WO2012080551A1 - Cloneable marker for use in microscopy - Google Patents

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WO2012080551A1
WO2012080551A1 PCT/ES2011/070869 ES2011070869W WO2012080551A1 WO 2012080551 A1 WO2012080551 A1 WO 2012080551A1 ES 2011070869 W ES2011070869 W ES 2011070869W WO 2012080551 A1 WO2012080551 A1 WO 2012080551A1
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Cristina Risco Ortiz
Eva SANMARTÍN CONESA
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Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic)
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/825—Metallothioneins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins

Abstract

The invention relates to a peptide that can be used as a cloneable marker for the detection of proteins of interest by means of microscopy, preferably electronic or correlative microscopy, in which the design of the amino acid sequence has been based on the skeleton of cysteines from the metallothionein (MT) sequence, but where the remaining amino acids have been substituted with small amino acids with no charge. The invention also relates to smaller fragments of the above-mentioned peptide and to the use thereof in the detection of proteins of interest by means of microscopy, preferably electronic or correlative, as well as to a method for the detection of proteins of interest by means of microscopy, preferably electronic or correlative, comprising the use of said peptide or the fragments thereof.

Description

MARCADOR CLONABLE PARA SU USO EN MICROSCOPÍA  CLONABLE MARKER FOR USE IN MICROSCOPY
La presente invención se encuadra en el campo de la biología molecular y la microscopía, específicamente, dentro de los marcadores clonables útiles para la detección de una o varias proteínas de interés por microscopía, preferiblemente por microscopía electrónica o correlativa; dentro de los métodos de detección de una o varias proteínas de interés por microscopía, preferiblemente por microscopía electrónica o correlativa, que comprenden el uso de dichos marcadores y dentro de los kits para la detección de una o varias proteínas de interés por microscopía, preferiblemente por microscopía electrónica o correlativa, que comprenden dichos marcadores. The present invention falls within the field of molecular biology and microscopy, specifically, within cloning markers useful for the detection of one or more proteins of interest by microscopy, preferably by electron or correlative microscopy; within the methods of detecting one or more proteins of interest by microscopy, preferably by electron or correlative microscopy, which comprise the use of said markers and within the kits for the detection of one or more proteins of interest by microscopy, preferably by electron or correlative microscopy, comprising said markers.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR STATE OF THE PREVIOUS TECHNIQUE
La microscopía electrónica es una técnica de estudio de imágenes a gran aumento que, en lugar de utilizar fotones como en el caso de la microscopía óptica, utiliza haces de electrones que atraviesan el espesor de la muestra ("transmisión") o que barren su superficie ("barrido"). Electron microscopy is a large-scale imaging technique that, instead of using photons as in the case of optical microscopy, uses electron beams that cross the thickness of the sample ("transmission") or that sweep its surface ("swept").
Los laboratorios de microscopía electrónica utilizan partículas de oro densas a los electrones para marcar y visualizar macromoléculas de interés en las muestras biológicas. Así, si se busca visualizar una proteína en la célula se suelen emplear grupos de átomos de oro unidos covalentemente entre sí y a una pequeña molécula para unirla a proteínas (Nanogold® y Undecagold®), o bien conjugados comerciales de partículas de oro coloidal adsorbidas a enzimas o a anticuerpos secundarios. Sin embargo, estos productos usados para marcar proteínas purificadas, no tienen aplicación en células vivas. Electron microscopy laboratories use dense gold particles to electrons to mark and visualize macromolecules of interest in biological samples. Thus, if one seeks to visualize a protein in the cell, groups of gold atoms covalently linked to each other and to a small molecule are usually used to bind it to proteins (Nanogold® and Undecagold®), or commercial conjugates of colloidal gold particles adsorbed to Enzymes or secondary antibodies. However, these products used to label purified proteins have no application in living cells.
Las partículas de oro conjugadas por adsorción a anticuerpos secundarios son dirigidas a células intactas (si la proteína de interés esta expuesta en la superficie de la célula) o a células previamente permeabilizadas (si la proteína a detectar es intracelular, situación más frecuente) donde reaccionan con anticuerpos primarios específicos previamente unidos a la proteína de interés. Sin embargo, mientras que los conjugados de oro coloidal para inmunomarcajes en microscopía electrónica son comerciales y pueden adquirirse en varias compañías, la obtención de anticuerpos primarios puede ser un proceso largo y costoso. Además, los anticuerpos son moléculas de gran tamaño y para hacerlos llegar al interior de las células es necesario abrir poros en la membrana celular, lo cual es incompatible con un estudio posterior de células vivas o de la estructura celular nativa. Por otro lado, el principal problema del uso de anticuerpos se encuentra en que sólo son capaces de reconocer un porcentaje variable e impredecible de las moléculas de la proteína contra la que van dirigidos, debido a problemas de preservación de los epítopos y al enmascaramiento de los mismos debido a las interacciones que las proteínas a localizar establecen con otras macromoléculas in vivo, lo que limita, por tanto, su sensibilidad. Además, con el uso de anticuerpos la distancia desde el epítopo en la proteína de interés y la partícula de oro coloidal densa a los electrones unida al anticuerpo secundario es de unos 15 a 20 nm, es decir, el gran tamaño de estos inmunocomplejos limita la resolución con la que se pueden localizar las proteínas in situ. Gold particles conjugated by adsorption to secondary antibodies are directed to intact cells (if the protein of interest is exposed in the surface of the cell) or to previously permeabilized cells (if the protein to be detected is intracellular, more frequent situation) where they react with specific primary antibodies previously bound to the protein of interest. However, while colloidal gold conjugates for immunomarking in electron microscopy are commercial and can be purchased from several companies, obtaining primary antibodies can be a long and expensive process. In addition, antibodies are large molecules and to get them inside the cells it is necessary to open pores in the cell membrane, which is incompatible with a subsequent study of living cells or the native cell structure. On the other hand, the main problem of the use of antibodies is that they are only able to recognize a variable and unpredictable percentage of the molecules of the protein against which they are directed, due to problems of preservation of epitopes and masking of due to the interactions that the proteins to be established establish with other macromolecules in vivo, which limits, therefore, their sensitivity. In addition, with the use of antibodies the distance from the epitope in the protein of interest and the electron-dense colloidal gold particle bound to the secondary antibody is about 15 to 20 nm, that is, the large size of these immune complexes limits the resolution with which proteins can be located in situ.
Los marcadores clonables permitirían localizar la práctica totalidad de las moléculas de la proteína de interés dentro de las células al presentar la ventaja de no depender del reconocimiento antígeno-anticuerpo. La proteína verde fluorescente es un marcador clonable para microscopía óptica que ha representado una auténtica revolución en el campo de la biología celular. No obstante, para microscopía electrónica no existen marcadores clonables de uso generalizado, aunque las proteínas que unen metales se han considerado como posibles candidatas. Por ejemplo, la metalotioneína (MT), una pequeña proteína que carece de estructura secundaria y que se pliega al unir metales, al ser tratada con sales de oro forma partículas densas a los electrones in vitro (Mercogliano y DeRosier, 2006, J. Mol. Biol., 355: 21 1 -223; Mercogliano y DeRosier, 2007, J. Struct. Biol., 160(1 ):70-82), por lo que se ha propuesto como marcador clonable para microscopía electrónica (WO20061 18615). Clonable markers would allow to locate almost all of the protein molecules of interest within the cells by presenting the advantage of not relying on antigen-antibody recognition. The green fluorescent protein is a clone marker for optical microscopy that has represented a real revolution in the field of cell biology. However, for electron microscopy there are no clonable markers for general use, although proteins that bind metals have been considered as possible candidates. For example, metallothionein (MT), a small protein that lacks secondary structure and that folds when joining metals, when treated with gold salts it forms dense particles to electrons in vitro (Mercogliano and DeRosier, 2006, J. Mol. Biol., 355: 21 1-222; Mercogliano and DeRosier, 2007, J. Struct. Biol., 160 (1): 70-82 ), which is why it has been proposed as a clone marker for electron microscopy (WO20061 18615).
En este sentido, estudios previos demuestran la visualización de proteínas quiméricas fusionadas a la MT en bacterias, mediante tratamientos de las células vivas con sales de oro y procesamientos de las mismas para su posterior visualización en microscopía electrónica (Diestra E., et al., 2009, J Struct Biol, 165:157-168; Diestra E., et al., 2009, PLoS ONE 4:e8301 ). Estos estudios demuestran que mediante esta técnica es posible visualizar moléculas individuales de las proteínas quiméricas en dos dimensiones (2D) y tres dimensiones (3D) con una sensibilidad muy alta, de varios órdenes de magnitud por encima de la proporcionada por los anticuerpos. No obstante, los estudios referentes a esta metodología basada en la MT como marcador clonable en microscopía electrónica únicamente han demostrado dicha utilidad en la visualización de proteínas en células procariotas. Por todo ello, continúa existiendo la necesidad de disponer de un marcador clonable para microscopía electrónica, equivalente a la proteína verde fluorescente y sus derivados en microscopía óptica, que no solo permita visualizar las proteínas in vivo en su entorno intracelular nativo en células procariotas sin depender del reconocimiento antígeno-anticuerpo, sino que también pudiera ser aplicado a estudios de visualización de moléculas individuales de proteínas en células eucariotas vivas con una alta sensibilidad y resolución, lo cual permitiría la elaboración de mapas macromoleculares en 2D y 3D de las células con los que obtener información relevante de las estructuras que mantienen las funciones celulares. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN In this sense, previous studies demonstrate the visualization of chimeric proteins fused to MT in bacteria, by means of treatments of living cells with gold salts and their processing for their subsequent visualization in electron microscopy (Diestra E., et al., 2009, J Struct Biol, 165: 157-168; Diestra E., et al., 2009, PLoS ONE 4: e8301). These studies demonstrate that through this technique it is possible to visualize individual molecules of the chimeric proteins in two dimensions (2D) and three dimensions (3D) with a very high sensitivity, of several orders of magnitude above that provided by the antibodies. However, studies regarding this MT-based methodology as a clone marker in electron microscopy have only demonstrated this utility in the visualization of proteins in prokaryotic cells. Therefore, there is still a need for a clone marker for electron microscopy, equivalent to fluorescent green protein and its derivatives in optical microscopy, which not only allows visualization of proteins in vivo in their native intracellular environment in prokaryotic cells without relying on of the antigen-antibody recognition, but it could also be applied to visualization studies of individual protein molecules in live eukaryotic cells with high sensitivity and resolution, which would allow the elaboration of 2D and 3D macromolecular maps of the cells with which Obtain relevant information on the structures that maintain cellular functions. DESCRIPTION OF THE INVENTION
La presente invención proporciona un marcador clonable (de ahora en adelante "marcador de la invención" o "péptido de la invención") útil para la detección de proteínas de interés por microscopía, preferiblemente electrónica o correlativa, cuya secuencia aminoacídica ha sido diseñada en base al esqueleto de cisternas de la secuencia de la metalotioneína (MT) pero donde el resto de los aminoácidos han sido sustituidos por aminoácidos de pequeño tamaño sin carga. La invención también se refiere a fragmentos de menor tamaño de dicho marcador de la invención y a su uso en la detección de proteínas de interés por microscopía, preferiblemente electrónica o correlativa. The present invention provides a cloning marker (hereinafter "marker of the invention" or "peptide of the invention") useful for the detection of proteins of interest by microscopy, preferably electronically or correlatively, whose amino acid sequence has been designed based to the skeleton of tanks of the sequence of metallothionein (MT) but where the rest of the amino acids have been replaced by small amino acids without charge. The invention also relates to smaller fragments of said marker of the invention and its use in the detection of proteins of interest by microscopy, preferably electronically or correlatively.
El marcador de la invención permite ampliar el rango de aplicaciones de los inmunocomplejos basados en anticuerpos secundarios conjugados a partículas de oro así como de la MT, ya que su empleo en la detección de proteínas de interés por microscopía electrónica, o por microscopía correlativa, presenta las siguientes ventajas: puede ser aplicado a células vivas, tanto procariotas como eucariotas, a orgánulos celulares purificados o a virus, permitiendo visualizar las proteínas en su entorno intracelular nativo sin depender del reconocimiento antígeno-anticuerpo; no interfiere con la funcionalidad de las proteínas debido a su pequeño tamaño; puede emplearse para la detección de una o de varias proteínas de interés, ya que el uso simultáneo de varias copias del péptido de la invención o de varios fragmentos del mismo de diferente longitud tratados con metales dan lugar a la formación de partículas densas a los electrones de tamaño diferente, permitiendo así los mareajes múltiples para la localización de más de una proteína simultáneamente; puede ser detectado por técnicas de microscopía electrónica proporcionando una señal distinguible de la proporcionada por la MT endógena, la cual también une metales en su función de proteína detoxificante, ya que la secuencia aminoacídica del marcador de la invención es diferente a la de esta proteína nativa; y permite visualizar las moléculas en la proteína de interés con una alta sensibilidad y resolución (localización muy precisa) en comparación con los anticuerpos comúnmente empleados en microscopía electrónica, ya que la distancia entre la molécula de la proteína de interés y la partícula densa a los electrones es de tan solo 1 nm, aproximadamente (Fig. 1 ). The marker of the invention allows to extend the range of applications of immunocomplexes based on secondary antibodies conjugated to gold particles as well as MT, since their use in the detection of proteins of interest by electron microscopy, or by correlative microscopy, presents the following advantages: it can be applied to living cells, both prokaryotic and eukaryotic, to purified cellular organelles or to viruses, allowing the visualization of proteins in their native intracellular environment without relying on antigen-antibody recognition; does not interfere with protein functionality due to its small size; it can be used for the detection of one or several proteins of interest, since the simultaneous use of several copies of the peptide of the invention or of several fragments thereof of different length treated with metals give rise to the formation of dense particles to the electrons of different size, thus allowing multiple tides for the location of more than one protein simultaneously; It can be detected by electron microscopy techniques by providing a distinguishable signal from that provided by endogenous MT, which also binds metals in their detoxifying protein function, since the amino acid sequence of the marker of the invention is different from that of this native protein; and allows to visualize the molecules in the protein of interest with a high sensitivity and resolution (very precise location) in comparison with the antibodies commonly used in electron microscopy, since the distance between the molecule of the protein of interest and the dense particle at electrons is only 1 nm, approximately (Fig. 1).
Por todo ello, un aspecto de la invención se refiere a un péptido aislado, "péptido de la invención" o "marcador de la invención", que comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 o cualquiera de sus fragmentos que comprenda 7 o más cisternas, preferiblemente que comprenda 8 o más cisternas, más preferiblemente que comprenda 9 o más cisternas. En una realización preferida, el péptido de la invención comprende un fragmento de la SEQ ID NO: 1 que comprende 9 cisternas. En otra realización preferida, el péptido de la invención comprende un fragmento de la SEQ ID NO: 1 que comprende 1 1 cisternas. En otra realización preferida, el péptido de la invención comprende una secuencia aminoacídica seleccionada de la lista que comprende: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6. La SEQ ID NO: 2 es el fragmento correspondiente a los aminoácidos 1 a 25 de la SEQ ID NO: 1 y comprende 9 cisternas. La SEQ ID NO: 3 es el fragmento correspondiente a los aminoácidos 26 a 53 de la SEQ ID NO: 1 y comprende 1 1 cisternas. La SEQ ID NO: 4 es un péptido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1 . La SEQ ID NO: 5 es el fragmento correspondiente a los aminoácidos 1 a 29 de la SEQ ID NO: 4 y comprende 9 cisteínas. La SEQ ID NO: 6 es el fragmento correspondiente a los aminoácidos 30 a 61 de la SEQ ID NO: 4 y comprende 1 1 cisteínas. Therefore, one aspect of the invention refers to an isolated peptide, "peptide of the invention" or "marker of the invention", comprising the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 or any of its fragments comprising 7 or more tanks, preferably comprising 8 or more tanks, more preferably comprising 9 or more tanks. In a preferred embodiment, the peptide of the invention comprises a fragment of SEQ ID NO: 1 comprising 9 tanks. In another preferred embodiment, the peptide of the invention comprises a fragment of SEQ ID NO: 1 comprising 1 1 tanks. In another preferred embodiment, the peptide of the invention comprises an amino acid sequence selected from the list comprising: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 2 is the fragment corresponding to amino acids 1 to 25 of SEQ ID NO: 1 and comprises 9 tanks. SEQ ID NO: 3 is the fragment corresponding to amino acids 26 to 53 of SEQ ID NO: 1 and comprises 1 1 tanks. SEQ ID NO: 4 is a peptide comprising the sequence SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 5 is the fragment corresponding to amino acids 1 to 29 of SEQ ID NO: 4 and comprises 9 cysteines. SEQ ID NO: 6 is the fragment corresponding to amino acids 30 to 61 of SEQ ID NO: 4 and comprises 1 1 cysteines.
El péptido de la invención y sus variantes o derivados pueden ser sintetizados, por ejemplo, aunque sin limitarnos, in vitro. Por ejemplo, mediante la síntesis de péptidos en fase sólida o mediante aproximaciones de ADN recombinante. El péptido de la invención puede producirse recombinantemente, no sólo directamente sino como un polipéptido de fusión junto con un polipéptido heterólogo, el cual puede contener, por ejemplo aunque sin limitarnos, una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de corte para una proteasa, por ejemplo, aunque sin limitarnos, en el extremo N-terminal del polipéptido. The peptide of the invention and its variants or derivatives can be synthesized, for example, but not limited to, in vitro. For example, by solid phase peptide synthesis or by recombinant DNA approaches. The peptide of the invention can produced recombinantly, not only directly but as a fusion polypeptide together with a heterologous polypeptide, which may contain, for example, but not limited to, a signal sequence or other polypeptide having a cleavage site for a protease, for example, but without limit ourselves, at the N-terminal end of the polypeptide.
El péptido de la invención puede presentar variantes. Estas variantes se refieren a variaciones limitadas en la secuencia aminoacídica, que permiten el mantenimiento de la funcionalidad del péptido. Esto quiere decir que la secuencia de referencia y la secuencia de la variante son similares en conjunto, e idénticas en muchas regiones. Estas variaciones se generan por sustituciones, deleciones o adiciones. Dichas sustituciones son por aminoácidos conservados. Los aminoácidos conservados son aminoácidos que tienen cadenas laterales y propiedades similares en cuanto a, por ejemplo, hidrofobicidad o aromaticidad. Estas sustituciones son entre serina (Ser) y treonina (Thr), y/o entre los aminoácidos que componen el grupo alanina (Ala), leucina (Leu), valina (Val) e isoleucina (lie). Las variaciones pueden ser variaciones generadas artificialmente como, por ejemplo, mediante mutagénesis o síntesis directa. Estas variaciones no provocan modificaciones esenciales en las características o propiedades esenciales del péptido. Por ello, dentro del alcance de la presente invención también se incluyen los péptidos o polipéptidos cuya secuencia de aminoácidos sea idéntica u homologa, en el sentido descrito en este párrafo, a las secuencias descritas en la presente invención. The peptide of the invention may have variants. These variants refer to limited variations in the amino acid sequence, which allow the maintenance of the functionality of the peptide. This means that the reference sequence and the variant sequence are similar as a whole, and identical in many regions. These variations are generated by substitutions, deletions or additions. These substitutions are conserved amino acids. The conserved amino acids are amino acids that have similar side chains and properties in terms of, for example, hydrophobicity or aromaticity. These substitutions are between serine (Ser) and threonine (Thr), and / or between the amino acids that make up the alanine (Ala), leucine (Leu), valine (Val) and isoleucine (lie) group. Variations can be artificially generated variations, such as by mutagenesis or direct synthesis. These variations do not cause essential modifications in the essential characteristics or properties of the peptide. Therefore, peptides or polypeptides whose amino acid sequence is identical or homologous, in the sense described in this paragraph, to the sequences described in the present invention are also included within the scope of the present invention.
En otra realización preferida, el péptido de la invención se encuentra fusionado a una proteína, de ahora en adelante "péptido de la invención fusionado a una proteína". El término "proteína", tal y como se utiliza en la presente invención, se refiere a cualquier péptido o polipéptido de interés cuya localización por microscopía se desee llevar a cabo, e incluye cualquier macromolécula intracelular, extracelular o viral, formada por una cadena lineal de aminoácidos. Este término incluye, sin limitarse, tanto las proteínas simples como las conjugadas o heteroproteínas y se refiere por ejemplo, aunque sin limitarnos, a proteínas estructurales, reguladoras (como por ejemplo, aunque sin limitarnos, hormonas), transportadoras, defensivas (como por ejemplo, aunque sin limitarnos, anticuerpos), enzimáticas o contráctiles. In another preferred embodiment, the peptide of the invention is fused to a protein, hereinafter "peptide of the invention fused to a protein". The term "protein", as used in the present invention, refers to any peptide or polypeptide of interest whose microscopy location is to be carried out, and includes any intracellular, extracellular or viral macromolecule, formed by a linear chain of amino acids. This term includes, without limitation, both simple and conjugated proteins or heteroproteins and refers for example, but not limited to, structural, regulatory proteins (such as, but not limited to, hormones), transporters, defensive (such as , but not limited to antibodies), enzymatic or contractile.
En otra realización preferida, el péptido de la invención se encuentra fusionado a una proteína marcadora, de ahora en adelante "péptido de la invención fusionado a una proteína marcadora". En una realización más preferida, el péptido de la invención se encuentra fusionado a una proteína y a una proteína marcadora, de ahora en adelante "péptido de la invención fusionado a una proteína y a una proteína marcadora". Se entiende por "proteína marcadora" o "proteína repórter" cualquier proteína que proporciona, al sistema donde se expresa, características identificables visualmente, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, fluorescencia o luminiscencia. Ejemplos de proteínas marcadoras son, aunque sin limitarnos, β-galactosidasa, luciferasa, GUS (β-glucuronidasa) o proteínas fluorescentes derivadas de la GFP, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, Green Fluorescent Protein o proteína verde fluorescente (GFP), Red Fluorescent Protein o proteína roja fluorescente (RFP), Cyan Fluorescent Protein o proteína cyan fluorescente (CFP), Yellow Fluorescent Protein o proteína amarilla fluorescente (YFP) o Blue Fluorescent Protein o proteína azul fluorescente (BFP). En una realización aun más preferida de este aspecto de la invención, la proteína marcadora es GFP, la cual es una proteína de 238 aminoácidos (26,9 kDa) aislada de la medusa Aequorea victoria que emite fluorescencia de color verde al ser expuesta a luz azul. La fusión proteica es una técnica que se emplea frecuentemente en biología molecular y que puede llevarse a cabo mediante técnicas conocidas por un experto en la materia. Habitualmente está relacionada con la producción de proteínas en sistemas vivos, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, en células (tanto procariotas, como las bacterias, como eucariotas, como las levaduras, células de mamífero o células de insecto), en orgánulos celulares o en virus. La fusión proteica consiste en el clonaje de la secuencia codificante de una proteína de interés en un extremo, preferiblemente el extremo 3' (extremo carboxilo), de otro péptido. La inclusión de la secuencia codificante de la proteína de interés ha de realizarse en fase, respetando la pauta de lectura, de manera que permita la producción de una proteína quimérica, que en el caso de la presente invención consistiría, aunque sin limitarnos, en el péptido de la invención fusionado a una proteína, en el péptido de la invención fusionado a una proteína marcadora, o en el péptido de la invención fusionado a una proteína y a una proteína marcadora. El péptido de la invención carece de estructura secundaria y se pliega al unir átomos de metal . Dicha unión es, preferiblemente, de tipo iónico entre los átomos de metal y los residuos de cisteína de dicho péptido, aunque también átomos de metal adicionales pueden incorporarse al grupo de átomos de metal ya unidos al péptido de la invención, dichos átomos de metal adicionales se unen covalentemente entre ellos y a los átomos que ya están unidos a las cisternas del péptido de la invención. Por ello, en otra realización preferida, el péptido de la invención además comprende unido un grupo de átomos de metal, "péptido de la invención unido a un grupo de átomos de metal". Los metales que pueden unirse al péptido de la invención son, aunque sin limitarnos, todos aquellos útiles para llevar a cabo mareajes en microscopía electrónica, preferiblemente, metales pesados. Así, en una realización más preferida, el metal se selecciona de la lista que comprende: oro (Au), plata (Ag), mercurio (Hg), cadmio (Cd), zinc (Zn), platino (Pt) o bismuto (Bi). En una realización aun más preferida, el metal es oro. El tamaño del "grupo de átomos de metal" unido al péptido de la invención es, como mínimo, el necesario para que las técnicas de microscopía electrónica lo detecten. Dicho tamaño, así como el número de átomos de metal que forman el grupo y su estabilidad durante la irradiación en el microscopio electrónico se pueden monitorizar mediante por ejemplo, aunque sin limitarnos, microscopía electrónica, espectrometría de masas o técnicas espectroscópicas. In another preferred embodiment, the peptide of the invention is fused to a marker protein, hereinafter "peptide of the invention fused to a marker protein". In a more preferred embodiment, the peptide of the invention is fused to a protein and a marker protein, hereinafter "peptide of the invention fused to a protein and a marker protein". "Marker protein" or "reporter protein" means any protein that provides, to the system where it is expressed, visually identifiable characteristics, such as, but not limited to, fluorescence or luminescence. Examples of marker proteins are, but are not limited to, β-galactosidase, luciferase, GUS (β-glucuronidase) or fluorescent proteins derived from GFP, such as, but not limited to, Green Fluorescent Protein or Green Fluorescent Protein (GFP), Red Fluorescent Protein or Fluorescent Red Protein (RFP), Cyan Fluorescent Protein or Cyan Fluorescent Protein (CFP), Yellow Fluorescent Protein or Yellow Fluorescent Protein (YFP) or Blue Fluorescent Protein or Blue Fluorescent Protein (BFP). In an even more preferred embodiment of this aspect of the invention, the marker protein is GFP, which is a 238 amino acid (26.9 kDa) protein isolated from the Aequorea victoria jellyfish that emits green fluorescence when exposed to light. blue. Protein fusion is a technique that is frequently used in molecular biology and can be carried out by techniques known to a person skilled in the art. It is usually related with the production of proteins in living systems, such as, but not limited to, in cells (both prokaryotes, bacteria, eukaryotes, yeasts, mammalian cells or insect cells), cell organelles or viruses. Protein fusion consists in cloning the coding sequence of a protein of interest at one end, preferably the 3 'end (carboxyl end), of another peptide. The inclusion of the coding sequence of the protein of interest must be carried out in phase, respecting the reading pattern, so as to allow the production of a chimeric protein, which in the case of the present invention would consist, although not limited, in the peptide of the invention fused to a protein, in the peptide of the invention fused to a marker protein, or in the peptide of the invention fused to a protein and a marker protein. The peptide of the invention has no secondary structure and is folded by joining metal atoms. Said union is preferably of the ionic type between the metal atoms and the cysteine residues of said peptide, although additional metal atoms can also be incorporated into the group of metal atoms already attached to the peptide of the invention, said additional metal atoms they covalently bind to each other and to the atoms that are already attached to the peptide tanks of the invention. Therefore, in another preferred embodiment, the peptide of the invention further comprises attached a group of metal atoms, "peptide of the invention attached to a group of metal atoms". The metals that can be attached to the peptide of the invention are, but not limited to, all those useful for carrying out electron microscopy, preferably, heavy metals. Thus, in a more preferred embodiment, the metal is selected from the list comprising: gold (Au), silver (Ag), mercury (Hg), cadmium (Cd), zinc (Zn), platinum (Pt) or bismuth ( Bi). In an even more preferred embodiment, the metal is gold. The size of the "group of metal atoms" attached to the peptide of the invention is, at a minimum, that necessary for electron microscopy techniques to detect. Said size, as well as the number of metal atoms that form the group and their stability during irradiation in the electron microscope can be monitored by, for example, but not limited to, electron microscopy, mass spectrometry or spectroscopic techniques.
Otro aspecto de la invención se refiere a una secuencia nucleotídica aislada, de ahora en adelante "secuencia nucleotídica de la invención", que codifica para al menos un péptido de la invención, preferiblemente para al menos un péptido de la invención fusionado a una proteína, más preferiblemente para al menos un péptido de la invención fusionado a una proteína marcadora y aun más preferiblemente para al menos un péptido de la invención fusionado a una proteína y a una proteína marcadora, donde dicha proteína marcadora es, preferiblemente, GFP. Another aspect of the invention relates to an isolated nucleotide sequence, hereinafter "nucleotide sequence of the invention", which codes for at least one peptide of the invention, preferably for at least one peptide of the invention fused to a protein, more preferably for at least one peptide of the invention fused to a marker protein and even more preferably for at least one peptide of the invention fused to a protein and a marker protein, wherein said marker protein is preferably GFP.
En una realización preferida, la secuencia nucleotídica de la invención codifica para más de un péptido de la invención de diferente tamaño entre sí, más preferiblemente para más de un péptido de la invención de diferente tamaño entre sí fusionados cada uno de ellos a una proteína diferente, aun más preferiblemente para más de un péptido de la invención de diferente tamaño entre sí fusionados cada uno de ellos a una proteína marcadora de diferente color y aun más preferiblemente para más de un péptido de la invención de diferente tamaño entre sí fusionados cada uno de ellos a una proteína diferente y a una proteína marcadora de diferente color. De esta manera, la secuencia nucleotídica de la invención es útil para la detección tanto de una como de varias proteínas simultáneamente por microscopía, preferiblemente electrónica o correlativa, cuando es clonada en un sistema vivo. Debido a la degeneración del código genético, en el cual diversos tripletes de nucleótidos dan lugar a un mismo aminoácido, existen diversas secuencias de nucleótidos que dan lugar a una misma secuencia aminoacídica. In a preferred embodiment, the nucleotide sequence of the invention encodes for more than one peptide of the invention of different size from each other, more preferably for more than one peptide of the invention of different size each fused together to a different protein. , even more preferably for more than one peptide of the invention of different size from each other fused each to a marker protein of different color and even more preferably for more than one peptide of the invention of different size fused to each other. they to a different protein and a different color marker protein. Thus, the nucleotide sequence of the invention is useful for the detection of both one and several proteins simultaneously by microscopy, preferably electronically or correlatively, when cloned into a living system. Due to the degeneracy of the genetic code, in which several nucleotide triplets give rise to the same amino acid, there are several nucleotide sequences that give rise to the same amino acid sequence.
Los términos "secuencia nucleotídica", "secuencia de nucleótidos", "ácido nucleico", "oligonucleótido" y "polinucleótido" se usan aquí de manera intercambiable y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud que pueden estar o no química o bioquímicamente modificados. Se refieren, por tanto, a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, tanto de cadena sencilla como de doble hebra. The terms "nucleotide sequence", "nucleotide sequence", "nucleic acid", "oligonucleotide" and "polynucleotide" are used interchangeably herein and refer to a polymeric form of nucleotides of any length that may or may not be chemical or biochemically modified. They refer, therefore, to any polyiribonucleotide or polydeoxyribonucleotide, both single-stranded and double-stranded.
La secuencia nucleotídica de la invención puede obtenerse de manera artificial mediante métodos de clonación y selección convencional, o mediante secuenciación. The nucleotide sequence of the invention can be obtained artificially by conventional cloning and selection methods, or by sequencing.
Dicha secuencia nucleotídica, adicionalmente a la secuencia codificante, puede llevar otros elementos, como por ejemplo aunque sin limitarse, intrones, secuencias no codificantes en los extremos 5' o 3', sitios de unión a ribosomas, o secuencias estábil izadoras. Estos polinucleótidos adicionalmente pueden incluir secuencias codificantes para aminoácidos adicionales que puedan ser útiles, por ejemplo, aunque sin limitarse, para aumentar la estabilidad del péptido generado a partir de ellos o para permitir una mejor purificación del mismo. Said nucleotide sequence, in addition to the coding sequence, can carry other elements, such as, but not limited to, introns, non-coding sequences at the 5 'or 3' ends, ribosome binding sites, or stabilizing sequences. These polynucleotides can additionally include coding sequences for additional amino acids that may be useful, for example, but not limited, to increase the stability of the peptide generated from them or to allow a better purification thereof.
Otro aspecto de la invención se refiere a un vector de expresión, de ahora en adelante, "vector de la invención", que comprende la secuencia nucleotídica de la invención. El término "vector de expresión", tal y como se utiliza en la presente invención, se refiere a una molécula de ADN en la que se puede integrar un polinucleótido sin que pierda la capacidad de autorreplicación, donde dicho polinucleótido se encuentra, generalmente, unido operativamente a secuencias control. Ejemplos de vectores de expresión son, pero sin limitarse, plásmidos, cósmidos, fagémidos, fagos de ADN, cromosomas artificiales de levadura (YAC), cromosomas artificiales de bacterias (BAC), cromosomas humanos artificiales (HAC), vectores virales, tales como adenovirus, retrovirus o cualquier otro tipo de molécula de ADN o ARN con capacidad para replicarse en el interior de una célula, procariota o eucariota. Another aspect of the invention relates to an expression vector, hereinafter, "vector of the invention", which comprises the nucleotide sequence of the invention. The term "expression vector", as used in the present invention, refers to a DNA molecule in which a polynucleotide can be integrated without losing self-replication capacity, where said polynucleotide is generally bound Operationally to control sequences. Vector examples of Expression are, but are not limited to, plasmids, cosmids, phagemids, DNA phages, artificial yeast chromosomes (YAC), artificial bacterial chromosomes (BAC), artificial human chromosomes (HAC), viral vectors, such as adenovirus, retrovirus or any another type of DNA or RNA molecule with the ability to replicate inside a cell, prokaryotic or eukaryotic.
Otro aspecto de la invención se refiere a una célula, de ahora en adelante "célula de la invención", que comprende de forma transitoria o de forma estable el péptido de la invención, la secuencia nucleotídica de la invención o el vector de la invención. La célula de la invención puede ser tanto eucariota como procariota, aunque preferiblemente es una célula eucariota. El término "expresión transitoria" se refiere a la expresión temporal del péptido de la invención, de la secuencia nucleotídica de la invención o del vector de la invención en la célula. El término "expresión estable" se refiere a la expresión permanente del péptido de la invención, de la secuencia nucleotídica de la invención o del vector de la invención en la célula. El péptido de la invención une átomos de metal plegándose a su alrededor, por lo que una vez expresado in vivo en células, preferiblemente, eucariotas, en orgánulos celulares purificados o en virus, fusionado a la proteína de interés, la proteína quimera así expresada forma partículas densas a los electrones siguiendo los protocolos descritos en la presente invención para tratar las células vivas, orgánulos o virus con un metal, preferiblemente, con sales de oro. Las muestras pueden entonces ser procesadas para su visualización en microscopía, preferiblemente correlativa o electrónica 2D o 3D, y las partículas densas a los electrones indican la localización precisa de las moléculas de la proteína quimérica dentro de las células, orgánulos o virus. Por ello, otro aspecto de la invención se refiere al uso del péptido de la invención, de la secuencia nucleotídica de la invención, del vector de la invención o de la célula de la invención para la detección de al menos una proteína mediante microscopía. El término "microscopía" se refiere a la técnica empleada para producir imágenes visibles aumentadas de cualquier estructura. Ejemplos de microscopía son, aunque sin limitarnos, microscopía óptica, por ejemplo, aunque sin limitarnos, microscopía óptica de campo brillante, de campo oscuro, de contraste de fases, microscopía diferencial de contraste de interferencia o DIC, de fluorescencia o confocal; microscopía electrónica, por ejemplo, aunque sin limitarnos, de barrido o de transmisión; o microscopía correlativa. Por ello, en una realización preferida de este aspecto de la invención, la microscopía es electrónica o correlativa. Se entiende por "microscopía correlativa" la técnica basada en el empleo de abordajes experimentales que permitan visualizar una muestra a dos niveles de observación, por ejemplo, aunque sin limitarnos, microscopía óptica y microscopía electrónica. Preferiblemente, la microscopía correlativa, tal y como se entiende en la presente invención, consiste en un primer análisis de la muestra por microscopía de fluorescencia y un segundo análisis de la muestra por microscopía electrónica. Se entiende por "microscopía electrónica" tanto la microscopía electrónica de transmisión (MET) como la de barrido (SEM) y tanto la microscopía electrónica 2D como la microscopía electrónica 3D. Another aspect of the invention relates to a cell, hereafter referred to as "cell of the invention", which transiently or stably comprises the peptide of the invention, the nucleotide sequence of the invention or the vector of the invention. The cell of the invention can be both eukaryotic and prokaryotic, although preferably it is a eukaryotic cell. The term "transient expression" refers to the temporary expression of the peptide of the invention, of the nucleotide sequence of the invention or of the vector of the invention in the cell. The term "stable expression" refers to the permanent expression of the peptide of the invention, of the nucleotide sequence of the invention or of the vector of the invention in the cell. The peptide of the invention binds metal atoms by folding around it, so that once expressed in vivo in cells, preferably, eukaryotes, in purified cell organelles or in viruses, fused to the protein of interest, the chimera protein thus expressed forms electron-dense particles following the protocols described in the present invention to treat living cells, organelles or viruses with a metal, preferably, with gold salts. Samples can then be processed for microscopic visualization, preferably correlative or 2D or 3D electronics, and electron-dense particles indicate the precise location of the chimeric protein molecules within cells, organelles or viruses. Therefore, another aspect of the invention relates to the use of the peptide of the invention, of the nucleotide sequence of the invention, of the vector of the invention or of the cell of the invention for the detection of at least one protein by microscopy. The term "microscopy" refers to the technique used to produce enlarged visible images of any structure. Examples of microscopy are, but are not limited to, optical microscopy, for example, but not limited to, bright field, dark field, phase contrast optical microscopy, differential interference contrast or DIC, fluorescence or confocal microscopy; electron microscopy, for example, but not limited to scanning or transmission; or correlative microscopy. Therefore, in a preferred embodiment of this aspect of the invention, the microscopy is electronic or correlative. "Correlative microscopy" means the technique based on the use of experimental approaches that allow viewing a sample at two levels of observation, for example, but not limited to optical microscopy and electron microscopy. Preferably, correlative microscopy, as understood in the present invention, consists of a first analysis of the sample by fluorescence microscopy and a second analysis of the sample by electron microscopy. "Electron microscopy" means both transmission electron microscopy (MET) and scanning electron microscopy (SEM) and both 2D electron microscopy and 3D electron microscopy.
La detección de dicha proteína mediante microscopía, además puede comprender la obtención de al menos una imagen elemental mediante espectroscopia. Mediante este análisis conjunto, se consigue una forma de visualización que permite aumentar considerablemente la sensibilidad de detección en comparación con la proporcionada únicamente por la técnica microscópica. The detection of said protein by microscopy can also comprise obtaining at least one elementary image by spectroscopy. Through this joint analysis, a form of visualization is achieved that allows the detection sensitivity to be considerably increased compared to that provided only by the microscopic technique.
En microscopía electrónica de transmisión convencional, no todos los metales se visualizan bien como partículas densas a los electrones. Concretamente, el oro es uno de los elementos más usados ya que es uno de los metales que mejor se puede visualizar por este tipo de microscopía. Por tanto, una de las ventajas principales de la imagen elemental es que permite visualizar otros metales distintos de oro, sean densos o no a los electrones. In conventional transmission electron microscopy, not all metals are well visualized as electron dense particles. Specifically, gold is one of the most used elements since it is one of the metals that can best be visualized by this type of microscopy. Therefore, one of the main advantages of the elementary image is that it allows visualizing other metals other than gold, whether or not they are dense to electrons.
Preferentemente, dicha imagen elemental puede obtenerse mediante espectroscopia electrónica de pérdida de energía (EELS, del inglés Electron Energy-Loss Spectroscopy) o mediante espectroscopia de rayos X. En realizaciones preferidas, la obtención de la imagen elemental se realiza con equipos espectroscópicos que están acoplados a determinados modelos de microscopios electrónicos. Preferably, said elementary image can be obtained by electronic energy loss spectroscopy (EELS) or by X-ray spectroscopy. In preferred embodiments, the elementary image is obtained with spectroscopic equipment that is coupled to certain models of electronic microscopes.
De manera preferida, la imagen elemental puede ser una imagen elemental de oro, una imagen elemental de plata, una imagen elemental de mercurio, una imagen elemental de cadmio, una imagen elemental de zinc, una imagen elemental de platino o una imagen elemental de bismuto. En una realización preferida, la imagen elemental es una imagen elemental de oro (también referida en la memoria como "imagen de oro" "imagen oro" o "mapa oro"). Preferably, the elementary image may be an elementary image of gold, an elementary image of silver, an elementary image of mercury, an elementary image of cadmium, an elementary image of zinc, an elementary image of platinum or an elementary image of bismuth . In a preferred embodiment, the elementary image is an elementary image of gold (also referred to in memory as "gold image" "gold image" or "gold map").
En concreto, en el caso del oro, la detección es muy específica porque en el espectro de pérdida de energía no solapan otros elementos de la tabla periódica. De este modo, cuando el metal es oro, la obtención de imágenes elementales (en este caso una imagen de oro) permite además la detección de las partículas de oro en muestras teñidas con sales de metales pesados (que las enmascaran en la imagen de MET convencional), permitiendo por tanto la obtención de imágenes de alto contraste y el estudio detallado de la distribución de las moléculas de proteína junto con la visualización simultánea de la ultraestructura celular. Esto permite obtener muchos más detalles sobre la localización subcelular de las proteínas que llevan el marcador-oro. Por otro lado, la capacidad del péptido de la invención para unir grupos de átomos de metal que se pueden detectar permite el diseño de biosensores destinados a detectar la presencia de átomos de metal en un medio determinado, preferiblemente en medios líquidos. Este biosensor puede construirse, por ejemplo, aunque sin limitarnos, mediante la suspensión, o bien mediante la inmovilización en un soporte sólido, del péptido de la invención, el cual tras ser expuesto al medio o suspensión objeto de estudio es capaz de captar los átomos de metal presentes en el mismo y de formar partículas fácilmente detectables mediante, por ejemplo, aunque sin limitarnos, técnicas microscópicas o espectroscópicas, espectrometría de masas o resonancia magnética nuclear. Specifically, in the case of gold, the detection is very specific because other elements of the periodic table do not overlap in the energy loss spectrum. Thus, when the metal is gold, obtaining elementary images (in this case a gold image) also allows the detection of gold particles in samples stained with heavy metal salts (which mask them in the MET image conventional), thus allowing high contrast imaging and detailed study of the distribution of protein molecules together with simultaneous visualization of cell ultrastructure. This allows to obtain many more details about the subcellular localization of the proteins that carry the gold-marker. On the other hand, the ability of the peptide of the invention to bind groups of metal atoms that can be detected allows the design of biosensors intended to detect the presence of metal atoms in a given medium, preferably in liquid media. This biosensor can be constructed, for example, but not limited to, by suspending, or by immobilizing on a solid support, the peptide of the invention, which after being exposed to the medium or suspension under study is able to capture the atoms of metal present therein and of forming particles easily detectable by, for example, but not limited to microscopic or spectroscopic techniques, mass spectrometry or nuclear magnetic resonance.
Así, otro aspecto de la invención se refiere al uso del péptido de la invención para la detección de metales. Preferiblemente, el péptido de la invención se encuentra fusionado a una proteína, más preferiblemente el péptido de la invención se encuentra fusionado a una proteína marcadora y aun más preferiblemente el péptido de la invención se encuentra fusionado a una proteína y a una proteína marcadora, donde dicha proteína marcadora es, preferiblemente, GFP. Thus, another aspect of the invention relates to the use of the peptide of the invention for the detection of metals. Preferably, the peptide of the invention is fused to a protein, more preferably the peptide of the invention is fused to a marker protein and even more preferably the peptide of the invention is fused to a protein and a marker protein, wherein said marker protein is preferably GFP.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método de detección de al menos una proteína por microscopía, de ahora en adelante "método de la invención", que comprende: a. expresar al menos un péptido de la invención fusionado a una proteína, o fusionado a una proteína marcadora o fusionado a una proteína y a una proteína marcadora, donde dicha proteína marcadora es, preferiblemente, GFP, en una célula, en un orgánulo celular o en un virus, Another aspect of the invention relates to a method of detecting at least one protein by microscopy, hereafter "method of the invention", comprising: a. expressing at least one peptide of the invention fused to a protein, or fused to a marker protein or fused to a protein and a marker protein, wherein said marker protein is preferably GFP, in a cell, in a cellular organelle or in a virus,
b. tratar la célula, el orgánulo celular o el virus del paso (a) con un metal, y c. analizar la célula, el orgánulo celular o el virus del paso (b) mediante microscopía. b. treat the cell, cell organelle or virus of step (a) with a metal, and C. analyze the cell, the cellular organelle or the virus of step (b) by microscopy.
Los ejemplos de la presente invención muestran que proteínas fusionadas a la MT o a uno de sus dos dominios, alfa o beta, forman partículas densas a los electrones dentro de las células, eucariotas o procariotas, orgánulos celulares o virus siguiendo los pasos comprendidos en el método de la invención. Esto demuestra que, además del péptido de la invención, también la MT o sus fragmentos son útiles en el método de la invención para la detección de al menos una proteína por microscopía cuando ésta se expresa en una célula, tanto eucariota como procariota, en un orgánulo celular o en un virus, fusionada a la proteína de interés. The examples of the present invention show that proteins fused to the MT or to one of its two domains, alpha or beta, form dense particles to the electrons within the cells, eukaryotes or prokaryotes, cellular organelles or viruses following the steps included in the method of the invention. This demonstrates that, in addition to the peptide of the invention, also the MT or its fragments are useful in the method of the invention for the detection of at least one protein by microscopy when it is expressed in a cell, both eukaryotic and prokaryotic, in a cellular organelle or in a virus, fused to the protein of interest.
Por tanto, en una realización preferida de este aspecto de la invención, en el paso (a) del método de la invención se expresa, en una célula, en un orgánulo celular o en un virus, al menos una copia de MT o de cualquiera de sus fragmentos que comprenda 7 o más cisternas, fusionada a una proteína, o fusionada a una proteína marcadora o fusionada a una proteína y a una proteína marcadora, donde dicha proteína marcadora es, preferiblemente, GFP. Preferiblemente, el fragmento de la MT comprende 8 o más cisternas, más preferiblemente comprende 9 o más cisternas, aun más preferiblemente el fragmento de la MT es el dominio beta de esta proteína, el cual comprende 9 cisteínas, o alternativamente, el fragmento de la MT es el dominio alfa de esta proteína, el cual comprende 1 1 cisteínas. Therefore, in a preferred embodiment of this aspect of the invention, in step (a) of the method of the invention it is expressed, in a cell, in a cellular organelle or in a virus, at least one copy of MT or any of its fragments comprising 7 or more cisterns, fused to a protein, or fused to a marker protein or fused to a protein and a marker protein, wherein said marker protein is preferably GFP. Preferably, the MT fragment comprises 8 or more cisterns, more preferably it comprises 9 or more cisterns, even more preferably the MT fragment is the beta domain of this protein, which comprises 9 cysteines, or alternatively, the fragment of the MT is the alpha domain of this protein, which comprises 1 1 cysteines.
En el contexto de la presente invención se entiende por "metalotioneína" o "MT" la familia de proteínas de 60 a 62 aminoácidos, ricas en residuos de cisteína, de bajo peso molecular, preferiblemente en un rango de entre 500 y 14.000 Da, que presentan capacidad de unión a metales pesados, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, zinc, cobre, selenio, cadmio, mercurio, plata, arsénico u oro, a través del grupo tiol de sus residuos de cisteína. La MT puede ser identificada mediante métodos basados en su caracterización química y/o funcional tales como, por ejemplo, aunque sin limitarnos, los descritos en Blindauer, C. A. y Leszczyszyn, O. I., 2010, Natural Product Reports, 27: 720-741 . Un ejemplo de MT es, aunque sin limitarnos, la MT1 de ratón de número de acceso en el GenBank AAH36990.1 , cuyo dominio beta comprende los aminoácidos 1 -29 de los cuales 9 son cisternas y cuyo dominio alfa comprende los aminoácidos 30-61 de los cuales 1 1 son cisternas; o la MT1 A humana de número de acceso en el GenBank NP-005937. In the context of the present invention, "metallothionein" or "MT" means the family of proteins of 60 to 62 amino acids, rich in cysteine residues, of low molecular weight, preferably in a range of between 500 and 14,000 Da, which they have the ability to bind heavy metals, such as, but not limited to, zinc, copper, selenium, cadmium, mercury, silver, arsenic or gold, through the thiol group of their waste cysteine MT can be identified by methods based on its chemical and / or functional characterization such as, for example, but not limited to, those described in Blindauer, CA and Leszczyszyn, OI, 2010, Natural Product Reports, 27: 720-741. An example of MT is, but not limited to, the mouse MT1 accession number in GenBank AAH36990.1, whose beta domain comprises amino acids 1-29 of which 9 are cisterns and whose alpha domain comprises amino acids 30-61 of which 1 1 are cisterns; or the human MT1 A access number in GenBank NP-005937.
La MT o sus fragmentos pueden presentar variantes. Estas variantes se refieren a variaciones limitadas en la secuencia aminoacídica, que permiten el mantenimiento de la funcionalidad de la MT o de sus fragmentos. Esto quiere decir que la secuencia de referencia y la secuencia de la variante son similares en conjunto, e idénticas en muchas regiones. Estas variaciones se generan por sustituciones, deleciones o adiciones. Dichas sustituciones son por aminoácidos conservados. Los aminoácidos conservados son aminoácidos que tienen cadenas laterales y propiedades similares en cuanto a, por ejemplo, hidrofobicidad o aromaticidad. Estas sustituciones incluyen, aunque sin limitarse, sustituciones entre ácido glutámico (Glu) y ácido aspártico (Asp), entre lisina (Lys) y arginina (Arg), entre asparagina (Asn) y glutamina (Gln), entre serina (Ser) y treonina (Thr), y/o entre los aminoácidos que componen el grupo alanina (Ala), leucina (Leu), valina (Val) e isoleucina (lie). Las variaciones pueden ser variaciones generadas artificialmente como, por ejemplo, mediante mutagénesis o síntesis directa. Estas variaciones no provocan modificaciones sustanciales en las características o propiedades esenciales de la MT o de sus fragmentos. Por ello, dentro del alcance de la presente invención también se incluyen los péptidos o polipéptidos cuya secuencia de aminoácidos sea idéntica u homologa a las secuencias de la MT o de cualquiera de sus fragmentos que comprenda 7 o más cisternas. La expresión en el paso (a) del método de la invención se puede llevar a cabo mediante, por ejemplo, aunque sin limitarnos, la clonación de la secuencia nucleotídica de la invención codificante para al menos un péptido de la invención fusionado a una proteína, o para al menos un péptido de la invención fusionado a una proteína marcadora o para al menos un péptido de la invención fusionado a una proteína y a una proteína marcadora, donde dicha proteína marcadora es, preferiblemente, GFP, en una célula, eucariota o procariota, o en un virus; o bien mediante la clonación del vector de la invención que comprende dicha secuencia nucleotídica en una célula, eucariota o procariota, o en un virus. The MT or its fragments may have variants. These variants refer to limited variations in the amino acid sequence, which allow the maintenance of the functionality of the MT or its fragments. This means that the reference sequence and the variant sequence are similar as a whole, and identical in many regions. These variations are generated by substitutions, deletions or additions. These substitutions are conserved amino acids. The conserved amino acids are amino acids that have similar side chains and properties in terms of, for example, hydrophobicity or aromaticity. These substitutions include, but are not limited to, substitutions between glutamic acid (Glu) and aspartic acid (Asp), between lysine (Lys) and arginine (Arg), between asparagine (Asn) and glutamine (Gln), between serine (Ser) and threonine (Thr), and / or among the amino acids that make up the alanine (Ala), leucine (Leu), valine (Val) and isoleucine (lie) group. Variations can be artificially generated variations, such as by mutagenesis or direct synthesis. These variations do not cause substantial changes in the essential characteristics or properties of the MT or its fragments. Therefore, peptides or polypeptides whose amino acid sequence is identical or homologous to the sequences of the MT or any of its fragments comprising 7 or more cisterns are also included within the scope of the present invention. The expression in step (a) of the method of the invention can be carried out by, for example, but not limited to, the cloning of the nucleotide sequence of the invention coding for at least one peptide of the invention fused to a protein, or for at least one peptide of the invention fused to a marker protein or for at least one peptide of the invention fused to a protein and a marker protein, wherein said marker protein is preferably GFP, in a cell, eukaryotic or prokaryotic, or in a virus; or by cloning the vector of the invention comprising said nucleotide sequence in a cell, eukaryotic or prokaryotic, or in a virus.
Los orgánulos celulares que expresan al menos un péptido de la invención fusionado a una proteína, o fusionado a una proteína marcadora o fusionado a una proteína y a una proteína marcadora, donde dicha proteína marcadora es, preferiblemente, GFP, pueden purificarse o aislarse a partir de células en las que se ha llevado a cabo la expresión de dicho péptido como se ha explicado anteriormente. Cellular organelles expressing at least one peptide of the invention fused to a protein, or fused to a marker protein or fused to a protein and a marker protein, wherein said marker protein is preferably GFP, can be purified or isolated from cells in which the expression of said peptide has been carried out as explained above.
En el caso de que en el paso (a) del método de la invención se exprese, en una célula o en un virus, al menos una copia de MT o de cualquiera de sus fragmentos que comprenda 7 o más cisternas, fusionada a una proteína, o fusionada a una proteína marcadora o fusionada a una proteína y a una proteína marcadora, dicha expresión podría llevarse a cabo mediante, por ejemplo, aunque sin limitarnos, la clonación de una secuencia nucleotídica codificante para al menos una copia de MT, o para al menos uno de sus fragmentos que comprenda 7 o más cisternas, fusionada a una proteína, o a una proteína marcadora o a una proteína y a una proteína marcadora, donde dicha proteína marcadora es, preferiblemente, GFP, en una célula, eucariota o procariota, o en un virus; o bien mediante la clonación de un vector de expresión que comprende dicha secuencia nucleotídica en una célula, eucariota o procariota, o en un virus. Los orgánulos celulares que expresan al menos una copia de MT, o de cualquiera de sus fragmentos que comprenda 7 o más cisternas, fusionada a una proteína, o fusionada a una proteína marcadora o fusionada a una proteína y a una proteína marcadora, donde dicha proteína marcadora es, preferiblemente, GFP, pueden purificarse o aislarse a partir de células en las que se ha llevado a cabo la expresión de dicha MT o de dicho fragmento como se ha explicado anteriormente. In the event that in step (a) of the method of the invention it is expressed, in a cell or in a virus, at least one copy of MT or any of its fragments comprising 7 or more cisterns, fused to a protein , or fused to a marker protein or fused to a protein and a marker protein, said expression could be accomplished by, for example, but not limited to, the cloning of a nucleotide sequence coding for at least one copy of MT, or for the minus one of its fragments comprising 7 or more tanks, fused to a protein, or a marker protein or a marker protein, where said marker protein is preferably GFP, in a cell, eukaryotic or prokaryotic, or in a virus; or by cloning an expression vector comprising said nucleotide sequence in a cell, eukaryotic or prokaryotic, or in a virus. Cellular organelles that express at least one copy of MT, or any of its fragments comprising 7 or more tanks, fused to a protein, or fused to a marker protein or fused to a protein and a marker protein, wherein said marker protein It is preferably GFP, they can be purified or isolated from cells in which the expression of said MT or said fragment has been carried out as explained above.
Una "secuencia nucleotídica codificante para al menos una copia de MT" puede obtenerse de manera artificial mediante, por ejemplo, aunque sin limitarnos, métodos de clonación y selección convencional, o mediante secuenciación. Ejemplos de dichas secuencias son, aunque sin limitarnos, la secuencia nucleotídica de número de acceso en el GenBank NM- 005946 codificante para la MT1A humana, o la secuencia nucleotídica de número de acceso en el GenBank NM-013602 codificante para la MT1 de ratón, o la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 7 codificante para la MT1 de ratón, o la secuencia nucleotídica de número de acceso en el GenBank NM-1388261 codificante para la MT1A de rata. A "nucleotide sequence coding for at least one copy of MT" can be obtained artificially by, for example, but not limited to, conventional cloning and selection methods, or by sequencing. Examples of such sequences are, but are not limited to, the nucleotide sequence of access number in GenBank NM-005946 encoding human MT1A, or the nucleotide sequence of access number in GenBank NM-013602 encoding for mouse MT1, or the nucleotide sequence SEQ ID NO: 7 encoding the mouse MT1, or the nucleotide sequence accession number in the GenBank NM-1388261 encoding the rat MT1A.
Una "secuencia nucleotídica codificante para al menos uno de los fragmentos de la MT que comprenda 7 o más cisternas" puede obtenerse de manera artificial mediante, por ejemplo, aunque sin limitarnos, métodos de clonación y selección convencional, o mediante secuenciación.A "nucleotide sequence coding for at least one of the fragments of the MT comprising 7 or more cisterns" can be obtained artificially by, for example, but not limited to, conventional cloning and selection methods, or by sequencing.
Ejemplos de dichas secuencias son, aunque sin limitarnos, la SEQ ID NO:Examples of such sequences are, but not limited to, SEQ ID NO:
8 (secuencia nucleotídica codificante para el dominio beta de la MT1 de ratón que comprende 9 cisteínas), o la SEQ ID NO: 9 (secuencia nucleotídica codificante para el dominio alfa de la MT1 de ratón que comprende 1 1 cisteínas). 8 (nucleotide sequence encoding the beta domain of mouse MT1 comprising 9 cysteines), or SEQ ID NO: 9 (nucleotide sequence encoding the alpha domain of mouse MT1 comprising 1 1 cysteines).
Ejemplos de vectores de expresión que comprenden estas secuencias nucleotídicas, preferiblemente la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 7 codificante para la MT1 de ratón o la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 8 codificante para el dominio beta de la MT1 de ratón son, por ejemplo, aunque sin limitarnos, los descritos en los ejemplos de la presente invención. Examples of expression vectors comprising these nucleotide sequences, preferably the nucleotide sequence SEQ ID NO: 7 encoding the mouse MT1 or the nucleotide sequence SEQ ID NO: 8 encoding the beta domain of the mouse MT1 are, for example, although not limited, those described in the examples of the present invention.
Los metales que pueden emplearse en el tratamiento de la célula, el orgánulo celular o el virus en el paso (b) del método de la invención son, preferiblemente, todos aquellos útiles para llevar a cabo mareajes en microscopía electrónica, más preferiblemente son metales pesados. Por ello, en otra realización preferida, el metal del paso (b) del método de la invención se selecciona de la lista que comprende: oro, plata, mercurio, cadmio, zinc, platino o bismuto. En una realización más preferida, el metal es oro. En una realización aun más preferida, la fuente de oro es cloruro auroso (AuCI), cloruro aúrico (AuCb) o aurotiomalato. The metals that can be used in the treatment of the cell, the cellular organelle or the virus in step (b) of the method of the invention are preferably all those useful for carrying out electronic microscopy markings, more preferably they are heavy metals . Therefore, in another preferred embodiment, the metal of step (b) of the method of the invention is selected from the list comprising: gold, silver, mercury, cadmium, zinc, platinum or bismuth. In a more preferred embodiment, the metal is gold. In an even more preferred embodiment, the gold source is aurous chloride (AuCI), auric chloride (AuCb) or aurothiomalate.
En otra realización preferida, el análisis por microscopía en el paso (c) del método de la invención se lleva a cabo por microscopía correlativa o por microscopía electrónica. En el caso de que el péptido de la invención, o la MT o cualquiera de los fragmentos de la misma que comprenda 7 o más cisteínas, expresado en el paso (a) se encuentre fusionado a una proteína marcadora o a una proteína y a una proteína marcadora, la célula, orgánulo celular o virus donde se expresa se analizan, preferiblemente, por microscopía correlativa. El análisis por microscopía correlativa supone la ventaja de permitir identificar y seleccionar, en un primer paso de análisis microscópico, las células, orgánulos celulares o virus que serán posteriormente analizados por microscopía electrónica en un segundo paso. In another preferred embodiment, the microscopy analysis in step (c) of the method of the invention is carried out by correlative microscopy or by electron microscopy. In the event that the peptide of the invention, or the MT or any fragment thereof comprising 7 or more cysteines, expressed in step (a) is fused to a marker protein or a protein and a marker protein , the cell, cell organelle or virus where it is expressed are preferably analyzed by correlative microscopy. The analysis by correlative microscopy supposes the advantage of allowing to identify and select, in a first step of microscopic analysis, the cells, cellular organelles or viruses that will be subsequently analyzed by electron microscopy in a second step.
Por ello, en otra realización preferida, el péptido del paso (a) es el péptido de la invención fusionado a una proteína marcadora o fusionado a una proteína y a una proteína marcadora, donde dicha proteína marcadora es, preferiblemente, GFP. En una realización más preferida, el método de la invención además comprende analizar la célula, el orgánulo celular o el virus del paso (b) mediante microscopía correlativa. En otra realización preferida, la MT o cualquiera de sus fragmentos que comprenda 7 o más cisternas del paso (a) es la MT, o cualquiera de dichos fragmentos, fusionada a una proteína marcadora o fusionada a una proteína y a una proteína marcadora, donde dicha proteína marcadora es, preferiblemente, GFP. En una realización más preferida, el método de la invención además comprende analizar la célula, el orgánulo celular o el virus del paso (b) mediante microscopía correlativa. Therefore, in another preferred embodiment, the peptide of step (a) is the peptide of the invention fused to a marker protein or fused to a protein and a marker protein, wherein said marker protein is preferably GFP. In a more preferred embodiment, the method of the invention further comprises analyzing the cell, the cellular organelle or the virus of step (b) by correlative microscopy. In another preferred embodiment, the MT or any of its fragments comprising 7 or more tanks of step (a) is the MT, or any of said fragments, fused to a marker protein or fused to a protein and a marker protein, wherein said marker protein is preferably GFP. In a more preferred embodiment, the method of the invention further comprises analyzing the cell, the cellular organelle or the virus of step (b) by correlative microscopy.
Tras el tratamiento del paso (b) del método de la invención, la célula, el orgánulo celular o el virus son procesados para su posterior análisis, preferiblemente, mediante microscopía electrónica, siguiendo, más preferiblemente, cualquiera de los siguientes protocolos: 1 ) fijación química, inclusión en una resina acrílica para microscopía electrónica y obtención de secciones ultrafinas o semifinas en, por ejemplo aunque sin limitarnos, un ultramicrotomo; 2) fijación química, congelación en, por ejemplo aunque sin limitarnos, nitrógeno líquido, y obtención de criosecciones en, por ejemplo aunque sin limitarnos, un crioultramicrotomo, preferiblemente, por el método de Tokuyasu; 3) congelación a alta presión (preferiblemente en el caso de células) o congelación a alta velocidad (preferiblemente en el caso de orgánulos celulares o virus) sin fijación química previa, criosustitución, inclusión en una resina acrílica para microscopía electrónica y obtención de secciones ultrafinas o semifinas en, por ejemplo aunque sin limitarnos, un ultramicrotomo, o de criosecciones vitreas en, por ejemplo, aunque sin limitarnos, un crioultramicrotomo; 4) congelación a alta velocidad y observación directa en un criomicroscopio electrónico (preferiblemente en el caso de orgánulos celulares o virus). After the treatment of step (b) of the method of the invention, the cell, the cellular organelle or the virus is processed for further analysis, preferably, by electron microscopy, following, more preferably, any of the following protocols: 1) fixation chemistry, inclusion in an acrylic resin for electron microscopy and obtaining ultrafine or semi-thin sections in, for example, but not limited to, an ultramicrotome; 2) chemical fixation, freezing in, for example, but not limited to, liquid nitrogen, and obtaining cryosections in, for example, but not limited to, a cryoultramicrotome, preferably, by the Tokuyasu method; 3) high pressure freezing (preferably in the case of cells) or high speed freezing (preferably in the case of cell organelles or viruses) without prior chemical fixation, cryosubstitution, inclusion in an acrylic resin for electron microscopy and obtaining ultrafine sections or semifines in, for example, but not limited to, an ultramicrotome, or of vitreous cryosections in, for example, but not limited to, a cryoultramicrotome; 4) freezing at high speed and direct observation in an electronic cryomicroscope (preferably in the case of cellular organelles or viruses).
Por ello, en otra realización preferida, cuando el análisis por microscopía en el paso (c) se va a realizar por microscopía electrónica, el método de la invención además comprende, entre los pasos (b) y (c), fijar la célula, el orgánulo celular o el virus del paso (b) mediante fijación química o congelación y realizar secciones de entre 20 y 500 nm de la célula, el orgánulo celular o el virus previamente fijados. Therefore, in another preferred embodiment, when the microscopy analysis in step (c) is to be performed by electron microscopy, the method of the invention further comprises, between steps (b) and (c), fix the cell, the cellular organelle or the virus of step (b) by chemical fixation or freezing and making sections of between 20 and 500 nm of the cell, the cell organelle or the virus previously fixed.
Una "resina acrílica para microscopía electrónica" es aquella resina de tipo preferiblemente metacrilato, que una vez polimerizada resulta en un bloque de gran dureza. Ejemplos de resinas acrílicas para microscopía electrónica son, por ejemplo, aunque sin limitarnos, Lowicryl, LR White o LR Gold, todas ellas muy transparentes a los electrones. La "congelación" se puede llevar a cabo, aunque sin limitarnos, en nitrógeno líquido, etano líquido o propano líquido, a alta presión o a alta velocidad a presión atmosférica. An "acrylic resin for electron microscopy" is that resin of preferably methacrylate type, which once polymerized results in a block of great hardness. Examples of acrylic resins for electron microscopy are, for example, but not limited to, Lowicryl, LR White or LR Gold, all of them very transparent to electrons. "Freezing" can be carried out, but not limited to, in liquid nitrogen, liquid ethane or liquid propane, at high pressure or at high speed at atmospheric pressure.
Se entiende por "secciones", aunque sin limitarnos, las secciones ultrafinas, semifinas o criosecciones. Las "secciones ultrafinas" son aquellas de entre preferiblemente 20 y 100 nm de la muestra, que pueden obtenerse, por ejemplo, aunque sin limitarnos, mediante un ultramicrotomo. Las "secciones semifinas" son aquellas de entre preferiblemente 100 y 500 nm de la muestra, que pueden obtenerse, por ejemplo, aunque sin limitarnos, mediante un ultramicrotomo. Las "criosecciones" son aquellas menores de, preferiblemente, 100 nm y pueden obtenerse, por ejemplo, aunque sin limitarnos, mediante un crioultramicrotomo. En otra realización preferida, en la etapa (c) del método de la invención, además de analizar mediante microscopía la célula, el orgánulo celular o el virus del paso (b), comprende analizar dicha célula, orgánulo celular o virus mediante al menos una imagen elemental obtenida por espectroscopia. Este análisis conjunto proporciona una forma de visualización que permite aumentar considerablemente la sensibilidad del método en comparación con la proporcionada únicamente por la técnica microscópica. Preferiblemente, la imagen elemental puede obtenerse mediante espectroscopia electrónica de pérdida de energía o espectroscopia de rayos X. Normalmente se obtienen mediante equipos espectroscópicos que están acoplados a determinados modelos de microscopios electrónicos. "Sections" are understood, but not limited to, ultra-thin, semi-thin or cryosection sections. The "ultrafine sections" are those between preferably 20 and 100 nm of the sample, which can be obtained, for example, but not limited to, by an ultramicrotome. The "semi-thin sections" are those between preferably 100 and 500 nm of the sample, which can be obtained, for example, but not limited to, by an ultramicrotome. The "cryosections" are those less than, preferably, 100 nm and can be obtained, for example, but not limited to, by a cryoultramicrotome. In another preferred embodiment, in step (c) of the method of the invention, in addition to microscopically analyzing the cell, the cellular organelle or the virus of step (b), it comprises analyzing said cell, cellular organelle or virus by at least one elemental image obtained by spectroscopy. This joint analysis provides a form of visualization that considerably increases the sensitivity of the method compared to that provided only by the microscopic technique. Preferably, the elementary image can be obtained by electronic energy loss spectroscopy or X-ray spectroscopy. They are usually obtained by spectroscopic equipment that are coupled to certain models of electron microscopes.
En una realización preferida, la imagen elemental es una imagen elemental del metal del paso (b) empleado en el tratamiento de la célula, del orgánulo celular o del virus. Por tanto, dicha imagen elemental puede ser, preferiblemente, una imagen elemental de oro, una imagen elemental de plata, una imagen elemental de mercurio, una imagen elemental de cadmio, una imagen elemental de zinc, una imagen elemental de platino o una imagen elemental de bismuto. In a preferred embodiment, the elementary image is an elementary image of the metal of step (b) used in the treatment of the cell, cell organelle or virus. Therefore, said elementary image may preferably be an elementary image of gold, an elementary image of silver, an elementary image of mercury, an elementary image of cadmium, an elementary image of zinc, an elementary image of platinum or an elementary image of bismuth.
En otra realización preferida, la imagen elemental es una imagen elemental de oro. In another preferred embodiment, the elementary image is an elementary image of gold.
La situación para cada elemento metálico anterior es diferente y en todos los casos se realiza un proceso de "extracción de ruido". Un "proceso de extracción de ruido" se refiere a un procedimiento que permite eliminar la señal no específica que puede interferir o estar emborronando una imagen obtenida por una técnica microscópica (según la invención), para producir una imagen donde sólo aparece el elemento de interés. Para ello, se emplean diversos métodos, pero uno de los más utilizados consiste en adquirir imágenes adicionales seleccionando pérdidas de energía próximas a la pérdida de energía específica del elemento de interés, anteriores y posteriores a la imagen elemental en el pico del espectro, para posteriormente restarlas de ésta última. A modo de ejemplo, y sin que sirva de limitación, el método más utilizado es el descrito por Egerton (Egerton, R.F. (1996) Electron Energy-Loss Spectroscopy in the Electron Microscope. Plenum Press, New York, USA). En el caso del oro, como se menciona anteriormente, la detección de las partículas de oro es muy específica, ya que el espectro de pérdida de energía permite la detección de dichas partículas incluso en muestras teñidas con sales de otros metales pesados, habitualmente empleadas para la tinción de la muestra y que normalmente las enmascaran en una imagen MET convencional . De este modo, se consigue una imagen de alto contraste que permite el estudio detallado de la distribución de las moléculas de proteína junto con la visualización simultánea de la ultraestructura celular. Y además, permite obtener muchos más detalles sobre la localización subcelular de las proteínas que llevan el marcador- oro. Por ello, en una realización más preferida de la anterior, la imagen elemental es una imagen oro obtenida por espectroscopia electrónica de pérdida de energía. En otra realización preferida, la expresión del péptido de la invención, o de la MT o de cualquiera de los fragmentos de la misma que comprenda 7 o más cisternas, en el paso (a) del método de la invención se realiza en una célula. En una realización más preferida, cuando la expresión en el paso (a) del método de la invención se realiza en una célula, el tratamiento del paso (b) se realiza con cloruro auroso, cloruro aúrico o aurotiomalato a una concentración de entre 0,1 y 50 mM. Preferiblemente, con cloruro auroso, cloruro aúrico o aurotiomalato a una concentración de 0,1 , 0,5, 1 , 2, 5, 10, 20, 30, 40 ó 50 mM. En una realización aun más preferida, cuando la expresión en el paso (a) del método de la invención se realiza en una célula y el tratamiento del paso (b) se realiza con cloruro auroso, cloruro aúrico o aurotiomalato a una concentración de entre 0,1 y 50 mM, el tratamiento del paso (b) se realiza durante entre 5 y 60 minutos. Preferiblemente, el tratamiento en el paso (b) se realiza durante 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 ó 60 minutos. En una realización aun más preferida, cuando la expresión en el paso (a) del método de la invención se realiza en una célula y el tratamiento del paso (b) se realiza con cloruro auroso, cloruro aúrico o aurotiomalato a una concentración de entre 0,1 y 50 mM durante entre 5 y 60 minutos, la célula del paso (c) se analiza para la visualización de al menos una proteína de superficie celular y/o de al menos una proteína endocitada in vivo. Es decir, cuando lo que se pretende detectar es al menos una proteína de superficie celular y/o al menos una proteína endocitada in vivo en una célula, el péptido de la invención, la MT o cualquiera de los fragmentos de la misma que comprenda 7 o más cisteínas, expresados en el paso (a) del método de la invención se encuentran fusionados a una de estas proteínas, se expresan en una célula en el paso (a) del método de la invención y el tratamiento del paso (b) con un metal se lleva a cabo, preferiblemente, como se ha explicado en este párrafo. The situation for each previous metallic element is different and in all cases a "noise extraction" process is carried out. A "noise extraction process" refers to a procedure that eliminates the non-specific signal that may interfere or be blurring an image obtained by a microscopic technique (according to the invention), to produce an image where only the element of interest appears . For this, various methods are used, but one of the most used is to acquire additional images by selecting energy losses close to the specific energy loss of the element of interest, before and after the elementary image at the peak of the spectrum, for later subtract them from the latter. As an example, and without limitation, the most commonly used method is that described by Egerton (Egerton, RF (1996) Electron Energy-Loss Spectroscopy in the Electron Microscope. Plenum Press, New York, USA). In the case of gold, as mentioned above, the detection of gold particles is very specific, since the energy loss spectrum allows the detection of said particles even in samples stained with salts of other heavy metals, usually used to staining the sample and normally masking them in a conventional MET image. In this way, a high contrast image is achieved that allows detailed study of the distribution of protein molecules together with the simultaneous visualization of cell ultrastructure. And also, it allows to obtain many more details about the subcellular localization of the proteins that carry the gold marker. Therefore, in a more preferred embodiment of the above, the elementary image is a gold image obtained by electronic energy loss spectroscopy. In another preferred embodiment, the expression of the peptide of the invention, or of the MT or of any of the fragments thereof comprising 7 or more cisterns, in step (a) of the method of the invention is performed in a cell. In a more preferred embodiment, when the expression in step (a) of the method of the invention is carried out in a cell, the treatment of step (b) is carried out with aurous chloride, auric chloride or aurothiomalate at a concentration of between 0, 1 and 50 mM. Preferably, with aurous chloride, auric chloride or aurothiomalate at a concentration of 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40 or 50 mM. In an even more preferred embodiment, when the expression in step (a) of the method of the invention is carried out in a cell and the treatment of step (b) is performed with aurous chloride, auric chloride or aurothiomalate at a concentration of between 0 , 1 and 50 mM, the treatment of step (b) is performed for between 5 and 60 minutes. Preferably, the treatment in step (b) is performed for 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 or 60 minutes. In an even more preferred embodiment, when the expression in step (a) of the method of the invention is carried out in a cell and the treatment of step (b) is performed with aurous chloride, auric chloride or aurothiomalate at a concentration of between 0 , 1 and 50 mM for 5 to 60 minutes, the cell in step (c) is analyzed for the visualization of at least one cell surface protein and / or at least one protein in vivo. That is, when what is intended to be detected is at least one cell surface protein and / or at least one protein in vivo in a cell, the peptide of the invention, the MT or any fragment thereof comprising 7 or more cysteines, expressed in step (a) of the method of the invention are fused to one of these proteins, are expressed in a cell in step (a) of the method of the invention and the treatment of step (b) with a metal is preferably carried out, as explained in this paragraph.
En otra realización preferida, cuando la expresión en el paso (a) del método de la invención se realiza en una célula y el tratamiento del paso (b) se realiza con cloruro auroso, cloruro aúrico o aurotiomalato a una concentración de entre 0,1 y 50 mM durante entre 5 y 60 minutos, el método de la invención además comprende permeabilizar selectivamente la membrana celular entre los pasos (a) y (b). En una realización más preferida, la permeabilización selectiva de la membrana celular se realiza mediante Streptolisina O. En una realización aun más preferida, cuando la expresión en el paso (a) del método de la invención se realiza en una célula, el tratamiento del paso (b) se realiza con cloruro auroso, cloruro aúrico o aurotiomalato a una concentración de entre 0,1 y 50 mM durante entre 5 y 60 minutos y el método de la invención además comprende permeabilizar selectivamente la membrana celular entre los pasos (a) y (b), preferiblemente tratando la célula con Streptolisina O, la célula del paso (c) del método de la invención se analiza para la visualización de al menos una proteína intracelular. Es decir, cuando lo que se pretende detectar es al menos una proteína intracelular, el péptido de la invención, la MT o cualquiera de los fragmentos de la misma que comprenda 7 o más cisteínas, expresados en el paso (a) del método de la invención se encuentran fusionados a una de estas proteínas, se expresan en una célula en el paso (a) del método de la invención, la membrana de dicha célula se permeabiliza selectivamente, preferiblemente con Streptolisina O, y el tratamiento del paso (b) con un metal se lleva a cabo, preferiblemente, como se ha explicado en este párrafo. In another preferred embodiment, when the expression in step (a) of the method of the invention is carried out in a cell and the treatment of step (b) is carried out with aurous chloride, auric chloride or aurothiomalate at a concentration of between 0.1 and 50 mM for 5 to 60 minutes, the method of the invention further comprises selectively permeabilizing the cell membrane between steps (a) and (b). In a more preferred embodiment, the selective permeabilization of the cell membrane is performed by Streptolysin O. In an even more preferred embodiment, when the expression in step (a) of the method of the invention is performed in a cell, the treatment of the step (b) it is performed with aurous chloride, auric chloride or aurothiomalate at a concentration of between 0.1 and 50 mM for between 5 and 60 minutes and the method of the invention further comprises selectively permeabilizing the cell membrane between steps (a) and (b), preferably treating the cell with Streptolysin O, the cell of step (c) of the method of the invention is analyzed for the visualization of at least one intracellular protein. That is, when what is intended to be detected is at least one intracellular protein, the peptide of the invention, the MT or any fragment thereof comprising 7 or more cysteines, expressed in step (a) of the method of invention are fused to one of these proteins, expressed in a cell in step (a) of the method of the invention, the membrane of said cell is selectively permeabilized, preferably with Streptolysin O, and the treatment of step (b) with a metal is carried out, preferably, as explained in this paragraph.
Se entiende por "permeabilización selectiva de la membrana celular" el tratamiento físico o enzimático que provoca la apertura de poros en la membrana plasmática celular dejando intacto el sistema de endomembranas. Ejemplos de agentes capaces de permeabilizar selectivamente la membrana celular son, aunque sin limitarnos, la Streptolisina O, la toxina alfa del estafilococo (Gudrun Ahnert-Hilger, et al., 1985, The Journal of Biológica! Chemistry, 260: 23 (12730-12734)) o la digitonina cuando se utiliza en concentraciones bajas, como por ejemplo aunque sin limitarnos, las descritas en Helen Plutner, et al., 1992, The Journal of Cell Biology, 1 19: 5 (1097-1 1 16). "Selective permeabilization of the cell membrane" means the physical or enzymatic treatment that causes the opening of pores in the cell plasma membrane leaving the endomembrane system intact. Examples of agents capable of selectively permeabilizing the cell membrane are, but not limited to, Streptolysin O, Staphylococcal alpha toxin (Gudrun Ahnert-Hilger, et al., 1985, The Journal of Biological! Chemistry, 260: 23 (12730- 12734)) or digitonin when used in low concentrations, such as but not limited to, those described in Helen Plutner, et al., 1992, The Journal of Cell Biology, 1 19: 5 (1097-1 1 16).
La "Streptolisina O" o SLO es la proteína termolábil sintetizada como exotoxina por, por ejemplo, aunque sin limitarnos, todas las cepas de estreptococo del grupo A y por algunas cepas de los grupos C y G. El tratamiento con SLO se puede llevar a cabo en la presente invención mediante protocolos estándar conocidos por un experto en la materia. Dicho tratamiento permite la sustitución del citosol de la célula por un medio que contiene sales de metal, preferiblemente oro, siguiendo el tratamiento del paso (b) del método de la invención. "Streptolysin O" or SLO is the thermolabile protein synthesized as exotoxin by, for example, but not limited to, all strains of group A streptococcus and by some strains of groups C and G. Treatment with SLO can be carried out. carried out in the present invention by standard protocols known to a person skilled in the art. Said treatment allows the replacement of the cytosol of the cell with a medium containing metal salts, preferably gold, following the treatment of step (b) of the method of the invention.
En otra realización preferida, la expresión del péptido de la invención, o de la MT o de cualquiera de los fragmentos de la misma que comprenda 7 o más cisternas, en el paso (a) del método de la invención se realiza en un orgánulo celular o en un virus. En una realización más preferida, cuando la expresión en el paso (a) del método de la invención se realiza en un orgánulo celular o en un virus, el tratamiento del paso (b) se realiza con cloruro auroso o cloruro aúrico a una concentración de entre 0,1 y 5 mM. Preferiblemente, la concentración de cloruro auroso o cloruro aúrico es de 0,1 , 0,5, 1 , 2 ó 5 mM. En una realización aun más preferida, cuando la expresión en el paso (a) del método de la invención se realiza en un orgánulo celular o en un virus y el tratamiento del paso (b) se realiza con cloruro auroso o cloruro aúrico a una concentración de entre 0,1 y 5 mM, el tratamiento del paso (b) se realiza durante entre 5 y 30 minutos. Preferiblemente, el tratamiento en el paso (b) se realiza durante 5, 10, 15, 20 ó 30 minutos. Los péptidos de la invención de distinto tamaño incorporan un número diferente de átomos de metal, por lo que forman partículas densas a los electrones de distinto tamaño que se distinguen en microscopía electrónica. Ocurre lo mismo cuando se emplean varias copias de MT o varios fragmentos de distinto tamaño de la misma. In another preferred embodiment, the expression of the peptide of the invention, or of the MT or of any of the fragments thereof comprising 7 or more cisterns, in step (a) of the method of the invention is performed in a cellular organelle or in a virus. In a more preferred embodiment, when the expression in step (a) of the method of the invention is carried out in a cellular organelle or in a virus, the treatment of step (b) is performed with aurous chloride or auric chloride at a concentration of between 0.1 and 5 mM. Preferably, the concentration of aurous chloride or auric chloride is 0.1, 0.5, 1, 2 or 5 mM. In an even more preferred embodiment, when the expression in step (a) of the method of the invention is carried out in a cellular organelle or in a virus and the treatment of step (b) is carried out with aurous chloride or auric chloride at a concentration between 0.1 and 5 mM, the treatment of step (b) is carried out for between 5 and 30 minutes. Preferably, the treatment in step (b) is performed for 5, 10, 15, 20 or 30 minutes. The peptides of the invention of different sizes incorporate a different number of metal atoms, so they form dense particles to electrons of different sizes that are distinguished in electron microscopy. The same happens when several copies of MT or several fragments of different size are used.
Por ello, en otra realización preferida, en el paso (a) del método de la invención se expresan, en una célula, en un orgánulo celular o en un virus, dos o más péptidos de la invención de distinto tamaño fusionados a proteínas diferentes, o fusionados a proteínas marcadoras de diferente color o fusionados a proteínas diferentes y a proteínas marcadoras de diferente color. Así, en el paso (a) del método de la invención se pueden expresar, en una célula, en un orgánulo celular o en un virus, por ejemplo, aunque sin limitarnos, el péptido de la invención de SEQ ID NO: 1 fusionado a una proteína y el péptido de la invención de SEQ ID NO: 2 fusionado a otra proteína, para la detección simultánea de dos proteínas diferentes, preferiblemente por microscopía electrónica; o bien el péptido de la invención de SEQ ID NO: 1 fusionado a una proteína, el péptido de la invención de SEQ ID NO: 2 fusionado a otra proteína y dos copias del péptido SEQ ID NO: 1 fusionado a otra proteína, para la detección simultánea de tres proteínas diferentes, preferiblemente por microscopía electrónica. En una realización más preferida, en el paso (a) del método de la invención se expresan, en una célula, en un orgánulo celular o en un virus, dos o más péptidos de la invención de distinto tamaño fusionados a proteínas marcadoras de diferente color o fusionados a proteínas diferentes y a proteínas marcadoras de diferente color. Así, el método de la invención también es de utilidad para la detección simultánea de dos o más proteínas diferentes por microscopía electrónica o, preferiblemente, por microscopía correlativa. En otra realización preferida, en el paso (a) del método de la invención se expresan, en una célula, en un orgánulo celular o en un virus, una copia de MT fusionada a una proteína, o fusionada a una proteína marcadora, o fusionada a una proteína y a una proteína marcadora, y otras dos copias de la MT fusionadas entre sí y a otra proteína, o a otra proteína marcadora o a otra proteína y a otra proteína marcadora; o bien dos o más fragmentos de MT de distinto tamaño que comprenden 7 o más cisteínas fusionados a proteínas diferentes, o fusionados a proteínas marcadoras de diferente color o fusionados a proteínas diferentes y a proteínas marcadoras de diferente color. Así, se podría llevar a cabo la detección simultánea de al menos dos proteínas diferentes, preferiblemente por microscopía electrónica. Therefore, in another preferred embodiment, in step (a) of the method of the invention, two or more different sized peptides of the invention fused to different proteins are expressed in a cell, in a cell organelle or in a virus, or fused to different color marker proteins or fused to different proteins and different color marker proteins. Thus, in step (a) of the method of the invention they can be expressed, in a cell, in a cellular organelle or in a virus, for example, but not limited to, the peptide of the invention of SEQ ID NO: 1 fused to a protein and the peptide of the invention of SEQ ID NO: 2 fused to another protein, for the simultaneous detection of two different proteins, preferably by electron microscopy; or the peptide of the invention of SEQ ID NO: 1 fused to a protein, the peptide of the invention of SEQ ID NO: 2 fused to another protein and two copies of the peptide SEQ ID NO: 1 fused to another protein, for Simultaneous detection of three different proteins, preferably by electron microscopy. In a more preferred embodiment, in step (a) of the method of the invention, two or more different sized peptides of the invention fused to different colored marker proteins are expressed in a cell, in a cell organelle or in a virus. or fused to different proteins and marker proteins of different color. Thus, the method of the invention is also useful for the simultaneous detection of two or more different proteins by electron microscopy or, preferably, by correlative microscopy. In another preferred embodiment, in step (a) of the method of the invention, a copy of MT fused to a protein, or fused to a marker, or fused protein is expressed in a cell, in a cell organelle or in a virus to one protein and one marker protein, and two other copies of the MT fused to each other and another protein, or another marker protein or another protein and another marker protein; or two or more fragments of MT of different size comprising 7 or more cysteines fused to different proteins, or fused to marker proteins of different color or fused to different proteins and marker proteins of different color. Thus, simultaneous detection of at least two different proteins could be carried out, preferably by electron microscopy.
En una realización más preferida, en el paso (a) del método de la invención se expresan, en una célula, en un orgánulo celular o en un virus, una copia de MT fusionada a una proteína marcadora o fusionada a una proteína y a una proteína marcadora, y otras dos copias de la MT fusionadas entre sí y a una proteína marcadora de diferente color o a otra proteína y a una proteína marcadora de diferente color; o bien dos o más fragmentos de MT de distinto tamaño que comprenden 7 o más cisteínas fusionados a proteínas marcadoras de diferente color o fusionados a proteínas diferentes y a proteínas marcadoras de diferente color. Así, se podría llevar a cabo la detección simultánea de dos o más proteínas diferentes por microscopía electrónica o, preferiblemente por microscopía correlativa. In a more preferred embodiment, in step (a) of the method of the invention, a copy of MT fused to a marker protein or fused to a protein and a protein is expressed in a cell, in a cell organelle or in a virus marker, and two other copies of the MT fused together to a different color marker protein or to another protein and a different color marker protein; or two or more different sized MT fragments comprising 7 or more cysteines fused to different color marker proteins or fused to different proteins and different color marker proteins. Thus, simultaneous detection of two or more proteins could be carried out. different by electron microscopy or, preferably by correlative microscopy.
En otra realización preferida del método de la invención, la célula es eucariota. In another preferred embodiment of the method of the invention, the cell is eukaryotic.
El método de la invención puede comprender otros pasos adicionales, por ejemplo, aunque sin limitarnos, tras el paso (c), como por ejemplo, aunque sin limitarnos, relacionados con un análisis por tomografía electrónica de las muestras (células, orgánulos celulares o virus), preferiblemente de las células procesadas mediante congelación a alta presión y crioultramicrotomía, o de los virus u orgánulos celulares purificados y vitrificados en suspensión, y/o con un posterior estudio de los tomogramas obtenidos para la búsqueda y acoplamiento (o "docking") de estructuras de alta resolución de las proteínas objeto de estudio obtenidas mediante, por ejemplo, aunque sin limitarnos, cristalografía de rayos X, resonancia magnética nuclear o criomicroscopía electrónica. Las partículas densas a los electrones asociadas al péptido de la invención, o a la MT o a cualquiera de sus fragmentos que comprenda 7 o más cisternas, dirigen el proceso de "docking", lo que permite un trazado rápido y preciso de las proteínas objeto de estudio. De este modo, se pueden obtener mapas macromoleculares, tri o bidimensionales, representativos de los cambios que se producen en la distribución de las moléculas de la proteína objeto de estudio en distintos estados fisiológicos de las células, en los orgánulos celulares o en los distintos intermediarios de maduración en el caso de los virus. The method of the invention may comprise other additional steps, for example, but not limited to, after step (c), such as, but not limited to, related to an electron tomography analysis of the samples (cells, cell organelles or viruses). ), preferably from cells processed by high pressure freezing and cryoltramicrotomy, or from virus or purified or vitrified cell organelles in suspension, and / or with a subsequent study of the tomograms obtained for search and coupling (or "docking") of high resolution structures of the proteins under study obtained by, for example, but not limited to, X-ray crystallography, nuclear magnetic resonance or electron cryomicroscopy. The particles dense to the electrons associated to the peptide of the invention, or to the MT or to any of its fragments comprising 7 or more tanks, direct the "docking" process, which allows a fast and precise tracing of the proteins under study. . In this way, macromolecular, tri or two-dimensional maps, representative of the changes that occur in the distribution of the molecules of the protein under study in different physiological states of the cells, in the cell organelles or in the different intermediates can be obtained of maturation in the case of viruses.
Otro aspecto de la invención se refiere a un kit, de ahora en adelante "primer kit de la invención", que comprende el péptido de la invención, preferiblemente el péptido de la invención fusionado a una proteína, o a una proteína marcadora o a una proteína y a una proteína marcadora, donde dicha proteína marcadora es, preferiblemente, GFP. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el kit además comprende las instrucciones para llevar a cabo el método de la invención. Another aspect of the invention relates to a kit, hereafter referred to as the "first kit of the invention", which comprises the peptide of the invention, preferably the peptide of the invention fused to a protein, or a marker protein or a protein already a marker protein, wherein said marker protein is preferably GFP. In a Preferred embodiment of this aspect of the invention, the kit further comprises the instructions for carrying out the method of the invention.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del primer kit de la invención para la detección de metales y/o para la detección de al menos una proteína mediante microscopía. En una realización preferida, la microscopía es correlativa o electrónica. Another aspect of the invention relates to the use of the first kit of the invention for the detection of metals and / or for the detection of at least one protein by microscopy. In a preferred embodiment, the microscopy is correlative or electronic.
Otro aspecto de la invención se refiere a un kit, de ahora en adelante "segundo kit de la invención", que comprende el péptido de la invención unido a un grupo de átomos de metal, la secuencia nucleotídica de la invención, el vector de la invención y/o la célula de la invención. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el kit además comprende las instrucciones para llevar a cabo el método de la invención. Another aspect of the invention relates to a kit, hereafter "second kit of the invention", comprising the peptide of the invention attached to a group of metal atoms, the nucleotide sequence of the invention, the vector of the invention and / or the cell of the invention. In a preferred embodiment of this aspect of the invention, the kit further comprises instructions for carrying out the method of the invention.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del segundo kit de la invención para la detección de al menos una proteína mediante microscopía. En una realización preferida, la microscopía es correlativa o electrónica. Another aspect of the invention relates to the use of the second kit of the invention for the detection of at least one protein by microscopy. In a preferred embodiment, the microscopy is correlative or electronic.
Otro aspecto de la invención se refiere a un kit, de ahora en adelante "tercer kit de la invención", que comprende al menos una copia de MT o de cualquiera de sus fragmentos que comprende 7 o más cisternas, preferiblemente al menos una copia de MT o de cualquiera de sus fragmentos que comprende 7 o más cisternas fusionados a una proteína, o a una proteína marcadora o a una proteína y a una proteína marcadora, donde dicha proteína marcadora es, preferiblemente, GFP. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el kit además comprende las instrucciones para llevar a cabo el método de la invención . Another aspect of the invention relates to a kit, hereinafter "third kit of the invention", comprising at least one copy of MT or any of its fragments comprising 7 or more tanks, preferably at least one copy of MT or any of its fragments comprising 7 or more tanks fused to a protein, or a marker protein or a protein and a marker protein, wherein said marker protein is preferably GFP. In a preferred embodiment of this aspect of the invention, the kit further comprises instructions for carrying out the method of the invention.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del tercer kit de la invención para la detección de metales y/o para la detección de al menos una proteína mediante microscopía. En una realización preferida, la microscopía es correlativa o electrónica. Another aspect of the invention relates to the use of the third kit of the invention for the detection of metals and / or for the detection of at least one protein by microscopy. In a preferred embodiment, the microscopy is correlative or electronic.
Otro aspecto de la invención se refiere a un kit, de ahora en adelante "cuarto kit de la invención", que comprende al menos una copia de MT o de cualquiera de sus fragmentos que comprende 7 o más cisternas, preferiblemente al menos una copia de MT o de cualquiera de sus fragmentos que comprende 7 o más cisternas unida a un grupo de átomos de metal; la secuencia nucleotídica que codifica para al menos una copia de la MT, preferiblemente la SEQ ID NO: 7, o para cualquiera de sus fragmentos que comprende 7 o más cisteínas, preferiblemente la SEQ ID NO: 8 o la SEQ ID NO: 9, más preferiblemente la SEQ ID NO: 8, o para al menos una copia de MT o de cualquiera de sus fragmentos que comprende 7 o más cisteínas fusionados a una proteína, a una proteína marcadora o a una proteína y a una proteína marcadora, donde dicha proteína marcadora es, preferiblemente, GFP; el vector que comprende dicha secuencia nucleotídica y/o la célula que comprende dicha MT, dichos fragmentos, dicha secuencia nucleotídica o dicho vector. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el kit además comprende las instrucciones para llevar a cabo el método de la invención. Another aspect of the invention relates to a kit, hereinafter "fourth kit of the invention", comprising at least one copy of MT or any of its fragments comprising 7 or more tanks, preferably at least one copy of MT or any of its fragments comprising 7 or more tanks attached to a group of metal atoms; the nucleotide sequence encoding at least one copy of the MT, preferably SEQ ID NO: 7, or for any of its fragments comprising 7 or more cysteines, preferably SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9, more preferably SEQ ID NO: 8, or for at least one copy of MT or any of its fragments comprising 7 or more cysteines fused to a protein, a marker protein or a protein and a marker protein, wherein said marker protein it is preferably GFP; the vector comprising said nucleotide sequence and / or the cell comprising said MT, said fragments, said nucleotide sequence or said vector. In a preferred embodiment of this aspect of the invention, the kit further comprises instructions for carrying out the method of the invention.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del cuarto kit de la invención para la detección de al menos una proteína por microscopía, preferiblemente por microscopía correlativa o electrónica, mediante el método descrito en la presente la invención. Another aspect of the invention relates to the use of the fourth kit of the invention for the detection of at least one protein by microscopy, preferably by correlative or electron microscopy, by the method described in the present invention.
En general, los kits de la invención comprenden todos aquellos reactivos necesarios para llevar a cabo el método de la invención como se ha descrito anteriormente. Los kits además pueden incluir, sin ningún tipo de limitación, al menos una fuente de metal, preferiblemente de un metal pesado, más preferiblemente sales de oro, al menos un agente para permeabilizar selectivamente la membrana celular, preferiblemente SLO, sondas, tampones, enzimas, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, polimerasas, cofactores para obtener una actividad óptima de éstas, agentes para prevenir la contaminación, etc. Por otro lado, los kits pueden incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Los kits pueden contener además otras moléculas, genes, proteínas, sondas, células, virus u orgánulos celulares de interés, que sirvan como controles positivos y negativos. In general, the kits of the invention comprise all those reagents necessary to carry out the method of the invention as described above. The kits may also include, without any limitation, at least one source of metal, preferably of a heavy metal, more preferably gold salts, at least one agent for selectively permeabilizing the cell membrane, preferably SLO, probes, buffers, enzymes, such as, but not limited to, polymerases, cofactors to obtain optimal activity from these, agents to prevent contamination, etc. On the other hand, the kits can include all the supports and containers necessary for its implementation and optimization. The kits may also contain other molecules, genes, proteins, probes, cells, viruses or cellular organelles of interest, which serve as positive and negative controls.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. Throughout the description and the claims the word "comprises" and its variants are not intended to exclude other technical characteristics, additives, components or steps. For those skilled in the art, other objects, advantages and features of the invention will be derived partly from the description and partly from the practice of the invention. The following examples and drawings are provided by way of illustration, and are not intended to be limiting of the present invention.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS DESCRIPTION OF THE FIGURES
Fig. 1. Esquema representativo de la distancia entre la proteína de interés y la partícula de oro coloidal empleada para mareaje en microscopía electrónica. (A) Anticuerpo unido a un conjugado de oro coloidal. (B) Marcador clonable de la invención unido a sales de oro. Fig. 1. Representative scheme of the distance between the protein of interest and the colloidal gold particle used for electronic microscopy marking. (A) Antibody bound to a colloidal gold conjugate. (B) Clonable marker of the invention attached to gold salts.
Fig. 2. Muestra la actividad una proteína quimera de MT1 en la superficie celular y en el interior de células permeabilizadas.Fig. 2. It shows the activity of a chimera protein of MT1 on the cell surface and inside permeabilized cells.
Actividad de los complejos replicativos del virus Rubella en los que la subunidad P150 de la replicasa viral ha sido fusionada con MT1 y expresada en forma de replicón (denominado Rep-HA-MT). Ensayos de inmunofluorescencia con anticuerpos específicos para RNA de doble cadena (dsRNA), intermediario de la replicación y marcador de la actividad de la RNA polimerasa viral, muestran actividad del complejo en la superficie de células no permeabilizadas (flechas en A, 9 h postransfección) y en el interior de células permeabilizadas (flechas en B, 24 h postransfección). Barras: 10 μηη. Activity of the Rubella virus replicative complexes in which the P150 subunit of the viral replicase has been fused with MT1 and expressed as a replicon (called Rep-HA-MT). Immunofluorescence assays with antibodies specific for double-stranded RNA (dsRNA), replication intermediate and marker of viral RNA polymerase activity, show complex activity on the surface of non-permeabilized cells (arrows at A, 9 h post-transfection) and inside permeabilized cells (arrows in B, 24 h post-transfection). Bars: 10 μηη.
Fig. 3. Muestra la visualización de las quimeras de MT1 incorporadas en la ruta endocítica. Células vivas transfectadas con un replicón del virus Rubella que contiene P150-MT1 fueron tratadas 17 minutos con AuCh y procesadas para su inclusión en resina acrílica, para la obtención de secciones ultrafinas y para su visualización en microscopía electrónica de transmisión (MET). Las moléculas de P150-MT1 se detectaron en la membrana plasmática (flecha en A) y dentro de las células tras ser endocitadas, como señalan los círculos en (A) y se muestran a mayor magnificación en (B) y (C), donde las flechas señalan algunos de los grupos de átomos de oro asociados a la MT1 . Los grupos de átomos de oro preformados en la superficie celular son transportados hasta regiones perinucleares (flecha en D) donde se incorporan al interior de lisosomas modificados (asterisco), donde P150 forma parte de los complejos replicativos funcionales del virus Rubella. (E) Imagen a mayor magnificación del lisosoma modificado marcado con asterisco en (D) y donde se observan grupos de átomos de metal densos a los electrones asociados a P150-MT1 incorporados en el interior de la estructura (flechas). N: núcleo. Barras: 100 nm en A y D; 30 nm en B, C y E. Fig. 3. Shows the visualization of the chimeras of MT1 incorporated in the endocytic pathway. Live cells transfected with a Rubella virus replicon containing P150-MT1 were treated 17 minutes with AuCh and processed for inclusion in acrylic resin, to obtain ultra-thin sections and for viewing in transmission electron microscopy (MET). The molecules of P150-MT1 were detected in the plasma membrane (arrow in A) and inside the cells after being endocitated, as indicated by the circles in (A) and shown at greater magnification in (B) and (C), where the arrows indicate some of the groups of gold atoms associated with MT1. The groups of preformed gold atoms on the cell surface are transported to perinuclear regions (arrow in D) where they are incorporated into modified lysosomes (asterisk), where P150 is part of the functional replicative complexes of the Rubella virus. (E) A larger magnification image of the modified lysosome marked with an asterisk in (D) and where groups of dense metal atoms are observed to the electrons associated with P150-MT1 incorporated inside the structure (arrows). N: core. Bars: 100 nm in A and D; 30 nm in B, C and E.
Fig. 4. Muestra los controles de especificidad de la visualización de los grupos de átomos de oro densos a los electrones asociados a MT1 en células intactas y en células permeabilizadas con SLO.Fig. 4. It shows the controls of specificity of the visualization of the groups of dense gold atoms to the electrons associated to MT1 in intact cells and in cells permeabilized with SLO.
Células vivas no transfectadas (A) y transfectadas con un replicón que expresa un componente de la replicasa del virus Rubella (la proteína P150) fusionada a MT1 (Rep-HA-MT) (B) fueron tratadas 17 minutos con AuCI 1 mM y procesadas para su inclusión en resina acrílica, obtención de secciones ultrafinas y visualización mediante microscopía electrónica de transmisión. Sólo las células que expresan la quimera de MT1 exógena presentan estructuras densas a los electrones, que corresponden a las moléculas de MT1 con grupos de átomos de oro asociados en la superficie celular y endosomas (círculos en B, la flecha señala la estructura ampliada en el recuadro). Células no transfectadas permeabilizadas con SLO (C) y células transfectadas con el mismo replicón y permeabilizadas con SLO (D) fueron tratadas 30 minutos con AuCI 1 mM antes de ser procesadas como se indicó anteriormente. De nuevo, las células control no presentan partículas densas a los electrones, siendo los elementos con ácidos nucleicos como los ribosomas (círculos y recuadro en C) o la cromatina del núcleo (N) los elementos más densos en secciones no teñidas. En células que expresan la replicasa-MT1 (D) se detectan moléculas de la quimera visualizadas como grupos de átomos de oro densos a los electrones en los orgánulos (retículo endoplasmático rugoso, RER) donde se ensambla el complejo replicativo del virus (círculos y recuadros en D). En los recuadros en D, las flechas indican grupos de átomos de oro asociados a la MT1 y los asteriscos indican las vacuolas perinucleares en las que se acumulan los complejos replicativos del virus de los que forma parte la replicasa (aquí visualizada como replicasa-MT). Barras: 2 μιτι en A y B; 1 μιτι en C y D; 50 nm en los recuadros de B, C y D. Live cells not transfected (A) and transfected with a replicon expressing a component of the Rubella virus replicase (the P150 protein) fused to MT1 (Rep-HA-MT) (B) were treated 17 minutes with 1 mM AuCI and processed for inclusion in acrylic resin, obtaining ultra-thin sections and visualization by transmission electron microscopy. Only cells that express the exogenous MT1 chimera have electron dense structures, corresponding to the MT1 molecules with groups of associated gold atoms on the cell surface and endosomes (circles in B, the arrow indicates the enlarged structure in the box). Non-transfected cells permeabilized with SLO (C) and cells transfected with the same replicon and permeabilized with SLO (D) were treated 30 minutes with 1 mM AuCI before being processed as indicated above. Again, the control cells do not have dense particles to the electrons, the elements with nucleic acids such as ribosomes (circles and C-box) or the chromatin of the nucleus (N) being the densest elements in unstained sections. In cells expressing replicase-MT1 (D), chimera molecules are detected as clusters of dense gold atoms to electrons in organelles (rough endoplasmic reticulum, RER) where the virus replicative complex (circles and boxes) is assembled in D). In the D-boxes, the arrows indicate groups of gold atoms associated with MT1 and the asterisks indicate the perinuclear vacuoles in which the replicative complexes of the virus of which the replicase forms part (here visualized as replicase-MT) . Bars: 2 μιτι in A and B; 1 μιτι in C and D; 50 nm in the boxes of B, C and D.
Fig. 5. Muestra la visualización de las quimeras de MT1 en el interior de células permeabilizadas con SLO. (A)-(E) Células transfectadas con el replicón del virus Rubella que expresa P150-MT1 fueron permeabilizadas con SLO y tratadas 30 min con AuCI 1 mM antes de ser procesadas mediante congelación, criosustitución, inclusión en resina acrílica, obtención de secciones ultrafinas y visualización mediante microscopía electrónica de transmisión. El tratamiento con SLO permeabiliza la membrana plasmática dejando intactas las membranas intracelulares, como se aprecia a nivel ultraestructural (célula de la izquierda marcada como "+SLO"). Las imágenes en (A) y (B) muestran a mayor magnificación la estructura marcada con un círculo en la célula de la izquierda (lisosoma modificado donde se ensamblan los complejos replicativos del virus) y donde se aprecia la acumulación de partículas densas a los electrones muy empaquetadas. Éstas corresponden a las moléculas de P150-MT1 visualizadas como grupos de átomos de oro de un diámetro aproximado de 1 nm. (C)-(E) Imágenes de mayor magnificación de grupos de oro en el interior de lisosomas de otras células y donde se aprecian diversos niveles de empaquetamiento y ordenación. La flecha en (E) apunta a partículas muy ordenadas o "close- packing". (F) Células transfectadas con un plásmido que codifica para la cápsida del virus Rubella fusionada a MT1 que se acumula en el citosol (campo principal) y en el interior de lisosomas modificados por el virus (recuadro). Las flechas apuntan a algunos de los grupos de átomos de oro asociados a MT y las puntas de flecha a partículas de oro coloidal que identifican las quimeras mediante inmunomarcaje con anticuerpos específicos y un anticuerpo secundario conjugado con oro coloidal. N: núcleo; RER: retículo endoplásmico rugoso; Barras: 1 μιτι en la imagen marcada como +SLO; 1 μιτι en A; 100 nm en B; 20 nm en C-E; 50 nm en F (campo principal y recuadro). Fig. 5. Shows the visualization of the chimeras of MT1 inside cells permeabilized with SLO. (A) - (E) Cells transfected with the Rubella virus replicon expressing P150-MT1 were permeabilized with SLO and treated 30 min with 1 mM AuCI before being processed by freezing, cryosubstitution, inclusion in acrylic resin, obtaining ultrafine sections and visualization by transmission electron microscopy. The SLO treatment permeabilizes the plasma membrane leaving the intracellular membranes intact, as seen at the ultrastructural level (left cell marked "+ SLO"). The images in (A) and (B) show a greater magnification of the structure marked with a circle in the cell on the left (modified lysosome where the complexes are assembled replicative of the virus) and where the accumulation of dense particles to highly packed electrons is appreciated. These correspond to the P150-MT1 molecules visualized as groups of gold atoms of an approximate diameter of 1 nm. (C) - (E) Images of greater magnification of gold groups inside lysosomes of other cells and where different levels of packaging and sorting are appreciated. The arrow in (E) points to very orderly particles or "close-packing". (F) Cells transfected with a plasmid encoding the capsule of the Rubella virus fused to MT1 that accumulates in the cytosol (main field) and inside lysosomes modified by the virus (box). The arrows point to some of the groups of gold atoms associated with MT and the arrowheads to colloidal gold particles that identify the chimeras by immunomarking with specific antibodies and a secondary antibody conjugated with colloidal gold. N: core; RER: rough endoplasmic reticulum; Bars: 1 μιτι in the image marked + SLO; 1 μιτι in A; 100 nm in B; 20 nm in CE; 50 nm in F (main field and box).
Fig. 6. Muestra la visualización de una proteína quimérica (Hfq- MTI beta) en células mediante microscopía electrónica de transmisión convencional. La imagen de la (A) muestra una sección ultrafina (50 nm) de una bacteria transformada con el plásmido pBAD-Hfq- MTI beta tras ser transformada por electroporacion de la cepa de E. coli MC4100 Hfq" y tratada in vivo 2h con Arabinosa 0,0025%, con AuCI 10 mM durante 3 h, y procesada mediante congelación rápida, criosustitución, inclusión en resina acrílica y obtención de cortes ultrafinos. Las flechas negras apuntan a agregados de la proteína quimérica en la periferia celular. En la imagen de (B) se muestra a mayor magnificación la zona marcada con un cuadrado en (A). Las flechas blancas apuntan a grupos de átomos de oro de < 1 nm de diámetro y que corresponden a moléculas individuales de la proteína quimérica. Estos grupos de átomos de oro son claramente más pequeños que los que se obtienen con la MT completa pero aún visibles mediante MET convencional. Barras: 25 nm en A, 10 nm en B. Fig. 6. Shows the visualization of a chimeric protein (Hfq-MTI beta) in cells by conventional transmission electron microscopy. The image of (A) shows an ultra-thin section (50 nm) of a bacterium transformed with plasmid pBAD-Hfq-MTI beta after being transformed by electroporation of the E. coli strain MC4100 Hfq " and treated in vivo 2h with Arabinose 0.0025%, with 10 mM AuCI for 3 h, and processed by rapid freezing, cryosubstitution, inclusion in acrylic resin and obtaining ultra-thin cuts.The black arrows point to aggregates of the chimeric protein in the cell periphery. (B) the area marked with a square in (A) is shown with greater magnification. The white arrows point to groups of gold atoms of <1 nm in diameter and that correspond to individual molecules of the chimeric protein. of gold are clearly smaller than those obtained with MT complete but still visible by conventional MET. Bars: 25 nm in A, 10 nm in B.
Fig. 7. Muestra la visualización de las quimeras de MT1 mediante imagen de oro elemental en sección de una célula teñida con sales de metales pesados (acetato de uranilo y citrato de plomo) y procesada mediante espectroscopia de pérdida de energía. (A) - (C)Fig. 7. It shows the visualization of the chimeras of MT1 by means of elementary gold image in section of a cell stained with salts of heavy metals (uranyl acetate and lead citrate) and processed by energy loss spectroscopy. (A) - (C)
Orgánulo denso de una célula viva transfectada con un replicón del virus Rubella que contiene P150-MT1 . La célula fue tratada 30 minutos con AuCh y procesada para su inclusión en resina acrílica, para la obtención de secciones ultrafinas, para tinción con acetato de uranilo y citrato de plomo y para su visualización en microscopía electrónica de transmisión (MET). Orgánulo perinuclear denso (lisosoma modificado donde se ensamblan los complejos replicativos del virus) visualizado tras tinción y mediante MET convencional (A). Se aprecian los detalles ultraestructurales del orgánulo pero las partículas de oro asociadas a las moléculas de P150-MT1 quedan enmascaradas por la tinción. (B) Detección de las moléculas de P150-MT1 -oro mediante imagen elemental obtenida con espectroscopia de pérdida de energía tras la sustracción del fondo no específico (mapa oro). (C) Superposición del mapa oro sobre la imagen de MET convencional. Se muestra la distribución detallada de las moléculas de P150-MT1 -oro en los distintos subdominios del orgánulo. Barra: 200 nm. EJEMPLOS Dense organelle of a living cell transfected with a Rubella virus replicon containing P150-MT1. The cell was treated 30 minutes with AuCh and processed for inclusion in acrylic resin, to obtain ultra-thin sections, for staining with uranyl acetate and lead citrate and for visualization in transmission electron microscopy (MET). Dense perinuclear organelle (modified lysosome where virus replicative complexes are assembled) visualized after staining and by conventional MET (A). The ultrastructural details of the organelle are appreciated but the gold particles associated with the P150-MT1 molecules are masked by staining. (B) Detection of P150-MT1 -oro molecules by elementary image obtained with energy loss spectroscopy after non-specific background subtraction (gold map). (C) Gold map overlay on conventional MET image. The detailed distribution of the P150-MT1 -oro molecules in the different subdomains of the organelle is shown. Bar: 200 nm EXAMPLES
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad del péptido de la invención, y de la MT o de cualquiera de sus fragmentos, como marcador clonable para la detección de al menos una proteína de interés por microscopía electrónica mediante el método descrito en la presente invención. Estos ejemplos específicos que se proporcionan sirven para ilustrar la naturaleza de la invención y se incluyen solamente con fines ilustrativos, por lo que no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. EJEMPLO 1. Localización de proteínas en células, eucariotas y procariotas, orgánulos celulares purificados y virus empleando como marcador clonable la MT o sus fragmentos. The invention will now be illustrated by tests carried out by the inventors, which show the effectiveness of the peptide of the invention, and of the MT or any of its fragments, as a clone marker for the detection of at least one protein of interest by electron microscopy by the method described in the present invention. These specific examples provided serve to illustrate the nature of the invention and are included for illustrative purposes only, so they should not be construed as limitations to the invention claimed herein. EXAMPLE 1. Localization of proteins in cells, eukaryotes and prokaryotes, purified cell organelles and viruses using the MT or its fragments as a clone marker.
1 .1 . Localización de una proteína de la superficie celular en células eucariotas. eleven . Localization of a cell surface protein in eukaryotic cells.
Se transfectaron células de mamífero BHK-21 cultivadas en monocapa con una construcción (replicón denominado Rep-HA-MT) que codificaba para una proteína viral (proteína P150 del complejo de la replicasa del virus Rubella, que se acumula en la superficie de las células) fusionada a la metalotioneína 1 (MT1 ) de ratón. Ensayos de inmunofluorescencia con anticuerpos específicos para RNA de doble cadena (dsRNA), intermediario de la replicación y marcador de la actividad de la RNA polimerasa viral, mostraron que la quimera de replicasa-MT1 (o P150- MT1 ) era activa en la superficie (Fig. 2A) y en el interior de las células transfectadas (Fig. 2B). BHK-21 mammalian cells cultured in monolayer were transfected with a construct (replicon called Rep-HA-MT) encoding a viral protein (P150 protein from the Rubella virus replicase complex, which accumulates on the surface of the cells ) fused to mouse metallothionein 1 (MT1). Immunofluorescence assays with antibodies specific for double-stranded RNA (dsRNA), replication intermediary and marker of viral RNA polymerase activity, showed that the chimera of replicase-MT1 (or P150-MT1) was active on the surface ( Fig. 2A) and inside the transfected cells (Fig. 2B).
Las células así transfectadas fueron tratadas in vivo con AuCb 1 mM o con AuCI 1 mM durante 17 minutos a 37°C e inmediatamente procesadas mediante fijación química estándar o mediante congelación a alta presión, criosustitución, inclusión en resina acrílica para microscopía electrónica y ultramicrotomía, siguiendo procedimientos estándar. The cells thus transfected were treated in vivo with 1 mM AuCb or 1 mM AuCI for 17 minutes at 37 ° C and immediately processed by standard chemical fixation or by high pressure freezing, cryosubstitution, inclusion in acrylic resin for electron microscopy and ultramicrotomy, following standard procedures.
Posteriormente, se recolectaron secciones ultrafinas (50-70 nm) seriadas de la muestra en rejillas de microscopía electrónica y se transfirieron al microscopio electrónico de transmisión (Fig. 3 y 4). Los cortes seriados orientados permitieron estudiar la distribución y organización de las moléculas de P150 en la superficie celular a través de la visualización de las pequeñas partículas densas a los electrones asociadas a la MT1 (Fig. 3A y 4B). 1 .2. Localización de una proteína durante su transporte intracelular en la ruta endocítica en células eucariotas. Subsequently, ultra-thin sections (50-70 nm) of the sample were collected on electron microscopy grids and transferred to the transmission electron microscope (Fig. 3 and 4). The oriented serial cuts allowed to study the distribution and organization of the P150 molecules on the cell surface through the visualization of small dense particles to the electrons associated with MT1 (Fig. 3A and 4B). 1 .2. Location of a protein during its intracellular transport in the endocytic pathway in eukaryotic cells.
Se transfectaron células de mamífero cultivadas en monocapa con una construcción que codificaba para una proteína viral (proteína P150 del complejo de la replicasa del virus Rubella, que es internalizada y transportada en la ruta endocítica) fusionada con la MT1 de ratón. Monolayer cultured mammalian cells were transfected with a construct encoding a viral protein (P150 protein from the Rubella virus replicase complex, which is internalized and transported in the endocytic pathway) fused with the mouse MT1.
Las células así transfectadas fueron tratadas in vivo con AuCb 1 mM o con AuCI 1 mM durante 17 minutos a 37°C y tras un lavado con medio de cultivo se mantuvieron en el incubador para que tuviera lugar la internalización de la proteína marcada. A distintos tiempos las células vivas fueron procesadas mediante fijación química estándar, inclusión en resina acrílica para microscopía electrónica y ultramicrotomía, siguiendo procedimientos estándar. The cells thus transfected were treated in vivo with 1 mM AuCb or 1 mM AuCI for 17 minutes at 37 ° C and after washing with culture medium they were kept in the incubator for internalization of the labeled protein. At different times the living cells were processed by standard chemical fixation, inclusion in acrylic resin for electron microscopy and ultramicrotomy, following standard procedures.
Posteriormente, se recolectaron secciones ultrafinas (50-70 nm) seriadas de la muestra en rejillas de microscopía electrónica y se transfirieron al microscopio electrónico de transmisión. Los cortes seriados orientados permitieron estudiar la distribución de las moléculas de las proteínas en distintos compartimentos de la ruta endocítica a través de la visualización de las pequeñas partículas densas a los electrones asociadas a la MT1 (Fig. 3 y 4B). La especificidad de la detección fue confirmada con controles que incluyeron células no transfectadas y tratadas in vivo como se ha descrito (Fig. 4A) y células no transfectadas y tratadas como se ha descrito pero después de llevar a cabo una permeabilización con SLO (Fig. 4C). 1 .3. Localización de una proteína asociada a compartimentos intracelulares en células eucariotas. Subsequently, ultra-thin sections (50-70 nm) of the sample were collected on electron microscopy grids and transferred to the transmission electron microscope. The oriented serial cuts allowed studying the distribution of protein molecules in different compartments of the endocytic pathway through the visualization of small dense particles to the electrons associated with MT1 (Fig. 3 and 4B). The specificity of the detection was confirmed with controls that included non-transfected and treated cells in vivo as described (Fig. 4A) and non-transfected and treated cells as described but after performing SLO permeabilization (Fig. 4C). 1 .3. Location of a protein associated with intracellular compartments in eukaryotic cells.
Se transfectaron células de mamífero cultivadas en monocapa con una construcción que codificaba para la proteína de interés (cápsida o P150- replicasa del virus Rubella) fusionada con la MT1 de ratón. Monolayer-grown mammalian cells were transfected with a construct encoding the protein of interest (Rubella virus capsid or P150-replicase) fused with mouse MT1.
Las células así transfectadas fueron tratadas con Streptolisina O siguiendo protocolos estándar para abrir poros en la membrana plasmática dejando intacto el sistema de endomembranas y sustituir el citosol de las células por un medio que contenía sales de oro (AuCI 1 mM o AuCb 1 mM). Las células fueron entonces tratadas en ese medio durante 30 min. The cells thus transfected were treated with Streptolysin O following standard protocols to open pores in the plasma membrane leaving the endomembrane system intact and replace the cytosol of the cells with a medium containing gold salts (1 mM AuCI or 1 mM AuCb). The cells were then treated in that medium for 30 min.
Las monocapas celulares fueron entonces procesadas mediante fijación química estándar o mediante congelación, criosustitución, inclusión en resina acrílica para microscopía electrónica y ultramicrotomía, siguiendo procedimientos estándar. Posteriormente, se recolectaron secciones ultrafinas (50-70 nm) seriadas de la muestra en rejillas de microscopía electrónica y se transfirieron al microscopio electrónico de transmisión. Los cortes seriados orientados permitieron estudiar la distribución de las moléculas de proteína en los orgánulos intracelulares a través de la visualización de las pequeñas partículas densas a los electrones asociadas a la MT1 (Fig. 5). Concretamente se observó que las moléculas de polimerasa se agruparon en pseudo-cristales en el interior de lisosomas modificados (que albergan los complejos replicativos funcionales del virus) (Fig. 5A-5E) mientras que las moléculas de la cápsida se acumularon en depósitos citoplásmicos o en el interior de los lisosomas modificados sin presentar ninguna organización aparente (Fig. 5F). 1 .4. Localización de proteínas en partículas virales. The cell monolayers were then processed by standard chemical fixation or by freezing, cryosubstitution, inclusion in acrylic resin for electron microscopy and ultramicrotomy, following standard procedures. Subsequently, ultra-thin sections (50-70 nm) of the sample were collected on electron microscopy grids and transferred to the transmission electron microscope. Serial oriented sections allowed studying the distribution of protein molecules in intracellular organelles through the visualization of small dense particles to electrons associated with MT1 (Fig. 5). Specifically, it was observed that the polymerase molecules were grouped in pseudo-crystals inside modified lysosomes (which house the virus's functional replicative complexes) (Fig. 5A-5E) while the capsid molecules accumulated in cytoplasmic deposits or inside the modified lysosomes without presenting any apparent organization (Fig. 5F). 1 .4. Location of proteins in viral particles.
Suspensiones de virus purificados (partículas virales inmaduras o partículas virales infectivas) que contienen proteínas quiméricas son tratadas con sales de oro (AuCI 1 mM o AuCb 1 mM durante 15 minutos) e inmediatamente tratadas mediante fijación química estándar o vitrificadas mediante congelación a alta velocidad en etano líquido. Purified virus suspensions (immature viral particles or infective viral particles) containing chimeric proteins are treated with gold salts (1 mM AuCI or 1 mM AuCb for 15 minutes) and immediately treated by standard chemical fixation or vitrified by high-speed freezing in liquid ethane
El estudio de la organización de las moléculas de proteína en las partículas virales se realiza mediante microscopía electrónica de virus incluidos en resina plástica y procesados para ultramicrotomía (cortes ultrafinos seriados) o visualizados directamente en estado vitreo mediante criomicroscopía electrónica. Dicho estudio está orientado a entender la contribución de las proteínas en la arquitectura y función del virus infectivo. The study of the organization of protein molecules in viral particles is carried out by electron microscopy of viruses included in plastic resin and processed for ultramicrotomy (serial ultrafine cuts) or visualized directly in the vitreous state by electronic cryomicroscopy. This study is aimed at understanding the contribution of proteins in the architecture and function of the infective virus.
1 .5. Localización de proteínas en orqánulos purificados. fifteen. Localization of proteins in purified orchulas.
Orgánulos celulares purificados que contienen proteínas quiméricas son tratados en suspensión con sales de oro (AuCI 1 mM o AuCb 1 mM durante 15 minutos) e inmediatamente tratados mediante fijación química estándar o vitrificados mediante congelación a alta velocidad en etano líquido. El estudio de la organización de las moléculas de proteína en los orgánulos se realiza mediante microscopía electrónica de orgánulos incluidos en resina plástica y procesados para ultramicrotomía (cortes ultrafinos seriados) o visualizados directamente en estado vitreo mediante criomicroscopía electrónica. Dicho estudio está orientado a entender la contribución de las proteínas en la arquitectura y función del orgánulo celular. 1 . 6. Localización de proteínas en células empleando el dominio beta de la MT como marcador clonable. Purified cellular organelles containing chimeric proteins are treated in suspension with gold salts (1 mM AuCI or 1 mM AuCb for 15 minutes) and immediately treated by standard chemical fixation or vitrified by high speed freezing in liquid ethane. The study of the organization of protein molecules in organelles is carried out by electron microscopy of organelles included in plastic resin and processed for ultramicrotomy (serial ultrafine cuts) or visualized directly in the vitreous state by electronic cryomicroscopy. This study is aimed at understanding the contribution of proteins in the architecture and function of the cellular organelle. one . 6. Localization of proteins in cells using the beta domain of MT as a clonable marker.
Se visualizó una proteína quimérica (Hfq-MT1 beta) en células mediante microscopía electrónica de transmisión convencional. Se realizaron secciones ultrafinas (50 nm) de una bacteria transformada con el plásmido pBAD-Hfq-MT1 beta tras ser transformada por electroporación de la cepa de E. coli MC4100 Hfq" y tratada in vivo 2h con Arabinosa 0,0025%, con AuCI 10 mM durante 3 h, y procesada mediante congelación rápida, criosustitución, inclusión en resina acrílica y obtención de cortes ultrafinos (Fig. 6). Los resultados mostraron agregados de la proteína quimérica en la periferia celular (Fig. 6A) y moléculas individuales en el interior de las células (Fig. 6B). 1 . 7. Localización de proteínas-MT-oro en células mediante análisis espectroscópico e imágenes elementales (mapas oro). A chimeric protein (Hfq-MT1 beta) was visualized in cells by conventional transmission electron microscopy. Ultra-thin sections (50 nm) of a bacterium transformed with the plasmid pBAD-Hfq-MT1 beta were made after being transformed by electroporation of E. coli strain MC4100 Hfq " and treated in vivo 2h with 0.0025% Arabinose, with AuCI 10 mM for 3 h, and processed by rapid freezing, cryosubstitution, inclusion in acrylic resin and obtaining ultra-thin cuts (Fig. 6). The results showed aggregates of the chimeric protein in the cell periphery (Fig. 6A) and individual molecules in the interior of the cells (Fig. 6B) 1. 7. Location of MT-gold proteins in cells by spectroscopic analysis and elementary images (gold maps).
Se visualizó una proteína quimérica de MT1 (P150-MT1 ) mediante imagen oro elemental en sección de una célula teñida con sales de metales pesados, y procesada mediante espectroscopia de pérdida de energía. Para ello, primeramente se trató una célula transfectada con un replicón del virus Rubella que contiene P150-MT1 in vivo con AuCb durante 30 minutos, y se procesó para su inclusión en resina acrílica, para obtener secciones ultrafinas para tinción con acetato de uranilo y citrato de plomo, que se visualizaron por microscopía electrónica de transmisión (MET) convencional (Figura 7A). Para la detección de las moléculas P150-MT1 -oro que quedan enmascaradas en la tinción anterior con metales pesados, se obtuvo una imagen oro elemental mediante espectroscopia de pérdida de energía tras la sustracción del fondo no específico (mapa oro, Figura 7B). La superposición del mapa oro sobre la imagen MET convencional mostró la distribución detallada de las moléculas de P150-MT1 -oro en los distintos subdominios del orgánulo (Figura 7C). A chimeric MT1 protein (P150-MT1) was visualized by elemental gold sectional imaging of a cell stained with heavy metal salts, and processed by energy loss spectroscopy. To that end, a cell transfected with a Rubella virus replicon containing P150-MT1 in vivo with AuCb was first treated for 30 minutes, and processed for inclusion in acrylic resin, to obtain ultra-thin sections for staining with uranyl acetate and citrate of lead, which were visualized by conventional transmission electron microscopy (MET) (Figure 7A). For the detection of the P150-MT1 -oro molecules that are masked in the previous staining with heavy metals, an elemental gold image was obtained by energy loss spectroscopy after non-specific background subtraction (gold map, Figure 7B). The gold map overlay on the conventional MET image showed the detailed distribution of the P150-MT1 -oro molecules in the different subdomains of the organelle (Figure 7C).
EJEMPLO 2. Localización de proteínas en células, eucariotas y procariotas, orgánulos celulares purificados y virus empleando como marcador clonable el péptido de la invención. EXAMPLE 2. Localization of proteins in cells, eukaryotes and prokaryotes, purified cell organelles and viruses using the peptide of the invention as a clone marker.
2.1 . Localización de una proteína de la superficie celular en células eucariotas. 2.1. Localization of a cell surface protein in eukaryotic cells.
Células de mamífero cultivadas en monocapa son transfectadas con una construcción que codifica para un receptor de superficie fusionado con el péptido de la invención. Las células así transfectadas son tratadas in vivo con AuCI3 1 mM o con AuCI 1 mM durante 10 minutos a 37°C e inmediatamente procesadas mediante fijación química estándar o mediante congelación a alta presión, criosustitución, inclusión en resina acrílica para microscopía electrónica y ultramicrotomía, siguiendo procedimientos estándar. Secciones ultrafinas (50-70 nm) seriadas de la muestra son recolectadas en rejillas de microscopía electrónica y transferidas al microscopio electrónico de transmisión. Los cortes seriados permiten estudiar la distribución de las moléculas de los receptores en la superficie celular a través de la visualización de las pequeñas partículas densas a los electrones asociadas al péptido de la invención (marcador). Monolayer cultured mammalian cells are transfected with a construct that encodes a surface receptor fused with the peptide of the invention. Cells thus transfected are treated in vivo with 1 mM AuCI 3 or 1 mM AuCI for 10 minutes at 37 ° C and immediately processed by standard chemical fixation or by high pressure freezing, cryosubstitution, inclusion in acrylic resin for electron microscopy and ultramicrotomy , following standard procedures. Ultra-thin sections (50-70 nm) of the sample are collected in electron microscopy grids and transferred to the transmission electron microscope. Serial sections allow to study the distribution of receptor molecules on the cell surface through the visualization of small dense particles to electrons associated with the peptide of the invention (marker).
Alternativamente se pueden obtener cortes más gruesos (200-300 nm) de la muestra y estudiarlos mediante tomografía electrónica para la obtención de mapas 3D de los grupos de receptores en la superficie celular y sus cambios en número y organización molecular en distintas situaciones fisiológicas de las células. 2.2. Localización de una proteína durante su transporte intracelular en la ruta endocítica en células eucariotas. Alternatively, thicker sections (200-300 nm) of the sample can be obtained and studied by electronic tomography to obtain 3D maps of the groups of receptors on the cell surface and their changes in number and molecular organization in different physiological situations of the cells. 2.2. Location of a protein during its intracellular transport in the endocytic pathway in eukaryotic cells.
Células de mamífero cultivadas en monocapa son transfectadas con una construcción que codifica para una proteína de interés fusionada con el péptido de la invención. Las células transfectadas son tratadas in vivo con AuCb 1 mM o con AuCI 1 mM durante 17 minutos a 37°C y tras un lavado con medio de cultivo se mantienen en el incubador para que tenga lugar la internalización de la proteína marcada. A distintos tiempos las células vivas son procesadas mediante fijación química estándar o mediante congelación a alta presión, criosustitución inclusión en resina y ultramicrotomía, siguiendo procedimientos estándar. Monolayer cultured mammalian cells are transfected with a construct that encodes a protein of interest fused with the peptide of the invention. Transfected cells are treated in vivo with 1 mM AuCb or 1 mM AuCI for 17 minutes at 37 ° C and after washing with culture medium they are kept in the incubator for internalization of the labeled protein. At different times living cells are processed by standard chemical fixation or by high pressure freezing, cryosubstitution, resin inclusion and ultramicrotomy, following standard procedures.
Secciones ultrafinas (50-70 nm) seriadas de la muestra son recolectadas en rejillas de microscopía electrónica y transferidas al microscopio electrónico de transmisión. Los cortes seriados permiten estudiar la distribución de las moléculas de las proteínas en distintos compartimentos de la ruta endocítica a través de la visualización de las pequeñas partículas densas a los electrones asociadas al péptido de la invención. Ultra-thin sections (50-70 nm) of the sample are collected in electron microscopy grids and transferred to the transmission electron microscope. Serial sections allow studying the distribution of protein molecules in different compartments of the endocytic pathway through the visualization of small dense particles to electrons associated with the peptide of the invention.
Alternativamente se pueden obtener cortes más gruesos (200-300 nm) de la muestra y estudiarlos mediante tomografía electrónica para la obtención de mapas 3D de las partículas de la proteína durante su transporte intracelular. Alternatively, thicker sections (200-300 nm) of the sample can be obtained and studied by electronic tomography to obtain 3D maps of the protein particles during their intracellular transport.
2.3. Localización de una proteína asociada a compartimentos intracelulares en células eucariotas. 2.3. Location of a protein associated with intracellular compartments in eukaryotic cells.
Células de mamífero cultivadas en monocapa son transfectadas con una construcción que codifica para la proteína de interés fusionada con el péptido de la invención. Las células son entonces tratadas con Streptolisina O siguiendo protocolos estándar para abrir poros en la membrana plasmática dejando intacto el sistema de endomembranas y sustituir el citosol de las células por un medio que contiene sales de oro (AuCI 1 mM o AuCb 1 mM) y tratadas en ese medio durante 30 minutos. Las monocapas celulares son entonces procesadas mediante fijación química estándar o mediante congelación a alta presión, criosustitución, inclusión en resina y ultramicrotomía, siguiendo procedimientos estándar. Monolayer cultured mammalian cells are transfected with a construct that encodes the protein of interest fused with the peptide of the invention. The cells are then treated with Streptolysin O following standard protocols to open pores in the Plasma membrane leaving the endomembrane system intact and replacing the cytosol of the cells with a medium containing gold salts (1 mM AuCI or 1 mM AuCb) and treated in that medium for 30 minutes. The cell monolayers are then processed by standard chemical fixation or by high pressure freezing, cryosubstitution, resin inclusion and ultramicrotomy, following standard procedures.
Secciones ultrafinas (50-70 nm) seriadas de la muestra son recolectadas en rejillas de microscopía electrónica y transferidas al microscopio electrónico de transmisión. Los cortes seriados permiten estudiar la distribución de las moléculas de proteína en los orgánulos intracelulares a través de la visualización de las pequeñas partículas densas a los electrones asociadas al péptido de la invención. Alternativamente se pueden obtener cortes más gruesos (200-300 nm) de la muestra y estudiarlos mediante tomografía electrónica para la obtención de mapas 3D de las partículas de la proteína asociada al compartimento intracelular. 2.4. Localización de proteínas en partículas virales. Ultra-thin sections (50-70 nm) of the sample are collected in electron microscopy grids and transferred to the transmission electron microscope. Serial sections allow studying the distribution of protein molecules in intracellular organelles through the visualization of small dense particles to electrons associated with the peptide of the invention. Alternatively, thicker sections (200-300 nm) of the sample can be obtained and studied by electronic tomography to obtain 3D maps of the protein particles associated with the intracellular compartment. 2.4. Location of proteins in viral particles.
Suspensiones de virus purificados (partículas virales inmaduras o partículas virales infectivas) que contienen proteínas quiméricas son tratadas con sales de oro (AuCI 1 mM o AuCb 1 mM durante 15 minutos) e inmediatamente tratadas mediante fijación química estándar o vitrificadas mediante congelación a alta velocidad en etano líquido. Purified virus suspensions (immature viral particles or infective viral particles) containing chimeric proteins are treated with gold salts (1 mM AuCI or 1 mM AuCb for 15 minutes) and immediately treated by standard chemical fixation or vitrified by high-speed freezing in liquid ethane
El estudio de la organización de las moléculas de proteína en las partículas virales se realiza mediante microscopía electrónica de virus incluidos en resina plástica y procesados para ultramicrotomía (cortes ultrafinos seriados) o visualizados directamente en estado vitreo mediante criomicroscopía electrónica. El estudio está orientado a entender la contribución de las proteínas en la arquitectura y función del virus infectivo. The study of the organization of protein molecules in viral particles is carried out by electron microscopy of viruses included in plastic resin and processed for ultramicrotomy (serial ultrafine cuts) or visualized directly in the vitreous state by electronic cryomicroscopy. The study is aimed at understanding the Contribution of proteins in the architecture and function of the infective virus.
2. 5. Localización de proteínas en orqánulos purificados. 2. 5. Location of proteins in purified orchulas.
Orgánulos celulares purificados que contienen proteínas quiméricas son tratados en suspensión con sales de oro (AuCI 1 mM o AuCb 1 mM durante 15 min) e inmediatamente tratados mediante fijación química estándar o vitrificados mediante congelación a alta velocidad en etano líquido. Purified cellular organelles containing chimeric proteins are treated in suspension with gold salts (1 mM AuCI or 1 mM AuCb for 15 min) and immediately treated by standard chemical fixation or vitrified by high-speed freezing in liquid ethane.
El estudio de la organización de las moléculas de proteína en los orgánulos se realiza mediante microscopía electrónica de orgánulos incluidos en resina plástica y procesados para ultramicrotomía (cortes ultrafinos seriados) o visualizados directamente en estado vitreo mediante criomicroscopía electrónica. El estudio está orientado a entender la contribución de las proteínas en la arquitectura y función del orgánulo celular. EJEMPLO 3. Diseño de biosensores para la detección de metales. The study of the organization of protein molecules in organelles is carried out by electron microscopy of organelles included in plastic resin and processed for ultramicrotomy (serial ultrafine cuts) or visualized directly in the vitreous state by electronic cryomicroscopy. The study is aimed at understanding the contribution of proteins in the architecture and function of the cellular organelle. EXAMPLE 3. Design of biosensors for metal detection.
La capacidad de los péptidos de la invención y de la MT o sus fragmentos para unir grupos de átomos de metal que se detectan permite el diseño de biosensores destinados a detectar la presencia de átomos de metal en medios líquidos. El sensor consiste en un péptido de la invención, o en la MT o en un fragmento de la misma, (inmovilizado en un soporte sólido o en suspensión) que al ser expuesto a la suspensión objeto de estudio capta los átomos de metal y formar partículas fácilmente detectables mediante técnicas microscópicas o espectroscópicas, espectrometría de masas o resonancia magnética nuclear. The ability of the peptides of the invention and MT or their fragments to bind groups of metal atoms that are detected allows the design of biosensors intended to detect the presence of metal atoms in liquid media. The sensor consists of a peptide of the invention, or the MT or a fragment thereof, (immobilized on a solid or suspended support) that when exposed to the suspension under study captures the metal atoms and forms particles easily detectable by microscopic or spectroscopic techniques, mass spectrometry or nuclear magnetic resonance.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Péptido aislado que comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 o cualquiera de sus fragmentos que comprenda 7 o más cisternas. one . Isolated peptide comprising the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 or any of its fragments comprising 7 or more cisterns.
2. Péptido según la reivindicación 1 que comprende una secuencia aminoacídica seleccionada de la lista que comprende: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6. 2. A peptide according to claim 1 comprising an amino acid sequence selected from the list comprising: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6.
3. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 fusionado a una proteína. 3. Peptide according to any one of claims 1 or 2 fused to a protein.
4. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 fusionado a una proteína marcadora. 4. Peptide according to any one of claims 1 to 3 fused to a marker protein.
5. Péptido según la reivindicación 4 donde la proteína marcadora es GFP. 5. Peptide according to claim 4 wherein the marker protein is GFP.
6. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 que además comprende unido un grupo de átomos de metal. 6. Peptide according to any one of claims 3 to 5 further comprising a group of metal atoms attached.
7. Péptido según la reivindicación 6 donde el metal se selecciona de la lista que comprende: oro, plata, mercurio, cadmio, zinc, platino o bismuto. 7. Peptide according to claim 6 wherein the metal is selected from the list comprising: gold, silver, mercury, cadmium, zinc, platinum or bismuth.
8. Péptido según la reivindicación 7 donde el metal es oro. 8. Peptide according to claim 7 wherein the metal is gold.
9. Secuencia nucleotídica aislada que codifica para al menos un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5. 9. Isolated nucleotide sequence encoding at least one peptide according to any one of claims 1 to 5.
10. Vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica según la reivindicación 9. 10. Expression vector comprising a nucleotide sequence according to claim 9.
1 1 . Célula que comprende de forma transitoria o de forma estable el péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, la secuencia nucleotídica según la reivindicación 9 o el vector de expresión según la reivindicación 10. eleven . A cell that transiently or stably comprises the peptide according to any one of claims 1 to 8, the nucleotide sequence according to claim 9 or the expression vector according to claim 10.
12. Uso del péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, de la secuencia nucleotídica según la reivindicación 9, del vector según la reivindicación 10 o de la célula según la reivindicación 1 1 para la detección de al menos una proteína mediante microscopía. 12. Use of the peptide according to any of claims 1 to 8, of the nucleotide sequence according to claim 9, of the vector according to claim 10 or of the cell according to claim 1 for the detection of at least one protein by microscopy.
13. Uso según la reivindicación 12 donde la microscopía es correlativa o electrónica. 13. Use according to claim 12 wherein the microscopy is correlative or electronic.
14. Uso según la reivindicación 12, donde la detección de dicha proteína mediante microscopía, comprende además la obtención de al menos una imagen elemental mediante espectroscopia. 14. Use according to claim 12, wherein the detection of said protein by microscopy further comprises obtaining at least one elementary image by spectroscopy.
15. Uso según la reivindicación 14, donde la espectroscopia es espectroscopia electrónica de pérdida de energía o espectroscopia de rayos X. 15. Use according to claim 14, wherein the spectroscopy is electronic energy loss spectroscopy or X-ray spectroscopy.
16. Uso según una de las reivindicaciones 14 ó 15, donde la imagen elemental es una imagen oro. 16. Use according to one of claims 14 or 15, wherein the elementary image is a gold image.
17. Uso del péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para la detección de metales. 17. Use of the peptide according to any of claims 1 to 5 for the detection of metals.
18. Método de detección de al menos una proteína por microscopía que comprende: 18. Method of detecting at least one protein by microscopy comprising:
a. expresar al menos un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 en una célula, en un orgánulo celular o en un virus,  to. expressing at least one peptide according to any one of claims 3 to 5 in a cell, in a cellular organelle or in a virus,
b. tratar la célula, el orgánulo celular o el virus del paso (a) con un metal, y  b. treat the cell, cell organelle or virus of step (a) with a metal, and
c. analizar la célula, el orgánulo celular o el virus del paso (b) mediante microscopía.  C. analyze the cell, the cellular organelle or the virus of step (b) by microscopy.
19. Método según la reivindicación 18 donde el metal del paso (b) se selecciona de la lista que comprende: oro, plata, mercurio, cadmio, zinc, platino o bismuto. 19. Method according to claim 18 wherein the metal of step (b) is selected from the list comprising: gold, silver, mercury, cadmium, zinc, platinum or bismuth.
20. Método según la reivindicación 19 donde el metal es oro. 20. Method according to claim 19 wherein the metal is gold.
21 . Método según la reivindicación 20 donde la fuente de oro es cloruro auroso, cloruro aúrico o aurotiomalato. twenty-one . Method according to claim 20 wherein the gold source is aurous chloride, auric chloride or aurothiomalate.
22. Método según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21 donde la microscopía es correlativa o electrónica. 22. Method according to any of claims 18 to 21 wherein the microscopy is correlative or electronic.
23. Método según la reivindicación 22 que además comprende, entre los pasos (b) y (c), fijar la célula, el orgánulo celular o el virus del paso (b) mediante fijación química o congelación y realizar secciones de entre23. The method according to claim 22, further comprising, between steps (b) and (c), fixing the cell, cell organelle or virus of step (b) by chemical fixation or freezing and making sections between
20 y 500 nm de la célula, el orgánulo celular o el virus previamente fijados. 20 and 500 nm of the cell, the cell organelle or the virus previously fixed.
24. Método según una de las reivindicaciones 18 a 23 donde en la etapa (c), además de analizar la célula, el orgánulo celular o el virus del paso24. Method according to one of claims 18 to 23 wherein in step (c), in addition to analyzing the cell, the cellular organelle or the virus of the passage
(b) mediante microscopía, comprende analizar dicha célula, orgánulo celular o virus mediante al menos una imagen elemental obtenida por espectroscopia. (b) by microscopy, comprises analyzing said cell, organelle cell or virus by at least one elementary image obtained by spectroscopy.
25. Método según la reivindicación 24, donde la espectroscopia es espectroscopia electrónica de pérdida de energía o espectroscopia de rayos X. 25. Method according to claim 24, wherein the spectroscopy is electronic energy loss spectroscopy or X-ray spectroscopy.
26. Método según una de las reivindicaciones 24 ó 25, donde la imagen elemental es una imagen elemental del metal del paso (b). 26. Method according to one of claims 24 or 25, wherein the elementary image is an elementary image of the metal of step (b).
27. Método según una de las reivindicaciones 24 ó 25, donde la imagen elemental es una imagen oro. 27. Method according to one of claims 24 or 25, wherein the elementary image is a gold image.
28. Método según la reivindicación 27, donde la imagen oro se obtiene por espectroscopia electrónica de pérdida de energía. 28. Method according to claim 27, wherein the gold image is obtained by electronic energy loss spectroscopy.
29. Método según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 23 donde la expresión del péptido en el paso (a) se realiza en una célula. 29. Method according to any of claims 18 to 23 wherein the expression of the peptide in step (a) is performed in a cell.
30. Método según la reivindicación 29 donde el tratamiento del paso (b) se realiza con cloruro auroso, cloruro aúrico o aurotiomalato a una concentración de entre 0,1 y 50 mM. 30. A method according to claim 29 wherein the treatment of step (b) is carried out with aurous chloride, auric chloride or aurothiomalate at a concentration of between 0.1 and 50 mM.
31 . Método según la reivindicación 30 donde el tratamiento del paso (b) se realiza durante entre 5 y 60 minutos. 31. Method according to claim 30 wherein the treatment of step (b) is carried out for between 5 and 60 minutes.
32. Método según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31 donde la célula del paso (c) se analiza para la visualización de al menos una proteína de superficie celular y/o de al menos una proteína endocitada in vivo. 32. A method according to any one of claims 29 to 31 wherein the cell of step (c) is analyzed for the visualization of at least one cell surface protein and / or at least one protein in vivo.
33. Método según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31 que además comprende permeabilizar selectivamente la membrana celular entre los pasos (a) y (b). 33. A method according to any of claims 29 to 31 which further comprises selectively permeabilizing the cell membrane between steps (a) and (b).
34. Método según la reivindicación 33 donde la permeabilización selectiva de la membrana celular se realiza mediante Streptolisina O. 34. Method according to claim 33 wherein the selective permeabilization of the cell membrane is performed by Streptolysin O.
35. Método según cualquiera de las reivindicaciones 33 ó 34 donde la célula del paso (c) se analiza para la visualización de al menos una proteína intracelular. 35. Method according to any of claims 33 or 34 wherein the cell of step (c) is analyzed for the visualization of at least one intracellular protein.
36. Método según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 23 donde la expresión del péptido en el paso (a) se realiza en un orgánulo celular o en un virus. 36. Method according to any of claims 18 to 23 wherein the expression of the peptide in step (a) is performed in a cellular organelle or in a virus.
37. Método según la reivindicación 36 donde el tratamiento del paso (b) se realiza con cloruro auroso o cloruro aúrico a una concentración de entre 0,1 y 5 mM. 37. Method according to claim 36 wherein the treatment of step (b) is carried out with aurous chloride or auric chloride at a concentration of between 0.1 and 5 mM.
38. Método según la reivindicación 37 donde el tratamiento del paso (b) se realiza durante entre 5 y 30 minutos. 38. Method according to claim 37 wherein the treatment of step (b) is carried out for between 5 and 30 minutes.
39. Método según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 38 donde en el paso (a) se expresan, en una célula, en un orgánulo celular o en un virus, dos o más péptidos según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 de distinto tamaño fusionados a proteínas diferentes. 39. A method according to any one of claims 18 to 38 wherein in step (a) two or more peptides according to any of claims 3 to 5 of different size fused are expressed in a cell, in a cell organelle or in a virus. to different proteins.
40. Método según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 39 donde en el paso (a) se expresan, en una célula, en un orgánulo celular o en un virus, dos o más péptidos según cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5 de distinto tamaño fusionados a proteínas diferentes y a proteínas marcadoras de diferente color. 40. A method according to any one of claims 18 to 39 wherein in step (a) two or more peptides according to any one of claims 4 or 5 of different size fused are expressed in a cell, in a cell organelle or in a virus. to different proteins and marker proteins of different color.
41 . Método según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 40 donde la célula es eucariota. 41. Method according to any of claims 18 to 40 wherein the cell is eukaryotic.
42. Kit que comprende un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5. 42. Kit comprising a peptide according to any one of claims 1 to 5.
43. Kit según la reivindicación 42 que además comprende las instrucciones para llevar a cabo el método según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 41 . 43. Kit according to claim 42 further comprising the instructions for carrying out the method according to any of claims 18 to 41.
44. Kit que comprende un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, una secuencia nucleotídica según la reivindicación 9, un vector de expresión según la reivindicación 10 o una célula según la reivindicación 1 1 . 44. Kit comprising a peptide according to any one of claims 6 to 8, a nucleotide sequence according to claim 9, an expression vector according to claim 10 or a cell according to claim 1 1.
45. Kit según la reivindicación 44 que además comprende las instrucciones para llevar a cabo el método según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 41 . 45. Kit according to claim 44, further comprising the instructions for carrying out the method according to any of claims 18 to 41.
46. Uso del kit según cualquiera de las reivindicaciones 42 ó 43 para la detección de metales y/o para la detección de al menos una proteína mediante microscopía. 46. Use of the kit according to any of claims 42 or 43 for the detection of metals and / or for the detection of at least one protein by microscopy.
47. Uso del kit según cualquiera de las reivindicaciones 44 ó 45 para la detección de al menos una proteína mediante microscopía. 47. Use of the kit according to any of claims 44 or 45 for the detection of at least one protein by microscopy.
48. Uso del kit según cualquiera de las reivindicaciones 46 ó 47 donde la microscopía es correlativa o electrónica. 48. Use of the kit according to any of claims 46 or 47 wherein the microscopy is correlative or electronic.
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