WO2012096384A1 - 小胞体カルシウムａｔｐアーゼ動態指示薬及びその利用 - Google Patents

小胞体カルシウムａｔｐアーゼ動態指示薬及びその利用 Download PDF

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WO2012096384A1
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WO
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fluorescent
endoplasmic reticulum
fusion protein
amino acid
calcium atpase
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PCT/JP2012/050628
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御子柴　克彦
松浦　徹
嘉名与 佐藤
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独立行政法人理化学研究所
独立行政法人科学技術振興機構
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
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    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Definitions

  • the present invention relates to a fusion protein for use as a probe for detecting the kinetics of endoplasmic reticulum calcium ATPase and use thereof.
  • Endoplasmic reticulum calcium ATPase is an intracellular calcium pump that exists on the endoplasmic reticulum membrane.
  • SERCA plays an extremely important role in maintaining the homeostasis of intracellular calcium ions, and when SERCA activity is hindered, diseases such as heart failure, diabetes, cancer and Alzheimer's disease are caused. SERCA is also one of the causative genes of hereditary heart disease.
  • Non-Patent Document 1 describes a SERCA fluorescent probe.
  • This fluorescent probe is a probe using FRET (fluorescence resonance energy transfer).
  • CFP Cyan fluorescent protein
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • Non-Patent Document 1 since the fluorescent probe of Non-Patent Document 1 is labeled with FITC, the SERCA activity is lost. Therefore, the conventional fluorescent probe has a problem that the dynamics of SERCA cannot be observed while maintaining the activity.
  • the present invention has been made in view of the above-described problems of the prior art, and an object thereof is to provide a fusion protein that can be used for a FRET probe capable of observing the dynamics of SERCA while maintaining activity. There is to do.
  • a fusion protein according to the present invention comprises an endoplasmic reticulum calcium ATPase, a FRET fluorescent donor, and a FRET fluorescent acceptor, and the fluorescent donor, the fluorescent acceptor, and One of which is linked to the N-terminal side of the endoplasmic reticulum calcium ATPase, and the other is one of SERCA2a between the one and the endoplasmic reticulum calcium ATPase or in the endoplasmic reticulum calcium ATPase. It is characterized by being inserted into the amino acid sequence corresponding to the -6th amino acid, 369-380th amino acid, or 572-583 amino acid.
  • the fusion protein according to the present invention is not particularly limited to the more specific examples shown below, but at least one of the fluorescent donor and the fluorescent acceptor is a fluorescent protein as a donor or an acceptor, or a donor. Alternatively, it is preferable to use a fluorescent substance as an acceptor that is specifically bound to a specific peptide sequence.
  • the fluorescent donor is a blue fluorescent protein
  • the fluorescent acceptor is specific to a yellow fluorescent protein or a tetracysteine tag, although not particularly limited to the more specific examples shown below. It is preferable to bind FlAsH or its analogs.
  • the fusion protein according to the present invention is not particularly limited to the more specific examples shown below, but the other is between the one and the N terminus of the endoplasmic reticulum calcium ATPase, or the endoplasmic reticulum.
  • the amino acid is preferably inserted between the 374th amino acid and the 375th amino acid of SERCA2a or between the 577th amino acid and the 578th amino acid.
  • the fusion protein according to the present invention is not particularly limited to the more specific examples shown below, but includes a fusion protein consisting of the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1 to 4; or SEQ ID NOs: 1-4 A fusion protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids of the amino acid sequence shown in any one of them is deleted, substituted or added.
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding any of the fusion proteins described above.
  • the present invention is also not particularly limited to the more specific examples shown below, but a polynucleotide comprising the base sequence shown in any of SEQ ID NOs: 6 to 9; A polynucleotide comprising a nucleotide sequence in which one or several nucleotide sequences of the nucleotide sequences represented by any of SEQ ID NOs: 6 to 9 are deleted, substituted or added; A polynucleotide comprising a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 6 to 9; or any of SEQ ID NOs: 6-9 A polynucleotide comprising a base sequence that is at least 66% identical to the base sequence shown in FIG.
  • the present invention also provides a vector containing the polynucleotide according to the present invention.
  • the present invention further provides a transformant containing the polynucleotide according to the present invention or the vector according to the present invention.
  • the present invention is also a method for observing the behavior of endoplasmic reticulum calcium ATPase, wherein the fluorescence intensity from the fluorescence donor and the fluorescence intensity from the fluorescence acceptor are detected using the fusion protein according to the present invention. To provide a method.
  • the present invention also relates to a method for screening a compound having an endoplasmic reticulum calcium ATPase as a target molecule, from the fluorescence donor in the case where the test compound is treated and not treated with the fusion protein according to the present invention.
  • the method includes the step of comparing the ratio of the fluorescence intensity of the fluorescent light to the fluorescence intensity from the fluorescent receptor.
  • the present invention also provides a kit for observing the behavior of endoplasmic reticulum calcium ATPase, comprising the polynucleotide according to the present invention.
  • the present invention also provides a method for designing a fusion protein comprising an endoplasmic reticulum calcium ATPase, a fluorescent donor for FRET, and a fluorescent acceptor for FRET, wherein the fluorescent donor and the fluorescent acceptor are: One is linked to the N-terminal side of the endoplasmic reticulum calcium ATPase, and the other is between the one and the endoplasmic reticulum calcium ATPase, or the 1st to 10th amino acids of SERCA2a in the endoplasmic reticulum calcium ATPase
  • the present invention provides a method characterized by being designed to be inserted into an amino acid sequence corresponding to amino acids 364 to 384 or amino acids 567 to 587.
  • a fusion protein that can be used for a FRET probe capable of observing the dynamics of SERCA while maintaining activity.
  • FIG. 1 are diagrams showing some examples of the fusion protein according to the present invention.
  • (A) to (e) in FIG. 2 are graphs showing changes in FRET efficiency when Tg is added to a transformant expressing a FRET probe.
  • (A) to (d) in FIG. 3 are graphs showing changes in FRET efficiency when the intracellular calcium concentration expressing the FRET probe is changed.
  • (A) to (c) in FIG. 4 are graphs showing the FRET efficiency when the FRET probe is fixed to each structure.
  • FIG. 5 are graphs showing the relationship between the change in FRET efficiency of F-L577 and the accumulation of Ca 2+ in the ER.
  • FIG. 6 shows the first derivative of FRET efficiency of F-L577 shown in FIGS. 5 (a)-(b) and the first derivative of Ca 2+ accumulation in ER. It is a superimposed graph.
  • (A) in FIG. 7 is a graph showing the relationship between the ATP concentration and the change in FRET efficiency of F-L577, and (b) in FIG. 7 shows the ATP concentration and the accumulation of Ca 2+ in the ER. It is a graph which shows the relationship. It is a figure which shows correlation with FRET efficiency of F-L577, and accumulation
  • the fusion protein according to the present invention comprises an endoplasmic reticulum calcium ATPase, a fluorescent donor for FRET, and a fluorescent acceptor for FRET.
  • One of the fluorescent donor and the fluorescent acceptor is linked to the N-terminal side of the endoplasmic reticulum calcium ATPase.
  • the other of the fluorescent donor and the fluorescent acceptor is SERCA2a (SEQ ID NO: between the one of the fluorescent donor and the fluorescent acceptor and the endoplasmic reticulum calcium ATPase or in the endoplasmic reticulum calcium ATPase. 11; Reference: P.
  • endoplasmic reticulum calcium ATPase or “SERCA” refers to a protein belonging to SERCA (Sarco / endoplasmic reticulum Ca 2+ -ATPase) family.
  • SERCA Searco / endoplasmic reticulum Ca 2+ -ATPase
  • proteins belonging to the SERCA family for example, SERCA 1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 3b, 3c and the like are known.
  • the endoplasmic reticulum calcium ATPase in the present invention has homology with any of these proteins. Any protein may be used.
  • the endoplasmic reticulum calcium ATPase is preferably a protein having at least 70% homology with known proteins belonging to the SERCA family, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, and particularly preferably 95%. % Homology.
  • the fluorescent donor in the present invention may be a molecule that acts as a FRET donor to the fluorescent acceptor in the present invention or a precursor thereof. That is, the fluorescent donor is preferably a molecule having an excitation spectrum that overlaps with the excitation spectrum of the fluorescent acceptor or a precursor thereof.
  • the fluorescent donor it is preferable to use a fluorescent protein as a donor or a fluorescent substance as a donor that specifically binds to a specific peptide sequence.
  • donor generally refers to a molecule that can be used as a molecule that emits excitation energy in the FRET technique.
  • fluorescent protein as a donor for example, a blue fluorescent protein, a yellow fluorescent protein, and the like can be used. Specific examples include CFP, ECFP, YFP, Venus, and the like. .
  • TC-tag tetracysteine tag
  • HaloTag registered trademark: many labels; Promega
  • SNAP-tag SNAP-tag
  • CLIP-tag SNAP-tag
  • ACP-tag SNAP-tag
  • MCP-tag MCP-tag
  • FAPs Fluorogen activating proteins
  • TC-tag is a peptide sequence to which FlAsH, which is a fluorescent substance of MW 664.5, or an analog thereof specifically binds.
  • the fluorescent acceptor in the present invention may be a molecule that acts as an FRET acceptor for the fluorescent donor in the present invention or a precursor thereof. That is, the fluorescent acceptor is preferably a molecule having an excitation spectrum that overlaps the excitation spectrum of the fluorescent donor or a precursor thereof.
  • the fluorescent receptor preferably uses a fluorescent protein as an acceptor or a fluorescent substance that specifically binds to a specific peptide sequence as an acceptor.
  • acceptor generally refers to a molecule that can be used as a molecule that emits fluorescence upon receiving excitation energy from a donor in the FRET technique.
  • a fluorescent protein as an acceptor for example, a blue fluorescent protein, a yellow fluorescent protein, and the like can be used. Specific examples include CFP, ECFP, YFP, Venus, and the like. .
  • Specific peptide sequences to which the fluorescent substance as an acceptor specifically binds include, for example, tetracysteine tag (TC-tag), HaloTag (registered trademark: many labeling reagents: Promega), SNAP-tag, CLIP-tag , ACP-tag and MCP-tag (there are many labels; New Englnad Biolabs), Fluorogen activating proteins (FAPs) (reference: Nat. Biotechnol. 2008; 26 (2): 235-240)
  • TC-tag tetracysteine tag
  • HaloTag registered trademark: many labeling reagents: Promega
  • SNAP-tag registered trademark: many labeling reagents: Promega
  • CLIP-tag labeling reagents: Promega
  • ACP-tag labeling reagents
  • MCP-tag there are many labels
  • New Englnad Biolabs Fluorogen activating proteins
  • the combination of the fluorescent donor and the fluorescent acceptor may be any combination that functions as a FRET fluorescent donor and a fluorescent acceptor.
  • a combination of a blue fluorescent protein (for example, ECFP) and a yellow fluorescent protein (for example, Venus), a combination of a blue fluorescent protein and FlAsH that binds to a tetracysteine tag or an analog thereof can be used.
  • One of the fluorescent donor and the fluorescent acceptor is linked to the N-terminal side of the endoplasmic reticulum calcium ATPase.
  • One of these may be linked to the N-terminus of the endoplasmic reticulum calcium ATPase via a linker.
  • a linker a peptide or the like can be used, a peptide having 1 to 5 amino acids is preferable, and a peptide having 1 to 3 amino acids is more preferable.
  • the amino acid sequence corresponding to the 1st to 6th amino acids of SERCA2a in the endoplasmic reticulum calcium ATPase, the 369th to 380th amino acids, or the 572 to 583th amino acids is the amino acid of ER calcium ATPase and SERCA2a in the present invention.
  • the amino acid sequence corresponding to these amino acids in SERCA2a is pointed out in view of the homology on the sequence or the three-dimensional structure.
  • SERCA1a (SEQ ID NO: 12; reference: C. Toyoshima et al., Nature 405 (2000) 647-655.) Is used as the endoplasmic reticulum calcium ATPase
  • the corresponding amino acid sequence is positions 1-6 of SERCA1a.
  • the amino acid sequence corresponding to the 369th to 380th amino acids of SERCA2a in SERCA1a is the 369th to 380th amino acids of SERCA1a.
  • the amino acid sequence corresponding to amino acids 572 to 583 of SERCA2a in SERCA1a is positions 573 to 584 of SERCA1a.
  • the other of the fluorescent donor and the fluorescent acceptor is one of the fluorescent donor and the fluorescent acceptor and the endoplasmic reticulum calcium ATPase, or the first to fifth of SERCA2a in the endoplasmic reticulum calcium ATPase. It is preferably inserted into the amino acid sequence corresponding to amino acids 370 to 379, or amino acids 573 to 582.
  • the other of the fluorescent donor and the fluorescent acceptor is one of the fluorescent donor and the fluorescent acceptor and the endoplasmic reticulum calcium ATPase, or the first to fourth SERCA2a in the endoplasmic reticulum calcium ATPase. It is more preferable that the amino acid sequence is inserted into the amino acid sequence corresponding to amino acids 371 to 378 or amino acids 574 to 581.
  • the other of the fluorescent donor and the fluorescent acceptor is one of the fluorescent donor and the fluorescent acceptor and the endoplasmic reticulum calcium ATPase, or the first to third of SERCA2a in the endoplasmic reticulum calcium ATPase. It is more preferable that the amino acid sequence is inserted into the amino acid sequence corresponding to amino acids 372 to 377 or amino acids 575 to 580.
  • the other of the fluorescent donor and the fluorescent acceptor is the first amino acid of SERCA2a between one of the fluorescent donor and the fluorescent acceptor and the endoplasmic reticulum calcium ATPase, or in the endoplasmic reticulum calcium ATPase. More preferably, the amino acid sequence is inserted into the amino acid sequence corresponding to the 373-376th amino acid, or the 576-579th amino acid, between the first and second amino acids.
  • the other of the fluorescent donor and the fluorescent acceptor is the amino acid at position 374 of SERCA2a between one of the fluorescent donor and the fluorescent acceptor and the endoplasmic reticulum calcium ATPase, or in the endoplasmic reticulum calcium ATPase.
  • the 375th amino acid, or the corresponding position between the 577th amino acid and the 578th amino acid is most preferable.
  • the fusion protein according to the present invention retains activity as an endoplasmic reticulum calcium ATPase.
  • SERCA undergoes a structural change with an activity change.
  • the main structure of SERCA includes E1-2Ca 2+ , E1-ATP, E2P, and E2 (reference: C. Toyoshima, Annu. Rev. Biochem. 2004, 73: 269-92; C. Toyoshima, Biochim Biophys. Acta 1793 (2009) 941-946 .; TL Sorensen et al., Science 304 (2004) 1672-1675 .; C. Toyoshima, T. Mizutani, Nature 430 (2004) 529-535 .; C. Toyoshima et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104 (2007) 19831-19836.).
  • E1-2Ca 2+ is a state in which two molecules of Ca 2+ are incorporated into SERCA, and when ATP further binds to this, it becomes E1-ATP. Then, ATP is decomposed and Ca 2+ is released to become E2P, and the phosphate group is removed to become E2. The E2 takes in Ca 2+, the E1-2Ca 2+.
  • the fusion protein according to the present invention undergoes a structural change with changes in the activity of the endoplasmic reticulum calcium ATPase, and the distance between the fluorescent donor and the fluorescent acceptor changes with this structural change. Therefore, the FRET probe using the fusion protein according to the present invention has different FRET efficiencies because the distance between the fluorescent donor and the fluorescent acceptor is different in each possible structure. Therefore, by checking the FRET efficiency in each structure that can be taken by the FRET probe in advance and detecting the FRET efficiency under a certain condition, it is possible to detect which structure the FRET probe has taken under the certain condition. be able to. The FRET efficiency varies depending on the configuration of the FRET probe.
  • FRET efficiency refers to the efficiency of excitation energy transfer from a fluorescent donor to a fluorescent acceptor.
  • the FRET efficiency can be expressed, for example, as a ratio between the fluorescence intensity from the fluorescence donor and the fluorescence intensity from the fluorescence acceptor.
  • the fusion protein according to the present invention can be used to provide a FRET probe using a fluorescence energy transfer (FRET) technique.
  • FRET fluorescence energy transfer
  • it can be used for a FRET probe capable of observing the dynamics of SERCA while maintaining activity.
  • the fusion protein according to the present invention can be used to provide a FRET probe that can visualize a structural change of endoplasmic reticulum calcium ATPase, that is, a change in activity as a change in FRET efficiency.
  • the fusion protein according to the present invention retains activity as an endoplasmic reticulum calcium ATPase in living cells. Therefore, by expressing the fusion protein according to the present invention in a living cell, it is possible to provide a FRET probe for easily visualizing the kinetics of the endoplasmic reticulum calcium ATPase while maintaining the activity using FRET technology. Can be used.
  • the present invention is also useful for analyzing the correlation between the structure and function of the endoplasmic reticulum calcium ATPase. In particular, it is useful when investigating what structural change is occurring when the state transitions.
  • the present invention can be suitably used as an endoplasmic reticulum calcium ATPase kinetic indicator. Further, the present invention is very useful not only for research on the dynamics of SERCA, but also for screening molecular target drugs for treating, ameliorating or preventing diseases related to SERCA, diagnosis of these diseases, and the like.
  • the fusion protein according to the present invention can be used for a FRET probe for detecting the level of calcium ion, a FRET probe for detecting a change in calcium ion concentration, and the like.
  • fusion protein may be one in which several proteins or polypeptides having different origins are artificially linked.
  • the fusion protein according to the present invention can be used as a FRET probe as it is when the fluorescent donor and the fluorescent acceptor are molecules that act as FRET donors and acceptors. Further, in the fusion protein according to the present invention, when one or both of the fluorescent donor and the fluorescent acceptor is a precursor of a molecule that acts as a donor or acceptor of FRET, the precursor is used as a donor or acceptor. It can be used as a FRET probe after it has been converted into a working molecule.
  • polypeptide is used interchangeably with “peptide” or “protein”.
  • the polypeptides according to the invention may also be chemically synthesized or isolated from natural sources.
  • isolated polypeptide or protein is intended to be a polypeptide or protein that has been removed from its natural environment.
  • recombinant polypeptides and proteins expressed and produced in host cells can be isolated in the same manner as natural or recombinant polypeptides and proteins that have been substantially purified by any suitable technique. It is thought that.
  • each constituent polypeptide includes natural purified products, products of chemical synthesis procedures, and prokaryotic or eukaryotic hosts (eg, bacterial cells, yeast cells, higher plant cells, insects). Cells, and products produced by recombinant techniques from mammalian cells).
  • prokaryotic or eukaryotic hosts eg, bacterial cells, yeast cells, higher plant cells, insects. Cells, and products produced by recombinant techniques from mammalian cells).
  • the fusion protein and the polypeptide of each component according to the present invention may contain an additional peptide.
  • the additional peptide include epitope-tagged peptides such as His tag, HA tag, Myc tag, and Flag tag.
  • the fusion protein according to the present invention can be modified into a preferred form and expressed recombinantly.
  • the fusion protein according to the present invention has stability in host cells, purification, operations following purification, storage, etc. by adding a specific amino acid, particularly a charged amino acid region, to the N-terminus or C-terminus. Sustainability etc. can be improved.
  • the fusion protein according to the present invention is preferably a fusion protein consisting of the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1 to 4 or a variant thereof.
  • this variant is preferably a fusion protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 4. .
  • variant refers to a polypeptide in which at least one or more of the original amino acids are point mutations, insertions, inversions, repeats, deletions, type substitutions. Or a protein is contemplated.
  • Such variants include deletions, insertions, inversions, repeats, type substitutions (eg, replacement of a hydrophilic residue with another residue, but usually a strong hydrophilic residue with a strong hydrophobic residue. And a mutant containing a point mutation or the like.
  • the amino acid substitution includes, for example, a case where a neutral amino acid in a polypeptide is substituted with another neutral amino acid.
  • Those skilled in the art can easily mutate one or several amino acids in the amino acid sequence of a polypeptide using well-known techniques. For example, according to a known point mutation introduction method, an arbitrary base of a polynucleotide encoding a polypeptide can be mutated. In addition, a deletion mutant or an addition mutant can be prepared by designing a primer corresponding to an arbitrary site of a polynucleotide encoding a polypeptide. Furthermore, if the method described in this specification is used, it can be easily determined whether the produced mutant has a desired activity.
  • “One or several amino acids have been deleted, substituted or added” means that the number can be deleted, substituted or added by a known mutant protein production method such as site-directed mutagenesis (preferably 10 Or less, more preferably 7 or less, most preferably 5 or less) amino acids are deleted, substituted or added.
  • a mutant protein is not limited to a protein having a mutation artificially introduced by a known mutant protein production method, but is a product obtained by isolating and purifying a naturally occurring mutant protein. There may be.
  • the fusion protein according to the present invention may be a polypeptide in which amino acids are peptide-bonded, but is not limited thereto, and may be a complex polypeptide containing a structure other than a polypeptide.
  • structures other than the polypeptide include sugar chains and isoprenoid groups, but are not particularly limited.
  • the fusion protein according to the present invention is a state in which a polynucleotide according to the present invention (that is, a gene encoding the fusion protein of the present invention) described later is introduced into a host cell and the fusion protein is expressed in the cell. It may be a case where it is isolated and purified from a cell, tissue or the like.
  • the variant of the fusion protein according to the present invention has a nucleotide sequence in which one or several nucleotide sequences of the nucleotide sequence represented by any of SEQ ID NOs: 6 to 9 are deleted, substituted or added Preferably, it is encoded by a polynucleotide consisting of
  • the variant of the fusion protein according to the present invention hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence shown in any of SEQ ID NOs: 6 to 9. Preferably encoded by the polynucleotide.
  • Hybridization is described in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed. , Cold Spring It can be performed by known methods such as the method described in Harbor Laboratory (1989). Usually, the higher the temperature and the lower the salt concentration, the higher the stringency (harder to hybridize), and a more homologous polynucleotide can be obtained.
  • the appropriate hybridization temperature varies depending on the base sequence and the length of the base sequence. For example, when a DNA fragment consisting of 18 bases encoding 6 amino acids is used as a probe, a temperature of 50 ° C. or lower is preferable.
  • stringent conditions refers to hybridization solutions (50% formamide, 5 ⁇ SSC (150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7). 6) Incubate overnight at 42 ° C. in 5 ⁇ Denhart solution, 10% dextran sulfate, and 20 ⁇ g / ml denatured sheared salmon sperm DNA, then in 0.1 ⁇ SSC at about 65 ° C. It is intended to wash the filter with.
  • the variant of the fusion protein according to the present invention is at least 66% identical, more preferably at least 80% identical, more preferably at least at least the nucleotide sequence shown in any of SEQ ID NOs: 6-9. It is preferably encoded by a polynucleotide comprising a base sequence that is 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical.
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding the fusion protein according to the present invention.
  • the polynucleotide according to the present invention encodes any of the fusion proteins described above.
  • nucleic acid sequence As used herein, the term “polynucleotide” is used interchangeably with “gene”, “nucleic acid” or “nucleic acid molecule” and is intended to be a polymer of nucleotides.
  • base sequence is used interchangeably with “nucleic acid sequence” or “nucleotide sequence” and refers to deoxyribonucleotides (abbreviated A, G, C, and T) or ribonucleic acid. Shown as a sequence of nucleotides (C, A, G and U).
  • polynucleotide comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 or a fragment thereof means a polynucleotide containing the sequence shown by each deoxynucleotide A, G, C and / or T of SEQ ID NO: 6 or a fragment thereof Is intended.
  • the polynucleotide according to the present invention may exist in the form of RNA (for example, mRNA) or in the form of DNA (for example, cDNA or genomic DNA).
  • DNA can be double-stranded or single-stranded.
  • Single stranded DNA or RNA can be the coding strand (also known as the sense strand) or it can be the non-coding strand (also known as the antisense strand).
  • the polynucleotide according to the present invention is preferably a polynucleotide comprising the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 6 to 9 or a variant thereof.
  • the variant of the polynucleotide according to the present invention is preferably any of the following polynucleotides: A polynucleotide comprising a base sequence from which one or several base sequences of SEQ ID NOs: 6 to 9 have been deleted, substituted or added; A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 6 to 9; At least 66% identical, more preferably at least 80% identical, even more preferably at least 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98 to the base sequence shown in any of SEQ ID NOs: 6-9 A polynucleotide comprising a base sequence that is% or 99% identical.
  • the polynucleotide according to the present invention may include a sequence such as an untranslated region (UTR) sequence or a vector sequence (including an expression vector sequence).
  • a sequence such as an untranslated region (UTR) sequence or a vector sequence (including an expression vector sequence).
  • the polynucleotide according to the present invention is subcloned into an expression vector or the like to prepare a vector (plasmid) for expressing the fusion protein, and this is encoded into the polynucleotide by introducing it into the cell.
  • the fusion protein can be expressed intracellularly.
  • polynucleotide according to the present invention may be one in which a promoter sequence for expressing the fusion protein in the cell is incorporated upstream of the region encoding the fusion protein.
  • polynucleotide according to the present invention may be a polynucleotide to which a tag sequence such as a His tag, HA tag, Myc tag, Flag tag or the like is added.
  • the polynucleotide according to the present invention can be produced, for example, by linearly linking polynucleotides encoding the polypeptide of each constituent element.
  • the present invention provides a vector used to produce the fusion protein according to the present invention.
  • the vector according to the present invention may be a vector for recombinant expression in a host cell or a vector used for production of a fusion protein in vitro.
  • the vector according to the present invention is not particularly limited as long as it contains the polynucleotide according to the present invention.
  • a vector into which cDNA (a form of polynucleotide) encoding the polypeptide according to the present invention is inserted may be mentioned.
  • a method for producing a vector a method using a plasmid, phage, cosmid or the like can be mentioned, but it is not particularly limited.
  • the specific type of the vector is not particularly limited, and a vector capable of introducing the target polynucleotide into the host cell, a vector capable of expressing the fusion protein encoded by the polynucleotide in the host cell, and the like are appropriately selected. It is preferable to select.
  • vectors that can be used include plasmids derived from E. coli, plasmids that allow protein expression in animal cells, and animal viruses.
  • a suitable promoter sequence is incorporated into the vector together with the polynucleotide according to the present invention.
  • the promoter sequence is preferably selected as appropriate in order to express the polynucleotide according to the present invention, depending on the type of host cell.
  • the promoter usable in the present invention may be any promoter as long as it is suitable for the host used for gene expression.
  • the host is Escherichia coli, trp promoter, lac promoter, recA promoter, ⁇ PL promoter, lpp promoter, etc.
  • the host is an animal cell, SR ⁇ promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter And HSV-TK promoter.
  • an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin and the like known in the art can be added to the vector according to the present invention as desired.
  • the fusion protein encoded by the polynucleotide of the present invention can be linked to other proteins to be expressed. Such linked proteins can be separated into the respective proteins by cleavage using an appropriate protease.
  • the vector according to the present invention preferably contains at least one selection marker.
  • a selectable marker a known drug resistance gene or the like can be used. By using a selectable marker, it can be confirmed whether or not the polynucleotide according to the present invention has been introduced into the host cell, and whether or not it is reliably expressed in the host cell.
  • the fusion protein according to the present invention can be expressed in the organism or cell by introduction into the organism or cell.
  • the present invention provides a transformant comprising the polynucleotide according to the present invention.
  • the “transformant” is a concept including not only cells, tissues, organs and the like but also individual organisms.
  • the transformant can be produced, for example, by transforming a host cell with the vector according to the present invention.
  • cell or “host cell” means not only cells in a living organism (prokaryotic cells, yeast cells, insect cells, plant cells, mammalian cells including humans, etc.) but also their original functions. Cultured cells (prokaryotic cells and eukaryotic cells) in a state in which “cell” or “host cell” is a primary cell, passage cell, cell line, transformed cell, isolated embryonic stem (ES) cell, tissue stem cell, or artificial manipulation such as genetic manipulation. Cells that have been given pluripotency (including, for example, artificial pluripotent (iPS) cells, including but not limited to cells that have been differentiated from the cells), cells that have been transplanted or infected in living organisms, etc. . The concept also includes tissues, organs, living organisms themselves, and the like.
  • pluripotency including, for example, artificial pluripotent (iPS) cells, including but not limited to cells that have been differentiated from the cells
  • iPS artificial pluripotent
  • the method for introducing a vector into a host cell ie, a transformation method is not particularly limited, and a conventionally known method such as an electroporation method, a calcium phosphate method, a liposome method, or a DEAE dextran method can be suitably used.
  • the transformant according to the present invention is preferably a transformant capable of expressing the fusion protein according to the present invention.
  • this transformant eukaryotic cultured cells are preferably used, and human-derived cultured cells are more preferably used.
  • the activity of the fusion protein expressed in the transformant can be maintained, and the dynamics of the endoplasmic reticulum calcium ATPase in living cells can be observed.
  • the fusion protein according to the present invention can be produced by expressing it in the transformant according to the present invention.
  • the fusion protein expressed in the transformant may be produced by further purification.
  • the method of purifying the fusion protein expressed in the transformant varies depending on the host cell used and the properties of the fusion protein, but the target fusion protein can be purified relatively easily by using a tag or the like.
  • the fusion protein can be purified from this cell extract by a well-known method.
  • the fusion protein according to the present invention may be produced by linking each component polypeptide after obtaining the polypeptide of each component by a chemical synthesis method using a well-known chemical synthesis technique. Further, the fusion protein may be produced in vitro using the above-described vector, for example, in a well-known cell-free protein synthesis system.
  • the present invention provides a method for observing the behavior of endoplasmic reticulum calcium ATPase.
  • This behavior observation method includes a step of detecting the fluorescence intensity from the fluorescence donor and the fluorescence intensity from the fluorescence acceptor using the fusion protein according to the present invention.
  • the fusion protein it is preferable to use a fusion protein expressed in the transformant according to the present invention.
  • the ratio of the fluorescence intensity from the fluorescence donor of the fusion protein to the fluorescence intensity from the fluorescence acceptor can be calculated, that is, the FRET efficiency can be detected.
  • the FRET efficiency of each structure that can be taken by the fusion protein is examined in advance, and by detecting the FRET efficiency under a predetermined condition, it is detected which structure the fusion protein has taken under this certain condition. be able to.
  • the behavior of SERCA in a state where the activity is maintained can be observed. Therefore, screening for molecular targeted drugs for treating diseases related to SERCA, diagnosis of these diseases, and the like can be performed.
  • the present invention provides a screening method for a compound that targets endoplasmic reticulum calcium ATPase as a target molecule.
  • This screening method uses the fusion protein according to the present invention to compare the ratio between the fluorescence intensity from the fluorescence donor and the fluorescence intensity from the fluorescence acceptor when the test compound is treated and not treated including.
  • the fusion protein it is preferable to use a fusion protein expressed in the transformant according to the present invention.
  • test compound When the ratio of FRET efficiency is compared between the case where the test compound is treated and the case where the test compound is not treated, and these are different values, it is highly possible that this test compound has changed the structure of the fusion protein.
  • Such a test compound is likely to be a compound that affects the structure of the endoplasmic reticulum calcium ATPase and further affects the activity. Therefore, in such a case, it can be judged that this test compound is a compound that can affect the structure and activity of endoplasmic reticulum calcium ATPase.
  • this test compound when the ratio in the case where the test compound is treated and the ratio in the case where the test compound is not treated are different, this test compound is used as a candidate compound for a compound having endoplasmic reticulum calcium ATPase as a target molecule. You may further include the process of selecting.
  • endoplasmic reticulum calcium ATPase is one of the genes responsible for hereditary heart disease, and its activity is known to be related to diseases such as heart failure, diabetes, cancer and Alzheimer's disease. ing. Therefore, a compound targeting endoplasmic reticulum calcium ATPase as a target molecule can be a candidate for a drug useful for the treatment or prevention of diseases, symptoms and the like associated with endoplasmic reticulum calcium ATPase.
  • the present invention also provides a kit comprising the polynucleotide according to the present invention.
  • the polynucleotide may be contained as a vector containing the polynucleotide, or may be contained as a transformant containing the polynucleotide.
  • This kit is a kit for using the fusion protein according to the present invention.
  • it may be a kit for observing the behavior of endoplasmic reticulum calcium ATPase, or a kit for screening a compound having endoplasmic reticulum calcium ATPase as a target molecule.
  • the kit according to the present invention can be suitably used for the behavior observation method and the screening method described above.
  • kit according to the present invention may be a kit for detecting a change in intracellular calcium concentration.
  • the kit according to the present invention further includes a plasmid for producing a vector by inserting this polynucleotide, a host cell for transforming the vector, etc. in addition to the polynucleotide according to the present invention. Also good.
  • the kit according to the present invention may contain the polynucleotide according to the present invention as a vector, and may further contain a host cell or the like for transforming the vector.
  • the kit according to the present invention includes the polynucleotide according to the present invention as a transformant, and may further include a reagent used in the behavior observation method or screening method, a control compound, and the like.
  • the kit may include instructions for using the kit.
  • the present invention also provides a method for designing a fusion protein comprising an endoplasmic reticulum calcium ATPase, a fluorescent donor for FRET, and a fluorescent acceptor for FRET.
  • This design method is designed so that one of the fluorescent donor and the fluorescent acceptor is linked to the N-terminal side of the endoplasmic reticulum calcium ATPase. Further, the other is between the one linked to the N-terminal side of the endoplasmic reticulum calcium ATPase and the endoplasmic reticulum calcium ATPase, or the first to sixth amino acids of SERCA2a in the endoplasmic reticulum calcium ATPase, 369 to 380. It is designed to be inserted into the amino acid sequence corresponding to the 1st amino acid or the 572nd to 583rd amino acid.
  • Examples of the endoplasmic reticulum calcium ATPase, the fluorescent donor, and the fluorescent acceptor are the same as those described above.
  • the other of the fluorescent donor and the fluorescent acceptor is the one between the fluorescent donor and the fluorescent acceptor and the endoplasmic reticulum calcium ATPase, or the first to fifth of SERCA2a in the endoplasmic reticulum calcium ATPase. It is preferably designed to be inserted into the amino acid sequence corresponding to amino acids 370 to 379, or amino acids 573 to 582.
  • the other of the fluorescent donor and the fluorescent acceptor is connected between one of the fluorescent donor and the fluorescent acceptor and the endoplasmic reticulum calcium ATPase, or the 1st to 4th SERCA2a in the endoplasmic reticulum calcium ATPase.
  • the amino acid sequence is designed to be inserted into the amino acid sequence corresponding to amino acids 371 to 378 or amino acids 574 to 581.
  • the other of the fluorescent donor and the fluorescent acceptor is connected between one of the fluorescent donor and the fluorescent acceptor and the endoplasmic reticulum calcium ATPase, or the first to third of SERCA2a in the endoplasmic reticulum calcium ATPase.
  • the amino acid sequence is designed so that it is inserted into the amino acid sequence corresponding to the amino acids 372 to 377, or 575 to 580.
  • the other of the fluorescent donor and the fluorescent acceptor is substituted with one of the fluorescent donor and the fluorescent acceptor and the endoplasmic reticulum calcium ATPase, or the first amino acid of SERCA2a in the endoplasmic reticulum calcium ATPase. It is even more preferable that the amino acid sequence is designed to be inserted into the amino acid sequence corresponding to the 373-376th amino acid, or the 576-579th amino acid, between the first and second amino acids.
  • the other of the fluorescent donor and the fluorescent acceptor is substituted with one of the fluorescent donor and the fluorescent acceptor and the endoplasmic reticulum calcium ATPase, or the 374th amino acid of SERCA2a in the endoplasmic reticulum calcium ATPase. Most preferably, it is designed to be inserted at a position corresponding to between amino acid No. 375 and amino acid No. 375, or between amino acid Nos. 577 and 578.
  • TdCV-s SEQ ID NO: 1: ECFP (fluorescent donor) is linked to the N-terminus of SERCA2a (endoplasmic reticulum calcium ATPase), and Venus (fluorescent acceptor) is connected to the C-terminus of ECFP and the N-terminus of SERCA2a FRET probe inserted between (a) in FIG.
  • V-G374 (SEQ ID NO: 2): FRET probe in which ECFP is linked to the N-terminus of SERCA2a and Venus is inserted between the 374th and 375th amino acids of SERCA2a (( b)).
  • V-L577 (SEQ ID NO: 3): FRET probe in which ECFP is linked to the N-terminus of SERCA2a, and Venus is inserted between the 577th amino acid and 578th amino acid of SERCA2a (( c)).
  • F-L577 FRET probe in which ECFP is linked to the N-terminus of SERCA2a and TC-tag is inserted between the 577th and 578th amino acids of SERCA2a (in FIG. 1) (D)).
  • V-G519 SEQ ID NO: 5: a FRET probe (not shown) in which ECFP is linked to the N-terminus of SERCA2a and Venus is inserted between the 519th and 520th amino acids of SERCA2a.
  • TdCV-s In order to prepare an expression vector for producing TdCV-s, a DNA fragment encoding ECFP, a DNA fragment encoding Venus, and a DNA fragment encoding SERCA2a were each amplified by PCR.
  • the DNA fragment encoding ECFP was amplified using pECFP1 (Invitrogen) as a template.
  • a DNA fragment encoding Venus was amplified using pRSETb-Venus (reference: Nagai et al., Nature Biotechnology, 2002; 20: 87-90) as a template.
  • a DNA fragment encoding SERCA2a was amplified using pTN3-GFP-SERCA2a (Uchida et al., J. Biol. Chem., 2003; 278 (19): 16551-60) as a template.
  • V-G374, V-L577, F-L577, and V-G519) Similarly to TdCV-s described above, V-G374, V-L577, FL-L577, and V-G519 were ligated after the DNA was amplified by PCR for each component, and V-G374, V- DNA fragments containing genes (SEQ ID NOs: 7 to 10) encoding L577, F-L577, and V-G519 were obtained. These DNA fragments were cloned into pFastBac1 to obtain an expression vector.
  • V-G374 will be described as an example.
  • DNA encoding ECFP DNA encoding amino acid sequence 1 to 374 of SERCA2a
  • DNA encoding Venus DNA encoding Venus
  • amino acids 375 to C-terminal of SERCA2a
  • Each of the DNA encoding sequences was amplified by PCR. These amplified fragments were ligated in this order from the 5 'side and cloned into pcDNA3.1 / Zeo (+).
  • the linker (Gly-Ser-Leu) was designed to be inserted between ECFP and the N-terminus of SERCA2a. This ligated DNA fragment was cloned into pFastBac1 to obtain an expression vector.
  • V-G519, V-L577, and F-L577 expression vectors were obtained by the same method as V-G374.
  • a DNA fragment (SEQ ID NO: 14) encoding TC-tag (SEQ ID NO: 13) was divided into two oligo DNAs, BamHI-CCPGCC-FW (SEQ ID NO: 15) and EcoRI.
  • BamHI-CCPGCC-FW SEQ ID NO: 15
  • EcoRI EcoRI
  • Each expression vector was transfected into COS7 cells (RIKEN Cell Bank, Tsukuba, Japan) to obtain transformants. Using these transformants, SERCA-specific inhibitor thapsigargin (Tg) was used to examine the change in FRET efficiency of each FRET probe when SERCA activity was inhibited.
  • Tg SERCA-specific inhibitor thapsigargin
  • FlAsH was added by treatment with FlAsH-EDT 2 reagent (Invitrogen) at room temperature for 60 to 90 minutes.
  • Transformants transformed with the respective expression vectors are made in an internal solution (19 mM NaCl, 125 mM KCl, 10 mM Hepes-KOH pH 7.4) that permeabilizes the cell membrane and contains Tg and mimics the intracellular fluid. Refluxed. Thereafter, the fluorescence intensity was measured under an IX71 inverter fluorescence microscope (Olympus), and the amount of change (dR / Rbase) in the fluorescence intensity ratio between the fluorescence donor and the fluorescence acceptor was calculated.
  • results are shown in (a) to (e) of FIG. (A) to (e) in FIG. 2 are graphs showing changes in FRET efficiency when Tg is added to a transformant expressing a FRET probe.
  • V-G374, V-L577, and F-L577 varies depending on the presence or absence of Tg. That is, it was suggested that V-G374, V-L577, and F-L577 change the FRET efficiency due to a structural change accompanying a change in SERCA activity caused by at least addition of Tg.
  • Agonist treatment was performed on each transformant to increase the intracellular calcium concentration. Then, the fluorescence intensity was measured under an IX71 inverter fluorescence microscope (Olympus), and dR / Rbase was calculated. In addition, Indo-5F (Dojindo) was used to see the change in intracellular Ca 2+ concentration at this time, and the dF / Fbase of this Indo-5F was calculated.
  • results are shown in (a) to (d) of FIG. (A) to (d) in FIG. 3 are graphs showing changes in FRET efficiency when the intracellular calcium concentration expressing the FRET probe is changed.
  • a indicates dR / Rbase of the FRET probe
  • b indicates dF / Fbase of Indo-5F.
  • FIG. 3A shows the results for TdCV-s
  • FIG. 3B shows the results for VL577
  • FIG. 3C shows the results for FL-577.
  • D in FIG. 3 is the result for V-G519. In each case, the agonist treatment was performed for 2 to 8 minutes.
  • TdCV-s, VL577, and F-L577 changes with an increase in intracellular calcium concentration. That is, it was suggested that TdCV-s, V-L577, and F-L577 change FRET efficiency due to a structural change accompanying a change in SERCA activity caused by a change in intracellular calcium ion concentration.
  • TdCV-s, V-G374, V-L577, and F-L577 can be used to provide a FRET probe for detecting the structural change of SERCA. Moreover, since these probes changed FRET efficiency by the change of intracellular calcium ion concentration, it was shown that they can be used to provide a FRET probe for detecting the change of intracellular calcium ion concentration.
  • an internal solution (19 mM NaCl, 125 mM KCl, 10 mM Hepes-KOH pH 7. Refluxed in 4).
  • an internal solution containing 100 ⁇ M CaCl 2 was used.
  • an internal solution containing 1 mM ADP, 0.33 mM AlCl 3 , 5 mM NaF, 1 mM MgCl 2 , and 100 ⁇ M CaCl 2 was used.
  • the dR / Rbase measured in each transformant was ⁇ 1, ⁇ 8, 6, ⁇ 2% for TdCV-s in the order of fixation to E1-2Ca 2+ , E1-ATP, E2P, E2, respectively.
  • (A) in FIG. 4) -6, 12, 15, 21% for VL577 ((b) in FIG. 4), 7, 12, 6, -2% for VL577 (in FIG. 4) (C)).
  • each FRET probe has a different FRET efficiency in each structure, suggesting that the FRET efficiency changes greatly reflecting different structural changes.
  • (a) to (c) in FIG. 4 indicate that the FRET efficiency of TdCV-s can change greatly when the structure changes from E1-2Ca 2+ to E1-ATP. It was also shown that the FRET efficiency of V-L577 can change greatly when the structure changes from E2 to E1-2Ca 2+ . It was also shown that the FRET efficiency of F-L577 can change greatly when the structure changes from E2P to E2. Therefore, these probes are useful for detecting different structural changes, and can be used to provide FRET probes for detecting structural changes that can greatly change the FRET efficiency.
  • the present invention can be used to provide a FRET probe that can detect different structural changes, it is useful for screening compounds that target various structures. It is also useful for detailed studies of SERCA structural changes.
  • FIG. 6 shows the first derivative of FRET efficiency of F-L577 shown in (a) to (b) of FIG. 5 and the first derivative of Ca 2+ accumulation in ER. Is a graph in which and are superimposed. That is, it is a graph in which the first derivative of ⁇ R / Rbase (d ( ⁇ R / Rbase) / dt: solid line) and the first derivative of ⁇ F / Fbase (d ( ⁇ F / Fbase) / dt: broken line) are superimposed. . (B) in FIG. 6 is an enlarged graph of (a) in FIG.
  • FIG. 7 is a graph showing the relationship between the ATP concentration and the change in FRET efficiency of F-L577
  • (b) in FIG. 7 shows the ATP concentration and the accumulation of Ca 2+ in the ER. It is a graph which shows the relationship.
  • the change in FRET efficiency of F-L577 is ATP concentration-dependent ((a) in FIG. 7), indicating that the dependence is similar to that in Ca 2+ accumulation.
  • FIG. 8 is a graph showing the correlation between the FRET efficiency of F-L577 and the accumulation of Ca 2+ in the ER (the amount of change in Mag-Indo-1 fluorescence in the ER).
  • F-L577 is a FRET probe useful for visualizing the Ca 2+ uptake activity of the endoplasmic reticulum calcium ATPase, and was shown to be usable for screening compounds targeting the Ca 2+ uptake activity.
  • the present invention can be used as an indicator of ER calcium ATPase kinetics because the kinetics of SERCA can be observed while maintaining activity. Therefore, the present invention is very useful for research on the kinetics of SERCA, treatment of diseases related to SERCA, screening of molecular targeted drugs for improvement or prevention, diagnosis of these diseases, and the like.

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Abstract

本発明の融合タンパク質は、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼと、ＦＲＥＴの蛍光供与体と、蛍光受容体とを備え、蛍光供与体と蛍光受容体とのうち一方は、当該ＡＴＰアーゼのＮ末端側に連結され、他方は、当該一方と当該ＡＴＰアーゼとの間、又は、当該ＡＴＰアーゼにおけるＳＥＲＣＡ２ａの１～６番目のアミノ酸、３６９～３８０番目のアミノ酸、もしくは５７２～５８３番目のアミノ酸に対応するアミノ酸配列内、に挿入されている。

Description

小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ動態指示薬及びその利用
　本発明は、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼの動態を検出するプローブとするための融合タンパク質及びその利用に関する。
　小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ）は、小胞体膜上に存在する細胞内カルシウムポンプである。ＳＥＲＣＡは、細胞内のカルシウムイオンの恒常性維持に極めて重要な働きを担っており、ＳＥＲＣＡ活性が妨げられると、心不全、糖尿病、癌及びアルツハイマー病などの病気が引き起こされる。ＳＥＲＣＡは、遺伝性の心臓病の原因遺伝子の一つでもある。
　非特許文献１には、ＳＥＲＣＡの蛍光プローブが記載されている。この蛍光プローブは、ＦＲＥＴ（fluorescence resonance energy transfer）を利用するプローブである。この蛍光プローブには、ＳＥＲＣＡのＮ末にＦＲＥＴのドナーとしてＣＦＰ（Cyan fluorescent protein）が融合されており、また、５１５番目のリジン残基がＦＲＥＴのアクセプタとしてのＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）で標識されている。
D.L. Winters, J.M. Autry, B. Svensson, D.D. Thomas, Biochemistry 2008, 47, 4246-4256.
　しかしながら、非特許文献１の蛍光プローブは、ＦＩＴＣ標識されたものであるため、ＳＥＲＣＡの活性が失われている。したがって、従来の蛍光プローブでは、活性を保持した状態でのＳＥＲＣＡの動態を観察することができないという問題がある。
　本発明は、上記の従来技術が有する問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、活性を保持した状態でのＳＥＲＣＡの動態を観察することができるＦＲＥＴプローブに利用可能な融合タンパク質を提供することにある。
　上記の課題を解決するために、本発明に係る融合タンパク質は、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼと、ＦＲＥＴの蛍光供与体と、ＦＲＥＴの蛍光受容体とを備え、上記蛍光供与体と上記蛍光受容体とのうち、一方は、上記小胞体カルシウムＡＴＰアーゼのＮ末端側に連結されており、他方は、上記一方と上記小胞体カルシウムＡＴＰアーゼとの間、又は、上記小胞体カルシウムＡＴＰアーゼにおけるＳＥＲＣＡ２ａの１～６番目のアミノ酸、３６９～３８０番目のアミノ酸、もしくは５７２～５８３番目のアミノ酸に対応するアミノ酸配列内、に挿入されていることを特徴とする。
　また、本発明に係る融合タンパク質では、特に、以下に示すより具体的な例に限定されないが、上記蛍光供与体及び上記蛍光受容体の少なくとも１つは、ドナーもしくはアクセプタとしての蛍光タンパク質、又はドナーもしくはアクセプタとしての蛍光物質であって特定のペプチド配列に特異的に結合しているものを利用することが好ましい。
　また、本発明に係る融合タンパク質では、特に、以下に示すより具体的な例に限定されないが、上記蛍光供与体が青色蛍光タンパク質であり、上記蛍光受容体が黄色蛍光タンパク質又はテトラシステインタグに特異的に結合するＦｌＡｓＨもしくはその類縁体であることが好ましい。
　また、本発明に係る融合タンパク質では、特に、以下に示すより具体的な例に限定されないが、上記他方は、上記一方と上記小胞体カルシウムＡＴＰアーゼのＮ末端との間、又は、上記小胞体カルシウムＡＴＰアーゼにおけるＳＥＲＣＡ２ａの３７４番目のアミノ酸と３７５番目のアミノ酸との間、もしくは５７７番目のアミノ酸と５７８番目のアミノ酸との間に対応する位置に挿入されていることが好ましい。
　本発明に係る融合タンパク質は、特に、以下に示すより具体的な例に限定されないが、配列番号１～４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる融合タンパク質；あるいは
　配列番号１～４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなる、融合タンパク質である。
　本発明はまた、上述したいずれかの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
　本発明はまた、特に、以下に示すより具体的な例に限定されないが、配列番号６～９のいずれかに示される塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；
　配列番号６～９のいずれかに示される塩基配列の１個又は数個の塩基配列が欠失、置換又は付加された塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；
　配列番号６～９のいずれかに示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；あるいは
　配列番号６～９のいずれかに示される塩基配列と少なくとも６６％同一な塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；を提供する。
　本発明はまた、本発明に係るポリヌクレオチドを含んでいるベクターを提供する。本発明はさらに、本発明に係るポリヌクレオチド又は本発明に係るベクターを含んでいる形質転換体を提供する。
　本発明はまた、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼの挙動観察方法であって、本発明に係る融合タンパク質を用いて、蛍光供与体からの蛍光強度と蛍光受容体からの蛍光強度とを検出することを特徴とする方法を提供する。
　本発明はまた、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼを標的分子とする化合物のスクリーニング方法であって、本発明に係る融合タンパク質を用いて、試験化合物を処理した場合と処理しない場合とにおける、蛍光供与体からの蛍光強度と蛍光受容体からの蛍光強度との比を比較する工程を含むことを特徴とする方法を提供する。
　本発明はまた、本発明に係るポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼの挙動を観察するためのキットを提供する。
　本発明はまた、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼと、ＦＲＥＴの蛍光供与体と、ＦＲＥＴの蛍光受容体とを備えた融合タンパク質の設計方法であって、上記蛍光供与体と上記蛍光受容体とのうち、一方が、上記小胞体カルシウムＡＴＰアーゼのＮ末端側に連結され、他方が、上記一方と上記小胞体カルシウムＡＴＰアーゼとの間、又は、上記小胞体カルシウムＡＴＰアーゼにおけるＳＥＲＣＡ２ａの１～１０番目のアミノ酸、３６４～３８４番目のアミノ酸、もしくは５６７～５８７番目のアミノ酸に対応するアミノ酸配列内、に挿入されるように設計することを特徴とする方法を提供する。
　本発明によれば、活性を保持した状態でのＳＥＲＣＡの動態を観察することができるＦＲＥＴプローブに利用可能な融合タンパク質を提供することができる。
図１中の（ａ）～（ｄ）は、本発明に係る融合タンパク質のいくつかの実施例を示す図である。 図２中の（ａ）～（ｅ）は、ＦＲＥＴプローブを発現する形質転換体にＴｇを添加したときの、ＦＲＥＴ効率の変化を示すグラフである。 図３中の（ａ）～（ｄ）は、ＦＲＥＴプローブを発現する細胞内のカルシウム濃度を変化させたときの、ＦＲＥＴ効率の変化を示すグラフである。 図４中の（ａ）～（ｃ）は、ＦＲＥＴプローブを各構造に固定したときのＦＲＥＴ効率を示すグラフである。 図５中の（ａ）～（ｂ）は、Ｆ－Ｌ５７７のＦＲＥＴ効率の変化と、ＥＲにおけるＣａ２＋の蓄積との関係を示すグラフである。 図６中の（ａ）～（ｂ）は、図５（ａ）～（ｂ）に示したＦ－Ｌ５７７のＦＲＥＴ効率の一次導関数と、ＥＲにおける、Ｃａ２＋の蓄積の一次導関数とを重ね合わせたグラフである。 図７中の（ａ）は、ＡＴＰ濃度と、Ｆ－Ｌ５７７のＦＲＥＴ効率の変化との関係を示すグラフであり、図７中の（ｂ）は、ＡＴＰ濃度と、ＥＲにおけるＣａ２＋の蓄積との関係を示すグラフである。 Ｆ－Ｌ５７７のＦＲＥＴ効率と、ＥＲにおけるＣａ２＋の蓄積との相関関係を示す図である。
　〔融合タンパク質〕
　本発明に係る融合タンパク質は、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼと、ＦＲＥＴの蛍光供与体と、ＦＲＥＴの蛍光受容体とを備えている。蛍光供与体と蛍光受容体とのうち、一方は、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼのＮ末端側に連結されている。また、蛍光供与体と蛍光受容体とのうち、他方は、蛍光供与体と蛍光受容体とのうちの一方と小胞体カルシウムＡＴＰアーゼとの間、又は、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼにおけるＳＥＲＣＡ２ａ（配列番号１１；参考文献：P. Vangheluwe et al., Cell Calcium 38 (2005) 291-302）の１～６番目のアミノ酸、３６９～３８０番目のアミノ酸、もしくは５７２～５８３番目のアミノ酸に対応するアミノ酸配列内、に挿入されている。
　本明細書中、「小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ」または「ＳＥＲＣＡ」は、ＳＥＲＣＡ（Sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase）ファミリーに属するタンパク質をさす。ＳＥＲＣＡファミリーに属するタンパク質としては、例えばＳＥＲＣＡ　１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａ、３ｂ、３ｃ等が知られているが、本発明における小胞体カルシウムＡＴＰアーゼは、これらのタンパク質のいずれかと相同性を有するタンパク質であればよい。小胞体カルシウムＡＴＰアーゼは、ＳＥＲＣＡファミリーに属する公知のタンパク質と、少なくとも７０％以上の相同性を有するタンパク質であることが好ましく、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有する。
　本発明における蛍光供与体とは、本発明における蛍光受容体に対してＦＲＥＴのドナーとして働く分子又はその前駆体であればよい。すなわち、蛍光供与体は、蛍光受容体の励起スペクトルと重なりがある励起スペクトルを有する分子又はその前駆体であることが好ましい。例えば蛍光供与体としては、ドナーとしての蛍光タンパク質、又はドナーとしての蛍光物質であって特定のペプチド配列に特異的に結合しているものを利用するものであることが好ましい。
　ここで、本明細書中「ドナー」とは、一般的にＦＲＥＴ技術において励起エネルギーを発する分子として利用しうる分子をさす。
　本発明における蛍光供与体として用いることができる、ドナーとしての蛍光タンパク質としては、例えば青色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質等を用いることができ、具体的にはＣＦＰ、ＥＣＦＰ、ＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ等が挙げられる。
　ドナーとしての蛍光物質が特異的に結合する特定のペプチド配列としては、例えばテトラシステインタグ（ＴＣ－ｔａｇ）、HaloTag（登録商標）（標識試薬：多数あり；Promega）、SNAP-tag、CLIP-tag、ACP-tag及びMCP-tag（以上、標識：多数あり；New Englnad Biolabs）、Fluorogen activating proteins (FAPs)（Nat. Biotechnol. 2008; 26(2):235-240）などを含むが、これらに限定されない。例えば、ＴＣ－ｔａｇは、ＭＷ６６４．５の蛍光物質であるＦｌＡｓＨ又はその類縁体が特異的に結合するペプチド配列である。
　本発明における蛍光受容体とは、本発明における蛍光供与体に対してＦＲＥＴのアクセプタとして働く分子又はその前駆体であればよい。すなわち、蛍光受容体は、蛍光供与体の励起スペクトルと重なりがある励起スペクトルを有する分子又はその前駆体であることが好ましい。例えば蛍光受容体としては、アクセプタとしての蛍光タンパク質、又はアクセプタとしての特定のペプチド配列に特異的に結合する蛍光物質を利用するものであることが好ましい。
　本明細書中「アクセプタ」とは、一般的にＦＲＥＴ技術においてドナーからの励起エネルギーを受けて蛍光を発する分子として利用しうる分子をさす。
　本発明における蛍光受容体として用いることができる、アクセプタとしての蛍光タンパク質としては、例えば青色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質等を用いることができ、具体的にはＣＦＰ、ＥＣＦＰ、ＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ等が挙げられる。
　アクセプタとしての蛍光物質が特異的に結合する特定のペプチド配列としては、例えばテトラシステインタグ（ＴＣ－ｔａｇ）、HaloTag（登録商標）（標識試薬：多数あり；Promega）、SNAP-tag、CLIP-tag、ACP-tag及びMCP-tag（以上、標識：多数あり；New Englnad Biolabs）、Fluorogen activating proteins (FAPs)（参考文献：Nat. Biotechnol. 2008; 26(2):235-240）などを含むが、これらに限定されない。
　蛍光供与体と蛍光受容体との組合せは、ＦＲＥＴの蛍光供与体及び蛍光受容体として互いに機能する組合せであればよい。例えば、青色蛍光タンパク質（例えばＥＣＦＰ）と黄色蛍光タンパク質（例えばＶｅｎｕｓ）との組合せ、青色蛍光タンパク質とテトラシステインタグに結合するＦｌＡｓＨ又はその類縁体との組合せなどが挙げられる。
　蛍光供与体及び蛍光受容体の一方は、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼのＮ末端側に連結される。この一方は、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼのＮ末端にリンカーを介して連結されてもよい。リンカーとしては、ペプチド等を用いることができ、１アミノ酸以上５アミノ酸以下のペプチドが好ましく、１アミノ酸以上３アミノ酸以下のペプチドがより好ましい。
　小胞体カルシウムＡＴＰアーゼにおけるＳＥＲＣＡ２ａの１～６番目のアミノ酸、３６９～３８０番目のアミノ酸、もしくは５７２～５８３番目のアミノ酸に対応するアミノ酸配列とは、本発明における小胞体カルシウムＡＴＰアーゼとＳＥＲＣＡ２ａとのアミノ酸配列上、又は立体構造上での相同性を鑑みて、ＳＥＲＣＡ２ａにおけるこれらのアミノ酸に対応するアミノ酸配列をさす。
　例えば、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼとしてＳＥＲＣＡ１ａ（配列番号１２；参考文献：C. Toyoshima et al., Nature 405 (2000) 647-655.）を用いた場合、ＳＥＲＣＡ１ａにおけるＳＥＲＣＡ２ａの１～６番目のアミノ酸に対応するアミノ酸配列は、ＳＥＲＣＡ１ａの１～６番目である。また、ＳＥＲＣＡ１ａにおけるＳＥＲＣＡ２ａの３６９～３８０番目のアミノ酸に対応するアミノ酸配列は、ＳＥＲＣＡ１ａの３６９～３８０番目である。また、ＳＥＲＣＡ１ａにおけるＳＥＲＣＡ２ａの５７２～５８３番目のアミノ酸に対応するアミノ酸配列は、ＳＥＲＣＡ１ａの５７３～５８４番目である。
　なお、蛍光供与体及び蛍光受容体のうちの他方は、蛍光供与体及び蛍光受容体のうちの一方と小胞体カルシウムＡＴＰアーゼとの間、又は、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼにおけるＳＥＲＣＡ２ａの１～５番目のアミノ酸、３７０～３７９番目のアミノ酸、もしくは５７３～５８２番目のアミノ酸に対応するアミノ酸配列内、に挿入されていることが好ましい。
　また、蛍光供与体及び蛍光受容体のうちの他方は、蛍光供与体及び蛍光受容体のうちの一方と小胞体カルシウムＡＴＰアーゼとの間、又は、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼにおけるＳＥＲＣＡ２ａの１～４番目のアミノ酸、３７１～３７８番目のアミノ酸、もしくは５７４～５８１番目のアミノ酸に対応するアミノ酸配列内、に挿入されていることがより好ましい。
　また、蛍光供与体及び蛍光受容体のうちの他方は、蛍光供与体及び蛍光受容体のうちの一方と小胞体カルシウムＡＴＰアーゼとの間、又は、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼにおけるＳＥＲＣＡ２ａの１～３番目のアミノ酸、３７２～３７７番目のアミノ酸、もしくは５７５～５８０番目のアミノ酸に対応するアミノ酸配列内、に挿入されていることがさらに好ましい。
　また、蛍光供与体及び蛍光受容体のうちの他方は、蛍光供与体及び蛍光受容体のうちの一方と小胞体カルシウムＡＴＰアーゼとの間、又は、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼにおけるＳＥＲＣＡ２ａの１番目のアミノ酸と２番目のアミノ酸との間、３７３～３７６番目のアミノ酸、もしくは５７６～５７９番目のアミノ酸に対応するアミノ酸配列内、に挿入されていることがよりさらに好ましい。
　また、蛍光供与体及び蛍光受容体のうちの他方は、蛍光供与体及び蛍光受容体のうちの一方と小胞体カルシウムＡＴＰアーゼとの間、又は、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼにおけるＳＥＲＣＡ２ａの３７４番目のアミノ酸と３７５番目のアミノ酸との間、もしくは５７７番目のアミノ酸と５７８番目のアミノ酸との間に対応する位置、に挿入されていることが最も好ましい。
　以上の構成により、本発明に係る融合タンパク質は、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼとしての活性を保持している。
　ここで、ＳＥＲＣＡは、活性変化に伴って構造変化する。ＳＥＲＣＡの主要な構造としては、Ｅ１－２Ｃａ２＋、Ｅ１－ＡＴＰ、Ｅ２Ｐ、及びＥ２がある（参考文献：C. Toyoshima, Annu. Rev. Biochem. 2004, 73:269-92；C. Toyoshima, Biochim. Biophys. Acta 1793 (2009) 941-946.；T.L. Sorensen et al., Science 304 (2004) 1672-1675.；C. Toyoshima, T. Mizutani, Nature 430 (2004) 529-535.；C. Toyoshima et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (2007) 19831-19836.）。Ｅ１－２Ｃａ２＋は、ＳＥＲＣＡ内に２分子のＣａ２＋を取り込んだ状態であり、これにさらにＡＴＰが結合すると、Ｅ１－ＡＴＰになる。そして、ＡＴＰが分解されるとともにＣａ２＋が放出されてＥ２Ｐとなり、リン酸基が外れてＥ２となる。このＥ２がＣａ２＋を取り込み、Ｅ１－２Ｃａ２＋となる。
　本発明に係る融合タンパク質は、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼの活性の変化に伴って構造変化し、この構造変化に伴って蛍光供与体と蛍光受容体との距離が変化する。したがって、本発明に係る融合タンパク質を利用したＦＲＥＴプローブは、とりうる各構造において、蛍光供与体と蛍光受容体との距離が異なるため、それぞれ異なるＦＲＥＴ効率を有する。したがって、ＦＲＥＴプローブがとりうる各構造において予めＦＲＥＴ効率を調べておき、ある条件下でのＦＲＥＴ効率を検出することによって、このある条件下でＦＲＥＴプローブがいずれの構造をとっているのかを検出することができる。なお、このＦＲＥＴ効率は、ＦＲＥＴプローブの構成により異なる値となる。
　「ＦＲＥＴ効率」とは、蛍光供与体から蛍光受容体への励起エネルギー移動の効率をさす。ＦＲＥＴ効率としては、例えば、蛍光供与体からの蛍光強度と、蛍光受容体からの蛍光強度との比として表すことができる。
　以上のように、本発明に係る融合タンパク質は、蛍光のエネルギー移動（ＦＲＥＴ）技術を用いたＦＲＥＴプローブの提供に利用することができる。特に、活性を保持した状態でのＳＥＲＣＡの動態を観察することができるＦＲＥＴプローブに利用することができる。
　また、本発明に係る融合タンパク質は、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼの構造変化、つまり活性の変化を、ＦＲＥＴ効率の変化として可視化することができるＦＲＥＴプローブの提供に利用することができる。
　また、本発明に係る融合タンパク質は、生細胞内において、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼとしての活性を保持している。したがって、本発明に係る融合タンパク質を生細胞内において発現させることにより、活性を保持した状態での小胞体カルシウムＡＴＰアーゼの動態を、ＦＲＥＴ技術を用いて容易に可視化するためのＦＲＥＴプローブの提供に利用することができる。また、本発明は、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼの構造と機能との相関を解析するために有用である。特に、状態が遷移した場合にどのような構造変化が起こっているのかを調べる際に有用である。
　したがって、本発明は、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ動態指示薬として、好適に利用することができる。また、本発明は、ＳＥＲＣＡの動態に関する研究だけでなく、ＳＥＲＣＡに関連する病気を治療、改善又は予防するための分子標的薬のスクリーニング、これらの病気の診断などに非常に有用である。
　また、ＳＥＲＣＡは、カルシウムイオン濃度の変化に伴い活性変化する。したがって、本発明に係る融合タンパク質は、カルシウムイオンのレベルを検出するためのＦＲＥＴプローブ、カルシウムイオン濃度の変化を検出するＦＲＥＴプローブなどに利用可能である。
　なお、本明細書中において、「融合タンパク質」とは、由来の異なるいくつかのタンパク質又はポリペプチドが人工的に連結されたものであってもよい。
　本発明に係る融合タンパク質は、蛍光供与体と蛍光受容体とが、ＦＲＥＴのドナーとアクセプタとして働く分子である場合には、そのままでＦＲＥＴプローブとして利用できる。また、本発明に係る融合タンパク質は、蛍光供与体及び蛍光受容体のいずれか一方または両方が、ＦＲＥＴのドナー又はアクセプタとして働く分子の前駆体である場合には、この前駆体をドナー又はアクセプタとして働く分子に変換した状態で、ＦＲＥＴプローブとして利用できる。
　本明細書中において、「ポリペプチド」は、「ペプチド」又は「タンパク質」と交換可能に使用される。本発明に係るポリペプチドはまた、化学合成されても、天然供給源より単離されてもよい。用語「単離された」ポリペプチド又はタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチド又はタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現され産生された組換えポリペプチド及びタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然の、又は組換えのポリペプチド及びタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。
　本発明に係る融合タンパク質において、各構成要素のポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、及び原核生物宿主又は真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。
　また、本発明に係る融合タンパク質及び各構成要素のポリペプチドは、付加的なペプチドを含むものであってもよい。付加的なペプチドとしては、例えば、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇタグ等のエピトープ標識ペプチドが挙げられる。本発明に係る融合タンパク質は、好ましい形態に改変され、組換え発現され得る。例えば、本発明に係る融合タンパク質は、Ｎ末端又はＣ末端に特定のアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域等を付加することによって、宿主細胞内、精製、精製に引き続く操作、及び保存等における安定性、持続性等を改善することができる。
　一実施形態において、本発明に係る融合タンパク質は、配列番号１～４のいずれかに示されるアミノ酸配列からなる融合タンパク質又はその変異体であることが好ましい。ここで、この変異体とは、配列番号１～４のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなる融合タンパク質であることが好ましい。
　本明細書中において融合タンパク質、ポリペプチド又はタンパク質に関して用いられる場合、用語「変異体」は、本来のアミノ酸の少なくとも１つ以上がポイント変異、挿入、逆転、反復、欠損、タイプ置換されたポリペプチド又はタンパク質が意図される。
　このような変異体としては、欠失、挿入、逆転、反復、タイプ置換（例えば、親水性残基の別の残基への置換、しかし通常は強い親水性の残基を強い疎水性の残基には置換しない）、及びポイント変異などを含む変異体が挙げられる。アミノ酸の置換には、例えば、ポリペプチドにおける中性アミノ酸を別の中性アミノ酸に置換する場合等が含まれる。
　ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造又は機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではなく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造又は機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
　当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体又は付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法を用いれば、作製した変異体が所望の活性を有するか否かを容易に決定し得る。
　「１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により欠失、置換又は付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、最も好ましくは５個以下）のアミノ酸が欠失、置換又は付加されていることを意味する。このような変異タンパク質は、上述したように、公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を有するタンパク質に限定されるものではなく、天然に存在する変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。
　なお、本発明に係る融合タンパク質は、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド以外の構造」としては、糖鎖やイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
　また、本発明に係る融合タンパク質は、後述する本発明にかかるポリヌクレオチド（すなわち本発明の融合タンパク質をコードする遺伝子）を宿主細胞に導入して、その融合タンパク質を細胞内で発現させた状態であってもよいし、細胞、組織などから単離精製された場合であってもよい。
　他の実施形態において、本発明に係る融合タンパク質の変異体は、配列番号６～９のいずれかに示される塩基配列の１個又は数個の塩基配列が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされることが好ましい。
　他の実施形態において、本発明に係る融合タンパク質の変異体は、配列番号６～９のいずれかに示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされることが好ましい。
　ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，２ｄ　Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる場合、５０℃以下の温度が好ましい。
　本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、及び２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。
　また、他の実施形態において、本発明に係る融合タンパク質の変異体は、配列番号６～９のいずれかに示される塩基配列と少なくとも６６％同一、より好ましくは少なくとも８０％同一、さらに好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされることが好ましい。
　〔ポリヌクレオチド〕
　本発明はまた、本発明に係る融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明に係るポリヌクレオチドは、上述した融合タンパク質のいずれかをコードする。
　本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」又は「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」又は「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ及びＴと省略される）もしくはリボヌクレオチド（Ｃ、Ａ、Ｇ及びＵ）の配列として示される。また、「配列番号６に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド又はそのフラグメント」とは、配列番号６の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ及び／又はＴによって示される配列を含むポリヌクレオチド又はその断片部分が意図される。
　本発明に係るポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、又はＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、又は、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
　一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号６～９のいずれかに示される塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその変異体であることが好ましい。
　一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドの変異体は、以下のポリヌクレオチドのいずれかであることが好ましい：
　配列番号６～９のいずれかに示される塩基配列の１個又は数個の塩基配列が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド；
　配列番号６～９のいずれかに示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
　配列番号６～９のいずれかに示される塩基配列と少なくとも６６％同一、より好ましくは少なくとも８０％同一、さらに好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド。
　本発明に係るポリヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列又はベクター配列（発現用ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
　本発明に係るポリヌクレオチドは、例えば、発現用ベクター等にサブクローンして、融合タンパク質を発現させるためのベクター（プラスミド）を作製し、これを細胞内に導入することによって、このポリヌクレオチドがコードする融合タンパク質を細胞内に発現させることができる。
　なお、本発明に係るポリヌクレオチドは、融合タンパク質をコードする領域の上流に、細胞内において融合タンパク質を発現させるためのプロモーター配列等が組み込まれたものであってもよい。
　また、本発明に係るポリヌクレオチドは、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇタグ等のタグ配列をコードするポリヌクレオチドが付加されたものであってもよい。
　本発明に係るポリヌクレオチドは、例えば、各構成要素のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを直鎖状に連結することによって生産することができる。
　〔ベクター〕
　本発明は、本発明に係る融合タンパク質を生産するために使用されるベクターを提供する。本発明に係るベクターは、宿主細胞において組換え発現するためのベクターであってもよいし、インビトロでの融合タンパク質の生産に用いるベクターであってもよい。
　本発明に係るベクターは、本発明に係るポリヌクレオチドを含むものであれば、特に限定されない。例えば、本発明に係るポリペプチドをコードするｃＤＮＡ（ポリヌクレオチドの一形態）が挿入されたベクターなどが挙げられる。ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
　ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞に目的のポリヌクレオチドを導入することができるベクター、ポリヌクレオチドにコードされた融合タンパク質を宿主細胞中で発現させることができるベクター等を、適宜選択することが好ましい。ベクターとしては、例えば大腸菌由来のプラスミド、動物細胞内でタンパク質を発現させることが可能なプラスミド、動物ウイルスなどを利用することができる。
　また、ベクターは、適当なプロモーター配列が、本発明に係るポリヌクレオチドとともに組み込まれていることが好ましい。プロモーター配列は、宿主細胞の種類に応じて、本発明に係るポリヌクレオチドを発現させるために適宜選択することが好ましい。
　本発明において利用可能なプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応した適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなど、宿主が動物細胞である場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ－ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
　また本発明に係るベクターには、以上の他に、所望により当該技術分野で公知の、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製起点などを付加することができる。また、必要に応じて、本発明のポリヌクレオチドにコードされた融合タンパク質と他のタンパク質とを連結させて発現させることも可能である。このような連結されたタンパク質は、適当なプロテアーゼを使用して切断することによって、それぞれのタンパク質に分離することができる。
　本発明に係るベクターには、少なくとも１つの選択マーカーが含まれていることが好ましい。選択マーカーとしては、公知の薬剤耐性遺伝子等を用いることができる。選択マーカーを用いれば、本発明に係るポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認することができる。
　本発明に係るベクターを用いれば、生物又は細胞に導入することにより、当該生物又は細胞中に本発明に係る融合タンパク質を発現させることができる。
　〔形質転換体〕
　本発明は、本発明に係るポリヌクレオチドを含む形質転換体を提供する。ここで「形質転換体」とは、細胞、組織、器官等だけでなく、生物の個体をも含む概念である。
　形質転換体は、例えば、本発明に係るベクターで宿主細胞を形質転換することにより生産することができる。
　本明細書中において、「細胞」又は「宿主細胞」とは、生物における細胞（原核細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、ヒトを含めた哺乳動物細胞等）のみならず、その本来の機能を維持した状態の培養細胞（原核細胞及び真核細胞）を含む。また、「細胞」又は「宿主細胞」は、初代細胞、継代細胞、株化細胞、形質転換細胞、単離された胚性幹(ES)細胞、組織幹細胞、遺伝子操作等の人為的操作により分化多能性が付与された細胞（例えば人工多能性(iPS)細胞を含み、当該細胞より分化した細胞なども非限定的に包含する）、生物個体内に移植、感染した細胞などを含む。また、組織、器官、生物の個体そのものなどをも含む概念である。
　ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法は、特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
　なお、本発明に係る形質転換体は、本発明に係る融合タンパク質を発現させ得る形質転換体であることが好ましい。この形質転換体としては、真核培養細胞を用いることが好ましく、ヒト由来の培養細胞を用いることがより好ましい。これにより、形質転換体内で発現した融合タンパク質の活性を保持させることができ、生細胞内での小胞体カルシウムＡＴＰアーゼの動態を観察することが可能となる。
　〔融合タンパク質の生産方法〕
　本発明に係る融合タンパク質は、本発明に係る形質転換体において発現させることによって、生産することができる。また、形質転換体内で発現した融合タンパク質を、さらに精製することによって生産してもよい。
　形質転換体内で発現した融合タンパク質を精製する方法は、用いた宿主細胞、融合タンパク質の性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的の融合タンパク質を精製することが可能である。本発明に係る融合タンパク質を精製する場合、周知の方法で宿主細胞から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法によって融合タンパク質を精製することができる。
　なお、本発明に係る融合タンパク質は、周知の化学合成技術を利用して、各構成要素のポリペプチドを化学合成法等で得た後に、それぞれを連結することによって生産してもよい。また、融合タンパク質は、上述したベクターを用いてインビトロで、例えば周知の無細胞タンパク質合成系において、生産してもよい。
　〔小胞体カルシウムＡＴＰアーゼの挙動観察方法〕
　本発明は、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼの挙動観察方法を提供する。この挙動観察方法は、本発明に係る融合タンパク質を用いて、蛍光供与体からの蛍光強度と蛍光受容体からの蛍光強度とを検出する工程を含む。融合タンパク質として、本発明に係る形質転換体において発現している融合タンパク質を用いることが好ましい。
　本発明により、融合タンパク質の蛍光供与体からの蛍光強度と蛍光受容体からの蛍光強度との比を算出することができ、すなわちＦＲＥＴ効率を検出することができる。融合タンパク質がとりうる各構造についてのＦＲＥＴ効率を予め調べておき、所定の条件下でのＦＲＥＴ効率を検出することによって、このある条件下で融合タンパク質がいずれの構造をとっているのかを検出することができる。
　また、本発明により、第１の状態から第２の状態に遷移した際のＦＲＥＴ効率の変化を検出することによって、融合タンパク質がどのように構造変化したのかを検出することができる。
　このように、本発明であれば、活性を保持した状態でのＳＥＲＣＡの挙動を観察することができる。したがって、ＳＥＲＣＡに関連する病気を治療するための分子標的薬のスクリーニング、これらの病気の診断などを行なうことができる。
　〔スクリーニング方法〕
　本発明は、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼを標的分子とする化合物のスクリーニング方法を提供する。このスクリーニング方法は、本発明に係る融合タンパク質を用いて、試験化合物を処理した場合と処理しない場合とにおける、蛍光供与体からの蛍光強度と蛍光受容体からの蛍光強度との比を比較する工程を含む。融合タンパク質として、本発明に係る形質転換体において発現している融合タンパク質を用いることが好ましい。
　試験化合物を処理した場合と処理しない場合とで、ＦＲＥＴ効率の比を比較し、これらが異なる値である場合には、この試験化合物は、融合タンパク質の構造を変化させている可能性が高い。このような試験化合物は、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼの構造に影響を与え、さらに活性に影響を与える化合物である可能性が高い。そのため、このような場合には、この試験化合物が、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼの構造及び活性に影響を与え得る化合物であると判断することができる。
　すなわち、本発明は、試験化合物を処理した場合における比と、試験化合物を処理しない場合における比とが異なる場合は、この試験化合物を、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼを標的分子とする化合物の候補化合物として選抜する工程をさらに含んでもよい。
　ここで、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼは、遺伝性の心臓病の原因遺伝子の一つであり、また、その活性が、心不全、糖尿病、癌及びアルツハイマー病などの病気に関連していることが知られている。したがって、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼを標的分子とする化合物は、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼが関連する病気、症状等の治療、予防などに有用な薬剤の候補となりうる。
　〔キット〕
　本発明はまた、本発明に係るポリヌクレオチドを含むキットを提供する。ポリヌクレオチドは、このポリヌクレオチドを含むベクターとして含まれていてもよいし、このポリヌクレオチドを含む形質転換体として含まれていてもよい。
　このキットは、本発明に係る融合タンパク質を利用するためのキットである。例えば、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼの挙動を観察するためのキットであってもよいし、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼを標的分子とする化合物をスクリーニングするためのキットであってもよい。本発明に係るキットは、上述した挙動観察方法及びスクリーニング方法に好適に利用できる。
　また、本発明に係るキットは、細胞内のカルシウム濃度の変化を検出するためのキットであってもよい。
　なお、本発明に係るキットは、本発明に係るポリヌクレオチドに加え、このポリヌクレオチドを挿入してベクターを製造するためのプラスミド、ベクターを形質転換するための宿主細胞等をさらに含むものであってもよい。また、本発明に係るキットは、本発明に係るポリヌクレオチドをベクターとして含み、さらに、このベクターを形質転換するための宿主細胞等を含むものであってもよい。また、本発明に係るキットは、本発明に係るポリヌクレオチドを形質転換体として含み、さらに、挙動観察方法又はスクリーニング方法に用いる試薬、コントロール化合物等を含むものであってもよい。さらに、本キットは、キットの使用説明書を含むものであってもよい。
　〔融合タンパク質の設計方法〕
　本発明はまた、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼと、ＦＲＥＴの蛍光供与体と、ＦＲＥＴの蛍光受容体とを備えた融合タンパク質の設計方法を提供する。
　この設計方法は、蛍光供与体と蛍光受容体とのうち、一方が、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼのＮ末端側に連結されるように設計する。また、他方が、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼのＮ末端側に連結されている一方と小胞体カルシウムＡＴＰアーゼとの間、又は、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼにおけるＳＥＲＣＡ２ａの１～６番目のアミノ酸、３６９～３８０番目のアミノ酸、もしくは５７２～５８３番目のアミノ酸に対応するアミノ酸配列内、に挿入されるように設計する。
　小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ、蛍光供与体及び蛍光受容体としては、上述したものと同じものを例示することができる。
　なお、蛍光供与体及び蛍光受容体のうちの他方を、蛍光供与体及び蛍光受容体のうちの一方と小胞体カルシウムＡＴＰアーゼとの間、又は、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼにおけるＳＥＲＣＡ２ａの１～５番目のアミノ酸、３７０～３７９番目のアミノ酸、もしくは５７３～５８２番目のアミノ酸に対応するアミノ酸配列内、に挿入されるよう設計することが好ましい。
　また、蛍光供与体及び蛍光受容体のうちの他方を、蛍光供与体及び蛍光受容体のうちの一方と小胞体カルシウムＡＴＰアーゼとの間、又は、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼにおけるＳＥＲＣＡ２ａの１～４番目のアミノ酸、３７１～３７８番目のアミノ酸、もしくは５７４～５８１番目のアミノ酸に対応するアミノ酸配列内、に挿入されるよう設計することがより好ましい。
　また、蛍光供与体及び蛍光受容体のうちの他方を、蛍光供与体及び蛍光受容体のうちの一方と小胞体カルシウムＡＴＰアーゼとの間、又は、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼにおけるＳＥＲＣＡ２ａの１～３番目のアミノ酸、３７２～３７７番目のアミノ酸、もしくは５７５～５８０番目のアミノ酸に対応するアミノ酸配列内、に挿入されるよう設計することがさらに好ましい。
　また、蛍光供与体及び蛍光受容体のうちの他方を、蛍光供与体及び蛍光受容体のうちの一方と小胞体カルシウムＡＴＰアーゼとの間、又は、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼにおけるＳＥＲＣＡ２ａの１番目のアミノ酸と２番目のアミノ酸との間、３７３～３７６番目のアミノ酸、もしくは５７６～５７９番目のアミノ酸に対応するアミノ酸配列内、に挿入されるよう設計することがよりさらに好ましい。
　また、蛍光供与体及び蛍光受容体のうちの他方を、蛍光供与体及び蛍光受容体のうちの一方と小胞体カルシウムＡＴＰアーゼとの間、又は、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼにおけるＳＥＲＣＡ２ａの３７４番目のアミノ酸と３７５番目のアミノ酸との間、もしくは５７７番目のアミノ酸と５７８番目のアミノ酸との間に対応する位置、に挿入されるよう設計することが最も好ましい。
　以上の設計方法により、活性を保持した状態でのＳＥＲＣＡの動態を観察することができるＦＲＥＴプローブに利用可能な融合タンパク質を設計することができる。
　本発明は上述した実施形態及び下記の各実施例に限定されるものではない。
　〔１：発現ベクターの作製〕
　以下のＦＲＥＴプローブ（融合タンパク質）を発現させるための発現ベクターを作製した。各ＦＲＥＴプローブの構成を図１中の（ａ）～（ｄ）に示す。図１中の（ａ）～（ｄ）は、本発明に係る融合タンパク質のいくつかの実施例を示す図である。
（１）ＴｄＣＶ－ｓ（配列番号１）：ＳＥＲＣＡ２ａ（小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ）のＮ末端にＥＣＦＰ（蛍光供与体）が連結され、Ｖｅｎｕｓ（蛍光受容体）がＥＣＦＰのＣ末端とＳＥＲＣＡ２ａのＮ末端との間に挿入されたＦＲＥＴプローブ（図１中の（ａ））。
（２）Ｖ－Ｇ３７４（配列番号２）：ＳＥＲＣＡ２ａのＮ末端にＥＣＦＰが連結され、ＳＥＲＣＡ２ａの３７４番目のアミノ酸と３７５番目のアミノ酸との間にＶｅｎｕｓが挿入されたＦＲＥＴプローブ（図１中の（ｂ））。
（３）Ｖ－Ｌ５７７（配列番号３）：ＳＥＲＣＡ２ａのＮ末端にＥＣＦＰが連結され、ＳＥＲＣＡ２ａの５７７番目のアミノ酸と５７８番目のアミノ酸との間にＶｅｎｕｓが挿入されたＦＲＥＴプローブ（図１中の（ｃ））。
（４）Ｆ－Ｌ５７７（配列番号４）：ＳＥＲＣＡ２ａのＮ末端にＥＣＦＰが連結され、ＳＥＲＣＡ２ａの５７７番目のアミノ酸と５７８番目のアミノ酸との間にＴＣ－ｔａｇが挿入されたＦＲＥＴプローブ（図１中の（ｄ））。
（５）Ｖ－Ｇ５１９（配列番号５）：ＳＥＲＣＡ２ａのＮ末端にＥＣＦＰが連結され、ＳＥＲＣＡ２ａの５１９番目のアミノ酸と５２０番目のアミノ酸との間にＶｅｎｕｓが挿入されたＦＲＥＴプローブ（図示せず）。
　これらのＦＲＥＴプローブを発現させるための発現ベクターを、以下の方法によって作製した。
　（ＴｄＣＶ－ｓ）
　ＴｄＣＶ－ｓを生産するための発現ベクターを作製するため、ＥＣＦＰをコードするＤＮＡ断片、ＶｅｎｕｓをコードするＤＮＡ断片、及びＳＥＲＣＡ２ａをコードするＤＮＡ断片を、それぞれＰＣＲによって増幅した。ＥＣＦＰをコードするＤＮＡ断片は、ｐＥＣＦＰ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をテンプレートとして用いて増幅した。ＶｅｎｕｓをコードするＤＮＡ断片は、ｐＲＳＥＴｂ－Ｖｅｎｕｓ（参考文献：Nagai et al.,　Nature Biotechnology, 2002;20:87-90）をテンプレートとして用いて増幅した。ＳＥＲＣＡ２ａをコードするＤＮＡ断片は、ｐＴＮ３－ＧＦＰ－ＳＥＲＣＡ２ａ（Uchida et al., J. Biol. Chem., 2003;278(19):16551-60）をテンプレートとして用いて増幅した。
　そして、これらの増幅した断片を、５’側からこの順に連結させ、ＴｄＣＶ－ｓをコードする遺伝子（配列番号６）を含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。
　Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃバキュロウイルス発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用するため、この連結したＤＮＡ断片を、ｐＦａｓｔＢａｃ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。これにより、発現ベクターを得た。
　（Ｖ－Ｇ３７４、Ｖ－Ｌ５７７、Ｆ－Ｌ５７７、及びＶ－Ｇ５１９）
　Ｖ－Ｇ３７４、Ｖ－Ｌ５７７、Ｆ－Ｌ５７７、及びＶ－Ｇ５１９についても、上述したＴｄＣＶ－ｓと同様に、それぞれの構成要素ごとにＤＮＡをＰＣＲによって増幅した後に連結させ、Ｖ－Ｇ３７４、Ｖ－Ｌ５７７、Ｆ－Ｌ５７７、及びＶ－Ｇ５１９をコードする遺伝子（配列番号７～１０）を含むＤＮＡ断片を得た。これらのＤＮＡ断片をｐＦａｓｔＢａｃ１にクローニングすることにより、発現ベクターを得た。
　Ｖ－Ｇ３７４を例として説明する。Ｖ－Ｇ３７４を生産するための発現ベクターを作製するため、ＥＣＦＰをコードするＤＮＡ、ＳＥＲＣＡ２ａの１～３７４番目のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、ＶｅｎｕｓをコードするＤＮＡ、及びＳＥＲＣＡ２ａの３７５～Ｃ末端のアミノ酸配列をコードするＤＮＡのそれぞれをＰＣＲによって増幅した。そして、これらの増幅した断片を、５’側からこの順に連結させ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）にクローニングした。なお、ＥＣＦＰとＳＥＲＣＡ２ａのＮ末との間に、リンカー（Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ）が挿入されるように設計した。この連結したＤＮＡ断片を、ｐＦａｓｔＢａｃ１にクローニングし、発現ベクターを得た。
　Ｖ－Ｇ５１９、Ｖ－Ｌ５７７及びＦ－Ｌ５７７についても、Ｖ－Ｇ３７４と同様の方法によって、発現ベクターを得た。なお、Ｆ－Ｌ５７７の発現ベクターを作製する際、ＴＣ－ｔａｇ（配列番号１３）をコードするＤＮＡ断片（配列番号１４）は、２つのオリゴＤＮＡ、ＢａｍＨＩ－ＣＣＰＧＣＣ－ＦＷ（配列番号１５）とＥｃｏＲＩ－ＣＣＰＧＣＣ－ＢＷ（配列番号１６）とをアニーリングすることにより得た。
　〔２．阻害剤添加によるＦＲＥＴ効率の変化〕
　それぞれの発現ベクターをＣＯＳ７細胞（ＲＩＫＥＮ　Ｃｅｌｌ　Ｂａｎｋ，Ｔｓｕｋｕｂａ，Ｊａｐａｎ）にトランスフェクションし、形質転換体を得た。これらの形質転換体を用いて、ＳＥＲＣＡ特異的な阻害剤であるタプシガルジン（Ｔｇ：Ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）を用いて、ＳＥＲＣＡの活性を阻害した場合について、各ＦＲＥＴプローブのＦＲＥＴ効率の変化を調べた。
　Ｆ－Ｌ５７７を形質転換した形質転換体については、ＦｌＡｓＨ－ＥＤＴ２試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により室温で６０～９０分処理することによって、ＦｌＡｓＨを付加させた。それぞれの発現ベクターを形質転換した形質転換体について、細胞膜を透過性にして、Ｔｇを含む、細胞内液に模したインターナル溶液（１９ｍＭ　ＮａＣｌ，１２５ｍＭ　ＫＣｌ，１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ－ＫＯＨ　ｐＨ７．４）内で還流した。その後、ＩＸ７１インバータ蛍光顕微鏡（オリンパス）下で蛍光強度を測定し、蛍光供与体と蛍光受容体との蛍光強度比の変化量（ｄＲ／Ｒｂａｓｅ）を算出した。
　その結果を図２中の（ａ）～（ｅ）に示す。図２中の（ａ）～（ｅ）は、ＦＲＥＴプローブを発現する形質転換体にＴｇを添加したときの、ＦＲＥＴ効率の変化を示すグラフである。
　ｄＲ／Ｒｂａｓｅは、Ｔｇの添加によって、Ｖ－Ｇ３７４を発現する形質転換体では１２％減少し（図２中の（ｂ））、Ｖ－Ｌ５７７を発現する形質転換体では８％減少し（図２中の（ｄ））、Ｆ－Ｌ５７７を発現する形質転換体では２０％増加した（図２中の（ｅ））。一方、ＴｄＣＶ－ｓ及びＶ－Ｇ５１９を発現する形質転換体では、Ｔｇの添加によってｄＲ／Ｒｂａｓｅが変化しなかった（図２中の（ａ），（ｃ））。
　以上の結果より、Ｖ－Ｇ３７４、Ｖ－Ｌ５７７及びＦ－Ｌ５７７のＦＲＥＴ効率は、Ｔｇの存在の有無によって変化することが示された。すなわち、Ｖ－Ｇ３７４、Ｖ－Ｌ５７７及びＦ－Ｌ５７７は、少なくともＴｇ添加によって生じるＳＥＲＣＡの活性の変化に伴う構造変化により、ＦＲＥＴ効率が変化することが示唆された。
　〔３．細胞内カルシウム濃度の変化によるＦＲＥＴ効率の変化〕
　細胞内カルシウム濃度の変化によってＳＥＲＣＡの活性が変化するときの、各ＦＲＥＴプローブのＦＲＥＴ効率の変化を調べた。
　それぞれの形質転換体に対してアゴニスト処理（ＡＴＰ）を行ない、細胞内のカルシウム濃度を上昇させた。そして、ＩＸ７１インバータ蛍光顕微鏡（オリンパス）下で蛍光強度を測定し、ｄＲ／Ｒｂａｓｅを算出した。またこのときの細胞内Ｃａ２＋濃度の変化を見るためにＩｎｄｏ－５Ｆ（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を用い、このＩｎｄｏ－５ＦのｄＦ／Ｆｂａｓｅを算出した。
　その結果を図３中の（ａ）～（ｄ）に示す。図３中の（ａ）～（ｄ）は、ＦＲＥＴプローブを発現する細胞内のカルシウム濃度を変化させたときの、ＦＲＥＴ効率の変化を示すグラフである。図３中の（ａ）～（ｄ）において、ａはＦＲＥＴプローブのｄＲ／Ｒｂａｓｅをさし、ｂはＩｎｄｏ－５ＦのｄＦ／Ｆｂａｓｅをさす。
　なお、図３中の（ａ）は、ＴｄＣＶ－ｓについての結果であり、図３中の（ｂ）は、Ｖ－Ｌ５７７についての結果であり、図３中の（ｃ）は、Ｆ－Ｌ５７７についての結果であり、図３中の（ｄ）は、Ｖ－Ｇ５１９についての結果である。それぞれ、アゴニスト処理は、２分～８分の間行なった。
　ｄＲ／Ｒｂａｓｅは、細胞内のカルシウムイオン濃度上昇に伴って、ＴｄＣＶ－ｓを発現する形質転換体では５％上昇した（図３中の（ａ））。また、Ｖ－Ｌ５７７及びＦ－Ｌ５７７のそれぞれを発現する形質転換体では４％減少した（図３中の（ｂ），（ｃ））。一方、Ｖ－Ｇ５１９を発現する形質転換体では、変化が見られなかった（図３中の（ｄ））。
　以上の結果より、ＴｄＣＶ－ｓ、Ｖ－Ｌ５７７及びＦ－Ｌ５７７のＦＲＥＴ効率は、細胞内のカルシウム濃度上昇によって変化することが示された。すなわち、ＴｄＣＶ－ｓ、Ｖ－Ｌ５７７及びＦ－Ｌ５７７は、少なくとも細胞内カルシウムイオン濃度の変動によって生じるＳＥＲＣＡの活性の変化に伴う構造変化により、ＦＲＥＴ効率が変化することが示唆された。
　以上の実験結果によって、ＴｄＣＶ－ｓ、Ｖ－Ｇ３７４、Ｖ－Ｌ５７７及びＦ－Ｌ５７７は、ＳＥＲＣＡの構造変化を検出するためのＦＲＥＴプローブの提供に利用できることが示された。また、これらのプローブは、細胞内のカルシウムイオン濃度の変化によってＦＲＥＴ効率が変化するため、細胞内のカルシウムイオン濃度の変化を検出するためのＦＲＥＴプローブの提供に利用できることが示された。
　〔４．ＳＥＲＣＡの活性変化に伴う各構造に固定したときのＦＲＥＴ効率の変化〕
　ＴｄＣＶ－ｓ、Ｖ－Ｌ５７７及びＦ－Ｌ５７７が、それぞれＳＥＲＣＡのどのような構造変化を検出可能であるかについて調べた。なお、ここでは、ＳＥＲＣＡの主要な４つの構造である、Ｅ１－２Ｃａ２＋、Ｅ１－ＡＴＰ、Ｅ２Ｐ、又はＥ２に固定した。
　ＴｄＣＶ－ｓ、Ｖ－Ｌ５７７及びＦ－Ｌ５７７それぞれを発現する形質転換体について、それぞれ細胞膜を透過性にして、細胞内液に模したインターナル溶液（１９ｍＭ　ＮａＣｌ，１２５ｍＭ　ＫＣｌ，１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ－ＫＯＨ　ｐＨ７．４）内で還流した。なお、Ｅ１－２Ｃａ２＋に固定する場合には、１００μＭのＣａＣｌ２を含むインターナル溶液を用いた。また、Ｅ１－ＡＴＰに固定する場合には、１ｍＭのＡＤＰ、０．３３ｍＭのＡｌＣｌ３、５ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、及び１００μＭのＣａＣｌ２を含むインターナル溶液を用いた。また、Ｅ２Ｐに固定する場合には、２ｍＭのＢｅＣｌ２、８ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、及び５ｍＭのＥＧＴＡを含むインターナル溶液を用いた。また、Ｅ２に固定する場合には、３０μＭのＴｇ及び５ｍＭのＥＧＴＡを含むインターナル溶液を用いた。その後、ＩＸ７１インバータ蛍光顕微鏡（オリンパス）下で蛍光強度を測定し、ｄＲ／Ｒｂａｓｅを算出した。
　その結果を図４中の（ａ）～（ｃ）に示す。図４中の（ａ）～（ｃ）は、ＦＲＥＴプローブを各構造に固定したときのＦＲＥＴ効率を示すグラフである。
　それぞれの形質転換体において測定されたｄＲ／Ｒｂａｓｅは、Ｅ１－２Ｃａ２＋、Ｅ１－ＡＴＰ、Ｅ２Ｐ、Ｅ２のそれぞれに固定した場合の順に、ＴｄＣＶ－ｓでは－１，－８，６，－２％（図４中の（ａ））、Ｖ－Ｌ５７７では－６，１２，１５，２１％（図４中の（ｂ））、Ｆ－Ｌ５７７では７，１２，６，－２％（図４中の（ｃ））であった。このように、各ＦＲＥＴプローブは、各構造において示すＦＲＥＴ効率がそれぞれ異なっており、それぞれ別の構造変化を反映してＦＲＥＴ効率が大きく変化することが示唆された。
　すなわち、図４中の（ａ）～（ｃ）より、ＴｄＣＶ－ｓのＦＲＥＴ効率は、Ｅ１－２Ｃａ２＋からＥ１－ＡＴＰに構造変化する際に大きく変化しうることが示された。また、Ｖ－Ｌ５７７のＦＲＥＴ効率は、Ｅ２からＥ１－２Ｃａ２＋に構造変化する際に大きく変化しうることが示された。また、Ｆ－Ｌ５７７のＦＲＥＴ効率は、Ｅ２ＰからＥ２に構造変化する際に大きく変化しうることが示された。したがって、これらのプローブは、それぞれ異なる構造変化を検出するために有用であり、それぞれＦＲＥＴ効率が大きく変化しうる構造変化を検出するためのＦＲＥＴプローブの提供に、利用することができる。
　このように、本発明は、異なる構造変化を検出することができるＦＲＥＴプローブの提供に利用することができることから、様々な構造を標的にした化合物のスクリーニングに有用である。また、ＳＥＲＣＡの構造変化についての詳細な研究にも有用である。
　〔５．Ｆ－Ｌ５７７のＦＲＥＴ効率の変化と、Ｃａ２＋取り込み活性との関係〕
　Ｆ－Ｌ５７７について、ＦＲＥＴ効率の変化と、Ｃａ２＋取り込み活性との関係を調べた。
　まず、Ｆ－Ｌ５７７のＦＲＥＴ効率の変化と、ＥＲにおけるＣａ２＋の蓄積との関係を調べた。Ｆ－Ｌ５７７を発現する形質転換体にＭｇＡＴＰを添加してＥＲへのＣａ２＋蓄積を開始させ、ＦＲＥＴ効率の変化と、ＥＲにおけるＭａｇ－Ｉｎｄｏ－１の蛍光強度の変化とを検出した。
　この結果を図５中の（ａ）～（ｂ）に示す。図５中の（ａ）～（ｂ）は、Ｆ－Ｌ５７７のＦＲＥＴ効率の変化と、ＥＲにおけるＣａ２＋の蓄積との関係を示すグラフである。ＭｇＡＴＰの添加によって、ＥＲにＣａ２＋が蓄積される（図５中の（ｂ））とともに、Ｆ－Ｌ５７７のΔＲ／Ｒｂａｓｅが３～６％上昇した（図５中の（ａ））。
　Ｆ－Ｌ５７７のＦＲＥＴ効率の変化とＣａ２＋の取り込みとのタイミングが一致するかを調べた。図６中の（ａ）～（ｂ）は、図５中の（ａ）～（ｂ）に示したＦ－Ｌ５７７のＦＲＥＴ効率の一次導関数と、ＥＲにおける、Ｃａ２＋の蓄積の一次導関数とを重ね合わせたグラフである。すなわち、ΔＲ／Ｒｂａｓｅの一次導関数（ｄ（ΔＲ／Ｒｂａｓｅ）／ｄｔ：実線）と、ΔＦ／Ｆｂａｓｅの一次導関数（ｄ（ΔＦ／Ｆｂａｓｅ）／ｄｔ：破線）とを重ね合わせたグラフである。図６中の（ｂ）は、図６中の（ａ）を拡大して示したグラフである。これらのグラフは、ΔＲ／Ｒｂａｓｅの一次導関数のピークと、ΔＦ／Ｆｂａｓｅの一次導関数のピークとが一致することを示す。したがって、Ｆ－Ｌ５７７の構造変化が、ＥＲへのＣａ２＋の取り込みと同時に生じたことが示された。
　また、ＳＥＲＣＡ２のＣａ２＋の取り込み活性は、ＡＴＰ濃度依存的であることが知られている。そこで、Ｆ－Ｌ５７７のＦＲＥＴ効率の変化がＡＴＰ依存的かを調べるために、ＡＴＰ濃度を０．０１ｍＭ、０．１ｍＭ、及び１ｍＭとし、上述した実験を行なった。図７中の（ａ）は、ＡＴＰ濃度と、Ｆ－Ｌ５７７のＦＲＥＴ効率の変化との関係を示すグラフであり、図７中の（ｂ）は、ＡＴＰ濃度と、ＥＲにおけるＣａ２＋の蓄積との関係を示すグラフである。Ｆ－Ｌ５７７のＦＲＥＴ効率の変化はＡＴＰ濃度依存的であり（図７中の（ａ））、その依存性はＣａ２＋の蓄積における依存性と類似することが示された。
　図８は、Ｆ－Ｌ５７７のＦＲＥＴ効率と、ＥＲにおけるＣａ２＋の蓄積（ＥＲにおけるＭａｇ－Ｉｎｄｏ－１の蛍光の変化量）との相関関係を示す図である。図８は、異なるＡＴＰ濃度での相関関係（ｒ＝０．７６７，Ｎ＝６１）を示す。この結果は、Ｆ－Ｌ５７７の応答と、Ｍａｇ－Ｉｎｄｏ－１の応答とが、強く相関していることを示す。
　以上の結果から、Ｆ－Ｌ５７７のＦＲＥＴ効率の正の変化は、ＳＥＲＣＡ２ａの瞬間的なＣａ２＋取り込み活性と、直接関連していることが示された。したがって、Ｆ－Ｌ５７７は、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼのＣａ２＋取り込み活性を可視化するのに有用なＦＲＥＴプローブであり、Ｃａ２＋取り込み活性を標的とした化合物のスクリーニングに利用可能であることが示された。
　本発明は、活性を保持した状態でのＳＥＲＣＡの動態を観察することができるので、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ動態指示薬として利用することができる。したがって、本発明は、ＳＥＲＣＡの動態に関する研究、ＳＥＲＣＡに関連する病気の治療、改善又は予防のための分子標的薬のスクリーニング、これらの病気の診断などに非常に有用である。

Claims (14)

  1. 　小胞体カルシウムＡＴＰアーゼと、ＦＲＥＴの蛍光供与体と、ＦＲＥＴの蛍光受容体とを備え、
    　上記蛍光供与体と上記蛍光受容体とのうち、
    　　一方は、上記小胞体カルシウムＡＴＰアーゼのＮ末端側に連結されており、
    　　他方は、上記一方と上記小胞体カルシウムＡＴＰアーゼとの間、又は、上記小胞体カルシウムＡＴＰアーゼにおけるＳＥＲＣＡ２ａの１～６番目のアミノ酸、３６９～３８０番目のアミノ酸、もしくは５７２～５８３番目のアミノ酸に対応するアミノ酸配列内、に挿入されていることを特徴とする融合タンパク質。
  2. 　上記蛍光供与体及び上記蛍光受容体の少なくとも１つは、ドナーもしくはアクセプタとしての蛍光タンパク質、又はドナーもしくはアクセプタとしての蛍光物質であって特定のペプチド配列に特異的に結合しているものを利用するものであることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. 　上記蛍光供与体が青色蛍光タンパク質であり、上記蛍光受容体が黄色蛍光タンパク質又はテトラシステインタグに特異的に結合するＦｌＡｓＨもしくはその類縁体であることを特徴とする請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
  4. 　上記他方は、上記一方と上記小胞体カルシウムＡＴＰアーゼのＮ末端との間、又は、上記小胞体カルシウムＡＴＰアーゼにおけるＳＥＲＣＡ２ａの３７４番目のアミノ酸と３７５番目のアミノ酸との間、もしくは５７７番目のアミノ酸と５７８番目のアミノ酸との間に対応する位置に挿入されていることを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  5. 　配列番号１～４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる融合タンパク質；あるいは
    　配列番号１～４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなる、融合タンパク質。
  6. 　請求項１～５のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
  7. 　配列番号６～９のいずれかに示される塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；
    　配列番号６～９のいずれかに示される塩基配列の１個又は数個の塩基配列が欠失、置換又は付加された塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；
    　配列番号６～９のいずれかに示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；あるいは
    　配列番号６～９のいずれかに示される塩基配列と少なくとも６６％同一な塩基配列からなる、ポリヌクレオチド。
  8. 　請求項６又は７に記載のポリヌクレオチドを含んでいることを特徴とするベクター。
  9. 　請求項６又は７に記載のポリヌクレオチドを含んでいることを特徴とする形質転換体。
  10. 　請求項８に記載のベクターを含んでいることを特徴とする形質転換体。
  11. 　小胞体カルシウムＡＴＰアーゼの挙動観察方法であって、
    　請求項１～５のいずれか１項に記載の融合タンパク質を用いて、蛍光供与体からの蛍光強度と蛍光受容体からの蛍光強度とを検出することを特徴とする挙動観察方法。
  12. 　小胞体カルシウムＡＴＰアーゼを標的分子とする化合物のスクリーニング方法であって、
    　請求項１～５のいずれか１項に記載の融合タンパク質を用いて、試験化合物を処理した場合と処理しない場合とにおける、蛍光供与体からの蛍光強度と蛍光受容体からの蛍光強度との比を比較する工程を含むことを特徴とするスクリーニング方法。
  13. 　請求項６又は７に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、小胞体カルシウムＡＴＰアーゼの挙動を観察するためのキット。
  14. 　小胞体カルシウムＡＴＰアーゼと、ＦＲＥＴの蛍光供与体と、ＦＲＥＴの蛍光受容体とを備えた融合タンパク質の設計方法であって、
    　上記蛍光供与体と上記蛍光受容体とのうち、
    　　一方が、上記小胞体カルシウムＡＴＰアーゼのＮ末端側に連結され、
    　　他方が、上記一方と上記小胞体カルシウムＡＴＰアーゼとの間、又は、上記小胞体カルシウムＡＴＰアーゼにおけるＳＥＲＣＡ２ａの１～５番目のアミノ酸、３６９～３７９番目のアミノ酸、もしくは５７２～５８２番目のアミノ酸に対応するアミノ酸配列内、に挿入されるように設計することを特徴とする融合タンパク質の設計方法。
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