WO2012121392A1 - アゾリン化合物及びアゾール化合物のライブラリー、並びにその製造方法 - Google Patents

アゾリン化合物及びアゾール化合物のライブラリー、並びにその製造方法 Download PDF

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    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Definitions

  • the present invention relates to a library of azoline compounds and azole compounds.
  • a peptide library rich in diversity can be constructed in a short time by preparing an mRNA library and translating it in one pot. Further, by combining with the mRNA display method or the like, it is possible to simultaneously obtain information on the peptide obtained by screening and the nucleic acid encoding the peptide, so that the genotype and the phenotype can be easily correlated. As described above, there are many excellent points in the synthesis of peptide libraries by a translation system, but only peptidic compounds can be produced. In screening using a library, it is often necessary to identify a compound that inhibits a target substance having protease activity. However, since the library of peptidic compounds is cleaved by proteases, it is not possible to efficiently screen for compounds that inhibit the activity of the target substance.
  • patellamide produced by the ascidian symbiotic alga Prochloron didemni is a low-molecular cyclic peptide considered to have various physiological activities, and is biosynthesized through a unique pathway by the products of the pat gene group consisting of patA to G.
  • FIG. 15 shows an outline of the pat gene group and this biosynthetic pathway.
  • the precursor in this biosynthesis is the PatE peptide of the patE gene product. Since the patE gene has a hypervariable region (cassette region), its product constructs a natural combinatorial library.
  • the PatE peptide has a recognition sequence by a post-translational modification enzyme on both sides of the cassette region.
  • PatD introduces an azoline skeleton into Cys, Ser, and Thr in the PatE cassette, and converts Cys into a thiazoline skeleton and Ser and Thr into an oxazoline skeleton.
  • PatA cleaves the recognition sequence on the N-terminal side of the cassette region of PatE.
  • PatG consists of two domains, and the N-terminal oxidase domain converts the azoline skeleton introduced by PatD into an azole skeleton, ie, a thiazoline skeleton into a thiazole skeleton.
  • the C-terminal peptidase domain undergoes macrocyclization while cleaving the C-terminal recognition sequence of the PatE cassette region.
  • Non-patent Document 1 describes the sequences shown in the following table.
  • the sequence of the natural cassette region includes (i) 7 or 8 residues, (ii) the Ser / Thr that is modified in the second, fourth, sixth, and eighth positions from the N-terminus of the cassette region.
  • Residues subject to modification (Ser / Thr / Cys) are rarely lined up
  • Residues other than Ser / Thr / Cys include Val, Ala, Ile , Phe, Leu and many other hydrophobic residues. Therefore, it was thought that these common points were necessary to become substrates for the post-translational modification enzymes PatD and PatG. However, it is unclear which of these Ser / Thr / Cys are modified or not, and the substrate specificity of PatD and PatG has not been clarified so far.
  • An object of the present invention is to provide a method for efficiently producing a library that can be used for screening a compound that has sufficient diversity and binds to a target substance having protease activity.
  • PatE library is expressed by cell-free translation system as a precursor peptide containing PatE leader sequence, recognition sequence 1 by azoline skeleton-introducing enzyme, cassette region, and recognition sequence 2 by azoline skeleton-introducing enzyme This can be efficiently performed in a single pot by modifying it with an azoline skeleton-introducing enzyme and cleaving unnecessary regions, and as a result, it can be used for screening using target substances that are sufficiently diverse and have protease activity.
  • the present invention has been completed.
  • the present invention [1] The following formula (I) A- (Xaa 0 ) m-B (I) [Wherein, m Xaa 0 represent any amino acid, at least one of which is an amino acid selected from the group consisting of Cys, Ser, Thr, 2,3-diamino acid, and analogs thereof, m represents an integer selected from 2 to 40, and A and B each independently represent a peptide consisting of 0 to 100 amino acids.
  • azoline compound library comprising two or more azoline compounds having an azoline skeleton introduced into at least one of Cya, Ser, Thr, 2,3-diamino acid of Xaa 0 , and analogs thereof
  • Manufacturing method In order from the N-terminal, a step of producing an mRNA library encoding a precursor peptide comprising a recognition sequence 1 by an azoline skeleton-introducing enzyme,-(Xaa 0 ) m-, and a recognition sequence 2 by an azoline skeleton-introducing enzyme (here , Recognition sequences 1 and 2 are recognition sequences by an azoline skeleton-introducing enzyme consisting of 0 to 10 amino acids); Using the mRNA library to express the precursor peptide by a cell-free translation system to produce a peptide library; The azoline skeleton-introducing enzyme is reacted with the peptide library in the presence of a peptide containing a leader sequence of the substrate of the azoline skeleton
  • An azoline compound in which an azoline skeleton is introduced into at least one of Cys, Ser, Thr, 2,3-diamino acid of Xaa 0 , and an analog thereof, and the peptide represented by the formula (I) A method for producing an azoline compound library comprising two or more complexes with mRNA encoding a peptide, comprising: In order from the N-terminal, a step of producing an mRNA library encoding a precursor peptide comprising a recognition sequence 1 by an azoline skeleton-introducing enzyme,-(Xaa 0 ) m-, and a recognition sequence 2 by an azoline skeleton-introducing enzyme (here , Recognition sequences 1 and 2 are recognition sequences by an azoline skeleton-introducing enzyme consisting of 0 to 10 amino acids); Binding puromycin to the 3 ′ end of each mRNA in the mRNA library to produce a puromycin-binding mRNA library; Using the puro
  • N Xaa 2 each independently represents an amino acid selected from the group consisting of Cys, Ser, Thr, 2,3-diamino acid, and analogs thereof, and n is an integer selected from 1 to 20 Indicates.
  • the azoline compounds, Cys of Xaa 1 and Xaa 2, Ser, Thr, 2,3-diamino acid, and azoline skeleton at least one of these analogs are introduced, the above-mentioned [1] or [2]
  • a method for producing an azole compound library In the method for producing an azoline compound library according to any one of [1] to [10] above, After the step of introducing the azoline skeleton, the library into which the azoline skeleton has been introduced and the azole skeleton-introducing enzyme are reacted in the presence or absence of a peptide containing a leader sequence of the substrate of the azole skeleton-introducing enzyme, A method comprising a step of converting at least one of the backbone into an azole backbone (wherein the leader sequence refers to a leader sequence of a substrate of an azoline backbone-introducing enzyme consisting of 0 to 50 amino acids); [12] The method according to [11] above, wherein the azole skeleton-introducing enzyme is a mutant lacking
  • At least one of the peptides represented by the formula (I) is an azoline compound library in which m is not 7 or 8; [14] In the formula (I),-(Xaa 0 ) m- is-(Xaa 1 -Xaa 2 ) n- [wherein, n Xaa 1 s independently represent any amino acid.
  • N Xaa 2 each independently represents an amino acid selected from the group consisting of Cys, Ser, Thr, 2,3-diamino acid, and analogs thereof, and n is an integer selected from 1 to 10 Indicates.
  • azoline compound library according to Item; [17]
  • m Xaa 0 represent any amino acid, at least one of which is an amino acid selected from the group consisting of Cys, Ser, Thr, 2,3-diamino acid, and analogs thereof
  • m represents an integer selected from 2 to 40
  • a and B each independently represent a peptide consisting of 0 to 100 amino acids.
  • an azole compound library comprising two or more azole compounds having an azole skeleton introduced into at least one of Cya, Ser, Thr, 2,3-diamino acid of Xaa 0 , and analogs thereof
  • At least one of the peptides represented by the formula (I) is an azole compound library in which m is not 7 or 8; [18] In the formula (I),-(Xaa 0 ) m- is-(Xaa 1 -Xaa 2 ) n- [wherein n Xaa 1 s independently represent any amino acid.
  • N Xaa 2 each independently represents an amino acid selected from the group consisting of Cys, Ser, Thr, 2,3-diamino acid, and analogs thereof, and n is an integer selected from 1 to 20 Indicates.
  • a method for producing an azoline compound in which an azoline skeleton is introduced into at least one of Cys, Ser, Thr, 2,3-diamino acid, and analogs thereof of Xaa 0 wherein: In order from the N-terminal, a step of producing an mRNA encoding a precursor peptide comprising a recognition sequence 1 by an azoline skeleton-introducing enzyme,-(Xaa 0 ) m-, and a recognition sequence 2 by an azoline skeleton-introducing enzyme; 1 and 2 refer to a recognition sequence by an azoline skeleton-introducing enzyme consisting of 0 to 10 amino acids); Expressing the precursor peptide by a cell-free translation system using the mRNA; An azoline skeleton-introducing enzyme is reacted with the precursor peptide in the presence of a peptide containing a leader sequence of a substrate of the azoline skeleton-introducing enzyme, Xaa 0 Cys, Ser, Thr, 2,
  • a method for producing an azole compound comprising: The azoline compound produced by the method described in [29] above is reacted with an azole skeleton-introducing enzyme in the presence or absence of a peptide containing a leader sequence of a substrate of the azole skeleton-introducing enzyme, and at least one of the azoline skeletons
  • a kit for producing an azoline compound or an azole compound comprising an azoline skeleton-introducing enzyme or an azole skeleton-introducing enzyme and a leader sequence of a substrate of the azoline skeleton-introducing enzyme
  • a kit comprising a peptide comprising About comprising about.
  • an azoline compound library and an azole compound library which are much more diverse than a natural PatE library can be obtained by a quick and simple method.
  • an azoline compound or azole compound library it is possible to screen for an azoline compound or azole compound that binds to a target substance having protease activity.
  • an mRNA display method is applied to the azoline compound or azole compound library according to the present invention to produce a library of complexes of the azoline compound or azole compound and the mRNA encoding the peptide portion, they are identified by screening. Since the nucleic acid sequence encoding the azoline compound / azole compound can be determined, the relationship between the structure and activity of the compound can be easily analyzed.
  • FIG. 1 is a schematic view showing one embodiment of a method for producing an azoline compound library of the present invention.
  • FIG. 2 shows the results of mass spectrometry before and after introducing an azoline skeleton with PatD into a precursor peptide having the same cassette region sequence as that of natural PatE.
  • FIG. 3 shows the results of mass spectrometry before and after the introduction of an azoline skeleton with PatD into a precursor peptide having a cassette region of 12 amino acids or 16 amino acids.
  • Figure 4 is a precursor peptide comprising a hydrophilic amino acid residues Xaa 1, shows the results before and after the mass analysis introducing azolin skeleton PATD.
  • FIG. 1 is a schematic view showing one embodiment of a method for producing an azoline compound library of the present invention.
  • FIG. 2 shows the results of mass spectrometry before and after introducing an azoline skeleton with PatD into a precursor peptide having the same cassette region sequence as that of natural PatE
  • FIG. 5 shows the results of summarizing PatD's substrate tolerance based on the results of PatD's introduction of azoline skeleton into various cassette regions.
  • the number of heterocycles introduced after the PatD reaction was indicated by the color intensity in the box as an index.
  • a darker color means that more products with the corresponding number of heterocycles were observed, and a lighter color means that a product was observed as a byproduct.
  • FIG. 6 shows the result of confirming the cleavage of the leader sequence by Glu-C by mass spectrometry.
  • FIG. 7 shows the results of examining the substrate tolerance of PatD when the leader sequence was added to the reaction system as a separate peptide and without the leader sequence.
  • FIG. 8 shows an example of the result of examining the substrate tolerance of PatD by deleting a part of the leader sequence.
  • FIG. 9 shows the results of examining the substrate tolerance of PatD by changing the recognition sequence.
  • FIG. 10A shows an outline of an experiment in which a substrate containing a non-natural amino acid in a cassette sequence was translationally synthesized and PatD substrate tolerance was examined.
  • FIG. 10B shows unnatural amino acids used in the experiment of FIG. 10A.
  • FIG. 11 shows representative results of the experiment of FIG.
  • FIG. 12 shows an outline of screening using the mRNA display method.
  • FIG. 13 shows the results of screening selection by mRNA display performed with MMP12 as a target.
  • FIG. 14 shows the results of evaluating the binding ability of azoline-containing compounds selected by the method of FIG. 13 to MMP12.
  • FIG. 15 is a schematic diagram showing the structure of the pat gene group and the biosynthetic pathway of patellamide.
  • FIG. 16 is an example of the results of examining the substrate tolerance of PatD for a synthetic peptide far from a natural substrate.
  • FIG. 17 is an example of the results of examining the substrate tolerance of PatD for a synthetic peptide far from a natural substrate.
  • FIG. 18 shows the results of examination of PatD substrate tolerance in the case where a Lacticin 481 precursor-derived or human actin-derived sequence was used as the leader sequence, and in which the PatE leader sequence was shuffled.
  • FIG. 19 shows the result of examining the substrate tolerance of PatD by deleting a part of the leader sequence.
  • FIG. 20 shows the results of examining the substrate tolerance of PatD by introducing a point mutation into the leader sequence.
  • FIG. 9 shows the results of examining the substrate tolerance of PatD by changing the recognition sequence.
  • the present invention provides a method for producing an azoline compound library including two or more azoline compounds.
  • azoline compound means that an azoline skeleton is introduced into at least one of Cys, Ser, Thr, 2,3-diamino acid, and analogs of the peptide represented by the following formula (I). Refers to a compound.
  • m Xaa 0 represent any amino acid, at least one of which is an amino acid selected from the group consisting of Cys, Ser, Thr, 2,3-diamino acid, and analogs thereof, m represents an integer selected from 2 to 40, and A and B each independently represent a peptide consisting of 0 to 100 amino acids.
  • n Xaa 1 each independently represents an arbitrary amino acid
  • n Xaa 2 each independently represents a group consisting of Cys, Ser, Thr, 2,3-diamino acid, and analogs thereof.
  • N represents an amino acid selected from n
  • n represents an integer selected from 1 to 20.
  • Cys, Ser, Thr, 2,3-diamino acid and an analog thereof into which an azoline skeleton has been introduced may be at the position of Xaa 1 or at the position of Xaa 2 .
  • amino acid is used in its broadest sense and includes artificial amino acid variants and derivatives in addition to natural amino acids.
  • amino acids include natural proteinaceous L-amino acids; D-amino acids; chemically modified amino acids such as amino acid variants and derivatives; natural non-protein amino acids such as norleucine, ⁇ -alanine, ornithine; and amino acid characteristics. And chemically synthesized compounds having properties known in the art.
  • non-natural amino acids include ⁇ -methyl amino acids (such as ⁇ -methylalanine), D-amino acids, histidine-like amino acids (such as ⁇ -hydroxy-histidine, homohistidine, ⁇ -fluoromethyl-histidine and ⁇ -methyl-histidine) Amino acids having an extra methylene in the side chain (“homo" amino acids) and amino acids in which the carboxylic acid functional amino acids in the side chain are replaced with sulfonic acid groups (such as cysteic acid).
  • ⁇ -methyl amino acids such as ⁇ -methylalanine
  • D-amino acids such as ⁇ -methylalanine
  • histidine-like amino acids such as ⁇ -hydroxy-histidine, homohistidine, ⁇ -fluoromethyl-histidine and ⁇ -methyl-histidine
  • Amino acids having an extra methylene in the side chain (“homo" amino acids)
  • amino acids are represented by commonly used one-letter code or three-letter code.
  • Amino acids represented by one-letter code or three-letter code shall include variants and derivatives thereof, respectively.
  • Examples of the analog of Thr include, but are not limited to, those represented by the following formula. [Wherein, R represents a hydrogen atom or an optionally substituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms or an optionally substituted aromatic group. ]
  • Cys analogs include, but are not limited to, those represented by the following formulae. [Wherein, R represents a hydrogen atom or an optionally substituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms or an optionally substituted aromatic group. ]
  • Ser and Thr analogs include, but are not limited to, the following.
  • 2,3-diamino acids and analogs thereof include, but are not limited to, the following.
  • R represents a hydrogen atom or an optionally substituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms or an optionally substituted aromatic group.
  • the azoline skeleton is introduced into at least one of Cys, Ser, Thr, 2,3-diamino acid, and analogs thereof” means Cys, Ser, Thr, 2,3-diamino. It means that a dehydration reaction occurs in the acid and an azoline ring represented by the following formula is introduced.
  • Xaa 0 represents any amino acid as long as it contains at least one Cys, Ser, Thr, 2,3-diamino acid, and analogs thereof.
  • azoline skeleton-introducing enzymes such as PatD were considered to modify only a cassette region having a predetermined regularity of 7 or 8 amino acids.
  • m is 2 to 40. A wide range of sequences can be substrates.
  • Xaa 1 independently represents any amino acid.
  • a peptide that is a substrate for an azoline skeleton-introducing enzyme such as PatD
  • the residues to be modified are few, but as shown in the examples described later, Xaa 1 is Even if it is Cys, Ser or Thr and is the same amino acid as the adjacent Xaa 2
  • the peptide of the formula (I) can be a substrate of the azoline skeleton transducing enzyme.
  • m is an integer of 2 or more, and is an integer of 16 or less, 18 or less, 20 or less, 30 or less, or 40 or less.
  • N is an integer of 1 or more, and may be an integer of 8 or less, 9 or less, 10 or less, or 20 or less.
  • a and B each independently represent a peptide consisting of 0 to 100 amino acids.
  • A may contain all or part of the recognition sequence 1 by the azoline skeleton-introducing enzyme. Further, it may contain all or part of the leader sequence of PatE, His tag, linker and the like.
  • B may comprise all or part of the recognition sequence 2. Moreover, a His tag, a linker, etc. may be included.
  • the length of A and B can be, for example, 100, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 2, 0 amino acids, but is not limited thereto.
  • one or several amino acids may be modified amino acids or amino acid analogs.
  • One embodiment of the method for producing an azoline compound library of the present invention comprises, in order from the N-terminal, a recognition sequence 1 by an azoline skeleton-introducing enzyme,-(Xaa 1 -Xaa 2 ) n-, and a recognition sequence 2 by an azoline skeleton-introducing enzyme.
  • Producing an mRNA library encoding the precursor peptide comprising.
  • Azolin skeleton introduced recognition sequences 1 and 2 by the enzyme refers to the recognition sequence by azolin skeleton introduced enzyme consisting of 0-10 amino acids, azoline skeleton introduced enzyme recognizes this - (Xaa 0) m- in introducing azolin skeleton Any arrangement may be used as long as it does.
  • the recognition sequence 1 include G (A / L / V) (G / E / D) (A / P) (S / T / C) (SEQ ID NO: 2).
  • GLEAS SEQ ID NO: 3 may be used.
  • the recognition sequence 2 by the azoline skeleton-introducing enzyme one containing (A / S) Y (D / E) G (A / L / V) (SEQ ID NO: 4) can be used.
  • such sequences may be AYDGVEPS (SEQ ID NO: 5), AYDGV (SEQ ID NO: 6), AYDGVGSGSGS (SEQ ID NO: 7), AYDGVGGGGGG (SEQ ID NO: 8), AYDGVEGSGSGS (SEQ ID NO: 9).
  • the precursor peptide can be a substrate for an azoline skeleton-introducing enzyme without the recognition sequences 1 and / or 2, the recognition sequences 1 and 2 are optional components of the precursor peptide.
  • the precursor peptide can serve as a substrate for the azoline skeleton-introducing enzyme even when a sequence that has nothing to do with a sequence known as a conventional recognition sequence is used as the recognition sequences 1 and 2.
  • the recognition sequence 1 on the N-terminal side of-(Xaa 1 -Xaa 2 ) n- is more susceptible to modification by the azoline skeleton-introducing enzyme, but the sequence is not particularly limited as long as it exists.
  • sequences such as GGGGG, QQQQQ, LLLLL, and PPPPP may be used as the recognition sequence 1
  • the precursor peptide may be further fused with a peptide containing a leader sequence on the N-terminal side.
  • the leader sequence, the recognition sequence 1 by azoline ring-introducing enzyme,-(Xaa 0 ) m-, and the recognition sequence 2 by azoline ring-introducing enzyme may be adjacent to each other in the precursor peptide. 1 to several amino acid sequences may be sandwiched between them as long as they are expressed in and modified by an azoline ring-introducing enzyme.
  • a library of mRNAs encoding-(Xaa 0 ) m- has, for example, sequences of-(NNN) n-,-(NNK) n-,-(NNU) n-,-(NNG) n-, etc. It can be produced by synthesizing the contained DNA and transcribing it.
  • N means any one of A / C / G / T
  • K means any one of G / T
  • NNN and NNK are any one of 20 kinds of proteinaceous amino acids.
  • NNU and NNG encode any one of 15 and 14 proteinaceous amino acids, respectively.
  • a library of mRNA encoding-(Xaa 1 -Xaa 2 ) n- synthesizes DNA containing sequences such as-(NNK-WSU) n- and-(NNK-UGU) n- It can be produced by transferring.
  • N is any one of A / C / G / T
  • K is any one of G / T
  • W is any one of A / T
  • S is C / G.
  • NNN and NNK encode any one of the 20 proteinaceous amino acids
  • WSU encodes any one of Ser / Thr / Cys
  • UGU encodes Cys.
  • One embodiment of the method for producing an azoline compound library of the present invention includes a step of producing the peptide library by expressing the precursor peptide by a cell-free translation system using the mRNA library.
  • Cell-free translation systems include, for example, ribosomal proteins, aminoacyl-tRNA synthetase (ARS), ribosomal RNA, amino acids, GTP, ATP, translation initiation factor (IF) elongation factor (EF), termination factor (RF), and ribosome regeneration factor (RRF), as well as other factors required for translation.
  • IF translation initiation factor
  • EF elongation factor
  • RF termination factor
  • RRF ribosome regeneration factor
  • E. coli extract or wheat germ extract may be used.
  • rabbit erythrocyte extract or insect cell extract may be used.
  • RNA polymerase As cell-free translation systems on the market, E. coli-derived systems such as RTS-100 (registered trademark) from Roche Diagnostics, PURESYSTEM (registered trademark) from PGI, etc. For example, those from Zoigene or Cell Free Science can be used. According to the cell-free translation system, the peptide can be modified in one pot by adding a post-translational modification enzyme to the same container without purifying the expression product.
  • an azoline skeleton-introducing enzyme and the above peptide library are reacted in the presence of a peptide containing a substrate leader sequence of the azoline skeleton-introducing enzyme, Cys, Ser , Thr, 2,3-diamino acid, and a step of introducing an azoline skeleton into at least one of these analogs. More specifically, Ser and Thr are introduced with an oxazoline skeleton, Cys with a thiazoline skeleton, and 2,3-diamino acid with an imidazoline skeleton.
  • the leader sequence is a sequence that facilitates modification by an azoline skeleton-introducing enzyme, and any sequence may be used as long as this purpose is achieved.
  • the precursor peptide containing the recognition sequence 1,-(Xaa 1 -Xaa 2 ) n-, and the recognition sequence 2 is a substrate for an azoline skeleton-introducing enzyme even in the absence of a leader sequence. It can be.
  • the leader sequence can be, for example, about 5 amino acids, 7 amino acids, 10 amino acids, 20 amino acids, 30 amino acids, 40 amino acids, 50 amino acids.
  • leader sequence for example, a peptide comprising the following amino acid sequence, a partial sequence of this amino acid sequence, or an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, added, or substituted in this amino acid sequence is used. it can. MNKKNILPQQGQPVIRLTAGQLSSQLAELSEEALGDA (SEQ ID NO: 1)
  • the partial sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 can include a sequence of 4 or more amino acids, 5 or more amino acids, or 6 or more amino acids.
  • the position of SEQ ID NO: 1 is not particularly limited.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may include C-terminal 4 amino acids, 5 amino acids, or 6 amino acids.
  • the precursor peptide can serve as a substrate for the azoline skeleton-introducing enzyme, even if a sequence that has nothing to do with the conventional PatE leader sequence is used as the leader sequence.
  • a sequence such as MKEQNSFNLLQEVTESELDLILGA derived from another peptide (Lacticin481 precursor), a sequence such as MILASLSTFQQMWISKQEYDEAGDA derived from human actin, or MELQLRPSGLEKKQAPISELNIAQTQGGDSQVLALNA may be used as the leader sequence.
  • a sequence having high helicity (alpha helicity) may be used as the leader sequence.
  • the peptide when “in the presence of a peptide containing a leader sequence of a substrate for an azoline skeleton-introducing enzyme”, the peptide is identified in the reaction system by a recognition sequence 1,-(Xaa 1 -Xaa 2 ) n-, and It may exist as a peptide separate from the precursor peptide containing recognition sequence 2, or fused to a precursor peptide containing recognition sequence 1,-(Xaa 1 -Xaa 2 ) n-, and recognition sequence 2 Also good.
  • the leader sequence, the recognition sequence 1, the cassette sequence, and the recognition sequence 2 are fused.
  • the present inventors have recognized the recognition sequence 1,-(Xaa When reacting a precursor peptide containing 1- Xaa 2 ) n- and recognition sequence 2 with an azoline skeleton-introducing enzyme, even if the leader sequence is added as an independent peptide to the reaction system, the precursor peptide is introduced into the azoline skeleton. It has been found that it can be a substrate for enzymes.
  • the leader sequence is a peptide different from the precursor peptide containing the recognition sequence 1,-(Xaa 1 -Xaa 2 ) n-, and the recognition sequence 2, each peptide (ie, the peptide containing the leader sequence and the precursor peptide).
  • leader sequence can be shortened, and preparation becomes easy. If the leader sequence is also fused, it may become a steric hindrance during binding to the target molecule, so it is desirable to cleave it before screening, but if it is originally a separate peptide, it will cleave. There is no need to do.
  • Each peptide may be prepared by translational synthesis or by chemical synthesis.
  • Examples of the azoline skeleton-introducing enzyme include PatD and an enzyme having homology thereto.
  • enzymes having homology with PatD for example, those included in the report of Lee et al. (Lee, SW et al., PNAS vol.105, No.15, 5879-5884, 2008) can be used. It is not limited to.
  • the azoline skeleton-introducing enzyme may be extracted and purified from a microorganism that produces the azoline skeleton-introducing enzyme, or may be expressed by a gene recombination method. For example, according to a conventional method, it can be expressed in E. coli as a construct with a His tag at the N-terminus and purified using the His tag.
  • the azoline skeleton-introducing enzyme may be a mutant as long as the azoline skeleton is introduced.
  • the reaction between the azoline skeleton-introducing enzyme and the peptide library is carried out by adding the azoline skeleton-introducing enzyme in the same container in which the above-mentioned precursor peptide is expressed, that is, in one pot without purifying the precursor peptide. It can be carried out.
  • the reaction between the azoline skeleton-introducing enzyme and Pat library is in the range of final concentration 0.1 ⁇ M to 50 ⁇ M, reaction temperature 4 ° C. to 45 ° C., reaction time 5 minutes to 100 hours, etc.
  • the confirmation of the reaction can be performed, for example, by measuring mass change using MALDI-TOF-MS.
  • a leader sequence when a leader sequence is fused with a precursor peptide containing recognition sequence 1,-(Xaa 1 -Xaa 2 ) n-, and recognition sequence 2
  • the step of cleaving the leader sequence from the precursor peptide may be performed.
  • the cassette region represented by-(Xaa 0 ) m- becomes easy to bind to the target substance.
  • the leader sequence can also be cleaved by adding peptidase in the same container as that used for the reaction of the azoline skeleton-introducing enzyme.
  • the leader sequence is cleaved by cleaving any of the leader sequence, recognition sequence 1, the binding site between leader sequence and recognition sequence 1, the binding site between recognition sequence 1 and the cassette region, and the binding site between cassette region and recognition sequence 2.
  • the peptidase is selected depending on the sequence of the site to be cleaved.
  • Peptidases include trypsin, Glu-C, Lys-C, Asp-N, Lys-N, Arg-C, thrombin, Factor Xa, prescission protease, TEV protease, enterokinase, HRV 3C Protease, etc. It is not limited.
  • the recognition sequence 1 of the azoline skeleton-introducing enzyme is GLEAS
  • it can be performed using endoproteinase Glu-C and can be cleaved between Glu and Ala.
  • the reaction of Glu-C can be performed according to a known method.
  • One embodiment of the method for producing an azoline compound library of the present invention is to produce an azoline compound library comprising two or more complexes of an azoline compound and mRNA encoding the peptide represented by the formula (I). is there.
  • an azoline compound library can be used for mRNA display (Nemoto, N. et al., FEBS Lett. 1997, 405-408; Roberts, RW and Szostak, JW Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 12297. -12302).
  • an azoline compound-mRNA complex library When such an azoline compound-mRNA complex library is used to screen for an azoline compound that binds to a target substance, the selected azoline compound-mRNA complex is subjected to a reverse transcription reaction to contain a cDNA. A body can be obtained and its base sequence determined.
  • puromycin is bound to the 3 ′ end of each mRNA of the mRNA library by a known method to prepare a puromycin-binding mRNA library.
  • This puromycin-binding mRNA library Can be used to express the precursor peptide by a cell-free translation system.
  • PatD the leader sequence is cleaved to obtain an azoline compound library.
  • At least one of the peptides represented by the formula (I) has at least one of the following features (i) to (iv).
  • (i) m is 2 to 40 (excluding 7 and 8).
  • m is, for example, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 10, 12, 14, 16, 20, 30, 40;
  • (ii) n is 1 to 20 (excluding 3 and 4).
  • n is, for example, 1, 2, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20;
  • At least one, at least 2, at least 3, at least 4, or at least 5 of Xaa 1 is an amino acid selected from Cys, Ser, Thr, 2,3-diamino acid, and analogs thereof ;as well as (iv) At least one, at least 2, at least 3, at least 4, or at least 5 of Xaa 1 are hydrophilic amino acids.
  • Peptides having the characteristics (i) to (iv) include those conventionally considered not to be a substrate for an azoline skeleton-introducing enzyme such as PatD. It has been confirmed that it can be.
  • cassette sequences that have been confirmed to be substrates for azoline skeleton-introducing enzymes for the first time.
  • At least one of the azoline compounds has 5 or more azoline skeletons.
  • the azoline compound having 5 or more azoline skeletons was synthesized for the first time by the present inventors.
  • At least one of the azoline compounds has an azoline skeleton other than a normal oxazoline / thiazoline obtained from Ser / Thr / Cys.
  • an azoline skeleton-introducing enzyme was used, an azoline skeleton was not introduced other than Ser / Thr / Cys present in the natural PatE cassette region.
  • the method includes a step of macrocyclizing the azoline compound before or after cleavage of the leader sequence.
  • Macrocyclization of an azoline compound can be performed using a known method for macrocyclizing a peptide or a method analogous thereto, such as the method disclosed in International Publication No. 2008/117833, the method of Timmerman et al. , P et al., ChemBioChem 2005, 6: 821-824).
  • the present invention also provides a method for producing an azole compound library containing two or more azole compounds.
  • the terms used in the method for producing an azole compound library of the present invention are understood to have the same meaning unless otherwise specified.
  • the “azole compound” refers to a peptide represented by the following formula (I) in which an azole skeleton is introduced into at least one of Cys, Ser, Thr, 2,3-diamino acid, and analogs thereof. Refers to the compound.
  • n Xaa 1 each independently represents an arbitrary amino acid
  • n Xaa 2 each independently represents a group consisting of Cys, Ser, Thr, 2,3-diamino acid, and analogs thereof.
  • N represents an amino acid selected from n
  • n represents an integer selected from 1 to 10.
  • Cys, Ser, Thr, 2,3-diamino acid into which an azole skeleton is introduced, and analogs thereof may be at the position of Xaa 1 or at the position of Xaa 2 .
  • the azole skeleton is introduced into at least one of Cys, Ser, Thr, 2,3-diamino acid, and analogs thereof” is caused by a dehydration reaction of Cys, Ser, Thr. It means that the azoline ring oxidation reaction is promoted and an azole ring represented by the following formula is introduced.
  • One aspect of the method for producing an azole compound library of the present invention is the above-described method for producing an azoline compound library, wherein the azoline skeleton is introduced after the step of introducing the azoline skeleton, the azole skeleton introducing enzyme, And converting at least one of the azoline skeletons to an azole skeleton.
  • the oxazoline skeleton introduced into Ser and Thr is converted into an oxazole skeleton
  • the imidazoline skeleton introduced into 2,3-diamino acid into an imidazole skeleton.
  • the step of reacting the library into which the azoline skeleton is introduced and the azole skeleton-introducing enzyme may be performed in the presence of a peptide containing a leader sequence of the substrate of the azole skeleton-introducing enzyme.
  • the peptide containing the azole backbone transducing enzyme substrate leader sequence may be the same as the peptide containing the azoline backbone transducing enzyme substrate leader sequence, or a different peptide may be used.
  • Examples of azole skeleton-introducing enzymes include PatG and enzymes having homology thereto. As enzymes having homology with PatG, for example, those included in the report of Lee et al.
  • the reaction with the azole skeleton-introducing enzyme can be carried out by adding the azole skeleton-introducing enzyme in the same container as the reaction with the azoline skeleton-introducing enzyme.
  • a mutant lacking the peptidase domain of PatG or a mutant lacking peptidase activity due to a point mutation is used as an azole skeleton-introducing enzyme.
  • PatG is composed of two domains. In nature, the N-terminal oxidase domain converts an azoline skeleton constructed with PatD into an azole skeleton, and the C-terminal peptidase domain excises the modified peptide site, creating a macrocycle. Is going on. Therefore, in the method for producing an azole compound library of the present invention, a mutant lacking the peptidase domain or a mutant having no peptidase activity due to a point mutation can be used.
  • the present invention also provides a library of two or more azoline compound.
  • the terms used here the terms used in the above-described library production method are understood to have the same meaning unless otherwise specified.
  • One embodiment of the azoline compound library of the present invention contains at least one azoline compound having at least one of the following characteristics (i) to (iv).
  • (i) m is 2 to 20 (except 7 and 8).
  • m can be, for example, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 10, 12, 14, 16, 20, 30, 40;
  • n is 1 to 10 (excluding 3 and 4).
  • n can be, for example, 1, 2, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20;
  • At least one, at least 2, at least 3, at least 4, or at least 5 of Xaa 1 is an amino acid selected from Cys, Ser, Thr, 2,3-diamino acid, and analogs thereof ;as well as (iv) At least one, at least 2, at least 3, at least 4, or at least 5 of Xaa 1 are hydrophilic amino acids.
  • Peptides having the characteristics (i) to (vi) include those previously considered not to be a substrate for an azoline skeleton-introducing enzyme such as PatD. It has been confirmed that it can be.
  • each azoline compound forms a complex with mRNA encoding the peptide portion.
  • This library can be applied to mRNA display.
  • all or part of the recognition sequence of the azoline skeleton-introducing enzyme is bound to the N-terminus and C-terminus of the peptide represented by the above formula (I).
  • the recognition sequence of the azoline skeleton-introducing enzyme is necessary to modify a peptide expressed in a cell-free translation system with the azoline skeleton-introducing enzyme.
  • all or part of these sequences may remain at the N-terminus and C-terminus.
  • the recognition sequence 1 is GLEAS (SEQ ID NO: 3) and the leader sequence is cleaved with Glu-C, Ala-Ser remains on the N-terminal side of the cassette region.
  • the present invention also provides a library of two or more azole compounds.
  • the terms used here the terms used in the above-described library production method are understood to have the same meaning unless otherwise specified.
  • One embodiment of the azole compound library of the present invention contains at least one azoline compound having at least one of the following characteristics (i) to (iv).
  • (i) m is 2 to 20 (except 7 and 8).
  • m is, for example, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 10, 12, 14, 16, 20, 30, 40;
  • (ii) n is 1 to 10 (excluding 3 and 4).
  • n is, for example, 1, 2, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20;
  • At least one, at least 2, at least 3, at least 4, or at least 5 of Xaa 1 is an amino acid selected from Cys, Ser, Thr, 2,3-diamino acid, and analogs thereof ;as well as (iv) At least one, at least 2, at least 3, at least 4, or at least 5 of Xaa 1 are hydrophilic amino acids.
  • Peptides having the characteristics (i) to (iv) include those conventionally considered not to be a substrate for an azoline skeleton-introducing enzyme such as PatD. It has been confirmed that it can be. Therefore, it is understood that after the azoline skeleton is introduced by the azoline skeleton-introducing enzyme, the azole skeleton can be introduced by modification with the azole skeleton-introducing enzyme.
  • each azole compound forms a complex with mRNA encoding the peptide portion.
  • This library can be applied to mRNA display.
  • all or part of the recognition sequence of PatD is bound to the N-terminus and C-terminus of the peptide represented by the above formula (I).
  • the PatD recognition sequence is necessary to modify the peptide expressed in the cell-free translation system with PatD. And all or part of these sequences may remain at the C-terminus.
  • the recognition sequence 1 is GLEAS and the leader sequence is cleaved with Glu-C, Ala-Ser remains on the N-terminal side of the cassette region.
  • the present invention provides a screening method for identifying an azoline compound that binds to a target substance.
  • One aspect of the screening method of the present invention includes a step of incubating the azoline compound library according to the present invention or the azoline compound library according to the present invention in contact with a target substance.
  • the target substance is not particularly limited, and may be a low molecular compound, a high molecular compound, a nucleic acid, a peptide, a protein, or the like.
  • the library of the present invention can be used even when the target substance has protease activity.
  • the target substance can be immobilized on a solid phase carrier and brought into contact with the library of the present invention.
  • the “solid phase carrier” is not particularly limited as long as it is a carrier capable of immobilizing a target substance, and is made of a microtiter plate made of glass, metal, resin, etc., substrate, beads, nitrocellulose membrane, nylon membrane , PVDF membranes and the like, and the target substance can be fixed to these solid phase carriers according to a known method.
  • the target substance and the library are brought into contact in an appropriately selected buffer solution, and reacted by adjusting pH, temperature, time and the like.
  • One aspect of the screening method of the present invention further includes a step of selecting an azoline compound bound to a target substance.
  • the peptide is labeled according to a known method for detectably labeling, and after the contact step, the surface of the solid phase carrier is washed with a buffer solution, and the azoline bound to the target substance is obtained. This is done by detecting the compound.
  • Detectable labels include enzymes such as peroxidase and alkaline phosphatase, radioactive substances such as 125 I, 131 I, 35 S, and 3 H, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, dansyl chloride, phycoerythrin, tetramethylrhodamine isothiocyanate, near red Examples include fluorescent materials such as outer fluorescent materials, luminescent materials such as luciferase, luciferin, and aequorin, and nanoparticles such as gold colloids and quantum dots.
  • an enzyme substrate can be added to cause color development and detection. It can also be detected by binding biotin to the peptide and binding avidin or streptavidin labeled with an enzyme or the like.
  • an azoline compound having physiological activity and useful as a pharmaceutical can be identified.
  • the step of analyzing the mRNA base sequence of the selected azoline compound is performed. May be. Analysis of the base sequence of mRNA can be performed by first synthesizing cDNA by a reverse transcription reaction and analyzing the base sequence of the cDNA. Thereby, the relationship between a genotype and a phenotype can be easily specified. In addition, after the reverse transcription reaction, further transcription is performed, conversion into an mRNA library is performed again, and screening using the target compound is repeated, whereby an azoline compound having a strong binding ability to the target substance can be concentrated.
  • the present invention provides a screening method for identifying an azole compound that binds to a target substance.
  • One aspect of the screening method of the present invention includes the step of incubating the azole compound library according to the present invention or the azole compound library according to the present invention in contact with a target substance.
  • the azole compound screening method can be performed according to the above-described azoline compound screening method.
  • the present invention provides a screening kit for an azoline compound or an azole compound.
  • One aspect of the screening kit of the present invention includes the azoline compound library or azole compound library produced by the production method according to the present invention, or the azoline compound library or azole compound library according to the present invention.
  • the screening kit of the present invention further includes reagents and devices necessary for detecting the binding between the target substance and the azoline compound or azole compound. Examples of such reagents and devices include, but are not limited to, solid phase carriers, buffers, labeling reagents, enzymes, enzyme reaction stop solutions, and microplate readers.
  • the library may be immobilized in an array on a solid phase carrier.
  • the present invention relates to an azoline compound having an azoline skeleton introduced into at least one of Cys, Ser, Thr, 2,3-diamino acid of Xaa 0 , and analogs thereof in the peptide represented by the formula (I).
  • a manufacturing method is also provided.
  • the method comprises the steps of producing mRNA encoding a precursor peptide comprising a recognition sequence 1 by an azoline skeleton-introducing enzyme,-(Xaa 0 ) m-, and a recognition sequence 2 by an azoline skeleton-introducing enzyme in this order from the N-terminus (here And the recognition sequences 1 and 2 are recognition sequences by an azoline skeleton-introducing enzyme consisting of 0 to 10 amino acids); Expressing the precursor peptide by a cell-free translation system using the mRNA; An azoline skeleton-introducing enzyme and a precursor peptide are reacted in the presence of a peptide containing a leader sequence of the substrate of the azoline skeleton-introducing enzyme, and Xaa 0 Cys, Ser, Thr, 2,3-diamino acid, and these Introducing an azoline skeleton into at least one of the analogs.
  • the peptide containing the leader sequence and the precursor peptide containing the recognition sequence 1,-(Xaa 0 ) m-, and the recognition sequence 2 are separate peptides. According to this method, the peptide containing the leader sequence and the precursor peptide containing the recognition sequence 1,-(Xaa 0 ) m-, and the recognition sequence 2 can be made shorter, respectively. Is easy. The preparation can be performed by chemical synthesis, translation synthesis, a combination thereof, or the like. Also, it is not necessary to separate the leader sequence prior to screening. Therefore, this method is particularly advantageous when a large amount of the azoline compound is prepared after the azoline compound that binds to the target substance is identified by the screening method of the present invention.
  • the present invention also includes a method for producing an azole compound using the azoline compound obtained by the above-described method for producing an azoline compound.
  • the method includes a step of reacting an azoline compound and an azole skeleton-introducing enzyme in the presence of a peptide containing a leader sequence of a substrate of the azole skeleton-introducing enzyme to convert at least one of the azoline skeleton into an azole skeleton.
  • the peptide containing the leader sequence and the azoline compound can be made shorter, respectively, it is easy to prepare.
  • the preparation can be performed by chemical synthesis, translation synthesis, a combination thereof, or the like. Also, it is not necessary to separate the leader sequence prior to screening. Therefore, this method is particularly advantageous when a large amount of the azole compound is prepared after the azole compound that binds to the target substance is identified by the screening method of the present invention.
  • kits for producing an azoline compound and an azole compound according to the present invention produces an azoline compound or an azole compound by the above-described method, it includes an azoline skeleton-introducing enzyme or an azole skeleton-introducing enzyme and a leader sequence of an azole skeleton-introducing enzyme substrate. Peptides.
  • the kit may include other necessary reagents, instruments, instruction manuals, and the like.
  • FIG. [1] A synthesis scheme of an azoline compound library in the following examples is shown in FIG. [1] Expression and purification of PatD
  • the PatD gene was introduced into the plasmid of pET16b to prepare a plasmid of a construct with a 10xHis tag attached to the N-terminus.
  • E. coli BL21 (DE3) pLysS strain was transformed and cultured at 30 ° C. When OD reached 0.4, IPTG 0.1 mM was added to induce mass expression, and then cultured overnight.
  • the collected cells were suspended in Lysis Buffer (1M NaCl, 10 mM Imidazole, 50 mM HEPES-Na (pH 7.5)), and then disrupted by ultrasonic waves.
  • the filtered sample was purified using a His-Trap HP column.
  • the column was equilibrated in advance with 10 CV Buffer A (500 mM NaCl, 25 mM Imidazole, 50 mM HEPES-Na (pH 7.5)), and after sample injection, Buffer B (500 mM NaCl, 500 mM Imidazole, 50 mM HEPES-Na (pH 7.5)) )
  • Buffer B 500 mM NaCl, 500 mM Imidazole, 50 mM HEPES-Na (pH 7.5)
  • the protein in the sample was separated by gradually increasing the concentration, and a pure PatD fraction was obtained.
  • the obtained sample was concentrated about 4-fold using Amicon Ultra (Millipore) 30 kDa. Thereafter, the buffer was exchanged into Store Buffer (200 mM NaCl, 25 mM HEPES (pH 7.5), 10% glycerol) using PD-10 (GE lifescience
  • PatE plasmid (pET16b) The following PatE sequence was subcloned into pET16b. ATGAACAAGAAAAACATCCTGCCCCAACAAGGTCAACCGGTTATCCGCTTAACCGCAGGACAGTTGAGCTCGCAACTCGCCGAACTGTCTGAAGAAGCACTGGGCGACGCGGGGTTGGAGGCAAGCGTTACGGCGTGTATCACGTTTTGTGCGTACGATGGCGTTGAGCCATCTATTACGGTCTACATTAGTGTCTGCGTA
  • PatEpre encodes a peptide consisting of the following amino acid sequence including a leader sequence and a recognition sequence (underlined).
  • MNKKNILPQQGQPVIRLTAGQLSSQLAELSEEALGDA GLEAS The primers used for PatEpre PCR are shown in the table below. Primer sequences are shown in the following primer list.
  • [3-2-2] Peptides with recognition sequence 2 other than AYDGVEPS (SEQ ID NO: 5) Similarly, DNA of peptides whose C-terminal sequence is other than AYDGVEPS is prepared by performing PCR twice or three times using PatEpre2 as a template. did. MNKKNILPQQGQPVIRLTAGQLSSQLAELSEEALGDAGLEAS (XXX) (YYY) (XXX) indicates the cassette region, and (YYY) indicates the recognition sequence 2.
  • the primers used are shown below. Primer sequences are shown in the following primer list.
  • [4] PatD enzyme reaction The DNA prepared in 3-2 was transcribed and transferred in a 2.5 ⁇ l cell-free protein expression system according to the method of Kawakami et al. (Kawakami et al., Chemistry & Biology 15, 32-42 (2008)). After translation, 40 mM Tris-HCl (pH 8.0), 8 mM DTT, 4 mM MgCl2, 0.8 mM ATP (each final concentration) was added to adjust the solution conditions, and then recombinant PatD was added. The reaction was performed under the following two conditions.
  • FIG. 2 shows the results of mass spectrometry when C1wt having the same amino acid sequence in the cassette region as that of wild-type PatE is modified with PatD. As a result, changes in molecular weight showing formation of four azoline rings were observed. Further, FIG.
  • FIG. 6 shows mass spectrometry of the modified peptide cleaved from the leader sequence obtained as a result of such an experiment.
  • MNKKNILPQQGQPVIRLTAGQLSSQLAELSEEALGDAGLEA (X C / S / T) nAYDGVGSGSGS (SEQ ID NO: 65)
  • the types of primers used for each library construction are shown below. Primer sequences are shown in the following primer list.
  • leader sequence In order to examine the necessity of the leader sequence, in the same manner as in [1] to [8] above, when the leader sequence is removed from the substrate peptide, the leader sequence is translated and synthesized as a peptide separate from the substrate peptide. Thus, the experiment was conducted with respect to the case of adding a chemically synthesized leader sequence to final concentrations of 1 uM, 10 uM, and 50 uM.
  • the cassette sequence was 8 amino acids (VTACITFC). The results are shown in FIG.
  • leader sequence is fused to the substrate peptide, the modification efficiency by the enzyme increases, but even if there is no leader sequence, one molecule is dehydrated, and it is found that the leader sequence is not essential to become a substrate for the enzyme It was. In addition, if the leader sequence was present in the reaction system, dehydration of 4 molecules was observed even if it was not fused with the substrate peptide, confirming that the substrate peptide was sufficiently modified. This suggests that the leader sequence is not necessary for substrate selection, and that the structure of the leader sequence contributes to the activation of the enzyme and affects the reaction efficiency.
  • leader sequence (2) In the same manner as in [1] to [8] above, a part of the leader sequence was deleted as shown in FIGS. 8 and 19, and the enzyme activity by PatD was confirmed. As shown in FIGS. 8 and 19, it was found that the full-length leader sequence is not essential for modification by PatD. In addition, it was confirmed that the sequence on the C-terminal side is important for the modification by PatD, and if the C-terminal of the leader sequence is included, for example, even about 6 amino acids are sufficiently modified by PatD.
  • leader sequence (3) Examination of leader sequence (3) In the same manner as in [1] to [8] above, the entire leader sequence was replaced with a completely different peptide sequence as shown in FIG. 18, and the enzyme activity by PatD was confirmed. As shown in FIG. 18, the leader sequence that needs to be present in order to be modified by PatD is not limited to the leader sequence of PatE. It was confirmed that the leader sequence may be a shuffled sequence.
  • FIG. 10A a substrate containing a non-natural amino acid in the cassette sequence was translationally synthesized and modified with PatD.
  • the amino acids used are shown in FIG. 10B.
  • FIG. 10B A typical result is shown in FIG.
  • FIG. 11 Thr isomers, substituted Sers, diamino acids, and the like that were not previously considered to be PatD substrates are also modified by PatD and converted to the corresponding azoline ring skeleton. It was confirmed.
  • MMP12 MMP12 was expressed in E. coli as a construct with a 6xHis tag and an Avi tag attached to the C-terminus. Purification was performed using a His tag. In addition, since the Avi tag is biotinylated by BirA expressed by birA incorporated in the same plasmid, MMP12 was added for immobilization with streptavidin beads during mRNA display.
  • [16-3-8] Identification of selected azoline-containing compound sequence The above-described series of operations is repeated, and TA cloning is performed using the amplified DNA when no change is observed in the DNA recovery rate. The sequence of the azoline-containing compound was identified.
  • [16-3-9] Evaluation of binding ability of selected azoline-containing compound According to the mRNA display scheme, a series of operations are performed from mRNA of a selected peptide, not from an mRNA library. Whether MMP12 bound to the bound beads was examined. In addition, the operation was performed under conditions where post-translational modification with PatD was performed and not performed. As a result, it was suggested that the resulting sequence was bound to MMP12 only when it was modified with PatD, and that the azoline skeleton contributed to binding to MMP12 in those sequences.
  • FIG. 1 An image of the mRNA display method is shown in FIG. The results of selection are shown in FIG. As a result of the selection, the sequences of the five kinds of azoline-containing compounds A to E selected (data not shown) were analyzed, and the results of evaluating the binding ability to MMP12 are shown in FIG.
  • SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of the leader sequence of PatE.
  • SEQ ID NOs: 2 and 3 are examples of the recognition sequence 1 by the azoline skeleton-introducing enzyme, respectively.
  • SEQ ID NOs: 4-9 are examples of the recognition sequence 2 by the azoline skeleton-introducing enzyme, respectively.
  • SEQ ID NOs: 10-57 are amino acid sequences that have been newly confirmed to be substrates for azoline skeleton-introducing enzymes.
  • SEQ ID NO: 58 is the base sequence of the nucleic acid encoding PatE.
  • SEQ ID NO: 59 is the base sequence of the nucleic acid encoding PatEpre.
  • SEQ ID NO: 60 is the amino acid sequence of the cassette region of wild type PatE.
  • SEQ ID NO: 61 is the base sequence of the nucleic acid encoding PatEpre2.
  • SEQ ID NO: 62 is the base sequence of the nucleic acid encoding the peptide portion of each compound in the (XC) n library.
  • SEQ ID NO: 63 is the amino acid sequence of the peptide portion of each compound in the (XC) n library.
  • SEQ ID NO: 64 is the base sequence of the nucleic acid encoding the peptide portion of each compound in the (XC / S / T) n library.
  • SEQ ID NO: 65 is the amino acid sequence of the peptide portion of each compound in the (XC / S / T) n library.
  • SEQ ID NOs: 66-172 are the base sequences of the primers used in the examples of the present application.

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Abstract

　本発明は、十分な多様性を有し、プロテアーゼ活性を有する標的物質に結合する 化合物のスクリーニングにも用いることができるライブラリーを効率よく製造する方法等を提供することを目的とする。　本発明は、下記式（Ｉ）　A－（Xaa0）n－B　（Ｉ） ［式中、m個のXaa0は、任意のアミノ酸を示すが、少なくとも1つはCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログからなる群より選択されるアミノ酸であり、mは、2から40より選択される整数を示し、A及びBは、それぞれ独立に0～100アミノ酸からなるペプチドを示す。］で示されるペプチドにおいて、Xaa0のCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログの少なくとも1つにアゾリン骨格が導入されているアゾリン化合物を2種以上含むアゾリン化合物ライブラリーの製造方法を提供するものである。

Description

アゾリン化合物及びアゾール化合物のライブラリー、並びにその製造方法
　本発明は、アゾリン化合物及びアゾール化合物のライブラリー等に関する。
　近年、様々なペプチドが、医薬品候補や研究用ツールとして注目されており、ペプチドライブラリーを開発し、標的物質に親和性を有するペプチドをスクリーニングしようとする様々な試みがなされている。
　人工的にペプチドライブラリーを作製する方法としては、従来、化学合成による方法、二次代謝産物の生合成酵素を用いる方法、翻訳合成系などが用いられている。
　しかしながら、化学合成による方法では、ライブラリーの多様性を大きくするのが困難である。また、スクリーニングや、化合物の構造と活性の相関解析にも時間を要する。
　これに対し、二次代謝産物の生合成酵素を用いる方法によれば、迅速かつ簡便に、有機化学的手法では得られないような精巧な骨格の構築や化学変換が可能となる。しかしながら、酵素には基質特異性があるため、合成できる化合物の種類が限られ、大規模な化合物ライブラリーの構築に適用するのは難しい。
　細胞を使った翻訳合成系によれば、mRNAライブラリーを作製し、これをワンポットで翻訳することによって短時間で多様性に富んだペプチドライブラリーを構築することができる。また、mRNAディスプレイ法等と組み合わせることにより、スクリーニングにより得られたペプチドと、これをコードする核酸の情報を同時に得ることができるので、遺伝子型と表現型を容易に関連づけることができる。このように、翻訳系によるペプチドライブラリーの合成には優れた点が多いが、産生できるのは、ほぼペプチド性の化合物に限られる。
　ライブラリーを用いたスクリーニングでは、プロテアーゼ活性を有する標的物質を阻害する化合物を同定することもしばしば必要とされる。しかしながら、ペプチド性化合物のライブラリーは、プロテアーゼによって切断されてしまうので、標的物質の活性を阻害する化合物を効率よくスクリーニングすることができない。
　翻訳後修飾酵素により、in vitroでペプチドライブラリーの各ペプチドを修飾することも考えられるが、所望の活性を有する酵素がin vitroで活性を有するとは限らない。また、酵素と反応させる前に、発現させたペプチドライブラリーを精製しなければならず、酵素の基質特異性も検討しなければならないので、所望の構造のペプチドで構成されるライブラリーを得ることは容易ではない。
　修飾の有無や程度が特定できないライブラリーは、結局、化学合成系と同様に構造と活性の相関解析が必要となるため、有用性に劣るという問題がある。
　ところで、ホヤの共生藻Prochloron didemniが産生するpatellamideは、様々な生理活性を有すると考えられる低分子環状ペプチドであり、patA～Gからなるpat遺伝子群の産物によるユニークな経路で生合成される。pat遺伝子群と、この生合成経路の概略を図１５に示す。
　この生合成において前駆体となるのは、patE遺伝子産物のPatEペプチドである。patE遺伝子は超可変領域（カセット領域）を有するため、その産物は天然のコンビナトリアルライブラリーを構築する。
　PatEペプチドは、カセット領域の両側に、翻訳後修飾酵素による認識配列を有する。翻訳後修飾酵素として働くのは、PatA、PatD及びPatGである。PatDは、PatEのカセットにおけるCys、Ser、及びThrにアゾリン骨格を導入し、Cysをチアゾリン骨格に、Ser及びThrをオキサゾリン骨格に変換する。
　PatAは、PatEのカセット領域のN末端側の認識配列を切断する。
　PatGは、2つのドメインからなり、N末端のオキシダーゼドメインは、PatDにより導入されたアゾリン骨格をアゾール骨格に、即ちチアゾリン骨格をチアゾール骨格に変換する。C末端側のペプチダーゼドメインは、PatEのカセット領域のC末端側の認識配列を切断しながら大環状化する。
　上述した天然のPatEのカセット領域について、M.S. Donia et al.（非特許文献１）には、下表に示す配列が記載されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　この表によると、天然のカセット領域の配列には、(i) 7又は8残基である、(ii) カセット領域のN末端から2、4、6、8番目に、修飾を受けるSer/Thr/Cysが位置することが多い、(iii) 修飾を受ける残基（Ser/Thr/Cys）は並ぶことが少ない、(iv) Ser/Thr/Cys以外の残基には、Val、Ala、Ile、Phe、Leuなどの疎水性残基が多い、などの共通点がある。
　従って、これらの共通点は、翻訳後修飾酵素であるPatD及びPatGの基質となるために必要であるようにも考えられた。しかしながら、これらのSer/Thr/Cysのうち、どれが修飾されているのか、されていないのかも不明であり、PatD及びPatGの基質特異性についてはこれまで明らかとなっていなかった。
Donia, M.S. et al., Nat. Chem. Biol., 2006, 2:729-735.
　本発明は、十分な多様性を有し、プロテアーゼ活性を有する標的物質に結合する化合物のスクリーニングにも用いることができるライブラリーを効率よく製造する方法等を提供することを目的とする。
　本発明者らは、何らかの方法で天然のものより多様性に富んだPatEライブラリーを効率よく得ることができ、且つ、これを基質として翻訳後修飾酵素による修飾を加えることができれば、プロテアーゼ活性を有する標的物質に結合する化合物のスクリーニングにも用いることができるライブラリーを得ることができ、上記課題を解決できるものと考えた。
　そして研究を重ねた結果、ある種のアゾリン骨格導入酵素はin vitroでもアゾリン骨格形成活性を有すること；かかるアゾリン骨格導入酵素の基質となるカセット領域の配列は、M.S. Donia et al.に記載されたものに限られず、カセット領域を2－40アミノ酸残基とすれば当該酵素の基質となり、カセット領域中のCys、Ser、Thr及び2,3-ジアミノ酸とこれらのアナログがアゾリン骨格へと変換されうることを見出した。
　さらに、N末端から順に、PatEのリーダー配列、アゾリン骨格導入酵素による認識配列1、カセット領域、及びアゾリン骨格導入酵素による認識配列2を含む前駆体ペプチドとして、PatEライブラリーを無細胞翻訳系により発現させ、これをアゾリン骨格導入酵素で修飾し、不要な領域を切断するという工程をワンポットで効率よく行うことができ、その結果、十分多様性に富み、プロテアーゼ活性を有する標的物質を用いるスクリーニングにも利用できるアゾリン化合物ライブラリーを得ることができることを確認した。
　また、上記前駆体ペプチドにおいて、PatEのリーダー配列を従来知られていたリーダー配列の一部のみとした場合や完全に除去した場合、認識配列1及び2として従来知られていた配列とは異なる配列を用いた場合、認識配列1及び2を除去した場合などにも、該前駆体ペプチドがアゾリン骨格導入酵素の基質となりうることを見出した。さらに、リーダー配列部分を、カセット領域を含む前駆体ペプチドとは別個のペプチドとしても、当該ペプチドが反応系に存在すれば、カセット領域を含む前駆体ペプチドがアゾリン骨格導入酵素の基質となりうることを確認し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は、
〔１〕下記式（Ｉ）
　A－（Xaa0）m－B　　　（Ｉ）
［式中、m個のXaa0は、任意のアミノ酸を示すが、少なくとも1つはCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログからなる群より選択されるアミノ酸であり、mは、2から40より選択される整数を示し、A及びBは、それぞれ独立に0～100アミノ酸からなるペプチドを示す。］
で示されるペプチドにおいて、Xaa0のCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログの少なくとも1つにアゾリン骨格が導入されているアゾリン化合物を2種以上含むアゾリン化合物ライブラリーの製造方法であって：
　N末端から順に、アゾリン骨格導入酵素による認識配列1、－（Xaa0）m－、及びアゾリン骨格導入酵素による認識配列2を含む前駆体ペプチドをコードするmRNAライブラリーを製造する工程と（ここで、認識配列1及び2は、0～10アミノ酸からなるアゾリン骨格導入酵素による認識配列をいう。）；
　前記mRNAライブラリーを用いて、無細胞翻訳系により前記前駆体ペプチドを発現させ、ペプチドライブラリーを製造する工程と；
　アゾリン骨格導入酵素と、前記ペプチドライブラリーとを、アゾリン骨格導入酵素の基質のリーダー配列を含むペプチドの存在下で反応させ、Xaa0のCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログの少なくとも1つにアゾリン骨格を導入する工程と（ここでリーダー配列は、0～50アミノ酸からなるアゾリン骨格導入酵素の基質のリーダー配列をいう）、を含む方法；
〔２〕下記式（Ｉ）
　A－（Xaa0）m－B　　　（Ｉ）
［式中、m個のXaa0は、任意のアミノ酸を示すが、少なくとも1つはCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログからなる群より選択されるアミノ酸であり、mは、2から40より選択される整数を示し、A及びBは、それぞれ独立に0～100アミノ酸からなるペプチドを示す。］
で示されるペプチドにおいて、Xaa0のCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログの少なくとも1つにアゾリン骨格が導入されているアゾリン化合物と、前記式（Ｉ）で示されるペプチドをコードするmRNAとの複合体を2種以上含むアゾリン化合物ライブラリーの製造方法であって：
　N末端から順に、アゾリン骨格導入酵素による認識配列1、－（Xaa0）m－、及びアゾリン骨格導入酵素による認識配列2を含む前駆体ペプチドをコードするmRNAライブラリーを製造する工程と（ここで、認識配列1及び2は、0～10アミノ酸からなるアゾリン骨格導入酵素による認識配列をいう。）；
　前記mRNAライブラリーの各mRNAの3’末端にピューロマイシンを結合させ、ピューロマイシン結合mRNAライブラリーを製造する工程と；
　前記ピューロマイシン結合mRNAライブラリーを用いて、無細胞翻訳系により前記前駆体ペプチドを発現させ、ペプチド－mRNA複合体ライブラリーを製造する工程と；
　アゾリン骨格導入酵素と、前記ペプチド－mRNA複合体ライブラリーとを、アゾリン骨格導入酵素の基質のリーダー配列を含むペプチドの存在下で反応させ、Xaa0のCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログの少なくとも1つにアゾリン骨格を導入する工程と（ここでリーダー配列は、0～50アミノ酸からなるアゾリン骨格導入酵素の基質のリーダー配列をいう）、を含む方法；
〔３〕前記式（Ｉ）において、－（Xaa0）m－が、－（Xaa1－Xaa2）n－であり
［式中、n個のXaa1は、それぞれ独立に任意のアミノ酸を示し、n個のXaa2は、それぞれ独立にCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログからなる群より選択されるアミノ酸を示し、nは、1から20より選択される整数を示す。］、
　前記アゾリン化合物には、Xaa1及びXaa２のCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログの少なくとも1つにアゾリン骨格が導入されている、上記〔１〕又は〔２〕に記載のアゾリン化合物ライブラリーの製造方法；
〔４〕前記式（Ｉ）で示されるペプチドの少なくとも1つを、以下の(i)～(iv)の少なくとも1つの特徴を有するペプチドとする、上記〔１〕から〔３〕のいずれか１項に記載の方法：
(i) mが2から40である（但し、7及び8を除く）；
(ii) nが1から20である（但し、3及び4を除く）；
(iii) Xaa1の少なくとも1つがCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログから選択されるアミノ酸である；及び
(iv) Xaa1の少なくとも1つが親水性アミノ酸である；
〔５〕前記－（Xaa0）m－で示されるペプチドの少なくとも1つを、配列番号：１０～５７のいずれかで表されるペプチドとする、上記〔１〕から〔３〕のいずれか１項に記載の方法；
〔６〕前記アゾリン化合物の少なくとも1つが、アゾリン骨格を5以上有する、上記〔１〕から〔５〕のいずれか１項に記載の方法；
〔７〕前記mRNAライブラリーの各mRNAは、前記リーダー配列を含むペプチドが、前記認識配列1、－（Xaa0）m－、及び認識配列2を含む前駆体ペプチドとの融合ペプチドとして発現されるように構成されている、上記〔１〕から〔６〕のいずれか１項に記載の方法；
〔８〕前記アゾリン骨格の導入後、リーダー配列を前記前駆体ペプチドから切断する工程を含む、上記〔７〕に記載の方法；
〔９〕前記アゾリン骨格を導入する工程において、前記リーダー配列を含むペプチドと、前記認識配列1、－（Xaa0）m－、及び認識配列2を含む前駆体ペプチドとが別個のペプチドである、上記〔１〕から〔６〕いずれか１項に記載の方法；
〔１０〕さらに、前記アゾリン化合物を大環状化する工程を含む、上記〔１〕から〔９〕のいずれか１項に記載の方法；
〔１１〕アゾール化合物ライブラリーの製造方法であって、
　上記〔１〕から〔１０〕のいずれか１項に記載のアゾリン化合物ライブラリーの製造方法において、
　前記アゾリン骨格の導入工程の後、アゾリン骨格が導入されたライブラリーと、アゾール骨格導入酵素とを、アゾール骨格導入酵素の基質のリーダー配列を含むペプチドの存在下又は非存在下で反応させ、アゾリン骨格の少なくとも１つをアゾール骨格に変換する工程を含む方法（ここでリーダー配列は、0～50アミノ酸からなるアゾリン骨格導入酵素の基質のリーダー配列をいう）；
〔１２〕前記アゾール骨格導入酵素は、PatGのペプチダーゼドメインを欠損した変異体または点変異によってペプチダーゼ活性をなくした変異体である、上記〔１１〕に記載の方法；
〔１３〕下記式（Ｉ）
　A－（Xaa0）m－B　　　（Ｉ）
［式中、m個のXaa0は、任意のアミノ酸を示すが、少なくとも1つはCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログからなる群より選択されるアミノ酸であり、mは、2から40より選択される整数を示し、A及びBは、それぞれ独立に0～100アミノ酸からなるペプチドを示す。］
で示されるペプチドにおいて、Xaa0のCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログの少なくとも1つにアゾリン骨格が導入されているアゾリン化合物を2種以上含むアゾリン化合物ライブラリーであって：
　前記式（Ｉ）で示されるペプチドの少なくとも1つは、mが7又は8でない、アゾリン化合物ライブラリー；
〔１４〕前記式（Ｉ）において、－（Xaa0）m－が、－（Xaa1－Xaa2）n－であり
［式中、n個のXaa1は、それぞれ独立に任意のアミノ酸を示し、n個のXaa2は、それぞれ独立にCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログからなる群より選択されるアミノ酸を示し、nは、1から10より選択される整数を示す。］、
　前記式（Ｉ）で示されるペプチドの少なくとも1つが、以下の(i)から(iv)の少なくとも1つの特徴を有する、上記〔１３〕に記載のアゾリン化合物ライブラリー：
(i) mが2から40である（但し、7及び8を除く）；
(ii) nが1から20である（但し、3及び4を除く）；
(iii) Xaa1の少なくとも1つがCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログ又はこれらのアナログから選択されるアミノ酸である；及び
(iv) Xaa1の少なくとも1つが親水性アミノ酸である；
〔１５〕前記アゾリン化合物のそれぞれが、そのペプチド部分をコードするmRNAとの複合体を形成している、上記〔１３〕又は〔１４〕に記載のアゾリン化合物ライブラリー；
〔１６〕上記式（Ｉ）で示されるペプチドのN末端及びC末端に、アゾリン骨格導入酵素の認識配列の全部または一部が結合している、上記〔１３〕から〔１５〕のいずれか１項に記載のアゾリン化合物ライブラリー；
〔１７〕下記式（Ｉ）
　A－（Xaa0）m－B　　　（Ｉ）
［式中、m個のXaa0は、任意のアミノ酸を示すが、少なくとも1つはCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログからなる群より選択されるアミノ酸であり、mは、2から40より選択される整数を示し、A及びBは、それぞれ独立に0～100アミノ酸からなるペプチドを示す。］
で示されるペプチドにおいて、Xaa0のCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログの少なくとも1つにアゾール骨格が導入されているアゾール化合物を2種以上含むアゾール化合物ライブラリーであって：
　前記式（Ｉ）で示されるペプチドの少なくとも1つは、mが7又は8でない、アゾール化合物ライブラリー；
〔１８〕前記式（Ｉ）において、－（Xaa0）m－が、－（Xaa1－Xaa2）n－であり
［式中、n個のXaa1は、それぞれ独立に任意のアミノ酸を示し、n個のXaa2は、それぞれ独立にCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログからなる群より選択されるアミノ酸を示し、nは、1から20より選択される整数を示す。］、
　前記式（Ｉ）で示されるペプチドの少なくとも1つが、以下の(i)から(iv)の少なくとも1つの特徴を有する、上記〔１７〕に記載のアゾール化合物ライブラリー：
(i) mが2から40である（但し、7及び8を除く）；
(ii) nが1から20である（但し、3及び4を除く）；
(iii) Xaa1の少なくとも1つがCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログから選択されるアミノ酸である；及び
(iv) Xaa1の少なくとも1つが親水性アミノ酸である；
〔１９〕前記アゾール化合物のそれぞれが、そのペプチド部分をコードするmRNAとの複合体を形成している、上記〔１７〕又は〔１８〕に記載のアゾール化合物ライブラリー；
〔２０〕上記式（Ｉ）で示されるペプチドのN末端及びC末端に、アゾリン骨格導入酵素の認識配列の全部または一部が結合している、上記〔１７〕から〔１９〕のいずれか１項に記載のアゾール化合物ライブラリー；
〔２１〕標的物質に結合するアゾリン化合物を同定するスクリーニング方法であって、
　上記〔１〕から〔１０〕のいずれか１項に記載の方法で製造されたアゾリン化合物ライブラリー又は上記〔１３〕から〔１６〕のいずれか１項に記載のアゾリン化合物ライブラリーと、標的物質とを接触させ、インキュベートする工程と、
　前記標的物質と結合したアゾリン化合物を選択する工程と、を含む方法；
〔２２〕標的物質に結合するアゾリン化合物を同定するスクリーニング方法であって、
　上記〔２〕から〔１０〕のいずれか１項に記載の方法で製造されたアゾリン化合物ライブラリー又は上記〔１５〕または〔１６〕に記載のアゾリン化合物ライブラリーと、標的物質とを接触させ、インキュベートする工程と、
　前記標的物質と結合したアゾリン化合物を選択する工程と、
　前記選択したアゾリン化合物のmRNAの塩基配列を解析する工程と、を含む方法；
〔２３〕標的物質に結合するアゾール化合物を同定するスクリーニング方法であって、
　上記〔１１〕又は〔１２〕に記載の方法で製造されたアゾール化合物ライブラリー又は上記〔１７〕から〔２０〕のいずれか１項に記載のアゾール化合物ライブラリーと、標的物質とを接触させ、インキュベートする工程と、
　前記標的物質と結合したアゾール化合物を選択する工程と、を含む方法；
〔２４〕標的物質に結合するアゾール化合物を同定するスクリーニング方法であって、
　上記〔１１〕又は〔１２〕に記載の方法で製造されたアゾール化合物ライブラリー又は上記〔１９〕または〔２０〕に記載のアゾール化合物ライブラリーと、標的物質とを接触させ、インキュベートする工程と、
　前記標的物質と結合したアゾール化合物を選択する工程と、
　前記選択したアゾール化合物のmRNAの塩基配列を解析する工程と、を含む方法；
〔２５〕標的物質に結合するアゾリン化合物を同定するためのスクリーニング用キットであって、
　上記〔１〕から〔１０〕のいずれか１項に記載の方法で製造されたアゾリン化合物ライブラリー又は上記〔１３〕から〔１６〕のいずれか１項に記載のアゾリン化合物ライブラリーを含む、キット；
〔２６〕前記ライブラリーが、固相担体に固定されている、上記〔２５〕に記載のキット；
〔２７〕標的物質に結合するアゾール化合物を同定するためのスクリーニング用キットであって、
　上記〔１１〕又は〔１２〕に記載の方法で製造されたアゾール化合物ライブラリー又は上記〔１７〕から〔２０〕のいずれか１項に記載のアゾール化合物ライブラリーを含む、キット；
〔２８〕前記ライブラリーが、固相担体に固定されている、上記〔２７〕に記載のキット；
〔２９〕下記式（Ｉ）
　A－（Xaa0）m－B　　　（Ｉ）
［式中、m個のXaa0は、任意のアミノ酸を示すが、少なくとも1つはCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログからなる群より選択されるアミノ酸であり、mは、2から40より選択される整数を示し、A及びBは、それぞれ独立に0～100アミノ酸からなるペプチドを示す。］
で示されるペプチドにおいて、Xaa0のCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログの少なくとも1つにアゾリン骨格が導入されているアゾリン化合物の製造方法であって：
　N末端から順に、アゾリン骨格導入酵素による認識配列1、－（Xaa0）m－、及びアゾリン骨格導入酵素による認識配列2を含む前駆体ペプチドをコードするmRNA製造する工程と（ここで、認識配列1及び2は、0～10アミノ酸からなるアゾリン骨格導入酵素による認識配列をいう。）；
　前記mRNAを用いて、無細胞翻訳系により前記前駆体ペプチドを発現させる工程と；
　アゾリン骨格導入酵素と、前記前駆体ペプチドとを、アゾリン骨格導入酵素の基質のリーダー配列を含むペプチドの存在下で反応させ、Xaa0のCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログの少なくとも1つにアゾリン骨格を導入する工程と（ここで、前記リーダー配列を含むペプチドと、前記認識配列1、－（Xaa0）m－、及び認識配列2を含む前駆体ペプチドとは別個のペプチドである。）、を含む方法；
〔３０〕アゾール化合物の製造方法であって、
　上記〔２９〕に記載の方法で製造したアゾリン化合物と、アゾール骨格導入酵素とを、アゾール骨格導入酵素の基質のリーダー配列を含むペプチドの存在下又は非存在下で反応させ、アゾリン骨格の少なくとも１つをアゾール骨格に変換する工程を含む、方法；及び
〔３１〕アゾリン化合物又はアゾール化合物の製造用キットであって、アゾリン骨格導入酵素又はアゾール骨格導入酵素と、アゾリン骨格導入酵素の基質のリーダー配列を含むペプチドとを含むキット、
に関する。
　本発明に係る方法によれば、天然のPatEライブラリーよりもはるかに多様性に富んだアゾリン化合物ライブラリー及びアゾール化合物ライブラリーを、迅速且つ簡便な方法で得ることができる。
　かかるアゾリン化合物又はアゾール化合物ライブラリーを用いれば、プロテアーゼ活性を有する標的物質に結合するアゾリン化合物又はアゾール化合物のスクリーニングを行うことが可能である。
　また、本発明に係るアゾリン化合物又はアゾール化合物ライブラリーにmRNAディスプレイ法を応用し、アゾリン化合物又はアゾール化合物とそのペプチド部分をコードするmRNAとの複合体のライブラリーを作製すれば、スクリーニングにより同定されたアゾリン化合物／アゾール化合物をコードする核酸配列を決定できるので、化合物の構造と活性との関係を容易に解析できる。
図１は、本発明のアゾリン化合物ライブラリーの製造方法の一態様を示す概略図である。 図２は、天然のPatEとカセット領域の配列が同一の前駆体ペプチドに、PatDでアゾリン骨格を導入する前後の質量分析の結果を示す。 図３は、カセット領域が12アミノ酸または16アミノ酸である前駆体ペプチドに、PatDでアゾリン骨格を導入する前後の質量分析の結果を示す。 図４は、Xaa1に親水性アミノ酸残基を含む前駆体ペプチドに、PatDでアゾリン骨格を導入する前後の質量分析の結果を示す。 図５は、様々な配列のカセット領域に対するPatDによるアゾリン骨格の導入実験を行った結果に基づき、PatDの基質許容性をまとめた結果を示す。それぞれの配列において、PatD反応後に導入されたヘテロ環の数をボックス中の色の濃さを指標として示した。色が濃いものほど該当するヘテロ環導入数の産物が多く観測された事を意味し、色は薄い物は副産物として観測されたことを意味する。 図６は、Glu-Cによりリーダー配列の切断を、質量分析により確認した結果を示す。PatEC1wt-GSをPatD処理及びGlu-C処理した場合（PatEC1wt-GS +PatD+Glu-C）、基質ペプチド非存在下（+PatD+Glu-C）には見られなかったピークが観測され（1880.5）、それは4個のヘテロ環を含むC末端の短鎖ペプチド部位に相当する。 図７は、リーダー配列を別個のペプチドとして反応系に加えた場合、リーダー配列なしの場合のそれぞれについて、PatDの基質許容性を調べた結果である。 図８は、リーダー配列の一部を欠失させて、PatDの基質許容性を調べた結果の一例である。 図９は、認識配列を変更して、PatDの基質許容性を調べた結果である。 図１０Ａは、カセット配列に非天然型アミノ酸を含む基質を翻訳合成し、PatDの基質許容性を調べた実験の概要を示す。 図１０Ｂは、図１０Ａの実験に用いた非天然型アミノ酸を示す。 図１１は、図１０の実験の代表的な結果を示す。 図１２は、mRNAディスプレイ法を用いたスクリーニングの概略を示す。 図１３は、MMP12を標的として行ったmRNAディスプレイ法によるスクリーニングのセレクションの結果を示す。 図１４は、図１３の方法で選択されたアゾリン含有化合物のMMP12に対する結合能力評価の結果である。 図１５は、pat遺伝子群の構造と、patellamideの生合成経路を示す概略図である。 図１６は、天然基質からかけ離れた合成ペプチドに対するPatDの基質許容性を調べた結果の一例である。 図１７は、天然基質からかけ離れた合成ペプチドに対するPatDの基質許容性を調べた結果の一例である。 図１８は、リーダー配列として、Lacticin481前駆体由来またはヒトアクチン由来の配列を用いた場合、PatEのリーダー配列をシャッフルした配列を用いた場合について、PatDの基質許容性を調べた結果である。 図１９は、リーダー配列の一部を欠失させ、PatDの基質許容性を調べた結果である。 図２０は、リーダー配列に点変異を導入して、PatDの基質許容性を調べた結果である。 図９は、認識配列を変更させて、PatDの基質許容性を調べた結果である。
（アゾリン化合物ライブラリーの製造方法）
　本発明は、2種以上のアゾリン化合物を含むアゾリン化合物ライブラリーの製造方法を提供する。
　本明細書において「アゾリン化合物」とは、下記式（Ｉ）で示されるペプチドのCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログの少なくとも1つにアゾリン骨格が導入されている化合物をいう。
　A－（Xaa0）m－B　　　（Ｉ）
［式中、m個のXaa0は、任意のアミノ酸を示すが、少なくとも1つはCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログからなる群より選択されるアミノ酸であり、mは、2から40より選択される整数を示し、A及びBは、それぞれ独立に0～100アミノ酸からなるペプチドを示す。］
　本発明の一態様において、アゾリン化合物は、式（Ｉ）における－（Xaa0）m－が、－（Xaa1－Xaa2）n－である。
［式中、n個のXaa1は、それぞれ独立に任意のアミノ酸を示し、n個のXaa2は、それぞれ独立にCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログからなる群より選択されるアミノ酸を示し、nは、1から20より選択される整数を示す。］
　アゾリン骨格が導入されたCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログは、Xaa1の位置にあっても、Xaa2の位置にあってもよい。
　本明細書において「アミノ酸」は、その最も広い意味で用いられ、天然アミノ酸に加え、人工のアミノ酸変異体、誘導体を含む。本明細書においてアミノ酸は、天然タンパク性L-アミノ酸；D-アミノ酸；アミノ酸変異体及び誘導体などの化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β-アラニン、オルニチンなどの天然非タンパク性アミノ酸；及びアミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられる。非天然アミノ酸の例として、α－メチルアミノ酸（α－メチルアラニンなど）、D-アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン及びα-メチル-ヒスチジンなど)、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）が挙げられる。
　本明細書においてアミノ酸は、慣用される1文字表記又は3文字表記で表される。1文字表記又は3文字表記で表されたアミノ酸は、それぞれその変異体、誘導体を含むものとする。
　Thrのアナログとしては、例えば以下の式で表されるものが挙げられるがこれに限定されない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 ［式中、Rは、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数1－10のアルキル基又は置換基を有していてもよい芳香族基を示す。］
　Cysのアナログとしては、例えば以下の式で表されるものが挙げられるがこれに限定されない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 ［式中、Rは、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数1－10のアルキル基又は置換基を有していてもよい芳香族基を示す。］
　Ser、Thrのアナログとしては、例えば以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　また、2,3-ジアミノ酸及びそのアナログとしては、例えば以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 ［式中、Rは、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数1－10のアルキル基又は置換基を有していてもよい芳香族基を示す。］
　本明細書において、「Cys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログの少なくとも1つにアゾリン骨格が導入されている」とは、Cys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸において脱水反応が生じ、下記式で示されるアゾリン環が導入されることを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　Ser、Thr、Cys、2,3-ジアミノプロピオン酸にアゾリン骨格を導入すると、それぞれ以下のようなオキサゾリン、チアゾリン骨格、またはイミダゾリン骨格を生じる。
Ser:
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 Thr:
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 Cys:
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 2,3-ジアミノプロピオン酸:
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 　また、例えば、上述したThrのアナログ残基にアゾリン骨格を導入すると以下に示すオキサゾリン骨格を生じる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 　上述したCysのアナログ残基にアゾリン骨格を導入すると以下に示すイミダゾリン骨格を生じる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 　上述した2,3-ジアミノ酸のアナログ残基にアゾリン骨格を導入すると以下に示すチアゾリン骨格を生じる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　上記式（Ｉ）において、Xaa0は、少なくとも1つのCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログを含む限り、任意のアミノ酸を示す。上述のとおり、PatD等のアゾリン骨格導入酵素は、7又は8アミノ酸の所定の規則性を有するカセット領域しか修飾しないと考えられていたが、後述する実施例に示されるとおり、mが2から40である幅広い配列が基質となりうる。
　上記式（Ｉ）において、Xaa1は、それぞれ独立に任意のアミノ酸を示す。上述のとおり、従来、PatD等のアゾリン骨格導入酵素の基質となるペプチドにおいては、修飾される残基は並ぶことが少ないと考えられていたが、後述する実施例に示されるとおり、Xaa1がCys、Ser又はThrであり、隣接するXaa2と同一のアミノ酸であっても、式（Ｉ）のペプチドは、アゾリン骨格導入酵素の基質となりうる。
　また、従来、PatD等のアゾリン骨格導入酵素の基質となるペプチドにおいては、Ser、Cys、Thr以外の残基は疎水性アミノ酸残基が多いと考えられていたが、後述する実施例に示されるとおり、Xaa1が親水性アミノ酸であっても、アゾリン骨格導入酵素の基質となりうる。
　上記式（Ｉ）において、mは2以上の整数であり、16以下、18以下、20以下、30以下、又は40以下の整数である。また、nは1以上の整数であり、8以下、9以下、10以下、又は20以下の整数でありうる。上述のとおり、従来、PatD等のアゾリン骨格導入酵素の基質となるのは、m=7又は8、即ちn=3又は4であると考えられていたが、後述する実施例に示されるとおり、mが9以上、nが5以上であっても、式（Ｉ）のペプチドはアゾリン骨格導入酵素の基質となりうる。
　上記式（Ｉ）にいおて、A及びBは、それぞれ独立に0～100アミノ酸からなるペプチドを示す。Aは、アゾリン骨格導入酵素による認識配列1の全部又は一部を含みうる。また、PatEのリーダー配列の全部又は一部、Hisタグ、リンカー等を含んでいてもよい。Bは、認識配列2の全部又は一部を含みうる。また、Hisタグ、リンカー等を含んでいてもよい。A及びBの長さは、例えば、100、70、60、50、40、30、20、10、5、2、0アミノ酸とすることができるがこれらに限定されない。また、A及びBは、1又は数個のアミノ酸が修飾アミノ酸やアミノ酸アナログであってもよい。
　本発明のアゾリン化合物ライブラリーの製造方法の一態様は、N末端から順に、アゾリン骨格導入酵素による認識配列1、－（Xaa1－Xaa2）n－、及びアゾリン骨格導入酵素による認識配列2を含む前駆体ペプチドをコードするmRNAライブラリーを製造する工程を含む。
　アゾリン骨格導入酵素による認識配列1及び2は、0～10アミノ酸からなるアゾリン骨格導入酵素による認識配列をいい、アゾリン骨格導入酵素がこれを認識して－（Xaa0）m－にアゾリン骨格を導入する限り、どのような配列であってもよい。アゾリン骨格導入酵素がPatDである場合、認識配列1としては、例えば、G（A/L/V）（G/E/D）（A/P）（S/T/C）（配列番号：２）を用いることができ、例えば、GLEAS（配列番号：３）としてもよい。アゾリン骨格導入酵素による認識配列2としては、（A/S）Y（D/E）G（A/L/V）（配列番号：４）含むものを用いることができる。例えば、かかる配列として、AYDGVEPS（配列番号：５）、AYDGV（配列番号：６）、AYDGVGSGSGS（配列番号：７）、AYDGVGGGGGG（配列番号：８）、AYDGVEGSGSGS（配列番号：９）としてもよい。
　後述する実施例に示すとおり、上記前駆体ペプチドは、認識配列1及び／又は2がなくてもアゾリン骨格導入酵素の基質となりうるので、認識配列1及び2は、前駆体ペプチドの任意の構成要素である。
　さらに、後述する実施例に示すとおり、認識配列1及び2として、従来認識配列として知られる配列とはまったく関係のない配列を用いても、上記前駆体ペプチドはアゾリン骨格導入酵素の基質となりうる。
　特に、－（Xaa1－Xaa2）n－のN末端側の認識配列1は、存在したほうがアゾリン骨格導入酵素による修飾を受けやすいが、存在する限りその配列は特に限定されない。例えば、認識配列1としては、GGGGGやQQQQQやLLLLLやPPPPPなどの配列を用いてもよい。
　後述のとおり、上記前駆体ペプチドは、そのN末端側にリーダー配列を含むペプチドをさらに融合させてもよい。
　リーダー配列、アゾリン環導入酵素による認識配列1、－（Xaa0）m－、及びアゾリン環導入酵素による認識配列2は、前駆体ペプチドにおいて隣接していてもよく、前駆体ペプチドとして無細胞発現系で発現し、アゾリン環導入酵素による修飾を受ける限り、間に1から数個のアミノ酸配列を挟んでいてもよい。
　－（Xaa0）m－をコードするmRNAのライブラリーは、例えば、－（NNN）n－、－（NNK）n－、－（NNU）n－、－（NNG）n－、などの配列を含むDNAを合成し、これを転写することによって作製することができる。ここで、NはA/C/G/Tのうち任意の一つ、KはG/Tのうち任意の一つを意味し、NNN及びNNKは20種類のタンパク質性アミノ酸のうちの任意の一つを、NNU及びNNGはそれぞれ15及び14種類のタンパク質性アミノ酸のうちの任意の一つをコードする。
　－（Xaa1－Xaa2）n－をコードするmRNAのライブラリーは、例えば、－（NNK－WSU）n－、－（NNK－UGU）n－などの配列を含むDNAを合成し、これを転写することによって作製することができる。ここで、NはA/C/G/Tのうち任意の一つ、KはG/Tのうち任意の一つ、WはA/Tのうち任意の一つ、SはC/Gのうち任意の一つを意味し、NNN及びNNKは20種類のタンパク質性アミノ酸のうちの任意の一つ、WSUはSer/Thr/Cysのうちの任意の一つ、UGUはCysをコードする。
　このような構成とすることで、例えば、－（Xaa0）m－において、m＝10の場合、天然のアミノ酸20種のみ使用することを想定しても、理論的に2010種類の変異体を作製することができ、－（Xaa1－Xaa2）n－においてn=5の場合、205×35種類の変異体を作製することができるので、ライブラリーとしては十分なサイズとなる。
　－（Xaa0）m－をコードするDNAの5’末端に認識配列1をコードするDNAを含み、3’末端側に認識配列2をコードするDNAを含むDNAを合成し、これを転写することによって、認識配列1、－（Xaa1－Xaa2）n－、及び認識配列2を含む前駆体ペプチドをコードするmRNAを得ることができる。また、認識配列1をコードするDNAの5’末端側に、さらにリーダー配列をコードするDNAを含むDNAを合成し、これを転写することによって、リーダー配列、認識配列1、－（Xaa1－Xaa2）n－、及び認識配列2を含む前駆体ペプチドをコードするmRNAを得ることができる。
　本発明のアゾリン化合物ライブラリーの製造方法の一態様は、上記mRNAライブラリーを用いて、無細胞翻訳系により上記前駆体ペプチドを発現させ、ペプチドライブラリーを製造する工程を含む。
　無細胞翻訳系は、例えば、リボソームタンパク質、アミノアシルtRNA合成酵素（ARS）、リボソームRNA、アミノ酸、GTP、ATP、翻訳開始因子（IF）伸長因子(EF)、終結因子(RF)、およびリボソーム再生因子(RRF)、ならびに翻訳に必要なその他の因子を含む。発現効率を高くするために大腸菌抽出液や小麦胚芽抽出液を用いてもよい。他に、ウサギ赤血球抽出液や昆虫細胞抽出液を用いてもよい。
　これらを含む系に、透析を用いて連続的にエネルギーを供給することで、数百μgから数mg/mLの蛋白質を生産することができる。遺伝子DNAからの転写を併せて行うためにRNAポリメレースを含む系としてもよい。市販されている無細胞翻訳系として、大腸菌由来の系としてはロシュ・ダイアグノスティックス社のRTS-100（登録商標）、PGI社のPURESYSTEM（登録商標）等、小麦胚芽抽出液を用いた系としてはゾイジーン社やセルフリーサイエンス社のもの等を使用できる。
　無細胞翻訳系によれば、発現産物を精製することなく、同じ容器に翻訳後修飾酵素を添加して、ワンポットでペプチドを修飾することができる。
　本発明のアゾリン化合物ライブラリーの製造方法の一態様は、アゾリン骨格導入酵素と、上記ペプチドライブラリーとを、アゾリン骨格導入酵素の基質のリーダー配列を含むペプチドの存在下で反応させ、Cys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログの少なくとも1つにアゾリン骨格を導入する工程を含む。より具体的には、Ser及びThrには、オキサゾリン骨格が、Cysにはチアゾリン骨格が、2,3-ジアミノ酸にはイミダゾリン骨格が導入される。
　リーダー配列は、アゾリン骨格導入酵素による修飾を受けやすくする配列であり、この目的を果たす限り、どのような配列であってもよい。後述する実施例に示されるとおり、リーダー配列が存在しなくても、認識配列1、－（Xaa1－Xaa2）n－、及び認識配列2を含む前駆体ペプチドは、アゾリン骨格導入酵素の基質となりうる。リーダー配列は、例えば、5アミノ酸、7アミノ酸、10アミノ酸、20アミノ酸、30アミノ酸、40アミノ酸、50アミノ酸程度とすることができる。
　リーダー配列としては、例えば、以下のアミノ酸配列、このアミノ酸配列の部分配列、又は、このアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸が欠失、付加、若しくは置換されたアミノ酸配列からなるペプチドを用いることができる。
MNKKNILPQQGQPVIRLTAGQLSSQLAELSEEALGDA（配列番号：１）
　配列番号：１のアミノ酸配列の部分配列としては、このアミノ酸の連続した4アミノ酸以上、5アミノ酸以上、または6アミノ酸以上の配列を含むものとすることができる。配列番号：１のどこに位置する部分であるかは特に限定されないが、例えば、配列番号：１のアミノ酸配列のうちC末端の4アミノ酸、5アミノ酸、又は6アミノ酸を含むものとすることができる。
　さらに、後述する実施例に示すとおり、リーダー配列として、従来リーダー配列として知られるPatEのリーダー配列とはまったく関係のない配列を用いても、上記前駆体ペプチドはアゾリン骨格導入酵素の基質となりうる。例えば、リーダー配列として、別のペプチド由来（Lacticin481前駆体）のMKEQNSFNLLQEVTESELDLILGAなどの配列や、ヒトアクチン由来のMILASLSTFQQMWISKQEYDEAGDAなどの配列、PatEのリーダー配列をシャッフルしたMELQLRPSGLEKKQAPISELNIAQTQGGDSQVLALNAなどの配列を用いてもよい。
　リーダー配列として、ヘリシティ（alpha helicity）の高い配列を用いてもよい。
　本明細書において、「アゾリン骨格導入酵素の基質のリーダー配列を含むペプチドの存在下で」という場合、当該ペプチドは、反応系において、認識配列1、－（Xaa1－Xaa2）n－、及び認識配列2を含む前駆体ペプチドとは別個のペプチドとして存在してもよいし、認識配列1、－（Xaa1－Xaa2）n－、及び認識配列2を含む前駆体ペプチドに融合していてもよい。
　天然のPatDの基質においては、リーダー配列、認識配列1、カセット配列、及び認識配列2が融合しているが、後述する実施例に示すとおり、本発明者らは、認識配列1、－（Xaa1－Xaa2）n－、及び認識配列2を含む前駆体ペプチドをアゾリン骨格導入酵素と反応させる際、リーダー配列を独立したペプチドとしてその反応系に加えても、当該前駆体ペプチドがアゾリン骨格導入酵素の基質となりうることを見出した。
　リーダー配列を、認識配列1、－（Xaa1－Xaa2）n－、及び認識配列2を含む前駆体ペプチドとは別個のペプチドとすると、それぞれのペプチド（すなわちリーダー配列を含むペプチドと前駆体ペプチド）を短くすることができるので、調製が容易になる。リーダー配列も融合している場合、標的分子への結合の際に立体的な障害となる可能性があるため、スクリーニング先立って切断しておくことが望ましいが、もともと別個のペプチドとしておけば、切断する必要がない。
　それぞれのペプチドは、翻訳合成によって調製してもよく、化学合成によって調製してもよい。
　アゾリン骨格導入酵素としては、PatD及びこれと相同性を有する酵素が挙げられる。PatDと相同性を有する酵素としては、例えば、Leeらの報告（Lee, S. W. et al., PNAS vol.105, No.15, 5879-5884, 2008）に含まれるものを用いることができるがこれらに限定されない。
　アゾリン骨格導入酵素は、アゾリン骨格導入酵素を産生する微生物から抽出・精製したものであっても、遺伝子組換え法によって発現させたものであってもよい。例えば、常法に従い、N末端にHisタグが付与されたコンストラクトとして大腸菌内で発現し、Hisタグを利用して精製することができる。アゾリン骨格導入酵素は、アゾリン骨格を導入する限り、その変異体であってもよい。
　アゾリン骨格導入酵素とペプチドライブラリーとの反応は、上述した前駆体ペプチドを発現させたのと同じ容器内で、即ちワンポットで、前駆体ペプチドを精製することなく、アゾリン骨格導入酵素を添加して行うことができる。アゾリン骨格導入酵素とペプチドライブラリーとの反応は、例えば、アゾリン骨格導入酵素がPatDの場合、終濃度0.1μM～50μM、反応温度4℃～45℃、反応時間5分～100時間等の範囲において、当業者が適宜条件を選択して行うことができる。
　反応の確認は、例えば、MALDI-TOF-MSを用いて質量変化を測定することにより行うことができる。
　本発明のアゾリン化合物ライブラリーの製造方法の一態様として、リーダー配列を、認識配列1、－（Xaa1－Xaa2）n－、及び認識配列2を含む前駆体ペプチドと融合させた場合には、当該前駆体ペプチドからリーダー配列を切断する工程を行ってもよい。これにより、－（Xaa0）m－で表されるカセット領域部分が、標的物質と結合しやすくなる。
　リーダー配列の切断も、アゾリン骨格導入酵素の反応を行ったのと同じ容器内に、ペプチダーゼを加えることによって行うことができる。
　リーダー配列の切断は、リーダー配列、認識配列1、リーダー配列と認識配列1の結合部位、認識配列1とカセット領域の結合部位、カセット領域と認識配列2との結合部位のいずれを切断して行ってもよく、切断する部位の配列に応じてペプチダーゼが選択される。ペプチダーゼとしては、トリプシン、Glu-C、Lys-C、Asp-N、Lys-N、Arg-C、トロンビン、Factor Xa、prescission protease、TEV protease、エンテロキナーゼ、HRV 3C Protease等が挙げられるがこれらに限定されない。
　一例として、アゾリン骨格導入酵素の認識配列1をGLEASとする場合、エンドプロテイナーゼGlu-Cを用いて行うことができ、GluとAlaの間で切断することが可能である。Glu-Cの反応は、公知の方法に従って行うことができる。
　本発明のアゾリン化合物ライブラリーの製造方法の一態様は、アゾリン化合物と、前記式（Ｉ）で示されるペプチドをコードするmRNAとの複合体を2種以上含むアゾリン化合物ライブラリーを製造するものである。これにより、アゾリン化合物ライブラリーを、mRNAディスプレイ（Nemoto, N. et al., FEBS Lett. 1997, 405－408; Roberts, R.W. and Szostak, J.W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94,12297－12302）に応用することができる。
　このようなアゾリン化合物－mRNA複合体ライブラリーを用いて、標的物質に結合するアゾリン化合物のスクリーニングを行えば、選択されたアゾリン化合物－mRNA複合体に対し、逆転写反応を行ってcDNAを含む複合体を得て、その塩基配列を決定することができる。
　アゾリン化合物－mRNA複合体の作製は、例えば、公知の方法でmRNAライブラリーの各mRNAの3’末端にピューロマイシンを結合させ、ピューロマイシン結合mRNAライブラリーを作製し、このピューロマイシン結合mRNAライブラリーを用いて、無細胞翻訳系により前駆体ペプチドを発現させることにより行うことができる。
　こうして、ペプチド－mRNA複合体ライブラリーを得た後、PatDと反応させ、必要に応じてリーダー配列を切断し、アゾリン化合物ライブラリーを得ることができる。
　本発明のアゾリン化合物ライブラリーの製造方法の一態様においては、式（Ｉ）で示させるペプチドの少なくとも1つが、以下の(i)～(iv)の少なくとも1つの特徴を有する。
(i) mが2～40（但し、7及び8を除く）。mは、例えば、2、3、4、5、6、9、10、12、14、16、20、30、40である；
(ii) nが1～20（但し、3及び4を除く）。nは、例えば、1、2、5、6、7、8、10、15、20である；
(iii) Xaa1の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、又は少なくとも5つがCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログから選択されるアミノ酸である；及び
(iv) Xaa1の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、又は少なくとも5つが親水性アミノ酸である。
　(i)～(iv)の特徴を有するペプチドは、従来PatD等のアゾリン骨格導入酵素の基質とはなり得ないと考えられていたものを含み、本発明者らが初めてアゾリン骨格導入酵素の基質となり得ることを確認したものである。
　今般、初めてアゾリン骨格導入酵素の基質となることが確認されたカセット配列として、以下のものが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　本発明のアゾリン化合物ライブラリーの製造方法の一態様においては、アゾリン化合物の少なくとも1つが、アゾリン骨格を5以上有する。
　従来、アゾリン骨格導入酵素を用いても、天然のPatEのカセット領域にアゾリン骨格は5以上導入されないものと考えられていた。アゾリン骨格を5以上有するアゾリン化合物は、本発明者らが初めて合成したものである。
　本発明のアゾリン化合物ライブラリーの製造方法の一態様においては、アゾリン化合物の少なくとも1つが、Ser/Thr/Cysから得られた通常のオキサゾリン/チアゾリン以外のアゾリン骨格を有する。
　従来、アゾリン骨格導入酵素を用いても、天然のPatEのカセット領域に存在するSer/Thr/Cys以外にはアゾリン骨格は導入されないものと考えられていた。Dap/tBuSer/iPrSer/PhSer/EtSerなどの非タンパク質性アミノ酸から誘導されたイミダゾリン骨格や置換型アゾリン骨格がPatD等のアゾリン骨格導入酵素によって導入された化合物は、本発明者らが初めて合成したものである。
　本発明のアゾリン化合物ライブラリーの製造方法の一態様では、リーダー配列の切断の前又は後に、アゾリン化合物を大環状化する工程を含む。アゾリン化合物の大環状化は、ペプチドを大環状化する公知の方法又はそれに準ずる方法を用いて行うことができ、例えば、国際公開第2008/117833号に開示された方法やTimmermanらの方法（Timmerman, P et al., ChemBioChem 2005, 6:821-824）に従って行うことができる。
（アゾール化合物ライブラリーの製造方法）
　本発明はまた、2種以上のアゾール化合物を含むアゾール化合物ライブラリーの製造方法を提供する。本発明のアゾール化合物ライブラリーの製造方法において使用される用語のうち、上述したアゾリン化合物ライブラリーの製造方法においても使用される用語は、特に断りがない限り同義と解される。
　本明細書において「アゾール化合物」とは、下記式（Ｉ）で示されるペプチドの、Cys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログの少なくとも1つにアゾール骨格が導入されている化合物をいう。
　A－（Xaa0）m－B　　　（Ｉ）
［式中、m個のXaa0は、任意のアミノ酸を示すが、少なくとも1つはCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログからなる群より選択されるアミノ酸であり、mは、2から20より選択される整数を示し、A及びBは、それぞれ独立に0から8アミノ酸からなるペプチドを示す。］
　本発明の一態様において、アゾール化合物は、式（Ｉ）における－（Xaa0）m－が、－（Xaa1－Xaa2）n－である。
［式中、n個のXaa1は、それぞれ独立に任意のアミノ酸を示し、n個のXaa2は、それぞれ独立にCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログからなる群より選択されるアミノ酸を示し、nは、1から10より選択される整数を示す。］
　アゾール骨格が導入されたCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログは、Xaa1の位置にあるものでも、Xaa2の位置にあるものでもよい。
　本明細書において、「Cys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログの少なくとも1つにアゾール骨格が導入されている」とは、Cys、Ser、Thrの脱水反応によって生じたアゾリン環の酸化反応が振興し、下記式で示されるアゾール環が導入されることを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　Ser、Thr、Cys、2,3-ジアミノ酸にアゾール骨格を導入すると、それぞれ以下のようなオキサゾール又はチアゾール又はイミダゾール骨格を生じる。
Ser：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 Thr：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 Cys：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 Dap：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　例えば、上述したThrの人工アナログ残基にアゾール骨格を導入すると以下に示すオキサゾール骨格を生じる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　また、上述したCysの人工アナログ残基にアゾール骨格を導入すると以下に示すチアゾール骨格を生じる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　また、上述したジアミノ酸の人工アナログ残基にアゾール骨格を導入すると以下に示すイミダゾール骨格を生じる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　本発明のアゾール化合物ライブラリーの製造方法の一態様は、上述したアゾリン化合物ライブラリーの製造方法において、アゾリン骨格を導入する工程の後、アゾリン骨格が導入されたライブラリーと、アゾール骨格導入酵素とを反応させ、アゾリン骨格の少なくとも１つをアゾール骨格に変換する工程を含む。Ser及びThrに導入されたオキサゾリン骨格はオキサゾール骨格に、Cysに導入されたチアゾリン骨格はチアゾール骨格に、2,3-ジアミノ酸に導入されたイミダゾリン骨格はイミダゾール骨格にそれぞれ変換される。アゾリン骨格が導入されたライブラリーと、アゾール骨格導入酵素とを反応させる工程は、アゾール骨格導入酵素の基質のリーダー配列を含むペプチドの存在下で行ってもよい。アゾール骨格導入酵素の基質のリーダー配列を含むペプチドは、アゾリン骨格導入酵素の基質のリーダー配列を含むペプチドと同一であってもよいし、別のペプチドを用いてもよい。
　アゾール骨格導入酵素としては、PatG及びこれと相同性を有する酵素が挙げられる。PatGと相同性を有する酵素としては、例えば、Leeらの報告（Lee, S. W. et al., PNAS vol.105, No.15, 5879-5884, 2008）に含まれるものを用いることができるがこれらに限定されない。
　アゾール骨格導入酵素との反応は、アゾリン骨格導入酵素による反応を行ったのと同じ
容器内に、アゾール骨格導入酵素を添加することによって行うことができる。
　本発明のアゾール化合物ライブラリーの製造方法の一態様は、アゾール骨格導入酵素としてPatGのペプチダーゼドメインを欠損した変異体もしくは点変異によりペプチダーゼ活性を無くした変異体を用いる。PatGは、2つのドメインからなり、天然においては、N末端のオキシダーゼドメインがPatDで構築されたアゾリン骨格をアゾール骨格に変換し、C末端のペプチダーゼドメインが、修飾後のペプチド部位の切り出し、大環状化を行っている。従って、本発明のアゾール化合物ライブラリーの製造方法では、ペプチダーゼドメインを欠損した変異体もしくは点変異によりペプチダーゼ活性を無くした変異体を用いることができる。
（アゾリン化合物ライブラリー）
　本発明は、2種以上のアゾリン化合物ライブラリーも提供する。ここで使用される用語のうち、上述したライブラリーの製造方法においても使用される用語は、特に断りがない限り同義と解される。
　本発明のアゾリン化合物ライブラリーの一態様は、以下の(i)～(iv)の少なくとも1つの特徴を有するアゾリン化合物を少なくとも1種含む。
(i) mが2～20（但し、7及び8を除く）。mは、例えば、2、3、4、5、6、9、10、12、14、16、20、30、40であり得る；
(ii) nが1～10（但し、3及び4を除く）。nは、例えば、1、2、5、6、7、8、10、15、20であり得る；
(iii) Xaa1の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、又は少なくとも5つがCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログから選択されるアミノ酸である；及び
(iv) Xaa1の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、又は少なくとも5つが親水性アミノ酸である。
　(i)～(vi)の特徴を有するペプチドは、従来PatD等のアゾリン骨格導入酵素の基質とはなり得ないと考えられていたものを含み、本発明者らが初めてアゾリン骨格導入酵素の基質となり得ることを確認したものである。
　本発明のアゾリン化合物ライブラリーの一態様は、アゾリン化合物のそれぞれが、そのペプチド部分をコードするmRNAとの複合体を形成している。mRNAディスプレイに応用可能なライブラリーである。
　本発明のアゾリン化合物ライブラリーの一態様は、上記式（Ｉ）で示されるペプチドのN末端及びC末端に、アゾリン骨格導入酵素の認識配列の全部または一部が結合している。
　アゾリン骨格導入酵素の認識配列は、無細胞翻訳系で発現させたペプチドをアゾリン骨格導入酵素で修飾するために必要であり、本発明の方法でアゾリン化合物ライブラリーを作製し、ペプチダーゼでリーダー配列を切断する場合、N末端及びC末端にこれらの配列の全部又は一部が残存することがある。
　例えば、認識配列1をGLEAS（配列番号：３）とし、リーダー配列をGlu－Cで切断する場合、カセット領域のN末端側には、Ala－Serが残る。
（アゾール化合物ライブラリー）
　本発明は、2種以上のアゾール化合物ライブラリーも提供する。ここで使用される用語のうち、上述したライブラリーの製造方法においても使用される用語は、特に断りがない限り同義と解される。
　本発明のアゾール化合物ライブラリーの一態様は、以下の(i)～(iv)の少なくとも1つの特徴を有するアゾリン化合物を少なくとも1種含む。
(i) mが2～20（但し、7及び8を除く）。mは、例えば、2、3、4、5、6、9、10、12、14、16、20、30、40である；
(ii) nが1～10（但し、3及び4を除く）。nは、例えば、1、2、5、6、7、8、10、15、20である；
(iii) Xaa1の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、又は少なくとも5つがCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログから選択されるアミノ酸である；及び
(iv) Xaa1の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、又は少なくとも5つが親水性アミノ酸である。
　(i)～(iv)の特徴を有するペプチドは、従来PatD等のアゾリン骨格導入酵素の基質とはなり得ないと考えられていたものを含み、本発明者らが初めてアゾリン骨格導入酵素の基質となり得ることを確認したものである。従って、アゾリン骨格導入酵素によりアゾリン骨格が導入された後、アゾール骨格導入酵素による修飾を行ってアゾール骨格を導入できるものと理解される。
　本発明のアゾール化合物ライブラリーの一態様は、アゾール化合物のそれぞれが、そのペプチド部分をコードするmRNAとの複合体を形成している。mRNAディスプレイに応用可能なライブラリーである。
　本発明のアゾール化合物ライブラリーの一態様は、上記式（Ｉ）で示されるペプチドのN末端及びC末端に、PatDの認識配列の全部または一部が結合している。
　PatDの認識配列は、無細胞翻訳系で発現させたペプチドをPatDで修飾するために必要であり、本発明の方法でアゾール化合物ライブラリーを作製し、ペプチダーゼでリーダー配列を切断する場合、N末端及びC末端にこれらの配列の全部又は一部が残存することがある。
　例えば、認識配列1をGLEASとし、リーダー配列をGlu－Cで切断する場合、カセット領域のN末端側には、Ala－Serが残る。
（アゾリン化合物のスクリーニング方法）
　本発明は、標的物質に結合するアゾリン化合物を同定するスクリーニング方法を提供する。
　本発明のスクリーニング方法の一態様は、本発明に係るアゾリン化合物ライブラリーの製造方法又は本発明に係るアゾリン化合物ライブラリーと、標的物質を接触させてインキュベートする工程を含む。
　本明細書において、標的物質は特に限定されず、低分子化合物、高分子化合物、核酸、ペプチド、タンパク質等とすることができる。特に、本発明のライブラリーによれば、標的物質がプロテアーゼ活性を有する場合にも用いることができる。
　標的物質は、例えば、固相担体に固定して、本発明のライブラリーと接触させることができる。本明細書において、「固相担体」は、標的物質を固定できる担体であれば特に限定されず、ガラス製、金属性、樹脂製等のマイクロタイタープレート、基板、ビーズ、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、PVDFメンブレン等が挙げられ、標的物質は、これらの固相担体に公知の方法に従って固定することができる。
　標的物質と、ライブラリーは、適宜選択された緩衝液中で接触させ、pH、温度、時間等を調節して反応させる。
　本発明のスクリーニング方法の一態様は、標的物質と結合したアゾリン化合物を選択する工程をさらに含む。標的物質への結合は、例えば、ペプチドを検出可能に標識する公知の方法に従って標識しておき、上記接触工程の後、緩衝液で固相担体表面を洗浄し、標的物質に結合しているアゾリン化合物を検出して行う。
　検出可能な標識としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素、125I、131I、35S、3H等の放射性物質、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ダンシルクロリド、フィコエリトリン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、近赤外蛍光材料等の蛍光物質、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリン等の発光物質、金コロイド、量子ドットなどのナノ粒子が挙げられる。酵素の場合、酵素の基質を加えて発色させ、検出することもできる。また、ペプチドにビオチンを結合させ、酵素等で標識したアビジン又はストレプトアビジンを結合させて検出することもできる。
　単に結合の有無又は程度を検出・測定するのみでなく、標的物質の活性の亢進又は阻害を測定し、かかる亢進活性又は阻害活性を有するアゾリン化合物を同定することも可能である。このような方法により、生理活性を有し、医薬として有用なアゾリン化合物の同定も可能となる。
　アゾリン化合物ライブラリーが、アゾリン化合物－mRNA複合体で構成される場合、上述の方法で、標的物質に結合するアゾリン化合物を選択した後、選択したアゾリン化合物のmRNAの塩基配列を解析する工程を行ってもよい。
　mRNAの塩基配列の解析は、まず逆転写反応によってcDNAを合成し、該cDNAの塩基配列を解析することにより行うことができる。これにより、遺伝子型と表現型の関係を簡単に特定することができる。
　また、逆転写反応の後、さらに転写を行い、再びmRNAライブラリーへと変換し、標的化合物を用いたスクリーニングを繰り返すことによって、標的物質に対する結合能の強いアゾリン化合物を濃縮することができる。
（アゾール化合物のスクリーニング方法）
　本発明は、標的物質に結合するアゾール化合物を同定するスクリーニング方法を提供する。
　本発明のスクリーニング方法の一態様は、本発明に係るアゾール化合物ライブラリーの製造方法又は本発明に係るアゾール化合物ライブラリーと、標的物質を接触させてインキュベートする工程を含む。
　アゾール化合物のスクリーニング方法は、上述したアゾリン化合物のスクリーニング方法に準じて行うことができる。
（スクリーニング用キット）
　本発明は、アゾリン化合物又はアゾール化合物のスクリーニング用キットを提供する。
　本発明のスクリーニング用キットの一態様は、本発明に係る製造方法で製造されたアゾリン化合物ライブラリー若しくはアゾール化合物ライブラリー、又は、本発明に係るアゾリン化合物ライブラリー若しくはアゾール化合物ライブラリーを含む。　本発明のスクリーニング用キットは、他に、標的物質とアゾリン化合物又はアゾール化合物との結合を検出するのに必要な試薬及び装置を含む。かかる試薬及び装置としては、例えば、固相担体、緩衝液、標識用試薬、酵素、酵素反応停止液、マイクロプレートリーダーが挙げられるがこれらに限定されない。
　本発明のスクリーニング用キットにおいては、ライブラリーが、固相担体にアレイ状に固定されていてもよい。
（アゾリン化合物の製造方法）
　本発明は、式(Ｉ)で表されるペプチドにおいて、Xaa0のCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログの少なくとも1つにアゾリン骨格が導入されているアゾリン化合物の製造方法も提供する。
　当該方法は、N末端から順に、アゾリン骨格導入酵素による認識配列1、－（Xaa0）m－、及びアゾリン骨格導入酵素による認識配列2を含む前駆体ペプチドをコードするmRNA製造する工程と（ここで、認識配列1及び2は、0～10アミノ酸からなるアゾリン骨格導入酵素による認識配列をいう。）；
　上記mRNAを用いて、無細胞翻訳系により前駆体ペプチドを発現させる工程と；
　アゾリン骨格導入酵素と、前駆体ペプチドとを、アゾリン骨格導入酵素の基質のリーダー配列を含むペプチドの存在下で反応させ、Xaa0のCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログの少なくとも1つにアゾリン骨格を導入する工程とを含む。
　ここで、リーダー配列を含むペプチドと、認識配列1、－（Xaa0）m－、及び認識配列2を含む前駆体ペプチドとは別個のペプチドである。
　本方法によれば、リーダー配列を含むペプチドと認識配列1、－（Xaa0）m－、及び認識配列2を含む前駆体ペプチドとを、それぞれより短いペプチドとすることができるので、調製するのが容易である。調製は化学合成、翻訳合成、これらの組合せ等によって行うことができる。また、スクリーニングに先立って、リーダー配列を切り離す必要もない。
　したがって、本方法は、本発明のスクリーニング方法によって、標的物質に結合するアゾリン化合物が同定された後、当該アゾリン化合物を大量に調製する場合に特に有利である。
（アゾール化合物の製造方法）
　本発明は、上述のアゾリン化合物の製造方法によって得られたアゾリン化合物を用いて、アゾール化合物を製造する方法も包含する。
　当該方法は、アゾリン化合物と、アゾール骨格導入酵素とを、アゾール骨格導入酵素の基質のリーダー配列を含むペプチドの存在下で反応させ、アゾリン骨格の少なくとも１つをアゾール骨格に変換する工程を含む。
　本方法によれば、リーダー配列を含むペプチドとアゾリン化合物とを、それぞれより短いペプチドとすることができるので、調製するのが容易である。調製は化学合成、翻訳合成、これらの組合せ等によって行うことができる。また、スクリーニングに先立って、リーダー配列を切り離す必要もない。
　したがって、本方法は、本発明のスクリーニング方法によって、標的物質に結合するアゾール化合物が同定された後、当該アゾール化合物を大量に調製する場合に特に有利である。
（アゾリン化合物又はアゾール化合物の製造用キット）
　本発明に係るアゾリン化合物とアゾール化合物の製造用キットは、上記方法でアゾリン化合物又はアゾール化合物を製造するので、アゾリン骨格導入酵素又はアゾール骨格導入酵素と、アゾール骨格導入酵素の基質のリーダー配列を含むペプチドとを含む。
　当該キットは、その他必要な試薬や器具、取扱説明書等を含んでいてもよい。
　以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に何ら限定されない。
　以下の実施例においてアゾリン化合物ライブラリーの合成スキームを図１に示す。
［１］PatDの発現・精製
　pET16bのプラスミドにPatDの遺伝子を導入し、N末端に10xHisタグが付与されたコンストラクトのプラスミドを作製した。大腸菌BL21(DE3)pLysS株に形質転換し、30℃で培養した。O.D.が0.4に達した所でIPTG 0.1mMを添加し、大量発現を誘導した後、オーバーナイトで培養した。回収した菌体をLysis Buffer(1M NaCl, 10mM Imidazole, 50mM HEPES-Na(pH7.5))で懸濁した後、超音波で破砕した。フィルターで濾過したサンプルを、His-Trap HPカラムを用いて精製した。カラムはあらかじめ10CVのBuffer A(500mM NaCl, 25mM Imidazole, 50mM HEPES-Na(pH7.5))で平衡化し、サンプル注入後、Buffer B(500mM NaCl, 500mM Imidazole, 50mM HEPES-Na(pH7.5))濃度を徐々に上げることによって、サンプル中のタンパク質を分離し、純粋なPatDフラクションを得た。得たサンプルを、Amicon Ultra(Millipore) 30kDaを用いて約4倍に濃縮した。その後PD-10(GE lifescience)を用いてStore Buffer(200mM NaCl,25mM HEPES(pH7.5), 10% glycerol)にバッファ交換し、80℃で保存した。
［２］PatEプラスミド(pET16b)の構築
　pET16bに、以下のPatE配列をサブクローニングした。
ATGAACAAGAAAAACATCCTGCCCCAACAAGGTCAACCGGTTATCCGCTTAACCGCAGGACAGTTGAGCTCGCAACTCGCCGAACTGTCTGAAGAAGCACTGGGCGACGCGGGGTTGGAGGCAAGCGTTACGGCGTGTATCACGTTTTGTGCGTACGATGGCGTTGAGCCATCTATTACGGTCTGCATTAGTGTCTGCGCCTATGATGGGGAGTAA（配列番号：５８）
［３］基質ペプチドのDNAの作製
［３-１］PatEpreの作製
　PatEプラスミドを鋳型に、2回のPCRによりPatEpreのDNAを作製した。下線部は、認識配列1のGLEAS（配列番号：３）をコードするDNAである。配列番号：５９の４８位～１５３位がリーダー配列のコード領域である。
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAACAAGGAGAAAAACATGAACAAGAAAAACATCCTGCCCCAACAAGGTCAACCGGTTATCCGCTTAACCGCAGGACAGTTGAGCTCGCAACTCGCCGAACTGTCTGAAGAAGCACTGGGCGACGCGGGGTTGGAGGCAAGC（配列番号：５９）
　PatEpreは、リーダー配列と認識配列（下線部）を含んだ以下のアミノ酸配列からなるペプチドをコードする。
MNKKNILPQQGQPVIRLTAGQLSSQLAELSEEALGDAGLEAS
　PatEpreのPCRに使用したプライマーを下表に示す。プライマーの配列は、後掲するプライマー一覧に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
［３-２］基質ペプチドのDNAの作製
［３-２-１］認識配列2がAYDGVEPSのもの
　PatEpreを鋳型に、2回もしくは3回のPCRによりカセット領域に変異を有するmutantのDNAを作製した。得られたペプチドの配列は、以下のとおりである。
MNKKNILPQQGQPVIRLTAGQLSSQLAELSEEALGDAGLEAS（XXX）AYDGVEPS
　カセット領域に当たる（XXX）内の配列および使用したプライマーを以下に示す。プライマーの配列は、後掲するプライマー一覧に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
［３-２-２］認識配列2がAYDGVEPS（配列番号：５）以外のペプチド
　同様に、PatEpre2を鋳型として２、３回のPCRを行い、C末配列がAYDGVEPS以外となるペプチドのDNAも調製した。
MNKKNILPQQGQPVIRLTAGQLSSQLAELSEEALGDAGLEAS（XXX）（YYY）
　（XXX）はカセット領域、（YYY）は認識配列2を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
 　使用したプライマーを以下に示す。プライマーの配列は、後掲するプライマー一覧に示
す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
［４］PatD酵素反応
　３-２で調製したDNAを、Kawakamiらの方法（Kawakami et al., Chemistry & Biology 15, 32-42 (2008)）に従って2.5μlスケールの無細胞タンパク質発現系で転写・翻訳した後、40mM Tris-HCl(pH8.0), 8mM DTT, 4mM MgCl2, 0.8mM ATP（それぞれ終濃度）を加えて溶液条件を整えた後、リコンビナントPatDを加えた。
　下記のような2条件で反応を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
［５］MALDI-TOF-MSによるペプチドの質量測定
　MatrixとしてSinapinic Acidを用いて、MALDI-TOF-MSによってペプチドの質量を測定し、PatD添加による質量変化の有無を確認した。質量変化により、導入されたアゾリン環の個数がわかる。
　カセット領域のアミノ酸配列が野生型PatEと同じであるC1wtをPatDで修飾したときの質量分析の結果を図２に示す。この結果、4つのアゾリン環形成を示す分子量変化が見られた。
　また、カセット領域が12アミノ酸（式（Ｉ）においてn=6）であるC1m10、及び16アミノ酸（式（Ｉ）においてn=8）であるC1m38の結果を図３に示す。C1m10は6つ、C1m38は8つのアゾリン環が導入されていることが確認された。
　その他の代表的な結果を図４に示す。図４に示されるとおり、従来はPatDの基質になると考えられていなかったようなCys、Ser、Thr以外に親水性残基が存在する場合にも、PatDによる修飾を受けることが確認された。
　このような実験の結果確認されたPatDの基質許容性を図５に示す。図示されるとおり、これまでにPatDの基質になると考えられていなかった配列を含む、多様な配列がPatDにより修飾を受けることが確認され、PatDは、アゾリン化合物ライブラリー合成に十分な基質許容性を有することがわかった。
［６］Glu-C酵素反応
　PatD酵素反応後、5.0μlの反応液に対してGlu-C（Roche）0.5μgを添加、25℃で2時間インキュベートし、ペプチドを切断した。このような実験の結果得られたリーダー配列の切断された修飾ペプチドの質量分析を図６に示す。
［７］Glu-C酵素反応後の質量測定
　Matrixとしてα-CHCAを用いて、MALDI-TOF-MSによってペプチドの質量を測定し、リーダー配列が切断されたペプチドを確認した。
　結果の一例を図６に示す。リーダー配列が切断されたペプチドの形成が確認された。
［８］ライブラリーの合成
　ライブラリー構築に適した非翻訳領域を持つPatEpre2のDNAを調製した。下線部は、認識配列1のGLEAS（配列番号：３）をコードするDNAである。配列番号：６１の４６位～１５１位がリーダー配列のコード領域である。
TAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAACAAGAAAAACATCCTGCCCCAACAAGGTCAACCGGTTATCCGCTTAACCGCAGGACAGTTGAGCTCGCAACTCGCCGAACTGTCTGAAGAAGCACTGGGCGACGCGGGGTTGGAGGCAAGC（配列番号：６１）
　PatEpre2を鋳型に、ランダム塩基を含むプライマーを用いて、2回もしくは3回のPCRにより、下記のような2種類のライブラリーを作製した。
［８-１］（XC）nライブラリー
　下記の配列を有する二本鎖DNAを調製した。(n=3-8)
TAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAACAAGAAAAACATCCTGCCCCAACAAGGTCAACCGGTTATCCGCTTAACCGCAGGACAGTTGAGCTCGCAACTCGCCGAACTGTCTGAAGAAGCACTGGGCGACGCGGGGTTGGAGGCAAGC(NNKTGT)nGCGTACGATGGCGTTGGT（配列番号：６２）
　このDNAを翻訳合成すると、以下のようなペプチドが合成される。
MNKKNILPQQGQPVIRLTAGQLSSQLAELSEEALGDAGLEAS(XC)nAYDGVGSGSGS（配列番号：６３）
［８-２］（X-C/S/T）nライブラリー
　下記の配列を有する二本鎖DNAを調製した。(n=3-6)
TAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAACAAGAAAAACATCCTGCCCCAACAAGGTCAACCGGTTATCCGCTTAACCGCAGGACAGTTGAGCTCGCAACTCGCCGAACTGTCTGAAGAAGCACTGGGCGACGCGGGGTTGGAGGCAAGC(NNKWST)nGCGTACGATGGCGTTGGT（配列番号：６４）
　このDNAを翻訳合成すると、以下のようなペプチドが合成される。
MNKKNILPQQGQPVIRLTAGQLSSQLAELSEEALGDAGLEA(X C/S/T)nAYDGVGSGSGS（配列番号：６５）
　それぞれのライブラリー構築に用いたプライマーの種類を下に示す。プライマーの配列は、後掲するプライマー一覧に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
［９］リーダー配列についての検討（１）
　リーダー配列の要否を検討するために、上記［１］～［８］と同様の方法で、基質ペプチドからリーダー配列を除いた場合と、リーダー配列を基質ペプチドとは別個のペプチドとして翻訳合成して反応系に加えた場合、及び化学合成したリーダー配列を終濃度1 uM、10 uM、50 uMになるように加えた場合とについて実験した。カセット配列は、8アミノ酸（VTACITFC）とした。
　結果を図７に示す。リーダー配列が基質ペプチドに融合していると酵素による修飾効率は高くなるものの、リーダー配列がなくても1分子の脱水は見られ、酵素の基質となるためにリーダー配列は必須ではないことがわかった。また、リーダー配列が反応系に存在していれば、基質ペプチドと融合していなくても4分子の脱水が見られ、基質ペプチドは十分に修飾されることが確認された。このことは、リーダー配列が基質の選択に必要なのではなく、リーダー配列の構造が酵素の活性化に寄与し、反応効率に影響を与えていることを示唆する。
［１０］リーダー配列についての検討（２）
　上記［１］～［８］と同様の方法で、図８及び図１９に示されるようにリーダー配列の一部を欠失させ、PatDによる酵素活性を確認した。
　図８及び図１９に示されるとおり、PatDによる修飾を受けるために、全長のリーダー配列は必須ではないことがわかった。また、C末端側の配列がPatDによる修飾に重要であり、リーダー配列のC末端を含んでいれば、例えば、6アミノ酸程度でもPatDによる修飾を十分に受けることが確認された。
［１１］リーダー配列についての検討（３）
　上記［１］～［８］と同様の方法で、図１８に示されるようにリーダー配列の全体を全く別のペプチド配列に置換し、PatDによる酵素活性を確認した。
　図１８に示されるとおり、PatDによる修飾を受けるために存在が必要なリーダー配列は、PatEのリーダー配列に制限されず、例えばヒトActinの部分配列や、Lacticin481の前駆体ペプチドのリーダー配列、PatEのリーダー配列をシャッフルした配列などであってもよいことが確認された。
［１２］リーダー配列についての検討（４）
　上記［１］～［８］と同様の方法で、図２０に示されるようにリーダー配列の一部アミノ酸に点変異を導入し、PatDによる酵素活性を確認した。
　図２０に示されるとおり、PatDによる修飾を受けるために、PatEのリーダー配列においては、28番目のGlu、29番目のLeu、31番目のGlu、32番目のGlu、34番目のLeuがPatDによる修飾に重要であることが確認された。
［１３］認識配列についての検討
　上記［１］～［８］と同様の方法で、図９及び図２１に示されるように認識配列を欠失させた場合や、配列を変えた場合、配列を追加した場合について、PatDによる酵素活性を検討した。
　図９及び図２１に示されるとおり、認識配列2が存在しなくても、基質ペプチドは4分子の脱水を受けた。認識配列1を除くと、2分子の脱水しか生じなかったが、認識配列1も酵素活性に必須ではないことが確認された。また、認識配列をGGGGGやQQQQQやLLLLLやPPPPPに変更しても十分に修飾（4分子の脱水）を受けた。さらに、リーダー配列と認識配列の間にGGGGGを挿入した場合、認識配列とカセット配列の間にGGGGGを挿入した場合でも十分に修飾（4分子以上の脱水）を受けた。認識配列2の下流に追加の配列を付加した場合でも十分に修飾を受けた。
　これらの結果から、認識配列1が存在したほうがPatDによる修飾効率は高くなるが、その配列は特に限定されず、認識配列2の存否はPatDによる修飾効率にほとんど影響しないことが示唆された。また、認識配列2の下流に配列を付加しても修飾効率にほとんど影響しないことも示唆された。
［１４］カセット配列に非天然型アミノ酸を含む基質に対するPatDの修飾効率の検討
　図１０Ａに示すとおり、カセット配列に非天然型アミノ酸を含む基質を翻訳合成し、PatDによる修飾を行った。用いたアミノ酸を図１０Ｂに示す。代表的な結果を図１１に示す。図１１に示されるとおり、従来はPatDの基質になると考えられていなかったようなThrの異性体、置換型のSer、ジアミノ酸などもPatDによる修飾を受け、対応するアゾリン環骨格に変換されることが確認された。
［１５］その他の基質についての検討
　以下の配列を有する基質をそれぞれ合成し、PatDによる修飾を確認した。結果を下表に示す。代表的な結果を図１６及び図１７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
［１６］mRNAディスプレイ法を用いたスクリーニング
　上述の方法で得られたアゾリン化合物ライブラリーを用いて、マトリックスメタロプロテアーゼ（Matrix metalloproteinase; MMP）12に結合する化合物をmRNAディスプレイ法を用いてスクリーニングした。
［１６-１］MMP12の精製
　MMP12はC末端に6xHisタグとAviタグが付与されたコンストラクトとして大腸菌内で発現した。精製はHisタグを利用して行った。
また、Aviタグは同じプラスミドに組み込まれているbirAが発現するBirAによってビオチン化されるため、mRNAディスプレイの際にMMP12をストレプトアビジンビーズで固定化するために付与した。
［１６-２］mRNAライブラリーの作製
　［８］で得られたDNAライブラリーをT7 RNAポリメラーゼを用いて転写することで対応するmRNAを得た。
［１６-３］mRNAディスプレイ
　以下の「ピューロマイシンリンカーとの連結」から「回収したペプチドの配列情報の増幅」までのサイクルを繰り返し、アゾリン含有化合物ライブラリーからMMP12に結合するペプチドを選択した。
［１６-３-１］ピューロマイシンリンカーとの連結
　下記の配列で表されるピューロマイシンリンカーを上記の mRNA ライブラリーとアニールさせ、T4 RNA ligase で連結した。(SPC18 はCとOの総数が18であるPEGを表す。）
pdCTCCCGCCCCCCGTCC(SPC18)5CC(Pu)
［１６-３-２］翻訳
　ピューロマイシンリンカーの連結されたmRNAライブラリーを翻訳し、ペプチドライブラリーを合成した。合成されたペプチドのC末端にピューロマイシンが結合することで、mRNAとペプチドが連結される。
［１６-３-３］PatDによる翻訳
　mRNAによってタグ付けされたペプチドライブラリーをPatDにより翻訳後修飾し、カセット配列内にアゾリン環を導入した。
［１６-３-４］逆転写
　ペプチドと結合しているmRNAを逆転写し、アゾリン修飾ペプチド-mRNA-DNA複合体を合成した。
［１６-３-５］プロテアーゼGlu-Cによる切断
　Glu-Cを加え、リーダー配列を切断した。
［１６-３-６］MMP12に結合するアゾリン修飾ペプチドの取得
　ストレプトアビジンビーズに固定化したMMP12に、調製したアゾリン含有化合物ライブラリーを混合し、4°Cで30分インキュベートした。上澄みを除去し、残ったビーズをバッファーで洗浄した。ビーズにPCR用の溶液を加えて95°Cで5分間加熱し、ペプチドをビーズからはがして上澄みを回収した。
［１６-３-７］回収したアゾリン修飾ペプチドの配列情報の増幅
　MMP12に結合して回収されてきたアゾリン修飾ペプチド-mRNA-DNA複合体に含まれるDNAを、PCRによって増幅した。得られたDNAを転写してmRNAとした。
［１６-３-８］選択されたアゾリン含有化合物配列の同定
　上記の一連の操作を繰り返し、DNAの回収率に変化が見られなくなったところで増幅されたDNAを用いてTAクローニングを行い、得られたアゾリン含有化合物の配列を同定した。
［１６-３-９］選択されたアゾリン含有化合物の結合能力評価
　mRNAディスプレイのスキームに従って、ただしmRNAライブラリーからではなく選択されたペプチドのmRNAから一連の操作を行い、選択されたアゾリン含有化合物がMMP12が結合したビーズに結合するかどうか調べた。また、PatDによる翻訳後修飾を行う条件と行わない条件で操作を行った。その結果、得られた配列についてPatDによる修飾がある時のみMMP12に結合し、それらの配列においてアゾリン骨格がMMP12への結合に寄与していることが示唆された。
　mRNAディスプレイ法のイメージを図１２に示す。
　セレクションの結果を図１３に示す。
　セレクションの結果選択された5種類のアゾリン含有化合物A～Eについて配列を解析し（データ示さず）、MMP12に対する結合能力を評価した結果を図１４に示す。
　以下に使用したプライマーの塩基配列一覧を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000035
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000036
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000037
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000038
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000039
　配列番号１は、PatEのリーダー配列のアミノ酸配列である。
　配列番号２及び３は、それぞれ、アゾリン骨格導入酵素による認識配列1の一例である。
　配列番号４－９は、それぞれ、アゾリン骨格導入酵素による認識配列2の一例である。
　配列番号１０－５７は、新たにアゾリン骨格導入酵素の基質となることが確認されたアミノ酸配列である。
　配列番号５８は、PatEをコードする核酸の塩基配列である。
　配列番号５９は、PatEpreをコードする核酸の塩基配列である。
　配列番号６０は、野生型PatEのカセット領域のアミノ酸配列である。
　配列番号６１は、PatEpre2をコードする核酸の塩基配列である。
　配列番号６２は、（XC）nライブラリーの各化合物のペプチド部分をコードする核酸の塩基配列である。
　配列番号６３は、（XC）nライブラリーの各化合物のペプチド部分のアミノ酸配列である。
　配列番号６４は、（X-C/S/T）nライブラリーの各化合物のペプチド部分をコードする核酸の塩基配列である。
　配列番号６５は、（X-C/S/T）nライブラリーの各化合物のペプチド部分のアミノ酸配列である。
　配列番号６６－１７２は、本願実施例で用いられたプライマーの塩基配列である。

Claims (31)

  1. 　下記式（Ｉ）
    　A－（Xaa0）m－B　　　（Ｉ）
    ［式中、m個のXaa0は、任意のアミノ酸を示すが、少なくとも1つはCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログからなる群より選択されるアミノ酸であり、mは、2から40より選択される整数を示し、A及びBは、それぞれ独立に0～100アミノ酸からなるペプチドを示す。］
    で示されるペプチドにおいて、Xaa0のCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログの少なくとも1つにアゾリン骨格が導入されているアゾリン化合物を2種以上含むアゾリン化合物ライブラリーの製造方法であって：
    　N末端から順に、アゾリン骨格導入酵素による認識配列1、－（Xaa0）m－、及びアゾリン骨格導入酵素による認識配列2を含む前駆体ペプチドをコードするmRNAライブラリーを製造する工程と（ここで、認識配列1及び2は、0～10アミノ酸からなるアゾリン骨格導入酵素による認識配列をいう。）；
    　前記mRNAライブラリーを用いて、無細胞翻訳系により前記前駆体ペプチドを発現させ、ペプチドライブラリーを製造する工程と；
    　アゾリン骨格導入酵素と、前記ペプチドライブラリーとを、アゾリン骨格導入酵素の基質のリーダー配列を含むペプチドの存在下で反応させ、Xaa0のCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログの少なくとも1つにアゾリン骨格を導入する工程と（ここでリーダー配列は、0～50アミノ酸からなるアゾリン骨格導入酵素の基質のリーダー配列をいう）、を含む方法。
  2. 　下記式（Ｉ）
    　A－（Xaa0）m－B　　　（Ｉ）
    ［式中、m個のXaa0は、任意のアミノ酸を示すが、少なくとも1つはCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログからなる群より選択されるアミノ酸であり、mは、2から40より選択される整数を示し、A及びBは、それぞれ独立に0～100アミノ酸からなるペプチドを示す。］
    で示されるペプチドにおいて、Xaa0のCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログの少なくとも1つにアゾリン骨格が導入されているアゾリン化合物と、前記式（Ｉ）で示されるペプチドをコードするmRNAとの複合体を2種以上含むアゾリン化合物ライブラリーの製造方法であって：
    　N末端から順に、アゾリン骨格導入酵素による認識配列1、－（Xaa0）m－、及びアゾリン骨格導入酵素による認識配列2を含む前駆体ペプチドをコードするmRNAライブラリーを製造する工程と（ここで、認識配列1及び2は、0～10アミノ酸からなるアゾリン骨格導入酵素による認識配列をいう。）；
    　前記mRNAライブラリーの各mRNAの3’末端にピューロマイシンを結合させ、ピューロマイシン結合mRNAライブラリーを製造する工程と；
    　前記ピューロマイシン結合mRNAライブラリーを用いて、無細胞翻訳系により前記前駆体ペプチドを発現させ、ペプチド－mRNA複合体ライブラリーを製造する工程と；
    　アゾリン骨格導入酵素と、前記ペプチド－mRNA複合体ライブラリーとを、アゾリン骨格導入酵素の基質のリーダー配列を含むペプチドの存在下で反応させ、Xaa0のCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログの少なくとも1つにアゾリン骨格を導入する工程と（ここでリーダー配列は、0～50アミノ酸からなるアゾリン骨格導入酵素の基質のリーダー配列をいう）、を含む方法。
  3. 　前記式（Ｉ）において、－（Xaa0）m－が、－（Xaa1－Xaa2）n－であり
    ［式中、n個のXaa1は、それぞれ独立に任意のアミノ酸を示し、n個のXaa2は、それぞれ独立にCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログからなる群より選択されるアミノ酸を示し、nは、1から20より選択される整数を示す。］、
    　前記アゾリン化合物には、Xaa1及びXaa２のCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログの少なくとも1つにアゾリン骨格が導入されている、請求項１又は２に記載のアゾリン化合物ライブラリーの製造方法。
  4. 　前記式（Ｉ）で示されるペプチドの少なくとも1つを、以下の(i)～(iv)の少なくとも1つの特徴を有するペプチドとする、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法：
    (i) mが2から40である（但し、7及び8を除く）；
    (ii) nが1から20である（但し、3及び4を除く）；
    (iii) Xaa1の少なくとも1つがCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログから選択されるアミノ酸である；及び
    (iv) Xaa1の少なくとも1つが親水性アミノ酸である。
  5. 　前記－（Xaa0）m－で示されるペプチドの少なくとも1つを、配列番号：１０～５７のいずれかで表されるペプチドとする、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　前記アゾリン化合物の少なくとも1つが、アゾリン骨格を5以上有する、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　前記mRNAライブラリーの各mRNAは、前記リーダー配列を含むペプチドが、前記認識配列1、－（Xaa0）m－、及び認識配列2を含む前駆体ペプチドとの融合ペプチドとして発現されるように構成されている、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　前記アゾリン骨格の導入後、リーダー配列を前記前駆体ペプチドから切断する工程を含む、請求項７に記載の方法。
  9. 　前記アゾリン骨格を導入する工程において、前記リーダー配列を含むペプチドと、前記認識配列1、－（Xaa0）m－、及び認識配列2を含む前駆体ペプチドとが別個のペプチドである、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　さらに、前記アゾリン化合物を大環状化する工程を含む、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 　アゾール化合物ライブラリーの製造方法であって、
    　請求項１から１０のいずれか１項に記載のアゾリン化合物ライブラリーの製造方法において、
    　前記アゾリン骨格の導入工程の後、アゾリン骨格が導入されたライブラリーと、アゾール骨格導入酵素とを、アゾール骨格導入酵素の基質のリーダー配列を含むペプチドの存在下又は非存在下で反応させ、アゾリン骨格の少なくとも１つをアゾール骨格に変換する工程を含む方法（ここでリーダー配列は、0～50アミノ酸からなるアゾリン骨格導入酵素の基質のリーダー配列をいう）。
  12. 　前記アゾール骨格導入酵素は、PatGのペプチダーゼドメインを欠損した変異体または点変異によってペプチダーゼ活性をなくした変異体である、請求項１１に記載の方法。
  13. 　下記式（Ｉ）
    　A－（Xaa0）m－B　　　（Ｉ）
    ［式中、m個のXaa0は、任意のアミノ酸を示すが、少なくとも1つはCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログからなる群より選択されるアミノ酸であり、mは、2から40より選択される整数を示し、A及びBは、それぞれ独立に0～100アミノ酸からなるペプチドを示す。］
    で示されるペプチドにおいて、Xaa0のCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログの少なくとも1つにアゾリン骨格が導入されているアゾリン化合物を2種以上含むアゾリン化合物ライブラリーであって：
    　前記式（Ｉ）で示されるペプチドの少なくとも1つは、mが7又は8でない、アゾリン化合物ライブラリー。
  14. 　前記式（Ｉ）において、－（Xaa0）m－が、－（Xaa1－Xaa2）n－であり
    ［式中、n個のXaa1は、それぞれ独立に任意のアミノ酸を示し、n個のXaa2は、それぞれ独立にCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログからなる群より選択されるアミノ酸を示し、nは、1から10より選択される整数を示す。］、
    　前記式（Ｉ）で示されるペプチドの少なくとも1つが、以下の(i)から(iv)の少なくとも1つの特徴を有する、請求項１３に記載のアゾリン化合物ライブラリー：
    (i) mが2から40である（但し、7及び8を除く）；
    (ii) nが1から20である（但し、3及び4を除く）；
    (iii) Xaa1の少なくとも1つがCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログ又はこれらのアナログから選択されるアミノ酸である；及び
    (iv) Xaa1の少なくとも1つが親水性アミノ酸である。
  15. 　前記アゾリン化合物のそれぞれが、そのペプチド部分をコードするmRNAとの複合体を形成している、請求項１３又は１４に記載のアゾリン化合物ライブラリー。
  16. 　上記式（Ｉ）で示されるペプチドのN末端及びC末端に、アゾリン骨格導入酵素の認識配列の全部または一部が結合している、請求項１３から１５のいずれか１項に記載のアゾリン化合物ライブラリー。
  17. 　下記式（Ｉ）
    　A－（Xaa0）m－B　　　（Ｉ）
    ［式中、m個のXaa0は、任意のアミノ酸を示すが、少なくとも1つはCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログからなる群より選択されるアミノ酸であり、mは、2から40より選択される整数を示し、A及びBは、それぞれ独立に0～100アミノ酸からなるペプチドを示す。］
    で示されるペプチドにおいて、Xaa0のCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログの少なくとも1つにアゾール骨格が導入されているアゾール化合物を2種以上含むアゾール化合物ライブラリーであって：
    　前記式（Ｉ）で示されるペプチドの少なくとも1つは、mが7又は8でない、アゾール化合物ライブラリー。
  18. 　前記式（Ｉ）において、－（Xaa0）m－が、－（Xaa1－Xaa2）n－であり
    ［式中、n個のXaa1は、それぞれ独立に任意のアミノ酸を示し、n個のXaa2は、それぞれ独立にCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログからなる群より選択されるアミノ酸を示し、nは、1から20より選択される整数を示す。］、
    　前記式（Ｉ）で示されるペプチドの少なくとも1つが、以下の(i)から(iv)の少なくとも1つの特徴を有する、請求項１７に記載のアゾール化合物ライブラリー：
    (i) mが2から40である（但し、7及び8を除く）；
    (ii) nが1から20である（但し、3及び4を除く）；
    (iii) Xaa1の少なくとも1つがCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログから選択されるアミノ酸である；及び
    (iv) Xaa1の少なくとも1つが親水性アミノ酸である。
  19. 　前記アゾール化合物のそれぞれが、そのペプチド部分をコードするmRNAとの複合体を形成している、請求項１７又は１８に記載のアゾール化合物ライブラリー。
  20. 　上記式（Ｉ）で示されるペプチドのN末端及びC末端に、アゾリン骨格導入酵素の認識配列の全部または一部が結合している、請求項１７から１９のいずれか１項に記載のアゾール化合物ライブラリー。
  21. 　標的物質に結合するアゾリン化合物を同定するスクリーニング方法であって、
    　請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法で製造されたアゾリン化合物ライブラリー又は請求項１３から１６のいずれか１項に記載のアゾリン化合物ライブラリーと、標的物質とを接触させ、インキュベートする工程と、
    　前記標的物質と結合したアゾリン化合物を選択する工程と、を含む方法。
  22. 　標的物質に結合するアゾリン化合物を同定するスクリーニング方法であって、
    　請求項２から１０のいずれか１項に記載の方法で製造されたアゾリン化合物ライブラリー又は請求項１５または１６に記載のアゾリン化合物ライブラリーと、標的物質とを接触させ、インキュベートする工程と、
    　前記標的物質と結合したアゾリン化合物を選択する工程と、
    　前記選択したアゾリン化合物のmRNAの塩基配列を解析する工程と、を含む方法。
  23. 　標的物質に結合するアゾール化合物を同定するスクリーニング方法であって、
    　請求項１１又は１２に記載の方法で製造されたアゾール化合物ライブラリー又は請求項１７から２０のいずれか１項に記載のアゾール化合物ライブラリーと、標的物質とを接触させ、インキュベートする工程と、
    　前記標的物質と結合したアゾール化合物を選択する工程と、を含む方法。
  24. 　標的物質に結合するアゾール化合物を同定するスクリーニング方法であって、
    　請求項１１又は１２に記載の方法で製造されたアゾール化合物ライブラリー又は請求項１９または２０に記載のアゾール化合物ライブラリーと、標的物質とを接触させ、インキュベートする工程と、
    　前記標的物質と結合したアゾール化合物を選択する工程と、
    　前記選択したアゾール化合物のmRNAの塩基配列を解析する工程と、を含む方法。
  25. 　標的物質に結合するアゾリン化合物を同定するためのスクリーニング用キットであって、
    　請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法で製造されたアゾリン化合物ライブラリー又は請求項１３から１６のいずれか１項に記載のアゾリン化合物ライブラリーを含む、キット。
  26. 　前記ライブラリーが、固相担体に固定されている、請求項２５に記載のキット。
  27. 　標的物質に結合するアゾール化合物を同定するためのスクリーニング用キットであって、
    　請求項１１又は１２に記載の方法で製造されたアゾール化合物ライブラリー又は請求項１７から２０のいずれか１項に記載のアゾール化合物ライブラリーを含む、キット。
  28. 　前記ライブラリーが、固相担体に固定されている、請求項２７に記載のキット。
  29. 　下記式（Ｉ）
    　A－（Xaa0）m－B　　　（Ｉ）
    ［式中、m個のXaa0は、任意のアミノ酸を示すが、少なくとも1つはCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログからなる群より選択されるアミノ酸であり、mは、2から40より選択される整数を示し、A及びBは、それぞれ独立に0～100アミノ酸からなるペプチドを示す。］
    で示されるペプチドにおいて、Xaa0のCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログの少なくとも1つにアゾリン骨格が導入されているアゾリン化合物の製造方法であって：
    　N末端から順に、アゾリン骨格導入酵素による認識配列1、－（Xaa0）m－、及びアゾリン骨格導入酵素による認識配列2を含む前駆体ペプチドをコードするmRNA製造する工程と（ここで、認識配列1及び2は、0～10アミノ酸からなるアゾリン骨格導入酵素による認識配列をいう。）；
    　前記mRNAを用いて、無細胞翻訳系により前記前駆体ペプチドを発現させる工程と；
    　アゾリン骨格導入酵素と、前記前駆体ペプチドとを、アゾリン骨格導入酵素の基質のリーダー配列を含むペプチドの存在下で反応させ、Xaa0のCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログの少なくとも1つにアゾリン骨格を導入する工程と（ここで、前記リーダー配列を含むペプチドと、前記認識配列1、－（Xaa0）m－、及び認識配列2を含む前駆体ペプチドとは別個のペプチドである。）、を含む方法。
  30. 　アゾール化合物の製造方法であって、
    　請求項２９に記載の方法で製造したアゾリン化合物と、アゾール骨格導入酵素とを、アゾール骨格導入酵素の基質のリーダー配列を含むペプチドの存在下又は非存在下で反応させ、アゾリン骨格の少なくとも１つをアゾール骨格に変換する工程を含む、方法。
  31. 　アゾリン化合物又はアゾール化合物の製造用キットであって、アゾリン骨格導入酵素又はアゾール骨格導入酵素と、アゾリン骨格導入酵素の基質のリーダー配列を含むペプチドとを含むキット。
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