WO2012126231A1 - 聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐的用途及其药物组合物 - Google Patents

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吴稚伟
邱敏
孙亦彬
蒋海燕
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SUZHOU VIROSEC CO Ltd
Nanjing University
Nanjing Tech University
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SUZHOU VIROSEC CO Ltd
Nanjing University
Nanjing Tech University
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    • A61K31/74—Synthetic polymeric materials
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV

Definitions

  • the present invention relates to the use of poly(4-styrenesulfonic acid-co-maleic acid) sodium salt, and to a pharmaceutical composition containing poly(4-styrenesulfonic acid-co-maleic acid) sodium salt as an active ingredient .
  • HIV-1 human immunodeficiency virus
  • Invasion of target cells by HIV-1 is a specific biological process that requires the envelope protein gpl20 on the surface of the virus to bind to the cellular receptor CD4, induce a change in the conformation of g pl20, and then bind to the cell surface co-receptor CCR5 or CXCR4.
  • the conformational change of the fusion protein gp41 which was originally blocked by gpl20, exposes its hydrophobic N-terminal fusion peptide sequence and is inserted into the host cell membrane, thereby initiating fusion of the viral membrane with the cell membrane, eventually leading to the entry of the viral core structure into the cell, establishing an infection. .
  • a number of inhibitors have been developed for this biological process, such as the adjuvant receptor inhibitors Maraviroc and PSC-RANTES, and the fusion process inhibitor T20 (which has been approved for marketing by the US FDA). Fuviridine) and C52L polypeptides are also promising candidates for microbicides.
  • Poly (4-styrenesulfonic acid-co-maleic acid) sodium salt is a synthetic polymer compound, soluble in water, and the aqueous solution is colorless to Light yellow, good heat resistance. Since the compound carries a styrene sulfonic acid group and a maleic anhydride group, it has a high anion distribution density and is highly dispersible, and is a surface active material.
  • Poly(4-styrenesulfonic acid-co-maleic acid) sodium salt has a wide range of applications in industry and agriculture, and can be used in detergents and dispersants, but there are few reports on its application in the field of medicine and health, especially It is used as an antiviral drug. Summary of the invention
  • a first object of the present invention is to provide a poly(4-styrenesulfonic acid-co-maleic acid) sodium salt for use in the preparation of a medicament for inhibiting HIV-1 infection;
  • a second object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for inhibiting HIV-1 comprising poly(4-styrenesulfonic acid-co-maleic acid) sodium salt as an active ingredient, which further comprises a conventional pharmaceutical carrier .
  • poly(4-styrenesulfonic acid-co-maleic acid) sodium salt has a high negative charge and can be associated with HIV-1 cell membrane protein g pl20 V3
  • the fragment (positive charge) interacts to block the interaction of the V3 fragment with the receptor CD4 to block the entry of HIV-1 virus into the cell or to inhibit the fusion of CH0-WT with MT-2 cells.
  • poly(4-styrenesulfonate-co-maleic acid) sodium salt has strong anti-CD4-dependent HIV-1 infection and also performs well for some clinical isolates.
  • the activity which includes the B', B'C and CRF01-AE recombinant subtypes, indicates that the poly(4-styrenesulfonate-co-maleic acid) sodium salt has a broad spectrum of resistance to HIV-1.
  • poly(4-styrenesulfonate-co-maleic acid) sodium salt also has good anti-infective ability against CD4-independent HIV-1 infection.
  • In vitro toxicity tests on poly(4-styrenesulfonic acid-co-maleic acid) sodium salt revealed that the compound has very low toxicity.
  • poly(4-styrenesulfonate-co-maleic acid) sodium salt has a role in inhibiting the fusion process mediated by the HIV-1 viral envelope protein gpl20.
  • Poly(4-styrenesulfonic acid-co-maleic acid) sodium salt is abundant in source and low in production cost, and has potential application value as a novel anti-HIV-1 drug and microbicide.
  • Figure 1 shows poly(4-styrenesulfonic acid-co-maleic acid) sodium salt inhibits HIV-1 B subtype standard strain JR-FUR5 tropism) and HXB2U4 tropism) to CD4+ CCR5+ CXCR4+ ghost (3 a graph of X4-Hi5 cell infection;
  • Figure 2 is a graph showing the inhibition of infection of CD4 + CCR5 + CXCR4 + ghost (3) X4_Hi5 cells by a poly(4-styrenesulfonic acid-co-maleic acid) sodium salt;
  • Figure 3 is a poly(4-styrenesulfonic acid-co-maleic acid) sodium salt inhibiting the HIV-1 B subtype standard strain JR-FL (R5 tropism) and HXB2 (X4 tropism) on CD4- a graph of Caco_2 cell infection;
  • Figure 4 is a poly(4-styrenesulfonic acid-co-maleic acid) sodium salt inhibiting the HIV-1 B subtype standard strain JR-FL (R5 tropism) and HXB2 (X4 tropism) on CD4- a graph of HEC-A cell infection;
  • Figure 5 is a graph showing the toxicity of poly(4-styrenesulfonic acid-co-maleic acid) sodium salt on CD4-Caco-2 cells;
  • Figure 6 is a graph showing the toxicity of poly(4-styrenesulfonic acid-co-maleic acid) sodium salt on CD4- HEC-1-A cells;
  • Figure 7 is poly(4-styrenesulfonic acid-co-maleic acid) sodium salt (PSM), dextran sulfate (Dextran sul f at e ), zidovudine (AZT), nevirapine (nev irapine) Inhibition of time-inhibition profiles of HIV-1 infected CD4+ CCR5+ CXCR4+ ghost (3) ⁇ 4- ⁇ 5 cells;
  • Figure 8 is a bar graph showing the inhibition of HIV-1 viral envelope protein gpl20 mediated cell fusion by poly(4-styrenesulfonate-co-maleic acid) sodium salt at various concentrations.
  • PEK linear, 25kD purchased from Polyscience, formulated into a 5 mg/ml solution
  • HIV-1 B subtype standard strain JR-FL, HXB2;
  • HIV-1 clinical isolates CNE6 ( ⁇ ' subtype), CNE30 ( ⁇ ' C subtype), CNE50 (B, C subtype) and Wokou CNE55 (CRF01-AE subtype), all isolated from HIV infection in China Including the major HIV-1 epidemic subtypes in China;
  • the HIV-1 pseudoviral backbone plasmid pNL4-3 and different pseudovirus envelope plasmids were co-transfected into 293T cells using PEI transfection reagent. After 48 hours of culture, the supernatant was collected and stored in -75 °C. That is, a pseudovirus solution was obtained for subsequent experiments. Luciferase assay for the infectivity of pseudoviruses (TCID 5 .)
  • the infectious titer of the pseudovirus To determine the infectious titer of the pseudovirus, firstly dilute the virus harvesting solution, add 100 ul to the 96-well plate, 4 replicate wells per gradient, and add lOOul ghost (3) X4-Hi5 cell suspension, cell density 10 5 After 48 hours of cell/mlo culture, the relative fluorescence value (RLU) of each ⁇ L was determined on a GloMax-96 Microplate Luminometer using a Promega GloMax Lysis Buffer and Luciferase assay system kit. The RLU was greater than 2.5 times the background value and was judged to be positive. The infectious titer of the pseudovirus (TCID 5 ) was calculated using the Reed_Muench method. PSM antiviral activity test
  • the PSM was dissolved in double distilled water and sterilized by filtration. Dilute with DMEM complete medium At a certain concentration, perform a 3-fold gradient dilution in a 96-well plate at a maximum concentration of 60 ⁇ g/ml (3 ⁇ M and then add 50 ⁇ 1 4000 TC ID 5 ⁇ /ml of virus dilution to each well to be tested. , mix, incubate for 30 min at 37 ° C.
  • the fluorescence intensity was measured on a GloMax-96 Microplate Luminometer using Promega GloMax Lysis Buffer and Luciferase as say system kit (the magnitude of the fluorescence intensity represents the extent of viral infection). In this experiment, complete medium wells were added as control at each time point.
  • CH0-WT 2.6 cell-cell fusion inhibition assay
  • CH0-WT was cultured in GMEM-S medium containing 400 ⁇ M methionine sulf oximine. When the coverage reached 70%, sodium butyrate was added to a final concentration of 6 mM to stimulate g pl60 trimer (envelope protein). Expression of gpl20 + fusion protein g p41). After stimulation for 16 h, the cells were digested with 0.5 mM (EDTA + EGTA), counted, and inoculated with 5 ⁇ 10 5 CH0-WT per well in a 24-well plate. At the same time, the same number of MT-2 were inoculated into each well of a 24-well plate.
  • the poly(4-styrenesulfonic acid-co-maleic acid) sodium salt was detected by a pseudovirus system carrying the luciferase gene to inhibit the HIV-1 B subtype standard strain JR-FL (R5 Sexuality HXB2 (X4 tropic) Infection of CD4+ CCR5+ CXCR4+ cells (Ghost (3) ⁇ 4- ⁇ 5) was found to have a significant inhibitory effect and inhibit EC 5 . They were 4.988 ⁇ g/ml and 5.260 g/ml, respectively.
  • the poly(4-styrenesulfonic acid-co-maleic acid) sodium salt has substantially no inhibitory effect on the HIV-1 strain VSV-G having the envelope protein VSV.
  • HIV-1 clinical isolates include CNE6 ( ⁇ ' subtype, R5 tropism), CNE30 ( ⁇ ' C subtype, R5 tropism), CNE50 ( ⁇ ' C subtype, R5 tropism) and CNE55 (CRF01-AE subtype, R5 tropism);
  • the compound PSM was found to have a significant inhibitory effect on these clinical strains, inhibiting EC 5 . 1.8757 ⁇ g/ml,
  • poly(4-styrenesulfonate-co-maleic acid) sodium salt was determined to inhibit HIV-1 infection of CD4 + CCR5 + CXCR4+ cells using a pseudovirus system carrying the luciferase gene.
  • poly(4-styrenesulfonic acid-co-maleic acid) sodium salt inhibits gpl20 and CD4-mediated cell fusion, and in Figure 7, poly(4) was found.
  • - Styrenesulfonic acid-co-maleic acid) Sodium salt can effectively inhibit the fusion of CH0-WT and MT-2 cells.
  • Inhibition of HIV-1 viral envelope protein-mediated fusion from poly(4-styrenesulfonate-co-maleic acid) sodium salt, further illustrating poly(4-styrenesulfonic acid-co-maleic acid) sodium Salt prevents the HIV-1 virus from entering the cell to inhibit the virus.
  • poly(4-styrenesulfonate-co-maleic acid) sodium salt has a high negative charge and can interact with the V3 fragment (positive charge) of the membrane protein g pl20 of HIV-1. The effect is to block the interaction of the V3 fragment with the receptor CD4 to block the entry of HIV-1 virus into the cell or to inhibit the fusion of CH0-WT with MT-2 cells.
  • poly(4-styrenesulfonate-co-maleic acid) sodium salt has strong anti-CD4-dependent HIV-1 infection and some clinical isolates It also showed good activity, including B', B'C and CRF01-AE recombinant subtypes.
  • poly(4-styrenesulfonic acid-co-maleic acid) sodium salt has a broad spectrum of resistance to HIV-1.
  • poly(4-styrenesulfonate-co-maleic acid) sodium salt also has good anti-infective ability against CD4-independent HIV-1 infection.
  • In vitro toxicity tests on poly(4-styrenesulfonic acid-co-maleic acid) sodium salt revealed that the compound has very low toxicity.
  • cell fusion experiments showed that poly(4-styrenesulfonate-co-maleic acid) sodium salt has a role in inhibiting the fusion process mediated by the HIV-1 viral envelope protein gpl20.
  • the poly(4-styrenesulfonic acid-co-maleic acid) sodium salt is rich in source and low in production cost, and has potential application value as a novel anti-HIV-1 drug and microbicide.
  • a poly(4-styrenesulfonic acid-co-maleic acid) sodium salt is used as an active ingredient, and a conventional pharmaceutical carrier is added.
  • the pharmaceutical composition can be formulated as an injection, a tablet, a capsule, an aerosol, a suppository, a film, a pill, a topical tincture, or a controlled release or sustained release dosage form or a nano preparation.

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Description

聚 （4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸） 钠盐的用途及其药物组合物 技术领域
本发明涉及聚 （4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸） 钠盐的用途， 还涉 及含有聚 （4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐作为有效成分的药物组 合物。 背景技术
艾滋病是感染人免疫缺陷病毒 （HIV)引起的。 HIV-1侵入靶细胞 是一个特异性的生物学过程，其需要病毒表面的包膜蛋白 gpl20与细 胞受体 CD4结合， 诱导 gpl20构象发生改变， 继而与细胞表面的辅助 受体 CCR5或 CXCR4结合，使得原先被 gpl20遮蔽的融合蛋白 gp41发 生构象变化， 曝露出其疏水的 N-末端融合肽序列并插入宿主细胞膜， 从而启动病毒毒膜与细胞膜的融合， 最终导致病毒核心结构进入细 胞， 建立感染。 针对这一生物学过程， 已有多种抑制剂被开发出来， 例如针对辅助受体的抑制剂 Maraviroc 与 PSC-RANTES, 另外针对融 合过程的抑制剂 T20 (已被美国 FDA批准上市， 商品名恩夫韦定） 与 C52L多肽也是很有希望的杀微生物剂候选药物。
发现新的具有抑制 HIV感染作用的化合物或天然产物，对于开发 有效预防 HIV传播的杀微生物剂具有重要意义。寻找创新性的先导化 合物， 继而开发出有效阻止 HIV感染的新型杀微生物剂或药物， 是本 发明的目的。
聚 （4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸） （Poly (4-styrenesulfonic acid-co-maleic acid) ) 钠盐是一种人工合成的高分子化合物， 溶于 水， 水溶液呈无色至淡黄色， 耐热性好。 由于该化合物携带有苯乙烯 磺酸基团以及马来酸酐基团， 因此其具有很高的阴离子分布密度， 并 具有很强的分散性， 是一种表面活性物质。 工业上苯乙烯磺酸 -马来 酸酐共聚物的合成技术非常成熟，通常分为先磺化后聚合方法和先聚 合后磺化方法： 前者先将苯乙烯单体磺化， 然后在惰性溶液中进行马 来酸酐共聚， 反应温度通常为 80-12CTC; 后者则是先将苯乙烯和马 来酸酐共聚合， 然后利用氯磺酸、 浓硫酸、 三氧化硫等对共聚物进行 磺化。 聚 （4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸） 钠盐在工农业中具有广泛的 应用， 可用于去垢剂和分散剂等， 但鲜有其在医药卫生领域的应用的 报道， 尤其是作为抗病毒药物。 发明内容
本发明的第一个目的是提供聚 （4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸） 钠 盐的应用， 用于制备抑制 HIV-1感染的药物；
本发明的第二个目的是提供含有聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸） 钠盐作为有效成分的抑制 HIV-1 的药物组合物，该药物组合物还含有 常规药用载体。
本发明与现有技术相比具有下列优点： 聚 （4-苯乙烯磺酸-共聚- 马来酸） 钠盐具有较高的负电荷性， 可以与 HIV-1 的胞膜蛋白 gpl20 的 V3 片段 （正电荷） 发生相互作用， 从而可以阻断 V3 片段与受体 CD4的相互作用， 以达到阻断 HIV-1病毒进入细胞的作用， 或者抑制 CH0-WT与 MT-2细胞的融合。 体外抗病毒实验证明， 聚 （4-苯乙烯磺 酸-共聚-马来酸） 钠盐具有很强的抗 CD4依赖性 HIV-1感染的能力， 并且对一些临床分离株也表现为很好的活性， 这其中包括 B' 、 B' C 和 CRF01-AE重组亚型， 这说明聚 （4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸） 钠 盐具有抗 HIV-1 的广谱性。 另外， 聚 （4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸） 钠盐对 CD4非依赖性的 HIV-1感染也具有很好的抗感染能力。对聚（4- 苯乙烯磺酸-共聚-马来酸） 钠盐的体外毒性实验发现， 该化合物具有 很低的毒性。 最后， 细胞融合实验结果表明聚 （4-苯乙烯磺酸-共聚- 马来酸）钠盐具有抑制 HIV-1病毒包膜蛋白 gpl20介导的融合过程的 作用。 聚 （4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸） 钠盐来源丰富， 生产成本低 廉， 具有作为一种新型抗 HIV-1药物及杀微生物剂的潜在应用价值。
附图说明 附图 1 为聚 （4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸） 钠盐抑制 HIV-1 B 亚型标准毒株 JR-FUR5嗜性）禾口 HXB2U4嗜性）对 CD4+ CCR5+ CXCR4+ Ghost (3) X4-Hi5细胞感染的曲线图；
附图 2为聚 （4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸） 钠盐抑制 HIV-1 临 床分离毒株对 CD4+ CCR5+ CXCR4+ Ghost (3) X4_Hi5细胞感染的曲 线图；
附图 3为聚 （4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸） 钠盐抑制 HIV-1 B 亚型标准毒株 JR-FL (R5嗜性） 禾口 HXB2 (X4嗜性） 对 CD4— Caco_2 细胞感染的曲线图；
附图 4为聚 （4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸） 钠盐抑制 HIV-1 B 亚型标准毒株 JR-FL ( R5嗜性 ) 禾口 HXB2 ( X4嗜性 ) 对 CD4— HEC -卜 A 细胞感染的曲线图；
附图 5为聚 （4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸） 钠盐对 CD4— Caco-2 细胞产生毒性的曲线图；
附图 6聚 （4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸） 钠盐对 CD4— HEC-1-A 细胞产生毒性的曲线图；
附图 7为聚 （4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸） 钠盐 （PSM)、 硫酸 葡聚糖（Dextran sul f at e )、齐多夫定（ AZT )、奈韦拉平（ nev irapine ) 抑制 HIV-1感染 CD4+ CCR5+ CXCR4+ Ghost (3) Χ4-ΗΪ5细胞的时间 抑制曲线图；
附图 8为聚 （4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸） 钠盐在不同浓度下 抑制 HIV-1病毒包膜蛋白 gpl20介导的细胞融合的柱状统计图。 具体实施方式
下面结合显示实验结果的附图来进一步阐述本发明。
1. 实验材料
1.1聚 （4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸） 钠盐 （PSM);
其分子式如下：
阳性对照样品： 硫酸葡聚糖（Dextran sulfate), 齐多夫定（AZT)， 奈韦拉平 （Nevirapine) 均购自 SIGMA公司；
CCK-8 , Dojindo Laboratories；
PEK linear, 25kD)，购自 Poly science公司，使用时配制成 5 mg/ml 的溶液；
HIV-1假病毒系统 (HIV-1 pseudotype virus)
1.6.1 假病毒骨架质粒： PNL4-3 ， 构建有萤光素酶报告基因
( lucif erase reporter gene ) , 弓 I自美国 Rockf eller university;
1.6.2 源自不同 HIV-1 亚型基因序列的假病毒包膜质粒， 引自 清华大学艾滋病研究中心；
HIV-1 B亚型标准毒株： JR-FL, HXB2;
HIV-1 临床分离毒株： CNE6 (Β' 亚型）、 CNE30 (Β' C亚 型）、 CNE50 (B， C亚型） 禾口 CNE55 (CRF01-AE亚型）， 均 分离自中国艾滋病感染者，包括了中国主要的 HIV-1流行 亚型；
Luciferase as say system kit 贝勾自 Promega公司；
细胞
1.7.1 人骨肉瘤细胞系 Ghost (3) Χ4-ΗΪ5, 表达 CD4 受体， CCR5与 CXCR4辅助受体；
1.7.2 人结肠癌上皮细胞 Caco-2， 不表达 CD4受体；
1.7.3 人宫颈癌上皮细胞 HEC-1-A, 不表达 CD4受体；
1.7.4 人 T细胞系白血病细胞 MT-2,表达 T细胞表面受体 CD4, 用于检测 HIV-1诱导的细胞融合作用；
1.7.5 仓鼠卵巢细胞 CH0-WT, 表达 HIV-1包膜蛋白 gpl20， 用 于检测 HIV-1 诱导的细胞融合作用；
1.7.6 人胚胎肾细胞 293T, 用于包装生成 HIV-1假病毒颗粒； 细胞培养液： DMEM high glucose +10%胎牛血清；
96孔细胞培养板： Corning;
0 24孔细胞培养板： Corning;
1 96 孔荧光检测板： Costar;
2 GloMax 96孔化学发光酶标仪；
3 TECAN酶标仪；
4 Thermo C02培养箱。 实验方法
HIV-1假病毒颗粒在人胚胎肾细胞 293T细胞内的包装
使用 PEI转染试剂， 将 HIV-1假病毒骨架质粒 pNL4-3和不同 的假病毒包膜质粒共转染至 293T细胞，培养 48小时后收集上清， 分装冻存于 -75°C， 即获得假病毒液用于后续实验。 萤光素酶法测定假病毒的感染性滴度 （TCID5。）
测定假病毒感染性滴度时， 先梯度稀释病毒收获液， 取 100 ul 加入 96 孔板， 每个梯度 4 个复孔， 再加入 lOOul Ghost (3) X4-Hi5细胞悬液， 细胞密度 105 cells/mlo 培养 48 小时后， 利 用 Promega GloMax Lysis Buffer禾口 Luciferase assay system kit 在 GloMax-96 Microplate Luminometer上测定每孑 L的相对荧光值 (RLU), RLU大于 2.5倍的背景值，判定为阳性，采用 Reed_Muench 方法计算假病毒的感染性滴度 （TCID5。）。 PSM抗病毒活性检测
将 PSM溶解于双蒸水中， 过滤除菌。 用 DMEM完全培养基稀释到 一定浓度， 分别在 96 孔板中进行 3 倍梯度稀释， 最高浓度分别为 60 μ g/ml ( 3 μ M 然后将 50μ 1 4000TC I D5。/ml 的病毒稀释液加入 到每个待测孔中， 混匀， 37°C抚育 30min。 最后在待测孔中加入 104 Ghost (3) X4_Hi5细胞 （或 2 X 104 Caco_2禾口 HEC -卜 A细胞）， 37°C、 5%( 02培养 48h， 禾 IJ用 Promega GloMax Lysis Buffer禾口 Luciferase assay system kit在 GloMax_96 Microplate Luminometer上检测萤 光强度 （萤光强度的大小代表病毒感染的程度）。
2.4体外细胞毒性实验
以 2X 104 Caco-2和 HEC-l-A细胞每孔接入 96 孔板中， 37°C、 5%C02培养 24h。 将 PSM进行梯度稀释， 最高浓度为 10mg/ml， 稀释倍 数为 3倍。 再将 96孔板中的培养液弃去， 换成含有梯度浓度 PSM的 DMEM完全培养基。 37 °C、 5%C02培养至检测时间点 （6h， 12h， 24h， 48h)， 力口入 10 μ 1/well 的 CCK-8试剂 ( Dojindo Laboratories), 继 续培养 3h。 最后用 TECAN酶标仪在 450nm处检测光吸收值， 从而计 算细胞的存活率。
2.5药物抑制作用阶段实验
本实验采用 Time-of-drug addition方法进行。 首先在 96孔板 中接种 104 Ghost (3) X4-Hi5 细胞， 37°C、 5%C02培养 12h。 在待测 孔中加入 50μ 1 4000TCID60/ml 的病毒稀释液。 然后在各时间点加入 PSM和阳性对照药物，混匀， PSM浓度为 60 μ g/ml, AZT为 0.5 μ g/ml, Nevirapine为 2μ g/ml , dextran sulfate为 300 μ g/ml。 待培养 48h 后， 利用 Promega GloMax Lysis Buffer禾口 Luciferase as say system kit 在 GloMax-96 Microplate Luminometer 上检测萤光强度 （萤光 强度的大小代表病毒感染的程度）。 本实验以各时间点加入完全培养 基孔为对照。
2.6细胞 -细胞融合抑制实验 用含有 400 μ Μ methionine sulf oximine 的 GMEM-S 培养基对 CH0-WT进行培养， 等覆盖率到达 70%左右时， 加入丁酸钠至终浓度为 6mM, 刺激 gpl60三聚体 （包膜蛋白 gpl20 +融合蛋白 gp41) 的表达。 在刺激 16h后， 用 0.5mM的 （EDTA+EGTA) 消化细胞， 计数后， 在 24 孔板中以每孔 5X105 的 CH0-WT进行接种。 同时将同样数目的 MT-2 接种于 24孔板的各孔中。 加入不同浓度的 PSM ( 60, 20, 6.67, 2.22, 0.74, 0 ug/ml), 37°C、 5%C02培养 24h 后， 用倒置显微镜观察并计 数合胞体数目。
3.实验结果
3.1 在图 1， 利用携带萤光素酶基因的假病毒系统检测聚 （4-苯乙 烯磺酸-共聚-马来酸） 钠盐抑制 HIV-1 B亚型标准毒株 JR-FL (R5嗜 性） 禾口 HXB2 (X4嗜性） 对 CD4+ CCR5+ CXCR4+细胞 ( Ghost (3) Χ4-ΗΪ5) 的感染， 发现其具有明显的抑制效果， 抑制 EC5。分别为 4.988 μ g/ml 和 5.260 g/ml。 聚 （4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸） 钠盐对具有包膜 蛋白 VSV的 HIV-1毒株 VSV-G基本无抑制作用。
3.2 在图 2中， 利用携带萤光素酶基因的假病毒系统检测聚 （4-苯 乙烯磺酸-共聚-马来酸） 钠盐抑制 HIV-1 临床分离毒株对 CD4+ CCR5 + CXCR4+细胞的感染， HIV-1 临床分离毒株包括 CNE6 (Β' 亚型， R5嗜 性）、 CNE30 (Β' C亚型， R5嗜性）、 CNE50 (Β' C亚型， R5嗜性） 和 CNE55 (CRF01-AE亚型， R5嗜性）； 发现该化合物 PSM对这些临床毒 株具有明显的抑制效果， 抑制 EC5。分别为 1.8757 μ g/ml、
3.1361 μ g/ml、 1.7050 μ g/ml禾口 1.7064 μ g/ml。
3.3 用携带萤光素酶基因的假病毒系统检测聚（4-苯乙烯磺酸-共聚- 马来酸） 钠盐抑制 HIV-1 B亚型标准毒株 JR-FL和 HXB2对 CD4—细胞 (人结肠癌上皮细胞 Caco-2和人宫颈癌腺上皮细胞 HEC-1-A) 的感 染， 发现其具有很强的抑制效果， 如图 3和图 4所示： 在 Caco-2细 胞上抑制 JR— FL禾口 HXB2的 EC50分另 lj为 7.307 μ g/ml禾口 9· 542 μ g/ml; 在 HEC-1-A上抑制 JR— FL禾口 HXB2的 EC50分另 lj为 2.050 μ g/ml禾口 3.951 μ g/ml。
3.4 在图 5和图 6中， 利用 CCK-8法检测聚 （4-苯乙烯磺酸-共聚- 马来酸）钠盐对相关人细胞株的毒性， 发现高浓度的该化合物 PSM对 人结肠癌上皮细胞 （Caco-2) 和人宫颈癌腺上皮细胞 （HEC-1-A) 毒 性很小。
3.5 在图 7中， 利用携带萤光素酶基因的假病毒系统确定聚 （4-苯 乙烯磺酸-共聚-马来酸） 钠盐抑制 HIV-1感染 CD4+ CCR5+ CXCR4+细胞
(Ghost (3) Χ4-ΗΪ5) 的作用方式和原理， 结果显示聚 （4-苯乙烯磺 酸-共聚-马来酸） 钠盐 （PSM) 与硫酸葡聚糖 （Dextran sulfate) 的 曲线走向相似， 可以推测聚 （4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸） 钠盐的作 用方式与硫酸葡聚糖相似， 是通过抑制病毒入胞来实现抗病毒作用 的。
3.6 利用 CH0-WT— MT-2共培养融合检测聚 （4-苯乙烯磺酸-共聚- 马来酸） 钠盐抑制 gpl20和 CD4介导的细胞融合效果， 在图 7中， 发 现聚 （4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸） 钠盐能有效抑制 CH0-WT与 MT-2 细胞的融合。 从聚 （4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸） 钠盐抑制 HIV-1病 毒包膜蛋白介导的融合过程， 进一步说明聚 （4-苯乙烯磺酸-共聚- 马来酸） 钠盐是阻止 HIV-1病毒进入细胞来实现抑制病毒的。
我们的研究表明， 聚 （4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸） 钠盐具有较 高的负电荷性，可以与 HIV-1 的胞膜蛋白 gpl20的 V3 片段（正电荷） 发生相互作用， 从而可以阻断 V3 片段与受体 CD4的相互作用， 以达 到阻断 HIV-1病毒进入细胞的作用，或者抑制 CH0-WT与 MT-2细胞的 融合。 体外抗病毒实验证明， 聚 （4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸） 钠盐 具有很强的抗 CD4依赖性 HIV-1感染的能力， 并且对一些临床分离株 也表现为很好的活性， 这其中包括 B' 、 B' C和 CRF01-AE重组亚型。 这说明聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐具有抗 HIV-1 的广谱性。 另外，聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐对 CD4非依赖性的 HIV-1 感染也具有很好的抗感染能力。 对聚 （4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸） 钠盐的体外毒性实验发现， 该化合物具有很低的毒性。 最后， 细胞融 合实验结果表明聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐具有抑制 HIV-1 病毒包膜蛋白 gpl20介导的融合过程的作用。 聚 （4-苯乙烯磺酸-共 聚-马来酸）钠盐来源丰富，生产成本低廉，具有作为一种新型抗 HIV-1 药物及杀微生物剂的潜在应用价值。
在制备抑制 HIV-1 感染的药物组合物时， 将聚 （4-苯乙烯磺酸- 共聚-马来酸） 钠盐作为有效成分， 并加上常规的药用载体。 该药物 组合物可制成注射剂、 片剂、 胶囊剂、 气雾剂、 栓剂、 膜剂、 滴丸剂、 外用搽剂， 或控释或缓释剂型或纳米制剂。

Claims

权利 要 求 书
1、 聚 （4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸） 钠盐在制备抑制 HIV-1感染 的药物中的应用。
2、 抑制 HIV-1感染的药物组合物， 其中含有聚 （4-苯乙烯磺酸- 共聚-马来酸） 钠盐作为有效成分， 并含有常规药用载体。
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