WO2012117136A1 - Fracción de bajo peso molecular de un hidrolizado de lactoferrina para el tratamiento de la hipertensión - Google Patents

Fracción de bajo peso molecular de un hidrolizado de lactoferrina para el tratamiento de la hipertensión Download PDF

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Paloma Manzanares Mir
Salvador VALLÉS ALVENTOSA
José F. MARCOS LÓPEZ
Isidra RECIO SÁNCHEZ
Pedro RUIZ-GIMÉNEZ
Germán TORREGROSA BERNABÉ
Enrique ALBORCH DOMÍNGUEZ
Juan B. SALOM SANVALERO
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Fundacion para la Investigacion del Hospital Universitario y Politecnico La Fe de La Comunidad Valenciana
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Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Fundacion para la Investigacion del Hospital Universitario y Politecnico La Fe de La Comunidad Valenciana
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention falls within the field of biotechnology and biomedicine. Specifically, it refers to a method for obtaining the molecular weight fraction of less than 3000 Da of a lactoferrin hydrogenate, which comprises various peptides. It also refers to the fraction obtainable by this method, as well as to some of the peptides contained in said fraction and the use of this fraction or the peptides for the preparation of drugs for the prevention and / or treatment of hypertension, food or nutritional supplements.
  • Hypertension consists of an increase in blood pressure above desirable levels, since this increase carries health risks. This hypertension is associated with an increase in mortality prematurely in individuals who suffer from it (Giles 2009. J Clin Hypertens 11 (11): 61 1-614).
  • strokes One of the biggest problems generated by hypertension are strokes. Among these, acute stroke (or stroke) is the most important, since it is the third cause of mortality (after cancer and ischemic heart disease) and the first permanent disability in advanced societies.
  • This stroke can be produced mainly by a thrombus (thrombosis) or by a plunger (embolism) in a cerebral artery, which causes a decrease in blood supply (ischemia) and therefore the necrotization and death of the tissue (infarction) It remains without irrigation. It can also be caused by the rupture of a blood vessel in the cerebral parenchyma (intracerebral hemorrhage) or in the cerebral surface (subarachnoid hemorrhage).
  • ventricular hypertrophy myocardial fibrosis, ventricular systolic dysfunction, ventricular diastolic dysfunction, renal ischemia, tubulo-interstitial fibrosis of the renal parenchyma, focal glomerulosclerosis, or atherosclerosis.
  • Prolonged treatment of decreased blood pressure through lifestyle changes or through pharmacological treatments is associated with a reduction in the risk of heart attack (30-40%) and coronary events (20%) and seems to also reduce the incidence of other complications.
  • renin inhibitors angiotensin converting enzyme inhibitors (RCT), angiotensin receptor blockers or aidosterone receptor antagonists
  • RCT angiotensin converting enzyme inhibitors
  • ACE angiotensin receptor blockers
  • aidosterone receptor antagonists Williams B 2009. J Hypertens 27 (3): S19-26.
  • these drugs would be, for example, captopril or enalapril, which are ACE inhibitors.
  • These drugs may have side effects such as dry cough, angioedema, headache, feeling unstable, fatigue, hypotension or fatigue.
  • the present invention relates to a method of obtaining the fraction of molecular weight of less than 3000 Da from a bovine lactoferrine (LF) hydrolyzate, as well as to the fraction of molecular weight of less than 3000 Da of a lactoferric hydrogenate obtainable by Said method
  • the present invention also relates to some of the peptides contained in said fraction.
  • This fraction, as well as the peptides it comprises, can be used for the preparation of medicaments, preferably for the prevention and / or treatment of hypertension, as well as for the elaboration of functional foods or nutritional supplements.
  • the present invention also relates to foods or compositions comprising the fraction of molecular weight less than 3000 Da of a bovine lactoferrine (LF) hydrogenate or some of the peptides it comprises.
  • the fraction of molecular weight of less than 3000 Da of a bovine lactoferrine hydrolyzate produced by hydrolysis with pepsin exhibits "in vivo" antihypertensive activity.
  • this antihypertensive effect does not occur in the case of using a complete lactoferrine hydrogenate, without selecting any of its fractions. This effect may be due. fundamentally to the elimination of compounds that interfere or present an antagonistic effect to the hypotensive capacity of small-sized peptides, or to the greater concentration of these small-sized peptides with antihypertensive effect in the selected fraction.
  • a hydrolyzate can be obtained by enzymatic hydrolysis or chemical hydrolysis (acid hydrolysis or alkaline hydrolysis).
  • the method selected for carrying out the hydrolysis confers on the product specific characteristics that cannot be obtained by another method since, for example, the different methods used would lead to hydrolysis in different peptide bonds of the protein, giving therefore different structural and functional characteristics of the resulting product.
  • Enzymatic hydrolysis occurs under more controlled conditions and the hydrolizates produced are more reproducible, so the resulting product has better characteristics than the hydrolysates obtained by chemical methods.
  • this enzymatic hydrolyzate does not have residual chemical compounds in its composition, which presents advantages at the time of its use compared to chemical hydrolysates.
  • hydrolysis has to be controlled by what is produced by enzymatic methods.
  • Enzymatic hydrolysis of proteins can be carried out by various active enzymes under different conditions.
  • proteolytic enzymes there are several options such as specific residue proteases or those that degrade proteins nonspecifically.
  • one of the most used is pepsin, a digestive enzyme that degrades the proteins in the stomach and acts by preferentially breaking the peptide bonds of hydrophobic and aromatic amino acids.
  • a first aspect of the invention relates to a method of obtaining a fraction of molecular weight of less than 3000 Da of a bovine lactoferrin hydride (hereinafter "method of the invention") comprising:
  • step (a) hydrolyze bovine lactoferrin by hydrolysis with pepsin, and b) select the fraction of molecular weight less than 3000 Da from the hydrolyzate of step (a).
  • fraction of molecular weight less than 3000 Da is understood in the present invention that fraction of the hydrolyzate comprising peptides that do not exceed 3000 Da molecular weight, and therefore excludes various polypeptides or fragments of the original protein that do not they are digested by the hydrolysis of the invention.
  • Pepsin in the present invention is understood to mean those enzymes with EC numbers (Enzyme Commission or Enzyme Commission number) 3.4.23.1 (pepsin A), 3.4.23.2 (pepsin B or parapepsin I) or 3.4.23.3 ( pepsin C or gastricsin), or any of its counterparts.
  • These homologous enzymes can be found for example, but not limited to, both animals and plants, fungi, protozoa or prokaryotes. All these enzymes are included in the group EC 3.4.23 (aspartic endopeptidases) so that the cut-off points on the proteins are similar and therefore, from the same substrate give rise to similar hydrolysates.
  • homologous enzyme is understood to mean those enzymes that have the same activity as the enzymes described, that is, those enzymes that have a certain structural similarity and equal functionality with the enzymes described.
  • pepsin A the pepsin from step (a) is pepsin A.
  • Hydrolysis must be carried out under controlled conditions, in order to avoid excess hydrolysis of lactoferrin produced by aggressive conditions. Uncontrolled conditions could cause degradation of bovine lactoferrin not only by pepsin, or even degradation of active peptides. Therefore, these conditions outside a set range, may result in obtaining a different final product.
  • these reaction conditions can also affect the activity of the enzyme used and not only the protein of origin, so they could also affect the final composition of the hydrolyzate. Within these reaction conditions one of the most important to take into account is the hydrolysis time, since this influences the degree of degradation of the original protein or intermediate products (peptides) and therefore the percentage of various elements in the final hydrolyzate, or the presence or absence of some of them, may vary giving different function to the product obtained.
  • the hydrolysis of step (a) is carried out for at least 1 hour. In a more preferred embodiment of the method of the invention, the hydrolysis is carried out for a period of between 3 and 5 hours. In an even more preferred embodiment of the method of the invention, the hydrolysis of step (a) is carried out for 4 hours.
  • step (a) is carried out at a pH lower than 7.
  • the hydrolysis is performed at a pH between 2 and 4.
  • the hydrolysis of step (a) is performed at a pH of 3.
  • step (a) is carried out at a temperature between 25 ° C and 45 ° C.
  • the hydrolysis of step (a) is carried out at a temperature between 30 ° C and 40 ° C.
  • the hydrolysis of step (a) is carried out at a temperature of 37 ° C.
  • the selection of the molecular weight fraction of less than 3000 Da of the hydrolyzate, which has the antihypertensive activity there are several useful methods known in the state of the art, such as, but not limited to, filtration chromatography in gel, or ultrafiltration.
  • the most practical for simplicity and cost thereof, and which offers greater guarantees for correctly selecting the desired fraction, without elements that can contaminate it is ultrafiltration. Therefore, in another preferred embodiment of the method of the invention, the selection of the fraction of molecular weight less than 3000 Da in step (b) is carried out by ultrafiltration.
  • fraction of molecular weight less than 3000 Da of a lactoferrin hydrolyzate obtained by the method of the invention, has a clear antihypertensive effect, which is not observed in the case of using the complete hydrolyzate without carrying out the selection of this fraction. Therefore, another aspect of the invention relates to a fraction of molecular weight less than 3000 Da of a lactoferrin hydrolyzate obtainable by the method of the invention, hereinafter "fraction of the invention”.
  • a preferred embodiment of this aspect of the invention relates to the fraction of the invention, wherein the fraction comprises at least one of the sequence peptides SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 1 1.
  • the fraction of the invention comprises the sequence peptides SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 1 1.
  • the present invention demonstrates the presence of various peptides within the fraction of the invention. These identified peptides are analyzed to determine their antihypertensive capacity. Of all the peptides identified, the peptides SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 1 1 are those with the best antihypertensive characteristics. These peptides can be isolated from the fraction of the invention or they can be synthesized de novo by chemical synthesis. In the present invention it is observed that de novo synthesized peptides exhibit antihypertensive activity. Therefore, another aspect of the invention relates to a sequence peptide SEQ ID NO: 9. Another aspect of the invention relates to a sequence peptide SEQ ID NO: 10. Another aspect of the invention relates to a sequence peptide SEQ ID NO: 11.
  • the peptides of the present invention and their variants or derivatives can be produced by different procedures. They can be obtained, for example, by isolating a lactoferrin hydrolyzate. They can also be obtained by other methods known in the state of the art, such as, but not limited to, chemical synthesis or solid phase biotechnological synthesis or by recombinant DNA approaches.
  • the peptides of the invention can be produced by recombinant DNA, not only directly but as fusion polypeptides bound to a heterologous polypeptide, which may contain, for example, but not limited to, a signal sequence or other polypeptide that has a protease cleavage site, for example, but not limited to, at the N-terminal end of the mature protein or polypeptide.
  • variant refers to a peptide that has a high identity with those described and which presents, for example, but not limited to, additions, deletions or substitutions. These variants have a degree of identity with respect to the described peptides of at least 75%, preferably of at least 85%, more preferably of at least 90% and even more preferably 95% .
  • peptide refers to a polymeric form of amino acids of any length, which may or may not be, chemically or biochemically modified.
  • bovine lactoferrin refers to the protein of 689 amino acid residues (accession number of Protein Data Bank (PDB): 1 BLF; SEQ ID NO: 13), derived from the translated protein of 708 amino acids (GenBank accession number: AAA30610; SEQ ID NO: 14) encoded by the GenBank accession number cDNA: L19981.1 (SEQ ID NO: 15). Also included within this definition are those peptides that have an identity of at least 95% and preferably 99% with respect to SEQ ID NO: 13, which give rise to the fraction of the invention and / or the peptides of the invention . These peptides can be produced, for example by substitutions, deletions or additions of amino acids with respect to the sequence SEQ ID NO: 13.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the fraction of the invention, preferably comprising at least one of the sequence peptides SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 1 1, and more preferably comprising the sequence peptides SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 1 1, in the preparation of a medicament, or alternatively, to the fraction of the invention, preferably comprising at least one of the sequence peptides SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 11, and more preferably comprising the sequence peptides SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 11, for use in medicine.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the sequence peptide SEQ ID NO: 9 in the preparation of a medicament, or alternatively, the sequence peptide SEQ ID NO: 9 for use in medicine.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the sequence peptide SEQ ID NO: 10 in the preparation of a medicament, or alternatively, the sequence peptide SEQ ID NO: 10 for use in medicine.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the sequence peptide SEQ ID NO: 11 in the preparation of a medicament, or alternatively, the sequence peptide SEQ ID NO: 11 for use in medicine.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the fraction of the invention, preferably comprising at least one of the sequence peptides SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 11, and more preferably that comprise the sequence peptides SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 11, in the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of hypertension, or alternatively, to the fraction of the invention, preferably comprising at least one of the sequence peptides SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 11, and more preferably comprising the sequence peptides SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO : 10, and SEQ ID NO: 11, for use in the prevention and / or treatment of hypertension.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the sequence peptide SEQ ID NO: 9 in the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of hypertension, or alternatively, the sequence peptide SEQ ID NO: 9 for its use in the prevention and / or treatment of hypertension.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the sequence peptide SEQ ID NO: 10 in the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of hypertension, or alternatively, the sequence peptide SEQ ID NO: 10 for use in the prevention and / or treatment of hypertension.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the sequence peptide SEQ ID NO: 11 in the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of hypertension, or alternatively, the sequence peptide SEQ ID NO: 11 for its use in the prevention and / or treatment of hypertension.
  • the term "medicine” refers to any substance used for prevention, diagnosis, relief, treatment or cure of diseases in humans and animals.
  • the medicament referred to in the present invention can be for human or veterinary use.
  • the "medicine for human use” is any substance or combination of substances that is presented as having properties for the treatment or prevention of diseases in humans or that can be used in humans or administered to humans in order to restore, correct or modify physiological functions by exerting a pharmacological, immunological or metabolic action, or establishing a medical diagnosis.
  • the "veterinary medicinal product” is any substance or combination of substances that is presented as having curative or preventive properties with respect to animal diseases or that can be administered to the animal in order to restore, correct or modify its physiological functions by exercising a pharmacological, immunological or metabolic action, or to establish a veterinary diagnosis.
  • treatment refers to combating the effects caused as a result of the disease or pathological condition of interest in a subject (preferably mammal, and more preferably a human) that includes:
  • prevention as understood in the present invention is to prevent the onset of the disease, that is, to prevent the occurrence of the disease or the pathological condition in a subject (preferably mammal, and more preferably a human), in particularly, when said subject has a predisposition for the pathological condition, but has not yet been diagnosed as having it.
  • “Hypertension” in the present invention is understood as a systemic blood pressure equal to or greater than control values known in the state of the art, which are preferably 140 mm of mercury of systolic blood pressure and / or 90 mm of mercury of diastolic blood pressure
  • This hypertension is presented primarily as arterial hypertonia.
  • Essential blood hypertension is due, as a general rule, to a high resistance to circulation as a consequence, for example, of the narrowing, at the purely functional and subsequently organic beginning, of the arterial bloodstream.
  • Secondary or also symptomatic blood hypertension is, on the contrary, a blood hypertension linked to an organ, that is to say caused by the disease of an organ, which can be externalized, for example, but not limited, as an endocrine, renal, pulmonary hypertonia or cardiovascular
  • Another aspect of the invention relates to the use of the fraction of the invention, preferably comprising at least one of the sequence peptides SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11, and more preferably comprising the sequence peptides SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 11, in the preparation of a food, or alternatively, to the fraction of the invention, preferably comprising at least one of the peptides of sequence SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11, and more preferably comprising the sequence peptides SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 11, for use I eat food.
  • a preferred embodiment of this aspect of the invention relates to the use of said fraction in the preparation of a functional food, or alternatively, to said fraction for use as a functional food.
  • a more preferred embodiment of this aspect of the invention relates to the use of said fraction in the preparation of a functional food for the prevention of hypertension, or alternatively, said fraction for use as a functional food for the prevention of hypertension.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the sequence peptide SEQ ID NO: 9 in the preparation of a food, or alternatively, the sequence peptide SEQ ID NO: 9 for use as a food.
  • a preferred embodiment of this aspect of the invention relates to the use of said peptide in the preparation of a functional food, or alternatively, said peptide for use as a functional food.
  • a more preferred embodiment of this aspect of the invention relates to the use of said peptide in the preparation of a functional food for the prevention of hypertension, or alternatively, said peptide for use as a functional food for the prevention of hypertension.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the sequence peptide SEQ ID NO: 10 in the preparation of a food, or alternatively, the sequence peptide SEQ ID NO: 10 for use as food.
  • a preferred embodiment of this aspect of the invention relates to the use of said peptide in the preparation of a functional food, or alternatively, said peptide for use as a functional food.
  • a more preferred embodiment of this aspect of the invention relates to the use of said peptide in the preparation of a functional food for the prevention of hypertension, or alternatively, said peptide for use as a functional food for the prevention of hypertension.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the sequence peptide SEQ ID NO: 11 in the preparation of a food, or alternatively, the sequence peptide SEQ ID NO: 11 for use as a food.
  • a preferred embodiment of this aspect of the invention relates to the use of said peptide in the preparation of a functional food, or alternatively, said peptide for use as a functional food.
  • a more preferred embodiment of this aspect of the invention refers to the use of said peptide in the preparation of a functional food for the prevention of hypertension, or alternatively, said peptide for use as a functional food for the prevention of hypertension.
  • “Functional food” in the present invention is understood to be food that is shown to beneficially affect one or more functions of the organism, beyond nutritional effects, in the sense of being relevant for an optimal state of health or for reducing the risk of suffering from a disease or pathological condition. In the context of the present invention, it preferably refers to reducing the risk of hypertension. This expression therefore also includes important foods in the medium or long-term maintenance of health as well as in its improvement. In this context, non-therapeutic uses are preferred. The expressions “nutraceuticals”, “al ⁇ mentoceuticals” and “design foods” are used as synonyms.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the fraction of the invention, preferably comprising at least one of the sequence peptides SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11, and more preferably comprising the sequence peptides SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 11, for the preparation of a food supplement, or alternatively to said fraction for use as a food supplement.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the sequence peptide SEQ ID NO: 9 for the preparation of a food supplement, or alternatively said peptide for use as a food supplement.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the sequence peptide SEQ ID NO: 10 for the preparation of a food supplement, or alternatively said peptide for use as a food supplement.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the sequence peptide SEQ ID NO: 11 for the preparation of a food supplement, or alternatively said peptide for use as a food supplement.
  • Food supplement is understood in the present invention as food products that contain one or more nutrients in concentrated form. Usually be in an atypical food form, preferably in capsules, pills, tablets or liquids. Additional typical forms of administration of these food supplements are, for example, but not limited to, envelopes with powders, ampoules with liquids, bottles with drip inserts and similar forms of administration of liquids and powders for the collection in small quantities measured that are useful. to supplement nutrition.
  • compositions hereinafter the first composition of the invention, comprising the fraction of the invention, which preferably comprises at least one of the sequence peptides SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11, and more preferably comprises the sequence peptides SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 11.
  • the composition is a pharmaceutical composition.
  • compositions hereinafter second composition of the invention, comprising the sequence peptide SEQ ID NO: 9.
  • the composition is a pharmaceutical composition.
  • compositions hereinafter third composition of the invention, comprising the sequence peptide SEQ ID NO: 10.
  • the composition is a pharmaceutical composition.
  • compositions hereinafter the fourth composition of the invention, comprising the sequence peptide SEQ ID NO: 11.
  • the composition is a pharmaceutical composition.
  • compositions hereinafter fifth composition of the invention, comprising the sequence peptides SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11, or any combination thereof.
  • the composition is A pharmaceutical composition
  • compositions of the present invention can be formulated for administration to an animal, and more preferably to a mammal, including man, in a variety of ways known in the state of the art.
  • they can be, without limitation, in aqueous or non-aqueous solutions, in emulsions or in suspensions.
  • non-aqueous solutions are, for example, but not limited to, propylene glycol, polyetylene glycol, vegetable oils, such as olive oil, or injectable organic esters, such as ethyl oleate.
  • aqueous solutions are, for example, but not limited to, water, alcoholic solutions in water, or saline media.
  • Aqueous solutions may be buffered or not, and may have additional active or inactive components.
  • compositions can be prepared for administration in solid form.
  • compositions may be combined with various inert carriers or excipients, including but not limited to: binders, such as microcrystalline cellulose, gum tragacanth, or gelatin; excipients, such as starch or lactose; dispersing agents, such as alginic acid or corn starch; lubricants, such as magnesium stearate, glidants such as colloidal silicon dioxide; sweetening agents, such as sucrose or saccharin; or flavoring agents, such as peppermint or methyl salicylate.
  • binders such as microcrystalline cellulose, gum tragacanth, or gelatin
  • excipients such as starch or lactose
  • dispersing agents such as alginic acid or corn starch
  • lubricants such as magnesium stearate, glidants such as colloidal silicon dioxide
  • sweetening agents such as sucrose or saccharin
  • flavoring agents such as peppermint or methyl salicylate.
  • compositions and / or their formulations can be administered to an animal, including a mammal and, therefore, to man, in a variety of ways, including, but not limited to, oral, nasal, otic, ocular, parenteral, intraperitoneal, intravenous. , intradermal, epidural, intraspinal, intrastromal, intraarticular, intrasynovial, intrathecal, intralesional, intraarterial, intracardiac, intramuscular, intranasal, intracranial, subcutaneous, intraorbital, intracapsular, topical, through transdermal patches, rectal route, vaginal or urethral administration of a suppository, percutaneous, nasal spray, surgical implant, internal surgical paint, infusion pump or catheter.
  • compositions of the present invention are suitable for application by medical devices that allow their release in concentrations suitable for treatment. These devices must be suitable for the administration of the drug locally that allows the treatment not to be dispersed and act in the affected area.
  • the devices may, for example, but not be limited, carry the drugs inside or be coated therewith. Within these devices can be found, for example, circulatory assistance devices, endovascular procedures and cardiovascular surgery, and within these, for example, but not limited to, stents, valves, rings, sutures, patches or vascular grafts.
  • compositions of the invention may further comprise one or more pharmaceutically acceptable carriers and / or other active ingredient (s), and may be administered alone or in combination with other pharmaceutical compositions or medicaments intended for the treatment and / or prevention of the hypertension.
  • Another aspect of the invention relates to a food comprising the fraction of the invention, which preferably comprises at least one of the sequence peptides SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11, and more preferably comprising the sequence peptides SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11.
  • the food is a functional food.
  • Another aspect of the invention relates to a food comprising the sequence peptide SEQ ID NO: 9.
  • the food is a functional food.
  • Another aspect of the invention relates to a food comprising the sequence peptide SEQ ID NO: 10.
  • the food is a functional food.
  • Another aspect of the invention relates to a food comprising the peptide of sequence SEQ ID NO: 11.
  • the food is a functional food.
  • Another aspect of the invention relates to a food comprising the sequence peptides SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11, or any combination thereof.
  • the food is a functional food.
  • Figure 1 Decrease in systolic blood pressure (SBP), obtained in spontaneously hypertensive rats (SHR), after oral administration of 1ml of saline (O), 50 mg / kg captopril ( ⁇ ), 200 mg / kg hydrolyzed lactoferrin obtained with pepsin ( ⁇ ) and 200 mg / kg fraction of the lactoferrin hydrolyzate obtained with pepsin less than 3000 Da ( ⁇ ).
  • SBP systolic blood pressure
  • SHR spontaneously hypertensive rats
  • O 1ml of saline
  • O 50 mg / kg captopril
  • ⁇ 200 mg / kg hydrolyzed lactoferrin obtained with pepsin
  • ⁇ 200 mg / kg fraction of the lactoferrin hydrolyzate obtained with pepsin less than 3000 Da
  • Data represent the mean ⁇ EMS for a
  • Figure 2 Chromatogram obtained using reverse phase high efficiency liquid chromatography (RP-HPLC) of the fraction less than 3000 Da produced by hydrolysis of lactoferrin with pepsin, in which 13 subfractions (F1-F13) are selected.
  • B ACE inhibitory activity, expressed as the protein concentration needed to inhibit 50% of the enzymatic activity (IC50), corresponding to each of the 13 fractions collected by RP-HPLC.
  • Figure 3 Decreased systolic blood pressure (SBP), obtained in spontaneously hypertensive rats (SHR), after oral administration of 1 ml of saline (O), 50 mg / kg captopril ( ⁇ ), 10 mg / kg SEQ ID NO: 9 ( ⁇ ), 10 mg / kg SEQ ID NO: 10 ( ⁇ ) and 10 mg / kg SEQ ID NO: 1 1 ( ⁇ ). * significantly different from the control (P ⁇ 0.05) and ⁇ significantly different from the control (P ⁇ 0.01). Data represent the mean ⁇ EMS for a minimum of 5 animals.
  • EXAMPLE 1 Obtaining peptides with antihypertensive effect from LF.
  • Bovine lactoferrin (USB Corporation, Cleveland OH USA) dissolves in water at a concentration of 50 mg / ml. The solution is adjusted to pH 3 with 1 M HCI and pepsin (3% by weight) is added. Hydrolysis is carried out at 37 ° C for 4 h with gentle agitation. The hydrolysis is stopped by heating at 80 ° C for 15 min, the pH is adjusted to 7 (1 M NaOH) and centrifuged (4000 rpm 30 min).
  • the ACE inhibitory activity was measured in the fraction of molecular weight less than 3000 Da using a fluorimetric method described in the literature (Sentandreu & Toldra, Food Chemistry, 97 (3), 546-554) based on the hydrolysis of the fluorescent substrate o-aminobenzoylglycyl-p-nitrophenylalanylproline.
  • the value of IC 5 0 calculated from the dose response curves was 14.3 ⁇ 3.3
  • FIG. 1 shows the changes in systolic blood pressure (SBP) in SHR at different times after oral administration of the corresponding dose.
  • SBP systolic blood pressure
  • the fraction of molecular weight less than 3000 Da showed a significant antihypertensive effect at one hour and two hours after oral administration (P ⁇ 0.01 and P ⁇ 0.05 respectively), while this effect was not observed in the case of the complete hydrolyzate of LF.
  • the antihypertensive effect of the fraction of molecular weight less than 3000 Da was again significant at 4 hours after ingestion and was maintained until 24 h, observing a behavior similar to that of the positive captopril control.
  • the fraction of molecular weight less than 3000 Da was fractionated by RP-HPLC on a semi-preparative scale. As shown in Figure 2A, 13 fractions were collected, in sufficient quantity for further analysis. As shown in Figure 2B the most active sub-fractions were fractions number 1, 3, 6 and 12, which were analyzed by tandem mass spectrometry to determine their constituent peptides. The identified peptides are shown in Table 1. Table 1. Peptides identified in subfractions 1, 3, 6 and 12 of the fraction less than 3000
  • aIC5o is the mean ⁇ EMS of at least three independent experiments.
  • Sequence peptides SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 11 produced significant inhibitions of ECA-dependent contraction compared to the peptide-free control. Although the contractions induced by angiotensin I in the segments preincubated with SEQ ID NO: 10 were smaller than the control, the reduction was not statistically significant.
  • the three peptides evaluated showed significant antihypertensive effect after 1 hour after oral administration (P ⁇ 0.01). While SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10, lost their effect after 2 hours after administration, the sequence peptide SEQ ID NO: 11 maintained its antihypertensive effect throughout the 24-hour duration of the experiment , with a behavior similar to that of the positive control captopril.

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Abstract

La invención se refiere a un método para obtener la fracción de paso molecular inferior a 3000 Da de un hidrolizado de lactoferrina, el cual comprende diversos péptidos. La invención también engloba la fracción del hidrolizado de lactoferrina obtenible por dicho método y algunos de los peptidos que incluye, así como al uso de dicha fracción y péptidos para la elaboración de medicamentos para la prevención y/o el tratamiento de la hipertensión, así como alimentos o suplementos alimenticios.

Description

Fracción de bajo peso molecular de un hidroiizado de lactoferrina para ei tratamiento de la hipertensión
La presente invención se encuadra dentro del campo de la biotecnología y la biomedicina. Específicamente, se refiere a un método para obtener la fracción de peso molecular inferior a 3000 Da de un hidroiizado de lactoferrina, que comprende diversos péptidos. También se refiere a la fracción obtenible por este método, así como a algunos de los péptidos contenidos en dicha fracción y al uso de esta fracción o de los péptidos para la elaboración de medicamentos para la prevención y/o el tratamiento de la hipertensión, alimentos o suplementos alimenticios.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
La hipertensión consiste en un aumento de la presión sanguínea por encima de unos niveles deseables, ya que este aumento conlleva riesgos para la salud. Esta hipertensión lleva asociado un aumento de la mortalidad de forma prematura en los individuos que la padecen (Giles 2009. J Clin Hypertens 11(11 ):61 1-614).
Uno de los mayores problemas generados por la hipertensión son los accidentes cerebrovasculares. Dentro de estos, el accidente cerebrovascular agudo (o ictus) es el más importante, ya que supone la tercera causa de mortalidad (tras el cáncer y las enfermedades isquémicas cardíacas) y la primera de incapacidad permanente en las sociedades avanzadas. Este ictus puede ser producido fundamentalmente por un trombo (trombosis) o por un émbolo (embolia) en una arteria cerebral, lo que produce un descenso de la irrigación sanguínea (isquemia) y por tanto la necrotización y muerte del tejido (infarto) que se queda sin irrigación. También puede ser producido por la rotura de un vaso sanguíneo en el parénquima cerebral (hemorragia intracerebral) o en la superficie cerebral (hemorragia subaracnoidea). Otras posibles complicaciones producidas por la hipertensión son por ejemplo hipertrofia ventricular, fibrosis miocárdica, disfunción sistólica ventricular, disfunción diastólica ventricular, isquemia renal, fibrosis túbulo-intersticial del parénquima renal, glomeruloesclerosis focal, o aterosclerosis.
El tratamiento prolongado de disminución de la presión sanguínea mediante cambios en el estilo de vida o mediante tratamientos farmacológicos está asociado con reducción en el riesgo de padecer infarto (30-40%) y sucesos coronarios (20%) y parece que también reduce la incidencia de otras complicaciones.
Dado que se han relacionado alteraciones en el sistema renina-angiotensina- aldosterona (SRA) con la hipertensión, se han desarrollado medicamentos antihipertensivos que utilizan como diana diferentes componentes de este sistema, como por ejemplo inhibidores de renina, inhibidores de la enzima conversora de angiotensina (ECA), bloqueantes de los receptores de angiotensina o antagonistas del receptor de aidosterona (Williams B 2009. J Hypertens 27(3):S19-26). Ejemplos de estos fármacos serían por ejemplo el captopril o el enalapril, los cuales son inhibidores de ECA. Estos fármacos pueden presentar efectos secundarios como tos seca, angioedema, cefaleas, sensación de inestabilidad, fatiga, hipotensión o astenia.
Debido a la necesidad en muchos de los casos no solo de administrar un fármaco, sino de cambiar los hábitos de vida de los pacientes, se ha tratado de buscar nuevos compuestos que sirvan para el tratamiento de la hipertensión que tengan un mayor número de aplicaciones, como por ejemplo que se encuentren incluidos en alimentos funcionales, a parte de su aplicación directa como fármacos. En este sentido se han utilizado tanto péptidos antihipertensivos derivados de proteínas de plantas y animales tales como leche, soja o pescado, como péptidos sintéticos que mimetizan estos péptidos naturales o péptidos diseñados de novo. Dichos péptidos pueden ser producidos, por ejemplo, mediante la hidrólisis enzimática de las proteínas precursoras durante el procesamiento de los alimentos y la digestión. Estos péptidos pueden ser incorporados en alimentos para el desarrollo de productos funcionales beneficiosos para ia salud. En ia actualidad, existen en el mercado o en desarrollo diversos productos que contienen estos péptidos bioactivos. Sin embargo, a pesar de estos desarrollos, los ensayos clínicos realizados hasta el momento con varios péptidos no han indicado un claro efecto beneficioso en todos los pacientes hipertensos (Engberink MF et al 2008. Hypertension 51 (2):399-405; De Leo et a/ 2009. Curr Pharm Des 15(31 ):3622-3643).
Dado que los fármacos utilizados en ia actualidad pueden producir efectos secundarios y los ensayos clínicos realizados con péptidos hasta la fecha no demuestran un claro efecto antihipertensivo, se hace necesaria una mejora en los medicamentos para controlar la hipertensión.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un método de obtención de ia fracción de peso molecular inferior a 3000 Da de un hídrolizado de lactoferrína bovina (LF), así como a la propia fracción de peso molecular inferior a 3000 Da de un hidroiizado de lactoferrína obtenible por dicho método. La presente invención también se refiere a algunos de los péptidos contenidos en dicha fracción. Esta fracción, ai igual que ios péptidos que comprende, puede ser utilizada para ia elaboración de medicamentos, preferiblemente para la prevención y/o el tratamiento de la hipertensión, así como para la elaboración de alimentos funcionales o suplementos alimenticios. La presente invención también se refiere a alimentos o composiciones que comprenden la fracción de peso molecular inferior a 3000 Da de un hidroiizado de lactoferrína bovina (LF) o algunos de los péptidos que comprende.
En la presente invención se demuestra que la fracción de peso molecular inferior a 3000 Da de un hídrolizado de lactoferrína bovina producido mediante hidrólisis con pepsina, presenta actividad antihipertensiva "in vivo". Como se observa en los ejemplos de la presente invención, este efecto antihipertensivo no se produce en caso de utilizar un hidroiizado de lactoferrína completo, sin seleccionar ninguna de sus fracciones. Este efecto puede ser debido fundamentalmente a la eliminación de compuestos que interfieren o presentan un efecto antagónico a la capacidad hipotensora de péptidos de pequeño tamaño, o a la mayor concentración de estos péptidos de pequeño tamaño con efecto antihipertensivo en la fracción seleccionada. Por otro lado, en la presente invención también se demuestra que dentro de esta fracción de lactoferrina bovina producida medíante hidrólisis con pepsina, existen 3 péptidos (de secuencias SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:11 ) los cuales también presentan capacidad antihipertensiva por si mismos.
Un hidrolízado puede ser obtenido mediante hidrólisis enzímátíca o hidrólisis química (hidrólisis ácida o hidrólisis alcalina). No obstante, el método seleccionado para la realización de la hidrólisis confiere al producto unas características concretas que no pueden ser obtenidas por otro método ya que, por ejemplo, los distintos métodos utilizados darían lugar a una hidrólisis en diferentes enlaces peptídicos de la proteína, dando por tanto diferentes características estructurales y funcionales al producto resultante. La hidrólisis enzimática se produce en unas condiciones más controladas y los hídrolizados producidos son más reproducibles, por lo que el producto resultante presenta unas mejores características que los hídrolizados obtenidos mediante métodos químicos. Además, este hidrolízado enzimático no presenta compuestos químicos residuales en su composición lo que presenta ventajas a la hora de su uso frente a los hídrolizados químicos. En la presente invención la hidrólisis ha de ser controlada por lo que se produce mediante métodos enzimáticos.
La hidrólisis enzimática de las proteínas puede llevarse a cabo mediante diversas enzimas activas en diferentes condiciones. Dentro de las enzimas proteolíticas existen diversas opciones como las proteasas específicas de residuo o aquellas que degradan las proteínas inespecíficamente. Entre estas enzimas, una de las más utilizadas es la pepsina, enzima digestiva que degrada las proteínas en el estómago y que actúa rompiendo de forma preferencial los enlaces peptídicos de aminoácidos hidrofóbicos y aromáticos.
Posteriormente a la hidrólisis es necesario seleccionar la fracción que presenta la actividad antihipertensiva para eliminar los posibles elementos que presenten acción contraria a la deseada o bien que interfieren con dicha acción. Esta selección se puede realizar por diversos métodos conocidos en el estado de la técnica, como por ejemplo mediante ultrafiitracion a través de una membrana que presenta como tamaño de selección 3000 Da.
Por todo ello, un primer aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de una fracción de peso molecular inferior a 3000 Da de un hídrolizado de lactoferrína bovina (de ahora en adelante "método de la invención") que comprende:
a) hidrolízar la lactoferrína bovina mediante hidrólisis con pepsina, y b) seleccionar la fracción de peso molecular inferior a 3000 Da del hídrolizado del paso (a).
Se entiende por "fracción de peso molecular inferior a 3000 Da" en la presente invención aquella fracción del hídrolizado que comprende péptidos que no superan los 3000 Da de peso molecular, y que por tanto excluye diversos polipéptidos o bien fragmentos de la proteína original que no son digeridos por la hidrólisis de la invención.
Se entiende por "pepsina" en la presente invención aquellas enzimas con números EC (número de la Comisión de Enzimas o Enzyme Commision number) 3.4.23.1 (pepsina A), 3.4.23.2 (pepsina B o parapepsina I) ó 3.4.23.3 (pepsina C o gastricsina), o cualquiera de sus homologas. Estas enzimas homologas se pueden encontrar por ejemplo, aunque sin limitarse, tanto en animales como en plantas, hongos, protozoos o procariotas. Todas estas enzimas se encuentran incluidas en el grupo EC 3.4.23 (endopeptidasas aspárticas) por lo que los puntos de corte sobre las proteínas son similares y por tanto, a partir del mismo sustrato dan lugar a hidrolizados semejantes. Se entiende por "enzima homologa" en este contexto aquellas enzimas que presentan la misma actividad que las enzimas descritas, es decir, aquellas enzimas que presentan cierta similitud estructural e igual funcionalidad con las enzimas descritas.
De estas enzimas la más común y ampliamente utilizada es la pepsina A. Esta pepsina es la utilizada en los ejemplos de la invención para la realización de la hidrólisis. Por ello, en una realización preferida del método de la invención, la pepsina del paso (a) es pepsina A.
La hidrólisis ha de ser llevada a cabo en unas condiciones controladas, con el fin de evitar un exceso de hidrólisis de la lactoferrina producido por unas condiciones agresivas. Las condiciones no controladas podrían provocar la degradación de la lactoferrina bovina no únicamente mediante pepsina, o incluso la degradación de los péptidos activos. Por tanto, estas condiciones fuera de un rango establecido, pueden provocar la obtención de un producto final diferente. Además estas condiciones de reacción también pueden afectar a la actividad de la enzima utilizada y no solo a la proteína de origen, por lo que también podrían afectar a la composición final del hidrolizado. Dentro de estas condiciones de reacción una de las más importantes a tener en cuenta es el tiempo de hidrólisis, ya que este influye en el grado de degradación de la proteína original o de los productos (péptidos) intermedios y por tanto el porcentaje de diversos elementos en el hidrolizado final, o bien la presencia o ausencia de algunos de los mismos, puede variar dando diferente función al producto obtenido. En la presente invención, la situación óptima se da cuando la pepsina hidroliza el 100% de la lactoferrina inicial. A pesar de ello, aunque la digestión no sea total, la digestión parcial consigue que el hidrolizado presente actividad, ya que la posterior filtración elimina los elementos no digeridos permitiendo el mantenimiento de los péptidos producidos por la digestión parcial, algunos de los cuales son los que presentan actividad. Por todo ello, en otra realización preferida del método de la invención, la hidrólisis del paso (a) se realiza durante al menos 1 hora. En una realización más preferida del método de la invención, la hidrólisis se realiza durante un tiempo de entre 3 y 5 horas. En una realización aun más preferida del método de la invención, la hidrólisis del paso (a) se realiza durante 4 horas.
Otra de las condiciones a tener en cuenta a la hora de llevar a cabo la hidrólisis es el pH al que se lleva a cabo la reacción. Este pH influye en la estabilidad de la lactoferrina bovina, así como en la actividad enzimática. La pepsina, para presentar actividad, necesita encontrarse en un entorno ácido (pH inferior a 7), y presenta un máximo de actividad a un pH en torno a 3. Por todo ello, en otra realización preferida del método de la invención, la hidrólisis del paso (a) se realiza a un pH inferior a 7. En una realización más preferida del método de la invención, la hidrólisis se realiza a un pH de entre 2 y 4. En una realización aun más preferida del método de la invención, la hidrólisis del paso (a) se realiza a un pH de 3.
Otra de las condiciones esenciales para mantener la estabilidad de la lactoferrina bovina, y para la actividad enzimática es la temperatura. Ambas proteínas presentan estabilidad en torno a los 37°C. Por tanto en otra realización preferida del método de la invención, la hidrólisis del paso (a) se lleva a cabo a una temperatura de entre 25°C y 45°C. En una realización más preferida del método de la invención, la hidrólisis del paso (a) se realiza a una temperatura de entre 30°C y 40°C. En una realización aun más preferida del método de la invención, la hidrólisis del paso (a) se realiza a una temperatura de 37°C.
Para llevar a cabo la selección de la fracción de peso molecular inferior a 3000 Da del hídrolízado, la cual presenta la actividad antihipertensiva, existen diversos métodos útiles conocidos en el estado de la técnica, como por ejemplo, aunque sin limitarse, cromatografía por filtración en gel, o ultrafiltración. De los posibles métodos de selección útiles en la presente invención el más práctico por sencillez y coste del mismo, y que ofrece mayores garantías para seleccionar correctamente la fracción deseada, sin elementos que puedan contaminarla, es la ultrafiltración. Por todo ello, en otra realización preferida del método de la invención, la selección de la fracción de peso molecular inferior a 3000 Da del paso (b) se realiza mediante ultrafiltración.
En la presente invención se demuestra que la fracción de peso molecular inferior a 3000 Da de un hidrolizado de lactoferrina, obtenida por el método de la invención, presenta un claro efecto antihipertensivo, el cual no se observa en caso de utilizar el hidrolizado completo sin llevar a cabo la selección de esta fracción. Por todo ello, otro aspecto de la invención se refiere a una fracción de peso molecular inferior a 3000 Da de un hidrolizado de lactoferrina obtenible por el método de la invención, de ahora en adelante "fracción de la invención".
En la presente invención, se demuestra que incluidos dentro de esta fracción de la invención se encuentran 3 péptidos de secuencia SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , los cuales, al igual que en el caso de la fracción de la invención, también presentan un efecto antihipertensivo en experimentos "in vivo". Por todo ello, una realización preferida de este aspecto de la invención se refiere a la fracción de la invención, donde la fracción comprende al menos uno de los péptidos de secuencia SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:1 1. En una realización más preferida la fracción de la invención comprende los péptidos de secuencia SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, y SEQ ID NO:1 1.
En la presente invención se demuestra la presencia de diversos péptidos dentro de la fracción de la invención. Estos péptidos identificados son analizados para determinar su capacidad antihipertensiva. De todos los péptidos identificados, los péptidos SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO: 1 1 son los que presentan mejores características antihipertensivas. Estos péptidos pueden ser aislados de la fracción de la invención o bien pueden ser sintetizados de novo mediante síntesis química. En la presente invención se observa que los péptidos sintetizados de novo presentan la actividad antihipertensiva. Por todo ello, otro aspecto de la invención se refiere a un péptido de secuencia SEQ ID NO:9. Otro aspecto de la invención se refiere a un péptido de secuencia SEQ ID NO: 10. Otro aspecto de la invención se refiere a un péptido de secuencia SEQ ID NO:11.
Los péptidos de la presente invención y sus variantes o derivados pueden ser producidos medíante distintos procedimientos. Pueden ser obtenidos, por ejemplo mediante su aislamiento de un hidrolizado de lactoferrina. También pueden ser obtenidos mediante otro métodos conocidos en el estado de la técnica, como por ejemplo, aunque sin limitarse, síntesis química o síntesis biotecnológica en fase sólida o mediante aproximaciones de ADN recombinante. Los péptidos de la invención pueden producirse mediante ADN recombinante, no sólo directamente sino como polipéptidos de fusión unidos a un polipéptido heterólogo, el cual puede contener, por ejemplo aunque sin limitarnos, una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de corte por una proteasa, por ejemplo, aunque sin limitarnos, en el extremo N-terminal de la proteína madura o del polipéptido.
En el sentido utilizado en la descripción, el término "variante" se refiere a un péptido que presenta una elevada identidad con los descritos y que presenta por ejemplo, aunque sin limitarse, adiciones, deleciones o sustituciones. Estas variantes presentan un grado de identidad con respecto a los péptidos descritos de, al menos, un 75%, preferentemente de, al menos, un 85%, más preferentemente de, al menos, un 90% y aun más preferentemente, un 95%.
Los términos "péptido", "polipéptido", "proteína" o "secuencia aminoacídíca" se usan de forma intercambiable en la presente invención, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden estar o no, química o bioquímicamente modificados.
El término "lactoferrina bovina" tal y como se utiliza en la presente invención, se refiere a la proteína de 689 residuos de aminoácidos (número de acceso del Protein Data Bank (PDB): 1 BLF; SEQ ID NO:13), derivada de la proteína traducida de 708 aminoácidos (número de acceso al GenBank: AAA30610; SEQ ID NO: 14) codificada por el cDNA de número de acceso al GenBank: L19981.1 (SEQ ID NO:15). También se incluyen dentro de esta definición aquellos péptidos que presentan una identidad de al menos un 95% y preferiblemente un 99% con respecto a SEQ ID NO: 13, que dan lugar a la fracción de la invención y/o a los péptidos de la invención. Estos péptidos pueden ser producidos, por ejemplo mediante sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos respecto a la secuencia SEQ ID NO: 13.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la fracción de la invención, preferiblemente que comprenda al menos uno de los péptidos de secuencia SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, o SEQ ID NO:1 1 , y más preferiblemente que comprenda los péptidos de secuencia SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10, y SEQ ID NO:1 1 , en la elaboración de un medicamento, o alternativamente, a la fracción de la invención, preferiblemente que comprenda al menos uno de los péptidos de secuencia SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, o SEQ ID NO:11, y más preferiblemente que comprenda los péptidos de secuencia SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, y SEQ ID NO:11 , para su uso en medicina.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del péptido de secuencia SEQ ID NO:9 en la elaboración de un medicamento, o alternativamente, al péptido de secuencia SEQ ID NO:9 para su uso en medicina.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del péptido de secuencia SEQ ID NO: 10 en la elaboración de un medicamento, o alternativamente, al péptido de secuencia SEQ ID NO: 10 para su uso en medicina.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del péptido de secuencia SEQ ID NO: 11 en la elaboración de un medicamento, o alternativamente, al péptido de secuencia SEQ ID NO:11 para su uso en medicina.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la fracción de la invención, preferiblemente que comprenda al menos uno de los péptidos de secuencia SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, o SEQ ID NO:11 , y más preferiblemente que comprenda los péptidos de secuencia SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10, y SEQ ID NO:11 , en la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de la hipertensión, o alternativamente, a la fracción de la invención, preferiblemente que comprenda al menos uno de los péptidos de secuencia SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, o SEQ ID NO:11 , y más preferiblemente que comprenda los péptidos de secuencia SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10, y SEQ ID NO:11 , para su uso en la prevención y/o el tratamiento de la hipertensión.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del péptido de secuencia SEQ ID NO:9 en la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de la hipertensión, o alternativamente, al péptido de secuencia SEQ ID NO:9 para su uso en la prevención y/o el tratamiento de la hipertensión.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del péptido de secuencia SEQ ID NO: 10 en la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de la hipertensión, o alternativamente, al péptido de secuencia SEQ ID NO: 10 para su uso en la prevención y/o el tratamiento de la hipertensión.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del péptido de secuencia SEQ ID NO: 11 en la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de la hipertensión, o alternativamente, al péptido de secuencia SEQ ID NO:11 para su uso en la prevención y/o el tratamiento de la hipertensión.
El término "medicamento", hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el ser humano y los animales. El medicamento al que se refiere la presente invención puede ser de uso humano o veterinario. El "medicamento de uso humano" es toda sustancia o combinación de sustancias que se presente como poseedora de propiedades para el tratamiento o prevención de enfermedades en seres humanos o que pueda usarse en seres humanos o administrarse a seres humanos con el fin de restaurar, corregir o modificar las funciones fisiológicas ejerciendo una acción farmacológica, inmunologica o metabolica, o de establecer un diagnóstico médico. El "medicamento de uso veterinario" es toda sustancia o combinación de sustancias que se presente como poseedora de propiedades curativas o preventivas con respecto a las enfermedades animales o que pueda administrarse al animal con el fin de restablecer, corregir o modificar sus funciones fisiológicas ejerciendo una acción farmacológica, inmunologica o metabolica, o de establecer un diagnóstico veterinario.
El término "tratamiento" tal como se entiende en la presente invención se refiere a combatir los efectos causados como consecuencia de la enfermedad o condición patológica de interés en un sujeto (preferiblemente mamífero, y más preferiblemente un humano) que incluye:
(i) inhibir la enfermedad o condición patológica, es decir, detener su desarrollo;
(ii) aliviar la enfermedad o la condición patológica, es decir, causar la regresión de la enfermedad o la condición patológica o su síntomatología;
(iii) estabilizar la enfermedad o la condición patológica. El término "prevención" tal como se entiende en la presente invención consiste en evitar la aparición de la enfermedad, es decir, evitar que se produzca ia enfermedad o la condición patológica en un sujeto (preferiblemente mamífero, y más preferiblemente un humano), en particular, cuando dicho sujeto tiene predisposición por la condición patológica, pero aún no se ha diagnosticado que la tenga.
Se entiende por "hipertensión" en la presente invención, una presión arterial sistémíca igual o superior a unos valores control conocidos en el estado de la técnica, que preferiblemente son de 140 mm de mercurio de presión arterial sistólica y/o 90 mm de mercurio de presión arterial diastólica. Esta hipertensión se presenta fundamentalmente como hipertonía arterial. Existen 2 formas básicas de hipertensión: la hipertensión sanguínea esencial o primaria, y la hipertensión sanguínea secundaria. La hipertensión sanguínea esencial es debida, por norma general, a una resistencia elevada a la circulación como consecuencia, por ejemplo, del estrechamiento, al comienzo puramente funcional y posteriormente orgánico, de la vía sanguínea arterial. La hipertensión sanguínea secundaria o también sintomática es, por el contrario, una hipertensión sanguínea vinculada con un órgano, es decir provocada por la enfermedad de un órgano, que puede exteriorizarse, por ejemplo, aunque sin limitarse, como una hipertonía endocrina, renal, pulmonar o cardiovascular.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la fracción de la invención, preferiblemente que comprenda al menos uno de los péptidos de secuencia SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:11 , y más preferiblemente que comprenda los péptidos de secuencia SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10, y SEQ ID NO:11 , en la elaboración de un alimento, o alternativamente, a la fracción de la invención, preferiblemente que comprenda al menos uno de los péptidos de secuencia SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:11 , y más preferiblemente que comprenda los péptidos de secuencia SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, y SEQ ID NO:11 , para su uso como alimento. Una realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso de dicha fracción en la elaboración de un alimento funcional, o alternativamente, a dicha fracción para su uso como alimento funcional. Una realización más preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso de dicha fracción en la elaboración de un alimento funcional para la prevención de la hipertensión, o alternativamente, a dicha fracción para su uso como alimento funcional para la prevención de la hipertensión.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del péptido de secuencia SEQ ID NO:9 en la elaboración de un alimento, o alternativamente, al péptido de secuencia SEQ ID NO:9 para su uso como alimento. Una realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso de dicho péptido en la elaboración de un alimento funcional, o alternativamente, a dicho péptido para su uso como alimento funcional. Una realización más preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso de dicho péptido en la elaboración de un alimento funcional para la prevención de la hipertensión, o alternativamente, a dicho péptido para su uso como alimento funcional para la prevención de la hipertensión.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del péptido de secuencia SEQ ID NO: 10 en la elaboración de un alimento, o alternativamente, ai péptido de secuencia SEQ ID NO: 10 para su uso como alimento. Una realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso de dicho péptido en ia elaboración de un alimento funcional, o alternativamente, a dicho péptido para su uso como alimento funcional. Una realización más preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso de dicho péptido en la elaboración de un alimento funcional para la prevención de la hipertensión, o alternativamente, a dicho péptido para su uso como alimento funcional para la prevención de la hipertensión.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del péptido de secuencia SEQ ID NO:11 en la elaboración de un alimento, o alternativamente, al péptido de secuencia SEQ ID NO:11 para su uso como alimento. Una realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso de dicho péptido en la elaboración de un alimento funcional, o alternativamente, a dicho péptido para su uso como alimento funcional. Una realización más preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso de dicho péptido en la elaboración de un alimento funcional para la prevención de la hipertensión, o alternativamente, a dicho péptido para su uso como alimento funcional para la prevención de la hipertensión.
Se entiende por "alimento funcional" en la presente invención aquel alimento que se demuestra que afecta de forma beneficiosa a una o más funciones del organismo, más allá de los efectos nutricionales, en el sentido de ser relevante para un óptimo estado de salud o para la reducción del riesgo de padecer una enfermedad o condición patológica. En el contexto de la presente invención se refiere, preferiblemente, a la reducción del riesgo de padecer hipertensión. Esta expresión por tanto incluye también alimentos importantes en el mantenimiento a medio o largo plazo de la salud así como en su mejora. En este contexto, se prefieren usos no terapéuticos. Las expresiones "nutracéuticos", "alímentocéuticos" y "alimentos de diseño" se usan como sinónimos.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la fracción de la invención, preferiblemente que comprenda al menos uno de los péptidos de secuencia SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:11 , y más preferiblemente que comprenda los péptidos de secuencia SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10, y SEQ ID NO: 11 , para la elaboración de un suplemento alimenticio, o alternativamente a dicha fracción para su uso como suplemento alimenticio. Otro aspecto de la invención se refiere al uso del péptido de secuencia SEQ ID NO:9 para la elaboración de un suplemento alimenticio, o alternativamente a dicho péptido para su uso como suplemento alimenticio. Otro aspecto de la invención se refiere al uso del péptido de secuencia SEQ ID NO: 10 para la elaboración de un suplemento alimenticio, o alternativamente a dicho péptido para su uso como suplemento alimenticio. Otro aspecto de la invención se refiere al uso del péptido de secuencia SEQ ID NO:11 para la elaboración de un suplemento alimenticio, o alternativamente a dicho péptido para su uso como suplemento alimenticio.
Se entiende por "suplemento alimenticio" en la presente invención productos alimenticios que contienen uno o más nutrientes en forma concentrada. Suelen encontrarse en forma alimenticia atípica, preferiblemente en cápsulas, pastillas, comprimidos o líquidos. Formas típicas adicionales de administración de estos suplementos alimenticios son, por ejemplo, aunque sin limitarnos, sobres con polvos, ampollas con líquidos, frascos con insertos de goteo y formas de administración similares de líquidos y polvos para la captación en pequeñas cantidades medidas que son útiles para suplementar la nutrición.
Otro aspecto de la invención se refiere a una composición, de ahora en adelante primera composición de la invención, que comprende la fracción de la invención, que preferiblemente comprende al menos uno de los péptídos de secuencia SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:11 , y más preferiblemente comprende los péptidos de secuencia SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10, y SEQ ID NO:11. En una realización preferida de este aspecto de la invención la composición es una composición farmacéutica.
Otro aspecto se refiere a una composición, de ahora en adelante segunda composición de la invención, que comprende el péptido de secuencia SEQ ID NO:9. En una realización preferida de este aspecto de la invención la composición es una composición farmacéutica.
Otro aspecto se refiere a una composición, de ahora en adelante tercera composición de la invención, que comprende el péptido de secuencia SEQ ID NO: 10. En una realización preferida de este aspecto de la invención la composición es una composición farmacéutica.
Otro aspecto se refiere a una composición, de ahora en adelante cuarta composición de la invención, que comprende el péptido de secuencia SEQ ID NO:11. En una realización preferida de este aspecto de la invención la composición es una composición farmacéutica.
Otro aspecto se refiere a una composición, de ahora en adelante quinta composición de la invención, que comprende los péptidos de secuencia SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:11 , o cualquiera de sus combinaciones. En una realización preferida de este aspecto de la invención la composición es una composición farmacéutica.
Las composiciones de la presente invención pueden formularse para su administración a un animal, y más preferiblemente a un mamífero, incluyendo al hombre, en una variedad de formas conocidas en el estado de la técnica. Así, pueden estar, sin limitarse, en soluciones acuosas o no acuosas, en emulsiones o en suspensiones. Ejemplos de soluciones no acuosas son, por ejemplo, pero sin limitarse, propilenglícol, políetilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, o ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Ejemplos de soluciones acuosas, son por ejemplo, pero sin limitarse, agua, soluciones alcohólicas en agua, o medios salinos. Las soluciones acuosas pueden estar tamponadas o no, y pueden tener componentes activos o inactivos adicionales. Los componentes adicionales incluyen sales para modular la fuerza iónica, conservantes incluyendo, pero sin limitarse a, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes, o similares, o nutrientes, incluyendo glucosa, dextrosa, vitaminas o minerales. Alternativamente, las composiciones pueden prepararse para su administración en forma sólida. Las composiciones pueden combinarse con varios vehículos o excipientes inertes, incluyendo pero sin limitarse a: aglutinantes, tales como celulosa microcristalina, goma tragacanto, o gelatina; excipientes, tales como almidón o lactosa; agentes dispersantes, tales como ácido algínico o almidón de maíz; lubricantes, tales como estearato de magnesio, deslizantes tales como dióxido de silicio coloidal; agentes edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina; o agentes aromatizantes, tales como menta o salícilato de metilo.
Tales composiciones y/o sus formulaciones pueden administrarse a un animal, incluyendo un mamífero y, por tanto, al hombre, en una variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse, a oral, nasal, ótica, ocular, parenteral, intraperitoneal, intravenosa, intradérmica, epidural, intraespinal, intraestromal, intraartícular, intrasinovial, intratecal, intralesional, intraarterial, intracardiaca, intramuscular, intranasal, intracraneal, subcutánea, intraorbital, intracapsular, tópica, mediante parches transdérmicos, vía rectal, vía vaginal o uretral, medíante la administración de un supositorio, percutánea, spray nasal, implante quirúrgico, pintura quirúrgica interna, bomba de infusión o vía catéter. Las composiciones de la presente invención son aptas para su aplicación mediante dispositivos médicos que permitan su liberación en concentraciones adecuadas para el tratamiento. Estos dispositivos deben ser adecuados para la administración del fármaco de forma local que permita que el tratamiento no se disperse y actúe en la zona afectada. Los dispositivos pueden, por ejemplo, pero sin limitarse, llevar los fármacos en su interior o ir recubiertos de los mismos. Dentro de estos dispositivos se pueden encontrar, por ejemplo, dispositivos de asistencia circulatoria, de procedimientos endovasculares y cirugía cardiovascular, y dentro de estos, por ejemplo, pero sin limitarse, stents, válvulas, anillos, suturas, parches o injertos vasculares.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender además uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables y/u otro/s principio/s activo/s, y pueden ser administradas solas o en combinación con otras composiciones farmacéuticas o medicamentos destinados al tratamiento y/o prevención de la hipertensión.
Otro aspecto de la invención se refiere a un alimento que comprende la fracción de la invención, que preferiblemente comprende al menos uno de los péptidos de secuencia SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:11 , y más preferiblemente que comprende los péptidos de secuencia SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:11. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el alimento es un alimento funcional.
Otro aspecto de la invención se refiere a un alimento que comprende el péptido de secuencia SEQ ID NO:9. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el alimento es un alimento funcional.
Otro aspecto de la invención se refiere a un alimento que comprende el péptido de secuencia SEQ ID NO:10. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el alimento es un alimento funcional.
Otro aspecto de la invención se refiere a un alimento que comprende el péptido de secuencia SEQ ID NO:11. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el alimento es un alimento funcional.
Otro aspecto de la invención se refiere a un alimento que comprende los péptidos de secuencia SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:11 , o cualquiera de sus combinaciones. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el alimento es un alimento funcional.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Disminución de la presión arterial sistólica (PAS), obtenida en ratas espontáneamente hipertensas (SHR), tras la administración oral de 1ml de suero salino (O), 50 mg/kg captopril (·), 200 mg/kg hídrolizado de lactoferrina obtenido con pepsina (■) y 200 mg/kg fracción del hídrolizado de lactoferrina obtenido con pepsina menor de 3000 Da (□). *significativamente diferente con respecto al control (P<0,05) y ^significativamente diferente con respecto al control (P<0,01). Los datos representan la media ± EMS para un mínimo de 5 animales.
Figura 2. A: Cromatograma obtenido utilizando cromatografía líquida de alta eficacia en fase inversa (RP-HPLC) de la fracción menor de 3000 Da producida mediante la hidrólisis de lactoferrina con pepsina, en el que se seleccionan 13 subfracciones (F1-F13). B: Actividad inhibidora de ECA, expresada como la concentración proteica necesana para inhibir el 50 % de la actividad enzimática (IC50), correspondiente a cada una de las 13 fracciones recogidas mediante RP-HPLC.
Figura 3. Disminución de la presión arterial sistólica (PAS), obtenida en ratas espontáneamente hipertensas (SHR), tras la administración oral de 1 ml de suero salino (O), 50 mg/kg captopril (·), 10 mg/kg SEQ ID NO:9 (Δ), 10 mg/kg SEQ ID NO:10 (■) y 10 mg/kg SEQ ID NO:1 1 (□). *signífícativamente diferente con respecto al control (P<0,05) y ^significativamente diferente con respecto al control (P<0,01 ). Los datos representan la medía ± EMS para un mínimo de 5 animales.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.
EJEMPLO 1. Obtención de péptídos con efecto antíhipertensivo a partir de LF.
Lactoferrina bovina (USB Corporation, Cleveland OH USA) se disuelve en agua a una concentración de 50 mg/ml. La solución se ajusta a pH 3 con HCI 1 M y se le adiciona pepsina (3% en peso). La hidrólisis se realiza a 37°C durante 4 h con agitación suave. La hidrólisis se detiene medíante calentamiento a 80°C durante 15 min, se ajusta el pH a 7 (NaOH 1 M) y se centrifuga (4000 rpm 30 min). La fracción de peso molecular inferior a 3000 Da del hidrolizado de lactoferrina obtenido mediante la hidrólisis con pepsina durante 4 h, se obtuvo mediante ultrafiltración a través de una membrana de 3000 Da (membrana de polietersulfona VívaFlowSO 3000 Da, Vivascíence, Sartorius Stedím Biotech, Aubagne, Francia). Se midió la actividad inhibidora de ECA en la fracción de peso molecular inferior a 3000 Da utilizando un método fluorimétrico descrito en la bibliografía (Sentandreu & Toldra, Food Chemistry, 97 (3), 546-554) basado en la hidrólisis del sustrato fluorescente o-aminobenzoilglicil-p- nitrophenilalanilprolina. El valor de IC50 calculado a partir de las curvas dosis respuesta fue de 14,3 ± 3,3
Figure imgf000022_0001
Se evaluó el efecto hipotensor del hidrolizado de LF con pepsina y de la fracción de peso molecular inferior a 3000 Da a una dosis de 200 mg/kg empleando ratas espontáneamente hipertensas (SHR). La Figura 1 muestra los cambios de la presión arterial sistólica (PAS) en SHR a distintos tiempos tras la administración oral de la dosis correspondiente. Así mismo se incluye la variación de la PAS observada tras la administración de captopril (control positivo, dosis de 50 mg/kg) o salino (control negativo).
La fracción de peso molecular inferior a 3000 Da mostró un efecto antihipertensivo significativo a la hora y a las dos horas de su administración oral (P<0,01 y P<0,05 respectivamente), mientras que dicho efecto no se observó en el caso del hidrolizado completo de LF. El efecto antihipertensivo de la fracción de peso molecular inferior a 3000 Da volvió a ser significativo a las 4 horas de la ingesta y se mantuvo hasta las 24 h, observándose un comportamiento similar al del control positivo captopril.
Con objeto de identificar los péptidos responsables de la actividad antihipertensiva, la fracción de peso molecular inferior a 3000 Da se fraccionó mediante RP-HPLC a escala semipreparativa. Tal y como se muestra en la Figura 2A se recogieron 13 fracciones, en cantidad suficiente para su posterior análisis. Como se muestra en la Figura 2B las sub-fracciones más activas fueron las fracciones número 1 , 3, 6 y 12, que se analizaron por espectrometría de masas en tándem para determinar sus péptidos constituyentes. Los péptidos identificados se muestran en la Tabla 1. Tabla 1. Péptidos identificados en las subfracciones 1, 3, 6 y 12 de la fracción menor de 3000
Da del hidrolizado de lactoferrina con pepsina durante cuatro horas.
Figure imgf000023_0001
EJEMPLO 2. Péptidos con efecto antíhipertensivo obtenidos mediante síntesis química.
Se sintetizaron químicamente todos los péptidos identificados, mencionados en la Tabla 1 del ejemplo 1 , mediante el método Fmoc en fase sólida (GenScript Corporation, Piscataway, NJ, pureza >90%). Los ensayos de inhibición in vitro a una concentración de 20 μΜ mostraron que sólo tres de ellos (SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:1 1 ) presentaban actividad inhibitoria de ECA. Los valores de IC50 correspondientes a estas tres secuencias se muestran en la Tabla 2. Destaca por su actividad SEQ ID NO:11 , con un valor de IC50 inferior a 1 μΜ. Tabla 2. Actividad inhibidora de ECA de las secuencias SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11 identificadas en las subfracciones 6 y 12 de la fracción menor de 3000 Da del hidrolizado de lactoferrina con pepsina durante cuatro horas.
Figure imgf000024_0001
aIC5o es la media ± EMS de al menos tres experimentos independientes.
Se midió la capacidad de inhibición de la vasoconstricción dependiente de ECA de los péptidos SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:11 en ensayos funcionales ex vivo con arterias aisladas Los resultados se resumen en la Tabla 3 e indican la contracción en respuesta a angiotensína-l (1 μΜ), en % respecto a una respuesta previa en el mismo segmento arterial, y se expresan como la media ± EMS de los experimentos realizados en (n) segmentos arteriales.
Tabla 3. Efecto inhibidor de las secuencias SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:11 (concentración 20 μΜ) identificadas en las subfracciones 6 y 12 de la fracción menor de 3000Da del hidrolizado de lactoferrina con pepsina durante cuatro horas, sobre la contracción
ECA-dependiente en arterias aisladas de conejo.
Figure imgf000024_0002
* Significativamente menor respecto a su control (P<0,05).
** Significativamente menor respecto a su control (P<0,01).
Los péptidos de secuencia SEQ ID NO:9 y SEQ ID NO:11 produjeron inhibiciones significativas de la contracción dependiente de ECA en comparación con el control sin péptido. Aunque las contracciones inducidas por angiotensina I en los segmentos preíncubados con SEQ ID NO: 10 fueron menores que el control, la reducción no fue estadísticamente significativa.
Por último, se evaluó el efecto antihipertensivo de los tres péptidos (SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:11 ) administrándolos por vía oral a una dosis de 10 mg/kg a ratas SHR. La Figura 3 muestra los cambios de la PAS a distintos tiempos tras su administración oral. También se incluyen los resultados obtenidos tras la administración de salino y de 50 mg/kg de captopril.
Los tres péptidos evaluados mostraron efecto antihipertensivo significativo transcurrida 1 hora desde su administración oral (P<0,01 ). Mientras que SEQ ID NO:9 y SEQ ID NO:10, perdieron su efecto una vez transcurridas 2 horas tras su administración, el péptido de secuencia SEQ ID NO:11 mantuvo su efecto antihipertensivo a lo largo de las 24 h de duración del experimento, con un comportamiento similar al del control positivo captopril.
Los resultados presentados demuestran que el péptido identificado por la secuencia SEQ ID NO:11 tiene un claro y pronunciado efecto antihipertensivo, que tras su administración aguda por vía oral sigue un curso temporal semejante al efecto antihipertensivo que se aprecia cuando se administra la fracción de peso molecular inferior a 3000 Da (<3000 Da) del hídrolizado de LF con pepsina (Figura 1 y Figura 3).

Claims

REIVINDICACIONES
1. Método de obtención de una fracción de peso molecular inferior a 3000 Da de un hidrolizado de lactoferrína bovina que comprende:
a) hidrolizar la lactoferrína bovina mediante hidrólisis con pepsina, y b) seleccionar la fracción de peso molecular inferior a 3000 Da del hidrolizado del paso (a).
2. Método según la reivindicación 1 donde la pepsina del paso (a) es pepsina A.
3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 donde la hidrólisis del paso (a) se realiza durante al menos 1 hora.
4. Método según la reivindicación 3 donde la hidrólisis se realiza durante entre 3 y 5 horas.
5. Método según la reivindicación 4 donde la hidrólisis se realiza durante 4 horas.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde la hidrólisis del paso (a) se realiza a un pH inferior a 7.
7. Método según la reivindicación 6 donde la hidrólisis del paso (a) se realiza a un pH de entre 2 y 4.
8. Método según la reivindicación 7 donde la hidrólisis del paso (a) se realiza a un pH de 3.
9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 donde la hidrólisis del paso (a) se realiza a una temperatura de entre 25 y 45 °C.
10. Método según la reivindicación 9 donde la hidrólisis del paso (a) se realiza a una temperatura de entre 30 y 40 °C.
11. Método según la reivindicación 10 donde la hidrólisis del paso (a) se realiza a una temperatura de 37 °C.
12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 donde la selección de la fracción de peso molecular inferior a 3000 Da del paso (b) se realiza mediante ultrafiltración.
13. Fracción de peso molecular inferior a 3000 Da de un hidrolizado de lactoferrina obtenible por un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
14. Fracción según la reivindicación 13 que comprende al menos uno de los péptidos de secuencia SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:11.
15. Fracción según la reivindicación 14 que comprende los péptidos de secuencia SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, y SEQ ID NO:11.
16. Péptido de secuencia SEQ ID NO:9.
17. Péptido de secuencia SEQ ID NO: 10.
18. Péptido de secuencia SEQ ID NO:11.
19. Uso de una fracción según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15 o de un péptído según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 en la elaboración de un medicamento.
20. Uso de una fracción según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15 o de un péptído según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 en la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de la hipertensión.
21. Uso de una fracción según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15 o de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 para la elaboración de un alimento.
22. Uso según la reivindicación 21 donde el alimento es un alimento funcional.
23. Uso de una fracción según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15 o de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 para la elaboración de un suplemento alimenticio.
24. Composición que comprende una fracción según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15 o al menos un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18.
25. Composición según la reivindicación 24 donde la composición es una composición farmacéutica.
26. Alimento que comprende una fracción según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15 o al menos un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18.
27. Alimento según la reivindicación 26 donde el alimento es un alimento funcional.
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2328435A1 (es) * 2006-04-05 2009-11-12 Consejo Sup. Investiga. Cientificas Mejora de la patente peptidos derivados de una proteina lactea con actividad inhibidora de la enzima conversora de angiotensina i.
WO2010125192A1 (en) * 2009-04-30 2010-11-04 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Use of a casein-derived peptide and compositions thereof as antihypertensive

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2328435A1 (es) * 2006-04-05 2009-11-12 Consejo Sup. Investiga. Cientificas Mejora de la patente peptidos derivados de una proteina lactea con actividad inhibidora de la enzima conversora de angiotensina i.
WO2010125192A1 (en) * 2009-04-30 2010-11-04 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Use of a casein-derived peptide and compositions thereof as antihypertensive

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HERNANDEZ-LEDESMA, E. ET AL.: "Identification of bioactive peptides after digection of human milk and infant formula with pepsin and pancreatin", INTERNATIONAL DAIRY JOURNAL., vol. 17, no. 1, 1 January 2007 (2007-01-01), pages 42 - 49 *
RECIO, I. ET AL.: "Two ion-exchange chromatographic methods for the isolation of antibacterial peptides from lactoferrin. In situ enzymatic hydrolysis on an ion-exchange membrane", JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A., vol. 831, no. 2, 29 January 1999 (1999-01-29), pages 191 - 201 *
TSOPMO, A. ET AL.: "Tryptophan released from mother's milk has antioxidant properties", PEDRIATIC RESEARCH., vol. 66, no. 6, 1 December 2009 (2009-12-01), pages 614 - 618 *

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