WO2012130951A1 - Aptamers that are specific for immunoglobulin-binding cell wall proteins - Google Patents
Aptamers that are specific for immunoglobulin-binding cell wall proteins Download PDFInfo
- Publication number
- WO2012130951A1 WO2012130951A1 PCT/EP2012/055655 EP2012055655W WO2012130951A1 WO 2012130951 A1 WO2012130951 A1 WO 2012130951A1 EP 2012055655 W EP2012055655 W EP 2012055655W WO 2012130951 A1 WO2012130951 A1 WO 2012130951A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- protein
- aptamer
- binding
- aptamers
- target
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
- G01N33/56944—Streptococcus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
- G01N33/56938—Staphylococcus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/16—Aptamers
Definitions
- the present invention relates to an aptamer which binds to microorganisms containing protein A, G or L, protein A, G or L or protein A, G or L, in particular Staphylococcus aureus, Streptococcus or Peptostreptococcus, uses of the aptamer and methods for Detection and enrichment of protein A, G or L, protein A, G or L-containing substances or protein A, G or L-containing microorganisms in which the aptamer is used.
- Staphylococcus aureus is a globular, Gram-positive, pathogenic bacterium. S. aureus occurs almost everywhere in nature, also on the skin and in the upper airways of 25 to 30% of all humans. Particularly dangerous are antibiotic-resistant forms and especially multi-drug resistant forms. These come in heaped
- S. aureus diseases that are caused by S. aureus include sepsis, skin and wound infections, pneumonia, abscesses, boils, endocarditis, osteomyelitis, food poisoning from S. aureus exotoxins, and bovine mastitis.
- S. aureus has hitherto been carried out by means of cultivation or immunological and molecular biological methods (antibody assays, PCR-based methods).
- the methods are either time consuming or expensive. It was therefore an object of the present invention to provide specific substances which enable rapid, simple and reliable detection of S. aureus.
- Immunoglobulin-binding cell wall proteins binding to substances containing an immunoglobulin-binding cell wall protein and to microorganisms containing an immunoglobulin-binding cell wall protein, wherein the immunoglobulin-binding cell wall protein is selected from the group consisting of or consisting of protein A, G or L.
- the aptamer in the sense of the previous paragraph means that the aptamer can also bind to other immunoglobulin-binding cell wall proteins or to substances or microorganisms containing another immunoglobulin-binding cell wall protein than said proteins A, G or L.
- an aptamer which binds to protein A, G or L, protein A, G or L-containing substances as well as protein A, G or L-containing microorganisms, in particular Staphylococcus aureus, Streptococcus or Peptostreptococcus.
- the aptamer according to the invention is specific for protein A, G or L.
- the aptamer according to the invention is a nucleic acid aptamer, in particular a
- Single-stranded DNA ssDNA
- RNA aptamer RNA aptamer
- the aptamer binds to a substance containing an immunoglobulin-binding cell wall protein, or to a microorganism that binds an immunoglobulin
- Cell wall protein contains, means in particular means that the aptamer to the cell wall protein, which is present in the substance or which part of the
- Is microorganism binds.
- the aptamer binds to the
- aptamer refers in the prior art to short single-stranded nucleic acid oligomers, also referred to as oligonucleotides, capable of specifically binding to a target structure or target molecule, also referred to as a target,
- Ring structures stacking forces through electron interaction with neighboring bases
- electrostatic interactions e.g., van der Waals, ion, dipole forces
- hydrogen bonds e.g., hydrogen bonds
- nucleic acid aptamers are distinguished, for example, from DNA aptamers formed from single-stranded DNA (ssDNA) and RNA aptamers.
- Aptamers are characterized by the formation of aptamers specific three-dimensional structure, which depends on the nucleic acid sequence. This structure enables aptamers, analogous to an antigen-antibody binding to bind target structures accurately.
- a particular nucleic acid sequence of an aptamer may, under defined conditions, have a three-dimensional structure that is specific to a defined target structure. The three-dimensional structure of an aptamer arises, among other things, as a result of intramolecular base pairings according to Watson and Crick and Hoogsteen base pairings (quadruplex).
- an aptamer according to the invention contains protein A, G or L, a protein A, G or L-containing substance or a protein A, G or L.
- Microorganism binds, or is specific, means that it binds to one or more targets selected from protein A, G or L, a substance containing protein A, G or L or a microorganism containing protein A, G or L.
- Protein A, protein G and protein L are bacterial cell wall proteins. They belong to a group of proteins that contain repeating domains that can bind immunoglobulins.
- Protein G is a protein found in the cell wall of bacteria of the genus Streptococcus. Depending on the Streptococcus strain, it has a molecular mass of about 58 to 65 kDa and has two or three homologous binding domains with high affinity for the Fc region of immunoglobulins, in particular of the isotype IgG, at the C terminus. It also binds to albumin proteins via three homologous domains N-terminal to the IgG binding region. At the N-terminus, protein G has another binding region (region E) for human alpha-2 globulin in the native conformation, also termed s-form. Exemplary protein G representatives have the UniProt (Universal Protein Database) Nos.
- Protein L is a protein found in the cell wall of Peptostreptococcus magnus. Similar to protein A and G, it is also capable of binding immunoglobulins, especially immunoglobulins containing the kappa-type light chains.
- aptamers Due to their specificity for protein A, G or L, aptamers are present
- Substances are substances which are firmly bound to protein A, G or L, for example by a covalent bond, hydrogen bonds or a complex bond
- the aptamers according to the invention are also specific for recombinantly produced protein A, protein G or protein L, for example recombinantly produced in E. coli protein A, G, or L.
- protein A, protein G and protein L also mutation forms of these proteins, ie altered protein A, G or L compared to the wild type, for example, caused by artificial or natural gene mutations include.
- Aptamers according to the invention which are specific for protein A, G or L, protein A, G or L-containing substances or protein A, G or L-containing microorganisms can be obtained for example with the SELEX method (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) , Basic work on the SELEX process is from Tuerk and Gold, Science 249 (1990) 505-510, and Ellington and Szostak, Nature 346 (1990) 818-822. SELEX processes are further disclosed in US 5,567,588 and US 5,270,163.
- a combinatorial random library consisting of single-stranded DNA (ssDNA) oligonucleotides is first generated.
- the oligonucleotides have an internal variable region, for example 40-60 nucleotides, flanked at the 5 'and 3' ends of primer regions.
- the primer regions serve as Primer binding sites for a PCR amplification.
- Combinatorial random libraries can be obtained from commercial providers.
- the variability of a library is for example in the range of about 10 15 different molecules.
- Selection and amplification steps are cyclically enriched the oligonucleotides that bind best to the target.
- Each cycle consists of the following substeps:
- the selected and enriched oligonucleotide pool is called
- a SELEX process for the isolation of aptamers of the invention is described in more detail in the accompanying examples.
- An exemplary method for the discovery of aptamers according to the invention is the so-called FluMag-SELEX method in which fluorescence-labeled ssDNA molecules and magnetic beads (beads) as
- Immobilization matrix can be used for the target. This method, which was used in the accompanying examples, is also described in: R. Stoltenburg et al. (2005) FluMag-SELEX as an advantageous method for DNA aptamer selection, Anal. Bioanal. Chem. 383, 83-91.
- aptamers according to the invention can be prepared by conventional techniques of chemical DNA and RNA synthesis, which are known to the person skilled in the art. If the sequence of a DNA aptamer is known, then an RNA aptamer having the same sequence can be prepared by conventional synthetic methods. Furthermore, the binding properties of individual aptamers to the target can be investigated.
- the aptamers according to the invention are synthetic oligonucleotides, which in particular were selected according to the SELEX method just described from an underlying synthetic combinatorial oligonucleotide library or are subsequently prepared by conventional synthesis methods.
- the invention relates to an aptamer which binds to microorganisms containing protein A, G or L, protein A, G or L or protein A, G or L and which is selected from the group consisting of
- an aptamer comprising, or consisting of, a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 65, with the proviso that thymine may be replaced by uracil,
- the functionality of the aptamers from a) -f), ie the binding to protein A, G or L-containing substances or protein A, G or L-containing microorganisms, can be estimated by a secondary structure analysis of the aptamers.
- the functionality of other variants mentioned in this description can thus be estimated.
- Modeling of the possible secondary structure of aptamers can be done using the "mfold" program (version 3.1 or 3.5), which is freely available on the Internet
- Binding buffer composition 100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.6, 10 mM MgCl 2 , 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2 .
- the invention includes aptamers whose sequence has an identity of at least 70%, preferably at least 80%, or at least 85%, or at least 90%, or at least 93%, or at least 95%, or at least 96%, or at least 97% , and most preferably at least 98%, having any of the sequences of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 65.
- identity is to be understood as meaning the number of matching nucleotides (identity), expressed in percent
- identity between two relevant nucleic acid sequences is preferably determined with the aid of computer programs.
- identity is to be determined so that the number of nucleotides sharing the shorter sequence with the longer sequence determines the percentage of identity
- the identity is determined using the known and publicly available computer program ClustalW2
- the definition of identity in the ClustalW2 program and its method of discovery, which are publicly available, are expressly referred to in this invention.
- ClustalW2 is publicly available from the European Bioinformatics Institute (EBI) of the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) and is available on the Internet at http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/.
- EBI European Bioinformatics Institute
- EMBL European Molecular Biology Laboratory
- the ClustalW2 computer program is used to determine the identity between eg the nucleotide sequence
- DNA Weight Matrix IUB
- CAP OPEN 10
- CAP EXTENSION 0.20
- CAP DISTANCES 5
- NO END GAPS no
- ITERATION none
- NUMBER 1;
- the invention also relates to any aptamer that hybridizes to the complementary strand of an aptamer according to the invention described above, provided that such an aptamer contains substance A, G or L, a protein A, G or L-containing substance or a protein A, G or L containing organism, in particular Staphylococcus aureus, Streptococcus or Peptostreptococcus binds.
- hybridization in the context of this invention means a hybridization under conventional hybridization conditions, preferably under stringent conditions, as described, for example, in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed. (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
- nucleic acid molecules for example, be isolated from DNA libraries.
- the identification and isolation of such nucleic acid molecules can thereby using the above
- Nucleic acid molecules SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 65
- parts of these molecules or the reverse complements of these molecules are carried out, e.g. by hybridization by standard methods (see, e.g., Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A
- Fragments used as a hybridization probe may also be synthetic fragments or oligonucleotides prepared by conventional methods
- the invention also provides an aptamer which is derived from an aptamer having one of the sequences of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 65 in that one of the sequences of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 65 or multiple nucleotides substituted, deleted (deletion), inserted within the sequence (inserted) and / or am 5'-end and / or 3'-end are added, wherein such an aptamer to protein A, G or L, a protein A, G or L-containing substance or a protein A, G or L-containing organism, in particular Staphylococcus aureus, Streptococcus or Peptostreptococcus binds.
- Such altered aptamers preferably have an identity of at least 70%, or at least 80%, or at least 85%, or at least 90%, or at least 93%, or at least 95%, or at least 96%, or at least 97%, and most preferably at least 98% with one of
- Sequences of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 65 The term identity has been previously defined.
- a sequence in which one or more nucleotides are substituted is also referred to as a substitution mutant, a sequence in which one or more nucleotides are deleted, as a deletion mutant and a sequence in which one or more nucleotides are inserted, as an insertion mutant.
- up to 60 nucleotides are substituted, deleted, and / or inserted, more preferably up to 50 nucleotides, even more preferably up to 40 nucleotides, or up to 30 nucleotides, in particular preferably up to 10 nucleotides or up to 8 nucleotides or up to 5 nucleotides, more preferably up to 3 nucleotides, and most preferably up to 2 nucleotides.
- nucleotides When added, preferably up to 100 nucleotides are added at the 5 'and / or 3' end of the aptamer, more preferably up to 50 nucleotides, even more preferably up to 40 nucleotides, or up to 20 nucleotides, most preferably up to 10 nucleotides or up to 8 nucleotides, most preferably up to 5 nucleotides.
- motifs ATACCAGCTTATTCAATT SEQ ID NO: 66
- ACAATCGTAATCAGTTAG SEQ ID NO: 67
- Substantially unchanged means that up to a maximum of 5 nucleotides, preferably a maximum of 4 nucleotides, most preferably a maximum of 3 nucleotides, are substituted, deleted and / or inserted in this motif.
- Adjuncts may, for example, be oligonucleotides which act as spacers between the Aptamer sequence and a label or to an oligonucleotide having a sequence which is complementary to a labeled oligonucleotide, as described in WO20051 13817.
- Fragments also referred to as parts or subsequences, have the previously
- Fragments are obtained by cleaving at the 5 'end and / or at the 3' end of a
- Aptamers removes one or more nucleic acids. Fragments are preferably at least 10, more preferably at least 15 and more preferably at least 20 nucleotides in length, most preferably at least 30 or at least 40 nucleotides in length. Fragments are, for example, those aptamers in which the motifs ATACCAGCTTATTCAATT (SEQ ID NO: 66) and / or
- ACAATCGTAATCAGTTAG (SEQ ID NO: 67) are completely or partially removed.
- derivative in the context of the present invention refers to an aptamer which has a chemical structure which does not occur in natural DNA or RNA.
- the term derivative denotes an aptamer containing a chemical structure other than deoxyribose, ribose, phosphate, adenine (A), guanine (G), cytosine (C), thymine (T), or uracil (U).
- An aptamer derivative may be modified at the nucleobase, at the pentose or at the phosphate backbone.
- derivative refers to an aptamer
- derivatives include, but are not limited to,
- Aptamers which have at least one nucleotide an alkylation, arylation or acetylation, alkoxylation, halogenation, an amino group or another functional group.
- modified nucleotides are 2'-fluoro ribonucleotides, 2'-NH 2 -, 2'-OCH 3 - and 2'-O-methoxyethyl ribonucleotides, which are used for RNA aptamers.
- Labeled aptamers also referred to as labeled aptamers.
- Labels are visual, optical, photonic, electronic, acoustic, opto-acoustic, mass, electrochemical, electro-optical, spectrometric, enzymatic, or otherwise chemically, biochemically, or physically detectable.
- Labels can be, for example, tethered reporter, marker or adapter molecules. Examples of these are labeled aptamers whose
- marker substances are given below in the explanation of methods according to the invention, in which labeled aptamers can be used.
- RNA or DNA Phosphodiselenoate RNA or DNA, locked nucleic acid (LNA), peptide nucleic acid (PNA), N3'-P5 'phosphoramidate, phosphoroamidate RNA or DNA
- RNA / DNA cyclohexene nucleic acid (CeNA), tricyclo-DNA (tcDNA) or aptamer, or have the phosphoramidate morpholine (PMO) components (see also Chan et al., Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology (2006) 33, 533-540).
- PMO phosphoramidate morpholine
- aptamers Some of the modifications allow aptamers to be stabilized against nucleic acid-cleaving enzymes.
- the stabilization does not affect the affinity of the modified RNA / DNA aptamers, but prevents the rapid decomposition of the Aptamers in an organism or biological solutions by RNases / DNases.
- An aptamer is referred to as stabilized in the context of the invention if the half-life in biological sera is greater than one minute, preferably greater than one hour, more preferably greater than one day.
- the aptamers can also be used
- Reporter molecules may be modified, which can contribute to the detection of the labeled aptamers also to increase the stability.
- the invention relates to an aptamer which binds to microorganisms containing protein A, G or L, protein A, G or L or protein A, G or L and which is selected from the group consisting of
- an aptamer comprising, or consisting of, a nucleic acid sequence having SEQ ID NO: 62, with the proviso that thymine may be replaced by uracil
- Nucleotides are substituted, deleted, inserted and / or attached, in particular an aptamer having a sequence according to SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4,
- the invention relates to an aptamer which binds to microorganisms containing protein A, G or L, protein A, G or L or protein A, G or L and which is selected from the group consisting of
- an aptamer comprising, or consisting of, a nucleic acid sequence having SEQ ID NO: 63, with the proviso that thymine may be replaced by uracil
- an aptamer whose nucleic acid sequence has an identity of at least 70% with the nucleic acid sequence of an aptamer from a), in particular an aptamer having a sequence according to SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 8,
- Nucleotides are substituted, deleted, inserted and / or attached, in particular an aptamer having a sequence according to SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 8,
- the invention relates to an aptamer which binds microorganisms containing protein A, G or L, protein A, G or L or protein A, G or L and which is selected from the group consisting of
- an aptamer comprising, or consisting of, a nucleic acid sequence having SEQ ID NO: 64, with the proviso that thymine may be replaced by uracil
- Nucleotides are substituted, deleted, inserted and / or attached, in particular an aptamer having a sequence according to SEQ ID NO: 9 to SEQ ID NO: 10, e) a fragment of an aptamer according to a), b), c) or d), and
- the invention relates to an aptamer which binds microorganisms containing protein A, G or L, protein A, G or L or protein A, G or L and which is selected from the group consisting of a) an aptamer comprising, or consisting of, a nucleic acid sequence having SEQ ID NO: 65, with the proviso that thymine may be replaced by uracil, b) an aptamer whose nucleic acid sequence has an identity of at least 70% with the nucleic acid sequence of an aptamer from a), in particular an aptamer having a sequence according to SEQ ID NO: 1 1 to SEQ ID NO: 12,
- Nucleotides are substituted, deleted, inserted and / or added, in particular an aptamer having a sequence according to SEQ ID NO: 1 1 to SEQ ID NO: 12, e) a fragment of an aptamer according to a), b), c) or d) , and
- a specific embodiment of the invention relates to an aptamer which binds to microorganisms containing protein A, G or L, protein A, G or L-containing substances or protein A, G or L, and which is selected from the group consisting of
- an aptamer comprising, or consisting of, a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 65, wherein
- an oligonucleotide having the sequence 5' ATACCAGCTTATTCAATT 3 '(SEQ ID NO: 66) is removed and / or
- an oligonucleotide having the sequence 5' ACAATCGTAATCAGTTAG 3 '(SEQ ID NO: 67) is removed,
- an aptamer whose nucleic acid sequence has an identity of at least 70% with the nucleic acid sequence of an aptamer from a), c) an aptamer which hybridizes with the complementary strand of an aptamer from a),
- an aptamer in which one or more nucleotides are substituted, deleted, inserted and / or attached to an aptamer from a), e) a fragment of an aptamer according to a), b), c) or d), and
- embodiments of the invention include embodiments in which an oligonucleotide with the sequence 5 'ACAATCGTAATCAGTTAG 3' (SEQ ID NO: 67) is removed at the 3 ' end of the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 65.
- the binding ability of the aptamers according to the invention is determined by the affinity
- the invention relates to a medicament, in particular for
- prophylaxis Diagnosis, prophylaxis and / or treatment of diseases attributable to Staphylococcus aureus, Streptococcus and / or Peptostreptococcus comprising one or more different aptamers of the invention as described above.
- prophylaxis it may be meant, for example, that Staphylococcus aureus, Streptococcus or Peptostreptococcus are rendered harmless by attachment of an aptamer according to the invention and thus infection of an organism is prevented.
- the invention also relates to the use of the aptamers according to the invention for the diagnosis, prophylaxis, treatment and / or treatment of diseases based on
- a pharmaceutical according to the invention is any agent which can be used in the prophylaxis, diagnosis, therapy, follow-up or after-treatment of patients who at least temporarily exhibit a pathogenic modification of the overall condition or condition of individual parts of the patient's organism.
- the medicine can be a medicine for humans as well as for animals.
- Diseases attributable to Staphylococcus aureus and treatable with a pharmaceutical composition according to the invention are, in particular, sepsis, skin and wound infections, pneumonias, abscesses, boils, carbuncles, endocarditis, muscle diseases (pyomyositis), Osteomyelitis, food poisoning by S. aureus exotoxins, Toxic shock syndrome (TSS) sepsis and mastitis in animals.
- TSS Toxic shock syndrome
- the medicament according to the invention preferably contains pharmaceutically acceptable excipients and / or carriers which are known to the person skilled in the art.
- the medicament may comprise the aptamer as a pharmaceutically acceptable salt.
- these may be, for example, salts of inorganic acids, e.g. the phosphoric acid, or salts of organic acids.
- the particular dose or dose range for the administration of the medicament according to the invention is large enough to achieve the desired prophylactic or therapeutic effect of binding to protein A, G or L. In general, the dose will vary with the age, constitution and gender of the patient, as well as the severity of the disease
- the medicament may also comprise further active ingredients, such as, for example, in order to promote the medicinal effect.
- further active ingredients such as, for example, in order to promote the medicinal effect.
- Antibody any active ingredient that is suitable for the treatment of a patient.
- the drug of the present invention may be administered orally, transmucosally, rectally, pulmonarily, enterally and / or parenterally.
- Preferred is a direct injection into the body.
- the chosen mode of administration will depend on the indication, dose to be administered, individual-specific parameters, etc. In particular, the different modes of administration will allow for site-specific therapy that minimizes side effects and reduces the drug dose.
- Preferred injections are the intradermal, subcutaneous, intramuscular or intravenous injection.
- the application can, for example, with the help of so-called vaccine guns that bring the DNA by means of gold balls into the skin, or by means of syringes, which bring the DNA under the skin or into the muscle to happen.
- the aptamer is also possible to provide the aptamer as an aerosol which is inhaled by the organism, preferably a human patient.
- pharmaceutically acceptable adjuvants such as adjuvants, may be added to the pharmaceutical compositions produced therefrom.
- adjuvants any substance which makes possible, amplifies or modifies an effect with the DNA aptamers according to the invention is an adjuvant.
- adjuvants are, for example
- Aluminum compounds e.g. Aluminum hydroxide or aluminum phosphate, saponins, e.g. QS 21, muramyl dipeptide or muramyl tripeptide, proteins, e.g.
- TNF Gamma interferon or TNF, MF 59, phosphate dibylcholine, squalene or polyols.
- the pharmaceutical agent can be present for example as a tablet, capsule, powder, solution, dispersion or suspension.
- the dosage forms of the pharmaceutical agent are with the usual solid or liquid carriers and / or
- the invention relates to a method for the detection of protein A, G or L, substances containing protein A, G or L or microorganisms containing protein A, G or L, in particular Staphylococcus aureus, Streptococcus or Peptostreptococcus, in which
- one or more different aptamers of the invention as described above are contacted with a sample containing protein A, G or L containing substance A, G or L or the microorganism, and
- the method can be both a qualitative and a quantitative detection method.
- the process steps a) and b) can be carried out simultaneously or substantially simultaneously, depending on the concrete process design.
- the method is particularly suitable for use in the food, water and
- the method is particularly suitable for the detection of Staphylococcus aureus in any media and environments, especially in water and other liquids, such as in drinking and wastewater samples.
- the aptamer of the present invention binds to Protein A, which exists in the cell wall and is accessible to the aptamer.
- the aptamer may also bind to other germs containing protein A, G or L, for example as a surface protein in the cell wall. If the protein A, G or L does not sit on the surface of a microorganism, it is possible to destroy the organism in order to release protein A, G or L contained therein for detection.
- a sample in the sense of the above detection method is a material provided or sampled which is believed to contain protein A, G or L, protein A, G or L-containing substance or a microorganism containing protein A, G or L (in summary referred to as “target” or as part of this detection method as “analyte”), and that on the
- Presence Target should be checked.
- a sample may be a water sample, in particular a drinking water, groundwater, surface water or wastewater sample, a sample of other environmental sampled material, a clinical sample or a food sample.
- a sample may further be any biological material isolated from individuals, for example, biological tissues and fluids, including but not limited to: Blood, skin, plasma, serum, lymph, urine, cerebrospinal fluid, tears, smears,
- components of cell cultures are also included in samples.
- the sampling takes place in particular so that the extracted subset corresponds to an average of the total amount.
- the characteristics determined by examination of the sample are used to assess the amount detected by the sample, which in turn allows conclusions to be drawn about the total amount, for example the blood or the lymph in an organism.
- the Pre-treated samples such as by mixing, addition of enzymes or markers, or purified.
- an aptamer-target complex is formed by binding the aptamer the target.
- the binding or binding event can be detected, for example, visually, optically, photonically, electronically, acoustically, opto-acoustically, by mass, electrochemically, electro-optically, spectrometrically, enzymatically, or otherwise chemically, biochemically or physically.
- the aptamer is fixed on a surface, for example, and the change in layer thickness after addition of the target is determined by one of the methods mentioned, such as, for example, about a change in the optical properties of the sensor layer (e.g., refractive index).
- Another method of label-free detection is the measurement of the mass change after binding of the aptamer to the target with a microbalance, or the measurement of a
- the complex may be visualized by labeling, for example, in an indicator reaction following direct or indirect coupling of a complex partner with a complex
- Labeling substance Either the used aptamer or the target can be provided with a label. Preferably, the aptamer is labeled.
- Preferred labels are visual, optical, photonic, electronic, acoustic, opto-acoustic, mass, electrochemical, electro-optical, spectrometric, enzymatic, or otherwise physically, chemically, or biochemically detectable.
- the label is detected by luminescence, UV / VIS spectroscopy, enzymatically, electrochemically or radioactively.
- Luminescence refers to the emission of light.
- photoluminescence, chemiluminescence and bioluminescence are used for detection of the label.
- photoluminescence or fluorescence the excitation takes place by absorption of photons.
- fluorophores include, without limitation, bisbenzimidazole, fluorescein, acridine orange, Cy5, Cy3 or propidium iodide, which can be covalently coupled to aptamers, tetramethyl-6-carboxyhodamine (TAMRA), Texas Red TR, rhodamine, Alexa fluorine dyes (inter alia, fluorescent dyes of various wavelengths from different companies).
- TAMRA tetramethyl-6-carboxyhodamine
- Alexa fluorine dyes inter alia, fluorescent dyes of various wavelengths from different companies.
- the evaluation is done visually or with appropriate measuring instruments, eg in the Multilabel Counter, in the fluorescence microscope, or by flow cytometry, eg in
- Chemiluminescence describes the emission of visible light as a result of a chemical reaction.
- Bioluminescence refers to the emission of visible light as a result of an enzyme reaction, such as a redox reaction catalyzed by the enzyme luciferase.
- colloidal metallic particles e.g. Gold nanoparticles, colloidal non-metallic particles, quantum dots, organic polymers, latex particles, or liposomes with signal-producing substances. Colloidal particles can be detected colorimetrically.
- markers enzymes whose enzymatic reaction is characterized by the consumption or formation of detectable substrates or products, without limitation, optical or electrochemical detection.
- Evidence may e.g. with enzymes as labeling substances that convert substrates into colored products, preferably peroxidase, green fluorescent protein (GFP), luciferase, [beta] -galactosidase or alkaline
- the colorless substrate X-Gal is converted by the activity of [beta] -galactosidase to a blue product whose color is visually detected.
- alkaline phosphatase Various proofs are possible with alkaline phosphatase (AP), as exemplified below: electrochemical detection: substrate phenylphosphate, enzymatic reaction of APP forms phenol, is electrochemically detected on phenol sensor (eg with immobilized tyrosinase)
- substrate AMPPD (2 '-Spiroadamantan) -4- methoxy-4- (3 "-phosphoryloxy) phenyl-1, 2-dioxetane
- APP converts 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP or X-phosphate) and nitroblue tetrazolium salt (NBT) in color.
- BCIP or X-phosphate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate
- NBT nitroblue tetrazolium salt
- the peroxidase catalyzes, for example, the oxidation of ABTS (2,2'-azino-bis- [3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid]) in the presence of H 2 0 2 .
- Horseradish peroxidase is preferred because of its enzyme stability and a variety of possible substrates.
- Other enzyme markers that catalyze the generation of detectable products are chloramphenicol acetyltransferase (CAT) and glutathione S-transferase (GST).
- the detection can also be carried out by means of radioactive isotopes with which the aptamer is labeled, preferably 3H, 14C, 32P, 33P, 35S or 125 I, particularly preferably 32P, 33P or 1251.
- radioactive isotopes with which the aptamer is labeled, preferably 3H, 14C, 32P, 33P, 35S or 125 I, particularly preferably 32P, 33P or 1251.
- scintillation counting the radiolabelled aptamer target Complex emitted radioactive radiation indirectly measured.
- Scintillator substance is excited by the radioactive radiation. During the transition to the ground state, the excitation energy is released again as flashes of light, which are amplified and counted by a photomultiplier.
- the aptamers can also be labeled with digoxigenin or biotin, which are bound, for example, by antibodies or streptavidin, which in turn can carry a label, such as an enzyme conjugate. If the antibody is coupled to an enzyme, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) can be used to demonstrate what will be explained below.
- ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
- the prior covalent attachment (conjugation) of an antibody to an enzyme can be accomplished in several known ways. Detection of antibody binding may also be radioactive in an RIA (radioactive immunoassay) with radioactive isotopes, preferably 125 I, or by fluorescence in a FIA (fluoroimmunoassay) with fluorophores, preferably with fluorescein or FITC.
- RIA radioactive immunoassay
- FIA fluoroimmunoassay
- the said methods preferably include washing steps to separate unbound and / or unspecifically bound aptamers and / or detection reagents.
- the implementation of all detection methods is known to the person skilled in the art.
- Direct detection of the label is preferred in the present method of the invention, especially direct detection by fluorescence.
- the detection is carried out in situ.
- This reaction requires a suitable incubation space on which the detection can be easily performed and visualized.
- a solid support is advantageously used, which makes it possible to fix sample, aptamers and, if necessary, detection reagents of the complexes.
- the aptamers can be applied to the solid support either before or after the sample. Methods of immobilization of the aforementioned aptamers are known to the person skilled in the art. Examples are given below. All proofs that have already been mentioned above, such as mark-free proof and evidence with the use of a marking, can be considered for the proof. In the case of a color detection, the aptamers can be marked so that a reading and evaluation can be realized directly after the incubation.
- the aptamer according to the invention alone or a mixture of different aptamers according to the invention can be used in the methods explained above and in all other methods disclosed by this invention.
- Aptamers according to the invention can also be used in combination with other aptamers.
- a combination with other aptamers for other targets ie other targets than protein A, G or L, protein A, G or L-containing substances, and protein A, G or L-containing microorganisms
- the sample or the aptamer can be immobilized on a solid phase, depending on the process design.
- (micro) arrays of the aptamer according to the invention, or microtiter plate test systems can be used in the process.
- the detection method described above can be carried out analogously to known immunoassays, wherein, in comparison to a known immunoassay, one or more antibodies are replaced by an aptamer according to the invention.
- the detection method in the form of a competitive assay or a sandwich assay.
- an aptamer of the invention specific for the target is bound to a solid phase. This is followed by the addition of the sample solution which contains the target to be measured and is simultaneously mixed with a known concentration of labeled target.
- Sample solution in unknown concentration present unlabelled target as well as the labeled target compete for binding to the bound aptamer.
- concentration of the target in the sample the less tagged target will be bound to the aptamer.
- By detecting and optionally quantitating the label it is possible to detect the target in the sample and to measure its concentration.
- an aptamer according to the invention which is specific for the target is also first bound to a solid phase. It is bound to labeled target. The measurement of the mark gives the
- the primary antibody In a classical immunological sandwich assay, at least two antibodies are used. First, one of the two antibodies is immobilized on a solid phase. This is called the primary antibody or as a catcher. After addition of the sample, the antigen contained therein binds to the primary antibody. Subsequently, the sample solution is removed and the second antibody called secondary antibody or detector is added in dissolved form to the solid phase. The detector now also binds to the antigen bound by the primary antibody. For detection and quantification, the secondary antibody is either self-labeled or detected via a labeled reagent. In the present invention, this process is modified so that either the primary antibody or as a catcher. After addition of the sample, the antigen contained therein binds to the primary antibody. Subsequently, the sample solution is removed and the second antibody called secondary antibody or detector is added in dissolved form to the solid phase. The detector now also binds to the antigen bound by the primary antibody. For detection and quantification, the secondary antibody is either self-labeled or detected
- Primary antibody or the secondary antibody, or both, are replaced by an inventive aptamer and that the antigen containing a target for the aptamer, so protein A, G or L, a protein A, G or L-containing substance or protein A, G or L. Microorganism, is.
- the assay can be carried out with all known solid phases, for example microtiter plates, strips, membranes, cuvettes etc.
- protein A, G or L Detection of protein A, G or L, protein A, G or L containing substances or microorganisms containing protein A, G or L, in particular Staphylococcus aureus, Streptococcus or Peptostreptococcus, in which
- step a) can be carried out using all conventional techniques, which are also known from immunological assays.
- the detection in step d) can be carried out in the case of an antibody by the known methods known from immunological direct and indirect sandwich assays. Either the antibody itself may be labeled, for example by attachment of an enzyme capable of catalyzing a color reaction for detection, or a third antibody may be added which in turn binds to the second antibody and has a label. If an aptamer is used in step c), this is preferably a labeled aptamer, which can be detected with suitable detection reactions, as previously described. Between said steps a) -d) are preferably
- the invention relates to a method for enrichment
- Containing a complex or complexes of the aptamer (s) and protein A, G or L, from the aptamer (s) and the protein A , G or L-containing substance or from the Aptamer (s) and the protein A, G or L-containing microorganism is formed,
- the complex (s) and the remaining sample are separated from each other, and c) optionally protein A, G or L, the protein A, G or L-containing substance or the microorganism containing the protein A, G or L from the complex is isolated.
- sample in the sense of this method is defined as well as a sample in the sense of the previously described detection method
- Water sample such as a sample of drinking water, groundwater, surface water, or sewage, a sample of other environmentally extracted material, or a food sample.
- This method is also used in particular in food, water and environmental analysis, water treatment and water treatment, especially of drinking water and wastewater, diagnostics and in hospitals and
- a “separation" of protein A, G or L, protein A, G or L-containing substance or a protein A, G or L-containing microorganism (collectively referred to as "target") from a sample may, in the context of the analytical
- Detection limit be complete or incomplete.
- Staphylococcus aureus, Streptococcus, or Peptostreptococcus can be separated from environments in which it is undesirable, for example, from aqueous or other liquid samples.
- Enrichment is achieved in step b) when the formed aptamer-target complex and the remaining sample are separated from each other Two fractions are obtained, wherein in the fraction containing the complex, the complex is enriched "Enrichment” may refer to the complex comprising aptamer and protein A, G or L, from aptamer and protein A, G or L-containing substance or from
- Aptamer and the protein A, G or L-containing microorganism is formed, or on the protein A, G or L, the protein A, G or L-containing substance or the protein A, G or L-containing microorganism (collectively referred to as "target"
- process step c) can be carried out, in other words an enrichment means an increase in the concentration of the aptamer-target complex or of the target itself.
- isolation may refer to the complex formed from aptamer and protein A, G or L, from aptamer and protein A, G or L containing substance or from aptamer and protein A, G or L containing microorganism , or on the protein A, G or L, the protein A, G or L-containing substance or the microorganism itself containing the protein A, G or L itself. Therefore, the last process step is optional.
- complex refers to the structure formed upon binding of the aptamer to its target
- complex refers to an aptamer-target structure in which the aptamer is attached to the target.
- aptamer-target binding occurs predominantly, but not necessarily exclusively, via the structural compatibility, so-called “stacking interactions" in aromatic compounds
- Ring structures stacking forces through electron interaction with neighboring bases
- electrostatic interactions e.g., van der Waals, ionic, dipole forces
- the said process steps a), b) and c) can take place simultaneously, depending on the process design, and in particular the process steps a) and b) can take place simultaneously.
- the formation of the aptamer-target complex can be promoted by tempering to the optimum aptamer-target binding temperature, preferably 20-25 q C, and / or stirring the sample.
- aptamer-target complexes are separated from the remaining sample solution. Suitable methods are known to those skilled in the art, e.g. Dialysis,
- the aptamer-target complex is separated in optional step c).
- physicochemical effects such as a variation of salt concentration or pH or heat denaturation conceivable.
- further purification of the target is possible, whereby the aptamer can be degraded beforehand, e.g. by acid (thermal) hydrolysis or DNases. If the aptamer is immobilized, the target can be eluted, e.g. from a column, which is then regenerated and reused.
- the aptamers can also be immobilized on a solid phase, more specifically on the surface of a solid phase, preferably via a spacer molecule, which can be, for example, a linker nucleic acid.
- a spacer molecule which can be, for example, a linker nucleic acid.
- suitable methods of immobilization are known in the art, both with a covalent coupling and a non-covalent coupling by means of suitable affinity pairs, such as Biotin / streptavidin may be associated.
- the solid phase may be, for example, plates, strips, membranes, films, gels, beads, micro- and nanoparticles.
- Exemplary carrier materials are inorganic and organic polymers, ceramics, glasses, metals, in particular noble metals. These include plastics, for example based on polystyrene.
- biopolymers preferably cellulose, dextran, agar, agarose and Sephadex, which may be functionalized, in particular as nitrocellulose or cyanogen bromide Sephadex, can be used as polymers in the process according to the invention.
- Aptamers can be bound to magnetic beads whose surface contains, for example, tosyl or epoxy groups, amino or carboxyl groups or streptavidin
- the separation, enrichment, and / or isolation method just described is an affinity chromatography method in which an aptamer according to the invention is immobilized on a solid phase, preferably on beads or beads
- the corresponding targets can be enriched starting from low concentrations.
- the invention also relates to the use of the previously described aptamer for detecting, enriching, separating and / or isolating protein A, G or L, protein A, G or L-containing substances or protein A, G or L-containing
- Microorganisms in particular Staphylococcus aureus, Streptococcus or
- the aptamer can be used in the previously explained methods.
- the term enrichment includes the purification of the target.
- the invention also relates to methods for quantifying the binding of an immunoglobulin to protein A, G or L, which method a) protein A, G or L or a microorganism containing a protein A, G or L is provided,
- the mentioned immunoglobulin binds to the same epitope of the protein A, G or L as the aptamer according to the invention.
- epitopes then means that they are the same epitopes which occur multiple times because several protein A, G or L molecules are used in the process and / or because protein A, G or L has several epitopes of the same type
- Step c) of the method binds the aptamer to protein A, G or L molecules to which no immunoglobulin has bound
- the amount of bound protein A, G or L is determined in step d), for example by fluorescence labeling over the intensity Binding can be determined for an array of protein A, G or L by the recognizable location of the label.
- the aptamer and the immunoglobulin bind to different epitopes. However, due to steric hindrance, the aptamer in step c) no longer binds to protein A, G, or L molecules to which immunoglobulin has already bound. In step c) of the method, the aptamer binds to protein A, G or L molecules to which no immunoglobulin has bound.
- the invention also relates to the use of the previously described aptamer for quantifying the binding of
- Immunoglobulins on protein A, G or L are particularly suitable as an assay for medical diagnostics.
- protein A, G or L or the microorganism containing the protein A, G or L can take place in various ways.
- protein A, G or L or the protein A, G or L containing microorganism in a be provided liquid phase in a defined amount. It is also possible to immobilize the aptamer in a defined amount on a solid phase or to immobilize protein A, G or L or the microorganism in a defined amount on a solid phase.
- the solid phase may be, for example, plates such as microtiter plates, strips, membranes, films, gels, beads, micro- and nanoparticles.
- step b) an immunoglobulin is added which binds to protein A, G or L or to protein A, G or L present in the cell wall of the microorganism.
- the antibody is usually suspended in a liquid phase.
- step b) If protein A, G or L or the microorganism are bound to a solid phase, after step b), preferably unbound antibody is removed by washing, for example with a suitable washing buffer. There are after the step b), and optionally a washing step, antibody-coated protein A, G or L molecules / microorganisms and not occupied with antibody protein A, G or L molecules / microorganisms, here referred to as "mixture" Step, the mixture is brought into contact with inventive aptamer, the aptamer binds to unassociated protein A, G or L.
- step c) preferably unbound aptamer is removed by washing, for example with a suitable washing buffer.
- Has bound microorganism A bond between the aptamer and protein A, G or L or the microorganism can be detected as previously explained in the detection method according to the invention.
- a labeled aptamer is used.
- Another use of the aptamer according to the invention relates to the use of blocking or quantifying free binding sites on protein A, G or L.
- protein A, G or L modified surfaces e.g. Beads or microtiter plates.
- the aptamers can be used for Blocking of the immobilized protein A, G or L - binding sites are used. This presupposes that the aptamer and the other protein A, G or L binding substance have the same binding site in the protein A, G or L or influence each other in their binding ability.
- the aptamers may be used to quantify the binding sites left after immobilization, or in other words, to control the
- the invention also relates to an aptamer probe for the detection of protein A, G or L, protein A, G or L containing substances or protein A, G or L-containing microorganisms, in particular Staphylococcus aureus, Streptococcus or Peptostreptococcus, wherein the probe Aptamer according to the invention and a labeling agent (label).
- the label may be attached to the aptamer in a variety of ways, for example, but not limited to, covalent binding, complexation, DNA / RNA hybridization.
- a labeling agent can be bound to an aptamer of the invention as in
- WO20051 13817 describe.
- WO20051 13817 describes an aptamer with an attached oligonucleotide tail and a linker oligonucleotide carrying a label, wherein the sequence of the linker oligonucleotide is complementary to the sequence of the oligonucleotide tail of the aptamer such that the linker oligonucleotide is attached to the oligonucleotide tail of the oligonucleotide tail Aptamers hybridizes and the aptamer is labeled.
- Another possibility is the binding of biotin to the aptamer and the binding of label to streptavidin. A biotin-streptavidin bond binds the label to the aptamer.
- labeling agents are basically usable, which can be bound to DNA or RNA. Concrete examples of labeling substances have been given above in the explanation of methods according to the invention in which labeled
- the label is a dye.
- the marking agent is a substance that imparts an image through the labeled aptamer in an imaging procedure.
- the image may be generated by radiation that produces an image directly visible to the human eye, or by radiation that is not directly visible, for example
- Labeling agents may be, for example, luminescence, phosphorescence, fluorescence, radioactive, or UV / VIS labeling substances.
- the probe according to the invention can be used in particular for the detection, enrichment, separation and / or isolation methods described in this description, in particular in assays for detecting microorganisms containing protein A, G or L or protein A, G or L, such as Staphylococcus aureus , Streptococcus or
- Assays may e.g. direct and indirect sandwich assays.
- the invention relates to a biosensor comprising a
- Such a biosensor according to the present invention preferably comprises the following elements:
- a transducer that converts the binding event between aptamer and target into an electrically quantifiable signal.
- Signal processing device an output electronics, a display device, a data processing device, a data storage and interfaces to other devices be present.
- the biological receptor of the aptamer biosensor preferably has the aptamer according to the invention in immobilized form or consists only of the aptamer in immobilized form.
- the function of the receptor is the recognition of the analyte based on a biochemical mechanism, here the binding of the
- Aptamers according to the invention to its target protein A, G or L, protein A, G or L-containing substance, protein A, G or L-containing microorganism. From a sample that comes into contact with the biosensor, such as a complex one Mixture containing target, the target can be identified and quantified via the specific binding of the aptamer.
- the specificity of the biosensor is dictated by the receptor, while the
- Sensitivity of the sensor is mainly influenced by the transducer used.
- the aptamer-target binding taking place at the receptor is converted by the transducer into an electronically usable signal.
- the transducer converts the signal from the selective recognition reaction of the receptor (binding target to aptamer), which is proportional to the concentration of the target in the sample, into an electrically quantifiable measurement signal. Signaling occurs due to the molecular interaction between the target and the aptamer.
- biosensor preferably qualitative, quantitative and / or semi-quantitative analytical information can be obtained. It is particularly suitable for use in food, water and environmental analysis, water treatment and water treatment, in particular of drinking water and wastewater, in diagnostics and for use in hospitals and
- the coupling between receptor and transducer is preferably carried out by the
- Immobilization of the aptamer on the transducer surface for example via a streptavidin-biotin bond, wherein preferably the aptamer is linked to biotin and the surface of the transducer has immobilized streptavidin.
- the binding of the target to the aptamer according to the invention can be measured, for example, via optical, microgravimetric, thermal or acoustic transducers, preferably via optical or microgravimetric transducers.
- optical transducers can be based on principles of photometry, whereby, for example, color or luminescence intensity changes are detected.
- Optical methods include the measurement of fluorescence, phosphorescence, bioluminescence and chemiluminescence, infrared transitions and light scattering.
- the optical methods also include the measurement of layer thickness changes when target is bound to aptamer.
- the layer thickness change may e.g. by means of
- Microgravimetric transducers include QCM sensors (Quartz Crystal
- Microbalance that detect mass change when targeting aptamer.
- Quartz crystal which is highly sensitive to mass changes that occur when target binds to aptamer.
- the quartz crystal used is placed in an oscillating electric field and the resonant frequency of the crystal is measured.
- a mass change on the surface of the quartz crystal e.g. by reacting the analyte with the receptor previously immobilized on the crystal surface causes a change in the resonance frequency, which can be quantified.
- Electrochemical transducers may be e.g. measure the change in the concentration of redox-active markers on the electrode surface, or the change in the concentration of redox-active substrates or products, e.g. be consumed or formed in the enzymatic reaction of an enzyme marker.
- Thermal transducers measure the heat of the aptamer-target binding reaction.
- the invention relates to a solid phase, also referred to as a solid support, in particular for use in the detection, enrichment, separation and / or isolation of protein A, G or L, protein A, G or L-containing
- Solid phases are conceivable in all possible geometric forms.
- solid supports are plates, strips, membranes, microtiter plates, films, gels, microparticles, nanoparticles or beads.
- Particularly suitable materials from which a solid phase can be made are inorganic polymers, organic polymers, glasses, organic and inorganic crystals, ceramics, metals, especially precious metals, and semiconductors.
- a particularly suitable organic polymer is a polymer based on polystyrene.
- biopolymers preferably cellulose, dextran, agar, agarose and Sephadex, which may be functionalized, in particular as nitrocellulose or cyanogen bromide Sephadex, can be used as polymers.
- Aptamers may be attached to magnetic beads, e.g.
- Carry carboxy-terminated or epoxy-activated side chains Furthermore, coupling of magnetic beads to the ribose or deoxyribose of the aptamers, e.g. via a hydrazone bond, possible.
- the examples of polymers are not limiting and other molecules are conceivable.
- the immobilized aptamer solid support is a stationary phase for affinity chromatography, which support is preferably in the form of spheres or otherwise shaped particles.
- the solid phase is a test strip containing one or more different aptamers of the invention.
- the test strip is particularly useful for qualitative, semi-quantitative and quantitative assays that use visual detection techniques, especially for lateral flow assays.
- a lateral flow assay works as follows: A liquid sample suspected of containing a target for the aptamer of the invention is applied to the strip at one location, or the strip is wetted with the sample at one site. This site is the so called trial order zone of the strip.
- the strip contains a matrix material through which the liquid test medium and the target suspended or dissolved therein can flow by capillary action from a sample application zone into a detection zone, where a detectable signal or the absence of such a signal indicates the presence of the target.
- the strip which can be used for lateral flow assays contains one or more aptamers according to the invention, for example in the sample application zone or at least still locally in front of the detection zone.
- target When target is present in the test sample, it forms a complex with the aptamer present in the strip, which flows to and is detected in the detection zone.
- the target within the strip flows to the aptamer, forming with it a complex which subsequently flows to the detection zone.
- the binding reaction may also take place directly on the site of application, e.g. the test strip contains the aptamer and the aptamer-target binding is visualized directly with a corresponding marker.
- a labeled aptamer is used, wherein any label already described above can be used.
- a label is used, which leads to a visually detectable signal in the detection zone of the test strip. Basically, the presence or absence of target in the sample can be detected by detection or lack of detection of a labeled aptamer in the sample
- Detection zone can be determined.
- an enzyme-labeled aptamer is used.
- Target present in the sample forms a complex with the enzyme-labeled aptamer, which flows along the strip to a detection zone containing a substrate for the enzyme label which is capable of producing a colored reaction in the presence of the enzyme label.
- the strip preferably contains a further zone in which target is immobilized, so that labeled aptamer arising due to the
- Absence of sufficient target in the sample is not combined with the target, detected, and thereby prevented from reaching the detection zone.
- test strip functions according to the principle of an immunological lateral flow assay, for example one
- Pregnancy test strip wherein a labeled immunoglobulin used there is replaced by an inventive, preferably labeled, aptamer.
- a special variant works according to the following principle: A test strip is wetted with the sample and the target present in the sample binds to a dye-labeled aptamer. The target aptamer-dye complex migrates to the detection zone where a second antibody is fixed which also binds to the target. The immobilized antibody binds the migrating target aptamer-dye complex in the
- the test strip can be produced from any material that can be wetted with a sample and into which an aptamer according to the invention can be introduced. Particularly preferred are materials through which a sample and a target contained therein can flow by capillary action. Examples are nitrocellulose, nitrocellulose blends with polyester or cellulose, uncoated paper, porous paper, viscose filament, glass fiber, acrylonitrile copolymer or nylon, as well as all other materials common in lateral flow assays.
- test strip can already be used as such to detect the presence of target in a sample.
- the strip may be dipped in a sample, for example, in a lateral flow assay, with only one end, which then serves as a trial application zone.
- the invention also provides a lateral flow assay device comprising the above-described test strip.
- the device may have, for example, a housing in which the test strip is embedded and which has a preferably closable opening to the sample application zone of the test strip, as well as recesses for monitoring a detection zone and possibly a control zone.
- a housing in which the test strip is embedded and which has a preferably closable opening to the sample application zone of the test strip, as well as recesses for monitoring a detection zone and possibly a control zone.
- recesses for monitoring a detection zone and possibly a control zone.
- the solid support and the aptamer form a microarray, or a so-called "DNA or RNA chip," which may be single-channel or multi-channel Measuring points one or more aptamers and reference materials for basic signal compensation or functional testing can be arranged. In a multi-channel chip, this arrangement takes place in the individual channels. This is the parallel
- Immobilization of aptamer to solid phase can be accomplished in a variety of ways and in any manner known to those skilled in the art for immobilizing DNA or RNA on solids. Known options have already been mentioned earlier in this description.
- the immobilization of aptamers on nanoparticles is e.g. described in WO2005 / 13817.
- a solid phase of paper or porous material may be wetted with the liquid phase aptamer and the volatiles then volatilized leaving the aptamer in the paper or porous material.
- the present invention also relates to a kit comprising an aptamer according to the invention.
- the kit preferably comprises an aptamer according to the invention, in particular a labeled aptamer according to the invention or an aptamer probe according to the invention, and further components for the reaction intended by the kit or the procedure to be carried out, for example components for an intended
- Detection enrichment, separation and / or isolation procedures are buffer solutions, substrates for a color reaction, dyes or enzymatic substrates.
- the aptamer and / or other components may be immobilized on a solid phase. Exemplary forms and materials for solid phases have been mentioned elsewhere in this specification.
- the solid phase can be provided for example in the form of a (micro) array or a microtiter plate.
- the solid phase may in the specific case comprise an immobilized capture substance for protein A, G or L, protein A, G or L-containing substance or a protein A, G or L-containing microorganism, in particular an immobilized antibody capable of binding protein A, G or L, a protein A, G or L-containing substance or a protein A, G or L-containing microorganism is used.
- an immobilized capture substance for protein A, G or L, protein A, G or L-containing substance or a protein A, G or L-containing microorganism in particular an immobilized antibody capable of binding protein A, G or L, a protein A, G or L-containing substance or a protein A, G or L-containing microorganism is used.
- Catcher substance is preferably arranged in the form of a (micro) array, in a microtiter plate or in chips.
- the kit is preferably for carrying out a detection, enrichment, separation and / or isolation method according to the invention for protein A, G or L, protein A, G or L-containing substance or a microorganism containing protein A, G or L, or for carrying out in other assays with the aid of an aptamer according to the invention.
- a detection, enrichment, separation and / or isolation method according to the invention for protein A, G or L, protein A, G or L-containing substance or a microorganism containing protein A, G or L, or for carrying out in other assays with the aid of an aptamer according to the invention.
- the aptamer can be provided in a variety of forms, for example freeze-dried or in a liquid medium.
- the invention also relates to a measuring device for detecting protein A, G or L, substances containing protein A, G or L or protein A, G or L.
- the meter includes one or more of the aptamers described above, an apta probe as previously described, or one
- the measuring device may include, inter alia, a sampling device, a signal processing device, a
- Data processing device a data storage device and interfaces for connection to external devices or storage media.
- the meter is a portable meter that can be used on-site, such as a pocket-sized lightweight meter.
- the sampling device of the measuring device can be constructed in various ways.
- the sampling device is a capillary or a porous strip in which liquids can be absorbed.
- Such Sampling device is usually immersed in a liquid sample for sampling.
- Capillary force transports the sample to the desired location in the meter where the aptamer is located and where the detection reaction can take place.
- the sample is transported to a biosensor having the aptamer, which in turn generates a measurement signal.
- the sampling device has a hose or a tube and a pump.
- the pump draws in a liquid sample and transports the sample to the desired location in the instrument where the aptamer is located and where the detection reaction can take place.
- the sample is transported to a biosensor identifying the aptamer, which in turn generates a measurement signal.
- the invention also relates in one aspect to the use of a previously described probe, a previously described solid phase, a previously described biosensor, a previously described test strip, a previously described lateral flow assay device, a previously described kit, or a previously described measuring device for Detection of protein A, G or L, substances containing protein A, G or L or microorganisms containing protein A, G or L, or for enrichment,
- Dynabeads® M-280 streptavidin (Invitrogen, UK) was used according to manufacturer's instructions. 1 ⁇ 10 9 Magnetic Beads first 3 were ⁇ each 500 ⁇ PBS, pH 7.4 and then incubated with shaking at 51 C ⁇ g biotinylated protein A for 1 h at 21 ° C (virgin, biotinylated protein A from Staphylococcus aureus (Sigma, P21 65), dissolved in 0.1 M sodium phosphate buffer pH7.4 to a stock solution of 2 mg / ml).
- DNA aptamers for protein A was carried out using the FluMag SELEX process. Biotinylated protein A was immobilized on streptavidin-functionalized magnetic beads and used in this form as a target for aptamer selection.
- a fluorescein label the DNA from the second SELEX round allowed au ßerdem their quantification in the different steps of the SELEX process by means of measurement of fluorescence (Wallac Victor 2 V Multilabel Counter; PerkinElmer, Germany; measurement conditions: Excitation 485 nm / Emission 535 nm, time 1 s, CW -lamp energy 22500, measuring volume ⁇ ⁇ / well, measurement in black 96 well microtiter plates (NUNC; Germany)).
- the starting point of the selection process was a randomized DNA oligonucleotide library prepared by chemical synthesis (Microsynth AG, CH):
- N 40 represents the variable nucleotide region (random sequence).
- oligonucleotides of this library have specific sequences at the 5 'and 3' end, which serve as primer binding sites for the amplification of the oligonucleotides by means of PCR.
- aptamer selection For aptamer selection, consecutive SELEX rounds were performed consisting of several steps: the selection steps - (i) binding of the DNA oligonucleotide library ( ⁇ 2.5nmol ssDNA) or the oligonucleotide pool selected in the previous round to the target-modified ones Magnetic beads (incubation for 30 min at 21 ° C.
- binding buffer [100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.6, 10 mM MgCl 2 , 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2 ], binding volume 250 ⁇ M
- separation of the unbound oligonucleotides by several washing steps of the binding complexes (iii) elution of the bound oligonucleotides by heat (2x incubation of the binding complexes in 250 ⁇ binding buffer for 10min at 95 ° C with shaking); the amplification step - (iv) Amplification of the eluted oligonucleotides by PCR and purification - (v) separation of the double-stranded PCR products and recovery of the relevant DNA single strands (sense strands) by means of denaturing PAGE and subsequent gel elution.
- the new oligonucleotide pool generated this way at the end of a SELEX round was used for a re-binding reaction with the target-modified magnetic beads in the next SELEX round.
- a fresh aliquot of ⁇ 10 8 target-modified magnetic beads was used.
- rounds 3 and 7 - 1 1 an additional negative selection step was added. This means that the oligonucleotides were first incubated with streptavidin-functionalized magnetic beads (without a target) in order to remove all oligonucleotides which bind non-specifically to the immobilization matrix.
- the oligonucleotides remaining in the supernatant were then ligated with the target-modified magnetic beads (see selection step - (i)).
- the SELEX process in FIG. Round after the amplification step in this case with unmodified primers, terminated.
- FIG. 1 shows the course of the SELEX process for the selection of protein A-binding aptamers. Shown is the amount of oligonucleotides binding to the target-modified magnetic beads in each SELEX round. In rounds 3 and 7-1 1 (marked in FIG. 1 with * symbol) was additionally carried out a negative selection step. The amount of oligonucleotides that bind to the immobilization matrix of the target is also shown (0-0.07 pmol), but was often at the detection limit of the fluorescence measurement.
- the selected oligonucleotides (aptamer pool) were amplified with unmodified primers, in order subsequently to clone the resulting PCR products directly into the vector pCR2.1 -TOPO and into E. coli TOP10 cells (TOPO TA cloning kit; UK). Positive clones were identified by colony PCR. Using the QIAprep 96 Turbo Miniprep Kit (Qiagen, Germany), the plasmid DNA of some of the clones was prepared and added for sequencing the aptamer insert (Microsynth AG, CH).
- the primer sequence (sense) at the 5 'end is ATACCAGCTTATTCAATT (SEQ ID NO: 66) and the primer binding region for the antisense primer at the 3' end is ACAATCGTAATCAGTTAG (SEQ ID NO: 67). They are each shown in bold type.
- the sequences having SEQ ID NOs: 66 and 67 are part of the aptamers, subject to truncated sequences as defined in the foregoing general description.
- the column “Number” indicates the number of clones with identical aptamer sequence If several clones with identical sequence were found, the aptamer designation is marked in bold (see, for example, PA # 2/8).
- Some aptamers can be grouped into groups based on their sequences. Different nucleotides within a group compared to the representative of a group are underlined. The sequences combined in a group are identical except for point mutations and deletions or derive from the substitute. The aptamer number of the proxy of a group is underlined (see, e.g., Aptamer No. PA # 2/8 for Group 1).
- the aptamers can be divided into groups based on their sequences. Within a group deviating nucleotides are marked with underlining.
- the sequence of SEQ ID NO: 62 summarizes the Group 1 sequences and shows variable nucleotides underlined.
- SEQ ID NO: 63 summarizes the Group 2 sequences and shows variable nucleotides underlined.
- SEQ ID NO: 64 summarizes the Group 3 sequences and shows variable nucleotides underlined.
- SEQ ID NO: 65 summarizes the group 4 sequences and shows variable nucleotides underlined.
- Xi is either A or L, where L is not a nucleotide (deletion).
- Table 2 shows an overview of the nucleotide symbols which represent one or more of the nucleotides A, G, C or T.
- PA # 2/8 ATACCAGCTTATTCAATTAGCAACATGAGGGGGATAGAGGGGGTGGGTTCTCTCGGCTACAATCGTAATCAGTTAG 1 4
- PA # 2 /16 ATACCAGCTTATTCAATTAGCAACATGAGGGGGATAGAGGGGGTGGGTTCTCGTTCGTTCTCGTGGCTACAATCGTAATCAGTTAG 3 1
- PA # 4/34 ATACCAGCTTATTCAATTCCCCAACGAGTCGATATGTAGCCCACACTCTGATTCGTCCACAATCGTAATCAGTTAG 5 3
- ATACCAGCTTATTCAATTVCMC AAC GAGT C GAT AT GT AGC C C AC AYT CTGATTCGTC CACAATCGTAATCAGTTAG 63
- PA # 6/54 ATACCAGCTTATTCAATTACC GATCACTAGCCGACTAATTGGT TT CCGATCGCAGTT CACAATCGTAATCAGTTAG 10 1
- PA # 14/82 ATACCAGCTTATTCAATTC C AC AAC C GAACT CGTAAGAC GTATGTAGCCGC C AAC T GTACAATCGTAATCAGTTAG 1 1 2
- PA # 2/3 ATACCAGCTTATTCAATTC GACAAGTGGGCATTAC GATT CT AGCC CT GATT AT GTTCCACAATCGTAATCAGTTAG 1 5 3
- PA # 2/14 ATACCAGCTTATTCAATTAC GAC C GT AGAC G AC T AC AC GAT GTTGCGCATTTC T GTACAATCGTAATCAGTTAG 1 7 2
- PA # 4/31 ATACCAGCTTATTCAATTC GATGACGACTGT AGCC GCAATACGCCCCTGTTACGTTGTACAATCGTAATCAGTTAG 1 8 2
- PA # 2/4 ATACCAGCTTATTCAATTGGAGTCCGACTAAATGATCTTTGAGAGTGTCTCACAGTCCACAATCGTAATCAGTTAG 21
- PA # 2 ATACCAGCTTATTCAATTGCAATGGACCCCAAAGTTGGATTGTAGCCGCTGCTGTTCGACAATCGTAATCAGTTAG 25
- PA # 4/29 ATACCAGCTTATTCAATTGGAGCCGCAAATATCGTGATGAATGTGTGAGCCGATCTACACAATCGTAATCAGTTAG 29
- PA # 4/30 ATACCAGCTTATTCAATTACCCCGATGTAGCCGACGTGCACTTGTTATGATTAGGACCACAATCGTAATCAGTTAG 30
- PA # 4/39 ATACCAGCTTATTCAATTGCAGCCGACTAACCTGATGAGTGTGGTCAGTTTACGCTTGACAATCGTAATCAGTTAG 32
- PA # 4 ATACCAGCTTATTCAATTGGAGACGACGCGGCTGATTATGTTAGTCTGTAACGCCACCACAATCGTAATCAGTTAG 33
- PA # 6/46 ATACCAGCTTATTCAATTACGAACATGGAGCCGCACTGATTACTGGTCCACCGCGTACACAATCGTAATCAGTTAG 34
- PA # 10/68 ATACCAGCTTATTCAATTACGATGTAGCCGTTCCCTTTACGATGTGCACCGACTAACCACAATCGTAATCAGTTAG 43
- PA # 1 0/80 ATACCAGCTTATTCAATTGTAGACGACGAACTGTTATGACATTTTTTCTTGTCCTCACACAATCGTAATCAGTTAG 50
- PA # 1 4/84 ATACCAGCTTATTCAATTCCAATGATCGATTGTTGCCCTGATTGATGGTTGTTGTCGTACAATCGTAATCAGTTAG 51
- PA # 1 4/85 ATACCAGCTTATTCAATTGGACGCCGACTAACTTAAGCGATTTGGCCCACTCATCTCGACAATCGTAATCAGTTAG 52
- PA # 1 4/86 ATACCAGCTTATTCAATTGGAGACGCTAACATGATGCTACGAAGGTGTGAATCGGTGCACAATCGTAATCAGTTAG 53
- PA # 1 4/89 ATACCAGCTTATTCAATTGGGCACCACGGGAGTCGGCCACATTTGGAGTTGTTTTTGCACAATCGTAATCAGTTAG 54
- PA # 1 4/91 ATACCAGCTTATTCAATTCGAGTGTGGCCGCCAACTGAGCTTGTTAGTGTCCTCTTGTACAATCGTAATCAGTTAG 55
- PA # 1 4/93 ATACCAGCTTATTCAATTGTAGACGACGACTGTACGTTGACCTGCTAACCACTTCTGGACAATCGTAATCAGTT 56
- PA # 1 4/94 ATACCAGCTTATTCAATTGCACCAGTGGAAAGATTGTAGCCGTTCCTCCTGATTATGCACAATCGTAATCAGTTAG 57
- PA # 1 4/95 ATACCAGCTTATTCAATTGCACGGTGGGAGATTGTAGCCCCTCTTTTTTTTTTTTGCCTGTACAATCGTAATCAGTTAG 58
- PA # 1 4/97 ATACCAGCTTATTCAATTGTAGACGACCACCTGATTAACTTTGGCCGGGCCCTTTTGTACAATCGTAATCAGTTAG 59
- PA # 1 4/99 ATACCAGCTTATTCAATTACGATCCTTGTAGCCCAGCGCACTGATCACGCTTGTGACCACAATCGTAATCAGTTAG 60
- PA # 1 4/100 ATACCAGCTTATTCAATTGTAGACGACGCAATATAATGATTAGTTGGCACGACCCTGCACAATCGTAATCAGTTAG 61
- Comparative sequence analyzes were performed using ClustalW2, a Multiple Sequence Alignment Tool (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/).
- FIG. 1 A possible secondary structure of aptamer PA # 2/8 (SEQ ID NO: 1) is shown in FIG.
- Aptamer clones with different sequence are examined for their individual binding ability to the selection target (biotinylated protein A immobilized on streptavidin-functionalized magnetic beads).
- the binding attempts are carried out according to the SELEX conditions. For each experiment come 2,5- ⁇ 3 10 7 Target-modified magnetic beads and ⁇ 55pmol fluorescein-labeled aptamer ssDNA in binding buffer (1 00mm NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.6, 1 0mm MgCl 2, 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2 ) and in a binding volume of 250 ⁇ used.
- the target-modified magnetic beads are washed several times in binding buffer prior to use and the aptamer ssDNA is thermally equilibrated by incubation at 90 ° C for 8 min, on ice for 10 min and at RT for ⁇ 5 min. Subsequently, the prepared aptamer ssDNA and the washed target-modified magnetic beads are combined for binding for 30 min at 21 ° C with shaking. The unbound ssDNA is removed and the binding complexes are washed several times in binding buffer. Thereafter, the elution of the target-bound ssDNA is carried out by heat by incubation of the binding complexes in binding buffer at 95 ° C for 10 min with shaking. This elution procedure is performed twice in total. Due to the fluorescein labeling of the aptamer ssDNA and a calibration curve, the amount of eluted ssDNA can be quantified. This corresponds to the amount of target-bound aptamer in the binding experiment.
- EXAMPLE 5 Construction of a biosensor and detection of protein A
- the Biacore® system is a commercially available biosensor system that provides label-free detection of biomolecular interactions in real time and utilizes the physical principle of surface plasmon resonance (SPR) spectroscopy, as shown in FIG.
- the biosensor chip of the Biacore system consists of a glass chip 1, which is coated with a thin gold film 2 and represents the sensor surface. A special functionalization of this sensor surface, for example with carboxymethyldextran (CM), allows the covalent immobilization of the biological receptor molecules.
- CM carboxymethyldextran
- the biotin-streptavidin coupling system is preferably used to immobilize the biotinylated aptamers on the streptavidin-coated sensor surface of the biosensor chip.
- the subsequent interaction between target and aptamer takes place in a flow cell 3, wherein the sample solution 4 with target 5 is passed over the sensor surface by means of an integrated, continuous flow system.
- the optical detection unit of the Biacore system consists of a light source 6 (light emitting diodes), a prism 7 and a detector 8 (diode array detector).
- Monochromatic polarized light L is irradiated under the conditions of total reflection from a high refractive index medium (sensor chip with gold film) into a low refractive index medium (sensor layer, buffer solution). At a certain angle of incidence, a weakening of the reflected light R occurs. This angle, the resonance angle, reacts very sensitively to changes in the refractive index of the sensor layer.
- the binding of the target 5 to the immobilized aptamer 9 on the sensor surface results in a mass increase in the sensor layer, which leads to a change in the refractive index of this layer and thus to a shift of the resonance angle.
- These changes are output as a measurable signal, expressed in units of resonance (RU), and are proportional to the amount of bound target 5 on the sensor surface.
- RU units of resonance
- the changes in resonance angle are recorded continuously and plotted against time as a sensorgram, which is shown schematically in FIG. In section II of the signal curve, a shift of the resonance angle is recognizable by the binding of target to the immobilized aptamer.
- the displacement of the resonance angle is also shown in FIG. 3, by means of a reflected light beam denoted by "I" and by "II".
- the aptamer-target complex can be redissolved under suitable buffer conditions so that the sensor surface is regenerated and available for re-binding with target molecules.
- An aptamer according to the invention is immobilized on the surface of the biosensor described above.
- a solution of protein A is passed over the sensor surface, with protein A binding to the aptamer.
- the attachment of protein A is called
- the truncated variants of the aptamer PA # 2/8 shown in Table 3 were prepared.
- the aptamer PA # 2/8 [S19-76] (SEQ ID NO: 69) lacks the 5 'primer region and PA # 2/8 [S1 -58] (SEQ ID NO: 70) lacks the 3' primer region ,
- the PA # 2 / 8KR40 (SEQ ID NO: 71) is the core region, without the 5 'primer region and without the 3' primer region.
- the binding experiments were carried out according to the SELEX conditions.
- target-modified magnetic beads 2.5-3 ⁇ 1 0 7 target-modified magnetic beads and ⁇ 55 pmol fluorescein-labeled aptamer ssDNA in binding buffer (100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.6, 10 mM MgCl 2 , 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2 ) are used.
- Target-modified magnetic beads were prepared in advance of the binding experiments using Dynabeads® M-280 streptavidin (Invitrogen, UK) to immobilize native, biotinylated protein A of Staphylococcus aureus (P21 65, Sigma-Aldrich, Germany).
- the target-modified magnetic beads Prior to each binding reaction, the target-modified magnetic beads were washed several times in binding buffer and the aptamer ssDNA thermally equilibrated by incubation at 90 ° C for 8 min, on ice for 10 min and then transferred to RT for ⁇ 5 min.
- the prepared aptamer ssDNA and the washed target-modified magnetic beads were then combined for binding and incubated for 30 min at 21 ° C with shaking.
- the unbound ssDNA was removed and the binding complexes washed several times in binding buffer. Thereafter, the elution of the target-bound ssDNA was carried out by heat by incubation of the binding complexes in binding buffer at 95 ° C for 10 min with shaking.
- FIG. 5 shows the results of the bead-based binding experiments with the aptamer PA # 2/8 and its truncated variants in comparison to the unselected SELEX library as a negative control.
- the original aptamer PA # 2/8 has a very good binding ability to protein A-modified magnetic beads. After removal of the 3 'primer region (variant PA # 2/8 [S1 -58]) this binding ability is retained and could even be improved.
- the Biacore X100 system is a commercially available biosensor system (GE Healthcare, Sweden) that enables label-free detection of biomolecular interactions in real-time using the physical principle of surface plasmon resonance (SPR) spectroscopy.
- SPR surface plasmon resonance
- the Biotin CAPture Kit with the sensor chip CAP was used, which enables the production of a streptavidin-coated sensor surface.
- the biotin-streptavidin coupling system can be used to immobilize biotinylated aptamers on the sensor surface.
- the target solution is passed through the sensor surface through an integrated, continuous flow system.
- the target solution consisting of recombinant protein A (P7837, Sigma-Aldrich, Germany) or native protein A (P3838, Sigma-Aldrich, Germany) in binding buffer (100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.6, 10 mM MgCl 2 , 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2 ) with 0.005% SP20 was passed over the prepared sensor surfaces at a flow rate of ⁇ ⁇ / min. The interaction between aptamer and target took place during a binding phase of 300s, followed by a dissociation phase of 300s. The running buffer used was binding buffer with 0.005% SP20.
- the sensorgrams (FIGS.
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
The invention relates to an aptamer that binds to protein A, G or L, protein A-, G- or L-containing substances, and also to protein A-, G- or L‑containing microorganisms, in particular Staphylococcus aureus, Streptococcus or Peptostreptococcus, methods for detection and enrichment of protein A, G or L, protein A-, G- or L-containing substances or protein A-, G- or L‑containing microorganisms in which the aptamer is used, and also a kit, a biosensor, a lateral flow assay device and a measuring instrument which contain such an aptamer and can be used in said methods.
Description
Aptamere, die spezifisch sind für Immunoglobulin bindende Zellwandproteine Aptamers specific for immunoglobulin-binding cell wall proteins
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Aptamer, das an Protein A, G oder L, Protein A, G oder L enthaltende Substanzen oder Protein A, G oder L enthaltende Mikroorganismen, insbesondere Staphylococcus aureus, Streptococcus oder Peptostreptococcus, bindet, Verwendungen des Aptamers sowie Verfahren zum Nachweis und Anreicherung von Protein A, G oder L, Protein A, G oder L enthaltenden Substanzen oder Protein A, G oder L enthaltenden Mikroorganismen, in denen das Aptamer eingesetzt wird. Staphylococcus aureus ist ein kugelförmiges, Gram-positives, pathogenes Bakterium. S. aureus kommt fast überall in der Natur, auch auf der Haut und in den oberen Atemwegen von 25 bis 30 % aller Menschen vor. Besonders gefährlich sind Antibiotika-resistente Formen und insbesondere multiresistente Formen. Diese kommen gehäuft in The present invention relates to an aptamer which binds to microorganisms containing protein A, G or L, protein A, G or L or protein A, G or L, in particular Staphylococcus aureus, Streptococcus or Peptostreptococcus, uses of the aptamer and methods for Detection and enrichment of protein A, G or L, protein A, G or L-containing substances or protein A, G or L-containing microorganisms in which the aptamer is used. Staphylococcus aureus is a globular, Gram-positive, pathogenic bacterium. S. aureus occurs almost everywhere in nature, also on the skin and in the upper airways of 25 to 30% of all humans. Particularly dangerous are antibiotic-resistant forms and especially multi-drug resistant forms. These come in heaped
Krankenhäusern, Pflegeheimen, aber auch im Klärschlamm vor. Auch in Lebensmitteln tierischer Herkunft werden resistente Keime des Stammes gefunden. Der Keim kann auch in das Trinkwasser gelangen. Häufige Erkrankungen, die auf S. aureus zurückzuführen sind, sind Sepsis, Haut- und Wundinfektionen, Pneumonien, Abszesse, Furunkel, Endokarditis, Osteomyelitis, Lebensmittelvergiftungen durch S. aureus Exotoxine und Mastitis bei Rindern. Hospitals, nursing homes, but also in sewage sludge. Even in foods of animal origin resistant germs of the strain are found. The germ can also get into the drinking water. Common diseases that are caused by S. aureus include sepsis, skin and wound infections, pneumonia, abscesses, boils, endocarditis, osteomyelitis, food poisoning from S. aureus exotoxins, and bovine mastitis.
Der Nachweis von S. aureus erfolgt bisher mittels Kultivierung oder immunologischer und molekularbiologischer Methoden (Antikörper-Assays, PCR-basierte Methoden). Die Methoden sind entweder zeitaufwändig oder teuer. Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es deshalb, spezifische Substanzen zur Verfügung zu stellen, die einen schnellen, einfachen und zuverlässigen Nachweis von S. aureus ermöglichen. The detection of S. aureus has hitherto been carried out by means of cultivation or immunological and molecular biological methods (antibody assays, PCR-based methods). The methods are either time consuming or expensive. It was therefore an object of the present invention to provide specific substances which enable rapid, simple and reliable detection of S. aureus.
Die Aufgabe wird mit einem Aptamer gelöst, das an Immunoglobulin bindende The problem is solved with an aptamer that binds to immunoglobulin
Zellwandproteine, an Substanzen, die ein Immunoglobulin bindendes Zellwandprotein enthalten, und an Mikroorganismen, die ein Immunoglobulin bindendes Zellwandprotein enthalten, bindet, wobei das Immunoglobulin bindende Zellwandprotein ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend oder bestehend aus Protein A, G oder L. Cell wall proteins binding to substances containing an immunoglobulin-binding cell wall protein and to microorganisms containing an immunoglobulin-binding cell wall protein, wherein the immunoglobulin-binding cell wall protein is selected from the group consisting of or consisting of protein A, G or L.
Der Begriff„umfassend" bedeutet im Sinne des vorigen Absatzes, dass das Aptamer auch an weitere Immunoglobulin bindende Zellwandproteine binden kann, bzw. an Substanzen
oder Mikroorganismen, die ein anderes Immunoglobulin bindendes Zellwandprotein enthalten als die genannten Proteine A, G oder L. The term "comprising" in the sense of the previous paragraph means that the aptamer can also bind to other immunoglobulin-binding cell wall proteins or to substances or microorganisms containing another immunoglobulin-binding cell wall protein than said proteins A, G or L.
Bereitgestellt wird somit ein Aptamer, das an Protein A, G oder L, Protein A, G oder L enthaltende Substanzen sowie Protein A, G oder L enthaltende Mikroorganismen, insbesondere Staphylococcus aureus, Streptococcus oder Peptostreptococcus, bindet. Insbesondere ist das erfindungsgemäße Aptamer spezifisch für Protein A, G oder L. Das erfindungsgemäße Aptamer ist ein Nukleinsäure-Aptamer, insbesondere ein Thus, an aptamer is provided which binds to protein A, G or L, protein A, G or L-containing substances as well as protein A, G or L-containing microorganisms, in particular Staphylococcus aureus, Streptococcus or Peptostreptococcus. In particular, the aptamer according to the invention is specific for protein A, G or L. The aptamer according to the invention is a nucleic acid aptamer, in particular a
einzelsträngiges DNA(ssDNA)- oder ein RNA-Aptamer. Single-stranded DNA (ssDNA) - or an RNA aptamer.
Dass das Aptamer an eine Substanz, die ein Immunoglobulin bindendes Zellwandprotein enthält, bzw. an einen Mikroorganismus, der ein Immunoglobulin bindendes That the aptamer binds to a substance containing an immunoglobulin-binding cell wall protein, or to a microorganism that binds an immunoglobulin
Zellwandprotein enthält, bindet, bedeutet insbesondere, dass das Aptamer an das Zellwandprotein, welches in der Substanz vorhanden ist oder welches Teil des Cell wall protein contains, means in particular means that the aptamer to the cell wall protein, which is present in the substance or which part of the
Mikroorganismus ist, bindet. Anders ausgedrückt, bindet das Aptamer an das Is microorganism binds. In other words, the aptamer binds to the
Zellwandprotein selbst, d.h. direkt an das Zellwandprotein. Vorzugsweise bindet das Aptamer nur an das in der Substanz oder in/an dem Mikroorganismus vorhandene Zellwandprotein und nicht an eine andere Stelle der Substanz bzw. des Mikroorganismus. Der allgemeine Begriff „Aptamere" bezeichnet im Stand der Technik kurze einzelsträngige Nukleinsäure-Oligomere, auch bezeichnet als Oligonukleotide, die spezifisch an eine Zielstruktur oder ein Zielmolekül, auch bezeichnet als Target, binden können, Cell wall protein itself, i. directly to the cell wall protein. Preferably, the aptamer only binds to the cell wall protein present in the substance or in / on the microorganism and not to another site of the substance or of the microorganism. The general term "aptamer" refers in the prior art to short single-stranded nucleic acid oligomers, also referred to as oligonucleotides, capable of specifically binding to a target structure or target molecule, also referred to as a target,
beispielsweise an ein Protein, an niedermolekulare Verbindungen, wie organische Substanzen, Aminosäuren und Antibiotika, Nukleinsäuren, Viruspartikel oder for example, to a protein, to low molecular weight compounds such as organic substances, amino acids and antibiotics, nucleic acids, virus particles or
(Mikro)Organismen. Die Aptamer-Target-Bindung erfolgt beispielsweise über die (Micro) organisms. The aptamer-target binding takes place for example via the
Strukturkompatibilität, so genannte„Stacking interactions" bei aromatischen Structure compatibility, so-called "stacking interactions" in aromatic compounds
Ringstrukturen (Stapelkräfte durch Elektronenwechselwirkung mit Nachbarbasen), elektrostatische Wechselwirkungen (z.B. Van der Waals-, Ionen-, Dipolkräfte) und Wasserstoffbrückenbindungen. Ring structures (stacking forces through electron interaction with neighboring bases), electrostatic interactions (e.g., van der Waals, ion, dipole forces) and hydrogen bonds.
Auch Aptamere mit Peptidstruktur sind bekannt, wobei sich die vorliegende Erfindung ausschließlich auf Nukleinsäure-Aptamere bezieht. Somit bezeichnet der Begriff „Aptamere" nachfolgend Nukleinsäure-Aptamere. Bei Nukleinsäure-Aptameren unterscheidet man beispielsweise DNA-Aptamere, gebildet aus einzelsträngiger DNA (ssDNA), und RNA-Aptamere. Aptamere zeichnen sich durch die Ausbildung einer
spezifischen dreidimensionalen Struktur, die von der Nukleinsäuresequenz abhängt, aus. Diese Struktur befähigt Aptamere, analog einer Antigen-Antikörper-Bindung Zielstrukturen passgenau zu binden. Eine bestimmte Nukleinsäuresequenz eines Aptamers kann bei definierten Bedingungen eine dreidimensionale Struktur aufweisen, die spezifisch für eine definierte Zielstruktur (Target) ist. Die dreidimensionale Struktur eines Aptamers entsteht unter anderem infolge von intramolekularen Basenpaarungen nach Watson und Crick und über Hoogsteen-Basenpaarungen (Quadruplex). Aptamers with a peptide structure are also known, the present invention referring exclusively to nucleic acid aptamers. Nucleic acid aptamers are distinguished, for example, from DNA aptamers formed from single-stranded DNA (ssDNA) and RNA aptamers. Aptamers are characterized by the formation of aptamers specific three-dimensional structure, which depends on the nucleic acid sequence. This structure enables aptamers, analogous to an antigen-antibody binding to bind target structures accurately. A particular nucleic acid sequence of an aptamer may, under defined conditions, have a three-dimensional structure that is specific to a defined target structure. The three-dimensional structure of an aptamer arises, among other things, as a result of intramolecular base pairings according to Watson and Crick and Hoogsteen base pairings (quadruplex).
Die Aussage, dass ein erfindungsgemäßes Aptamer an Protein A, G oder L, eine Protein A, G oder L enthaltende Substanz oder einen Protein A, G oder L enthaltenden The statement that an aptamer according to the invention contains protein A, G or L, a protein A, G or L-containing substance or a protein A, G or L.
Mikroorganismus bindet, oder dafür spezifisch ist, bedeutet, dass es an ein oder mehrere Targets bindet, die ausgewählt sind aus Protein A, G oder L, einer Protein A, G oder L enthaltenden Substanz oder einem Protein A, G oder L enthaltenden Mikroorganismus. Protein A, Protein G und Protein L sind bakterielle Zellwandproteine. Sie gehören zu einer Gruppe Proteine, die wiederholende Domänen enthalten, welche Immunoglobuline binden können. Microorganism binds, or is specific, means that it binds to one or more targets selected from protein A, G or L, a substance containing protein A, G or L or a microorganism containing protein A, G or L. Protein A, protein G and protein L are bacterial cell wall proteins. They belong to a group of proteins that contain repeating domains that can bind immunoglobulins.
Protein A ist ein Protein, das in der Zellwand des Bakteriums Staphylococcus aureus vorkommt. Protein A hat eine Größe von 40 - 60 kDa und wird in der biochemischen Forschung häufig wegen seiner Fähigkeit genutzt, Immunoglobuline über deren Fc- Region zu binden. Protein A bindet verschiedene Klassen von Immunoglobulinen, insbesondere verschiedene IgG-Subklassen von verschiedenen Spezies. Beispielhafte Protein A- Vertreter haben die UniProt Nr. P38507, P02976, P99134, P0A015 (aus section: Swiss-Prot, der UniProtKB = Protein knowledgebase). Protein A is a protein found in the cell wall of the bacterium Staphylococcus aureus. Protein A is 40-60 kDa in size and is often used in biochemical research because of its ability to bind immunoglobulins via its Fc region. Protein A binds different classes of immunoglobulins, in particular different IgG subclasses of different species. Exemplary protein A representatives have the UniProt No. P38507, P02976, P99134, P0A015 (from section: Swiss-Prot, the UniProtKB = protein knowledgebase).
Protein G ist ein Protein, das in der Zellwand von Bakterien der Gattung Streptococcus vorkommt. Es hat je nach Streptococcus-Stamm eine Molekülmasse von etwa 58 bis 65 kDa und besitzt am C-Terminus zwei oder drei homologe Bindungsdomänen mit hoher Affinität für die Fc-Region von Immunglobulinen, insbesondere des Isotyps IgG. Darüber hinaus bindet es über drei homologe Domänen N-terminal zur IgG-Bindungsregion auch an Albuminproteine. Am N-Terminus besitzt Protein G eine weitere Bindungsregion (Region E) für humanes Alpha-2-Globulin in der auch als s-Form bezeichneten nativen Konformation. Beispielhafte Protein G-Vertreter haben die UniProt (Universal Protein Database) Nr. P06654 und P19909.
Protein L ist ein Protein, das in der Zellwand von Peptostreptococcus magnus vorkommt. Ähnlich wie Protein A und G ist es ebenfalls in der Lage Immunglobuline zu binden, insbesondere Immunglobuline, welche die leichten Ketten des Kappa-Typs enthalten. Protein G is a protein found in the cell wall of bacteria of the genus Streptococcus. Depending on the Streptococcus strain, it has a molecular mass of about 58 to 65 kDa and has two or three homologous binding domains with high affinity for the Fc region of immunoglobulins, in particular of the isotype IgG, at the C terminus. It also binds to albumin proteins via three homologous domains N-terminal to the IgG binding region. At the N-terminus, protein G has another binding region (region E) for human alpha-2 globulin in the native conformation, also termed s-form. Exemplary protein G representatives have the UniProt (Universal Protein Database) Nos. P06654 and P19909. Protein L is a protein found in the cell wall of Peptostreptococcus magnus. Similar to protein A and G, it is also capable of binding immunoglobulins, especially immunoglobulins containing the kappa-type light chains.
Aufgrund ihrer Spezifität für Protein A, G oder L sind Aptamere der vorliegenden Due to their specificity for protein A, G or L, aptamers are present
Erfindung auch spezifisch für Protein A, G oder L enthaltende Substanzen und Protein A, G oder L enthaltende Mikroorganismen, insbesondere Staphylococcus aureus, Invention also specifically for protein A, G or L-containing substances and protein A, G or L-containing microorganisms, in particular Staphylococcus aureus,
Streptococcus oder Peptostreptococcus. Unter„Protein A, G oder L enthaltenden Streptococcus or Peptostreptococcus. Under "Protein A, G or L containing
Substanzen" sind Substanzen zu verstehen, die mit Protein A, G oder L fest verbunden sind, beispielsweise durch eine kovalente Bindung, Wasserstoffbrückenbindungen oder eine Komplexbindung. Aus ihrer Spezifität ergeben sich zahlreiche Substances "are substances which are firmly bound to protein A, G or L, for example by a covalent bond, hydrogen bonds or a complex bond
Verwendungsmöglichkeiten der erfindungsgemäßen Aptamere, die an anderem Ort in dieser Beschreibung noch erläutert werden. Uses of the aptamers according to the invention, which will be explained elsewhere in this description.
Die erfindungsgemäßen Aptamere sind auch spezifisch für rekombinant hergestelltes Protein A, Protein G oder Protein L, beispielsweise in E coli rekombinant hergestelltes Protein A, G, oder L. Ebenso sollen die Begriffe Protein A, Protein G und Protein L auch Mutationsformen dieser Proteine, also verändertes Protein A, G oder L im Vergleich zum Wildtyp, beispielsweise entstanden durch künstliche oder natürliche Genmutationen, einschließen. The aptamers according to the invention are also specific for recombinantly produced protein A, protein G or protein L, for example recombinantly produced in E. coli protein A, G, or L. Similarly, the terms protein A, protein G and protein L also mutation forms of these proteins, ie altered protein A, G or L compared to the wild type, for example, caused by artificial or natural gene mutations include.
Erfindungsgemäße Aptamere, die spezifisch für Protein A, G oder L, Protein A, G oder L enthaltende Substanzen oder Protein A, G oder L enthaltende Mikroorganismen sind, können beispielsweise mit dem SELEX- Verfahren (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) erhalten werden. Grundlegende Arbeiten zum SELEX-Verfahren stammen von Tuerk and Gold, Science 249 (1990) 505-510, sowie Ellington and Szostak, Nature 346 (1990) 818-822. SELEX Verfahren sind weiterhin offenbart in US 5,567,588 und US 5,270,163. Aptamers according to the invention, which are specific for protein A, G or L, protein A, G or L-containing substances or protein A, G or L-containing microorganisms can be obtained for example with the SELEX method (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) , Basic work on the SELEX process is from Tuerk and Gold, Science 249 (1990) 505-510, and Ellington and Szostak, Nature 346 (1990) 818-822. SELEX processes are further disclosed in US 5,567,588 and US 5,270,163.
Im SELEX Verfahren wird zunächst eine kombinatorische Zufallsbibliothek, bestehend aus einzelsträngigen DNA (ssDNA)-Oligonukleotiden erzeugt. Die Oligonukleotide weisen einen internen variablen Bereich auf, mit beispielsweise 40-60 Nukleotiden, der am 5' und 3' Ende von Primerregionen flankiert wird. Die Primerregionen dienen als
Primerbindungsstellen für eine PCR Amplifikation. Kombinatorische Zufallsbibliotheken können von kommerziellen Anbietern bezogen werden. Die Variabilität einer Bibliothek liegt beispielsweise im Bereich von ca. 1015 verschiedenen Molekülen. Ausgehend von der einzelsträngigen DNA-Oligonukleotid-Bibliothek werden über verschiedene In the SELEX method, a combinatorial random library consisting of single-stranded DNA (ssDNA) oligonucleotides is first generated. The oligonucleotides have an internal variable region, for example 40-60 nucleotides, flanked at the 5 'and 3' ends of primer regions. The primer regions serve as Primer binding sites for a PCR amplification. Combinatorial random libraries can be obtained from commercial providers. The variability of a library is for example in the range of about 10 15 different molecules. Starting from the single-stranded DNA oligonucleotide library are various
Selektions- und Amplifikationsschritte zyklusweise die Oligonukleotide angereichert, die am besten an das Target binden. Jeder Zyklus besteht aus folgenden Teilschritten: Selection and amplification steps are cyclically enriched the oligonucleotides that bind best to the target. Each cycle consists of the following substeps:
a) Bindung der Oligonukleotide an das Target, a) binding of the oligonucleotides to the target,
b) Waschen der Oligonukleotid-Target-Komplexe zur Entfernung von b) washing the oligonucleotide target complexes to remove
ungebundenen Oligonukleotiden, unbound oligonucleotides,
c) Elution der am Target gebundenen Oligonukleotide, c) elution of the oligonucleotides bound to the target,
d) Amplifikation der eluierten Oligonukleotide mittels PCR, d) amplification of the eluted oligonucleotides by PCR,
e) Reinigung der relevanten ssDNA-Oligonukleotide aus dem PCR-Produkt e) Purification of the relevant ssDNA oligonucleotides from the PCR product
Nach jedem Zyklus wird der selektierte und angereicherte Oligonukleotidpool als After each cycle, the selected and enriched oligonucleotide pool is called
Ausgangsmaterial für einen nächsten Zyklus genutzt. Vorteilhafterweise werden 8 bis 12 Zyklen durchlaufen. Starting material used for a next cycle. Advantageously, 8 to 12 cycles are run through.
Ein SELEX Verfahren zur Isolierung erfindungsgemäßer Aptamere ist in den beigefügten Beispielen genauer beschrieben. Ein beispielhaftes Verfahren zur Auffindung von erfindungsgemäßen Aptameren ist das sogenannte FluMag-SELEX Verfahren, bei dem fluoreszenzmarkierte ssDNA Moleküle und magnetische Kügelchen (Beads) als A SELEX process for the isolation of aptamers of the invention is described in more detail in the accompanying examples. An exemplary method for the discovery of aptamers according to the invention is the so-called FluMag-SELEX method in which fluorescence-labeled ssDNA molecules and magnetic beads (beads) as
Immobilisierungsmatrix für das Target eingesetzt werden. Dieses Verfahren, das in den beigefügten Beispielen verwendet wurde, ist auch beschrieben in: R. Stoltenburg et al. (2005) FluMag-SELEX as an advantageous method for DNA aptamer selection, Anal. Bioanal. Chem. 383, 83-91 . Immobilization matrix can be used for the target. This method, which was used in the accompanying examples, is also described in: R. Stoltenburg et al. (2005) FluMag-SELEX as an advantageous method for DNA aptamer selection, Anal. Bioanal. Chem. 383, 83-91.
Nach Analyse der Sequenz können erfindungsgemäße Aptamere sowie Varianten, Mutanten, Fragmente und Derivate davon, welche nachfolgend noch beschrieben werden, mit üblichen Techniken der chemischen DNA- und RNA-Synthese hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Ist die Sequenz eines DNA Aptamers bekannt, so kann ein RNA Aptamer mit der gleichen Sequenz durch übliche Syntheseverfahren hergestellt werden. Ferner können die Bindungseigenschaften einzelner Aptamere an das Target untersucht werden.
Vorzugsweise sind die erfindungsgemäßen Aptamere synthetische Oligonukleotide, die insbesondere nach dem soeben beschriebenen SELEX Verfahren aus einer zugrunde gelegten synthetischen, kombinatorischen Oligonukleotid-Bibliothek selektiert wurden oder anschließend mit üblichen Syntheseverfahren hergestellt sind. After analysis of the sequence, aptamers according to the invention as well as variants, mutants, fragments and derivatives thereof, which are described below, can be prepared by conventional techniques of chemical DNA and RNA synthesis, which are known to the person skilled in the art. If the sequence of a DNA aptamer is known, then an RNA aptamer having the same sequence can be prepared by conventional synthetic methods. Furthermore, the binding properties of individual aptamers to the target can be investigated. Preferably, the aptamers according to the invention are synthetic oligonucleotides, which in particular were selected according to the SELEX method just described from an underlying synthetic combinatorial oligonucleotide library or are subsequently prepared by conventional synthesis methods.
Die Erfindung betrifft in einer speziellen Ausführungsform ein Aptamer das an Protein A, G oder L, Protein A, G oder L enthaltende Substanzen oder Protein A, G oder L enthaltende Mikroorganismen bindet und das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus In a specific embodiment, the invention relates to an aptamer which binds to microorganisms containing protein A, G or L, protein A, G or L or protein A, G or L and which is selected from the group consisting of
a) einem Aptamer umfassend, oder bestehend aus, eine(r) Nukleinsäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 65, mit der Maßgabe, dass Thymin durch Uracil ersetzt sein kann, a) an aptamer comprising, or consisting of, a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 65, with the proviso that thymine may be replaced by uracil,
b) einem Aptamer, dessen Nukleinsäuresequenz eine Identität von mindestens 70% mit der Nukleinsäuresequenz eines Aptamers aus a) aufweist b) an aptamer whose nucleic acid sequence has an identity of at least 70% with the nucleic acid sequence of an aptamer from a)
c) einem Aptamer, das mit dem komplementären Strang eines Aptamers aus a) hybridisiert, c) an aptamer which hybridizes with the complementary strand of an aptamer from a),
d) einem Aptamer bei dem gegenüber einem Aptamer aus a) ein oder mehrere d) an aptamer with respect to an aptamer from a) one or more
Nukleotide substituiert, deletiert, insertiert und/oder angefügt sind Nucleotides are substituted, deleted, inserted and / or attached
e) einem Fragment eines Aptamers nach a), b), c) oder d), und e) a fragment of an aptamer according to a), b), c) or d), and
f) einem Derivat eines Aptamers nach a), b), c), d) oder e). f) a derivative of an aptamer according to a), b), c), d) or e).
Die Funktionalität der Aptamere aus a) - f), also die Bindung an Protein A, G oder L, Protein A, G oder L enthaltende Substanzen oder Protein A, G oder L enthaltende Mikroorganismen kann mit einer Sekundärstrukturanalyse der Aptamere, abgeschätzt werden. Auch die Funktionalität sonstiger in dieser Beschreibung genannter Varianten kann so abgeschätzt werden. Die Modellierung der möglichen Sekundärstruktur der Aptamere kann unter Nutzung des im Internet frei verfügbaren Programms„mfold" (Version 3.1 oder 3.5) erfolgen. Dieses Programm führt eine Analyse der The functionality of the aptamers from a) -f), ie the binding to protein A, G or L-containing substances or protein A, G or L-containing microorganisms, can be estimated by a secondary structure analysis of the aptamers. The functionality of other variants mentioned in this description can thus be estimated. Modeling of the possible secondary structure of aptamers can be done using the "mfold" program (version 3.1 or 3.5), which is freely available on the Internet
zweidimensionalen Struktur mit Hilfe einer Energieminimierungsmethode aus (Zuker M., 2003, Nucleic Acid Research 31 , 3406-3415). Bei der Faltung der Aptamere kann es zu Sterns (doppelsträngige Bereiche), Loops, d.h. Ausschleifungen von einzelsträngigen Bereichen, wie Haarnadel- oder interne Schleifen, und Bulbs, d.h. kleine einzelsträngige Ausbuchtungen in doppelsträngigen Bereichen, kommen. Mit dem Programm mfold wird für eine Aptamer-Nukleotidsequenz die hypothetische Sekundärstruktur bei two-dimensional structure using an energy minimization method (Zuker M., 2003, Nucleic Acid Research 31, 3406-3415). When folding the aptamers, it may turn into star (double-stranded regions), loops, i. Abrasion of single-stranded areas, such as hairpin or internal loops, and bulbs, i. small single-stranded bulges in double-stranded areas, come. The mfold program adds the hypothetical secondary structure to an aptamer nucleotide sequence
Standardbedingungen bestimmt (Bindungs-/Faltungstemperatur: 21 °C, lonenstärke des
Bindungspuffers: [Na+] 100 mM / [Mg ] 10 mM). Bindungspufferzusammensetzung: 100mM NaCI, 20mM Tris-HCI, pH 7.6, 10mM MgCI2, 5mM KCl, 1 mM CaCI2. Der Standard conditions determined (binding / folding temperature: 21 ° C, ionic strength of Binding buffer: [Na + ] 100 mM / [Mg] 10 mM). Binding buffer composition: 100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.6, 10 mM MgCl 2 , 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2 . Of the
Fachmann kann sehr leicht eine große Anzahl Varianten der konkret mit Sequenzen beschriebenen erfindungsgemäßen Aptamere entwerfen, beispielsweise durch A person skilled in the art can very easily design a large number of variants of the aptamers of the invention specifically described with sequences, for example by
Substitution, Insertion oder Deletion einzelner Basen. Solche Varianten können perSubstitution, insertion or deletion of individual bases. Such variants can per
Computer, wie oben beschrieben, in großer Zahl und ohne experimentellen Aufwand auf ihre Sekundärstruktur analysiert werden. Wenn eine Übereinstimmung der Computer, as described above, be analyzed in large numbers and without any experimental effort on their secondary structure. If a match of the
Sekundärstruktur einer Variante mit der Sekundärstruktur eines konkret mit Sequenz beschriebenen Aptamers vorliegt, ist eine Funktionalität der Variante wahrscheinlich oder bisweilen sehr wahrscheinlich. Secondary structure of a variant with the secondary structure of a concretely described with sequence aptamer, a functionality of the variant is likely or sometimes very likely.
Varianten der Aptamere nach Anspruch 1 a) werden nachfolgend erläutert. Variants of the aptamers according to claim 1 a) are explained below.
Von der Erfindung umfasst sind Aptamere, deren Sequenz eine Identität von mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 80%, oder mindestens 85%, oder mindestens 90%, oder mindestens 93%, oder mindestens 95%, oder mindestens 96%, oder mindestens 97%, und am meisten bevorzugt mindestens 98%, mit einer der Sequenzen der SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 65 aufweisen. Unter dem Begriff„Identität" soll im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung die Anzahl der übereinstimmenden Nukleotide (Identität), ausgedrückt in Prozent verstanden werden. Bevorzugt wird die Identität zwischen zwei betreffenden Nukleinsäuresequenzen mit Hilfe von Computerprogrammen ermittelt. Weisen Sequenzen, die miteinander verglichen werden, unterschiedliche Längen auf, ist die Identität so zu ermitteln, dass die Anzahl an Nukleotide, welche die kürzere Sequenz mit der längeren Sequenz gemeinsam hat, den prozentualen Anteil der Identität bestimmt. Vorzugsweise wird die Identität mittels des bekannten und der Öffentlichkeit zur Verfügung stehenden Computerprogramms ClustalW2 bestimmt. Auf die Definition von Identität in dem Programm ClustalW2 und die Methode zu ihrer Ermittlung, die öffentlich zugänglich sind, wird in dieser Erfindung ausdrücklich Bezug genommen. The invention includes aptamers whose sequence has an identity of at least 70%, preferably at least 80%, or at least 85%, or at least 90%, or at least 93%, or at least 95%, or at least 96%, or at least 97% , and most preferably at least 98%, having any of the sequences of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 65. In the context of the present invention, the term "identity" is to be understood as meaning the number of matching nucleotides (identity), expressed in percent The identity between two relevant nucleic acid sequences is preferably determined with the aid of computer programs. different lengths, identity is to be determined so that the number of nucleotides sharing the shorter sequence with the longer sequence determines the percentage of identity Preferably, the identity is determined using the known and publicly available computer program ClustalW2 The definition of identity in the ClustalW2 program and its method of discovery, which are publicly available, are expressly referred to in this invention.
ClustalW2 wird öffentlich zur Verfügung gestellt vom European Bioinformatics Institute (EBI) des European Molecular Biology Laboratory (EMBL) und kann im Internet unter http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/ abgerufen werden. Wenn das ClustalW2 Computerprogramm benutzt wird, um die Identität zwischen z.B. der Nukleotidsequenz
der im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschriebenen Nukleinsäuremoleküle und der Nukleotidsequenz von anderen Nukleinsäuremolekülen zu bestimmen, werden folgende Parameter eingestellt: DNA Weight Matrix: IUB; GAP OPEN: 10; GAP EXTENSION: 0,20; GAP DISTANCES: 5; NO END GAPS: no; ITERATION: none; NUMITER: 1 ; ClustalW2 is publicly available from the European Bioinformatics Institute (EBI) of the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) and is available on the Internet at http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/. When the ClustalW2 computer program is used to determine the identity between eg the nucleotide sequence To determine the nucleic acid molecules described in the context of the present invention and the nucleotide sequence of other nucleic acid molecules, the following parameters are set: DNA Weight Matrix: IUB; CAP OPEN: 10; CAP EXTENSION: 0.20; CAP DISTANCES: 5; NO END GAPS: no; ITERATION: none; NUMBER: 1;
CLUSTERING: NJ. CLUSTERING: NJ.
Gegenstand der Erfindung ist auch jedes Aptamer, das mit dem komplementären Strang eines zuvor beschriebenen, erfindungsgemäßen Aptamers hybridisiert, vorausgesetzt, dass ein solches Aptamer an Protein A, G oder L, eine Protein A, G oder L enthaltende Substanz oder einen Protein A, G oder L enthaltenden Organismus, insbesondere Staphylococcus aureus, Streptococcus oder Peptostreptococcus, bindet. The invention also relates to any aptamer that hybridizes to the complementary strand of an aptamer according to the invention described above, provided that such an aptamer contains substance A, G or L, a protein A, G or L-containing substance or a protein A, G or L containing organism, in particular Staphylococcus aureus, Streptococcus or Peptostreptococcus binds.
Der Begriff "Hybridisierung" bedeutet im Rahmen dieser Erfindung eine Hybridisierung unter konventionellen Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3. Aufl. (2001 ) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, beschrieben sind. The term "hybridization" in the context of this invention means a hybridization under conventional hybridization conditions, preferably under stringent conditions, as described, for example, in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed. (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
Nukleinsäuremoleküle, die mit den genannten Molekülen hybridisieren können Nucleic acid molecules that can hybridize with said molecules
beispielsweise aus DNA-Bibliotheken isoliert werden. Die Identifizierung und Isolierung derartiger Nukleinsäuremoleküle kann dabei unter Verwendung der genannten for example, be isolated from DNA libraries. The identification and isolation of such nucleic acid molecules can thereby using the above
Nukleinsäuremoleküle (SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 65) oder Teile dieser Moleküle bzw. der reversen Komplemente dieser Moleküle erfolgen, z.B. mittels Hybridisierung nach Standardverfahren (siehe z.B. Sambrook et al., 2001 , Molecular Cloning, A Nucleic acid molecules (SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 65) or parts of these molecules or the reverse complements of these molecules are carried out, e.g. by hybridization by standard methods (see, e.g., Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, 3. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Bei als Hybridisierungsprobe verwendeten Fragmenten kann es sich auch um synthetische Fragmente oder Oligonukleotide handeln, die mit Hilfe gängiger Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Fragments used as a hybridization probe may also be synthetic fragments or oligonucleotides prepared by conventional methods
Synthesetechniken hergestellt wurden und deren Sequenz im Wesentlichen mit der eines in Rahmen der vorliegenden Erfindung beschriebenen Aptamers bzw. dessen Synthesis techniques were prepared and their sequence substantially with that of an aptamer described in the context of the present invention or its
komplementären Strangs übereinstimmt. complementary strand matches.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Aptamer, das von einem Aptamer mit einer der Sequenzen der SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 65 dadurch abgeleitet ist, dass bei einer der Sequenzen der SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 65 ein oder mehrere Nukleotide substituiert, entfernt (deletiert), innerhalb der Sequenz eingefügt (insertiert) und/oder am
5'-Ende und/oder 3'-Ende angefügt sind, wobei ein solches Aptamer an Protein A, G oder L, eine Protein A, G oder L enthaltende Substanz oder einen Protein A, G oder L enthaltenden Organismus, insbesondere Staphylococcus aureus, Streptococcus oder Peptostreptococcus, bindet. Derart veränderte Aptamere weisen vorzugsweise eine Identität von mindestens 70%, oder mindestens 80%, oder mindestens 85%, oder mindestens 90%, oder mindestens 93%, oder mindestens 95%, oder mindestens 96%, oder mindestens 97%, und am meisten bevorzugt mindestens 98% mit einer der The invention also provides an aptamer which is derived from an aptamer having one of the sequences of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 65 in that one of the sequences of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 65 or multiple nucleotides substituted, deleted (deletion), inserted within the sequence (inserted) and / or am 5'-end and / or 3'-end are added, wherein such an aptamer to protein A, G or L, a protein A, G or L-containing substance or a protein A, G or L-containing organism, in particular Staphylococcus aureus, Streptococcus or Peptostreptococcus binds. Such altered aptamers preferably have an identity of at least 70%, or at least 80%, or at least 85%, or at least 90%, or at least 93%, or at least 95%, or at least 96%, or at least 97%, and most preferably at least 98% with one of
Sequenzen der SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 65 auf. Der Begriff Identität wurde zuvor definiert. Eine Sequenz, bei der ein oder mehr Nukleotide substituiert sind, bezeichnet man auch als Substitutionsmutante, eine Sequenz, bei der ein oder mehr Nukleotide deletiert sind, als Deletionsmutante und eine Sequenz, bei der ein oder mehr Nukleotide insertiert sind, als Insertionsmutante. Vorzugsweise sind insgesamt, bezogen auf Substitution, Deletion und Insertion in einem Aptamermolekül, bis zu 60 Nukleotide substituiert, deletiert, und/oder insertiert, mehr bevorzugt bis zu 50 Nukleotide, noch mehr bevorzugt bis zu 40 Nukleotide, oder bis zu 30 Nuleotide, insbesondere bevorzugt bis zu 10 Nukleotide oder bis zu 8 Nukleotide oder bis zu 5 Nukleotide, weiterhin bevorzugt bis zu 3 Nukleotide, und am meisten bevorzugt bis zu 2 Nukleotide. Sequences of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 65. The term identity has been previously defined. A sequence in which one or more nucleotides are substituted is also referred to as a substitution mutant, a sequence in which one or more nucleotides are deleted, as a deletion mutant and a sequence in which one or more nucleotides are inserted, as an insertion mutant. Preferably, in total, based on substitution, deletion and insertion in an aptamer molecule, up to 60 nucleotides are substituted, deleted, and / or inserted, more preferably up to 50 nucleotides, even more preferably up to 40 nucleotides, or up to 30 nucleotides, in particular preferably up to 10 nucleotides or up to 8 nucleotides or up to 5 nucleotides, more preferably up to 3 nucleotides, and most preferably up to 2 nucleotides.
Bei einer Anfügung sind vorzugweise am 5' und/oder am 3' Ende des Aptamers bis zu 100 Nukleotide angefügt, mehr bevorzugt bis zu 50 Nukleotide, noch mehr bevorzugt bis zu 40 Nukleotide, oder bis zu 20 Nuleotide, insbesondere bevorzugt bis zu 10 Nukleotide oder bis zu 8 Nukleotide, am meisten bevorzugt bis zu 5 Nukleotide. When added, preferably up to 100 nucleotides are added at the 5 'and / or 3' end of the aptamer, more preferably up to 50 nucleotides, even more preferably up to 40 nucleotides, or up to 20 nucleotides, most preferably up to 10 nucleotides or up to 8 nucleotides, most preferably up to 5 nucleotides.
In einer speziellen Ausführungsform bleiben bei den in den Punkten b) bis f) In a specific embodiment, in the points b) to f) remain in the
beschriebenen Abwandlungen eins oder beide der Motive ATACCAGCTTATTCAATT (SEQ ID NO: 66) und ACAATCGTAATCAGTTAG (SEQ ID NO: 67) unverändert oder im Wesentlichen unverändert. Im Wesentlichen unverändert bedeutet, dass bis zu maximal 5 Nukleotide, vorzugsweise maximal 4 Nukleotide, am meisten bevorzugt maximal 3 Nukleotide, bei diesem Motiv substituiert, deletiert und/oder insertiert sind. one or both of the motifs ATACCAGCTTATTCAATT (SEQ ID NO: 66) and ACAATCGTAATCAGTTAG (SEQ ID NO: 67) described unaltered or substantially unchanged. Substantially unchanged means that up to a maximum of 5 nucleotides, preferably a maximum of 4 nucleotides, most preferably a maximum of 3 nucleotides, are substituted, deleted and / or inserted in this motif.
Bei einem Aptamer, bei dem gegenüber einem Aptamer, welches eine In an aptamer, in which compared to an aptamer, which a
Nukleinsäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus einer der SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 65, ein oder mehrere Nukleotide angefügt sind, können Anfügungen am 5'-Ende des Aptamers und/oder am 3'-Ende des Aptamers erfolgen. Bei Anfügungen kann es sich beispielsweise um Oligonukleotide handeln, die als Spacer zwischen der
Aptamersequenz und einer Markierung dienen oder um ein Oligonukleotid das eine Sequenz aufweist, die komplementär zu einem gelabelten Oligonukleotid ist, wie beschrieben in WO20051 13817. Verschiedene weitere anfügbare Sequenzen, welche die Bindungseigenschaften des Aptamers an sein Target nicht beeinträchtigen, sind dem Fachmann auf dem Gebiet der SELEX Verfahren bekannt, beispielsweise aus Conrad et al., "In Vitro Selection of Nucleic Acid Aptamers That Bind Proteins, " Methods in Nucleic acid sequence selected from one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 65, one or more nucleotides are added, additions may be made at the 5 'end of the aptamer and / or at the 3' end of the aptamer. Adjuncts may, for example, be oligonucleotides which act as spacers between the Aptamer sequence and a label or to an oligonucleotide having a sequence which is complementary to a labeled oligonucleotide, as described in WO20051 13817. Various other attachable sequences which do not affect the binding properties of the aptamer to its target, are those skilled in the art The SELEX method is known, for example from Conrad et al., "In Vitro Selection of Nucleic Acid Aptamers That Bind Protein," Methods in
Enzymology, 267: 336-83 (1996) ; Ciesiolka et al., "Affinity Selection-Amplification from Randomized Ribooligonucleotide Pools, " Methods in Enzymology, 267: 315-35 (1996); and Fitzwater et al., "A SELEX Primer, " Methods in Enzymology, 267: 275-301 (1996). Enzymology, 267: 336-83 (1996); Ciesiolka et al., "Affinity Selection Amplification from Randomized Ribooligonucleotide Pools," Methods in Enzymology, 267: 315-35 (1996); and Fitzwater et al., "A SELEX Primer," Methods in Enzymology, 267: 275-301 (1996).
Fragmente, auch bezeichnet als Teile oder Teilsequenzen, weisen die zuvor Fragments, also referred to as parts or subsequences, have the previously
beschriebene Funktionalität der erfindungsgemäßen Aptamere auf. Fragmente werden erhalten, indem man am 5'-Ende und/oder am 3'-Ende eines erfindungsgemäßen described functionality of the aptamers according to the invention. Fragments are obtained by cleaving at the 5 'end and / or at the 3' end of a
Aptamers eine oder mehrere Nukleinsäuren entfernt. Fragmente haben vorzugsweise eine Länge von mindestens 10, insbesondere von mindestens 15 und besonders bevorzugt von mindestens 20 Nukleotiden, am meisten bevorzugt mindestens 30 oder mindestens 40 Nukleotiden. Fragmente sind beispielsweise solche Aptamere, bei welchen die Motive ATACCAGCTTATTCAATT (SEQ ID NO: 66) und/oder Aptamers removes one or more nucleic acids. Fragments are preferably at least 10, more preferably at least 15 and more preferably at least 20 nucleotides in length, most preferably at least 30 or at least 40 nucleotides in length. Fragments are, for example, those aptamers in which the motifs ATACCAGCTTATTCAATT (SEQ ID NO: 66) and / or
ACAATCGTAATCAGTTAG (SEQ ID NO: 67) ganz oder teilweise entfernt sind. ACAATCGTAATCAGTTAG (SEQ ID NO: 67) are completely or partially removed.
Der Begriff„Derivat" bezeichnet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ein Aptamer, das eine chemische Struktur aufweist, die in natürlicher DNA oder RNA nicht vorkommt. The term "derivative" in the context of the present invention refers to an aptamer which has a chemical structure which does not occur in natural DNA or RNA.
Insbesondere bezeichnet der Begriff Derivat ein Aptamer, das eine chemische Struktur enthält, die von Desoxyribose, Ribose, Phosphat, Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C), Thymin (T), oder Uracil (U) abweichend ist. Ein Aptamer-Derivat kann an der Nukleobase, an der Pentose oder am Phosphat-Rückgrat modifiziert sein. In particular, the term derivative denotes an aptamer containing a chemical structure other than deoxyribose, ribose, phosphate, adenine (A), guanine (G), cytosine (C), thymine (T), or uracil (U). An aptamer derivative may be modified at the nucleobase, at the pentose or at the phosphate backbone.
Insbesondere bezeichnet der Begriff „Derivat" ein Aptamer, In particular, the term "derivative" refers to an aptamer,
- bei dem natürlich in DNA und RNA vorkommende Nukleotide teilweise oder - In the naturally occurring in DNA and RNA nucleotides partially or
vollständig durch chemisch davon abweichende Nukleotide, sogenannte modifizierte Nukleotide, ersetzt sind und/oder completely replaced by chemically deviating nucleotides, so-called modified nucleotides, and / or
- dessen molekulare Struktur anderweitig modifiziert ist, insbesondere durch - whose molecular structure is otherwise modified, in particular by
Anbindung nicht natürlich in RNA oder DNA vorkommender Strukturen, und/oder
- die ein modifiziertes Rückgrat aufweisen. Attachment of non-naturally occurring in RNA or DNA structures, and / or - Have a modified backbone.
Spezielle Beispiele für Derivate sind, ohne darauf beschränkt zu sein, Specific examples of derivatives include, but are not limited to,
- Aptamere, die an mindestens einem Nukleotid eine Alkylierung, Arylierung oder Acetylierung, Alkoxylierung, Halogenierung, eine Aminogruppe oder eine andere funktionelle Gruppe aufweisen. Beispiele für modifizierte Nukleotide sind 2'-Fluor- Ribonucleotide, 2'-NH2-, 2'-OCH3- und 2'-0-methoxyethyl-Ribonukleotide, die für RNA-Aptamere genutzt werden. Aptamers which have at least one nucleotide an alkylation, arylation or acetylation, alkoxylation, halogenation, an amino group or another functional group. Examples of modified nucleotides are 2'-fluoro ribonucleotides, 2'-NH 2 -, 2'-OCH 3 - and 2'-O-methoxyethyl ribonucleotides, which are used for RNA aptamers.
- Aptamere, die eine Basenmodifikation aufweisen, wie Bromuridin, Aptamers which have a base modification, such as bromuridine,
- Markierte Aptamere, auch bezeichnet als gelabelte Aptamere. Bevorzugte - Labeled aptamers, also referred to as labeled aptamers. preferred
Markierungen (Label) sind visuell, optisch, photonisch, elektronisch, akustisch, opto-akustisch, nach Masse, elektrochemisch, elektrooptisch, spektrometrisch, enzymatisch, oder anderweitig chemisch, biochemisch oder physikalisch detektierbar. Label können beispielsweise angebundene Reporter-, Marker- oder Adaptermoleküle sein. Beispiele hierfür sind markierte Aptamere, deren Labels are visual, optical, photonic, electronic, acoustic, opto-acoustic, mass, electrochemical, electro-optical, spectrometric, enzymatic, or otherwise chemically, biochemically, or physically detectable. Labels can be, for example, tethered reporter, marker or adapter molecules. Examples of these are labeled aptamers whose
Markierung durch Lumineszenz, UV/VIS-Farbgebung, enzymatisch, Luminescence labeling, UV / VIS coloring, enzymatic,
elektrochemisch, immunologisch oder radioaktiv nachgewiesen werden kann. Beispiele für Markierungssubstanzen sind weiter unten bei der Erläuterung von erfindungsgemäßen Verfahren angegeben, bei denen markierte Aptamere eingesetzt werden können. can be detected electrochemically, immunologically or radioactively. Examples of marker substances are given below in the explanation of methods according to the invention, in which labeled aptamers can be used.
- Aptamere, die enantiomere Nukleotide aufweisen. Aptamers having enantiomeric nucleotides.
- Aptamere, die ganz oder teilweise als Phosphorthioat-RNA oder -DNA, Aptamers, all or in part as phosphorothioate RNA or DNA,
Phosphordithioat-RNA oder -DNA, Phosphorselenoat-RNA oder -DNA, Phosphorodithioate RNA or DNA, phosphorselenoate RNA or DNA,
Phosphordiselenoat-RNA oder -DNA, Phosphoroamidat-RNA oder -DNA, locked nucleic acid (LNA), peptide nucleic acid (PNA), N3'-P5' Phosphoramidat Phosphodiselenoate RNA or DNA, locked nucleic acid (LNA), peptide nucleic acid (PNA), N3'-P5 'phosphoramidate, phosphoroamidate RNA or DNA
RNA/DNA, Cyclohexennukleinsäure (CeNA), Tricyclo-DNA (tcDNA) oder Spiegelmer vorliegen, oder die Phosphoramidatmorpholin (PMO) Komponenten aufweisen (siehe auch Chan et al., Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology (2006) 33, 533-540). RNA / DNA, cyclohexene nucleic acid (CeNA), tricyclo-DNA (tcDNA) or spiegelmer, or have the phosphoramidate morpholine (PMO) components (see also Chan et al., Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology (2006) 33, 533-540). ,
Durch manche der Modifikationen können Aptamere gegen Nukleinsäure-spaltende Enzyme stabilisiert werden. Bei der Stabilisierung der Aptamere kann grundsätzlich zwischen der nachträglichen Modifikation der Aptamere und der Selektion mit bereits modifizierter RNA/DNA unterschieden werden. Die Stabilisierung berührt die Affinität der modifizierten RNA/DNA-Aptamere nicht, verhindert jedoch die schnelle Zersetzung der
Aptamere in einem Organismus oder biologischen Lösungen durch RNasen/DNasen. Ein Aptamer wird im Rahmen der Erfindung als stabilisiert bezeichnet, wenn die Halbwertszeit in biologischen Seren grösser als eine Minute, vorzugsweise grösser als eine Stunde, besonders bevorzugt grösser als ein Tag ist. Die Aptamere können auch mit Some of the modifications allow aptamers to be stabilized against nucleic acid-cleaving enzymes. In the stabilization of the aptamers, a distinction can generally be made between the subsequent modification of the aptamers and the selection with already modified RNA / DNA. The stabilization does not affect the affinity of the modified RNA / DNA aptamers, but prevents the rapid decomposition of the Aptamers in an organism or biological solutions by RNases / DNases. An aptamer is referred to as stabilized in the context of the invention if the half-life in biological sera is greater than one minute, preferably greater than one hour, more preferably greater than one day. The aptamers can also be used
Reportermolekülen modifiziert sein, die neben der Detektion der markierten Aptamere auch zur Erhöhung der Stabilität beitragen können. Reporter molecules may be modified, which can contribute to the detection of the labeled aptamers also to increase the stability.
In einer weiteren speziellen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Aptamer das an Protein A, G oder L, Protein A, G oder L enthaltende Substanzen oder Protein A, G oder L enthaltende Mikroorganismen bindet und das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus In a further specific embodiment, the invention relates to an aptamer which binds to microorganisms containing protein A, G or L, protein A, G or L or protein A, G or L and which is selected from the group consisting of
a) einem Aptamer umfassend, oder bestehend aus, eine(r) Nukleinsäuresequenz, mit der SEQ ID NO: 62, mit der Maßgabe, dass Thymin durch Uracil ersetzt sein kann, b) einem Aptamer, dessen Nukleinsäuresequenz eine Identität von mindestens 70% mit der Nukleinsäuresequenz eines Aptamers aus a) aufweist, insbesondere ein a) an aptamer comprising, or consisting of, a nucleic acid sequence having SEQ ID NO: 62, with the proviso that thymine may be replaced by uracil, b) an aptamer whose nucleic acid sequence has an identity of at least 70% the nucleic acid sequence of an aptamer from a), in particular a
Aptamer mit einer Sequenz nach SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 4, Aptamer having a sequence according to SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4,
c) einem Aptamer, das mit dem komplementären Strang eines Aptamers aus a) c) an aptamer linked to the complementary strand of an aptamer from a)
hybridisiert, insbesondere ein Aptamer mit einer Sequenz nach SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 4, hybridizes, in particular an aptamer having a sequence according to SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4,
d) einem Aptamer bei dem gegenüber einem Aptamer aus a) ein oder mehrere d) an aptamer with respect to an aptamer from a) one or more
Nukleotide substituiert, deletiert, insertiert und/oder angefügt sind, insbesondere ein Aptamer mit einer Sequenz nach SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 4, Nucleotides are substituted, deleted, inserted and / or attached, in particular an aptamer having a sequence according to SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4,
e) einem Fragment eines Aptamers nach a), b), c) oder d), und e) a fragment of an aptamer according to a), b), c) or d), and
f) einem Derivat eines Aptamers nach a), b), c), d) oder e). f) a derivative of an aptamer according to a), b), c), d) or e).
Zu den Punkten b) - f) gelten, auch für die noch folgenden Ausführungsformen, analog die obigen Offenbarungen. For the points b) - f) apply analogously to the above disclosures, also for the following embodiments.
In einer weiteren speziellen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Aptamer das an Protein A, G oder L, Protein A, G oder L enthaltende Substanzen oder Protein A, G oder L enthaltende Mikroorganismen bindet und das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus In a further specific embodiment, the invention relates to an aptamer which binds to microorganisms containing protein A, G or L, protein A, G or L or protein A, G or L and which is selected from the group consisting of
a) einem Aptamer umfassend, oder bestehend aus, eine(r) Nukleinsäuresequenz, mit der SEQ ID NO: 63, mit der Maßgabe, dass Thymin durch Uracil ersetzt sein kann,
b) einem Aptamer, dessen Nukleinsäuresequenz eine Identität von mindestens 70% mit der Nukleinsäuresequenz eines Aptamers aus a) aufweist, insbesondere ein Aptamer mit einer Sequenz nach SEQ ID NO: 5 bis SEQ ID NO: 8, a) an aptamer comprising, or consisting of, a nucleic acid sequence having SEQ ID NO: 63, with the proviso that thymine may be replaced by uracil, b) an aptamer whose nucleic acid sequence has an identity of at least 70% with the nucleic acid sequence of an aptamer from a), in particular an aptamer having a sequence according to SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 8,
c) einem Aptamer, das mit dem komplementären Strang eines Aptamers aus a) c) an aptamer linked to the complementary strand of an aptamer from a)
hybridisiert, insbesondere ein Aptamer mit einer Sequenz nach SEQ ID NO: 5 bis SEQ ID NO: 8, hybridized, in particular an aptamer having a sequence according to SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 8,
d) einem Aptamer bei dem gegenüber einem Aptamer aus a) ein oder mehrere d) an aptamer with respect to an aptamer from a) one or more
Nukleotide substituiert, deletiert, insertiert und/oder angefügt sind, insbesondere ein Aptamer mit einer Sequenz nach SEQ ID NO: 5 bis SEQ ID NO: 8, Nucleotides are substituted, deleted, inserted and / or attached, in particular an aptamer having a sequence according to SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 8,
e) einem Fragment eines Aptamers nach a), b), c) oder d), und e) a fragment of an aptamer according to a), b), c) or d), and
f) einem Derivat eines Aptamers nach a), b), c), d) oder e). f) a derivative of an aptamer according to a), b), c), d) or e).
In noch einer weiteren speziellen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Aptamer das an Protein A, G oder L, Protein A, G oder L enthaltende Substanzen oder Protein A, G oder L enthaltende Mikroorganismen bindet und das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus In yet another specific embodiment, the invention relates to an aptamer which binds microorganisms containing protein A, G or L, protein A, G or L or protein A, G or L and which is selected from the group consisting of
a) einem Aptamer umfassend, oder bestehend aus, eine(r) Nukleinsäuresequenz, mit der SEQ ID NO: 64, mit der Maßgabe, dass Thymin durch Uracil ersetzt sein kann, b) einem Aptamer, dessen Nukleinsäuresequenz eine Identität von mindestens 70% mit der Nukleinsäuresequenz eines Aptamers aus a) aufweist, insbesondere ein a) an aptamer comprising, or consisting of, a nucleic acid sequence having SEQ ID NO: 64, with the proviso that thymine may be replaced by uracil, b) an aptamer whose nucleic acid sequence has an identity of at least 70% with the nucleic acid sequence of an aptamer from a), in particular a
Aptamer mit einer Sequenz nach SEQ ID NO: 9 bis SEQ ID NO: 10, Aptamer having a sequence according to SEQ ID NO: 9 to SEQ ID NO: 10,
c) einem Aptamer, das mit dem komplementären Strang eines Aptamers aus a) c) an aptamer linked to the complementary strand of an aptamer from a)
hybridisiert, insbesondere ein Aptamer mit einer Sequenz nach SEQ ID NO: 9 bis SEQ ID NO: 10, hybridized, in particular an aptamer having a sequence according to SEQ ID NO: 9 to SEQ ID NO: 10,
d) einem Aptamer bei dem gegenüber einem Aptamer aus a) ein oder mehrere d) an aptamer with respect to an aptamer from a) one or more
Nukleotide substituiert, deletiert, insertiert und/oder angefügt sind, insbesondere ein Aptamer mit einer Sequenz nach SEQ ID NO: 9 bis SEQ ID NO: 10, e) einem Fragment eines Aptamers nach a), b), c) oder d), und Nucleotides are substituted, deleted, inserted and / or attached, in particular an aptamer having a sequence according to SEQ ID NO: 9 to SEQ ID NO: 10, e) a fragment of an aptamer according to a), b), c) or d), and
f) einem Derivat eines Aptamers nach a), b), c), d) oder e). f) a derivative of an aptamer according to a), b), c), d) or e).
In noch einer weiteren speziellen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Aptamer das an Protein A, G oder L, Protein A, G oder L enthaltende Substanzen oder Protein A, G oder L enthaltende Mikroorganismen bindet und das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
a) einem Aptamer umfassend, oder bestehend aus, eine(r) Nukleinsäuresequenz, mit der SEQ ID NO: 65, mit der Maßgabe, dass Thymin durch Uracil ersetzt sein kann, b) einem Aptamer, dessen Nukleinsäuresequenz eine Identität von mindestens 70% mit der Nukleinsäuresequenz eines Aptamers aus a) aufweist, insbesondere ein Aptamer mit einer Sequenz nach SEQ ID NO: 1 1 bis SEQ ID NO: 12, In yet another specific embodiment, the invention relates to an aptamer which binds microorganisms containing protein A, G or L, protein A, G or L or protein A, G or L and which is selected from the group consisting of a) an aptamer comprising, or consisting of, a nucleic acid sequence having SEQ ID NO: 65, with the proviso that thymine may be replaced by uracil, b) an aptamer whose nucleic acid sequence has an identity of at least 70% with the nucleic acid sequence of an aptamer from a), in particular an aptamer having a sequence according to SEQ ID NO: 1 1 to SEQ ID NO: 12,
c) einem Aptamer, das mit dem komplementären Strang eines Aptamers aus a) c) an aptamer linked to the complementary strand of an aptamer from a)
hybridisiert, insbesondere ein Aptamer mit einer Sequenz nach SEQ ID NO: 1 1 bis SEQ ID NO: 12, hybridized, in particular an aptamer having a sequence according to SEQ ID NO: 1 1 to SEQ ID NO: 12,
d) einem Aptamer bei dem gegenüber einem Aptamer aus a) ein oder mehrere d) an aptamer with respect to an aptamer from a) one or more
Nukleotide substituiert, deletiert, insertiert und/oder angefügt sind, insbesondere ein Aptamer mit einer Sequenz nach SEQ ID NO: 1 1 bis SEQ ID NO: 12, e) einem Fragment eines Aptamers nach a), b), c) oder d), und Nucleotides are substituted, deleted, inserted and / or added, in particular an aptamer having a sequence according to SEQ ID NO: 1 1 to SEQ ID NO: 12, e) a fragment of an aptamer according to a), b), c) or d) , and
f) einem Derivat eines Aptamers nach a), b), c), d) oder e). f) a derivative of an aptamer according to a), b), c), d) or e).
Eine spezielle Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Aptamer, das an Protein A, G oder L, Protein A, G oder L enthaltende Substanzen oder Protein A, G oder L enthaltende Mikroorganismen bindet, und das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus A specific embodiment of the invention relates to an aptamer which binds to microorganisms containing protein A, G or L, protein A, G or L-containing substances or protein A, G or L, and which is selected from the group consisting of
a) einem Aptamer umfassend, oder bestehend aus, eine(r) Nukleinsäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 65, wobei a) an aptamer comprising, or consisting of, a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 65, wherein
am 5'-Ende der Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 65 ein Oligonukleotid mit der Sequenz 5' ATACCAGCTTATTCAATT 3' (SEQ ID NO: 66) entfernt ist und/oder at the 5 ' end of the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 65, an oligonucleotide having the sequence 5' ATACCAGCTTATTCAATT 3 '(SEQ ID NO: 66) is removed and / or
am 3'-Ende der Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 65 ein Oligonukleotid mit der Sequenz 5' ACAATCGTAATCAGTTAG 3' (SEQ ID NO: 67) entfernt ist, at the 3 ' end of the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 65 an oligonucleotide having the sequence 5' ACAATCGTAATCAGTTAG 3 '(SEQ ID NO: 67) is removed,
mit der Maßgabe, dass Thymin durch Uracil ersetzt sein kann, with the proviso that thymine can be replaced by uracil,
b) einem Aptamer, dessen Nukleinsäuresequenz eine Identität von mindestens 70% mit der Nukleinsäuresequenz eines Aptamers aus a) aufweist, c) einem Aptamer, das mit dem komplementären Strang eines Aptamers aus a) hybridisiert, b) an aptamer whose nucleic acid sequence has an identity of at least 70% with the nucleic acid sequence of an aptamer from a), c) an aptamer which hybridizes with the complementary strand of an aptamer from a),
d) einem Aptamer bei dem gegenüber einem Aptamer aus a) ein oder mehrere Nukleotide substituiert, deletiert, insertiert und/oder angefügt sind, e) einem Fragment eines Aptamers nach a), b), c) oder d), und d) an aptamer in which one or more nucleotides are substituted, deleted, inserted and / or attached to an aptamer from a), e) a fragment of an aptamer according to a), b), c) or d), and
f) einem Derivat eines Aptamers nach a), b), c), d) oder e).
Beispielhafte Sequenzen dafür sind in den Beispielen als SEQ ID NO: 69-71 angegeben. Insbesondere umfasst von der Erfindung sind Ausführungsformen, bei denen am 3'-Ende der Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 65 ein Oligonukleotid mit der Sequenz 5' ACAATCGTAATCAGTTAG 3' (SEQ ID NO: 67) entfernt ist. f) a derivative of an aptamer according to a), b), c), d) or e). Exemplary sequences for this are given in the examples as SEQ ID NO: 69-71. In particular, embodiments of the invention include embodiments in which an oligonucleotide with the sequence 5 'ACAATCGTAATCAGTTAG 3' (SEQ ID NO: 67) is removed at the 3 ' end of the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 65.
Die Bindungsfähigkeit der erfindungsgemäßen Aptamere wird durch die Affinität The binding ability of the aptamers according to the invention is determined by the affinity
(Sensitivität) der Bindung (ausgedrückt durch die Dissoziationskonstante) beschrieben. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Arzneimittel, insbesondere zur (Sensitivity) of the binding (expressed by the dissociation constant). In a further aspect, the invention relates to a medicament, in particular for
Diagnose, Prophylaxe und/oder Behandlung von Erkrankungen, die auf Staphylococcus aureus, Streptococcus und/oder Peptostreptococcus zurückzuführen sind, umfassend ein oder mehrere verschiedene erfindungsgemäße Aptamere wie zuvor beschrieben. Mit dem Begriff Prophylaxe kann beispielsweise gemeint sein, dass Staphylococcus aureus, Streptococcus oder Peptostreptococcus durch Anbindung eines erfindungsgemäßen Aptamers unschädlich gemacht werden und dadurch eine Infektion eines Organismus verhindert wird. Diagnosis, prophylaxis and / or treatment of diseases attributable to Staphylococcus aureus, Streptococcus and / or Peptostreptococcus comprising one or more different aptamers of the invention as described above. By the term prophylaxis, it may be meant, for example, that Staphylococcus aureus, Streptococcus or Peptostreptococcus are rendered harmless by attachment of an aptamer according to the invention and thus infection of an organism is prevented.
Ferner betrifft die Erfindung auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Aptamere zur Diagnose, Prophylaxe, Behandlung und/oder Therapie von Erkrankungen, die aufFurthermore, the invention also relates to the use of the aptamers according to the invention for the diagnosis, prophylaxis, treatment and / or treatment of diseases based on
Staphylococcus aureus, Streptococcus oder Peptostreptococcus zurückzuführen sind, sowie die Verwendung der erfindungsgemäßen Aptamere zur Herstellung eines Staphylococcus aureus, Streptococcus or Peptostreptococcus, as well as the use of the aptamers according to the invention for the preparation of a
Arzneimittels zur Diagnose, Prophylaxe, Behandlung und/oder Therapie von Medicament for the diagnosis, prophylaxis, treatment and / or therapy of
Erkrankungen, die auf Staphylococcus aureus, Streptococcus oder Peptostreptococcus zurückzuführen sind. Diseases caused by Staphylococcus aureus, Streptococcus or Peptostreptococcus.
Ein Arzneimittel im Sinne der Erfindung ist jedes Mittel, welches in der Prophylaxe, Diagnose, Therapie, Verlaufskontrolle oder Nachbehandlung von Patienten eingesetzt werden kann, die zumindest zeitweise eine pathogene Modifikation des Gesamtzustandes bzw. des Zustandes einzelner Teile des Patientenorganismus zeigen. Das Arzneimittel kann ein Arzneimittel für Menschen wie auch für Tiere sein. Erkrankungen, die auf Staphylococcus aureus zurückzuführen und mit einem erfindungsgemäßen Arzneimittel behandelbar sind, sind insbesondere Sepsis, Haut- und Wundinfektionen, Pneumonien, Abszesse, Furunkel, Karbunkel, Endokarditis, Muskelerkrankungen (Pyomyositis),
Osteomyelitis, Lebensmittelvergiftungen durch S. aureus Exotoxine, Toxisches Schock- Syndrom (TSS) Sepsis und Mastitis bei Tieren. A pharmaceutical according to the invention is any agent which can be used in the prophylaxis, diagnosis, therapy, follow-up or after-treatment of patients who at least temporarily exhibit a pathogenic modification of the overall condition or condition of individual parts of the patient's organism. The medicine can be a medicine for humans as well as for animals. Diseases attributable to Staphylococcus aureus and treatable with a pharmaceutical composition according to the invention are, in particular, sepsis, skin and wound infections, pneumonias, abscesses, boils, carbuncles, endocarditis, muscle diseases (pyomyositis), Osteomyelitis, food poisoning by S. aureus exotoxins, Toxic shock syndrome (TSS) sepsis and mastitis in animals.
Das erfindungsgemäße Arzneimittel enthält vorzugsweise pharmazeutisch verträgliche Hilfsstoffe und/oder Trägerstoffe, die dem Fachmann bekannt sind. The medicament according to the invention preferably contains pharmaceutically acceptable excipients and / or carriers which are known to the person skilled in the art.
Das Arzneimittel kann das Aptamer beispielsweise als ein pharmazeutisch akzeptables Salz umfassen. Hierbei kann es sich beispielsweise um Salze anorganischer Säuren, wie z.B. der Phosphorsäure, oder um Salze organischer Säuren handeln. Die jeweilige Dosis bzw. der Dosisbereich für die Gabe des erfindungsgemäßen Arzneimittels ist groß genug, um den gewünschten prophylaktischen oder therapeutischen Effekt der Bindung an Protein A, G oder L zu erreichen. Im Allgemeinen wird die Dosis mit dem Alter, der Konstitution und dem Geschlecht des Patienten variieren, sowie die Schwere der For example, the medicament may comprise the aptamer as a pharmaceutically acceptable salt. These may be, for example, salts of inorganic acids, e.g. the phosphoric acid, or salts of organic acids. The particular dose or dose range for the administration of the medicament according to the invention is large enough to achieve the desired prophylactic or therapeutic effect of binding to protein A, G or L. In general, the dose will vary with the age, constitution and gender of the patient, as well as the severity of the disease
Erkrankung berücksichtigen. Es versteht sich, dass die spezifische Dosis, Häufigkeit und Dauer der Verabreichung darüber hinaus von einer Vielzahl an Faktoren abhängen, wie z.B. der Bindungsfähigkeit der Aptamere, Ernährungsgewohnheiten des zu behandelnden Individuums, Art der Verabreichung, Ausscheidungsrate und Kombination mit anderen Medikamenten. Die exakte Dosis ist durch einen Fachmann mit bekannten Mitteln und Methoden feststellbar. Consider disease. It should also be understood that the specific dose, frequency and duration of administration will depend on a variety of factors, such as: the binding ability of aptamers, dietary habits of the individual to be treated, route of administration, excretion rate and combination with other drugs. The exact dose can be determined by a person skilled in the art by known means and methods.
Zur Unterstützung der medizinischen Wirkung kann das Arzneimittel in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung auch weitere Wirkstoffe umfassen, wie z.B. Antikörper. In a preferred embodiment of the invention the medicament may also comprise further active ingredients, such as, for example, in order to promote the medicinal effect. Antibody.
Das Arzneimittel der vorliegenden Erfindung kann oral, transmucosal, rektal, pulmonal, enteral und/oder parenteral angewendet werden. Bevorzugt ist eine direkte Injektion in den Körper. Die gewählte Art der Verabreichung richtet sich nach der Indikation, der zu verabreichenden Dosis, Individuums-spezifischen Parametern etc. Insbesondere ermöglichen die verschiedenen Arten der Verabreichung eine ortspezifische Therapie, die Nebenwirkungen minimiert und die Wirkstoffdosis verringert. Bevorzugte Injektionen sind die intradermale, subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion. Die Applikation kann z.B. mit Hilfe sogenannter Impfpistolen, die die DNA mittels Goldkugeln in die Haut einbringen, oder mittels Spritzen, die die DNA unter die Haut oder in den Muskel einbringen, geschehen. Es ist auch möglich, das Aptamer als Aerosol bereitzustellen, welches von dem Organismus, bevorzugt einem humanen Patienten, inhaliert wird.
Um die protektive oder therapeutische Wirkung der erfindungsgemäßen Aptamere zu erhöhen, können den daraus hergestellten pharmazeutischen Mitteln pharmazeutisch verträgliche Hilfsstoffe, wie z.B. Adjuvantien, zugesetzt werden. Im Sinne der Erfindung ist jede Substanz, die mit den erfindungsgemäßen DNA-Aptameren eine Wirkung ermöglicht, verstärkt oder modifiziert, ein Adjuvante. Bekannte Adjuvantien sind beispielsweiseThe drug of the present invention may be administered orally, transmucosally, rectally, pulmonarily, enterally and / or parenterally. Preferred is a direct injection into the body. The chosen mode of administration will depend on the indication, dose to be administered, individual-specific parameters, etc. In particular, the different modes of administration will allow for site-specific therapy that minimizes side effects and reduces the drug dose. Preferred injections are the intradermal, subcutaneous, intramuscular or intravenous injection. The application can, for example, with the help of so-called vaccine guns that bring the DNA by means of gold balls into the skin, or by means of syringes, which bring the DNA under the skin or into the muscle to happen. It is also possible to provide the aptamer as an aerosol which is inhaled by the organism, preferably a human patient. In order to increase the protective or therapeutic effect of the aptamers according to the invention, pharmaceutically acceptable adjuvants, such as adjuvants, may be added to the pharmaceutical compositions produced therefrom. For the purposes of the invention, any substance which makes possible, amplifies or modifies an effect with the DNA aptamers according to the invention is an adjuvant. Known adjuvants are, for example
Aluminiumverbindungen, wie z.B. Aluminiumhydroxid oder Aluminiumphosphat, Saponine, wie z.B. QS 21 , Muramyldipeptid oder Muramyltripeptid, Proteine, wie z.B. Aluminum compounds, e.g. Aluminum hydroxide or aluminum phosphate, saponins, e.g. QS 21, muramyl dipeptide or muramyl tripeptide, proteins, e.g.
Gammainterferon oder TNF, MF 59, Phosphatdibylcholin, Squalen oder Polyole. Des Weiteren kann DNA, die eine immunstimulatorische Eigenschaft hat, oder die ein Protein mit Adjuvants-Effekt kodiert, wie z.B. ein Cytokin, parallel oder in einem Konstrukt appliziert werden. Gamma interferon or TNF, MF 59, phosphate dibylcholine, squalene or polyols. Furthermore, DNA which has an immunostimulatory property or which encodes a protein having an adjuvant effect, e.g. a cytokine, in parallel or in a construct.
Das pharmazeutische Mittel kann beispielsweise als Tablette, Kapsel, Pulver, Lösung, Dispersion oder Suspension vorliegen. Die Darreichungsformen des pharmazeutischen Mittels werden mit den üblichen festen oder flüssigen Trägerstoffen und/oder The pharmaceutical agent can be present for example as a tablet, capsule, powder, solution, dispersion or suspension. The dosage forms of the pharmaceutical agent are with the usual solid or liquid carriers and / or
Verdünnungsmitteln und den üblicherweise eingesetzten Hilfsstoffen entsprechend der gewünschten Applikationsart in einer geeigneten Dosierung und in an sich bekannter Weise hergestellt. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Protein A, G oder L, Protein A, G oder L enthaltenden Substanzen oder Protein A, G oder L enthaltenden Mikroorganismen, insbesondere Staphylococcus aureus, Streptococcus oder Peptostreptococcus, bei dem Diluents and the excipients usually used according to the desired mode of administration in a suitable dosage and prepared in a conventional manner. In a further aspect, the invention relates to a method for the detection of protein A, G or L, substances containing protein A, G or L or microorganisms containing protein A, G or L, in particular Staphylococcus aureus, Streptococcus or Peptostreptococcus, in which
ein oder mehrere verschiedene erfindungsgemäße Aptamere, wie zuvor beschrieben, mit einer Probe, die Protein A, G oder L, die Protein A, G oder L enthaltende Substanz oder den Mikroorganismus enthält, in Kontakt gebracht wird und one or more different aptamers of the invention as described above are contacted with a sample containing protein A, G or L containing substance A, G or L or the microorganism, and
b) eine Bindung zwischen dem/den Aptamer(en) und Protein A, G oder L, oder b) binding between the aptamer (s) and protein A, G or L, or
zwischen dem/den Aptamer(en) und der Substanz, oder zwischen dem/den between the aptamer (s) and the substance, or between the / the
Aptamer(en) und dem Mikroorganismus nachgewiesen wird. Aptamer (s) and the microorganism is detected.
Das Verfahren kann sowohl ein qualitatives als auch ein quantitatives Nachweisverfahren sein. Die Verfahrensschritte a) und b) können je nach konkreter Verfahrensgestaltung gleichzeitig oder im Wesentlichen gleichzeitig erfolgen.
Das Verfahren ist insbesondere zum Einsatz in der Lebensmittel-, Wasser- und The method can be both a qualitative and a quantitative detection method. The process steps a) and b) can be carried out simultaneously or substantially simultaneously, depending on the concrete process design. The method is particularly suitable for use in the food, water and
Umweltanalytik, der Wasserbehandlung und der Wasseraufbereitung, insbesondere von Trinkwasser und Abwasser, der Diagnostik sowie zur Anwendung in Krankenhäusern und Pflegeeinrichtungen geeignet. Environmental analysis, water treatment and water treatment, especially of drinking water and wastewater, diagnostics and for use in hospitals and care facilities suitable.
Das Verfahren eignet sich insbesondere zum Nachweis von Staphylococcus aureus in beliebigen Medien und Umgebungen, insbesondere in Wasser und anderen Flüssigkeiten, wie beispielsweise in Trink- und Abwasserproben. Im Fall von Staphylococcus aureus bindet das erfindungsgemäße Aptamer an Protein A, das in der Zellwand vorkommt und für das Aptamer zugänglich ist. Das Aptamer kann ebenfalls an andere Keime binden, die Protein A, G oder L enthalten, beispielsweise als Oberflächenprotein in der Zellwand. Sofern das Protein A, G oder L nicht an der Oberfläche eines Mikroorganismus sitzt, besteht die Möglichkeit, den Organismus zu zerstören, um darin enthaltenes Protein A, G oder L zum Nachweis freizusetzen. The method is particularly suitable for the detection of Staphylococcus aureus in any media and environments, especially in water and other liquids, such as in drinking and wastewater samples. In the case of Staphylococcus aureus, the aptamer of the present invention binds to Protein A, which exists in the cell wall and is accessible to the aptamer. The aptamer may also bind to other germs containing protein A, G or L, for example as a surface protein in the cell wall. If the protein A, G or L does not sit on the surface of a microorganism, it is possible to destroy the organism in order to release protein A, G or L contained therein for detection.
Eine Probe im Sinne des obigen Nachweisverfahrens ist ein bereitgestelltes oder durch Probenentnahme erhaltenes Material, von dem angenommen wird, dass es Protein A, G oder L, Protein A, G oder L enthaltende Substanz oder einen Protein A, G oder L enthaltenden Mikroorganismus (zusammenfassend bezeichnet als„Target" oder im Rahmen dieses Nachweisverfahrens auch als„Analyt") umfasst, und das auf das A sample in the sense of the above detection method is a material provided or sampled which is believed to contain protein A, G or L, protein A, G or L-containing substance or a microorganism containing protein A, G or L (in summary referred to as "target" or as part of this detection method as "analyte"), and that on the
Vorhandensein Target geprüft werden soll. Presence Target should be checked.
Eine Probe kann eine Wasserprobe, insbesondere eine Trinkwasser-, Grundwasser, Oberflächenwasser oder Abwasserprobe, eine Probe von anderweitigem, aus der Umwelt entnommenem Material, eine klinische Probe oder eine Lebensmittelprobe sein. A sample may be a water sample, in particular a drinking water, groundwater, surface water or wastewater sample, a sample of other environmental sampled material, a clinical sample or a food sample.
Eine Probe können weiterhin alle biologischen Materialien sein, die von Individuen isoliert worden sind, beispielsweise biologische Gewebe und Flüssigkeiten, zu denen u.a. Blut, Haut, Plasma, Serum, Lymphe, Urin, Gehirnflüssigkeit, Tränen, Abstriche, A sample may further be any biological material isolated from individuals, for example, biological tissues and fluids, including but not limited to: Blood, skin, plasma, serum, lymph, urine, cerebrospinal fluid, tears, smears,
Gewebeproben, Organe und Tumore zählen. Vorliegend sind in Proben auch Bestandteile von Zellkulturen eingeschlossen. Die Probenentnahme erfolgt insbesondere so, dass die entnommene Teilmenge einem Durchschnitt der gesamten Menge entspricht. Die durch Untersuchung der Probe ermittelten Merkmale dienen der Beurteilung der durch die Probe erfassten Menge, die wiederum Rückschlüsse auf die Gesamtmenge, beispielsweise das Blut bzw. die Lymphe in einem Organismus, zulässt. Für die Untersuchung können die
Proben vorbehandelt, wie z.B. durch Mischen, Zugabe von Enzymen oder Markern, oder aufgereinigt werden. Tissue samples, organs and tumors count. In the present case, components of cell cultures are also included in samples. The sampling takes place in particular so that the extracted subset corresponds to an average of the total amount. The characteristics determined by examination of the sample are used to assess the amount detected by the sample, which in turn allows conclusions to be drawn about the total amount, for example the blood or the lymph in an organism. For the investigation, the Pre-treated samples, such as by mixing, addition of enzymes or markers, or purified.
Wird das Aptamer mit dem Target (Protein A, G oder L, Protein A, G oder L enthaltende Substanz oder Protein A, G oder L enthaltender Mikroorganismus) in Kontakt gebracht, so bildet sich ein Aptamer-Target-Komplex durch Bindung des Aptamers an das Target. Die Bindung bzw. das Bindungsereignis kann beispielsweise visuell, optisch, photonisch, elektronisch, akustisch, opto-akustisch, nach Masse, elektrochemisch, elektrooptisch, spektrometrisch, enzymatisch, oder anderweitig chemisch, biochemisch oder physikalisch nachgewiesen werden. When the aptamer is contacted with the target (protein A, G or L, protein A, G or L-containing substance or protein A, G or L-containing microorganism), an aptamer-target complex is formed by binding the aptamer the target. The binding or binding event can be detected, for example, visually, optically, photonically, electronically, acoustically, opto-acoustically, by mass, electrochemically, electro-optically, spectrometrically, enzymatically, or otherwise chemically, biochemically or physically.
Bei einem markierungsfreien Nachweis wird das Aptamer beispielsweise auf einer Oberfläche fixiert und die Änderung der Schichtdicke nach Anlagerung des Targets mit einer der genannten Methoden bestimmt, wie z.B. über eine Änderung der optischen Eigenschaften der Sensorschicht (z.B. Brechungsindex). Ein weiteres Verfahren des markierungsfreien Nachweises ist die Messung der Masseänderung nach Bindung des Aptamers an das Target mit einer Mikrowaage, oder die Messung einer In the case of label-free detection, the aptamer is fixed on a surface, for example, and the change in layer thickness after addition of the target is determined by one of the methods mentioned, such as, for example, about a change in the optical properties of the sensor layer (e.g., refractive index). Another method of label-free detection is the measurement of the mass change after binding of the aptamer to the target with a microbalance, or the measurement of a
Frequenzänderung eines Schwingquarzes nach Bindung des Aptamers an das Target, welches auf der Oberfläche des Schwingquarzes bereitgestellt wird. Frequency change of a quartz crystal after binding of the aptamer to the target, which is provided on the surface of the quartz crystal.
In Fällen, in denen die Komplexierung nicht direkt detektierbar ist, kann der Komplex durch eine Markierung sichtbar gemacht werden, beispielsweise in einer Indikatorreaktion nach einer direkten oder indirekten Kopplung eines Komplexpartners mit einer In cases where the complexation is not directly detectable, the complex may be visualized by labeling, for example, in an indicator reaction following direct or indirect coupling of a complex partner with a complex
Markierungssubstanz. Entweder kann das verwendete Aptamer oder das Target mit einer Markierung (Label) versehen sein. Bevorzugt ist das Aptamer markiert. Labeling substance. Either the used aptamer or the target can be provided with a label. Preferably, the aptamer is labeled.
Bevorzugte Markierungen (Label) sind visuell, optisch, photonisch, elektronisch, akustisch, opto-akustisch, nach Masse, elektrochemisch, elektrooptisch, spektrometrisch, enzymatisch, oder anderweitig physikalisch, chemisch oder biochemisch detektierbar. In einer Ausführungsform des Verfahrens wird die Markierung durch Lumineszenz, UV/VIS- Spektroskopie, enzymatisch, elektrochemisch oder radioaktiv nachgewiesen. Preferred labels are visual, optical, photonic, electronic, acoustic, opto-acoustic, mass, electrochemical, electro-optical, spectrometric, enzymatic, or otherwise physically, chemically, or biochemically detectable. In one embodiment of the method, the label is detected by luminescence, UV / VIS spectroscopy, enzymatically, electrochemically or radioactively.
Lumineszenz betrifft die Emission von Licht. Im erfindungsgemäßen Verfahren finden beispielsweise die Photolumineszenz, die Chemilumineszenz und die Biolumineszenz zum Nachweis der Markierung Anwendung. Bei der Photolumineszenz oder Fluoreszenz
erfolgt die Anregung durch Absorption von Photonen. Beispielhafte Fluorophore sind, ohne Beschränkung, Bisbenzimidazol, Fluoreszein, Acridinorange, Cy5, Cy3 oder Propidiumiodid, die kovalent an Aptamere gekoppelt werden können, Tetramethyl-6- Carboxyrhodamin (TAMRA), Texas Red TR, Rhodamin, Alexa Fluor Farbstoffe (u.a. Fluoreszenzfarbstoffe verschiedener Wellenlängen von verschiedenen Firmen). Die Auswertung geschieht visuell oder mit entsprechenden Messgeräten, z.B. im Multilabel Counter, im Fluoreszenzmikroskop, oder durch Durchflusszytometrie, z.B. im Luminescence refers to the emission of light. In the method according to the invention, for example, photoluminescence, chemiluminescence and bioluminescence are used for detection of the label. In photoluminescence or fluorescence the excitation takes place by absorption of photons. Exemplary fluorophores include, without limitation, bisbenzimidazole, fluorescein, acridine orange, Cy5, Cy3 or propidium iodide, which can be covalently coupled to aptamers, tetramethyl-6-carboxyhodamine (TAMRA), Texas Red TR, rhodamine, Alexa fluorine dyes (inter alia, fluorescent dyes of various wavelengths from different companies). The evaluation is done visually or with appropriate measuring instruments, eg in the Multilabel Counter, in the fluorescence microscope, or by flow cytometry, eg in the
Cytofluorimeter. Chemilumineszenz beschreibt die Emission sichtbaren Lichts als Folge einer chemischen Reaktion. Biolumineszenz bezeichnet die Emission sichtbaren Lichts als Folge einer Enzymreaktion, beispielsweise einer durch das Enzym Luciferase katalysierten Redoxreaktion. Cytofluorimeter. Chemiluminescence describes the emission of visible light as a result of a chemical reaction. Bioluminescence refers to the emission of visible light as a result of an enzyme reaction, such as a redox reaction catalyzed by the enzyme luciferase.
Andere Markierungsstoffe sind Katalysatoren, kolloidale metallische Teilchen, z.B. Gold- Nanopartikel, kolloidale nicht metallische Teilchen, Quantum Dots, organische Polymere, Latexteilchen, oder Liposome mit signalerzeugenden Stoffen. Kolloidale Teilchen können kolorimetrisch nachgewiesen werden. Other labels are catalysts, colloidal metallic particles, e.g. Gold nanoparticles, colloidal non-metallic particles, quantum dots, organic polymers, latex particles, or liposomes with signal-producing substances. Colloidal particles can be detected colorimetrically.
Auch einsetzbar sind visuell detektierbare Farbstoffe, wie beispielsweise interkalierende Farbstoffe. Also usable are visually detectable dyes, such as intercalating dyes.
Einsetzbar als Marker sind auch Enzyme, deren enzymatische Reaktion durch den Verbrauch oder die Entstehung detektierbarer Substrate oder Produkte gekennzeichnet ist, wobei ohne Beschränkung eine optische oder elektrochemische Detektion angewandt werden kann. Ein Nachweis kann z.B. mit Enzymen als Markierungssubstanzen geführt werden, die Substrate zu farbigen Produkten umsetzen, vorzugsweise Peroxidase, Green Fluorescent Protein (GFP), Luciferase, [beta]-Galactosidase oder Alkalische Also useful as markers are enzymes whose enzymatic reaction is characterized by the consumption or formation of detectable substrates or products, without limitation, optical or electrochemical detection. Evidence may e.g. with enzymes as labeling substances that convert substrates into colored products, preferably peroxidase, green fluorescent protein (GFP), luciferase, [beta] -galactosidase or alkaline
Phosphatase. Beispielsweise wird das farblose Substrat X-Gal durch die Aktivität der [beta]-Galactosidase zu einem blauen Produkt umgesetzt, dessen Farbgebung visuell erfasst wird. Phosphatase. For example, the colorless substrate X-Gal is converted by the activity of [beta] -galactosidase to a blue product whose color is visually detected.
Ein oben genanntes enzymatisches Marker- und Nachweissystem verwendet Alkalische Phosphatase. Mit Alkalischer Phosphatase (AP) sind verschiedene Nachweise möglich, wie nachfolgend beispielhaft dargestellt:
elektrochemischer Nachweis: Substrat Phenylphosphat, enzymatische Reaktion von APP bildet Phenol, wird an Phenolsensor (z.B. mit immobilisierter Tyrosinase) elektrochemisch detektiert An above-mentioned enzymatic marker and detection system uses alkaline phosphatase. Various proofs are possible with alkaline phosphatase (AP), as exemplified below: electrochemical detection: substrate phenylphosphate, enzymatic reaction of APP forms phenol, is electrochemically detected on phenol sensor (eg with immobilized tyrosinase)
- Messung der Farbreaktion: Substrat p-Nitrophenylphosphat, enzymatische - Measurement of color reaction: substrate p-nitrophenyl phosphate, enzymatic
Reaktion von APP bildet p-Nitrophenol, ist gelb gefärbt Reaction of APP forms p-nitrophenol, is colored yellow
Fluoreszenz-Nachweis: Substrat 4-Methylumbelliferonylphosphat: enzymatische Reaktion von APP bildet Methylumbelliferonyl-Rest, der nach Anregung Fluorescence detection: Substrate 4-methylumbelliferonyl phosphate: enzymatic reaction of APP forms methylumbelliferonyl residue after stimulation
Fluoreszenz freisetzt Fluorescence releases
- für Chemilumineszenz-Nachweis: Substrat AMPPD (3-(2'-Spiroadamantan)-4- Methoxy-4-(3"-Phosphoryloxy)phenyl-1 ,2-Dioxetan): enzymatische Reaktion von- for chemiluminescence detection: substrate AMPPD (3- (2 '-Spiroadamantan) -4- methoxy-4- (3 "-phosphoryloxy) phenyl-1, 2-dioxetane): enzymatic reaction of
APP bildet ΑΜΡΌ und setzt hv (Chemilumineszenz) frei APP forms ΑΜΡΌ and releases hv (chemiluminescence)
Ferner setzt APP 5-Brom-4-Chlor-3-lndolylphosphat (BCIP oder X-Phosphat) und Nitroblau-Tetrazoliumsalz (NBT) farbig um. Die Farbstoffe fallen dabei in unmittelbarer Nähe der AP-Moleküle aus und färben die Umgebung der gebundenen Verbindungen dunkelviolett an. Furthermore, APP converts 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP or X-phosphate) and nitroblue tetrazolium salt (NBT) in color. The dyes precipitate in the immediate vicinity of the AP molecules and color the environment of the bound compounds dark purple.
Die Peroxidase katalysiert z.B. die Oxidation von ABTS (2,2'-Azino-bis-[3- ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure]) in Gegenwart von H202. Aufgrund der Enzymstabilität und einer Vielzahl an möglichen Substraten ist die Meerrettich-Peroxidase bevorzugt. Weitere Enzymmarker, die die Erzeugung detektierbarer Produkte katalysieren sind Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) und Glutathion-S-Transferase (GST). The peroxidase catalyzes, for example, the oxidation of ABTS (2,2'-azino-bis- [3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid]) in the presence of H 2 0 2 . Horseradish peroxidase is preferred because of its enzyme stability and a variety of possible substrates. Other enzyme markers that catalyze the generation of detectable products are chloramphenicol acetyltransferase (CAT) and glutathione S-transferase (GST).
Der Nachweis kann auch mittels radioaktiver Isotope erfolgen, mit denen das Aptamer markiert ist, vorzugsweise 3H, 14C, 32P, 33P, 35S oder 125 I, besonders bevorzugt 32P, 33P oder 1251. Bei der Szintillationszählung wird die vom radioaktiv-markierten Aptamer- Target-Komplex abgegebene radioaktive Strahlung indirekt gemessen. Eine The detection can also be carried out by means of radioactive isotopes with which the aptamer is labeled, preferably 3H, 14C, 32P, 33P, 35S or 125 I, particularly preferably 32P, 33P or 1251. In scintillation counting, the radiolabelled aptamer target Complex emitted radioactive radiation indirectly measured. A
Szintillatorsubstanz wird durch die radioaktive Strahlung angeregt. Beim Übergang in den Grundzustand wird die Anregungsenergie wieder als Lichtblitze freigesetzt, welche durch einen Photoelektronenvervielfacher (Photomultiplier) verstärkt und gezählt werden. Scintillator substance is excited by the radioactive radiation. During the transition to the ground state, the excitation energy is released again as flashes of light, which are amplified and counted by a photomultiplier.
Die Aptamere können auch mit Digoxigenin oder Biotin markiert sein, die beispielsweise durch Antikörper oder Streptavidin gebunden werden, die wiederum eine Markierung tragen können, wie z.B. ein Enzymkonjugat. Ist der Antikörper an ein Enzym gekoppelt, kann ein ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) zum Nachweis erfolgen, was
nachfolgend noch erläutert ist. Die vorherige kovalente Verknüpfung (Konjugation) eines Antikörpers mit einem Enzym kann auf verschiedene bekannte Arten erfolgen. Der Nachweis der Antikörper-Bindung kann auch radioaktiv in einem RIA (radioactive immunoassay) mit radioaktiven Isotopen, vorzugsweise mit 125 I, oder durch Fluoreszenz in einem FIA (Fluoroimmunoassay) mit Fluorophoren, vorzugsweise mit Fluorescein oder FITC, erfolgen. The aptamers can also be labeled with digoxigenin or biotin, which are bound, for example, by antibodies or streptavidin, which in turn can carry a label, such as an enzyme conjugate. If the antibody is coupled to an enzyme, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) can be used to demonstrate what will be explained below. The prior covalent attachment (conjugation) of an antibody to an enzyme can be accomplished in several known ways. Detection of antibody binding may also be radioactive in an RIA (radioactive immunoassay) with radioactive isotopes, preferably 125 I, or by fluorescence in a FIA (fluoroimmunoassay) with fluorophores, preferably with fluorescein or FITC.
Die genannten Methoden schließen vorzugsweise Waschschritte ein, um ungebundene und/oder unspezifisch gebundene Aptamere und/oder Nachweisreagenzien abzutrennen. Die Durchführung sämtlicher Nachweisverfahren ist dem Fachmann bekannt. Der direkte Nachweis der Markierung ist im vorliegenden Verfahren der Erfindung bevorzugt, insbesondere der direkte Nachweis durch Fluoreszenz. The said methods preferably include washing steps to separate unbound and / or unspecifically bound aptamers and / or detection reagents. The implementation of all detection methods is known to the person skilled in the art. Direct detection of the label is preferred in the present method of the invention, especially direct detection by fluorescence.
In einer weiteren Ausgestaltung des Verfahrens wird der Nachweis in-situ durchgeführt. Diese Umsetzung erfordert einen geeigneten Inkubationsraum, auf dem der Nachweis einfach durchgeführt und sichtbar gemacht werden kann. Hierzu wird vorteilhaft ein fester Träger verwendet, der es ermöglicht, Probe, Aptamere und ggf. Nachweisreagenzien der Komplexe zu fixieren. Die Aptamere können sowohl vor oder nach der Probe auf den festen Träger aufgebracht werden. Methoden der Immobilisierung vorgenannter Aptamere sind dem Fachmann bekannt. Beispiele sind weiter unten angegeben. Für den Nachweis kommen alle Nachweise in Betracht, die zuvor bereits genannt sind, wie markierungsfreie Nachweise und Nachweise mit Verwendung einer Markierung. Bei einem Farbnachweis können die Aptamere so markiert sein, so dass direkt im Anschluss an die Inkubation ein Ablesen und Auswerten realisiert werden kann. In a further embodiment of the method, the detection is carried out in situ. This reaction requires a suitable incubation space on which the detection can be easily performed and visualized. For this purpose, a solid support is advantageously used, which makes it possible to fix sample, aptamers and, if necessary, detection reagents of the complexes. The aptamers can be applied to the solid support either before or after the sample. Methods of immobilization of the aforementioned aptamers are known to the person skilled in the art. Examples are given below. All proofs that have already been mentioned above, such as mark-free proof and evidence with the use of a marking, can be considered for the proof. In the case of a color detection, the aptamers can be marked so that a reading and evaluation can be realized directly after the incubation.
In den zuvor erläuterten Verfahren und allen anderen von dieser Erfindung offenbarten Verfahren kann das erfindungsgemäße Aptamer allein, oder eine Mischung verschiedener erfindungsgemäßer Aptamere eingesetzt werden. Erfindungsgemäße Aptamere können auch in Kombination mit anderen Aptameren angewendet werden. Eine Kombination mit anderen Aptameren für andere Targets (d.h. andere Targets als Protein A, G oder L, Protein A, G oder L enthaltende Substanzen, und Protein A, G oder L enthaltende Mikroorganismen) bietet den Vorteil, dass ein entsprechendes Verfahren gleichzeitig auch zum Nachweis, Anreicherung, Abtrennung und/oder Isolierung anderer Targets anwendbar ist.
Wie bereits erwähnt, können die Probe oder das Aptamer je nach Verfahrensgestaltung an eine feste Phase immobilisiert sein. In dem Verfahren können beispielsweise (Micro)- Arrays des erfindungsgemäßen Aptamers, oder Mikrotiterplatten-Testsysteme eingesetzt werden. The aptamer according to the invention alone or a mixture of different aptamers according to the invention can be used in the methods explained above and in all other methods disclosed by this invention. Aptamers according to the invention can also be used in combination with other aptamers. A combination with other aptamers for other targets (ie other targets than protein A, G or L, protein A, G or L-containing substances, and protein A, G or L-containing microorganisms) offers the advantage that a corresponding method at the same time for Detection, enrichment, separation and / or isolation of other targets is applicable. As already mentioned, the sample or the aptamer can be immobilized on a solid phase, depending on the process design. For example, (micro) arrays of the aptamer according to the invention, or microtiter plate test systems can be used in the process.
Aptamere binden an das Target ähnlich stark wie Antikörper an ihr Target (Antigen). Daher ist das oben beschriebene Nachweisverfahren analog durchführbar wie bekannte Immunoassays, wobei im Vergleich zu einem bekannten Immunoassay einer oder mehrere Antikörper durch ein erfindungsgemäßes Aptamer ersetzt sind. Aptamers bind to the target as strongly as antibodies to their target (antigen). Therefore, the detection method described above can be carried out analogously to known immunoassays, wherein, in comparison to a known immunoassay, one or more antibodies are replaced by an aptamer according to the invention.
Beispielsweise ist es möglich, das Nachweisverfahrens in Form eines kompetitiven Assays oder eines Sandwich-Assays durchzuführen. For example, it is possible to carry out the detection method in the form of a competitive assay or a sandwich assay.
Bei einer Ausführungsform eines kompetitiven Assays wird ein für das Target spezifisches erfindungsgemäßes Aptamer an eine feste Phase gebunden. Anschließend erfolgt die Zugabe der Probenlösung, die das zu messende Target enthält und gleichzeitig mit einer bekannten Konzentration an markiertem Target versetzt ist. Sowohl das in der In one embodiment of a competitive assay, an aptamer of the invention specific for the target is bound to a solid phase. This is followed by the addition of the sample solution which contains the target to be measured and is simultaneously mixed with a known concentration of labeled target. Both in the
Probenlösung in unbekannter Konzentration vorliegende unmarkierte Target als auch das markierte Target konkurrieren um die Bindung an das gebundene Aptamer. Je höher die Konzentration des Targets in der Probe ist, desto weniger markiertes Target wird demzufolge an das Aptamer gebunden. Über die Erkennung und gegebenenfalls eine quantitative Bestimmung der Markierung sind der Nachweis des Targets in der Probe und die Messung seiner Konzentration möglich. In einer anderen Ausführungsform eines kompetetiven Assays wird ebenfalls zunächst ein für das Target spezifisches erfindungsgemäßes Aptamer an eine feste Phase gebunden. Daran wird markiertes Target gebunden. Die Messung der Markierung ergibt das Sample solution in unknown concentration present unlabelled target as well as the labeled target compete for binding to the bound aptamer. The higher the concentration of the target in the sample, the less tagged target will be bound to the aptamer. By detecting and optionally quantitating the label, it is possible to detect the target in the sample and to measure its concentration. In another embodiment of a competitive assay, an aptamer according to the invention which is specific for the target is also first bound to a solid phase. It is bound to labeled target. The measurement of the mark gives the
Ausgangssignal. Die Zugabe von Probe mit unmarkiertem Target verdrängt gebundenes markiertes Target, und das abnehmende Messsignal ist der Probenkonzentration proportional. Output. The addition of sample with unlabelled target displaces bound labeled target, and the decreasing measurement signal is proportional to the sample concentration.
Bei einem klassischen immunologischen Sandwich-Assay werden mindestens zwei Antikörper eingesetzt. Zunächst wird einer der beiden Antikörper an eine feste Phase immobilisiert. Dieser wird als Primärantikörper oder auch als Fänger bezeichnet. Nach der Zugabe der Probe bindet das darin enthaltene Antigen an den Primärantikörper.
Anschließend wird die Probenlösung entfernt und der als Sekundärantikörper oder Detektor bezeichnete zweite Antikörper in gelöster Form auf die feste Phase gegeben. Der Detektor bindet nun ebenfalls an das durch den Primärantikörper gebundene Antigen. Für den Nachweis und die Quantifizierung ist der Sekundärantikörper entweder selbst markiert, oder er wird über ein markiertes Reagens nachgewiesen. In der vorliegenden Erfindung wird dieses Verfahren dahin gehend abgewandelt, dass entweder der In a classical immunological sandwich assay, at least two antibodies are used. First, one of the two antibodies is immobilized on a solid phase. This is called the primary antibody or as a catcher. After addition of the sample, the antigen contained therein binds to the primary antibody. Subsequently, the sample solution is removed and the second antibody called secondary antibody or detector is added in dissolved form to the solid phase. The detector now also binds to the antigen bound by the primary antibody. For detection and quantification, the secondary antibody is either self-labeled or detected via a labeled reagent. In the present invention, this process is modified so that either the
Primärantikörper oder der Sekundärantikörper, oder beide, durch ein erfindungsgemäßes Aptamer ersetzt werden und dass das Antigen ein Target für das Aptamer, also Protein A, G oder L, eine Protein A, G oder L enthaltende Substanz oder ein Protein A, G oder L enthaltender Mikroorganismus, ist. Der Assay kann mit allen bekannten festen Phasen durchgeführt werden, beispielsweise Mikrotiterplatten, Streifen, Membranen, Küvetten etc. Primary antibody or the secondary antibody, or both, are replaced by an inventive aptamer and that the antigen containing a target for the aptamer, so protein A, G or L, a protein A, G or L-containing substance or protein A, G or L. Microorganism, is. The assay can be carried out with all known solid phases, for example microtiter plates, strips, membranes, cuvettes etc.
Die Erfindung stellt somit in einer speziellen Ausführungsform ein Verfahren zum The invention thus provides in a specific embodiment a method for
Nachweis von Protein A, G oder L, Protein A, G oder L enthaltenden Substanzen oder Protein A, G oder L enthaltenden Mikroorganismen, insbesondere Staphylococcus aureus, Streptococcus oder Peptostreptococcus, zur Verfügung, bei dem Detection of protein A, G or L, protein A, G or L containing substances or microorganisms containing protein A, G or L, in particular Staphylococcus aureus, Streptococcus or Peptostreptococcus, in which
a) ein erster Antikörper oder ein erfindungsgemäßes Aptamer, der/das für Protein A, G oder L spezifisch ist, an eine feste Phase immobilisiert wird, a) a first antibody or an aptamer according to the invention which is specific for protein A, G or L is immobilized on a solid phase,
b) die feste Phase mit daran immobilisiertem Antikörper oder Aptamer mit einer b) the solid phase with immobilized antibody or aptamer with a
Probe, die Protein A, G oder L, die Protein A, G oder L enthaltende Substanz oder den Protein A, G oder L enthaltenden Mikroorganismus enthält, inkubiert wird, und c) die feste Phase mit einem zweiten Antikörper oder einem erfindungsgemäßen Aptamer, der/das für Protein A, G oder L spezifisch ist, inkubiert wird und d) eine Bindung zwischen dem zweiten Antikörper oder dem Aptamer und Protein A, G oder L, Protein A, G oder L enthaltender Substanzen oder Protein A, G oder L enthaltendem Mikroorganismus nachgewiesen wird, Sample containing protein A, G or L, the substance containing protein A, G or L or the microorganism containing the protein A, G or L, and c) the solid phase with a second antibody or an aptamer according to the invention / which is specific for protein A, G or L, and d) contains a bond between the second antibody or the aptamer and protein A, G or L, substances containing protein A, G or L or protein A, G or L. Microorganism is detected,
unter der Bedingung, dass mindestens in einem der Schritte a) oder c) ein erfindungsgemäßes Aptamer statt eines Antikörpers eingesetzt wird. Die Immobilisierung in Schritt a) kann mit allen üblichen Techniken erfolgen, die auch aus immunologischen Assays bekannt sind. Der Nachweis in Schritt d) kann im Falle eines Antikörpers durch die bekannten Methoden erfolgen, die aus immunologischen direkten und indirekten Sandwich-Assays bekannt sind. Entweder kann der Antikörper selbst markiert sein, beispielsweise durch Anbindung eines Enzyms, das eine Farbreaktion zum Nachweis katalysieren kann, oder es kann ein dritter Antikörper zugegeben werden, der
seinerseits an den zweiten Antikörper bindet und eine Markierung aufweist. Sofern in Schritt c) ein Aptamer eingesetzt wird, ist dieses vorzugsweise ein markiertes Aptamer, das mit geeigneten Nachweisreaktionen detektiert werden kann, wie zuvor bereits beschrieben. Zwischen den genannten Schritten a) -d) werden vorzugsweise with the proviso that at least in one of the steps a) or c) an inventive aptamer is used instead of an antibody. The immobilization in step a) can be carried out using all conventional techniques, which are also known from immunological assays. The detection in step d) can be carried out in the case of an antibody by the known methods known from immunological direct and indirect sandwich assays. Either the antibody itself may be labeled, for example by attachment of an enzyme capable of catalyzing a color reaction for detection, or a third antibody may be added which in turn binds to the second antibody and has a label. If an aptamer is used in step c), this is preferably a labeled aptamer, which can be detected with suitable detection reactions, as previously described. Between said steps a) -d) are preferably
Waschschritte durchgeführt, z.B. mit üblichen und bekannten Waschpuffern. Der Begriff Immobilierung bedeutet bei diesem Verfahren, dass der in Schritt a) immobilisierte Antikörper oder das Aptamer nicht durch einen Waschschritt von der festen Phase entfernt wird. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Anreicherung, Washes, e.g. with conventional and known washing buffers. The term immobilization in this process means that the antibody immobilized in step a) or the aptamer is not removed from the solid phase by a washing step. In a further aspect, the invention relates to a method for enrichment,
Abtrennung und/oder Isolierung von Protein A, G oder L, Protein A, G oder L enthaltenden Substanzen oder Protein A, G oder L enthaltenden Mikroorganismen, insbesondere Staphylococcus aureus, Streptococcus oder Peptostreptococcus, bei dem Separation and / or isolation of protein A, G or L, protein A, G or L containing substances or microorganisms containing protein A, G or L, in particular Staphylococcus aureus, Streptococcus or Peptostreptococcus, in which
a) ein oder mehrere verschiedene Aptamere wie zuvor beschrieben mit einer Probe, die Protein A, G oder L, eine Protein A, G oder L enthaltende Substanz oder einen a) one or more different aptamers as described above with a sample containing protein A, G or L, a protein A, G or L-containing substance or a
Protein A, G oder L enthaltenden Mikroorganismus enthält, in Kontakt gebracht wird/werden, wobei ein Komplex oder Komplexe aus dem/den Aptamer(en) und Protein A, G oder L, aus dem/den Aptamer(en) und der Protein A, G oder L enthaltenden Substanz oder aus dem/den Aptamer(en) und dem Protein A, G oder L enthaltenden Mikroorganismus gebildet wird, Containing a complex or complexes of the aptamer (s) and protein A, G or L, from the aptamer (s) and the protein A , G or L-containing substance or from the Aptamer (s) and the protein A, G or L-containing microorganism is formed,
b) der/die Komplex(e) und die übrige Probe voneinander getrennt werden, und c) optional Protein A, G oder L, die Protein A, G oder L enthaltende Substanz oder der Protein A, G oder L enthaltende Mikroorganismus aus dem Komplex isoliert wird. b) the complex (s) and the remaining sample are separated from each other, and c) optionally protein A, G or L, the protein A, G or L-containing substance or the microorganism containing the protein A, G or L from the complex is isolated.
Eine„Probe" im Sinne dieses Verfahrens ist ebenso definiert wie eine Probe im Sinne des zuvor beschriebenen Nachweisverfahrens. Eine Probe ist insbesondere eine A "sample" in the sense of this method is defined as well as a sample in the sense of the previously described detection method
Wasserprobe, wie zum Beispiel eine Trinkwasser-, Grundwasser-, Oberflächenwasser- oder Abwasserprobe, eine Probe von anderweitigem aus der Umwelt entnommenem Material, oder eine Lebensmittelprobe. Water sample, such as a sample of drinking water, groundwater, surface water, or sewage, a sample of other environmentally extracted material, or a food sample.
Auch dieses Verfahren kommt insbesondere zum Einsatz in der Lebensmittel-, Wasser- und Umweltanalytik, der Wasserbehandlung und der Wasseraufbereitung, insbesondere von Trinkwasser und Abwasser, der Diagnostik sowie in Krankenhäusern und This method is also used in particular in food, water and environmental analysis, water treatment and water treatment, especially of drinking water and wastewater, diagnostics and in hospitals and
Pflegeeinrichtungen.
Eine„Abtrennung" von Protein A, G oder L, Protein A, G oder L enthaltender Substanz oder eines Protein A, G oder L enthaltenden Mikroorganismus (zusammengefasst bezeichnet als„Target") aus einer Probe kann, im Rahmen der analytischen Care facilities. A "separation" of protein A, G or L, protein A, G or L-containing substance or a protein A, G or L-containing microorganism (collectively referred to as "target") from a sample may, in the context of the analytical
Nachweisgrenze, vollständig sein oder nicht vollständig sein. Eine vollständige Detection limit, be complete or incomplete. A complete
Abtrennung wird hierin auch als„Entfernung" bezeichnet. Mit diesem Verfahren kann insbesondere Staphylococcus aureus, Streptococcus oder Peptostreptococcus aus Umgebungen, in denen es unerwünscht ist, abgetrennt werden, beispielsweise aus wässrigen oder anderen flüssigen Proben. Separation is also referred to herein as "removal." In particular, Staphylococcus aureus, Streptococcus, or Peptostreptococcus can be separated from environments in which it is undesirable, for example, from aqueous or other liquid samples.
Eine„Anreicherung" wird in Schritt b) erzielt, wenn der gebildete Aptamer-Target-Komplex und die übrige Probe voneinander getrennt werden. Es werden zwei Fraktionen erhalten, wobei in der Fraktion, die den Komplex enthält, der Komplex angereichert ist. Der Begriff „Anreicherung" kann sich auf den Komplex beziehen, der aus Aptamer und Protein A, G oder L, aus Aptamer und der Protein A, G oder L enthaltenden Substanz oder aus"Enrichment" is achieved in step b) when the formed aptamer-target complex and the remaining sample are separated from each other Two fractions are obtained, wherein in the fraction containing the complex, the complex is enriched "Enrichment" may refer to the complex comprising aptamer and protein A, G or L, from aptamer and protein A, G or L-containing substance or from
Aptamer und dem Protein A, G oder L enthaltenden Mikroorganismus gebildet ist, oder auf das Protein A, G oder L, die Protein A, G oder L enthaltende Substanz oder den Protein A, G oder L enthaltenden Mikroorganismus (zusammengefasst bezeichnet als „Target") selbst, d.h. das Target ohne Aptamer. Zur Anreicherung des Targets kann der Verfahrensschritt c) durchgeführt werden. Eine Anreicherung bedeutet mit anderen Worten eine Erhöhung der Konzentration des Aptamer-Target-Komplexes oder des Targets selbst. Aptamer and the protein A, G or L-containing microorganism is formed, or on the protein A, G or L, the protein A, G or L-containing substance or the protein A, G or L-containing microorganism (collectively referred to as "target" In order to concentrate the target, process step c) can be carried out, in other words an enrichment means an increase in the concentration of the aptamer-target complex or of the target itself.
Der Begriff„Isolierung" kann sich auf den Komplex beziehen, der aus Aptamer und Protein A, G oder L, aus Aptamer und der Protein A, G oder L enthaltenden Substanz oder aus Aptamer und dem Protein A, G oder L enthaltenden Mikroorganismus gebildet ist, oder auf das Protein A, G oder L, die Protein A, G oder L enthaltende Substanz oder den Protein A, G oder L enthaltenden Mikroorganismus selbst. Daher ist der letzte Verfahrensschritt optional. The term "isolation" may refer to the complex formed from aptamer and protein A, G or L, from aptamer and protein A, G or L containing substance or from aptamer and protein A, G or L containing microorganism , or on the protein A, G or L, the protein A, G or L-containing substance or the microorganism itself containing the protein A, G or L itself. Therefore, the last process step is optional.
Die oben beschriebene Abtrennung, Anreicherung, und Isolierung können mit dem Verfahren gleichzeitig verwirklicht werden. Vorzugsweise wird das Verfahren aber zu einem dieser Zwecke durchgeführt.
Der Begriff„Komplex" bezeichnet die Struktur, die bei der Bindung des Aptamers an sein Target gebildet wird. Somit bezeichnet der Begriff „Komplex" eine Aptamer-Target- Struktur, bei der das Aptamer an das Target gebunden ist. Wie einleitend erläutert, erfolgt die Aptamer-Target-Bindung vorwiegend, aber nicht unbedingt ausschließlich, über die Strukturkompatibilität, so genannte„Stacking interactions" bei aromatischen The separation, enrichment, and isolation described above can be accomplished simultaneously with the process. Preferably, however, the method is performed for one of these purposes. The term "complex" refers to the structure formed upon binding of the aptamer to its target Thus, the term "complex" refers to an aptamer-target structure in which the aptamer is attached to the target. As explained in the introduction, aptamer-target binding occurs predominantly, but not necessarily exclusively, via the structural compatibility, so-called "stacking interactions" in aromatic compounds
Ringstrukturen (Stapelkräfte durch Elektronenwechselwirkung mit Nachbarbasen), elektrostatische Wechselwirkungen (z.B. Van der Waals-, Ionen-, Dipolkräfte) und Ring structures (stacking forces through electron interaction with neighboring bases), electrostatic interactions (e.g., van der Waals, ionic, dipole forces) and
Wasserstoffbrückenbindungen. Die genannten Verfahrensschritte a), b) und c) können je nach Verfahrensgestaltung gleichzeitig erfolgen, und insbesondere können die Verfahrensschritte a) und b) gleichzeitig erfolgen. Hydrogen bonds. The said process steps a), b) and c) can take place simultaneously, depending on the process design, and in particular the process steps a) and b) can take place simultaneously.
Bei der Kontaktierung von Target und Aptamer kann die Bildung des Aptamer-Target- Komplexes durch Temperierung auf die optimale Aptamer-Target-Bindungstemperatur, bevorzugt 20 - 25qC, und/oder Rühren der Probe befördert werden. Nach einer When contacting the target and aptamer, the formation of the aptamer-target complex can be promoted by tempering to the optimum aptamer-target binding temperature, preferably 20-25 q C, and / or stirring the sample. After a
Inkubationszeit werden die Aptamer-Target-Komplexe, von der restlichen Probenlösung abgetrennt. Geeignete Methoden sind dem Fachmann bekannt, wie z.B. Dialyse, Incubation period, the aptamer-target complexes are separated from the remaining sample solution. Suitable methods are known to those skilled in the art, e.g. Dialysis,
Ultrafiltration, Gelfiltration, Chromatographie, magnetische Trennung oder Waschschritte, sofern der Komplex immobilisiert vorliegt. Ultrafiltration, gel filtration, chromatography, magnetic separation or washing steps, provided that the complex is immobilized.
Durch Veränderungen der für die Aptamerbindung erforderlichen definierten Bedingungen wird im optionalen Schritt c) der Aptamer-Target-Komplex getrennt. Hierzu sind physikochemische Einwirkungen, wie z.B. eine Variation von Salzkonzentration oder pH oder eine hitzebedingte Denaturierung, denkbar. Abschließend ist eine weitere Reinigung des Targets möglich, wobei das Aptamer zuvor abgebaut werden kann, z.B. durch saure (thermische) Hydrolyse oder DNasen. Sofern das Aptamer immobilisiert ist, kann das Target eluiert werden, wie z.B. von einer Säule, die anschließend regeneriert und wiederverwendet wird. By altering the defined conditions required for the aptamer bond, the aptamer-target complex is separated in optional step c). For this purpose, physicochemical effects, such as a variation of salt concentration or pH or heat denaturation conceivable. Finally, further purification of the target is possible, whereby the aptamer can be degraded beforehand, e.g. by acid (thermal) hydrolysis or DNases. If the aptamer is immobilized, the target can be eluted, e.g. from a column, which is then regenerated and reused.
Erfindungsgemäß können die Aptamere auch an einer festen Phase, genauer gesagt an der Oberfläche einer festen Phase, immobilisiert sein, vorzugsweise über ein Spacer- Molekül, das beispielsweise eine Linker-Nukleinsäure sein kann. Geeignete Methoden der Immobilisierung sind dem Fachmann bekannt, die sowohl mit einer kovalenten Kopplung als auch einer nicht-kovalenten Kopplung mittels geeigneter Affinitätspaare, wie z.B.
Biotin/Streptavidin, einhergehen können. Die feste Phase können beispielsweise Platten, Streifen, Membranen, Filme, Gele, Perlen, Mikro- und Nanopartikel sein. Beispielhafte Trägermaterialien sind anorganische und organische Polymere, Keramiken, Gläser, Metalle, insbesondere Edelmetalle. Hierzu zählen Kunststoffe, beispielsweise auf Basis von Polystyrol. Des Weiteren sind Biopolymere, vorzugsweise Cellulose, Dextran, Agar, Agarose und Sephadex, die funktionalisiert sein können, insbesondere als Nitrocellulose oder Cyanbromid-Sephadex, als Polymere im erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbar. Aptamere können an Magnetic Beads gebunden werden, deren Oberfläche z.B. mit Tosyl- oder Epoxy-Gruppen, mit Amino- oder Carboxyl-Gruppen oder mit Streptavidin According to the invention, the aptamers can also be immobilized on a solid phase, more specifically on the surface of a solid phase, preferably via a spacer molecule, which can be, for example, a linker nucleic acid. Suitable methods of immobilization are known in the art, both with a covalent coupling and a non-covalent coupling by means of suitable affinity pairs, such as Biotin / streptavidin may be associated. The solid phase may be, for example, plates, strips, membranes, films, gels, beads, micro- and nanoparticles. Exemplary carrier materials are inorganic and organic polymers, ceramics, glasses, metals, in particular noble metals. These include plastics, for example based on polystyrene. Furthermore, biopolymers, preferably cellulose, dextran, agar, agarose and Sephadex, which may be functionalized, in particular as nitrocellulose or cyanogen bromide Sephadex, can be used as polymers in the process according to the invention. Aptamers can be bound to magnetic beads whose surface contains, for example, tosyl or epoxy groups, amino or carboxyl groups or streptavidin
funktionalisiert sind. Weiterhin ist eine Kopplung von Magnetic Beads an die Desoxyribose der Aptamere, wie z.B. über eine Hydrazon-Bindung, möglich. Die Beispiele für Polymere sind nicht limitierend und andere sind denkbar. Bevorzugte Kombinationen von functionalized. Furthermore, coupling of magnetic beads to the deoxyribose of the aptamers, e.g. via a hydrazone bond, possible. The examples of polymers are not limiting and others are conceivable. Preferred combinations of
geometrischer Form und Material sind Gele aus Biopolymeren, insbesondere Agarose, und Gelmatrices aus Dextran und Sephadex, die - beispielsweise in Säulen verpackt - Hohlräume definierter Porengröße ausbilden. In einer speziellen Ausgestaltung ist das soeben beschriebene Abtrennungs-, Anreicherungs-, und/oder Isolierungsverfahren ein Affinitätschromatographie- Verfahren, bei dem ein erfindungsgemäßes Aptamer an einer festen Phase immobilisiert ist, vorzugsweise an Kügelchen (Beads) oder einem geometric shape and material are gels of biopolymers, especially agarose, and gel matrices of dextran and Sephadex, which form - for example, packed in columns - cavities defined pore size. In a specific embodiment, the separation, enrichment, and / or isolation method just described is an affinity chromatography method in which an aptamer according to the invention is immobilized on a solid phase, preferably on beads or beads
anderweitigen chromatographischen Säulenmaterial, wobei alle geometrische Formen einer festen Phase verwendbar und alle oben genannten Substanzen beispielhaft einsetzbar sind. otherwise chromatographic column material, all geometric shapes of a solid phase usable and all the above substances are exemplified.
Mit Aptamer-modifizierten Oberflächen können die entsprechenden Targets ausgehend von geringen Konzentrationen angereichert werden. With aptamer-modified surfaces, the corresponding targets can be enriched starting from low concentrations.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des zuvor beschriebenen Aptamers zum Nachweis, Anreicherung, Abtrennung und/oder Isolierung von Protein A, G oder L, Protein A, G oder L enthaltenden Substanzen oder Protein A, G oder L enthaltenden The invention also relates to the use of the previously described aptamer for detecting, enriching, separating and / or isolating protein A, G or L, protein A, G or L-containing substances or protein A, G or L-containing
Mikroorganismen, insbesondere Staphylococcus aureus, Streptococcus oder Microorganisms, in particular Staphylococcus aureus, Streptococcus or
Peptostreptococcus. Insbesondere kann das Aptamer in den zuvor erläuterten Verfahren eingesetzt werden. Der Begriff Anreicherung schließt die Aufreinigung des Targets mit ein. Peptostreptococcus. In particular, the aptamer can be used in the previously explained methods. The term enrichment includes the purification of the target.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung auch Verfahren zur Quantifizierung der Bindung eines Immunoglobulins an Protein A, G oder L, wobei bei dem Verfahren
a) Protein A, G oder L oder ein Protein A, G oder L enthaltender Mikroorganismus bereitgestellt wird, In a further aspect, the invention also relates to methods for quantifying the binding of an immunoglobulin to protein A, G or L, which method a) protein A, G or L or a microorganism containing a protein A, G or L is provided,
b) Protein A, G oder L oder der Protein A, G oder L enthaltende Mikroorganismus mit dem Immunoglobulin versetzt wird, b) the microorganism containing protein A, G or L or the protein A, G or L is mixed with the immunoglobulin,
c) das in b) erzeugte Gemisch mit einem erfindungsgemäßen Aptamer in Kontakt gebracht wird, c) the mixture produced in b) is brought into contact with an aptamer according to the invention,
d) die Menge gebundenen Aptamers bestimmt wird und daraus die Menge d) the amount of bound aptamer is determined and from this the amount
gebundenen Immunoglobulins bestimmt wird. Verschiedene Verfahrensvarianten sind denkbar: bound immunoglobulin is determined. Various process variants are conceivable:
In einer Variante bindet das erwähnte Immunoglobulin an das gleiche Epitop des Protein A, G oder L wie das erfindungsgemäße Aptamer. Der Begriff„Epitope" bedeutet dann, dass es sich um gleiche Epitope handelt, die mehrfach vorkommen weil mehrere Protein A, G oder L Moleküle im Verfahren eingesetzt werden und/oder weil Protein A, G oder L mehrere Epitope des gleichen Typs aufweist. In Schritt c) des Verfahrens bindet das Aptamer an Protein A, G oder L Moleküle, an die kein Immunoglobulin gebunden hat. Die Menge gebundenen Proteins A, G oder L wird in Schritt d) bestimmt, beispielsweise über die Intensität eine Fluoreszenzmarkierung. Der Ort der Bindung kann bei einem Array von Protein A, G oder L durch den erkennbaren Ort der Markierung bestimmt werden. In a variant, the mentioned immunoglobulin binds to the same epitope of the protein A, G or L as the aptamer according to the invention. The term "epitopes" then means that they are the same epitopes which occur multiple times because several protein A, G or L molecules are used in the process and / or because protein A, G or L has several epitopes of the same type Step c) of the method binds the aptamer to protein A, G or L molecules to which no immunoglobulin has bound The amount of bound protein A, G or L is determined in step d), for example by fluorescence labeling over the intensity Binding can be determined for an array of protein A, G or L by the recognizable location of the label.
In einer anderen Variante binden das Aptamer und das Immunoglobulin an verschiedene Epitope. Dennoch bindet das Aptamer in Schritt c) aufgrund sterischer Hinderung nicht mehr an Protein A, G oder L Moleküle, an die bereits Immunoglobulin gebunden hat. In Schritt c) des Verfahrens bindet das Aptamer an Protein A, G oder L Moleküle, an die kein Immunoglobulin gebunden hat. In another variant, the aptamer and the immunoglobulin bind to different epitopes. However, due to steric hindrance, the aptamer in step c) no longer binds to protein A, G, or L molecules to which immunoglobulin has already bound. In step c) of the method, the aptamer binds to protein A, G or L molecules to which no immunoglobulin has bound.
Im Zusammenhang mit dem obigen Verfahren betrifft die Erfindung auch die Verwendung des zuvor beschriebenen Aptamers zur Quantifizierung der Bindung von In the context of the above process, the invention also relates to the use of the previously described aptamer for quantifying the binding of
Immunoglobulinen an Protein A, G oder L. Diese Anwendung und das zugehörige Verfahren sind insbesondere als Assay für die medizinische Diagnostik geeignet. Immunoglobulins on protein A, G or L. This application and the associated method are particularly suitable as an assay for medical diagnostics.
Die Bereitstellung von Protein A, G oder L oder des Protein A, G oder L enthaltenden Mikroorganismus kann auf verschiedene Art und Weise erfolgen. Beispielsweise kann Protein A, G oder L oder der Protein A, G oder L enthaltende Mikroorganismus in einer
flüssigen Phase in definierter Menge bereitgestellt werden. Es ist auch möglich, das Aptamer in definierter Menge an einer festen Phase zu immobilisieren oder Protein A, G oder L oder den Mikroorganismus in definierter Menge an einer festen Phase zu immobilisieren. Die feste Phase können beispielsweise Platten, wie beispielsweise Mikrotiterplatten, Streifen, Membranen, Filme, Gele, Perlen, Mikro- und Nanopartikel sein. The provision of protein A, G or L or the microorganism containing the protein A, G or L can take place in various ways. For example, protein A, G or L or the protein A, G or L containing microorganism in a be provided liquid phase in a defined amount. It is also possible to immobilize the aptamer in a defined amount on a solid phase or to immobilize protein A, G or L or the microorganism in a defined amount on a solid phase. The solid phase may be, for example, plates such as microtiter plates, strips, membranes, films, gels, beads, micro- and nanoparticles.
Anschließend wird in Schritt b) ein Immunoglobulin zugegeben, das an Protein A, G oder L oder an in der Zellwand des Mikroorganismus vorhandenes Protein A, G oder L bindet. Der Antikörper ist üblicherweise in einer flüssigen Phase suspendiert. Subsequently, in step b), an immunoglobulin is added which binds to protein A, G or L or to protein A, G or L present in the cell wall of the microorganism. The antibody is usually suspended in a liquid phase.
Sofern Protein A, G oder L oder der Mikroorganismus an einer festen Phase gebunden sind, wird nach dem Schritt b) vorzugsweise ungebundener Antikörper durch Waschen, beispielsweise mit einem geeigneten Waschpuffer, entfernt. Es werden nach dem Schritt b), und gegebenenfalls einem Waschschritt, mit Antikörper belegte Protein A, G oder L Moleküle/Mikroorganismen und nicht mit Antikörper belegte Protein A, G oder L Moleküle/Mikroorganismen erhalten, hier bezeichnet als„Gemisch". Im nächsten Schritt wird das Gemisch mit erfindungsgemäßem Aptamer in Kontakt gebracht, Das Aptamer bindet an nicht mit Antikörper belegte Protein A, G oder L If protein A, G or L or the microorganism are bound to a solid phase, after step b), preferably unbound antibody is removed by washing, for example with a suitable washing buffer. There are after the step b), and optionally a washing step, antibody-coated protein A, G or L molecules / microorganisms and not occupied with antibody protein A, G or L molecules / microorganisms, here referred to as "mixture" Step, the mixture is brought into contact with inventive aptamer, the aptamer binds to unassociated protein A, G or L.
Moleküle/Mikroorganismen. Nach dem Schritt c) wird vorzugsweise nicht gebundenes Aptamer durch Waschen, beispielsweise mit einem geeigneten Waschpuffer, entfernt. Molecules / microorganisms. After step c) preferably unbound aptamer is removed by washing, for example with a suitable washing buffer.
Im letzten Schritt wird ermittelt, wie viel Aptamer an Protein A, G oder L oder den In the final step, it is determined how much aptamer protein A, G or L or the
Mikroorganismus gebunden hat. Eine Bindung zwischen dem Aptamer und Protein A, G oder L oder dem Mikroorganismus kann nachgewiesen werden wie bereits zuvor bei dem erfindungsgemäßen Nachweisverfahren erläutert. Vorzugsweise wird ein markiertes Aptamer eingesetzt. Has bound microorganism. A bond between the aptamer and protein A, G or L or the microorganism can be detected as previously explained in the detection method according to the invention. Preferably, a labeled aptamer is used.
Eine weitere Verwendung des erfindungsgemäßen Aptamers betrifft die Verwendung zur Blockierung oder Quantifizierung freier Bindungsstellen an Protein A, G oder L. Es gibt kommerziell verfügbare Protein A, G oder L modifizierte Oberflächen, wie z.B. Kügelchen (Beads) oder Mikrotiterplatten. Another use of the aptamer according to the invention relates to the use of blocking or quantifying free binding sites on protein A, G or L. There are commercially available protein A, G or L modified surfaces, e.g. Beads or microtiter plates.
Wird die mit Protein A, G oder L modifizierte Oberfläche für die Immobilisierung von Protein A, G oder L bindenden Substanzen verwendet, können die Aptamere zur
Blockierung der nach der Immobilisierung frei gebliebenen Protein A, G oder L - Bindungsstellen benutzt werden. Dies setzt voraus, dass das Aptamer und die andere Protein A, G oder L bindende Substanz die gleiche Bindungsstelle im Protein A, G oder L haben oder sich gegenseitig in ihrer Bindungsfähigkeit beeinflussen. If the surface modified with protein A, G or L is used for the immobilization of protein A, G or L binding substances, the aptamers can be used for Blocking of the immobilized protein A, G or L - binding sites are used. This presupposes that the aptamer and the other protein A, G or L binding substance have the same binding site in the protein A, G or L or influence each other in their binding ability.
In bestimmten Anwendungen kann es auch wünschenswert sein, Protein A, G oder L an der Oberfläche mit Aptamer zu belegen, so dass keine anderen Substanzen, In certain applications, it may also be desirable to surface protein A, G or L with aptamer so that no other substances,
insbesondere Immunoglobuline, daran binden können. Ebenso können die Aptamere zur Quantifizierung der nach der Immobilisierung frei gebliebenen Bindungsstellen, oder anders ausgedrückt, zur Kontrolle der especially immunoglobulins, can bind to it. Similarly, the aptamers may be used to quantify the binding sites left after immobilization, or in other words, to control the
Oberflächenbelegung verwendet werden. Surface assignment can be used.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung auch eine Aptamersonde zur Detektion von Protein A, G oder L, Protein A, G oder L enthalten Substanzen oder Protein A, G oder L enthaltenden Mikroorganismen, insbesondere Staphylococcus aureus, Streptococcus oder Peptostreptococcus, wobei die Sonde ein erfindungsgemäßes Aptamer und ein Markierungsmittel (Label) umfasst. Das Markierungsmittel kann auf verschiedene Art und Weise an das Aptamer gebunden sein, beispielsweise, und nicht beschränkend, durch kovalente Bindung, Komplexierung, DNA/RNA-Hybridisierung. Beispielsweise kann ein Markierungsmittel an ein erfindungsgemäßes Aptamer gebunden werden, wie in In a further aspect, the invention also relates to an aptamer probe for the detection of protein A, G or L, protein A, G or L containing substances or protein A, G or L-containing microorganisms, in particular Staphylococcus aureus, Streptococcus or Peptostreptococcus, wherein the probe Aptamer according to the invention and a labeling agent (label). The label may be attached to the aptamer in a variety of ways, for example, but not limited to, covalent binding, complexation, DNA / RNA hybridization. For example, a labeling agent can be bound to an aptamer of the invention as in
WO20051 13817 beschreiben. WO20051 13817 beschreibt ein Aptamer mit einem angefügten Oligonukleotidschwanz (oligonucleotide tail) und einem Linker-Oligonukleotid, der ein Label trägt, wobei die Sequenz des Linker-Oligonukleotid komplementär zu der Sequenz des Oligonukleotidschwanzes des Aptamers ist, sodass das Linker- Oligonukleotid an den Oligonukleotidschwanz des Aptamers hybridisiert und das Aptamer mit dem Label markiert wird. Eine weitere Möglichkeit ist die Bindung von Biotin an das Aptamer und die Bindung von Markierungsmittel an Steptavidin. Durch eine Biotin- Streptavidin Bindung wird das Markierungsmittel an das Aptamer gebunden. WO20051 13817 describe. WO20051 13817 describes an aptamer with an attached oligonucleotide tail and a linker oligonucleotide carrying a label, wherein the sequence of the linker oligonucleotide is complementary to the sequence of the oligonucleotide tail of the aptamer such that the linker oligonucleotide is attached to the oligonucleotide tail of the oligonucleotide tail Aptamers hybridizes and the aptamer is labeled. Another possibility is the binding of biotin to the aptamer and the binding of label to streptavidin. A biotin-streptavidin bond binds the label to the aptamer.
Alle Markierungsmittel sind grundsätzlich einsetzbar, die sich an DNA oder RNA binden lassen. Konkrete Beispiele für Markierungssubstanzen wurden weiter oben bei der Erläuterung von erfindungsgemäßen Verfahren angegeben, bei denen markierte All labeling agents are basically usable, which can be bound to DNA or RNA. Concrete examples of labeling substances have been given above in the explanation of methods according to the invention in which labeled
Aptamere eingesetzt werden können. Beispielsweise ist die Markierung ein Farbstoff. In einer speziellen Variante ist das Markierungsmittel eine Substanz, die eine Bilderzeugung
durch das markierte Aptamer in einem bildgebenden Verfahren ermöglicht. Das Bild kann durch Strahlung erzeugt sein, die ein für das menschliche Auge direkt sichtbares Bild erzeugt, oder durch Strahlung, die nicht direkt sichtbar ist, beispielsweise Aptamers can be used. For example, the label is a dye. In a specific variant, the marking agent is a substance that imparts an image through the labeled aptamer in an imaging procedure. The image may be generated by radiation that produces an image directly visible to the human eye, or by radiation that is not directly visible, for example
Röntgenstrahlung oder radioaktive Strahlung, die anderweitig sichtbar gemacht wird, beispielsweise auf einem Film. Markierungsmittel können beispielsweise Lumineszenz-, Phosphoreszenz, Fluoreszenz-, radioaktive, oder UV/VIS- Markierungssubstanzen sein. Die erfindungsgemäße Sonde ist besonders für die in dieser Beschreibung erläuterten Nachweis-, Anreicherungs-, Abtrennungs- und/oder Isolierungsverfahren einsetzbar, insbesondere in Assays zur Detektion von Protein A, G oder L oder Protein A, G oder L enthaltenden Mikroorganismen, wie Staphylococcus aureus, Streptococcus oder X-radiation or radioactive radiation which is otherwise made visible, for example on a film. Labeling agents may be, for example, luminescence, phosphorescence, fluorescence, radioactive, or UV / VIS labeling substances. The probe according to the invention can be used in particular for the detection, enrichment, separation and / or isolation methods described in this description, in particular in assays for detecting microorganisms containing protein A, G or L or protein A, G or L, such as Staphylococcus aureus , Streptococcus or
Peptostreptococcus. Assays können z.B. direkte und indirekte Sandwich-Assays sein. Peptostreptococcus. Assays may e.g. direct and indirect sandwich assays.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen Biosensor, der ein In a further aspect, the invention relates to a biosensor comprising a
erfindungsgemäßes Aptamer aufweist. having inventive aptamer.
Ein solcher Biosensor weist gemäß der vorliegenden Erfindung vorzugsweise die folgenden Elemente auf: Such a biosensor according to the present invention preferably comprises the following elements:
- einen Rezeptor, aufweisend oder bestehend aus einem erfindungsgemäßen - A receptor, comprising or consisting of an inventive
Aptamer, und Aptamer, and
- einen Transducer, der das Bindungsereignis zwischen Aptamer und Target in ein elektrisch quantifizierbares Signal wandelt. a transducer that converts the binding event between aptamer and target into an electrically quantifiable signal.
Außerdem können weitere Elemente, wie beispielsweise eine In addition, other elements, such as a
Signalverarbeitungseinrichtung, eine Ausgabeelektronik, eine Anzeigevorrichtung, eine Datenverarbeitungseinrichtung, ein Datenspeicher sowie Schnittstellen zu anderen Geräten vorhanden sein. Signal processing device, an output electronics, a display device, a data processing device, a data storage and interfaces to other devices be present.
Der biologische Rezeptor des Aptamer-Biosensors weist das erfindungsgemäße Aptamer vorzugsweise in immobilisierter Form auf oder besteht nur aus dem Aptamer in immobilisierter Form. Die Funktion des Rezeptors ist die auf einem biochemischen Mechanismus beruhende Erkennung des Analyten, hier die Bindung des The biological receptor of the aptamer biosensor preferably has the aptamer according to the invention in immobilized form or consists only of the aptamer in immobilized form. The function of the receptor is the recognition of the analyte based on a biochemical mechanism, here the binding of the
erfindungsgemäßen Aptamers an sein Target (Protein A, G oder L, Protein A, G oder L enthaltende Substanz, Protein A, G oder L enthaltender Mikroorganismus). Aus einer Probe, die man mit dem Biosensor in Kontakt bringt, beispielsweise einem komplexen
Gemisch, das Target enthält, kann das Target über die spezifische Anbindung des Aptamers identifiziert und quantifiziert werden. Aptamers according to the invention to its target (protein A, G or L, protein A, G or L-containing substance, protein A, G or L-containing microorganism). From a sample that comes into contact with the biosensor, such as a complex one Mixture containing target, the target can be identified and quantified via the specific binding of the aptamer.
Die Spezifität des Biosensors wird durch den Rezeptor vorgegeben, während die The specificity of the biosensor is dictated by the receptor, while the
Sensitivität des Sensors vorwiegend durch den verwendeten Transducer beeinflusst wird. Die am Rezeptor stattfindende Aptamer-Target Bindung wird durch den Transducer in ein elektronisch verwertbares Signal umgesetzt. Der Transducer wandelt das Signal aus der selektiven Erkennungsreaktion des Rezeptors (Bindung Target an Aptamer), das der Konzentration des Targets in der Probe proportional ist, in ein elektrisch quantifizierbares Messsignal um. Die Signalbildung erfolgt auf Grund der molekularen Interaktion zwischen dem Target und dem Aptamer. Sensitivity of the sensor is mainly influenced by the transducer used. The aptamer-target binding taking place at the receptor is converted by the transducer into an electronically usable signal. The transducer converts the signal from the selective recognition reaction of the receptor (binding target to aptamer), which is proportional to the concentration of the target in the sample, into an electrically quantifiable measurement signal. Signaling occurs due to the molecular interaction between the target and the aptamer.
Mit einem erfindungsgemäßen Biosensor können vorzugsweise qualitative, quantitative und/oder halb-quantitative analytische Informationen gewonnen werden. Er ist insbesondere zum Einsatz in der Lebensmittel-, Wasser- und Umweltanalytik, der Wasserbehandlung und der Wasseraufbereitung, insbesondere von Trinkwasser und Abwasser, in der Diagnostik sowie zur Verwendung in Krankenhäusern und With a biosensor according to the invention, preferably qualitative, quantitative and / or semi-quantitative analytical information can be obtained. It is particularly suitable for use in food, water and environmental analysis, water treatment and water treatment, in particular of drinking water and wastewater, in diagnostics and for use in hospitals and
Pflegeeinrichtungen geeignet. Die Kopplung zwischen Rezeptor und Transducer erfolgt vorzugsweise durch die Care facilities suitable. The coupling between receptor and transducer is preferably carried out by the
Immobilisierung des Aptamers auf der Transduceroberfläche, beispielsweise über eine Streptavidin-Biotin-Bindung, wobei vorzugsweise das Aptamer mit Biotin verbunden ist und die Oberfläche des Transducers immobilisiertes Streptavidin aufweist. Die Bindung des Targets an das erfindungsgemäße Aptamer kann beispielsweise über optische, mikrogravimetrische, thermische oder akustische Transducer gemessen werden, vorzugsweise über optische oder mikrogravimetrische Transducer. Immobilization of the aptamer on the transducer surface, for example via a streptavidin-biotin bond, wherein preferably the aptamer is linked to biotin and the surface of the transducer has immobilized streptavidin. The binding of the target to the aptamer according to the invention can be measured, for example, via optical, microgravimetric, thermal or acoustic transducers, preferably via optical or microgravimetric transducers.
Die Messung in optischen Transducern kann auf Prinzipien der Photometrie beruhen, wobei beispielsweise Färb- oder Lumineszenz- Intensitätsänderungen erfasst werden. Zu den optischen Methoden zählen die Messung von Fluoreszenz, Phosphoreszenz, Biolumineszenz und Chemolumineszenz, Infrarotübergängen und die Lichtstreuung. Zu den optischen Methoden zählt auch die Messung von Schichtdickenänderungen wenn Target an Aptamer gebunden wird. Die Schichtdickenänderung kann z.B. mittels The measurement in optical transducers can be based on principles of photometry, whereby, for example, color or luminescence intensity changes are detected. Optical methods include the measurement of fluorescence, phosphorescence, bioluminescence and chemiluminescence, infrared transitions and light scattering. The optical methods also include the measurement of layer thickness changes when target is bound to aptamer. The layer thickness change may e.g. by means of
Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) oder reflektometrischer Interferenzspektroskopie
(RlfS) durchgeführt werden. Ferner kann die Interferenz an dünnen Schichten Surface Plasmon Resonance (SPR) or Reflectometric Interference Spectroscopy (RlfS). Furthermore, the interference on thin layers
(reflektrometrische Interferenzspektroskopie) sowie die Änderung des evaneszenten Feldes gemessen werden. Mikrogravimetrische Transducer sind zum Beispiel QCM-Sensoren (Quartz Crystal(Reflectrometric interference spectroscopy) and the change of the evanescent field are measured. Microgravimetric transducers include QCM sensors (Quartz Crystal
Microbalance), die eine Masseänderung detektieren, wenn Target an Aptamer gebunden wird. Microbalance) that detect mass change when targeting aptamer.
Akustische Transducer nutzen die Frequenzänderungen eines piezoelektrischen Acoustic transducers use the frequency changes of a piezoelectric
Schwingquarzes, der Masseänderungen hochempfindlich nachweist, die auftreten wenn Target an Aptamer bindet. Der verwendete Quarzkristall wird in einem oszillierenden elektrischen Feld platziert und die Resonanzfrequenz des Kristalls gemessen. Eine Masseänderung auf der Oberfläche des Schwingquarzes, z.B. durch Reaktion des Analyten mit dem vorher auf der Kristalloberfläche immobilisierten Rezeptor, bewirkt eine Änderung der Resonanzfrequenz, welche quantifiziert werden kann. Quartz crystal, which is highly sensitive to mass changes that occur when target binds to aptamer. The quartz crystal used is placed in an oscillating electric field and the resonant frequency of the crystal is measured. A mass change on the surface of the quartz crystal, e.g. by reacting the analyte with the receptor previously immobilized on the crystal surface causes a change in the resonance frequency, which can be quantified.
Elektrochemische Transducer können z.B. die Änderung der Konzentration redoxaktiver Marker an der Elektrodenoberfläche messen, oder die Änderung der Konzentration redoxaktiver Substrate oder Produkte, die z.B. in der enzymatischen Reaktion eines Enzym-Markers verbraucht werden oder entstehen. Electrochemical transducers may be e.g. measure the change in the concentration of redox-active markers on the electrode surface, or the change in the concentration of redox-active substrates or products, e.g. be consumed or formed in the enzymatic reaction of an enzyme marker.
Thermische Transducer messen die Wärmetönung der Aptamer-Target-Bindungsreaktion. Thermal transducers measure the heat of the aptamer-target binding reaction.
Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt eine feste Phase, auch bezeichnet als fester Träger, insbesondere zur Verwendung beim Nachweis, Anreicherung, Abtrennung und/oder Isolierung von Protein A, G oder L, Protein A, G oder L enthaltenden In a further aspect, the invention relates to a solid phase, also referred to as a solid support, in particular for use in the detection, enrichment, separation and / or isolation of protein A, G or L, protein A, G or L-containing
Substanzen oder Protein A, G oder L enthaltenden Mikroorganismen, an dem ein erfindungsgemäßes Aptamer immobilisiert ist. Ein beispielhafter Biosensor ist im beigefügten Ausführungsbeispiel erläutert. Anleitung zur Konstruktion weiterer Biosensoren findet der Fachmann in Cho, E. J., Lee, J.-W., Ellington, A. D. (2009): Applications of Aptamers as Sensors, Annual Review of Analytical Chemistry 2: 241 -264; Mok, W and Li, Y. (2008): Recent Progress in Nucleic Acid Substances or microorganisms containing protein A, G or L, to which an aptamer according to the invention is immobilized. An exemplary biosensor is explained in the attached embodiment. Guidance in the construction of other biosensors will be found in Cho, E.J., Lee, J.-W., Ellington, A.D. (2009): Applications of Aptamers as Sensors, Annual Review of Analytical Chemistry 2: 241-264; Mok, W and Li, Y. (2008): Recent Progress in Nucleic Acid
Aptamer-Based Biosensors and Bioassays, Sensors 8: 7050-7084; Song, S., Wang, L., Li,
J., Fan, C, Zhao, J. (2008): Aptamer-based biosensors, TrAC Trends in Analytical Chemistry 27: 108-1 17. Aptamer-Based Biosensors and Bioassays, Sensors 8: 7050-7084; Song, S., Wang, L., Li, J., Fan, C, Zhao, J. (2008): Aptamer-based biosensors, TrAC Trends in Analytical Chemistry 27: 108-1 17.
Feste Phasen sind in allen möglichen geometrischen Formen denkbar. Beispiele für feste Träger sind Platten, Streifen, Membranen, Mikrotiterplatten, Filme, Gele, Mikropartikel, Nanopartikel oder Perlen. Besonders geeignete Materialien, aus denen eine feste Phase hergestellt werden kann, sind anorganische Polymere, organische Polymere, Gläser, organische und anorganische Kristalle, Keramiken, Metalle, insbesondere Edelmetalle, und Halbleiter. Ein besonders geeignetes organisches Polymer ist ein Polymer auf Basis von Polystyrol. Des Weiteren sind Biopolymere, vorzugsweise Cellulose, Dextran, Agar, Agarose und Sephadex, die funktionalisiert sein können, insbesondere als Nitrocellulose oder Cyanbromid-Sephadex, als Polymere einsetzbar. Aptamere können an magnetische Kügelchen (Magnetic Beads) gebunden sein, die z.B. Carboxy-terminierte oder Epoxy- aktivierte Seitenketten tragen. Des Weiteren ist eine Kopplung von Magnetic Beads an die Ribose oder Desoxyribose der Aptamere, wie z.B. über eine Hydrazon-Bindung, möglich. Die Beispiele für Polymere sind nicht limitierend und andere Moleküle denkbar. Solid phases are conceivable in all possible geometric forms. Examples of solid supports are plates, strips, membranes, microtiter plates, films, gels, microparticles, nanoparticles or beads. Particularly suitable materials from which a solid phase can be made are inorganic polymers, organic polymers, glasses, organic and inorganic crystals, ceramics, metals, especially precious metals, and semiconductors. A particularly suitable organic polymer is a polymer based on polystyrene. Furthermore, biopolymers, preferably cellulose, dextran, agar, agarose and Sephadex, which may be functionalized, in particular as nitrocellulose or cyanogen bromide Sephadex, can be used as polymers. Aptamers may be attached to magnetic beads, e.g. Carry carboxy-terminated or epoxy-activated side chains. Furthermore, coupling of magnetic beads to the ribose or deoxyribose of the aptamers, e.g. via a hydrazone bond, possible. The examples of polymers are not limiting and other molecules are conceivable.
Bevorzugte Kombinationen von geometrischer Form und Material sind Gele aus Preferred combinations of geometric shape and material are gels
Biopolymeren, insbesondere Agarose, und Gelmatrices aus Dextran und Sephadex, die - beispielsweise in Säulen verpackt - Hohlräume definierter Porengröße ausbilden. In einer speziellen Ausführungsform ist der feste Träger mit immobilisiertem Aptamer eine stationäre Phase für die Affinitätschromatographie, wobei der Träger vorzugsweise die Form von Kugeln oder anderweitig geformten Partikeln hat. Biopolymers, in particular agarose, and gel matrices of dextran and Sephadex, which form - for example, packed in columns - cavities defined pore size. In a specific embodiment, the immobilized aptamer solid support is a stationary phase for affinity chromatography, which support is preferably in the form of spheres or otherwise shaped particles.
In einer speziellen Ausführungsform ist die feste Phase ein Teststreifen, der ein oder mehrere verschiedene erfindungsgemäße Aptamere enthält. Der Teststreifen ist insbesondere einsetzbar für qualitative, halb-quantitative und quantitative Assays, die mit visuellen Nachweisverfahren arbeiten, insbesondere für Lateralfluss-Assays. In a specific embodiment, the solid phase is a test strip containing one or more different aptamers of the invention. The test strip is particularly useful for qualitative, semi-quantitative and quantitative assays that use visual detection techniques, especially for lateral flow assays.
Ein Lateralfluss-Assay arbeitet wie folgt: Eine flüssige Probe, die mutmaßlich ein Target für das erfindungsgemäße Aptamer enthält, wird an einer Stelle auf den Streifen aufgebracht bzw. der Streifen an einer Stelle mit der Probe benetzt. Diese Stelle ist die sogenannte Probeauftragszone des Streifens. Der Streifen enthält ein Matrixmaterial, durch welches das flüssige Testmedium und das darin suspendierte oder gelöste Target durch Kapillarwirkung aus einer Probeauftragszone in eine Nachweiszone strömen kann,
wo ein nachweisbares Signal oder die Abwesenheit eines solchen Signals auf das Vorhandensein des Targets hinweist. A lateral flow assay works as follows: A liquid sample suspected of containing a target for the aptamer of the invention is applied to the strip at one location, or the strip is wetted with the sample at one site. This site is the so called trial order zone of the strip. The strip contains a matrix material through which the liquid test medium and the target suspended or dissolved therein can flow by capillary action from a sample application zone into a detection zone, where a detectable signal or the absence of such a signal indicates the presence of the target.
Der Streifen, der für Lateralfluss-Assays einsetzbar ist, enthält ein oder mehrere erfindungsgemäße Aptamere, beispielsweise in der Probeauftragszone oder zumindest noch örtlich vor der Nachweiszone. Wenn Target in der Testprobe vorhanden ist bildet es mit dem im Streifen vorhandenen Aptamer einen Komplex, der zur Nachweiszone strömt und dort detektiert wird. Anders ausgedrückt strömt das Target innerhalb des Streifens zu dem Aptamer, bildet mit diesem einen Komplex, welcher anschließend zur Nachweiszone strömt. The strip which can be used for lateral flow assays contains one or more aptamers according to the invention, for example in the sample application zone or at least still locally in front of the detection zone. When target is present in the test sample, it forms a complex with the aptamer present in the strip, which flows to and is detected in the detection zone. In other words, the target within the strip flows to the aptamer, forming with it a complex which subsequently flows to the detection zone.
Die Bindungsreaktion kann auch direkt auf der Auftragsstelle stattfinden, wenn z.B. der Teststreifen das Aptamer enthält und die Aptamer-Target-Bindung direkt mit einem entsprechenden Marker sichtbar gemacht wird. The binding reaction may also take place directly on the site of application, e.g. the test strip contains the aptamer and the aptamer-target binding is visualized directly with a corresponding marker.
Vorzugsweise wird ein markiertes Aptamer eingesetzt, wobei jede bereits weiter oben beschriebene Markierung einsetzbar ist. Vorzugsweise wird eine Markierung eingesetzt, die in der Nachweiszone des Teststreifens zu einem visuell detektierbaren Signal führt. Grundsätzlich kann das Vorhandensein oder die Abwesenheit von Target in der Probe durch Nachweis oder fehlenden Nachweis eines markierten Aptamers in der Preferably, a labeled aptamer is used, wherein any label already described above can be used. Preferably, a label is used, which leads to a visually detectable signal in the detection zone of the test strip. Basically, the presence or absence of target in the sample can be detected by detection or lack of detection of a labeled aptamer in the sample
Nachweiszone ermittelt werden. Detection zone can be determined.
In einer Ausführungsform eines Teststreifens wird ein Enzym-markiertes Aptamer eingesetzt. In der Probe vorhandenes Target bildet mit dem Enzym-markierten Aptamer einen Komplex, der entlang des Streifens zu einer Nachweiszone strömt, die ein Substrat für den Enzymmarker enthält, der in Anwesenheit des Enzymmarkers eine farbige Reaktion zu erzeugen vermag. Der Streifen enthält vorzugsweise eine weitere Zone, in der Target immobilisiert ist, so dass markiertes Aptamer, das sich aufgrund der In one embodiment of a test strip, an enzyme-labeled aptamer is used. Target present in the sample forms a complex with the enzyme-labeled aptamer, which flows along the strip to a detection zone containing a substrate for the enzyme label which is capable of producing a colored reaction in the presence of the enzyme label. The strip preferably contains a further zone in which target is immobilized, so that labeled aptamer arising due to the
Abwesenheit von ausreichendem Target in der Probe nicht mit dem Target vereinigt, erfasst wird und dadurch gehindert wird, die Nachweiszone zu erreichen. Absence of sufficient target in the sample is not combined with the target, detected, and thereby prevented from reaching the detection zone.
In einer weiteren Ausführungsform funktioniert der Teststreifen nach dem Prinzip eines immunologischen Lateralfluss-Assays, beispielsweise eines In a further embodiment, the test strip functions according to the principle of an immunological lateral flow assay, for example one
Schwangerschaftsteststreifens, wobei ein dort verwendetes markiertes Immunglobulin durch ein erfindungsgemäßes, vorzugsweise markiertes, Aptamer ersetzt ist.
Eine spezielle Variante funktioniert nach folgendem Prinzip: Ein Teststreifen wird mit Probe benetzt und in der Probe vorhandenes Target bindet an ein Farbstoff-markiertes Aptamer. Der Target-Aptamer-Farbstoff-Komplex wandert zur Nachweiszone, in der ein zweiter Antikörper fixiert ist, welcher ebenfalls an das Target bindet. Der immobilisierte Antikörper bindet den wandernden Target-Aptamer-Farbstoff-Komplex in der Pregnancy test strip, wherein a labeled immunoglobulin used there is replaced by an inventive, preferably labeled, aptamer. A special variant works according to the following principle: A test strip is wetted with the sample and the target present in the sample binds to a dye-labeled aptamer. The target aptamer-dye complex migrates to the detection zone where a second antibody is fixed which also binds to the target. The immobilized antibody binds the migrating target aptamer-dye complex in the
Nachweiszone und diese wird angefärbt. Überschüssiges Farbstoff-markiertes Aptamer wandert weiter zu einer Kontrollzone, in der eine Substanz fixiert ist, die das Farbstoffmarkierte Aptamer bindet und dadurch angefärbt wird. Detection zone and this is stained. Excess dye-labeled aptamer migrates further to a control zone in which a substance is fixed which binds and is stained with the dye-labeled aptamer.
Der Teststreifen ist aus jedem Material herstellbar, das mit einer Probe benetzbar ist und in das ein erfindungsgemäßes Aptamer eingebracht werden kann. Insbesondere bevorzugt sind Materialien durch die eine Probe und ein darin enthaltenes Target durch Kapillarwirkung strömen können. Beispiele sind Nitrozellulose, Nitrozellulosemischungen mit Polyester oder Zellulose, unbeschichtetes Papier, poröses Papier, Viskosefilament, Glasfaser, Acrylnitrilcopolymer oder Nylon, sowie alle weiteren Materialien, die bei Lateralfluss-Assays üblich sind. The test strip can be produced from any material that can be wetted with a sample and into which an aptamer according to the invention can be introduced. Particularly preferred are materials through which a sample and a target contained therein can flow by capillary action. Examples are nitrocellulose, nitrocellulose blends with polyester or cellulose, uncoated paper, porous paper, viscose filament, glass fiber, acrylonitrile copolymer or nylon, as well as all other materials common in lateral flow assays.
Der Teststreifen kann bereits als solcher verwendet werden, um das Vorhandensein von Target in einer Probe festzustellen. Zur Anwendung kann der Streifen in eine Probe eingetaucht werden, im Falle eines Lateralfluss-Assays beispielsweise mit nur einem Ende, das dann als Probeauftragszone dient. The test strip can already be used as such to detect the presence of target in a sample. For use, the strip may be dipped in a sample, for example, in a lateral flow assay, with only one end, which then serves as a trial application zone.
Gegenstand der Erfindung ist auch eine Lateralfluss-Assay- Vorrichtung, die den oben beschriebenen Teststreifen aufweist. Die Vorrichtung kann neben dem Teststreifen beispielsweise ein Gehäuse aufweisen, in das der Teststreifen eingebettet ist und das eine, vorzugsweise verschließbare, Öffnung zur Probenauftragszone des Teststreifens aufweist, sowie Aussparungen zur Beobachtung einer Nachweis und ggf. Kontrollzone. Ein solcher Aufbau ist aus dem Gebiet der Schwangerschaftstests bekannt und entsprechend sind bekannte Aufbauten von Lateralfluss-Assay-Vorrichtung auch in der vorliegenden Erfindung verwendbar. The invention also provides a lateral flow assay device comprising the above-described test strip. In addition to the test strip, the device may have, for example, a housing in which the test strip is embedded and which has a preferably closable opening to the sample application zone of the test strip, as well as recesses for monitoring a detection zone and possibly a control zone. Such a structure is known in the field of pregnancy tests and, accordingly, known structures of lateral flow assay device are also useful in the present invention.
In einer anderen speziellen Ausführungsform bilden der feste Träger und das Aptamer ein Microarray oder einen sogenannten„DNA oder RNA-Chip", der einkanalig oder mehrkanalig sein kann. Im Microarray können auf mehreren Array-förmig angeordneten
Messpunkten ein oder mehrere Aptamere sowie Referenzmaterialien zur Grundsignalkompensation bzw. Funktionstestung angeordnet sein. In einem Mehrkanal- Chip erfolgt diese Anordnung in den einzelnen Kanälen. Dadurch ist die parallele In another specific embodiment, the solid support and the aptamer form a microarray, or a so-called "DNA or RNA chip," which may be single-channel or multi-channel Measuring points one or more aptamers and reference materials for basic signal compensation or functional testing can be arranged. In a multi-channel chip, this arrangement takes place in the individual channels. This is the parallel
Mehrfachmessung einer Probe, oder bei verschiedenen Aptameren, die parallele Multiple measurement of a sample, or with different aptamers, the parallel
Messung unterschiedlicher Analyte in einer Probe möglich. Measurement of different analytes in a sample possible.
Die Immobilisierung von Aptamer an fester Phase kann auf verschiedene Art und Weise erfolgen und auf jegliche Art und Weise, die dem Fachmann zur Immobilisierung von DNA oder RNA an Feststoffen bekannt ist. Bekannte Möglichkeiten wurden bereits zuvor in dieser Beschreibung genannt. Die Immobilisierung von Aptameren auf Nanopartikeln ist z.B. beschrieben in WO2005/13817. Eine feste Phase aus Papier oder einem porösen Material kann mit dem Aptamer in flüssiger Phase benetzt und die flüssige Phase anschließend verflüchtigt werden, so dass das Aptamer in dem Papier bzw. dem porösen Material zurückbleibt. Immobilization of aptamer to solid phase can be accomplished in a variety of ways and in any manner known to those skilled in the art for immobilizing DNA or RNA on solids. Known options have already been mentioned earlier in this description. The immobilization of aptamers on nanoparticles is e.g. described in WO2005 / 13817. A solid phase of paper or porous material may be wetted with the liquid phase aptamer and the volatiles then volatilized leaving the aptamer in the paper or porous material.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Kit umfassend ein erfindungsgemäßes Aptamer. In a further aspect, the present invention also relates to a kit comprising an aptamer according to the invention.
Das Kit umfasst vorzugsweise ein erfindungsgemäßes Aptamer, insbesondere ein markiertes erfindungsgemäßes Aptamer bzw. eine erfindungsgemäße Aptamersonde, sowie weitere Komponenten für die mit dem Kit beabsichtigte Reaktion oder das mit dem durchzuführende Verfahren, beispielsweise Komponenten für ein beabsichtigtes The kit preferably comprises an aptamer according to the invention, in particular a labeled aptamer according to the invention or an aptamer probe according to the invention, and further components for the reaction intended by the kit or the procedure to be carried out, for example components for an intended
Nachweis Anreicherungs-, Abtrennungs- und/oder Isolierungsverfahren. Beispiele sind Pufferlösungen, Substrate für eine Farbreaktion, Farbstoffe oder enzymatische Substrate. Das Aptamer und/oder weitere Komponenten können an einer festen Phase immobilisiert sein. Beispielhafte Formen und Materialien für feste Phasen wurden bereits an anderer Stelle in dieser Beschreibung genannt. Die feste Phase kann beispielsweise in Form eines (Micro)-Arrays oder einer Mikrotiterplatte-bereitgestellt werden. Die feste Phase kann im konkreten Fall eine immobilisierte Fängersubstanz für Protein A, G oder L, Protein A, G oder L enthaltende Substanz oder einen Protein A, G oder L enthaltenden Mikroorganismus aufweisen, insbesondere einen immobilisierten Antikörper, der zur Anbindung von Protein A, G oder L, einer Protein A, G oder L enthaltenden Substanz oder eines Protein A, G oder L enthaltenden Mikroorganismus dient. Die immobilisierte Detection enrichment, separation and / or isolation procedures. Examples are buffer solutions, substrates for a color reaction, dyes or enzymatic substrates. The aptamer and / or other components may be immobilized on a solid phase. Exemplary forms and materials for solid phases have been mentioned elsewhere in this specification. The solid phase can be provided for example in the form of a (micro) array or a microtiter plate. The solid phase may in the specific case comprise an immobilized capture substance for protein A, G or L, protein A, G or L-containing substance or a protein A, G or L-containing microorganism, in particular an immobilized antibody capable of binding protein A, G or L, a protein A, G or L-containing substance or a protein A, G or L-containing microorganism is used. The immobilized
Fängersubstanz ist vorzugsweise in Form eines (Micro)-Arrays, in einer Mikrotiterplatte oder in Chips angeordnet.
Das Kit dient vorzugsweise zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Nachweis-, Anreicherungs-, Abtrennungs- und/oder Isolierungsverfahrens für Protein A, G oder L, Protein A, G oder L enthaltender Substanz oder eines Protein A, G oder L enthaltenden Mikroorganismus, oder zur Durchführung anderweitiger Assays unter Zuhilfenahme eines erfindungsgemäßen Aptamers. Insofern wird auf die vorangehende Offenbarung Bezug genommen. Catcher substance is preferably arranged in the form of a (micro) array, in a microtiter plate or in chips. The kit is preferably for carrying out a detection, enrichment, separation and / or isolation method according to the invention for protein A, G or L, protein A, G or L-containing substance or a microorganism containing protein A, G or L, or for carrying out in other assays with the aid of an aptamer according to the invention. In this respect, reference is made to the preceding disclosure.
In dem Kit kann das Aptamer in verschiedensten Formen bereitgestellt werden, beispielsweise gefriergetrocknet oder in einem flüssigen Medium. In the kit, the aptamer can be provided in a variety of forms, for example freeze-dried or in a liquid medium.
Die Erfindung betrifft auch ein Messgerät zum Nachweis von Protein A, G oder L, Protein A, G oder L enthaltenden Substanzen oder Protein A, G oder L enthaltenden The invention also relates to a measuring device for detecting protein A, G or L, substances containing protein A, G or L or protein A, G or L.
Mikroorganismen. Das Messgerät weist ein oder mehrere verschiedene der zuvor beschriebenen Aptamere, eine Aptamersonde wie zuvor beschrieben oder einen Microorganisms. The meter includes one or more of the aptamers described above, an apta probe as previously described, or one
Biosensor wie zuvor beschrieben auf. Darüber hinaus kann das Messgerät unter anderem eine Probeentnahmeeinrichtung, eine Signalverarbeitungseinrichtung, eine Biosensor as described above. In addition, the measuring device may include, inter alia, a sampling device, a signal processing device, a
Anzeigevorrichtung zum Ablesen von Messergebnissen oder Messwerten, eine Display device for reading measurement results or measured values, a
Datenverarbeitungseinrichtung, einen Datenspeichereinrichtung und Schnittstellen zur Verbindung mit externen Geräten oder Speichermedien aufweisen. Data processing device, a data storage device and interfaces for connection to external devices or storage media.
Mit dem Messgerät können je nach Ausgestaltung qualitative, quantitative und/oder halbquantitative analytische Informationen über das zu messende Target gewonnen werden. Mit dem Messgerät können die zuvor erläuterten Nachweisverfahren durchgeführt werden. Es ist insbesondere zum Einsatz in der Lebensmittel-, Wasser- und Depending on the design, qualitative, quantitative and / or semi-quantitative analytical information about the target to be measured can be obtained with the measuring device. With the measuring device, the previously explained detection methods can be performed. It is particularly suitable for use in food, water and
Umweltanalytik, der Wasserbehandlung und der Wasseraufbereitung, insbesondere von Trinkwasser und Abwasser, in der Diagnostik sowie zur Verwendung in Krankenhäusern und Pflegeeinrichtungen geeignet. Das Messgerät ist insbesondere ein transportables Messgerät, das vor Ort eingesetzt werden kann, beispielsweise ein leichtes Messgerät im Taschenformat. Environmental analysis, water treatment and water treatment, especially of drinking water and wastewater, in diagnostics and for use in hospitals and care facilities suitable. In particular, the meter is a portable meter that can be used on-site, such as a pocket-sized lightweight meter.
Die Probeentnahmeeinrichtung des Messgeräts kann auf verschiedene Art und Weise aufgebaut sein. In einer Variante ist die Probeentnahmeeinrichtung eine Kapillare oder ein poröser Streifen, im dem Flüssigkeiten aufgesaugt werden können. Eine solche
Probeentnahmevorrichtung wird zur Probeentnahme üblicherweise in eine flüssige Probe eingetaucht. Durch Kapillarkraft wird die Probe zu dem gewünschten Ort im Messgerät transportiert, an dem sich das Aptamer befindet und wo die Nachweisreaktion stattfinden kann. Beispielsweise wird die Probe zu einem das Aptamer aufweisenden Biosensor transportiert, welcher seinerseits ein Messsignal erzeugt. The sampling device of the measuring device can be constructed in various ways. In a variant, the sampling device is a capillary or a porous strip in which liquids can be absorbed. Such Sampling device is usually immersed in a liquid sample for sampling. Capillary force transports the sample to the desired location in the meter where the aptamer is located and where the detection reaction can take place. For example, the sample is transported to a biosensor having the aptamer, which in turn generates a measurement signal.
In einer anderen Variante weist die Probeentnahmeeinrichtung einen Schlauch oder ein Röhrchen sowie eine Pumpe auf. Mit der Pumpe wird eine flüssige Probe angesaugt und die Probe zu dem gewünschten Ort im Messgerät transportiert, an dem sich das Aptamer befindet und wo die Nachweisreaktion stattfinden kann. Beispielsweise wird die Probe zu einem das Aptamer ausweisenden Biosensor transportiert, welcher seinerseits ein Messsignal erzeugt. In another variant, the sampling device has a hose or a tube and a pump. The pump draws in a liquid sample and transports the sample to the desired location in the instrument where the aptamer is located and where the detection reaction can take place. For example, the sample is transported to a biosensor identifying the aptamer, which in turn generates a measurement signal.
Die Erfindung betrifft in einem Aspekt auch die Verwendung einer zuvor beschriebenen Sonde, einer zuvor beschriebenen festen Phase, eines zuvor beschriebenen Biosensors, eines zuvor beschriebenen Teststreifens, einer zuvor beschriebenen Lateralfluss-Assay- Vorrichtung, eines zuvor beschriebenen Kits, oder eines zuvor beschriebenen Messgeräts zum Nachweis von Protein A, G oder L, Protein A, G oder L enthaltenden Substanzen oder Protein A, G oder L enthaltenden Mikroorganismen, oder zur Anreicherung, The invention also relates in one aspect to the use of a previously described probe, a previously described solid phase, a previously described biosensor, a previously described test strip, a previously described lateral flow assay device, a previously described kit, or a previously described measuring device for Detection of protein A, G or L, substances containing protein A, G or L or microorganisms containing protein A, G or L, or for enrichment,
Abtrennung und/oder Isolierung von Protein A, G oder L, Protein A, G oder L enthaltenden Substanzen oder Protein A, G oder L enthaltenden Mikroorganismen. Hierbei wird auf alle zuvor beschriebenen Verfahrensvarianten Bezug genommen. Separation and / or isolation of protein A, G or L, protein A, G or L-containing substances or microorganisms containing protein A, G or L. In this case, reference is made to all method variants described above.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand von nicht limitierenden Beispielen für konkrete Ausführungsformen näher erläutert. In den Beispielexperimenten werden In the following, the invention will be explained in more detail with reference to non-limiting examples of specific embodiments. In the example experiments will be
Standardreagenzien und Puffer verwendet, die frei von Kontaminationen sind.
Standard reagents and buffers used, which are free of contamination.
BEISPIEL 1 : Präparation der Target-modifizierten Magnetic Beads. EXAMPLE 1: Preparation of Target-Modified Magnetic Beads.
Dynabeads® M-280 Streptavidin (Invitrogen, UK) wurden nach Herstellerangaben verwendet. 1 χ 109 Magnetic Beads wurden zunächst 3χ mit je 500μΙ PBS, pH 7.4 gewaschen und anschließend mit 51 C^g biotinyliertem Protein A für 1 h bei 21 °C unter Schütteln inkubiert (natives, biotinyliertes Protein A von Staphylococcus aureus (Sigma, P21 65); gelöst in 0, 1 M Natriumphosphatpuffer pH7.4 zu einer Stammlösung von 2mg/ml). Danach folgten weitere Waschschritte: 3χ 500μΙ PBS, pH 7.4; 1 χ 500μΙ PBS, pH 7.4 + 0,05% Tween20 mit einer Inkubation von 5min bei 21 °C unter Schütteln; 1 χ 500μΙ PBS, pH 7.4 + 0,05% Tween20 (ohne Inkubation); 2χ 500μΙ PBS, pH 7.4. Die Abtrennung der Beads von den Lösungen erfolgte jeweils unter Verwendung eines Magnet- Separationsstandes (Promega, Deutschland). Die Protein A - modifizierten Beads wurden dann in 500μΙ PBS, pH 7.4 + 0,02% Natriumazid suspendiert und bei 4°C gelagert. Dynabeads® M-280 streptavidin (Invitrogen, UK) was used according to manufacturer's instructions. 1 χ 10 9 Magnetic Beads first 3 were χ each 500μΙ PBS, pH 7.4 and then incubated with shaking at 51 C ^ g biotinylated protein A for 1 h at 21 ° C (virgin, biotinylated protein A from Staphylococcus aureus (Sigma, P21 65), dissolved in 0.1 M sodium phosphate buffer pH7.4 to a stock solution of 2 mg / ml). This was followed by further washes: 3 χ 500μΙ PBS, pH 7.4; 1 χ 500μΙ PBS, pH 7.4 + 0.05% Tween 20 with an incubation of 5 min at 21 ° C with shaking; 1 χ 500μΙ PBS, pH 7.4 + 0.05% Tween20 (without incubation); 2χ 500μΙ PBS, pH 7.4. The separation of the beads from the solutions was carried out in each case using a magnetic separation stand (Promega, Germany). The protein A-modified beads were then suspended in 500 μM PBS, pH 7.4 + 0.02% sodium azide and stored at 4 ° C.
BEISPIEL 2: In vitro Selektion (FluMag-SELEX). EXAMPLE 2: In Vitro Selection (FluMag-SELEX).
Die Selektion von DNA-Aptameren für Protein A erfolgte unter Anwendung des FluMag- SELEX-Prozesses. Biotinyliertes Protein A wurde dafür auf Streptavidin-funktionalisierte Magnetic Beads immobilisiert und in dieser Form als Target für die Aptamerselektion eingesetzt. Eine Fluoresceinmarkierung der DNA ab der zweiten SELEX-Runde ermöglichte au ßerdem deren Quantifizierung in den verschiedenen Schritten des SELEX- Prozesses mittels Fluoreszenzmessung (Wallac Victor2 V Multilabel Counter; PerkinElmer, Deutschland; Messbedingungen : Excitation 485nm/Emission 535nm, time 1 s, CW-lamp energy 22500, Messvolumen Ι ΟΟμΙ/well, Messung in schwarzen 96 well Mikrotiterplatten (NUNC; Deutschland)). The selection of DNA aptamers for protein A was carried out using the FluMag SELEX process. Biotinylated protein A was immobilized on streptavidin-functionalized magnetic beads and used in this form as a target for aptamer selection. A fluorescein label the DNA from the second SELEX round allowed au ßerdem their quantification in the different steps of the SELEX process by means of measurement of fluorescence (Wallac Victor 2 V Multilabel Counter; PerkinElmer, Germany; measurement conditions: Excitation 485 nm / Emission 535 nm, time 1 s, CW -lamp energy 22500, measuring volume Ι ΟΟμΙ / well, measurement in black 96 well microtiter plates (NUNC; Germany)).
Ausgangspunkt des Selektionsprozesses war eine randomisierte DNA-Oligonukleotid- Bibliothek, die mittels chemischer Synthese (Microsynth AG, CH) hergestellt wurde: The starting point of the selection process was a randomized DNA oligonucleotide library prepared by chemical synthesis (Microsynth AG, CH):
5 -ATACCAGCTTATTCAATT - N40 - ACAATCGTAATCAGTTAG-3'. N40 stellt den Bereich mit variablen Nukleotiden (Zufallssequenz) dar. 5-ATACCAGCTTATTCAATT - N 40 - ACAATCGTAATCAGTTAG-3 '. N 40 represents the variable nucleotide region (random sequence).
Alle Oligonukleotide dieser Bibliothek besitzen am 5'- und 3'-Ende spezifische Sequenzen, die als Primerbindungsorte für die Amplifizierung der Oligonukleotide mittels PCR dienen. Folgende modifizierte PCR-Primer wurden verwendet:
als Sense-Primer 5'-FI-ATACCAGCTTATTCAATT-3' (siehe SEQ ID NO: 66) mit einer Fluorescein(FI)-Markierung am 5'-Ende und als Antisense-Primer 5'-dA20HEGL- CTAACTGATTACGATTGT-3' mit einer Verlängerung am 5'-Ende (dA20 = 20 Nukleotide mit der Base Adenin; HEGL = Hexaethylenglycolspacer, Primersequenz siehe SEQ ID NO: 68). All oligonucleotides of this library have specific sequences at the 5 'and 3' end, which serve as primer binding sites for the amplification of the oligonucleotides by means of PCR. The following modified PCR primers were used: as sense primer 5'-FI-ATACCAGCTTATTCAATT-3 '(see SEQ ID NO: 66) with a fluorescein (FI) label at the 5'-end and as antisense primer 5'-dA 20 HEGL-CTAACTGATTACGATTGT-3' with an extension at the 5 'end (dA 20 = 20 nucleotides with the base adenine, HEGL = hexaethylene glycol spacer, primer sequence see SEQ ID NO: 68).
Für die Aptamerselektion wurden aufeinanderfolgende SELEX-Runden durchgeführt, die aus mehreren Schritten bestehen: den Selektionsschritten - (i) Bindung der DNA- Oligonukleotid-Bibliothek (~2,5nmol ssDNA) bzw. des in der vorhergehenden Runde selektierten Oligonukleotidpools an die Target-modifizierten Magnetic Beads (Inkubation für 30min bei 21 °C unter Schütteln in Bindungspuffer [100mM NaCI, 20mM Tris-HCI, pH 7.6, 10mM MgCI2, 5mM KCl, 1 mM CaCI2]; Bindungsvolumen 250μΙ), (ii) Abtrennen der ungebundenen Oligonukleotide durch mehrere Waschschritte der Bindungskomplexe, (iii) Elution der gebundenen Oligonukleotide mittels Hitze (2x Inkubation der Bindungskomplexe in 250μΙ Bindungspuffer für 10min bei 95°C unter Schütteln); dem Amplifikationsschritt - (iv) Vervielfältigung der eluierten Oligonukleotide mittels PCR und dem Rein ig unqssch ritt - (v) Trennung der doppelsträngigen PCR-Produkte und Gewinnung der relevanten DNA-Einzelstränge (sense-Stränge) mittels denaturierender PAGE und anschließender Gelelution. Der auf diese Weise generierte neue Oligonukleotid-Pool am Ende einer SELEX-Runde wurde für eine erneute Bindungsreaktion mit den Target-modifizierten Magnetic Beads in der nächsten SELEX- Runde eingesetzt. In jeder SELEX-Runde wurde dabei ein frisches Aliquot von ~108 Target-modifizierte Magnetic Beads verwendet. In den Runden 3 und 7 - 1 1 wurde zusätzlich ein negativer Selektionsschritt eingefügt. Dies bedeutet, die Oligonukleotide wurden zunächst mit Streptavidin-funktionalisierten Magnetic Beads (ohne Target) inkubiert, um alle Oligonukleotide zu entfernen, die unspezifisch an die Immobilisierungsmatrix binden. Die im Überstand verbliebenen Oligonukleotide wurden anschließend mit den Target-modifizierten Magnetic Beads zur Bindung gebracht (siehe Selektionsschritt - (i)). Nach einer schrittweisen Anreicherung Target-bindender Oligonukleotide insbesondere in den Runden 8 - 1 1 (siehe Fig. 1 ), wurde der SELEX- Prozess in der 1 1 . Runde nach dem Amplifikationsschritt, in diesem Fall mit unmodifizierten Primern, beendet. For aptamer selection, consecutive SELEX rounds were performed consisting of several steps: the selection steps - (i) binding of the DNA oligonucleotide library (~ 2.5nmol ssDNA) or the oligonucleotide pool selected in the previous round to the target-modified ones Magnetic beads (incubation for 30 min at 21 ° C. with shaking in binding buffer [100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.6, 10 mM MgCl 2 , 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2 ], binding volume 250 μM), (ii) separation of the unbound oligonucleotides by several washing steps of the binding complexes, (iii) elution of the bound oligonucleotides by heat (2x incubation of the binding complexes in 250μΙ binding buffer for 10min at 95 ° C with shaking); the amplification step - (iv) Amplification of the eluted oligonucleotides by PCR and purification - (v) separation of the double-stranded PCR products and recovery of the relevant DNA single strands (sense strands) by means of denaturing PAGE and subsequent gel elution. The new oligonucleotide pool generated this way at the end of a SELEX round was used for a re-binding reaction with the target-modified magnetic beads in the next SELEX round. In each SELEX round, a fresh aliquot of ~ 10 8 target-modified magnetic beads was used. In rounds 3 and 7 - 1 1 an additional negative selection step was added. This means that the oligonucleotides were first incubated with streptavidin-functionalized magnetic beads (without a target) in order to remove all oligonucleotides which bind non-specifically to the immobilization matrix. The oligonucleotides remaining in the supernatant were then ligated with the target-modified magnetic beads (see selection step - (i)). After a stepwise enrichment of target-binding oligonucleotides, especially in rounds 8-1 (see FIG. 1), the SELEX process in FIG. Round after the amplification step, in this case with unmodified primers, terminated.
Die beigefügte Fig. 1 zeigt den Verlauf des SELEX-Prozesses zur Selektion Protein A- bindender Aptamere. Dargestellt ist die an die Target-modifizierten Magnetic Beads bindende Menge an Oligonukleotiden in jeder SELEX-Runde. In den Runden 3 und 7-1 1
(gekennzeichnet in der Fig. 1 mit *-Symbol) wurde zusätzlich ein negativer Selektionsschritt durchgeführt. Die Menge an Oligonukleotiden, die an die Immobilisierungsmatrix des Targets bindet ist ebenfalls dargestellt (0-0,07pmol), lag jedoch oftmals am Nachweislimit der Fluoreszenzmessung. The attached Fig. 1 shows the course of the SELEX process for the selection of protein A-binding aptamers. Shown is the amount of oligonucleotides binding to the target-modified magnetic beads in each SELEX round. In rounds 3 and 7-1 1 (marked in FIG. 1 with * symbol) was additionally carried out a negative selection step. The amount of oligonucleotides that bind to the immobilization matrix of the target is also shown (0-0.07 pmol), but was often at the detection limit of the fluorescence measurement.
BEISPIEL 3: Klonierung and Sequenzierung. EXAMPLE 3: Cloning and Sequencing.
In der letzten 1 1 . SELEX-Runde wurden die selektierten Oligonukleotide (Aptamer-Pool) mit unmodifizierten Primern amplifiziert, um anschließend die entstandenen PCR- Produkte direkt in den Vektor pCR2.1 -TOPO zu klonieren und in E. coli TOP10 Zellen (TOPO TA Cloning Kit; Invitrogen, UK) zu transformieren. Positive Klone wurden mittels Kolonie-PCR identifiziert. Unter Verwendung des QIAprep 96 Turbo Miniprep Kit (Qiagen, Deutschland) wurde die Plasmid-DNA von einigen der Klone präpariert und zur Sequenzierung des Aptamer-Inserts gegeben (Microsynth AG, CH). In the last 1 1. SELEX round, the selected oligonucleotides (aptamer pool) were amplified with unmodified primers, in order subsequently to clone the resulting PCR products directly into the vector pCR2.1 -TOPO and into E. coli TOP10 cells (TOPO TA cloning kit; UK). Positive clones were identified by colony PCR. Using the QIAprep 96 Turbo Miniprep Kit (Qiagen, Germany), the plasmid DNA of some of the clones was prepared and added for sequencing the aptamer insert (Microsynth AG, CH).
Eine Übersicht der aus der Klonierung erhaltenen Aptamersequenzen ist in der Tabelle 1 angegeben. Die Primersequenz (Sense) am 5'-Ende ist ATACCAGCTTATTCAATT (SEQ ID NO: 66) und die Primerbindungsregion für den Antisense-Primer am 3'-Ende ist ACAATCGTAATCAGTTAG (SEQ ID NO: 67). Sie sind jeweils in Fettschrift dargestellt. Die Sequenzen mit der SEQ ID NOs: 66 und 67 sind Bestandteil der Aptamere, vorbehaltlich verkürzter Sequenzen, wie in der vorangehenden allgemeinen Beschreibung definiert. Die Spalte„Anzahl" gibt die Anzahl Klone mit identischer Aptamersequenz an. Wenn mehrere Klone mit identischer Sequenz gefunden wurden, ist die Aptamerbezeichnung in Fettschrift markiert (siehe z.B. PA#2/8). An overview of the aptamer sequences obtained from the cloning is given in Table 1. The primer sequence (sense) at the 5 'end is ATACCAGCTTATTCAATT (SEQ ID NO: 66) and the primer binding region for the antisense primer at the 3' end is ACAATCGTAATCAGTTAG (SEQ ID NO: 67). They are each shown in bold type. The sequences having SEQ ID NOs: 66 and 67 are part of the aptamers, subject to truncated sequences as defined in the foregoing general description. The column "Number" indicates the number of clones with identical aptamer sequence If several clones with identical sequence were found, the aptamer designation is marked in bold (see, for example, PA # 2/8).
Einige Aptamere lassen sich aufgrund ihrer Sequenzen in Gruppen einteilen. Innerhalb einer Gruppe im Vergleich zum Stellvertreter einer Gruppe abweichende Nukleotide sind unterstrichen gekennzeichnet. Die in einer Gruppe zusammengefassten Sequenzen sind bis auf Punktmutationen und Deletionen identisch bzw. vom Stellvertreter abzuleiten. Die Aptamernummer des Stellvertreters einer Gruppe ist unterstrichen gekennzeichnet (siehe z.B. Aptamer Nr. PA#2/8 für Gruppe 1 ). Some aptamers can be grouped into groups based on their sequences. Different nucleotides within a group compared to the representative of a group are underlined. The sequences combined in a group are identical except for point mutations and deletions or derive from the substitute. The aptamer number of the proxy of a group is underlined (see, e.g., Aptamer No. PA # 2/8 for Group 1).
Die Aptamere lassen sich aufgrund ihrer Sequenzen in Gruppen einteilen. Innerhalb einer Gruppe abweichende Nukleotide sind mit Unterstreichung gekennzeichnet.
Die Sequenz mit der SEQ ID NO: 62 fasst die Sequenzen der Gruppe 1 zusammen und zeigt variable Nukleotide unterstrichen. The aptamers can be divided into groups based on their sequences. Within a group deviating nucleotides are marked with underlining. The sequence of SEQ ID NO: 62 summarizes the Group 1 sequences and shows variable nucleotides underlined.
Die Sequenz mit der SEQ ID NO: 63 fasst die Sequenzen der Gruppe 2 zusammen und zeigt variable Nukleotide unterstrichen. The sequence of SEQ ID NO: 63 summarizes the Group 2 sequences and shows variable nucleotides underlined.
Die Sequenz mit der SEQ ID NO: 64 fasst die Sequenzen der Gruppe 3 zusammen und zeigt variable Nukleotide unterstrichen. The sequence of SEQ ID NO: 64 summarizes the Group 3 sequences and shows variable nucleotides underlined.
Die Sequenz mit der SEQ ID NO: 65 fasst die Sequenzen der Gruppe 4 zusammen und zeigt variable Nukleotide unterstrichen. The sequence of SEQ ID NO: 65 summarizes the group 4 sequences and shows variable nucleotides underlined.
In der SEQ ID NO:65 bedeutet Xi entweder A oder L, wobei L für kein Nukleotid (Deletion) steht. In SEQ ID NO: 65, Xi is either A or L, where L is not a nucleotide (deletion).
Die Tabelle 2 zeigt eine Übersicht der Nukleotidsymbole, die für eines oder mehrere der Nukleotide A, G, C oder T stehen.
Table 2 shows an overview of the nucleotide symbols which represent one or more of the nucleotides A, G, C or T.
Tabelle 1 Table 1
Aptamer- Aptamersequenz (5' -» 3') SEQ Anzahl Nr. ID NO Aptamer aptamer sequence (5 '- »3') SEQ number NO. ID NO
Gruppe 1 Group 1
PA#2/8 ATACCAGCTTATTCAATTAGCAACATGAGGGGGATAGAGGGGGTGGGTTCTCTCGGCTACAATCGTAATCAGTTAG 1 4 PA # 2/8 ATACCAGCTTATTCAATTAGCAACATGAGGGGGATAGAGGGGGTGGGTTCTCTCGGCTACAATCGTAATCAGTTAG 1 4
PA#2/16 ATACCAGCTTATTCAATTAGCAACATGAGGGGGATAGAGGGGGTGGGTTCTCTCGRC TACAATCGTAATCAGTTAG 2 1 PA#6/48 ATACCAGCTTATTCAATTAGCAACATGAGGGGGATAAAGGGGGTGGGTTCTCTCGGCTACAATCGTAATCAGTTAG 3 1PA # 2/16 ATACCAGCTTATTCAATTAGCAACATGAGGGGGATAGAGGGGGTGGGTTCTCTCGRC TACAATCGTAATCAGTTAG 2 1 PA # 6/48 ATACCAGCTTATTCAATTAGCAACATGAGGGGGATAAAGGGGGTGGGTTCTCTCGGCTACAATCGTAATCAGTTAG 3 1
10 PA#6/58 ATACCAGCTTATTCAATTAGCAACATGAGGGGGATGGAGGGGGTGGGTT CT CT T^GGC TACAATCGTAATCAGTTAG 4 1 10 PA # 6/58 ATACCAGCTTATTCAATTAGCAACATGAGGGGGATGGAGGGGGTGGGTT CT CT T ^ GGC TACAATCGTAATCAGTTAG 4 1
ATACCAGCTTATTCAATTAGCAACATGAGGGGGATRRAGGGGGTGGGTTCTCTYGRC TACAATCGTAATCAGTTAG 62 ATACCAGCTTATTCAATTAGCAACATGAGGGGGATRRAGGGGGTGGGTTCTCTYGRC TACAATCGTAATCAGTTAG 62
Gruppe 2 Group 2
PA#4/34 ATACCAGCTTATTCAATTCCCCAACGAGTCGATATGTAGCCCACACTCTGATTCGTCCACAATCGTAATCAGTTAG 5 3 PA # 4/34 ATACCAGCTTATTCAATTCCCCAACGAGTCGATATGTAGCCCACACTCTGATTCGTCCACAATCGTAATCAGTTAG 5 3
15 PA#2/9 ATACCAGCTTATTCAATTGCACAACGAGTCGATATGTAGCCCACACTCTGATTCGTCCACAATCGTAATCAGTTAG 6 1 PA#10/71 ATACCAGCTTATTCAATTCCCCAACGAGTCGATATGTAGCCCACATTCTGATTCGTCCACAATCGTAATCAGTTAG 7 1 PA#10/76 ATACCAGCTTATTCAATTACC CAACGAGTCGATATGTAGCCCACACT CT GATT CGTCCACAATCGTAATCAGTTAG 8 1 15 PA # 2/9 ATACCAGCTTATTCAATTGCACAACGAGTCGATATGTAGCCCACACTCTGATTCGTCCACAATCGTAATCAGTTAG 6 1 PA # 10/71 ATACCAGCTTATTCAATTCCCCAACGAGTCGATATGTAGCCCACATTCTGATTCGTCCACAATCGTAATCAGTTAG 7 1 PA # 10/76 ATACCAGCTTATTCAATTACC CAACGAGTCGATATGTAGCCCACACT CT GATT CGTCCACAATCGTAATCAGTTAG 8 1
ATACCAGCTTATTCAATTVCMC AAC GAGT C GAT AT GT AGC C C AC AYT CTGATTCGTC CACAATCGTAATCAGTTAG 63 ATACCAGCTTATTCAATTVCMC AAC GAGT C GAT AT GT AGC C C AC AYT CTGATTCGTC CACAATCGTAATCAGTTAG 63
20 Gruppe 3 20 Group 3
PA #2/6 ATACCAGCTTATTCAATTACC GATCACTAGCCGACTAATTGGT TT CCGATCGCAGTCCACAATCGTAATCAGTTAG 9 2 PA # 2/6 ATACCAGCTTATTCAATTACC GATCACTAGCCGACTAATTGGT TT CCGATCGCAGTCCACAATCGTAATCAGTTAG 9 2
PA#6/54 ATACCAGCTTATTCAATTACC GATCACTAGCCGACTAATTGGT TT CCGATCGCAGTT CACAATCGTAATCAGTTAG 10 1 PA # 6/54 ATACCAGCTTATTCAATTACC GATCACTAGCCGACTAATTGGT TT CCGATCGCAGTT CACAATCGTAATCAGTTAG 10 1
ATACCAGCTTATTCAATTACC GATCACTAGCCGACTAATTGGT TT CCGATCGCAGTYCACAATCGTAATCAGTTAG 64
ATACCAGCTTATTCAATTACC GATCACTAGCCGACTAATTGGT TT CCGATCGCAGTYCACAATCGTAATCAGTTAG 64
Gruppe 4 Group 4
PA #14/82 ATACCAGCTTATTCAATTC C AC AAC C GAACT CGTAAGAC GTATGTAGCCGC C AAC T GTACAATCGTAATCAGTTAG 1 1 2 PA # 14/82 ATACCAGCTTATTCAATTC C AC AAC C GAACT CGTAAGAC GTATGTAGCCGC C AAC T GTACAATCGTAATCAGTTAG 1 1 2
PA#2/18 ATACCAGCTTATTCAATTCC-CAACCGAACTCGTAAGACGTATGTAGCCGCCAACTGTACAATCGTAATCAGTTAG 1 2 1 ATACCAGCTTATTCAATTC CXiCAACCGAACTCGTAAGACGTATGTAGCCGCCAACT GTACAATCGTAATCAGTTAG 65 PA # 2/18 ATACCAGCTTATTCAATTCC-CAACCGAACTCGTAAGACGTATGTAGCCGCCAACTGTACAATCGTAATCAGTTAG 1 2 1 ATACCAGCTTATTCAATTC CXiCAACCGAACTCGTAAGACGTATGTAGCCGCCAACT GTACAATCGTAATCAGTTAG 65
Weitere Aptamere Further aptamers
PA#4/22 ATACCAGCTTATTCAATTGCAGTACTGATGAGTGTAGCCGTATGATTATCGTTTGTGGACAATCGTAATCAGTTAG 1 3 8PA # 4/22 ATACCAGCTTATTCAATTGCAGTACTGATGAGTGTAGCCGTATGATTATCGTTTGTGGACAATCGTAATCAGTTAG 1 3 8
10 PA #2/11 ATACCAGCTTATTCAATTGGAGAC GAC AAAC T AT T AC GT AC T AC GGC AT GC AC T T GGTACAATCGTAATCAGTTAG 14 610 PA # 2/11 ATACCAGCTTATTCAATTGGAGAC GAC AAAC T AT T AC GT AC T AC GGC AT GC AC T T GGTACAATCGTAATCAGTTAG 14 6
PA #2/3 ATACCAGCTTATTCAATTC GACAAGTGGGCATTAC GATT CT AGCC CT GATT AT GTTCCACAATCGTAATCAGTTAG 1 5 3PA # 2/3 ATACCAGCTTATTCAATTC GACAAGTGGGCATTAC GATT CT AGCC CT GATT AT GTTCCACAATCGTAATCAGTTAG 1 5 3
PA #6/52 ATACCAGCTTATTCAATTAC GC AT T GGAGCC C GAAAC T GAT T C AT T GAGCC T AC C T GTACAATCGTAATCAGTTAG 1 6 2PA # 6/52 ATACCAGCTTATTCAATTAC GC AT T GGAGCC C GAAAC T GAT T C AT T GAGCC TACC T GTACAATCGTAATCAGTTAG 1 6 2
PA #2/14 ATACCAGCTTATTCAATTAC GAC C GT AGAC GAC T T AC AC T GAT GTTGCGCATTTC T GTACAATCGTAATCAGTTAG 1 7 2PA # 2/14 ATACCAGCTTATTCAATTAC GAC C GT AGAC G AC T AC AC GAT GTTGCGCATTTC T GTACAATCGTAATCAGTTAG 1 7 2
PA #4/31 ATACCAGCTTATTCAATTC GATGACGACTGT AGCC GCAATACGCCCCTGTTACGTTGTACAATCGTAATCAGTTAG 1 8 2PA # 4/31 ATACCAGCTTATTCAATTC GATGACGACTGT AGCC GCAATACGCCCCTGTTACGTTGTACAATCGTAATCAGTTAG 1 8 2
15 PA #6/41 ATACCAGCTTATTCAATTGGACGCCGACTAACTTTACGTGGTTCTCCTACCGCCTAACCACAATCGTAATCAGTTAG 1 9 215 PA # 6/41 ATACCAGCTTATTCAATTGGACGCCGACTAACTTTACGTGGTTCTCCTACCGCCTAACCACAATCGTAATCAGTTAG 1 9 2
PA #6/43 ATACCAGCTTATTCAATTACGAAATGT AGCC GATC CT GATT ACTCTCTGTCAGCTTGGACAATCGTAATCAGTTAG 20 2PA # 6/43 ATACCAGCTTATTCAATTACGAAATGT AGCC GATC CT GATT ACTCTCTGTCAGCTTGGACAATCGTAATCAGTTAG 20 2
PA#2/4 ATACCAGCTTATTCAATTGGAGTCCGACTAAATGATCTTTGAGAGTGTCTCACAGTCCACAATCGTAATCAGTTAG 21 PA # 2/4 ATACCAGCTTATTCAATTGGAGTCCGACTAAATGATCTTTGAGAGTGTCTCACAGTCCACAATCGTAATCAGTTAG 21
PA #2/5 ATACCAGCTTATTCAATTGCAGATTACGCCTTGTAGCCCGCACTGATCTCGATATTTGGACAATCGTAATCAGTTAG 22 PA # 2/5 ATACCAGCTTATTCAATTGCAGATTACGCCTTGTAGCCCGCACTGATCTCGATATTTGGACAATCGTAATCAGTTAG 22
PA#2/7 ATACCAGCTTATTCAATTACGAGGTAC GATT AC AGAC GATC GAACTGATAC TT GTTGGACAATCGTAATCAGTTAG 23 PA # 2/7 ATACCAGCTTATTCAATTACGAGGTAC GATT AC AGAC GATC GAACTGATAC TT GTTGGACAATCGTAATCAGTTAG 23
20 PA #2/10 ATACCAGCTTATTCAATTACGATCACTGTAGACGGCGACTGATTAATCTACGTATTGGACAATCGTAATCAGTTAG 24 20 PA # 2/10 ATACCAGCTTATTCAATTACGATCACTGTAGACGGCGACTGATTAATCTACGTATTGGACAATCGTAATCAGTTAG 24
PA #2/12 ATACCAGCTTATTCAATTGCAATGGACCCCAAAGTTGGATTGTAGCCGCTGCTGTTCGACAATCGTAATCAGTTAG 25 PA # 2/12 ATACCAGCTTATTCAATTGCAATGGACCCCAAAGTTGGATTGTAGCCGCTGCTGTTCGACAATCGTAATCAGTTAG 25
PA #2/13 ATACCAGCTTATTCAATTACGGCAACGAGTGTAGACCGACGCTGATTACTGTCTCATCGACAATCGTAATCAGTTAG 26
PA # 2/13 ATACCAGCTTATTCAATTACGGCAACGAGTGTAGACCGACGCTGATTACTGTCTCATCGACAATCGTAATCAGTTAG 26
PA#2/17 ATACCAGCTTATTCAATTGCACCAACCCGCTGATAGGATGTAGCCGCTAACTCCTTCCACAATCGTAATCAGTTAG 27PA # 2/17 ATACCAGCTTATTCAATTGCACCAACCCGCTGATAGGATGTAGCCGCTAACTCCTTCCACAATCGTAATCAGTTAG 27
PA#4/25 ATACCAGCTTATTCAATTGGAGACGACGCCTGGTTTCGTTATTGAGTGTCTCTCTGCCACAATCGTAATCAGTTAG 28PA # 4/25 ATACCAGCTTATTCAATTGGAGACGACGCCTGGTTTCGTTATTGAGTGTCTCTCTGCCACAATCGTAATCAGTTAG 28
PA#4/29 ATACCAGCTTATTCAATTGGAGCCGCAAATATCGTGATGAATGTGTGAGCCGATCTACACAATCGTAATCAGTTAG 29PA # 4/29 ATACCAGCTTATTCAATTGGAGCCGCAAATATCGTGATGAATGTGTGAGCCGATCTACACAATCGTAATCAGTTAG 29
PA#4/30 ATACCAGCTTATTCAATTACCCCGATGTAGCCGACGTGCACTTGTTATGATTAGGACCACAATCGTAATCAGTTAG 30PA # 4/30 ATACCAGCTTATTCAATTACCCCGATGTAGCCGACGTGCACTTGTTATGATTAGGACCACAATCGTAATCAGTTAG 30
5 PA#4/28 ATACCAGCTTATTCAATTCCAGAACCGGCGATTGTAACCGACTAAGTGTGCATGATCCACAATCGTAATCAGTTAG 315 PA # 4/28 ATACCAGCTTATTCAATTCCAGAACCGGCGATTGTAACCGACTAAGTGTGCATGATCCACAATCGTAATCAGTTAG 31
PA#4/39 ATACCAGCTTATTCAATTGCAGCCGACTAACCTGATGAGTGTGGTCAGTTTACGCTTGACAATCGTAATCAGTTAG 32PA # 4/39 ATACCAGCTTATTCAATTGCAGCCGACTAACCTGATGAGTGTGGTCAGTTTACGCTTGACAATCGTAATCAGTTAG 32
PA#4/40 ATACCAGCTTATTCAATTGGAGACGACGCGGCTGATTATGTTAGTCTGTAACGCCACCACAATCGTAATCAGTTAG 33PA # 4/40 ATACCAGCTTATTCAATTGGAGACGACGCGGCTGATTATGTTAGTCTGTAACGCCACCACAATCGTAATCAGTTAG 33
PA#6/46 ATACCAGCTTATTCAATTACGAACATGGAGCCGCACTGATTACTGGTCCACCGCGTACACAATCGTAATCAGTTAG 34PA # 6/46 ATACCAGCTTATTCAATTACGAACATGGAGCCGCACTGATTACTGGTCCACCGCGTACACAATCGTAATCAGTTAG 34
PA#6/47 ATACCAGCTTATTCAATTGTAGCCGAACACGAACTGACACTAATTGCCGATGGCACCTGCACAATCGTAATCAGTTAG 35PA # 6/47 ATACCAGCTTATTCAATTGTAGCCGAACACGAACTGACACTAATTGCCGATGGCACCTGCACAATCGTAATCAGTTAG 35
10 PA#6/49 ATACCAGCTTATTCAATTGGAGCCGAACAACTGCTTACCCTGCGTCTTATTGTCCCGTACAATCGTAATCAGTTAG 3610 PA # 6/49 ATACCAGCTTATTCAATTGGAGCCGAACAACTGCTTACCCTGCGTCTTATTGTCCCGTACAATCGTAATCAGTTAG 36
PA#6/55 ATACCAGCTTATTCAATTGGAGACGACTAGCTGCTTACGATGACTCTGTACTGTAACCACAATCGTAATCAGTTAG 37PA # 6/55 ATACCAGCTTATTCAATTGGAGACGACTAGCTGCTTACGATGACTCTGTACTGTAACCACAATCGTAATCAGTTAG 37
■ i ■ i
PA#6/59 ATACCAGCTTATTCAATTACGAACAGTAGCCGCATAAACTCTACAGATATTCTCGTTGGACAATCGTAATCAGTTAG 38 PA # 6/59 ATACCAGCTTATTCAATTACGAACAGTAGCCGCATAAACTCTACAGATATTCTCGTTGGACAATCGTAATCAGTTAG 38
PA#6/60 ATACCAGCTTATTCAATTACGATGTAGTCCGACTCCAACTGATGATTGTTACGCCGCCACAATCGTAATCAGTTAG 39PA # 6/60 ATACCAGCTTATTCAATTACGATGTAGTCCGACTCCAACTGATGATTGTTACGCCGCCACAATCGTAATCAGTTAG 39
PA#10/64 ATACCAGCTTATTCAATTGGACGCCGACTAACTTACGATTGCTAGATAACTGTTTCCACAATCGTAATCAGTTAG 40PA # 10/64 ATACCAGCTTATTCAATTGGACGCCGACTAACTTACGATTGCTAGATAACTGTTTCCACAATCGTAATCAGTTAG 40
15 PA#10/65 ATACCAGCTTATTCAATTACCGATTTAGACGATCCATACAGTCTGATTAACGTGTTGCACAATCGTAATCAGTTAG 4115 PA # 10/65 ATACCAGCTTATTCAATTACCGATTTAGACGATCCATACAGTCTGATTAACGTGTTGCACAATCGTAATCAGTTAG 41
PA#10/66 ATACCAGCTTATTCAATTACGATGCCAGCCGAAACTCAGATTACGTTCTTGACCGTGGACAATCGTAATCAGTTAG 42PA # 10/66 ATACCAGCTTATTCAATTACGATGCCAGCCGAAACTCAGATTACGTTCTTGACCGTGGACAATCGTAATCAGTTAG 42
PA#10/68 ATACCAGCTTATTCAATTACGATGTAGCCGTTCCCTTTACGATGTGCACCGACTAACCACAATCGTAATCAGTTAG 43PA # 10/68 ATACCAGCTTATTCAATTACGATGTAGCCGTTCCCTTTACGATGTGCACCGACTAACCACAATCGTAATCAGTTAG 43
PA#10/69 ATACCAGCTTATTCAATTGGGTACGAGATAGCCGTCTTTCGATCTGAGTCCATTGGATACAATCGTAATCAGTTAG 44PA # 10/69 ATACCAGCTTATTCAATTGGGTACGAGATAGCCGTCTTTCGATCTGAGTCCATTGGATACAATCGTAATCAGTTAG 44
PA#10/72 ATACCAGCTTATTCAATTCCAACTGCACGATGTAGCCGGACCTCTAATGATTACCTGTACAATCGTAATCAGTTAG 45PA # 10/72 ATACCAGCTTATTCAATTCCAACTGCACGATGTAGCCGGACCTCTAATGATTACCTGTACAATCGTAATCAGTTAG 45
20 PA#10/74 ATACCAGCTTATTCAATTGTACGCCGACTGACTGAGAAATGTGCTTGAGTTCGCATCGACAATCGTAATCAGTTAG 4620 PA # 10/74 ATACCAGCTTATTCAATTGTACGCCGACTGACTGAGAAATGTGCTTGAGTTCGCATCGACAATCGTAATCAGTTAG 46
PA#10/77 ATACCAGCTTATTCAATTGGAGCCGAACTGTCTGAGTAGTGTTGACATTCTTCTACGTACAATCGTAATCAGTTAG 47PA # 10/77 ATACCAGCTTATTCAATTGGAGCCGAACTGTCTGAGTAGTGTTGACATTCTTCTACGTACAATCGTAATCAGTTAG 47
PA#10/78 ATACCAGCTTATTCAATTACCGAGACGTGGAACCGATTGTTGCCGCACTGATTATTCCACAATCGTAATCAGTTAG 48
PA # 10/78 ATACCAGCTTATTCAATTACCGAGACGTGGAACCATTGTTGCCGCACTGATTATTCCACAATCGTAATCAGTTAG 48
PA#10/79 ATACCAGCTTATTCAATTGGAGACGACCCGAACTGACTATGTAGAATGTGTCCGACCCACAATCGTAATCAGTTAG 49PA # 10/79 ATACCAGCTTATTCAATTGGAGACGACCCGAACTGACTATGTAGAATGTGTCCGACCCACAATCGTAATCAGTTAG 49
PA#1 0/80 ATACCAGCTTATTCAATTGTAGACGACGAACTGTTATGACATTTTTTCTTGTCCTCACACAATCGTAATCAGTTAG 50PA # 1 0/80 ATACCAGCTTATTCAATTGTAGACGACGAACTGTTATGACATTTTTTCTTGTCCTCACACAATCGTAATCAGTTAG 50
PA#1 4/84 ATACCAGCTTATTCAATTCCAATGATCGATTGTTGCCCTGATTGATGGTTGTTGTCGTACAATCGTAATCAGTTAG 51PA # 1 4/84 ATACCAGCTTATTCAATTCCAATGATCGATTGTTGCCCTGATTGATGGTTGTTGTCGTACAATCGTAATCAGTTAG 51
PA#1 4/85 ATACCAGCTTATTCAATTGGACGCCGACTAACTTAAGCGATTTGGCCCACTCATCTCGACAATCGTAATCAGTTAG 52PA # 1 4/85 ATACCAGCTTATTCAATTGGACGCCGACTAACTTAAGCGATTTGGCCCACTCATCTCGACAATCGTAATCAGTTAG 52
PA#1 4/86 ATACCAGCTTATTCAATTGGAGACGCTAACATGATGCTACGAAGGTGTGAATCGGTGCACAATCGTAATCAGTTAG 53PA # 1 4/86 ATACCAGCTTATTCAATTGGAGACGCTAACATGATGCTACGAAGGTGTGAATCGGTGCACAATCGTAATCAGTTAG 53
PA#1 4/89 ATACCAGCTTATTCAATTGGGCACCACGGGAGTCGGCCACATTTGGAGTTGTTTTTGCACAATCGTAATCAGTTAG 54PA # 1 4/89 ATACCAGCTTATTCAATTGGGCACCACGGGAGTCGGCCACATTTGGAGTTGTTTTTGCACAATCGTAATCAGTTAG 54
PA#1 4/91 ATACCAGCTTATTCAATTCGAGTGTGGCCGCCAACTGAGCTTGTTAGTGTCCTCTTGTACAATCGTAATCAGTTAG 55PA # 1 4/91 ATACCAGCTTATTCAATTCGAGTGTGGCCGCCAACTGAGCTTGTTAGTGTCCTCTTGTACAATCGTAATCAGTTAG 55
PA#1 4/93 ATACCAGCTTATTCAATTGTAGACGACGACTGTACGTTGACCTGCTAACCACTTCTGGACAATCGTAATCAGTT 56PA # 1 4/93 ATACCAGCTTATTCAATTGTAGACGACGACTGTACGTTGACCTGCTAACCACTTCTGGACAATCGTAATCAGTT 56
PA#1 4/94 ATACCAGCTTATTCAATTGCACCAGTGGAAAGATTGTAGCCGTTCCTCCTGATTATGCACAATCGTAATCAGTTAG 57PA # 1 4/94 ATACCAGCTTATTCAATTGCACCAGTGGAAAGATTGTAGCCGTTCCTCCTGATTATGCACAATCGTAATCAGTTAG 57
10 PA#1 4/95 ATACCAGCTTATTCAATTGCACGGTGGGAGATTGTAGCCCCTCTTTTTTTTTGCCTGTACAATCGTAATCAGTTAG 5810 PA # 1 4/95 ATACCAGCTTATTCAATTGCACGGTGGGAGATTGTAGCCCCTCTTTTTTTTTTGCCTGTACAATCGTAATCAGTTAG 58
PA#1 4/97 ATACCAGCTTATTCAATTGTAGACGACCACCTGATTAACTTTGGCCGGGCCCTTTTGTACAATCGTAATCAGTTAG 59PA # 1 4/97 ATACCAGCTTATTCAATTGTAGACGACCACCTGATTAACTTTGGCCGGGCCCTTTTGTACAATCGTAATCAGTTAG 59
00 00
PA#1 4/99 ATACCAGCTTATTCAATTACGATCCTTGTAGCCCAGCGCACTGATCACGCTTGTGACCACAATCGTAATCAGTTAG 60 PA # 1 4/99 ATACCAGCTTATTCAATTACGATCCTTGTAGCCCAGCGCACTGATCACGCTTGTGACCACAATCGTAATCAGTTAG 60
PA#1 4/100 ATACCAGCTTATTCAATTGTAGACGACGCAATATAATGATTAGTTGGCACGACCCTGCACAATCGTAATCAGTTAG 61
PA # 1 4/100 ATACCAGCTTATTCAATTGTAGACGACGCAATATAATGATTAGTTGGCACGACCCTGCACAATCGTAATCAGTTAG 61
Tabelle 2 Table 2
Vergleichende Sequenzanalysen wurden mittels ClustalW2, einem Multiple Sequence Alignment Tool (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/), durchgeführt. Comparative sequence analyzes were performed using ClustalW2, a Multiple Sequence Alignment Tool (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/).
Die Analyse der Sekundärstruktur einiger Aptamer-Klone erfolgte mittels des Internet- Tools „The mfold Web Server" (http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold), einer frei verfügbaren Software zur Faltung von Nukleinsäuren, die auf einem Energie- Minimierungs-Algorithmus beruht. Das Aptamer PA#2/8 (SEQ ID NO: 1 ) fällt aufgrund seiner G-reichen Sequenz auf, welche die Faltung zu einer G-Quartett-Struktur vermuten lässt: The secondary structure of some aptamer clones was analyzed by means of the Internet tool "The mfold Web Server" (http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold), a freely available software for the folding of nucleic acids on The aptamer PA # 2/8 (SEQ ID NO: 1) stands out for its G-rich sequence, which suggests folding into a G-quartet structure:
PA#2/8 AGC AAC AT GAGGGGGAT AGAGGGGGTGGGT T C T C TCGGC T PA # 2/8 AGC AAC AT GAGGGGGAT AGAGGGGGTGGGT T C T C TCGGC T
Eine mögliche Sekundärstruktur von Aptamer PA#2/8 (SEQ ID NO: 1 ) ist der Fig. 2 gezeigt. A possible secondary structure of aptamer PA # 2/8 (SEQ ID NO: 1) is shown in FIG.
BEISPIEL 4: Bindungstests EXAMPLE 4: Binding Tests
Aptamer-Klone mit unterschiedlicher Sequenz werden auf ihre individuelle Bindungsfähigkeit zum Selektionstarget (biotinyliertes Protein A, immobilisiert an Streptavidin-funktionalisierte Magnetic Beads) untersucht. Die Bindungsversuche werden
entsprechend den SELEX-Bedingungen durchgeführt. Für jeden Versuch kommen 2,5- 3χ 107 Target-modifizierte Magnetic Beads und ~55pmol Fluorescein-markierte Aptamer- ssDNA in Bindungspuffer (1 00mM NaCI, 20mM Tris-HCI, pH 7.6, 1 0mM MgCI2, 5mM KCl, 1 mM CaCI2) und in einem Bindungsvolumen von 250μΙ zum Einsatz. Die Target- modifizierte Magnetic Beads werden vor der Verwendung mehrmals in Bindungspuffer gewaschen und die Aptamer-ssDNA wird thermisch equilibriert durch Inkubation bei 90 °C für 8min, auf Eis für 10min und bei RT für ~5min. Anschließend werden die vorbereitete Aptamer-ssDNA und die gewaschenen Target-modifizierten Magnetic Beads zur Bindung zusammengegeben für 30min bei 21 °C unter Schütteln. Die ungebundene ssDNA wird entfernt und die Bindungskomplexe mehrmals in Bindungspuffer gewaschen. Danach erfolgt die Elution der Target-gebundenen ssDNA mittels Hitze durch Inkubation der Bindungskomplexe in Bindungspuffer bei 95 °C für 10min unter Schütteln. Diese Elutionsprozedur wird insgesamt zweimal durchgeführt. Aufgrund der Fluoresceinmarkierung der Aptamer-ssDNA und mittels einer Kalibrierkurve kann die Menge der eluierten ssDNA quantifiziert werden. Diese entspricht der Menge an Targetgebundenem Aptamer im Bindungsversuch. Aptamer clones with different sequence are examined for their individual binding ability to the selection target (biotinylated protein A immobilized on streptavidin-functionalized magnetic beads). The binding attempts are carried out according to the SELEX conditions. For each experiment come 2,5- χ 3 10 7 Target-modified magnetic beads and ~ 55pmol fluorescein-labeled aptamer ssDNA in binding buffer (1 00mm NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.6, 1 0mm MgCl 2, 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2 ) and in a binding volume of 250μΙ used. The target-modified magnetic beads are washed several times in binding buffer prior to use and the aptamer ssDNA is thermally equilibrated by incubation at 90 ° C for 8 min, on ice for 10 min and at RT for ~ 5 min. Subsequently, the prepared aptamer ssDNA and the washed target-modified magnetic beads are combined for binding for 30 min at 21 ° C with shaking. The unbound ssDNA is removed and the binding complexes are washed several times in binding buffer. Thereafter, the elution of the target-bound ssDNA is carried out by heat by incubation of the binding complexes in binding buffer at 95 ° C for 10 min with shaking. This elution procedure is performed twice in total. Due to the fluorescein labeling of the aptamer ssDNA and a calibration curve, the amount of eluted ssDNA can be quantified. This corresponds to the amount of target-bound aptamer in the binding experiment.
BEISPIEL 5: Aufbau eines Biosensors und Durchführung eines Nachweises auf Protein A EXAMPLE 5: Construction of a biosensor and detection of protein A
Bezugszeichenliste zu Fig. 3: List of reference numerals to FIG. 3:
1 Sensorchip (Glaschip) 1 sensor chip (glass chip)
2 Goldfilm 2 gold film
3 Flusszelle 3 flow cell
4 Probelösung 4 sample solution
5 Target 5 target
6 Lichtquelle 6 light source
7 Prisma 7 prism
8 Detektor 8 detector
9 Aptamer 9 aptamer
L monochromatisches polarisiertes Licht L monochromatic polarized light
R reflektiertes Licht R reflected light
Das Biacore®-System ist ein kommerziell erhältliches Biosensor-System, welches den markierungsfreien Nachweis von biomolekularen Wechselwirkungen in Echtzeit
ermöglicht und dafür das physikalische Prinzip der Oberflächenplasmonenresonanz- Spektroskopie (Surface Plasmon Resonance, SPR) nutzt, wie in der Fig. 3 dargestellt. Der Biosensorchip des Biacore-Systems besteht aus einem Glaschip 1 , der mit einem dünnen Goldfilm 2 beschichtet ist und die Sensoroberfläche darstellt. Eine spezielle Funktionalisierung dieser Sensoroberfläche, beispielsweise mit Carboxymethyldextran (CM), erlaubt die kovalente Immobilisierung der biologischen Rezeptormoleküle. Im Falle der Aptamere 9 wird bevorzugt das Biotin-Streptavidin-Kopplungssystem genutzt, um die biotinylierten Aptamere auf die Streptavidin-beschichtete Sensoroberfläche des Biosensorchips zu immobilisieren. Die anschließende Interaktion zwischen Target und Aptamer findet in einer Flusszelle 3 statt, wobei durch ein integriertes, kontinuierliches Flusssystem die Probelösung 4 mit Target 5 über die Sensoroberfläche geleitet wird. Die optische Detektionseinheit des Biacore-Systems besteht aus einer Lichtquelle 6 (Leuchtdioden), einem Prisma 7 und einem Detektor 8 (Diodenarray-Detektor). Monochromatisches, polarisiertes Licht L wird unter den Bedingungen der Totalreflexion von einem Medium mit hohem Brechungsindex (Sensorchip mit Goldfilm) in ein Medium mit niedrigem Brechungsindex (Sensorschicht, Pufferlösung) eingestrahlt. Dabei tritt bei einem bestimmten Einfallswinkel eine Abschwächung des reflektierten Lichtes R auf. Dieser Winkel, der Resonanzwinkel, reagiert sehr sensitiv auf Veränderungen des Brechungsindexes der Sensorschicht. Die Anbindung des Targets 5 an das immobilisierte Aptamer 9 auf der Sensoroberfläche resultiert in einem Massezuwachs in der Sensorschicht, welcher zu einer Änderung des Brechungsindexes dieser Schicht und damit zu einer Verschiebung des Resonanzwinkels führt. Diese Änderungen werden als messbares Signal, ausgedrückt in Resonanz-Einheiten (RU), ausgegeben und sind proportional zu der Menge an gebundenem Target 5 auf der Sensoroberfläche. Während der Bindungsanalyse werden die Änderungen des Resonanzwinkels kontinuierlich aufgezeichnet und aufgetragen gegen die Zeit als Sensorgramm dargestellt, das in der Fig. 4 schematisch dargestellt ist. Im Abschnitt II der Signalkurve ist eine Verschiebung des Resonanzwinkels durch die Anbindung von Target an das immobilisierte Aptamer erkennbar. Die Verschiebung des Resonanzwinkels ist auch in der Fig. 3 gezeigt, anhand eines mit„I" und eines mit„II" bezeichneten reflektierten Lichtstrahles. The Biacore® system is a commercially available biosensor system that provides label-free detection of biomolecular interactions in real time and utilizes the physical principle of surface plasmon resonance (SPR) spectroscopy, as shown in FIG. The biosensor chip of the Biacore system consists of a glass chip 1, which is coated with a thin gold film 2 and represents the sensor surface. A special functionalization of this sensor surface, for example with carboxymethyldextran (CM), allows the covalent immobilization of the biological receptor molecules. In the case of aptamer 9, the biotin-streptavidin coupling system is preferably used to immobilize the biotinylated aptamers on the streptavidin-coated sensor surface of the biosensor chip. The subsequent interaction between target and aptamer takes place in a flow cell 3, wherein the sample solution 4 with target 5 is passed over the sensor surface by means of an integrated, continuous flow system. The optical detection unit of the Biacore system consists of a light source 6 (light emitting diodes), a prism 7 and a detector 8 (diode array detector). Monochromatic polarized light L is irradiated under the conditions of total reflection from a high refractive index medium (sensor chip with gold film) into a low refractive index medium (sensor layer, buffer solution). At a certain angle of incidence, a weakening of the reflected light R occurs. This angle, the resonance angle, reacts very sensitively to changes in the refractive index of the sensor layer. The binding of the target 5 to the immobilized aptamer 9 on the sensor surface results in a mass increase in the sensor layer, which leads to a change in the refractive index of this layer and thus to a shift of the resonance angle. These changes are output as a measurable signal, expressed in units of resonance (RU), and are proportional to the amount of bound target 5 on the sensor surface. During bond analysis, the changes in resonance angle are recorded continuously and plotted against time as a sensorgram, which is shown schematically in FIG. In section II of the signal curve, a shift of the resonance angle is recognizable by the binding of target to the immobilized aptamer. The displacement of the resonance angle is also shown in FIG. 3, by means of a reflected light beam denoted by "I" and by "II".
Der Aptamer-Target-Komplex kann unter geeigneten Pufferbedingungen wieder gelöst werden, so dass die Sensoroberfläche regeneriert wird und für eine erneute Bindung mit Targetmolekülen zu Verfügung steht.
An der Oberfläche des oben beschriebenen Biosensors wird ein erfindungsgemäßes Aptamer immobilisiert. Eine Lösung von Protein A wird über die Sensoroberfläche geleitet, wobei Protein A an das Aptamer bindet. Die Anbindung von Protein A wird als The aptamer-target complex can be redissolved under suitable buffer conditions so that the sensor surface is regenerated and available for re-binding with target molecules. An aptamer according to the invention is immobilized on the surface of the biosensor described above. A solution of protein A is passed over the sensor surface, with protein A binding to the aptamer. The attachment of protein A is called
Verschiebung des Resonanzwinkels detektiert. Displacement of the resonance angle detected.
BEISPIEL 6: Bindungstests mit trunkierten Aptameren EXAMPLE 6: Binding Assays with Truncated Aptamers
Hergestellt wurden die in Tabelle 3 gezeigten trunkierten Varianten des Aptamers PA#2/8 (SEQ ID NO: 1 ). Dem Aptamer PA#2/8[S19-76] (SEQ ID NO: 69) fehlt die 5'-Primerregion und dem PA#2/8[S1 -58] (SEQ ID NO: 70) fehlt die 3'-Primerregion. Das PA#2/8KR40 (SEQ ID NO: 71 ) ist die Kernregion (core), ohne 5'-Primerregion und ohne 3'- Primerregion. Die Bindungsversuche wurden entsprechend den SELEX-Bedingungen durchgeführt. Für jeden Versuch kamen 2,5-3χ 1 07 Target-modifizierte Magnetic Beads und ~55pmol Fluorescein-markierte Aptamer-ssDNA in Bindungspuffer (1 00mM NaCI, 20mM Tris-HCI, pH 7.6, 10mM MgCI2, 5mM KCl, 1 mM CaCI2) zum Einsatz. Die Präparation Targetmodifizierter Magnetic Beads erfolgte im Vorfeld der Bindungsversuche, wobei Dynabeads® M-280 Streptavidin (Invitrogen, UK) verwendet wurden, um natives, biotinyliertes Protein A von Staphylococcus aureus (P21 65, Sigma-Aldrich, Germany) zu immobilisieren. Vor jeder Bindungsreaktion wurden die Target-modifizierten Magnetic Beads mehrmals in Bindungspuffer gewaschen und die Aptamer-ssDNA thermisch equilibriert durch Inkubation bei 90 °C für 8min, auf Eis für 1 0min und anschließend überführt auf RT für ~5min. Die vorbereitete Aptamer-ssDNA und die gewaschenen Target-modifizierten Magnetic Beads wurden dann zur Bindung zusammengegeben und für 30min bei 21 °C unter Schütteln inkubiert. Die ungebundene ssDNA wurde entfernt und die Bindungskomplexe mehrmals in Bindungspuffer gewaschen. Danach erfolgte die Elution der Target-gebundenen ssDNA mittels Hitze durch Inkubation der Bindungskomplexe in Bindungspuffer bei 95 °C für 10min unter Schütteln. Diese Elutionsprozedur wurde insgesamt zweimal durchgeführt. Aufgrund der Fluoresceinmarkierung der Aptamer-ssDNA und mittels einer Kalibrierkurve konnte die Menge der eluierten ssDNA quantifiziert werden. Diese entspricht der Menge an Targetgebundenem Aptamer im Bindungsversuch.
Die Fig. 5 zeigt die Ergebnisse der beadbasierten Bindungsversuche mit dem Aptamer PA#2/8 und seinen Verkürzten Varianten im Vergleich zur unselektierten SELEX- Bibliothek als Negativkontrolle. Das Original-Aptamer PA#2/8 besitzt eine sehr gute Bindungsfähigkeit an Protein A-modifizierte Magnetic Beads. Nach Entfernen der 3'- Primerregion (Variante PA#2/8[S1 -58]) bleibt diese Bindungsfähigkeit erhalten und konnte sogar verbessert werden. Das Entfernen der 5'-Primerregion (Variante PA#2/8[S 19-76]) führte dagegen zu einem vollständigen Verlust der Bindungsfähigkeit des Aptamers. Das gleiche negative Ergebnis zeigte auch die Variante ohne beide Primerregionen (PA#2/8KR40). Daraus lässt sich bisher schließen, dass das Aptamer PA#2/8 verkürzt werden kann und die Kernregion zusammen mit der 5'-Primerregion für die Bindungsfähigkeit des Aptamers eine wichtige Rolle spielen.
The truncated variants of the aptamer PA # 2/8 shown in Table 3 (SEQ ID NO: 1) were prepared. The aptamer PA # 2/8 [S19-76] (SEQ ID NO: 69) lacks the 5 'primer region and PA # 2/8 [S1 -58] (SEQ ID NO: 70) lacks the 3' primer region , The PA # 2 / 8KR40 (SEQ ID NO: 71) is the core region, without the 5 'primer region and without the 3' primer region. The binding experiments were carried out according to the SELEX conditions. For each experiment, 2.5-3 χ 1 0 7 target-modified magnetic beads and ~ 55 pmol fluorescein-labeled aptamer ssDNA in binding buffer (100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.6, 10 mM MgCl 2 , 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2 ) are used. Target-modified magnetic beads were prepared in advance of the binding experiments using Dynabeads® M-280 streptavidin (Invitrogen, UK) to immobilize native, biotinylated protein A of Staphylococcus aureus (P21 65, Sigma-Aldrich, Germany). Prior to each binding reaction, the target-modified magnetic beads were washed several times in binding buffer and the aptamer ssDNA thermally equilibrated by incubation at 90 ° C for 8 min, on ice for 10 min and then transferred to RT for ~5 min. The prepared aptamer ssDNA and the washed target-modified magnetic beads were then combined for binding and incubated for 30 min at 21 ° C with shaking. The unbound ssDNA was removed and the binding complexes washed several times in binding buffer. Thereafter, the elution of the target-bound ssDNA was carried out by heat by incubation of the binding complexes in binding buffer at 95 ° C for 10 min with shaking. This elution procedure was performed twice in total. Due to the fluorescein labeling of the aptamer ssDNA and a calibration curve, the amount of ssDNA eluted could be quantified. This corresponds to the amount of target-bound aptamer in the binding experiment. FIG. 5 shows the results of the bead-based binding experiments with the aptamer PA # 2/8 and its truncated variants in comparison to the unselected SELEX library as a negative control. The original aptamer PA # 2/8 has a very good binding ability to protein A-modified magnetic beads. After removal of the 3 'primer region (variant PA # 2/8 [S1 -58]) this binding ability is retained and could even be improved. On the other hand, removal of the 5 'primer region (variant PA # 2/8 [S 19-76]) resulted in a complete loss of the binding ability of the aptamer. The same negative result was also shown by the variant without both primer regions (PA # 2 / 8KR40). It can thus be concluded that the aptamer PA # 2/8 can be shortened and the core region together with the 5 'primer region play an important role in the binding ability of the aptamer.
Tabelle 3 Table 3
Aptamer- Aptamersequenz (5' -» 3') SEQ Aptamer aptamer sequence (5 '-> 3') SEQ
Nr. ID NO No. ID NO
PA#2/8 ATACCAGCTTATTCAATTAGCAACATGAGGGGGATAGAGGGGGTGGGTTCTCTCGGCTACAATCGTAATCAGTTAG 7 PA # 2/8 ATACCAGCTTATTCAATTAGCAACATGAGGGGGATAGAGGGGGTGGGTTCTCTCGGCTACAATCGTAATCAGTTAG 7
Trunkierte Varianten Truncated variants
PA#2/8[S 19-76] AGCAACATGAGGGGGATAGAGGGGGTGGGTTCTCTCGGCTACAATCGTAATCAGTTAG 69 5 PA # 2/8 [S 19-76] AGCAACATGAGGGGGATAGAGGGGGTGGGTTCTCTCGGCTACAATCGTAATCAGTTAG 69 5
PA#2/8[S1 -58] ATACCAGCTTATTCAATTAGCAACATGAGGGGGATAGAGGGGGTGGGTTCTCTCGGCT 70 5 PA # 2/8 [S1 -58] ATACCAGCTTATTCAATTAGCAACATGAGGGGGATAGAGGGGGTGGGTTCTCTCGGCT 70 5
PA#2/8KR40 AGCAACATGAGGGGGATAGAGGGGGTGGGTTCTCTCGGCT 71 4
PA # 2 / 8KR40 AGCAACATGAGGGGGATAGAGGGGGTGGGTTCTCTCGGCT 71 4
BEISPIEL 7: Markierungsfreie Bindungsversuche mit einem Biosensor EXAMPLE 7: Label-free binding experiments with a biosensor
Das Biacore X100 - System ist ein kommerziell erhältliches Biosensor-System (GE Healthcare, Schweden), welches den markierungsfreien Nachweis von biomolekularen Wechselwirkungen in Echtzeit ermöglicht und dafür das physikalische Prinzip der Oberflächenplasmonenresonanz-Spektroskopie (Surface Plasmon Resonance, SPR) nutzt. Für die hier dargestellten Versuche wurde der Biotin CAPture Kit mit dem Sensorchip CAP verwendet, der die Herstellung einer Streptavidin-beschichteten Sensoroberfläche ermöglicht. Auf diese Weise kann das Biotin-Streptavidin- Kopplungssystem genutzt werden, um biotinylierte Aptamere auf der Sensoroberfläche zu immobilisieren. Für die Interaktionsanalysen zwischen Aptamer und Target wird die Targetlösung durch ein integriertes, kontinuierliches Flusssystem über die Sensoroberfläche geleitet. Die Anbindung des Targets an das immobilisierte Aptamer auf der Sensoroberfläche resultiert in einem Massezuwachs in der Sensorschicht, welcher zu einer Änderung des Brechungsindexes dieser Schicht und damit zu einer Verschiebung des Resonanzwinkels führt. Diese Änderungen werden als messbares Signal, ausgedrückt in Resonanz-Einheiten (RU), ausgegeben und sind proportional zu der Menge an gebundenem Target auf der Sensoroberfläche. In den hier dargestellten Versuchen wurde unspezifische ssDNA (SELEX-Bibliothek, 3'-biotinyliert) in der Referenzzelle und ssDNA des Aptamers PA#2/8 (3'-biotinyliert) in der Messzelle immobilisiert. Die Targetlösung, bestehend aus rekombinantem Protein A (P7837, Sigma- Aldrich, Germany) bzw. nativem Protein A (P3838, Sigma-Aldrich, Germany) in Bindungspuffer (100mM NaCI, 20mM Tris-HCI, pH 7.6, 10mM MgCI2, 5mM KCl, 1 mM CaCI2) mit 0,005% SP20, wurde bei einer Flussrate von Ι ΟμΙ/min über die präparierten Sensoroberflächen geleitet. Die Interaktion zwischen Aptamer und Target fand während einer Bindungsphase von 300s statt, anschließend erfolgte eine Dissoziationsphase von ebenfalls 300s. Als Laufpuffer wurde Bindungspuffer mit 0,005% SP20 verwendet. Die Sensorgramme (Fig. 6, 8) zeigen den doppelt-referenzierten Signalverlauf (Messzelle minus Referenzzelle und Pufferreferenzierung) während der Bindungs- und Dissoziationsphase bei unterschiedlichen Targetkonzentrationen in einem Bereich von 10nM - 5000nM Protein A. Während einer solchen Messreihe wurde zur Kontrolle die 1000nM - Konzentration von Protein A 3 mal vermessen. Nach jeder Bindung/Dissoziation wurde die Sensoroberfläche regeneriert. Die Sensorgramme (Fig. 6, 8) zeigen au ßerdem neben den experimentellen Daten auch den Fit dieser Daten als Overlay. Dabei wurde sichtbar, dass die Interaktion zwischen Aptamer (Ligand) und
Target (Analyt) nicht einer 1 :1 - Bindung folgt, sondern einer bivalenten Analyt-Bindung entspricht. Dies weist darauf hin, dass das Protein A zwei oder mehrere Bindungsstellen für das Aptamer besitzt. Aus den Bindungsdaten zum Ende jeder Bindungsphase mit den unterschiedlichen Protein A - Konzentrationen wurde eine Sättigungskurve erstellt (Fig. 7, 9) und aus dieser die Steady State - Affinität des Aptamers PA#2/8 zum Protein A berechnet. Die berechnete Affinität entspricht hier eher der Avidität, da es sich bei dem vorliegenden Versuchsaufbau um eine bivalente Bindung von Protein A an die immobilisierten Aptamere handelt. Für die Bindung zwischen rekombinantem (Fig. 6-7) bzw. nativem (Fig. 8-9) Protein A und dem Aptamer PA#2/8 wurde eine Avidität von 1 88nM +1-22 bzw. 75,3nM +/-6, 1 ermittelt.
The Biacore X100 system is a commercially available biosensor system (GE Healthcare, Sweden) that enables label-free detection of biomolecular interactions in real-time using the physical principle of surface plasmon resonance (SPR) spectroscopy. For the experiments presented here, the Biotin CAPture Kit with the sensor chip CAP was used, which enables the production of a streptavidin-coated sensor surface. In this way, the biotin-streptavidin coupling system can be used to immobilize biotinylated aptamers on the sensor surface. For the interaction analyzes between aptamer and target, the target solution is passed through the sensor surface through an integrated, continuous flow system. The binding of the target to the immobilized aptamer on the sensor surface results in a mass increase in the sensor layer, which leads to a change in the refractive index of this layer and thus to a shift in the resonance angle. These changes are output as a measurable signal expressed in units of resonance (RU) and are proportional to the amount of bound target on the sensor surface. In the experiments presented here nonspecific ssDNA (SELEX library, 3'-biotinylated) in the reference cell and ssDNA of the aptamer PA # 2/8 (3'-biotinylated) were immobilized in the measuring cell. The target solution consisting of recombinant protein A (P7837, Sigma-Aldrich, Germany) or native protein A (P3838, Sigma-Aldrich, Germany) in binding buffer (100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.6, 10 mM MgCl 2 , 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2 ) with 0.005% SP20 was passed over the prepared sensor surfaces at a flow rate of Ι ΟμΙ / min. The interaction between aptamer and target took place during a binding phase of 300s, followed by a dissociation phase of 300s. The running buffer used was binding buffer with 0.005% SP20. The sensorgrams (FIGS. 6, 8) show the doubly-referenced signal course (measuring cell minus reference cell and buffer referencing) during the binding and dissociation phase at different target concentrations in a range from 10 nM to 5000 nM protein A. During such a series of measurements, the control was 1000 nM - Measure concentration of protein A 3 times. After each binding / dissociation, the sensor surface was regenerated. In addition to the experimental data, the sensorgrams (FIGS. 6, 8) also show the fit of this data as an overlay. It became visible that the interaction between aptamer (ligand) and Target (analyte) does not follow a 1: 1 binding but corresponds to a bivalent analyte binding. This indicates that the protein A has two or more binding sites for the aptamer. From the binding data at the end of each binding phase with the different protein A concentrations, a saturation curve was created (FIGS. 7, 9) and from this the steady state affinity of the aptamer PA # 2/8 for protein A was calculated. The calculated affinity corresponds here rather to avidity, since the present experimental setup is a bivalent binding of protein A to the immobilized aptamers. For binding between recombinant (Fig. 6-7) and native (Fig. 8-9) protein A and the aptamer PA # 2/8 an avidity of 1 88nM + 1-22 and 75.3nM, respectively +/- 6, 1 determined.
Claims
1 . Aptamer, das an Immunoglobulin bindende Zellwandproteine, an Substanzen, die ein Immunoglobulin bindendes Zellwandprotein enthalten, und an Mikroorganismen, die ein Immunoglobulin bindendes Zellwandprotein enthalten, bindet, 1 . Aptamer which binds to immunoglobulin-binding cell wall proteins, to substances containing an immunoglobulin-binding cell wall protein, and to microorganisms containing an immunoglobulin-binding cell wall protein.
wobei das Immunoglobulin bindende Zellwandprotein ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Protein A, G oder L. wherein the immunoglobulin-binding cell wall protein is selected from the group comprising protein A, G or L.
2. Aptamer nach Anspruch 1 , das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 2. Aptamer according to claim 1, which is selected from the group consisting of
a) einem Aptamer umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 62, 1 -4, 63, 5-8, 64, 9, 10, 65, 1 1 , 12 und 13- 61 , mit der Maßgabe, dass Thymin durch Uracil ersetzt sein kann, a) an aptamer comprising a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 62, 1-4, 63, 5-8, 64, 9, 10, 65, 11, 12 and 13-61, with with the proviso that thymine can be replaced by uracil,
b) einem Aptamer, dessen Nukleinsäuresequenz eine Identität von mindestens 70% mit der Nukleinsäuresequenz eines Aptamers aus a) aufweist, b) an aptamer whose nucleic acid sequence has an identity of at least 70% with the nucleic acid sequence of an aptamer from a),
c) einem Aptamer, das mit dem komplementären Strang eines Aptamers aus a) hybridisiert, c) an aptamer which hybridizes with the complementary strand of an aptamer from a),
d) einem Aptamer bei dem gegenüber einem Aptamer aus a) ein oder mehrere d) an aptamer with respect to an aptamer from a) one or more
Nukleotide substituiert, deletiert, insertiert und/oder angefügt sind Nucleotides are substituted, deleted, inserted and / or attached
e) einem Fragment eines Aptamers nach a), b), c) oder d), und e) a fragment of an aptamer according to a), b), c) or d), and
f) einem Derivat eines Aptamers nach a), b), c), d) oder e). f) a derivative of an aptamer according to a), b), c), d) or e).
3. Arzneimittel, insbesondere zur Diagnose, Prophylaxe und/oder Behandlung von Erkrankungen, die auf Staphylococcus aureus, Streptococcus oder 3. Medicaments, in particular for the diagnosis, prophylaxis and / or treatment of diseases which are related to Staphylococcus aureus, Streptococcus or
Peptostreptococcus zurückzuführen sind, umfassend ein oder mehrere verschiedene Aptamere wie in einem der Ansprüche 1 oder 2 beschrieben. Peptostreptococcus comprising one or more different aptamers as described in any one of claims 1 or 2.
4. Aptamersonde zur Detektion von Protein A, G oder L, Protein A, G oder L 4. Aptamer probe for the detection of protein A, G or L, protein A, G or L.
enthaltenden Substanzen oder Protein A, G oder L enthaltenden Mikroorganismen, insbesondere Staphylococcus aureus, Streptococcus oder Peptostreptococcus, umfassend ein oder mehrere verschiedene Aptamere wie in einem der Ansprüche 1 oder 2 beschrieben und ein Markierungsmittel. containing substances or protein A, G or L-containing microorganisms, in particular Staphylococcus aureus, Streptococcus or Peptostreptococcus, comprising one or more different aptamers as described in one of claims 1 or 2 and a labeling agent.
5. Biosensor, aufweisend ein oder mehrere verschiedene Aptamere wie in einem der Ansprüche 1 oder 2 beschrieben. A biosensor comprising one or more different aptamers as described in any of claims 1 or 2.
6. Feste Phase, insbesondere zur Verwendung beim Nachweis, Anreicherung, 6. Solid phase, in particular for use in detection, enrichment,
Abtrennung und/oder Isolierung von Protein A, G oder L, Protein A, G oder L enthaltenden Substanzen oder Protein A, G oder L enthaltenden Mikroorganismen, an die ein oder mehrere verschiedene Aptamere nach einem der Ansprüche 1 oder 2 immobilisiert ist/sind. Separation and / or isolation of protein A, G or L, protein A, G or L-containing microorganisms or protein A, G or L-containing microorganisms to which one or more different aptamers according to any one of claims 1 or 2 is / are immobilized.
7. Teststreifen, insbesondere zur Verwendung in Lateralfluss-Assays, der ein oder mehrere verschiedene Aptamere nach einem der Ansprüche 1 oder 2 enthält. 7. Test strip, in particular for use in lateral flow assays, containing one or more different aptamers according to any one of claims 1 or 2.
8. Lateralfluss-Assay-Vorrichtung, die einen Teststreifen nach Anspruch 7 aufweist. 8. Lateral flow assay device comprising a test strip according to claim 7.
9. Kit, umfassend ein oder mehrere verschiedene Aptamere wie in einem der Ansprüche 1 oder 2 beschrieben. A kit comprising one or more different aptamers as described in any of claims 1 or 2.
10. Messgerät zum Nachweis von Protein A, G oder L, Protein A, G oder L enthaltenden Substanzen oder Protein A, G oder L enthaltenden Mikroorganismen, aufweisend ein oder mehrere verschiedene Aptamere nach Anspruch 1 oder 2, eine Aptamersonde nach Anspruch 4, einen Biosensor nach Anspruch 5 oder einen Teststreifen nach Anspruch 7. 10. A measuring device for the detection of protein A, G or L, protein A, G or L-containing microorganisms or protein A, G or L containing microorganisms, comprising one or more different aptamers according to claim 1 or 2, an apta probe according to claim 4, a Biosensor according to claim 5 or a test strip according to claim 7.
1 1 . Verwendung des Aptamers wie in einem der Ansprüche 1 oder 2 beschrieben zum Nachweis, Anreicherung, Abtrennung und/oder Isolierung von Protein A, G oder L, Protein A, G oder L enthaltenden Substanzen oder Protein A, G oder L enthaltenden Mikroorganismen, insbesondere Staphylococcus aureus, Streptococcus oder Peptostreptococcus. 1 1. Use of the aptamer as described in any one of claims 1 or 2 for the detection, enrichment, separation and / or isolation of protein A, G or L, protein A, G or L-containing substances or protein A, G or L-containing microorganisms, especially Staphylococcus aureus, streptococcus or peptostreptococcus.
12. Verwendung des Aptamers wie in einem der Ansprüche 1 oder 2 beschrieben zur Quantifizierung der Bindung eines Immunoglobulins an Protein A, G oder L. 12. Use of the aptamer as described in any one of claims 1 or 2 for quantifying the binding of an immunoglobulin to protein A, G or L.
13. Verwendung des Aptamers wie in einem der Ansprüche 1 oder 2 beschrieben zur Blockierung oder Quantifizierung freier Bindungsstellen an Protein A, G oder L. 13. Use of the aptamer as described in any one of claims 1 or 2 for blocking or quantification of free binding sites on protein A, G or L.
14. Verwendung des Aptamers wie in einem der Ansprüche 1 oder 2 beschrieben zur Diagnose, Prophylaxe, Behandlung und/oder Therapie von Erkrankungen, die auf Staphylococcus aureus zurückzuführen sind. 14. Use of the aptamer as described in any one of claims 1 or 2 for the diagnosis, prophylaxis, treatment and / or treatment of diseases that are due to Staphylococcus aureus.
15. Verfahren zum Nachweis von Protein A, G oder L, Protein A, G oder L enthaltenden Substanzen oder Protein A, G oder L enthaltenden Mikroorganismen, insbesondere Staphylococcus aureus, Streptococcus oder Peptostreptococcus, bei dem 15. A method for the detection of protein A, G or L, protein A, G or L-containing microorganisms or microorganisms containing protein A, G or L, in particular Staphylococcus aureus, Streptococcus or Peptostreptococcus, in which
a) ein oder mehrere verschiedene Aptamere wie in einem der Ansprüche 1 oder 2 beschrieben mit einer Probe, die Protein A, G oder L, die Protein A, G oder L enthaltende Substanz oder den Mikroorganismus enthält, in Kontakt gebracht wird/werden und a) one or more different aptamers as described in any one of claims 1 or 2 is contacted with a sample containing protein A, G or L, the protein A, G or L-containing substance or the microorganism, and / or
b) eine Bindung zwischen dem/den Aptamer(en) und Protein A, G oder L, oder zwischen dem/den Aptamer(en) und der Substanz, oder zwischen dem/den Aptamer(en) und dem Mikroorganismus nachgewiesen wird. b) a binding between the aptamer (s) and protein A, G or L, or between the aptamer (s) and the substance, or between the aptamer (s) and the microorganism is detected.
16. Verfahren zur Anreicherung, Abtrennung und/oder Isolierung von Protein A, G oder L, Protein A, G oder L enthaltenden Substanzen oder Protein A, G oder L enthaltenden Mikroorganismen, insbesondere Staphylococcus aureus, Streptococcus oder 16. A method for the enrichment, separation and / or isolation of protein A, G or L, protein A, G or L-containing substances or protein A, G or L-containing microorganisms, in particular Staphylococcus aureus, Streptococcus or
Peptostreptococcus, bei dem Peptostreptococcus, in which
a) ein oder mehrere verschiedene Aptamere wie in einem der Ansprüche 1 oder 2 beschrieben mit einer Probe, die Protein A, G oder L, eine Protein A, G oder L enthaltende Substanz oder einen Protein A, G oder L enthaltenden a) one or more different aptamers as described in any one of claims 1 or 2 with a sample containing protein A, G or L, a protein A, G or L-containing substance or a protein A, G or L.
Mikroorganismus enthält, in Kontakt gebracht wird/werden, wobei ein Komplex oder Komplexe aus dem/den Aptamer(en) und Protein A, G oder L, aus dem/den Aptamer(en) und der Protein A, G oder L enthaltenden Substanz oder aus dem/den Aptamer(en) und dem Protein A, G oder L enthaltenden Mikroorganismus gebildet wird, Containing a complex or complexes of the aptamer (s) and protein A, G or L, from the aptamer (s) and the protein A, G or L-containing substance, or is formed from the aptamer (s) and the protein A, G or L containing microorganism,
b) der/die Komplex(e) und die übrige Probe voneinander getrennt werden, und c) optional Protein A, G oder L, die Protein A, G oder L enthaltende Substanz oder der Protein A, G oder L enthaltende Mikroorganismus aus dem Komplex isoliert wird. b) the complex (s) and the remaining sample are separated from each other, and c) optionally protein A, G or L, the protein A, G or L-containing substance or the microorganism containing the protein A, G or L from the complex is isolated.
17. Verfahren zur Quantifizierung der Bindung eines Immunoglobulins an Protein A, G oder L, wobei bei dem Verfahren 17. A method for quantifying the binding of an immunoglobulin to protein A, G or L, wherein in the method
a) Protein A, G oder L, Protein A, G oder L enthaltende Substanz oder ein Protein A, G oder L enthaltender Mikroorganismus bereitgestellt wird, a) protein A, G or L, protein A, G or L-containing substance or a protein A, G or L-containing microorganism is provided,
b) Protein A, G oder L, Protein A, G oder L enthaltende Substanz oder der Protein A, G oder L enthaltende Mikroorganismus mit dem Immunoglobulin versetzt wird, c) das in b) erzeugte Gemisch mit einem Aptamer nach einem der Ansprüche 1 oder 2 in Kontakt gebracht wird, und b) protein containing protein A, G or L, protein A, G or L or the protein A, G or L containing microorganism is added to the immunoglobulin, c) the mixture produced in b) is brought into contact with an aptamer according to one of claims 1 or 2, and
d) die Menge gebundenen Aptamers bestimmt wird und daraus die Menge d) the amount of bound aptamer is determined and from this the amount
gebundenen Immunoglobulins bestimmt wird. bound immunoglobulin is determined.
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US14/009,088 US9353421B2 (en) | 2011-03-31 | 2012-03-29 | Aptamers that are specific for immunoglobulin-binding cell wall proteins |
EP12713665.3A EP2691527A1 (en) | 2011-03-31 | 2012-03-29 | Aptamers that are specific for immunoglobulin-binding cell wall proteins |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE201110006610 DE102011006610B3 (en) | 2011-03-31 | 2011-03-31 | Aptamers specific for immunoglobulin-binding cell wall proteins |
DE102011006610.1 | 2011-03-31 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
WO2012130951A1 true WO2012130951A1 (en) | 2012-10-04 |
Family
ID=45952501
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PCT/EP2012/055655 WO2012130951A1 (en) | 2011-03-31 | 2012-03-29 | Aptamers that are specific for immunoglobulin-binding cell wall proteins |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP2691527A1 (en) |
DE (1) | DE102011006610B3 (en) |
WO (1) | WO2012130951A1 (en) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103048369A (en) * | 2013-01-18 | 2013-04-17 | 江南大学 | Staphylococcus aureus unmarked electrochemical aptamer sensor based on reduced graphene oxide-nanogold composite material |
WO2019215112A1 (en) | 2018-05-09 | 2019-11-14 | Lifetaq-Analytics Gmbh | In situ cell analysis in cell culture system |
CN111004805A (en) * | 2019-12-30 | 2020-04-14 | 广西医科大学 | Aptamer screening and identifying method of T cell immune checkpoint PD-L1 and anti-tumor application |
WO2021096759A1 (en) * | 2019-11-13 | 2021-05-20 | Crosslife Technologies Inc. | Engineered gyri-like mutein aptamers, and related methods |
Citations (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5270163A (en) | 1990-06-11 | 1993-12-14 | University Research Corporation | Methods for identifying nucleic acid ligands |
US5567588A (en) | 1990-06-11 | 1996-10-22 | University Research Corporation | Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Solution SELEX |
WO2005013817A1 (en) | 2003-08-07 | 2005-02-17 | Charité-Universitäts- Medezin Berlin | Ecg system and method for the large-surface measurement of ecg signals |
WO2005113817A2 (en) | 2004-05-03 | 2005-12-01 | Nanosphere, Inc. | Aptamer-nanoparticle conjugates and method of use for target analyte detection |
KR20090032285A (en) * | 2007-09-27 | 2009-04-01 | 고려대학교 산학협력단 | Dna aptamer binding to retinol binding protein 4 with specificity and production method thereof |
US20090203028A1 (en) * | 2006-07-21 | 2009-08-13 | Hitachi Chemical Research Center, Inc. | Novel aptamers that bind to listeria surface proteins |
KR20100060213A (en) * | 2008-11-27 | 2010-06-07 | 고려대학교 산학협력단 | Dna aptamers binding to visfatin with specificity and production method thereof |
JP2010158238A (en) * | 2008-12-09 | 2010-07-22 | Tokyo Univ Of Agriculture & Technology | C-reactive protein-binding aptamer and use of the same |
KR20100083970A (en) * | 2009-01-15 | 2010-07-23 | 고려대학교 산학협력단 | Dna aptamer binding to diclofenac with specificity and production method thereof |
KR20100130092A (en) * | 2009-06-02 | 2010-12-10 | 고려대학교 산학협력단 | Enantioselective dna aptamers for binding to ciral ibuprofen and production method thereof |
-
2011
- 2011-03-31 DE DE201110006610 patent/DE102011006610B3/en not_active Expired - Fee Related
-
2012
- 2012-03-29 WO PCT/EP2012/055655 patent/WO2012130951A1/en active Application Filing
- 2012-03-29 EP EP12713665.3A patent/EP2691527A1/en not_active Withdrawn
Patent Citations (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5270163A (en) | 1990-06-11 | 1993-12-14 | University Research Corporation | Methods for identifying nucleic acid ligands |
US5567588A (en) | 1990-06-11 | 1996-10-22 | University Research Corporation | Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Solution SELEX |
WO2005013817A1 (en) | 2003-08-07 | 2005-02-17 | Charité-Universitäts- Medezin Berlin | Ecg system and method for the large-surface measurement of ecg signals |
WO2005113817A2 (en) | 2004-05-03 | 2005-12-01 | Nanosphere, Inc. | Aptamer-nanoparticle conjugates and method of use for target analyte detection |
US20090203028A1 (en) * | 2006-07-21 | 2009-08-13 | Hitachi Chemical Research Center, Inc. | Novel aptamers that bind to listeria surface proteins |
KR20090032285A (en) * | 2007-09-27 | 2009-04-01 | 고려대학교 산학협력단 | Dna aptamer binding to retinol binding protein 4 with specificity and production method thereof |
KR20100060213A (en) * | 2008-11-27 | 2010-06-07 | 고려대학교 산학협력단 | Dna aptamers binding to visfatin with specificity and production method thereof |
JP2010158238A (en) * | 2008-12-09 | 2010-07-22 | Tokyo Univ Of Agriculture & Technology | C-reactive protein-binding aptamer and use of the same |
KR20100083970A (en) * | 2009-01-15 | 2010-07-23 | 고려대학교 산학협력단 | Dna aptamer binding to diclofenac with specificity and production method thereof |
KR20100130092A (en) * | 2009-06-02 | 2010-12-10 | 고려대학교 산학협력단 | Enantioselective dna aptamers for binding to ciral ibuprofen and production method thereof |
Non-Patent Citations (22)
Title |
---|
CAMILLE L. A. HAMULA ET AL: "Selection of Aptamers against Live Bacterial Cells", ANALYTICAL CHEMISTRY, vol. 80, no. 20, 15 October 2008 (2008-10-15), pages 7812 - 7819, XP055030661, ISSN: 0003-2700, DOI: 10.1021/ac801272s * |
CHAN ET AL., CLINICAL AND EXPERIMENTAL PHARMACOLOGY AND PHYSIOLOGY, vol. 33, 2006, pages 533 - 540 |
CHO, E. J.; LEE, J.-W.; ELLINGTON, A. D., APPLICATIONS OF APTAMERS AS SENSORS, ANNUAL REVIEW OF ANALYTICAL CHEMISTRY, vol. 2, 2009, pages 241 - 264 |
CIESIOLKA ET AL.: "Affinity Selection-Amplification from Randomized Ribooligonucleotide Pools", METHODS IN ENZYMOLOGY, vol. 267, 1996, pages 315 - 35 |
CONRAD ET AL.: "In Vitro Selection of Nucleic Acid Aptamers That Bind Proteins", METHODS IN ENZYMOLOGY, vol. 267, 1996, pages 336 - 83 |
ELLINGTON; SZOSTAK, NATURE, vol. 346, 1990, pages 818 - 822 |
FITZWATER ET AL.: "A SELEX Primer", METHODS IN ENZYMOLOGY, vol. 267, 1996, pages 275 - 301, XP002112701, DOI: doi:10.1016/S0076-6879(96)67019-0 |
FOWLER CASEY C ET AL: "Aptamers and Their Potential as Recognition Elements for the Detection of Bacteria", PRINCIPLES OF BACTERIAL DETECTION: BIOSENSORS, RECOGNITION RECEPTORS AND MICROSYSTEMS, SPRINGER, 1 January 2008 (2008-01-01), pages 689 - 714, XP008152999, ISBN: 978-0-387-75112-2 * |
GNANAM A J ET AL: "Development of aptamers specific for potential diagnostic targets in Burkholderia pseudomallei", TRANSACTIONS OF THE ROYAL SOCIETY OF TROPICAL MEDICINE AND HYGIENE, ELSEVIER, GB, vol. 102, 1 December 2008 (2008-12-01), pages S55 - S57, XP025846792, ISSN: 0035-9203, [retrieved on 20081201], DOI: 10.1016/S0035-9203(08)70015-4 * |
J. G. BRUNO ET AL: "In Vitro antibacterial effects of antilipopolysaccharide DNA aptamer-C1qrs complexes", FOLIA MICROBIOLOGICA, vol. 53, no. 4, 1 July 2008 (2008-07-01), pages 295 - 302, XP055030719, ISSN: 0015-5632, DOI: 10.1007/s12223-008-0046-6 * |
J. P. BANNANTINE ET AL: "Development and Characterization of Monoclonal Antibodies and Aptamers against Major Antigens of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis", CLINICAL AND VACCINE IMMUNOLOGY, vol. 14, no. 5, 1 May 2007 (2007-05-01), pages 518 - 526, XP055030720, ISSN: 1556-6811, DOI: 10.1128/CVI.00022-07 * |
JEEVALATHA VIVEKANANDA ET AL: "Anti-Francisella tularensis DNA aptamers detect tularemia antigen from different subspecies by Aptamer-Linked Immobilized Sorbent Assay", LABORATORY INVESTIGATION, vol. 86, no. 6, 1 June 2006 (2006-06-01), pages 610 - 618, XP055030675, ISSN: 0023-6837, DOI: 10.1038/labinvest.3700417 * |
JOSHI R ET AL: "Selection, characterization, and application of DNA aptamers for the capture and detection of Salmonella enterica serovars", MOLECULAR AND CELLULAR PROBES, ACADEMIC PRESS, LONDON, GB, vol. 23, no. 1, 1 February 2009 (2009-02-01), pages 20 - 28, XP025910706, ISSN: 0890-8508, [retrieved on 20081118], DOI: 10.1016/J.MCP.2008.10.006 * |
MOK, W; LI, Y.: "Recent Progress in Nucleic Acid Aptamer-Based Biosensors and Bioassays", SENSORS, vol. 8, 2008, pages 7050 - 7084 |
Q. PAN ET AL: "Aptamers That Preferentially Bind Type IVB Pili and Inhibit Human Monocytic-Cell Invasion by Salmonella enterica Serovar Typhi", ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, vol. 49, no. 10, 1 October 2005 (2005-10-01), pages 4052 - 4060, XP055030688, ISSN: 0066-4804, DOI: 10.1128/AAC.49.10.4052-4060.2005 * |
R. STOLTENBURG ET AL.: "FluMag-SELEX as an advantageous method for DNA aptamer selection", ANAL. BIOANAL. CHEM., vol. 383, 2005, pages 83 - 91, XP019327576, DOI: doi:10.1007/s00216-005-3388-9 |
SAMBROOK ET AL.: "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2001, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS |
SONG, S.; WANG, L.; LI, J.; FAN, C.; ZHAO, J.: "Aptamer-based biosensors", TRAC TRENDS IN ANALYTICAL CHEMISTRY, vol. 27, 2008, pages 108 - 117, XP022520321, DOI: doi:10.1016/j.trac.2007.12.004 |
TUERK; GOLD, SCIENCE, vol. 249, 1990, pages 505 - 510 |
W. G. PURSCHKE: "A DNA Spiegelmer to staphylococcal enterotoxin B", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 31, no. 12, 15 June 2003 (2003-06-15), pages 3027 - 3032, XP055030769, DOI: 10.1093/nar/gkg413 * |
X. CAO ET AL: "Combining use of a panel of ssDNA aptamers in the detection of Staphylococcus aureus", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 37, no. 14, 4 June 2009 (2009-06-04), pages 4621 - 4628, XP055030768, ISSN: 0305-1048, DOI: 10.1093/nar/gkp489 * |
ZUKER M., NUCLEIC ACID RESEARCH, vol. 31, 2003, pages 3406 - 3415 |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103048369A (en) * | 2013-01-18 | 2013-04-17 | 江南大学 | Staphylococcus aureus unmarked electrochemical aptamer sensor based on reduced graphene oxide-nanogold composite material |
WO2019215112A1 (en) | 2018-05-09 | 2019-11-14 | Lifetaq-Analytics Gmbh | In situ cell analysis in cell culture system |
US11279971B2 (en) | 2018-05-09 | 2022-03-22 | Lifetaq-Analytics Gmbh | In situ cell analysis in cell culture system |
WO2021096759A1 (en) * | 2019-11-13 | 2021-05-20 | Crosslife Technologies Inc. | Engineered gyri-like mutein aptamers, and related methods |
CN111004805A (en) * | 2019-12-30 | 2020-04-14 | 广西医科大学 | Aptamer screening and identifying method of T cell immune checkpoint PD-L1 and anti-tumor application |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2691527A1 (en) | 2014-02-05 |
DE102011006610B3 (en) | 2012-06-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Yoo et al. | Detection and beyond: Challenges and advances in aptamer-based biosensors | |
Li et al. | Nucleic acid tests for clinical translation | |
Qu et al. | Rapid and label-free strategy to isolate aptamers for metal ions | |
Mok et al. | Recent progress in nucleic acid aptamer-based biosensors and bioassays | |
Liu et al. | Functional nucleic acid sensors | |
Musumeci et al. | Fluorescence sensing using DNA aptamers in cancer research and clinical diagnostics | |
Strehlitz et al. | Aptamers for pharmaceuticals and their application in environmental analytics | |
Ramezani et al. | A selective and sensitive fluorescent aptasensor for detection of kanamycin based on catalytic recycling activity of exonuclease III and gold nanoparticles | |
Song et al. | Aptamer-based biosensors | |
Tang et al. | Colorimetric and ultrasensitive bioassay based on a dual-amplification system using aptamer and DNAzyme | |
Wang et al. | Recent advances in fluorescent nucleic acid probes for living cell studies | |
US10975370B2 (en) | Methods for screening nucleic acid aptamers | |
Suo et al. | A versatile turn-on fluorometric biosensing profile based on split aptamers-involved assembly of nanocluster beacon sandwich | |
JP2021535409A (en) | Nucleic acid-based detection method | |
Bognár et al. | Aptamers against immunoglobulins: Design, selection and bioanalytical applications | |
DE102011006610B3 (en) | Aptamers specific for immunoglobulin-binding cell wall proteins | |
KR20150139582A (en) | Rna microchip detection using nanoparticle-assisted signal amplification | |
Zhang et al. | Engineering multivalence aptamer probes for amplified and label-free detection of antibiotics in aquatic products | |
Wu et al. | Low-noise solid-state nanopore enhancing direct label-free analysis for small dimensional assemblies induced by specific molecular binding | |
Liao et al. | Aptamer-based sensitive detection of target molecules via RT-PCR signal amplification | |
EP2691523B1 (en) | Aminoglycoside-specific aptamers | |
EP2774988B1 (en) | Fluoroquinolone-specific aptamers | |
Du et al. | Fluorescent platforms for RNA chemical biology research | |
WO2022182253A1 (en) | Aptamers that selectively bind to a sars-cov-2 virus nucleocapsid protein | |
DE102010038842A1 (en) | New aptamer that specifically binds to human tau protein or its fragment, useful e.g. in vitro for isolating, purifying and/or detecting tau protein, and to treat cerebral infarction, pick disease and/or progressive supranuclear palsy |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 12713665 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
REEP | Request for entry into the european phase |
Ref document number: 2012713665 Country of ref document: EP |
|
NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 14009088 Country of ref document: US |