caution must be taken.
  • influenza viruses are thought to be difficult to suppress by vaccination because influenza viruses infect and proliferate in the airway mucosal epithelium and the epidemic type of the year cannot be accurately predicted. Frequent gargling, avoiding throat dryness, and adequate nutrition and rest are currently considered the most effective preventive measures. Development of an anti-influenza virus agent that is highly effective in suppressing infection and has no safety problems and can be used on a daily basis is desired.
  • Non-patent Documents 1 and 2 polyphenol components of tea and black tea have been reported as anti-influenza materials derived from natural products (Non-patent Documents 1 and 2), and it has become clear that gargle of black tea suppresses actual viral infections through tests using humans. (Non-Patent Document 3). In addition, it has been reported that ougon-derived flavonoid components exhibit an influenza infection suppression effect due to viral sialidase inhibitory activity (Non-patent Document 4).
  • Patent Document 1 Kameda Futoshi Koshiketsu
  • Patent Document 2 Kuroburi Currant Extract
  • Patent Document 3 Potato Anthocyanin Pigment
  • Patent Document 4 Guava Leaf Extract
  • Rafu Hemp Antiviral effects such as an extract (Patent Document 5) and an olive leaf extract (Patent Document 7) have been reported.
  • an anti-influenza agent containing an extract of the flower bud or petal as an active ingredient is disclosed (Patent Document 6), an extract of Karin (Patent Document 8), and a column fraction of Karin.
  • Patent Document 9 Non-Patent Document 5
  • Anti-influenza virus effect, infection-inhibiting effect of Karin fraction by new plaque test method against new influenza virus (Non-Patent Document 6)
  • Karin extract is agglutination of erythrocytes by influenza virus (Non-patent Document 7) has been reported.
  • Karin Chaenomeles sinensis
  • the fruit part is eaten as Karin liquor, candied sugar, syrup, etc.
  • the fruit is called Meisa and is prescribed as a Chinese medicine with medicinal properties such as expectorant, antitussive, and analgesic.
  • We identified medicinal ingredients in karin fruits and reported triterpenes such as oleanolic acid as antibacterial components against hemolytic streptococci (Streptococcus pyogenes), the causative agent of pharyngitis, and polymer polyphenols as anti-inflammatory components. ing.
  • the present inventors have reported the hemagglutination suppression effect and the infection suppression effect with respect to seasonal influenza virus of the high molecular polyphenols in a karin fruit (patent document 9).
  • the object of the present invention is to use a highly safe plant extract that can be used with peace of mind on a daily basis, a novel influenza virus infection inhibitor, an agglutination inhibitor of erythrocytes by the novel influenza virus, and an inhibition of adsorption of the novel influenza virus to cells. Is to provide an agent.
  • the present inventors focused on Karin which has no side effects and is highly safe, and an extract of Karin in MDCK cells to which a new influenza virus is added, that is, an image rich in polyphenols in Karin fruit.
  • (CSD3) found infectious neutralizing activity against the new influenza virus A / Chiba / 1001/2009 (H1N1) pdm and the hemagglutination-inhibiting effect of the Karin fraction (CSD3) on the new influenza virus. Completed the invention.
  • the present invention relates to a novel influenza virus infection inhibitor characterized by comprising an extract of kalin (Chaenomeles sinensis, Pseudocydonia sinensis), a hemagglutination inhibitor in a novel influenza virus-infected cell, and a novel influenza virus cell It is an adsorption inhibitor. Furthermore, this invention is the food / beverage products which have an anti- new influenza virus effect
  • the present invention comprises a highly safe extract of karin as an active ingredient, an influenza virus infection inhibitor that is strong against new influenza viruses, an hemagglutination inhibitor in influenza virus-infected cells, and a novel influenza virus adsorption inhibitor to cells. It is to provide.
  • the extract of Karin which is an active ingredient of the present invention, has high safety, it is adsorbed, impregnated and added to a mask, air conditioner filter, clothing, wet tissue, spray solution, etc. Can be widely used in daily life.
  • it can be added to foods and drinks such as chewing gum, candy, tablet confectionery, beverages, etc., and can be used and taken on a daily basis as food and drink having an anti-new influenza virus action.
  • the product of the present invention is effective in preventing infection with a new influenza virus and treating diseases caused by the new influenza virus.
  • ⁇ It is desirable to use the fruits of karin as the raw material for the product of the present invention.
  • the method for obtaining the extract of the present invention from the pulverized plant is not particularly limited, but water, methanol, ethanol, n-propanol, and lower alcohols such as n-butanol, ether, ethyl acetate, acetone, glycerin, propylene glycol.
  • One or two or more mixed solvents of organic solvents such as these are added, and extraction is performed by a conventional extraction method.
  • the extraction condition is not particularly limited, but it is preferably about 1 to 5 hours at 50 to 90 ° C.
  • the extract can be filtered and the extraction solvent can be distilled off, followed by concentration or lyophilization under reduced pressure. Further, those obtained by fractionating and purifying these extracts by organic solvent fractionation, column chromatography or the like can also be used.
  • the form of use of the product of the present invention is not particularly limited, and powders, tablets, troches can be obtained by adding a solvent, a dispersant, a pharmaceutical carrier, an emulsifier, a diluent, a stabilizer, etc. to the plant extract exemplified as an active ingredient.
  • a solvent e.g., ethanol
  • emulsifier e.g., EDTA
  • a diluent e.g., diluent
  • a stabilizer emulsifier
  • a diluent emulsifier
  • a diluent emulsifier
  • a diluent emulsifier
  • a diluent emulsifier
  • a diluent e.g., diluent
  • a stabilizer e.g., diluent
  • etc. e.g., diluent
  • a stabilizer
  • an infection control product that can contribute to influenza prevention can be provided.
  • the amount of adsorbed and added plant extract in these applications varies depending on the form of the infection control product, and cannot be specified in general, but is added so that the proportion is 0.001 to 5% by weight. Is preferred.
  • the present invention is highly safe, for example, it is blended in confectionery such as chewing gum, candy, tablet confectionery, gummy jelly, chocolate and biscuits, ice cream, sorbet and other frozen confectionery, beverages, soups, jams and other foods and drinks, Can be used.
  • confectionery such as chewing gum, candy, tablet confectionery, gummy jelly, chocolate and biscuits, ice cream, sorbet and other frozen confectionery, beverages, soups, jams and other foods and drinks, Can be used.
  • the amount to be added varies depending on the form of use and the taste of the extract, but it is added in an amount of 0.001 to 5% by weight, preferably about 0.01 to 1% by weight, based on the food or drink. Is preferred.
  • H3N2 Eagle's minimum essential medium
  • H1N1 Mardin-Darby canine kidney
  • the A / Chiba / 1001/2009 (H1N1) pdm strain was inoculated into MDCK cells and grown for 2 days in a carbon dioxide incubator (37 ° C., 5% CO 2 ). Centrifugation was performed at 5,000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was used as a virus solution.
  • CSE50 is made turbid with water, and Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemical) column chromatography (column: 8 ⁇ 15cm) with 5 stages of water-containing ethanol (0%, 20%, 40%, 60%, 100% ethanol) Elution, CSD1 (water elution fraction: 14.5 g), CSD2 (20% ethanol elution fraction: 3.2 g), CSD3 (40% ethanol elution fraction: 3.7 g), CSD4 (60% ethanol elution fraction: 161 mg) ), 5 fractions of CSD5 (100% ethanol elution fraction: 161 mg) were obtained. Condensed polyphenol in each fraction was quantified by vanillin-hydrochloric acid method using (-)-epicatechin as a standard.
  • the infection neutralization value of each fraction was measured by plaque method using A / Udorn / 307/72 (H3N2). Add 0.1 ml of virus solution (1,000 PFU / ml) with an equal volume of 10-fold serial dilution, react for 30 minutes at room temperature, inoculate 100 ⁇ l into MDCK cells (6-well plate), and 60 minutes at room temperature Adsorbed. After adsorption, 1.6 ml of Leibovitz's L-15 medium (Life Technologies Japan Ltd.) containing 0.6% agarose, 1.5% gelatin and 2.5 ⁇ g / ml trypsin was added and solidified. After culturing at 34 ° C.
  • TGS 25 mM Tris, 140 mM sodium chloride, 5 mM potassium chloride, 0.7 mM sodium phosphate 12 hydrate, 5.6 mM glucose, pH 7.4 was used for dilution of virus and fractions.
  • each fraction of A / Udorn / 307/72 was obtained by eluting a 50% ethanol extract of Karin with 5 stages of aqueous ethanol using DiaionHP-20 and fractionating it into CSD1-5.
  • Table 1 shows the 50% infection neutralizing IC 50 and the polyphenol content for each.
  • CSD3 had the highest polyphenol content of 53.8%.
  • the hemagglutination titer (HA price) was measured using a 96-well plate.
  • the presence or absence of aggregation was judged, and the reciprocal of the highest dilution showing aggregation was taken as the HA value of each virus solution.
  • the inhibitory effect of hemagglutination on the new influenza virus A / Chiba / 1001/2009 (H1N1) pdm in the Cullin CSD3 fraction was evaluated by the HA titration reduction test.
  • Add equal volume of CSD3 solution (0: control, 0.1, 2, 10, 50, 500 ⁇ g / ml) to 0.1 ml virus solution (HA value: 32), react for 60 minutes at room temperature, and then measure HA value did.
  • the effect of A / Chiba / 1001/2009 (H1N1) pdm on hemagglutination inhibition by CSD3 treatment was evaluated by a hemagglutination titration reduction test.
  • the hemagglutination test is based on a reaction in which hemagglutinin on the surface of the virus binds to the receptor of erythrocytes, and is a test for evaluating the receptor binding ability of the virus.
  • CSD3 50 ⁇ g / ml or more, the hemagglutination effect of CSD3 itself was observed.
  • the hemagglutination reduction test for A / Chiba / 1001/2009 (H1N1) pdm was performed using CSD3 of 25 ⁇ g / ml or less.
  • the virus HA titer was 16 as in the untreated virus, and no reduction in hemagglutination titer was observed.
  • the treatment at 5 ⁇ g / ml was 8 and decreased to 1/2.
  • TCID 50 Measurement by TCID 50 method
  • the infection neutralizing activity was evaluated by an infectivity titer reduction test using the plaque method.
  • the infectivity of untreated virus was 1.0 ⁇ 10 7 PFU / ml.
  • CSD3 treatment confirmed the infection-inhibiting effect in a dose-dependent manner, and the infectious titre decreased to about 2/3 at 1 ⁇ g / ml, about 1/60 at 25 ⁇ g / ml, and about 1 / 10,000 at 250 ⁇ g / ml (FIG. 2).
  • the infectious titration reduction test using the TCID 50 method since there were many very small plaques and accurate measurement was difficult, it was evaluated by an infectious titration reduction test using the TCID 50 method.
  • infectious titer is suppressed to about 1/3 with 1 ⁇ g / ml CSD3 treatment, about 1/10 with 5 ⁇ g / ml, about 1/100 with 25 ⁇ g / ml, 1 / 3,000 with 250 ⁇ g / ml ( Figure 2).
  • TCID 50 evaluation cytopathic effect under the microscope (Cytopathic When TCID 50 was evaluated by observation of effect (CPE), the results were completely consistent.
  • the hemagglutination-inhibiting activity and infectious neutralizing activity against the new influenza virus A / Chiba / 1001/2009 (H1N1) pdm were evaluated.
  • the virus treated with CSD3 was found to have a hemagglutination titer of about 1/2 and an infectivity of about 1/10.
  • Treatment with 250 ⁇ g / ml reduced the infectivity titer to 1 / 3,000.
  • Prescription ethanol of spray liquid 25.0% by weight Citric acid 1.5% by weight Trisodium citrate 1.0 wt% CSD3 0.5 wt% Water remaining 100.0% by weight
  • Prescription sugar for tablet candy 76.1% by weight Glucose 19.0% by weight Sucrose fatty acid ester 0.2% by weight Fragrance 0.2 wt% CSD3 0.5 wt% Water remaining 100.0% by weight
  • the present invention can be widely used in daily life as a new influenza virus infection suppression product by adsorbing, impregnating and adding to a mask, an air conditioner filter, clothing, wet tissue, spray liquid, and the like. Furthermore, it can be added to various foods and drinks, and can be used and taken on a daily basis as foods and drinks having an anti-new influenza virus action.
  • the product of the present invention is effective in preventing infection with a new influenza virus and treating diseases caused by the new influenza virus. In other words, it can be expected to be applied as a new product development material as an infection prevention material.

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Abstract

　カリンを５０％エタノール水を用いて、抽出し、その抽出液をカラム分画して精製することにより得た抽出物を有効成分とすることを特徴とする抗新型インフルエンザウイルス剤。

Description

抗新型インフルエンザウイルス剤
　本発明は新型ンフルエンザウイルスの感染抑制作用を有する植物由来の抽出物を有効成分とする抗新型インフルエンザウイルス剤、新型インフルエンザウイルス赤血球凝集抑制剤、新型インフルエンザウイルスの細胞への吸着抑制剤に関する。
　毎年のようにインフルエンザの流行を引き起こすインフルエンザウイルスは直径１万分の１ミリメートル程度のエンベロープ膜を有するＲＮＡウイルスである。その抗原性の違いからＡ、Ｂ、Ｃの３つの型に分類されるが、流行的な広がりをみせるのはＡ型、Ｂ型である。これらのウイルスの粒子表面には、赤血球凝集素（ＨＡ）とノイラミニダーゼ（ＮＡ）という２種類の糖蛋白がスパイク状に突き出しており、内部には８本に分節した遺伝子ＲＮＡが存在する。ウイルスの表面にあるＨＡとＮＡは同一の亜型内で変異を頻繁に起こし、毎年のように新しい抗原変異株が出現する。
　咳による飛沫によって放出されたインフルエンザウイルスはヒトの鼻や口から侵入し、ウイルス表層のスパイク状糖蛋白質ＨＡにより上気道の粘膜上皮細胞に吸着し、細胞へ侵入後増殖を開始する。近年の研究により、ウイルスの感染メカニズムが明らかにされている。ウイルスはヒトの標的細胞の表層に存在する糖鎖よりなるレセプターに結合し、エンドゾームへ取り込まれ、ウイルス膜とエンドゾーム膜の融合により細胞内に侵入し、脱殻・移行を経て、ウイルス遺伝子の発現と複製がおこり、最後に宿主細胞膜からの出芽により子孫ウイルス粒子を形成し増殖する。
　インフルエンザウイルスの感染により数日で突然の発熱、頭痛、関節の痛み、全身倦怠感等の症状が現れ、それと前後して咳や喉の痛み、鼻水、鼻づまりなどの呼吸器症状が出現する。いわゆる風邪とは異なり、感染力が強く短期間で爆発的な流行を引き起こすのが特徴である。またインフルエンザウイルスのＨＡ蛋白質の構造は年ごとに変異を繰り返し、過去の感染によりできた抗体があまり役に立たないことも感染を広げてしまう要因になっている。
　インフルエンザウイルスの感染を抑制するためには、上皮細胞への吸着の阻害、細胞への侵入の阻害、遺伝子の転写・複製の抑制、蛋白質の合成阻害、細胞からの放出の抑制などが考えられ、それぞれが抗ウイルス薬のターゲットになっている。現在までに、アマンタジン、リマンタジン、ザナミビル等の抗ウイルス薬が開発されているが、過敏症、精神神経症状、消化器系症状、自律神経系症状等の副作用が報告されており、その応用に関しては注意が必要である。
　またインフルエンザウイルスは気道粘膜上皮で感染、増殖することや、その年の流行型が正確には予想できないことから、ワクチンの接種によって感染を抑えることも困難であると考えられている。頻繁なうがいと、喉の乾燥を避けること、栄養と休息を十分にとることなどが、現在最も有効な予防策と考えられている。感染抑制効果が高く、さらに安全性に問題がなく、日常的に利用できる抗インフルエンザウイルス剤の開発が望まれている。
　近年、天然物由来の抗インフルエンザ素材としてお茶や紅茶のポリフェノール成分が報告されており（非特許文献１及び２）、人を用いた試験により紅茶のうがいが実際のウイルス感染を抑えることが明らかになっている（非特許文献３）。またオウゴン由来のフラボノイド成分が、ウイルスのシアリダーゼ阻害活性によりインフルエンザ感染抑制効果を示すことが報告されている（非特許文献４）。さらに漢方製剤である桂枝二越婢一湯（特許文献１）、黒房すぐり抽出物（特許文献２）、馬鈴薯アントシアニン色素（特許文献３）、グァバ葉抽出物（特許文献４）、羅布麻抽出物（特許文献５）、オリーブ葉抽出物（特許文献７）等の抗ウイルス効果が報告されている。
　また、バラ科植物においては、その花蕾または花弁の抽出物を有効成分とする抗インフルエンザ剤が開示されており（特許文献６）、カリンの抽出物（特許文献８）、カリンのカラム分画物（特許文献９、非特許文献５）の抗インフルエンザウイルス効果、プラーク試験法によるカリン分画物の新型インフルエンザウイルスに対する感染抑制効果（非特許文献６）、さらにカリン抽出物がインフルエンザウイルスによる赤血球の凝集を抑制すること（非特許文献７）が報告されている。
　カリン（Chaenomeles sinensis）は、中国が原産の落葉性高木であり、果実部はカリン酒や砂糖漬け、シロップ等にして食されている。その果実はメイサと呼ばれ、去痰、鎮咳、鎮痛等を薬効とした漢方として処方されている。カリン果実中の薬効成分の同定を行い、咽頭炎の原因菌である溶血性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）に対する抗菌性成分としてオレアノール酸などのトリテルペン類を、抗炎症成分として高分子ポリフェノール類を報告している。本発明者らは、カリン果実中の高分子ポリフェノール類の季節性インフルエンザウイルスに対する赤血球凝集抑制効果と感染抑制効果を報告している（特許文献９）。
　しかしながら、本願発明特許に示したカリンのカラム分画物が新型インフルエンザウイルスによる赤血球の凝集を抑制する効果、および新型インフルエンザウイルスの細胞への吸着抑制効果に関する報告はみられず、本願発明により初めて明らかにされたものである。インフルエンザは、毎年のように流行を繰り返しており、時折パンデミックと呼ばれる世界的大流行を引き起こす。2009年3月、メキシコを発端として発生したH1N1新型ウイルスによるインフルエンザもその一つである。今回、新型インフルエンザウイルスA/Chiba/1001/2009(H1N1)pdmに対してカリン抽出物に赤血球凝集抑制効果および感染抑制効果が認められた。
特開平６－１９９６８０号公報 特開２０００－２１２０９２公報 特開２００１－３１６３９９公報 特開２０００－２７３０４８公報 特開平１１－７１２９６号公報 特開２００２－1４５７９０公報 特表２００２－０２０３０５公報 特開２００５－３４３８３６号公報 ＰＣＴ／ＪＰ２０１０／００５７６２明細書
感染症学雑誌，６８（７）８２４－８２９（１９９４） 感染症学雑誌，７０（１１）１１９０－１１９２（１９９６） 感染症学雑誌，７１（６）４８７－４９４（１９９７） Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３８（５）１３２９－１３３２（１９９０） Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，　１１８，１０８－１１２（２００８） フードニュース、４３（１）１５５－１５７（２００９） Ｊ　Ａｇｒｉｃ．　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ．５３，　９２８－９３４　（２００５）
　本発明の目的は、日常的に安心して使用できる安全性の高い植物抽出物を用いて、新型インフルエンザウイルス感染抑制剤、新型インフルエンザウイルスによる赤血球の凝集抑制剤、新型インフルエンザウイルスの細胞への吸着抑制剤を提供することである。
　上記課題を解決するために、本発明者らは副作用がなく安全性の高いカリンに着目し、新型インフルエンザウイルスを添加したＭＤＣＫ細胞におけるカリンの抽出物、すなわちカリン果実中のポリフェノールを豊富に含む画分（ＣＳＤ３）が、新型インフルエンザウイルス　Ａ／Ｃｈｉｂａ／１００１／２００９（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍに対して感染性中和活性およびカリン分画部物（ＣＳＤ３）の新型インフルエンザウイルスに対する赤血球凝集抑制効果を見出し、本発明品を完成させた。
　すなわち、本発明は、カリン（Chaenomeles sinensis, Pseudocydonia sinensis）の抽出物を有効成分とすることを特徴とする新型インフルエンザウイルス感染抑制剤、新型インフルエンザウイルス感染細胞における赤血球凝集抑制剤、新型インフルエンザウイルスの細胞への吸着抑制剤である。さらに、本発明は、カリン抽出物を含有する抗新型インフルエンザウイルス作用を有する飲食品である。
　本発明は安全性の高いカリンの抽出物を有効成分とし、新型インフルエンザウイルスに対して強いインフルエンザウイルス感染抑制剤、インフルエンザウイルス感染細胞における赤血球凝集抑制剤、新型インフルエンザウイルスの細胞への吸着抑制剤を提供するものである。また、本発明の有効成分であるカリンの抽出物は安全性が高いことから、マスク、エアコンフィルター、衣類、ウェットティッシュ、スプレー液等に吸着、含浸、添加することにより、新型インフルエンザウイルス感染抑制用品として日常生活において広く利用することができる。さらに、チューインガム、キャンディ、錠菓、飲料等の飲食物に添加し、抗新型インフルエンザウイルス作用を有する飲食物として日常的に利用、摂取することも可能である。本発明品は新型インフルエンザウイルスの感染予防や、新型インフルエンザウイルスに起因する疾病の治療に有効である。
カリン抽出物ＣＳＤ３の赤血球凝集抑制効果を示すグラフである。 カリン抽出物ＣＳＤ３のA/Chiba/1001/2009(H1N1)pdm感染性中和活性（プラーク法）を示すグラフである。 カリン抽出物ＣＳＤ３のA/Chiba/1001/2009(H1N1)pdm感染性中和活性（TCID50法）を示すグラフである。
　本発明品の原料となるカリンにおいてはその実を使用することが望ましい。
　上記植物の粉砕物から本発明の抽出物を得る方法については特に限定しないが、水、メタノール、エタノール、ｎ-プロパノール並びにｎ－ブタノール等の低級アルコール、エーテル、酢酸エチル、アセトン、グリセリン、プロピレングリコール等の有機溶剤の１種または２種以上の混合溶媒を加えて、従来行なわれている抽出方法によって抽出する。しかし、本発明の抗インフルエンザウイルス剤を経口で摂取することを考慮すると、安全性の面から水、エタノールもしくはその混合液を用いて抽出することが望ましい。
　抽出条件としては特に制限はないが、５０～９０℃で１～５時間程度が望ましい。抽出液を濾過し、抽出溶剤を留去したあと、減圧下において濃縮または凍結乾燥したものを使用することができる。また、これらの抽出物を有機溶剤分画、カラムクロマトグラフィー等により分画精製したものも使用することができる。
　本発明品の利用形態については特に制限はなく、有効成分として例示した植物抽出物に溶剤、分散剤、製剤用担体、乳化剤、希釈剤、安定剤等を添加することにより、散剤、錠剤、トローチ剤、吸入剤、うがい薬、含漱剤、座剤、注射剤等任意の製剤として調製することが可能であり、投与経路として経口投与、気道投与、静脈内投与、直腸投与、皮下投与、皮内投与等を例示することができる。この場合成人への投与量は各抽出物で１０～２０００ｍｇ／日が好ましいが、この値に制限されるものではない。各種製剤への抽出物の添加量としては、その製剤の形態によって異なるが、０．００１重量％以上、好ましくは約０．０１重量％以上の割合になるように添加するのが好適である。
　また、本発明を、マスク、エアコンフィルター、衣類、ウェットティッシュ、スプレー液等に吸着、含浸、添加することにより、インフルエンザ予防に寄与しうる感染抑制用品を提供することができる。これらの用途における植物抽出物の吸着、添加量は、その感染抑制用品の形態に応じて異なり、一概に規定することは出来ないが、０．００１～５重量％の割合になるように添加するのが好適である。
　また本発明は安全性が高いことから、例えばチューインガム、キャンディ、錠菓、グミゼリー、チョコレート、ビスケット等の菓子、アイスクリーム、シャーベット等の冷菓、飲料、スープ、ジャム等の飲食物に配合し、日常的に利用することが可能である。添加量としては、その利用形態および抽出物の呈味性によって異なるが、飲食品に対して０．００１～５重量％、好ましくは約０．０１～１重量％の割合になるように添加するのが好適である。
　以下実施例、試験例を挙げて本発明を具体的に説明するが本発明はこれらに限定されるものではない。
細胞株およびウイルスの調製
　細胞はMardin-Darby canine kidney (MDCK) 細胞を用いて、10%ウシ胎仔血清を含むEagle’s minimum essential medium (EMEM)で培養した。インフルエンザウイルスは、A/Udorn/307/72(H3N2)及びA/Chiba/1001/2009(H1N1)pdmを用いた。A/Udorn/307/72は、発育鶏卵（11日卵）漿尿膜腔内に接種し増殖させ、Temperature-Sensitive Mutants of Influenza A/Udorn/72(H3N2) Virus. Virology　117, 45-61 (1982)に記載の方法で精製した。A/Chiba/1001/2009(H1N1)pdm株はMDCK細胞に接種し、炭酸ガス培養機（37℃、5%CO2）内で2日間増殖させた。5,000rpmで5分間遠心し、その上清液をウイルス液とした。
カリン中の活性成分の精製
　カリン（C.sinensis Koehne）の乾燥果実は、中国の湖北省の市場から入手した。乾燥果実100gを50％エタノール（700ml）で1時間還流抽出し、ろ過後、抽出液を減圧濃縮および凍結乾燥させることによりカリンの50%エタノール抽出物（CSE50）を得た（23g）。CSE50を水により懇濁させ、Diaion HP-20（三菱化学）カラムクロマトグラフィー（カラム：8×15cm）により5段階の含水エタノール（0%、20%、40%、60%、100% エタノール）により溶出させ、CSD1（水溶出画分：14.5g）、CSD2（20％　エタノール溶出画分：3.2g）、CSD3（40%　エタノール溶出画分：3.7g）、CSD4（60％　エタノール溶出画分：161mg）、CSD5（100％　エタノール溶出画分：161mg）の５つの画分を得た。各画分中の縮合型ポリフェノールは(-)-epicatechinをスタンダードとして用いバニリン-塩酸法により定量した。
各カリン分画物のポリフェノール含有量および感染中和価の測定
　各画分の感染中和価は、A/Udorn/307/72(H3N2)を用いて、プラーク法により測定した。0.1mlのウイルス液（1,000PFU/ml）に等量の分画物10倍段階希釈液を加え、室温で30分間反応させ、100μlをMDCK細胞（6穴プレート）に接種し、室温で60分間吸着させた。吸着後、0.6%アガロース、1.5%ゼラチン、2.5μg/mlトリプシンを含むLeibovitz’s L-15培地（Life Technologies Japan Ltd.）を1.6ml添加し、固化した。34℃で3日間培養した後、出現したプラーク数を計測し、50%感染中和濃度（IC50）を求めた。ウイルス及び分画物の希釈にはTGS（25mM トリス、140mM 塩化ナトリウム、5mM 塩化カリウム、0.7mM リン酸ナトリウム12水和物、5.6mM グルコース、pH7.4）を用いた。
　実施例２のように、カリンの50％エタノール抽出物を、DiaionHP-20を用いて5段階の含水エタノールで溶出させCSD1～5に分画した各フラクションのA/Udorn/307/72(H3N2)に対する50％感染中和IC50およびポリフェノール含量を表１に示した。CSD3画分が最も高い感染抑制効果（IC50=0.8μg/ml）を有していた。また、CSD3はポリフェノール含量が53.8%と最も高かった。
　そこで、以後の実験ではCSD3を用いて新型インフルエンザウイルスA/Chiba/1001/2009(H1N1)pdmに対する抗ウイルス効果を評価することとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 a；A/Udorn/307/72に対する50％感染中和濃度
b；エピカテキン換算、n=3、平均値±標準偏差
CSD3処理の新型インフルエンザウイルスA/Chiba/1001/2009(H1N1)pdmに対する赤血球凝集減少試験
　赤血球凝集価（HA価格）の測定は、96穴プレートを用いて行った。リン酸緩衝生理食塩水で各濃度のCSD3処理ウイルスの2倍段階希釈液系列（50μl）を作り、0.5％(v/v)鶏赤血球50μlを添加し、４℃で1時間静置後、赤血球凝集の有無を判定し、凝集を示す最高希釈の逆数を各ウイルス液のHA価とした。カリンCSD3画分の新型インフルエンザウイルスA/Chiba/1001/2009(H1N1)pdmに対する赤血球凝集抑制効果をHA価減少試験により評価した。0.1mlのウイルス液（HA価：32）に等量のCSD3液（0：コントロール，0.1、2、10、50、500μg/ml）を加え、室温で60分間反応させた後、HA価を測定した。
　上記の方法に従い、CSD3処理によるA/Chiba/1001/2009(H1N1)pdmの赤血球凝集抑制効果を、赤血球凝集価減少試験により評価した。赤血球凝集試験はウイルス表面のヘマグルチニンが赤血球のレセプターと結合する反応に基づくものであり、ウイルスのレセプター結合能を評価する試験である。50μg/ml以上のCSD3では、CSD3自身の赤血球凝集作用が観察されたため、A/Chiba/1001/2009(H1N1)pdmに対する赤血球凝集価減少試験は、25μg/ml以下のCSD3を用いて行った。1μg/ml以下ではウイルスのHA価は、非処理ウイルスと同様16であり、赤血球凝集価の減少は観察されなかった。5μg/mlの処理では8であり1/2に減少した。25μg/mlでは検出限界（2）未満に減少した（図1）。以上の結果から、カリン分画物の新型インフルエンザによる赤血球凝集抑制効果、細胞への新型インフルエンザウイルス吸着抑制効果が認められた。
新型インフルエンザウイルスA/Chiba/1001/2009(H1N1)pdmに対するCSD3の感染価減少試験
　カリンCSD3画分の新型インフルエンザウイルスA/Chiba/1001/2009(H1N1)pdmに対する感染性中和効果を感染価減少試験により評価した。0.1 mlのウイルス液（2×107PFU/ml、HA価：32）に等量のCSD3液（0：コントロール、0.1、2、10、50、500μg/ml）を加え、室温で60分間反応させ、感染価をプラーク法および　Tissue　Culture　Infectious　Dose　50%（TCID50）法により測定した。 
　ｉ)プラーク法による測定
　各濃度のCSD3処理ウイルスの10倍段階希釈液系列を作り、100μlをMDCK細胞（6穴プレート）に接種し、前述の方法でプラークを計数した。感染価はPFU（plaque forming units）/mlで表した。 
　ii)TCID50法による測定
　各濃度のCSD3処理ウイルスの10倍段階希釈液系列を2.5μg/mlトリプシンを含むMEMで作り、200μlをMDCK細胞（24穴プレート）に接種し、炭酸ガス培養機で37℃3日間培養した。培養後、上清液中の赤血球凝集活性の有無により感染を判定し、TCID50量を求めた。
　上記の方法に従い、感染中和活性を、プラーク法による感染価減少試験により評価した。未処理ウイルスの感染価は1.0×107PFU/mlであった。CSD3処理により、用量依存的に感染抑制効果が確認され、1μg/mlでは約2/3、25μg/mlでは約1/60、250μg/mlでは約1/10,000に感染価が減少した（図2）。しかし、極小なプラークが多く正確な計測が困難であったため、TCID50法による感染価減少試験により評価した。
　TCID50法による測定の結果、1μg/mlのCSD3処理では約1/3、5μg/mlでは約1/10、25μg/mlでは約1/100、250μg/mlでは1/3,000に感染価が抑制された（図2）。また、TCID50の評価と同時に、顕微鏡下で細胞変性効果（Cytopathic
effect：CPE）の観察によるTCID50の評価を行ったところ、結果は完全に一致していた。
　5μg/mlのCSD3処理では、赤血球凝集価の減少は約1/2であったが、感染価の減少は約1/10であった。感染価の減少は赤血球凝集価の減少の５倍であり、CSD3は新型インフルエンザウイルスA/Chiba/1001/2009(H1N1)pdmの吸着以降のウイルス増殖過程を主に抑制することが示唆された。
　以上の結果から、カリン中の活性画分CSD3を用いて、新型インフルエンザウイルスA/Chiba/1001/2009(H1N1)pdmに対する赤血球凝集抑制活性および感染性中和活性を評価したところ、5μg/mlのCSD3で処理したウイルスは赤血球凝集価が約1/2に、感染性が約1/10に減少することが明らかになった。250μg/mlの処理では感染価は1/3,000に減少した。これらの結果は、カリン中の抗インフルエンザウイルス活性成分は、H1N1新型インフルエンザウイルスに対しても有効であることを示す。更に、赤血球凝集価の減少以上に感染性が減少したことからウイルス吸着段階以降における抑制作用の存在が示唆された。
　実施例１で調製したカリン抽出物を用いて、うがい薬、吸入剤、トローチ剤、スプレー液、チューインガム、キャンディ、錠菓、飲料、粉末剤、錠剤、含漱剤、グミゼリー、チョコレート、ビスケット、アイス、シャーベット、スープ、ジャム、ウェットティッシュ、マスクを調製した。以下に実施例としてその処方を示した。
うがい薬の処方
エタノール　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．０　　重量％
香料　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０　　重量％
サッカリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０５　重量％
塩酸クロルヘキシジン　　　　　　　　　　　　　０．０１　重量％
ＣＳＤ３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．５　　重量％
水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　残
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００．０　　重量％
吸入剤の処方
エタノール　　　　　　　　　　　　　　　　　　５．０　　重量％
ＣＳＤ３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０　　重量％
水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　残
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００．０　　重量％
トローチ剤の処方
ブドウ糖　　　　　　　　　　　　　　　　　　７２．３　　重量％
乳糖　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１９．０　　重量％
アラビアゴム　　　　　　　　　　　　　　　　　６．０　　重量％
香料　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０　　重量％
モノフルオロリン酸ナトリウム　　　　　　　　　０．７　　重量％
ＣＳＤ３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０　　重量％
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００．０　　重量％
スプレー液の処方
エタノール　　　　　　　　　　　　　　　　　２５．０　　重量％
クエン酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．５　　重量％
クエン酸三ナトリウム　　　　　　　　　　　　　１．０　　重量％
ＣＳＤ３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．５　　重量％
水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　残
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００．０　　重量％
チューインガムの処方
ガムベース　　　　　　　　　　　　　　　　　２０．０　　重量％
砂糖　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５４．７　　重量％
グルコース　　　　　　　　　　　　　　　　　１５．０　　重量％
水飴　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　９．３　　重量％
香料　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．５　　重量％
ＣＳＤ３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．２　　重量％
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００．０　　重量％
キャンディの処方
砂糖　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５０．０　　重量％
水飴　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３４．０　　重量％
クエン酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０　　重量％
香料　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．２　　重量％
ＣＳＤ３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．４　　重量％
水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　残
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００．０　　重量％
錠菓の処方
砂糖　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　７６．１　　重量％
グルコース　　　　　　　　　　　　　　　　　１９．０　　重量％
ショ糖脂肪酸エステル　　　　　　　　　　　　　０．２　　重量％
香料　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．２　　重量％
ＣＳＤ３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．５　　重量％
水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　残
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００．０　　重量％
飲料の処方
オレンジ果汁　　　　　　　　　　　　　　　　　３０．００　重量％
異性化糖　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５．２４　重量％
クエン酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１０　重量％
ビタミンＣ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０４　重量％
香料　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１０　重量％
ＣＳＤ３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１０　重量％
水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　残
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００．００　重量％
粉末剤の処方
トウモロコシ澱粉　　　　　　　　　　　　　　　５５．０　　重量％
カルボキシセルロース　　　　　　　　　　　　　４０．０　　重量％
ＣＳＤ３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５．０　　重量％
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００．０　　重量％
錠剤の処方
ラクトース　　　　　　　　　　　　　　　　　　７０．０　　重量％
結晶性セルロース　　　　　　　　　　　　　　　１５．０　　重量％
ステアリン酸マグネシウム　　　　　　　　　　　　５．０　　重量％
ＣＳＤ３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．０　　重量％
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００．０　　重量％
含漱剤の処方
エタノール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．００　重量％
香料　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．００　重量％
サッカリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０５　重量％
塩酸クロルヘキシジン　　　　　　　　　　　　　　０．０１　重量％
ＣＳＤ３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．５０　重量％
水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　残
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００．００　重量％
グミゼリーの処方
ゼラチン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０．００　重量％
水飴　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２３．００　重量％
砂糖　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　８．５０　重量％
植物油脂　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４．５０　重量％
マンニトール　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．９５　重量％
レモン果汁　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．００　重量％
ＣＳＤ３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０５　重量％
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００．００　重量％
　本発明は、マスク、エアコンフィルター、衣類、ウェットティッシュ、スプレー液等に吸着、含浸、添加することにより、新型インフルエンザウイルス感染抑制用品として日常生活において広く利用することができる。さらに、種々の飲食物に添加し、抗新型インフルエンザウイルス作用を有する飲食物として日常的に利用、摂取することも可能である。本発明品は新型インフルエンザウイルスの感染予防や、新型インフルエンザウイルスに起因する疾病の治療に有効である。すなわち、感染予防素材として、新製品開発の素材としての応用が期待できる。
　この出願は２０１１年４月２６日に出願された日本国特許出願第２０１１－０９８２３０号からの優先権を主張するものであり、その内容を引用してこの出願の一部とするものである。

Claims (5)

  1. 　カリン（Chaenomeles sinensis,Pseudocydonia sinensis）の抽出物を有効成分とすることを特徴とする抗新型インフルエンザウイルス剤。
  2. 　カリンを５０％エタノール水を用いて、抽出し、その抽出液をカラム分画して精製することにより得た抽出物を有効成分とすることを特徴とする抗新型インフルエンザウイルス剤。
  3. 　カリンを５０％エタノール水を用いて、抽出し、その抽出液をカラム分画して精製することにより得た抽出物を有効成分とすることを特徴とする新型インフルエンザウイルスによる赤血球の凝集抑制剤。
  4. 　カリンを５０％エタノール水を用いて、抽出し、その抽出液をカラム分画して精製することにより得た抽出物を有効成分とすることを特徴とする新型インフルエンザウイルスの細胞への吸着抑制剤。
  5. 　カリン抽出物を含有する抗新型インフルエンザウイルス作用を有する飲食品。

     
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