WO2012080201A2 - Lagerstabiles flüssiges wasch- oder reinigungsmittel enthaltend protease und cellulase - Google Patents

Lagerstabiles flüssiges wasch- oder reinigungsmittel enthaltend protease und cellulase Download PDF

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WO2012080201A2
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    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus

Definitions

  • the invention is in the field of liquid detergents and cleaners. More particularly, the invention relates to liquid enzyme-containing detergents and cleaners containing defined proteases in combination with a cellulase, and further proposes methods in which such agents are used. The invention further relates to uses of defined proteases in flux detergents or cleaners containing a cellulase.
  • proteases of the subtilisin type are preferably used.
  • the proteases used in the detergents or cleaning agents known from the prior art are either originally derived from microorganisms, for example the genera Bacillus, Streptomyces, Humicola or Pseudomonas, and / or are produced according to known biotechnological methods by suitable microorganisms, for example by transgenic expression hosts of the genera Bacillus or by filamentous fungi.
  • a cellulase is an enzyme that catalyzes the hydrolysis of 1,4- ⁇ -D-glucosidic bonds in cellulose (cellobiose), and / or lichenin and / or ⁇ -D-glucans. Often they are able to hydrolyze the 1, 4 bonds in ß-D-glucans, which in addition to 1, 4 bonds also 1, 3 bonds.
  • cellulases have the EC number (English: Enzyme Commission number) 3.2.1 .4 and thus belong to the third of the six major enzyme classes, the hydrolases (EC3. -.-.-), below to the
  • Enzymes that hydrolyze O- and / or S-glycosyl compounds are capable of degrading cellulose to ⁇ -glucose. Consequently cellulases in particular act against residues in the laundry which contain cellulose or cellulose derivatives and catalyze their hydrolysis.
  • proteases or protease variants of the subtilisin type from Bacillus lentus DSM 5483 which are suitable for use in detergents or cleaners.
  • proteases is also one which may have an amino acid substitution R99E, A, S or G.
  • the detergents may contain other enzymes, including a cellulase.
  • the detergents can be solid or liquid.
  • protease- and cellulase-containing liquid detergents and cleaners of the prior art are not sufficiently stable on storage and therefore after a short time they lose a considerable amount of cellulolytic and / or proteolytic, in particular cellulolytic, activity. Often, the presence of protease results in the loss of cellulolytic activity as the protease inactivates the cellulase. The washing or
  • Detergent then shows no more optimal cleaning performance.
  • the object of the present invention is to overcome the mentioned disadvantage and to provide protease- and cellulase-containing liquid washing or cleaning agents which are sufficiently stable or improved in storage, in particular with respect to their cellulolytic activity.
  • An object of the invention is therefore a liquid washing or cleaning agent comprising (a1) a protease which comprises an amino acid sequence which corresponds to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 1 amino acid sequence is at least 80% identical and at position 99 in the count according to SEQ ID NO. 1 has the amino acid glutamic acid (E) or aspartic acid (D), or
  • a protease comprising an amino acid sequence which corresponds to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 1 amino acid sequence is at least 80% identical and at position 99 in the count according to SEQ ID NO. 1 has the amino acid asparagine (N) or glutamine (Q), or (a3) a protease comprising an amino acid sequence corresponding to that shown in SEQ ID NO. 1 amino acid sequence is at least 80% identical and at position 99 in the count according to SEQ ID NO. 1 has the amino acid alanine (A) or glycine (G) or serine (S), and
  • a liquid washing or cleaning agent which contains the combination of such a protease with a cellulase is advantageously storage-stable.
  • it has a higher cellulolytic activity after storage in comparison with a detergent or cleaning agent which differs from an agent according to the invention only by the protease present in the respective agent, wherein in the agents to be compared the protease at the beginning of storage in the same concentration is based on active enzyme.
  • a protease provided in the context of the present invention therefore leads to a reduced inactivation of the cellulase.
  • the reduced inactivation of cellulase by the protease provided in the present invention is not due to insufficient protease activity.
  • An inventive composition has in this regard, and preferably a further good, in particular advantageous, cleaning performance of protease-sensitive soiling.
  • a cleaning performance with respect to at least one protease-sensitive soiling occurs in particular even at low temperatures, for example between 10 ° C and 50 ° C, preferably between 10 ° C and 40 ° C or between 20 ° C and 40 ° C.
  • Such an agent therefore allows a satisfactory or improved removal of at least one, preferably of several protease-sensitive stains on textiles and / or hard surfaces, for example crockery.
  • the present invention thus represents a particularly advantageous selection which leads to obtaining an efficient and storage-stable liquid washing by means, in particular with regard to the proteolytic and / or cellulolytic activity of the agent or residual activity of the agent after storage.
  • cleaning performance is understood to mean the whitening performance on one or more soiling, in particular laundry soiling.
  • stains are blood milk / ink on cotton, full egg / pigment on cotton, chocolate milk / ink on cotton, peanut oil pigment / ink on polyester / cotton, grass on cotton or cocoa on cotton, especially such as indicated below.
  • both the washing or cleaning agent which comprises the protease and the cellulase or the washing or cleaning liquor formed by this agent, and the protease or the cellulase itself have a respective cleaning performance.
  • the cleaning performance of the enzymes thus contributes to the cleaning performance of the agent or the washing or cleaning liquor formed by the agent.
  • the cleaning performance is preferably determined as indicated below.
  • Washing or cleaning liquor is understood as meaning the use solution containing the washing or cleaning agent which acts on textiles or fabrics (wash liquor) or hard surfaces (cleaning liquor) and thus comes into contact with the soiling present on textiles or fabrics or hard surfaces , Usually, the washing or
  • Cleaning liquor when the washing or cleaning process begins and the washing or Detergent example, in a washing machine or other suitable container with water is diluted.
  • a storage stability within the meaning of the invention is when a washing or cleaning agent according to the invention has a higher cellulase activity after storage compared to a control composition which differs from the washing or cleaning agent according to the invention only by the protease contained in the control composition.
  • a washing or cleaning agent according to the invention therefore has a higher residual activity of the cellulase compared to the control.
  • Both means to be compared therefore have the same cellulase quantity or concentration and / or initial cellulolytic activity at the start of storage.
  • the protease is present at the beginning of storage in the same concentration, based on active enzyme, and both agents are treated in the same way, in particular regarding the conditions of storage and the
  • storage is for at least 24 hours, 48 hours, 72 hours, 5 days, 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 4 weeks or 8 weeks. More preferably, the storage is carried out at a temperature of 20 ° C, 25 ° C or 30 ° C, more preferably at 30 ° C.
  • the enzyme activity can in this regard - matched to the respective type of enzyme - done in the usual way. Methods for determining activity are familiar to the expert in the field of enzyme technology and are routinely used by him. Methods for determining the protease activity are disclosed, for example, in Tenside, Vol. 7 (1970), pp. 125-132. The proteolytic activity can be further determined by the release of the
  • the protease cleaves the substrate and releases pNA.
  • the release of pNA causes an increase in absorbance at 410 nm, the time course of which is a measure of enzymatic activity (see Del Mar et al., 1979).
  • the measurement is carried out at a temperature of 25 ° C, at pH 8.6 and a wavelength of 410 nm.
  • the measuring time is 5 min. at a measuring interval of 20s to 60s.
  • the protease activity is preferably indicated in PE (protease units).
  • the cellulase activity is determined in the usual way. Preferably, the cellulase activity is determined as indicated below.
  • Cellulases release glucose from CMC (carboxymethylcellulose).
  • CMC carboxymethylcellulose
  • the samples to be examined are incubated with a substrate (1.25% CMC).
  • PAHBAH p-hydroxybenzoic acid hydrazide
  • Condition is one alkaline pH during the color reaction. The amount of released sugar corresponding to the color is a measure of the enzyme activity (compare Lever, Anal. Biochem., 1972, 47 & 1977, 81).
  • the presence of enzyme stabilization in the context of the present invention is particularly preferably determined as indicated above using a protease and cellulase-containing liquid washing or cleaning agent which is stored for at least four and at most eight weeks at a temperature of 30 ° C.
  • the proteolytic activity is determined via the release of the chromophore para-nitroaniline (pNA) from the substrate suc-AAPF-pNA, and the cellulolytic activity is determined as indicated above.
  • the protease contained in a washing or cleaning agent according to the invention comprises an amino acid sequence which corresponds to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 1 amino acid sequence is at least 80% identical and at position 99 in the count according to SEQ ID NO. 1, the amino acid glutamic acid (E) or aspartic acid (D) or the amino acid asparagine (N) or glutamine (Q) or the amino acid alanine (A) or glycine (G) or serine (S).
  • amino acid sequence is at least 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% %, 96%, 97%, 98% and most preferably 99% identical to that shown in SEQ ID NO. 1 indicated amino acid sequence.
  • SEQ ID NO. Figure 1 is the sequence of the mature (mature) alkaline protease from Bacillus lentus DSM 5483, which is disclosed in International Patent Application WO 92/21760, the disclosure of which is incorporated herein by reference.
  • storage-stable liquid detergent is obtained, in particular with regard to the remaining cellulolytic activity after storage, in particular after a storage period of increasingly preferably 24 hours, 48 hours, 72 hours, 5 days, 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 4 weeks or 8 weeks.
  • a protease contained in a washing or cleaning agent according to the invention has a proteolytic activity, that is, it is capable of hydrolysing peptide bonds of a polypeptide or protein. It is therefore an enzyme which catalyzes the hydrolysis of peptide bonds and thereby is able to cleave peptides or proteins. It is especially a subtilase and most preferably a subtilisin.
  • a cellulase is an enzyme as described in the introduction. For cellulases, synonymous terms may be used, especially endoglucanase, endo-1, 4-beta-glucanase,
  • Crucial for determining whether an enzyme is a cellulase according to the invention is its ability to hydrolyze 1, 4-.beta.-D-glucosidic bonds in cellulose.
  • Cellulases (endoglucanases, EG) which can be synthesized according to the invention comprise, for example, the fungal cellulase preparation rich in endoglucanase (EG) or its derivatives
  • Celluzyme® is offered. Endolase® and Carezyme®, also available from Novozymes, are based on the 50 kD EG or 43 kD EG from Humicola insolens DSM 1800. Further commercial products of this company are Cellusoft®, Renozyme® and Celluclean®. Continue to be used, for example
  • Ecostone® and Biotouch® which are based at least in part on the 20 kD EG from Melanocarpus.
  • Other cellulases from AB Enzymes are Econase® and Ecopulp®.
  • Other suitable cellulases are from Bacillus sp. CBS 670.93 and CBS 669.93, those derived from Bacillus sp. CBS 670.93 is available from the company Danisco / Genencor under the trade name Puradax®.
  • Other usable commercial products of the company Danisco / Genencor are "Genencor detergent cellulase L" and lndiAge®Neutra.
  • variants of these enzymes obtainable by point mutations can be used according to the invention.
  • Particularly preferred cellulases are Thielavia terrestris cellulase variants disclosed in International Publication WO 98/12307, cellulases from Melanocarpus, in particular Melanocarpus albomyces, which are described in International
  • WO 97/14804 discloses cellulases of the EGIII type from Trichoderma reesei which are disclosed in European patent application EP 1 305 432 or variants obtainable therefrom, in particular those disclosed in the European patent applications
  • the respective disclosure is therefore expressly referred to, or the disclosure content of which in this respect is therefore expressly included in the present patent application.
  • the washing or cleaning agent is characterized in that the protease is further counted according to SEQ ID NO. 1 has at least one of the following amino acids:
  • the protease therefore has one or more of the abovementioned amino acids at the respective positions.
  • These amino acids can bring about further advantageous properties and / or enhance already existing properties.
  • the abovementioned amino acids bring about an increase in the proteolytic activity and / or the stability of the protease in a liquid washing or cleaning agent or in the wash liquor formed by this washing or cleaning agent.
  • Detergent containing a cellulase is thus likewise obtained a particularly storage-stable liquid detergent, in particular with respect to its remaining cellulolytic activity after storage, but preferably also with regard to its remaining proteolytic activity after storage, in particular after a storage period of increasingly preferably 24 hours, 48 hours, 72 Hours, 5 days, 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 4 weeks or 8 weeks. Furthermore, such an agent shows improved cleaning performance on protease- and / or cellulase-sensitive stains.
  • the amino acid positions are determined here by an alignment of the amino acid sequence of the protease to be used with the amino acid sequence of the protease from Bacillus lentus, as described in SEQ ID NO. 1 is defined. Since the Bacillus lentus protease of the prior art is an important reference molecule for describing proteases and amino acid changes, it is advantageous to refer in the assignment of amino acid positions to the enumeration of the protease from Bacillus lentus (SEQ ID NO: 1). Furthermore, the count depends on the mature (mature) protein. This assignment is also to be used in particular if the amino acid sequence of the protease to be used comprises a higher number of amino acid residues than the protease from Bacillus lentus according to SEQ ID NO. 1 .
  • the amino acid positions in a protease to be used according to the invention are those which are just assigned to these positions in an alignment.
  • particularly advantageous positions are therefore the positions 3, 4, 61, 154, 188, 193, 199 and 21 1, assign in an alignment with SEQ ID NO. 1 and thus in the count according to SEQ ID NO. 1 .
  • the following amino acid residues are present in the wild-type molecule of the protease from Bacillus lentus: S3, V4, G61, S154, A188, V193, V199, and L21 1.
  • amino acids 3T, 41, 61A, 154D, 154E, 21 1 D, 21 1 G and 21 1 E are particularly preferred.
  • exchanges 3T and 41 lead to a stabilizing effect on the molecule
  • Amino acid-long amino acid sequence or 99.64%, 99.27%, 98.91%, 98.55%, 98.18%, 97.82%, 97.45%, 97.09% and 96.73%, respectively at a 275 amino acids long
  • nucleic acid or amino acid sequences is determined by a sequence comparison. Such a comparison is made by assigning similar sequences in the nucleotide sequences or amino acid sequences to each other.
  • This sequence comparison is preferably based on the BLAST algorithm established and commonly used in the prior art (see, for example, Altschul, SF, Gish, W., Miller, W., Myers, EW & Lipman, DJ (1990) "Basic local alignment search tool. "J. Mol. Biol. 215: 403-410, and Altschul, Stephan F. Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller, and David J.
  • Another algorithm available in the prior art is the FASTA algorithm. Sequence comparisons (alignments), in particular multiple sequence comparisons, are usually created using computer programs.
  • Sequence comparisons and alignments are preferably created using the Vector NTI® Suite 10.3 computer program (Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, California, USA) with default default parameters.
  • Identity and / or homology information can be made about whole polypeptides or genes or only over individual regions. Homologous or identical regions of different nucleic acid or amino acid sequences are therefore defined by matches in the sequences. They often have the same or similar functions. They can be small and comprise only a few nucleotides or amino acids. Often, such small regions exert essential functions for the overall activity of the protein. It may therefore be useful to relate sequence matches only to individual, possibly small areas. Unless stated otherwise, identity or homology information in the present application, however, refers to the total length of the respectively indicated nucleic acid or amino acid sequence.
  • protease comprises an amino acid sequence identical to that shown in SEQ ID NO. 1 amino acid sequence indicated above is identical and which consists of a protease according to SEQ ID NO. 1 is obtained by single or multiple conservative amino acid substitution, wherein the protease at position 99 still has one of the amino acids provided for this position as described above.
  • conservative amino acid substitution means the
  • Cleaning agent further characterized in that its cleaning performance is at least equal to that of a detergent containing a protease comprising an amino acid sequence corresponding to that shown in SEQ ID NO. 2 or SEQ ID NO. 3 or SEQ ID NO. 4 or SEQ ID NO. 5 or SEQ ID NO. 6 or SEQ ID NO. 7 or SEQ ID NO. 8, particularly preferably in SEQ ID NO. 2, indicated amino acid sequence corresponds.
  • the cleaning performance is determined in a washing system containing a cellulase-containing detergent in a dosage between 2.0 and 9.0 grams per liter of wash liquor and the protease, wherein the proteases to be compared in concentration (based on active protein) are used and the cleaning performance against one or more of the soils blood milk / ink on cotton, whole egg / pigment (wholegrain / soot) on cotton, peanut oil pigment / ink on polyester / cotton and grass on cotton, especially against one or more of the stains
  • the detergent for the washing system is a liquid detergent which is as follows
  • coconut fatty acids 0.5% HEDP (1-hydroxyethane- (1,1-di-phosphonic acid)), 0-0.4% PVP (polyvinylpyrrolidone), 0-0.05% optical brightener, 0-0.001% dye , 0.0002-0.06% cellulase (active protein), preferably Ecostone N400® (cellulase preparation from AB Enzymes), remainder demineralized water.
  • the protease is used in the detergent in a concentration of 0.001-0.1%, preferably 0.01 to 0.06%, based on active protein.
  • the dosage of the liquid detergent is between 2.0 and 9.0, preferably between 3.0 and 8.2, between 4.0 and 7.5 and more preferably 4.7 grams per liter of wash liquor.
  • Washing takes place in a pH range between pH 8 and pH 10.5, preferably between pH 8 and pH 9. Neither the protease nor the cellulase activity in the wash liquor are equal to zero at the beginning of the wash.
  • the degree of whiteness i. the brightening of stains, as a measure of the cleaning performance is determined by optical measuring methods, preferably photo metric.
  • a suitable device for this purpose is for example the spectrometer Minolta CM508d.
  • the devices used for the measurement are previously calibrated with a white standard, preferably a supplied white standard.
  • Cleaning agent further characterized in that its storage stability at least equal to that of a detergent or cleaning agent which includes a protease, the one
  • Amino acid sequence comprising the in SEQ ID NO. 2 or SEQ ID NO. 3 or SEQ ID NO. 4 or SEQ ID NO. 5 or SEQ ID NO. 6 or SEQ ID NO. 7 or SEQ ID NO. 8, particularly preferably in SEQ ID NO. 2, indicated amino acid sequence corresponds.
  • Such storage stability is present when the washing or cleaning agent according to the invention after an eight-week storage at 30 ° C has an equal or higher cellulase activity than the detergent or detergent to be used for comparison, wherein the
  • inventive agent only by the contained protease of the as a comparison
  • the agent to be used for comparison is a liquid detergent composed as follows (all figures in weight percent): 0.3-0.5% xanthan gum, 0.2-0.4% anti-foaming agent , 6-7% glycerol, 0.3-0.5% ethanol, 4-7% FAEOS (fatty alcohol ether sulfate), 24-28% nonionic surfactants, 1% boric acid, 1 -2% sodium citrate
  • Starting activity contain the protease in the same concentration based on active enzyme, and both agents are treated in the same manner.
  • the proteolytic activity in the agents is determined in each case by the release of the chromophore para-nitroaniline (pNA) from the substrate suc-AAPF-pNA, and their cellulolytic activity is determined in each case as indicated above.
  • the initial activities for the protease and the cellulase in the respective agent are not equal to zero.
  • subtilisins are formed as so-called pre-proteins, ie together with a propeptide and a signal peptide, the function of the pre-proteins
  • Signal peptide is usually to ensure the discharge of the protease from the cell producing it into the periplasm or surrounding the cell medium, and the propeptide is usually necessary for the correct folding of the protease.
  • the signal peptide and the propeptide are usually the N-terminal part of the preprotein.
  • the signal peptide is cleaved from the rest of the protease under natural conditions by a signal peptidase. Subsequently, the correct final folding of the protease supported by the propeptide takes place. The protease is then in its active form and cleaves off the propeptide itself.
  • the then mature protease in particular subtilisin, exerts its catalytic activity without the originally present N-terminal amino acids.
  • the mature (mature) proteases ie the enzymes processed after their preparation, are preferred over the preproteins.
  • the proteases may also be modified from the cells producing them after the production of the polypeptide chain, for example by attachment of sugar molecules, formylations, aminations, etc. Such modifications are posttranslational modifications and may, but need not, exert any influence on the function of the protease.
  • the mature protease can be shortened at its N-terminal and / or C-terminal end, so that a comparison with SEQ ID NO. 1 or SEQ ID NO. 2 or SEQ ID NO. 3 or SEQ ID NO. 4 or SEQ ID NO. 5 or SEQ ID NO. 6 or SEQ ID NO. 7 or SEQ ID NO. 8 shortened protease, ie a fragment is contained in the washing or cleaning agent according to the invention. All identity data refer in this case to the region in which the respective fragment in an alignment SEQ ID NO. 1 is assigned. In any case, the respective fragment contains the position corresponding to position 99 in an alignment with SEQ ID NO. 1, and has a corresponding amino acid at this position.
  • a fragment also includes one or more of the other positions described above and has a corresponding amino acid there. Furthermore, such a fragment is proteolytically active.
  • a further preferred fragment comprises a
  • the cleaning performance and / or storage stability of a liquid detergent or cleaning agent according to the invention with such a fragment at least equal to that of a washing or
  • a detergent containing a protease comprising an amino acid sequence which is as described in SEQ ID NO. 2 or SEQ ID NO. 3 or SEQ ID NO. 4 or SEQ ID NO. 5 or SEQ ID NO. 6 or SEQ ID NO. 7 or SEQ ID NO. 8 corresponds to the amino acid sequence indicated, each determined as indicated above.
  • Another object of the invention is a liquid detergent or cleaning composition
  • a liquid detergent or cleaning composition comprising (a) a protease selected from the group consisting of
  • Protease comprising an amino acid sequence according to SEQ ID NO. 2 or SEQ ID NO. 3 or SEQ ID NO. 4 or SEQ ID NO. 5 or SEQ ID NO. 6 or SEQ ID NO. 7 or SEQ ID NO. 8th;
  • Proteases which have a version opposite SEQ ID NO. 2 or SEQ ID NO. 3 or SEQ ID NO. 4 or SEQ ID NO. 5 or SEQ ID NO. 6 or SEQ ID NO. 7 or SEQ ID NO. 8 in at least one position modified amino acid sequence, wherein the change in the count according to SEQ ID NO. 1 is selected from the group consisting of: i. Threonine at position 3 (3T),
  • proteases are very particularly preferably used in a liquid washing or cleaning agent according to the invention. They are based on SEQ ID NO. 1 obtained by the substitution of the amino acid arginine at position 99 by the amino acid glutamic acid (E) or aspartic acid (D) or the amino acid asparagine (N) or glutamine (Q) or the amino acid alanine (A) or glycine (G) or serine ( S) in the count according to SEQ ID NO. 1 . These amino acid sequences are shown in the sequence listing as SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 and SEQ ID NO. 8 indicated.
  • these proteases may have one or more of the above-described amino acids in positions 3, 4, 61, 154, 188, 193, 199 and 21 1 in an alignment with SEQ ID NO. 1 and thus in the count according to SEQ ID NO. 1 .
  • the amino acids mentioned for these positions also bring about further advantageous properties in these proteases and / or reinforce existing ones
  • Embodiments - if applicable - apply accordingly to these particularly preferred proteases.
  • An agent of the invention will more preferably contain the protease in an amount of 1 x 10 -8 wt%, from 0.0001 to 1 wt%, from 0.0005 to 0.5 wt%, from 0.001 to 0.1% by weight and more preferably from 0.001 to 0.06% by weight, based on active protein
  • agent according to the invention increasingly preferably contains the cellulase in an amount of from 1 ⁇ 10 -8 to 5% by weight, from 0.00001 to 1% by weight, from 0.00005 to 0.5% by weight, from 0, 0001 to 0.1 wt .-% and particularly preferably from 0.0001 to 0.065 wt .-%, based on active protein.
  • Protein concentration can be determined by known methods, for example the BCA method (bicinchoninic acid, 2,2'-biquinolyl-4,4'-dicarboxylic acid) or the biuret method (AG Gornall, CS Bardawill and MM David, J. Biol. Chem., 177 (1948), pp. 751-766).
  • BCA bisinchoninic acid
  • biuret AG Gornall, CS Bardawill and MM David, J. Biol. Chem., 177 (1948), pp. 751-766.
  • the determination of the active protein concentration was carried out by titration of the active sites using a suitable irreversible inhibitor (for proteases, for example phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)) and determination of the residual activity (see M. Bender et al., J. Am. Chem , 24 (1966), pp. 5890-5913).
  • PMSF phenylmethylsulfonyl flu
  • protease and / or cellulase may also be adsorbed to carriers and / or embedded in encapsulants to protect against premature inactivation.
  • the washing or cleaning agent is characterized in that it further comprises a component which is selected from
  • anionic and / or polyanionic substance i. anionic and / or polyanionic substance, and / or
  • the substances indicated are anionic or polyanionic substances, ie these substances carry at least one and preferably several negative charges. It is preferably a polymer having at least one negatively charged monomer, preferably having a plurality of negatively charged monomers. According to the invention, this polymer is therefore a negatively charged polymer.
  • preferred polymers of organic acids or their salts in particular polyacrylates and / or poly-sugar acids and / or polyarcylate copolymers and / or poly-sugar copolymers.
  • further preferred compounds are polyacrylic sulfonates or polycarboxylates and their salts, copolymers or salts of the copolymers. Examples of particularly preferable substances to be used are Acusol 587D (polyacrylic sulfonate, Rohm & Haas / Dow Chemical Co.), Acusol 445N (sodium polycarboxylate salt;
  • the substances indicated are cationic or polycationic substances, i. these substances carry at least one and preferably several positive charges. It is preferably a polymer having at least one positively charged monomer, preferably having a plurality of positively charged monomers. According to the invention, this polymer is therefore a positively charged polymer.
  • preferred compounds in this regard are salts of polyamines, polyethylene imines or their copolymers, salts of polyallylamines, salts of Polydiallyldimethylammonium compounds or poly (acrylamide-c-diallyldimethylammonium compounds.
  • under iii. specified substances are substances which have at least one hydroxyl and / or polyhydroxyl group and preferably more hydroxyl and / or polyhydroxyl groups.
  • Preferred in this regard are, for example, polyvinyl alcohols, for example those which are available under the trade name Mowiol (Kremer Pigmente GmbH & Co. KG).
  • a specific substance to one or more of the above groups i. to iii. may be associated.
  • it may be an anionic polymer having one or more hydroxyl and / or polyhydroxyl group (s). Such a substance is then associated with the groups i. and iii.
  • a derivative is understood as meaning a substance which is chemically modified starting from one of the abovementioned substances, for example by the conversion a side chain or by covalent attachment of another compound to the substance.
  • a compound may be, for example, low molecular weight compounds such as lipids or mono-, oligo- or polysaccharides or amines or amine compounds.
  • the substance may be glycosylated, hydrolyzed, oxidized, N-methylated, N-formylated, N-acetylated or methyl, formyl, ethyl, acetyl, t-butyl, anisyl, benzyl, trifluoroacetyl, N-hydroxysuccinimides, t-butyloxycarbonyl, benzoyl , 4-methylbenzyl, thioanizyl, thiocresyl, benzyloxymethyl, 4-nitrophenyl, benzyloxycarbonyl, 2-nitrobenzoyl, 2-nitrophenylsulphenyl, 4-toluenesulphonyl, pentafluorophenyl, diphenylmethyl, 2-chlorobenzyloxycarbonyl, 2,4,5-trichlorophenyl, 2-bromobenzyloxycarbonyl, 9 Fluorenylmethyloxycarbonyl, tripheylmethyl, 2,2,
  • a derivative is to be understood as meaning the covalent or noncovalent binding of the substance to a macromolecular carrier, as well as noncovalent inclusion in suitable macromolecular cage structures.
  • couplings with other macromolecular compounds, such as polyethylene glycol may be made.
  • -R 1 is H, - R, - N0 2, - CN, halide substituent, - N 3, - C1 -8 alkyl, - (CH 2) NC0 2 R 2, - C2-8 alkenyl-C0 2 R 2, - 0 (CH (C 0) NR2R3, - - 2) NC0 2 R 2, P (0) (OR2) 2, alkyl substituted tetrazol-5-yl, - (CH 2) n O (CH 2) n aryl, - NR2R3, - (CH 2 ) n OR2, - (CH 1) n SR 2 , - N (R 2 ) C (O) R 3, - S (O 2) NR 2 R 3, - N (R 2 ) S (O 2 ) R 3, - (CHR 2) n NR 2 R 3, C (0) R3, (CH 2) n N (R3) C (0) R3, - N (R2) CR2R3, substituted or unsubstituted
  • R 2 is H, halide substituent, -alkyl, -haloalkyl, - (CH 2 ) n -phenyl, - (CH 2 ) 1 -3-biphenyl,
  • R1 and R3 may be the same or different; -R3 is H, - OH, - CN, substituted alkyl, - C 2 to C 8 alkenyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, - N (R1) R2, saturated or unsaturated C 5 to C 7 heterocycle or
  • -R 4 is H, - (CH 2) n OH, - C (0) OR5, - C (0) SR5, - (CH 2) n C (0) NR6R7, - O- C (O) - O- R6, a
  • n is a number between 0 and 4.
  • -R6 is - C (R7) - (CH2) n-O- C (O) - R 8, - (CH 2) n C (R7) - O- C (0) R8, - (CH 2) n - C (R 7) - O - C (O) - O - R 8, or - C (R 7) - (CH 2 ) n - O - C (O) - O - R 8; where n is a number between 0 and 4; and
  • R 7 and R 8 are each H, alkyl, substituted alkyl, aryl, substituted aryl, alkenyl,
  • R 7 and R 8 may be the same or different.
  • An inventive liquid detergent or cleaning agent can be used as such or after dilution with water for the cleaning of textiles and / or hard surfaces.
  • Such dilution can be readily made by diluting a measured amount of the agent in a further amount of water in certain weight ratios of agent: water and optionally shaking this dilution to ensure even distribution of the agent in the water.
  • Possible weight or volume ratios of the dilutions are from 1: 0 means: water to 1: 10,000 or 1: 20000 means: water, preferably from 1:10 to 1: 2000 means: water.
  • liquid or flowable liquids can be used as liquid washing or cleaning agents
  • "flowable” are agents which are pourable and can have viscosities of up to several tens of thousands of mPas
  • the viscosity can be determined by conventional standard methods (for example Brookfield LVT-II viscometer at 20 rpm and 20 C., spindle 3) and is preferably in the range from 5 to 10000 mPas
  • Preferred agents have viscosities of from 10 to 8000 mPas, with values between 120 and 3000 mPas being particularly preferred
  • the invention may therefore also be gelatinous or paste-like, it may be in the form of a homogeneous solution or suspension, and it may for example be sprayable or compounded in other customary dosage forms possible types of detergents, in particular detergents for textiles, carpets or natural fibers. They can be provided for manual and / or machine application.
  • the detergents also include washing aids that are used in manual or machine
  • Textile laundry be added to the actual detergent to achieve a further Wrkung.
  • the cleaning agents are all, also in all mentioned
  • Dosage forms occurring means for cleaning and / or disinfecting hard
  • Textile pre- and post-treatment are finally on the one hand such means with which the garment is brought into contact before the actual laundry, for example, for solving stubborn dirt, on the other hand, those in one of the actual textile laundry downstream step the laundry further desirable Give properties such as a comfortable grip, crease resistance or low static charge.
  • Disinfectants are, for example, hand disinfectants, surface disinfectants and instrument disinfectants, also mentioned in the
  • Dosage forms may occur.
  • the washing or cleaning agent is characterized in that it comprises at least one further ingredient, in particular one selected from the group consisting of phosphonate, surfactant, builder, non-aqueous solvent, acid, water-soluble Salt,
  • Phosphonates are salts and organic compounds, especially esters, of phosphonic acid.
  • Inorganic phosphonates are formed, for example, by reaction of phosphonic acid HP (O) (OH) 2 , in particular the stable tautomeric form of phosphorous acid with a (primary) or two (secondary) equivalents of base, for example alkali metal hydroxide.
  • Their general structure is
  • Particularly preferred phosphonates in the context of the present invention include, in particular, organophosphonates, such as, for example, 1-hydroxyethane-1,1-diphosphonic acid (HEDP), aminotri (methylenephosphonic acid) (ATMP, also termed amino-tris (methylenephosphonic acid) or nitrolotris (methylenephosphonic acid) ( NTMP)), diethylenetriamine penta (methylenephosphonic acid) (DTPMP or DETPMP or DTPNT), ethylenediaminetetra (methylenephosphonic acid) (EDTMP, also referred to as ethylenediaminetetra (methylenephosphonic acid) and 2-phosphonobutane-1,2,4-tricarboxylic acid (PBS-AM , also referred to as 2-phosphonobutane-1, 2,4-tricarboxylic acid or 3-carboxy-3-phosphonoadipic acid), which are mostly used in the form of their ammonium or alkali metal salts.
  • organophosphonates such
  • the phosphonate is present in an amount of from 0.01 to 2.5 wt.%, And more preferably from 0.02 to 2 wt.%, From 0.03 to 1.5 wt.% And especially from 0, From 05 to 1% by weight in the washing or cleaning agent.
  • surfactant (s) it is possible to use anionic, nonionic, zwitterionic and / or amphoteric surfactants. From an application point of view, preference is given to mixtures of anionic and nonionic surfactants.
  • the total surfactant content of the liquid washing or cleaning agent is preferably below 60% by weight and more preferably below 45% by weight, based on the total liquid washing or cleaning agent.
  • Suitable nonionic surfactants include alkoxylated fatty alcohols, alkoxylated
  • Fatty acid alkyl esters Fatty acid alkyl esters, fatty acid amides, alkoxylated fatty acid amides, polyhydroxy fatty acid amides, alkylphenol polyglycol ethers, amine oxides, alkyl polyglucosides and mixtures thereof.
  • the nonionic surfactants used are preferably alkoxylated, advantageously ethoxylated, in particular primary, alcohols having preferably 8 to 18 carbon atoms and on average 1 to 12 moles of ethylene oxide (EO) per mole of alcohol, in which the alcohol radical can be linear or preferably methyl-branched in the 2-position or linear and methyl-branched radicals in the mixture can contain, as they are usually present in Oxoalkoholresten.
  • alcohol ethoxylates with linear radicals of alcohols of native origin having 12 to 18 carbon atoms, for example of coconut, palm, tallow or oleyl alcohol, and on average 2 to 8 EO per mole of alcohol are preferred.
  • the preferred ethoxylated alcohols include, for example, C 12-14 alcohols with 3 EO, 4 EO or 7 EO, C 7-18 alcohol with 7 EO, C 13 . 15 -alcohols with 3 EO, 5 EO, 7 EO or 8 EO, C 2 -8 alcohols with 3 EO, 5 EO or 7 EO and mixtures of these, such as Mixtures of C 2 -i 4 -alcohol with 3 EO and C 2 -i 8 -alcohol with 7 EO.
  • Levels of ethoxylation represent statistical averages, which may be an integer or a fractional number for a particular product.
  • Preferred alcohol ethoxylates have a narrow homolog distribution (narrow rank ethoxylates, NRE).
  • fatty alcohols with more than 12 EO can also be used. Examples include tallow fatty alcohol with 14 EO, 25 EO, 30 EO or 40 EO.
  • Nonionic surfactants containing EO and PO groups together in the molecule can also be used according to the invention.
  • washing, cleaning, aftertreatment or washing aid contains a C 2 -i 8-fatty alcohol with 7 EO or a C 3 . 5 -Oxoalkohol with 7 EO as nonionic surfactant.
  • the content of nonionic surfactants in the washing or cleaning agent is preferably 3 to 40 wt .-%, preferably 5 to 30 wt .-% and in particular 7 to 20 wt .-%, each based on the total detergent or cleaning agent.
  • the washing or cleaning agent may also contain anionic surfactants.
  • the anionic surfactant used is preferably sulfonates, sulfates, soaps, alkyl phosphates, anionic silicone surfactants and mixtures thereof.
  • the surfactants of the sulfonate type are preferably C 9 . 3- alkyl benzene sulphonates,
  • Olefinsulfonate ie mixtures of alkene and hydroxyalkanesulfonates and disulfonates, as obtained for example from C 2 -i 8 monoolefins with terminal or internal double bond by sulfonation with gaseous sulfur trioxide and subsequent alkaline or acid hydrolysis of the sulfonation, into consideration.
  • Alk (en) ylsulfates are the alkali metal and in particular the sodium salts of
  • Sulfuric acid half esters of C 2 -C 8 fatty alcohols for example from coconut fatty alcohol,
  • Tallow fatty alcohol, lauryl, myristyl, cetyl or stearyl alcohol or the C 0 -C 20 oxo alcohols and those half-esters of secondary alcohols of these chain lengths are preferred.
  • the C 2 -C 6 alkyl sulfates and C 2 -C 5 alkyl sulfates and C 4 -C 5 alkyl sulfates are preferred.
  • 2,3-alkyl sulfates are also suitable anionic surfactants.
  • 2 i-alcohols such as 2-methyl-branched Cg- alcohols having an average of 3.5 moles of ethylene oxide (EO) or C 2 -8 fatty alcohols having 1 to 4 EO, are suitable.
  • anionic surfactants are soaps.
  • Suitable are saturated and unsaturated fatty acid soaps, such as the salts of lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, (hydrogenated) erucic acid and behenic acid and, in particular, soap mixtures derived from natural fatty acids, for example coconut, palm kernel, olive oil or tallow fatty acids.
  • the anionic surfactants including the soaps may be in the form of their sodium, potassium or magnesium or ammonium salts.
  • the anionic surfactants are in the form of their sodium salts.
  • Further preferred counterions for the anionic surfactants are also the protonated forms of choline, triethylamine or methylethylamine.
  • the content of anionic surfactants in a washing or cleaning agent may be from 1 to 40% by weight, preferably from 5 to 30% by weight and most preferably from 10 to 25% by weight, based in each case on the total washing or cleaning agent ,
  • builders which may be present in the washing or cleaning agent, in particular silicates, aluminum silicates (in particular zeolites), carbonates, salts of organic di- and polycarboxylic acids and mixtures of these substances may be mentioned.
  • Organic builders which may be present in the washing or cleaning agent are, for example, the polycarboxylic acids which can be used in the form of their sodium salts, polycarboxylic acids meaning those carboxylic acids which carry more than one acid function.
  • these are citric acid, adipic acid, succinic acid, glutaric acid, malic acid, tartaric acid, maleic acid, fumaric acid, sugar acids, aminocarboxylic acids,
  • NTA Nitrilotriacetic acid
  • MGDA methylglycine diacetic acid
  • Preferred salts are the salts of polycarboxylic acids such as
  • Citric acid Citric acid, adipic acid, succinic acid, glutaric acid, tartaric acid, sugar acids and
  • polymeric polycarboxylates are suitable. These are, for example, the alkali metal salts of polyacrylic acid or polymethacrylic acid, for example, those having a molecular weight of 600 to 750,000 g / mol.
  • Suitable polymers are, in particular, polyacrylates, which preferably have a molecular weight of from 1, 000 to 15, 000 g / mol. Because of their superior solubility, the short-chain polyacrylates, which have molecular weights of from 1 000 to 10 000 g / mol, and particularly preferably from 1 000 to 5 000 g / mol, may again be preferred from this group.
  • copolymeric polycarboxylates in particular those of acrylic acid with methacrylic acid and of acrylic acid or methacrylic acid with maleic acid.
  • the polymers may also contain allylsulfonic acids, such as allyloxybenzenesulfonic acid and methallylsulfonic acid, as a monomer.
  • soluble builders such as, for example, citric acid, or acrylic polymers having a molar mass of from 1 000 to 5 000 g / mol, preferably in the liquid detergents or cleaners.
  • the molecular weights stated for polymeric polycarboxylates are weight-average molecular weights M w of the particular acid form, which were determined in principle by means of gel permeation chromatography (GPC), a UV detector being used. The measurement was carried out against an external polyacrylic acid standard, which provides realistic molecular weight values due to its structural relationship with the polymers investigated. These data differ significantly from the molecular weight data in which
  • Polystyrene sulfonic acids are used as standard.
  • the molar masses measured against polystyrenesulfonic acids are generally significantly higher than the molecular weights specified in this document.
  • organic builder substances may be present in amounts of up to 40% by weight, in particular up to 25% by weight and preferably from 1% by weight to 8% by weight. Quantities close to the stated upper limit are preferably used in pasty or liquid, in particular hydrous, agents.
  • washing or cleaning agents according to the invention are liquid and preferably contain water as the main solvent.
  • the washing or cleaning agent can be any suitable washing or cleaning agent.
  • non-aqueous solvents are added.
  • Suitable non-aqueous solvents include mono- or polyhydric alcohols, alkanolamines or glycol ethers, provided that they are miscible with water in the specified concentration range.
  • the solvents are selected from ethanol, n-propanol, i-propanol, butanols, glycol, propanediol, butanediol, glycerol, diglycol, propyldiglycol, butyldiglycol, hexylene glycol, ethylene glycol methyl ether,
  • the washing or cleaning agent contain a polyol as a nonaqueous solvent.
  • the polyol may in particular comprise glycerol, 1, 2-propanediol, 1, 3-propanediol, ethylene glycol, diethylene glycol and / or dipropylene glycol.
  • the washing or cleaning agent contains a mixture of a polyol and a monohydric alcohol.
  • Non-aqueous solvents may be used in the washing or cleaning agent in amounts between 0.5 and 15 wt .-%, but preferably below 12 wt .-% and.
  • the agents systemic and environmentally friendly acids especially citric acid, acetic acid, tartaric acid, malic acid, lactic acid, glycolic acid, succinic acid, glutaric acid and / or adipic acid, but also, mineral acids, in particular sulfuric acid, or bases, in particular ammonium or alkali metal hydroxides.
  • Such pH regulators are present in the compositions in amounts of preferably not more than 20% by weight, in particular from 1.2% by weight to 17% by weight.
  • An agent according to the invention may further contain one or more water-soluble salts, which serve for example for viscosity adjustment.
  • These may be inorganic and / or organic salts.
  • Useful inorganic salts are preferably selected from the group consisting of colorless water-soluble halides, sulfates, sulfites, carbonates, bicarbonates, nitrates, nitrites, phosphates and / or oxides of the alkali metals, alkaline earth metals, aluminum and / or transition metals; Furthermore, ammonium salts can be used.
  • the inorganic salt is selected from the group comprising sodium chloride, potassium chloride, sodium sulfate, potassium sulfate and mixtures thereof.
  • Useful organic salts are, for example, colorless water-soluble alkali metal, alkaline earth metal, ammonium, aluminum and / or transition metal salts of the carboxylic acids.
  • the salts are selected from the group comprising formate, acetate, propionate, citrate, malate, tartrate, succinate, malonate, oxalate, lactate and mixtures thereof.
  • an agent according to the invention may contain one or more thickeners.
  • the thickener is selected from the group comprising xanthan gum, guar, Carrageenan, agar-agar, gellan, pectin, locust bean gum and mixtures thereof. These compounds are effective thickeners even in the presence of inorganic salts.
  • the washing or cleaning agent contains xanthan gum as a thickening agent, since xanthan gum effectively thickened even in the presence of high salt concentrations and prevents macroscopic separation of the continuous phase.
  • the thickener stabilizes the continuous, low surfactant phase and prevents macroscopic phase separation.
  • acrylic and methacrylic (co) polymers include, for example, the high molecular weight homopolymers of acrylic acid crosslinked with a polyalkenyl polyether, in particular an allyl ether of sucrose, pentaerythritol or propylene (INCI name according to "International Dictionary of Cosmetic Ingredients” of "The Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association (CTFA) ": carbomer), also referred to as carboxyvinyl polymers.
  • CFA Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association
  • Such polyacrylic acids are available, inter alia, under the trade names Polygel® and Carbopol®.
  • acrylic acid copolymers are suitable: (i) copolymers of two or more monomers from the group of acrylic acid, methacrylic acid and their simple, preferably with C ⁇ alkanols formed esters (INCI acrylates copolymer), for example under the trade name Aculyn ®, Acusol® or Tego® polymer are available; (ii) crosslinked high molecular weight acrylic acid copolymers, such as those crosslinked with an allyl ether of sucrose or pentaerythritol copolymers of C 0 -3o-alkyl acrylates with one or more monomers from the group of acrylic acid, methacrylic acid and their simple, preferably with C ⁇ alkanols formed, esters (INCI acrylates / C 0. 30 alkyl acrylate Crosspolymer) and which are for example available under the trade name Carbopol®.
  • Other suitable polymers are (meth) acrylic acid (co) polymers of the Sokalan® type
  • washing or cleaning agent according to the invention
  • the washing or cleaning agent may contain from 0.05 to 1, 5 wt .-% and preferably 0.1 to 1 wt .-%, each based on the total washing or cleaning agent, thickener.
  • the amount of thickener used depends on the type of thickener and the desired degree of thickening.
  • Liquid or pasty compositions according to the invention in the form of customary solvent-containing solutions are generally prepared by simply mixing the ingredients, which can be added in bulk or as a solution in an automatic mixer.
  • Detergents or cleaners according to the invention may contain only a protease and a cellulase as described. Alternatively, they may also contain other hydrolytic enzymes or other enzymes in a concentration effective for the effectiveness of the agent.
  • a further subject of the invention thus represents agents which further comprise one or more further enzymes, wherein in principle all enzymes established in the prior art for these purposes can be used.
  • enzymes which can be used as further enzymes are all enzymes which can display catalytic activity in the agent according to the invention, in particular a protease, amylase, cellulase, hemicellulase, mannanase, tannase, xylanase, xanthanase, xyloglucanase, .beta.-glucosidase, pectinase, carrageenase, perhydrolase, Oxidase, oxidoreductase or a lipase, and mixtures thereof. Additional enzymes are advantageously included in the agent each in a total amount of from 1 x 10 -8 to 5 percent by weight based on active protein.
  • each additional enzyme is in an amount of 1 x 10 "-3 7 wt .-%, from 0.00001 -1 wt .-%, of 0.00005 to 0.5 wt .-%, from 0.0001 to 0.1% by weight and particularly preferably from 0.0001 to 0.05% by weight in agents according to the invention, based on active protein, more preferably the enzymes show synergistic cleaning performances against certain stains or stains, ie those in the Very particular preference is given to such a synergism between the protease according to the invention and another enzyme of an agent according to the invention, in particular between said protease and the cellulase and / or a lipase and / or a mannanase and / or an amylase and / or a pectinase Synergistic effects may exist not only between different enzymes, but also between one or more enzymes and other content substances of the composition according to the invention occur.
  • a further subject of the invention is the use of a washing or cleaning agent according to the invention for the removal of stains, in particular of protease- and / or cellulase-sensitive stains, on textiles or hard surfaces, i. for cleaning textiles or hard surfaces.
  • a washing or cleaning agent according to the invention for the removal of stains, in particular of protease- and / or cellulase-sensitive stains, on textiles or hard surfaces, i. for cleaning textiles or hard surfaces.
  • Embodiments of this subject invention include, for example, hand washing, manual removal of stains from fabrics or hard surfaces, or use in conjunction with a machine process. All aspects, objects, and embodiments described for washing or cleaning compositions of the present invention are also directed to this subject matter applicable. Therefore, reference is made at this point to the disclosure in the appropriate place with the statement that this disclosure also applies to the above inventive
  • a further subject of the invention is a process for the cleaning of textiles or of hard surfaces, wherein in at least one process step an inventive washing or cleaning agent is used.
  • the process is characterized in that the cellulase is present in the wash liquor in a concentration of 0.0000004 to 0.0006 wt .-%, preferably from 0.0000008 to 0.00048 wt .-%, and / or the protease is present in the wash liquor in a concentration of from 0.00009 to 0.0005% by weight, preferably from 0.00015 to 0.00035% by weight, the statements being based on active protein in the wash liquor.
  • the method is characterized in that it is carried out at a temperature between 10 ° C and 50 ° C, preferably between 10 ° C and 40 ° C and more preferably between 20 ° C and 40 ° C.
  • Proteases used in compositions according to the invention can advantageously be used in detergents and cleaners according to the invention and processes, in particular washing and cleaning processes, in accordance with the above statements. Thus, they can be advantageously used to provide proteolytic activity in appropriate agents.
  • a further subject of the invention is therefore the use of a protease,
  • Amino acid sequence is at least 80% identical and at position 99 in the count according to
  • SEQ ID NO. 1 has the amino acid glutamic acid (E) or aspartic acid (D), or
  • Amino acid sequence is at least 80% identical and at position 99 in the count according to
  • SEQ ID NO. 1 has the amino acid asparagine (N) or glutamine (Q), or
  • Amino acid sequence is at least 80% identical and at position 99 in the count according to
  • SEQ ID NO. 1 has the amino acid alanine (A) or glycine (G) or serine (S),
  • a liquid detergent or cleaning agent for providing proteolytic activity in a liquid detergent or cleaning agent, which further comprises a cellulase.
  • this use is characterized in that the protease is further included in the count according to SEQ ID NO. 1 has at least one of the following amino acids:
  • Another object of the invention is the use of a protease which is selected from the group consisting of
  • Protease comprising an amino acid sequence according to SEQ ID NO. 2 or SEQ ID NO. 3 or SEQ ID NO. 4 or SEQ ID NO. 5 or SEQ ID NO. 6 or SEQ ID NO. 7 or SEQ ID NO.
  • Proteases which have a version opposite SEQ ID NO. 2 or SEQ ID NO. 3 or SEQ ID NO. 4 or SEQ ID NO. 5 or SEQ ID NO. 6 or SEQ ID NO. 7 or SEQ ID NO. 8 in at least one position modified amino acid sequence, wherein the change in the count according to SEQ ID NO. 1 is selected from the group consisting of:
  • a liquid detergent or cleaning agent for providing proteolytic activity in a liquid detergent or cleaning agent, which further comprises a cellulase.
  • the detergent base formulations were mixed for the different experimental approaches with the following proteases, the information being based on active protein:
  • Liquid detergent according to b Liquid detergent according to b).
  • the detergents according to the respective formulations 1, 2 and 3 were checked for their storage stability.
  • the detergents were stored at a temperature of 30 ° C for the specified period and determined the respective residual cellulolytic activity.
  • the samples to be examined were incubated with a substrate (1, 25% carboxymethylcellulose).
  • PAHBAH p-hydroxybenzoic acid hydrazide
  • the amount of released sugar corresponding to the color is a measure of the enzyme activity (compare Lever, Anal. Biochem., 1972, 47 & 1977, 81).
  • the cellulolytic residual activities obtained are given in Table 1 below.
  • detergents according to the invention have markedly improved residual cellulolytic activity and thus storage stability in comparison with the detergents of formulations 1 and 2.

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Abstract

Bei einem flüssigen Wasch- oder Reinigungsmittel, welches eine Protease und Cellulase umfasst, soll die Lagerstabilität hinsichtlich der cellulolytischen Aktivität verbessert werden. Dies gelingt durch den Einsatz einer Protease, die eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 80% identisch ist und die an Position 99 in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 1 die Aminosäure Glutaminsäure (E) oder Asparaginsäure (D) oder die Aminosäure Asparagin (N) oder Glutamin (Q) oder die Aminosäure Alanin (A) oder Glycin (G) oder Serin (S) aufweist.

Description

Lagerstabiles flüssiges Wasch- oder Reinigungsmittel enthaltend Protease und Cellulase
Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der flüssigen Wasch- und Reinigungsmittel. Die Erfindung betrifft insbesondere flüssige enzymhaltige Wasch- und Reinigungsmittel, die definierte Proteasen in Kombination mit einer Cellulase enthalten, und schlägt ferner Verfahren vor, in denen solche Mittel angewendet werden. Die Erfindung betrifft ferner Verwendungen definierter Proteasen in flüssen Wasch- oder Reinigungsmitteln, die eine Cellulase enthalten.
Für Wasch- und Reinigungsmittel werden bevorzugt Proteasen vom Subtilisin-Typ eingesetzt. Die in den aus dem Stand der Technik bekannten Wasch- oder Reinigungsmitteln eingesetzten Proteasen stammen entweder ursprünglich aus Mikroorganismen, beispielsweise der Gattungen Bacillus, Streptomyces, Humicola, oder Pseudomonas, und/oder werden nach an sich bekannten biotechnologischen Verfahren durch geeignete Mikroorganismen produziert, beispielsweise durch transgene Expressionswirte der Gattungen Bacillus oder durch filamentöse Pilze.
Insbesondere in modernen Flüssigwaschmitteln sind zunehmend weitere Enzyme enthalten, hierunter insbesondere Cellulasen (Endoglucanasen). Eine Cellulase ist ein Enzym, das die Hydrolyse von 1 ,4-ß-D-glucosidischen Bindungen in Cellulose (Cellobiose), und/oder Lichenin und/oder ß-D-Glucanen katalysiert. Oftmals sind sie in der Lage, die 1 ,4-Bindungen auch in ß-D- Glucanen zu hydrolysieren, die neben 1 ,4-Bindungen auch 1 ,3-Bindungen aufweisen. Innerhalb der EC-Klassifikation der Enzyme, dem numerischen Klassifikationssystem für Enzyme, weisen Cellulasen die EC-Nummer (engl.„Enzyme Commission number") 3.2.1 .4 auf und zählen folglich zur dritten der sechs Enzymhauptklassen, den Hydrolasen (E.C.3. -.-.-), hierunter zu den
Glycosylasen (E.C. 3.2.-.-) und wiederum hierunter zu den Glycosidasen (E.C. 3.2.1 .-), d.h.
Enzymen, die O- und/oder S-Glycosyl-Verbindungen hydrolysieren. Cellulasen sind in der Lage, Cellulose zu ß-Glucose abzubauen. Cellulasen wirken folglich insbesondere gegen Rückstände in der Wäsche, die Cellulose oder Cellulosederivate enthalten, und katalysieren deren Hydrolyse.
In der internationalen Patentanmeldung WO 95/23221 sind Proteasen bzw. Protease-Varianten vom Subtilisin-Typ aus Bacillus lentus DSM 5483 offenbart, die für den Einsatz in Wasch- oder Reinigungsmitteln geeignet sind. Unter diesen Proteasen ist auch eine, die einen Aminosäureaustausch R99E, A, S oder G aufweisen kann. Ferner ist offenbart, dass die Waschmittel weitere Enzyme enthalten können, hierunter auch eine Cellulase. Die Waschmittel können fest oder flüssig sein. Jedoch geht aus dieser Schrift nicht unmittelbar und eindeutig ein flüssiges Waschmittel hervor, das eine Cellulase in Kombination mit einer Protease, die an Position 99 die Aminosäure Glutaminsäure (E) oder Asparaginsäure (D) oder die Aminosäure Asparagin (N) oder Glutamin (Q) oder die Aminosäure Alanin (A) oder Glycin (G) oder Serin (S) aufweist, enthält. Entsprechendes gilt für die europäische Patentanmeldung EP 1921 147.
Ein Nachteil von protease- und cellulasehaltigen flüssigen Wasch- und Reinigungsmitteln aus dem Stand der Technik ist, dass sie nicht ausreichend lagerstabil sind und sie demnach bereits nach kurzer Zeit ein erhebliches Maß an cellulolytischer und/oder proteolytischer, insbesondere an cellulolytischer, Aktivität einbüßen. Häufig führt die Anwesenheit von Protease zum Verlust cellulolytischer Aktivität, da die Protease die Cellulase inaktiviert. Das Wasch- oder
Reinigungsmittel zeigt dann keine optimale Reinigungsleistung mehr.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, den genannten Nachteil zu überwinden und protease- und cellulasehaltige flüssige Wasch- oder Reinigungsmittel bereitzustellen, die ausreichend bzw. verbessert lagerstabil sind, insbesondere hinsichtlich ihrer cellulolytischen Aktivität.
Ein Gegenstand der Erfindung ist daher ein flüssiges Wasch- oder Reinigungsmittel umfassend (a1) eine Protease, die eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 80% identisch ist und die an Position 99 in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 1 die Aminosäure Glutaminsäure (E) oder Asparaginsäure (D) aufweist, oder
(a2) eine Protease, die eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 80% identisch ist und die an Position 99 in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 1 die Aminosäure Asparagin (N) oder Glutamin (Q) aufweist, oder (a3) eine Protease, die eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 80% identisch ist und die an Position 99 in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 1 die Aminosäure Alanin (A) oder Glycin (G) oder Serin (S) aufweist, und
(b) eine Cellulase.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass ein flüssiges Wasch- oder Reinigungsmittel, welches die Kombination einer solchen Protease mit einer Cellulase enthält, vorteilhaft lagerstabil ist. Insbesondere weist es eine höhere cellulolytische Aktivität nach Lagerung auf im Vergleich mit einem Wasch- oder Reinigungsmittel, welches sich von einem erfindungsgemäßen Mittel lediglich durch die in dem jeweiligen Mittel vorhandene Protease unterschiedet, wobei in den zu vergleichenden Mitteln die Protease zu Lagerbeginn in gleicher Konzentration vorhanden ist, bezogen auf aktives Enzym. Eine im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorgesehene Protease führt daher zu einer verminderten Inaktivierung der Cellulase. Die verminderte Inaktivierung von Cellulase durch die im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorgesehene Protease beruht jedoch nicht auf einer unzureichenden Proteaseaktivität.
Ein erfindungsgemäßes Mittel weist diesbezüglich und vorzugsweise eine weiterhin gute, insbesondere vorteilhafte, Reinigungsleistung an protease-sensitiven Anschmutzungen auf. Eine solche Reinigungsleistung hinsichtlich mindestens einer protease-sensitiven Anschmutzung tritt insbesondere auch bei niedrigen Temperaturen, auf, beispielsweise zwischen 10°C und 50°C, bevorzugt zwischen 10°C und 40°C oder zwischen 20°C und 40°C. Ein solches Mittel ermöglicht daher eine zufrieden stellende oder verbesserte Entfernung von mindestens einer, bevorzugt von mehreren protease-sensitiven Anschmutzungen auf Textilien und/oder harten Oberflächen, beispielsweise Geschirr.
Hinsichtlich der einleitend erwähnten internationalen Patentanmeldung WO 95/23221 handelt es bei der vorliegenden Erfindung somit um eine besonders vorteilhafte Auswahl, die zum Erhalt eines leistungsfähigen und lagerstabilen Flüssigwasch mittels führt, insbesondere hinsichtlich der proteolytischen und/oder cellulolytischen Aktivität des Mittels bzw. Restaktivität des Mittels nach Lagerung.
Unter Reinigungsleistung wird im Rahmen der Erfindung die Aufhellungsleistung an einer oder mehreren Anschmutzungen, insbesondere Wäscheanschmutzungen, verstanden. Beispiele für solche Anschmutzungen sind Blut-Milch/Tusche auf Baumwolle, Voll-Ei/Pigment auf Baumwolle, Schokolade-Milch/Tusche auf Baumwolle, Erdnuss Öl-Pigment/Tusche auf Polyester/Baumwolle, Gras auf Baumwolle oder Kakao auf Baumwolle, insbesondere derart wie weiter unten angegeben. Im Rahmen der Erfindung weist sowohl das Wasch- oder Reinigungsmittel, welches die Protease und die Cellulase umfasst bzw. die durch dieses Mittel gebildete Wasch- bzw. Reinigungsflotte, als auch die Protease bzw. die Cellulase selbst eine jeweilige Reinigungsleistung auf. Die Reinigungsleistung der Enzyme trägt somit zur Reinigungsleistung des Mittels bzw. der durch das Mittel gebildeten Wasch- bzw. Reinigungsflotte bei. Die Reinigungsleistung wird bevorzugt ermittelt wie weiter unten angegeben.
Unter wasch- bzw. Reinigungsflotte wird diejenige das Wasch- oder Reinigungsmittel enthaltende Gebrauchslösung verstanden, die auf Textilien oder Gewebe (Waschflotte) bzw. harte Oberflächen (Reinigungsflotte) einwirkt und damit mit den auf Textilien bzw. Geweben oder harten Oberflächen vorhandenen Anschmutzungen in Kontakt kommt. Üblicherweise entsteht die Wasch- bzw.
Reinigungsflotte, wenn der Wasch- oder Reinigungsvorgang beginnt und das Wasch- oder Reinigungsmittel beispielsweise in einer Waschmaschine oder in einem anderen geeigneten Behältnis mit Wasser verdünnt wird.
Eine Lagerstabilität im Sinne der Erfindung liegt vor, wenn ein erfindungsgemäßes Wasch- oder Reinigungsmittel nach einer Lagerung eine höhere Cellulase-Aktivität aufweist im Vergleich zu einer Kontrollzusammensetzung, die sich nur durch die in der Kontrollzusammensetzung enthaltene Protease von dem erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel unterscheidet. Nach Lagerung weist ein erfindungsgemäßes Wasch- oder Reinigungsmittel daher eine höhere Restaktivität der Cellulase auf im Vergleich zur Kontrolle. Beide zu vergleichenden Mittel weisen bei Lagerbeginn daher die gleiche Cellulasemenge bzw. -konzentration und/oder cellulolytische Ausgangsaktivität auf. Weiterhin ist in beiden Mitteln die Protease zu Lagerbeginn in gleicher Konzentration vorhanden, bezogen auf aktives Enzym, und beide Mittel werden auf die gleiche Art und Weise behandelt, insbesondere betreffend die Bedingungen der Lagerung und die
Bestimmung der Enzymaktivität. Zunehmend bevorzugt erfolgt die Lagerung für mindestens 24 Stunden, 48 Stunden, 72 Stunden, 5 Tage, 1 Woche, 2 Wochen, 3 Wochen, 4 Wochen oder 8 Wochen. Weiter bevorzugt erfolgt die Lagerung bei einer Temperatur von 20°C, 25°C oder 30°C, besonders bevorzugt bei 30°C.
Die Enzymaktivität kann diesbezüglich - abgestimmt auf den jeweiligen Enzymtyp - in fachüblicher Art und Weise erfolgen. Methoden zur Aktivitätsbestimmung sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Enzymtechnologie geläufig und werden von ihm routinemäßig angewendet. Verfahren zur Bestimmung der Proteaseaktivität sind beispielsweise offenbart in Tenside, Band 7 (1970), S. 125- 132. Die proteolytische Aktivität kann ferner bestimmt werden über die Freisetzung des
Chromophors para-Nitroanilin (pNA) aus dem Substrat suc-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-Nitroanilid (suc-AAPF-pNA). Die Protease spaltet das Substrat und setzt pNA frei. Die Freisetzung des pNA verursacht eine Zunahme der Extinktion bei 410 nm, deren zeitlicher Verlauf ein Maß für die enzymatische Aktivität ist (vgl. Del Mar et al., 1979). Die Messung erfolgt bei einer Temperatur von 25°C, bei pH 8,6 und einer Wellenlänge von 410 nm. Die Messzeit beträgt 5 min. bei einem Messintervall von 20s bis 60s. Die Proteaseaktivität wird vorzugsweise in PE (Protease-Einheiten) angegeben.
Die Cellulaseaktivität wird in fachüblicher Weise bestimmt. Vorzugsweise wird die Cellulaseaktivität bestimmt wie nachstehend angegeben. Cellulasen setzen aus CMC (Carboxymethylcellulose) Glucose frei. Unter definierten Reaktionsbedingungen (100 mM Natriumphosphatpuffer pH 7.5, 40°C, 15 min) werden die zu untersuchenden Proben mit einem Substrat (1 ,25% CMC) inkubiert. Diese reagieren mit p-Hydroxybenzoesäure-hydrazid (PAHBAH) unter Anwesenheit von Bismuth zu einem gelben Farbstoff, der photometrisch bei 410 nm bestimmt werden kann. Bedingung ist ein alkalischer pH-Wert während der Farbreaktion. Die der Färbung entsprechende Menge des freigesetzten Zuckers ist dabei ein Maß für die Enzymaktivität (vgl. Lever, Anal. Biochem., 1972, 47 & 1977, 81).
Besonders bevorzugt wird das Vorliegen einer Enzymstabilisierung im Sinne der vorliegenden Erfindung ermittelt wie vorstehend angegeben unter Verwendung eines Protease-und Cellulase- haltigen flüssigen Wasch- oder Reinigungsmittels, das für mindestens vier und höchstens 8 Wochen bei einer Temperatur von 30°C gelagert wird, wobei die proteolytische Aktivität bestimmt wird über die Freisetzung des Chromophors para-Nitroanilin (pNA) aus dem Substrat suc-AAPF- pNA, und die cellulolytische Aktivität bestimmt wird wie vorstehend angegeben.
Die in einem erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel enthaltene Protease umfasst eine Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 80% identisch ist und die an Position 99 in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 1 die Aminosäure Glutaminsäure (E) oder Asparaginsäure (D) oder die Aminosäure Asparagin (N) oder Glutamin (Q) oder die Aminosäure Alanin (A) oder Glycin (G) oder Serin (S) aufweist. Zunehmend bevorzugt ist die Aminosäuresequenz zu mindestens 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% und ganz besonders bevorzugt zu 99% identisch zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Aminosäuresequenz. SEQ ID NO. 1 ist die Sequenz der reifen (maturen) alkalischen Protease aus Bacillus lentus DSM 5483, die offenbart ist in der internationalen Patentanmeldung WO 92/21760, und auf deren Offenbarung hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird.
Erfindungsgemäß hat sich gezeigt, dass durch den Zusatz einer solchen Protease zu einem flüssigen Wasch- oder Reinigungsmittel, welches eine Cellulase enthält, ein besonders
lagerstabiles Flüssigwaschmittel erhalten wird, insbesondere hinsichtlich dessen verbleibender cellulolytischer Aktivität nach Lagerung, insbesondere nach einer Lagerdauer von zunehmend bevorzugt 24 Stunden, 48 Stunden, 72 Stunden, 5 Tage, 1 Woche, 2 Wochen, 3 Wochen, 4 Wochen oder 8 Wochen.
Eine in einem erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel enthaltene Protease weist eine proteolytische Aktivität auf, das heißt, sie ist zur Hydrolyse von Peptidbindungen eines Polypeptids bzw. Proteins befähigt. Sie ist daher ein Enzym, welches die Hydrolyse von Peptidbindungen katalysiert und dadurch in der Lage ist, Peptide oder Proteine zu spalten. Sie ist insbesondere eine Subtilase und besonders bevorzugt ein Subtilisin. Eine Cellulase ist ein Enzym wie einleitend beschrieben. Für Cellulasen können synonyme Begriffe verwendet werden, insbesondere Endoglucanase, Endo-1 ,4-beta-Glucanase,
Carboxymethylcellulase, Endo-1 ,4-beta-D-Glucanase, beta-1 ,4-Glucanase, beta-1 ,4- Endoglucanhydrolase, Celludextrinase oder Avicelase. Entscheidend dafür, ob ein Enzym eine Cellulase im Sinne der Erfindung ist, ist deren Fähigkeit zur Hydrolyse von 1 ,4-ß-D-glucosidischen Bindungen in Cellulose.
Erfindungsgemäß konfektionierbare Cellulasen (Endoglucanasen, EG) umfassen beispielsweise die pilzliche, Endoglucanase(EG)-reiche Cellulase-Präparation beziehungsweise deren
Weiterentwicklungen, die von dem Unternehmen Novozymes unter dem Handelsnamen
Celluzyme® angeboten wird. Die ebenfalls von dem Unternehmen Novozymes erhältlichen Produkte Endolase® und Carezyme® basieren auf der 50 kD-EG, beziehungsweise der 43 kD-EG aus Humicola insolens DSM 1800. Weitere einsetzbare Handelsprodukte dieses Unternehmens sind Cellusoft®, Renozyme® und Celluclean®. Weiterhin einsetzbar sind beispielsweise
Cellulasen, die von dem Unternehmen AB Enzymes, Finnland, unter den Handelsnamen
Ecostone® und Biotouch® erhältlich sind, und die zumindest zum Teil auf der 20 kD-EG aus Melanocarpus basieren. Weitere Cellulasen von dem Unternehmen AB Enzymes sind Econase® und Ecopulp®. Weitere geeignete Cellulasen sind aus Bacillus sp. CBS 670.93 und CBS 669.93, wobei die aus Bacillus sp. CBS 670.93 von dem Unternehmen Danisco/Genencor unter dem Handelsnamen Puradax® erhältlich ist. Weitere verwendbare Handelsprodukte des Unternehmens Danisco/Genencor sind„Genencor detergent cellulase L" und lndiAge®Neutra.
Auch durch Punktmutationen erhältliche Varianten dieser Enzyme können erfindungsgemäß eingesetzt werden. Besonders bevorzugte Cellulasen sind Thielavia terrestris Cellulasevarianten, die in der internationalen Offenlegungsschrift WO 98/12307 offenbart sind, Cellulasen aus Melanocarpus, insbesondere Melanocarpus albomyces, die in der internationalen
Offenlegungsschrift WO 97/14804 offenbart sind, Cellulasen vom EGIII-Typ aus Trichoderma reesei, die in der europäischen Patentanmeldung EP 1 305 432 offenbart sind bzw. hieraus erhältliche Varianten, insbesondere diejenigen, die offenbart sind in den europäischen
Patentanmeldungen EP 1240525 und EP 1305432, sowie Cellulasen, die offenbart sind in den internationalen Offenlegungsschriften WO 1992006165, WO 96/29397 und WO 02/099091 . Auf deren jeweilige Offenbarung wird daher ausdrücklich verwiesen bzw. deren diesbezüglicher Offenbarungsgehalt wird daher ausdrücklich in die vorliegende Patentanmeldung mit einbezogen.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Wasch- oder Reinigungsmittel dadurch gekennzeichnet, dass die Protease ferner in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 1 mindestens eine der folgenden Aminosäuren aufweist:
(a) Threonin an Position 3 (3T), (b) Isoleucin an Position 4 (41),
(c) Alanin, Threonin oder Arginin an Position 61 (61 A, 61 T oder 61 R),
(d) Asparaginsäure oder Glutaminsäure an Position 154 (154D oder 154E),
(e) Prolin an Position 188 (188P),
(f) Methionin an Position 193 (193M),
(g) Isoleucin an Position 199 (1991),
(h) Asparaginsäure, Glutaminsäure oder Glycin an Position 21 1 (21 1 D, 21 1 E oder 21 1 G),
(i) Kombinationen der Aminosäuren (a) bis (h).
Neben einer der genannten Aminosäuren an Position 99 weist die Protease daher eine oder mehrere der vorstehend genannten Aminosäuren an den jeweiligen Positionen auf. Diese Aminosäuren können weitere vorteilhafte Eigenschaften bewirken und/oder bereits vorhandene Eigenschaften noch verstärken. Insbesondere bewirken die vorstehend genannten Aminosäuren eine Steigerung der proteolytischen Aktivität und/oder der Stabilität der Protease in einem flüssigen Wasch- oder Reinigungsmittel bzw. in der durch dieses Wasch- oder Reinigungsmittel gebildeten Waschflotte. Durch den Zusatz einer solchen Protease zu einem flüssigen Wasch- oder
Reinigungsmittel, welches eine Cellulase enthält, wird somit ebenfalls ein besonders lagerstabiles Flüssigwaschmittel erhalten, insbesondere hinsichtlich dessen verbleibender cellulolytischer Aktivität nach Lagerung, aber vorzugsweise auch hinsichtlich dessen verbleibender proteolytischer Aktivität nach Lagerung, insbesondere nach einer Lagerdauer von zunehmend bevorzugt 24 Stunden, 48 Stunden, 72 Stunden, 5 Tage, 1 Woche, 2 Wochen, 3 Wochen, 4 Wochen oder 8 Wochen. Ferner zeigt ein solches Mittel verbesserte Reinigungsleistungen an protease- und/oder cellulase-sensitiven Anschmutzungen.
Die Aminosäurepositionen werden hierbei durch ein Alignment der Aminosäuresequenz der einzusetzenden Protease mit der Aminosäuresequenz der Protease aus Bacillus lentus, wie sie in SEQ ID NO. 1 angegeben ist, definiert. Da die Protease aus Bacillus lentus im Stand der Technik ein wichtiges Referenzmolekül zur Beschreibung von Proteasen und von Aminosäureveränderungen darstellt ist es vorteilhaft, in der Zuordnung der Aminosäurepositionen auf die Zählung der Protease aus Bacillus lentus (SEQ ID NO. 1) Bezug zu nehmen. Weiterhin richtet sich die Zählung nach dem reifen (maturen) Protein. Diese Zuordnung ist insbesondere auch anzuwenden, wenn die Aminosäuresequenz der einzusetzenden Protease eine höhere Zahl von Aminosäurenresten umfasst als die Protease aus Bacillus lentus gemäß SEQ ID NO. 1 .
Ausgehend von den genannten Positionen in der Aminosäuresequenz der Protease aus Bacillus lentus sind die Aminosäurepositionen in einer erfindungsgemäß einzusetzenden Protease diejenigen, die eben diesen Positionen in einem Alignment zugeordnet sind. Neben Position 99 besonders vorteilhafte Positionen sind demnach die Positionen 3, 4, 61 , 154, 188, 193, 199 und 21 1 , zuzuordnen in einem Alignment mit SEQ ID NO. 1 und damit in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 1 . In den genannten Positionen liegen in dem Wildtypmolekül der Protease aus Bacillus lentus folgende Aminosäurereste: S3, V4, G61 , S154, A188, V193, V199, und L21 1 . Besonders bevorzugt sind die Aminosäuren 3T, 41, 61 A, 154D, 154E, 21 1 D, 21 1 G und 21 1 E, sofern die entsprechenden Positionen in einer erfindungsgemäß einzusetzenden Protease nicht schon von einer dieser bevorzugten Aminosäuren eingenommen werden. Die Austausche 3T und 41 führen beispielsweise über einen Stabilisierungseffekt auf das Molekül zu einer
Verbesserung der Lagerstabilität und der Reinigungsleistung der Protease und damit zu einer verbesserten Reinigungsleistung eines erfindungsgemäßen flüssigen Wasch- oder
Reinigungsmittels, welches die Protease enthält.
Sind eine oder mehrere der vorstehend genannten Aminosäuren an der jeweiligen Position verwirklicht, ergeben sich zusätzlich zu Position 99 weitere Sequenzabweichungen von SEQ ID NO. 1 , da SEQ ID NO. 1 eine andere Aminosäure in der jeweiligen Position aufweist. In
Abhängigkeit von der Anzahl der vorliegenden Sequenzabweichungen von SEQ ID NO.1 ergeben sich daher unterschiedliche maximale Identitätswerte, die eine erfindungsgemäß einzusetzende Protease zu SEQ ID NO. 1 aufweisen kann, selbst wenn sie in allen übrigen Aminosäuren mit SEQ ID NO. 1 übereinstimmen sollte. Dieser Sachverhalt ist für jede mögliche Kombination der vorgeschlagenen Aminosäuren im Einzelfall zu berücksichtigen und ist ferner auch abhängig von der Länge der Aminosäuresequenz der Protease. Beispielsweise beträgt die maximale Identität bei einer, zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht oder neun Sequenzveränderungen 99,63%, 99,26%, 98,88%, 98,51 %, 98,14%, 97,77%, 97,40%, 97,03% bzw. 96,65% bei einer 269
Aminosäuren langen Aminosäuresequenz, beziehungsweise 99,64%, 99,27%, 98,91 %, 98,55%, 98,18%, 97,82%, 97,45%, 97,09% bzw. 96,73% bei einer 275 Aminosäuren langen
Aminosäuresequenz.
Die Bestimmung der Identität von Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen erfolgt durch einen Sequenzvergleich. Solch ein Vergleich erfolgt dadurch, dass ähnliche Abfolgen in den Nukleotid- sequenzen oder Aminosäuresequenzen einander zugeordnet werden. Dieser Sequenzvergleich erfolgt vorzugsweise basierend auf dem im Stand der Technik etablierten und üblicherweise genutzten BLAST-Algorithmus (vgl. beispielsweise Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, DJ. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215:403-410, und Altschul, Stephan F..Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997): "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs"; Nucleic Acids Res., 25, S.3389-3402) und geschieht prinzipiell dadurch, dass ähnliche Abfolgen von Nukleotiden oder Aminosäuren in den Nukleinsäure- bzw. Aminosäuresequenzen einander zugeordnet werden. Eine tabellarische Zuordnung der betreffenden Positionen wird als Alignment bezeichnet. Ein weiterer im Stand der Technik verfügbarer Algorithmus ist der FASTA-Algorithmus. Sequenzvergleiche (Alignments), insbesondere multiple Sequenzvergleiche, werden üblicherweise mit Computerprogrammen erstellt. Häufig genutzt werden beispielsweise die Clustal-Serie (vgl. beispielsweise Chenna et al. (2003): Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. Nucleic Acid Research 31 , 3497-3500), T-Coffee (vgl. beispielsweise Notredame et al. (2000): T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 302, 205-217) oder Programme, die auf diesen Programmen bzw. Algorithmen basieren. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden
Sequenzvergleiche und Alignments bevorzugt mit dem Computer-Programm Vector NTI® Suite 10.3 (Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, Kalifornien, USA) mit den vorgegebenen Standard (Default)-Parametern erstellt.
Solch ein Vergleich erlaubt eine Aussage über die Ähnlichkeit der verglichenen Sequenzen zueinander. Sie wird üblicherweise in Prozent Identität, das heißt dem Anteil der identischen Nukleotide oder Aminosäurereste an denselben bzw. in einem Alignment einander entsprechenden Positionen, angegeben. Der weiter gefasste Begriff der Homologie bezieht bei Aminosäuresequenzen konservierte Aminosäure-Austausche in die Betrachtung mit ein, also Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften, da diese innerhalb des Proteins meist ähnliche Aktivitäten bzw.
Funktionen ausüben. Daher kann die Ähnlichkeit der verglichenen Sequenzen auch Prozent Homologie oder Prozent Ähnlichkeit angegeben sein. Identitäts- und/oder Homologieangaben können über ganze Polypeptide oder Gene oder nur über einzelne Bereiche getroffen werden. Homologe bzw. identische Bereiche von verschiedenen Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen sind daher durch Übereinstimmungen in den Sequenzen definiert. Sie weisen oftmals gleiche oder ähnliche Funktionen auf. Sie können klein sein und nur wenige Nukleotide bzw. Aminosäuren umfassen. Oftmals üben solche kleinen Bereiche für die Gesamtaktivität des Proteins essentielle Funktionen aus. Es kann daher sinnvoll sein, Sequenzübereinstimmungen nur auf einzelne, gegebenenfalls kleine Bereiche zu beziehen. Soweit nicht anders angegeben beziehen sich Identitäts- bzw. Homologieangaben in der vorliegenden Anmeldung aber auf die Gesamtlänge der jeweils angegebenen Nukleinsäure- oder Aminosäuresäuresequenz.
In einer weiteren Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstandes ist das Wasch- oder
Reinigungsmittel dadurch gekennzeichnet, dass die Protease eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Aminosäuresequenz wie vorstehend angegeben identisch ist und die aus einer Protease gemäß SEQ ID NO. 1 durch ein- oder mehrfache konservative Aminosäuresubstitution erhalten wird bzw. erhältlich ist, wobei die Protease an Position 99 noch immer eine der für diese Position vorgesehenen Aminosäuren aufweist wie vorstehend beschrieben. Der Begriff "konservative Aminosäuresubstitution" bedeutet den
Austausch (Substitution) eines Aminosäurerestes gegen einen anderen Aminosäurerest, wobei dieser Austausch nicht zu einer Änderung der Polarität oder Ladung an der Position der ausgetauschten Aminosäure führt, z. B. der Austausch eines unpolaren Aminosäurerestes gegen einen anderen unpolaren Aminosäurerest. Konservative Aminosäuresubstitutionen im Rahmen der Erfindung umfassen beispielsweise: G=A=S, l=V=L=M, D=E, N=Q, K=R, Y=F, S=T,
G=A=I=V=L=M=Y=F=W=P=S=T.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist ein erfindungsgemäßes Wasch- oder
Reinigungsmittel ferner dadurch gekennzeichnet, dass seine Reinigungsleistung mindestens derjenigen eines Wasch- bzw. Reinigungsmittels entspricht, das eine Protease beinhaltet, die eine Aminosäuresequenz umfasst, die der in SEQ ID NO. 2 oder SEQ ID NO. 3 oder SEQ ID NO. 4 oder SEQ ID NO. 5 oder SEQ ID NO. 6 oder SEQ ID NO. 7 oder SEQ ID NO. 8, besonders bevorzugt der in SEQ ID NO. 2, angegebenen Aminosäuresequenz entspricht. Die Reinigungsleistung wird in einem Waschsystem bestimmt, das ein cellulasehaltiges Waschmittel in einer Dosierung zwischen 2,0 und 9,0 Gramm pro Liter Waschflotte sowie die Protease enthält, wobei die zu vergleichenden Proteasen konzentrationsgleich (bezogen auf aktives Protein) eingesetzt sind und die Reinigungsleistung gegenüber einer oder mehrerer der Anschmutzungen Blut- Milch/Tusche auf Baumwolle, Voll-Ei/Pigment (Ganzei/Ruß) auf Baumwolle, Erdnuss Öl- Pigment/Tusche auf Polyester/Baumwolle und Gras auf Baumwolle, insbesondere gegenüber einer oder mehrerer der Anschmutzungen
- Blut-Milch/Tusche auf Baumwolle: Produkt Nr. C-05 erhältlich von CFT (Center For Testmaterials) B.V. Viaardingen, Niederlande
- Voll-Ei/Pigment (Ganzei/Ruß) auf Baumwolle: Produkt Nr. 10N erhältlich von der Firma wfk Testgewebe GmbH; Brüggen-Bracht, Deutschland, oder Produkt C-S-37 erhältlich von CFT (Center For Testmaterials) B.V. Viaardingen, Niederlande
- Erdnuss Öl-Pigment/Tusche auf Polyester/Baumwolle: Produkt Nr. PC-10 erhältlich von CFT (Center For Testmaterials) B.V. Viaardingen, Niederlande
- Gras auf Baumwolle: Produkt Nr. 164 erhältlich von der Firma Eidgenössische Material- und Prüfanstalt (EMPA) Testmaterialien AG, St. Gallen, Schweiz,
bestimmt wird durch Messung des Weißheitsgrades der gewaschenen Textilien, der
Waschvorgang für mindestens 30 Minuten, optional 60 Minuten, bei einer Temperatur von 20°C erfolgt und das Wasser eine Wasserhärte zwischen 15,5 und 16,5° (deutsche Härte) aufweist.
Das Waschmittel für das Waschsystem ist ein flüssiges Waschmittel, das wie folgt
zusammengesetzt (alle Angaben in Gewichts-Prozent): 0,3-0,5% Xanthan, 0,2-0,4% Anti- Schaummittel, 6-7% Glycerin, 0,3-0,5% Ethanol, 4-7% FAEOS (Fettalkoholethersulfat) , 24-28% nichtionische Tenside, 1 % Borsäure, 1 -2% Natriumeitrat (Dihydrat), 2-4% Soda, 14-16%
Kokosnuss-Fettsäuren, 0,5% HEDP (1 -Hydroxyethan-(1 ,1 -di-phosphonsäure)), 0-0,4% PVP (Polyvinylpyrrolidon), 0-0,05% optischer Aufheller, 0-0,001 % Farbstoff, 0,0002-0,06% Cellulase (aktives Protein), vorzugsweise Ecostone N400® (Cellulasepräparation der Firma AB Enzymes), Rest demineralisiertes Wasser. Die Protease wird in dem Waschmittel in einer Konzentration von 0,001 -0,1 %, vorzugsweise von 0,01 bis 0,06%, eingesetzt, bezogen auf aktives Protein. Die Dosierung des flüssigen Waschmittels beträgt zwischen 2,0 und 9,0, vorzugsweise zwischen 3,0 und 8,2, zwischen 4,0 und 7,5 und besonders bevorzugt 4,7 Gramm pro Liter Waschflotte.
Gewaschen wird in einem pH-Wertebereich zwischen pH 8 und pH 10,5, bevorzugt zwischen pH 8 und pH 9. Weder die Protease- noch die Cellulaseaktivität in der Waschflotte sind zu Waschbeginn gleich Null.
Der Weißheitsgrad, d.h. die Aufhellung der Anschmutzungen, als Maß für die Reinigungsleistung wird mit optischen Mess verfahren bestimmt, bevorzugt photo metrisch. Ein hierfür geeignetes Gerät ist beispielsweise das Spektrometer Minolta CM508d. Üblicherweise werden die für die Messung eingesetzten Geräte zuvor mit einem Weißstandard, bevorzugt einem mitgelieferten Weißstandard, kalibriert.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist ein erfindungsgemäßes Wasch- oder
Reinigungsmittel ferner dadurch gekennzeichnet, dass seine Lagerstabilität mindestens derjenigen eines Wasch- bzw. Reinigungsmittels entspricht, das eine Protease beinhaltet, die eine
Aminosäuresequenz umfasst, die der in SEQ ID NO. 2 oder SEQ ID NO. 3 oder SEQ ID NO. 4 oder SEQ ID NO. 5 oder SEQ ID NO. 6 oder SEQ ID NO. 7 oder SEQ ID NO. 8, besonders bevorzugt der in SEQ ID NO. 2, angegebenen Aminosäuresequenz entspricht. Eine solche Lagerstabilität liegt dann vor, wenn das erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel nach einer Lagerung von acht Wochen bei 30°C eine gleiche oder höhere Cellulase-Aktivität aufweist als das zum Vergleich heranzuziehende Wasch- oder Reinigungsmittel, wobei sich das
erfindungsgemäße Mittel nur durch die enthaltene Protease von dem als Vergleich
heranzuziehenden Wasch- oder Reinigungsmittel unterscheidet.
Besonders bevorzugt handelt es sich bei dem zum Vergleich heranzuziehenden Mittel um ein flüssiges Waschmittel, das wie folgt zusammengesetzt (alle Angaben in Gewichts-Prozent): 0,3- 0,5% Xanthan, 0,2-0,4% Anti-Schaummittel, 6-7% Glycerin, 0,3-0,5% Ethanol, 4-7% FAEOS (Fettalkoholethersulfat), 24-28% nichtionische Tenside, 1 % Borsäure, 1 -2% Natriumeitrat
(Dihydrat), 2-4% Soda, 14-16% Kokosnuss-Fettsäuren, 0,5% HEDP (1 -Hydroxyethan-(1 ,1 -di- phosphonsäure)), 0-0,4% PVP (Polyvinylpyrrolidon), 0-0,05% optischer Aufheller, 0-0,001 % Farbstoff, 0,0002-0,06% Cellulase (aktives Protein), vorzugsweise Ecostone N400® (Cellulasepräparation der Firma AB Enzymes), Rest demineralisiertes Wasser. Die Protease wird in dem Waschmittel in einer Konzentration von 0,001 -0,1 %, vorzugsweise von 0,01 bis 0,06%, eingesetzt, bezogen auf aktives Protein.
Bei Lagerbeginn weisen beide zu vergleichenden Mittel die gleiche cellulolytische
Ausgangsaktivität auf, enthalten die Protease in gleicher Konzentration bezogen auf aktives Enzym, und beide Mittel werden auf die gleiche Art und Weise behandelt. Die proteolytische Aktivität in den Mitteln wird jeweils bestimmt über die Freisetzung des Chromophors para- Nitroanilin (pNA) aus dem Substrat suc-AAPF-pNA, und deren cellulolytische Aktivität wird jeweils bestimmt wie vorstehend angegeben. Die Ausgangsaktivitäten für die Protease und die Cellulase in dem jeweiligen Mittel sind nicht gleich Null.
Durch den jeweils aktivitätsgleichen Einsatz der Cellulase und den konzentrationsgleichen Einsatz der Proteasen, bezogen auf aktives Protein, wird sichergestellt, dass auch bei einem etwaigen Auseinanderklaffen des Verhältnisses von Aktivsubstanz zu Gesamtprotein (die Werte der spezifischen Aktivität) die real vorliegenden enzymatischen Eigenschaften verglichen werden.
Soweit nicht anders angegeben wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung jeweils auf das Gewicht des flüssigen Waschmittels Bezug genommen, d.h. die Angaben sind bezogen auf dessen Gewicht.
Zahlreiche Proteasen und insbesondere Subtilisine werden als sogenannte Präproteine, also zusammen mit einem Propeptid und einem Signalpeptid gebildet, wobei die Funktion des
Signalpeptids üblicherweise darin besteht, die Ausschleusung der Protease aus der sie produzierenden Zelle in das Periplasma oder das die Zelle umgebende Medium zu gewährleisten, und das Propeptid üblicherweise für die korrekte Faltung der Protease nötig ist. Das Signalpeptid und das Propeptid sind in der Regel der N-terminale Teil des Präproteins. Das Signalpeptid wird unter natürlichen Bedigungen durch eine Signalpeptidase von der übrigen Protease abgespalten. Anschließend erfolgt die durch das Propeptid unterstützte korrekte endgültige Faltung der Protease. Die Protease ist dann in ihrer aktiven Form und spaltet das Propeptid selbst ab. Nach der Abspaltung des Propeptids übt die dann reife (mature) Protease, insbesondere Subtilisin, ihre katalytische Aktivität ohne die ursprünglich vorhandenen N-terminalen Aminosäuren aus. Für technische Anwendungen allgemein und insbesondere im Rahmen der Erfindung sind die reifen (maturen) Proteasen, d.h. die nach ihrer Herstellung prozessierten Enzyme, gegenüber den Präproteinen bevorzugt. Die Proteasen können ferner von den sie produzierenden Zellen nach der Herstellung der Polypeptidkette modifiziert werden, beispielsweise durch Anknüpfung von Zuckermolekülen, Formylierungen, Aminierungen, usw. Solche Modifikationen sind posttranslationale Modifikationen und können, müssen jedoch nicht einen Einfluss auf die Funktion der Protease ausüben.
Ferner kann auch die reife Protease an ihrem N-terminalen und/oder C-terminalen Ende verkürzt sein, so dass eine gegenüber SEQ ID NO. 1 bzw. SEQ ID NO. 2 oder SEQ ID NO. 3 oder SEQ ID NO. 4 oder SEQ ID NO. 5 oder SEQ ID NO. 6 oder SEQ ID NO. 7 oder SEQ ID NO. 8 verkürzte Protease, also ein Fragment, in dem erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel enthalten ist. Alle Identitätsangaben beziehen sich in diesem Fall auf denjenigen Bereich, in dem das jeweilige Fragment in einem Alignment SEQ ID NO. 1 zugeordnet ist. Das jeweilige Fragment beinhaltet aber in jedem Fall diejenige Position, die der Position 99 in einem Alignment mit SEQ ID NO. 1 zugeordnet ist, und weist an dieser Position eine entsprechende Aminosäure auf.
Vorteilhafterweise beinhaltet es auch eine oder mehrere der weiteren vorstehend beschriebenen Positionen und weist dort eine entsprechende Aminosäure auf. Ferner ist ein solches Fragment proteolytisch aktiv. Ein diesbezüglich weiter bevorzugtes Fragment umfasst eine
Aminosäuresequenz, die über eine Länge von mindestens 50 oder mindestens 60, 70, 80, 90, 100, 1 10, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 265, 266, 267 oder 268 zusammenhängenden Aminosäurepositionen mit SEQ ID NO. 1 oder SEQ ID NO. 2 oder SEQ ID NO. 3 oder SEQ ID NO. 4 oder SEQ ID NO. 5 oder SEQ ID NO. 6 oder SEQ ID NO. 7 oder SEQ ID NO. 8 übereinstimmt unter Berücksichtigung der vorstehend genannten Aminosäuren für die Position 99 und optional ferner für die Positionen 3 und/oder 4 und/oder 61 und/oder 154 und/oder 188 und/oder 193 und/oder 199 und/oder 21 1 . Besonders bevorzugt entspricht die Reinigungsleistung und/oder Lagerstabilität eines erfindungsgemäßen flüssigen Wasch- oder Reinigungsmittels mit einem solchen Fragment mindestens derjenigen eines Wasch- bzw.
Reinigungsmittels, das eine Protease beinhaltet, die eine Aminosäuresequenz umfasst, die der in SEQ ID NO. 2 oder SEQ ID NO. 3 oder SEQ ID NO. 4 oder SEQ ID NO. 5 oder SEQ ID NO. 6 oder SEQ ID NO. 7 oder SEQ ID NO. 8 angegebenen Aminosäuresequenz entspricht, jeweils bestimmt wie vorstehend angegeben.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein flüssiges Wasch- oder Reinigungsmittel umfassend (a) eine Protease, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
a. Protease umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2 oder SEQ ID NO. 3 oder SEQ ID NO. 4 oder SEQ ID NO. 5 oder SEQ ID NO. 6 oder SEQ ID NO. 7 oder SEQ ID NO. 8;
b. Protease, die eine gegenüber SEQ ID NO. 2 oder SEQ ID NO. 3 oder SEQ ID NO. 4 oder SEQ ID NO. 5 oder SEQ ID NO. 6 oder SEQ ID NO. 7 oder SEQ ID NO. 8 in mindestens einer Position veränderte Aminosäuresequenz umfasst, wobei die Veränderung in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 1 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i. Threonin an Position 3 (3T),
ii. Isoleucin an Position 4 (41),
iii. Alanin, Threonin oder Arginin an Position 61 (61A, 61 T oder 61 R),
iv. Asparaginsäure oder Glutaminsäure an Position 154 (154D oder 154E),
v. Prolin an Position 188 (188P),
vi. Methionin an Position 193 (193M),
vii. Isoleucin an Position 199 (1991),
viii. Asparaginsäure, Glutaminsäure oder Glycin an Position 21 1 (21 1 D, 21 1 E oder 21 1 G), ix. Kombinationen der Aminosäuren (i) bis (viii);
eine Cellulase.
Diese Proteasen werden ganz besonders bevorzugt in einem erfindungsgemäßen flüssigen Wasch- oder Reinigungsmittel eingesetzt. Sie werden ausgehend von SEQ ID NO. 1 erhalten durch die Substitution der Aminosäure Arginin an Position 99 durch die Aminosäure Glutaminsäure (E) oder Asparaginsäure (D) oder die Aminosäure Asparagin (N) oder Glutamin (Q) oder die Aminosäure Alanin (A) oder Glycin (G) oder Serin (S) in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 1 . Diese Aminosäuresequenzen sind im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 und SEQ ID NO. 8 angegeben. Ferner können diese Proteasen zusätzlich zu der für Position 99 vorgesehenen Aminosäure eine oder mehrere der vorstehend erläuterten Aminosäuren in den Positionen 3, 4, 61 , 154, 188, 193, 199 und 21 1 aufweisen, zuzuordnen in einem Alignment mit SEQ ID NO. 1 und damit in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 1 . Die genannten Aminosäuren für diese Positionen bewirken auch bei diesen Proteasen weitere vorteilhafte Eigenschaften und/oder verstärken bereits vorhandene
Eigenschaften noch. Insbesondere bewirken sie eine Steigerung der proteolytischen Aktivität und/oder der Stabilität der Protease in einem flüssigen Wasch- oder Reinigungsmittel bzw. in der durch dieses Wasch- oder Reinigungsmittel gebildeten Waschflotte. Alle vorstehenden
Ausführungen - sofern anwendbar - gelten für diese besonders bevorzugten Proteasen entsprechend.
Ein erfindungsgemäßes Mittel enthält die Protease zunehmend bevorzugt in einer Menge von 1 x 10"8-5 Gew.-%, von 0,0001 -1 Gew.-%, von 0,0005-0,5 Gew.-%, von 0,001 bis 0,1 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,001 bis 0,06 Gew.-%, bezogen auf aktives Protein. Ein
erfindungsgemäßes Mittel enthält die Cellulase zunehmend bevorzugt in einer Menge von 1 x 10~8- 5 Gew.-%, von 0,00001 -1 Gew.-%, von 0,00005-0,5 Gew.-%, von 0,0001 bis 0,1 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,0001 bis 0,065 Gew.-%, bezogen auf aktives Protein. Die
Proteinkonzentration kann mit Hilfe bekannter Methoden, zum Beispiel dem BCA-Verfahren (Bicinchoninsäure; 2,2'-Bichinolyl-4,4'-dicarbonsäure) oder dem Biuret- Verfahren (A. G. Gornall, C. S. Bardawill und M.M. David, J. Biol. Chem., 177 (1948), S. 751 -766) bestimmt werden. Die Bestimmung der Aktivproteinkonzentration erfolgte diesbezüglich über eine Titration der aktiven Zentren unter Verwendung eines geeigneten irreversiblen Inhibitors (für Proteasen beispielsweise Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)) und Bestimmung der Restaktivität (vgl. M. Bender et al., J. Am. Chem. Soc. 88, 24 (1966), S. 5890-5913).
Die Protease und/oder die Cellulase können ferner an Trägerstoffen adsorbiert und/oder in Hüllsubstanzen eingebettet sein, um sie gegen vorzeitige Inaktivierung zu schützen. In der
Waschflotte, also unter Anwendungsbedingungen, wird das Enzym dann freigesetzt und kann seine katalytische Wrkung entfalten.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Wasch- oder Reinigungsmittel dadurch gekennzeichnet, dass es ferner eine Komponente umfasst, die ausgewählt ist aus
i. anionische und/oder polyanionische Substanz, und/oder
ii. kationische und/oder polykationische Substanz, und/oder
iii. Hydroxyl- und/oder Polyhydroxyl-Gruppe(n) aufweisende Substanz.
Es wurde festgestellt, dass der Zusatz solcher Substanzen die Reinigungsleistung von Wasch- und Reinigungsmitteln, insbesondere von flüssigen Wasch- oder Reinigungsmitteln, welche Proteasen und Cellulasen enthalten, insbesondere solche wie vorstehend beschrieben, weiter verbessert, insbesondere bei vergleichsweise niedrigen Temperaturen, insbesondere zwischen 10°C und 50°C, zwischen 10°C und 40°C, zwischen 10°C und 30°C und/oder zwischen 20°C und 40°C. Insbesondere in Kombination mit einer erfindungsgemäß einzusetzenden Protease tritt eine synergistische Wrkung auf, vor allem hinsichtlich der Entfernung von mindestens einer protease- sensitiven Anschmutzung, insbesondere einer solchen wie vorstehend angegeben.
Bei den vorstehend unter i. angegebenen Substanzen handelt es sich um anionische oder polyanionische Substanzen, d.h. diese Substanzen tragen mindestens eine und bevorzugt mehrere negative Ladungen. Bevorzugt handelt es sich um ein Polymer mit mindestens einem negativ gelandenen Monomer, bevorzugt mit mehreren negativ geladenen Monomeren. Erfindungsgemäß bevorzugt ist dieses Polymer daher ein negativ geladenes Polymer. Bevorzugt sind beispielsweise Polymere organischer Säuren bzw. deren Salze, insbesondere Polyacrylate und/oder Poly- Zuckersäuren und/oder Polyarcylat-copolymere und/oder Poly-zucker-copolymere. Diesbezüglich weitere bevorzugte Verbindungen sind Polyacrylsulfonate oder Polycarboxylate und deren Salze, Copolymere oder Salze der Coploymere. Beispiele für besonders bevorzugt einzusetzende Substanzen sind Acusol 587D (Polyacrylsulfonat; Unternehmen Rohm & Haas/Dow Chemical), Acusol 445N (Polycarboxylat Natriumsalz;
Unternehmen Rohm & Haas/Dow Chemical), Acusol 590 (Polyarcrylat-copolymer; Unternehmen Rohm & Haas/Dow Chemical), Acusol 916 (Polyarcrylat Natriumsalz; Unternehmen Rohm & Haas/Dow Chemical), Sokalan CP42 (modifiziertes Polycarboxylat Natriumsalz; Unternehmen BASF), Sokalan PA 30CL (Polycarboxylat Natriumsalz; Unternehmen BASF), Dequest P 9000 (Polymaleinsäure; Unternehmen Thermphos), Alginsäure, Poly-2-acrylamido-2-methyl-1 -propan- sulfonsäure, Poly-4-styrol sulfonsäure -co-maleinsäure Natriumsalz, Poly-acrylamido-co-acrylsäure Natriumsalz, Poly-methacrylsäure Natriumsalz, Poly-methyl vinyl ether-alt maleinsäure oder Poly- vinylsulfonsäure Natriumsalz.
Bei den unter ii. angegebenen Substanzen handelt es sich kationische oder polykationische Substanzen, d.h. diese Substanzen tragen mindestens eine und bevorzugt mehrere positive Ladungen. Bevorzugt handelt es sich um ein Polymer mit mindestens einem positiv gelandenen Monomer, bevorzugt mit mehreren positiv geladenen Monomeren. Erfindungsgemäß bevorzugt ist dieses Polymer daher ein positiv geladenes Polymer. Beispiele für diesbezüglich bevorzugte Verbindungen sind Salze der Polyamine, Polyethyleneimine bzw. deren Copolymere, Salze der Polyallylamine, Salze der Polydiallyldimethylammonium-verbindungen oder Poly(acrylamide-co- diallyldimethylammonium-verbindungen.
Bei den unter iii. angegebenen Substanzen handelt es sich um Substanzen, die mindestens eine Hydroxyl- und/oder Polyhydroxyl-Gruppe und bevorzugt mehrere Hydroxyl- und/oder Polyhydroxyl- Gruppen aufweisen. Bevorzugt sind diesbezüglich beispielsweise Polyvinylalkohole, beispielsweise solche, die unter dem Handelsnamen Mowiol verfügbar sind (Unternehmen Kremer Pigmente GmbH & Co. KG).
Es wird an dieser Stelle ausdrücklich darauf hingewiesen, dass eine konkrete Substanz zu einer oder mehreren der vorstehend genannten Gruppen i. bis iii. zugehörig sein kann. Beispielsweise kann es sich um ein anionisches Polymer handeln, welches eine oder mehrere Hydroxyl- und/oder Polyhydroxyl-Gruppe(n) aufweist. Eine solche Substanz ist dann zugehörig zu den Gruppen i. und iii. Ebenso ist ein kationisches Polymer, welches eine oder mehrere Hydroxyl- und/oder
Polyhydroxyl-Gruppe(n) aufweist, zugehörig zu den Gruppen ii. und iii.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ebenfalls einsetzbar sind Derivate der vorstehend als zugehörig zu i., ii. oder iii. genannten Substanzen. Unter einem Derivat wird im Sinne der vorliegenden Anmeldung eine solche Substanz verstanden, die ausgehend von einer der vorstehend genannten Substanzen chemisch modifiziert ist, beispielsweise durch die Umwandlung einer Seitenkette oder durch kovalente Bindung einer anderen Verbindung an die Substanz. Bei solch einer Verbindung kann es sich beispielsweise um niedrigmolekulare Verbindungen wie Lipide oder Mono-, Oligo- oder Polysaccharide oder Amine bzw. Aminverbindungen handeln. Ferner kann die Substanz glykosyliert, hydrolysiert, oxidiert, N-methyliert, N-formyliert, N-acetyliert sein oder Methyl, Formyl, Ethyl, Acetyl, t-Butyl, Anisyl, Benzyl, Trifluroacetyl, N-hydroxysuccinimide, t- Butyloxycarbonyl, Benzoyl, 4-Methylbenzyl, Thioanizyl, Thiocresyl, Benzyloxymethyl, 4- Nitrophenyl, Benzyloxycarbonyl, 2-Nitrobenzoyl, 2-Nitrophenylsulphenyl, 4-Toluenesulphonyl, Pentafluorophenyl, Diphenylmethyl, 2-Chlorobenzyloxycarbonyl, 2,4,5-trichlorophenyl, 2- bromobenzyloxycarbonyl, 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl, Tripheylmethyl, 2,2,5,7,8-pentamethyl- chroman-6-sulphonyl enthalten. Ebenso ist unter einem Derivat die kovalente oder nichtkovalente Bindung der Substanz an einen makromolekularen Träger zu verstehen, genauso wie auch ein nichtkovalenter Einschluss in geeignete makromolekulare Käfigstrukturen. Auch Kopplungen mit sonstigen makromolekularen Verbindungen, wie etwa Polyethylenglykol, können vorgenommen sein. Weitere bevorzugte chemische Modifikationen sind die Modifikation von einer oder mehreren der chemischen Gruppen -COOH, -OH, =NH, -NH2 -SH zu -COOR, -OR, -NHR, -NR2, -NHR, -NR, -SR; wobei:
R ist— CH=CH— R2,— CEC— R2,— C(R2)=CH2,— C(R2)=C(R3),— CH=NR2,— C(R2)=N— R3, ein 4-7 C-Ring System mit oder ohne Substitution, ein 4-7 Stickstoffheterozyklus mit oder ohne Substitution, oder eine C2 bis C8 Kette mit 1 bis 5 Doppel- oder Dreifachbindungen mit
Substitutionen ausgewählt aus R1 , R2, oder R3, wobei
-R1 ist H,— R,— N02,— CN, Halogenidsubstituent, — N3,— C1 -8 alkyl,— (CH2)nC02R2,— C2-8 alkenyl-C02R2,— 0(CH2)nC02R2,— C(0)NR2R3,— P(0)(OR2)2, alkyl substituiertes tetrazol-5-yl, — (CH2)nO(CH2)n aryl,— NR2R3,— (CH2)n OR2,— (CH^n SR2,— N(R2)C(0)R3,— S(02)NR2R3, — N(R2)S(02)R3,— (CHR2)n NR2R3,— C(0)R3, (CH2)n N(R3)C(0)R3,— N(R2)CR2R3, substituiertes oder nicht substituiertes (CH2)n-zykloalkyl, substituiertes oder nicht substituiertes (CH2)n-phenyl, oder -zyklus; wobei n eine Zahl größer als 1 ist;
-R2 ist H, Halogenidsubstituent, -alkyl, -halogenalkyl,— (CH2)n-phenyl,— (CH2)1 -3-biphenyl,
— (CH2)1 -4-Ph-N(S02— C1 -2-alkyl)2,— CO(CHR1)n— OR1 ,— (CHRI)n-Heterozyklus,
— (CHR1 )n— NH— CO— R1 ,— (CHRI )n-NH— SOzR1 ,— (CHR1)n-Ph-N(S02— C1 -2-alkyl)2,
— (CHR1)n— C(0)(CHR1 )— NHR1 ,— (CHR1)n— C(S)(CHR1)— NHR1 ,— (CH2)nO(CH2)nCH3,
— CF3,— C2-C5 acyl,— (CHR1)nOH,— (CHR1)nC02R1 ,— (CHR1)n— O-alkyl,— (CHR1)n— O—
(CH2)n— O-alkyl,— (CHR1)n— S-alkyl,— (CHR1)n— S(0)-alkyl,— (CHR1)n— S(02)-alkyl,
— (CHR1 )n— S(02)— NHR3,— (CHR3)n— N3,— (CHR3)nNHR4, eine C2 bis C8 Kette Alken-Kette mit 1 bis 5 Doppelbindungen, eine C2 bis C8 Kette Alkin-Kette mit 1 bis 5 Dreifachbindungen, substituierter oder nicht substituierter -(CHR3)n Heterozyklus, substituiertes oder nicht substituiertes gesättigtes oder nicht gesättigtes -(CHR3)n Zykloalkyl; wobei n eine Zahl größer als
1 ist und R1 und R3 gleich oder unterschiedlich sein können; -R3 ist H,— OH,— CN, substituiertes Alkyl,— C2 bis C8 Alkenyl, substituiertes oder nicht substituiertes Zykloalkyl,— N(R1)R2, gesättigter oder nicht gesättigter C5 bis C7 Heterozyklus oder
Heterobizyklus von 4 bis 7 C-Atomen,— NR1 ,— NR2,— NR1 R2 bestehend aus einem gesättigten oder nicht gesättigten Heterozyklus oder einem Heterobizyklus von 4 bis 7 C-Atomen;
-R4 ist H,— (CH2)nOH,— C(0)OR5,— C(0)SR5,— (CH2)n C(0)NR6R7,— O— C(O)— O— R6, eine
Aminosäure oder ein Peptid; wobei n eine Zahl zwischen 0 und 4 ist;
-R5 ist H,
-R6 ist — C(R7)— (CH2)n— O— C(O)— R8,— (CH2)n— C(R7)— O— C(0)R8,— (CH2)n— C(R7)— O— C(O)— O— R8, oder— C(R7)— (CH2)n— O— C(O)— O— R8; wobei n eine Zahl zwischen 0 und 4 ist; und
-R7 und R8 sind jeweils H, Alkyl, substituiertes Alkyl, Aryl, substituiertes Aryl, Alkenyl,
substituiertes Alkenyl, Alkinyl, substituiertes Alkinyl, Heterozyklus, substituierter Heterozyklus, Alkylaryl, substituiertes Alkylaryl, Zykloalkyl, substituiertes Zykloalkyl, oder CH2C02alkyl, wobei R7 und R8 gleich oder unterschiedlich sein können.
Erfindungsgemäß ist es weiter möglich, alle möglichen Kombinationen der vorstehend als zugehörig zu i., ii. oder iii. genannten Substanzen und/oder deren Derivate einzusetzen.
Ein erfindungsgemäßes flüssiges Wasch- oder Reinigungsmittel kann als solches oder nach Verdünnen mit Wasser zur Reinigung von Textilien und/oder harten Oberflächen eingesetzt werden. Eine solche Verdünnung kann leicht hergestellt werden, indem eine abgemessene Menge des Mittels in einer weiteren Menge Wasser verdünnt wird in bestimmten Gewichtsverhältnissen von Mittel : Wasser und optional diese Verdünnung geschüttelt wird, um eine gleichmäßige Verteilung des Mittels im Wasser sicherzustellen. Mögliche Gewichts- oder Volumenverhältnisse der Verdünnungen sind von 1 :0 Mittel : Wasser bis 1 :10000 oder 1 :20000 Mittel : Wasser, vorzugsweise von 1 :10 bis 1 :2000 Mittel : Wasser.
Als flüssige Wasch- oder Reinigungsmittel können hierbei alle flüssigen bzw. fließfähigen
Darreichungsformen dienen.„Fließfähig" im Sinne der vorliegenden Anmeldung sind dabei Mittel, welche gießbar sind und Viskositäten bis hin zu mehreren 10.000 mPas aufweisen können. Die Viskosität kann mit üblichen Standardmethoden (beispielsweise Brookfield-Viskosimeter LVT-II bei 20 U/min und 20°C, Spindel 3) gemessen werden und liegt vorzugsweise im Bereich von 5 bis 10000 mPas. Bevorzugte Mittel haben Viskositäten von 10 bis 8000 mPas, wobei Werte zwischen 120 bis 3000 mPas besonders bevorzugt sind. Ein flüssiges Wasch- oder Reinigungsmittel im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann daher auch gelförmig oder pastenförmig sein, es kann als homogene Lösung oder Suspension vorliegen, sowie beispielsweise versprühbar oder in sonstigen üblichen Darreichungsformen konfektioniert sein. Zu den Waschmitteln zählen alle denkbaren Waschmittelarten, insbesondere Waschmittel für Textilien, Teppiche oder Naturfasern. Sie können für die manuelle und/oder auch die maschinelle Anwendung vorgesehen sein. Zu den Waschmitteln zählen ferner Waschhilfsmittel, die bei der manuellen oder maschinellen
Textilwäsche zum eigentlichen Waschmittel hinzudosiert werden, um eine weitere Wrkung zu erzielen. Zu den Reinigungsmitteln werden alle, ebenfalls in sämtlichen genannten
Darreichungsformen vorkommenden Mittel zur Reinigung und/oder Desinfektion harter
Oberflächen, manuelle und maschinelle Geschirrspülmittel, Teppichreiniger, Scheuermittel, Glasreiniger, WC-Duftspüler, usw. gezählt. Textilvor- und Nachbehandlungsmittel sind schließlich auf der einen Seite solche Mittel, mit denen das Wäschestück vor der eigentlichen Wäsche in Kontakt gebracht wird, beispielsweise zum Anlösen hartnäckiger Verschmutzungen, auf der anderen Seite solche, die in einem der eigentlichen Textilwäsche nachgeschalteten Schritt dem Waschgut weitere wünschenswerte Eigenschaften wie angenehmen Griff, Knitterfreiheit oder geringe statische Aufladung verleihen. Zu letztgenannten Mittel werden u.a. die Weichspüler gerechnet. Desinfektionsmittel sind beispielsweise Händedesinfektionsmittel, Flächendesinfektionsmittel und Instrumentendesinfektionsmittel, die ebenfalls in den genannten
Darreichungsformen vorkommen können.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Wasch- oder Reinigungsmittel dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens einen weiteren Inhaltsstoff umfasst, insbesondere einen, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phosphonat, Tensid, Gerüststoff (Builder), nichtwässriges Lösungsmittel, Säure, wasserlösliches Salz,
Verdickungsmittel sowie Kombinationen hiervon.
Phosphonate sind Salze und organische Verbindungen, insbesondere Ester, der Phosphonsäure. Als Salze existieren primäre (ΜΉ2Ρ03 bzw. HP(0)(OH)(OM')) und sekundäre (M' 2HP03 bzw. HP(0)(OM')2) Phosphonate, wobei M' für ein einwertiges Metall steht. Diese anorganischen Phosphonate und werden auch als primäre bzw. sekundäre Phosphite bezeichnet. Anorganische Phosphonate entstehen beispielsweise durch Umsetzung von Phosphonsäure HP(0)(OH)2, insbesondere der stabilen tautomeren Form der Phosphorigsäure mit einem (primäre) oder zwei (sekundäre) Äquivalenten Base, beispielsweise Alkalimetallhydroxid. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt sind organisch P-substituierte Phosphonate, die eine Phosphor-Kohlenstoff- Bindung aufweisen (Phosphor-organische Verbindungen). Ihre allgemeine Struktur ist
R1 P(0)(OR2)2, mit R1 und/oder R2 = Alkyl, Aryl oder H, wobei die Alkyl- bzw. Arylreste weitere Substitutionen aufweisen oder weitere chemische Gruppen tragen können. Organisch P- substituierte Phosphonate entstehen beispielsweise durch Michaelis-Arbusov-Reaktion. Viele dieser Phosphonate sind löslich in Wasser. Einige technisch wichtige Phosphonate tragen ferner Amino-Gruppe(n) in der Art NR-(CH2)x-PO(OH)2 (R = Alkyl, Aryl oder H). Einige diese Aminophosphonate haben strukturelle Ähnlichkeiten mit Komplexbildnern wie EDTA, NTA oder DTPA und haben eine ähnliche Funktion. Zu besonders bevorzugten Phosphonaten im Rahmen der vorliegenden Erfindung zählen insbesondere Organophosphonate wie beispielsweise 1 - Hydroxyethan-1 ,1 -diphosphonsäure (HEDP), Aminotri(methylenphosphonsäure) (ATMP, auch bezeichnet als Amino-tris(methylenphosphonsäure) bzw. Nitrolotris(methylenphosphonsäure) (NTMP)), Diethylentriamin-penta(methylenphosphonsäure) (DTPMP oder DETPMP oder DTPNT), Ethylendiamintetra(methylenphosphonsäure) (EDTMP, auch bezeichnet als Ethylendiamin- tetra(methylenphosphonsäure) sowie 2-Phosphonobutan-1 ,2,4-tricarbonsäure (PBS-AM, auch bezeichnet als 2-Phosphonobutan-1 ,2,4-tricarbonsäure bzw. 3-Carboxy-3-phosphonoadipinsäure), die zumeist in Form ihrer Ammonium- oder Alkalimetallsalze eingesetzt werden. Besonders bevorzugt ist Diethylentriamin-penta(methylenphosphonsäure)-Natrium. Ein solches Phosphonat ist beispielsweise unter dem Handelsnamen Dequest® 2066 (Firma Thermphos) erhältlich.
Vorzugsweise ist das Phosphonat in einer Menge von 0,01 bis 2,5 Gew.-% und zunehmend bevorzugt von 0,02 bis 2 Gew.-%, von 0,03 bis 1 ,5 Gew.-% und insbesondere von 0,05 bis 1 Gew.- % in dem Wasch- oder Reinigungsmittel enthalten.
Als Tensid(e) können anionische, nichtionische, zwitterionische und/oder amphotere Tenside eingesetzt werden. Bevorzugt sind aus anwendungstechnischer Sicht Mischungen aus anionischen und nichtionischen Tensiden. Der Gesamttensidgehalt des flüssigen Wasch- oder Reinigungsmittels liegt vorzugsweise unterhalb von 60 Gew.-% und besonders bevorzugt unterhalb von 45 Gew.-%, bezogen auf das gesamte flüssige Wasch- oder Reinigungsmittel.
Geeignete nichtionische Tenside umfassen alkoxylierte Fettalkohole, alkoxylierte
Fettsäurealkylester, Fettsäureamide, alkoxylierte Fettsäureamide, Polyhydroxyfettsäureamide, Alkylphenolpolyglycolether, Aminoxide, Alkylpolyglucoside und Mischungen daraus.
Als nichtionische Tenside werden vorzugsweise alkoxylierte, vorteilhafterweise ethoxylierte, insbesondere primäre Alkohole mit vorzugsweise 8 bis 18 C-Atomen und durchschnittlich 1 bis 12 Mol Ethylenoxid (EO) pro Mol Alkohol eingesetzt, in denen der Alkoholrest linear oder bevorzugt in 2-Stellung methylverzweigt sein kann bzw. lineare und methylverzweigte Reste im Gemisch enthalten kann, so wie sie üblicherweise in Oxoalkoholresten vorliegen. Insbesondere sind jedoch Alkoholethoxylate mit linearen Resten aus Alkoholen nativen Ursprungs mit 12 bis 18 C-Atomen, zum Beispiel aus Kokos-, Palm-, Talgfett- oder Oleylalkohol, und durchschnittlich 2 bis 8 EO pro Mol Alkohol bevorzugt. Zu den bevorzugten ethoxylierten Alkoholen gehören beispielsweise C12-14- Alkohole mit 3 EO, 4 EO oder 7 EO, Cg- -Alkohol mit 7 EO, C13.15-Alkohole mit 3 EO, 5 EO, 7 EO oder 8 EO, C 2-i8-Alkohole mit 3 EO, 5 EO oder 7 EO und Mischungen aus diesen, wie Mischungen aus C 2-i4-Alkohol mit 3 EO und C 2-i8-Alkohol mit 7 EO. Die angegebenen
Ethoxylierungsgrade stellen statistische Mittelwerte dar, die für ein spezielles Produkt eine ganze oder eine gebrochene Zahl sein können. Bevorzugte Alkoholethoxylate weisen eine eingeengte Homologenverteilung auf (narrow ränge ethoxylates, NRE). Zusätzlich zu diesen nichtionischen Tensiden können auch Fettalkohole mit mehr als 12 EO eingesetzt werden. Beispiele hierfür sind Talgfettalkohol mit 14 EO, 25 EO, 30 EO oder 40 EO. Auch nichtionische Tenside, die EO- und PO-Gruppen zusammen im Molekül enthalten, sind erfindungsgemäß einsetzbar. Geeignet sind ferner auch eine Mischung aus einem (stärker) verzweigten ethoxylierten Fettalkohol und einem unverzweigten ethoxylierten Fettalkohol, wie beispielsweise eine Mischung aus einem C16-18- Fettalkohol mit 7 EO und 2-Propylheptanol mit 7 EO. Insbesondere bevorzugt enthält das Wasch-, Reinigungs-, Nachbehandlungs- oder Waschhilfsmittel einen C 2-i 8-Fettalkohol mit 7 EO oder einen C 3. 5-Oxoalkohol mit 7 EO als nichtionisches Tensid.
Der Gehalt an nichtionischen Tensiden beträgt in dem Wasch- oder Reinigungsmittel bevorzugt 3 bis 40 Gew.-%, vorzugsweise 5 bis 30 Gew.-% und insbesondere 7 bis 20 Gew.-%, jeweils bezogen auf das gesamte Wasch- oder Reinigungsmittel.
Neben den nichtionischen Tensiden kann das Wasch- oder Reinigungsmittel auch anionische Tenside enthalten. Als anionisches Tensid werden vorzugsweise Sulfonate, Sulfate, Seifen, Alkylphosphate, anionische Silikontenside und Mischungen daraus eingesetzt.
Als Tenside vom Sulfonat-Typ kommen dabei vorzugsweise C9. 3-Alkylbenzolsulfonate,
Olefinsulfonate, d.h. Gemische aus Alken- und Hydroxyalkansulfonaten sowie Disulfonaten, wie man sie beispielsweise aus C 2-i8-Monoolefinen mit end- oder innenständiger Doppelbindung durch Sulfonieren mit gasförmigem Schwefeltrioxid und anschließende alkalische oder saure Hydrolyse der Sulfonierungsprodukte erhält, in Betracht. Geeignet sind auch C 2. 8-Alkansulfonate und die Ester von α-Sulfofettsäuren (Estersulfonate), zum Beispiel die α-sulfonierten Methylester der hydrierten Kokos-, Palmkern- oder Talgfettsäuren.
Als Alk(en)ylsulfate werden die Alkali- und insbesondere die Natriumsalze der
Schwefelsäurehalbester der C 2-C 8-Fettalkohole, beispielsweise aus Kokosfettalkohol,
Talgfettalkohol, Lauryl-, Myristyl-, Cetyl- oder Stearylalkohol oder der C 0-C20-Oxoalkohole und diejenigen Halbester sekundärer Alkohole dieser Kettenlängen bevorzugt. Aus waschtechnischem Interesse sind die C 2-C 6-Alkylsulfate und C 2-C 5-Alkylsulfate sowie C 4-C 5-Alkylsulfate bevorzugt. Auch 2,3-Alkylsulfate sind geeignete anionische Tenside. Auch die Schwefelsäuremonoester der mit 1 bis 6 Mol Ethylenoxid ethoxylierten geradkettigen oder verzweigten C7.2i-Alkohole, wie 2-Methyl-verzweigte Cg- -Alkohole mit im Durchschnitt 3,5 Mol Ethylenoxid (EO) oder C 2-i8-Fettalkohole mit 1 bis 4 EO, sind geeignet.
Auch bevorzugte anionische Tenside sind Seifen. Geeignet sind gesättigte und ungesättigte Fettsäureseifen, wie die Salze der Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, (hydrierten) Erucasäure und Behensäure sowie insbesondere aus natürlichen Fettsäuren, zum Beispiel Kokos-, Palmkern-, Olivenöl- oder Talgfettsäuren, abgeleitete Seifengemische.
Die anionischen Tenside einschließlich der Seifen können in Form ihrer Natrium-, Kalium- oder Magnesium- oder Ammoniumsalze vorliegen. Vorzugsweise liegen die anionischen Tenside in Form ihrer Natriumsalze vor. Weitere bevorzugte Gegenionen für die anionischen Tenside sind auch die protonierten Formen von Cholin, Triethylamin oder Methylethylamin.
Der Gehalt eines Wasch- oder Reinigungsmittels an anionischen Tensiden kann 1 bis 40 Gew.-%, vorzugsweise 5 bis 30 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt 10 bis 25 Gew.-%, jeweils bezogen auf das gesamte Wasch- oder Reinigungsmittel, betragen.
Als Gerüststoffe (Builder), die in dem Wasch- oder Reinigungsmittel enthalten sein können, sind insbesondere Silikate, Aluminiumsilikate (insbesondere Zeolithe), Carbonate, Salze organischer Di- und Polycarbonsäuren sowie Mischungen dieser Stoffe zu nennen.
Organische Gerüststoffe, welche in dem Wasch- oder Reinigungsmittel vorhanden sein können, sind beispielsweise die in Form ihrer Natriumsalze einsetzbaren Polycarbonsäuren, wobei unter Polycarbonsäuren solche Carbonsäuren verstanden werden, die mehr als eine Säurefunktion tragen. Beispielsweise sind dies Citronensäure, Adipinsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Zuckersäuren, Aminocarbonsäuren,
Nitrilotriessigsäure (NTA), Methylglycindiessigsäure (MGDA) und deren Abkömmlinge sowie Mischungen aus diesen. Bevorzugte Salze sind die Salze der Polycarbonsäuren wie
Citronensäure, Adipinsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Weinsäure, Zuckersäuren und
Mischungen aus diesen.
Als Gerüststoffe sind weiter polymere Polycarboxylate geeignet. Dies sind beispielsweise die Alkalimetallsalze der Polyacrylsäure oder der Polymethacrylsäure, zum Beispiel solche mit einer relativen Molekülmasse von 600 bis 750.000 g / mol. Geeignete Polymere sind insbesondere Polyacrylate, die bevorzugt eine Molekülmasse von 1 .000 bis 15.000 g / mol aufweisen. Aufgrund ihrer überlegenen Löslichkeit können aus dieser Gruppe wiederum die kurzkettigen Polyacrylate, die Molmassen von 1 .000 bis 10.000 g / mol, und besonders bevorzugt von 1 .000 bis 5.000 g / mol, aufweisen, bevorzugt sein.
Geeignet sind weiterhin copolymere Polycarboxylate, insbesondere solche der Acrylsäure mit Methacrylsäure und der Acrylsäure oder Methacrylsäure mit Maleinsäure. Zur Verbesserung der Wasserlöslichkeit können die Polymere auch Allylsulfonsäuren, wie Allyloxybenzolsulfonsäure und Methallylsulfonsäure, als Monomer enthalten.
Bevorzugt werden allerdings lösliche Gerüststoffe, wie beispielsweise Citronensäure, oder Acrylpolymere mit einer Molmassen von 1 .000 bis 5.000 g / mol bevorzugt in den flüssigen Waschoder Reinigungsmitteln eingesetzt.
Bei den für polymere Polycarboxylate angegebenen Molmassen handelt es sich im Sinne dieser Schrift um gewichtsmittlere Molmassen Mw der jeweiligen Säureform, die grundsätzlich mittels Gelpermeationschromatographie (GPC) bestimmt wurden, wobei ein UV-Detektor eingesetzt wurde. Die Messung erfolgte dabei gegen einen externen Polyacrylsäure-Standard, der aufgrund seiner strukturellen Verwandtschaft mit den untersuchten Polymeren realistische Molgewichtswerte liefert. Diese Angaben weichen deutlich von den Molgewichtsangaben ab, bei denen
Polystyrolsulfonsäuren als Standard eingesetzt werden. Die gegen Polystyrolsulfonsäuren gemessenen Molmassen sind in der Regel deutlich höher als die in dieser Schrift angegebenen Molmassen.
Derartige organische Buildersubstanzen können gewünschtenfalls in Mengen bis zu 40 Gew.-%, insbesondere bis zu 25 Gew.-% und vorzugsweise von 1 Gew.-% bis 8 Gew.-% enthalten sein. Mengen nahe der genannten Obergrenze werden vorzugsweise in pastenförmigen oder flüssigen, insbesondere wasserhaltigen, Mitteln eingesetzt.
Die erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel sind flüssig und enthalten vorzugsweise Wasser als Hauptlösungsmittel. Daneben können dem Wasch- oder Reinigungsmittel
nichtwässrige Lösungsmittel zugesetzt werden. Geeignete nichtwässrige Lösungsmittel umfassen ein- oder mehrwertige Alkohole, Alkanolamine oder Glykolether, sofern sie im angegebenen Konzentrationsbereich mit Wasser mischbar sind. Vorzugsweise werden die Lösungsmittel ausgewählt aus Ethanol, n-Propanol, i-Propanol, Butanolen, Glykol, Propandiol, Butandiol, Glycerin, Diglykol, Propyldiglycol, Butyldiglykol, Hexylenglycol, Ethylenglykolmethylether,
Ethylenglykolethylether, Ethylenglykolpropylether, Ethylenglykolmono-n-butylether, Diethylenglykolmethylether, Diethylenglykolethylether, Propylenglykolmethylether, Propylenglykolethylether, Propylenglykolpropylether, Dipropylenglykolmonomethylether,
Dipropylenglykolmonoethylether, Di-isopropylenglykolmonomethylether, Di- isopropylenglykolmonoethylether, Methoxytriglykol, Ethoxytriglykol, Butoxytriglykol, 1 - Butoxyethoxy-2-propanol, 3-Methyl-3-methoxybutanol, Propylen-glykol-t-butylether, Di-n-octylether sowie Mischungen dieser Lösungsmittel. Es ist allerdings bevorzugt, dass das Wasch- oder Reinigungsmittel ein Polyol als nicht-wässriges Lösungsmittel enthält. Das Polyol kann insbesondere Glycerin, 1 ,2-Propandiol, 1 ,3-Propandiol, Ethylenglycol, Diethylenglycol und/oder Dipropylenglycol umfassen. Insbesondere bevorzugt enthält das Wasch- oder Reinigungsmittel eine Mischung aus einem Polyol und einem einwertigen Alkohol. Nichtwässrige Lösungsmittel können in dem Wasch- oder Reinigungsmittel in Mengen zwischen 0,5 und 15 Gew.-%, bevorzugt aber unter 12 Gew.-% und eingesetzt werden.
Zur Einstellung eines gewünschten, sich durch die Mischung der übrigen Komponenten nicht von selbst ergebenden pH-Werts können die Mittel System- und umweltverträgliche Säuren, insbesondere Citronensäure, Essigsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Milchsäure, Glykolsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure und/oder Adipinsäure, aber auch Mineralsäuren, insbesondere Schwefelsäure, oder Basen, insbesondere Ammonium- oder Alkalihydroxide, enthalten. Derartige pH- Regulatoren sind in den Mitteln in Mengen von vorzugsweise nicht über 20 Gew.-%, insbesondere von 1 ,2 Gew.-% bis 17 Gew.-%, enthalten.
Ein Mittel im Sinne der Erfindung kann weiterhin ein oder mehrere wasserlösliche Salze enthalten, die beispielsweise zur Viskositätseinstellung dienen. Es kann sich dabei um anorganische und/oder organische Salze handeln. Einsetzbare anorganische Salze sind dabei vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend farblose wasserlösliche Halogenide, Sulfate, Sulfite, Carbonate, Hydrogencarbonate, Nitrate, Nitrite, Phosphate und/oder Oxide der Alkalimetalle, der Erdalkalimetalle, des Aluminiums und/oder der Übergangsmetalle; weiterhin sind Ammoniumsalze einsetzbar. Besonders bevorzugt sind dabei Halogenide und Sulfate der Alkalimetalle; vorzugsweise ist das anorganische Salz daher ausgewählt aus der Gruppe umfassend Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Natriumsulfat, Kaliumsulfat sowie Gemische derselben. Einsetzbare organische Salze sind beispielsweise farblose wasserlösliche Alkalimetall-, Erdalkalimetall-, Ammonium-, Aluminium- und/oder Übergangsmetallsalze der Carbonsäuren. Vorzugsweise sind die Salze ausgewählt aus der Gruppe umfassend Formiat, Acetat, Propionat, Citrat, Malat, Tartrat, Succinat, Malonat, Oxalat, Lactat sowie Gemische derselben.
Zur Verdickung kann ein erfindungsgemäßes Mittel ein oder mehrere Verdickungsmittel enthalten. Bevorzugt ist das Verdickungsmittel ausgewählt aus der Gruppe umfassend Xanthan, Guar, Carrageenan, Agar-Agar, Gellan, Pektin, Johannisbrotkernmehl und Mischungen daraus. Diese Verbindungen sind auch in Gegenwart von anorganischen Salzen effektive Verdickungsmittel. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält das Wasch- oder Reinigungsmittel Xanthan als Verdickungsmittel, da Xanthan auch in Gegenwart von hohen Salzkonzentrationen effektiv verdickt und eine makroskopische Auftrennung der kontinuierlichen Phase verhindert. Zusätzlich stabilisiert das Verdickungsmittel die kontinuierliche, tensidarme Phase und verhindert eine makroskopische Phasenseparation.
Alternativ oder ergänzend können auch (Meth)Acrylsäure(co)polymere als Verdickungsmittel eingesetzt werden. Geeignete Acryl- und Methacryl(co)polymere umfassen beispielsweise die hochmolekularen mit einem Polyalkenylpolyether, insbesondere einem Allylether von Saccharose, Pentaerythrit oder Propylen, vernetzten Homopolymere der Acrylsäure (INCI-Bezeichnung gemäß „International Dictionary of Cosmetic Ingredients" der„The Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association (CTFA)": Carbomer), die auch als Carboxyvinylpolymere bezeichnet werden. Solche Polyacrylsäuren sind unter anderem unter den Handelsnamen Polygel® und Carbopol® erhältlich. Weiterhin sind beispielsweise folgende Acrylsäure-Copolymere geeignet: (i) Copolymere von zwei oder mehr Monomeren aus der Gruppe der Acrylsäure, Methacrylsäure und ihrer einfachen, vorzugsweise mit C^-Alkanolen gebildeten, Ester (INCI Acrylates Copolymer), die beispielsweise unter den Handelsnamen Aculyn®, Acusol® oder Tego® Polymer erhältlich sind; (ii) vernetzte hochmolekulare Acrylsäure-Copolymere, zu denen etwa die mit einem Allylether der Saccharose oder des Pentaerythrits vernetzten Copolymere von C 0-3o-Alkylacrylaten mit einem oder mehreren Monomeren aus der Gruppe der Acrylsäure, Methacrylsäure und ihrer einfachen, vorzugsweise mit C^-Alkanolen gebildeten, Ester (INCI Acrylates/C 0.30 Alkyl Acrylate Crosspolymer) gehören und die beispielsweise unter dem Handelsnamen Carbopol® erhältlich sind. Weitere geeignete Polymere sind (Meth)Acrylsäure(co)polymere des Typs Sokalan®.
Es kann bevorzugt sein, dass das erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel ein
(Meth)Acrylsäure(co)polymer in Kombination mit einem weiteren Verdickungsmittel, vorzugsweise Xanthan, enthält. Das Wasch- oder Reinigungsmittel kann 0,05 bis 1 ,5 Gew.-% und vorzugsweise 0,1 bis 1 Gew.-%, jeweils bezogen auf das gesamte Wasch- oder Reinigungsmittel, Verdickungsmittel enthalten. Die Menge an eingesetztem Verdickungsmittel ist dabei abhängig von der Art des Verdickungsmittels und dem gewünschten Grad der Verdickung.
Flüssige beziehungsweise pastöse erfindungsgemäße Mittel in Form von übliche Lösungsmittel enthaltenden Lösungen werden in der Regel durch einfaches Mischen der Inhaltsstoffe, die in Substanz oder als Lösung in einen automatischen Mischer gegeben werden können, hergestellt. Erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel können ausschließlich eine Protease und eine Cellulase enthalten wie beschrieben. Alternativ können sie auch weitere hydrolytische Enzyme oder andere Enzyme in einer für die Wirksamkeit des Mittels zweckmäßigen Konzentration enthalten. Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellen somit Mittel dar, die ferner eines oder mehrere weitere Enzyme umfassen, wobei prinzipiell alle im Stand der Technik für diese Zwecke etablierten Enzyme einsetzbar sind. Als weitere Enzyme bevorzugt einsetzbar sind alle Enzyme, die in dem erfindungsgemäßen Mittel eine katalytische Aktivität entfalten können, insbesondere eine Protease, Amylase, Cellulase, Hemicellulase, Mannanase, Tannase, Xylanase, Xanthanase, Xyloglucanase, ß-Glucosidase, Pektinase, Carrageenase, Perhydrolase, Oxidase, Oxidoreduktase oder eine Lipase, sowie deren Gemische. Weitere Enzyme sind in dem Mittel vorteilhafterweise jeweils in einer Gesamtmenge von 1 x 10~8 bis 5 Gewichts-Prozent bezogen auf aktives Protein enthalten. Zunehmend bevorzugt ist jedes weitere Enzym in einer Menge von 1 x 10"7-3 Gew.-%, von 0,00001 -1 Gew.-%, von 0,00005-0,5 Gew.-%, von 0,0001 bis 0,1 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,0001 bis 0,05 Gew.-% in erfindungsgemäßen Mitteln enthalten, bezogen auf aktives Protein. Besonders bevorzugt zeigen die Enzyme synergistische Reinigungsleistungen gegenüber bestimmten Anschmutzungen oder Flecken, d.h. die in der Mittelzusammensetzung enthaltenen Enzyme unterstützen sich in ihrer Reinigungsleistung gegenseitig. Ganz besonders bevorzugt liegt ein solches Synergismus vor zwischen der erfindungsgemäß enthaltenen Protease und einem weiteren Enzym eines erfindungsgemäßen Mittels, darunter insbesondere zwischen der genannten Protease und der Cellulase und/oder einer Lipase und/oder einer Mannanase und/oder einer Amylase und/oder einer Pektinase. Synergistische Effekte können nicht nur zwischen verschiedenen Enzymen, sondern auch zwischen einem oder mehreren Enzymen und weiteren Inhaltsstoffen des erfindungsgemäßen Mittels auftreten.
Einen weiteren Erfindungsgegenstand stellt die Verwendung eines erfindungsgemäßen Waschoder Reinigungsmittels zur Entfernung von Anschmutzungen, insbesondere von protease- und/oder cellulase-sensitiven Anschmutzungen, auf Textilien oder harten Oberflächen, d.h. zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen, dar. Denn erfindungsgemäße Mittel können, insbesondere auf Grund der enthaltenen Kombination von Protease und Cellulase, vorteilhaft dazu verwendet werden, um von Textilien oder von harten Oberflächen entsprechende
Verunreinigungen zu beseitigen. Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes stellen beispielsweise die Handwäsche, die manuelle Entfernung von Flecken von Textilien oder von harten Oberflächen oder die Verwendung im Zusammenhang mit einem maschinellen Verfahren dar. Alle Sachverhalte, Gegenstände und Ausführungsformen, die für erfindungsgemäße Waschoder Reinigungsmittel beschrieben sind, sind auch auf diesen Erfindungsgegenstand anwendbar. Daher wird an dieser Stelle ausdrücklich auf die Offenbarung an entsprechender Stelle verwiesen mit dem Hinweis, dass diese Offenbarung auch für die vorstehende erfindungsgemäße
Verwendung gilt.
Einen weiteren Erfindungsgegenstand stellt ein Verfahren zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen dar, wobei in mindestens einem Verfahrensschritt ein erfindungsgemäßes Wasch- oder Reinigungsmittel angewendet wird.
Hierunter fallen sowohl manuelle als auch maschinelle Verfahren, wobei maschinelle Verfahren aufgrund ihrer präziseren Steuerbarkeit, was beispielsweise die eingesetzten Mengen und Einwirkzeiten angeht, bevorzugt sind. Verfahren zur Reinigung von Textilien zeichnen sich im allgemeinen dadurch aus, dass in mehreren Verfahrensschritten verschiedene reinigungsaktive Substanzen auf das Reinigungsgut aufgebracht und nach der Einwirkzeit abgewaschen werden, oder dass das Reinigungsgut in sonstiger Weise mit einem Waschmittel oder einer Lösung bzw. Verdünnung dieses Mittels behandelt wird. Entsprechendes gilt für Verfahren zur Reinigung von allen anderen Materialien als Textilien, insbesondere von harten Oberflächen. Alle denkbaren Wasch- oder Reinigungsverfahren können in wenigstens einem der Verfahrensschritte um die Anwendung eines erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittels bereichert werden und stellen dann Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar. Alle Sachverhalte, Gegenstände und Ausführungsformen, die für erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel beschrieben sind, sind auch auf diesen Erfindungsgegenstand anwendbar. Daher wird an dieser Stelle ausdrücklich auf die Offenbarung an entsprechender Stelle verwiesen mit dem Hinweis, dass diese Offenbarung auch für die vorstehenden erfindungsgemäßen Verfahren gilt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Cellulase in der Waschflotte in einer Konzentration von 0,0000004 bis 0,0006 Gew.-%, bevorzugt von 0,0000008 bis 0,00048 Gew.-% vorliegt, und/oder dass die Protease in der Waschflotte in einer Konzentration von 0,00009 bis 0,0005 Gew.-%, bevorzugt von 0,00015 bis 0,00035 Gew.-% vorliegt, wobei die Angaben auf Aktivprotein in der Waschflotte bezogen sind. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass es bei einer Temperatur zwischen 10°C und 50°C, bevorzugt zwischen 10°C und 40°C und besonders bevorzugt zwischen 20°C und 40°C durchgeführt wird.
In erfindungsgemäßen Mitteln eingesetzte Proteasen sind entsprechend der vorstehenden Ausführungen vorteilhaft in erfindungsgemäßen Wasch- und Reinigungsmitteln sowie Verfahren, insbesondere Wasch- und Reinigungsverfahren, einsetzbar. Sie können also vorteilhaft dazu verwendet werden, um in entsprechenden Mitteln eine proteolytische Aktivität bereitzustellen. Einen weiteren Gegenstand der Erfindung bildet daher die Verwendung einer Protease,
(a1) die eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen
Aminosäuresequenz zu mindestens 80% identisch ist und die an Position 99 in der Zählung gemäß
SEQ ID NO. 1 die Aminosäure Glutaminsäure (E) oder Asparaginsäure (D) aufweist, oder
(a2) die eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen
Aminosäuresequenz zu mindestens 80% identisch ist und die an Position 99 in der Zählung gemäß
SEQ ID NO. 1 die Aminosäure Asparagin (N) oder Glutamin (Q) aufweist, oder
(a3) die eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen
Aminosäuresequenz zu mindestens 80% identisch ist und die an Position 99 in der Zählung gemäß
SEQ ID NO. 1 die Aminosäure Alanin (A) oder Glycin (G) oder Serin (S) aufweist,
zur Bereitstellung einer proteolytischen Aktivität in einem flüssigen Wasch- oder Reinigungsmittel, welches ferner eine Cellulase umfasst.
In einer weiteren Ausführungsform ist diese Verwendung dadurch gekennzeichnet, dass die Protease ferner in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 1 mindestens eine der folgenden Aminosäuren aufweist:
(a) Threonin an Position 3 (3T),
(b) Isoleucin an Position 4 (41),
(c) Alanin, Threonin oder Arginin an Position 61 (61A, 61 T oder 61 R),
(d) Asparaginsäure oder Glutaminsäure an Position 154 (154D oder 154E),
(e) Prolin an Position 188 (188P),
(f) Methionin an Position 193 (193M),
(g) Isoleucin an Position 199 (1991),
(h) Asparaginsäure, Glutaminsäure oder Glycin an Position 21 1 (21 1 D, 21 1 E oder 21 1 G),
(i) Kombinationen der Aminosäuren (a) bis (h).
Einen weiteren Gegenstand der Erfindung bildet die Verwendung einer Protease, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
a. Protease umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2 oder SEQ ID NO. 3 oder SEQ ID NO. 4 oder SEQ ID NO. 5 oder SEQ ID NO. 6 oder SEQ ID NO. 7 oder SEQ ID NO.
8;
b. Protease, die eine gegenüber SEQ ID NO. 2 oder SEQ ID NO. 3 oder SEQ ID NO. 4 oder SEQ ID NO. 5 oder SEQ ID NO. 6 oder SEQ ID NO. 7 oder SEQ ID NO. 8 in mindestens einer Position veränderte Aminosäuresequenz umfasst, wobei die Veränderung in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 1 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
i. Threonin an Position 3 (3T),
ii. Isoleucin an Position 4 (41), iii. Alanin, Threonin oder Arginin an Position 61 (61A, 61 T oder 61 R),
iv. Asparaginsäure oder Glutaminsäure an Position 154 (154D oder 154E),
v. Prolin an Position 188 (188P),
vi. Methionin an Position 193 (193M),
vii. Isoleucin an Position 199 (1991),
viii. Asparaginsäure, Glutaminsäure oder Glycin an Position 21 1 (21 1 D, 21 1 E oder 21 1 G), ix. Kombinationen der Aminosäuren (i) bis (viii);
zur Bereitstellung einer proteolytischen Aktivität in einem flüssigen Wasch- oder Reinigungsmittel, welches ferner eine Cellulase umfasst.
Alle Sachverhalte, Gegenstände und Ausführungsformen, die für erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel beschrieben sind, sind auch auf die genannten Verwendungen anwendbar. Daher wird an dieser Stelle ausdrücklich auf die Offenbarung an entsprechender stelle verwiesen mit dem Hinweis, dass diese Offenbarung auch für die vorstehenden erfindungsgemäßen
Verwendungen gilt.
Beispiel: Ermittlung der Lagerstabilität erfindungsgemäßer flüssiger Waschmittel Als Waschmittel-Basisrezepturen dienten
a) ein erstes Flüssigwaschmittel folgender Zusammensetzung (alle Angaben in Gewichts-Prozent): 0,3-0,5% Xanthan, 0,2-0,4% Anti-Schaummittel, 6-7% Glycerin, 0,3-0,5% Ethanol, 4-7% FAEOS (Fettalkoholethersulfat) , 24-28% nichtionische Tenside, 1 % Borsäure, 1 -2% Natriumeitrat (Dihydrat), 2-4% Soda, 14-16% Kokosnuss-Fettsäuren, 0,5% HEDP (1 -Hydroxyethan-(1 ,1 -di- phosphonsäure)), 0-0,4% PVP (Polyvinylpyrrolidon), 0-0,05% optischer Aufheller, 0-0,001 % Farbstoff, Rest demineralisiertes Wasser. Als Cellulase enthalten war 0,15 Gew.-% Ecostone N400® (Cellulasepräparation der Firma AB Enzymes).
b) ein zweites Flüssigwaschmittel folgender Zusammensetzung:
Inhaltsstoff Gew.-%
C 2-i 8-Fettalkohol mit 7 EO 7,5
Lin. C 0-C 3-Alkylbenzolsulfonat (Na-Salz) 8,5
Kokosfettsäure (Na-Salz) 14,6
Laurylethersulfat mit 2 EO (Na-Salz) 13,0
Citronensäure (Na-Salz) 3,1
Borsäure (Na-Salz) 1 ,0
Polyacrylat- Verdicker 0,4
Propylenglykol 2,1
Silikon-Entschäumer 0,2 Cellulasepräparation Ecostone N400® 0,1
(Firma AB Enzymes)
Wasser Ad 100
Die Waschmittel-Basis-Rezepturen wurden für die verschiedenen Versuchsansätze mit folgenden Proteasen versetzt, wobei die Angaben auf aktives Protein bezogen sind:
Ansatz 1 : Leistungsverbesserte Variante F49 der Protease aus Bacillus lentus gemäß WO
95/23221 (Arg an Position 99 (99R)): 0,4 mg/ml (0,04 Gew.-%) in den Flüssigwaschmitteln gemäß a) und b).
Ansatz 2: Protease, die in Figur 2 bzw. SEQ ID NO. 3 der internationalen Offenlegungsschrift WO 03/057713 offenbart ist (Ser an Position 99 (99S; Identität zu SEQ ID NO. 1 < 80%): 0,4 mg/ml (0,04 Gew.-%) in dem Flüssigwaschmittel gemäß a), 0,3 mg/ml (0,03 Gew.-%) in dem
Flüssigwaschmittel gemäß b).
Ansatz 3: Protease umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2 (Glu an Position 99 (99E)): 0,4 mg/ml (0,04 Gew.-%) in dem Flüssigwaschmittel gemäß a), 0,3 mg/ml (0,03 Gew.-%) in dem Flüssigwaschmittel gemäß b).
Die Waschmittel gemäß der jeweiligen Ansätze 1 , 2 und 3 wurden hinsichtlich ihrer Lagerstabilität überprüft. Hierfür wurden die Waschmittel bei einer Temperatur von 30°C für den jeweils angegebenen Zeitraum gelagert und die jeweilige cellulolytische Restaktivität bestimmt. Unter definierten Reaktionsbedingungen (100 mM Natriumphosphatpuffer pH 7.5, 40°C, 15 min) wurden die zu untersuchenden Proben mit einem Substrat (1 ,25% Carboxymethylcellulose) inkubiert. Unter alkalischen Bedingungen reagierten diese mit p-Hydroxybenzoesäure-hydrazid (PAHBAH) unter Anwesenheit von Bismuth zu einem gelben Farbstoff, der photometrisch bei einer Wellenlänge von 410 nm bestimmt wurde. Die der Färbung entsprechende Menge des freigesetzten Zuckers ist dabei ein Maß für die Enzymaktivität (vgl. Lever, Anal. Biochem., 1972, 47 & 1977, 81). Die erhaltenen cellulolytischen Restaktivitäten sind in nachfolgender Tabelle 1 angegeben.
Tabelle! :
Figure imgf000031_0001
Es wird deutlich, dass erfindungsgemäße Waschmittel eine deutlich verbesserte cellulolytische Restaktivität und damit Lagerstabilität aufweisen im Vergleich mit den Waschmitteln der Ansätze 1 und 2.

Claims

Patentansprüche
1 . Flüssiges Wasch- oder Reinigungsmittel umfassend
(a1) eine Protease, die eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 80% identisch ist und die an Position 99 in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 1 die Aminosäure Glutaminsäure (E) oder Asparaginsäure (D) aufweist, oder
(a2) eine Protease, die eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 80% identisch ist und die an Position 99 in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 1 die Aminosäure Asparagin (N) oder Glutamin (Q) aufweist, oder
(a3) eine Protease, die eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 80% identisch ist und die an Position 99 in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 1 die Aminosäure Alanin (A) oder Glycin (G) oder Serin (S) aufweist, und
(b) eine Cellulase.
2. Wasch- oder Reinigungsmittel nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Protease ferner in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 1 mindestens eine der folgenden Aminosäuren aufweist:
(a) Threonin an Position 3 (3T),
(b) Isoleucin an Position 4 (41),
(c) Alanin, Threonin oder Arginin an Position 61 (61 A, 61 T oder 61 R),
(d) Asparaginsäure oder Glutaminsäure an Position 154 (154D oder 154E),
(e) Prolin an Position 188 (188P),
(f) Methionin an Position 193 (193M),
(g) Isoleucin an Position 199 (1991),
(h) Asparaginsäure, Glutaminsäure oder Glycin an Position 21 1 (21 1 D, 21 1 E oder 21 1 G),
(i) Kombinationen der Aminosäuren (a) bis (h).
3. Flüssiges Wasch- oder Reinigungsmittel umfassend
(a) eine Protease, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
a. Protease umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2 oder SEQ ID NO. 3 oder SEQ ID NO. 4 oder SEQ ID NO. 5 oder SEQ ID NO. 6 oder SEQ ID NO. 7 oder SEQ ID NO. 8; b. Protease, die eine gegenüber SEQ ID NO. 2 oder SEQ ID NO. 3 oder SEQ ID NO. 4 oder SEQ ID NO. 5 oder SEQ ID NO. 6 oder SEQ ID NO. 7 oder SEQ ID NO. 8 in mindestens einer Position veränderte Aminosäuresequenz umfasst, wobei die Veränderung in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 1 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
i. Threonin an Position 3 (3T),
ii. Isoleucin an Position 4 (41),
iii. Alanin, Threonin oder Arginin an Position 61 (61A, 61 T oder 61 R), iv. Asparaginsäure oder Glutaminsäure an Position 154 (154D oder 154E), v. Prolin an Position 188 (188P),
vi. Methionin an Position 193 (193M),
vii. Isoleucin an Position 199 (1991),
viii. Asparaginsäure, Glutaminsäure oder Glycin an Position 21 1 (21 1 D, 21 1 E oder 21 1 G),
ix. Kombinationen der Aminosäuren (i) bis (viii);
(b) eine Cellulase.
4. Wasch oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Cellulase in einer Menge von 1 x 10~8 bis 5 Gewichts-Prozent, bezogen auf aktives Protein, enthalten ist, und/oder dass die Protease in einer Menge von 1 x 10~8 bis 5 Gewichts- Prozent, bezogen auf aktives Protein, enthalten ist.
5. Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es ferner eine Komponente umfasst, die ausgewählt ist aus
i. anionische und/oder polyanionische Substanz, und/oder
ii. kationische und/oder polykationische Substanz, und/oder
iii. Hydroxyl- und/oder Polyhydroxyl-Gruppe(n) aufweisende Substanz.
6. Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens einen weiteren Inhaltsstoff umfasst, insbesondere einen, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phosphonat, Tensid, Gerüststoff (Builder), nichtwässriges Lösungsmittel, Säure, wasserlösliches Salz, Verdickungsmittel sowie Kombinationen hiervon.
7. Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens ein weiteres Enzym umfasst, insbesondere eine Protease, Amylase, Cellulase, Hemicellulase, Mannanase, Tannase, Xylanase, Xanthanase, Xyloglucanase, ß- Glucosidase, Pektinase, Carrageenase, Perhydrolase, Oxidase, Oxidoreduktase oder eine Lipase, sowie deren Gemische.
8. Verwendung eines Wasch- oder Reinigungsmittels nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Entfernung von protease-sensitiven Anschmutzungen auf Textilien oder harten Oberflächen.
9. Verfahren zur Reinigung von Textilien oder harten Oberflächen, dadurch gekennzeichnet, dass in mindestens einem Verfahrensschritt ein Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 7 angewendet wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Cellulase in der Waschflotte in einer Konzentration von 0,0000004 bis 0,0006 Gew.-% vorliegt, und/oder dass die Protease in der Waschflotte in einer Konzentration von 0,00009 bis 0,0005 Gew.-% vorliegt.
1 1 . Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass es bei einer Temperatur zwischen 10°C und 50°C, bevorzugt zwischen 10°C und 40°C und besonders bevorzugt zwischen 20°C und 40°C durchgeführt wird.
12. Verwendung einer Protease,
(a1) die eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 80% identisch ist und die an Position 99 in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 1 die Aminosäure Glutaminsäure (E) oder Asparaginsäure (D) aufweist, oder
(a2) die eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 80% identisch ist und die an Position 99 in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 1 die Aminosäure Asparagin (N) oder Glutamin (Q) aufweist, oder (a3) die eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 80% identisch ist und die an Position 99 in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 1 die Aminosäure Alanin (A) oder Glycin (G) oder Serin (S) aufweist, zur Bereitstellung einer proteolytischen Aktivität in einem flüssigen Wasch- oder
Reinigungsmittel, welches eine Cellulase umfasst.
13. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Protease ferner in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 1 mindestens eine der folgenden Aminosäuren aufweist:
(j) Threonin an Position 3 (3T),
(k) Isoleucin an Position 4 (41),
(I) Alanin, Threonin oder Arginin an Position 61 (61 A, 61 T oder 61 R), (m) Asparaginsäure oder Glutaminsäure an Position 154 (154D oder 154E),
(n) Prolin an Position 188 (188P),
(o) Methionin an Position 193 (193M),
(p) Isoleucin an Position 199 (1991),
(q) Asparaginsäure, Glutaminsäure oder Glycin an Position 21 1 (21 1 D, 21 1 E oder 21 1 G), (r) Kombinationen der Aminosäuren (a) bis (h).
14. Verwendung einer Protease, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
a. Protease umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2 oder SEQ ID NO. 3 oder SEQ ID NO. 4 oder SEQ ID NO. 5 oder SEQ ID NO. 6 oder SEQ ID NO. 7 oder SEQ ID NO. 8;
b. Protease, die eine gegenüber SEQ ID NO. 2 oder SEQ ID NO. 3 oder SEQ ID NO. 4 oder SEQ ID NO. 5 oder SEQ ID NO. 6 oder SEQ ID NO. 7 oder SEQ ID NO. 8 in mindestens einer Position veränderte Aminosäuresequenz umfasst, wobei die Veränderung in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 1 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
i. Threonin an Position 3 (3T),
ii. Isoleucin an Position 4 (41),
iii. Alanin, Threonin oder Arginin an Position 61 (61A, 61 T oder 61 R),
iv. Asparaginsäure oder Glutaminsäure an Position 154 (154D oder 154E), v. Prolin an Position 188 (188P),
vi. Methionin an Position 193 (193M),
vii. Isoleucin an Position 199 (1991),
viii. Asparaginsäure, Glutaminsäure oder Glycin an Position 21 1 (21 1 D, 21 1 E oder 21 1 G),
ix. Kombinationen der Aminosäuren (i) bis (viii);
zur Bereitstellung einer proteolytischen Aktivität in einem flüssigen Wasch- oder
Reinigungsmittel, welches eine Cellulase umfasst.
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