WO2012077786A1 - 病害抵抗性植物及びその作出方法 - Google Patents

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雄司 中野
英雄 仲下
忠男 浅見
美智子 安田
あゆみ 山上
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    • C12N15/8298—Brassinosteroids

Definitions

  • the first embodiment of the present invention relates to a method for producing a disease-resistant plant.
  • the production method of the present invention includes a nucleic acid expression system introduction step. That is, the disease-resistant plant production method of the present embodiment is a method of producing a disease-resistant transgenic plant. Disease production can be imparted to plants by the production method of the present invention. Therefore, the method of the present invention is also a method for imparting disease resistance to plants.
  • BIL5 includes not only Arabidopsis thaliana-derived BIL5 (hereinafter referred to as “Arabidopsis thaliana BIL5”) but also other species of Arabidopsis thaliana BIL5 ortholog.
  • the Arabidopsis thaliana BIL5 ortholog has 40% or more identity with the amino acid sequence of Arabidopsis thaliana BIL5 and has the same activity to enhance plant disease resistance.
  • grape BIL5 NCBI Gene-ID No.100243035
  • castor bean Ricinus communis (castor bean)
  • BIL5 NCBI Gene-ID No.8288150
  • black cottonwood Populus trichocarpa
  • the target plant cell is infected with a viral expression vector incorporating a plant disease resistant nucleic acid or the like.
  • a viral expression vector incorporating a plant disease resistant nucleic acid or the like.
  • a transformed cell can be obtained.
  • Hohn et al. Molecular Biology of Plant Tumors (Academic Press, New York) 1982, pp549), U.S. Pat. No. 4,407,956, etc. Good.
  • a nucleic acid expression system including the Arabidopsis thaliana BIL5 gene may be introduced into cells of Nicotiana tabacum. This is because the BR signaling pathway is widely present in plants, and the conservation of individual signaling factors is high across species, so even if different types of nucleic acid expression systems are introduced, they are inserted into the nucleic acid expression system. This is because an ortholog such as a plant disease-resistant nucleic acid that has been introduced can exhibit the same function as that of the introduced plant species when introduced into the same plant species.

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Abstract

　ブラシノステロイドによる病原抵抗性の誘導に関与する新規遺伝子を同定し、それらを目的の植物細胞体に導入することにより病害抵抗性を増強した病害抵抗性植物を作出することを目的とする。　病原抵抗性のブラシノステロイド変異株を単離し、その原因遺伝子の解析に基づいて得られた４つの遺伝子を目的とする植物細胞内に導入したトランスジェニック植物を作成する。

Description

病害抵抗性植物及びその作出方法
　本発明は、病害抵抗性植物及びその作出方法に関する。
　植物において、微生物の感染は不可避であり、植物体は、通常、その感染によって深刻なストレスを引き起こす。このような微生物の感染、特に病原体の感染に対して、植物は、形態的適応に加えて、独自の保護防衛システムを発達させてきた。すなわち、植物は、病原体の感染に対する最初の応答として、その病原体を特異的に認識し、感染した細胞の迅速な細胞死（過敏感細胞死）を誘導して感染細胞ごと排除する（非特許文献１）。続く応答として、植物は、病原体のさらなる攻撃から植物体を保護するために、過敏感細胞死を引き金として全身獲得抵抗性（systemic acquired resistance; SAR）と呼ばれる病原抵抗性を誘導する（非特許文献２、３）。SARは、多くの植物で確認されており、様々な植物病原体に対する抵抗性を植物の未感染部分に付与する（非特許文献４、５）。このSARを誘導するシグナル伝達因子の一つとして、サリチル酸がシロイヌナズナやタバコ等の双子葉植物で同定されている（非特許文献６、７）。SARを誘導する他のシグナル伝達因子を同定し、植物細胞内シグナルを制御することができれば、過敏感細胞死を介すことなく植物体に病害抵抗性を付与することができる。しかし、このサリチル酸を介したSAR誘導のシグナル伝達機構については、未だに未解明な点が多く、その全貌は明らかにされていない。
Ross A.F. (1961) Virology, 14:340-358 Kuc J. (1982) Bioscience, 32:854-860 McIntyre J.L. et al., (1981) Phytopathology, 71:297-301 Chester KS., (1933) Q. Rev. Biol., 8:275-324 Durner J. et al., (1997) Trends in Plant Sci., 2:266-274 Delaney TP. et al., (1994) Science, 266:1247-1250 Gaffney T. et al., (1993) Science, 261:754-756
　本発明者らは、上記のサリチル酸を介した誘導型病害抵抗性とは異なる、ブラシノステロイド処理による病害抵抗性（Brassinosteroid-mediated disease resistance; 以下「BDR」とする）の誘導を新たに見出した（Nakashita H. et al, 2003, The Plant Jour., 33:887-898）。ブラシノステロイド（以下、「BR」とする）は、植物の成長調節、光形態形成、維管束形成制御、葉緑体機能調節等に関与する植物ホルモンである（Azpiroz R. et al., 1988, Plant Cell, 10:219-230; Clouse S. & Sasse J., 1998, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.,49: 427-45; Mandava N., 1988, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 39:23-52; Sakurai A. et al., 1999, Brassinosteroids, Steroidal Plant Hormones, Tokyo: Springer）。BRが病害抵抗性誘導に関与するという知見は、それまで知られておらず、新規の植物病害抵抗性増強剤候補として注目されたが、高価なBRを常時植物体に付与し続けるという方法は、農業現場での実施には現実的ではないという問題があった。一方、BR処理によるBDR誘導から、BRによって活性化された細胞内シグナル伝達経路（以下、「BR細胞内シグナル伝達経路」とする）が病害抵抗性を誘導し得ることが予測された。しかし、BR細胞内シグナル経路は未解明な点が多く、同経路で機能するシグナル伝達因子（以下、「BR細胞内シグナル伝達因子」とする）の同定も不十分であった。さらに、BR細胞内シグナル伝達分子として既に同定されていた転写因子であるBIL1は、病害抵抗性を誘導できないことも明らかとなった。それ故、BR細胞内シグナル伝達経路とBDR誘導とは必ずしも関連しないことが示唆された。
　本発明は、BDR誘導に関与する新規遺伝子を同定し、それらを目的の植物細胞体に導入することにより病害抵抗性を増強した病害抵抗性植物を作出することを目的とする。
　上記課題を解決するため、本発明者らは、BR細胞内シグナル伝達経路が途中で分岐し、その一部がBDR誘導を制御しているのではないかと予測した。そこで、当該仮説に基づいて同シグナル伝達経路に関与することが予測されるシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の変異株について、病害抵抗性について検証したところ、トマトの日和見感染菌Pseudomonas syringae 3000に感染抵抗性を示す変異株bil5-1D及びbil4-1Dを単離することに成功した。これらの変異株を解析した結果、当該形質は、BIL5遺伝子又はBIL4遺伝子に機能獲得型変異が生じた結果であることが明らかになった。BIL5遺伝子産物（BIL5）及びBIL4遺伝子産物（BIL4）（本明細書では、以降、例えば、単に「BIL5」のように記載した時には、原則として「BIL5タンパク質」を意味するものとする。一方、BIL5をコードする遺伝子については、「BIL5遺伝子」のように「遺伝子」を付けて表すものとする。）が植物病害耐性に関与することは、新規の知見である。さらに、この結果から、野生型BIL5遺伝子又は野生型BIL4遺伝子をそれぞれシロイヌナズナの野生株に導入し過剰発現させたところ、その植物体に植物病害抵抗性を誘導できることを見出した。また、BIL5遺伝子のパラログと予想される新規のBNX1遺伝子、及びBIL6遺伝子も植物細胞内で過剰発現することで、同様の効果を得られることを見出した。本発明は、当該新規知見に基づくものであって、以下を提供する。
（１）以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかのポリペプチド又は植物病害抵抗性を増強する活性を有するその断片をコードする核酸を発現可能な状態で包含する核酸発現システムを、目的とする植物に少なくとも一つ導入する工程を含む、病害抵抗性植物の作出方法。
　　（ａ）配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
　　（ｂ）配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物病害抵抗性を増強する活性を有するポリペプチド、及び
　　（ｃ）配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列に対して40％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ植物病害抵抗性を増強する活性を有するポリペプチド
（２）核酸が配列番号３若しくは４で示される塩基配列からなる核酸、又は配列番号３若しくは４で示される塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物病害抵抗性を増強する活性を有するポリペプチドをコードする核酸である、（１）に記載の作出方法。
（３）以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかのポリペプチド又は植物病害抵抗性を増強する活性を有するその断片をコードする核酸を発現可能な状態で包含する核酸発現システムを、目的とする植物に少なくとも一つ導入する工程を含む、病害抵抗性植物の作出方法。
　（ａ）配列番号１１又は１２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
　（ｂ）配列番号１１又は１２で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物病害抵抗性を増強する活性を有するポリペプチド、及び
　（ｃ）配列番号１１又は１２で示されるアミノ酸配列に対して40％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ植物病害抵抗性を増強する活性を有するポリペプチド
（４）核酸が配列番号１３若しくは１４で示される塩基配列からなる核酸、又は配列番号１３若しくは１４で示される塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物病害抵抗性を増強する活性を有するポリペプチドをコードする核酸である、（３）に記載の作出方法。
（５）前記核酸発現システムが、包含する前記核酸を過剰発現する、（１）～（４）のいずれかに記載の作出方法。
（６）前記核酸発現システムが、包含する前記核酸を構成的に発現する、（５）に記載の作出方法。
（７）前記核酸発現システムが、包含する前記核酸を誘導性に発現する、（５）に記載の作出方法。
（８）前記核酸発現システムが発現ベクターである、（１）～（７）のいずれかに記載の作出方法。
（９）（１）～（８）のいずれかに記載の作出方法で得られた病害抵抗性植物又はその後代。
（１０）以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかのポリペプチド又は植物病害抵抗性を増強する活性を有するその断片をコードする核酸を発現可能な状態で包含する外因性の核酸発現システムを少なくとも一つ含む病害抵抗性植物。
　　（ａ）配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
　　（ｂ）配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物病害抵抗性を増強する活性を有するポリペプチド、及び
　　（ｃ）配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列に対して40％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ植物病害抵抗性を増強する活性を有するポリペプチド
（１１）以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかのポリペプチド又は植物病害抵抗性を増強する活性を有するその断片をコードする核酸を発現可能な状態で包含する外因性の核酸発現システムを少なくとも一つ含む病害抵抗性植物。
　　（ａ）配列番号１１又は１２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
　　（ｂ）配列番号１１又は１２で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物病害抵抗性を増強する活性を有するポリペプチド、及び
　　（ｃ）配列番号１１又は１２で示されるアミノ酸配列に対して40％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ植物病害抵抗性を増強する活性を有するポリペプチド
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2010-275925号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
　本発明の病害抵抗性植物の作出方法によれば、所望の植物に対する病害抵抗性の付与又は増強が可能となる。
　本発明の病害抵抗性植物の後代によれば、世代を超えて病害抵抗性を獲得した植物を提供することができる。
シロイヌナズナの機能獲得型変異株bil5-１Dにおける病原抵抗性マーカーPR1遺伝子の発現誘導を示す図である。それぞれの株での、BR無添加時（－）と添加時（＋）におけるPR1遺伝子の発現レベルを示す。 野生型BIL5遺伝子と野生型BNX1遺伝子の二重過剰発現株（BIL5-OX1×BNX1-OX1株）におけるPR1遺伝子の発現誘導を示す図である。 bil5-１D株等におけるタバコ病原菌（Pseudomonas syringae pv. tabasi：Pst)に対する病原抵抗性の獲得を示す図である。 bil5-１D株等における遊離サリチル酸量を示す図である。 BIL5-OX1×BNX1-OX1株等における病原抵抗性獲得を示す図である。Pstは、タバコ病原菌を示す。 BIL5-OX1×BNX1-OX1株等における遊離サリチル酸量を示す図である。 野生型BIL4遺伝子の過剰発現株（BIL4－OX1）におけるPR1遺伝子(A)又はPR5遺伝子（B）の発現誘導を示す図である。 野生型BIL6遺伝子の過剰発現株2株（BIL6－OX1及びBIL6－OX2）におけるPR1遺伝子(A)又はPR5遺伝子（B）の発現誘導を示す図である。
１．病害抵抗性植物の作出方法
　本発明の第１の実施形態は、病害抵抗性植物の作出方法に関する。本発明の作出方法は、核酸発現システム導入工程を含むことを特徴とする。すなわち、本実施形態の病害抵抗性植物の作出方法とは、病害抵抗性を有するトランスジェニック植物を作出する方法である。本発明の作出方法によって、植物に病害抵抗性を付与することができる。したがって、本発明の方法は、植物に病害抵抗性を付与する方法でもある。
　本明細書において「トランスジェニック植物」とは、前記核酸発現システムの導入によって病害抵抗性を獲得した形質転換植物をいう。
＜核酸発現システム導入工程＞
　「核酸発現システム導入工程」とは、本発明者らによって見出された４つの植物病害抵抗性ポリペプチドのいずれか若しくは植物病害抵抗性を増強する活性を有するその変異ポリペプチド、又は該活性を有するそれらの断片をコードする核酸を発現可能な状態で包含する核酸発現システムを、目的とする植物細胞に少なくとも一つ導入する工程である。この工程によって、所望の植物細胞が形質転換される。以下、本工程について詳細に説明をする。
（１）構成
　本発明において「病害」又は「植物病害」とは、病原体によって引き起こされる植物の病気をいう。ここでいう「病原体」とは、ウイロイド、ウイルス、ファイトプラズマ、バクテリア、真菌（酵母、糸状菌、担子菌を含む）、粘菌、原生動物又は線虫のような植物に対して感染性を有し、その感染によって植物に何らかの病的症状をもたらすものをいう。本発明においては、特にウイロイド、ウイルス、ファイトプラズマ、バクテリアが好適に該当する。また、本発明において、「植物」とは、コケ類、シダ類、被子植物及び裸子植物が該当する。被子植物は、双子葉類又は単子葉類植物のいずれも包含する。
　「病害抵抗性」とは、前記病原体の感染又はそれによる病的症状の発症を防止又は抑制する作用をいう。この作用は、植物の自然免疫システムによって制御されている。したがって、「病害抵抗性植物」とは、病害抵抗性が増強された植物であり、これは同時に自然免疫系が強化された植物を意味する。また、ここでいう「病害抵抗性植物」は、植物体に限られず、病害抵抗性を有する植物の細胞、組織及び器官（胚、分裂組織、種子、シュート、根、茎、葉及び花）のいずれも包含する。
　「４つの植物病害抵抗性ポリペプチド」（本明細書において「４つのタンパク質」、「４つのポリペプチド」、「４つの野生型ポリペプチド」ともいう）とは、すなわち、野生型のBIL5、BNX1、BIL4及びBIL6である。「野生型」とは、そのタンパク質本来の機能を有し、自然界に存在する対立遺伝子群において、通常、最も多く存在する対立遺伝子にコードされたタンパク質をいう。前記４つのタンパク質は、いずれも本発明者らの研究結果から病害抵抗性に機能することが初めて明らかとなったものである。以下、それぞれのタンパク質について説明をする。
　「BIL5（Brz-Insentive-Long hypocoty 5）」は、BIL5遺伝子がコードするタンパク質である。BIL5遺伝子は、BRの生合成におけるP450酸化酵素DWF4を特異的に阻害するBR生合成阻害剤ブラシナゾール（Brassinazole:以下、Brzとする。）に対して、耐性を有するシロイヌナズナの変異株bil5の原因遺伝子として同定された。本発明者らの研究の結果、BIL5は、TIR（Toll/IL-1 receptor）－NBS（Nucleotide Binding Site）－LRRの各ドメインを有し、BRシグナル伝達経路において、BRI1の下流で植物の発生及び病害抵抗性を正に制御する細胞内シグナル伝達因子であることが示唆されている。シロイヌナズナ由来の野生型BIL5の具体的なアミノ酸配列は、配列番号１（NCBIアクセッションNo.NM_105051）で示される。
　本発明においてBIL5は、前記シロイヌナズナ由来のBIL5（以下、「シロイヌナズナBIL5」という）のみならず、他の生物種のシロイヌナズナBIL5オルソログを包含する。シロイヌナズナBIL5オルソログは、シロイヌナズナBIL5のアミノ酸配列と40％以上の同一性を有し、かつ同様の植物病害抵抗性を増強する活性を有する。具体的には、例えば、ブドウのBIL5（NCBI Gene-ID No.100243035）、トウゴマ（Ricinus communis (castor bean))のBIL5（NCBI Gene-ID No.8288150）、ブラックコットンウッド（Populus trichocarpa）のBIL5（NCBI Gene-ID No. 7463263）、ダイコン（Raphanus sativus）のBIL5（NCBIアクセッションNo. CAZ40338）、アブラナ（Brassica rapa）のBIL5（NCBIアクセッションNo. ACP30636）、トマトのBIL5（NCBIアクセッションNo.BABP01013461）、及びダイズのBIL5（NCBI Gene-ID No. GU967682）が挙げられる。
　「BNX1（Bil5-NeXt1）」は、シロイヌナズナのゲノム上で、BIL5遺伝子の遺伝子座に隣接して存在するBNX1遺伝子がコードするタンパク質として同定された。BNX1は、BIL5とアミノ酸レベルで70％の同一性を有しており、BIL5のパラログの可能性が示唆されている。シロイヌナズナ由来の野生型BNX1の具体的なアミノ酸配列は、配列番号２（NCBIアクセッションNo. NM_105052）で示される。
　本発明においてBNX1は、前記シロイヌナズナ由来のBNX1（以下、「シロイヌナズナBNX1」という）のみならず、他の生物種のシロイヌナズナBNX1オルソログを包含する。シロイヌナズナBNX1オルソログは、シロイヌナズナBNX1のアミノ酸配列と40％以上の同一性を有し、かつ同様の植物病害抵抗性を増強する活性を有する。具体的には、例えば、イネのBNX1（NCBI Gene-ID.4326532）、オオムギのBNX1（NCBI Gene-ID 606485）、ブドウのBNX1 (wine grape)（NCBI Gene-ID No. 100260274）、トウゴマのBNX1（NCBI Gene-ID No. 8282489）、ブラックコットンウッドのBNX1（NCBI Gene-ID No. 7463263）、ダイコンのBNX1（NCBIアクセッションNo.CAZ40338）、アブラナのBNX1（NCBIアクセッションNo. ACP30636）、（NCBIアクセッションNo.5939404）及び、トマトのBNX1（NCBIアクセッションNo.AAP44392）が挙げられる。
　「BIL4（Brz-Insentive-Long hypocoty 4）」は、BIL4遺伝子がコードするタンパク質である。BIL4遺伝子は、bil5変異株と同様のBrz耐性と細矮性（slender dwarf）様の形質を有するシロイヌナズナの半優性変異株bil4-1Dの原因遺伝子として同定された。本発明者らの研究の結果、BIL4は、7回膜貫通ドメインを有する新規タンパク質であり、BRI1と共局在し、BRシグナル伝達経路においてBRI1の下流で、植物の発生及び病害抵抗性を正に制御する細胞内シグナル伝達因子であることが示唆されている。シロイヌナズナ由来の野生型BIL4は、239アミノ酸からなり、その具体的なアミノ酸配列配列番号１１（NCBIアクセッションNo. NP_191890.1）で示される。
　本発明においてBIL4は、前記シロイヌナズナ由来のBIL4（以下、「シロイヌナズナBIL4」という）のみならず、他の生物種のシロイヌナズナBIL4オルソログを包含する。シロイヌナズナBIL4オルソログは、シロイヌナズナBIL4のアミノ酸配列と40％以上の同一性を有し、かつ同様の植物病害抵抗性を増強する活性を有する。具体的には、例えば、イネ（Oryza sativa）のBIL4（NCBI Gene-ID No. NP_001051246.2；No. NP_001051551.1; No. NP_001059026.1）、マメ科タルウマゴヤシ（Medicago truncatula）のBIL4（NCBIアクセッションNo. XP_003590585.1）が挙げられる。
　「BIL6（Brz-Insentive-Long hypocoty 6）」は、BIL6遺伝子がコードするタンパク質である。BIL6遺伝子は、その高発現株がbil5変異株やbil4変異株と同様のBrz耐性を示す遺伝子として同定された。BIL6は、タンパク質キナーゼファミリーに属する哺乳類自然免疫系シグナル伝達因子であり、セリン・スレオニンキナーゼのIRAKとキナーゼドメインにおける相同性が比較的高く、BIL6高発現形質転換体では病原抵抗性マーカーであるPR1遺伝子及びPR5遺伝子の発現が活性化されたことから、BRシグナル伝達経路においてBRI1の下流で植物病害抵抗性を正に制御する因子であることが示唆されている。シロイヌナズナ由来の野生型BIL6の具体的なアミノ酸配列は、456アミノ酸からなり、配列番号１２（NCBIアクセッションNo.NP_191271）で示される。
　本発明においてBIL6は、前記シロイヌナズナ由来のBIL6（以下、「シロイヌナズナBIL6」という）のみならず、他の生物種のシロイヌナズナBIL6オルソログを包含する。シロイヌナズナBIL6オルソログは、シロイヌナズナBIL6のアミノ酸配列と40％以上の同一性を有し、かつ同様の植物病害抵抗性を増強する活性を有する。具体的には、例えば、イネ（Oryza sativa）のBIL6（NCBI Gene-ID No. NP_001048538.2）、マメ科タルウマゴヤシ（Medicago truncatula）のBIL6（NCBIアクセッションNo. XP_003591872.1; No. AES85204.1）が挙げられる。
　「植物病害抵抗性を増強する活性を有するその変異ポリペプチド」とは、前記野生型BIL5、BNX1、BIL4及びBIL6に変異が生じた変異型BIL5、BNX1、BIL4及びBIL6をいう。これらの変異型タンパク質は、いずれもそれぞれの野生型タンパク質と同等以上の植物病害抵抗性増強活性を有する。変異ポリペプチドは、具体的には、前記各種野生型ポリペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるものをいう。また、前記各種野生型ポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が翻訳後メチル化される等の修飾を受けたものも本発明の変異ポリペプチドに包含される。ここで、「数個」とは、２～２０個、２～１５個、２～１０個、例えば、２～７個、２～５個、２～４個又は２～３個のアミノ酸をいう。
　「該活性を保持するその断片」とは、前記４つの野生型ポリペプチド、すなわち、BIL5、BNX1、BIL4若しくはBIL6、又は植物病害抵抗性を増強する活性を有するその変異ポリペプチドのポリペプチド断片であって、それぞれの親ポリペプチドが有する植物病害抵抗性を増強する活性と同等以上の活性を保持しているものをいう。このようなポリペプチド断片のアミノ酸の長さや全長ポリペプチドにおける領域は、その全長ポリペプチドの機能や構造等によって異なる。それ故、それぞれのタンパク質に応じて適宜定めればよい。通常は、その全長タンパク質中の機能ドメインを破壊しない状態で包含するポリペプチド断片が好適に用いられる。ここでいう機能ドメインとは、そのタンパク質に特有の機能を担い、又はその機能を発揮する上で不可欠な領域をいう。例えば、全長タンパク質が転写制御因子であれば、核酸結合ドメイン等が該当し、また細胞内シグナル因子として機能するキナーゼであれば、キナーゼドメイン等が該当する。
　前記「コードする核酸」とは、前述の４つのポリペプチド、すなわち、BIL5、BNX1、BIL4若しくはBIL6、又は植物病害抵抗性を増強する活性を有するその変異ポリペプチド、あるいは該活性を有するその断片をそれぞれコードする核酸をいう。例えば、シロイヌナズナの配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるBIL5をコードする核酸としては配列番号３で示される塩基配列からなる核酸が、シロイヌナズナの配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるBNX1をコードする核酸としては配列番号４で示される塩基配列からなる核酸が、シロイヌナズナの配列番号１１で示されるアミノ酸配列からなるBIL4をコードする核酸としては配列番号１３で示される塩基配列からなる核酸が、シロイヌナズナの配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるBIL6をコードする核酸としては配列番号１４示される塩基配列からなる核酸が挙げられる。
　本発明において、「核酸」とは、主としてDNA及び／又はRNAのような天然型核酸をいうが、人工的に化学修飾又は構築された核酸又は核酸類似体を含むこともできる。また、核酸は、必要に応じて、リン酸基、糖及び／又は塩基が核酸用標識物質で標識されていてもよい。
　「野生型遺伝子」とは、前述の野生型タンパク質、すなわち本来の機能を有するタンパク質をコードし、同種の対立遺伝子群において、通常、自然界に最も多く存在する塩基配列を有する遺伝子である。
　「変異ポリペプチドをコードする核酸」とは、前述のBIL5、BNX1、BIL4又はBIL6の変異ポリペプチドをコードする核酸をいう。この変異ポリペプチドをコードする核酸には、例えば、それぞれの野生型遺伝子の塩基配列において１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換又は付加されたもの、前記塩基配列と40％以上、50％以上又は60％以上、好ましくは、70％、75%、80％又は85％、より好ましくは90％以上、95％以上、98％以上、又は99％以上の同一性を有するもの、又は野生型遺伝子の部分塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、それがコードするポリペプチドが植物病害抵抗性を増強する活性を保持する核酸が含まれる。ここで前記「同一性」とは、２つの塩基配列にギャップを導入して又は導入しないでアラインメントさせたときに、一方の塩基配列の全塩基数に対する他方の塩基配列の同一塩基数の割合（％）をいう。「数個のヌクレオチド」とは、２～６０個、２～４５個、２～３０個、２～１４個、２～１０個、例えば、２～８個、２～６個、２～５個、２～４個又は２～３個のヌクレオチドをいう。また、「ストリンジェントな条件」とは、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味する。通常は低ストリンジェント～高ストリンジェントな条件が挙げられるが、高ストリンジェントな条件が好ましい。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば42℃、5×SSC、0.1% SDSで洗浄する条件であり、好ましくは50℃、5×SSC及び0.1% SDSで洗浄する条件である。高ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば65℃、0.1×SSC及び0.1% SDSで洗浄する条件である。ハイブリダイゼーション条件は、例えば、Sambrook, J. et. al., (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual Second Ed., Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkにも記載されている。このような変異ポリペプチドをコードする核酸の具体例としては、SNP（一塩基多型）等の多型に基づく変異体、スプライス変異体、遺伝暗号の縮重に基づく変異体等が挙げられる。
　「その断片をコードする核酸」とは、前記BIL5、BNX1、BIL4若しくはBIL6、又は植物病害抵抗性を増強する活性を有するその変異ポリペプチドの断片であって、植物病害抵抗性を増強する活性を保持している断片をコードする核酸をいう。
　「核酸発現システム」とは、そのシステムに内包された核酸（主として、遺伝子又はその断片）を発現することのできる一つの発現系単位をいう。核酸発現システムは、前記核酸領域の他に、遺伝子発現に必須の発現調節領域を有する。必須の発現調節領域には、例えば、プロモーター及びターミネーターが含まれる。この他にも、エンハンサ、ポリA付加シグナル、5'-UTR（非翻訳領域）配列、標識若しくは選抜マーカー遺伝子、マルチクローニング部位、複製開始点等を含むこともできる。核酸発現システムには、特定の遺伝子等を発現させる上で必要な一つの発現系単位をゲノム上からそっくり取り出したものの他、様々な生物由来の発現調節領域等を組合せる等して人工的に構築したものが存在するが、本発明ではいずれの核酸発現システムも利用できる。
　本明細書において「核酸発現システム」は、目的とする植物に野生型BIL5、BNX1、BIL4若しくはBIL6、又は植物病害抵抗性を増強する活性を有するその変異ポリペプチド、あるいは該活性を有するそれらのポリペプチド断片（以下、「植物病害抵抗性ポリペプチド等」という）を提供し、その植物の病害抵抗性を増強する機能を有する。
　しかしながら、一般の植物も、通常、内因性の野生型BIL5遺伝子、野生型BNX1遺伝子、野生型BIL4遺伝子又は野生型BIL6遺伝子を有しており、それらの遺伝子の発現に起因する生来の病害抵抗性を有している。それ故、本発明の方法で作出される病害抵抗性植物が、通常の同種植物と比較して、より増強された病害抵抗性を有するようにするためには、前記核酸発現システムが目的とする植物におけるBIL5、BNX1、BIL4又はBIL6の発現レベルを通常以上に増加させる機能を有する必要がある。
　したがって、本発明で目的の植物に導入する核酸発現システムは、例えば、包含する植物病害抵抗性ポリペプチド等をコードする核酸（以下、「植物病害抵抗性核酸等」という）を過剰発現する、及び／又は包含する植物病害抵抗性核酸等を構成的に発現する若しくは包含する植物病害抵抗性核酸等を誘導性に発現することのできる性質を有することが望ましい。さらに、この外因性の核酸発現システム自身が植物細胞内で複数のコピー（多コピー）を維持できる性質を有するものであってもよい。
　本発明の方法で使用する植物病害抵抗性核酸等を過剰発現することのできる核酸発現システムは、一の核酸発現システムあたりで、その植物病害抵抗性核酸等の通常の発現量の２倍以上、好ましくは５倍以上、より好ましくは１０倍以上又は２０倍以上を発現する。このような核酸発現システムは、細胞あたりの植物病害抵抗性ポリペプチド等の絶対量を増加させることで、その植物に対して通常の抵抗性を上回る病害抵抗性を付与することができるため有効である。
　本発明の方法で使用する植物病害抵抗性核酸等を構成的に発現することのできる核酸発現システムは、時期や発現部位を問わず、植物病害抵抗性核酸等を常時発現し続けることができる。それ故、本性質を有する核酸発現システムは、内因性のBIL5遺伝子、BNX1遺伝子、BIL4遺伝子又はBIL6遺伝子の発現量が時期的制御や位置的制御を受けている場合には、その制御から独立して植物病害抵抗性ポリペプチド等を提供できるので非常に有効である。
　本発明の方法で使用する植物病害抵抗性核酸等の発現を誘導することのできる核酸発現システムは、時期特異的又は部位特異的に、包含する植物病害抵抗性核酸等を発現することができる。したがって、本性質を有する核酸発現システムは、内因性のBIL5遺伝子、BNX1遺伝子、BIL4遺伝子又はBIL6遺伝子が時期的及び／又は部位特異的な発現制御を受けている場合には、その制御から独立して、他の時期や部位で植物病害抵抗性核酸等を発現させて植物病害抵抗性ポリペプチド等を提供できるので非常に有効である。
　本発明の方法で使用する多コピー核酸発現システムは、個々の核酸発現システムからの植物病害抵抗性核酸等の発現量が低い場合であっても、核酸発現システム自体の数を増やすことで、全体として一細胞あたりの発現量を増加することができる利点がある。本発明においては、多コピー核酸発現システムを前述の過剰発現系の核酸発現システム、構成的発現系の核酸発現システム又は誘導型発現系の核酸発現システムと組合せて用いることで、病原抵抗性をより効果的に植物に付与することができる。
　上記の性質を有する外因性の核酸発現システムの構成は、発現に必須の構成要素を有し、植物病害抵抗性核酸等を発現可能な状態で包含しているものであれば、特に限定はしない。ここで「発現可能な状態で包含」とは、植物病害抵抗性核酸等が発現可能なように核酸発現システム内に挿入されていることを意味する。具体的には、核酸発現システム内のプロモーターとターミネーターの制御下に配置されていること、すなわち、それらに作動可能に連結されていることをいう。このような構成を有する核酸発現システムの具体例としては、発現ベクターが挙げられる。
　本発明において「発現ベクター」とは、内包する植物病害抵抗性核酸等を目的とする植物細胞内に運搬して発現させることのできる核酸発現システムである。具体的には、例えば、プラスミド又はウイルスを利用した発現ベクターが挙げられる。
　プラスミドを利用した発現ベクター（以下、「プラスミド発現ベクター」という）の場合、プラスミド部分は、例えば、pPZP系、pSMA系、pUC系、pBR系、pBluescript系（stratagene社）、pTriEXTM系（TaKaRa社）、又はpBI系、pRI系若しくはpGW系のバイナリーベクター等を利用することができる。
　ウイルスを利用した発現ベクター（以下、「ウイルス発現ベクター」という）の場合、ウイルス部分は、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）、インゲンマメゴールデンモザイクウイルス（BGMV）、タバコモザイクウイルス（TMV）等を利用することができる。
　前記発現ベクターは、前述のようにプロモーター及びターミネーターの発現調節領域が含まれる。この他にも、エンハンサ、ポリA付加シグナル、5'-UTR（非翻訳領域）配列、標識若しくは選抜マーカー遺伝子、マルチクローニング部位、複製開始点等を含むこともできる。それぞれの種類は、植物細胞内でその機能を発揮し得るものであれば、特に限定されない。導入する植物に応じて又は植物内での目的（例えば、発現パターン）に応じて当該分野で公知のものを適宜選択すればよい。
　プロモーターは、例えば、所望の発現パターンに応じて、過剰発現型プロモーター、構成的プロモーター、部位特異的プロモーター、段階特異的プロモーター、及び／又は誘導性プロモーターを用いることができる。過剰発現型で構成的プロモーターの具体例としては、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）由来の35Sプロモーター、Tiプラスミド由来のノパリン合成酵素遺伝子のプロモーターPnos、トウモロコシ由来のユビキチンプロモーター、イネ由来のアクチンプロモーター、タバコ由来PRタンパク質プロモーター等が挙げられる。様々な植物種のリブロース二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（Rubisco ssu）プロモーター、又はヒストンプロモーターも使用することができる。また、部位特異的プロモーターの具体例としては、特開2007－77677号に記載の根特異的プロモーターが挙げられる。
　ターミネーターは、例えば、ノパリン合成酵素（NOS）遺伝子のターミネーター、オクトピン合成酵素（OCS）遺伝子のターミネーター、CaMV 35Sターミネーター、大腸菌リポポリプロテインlppの3’ターミネーター、trpオペロンターミネーター、amyBターミネーター、ADH1遺伝子のターミネーター等が挙げられる。前記プロモーターにより転写された遺伝子の転写を終結できる配列であれば特に限定はしない。
　エンハンサであれば、例えば、CaMV 35Sプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサ領域が挙げられる。植物病害抵抗性核酸等の発現効率を増強できるものであれば特に限定はされない。
　標識若しくは選抜マーカー遺伝子は、例えば、薬剤耐性遺伝子（例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、又はネオマイシン耐性遺伝子）、蛍光又は発光レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニターゼ（GUS）、又はグリーンフルオレッセンスプロテイン（GFP））、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII（NPT II）、ジヒドロ葉酸還元酵素、ブラストサイジンS耐性遺伝子等の酵素遺伝子が挙げられる。標識若しくは選抜マーカー遺伝子は、植物病害抵抗性核酸等を包含する発現ベクターと同一の発現ベクターに連結させたものの他、別の発現ベクターに連結したものであってもよい。後者の場合には、それぞれの発現ベクターを目的の植物に共導入することで、同一発現ベクターに連結させたものと同等の効果を得ることができる。
（２）核酸発現システムの調製
　本発明の方法において、目的の植物に導入する核酸発現システムの調製は、当該分野で公知の方法、例えば、Sambrook, J. et. al., (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual Second Ed., Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkに記載の方法に従って行えばよい。
　以下でプラスミド発現ベクター又はウイルス発現ベクターを調製する場合の具体例を挙げて説明をするが、核酸発現システムの調製は、これに制限されるものではない。
（２－１）プラスミド発現ベクターの調製
　まず、前記植物病害抵抗性核酸等のうち所望の核酸をクローニングする。例えば、シロイヌナズナBIL5遺伝子をクローニングする場合、配列番号３で示される塩基配列から適当な領域を選択し、その塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを化学合成する。化学合成は、ライフサイエンスメーカーの受託合成サービスを利用すればよい。
　次に、そのオリゴヌクレオチドをプローブとしてシロイヌナズナのcDNAライブラリーからBIL5遺伝子を当該分野で公知の方法に基づいて単離する。詳細な単離方法については、上記Sambrook, J. et. al., (1989)を参照すればよい。また、シロイヌナズナのcDNAライブラリーは、Stratagene社のようなライフサイエンスメーカー各社から市販されているので、それを利用することもできる。あるいは、配列番号３で示される塩基配列に基づいてプライマーペアとなるオリゴヌクレオチドを化学合成して、そのプライマーペアを用いて、シロイヌナズナのゲノムDNA又はcDNAライブラリーから、PCR法等の核酸増幅法により目的とするBIL5遺伝子を増幅してもよい。核酸増幅を行なう場合には、pfuポリメラーゼのような3’－5’エキソヌクレアーゼ活性を有するフィデリティー（正確性）の高いDNAポリメラーゼを使用することが好ましい。核酸増幅の詳細な条件等ついては、例えば、Innis M. et al （Ed.）， (1990） Academic Press, PCR Protocols： A Guide to Methods and Applicationsに記載の方法を参照すればよい。単離したBIL5遺伝子は、必要に応じて適当なプラスミドに挿入され、大腸菌等の宿主微生物内でクローニングされた後、全長塩基配列を公知技術に基づいて決定する。
　続いて、BIL5遺伝子を所望の核酸発現システムの骨格部分の所定の部位に組み込む。例えば、決定された塩基配列に基づいてBIL5遺伝子を適当な制限酵素で切断する。その一方で、核酸発現システムを対応する制限酵素部位で切断する。マルチクローニング部位を有する核酸発現システムであれば、それを利用すると便利である。続いて、両核酸の末端を、リガーゼ等を用いて連結し、BIL5遺伝子を核酸発現システムに挿入することによって、目的のBIL5遺伝子用核酸発現システムが完成する。これら一連の遺伝子操作技術は、当該分野で周知の技術である。詳細な方法については、上記Sambrook, J. et. al., (1989)等を参照すればよい。
（２－２）ウイルス発現ベクターの調製
　基本操作は、前記プラスミド発現ベクターの方法に準ずればよい。まず、植物ウイルスゲノムを当該分野で公知の方法により調製した後、それを適当なクローニングベクター（例えば、大腸菌由来のpBI系、pPZP系、pSMA系、pUC系、pBR系、pBluescript系）に挿入して組換え体を得る。次に、組換え体に含まれるウイルスゲノム内の所定の部位に植物病害抵抗性核酸等を挿入し、クローニングする。続いて、制限酵素によって前記組換え体から植物ウイルスゲノム領域を切り出せばよい。それによって、目的のウイルス発現ベクターが得ることができる。
（３）核酸発現システムの植物細胞導入方法 
　植物病害抵抗性核酸等を包含する核酸発現システムを植物細胞内に導入する方法、すなわち植物細胞の形質転換方法は、当該分野で公知の任意の適当な方法を用いればよい。好適な形質転換方法として、核酸発現システムがプラスミド発現ベクターの場合、プロトプラスト法、パーティクルガン法又はアグロバクテリウム（Agrobacterium）法等を用いることができる。
　プロトプラスト法は、セルラーゼ等の酵素的処理によって細胞壁を除去した植物細胞（プロトプラスト）を用いて、目的の遺伝子を植物細胞中に導入する方法である。この方法は、遺伝子導入の方法により、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法又はポリエチレングリコール法等に、さらに分類することができる。エレクトロポレーション法は、プロトプラストと目的遺伝子の混合液に電気パルスを与えてプロトプラスト内に遺伝子を導入する方法である。また、マイクロインジェクション法は、微針を用いて顕微鏡下でプロトプラスト中に目的の遺伝子を直接導入する方法である。そして、ポリエチレングリコール法は、ポリエチレングリコールを作用させてプロトプラストに目的の遺伝子を導入する方法である。
　パーティクルガン法は、金又はタングステン等の微粒子に目的の遺伝子を付着させて、それを高圧ガスにより植物組織細胞内に打ち込み、目的の遺伝子を細胞内に導入する方法である。宿主植物細胞のゲノムDNA中に目的の遺伝子が取り込まれた形質転換細胞を得ることができる。形質転換した細胞は、通常、核酸発現システム中のマーカー遺伝子産物に基づいて選択される。
　アグロバクテリウム法は、形質転換因子としてアグロバクテリウム属の菌（例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(A． tumefaciens)、アグロバクテリウム・リゾゲネス（A． rhizogenes）等）及びそれに由来するTiプラスミド、Riプラスミド等を用いる植物細胞の形質転換方法であって、目的の遺伝子を宿主植物細胞のゲノムDNA中に導入することができる。
　上記の方法は、いずれも当該分野においては公知の方法であり、詳細については植物代謝工学ハンドブック（2002年、NTS社）又は新版モデル植物の実験プロトコル：遺伝学的手法からゲノム解析まで（2001年秀潤社）等の適当なプロトコルを参照すればよい。
　また、核酸発現システムがウイルス発現ベクターの場合（例えば、前述のCaMV、BGMV、TMV等の場合）には、植物病害抵抗性核酸等を組み込んだウイルス発現ベクターを目的の植物細胞に感染させることによって、形質転換細胞を得ることができる。このようなウイルスベクターを用いた遺伝子導入方法の詳細については、Hohnらの方法（Molecular Biology of Plant Tumors（Academic Press、New York）1982、pp549）、米国特許第4,407,956号明細書等を参照すればよい。
　本発明において、植物病害抵抗性核酸等の由来する植物種と形質転換する植物細胞の植物種とを一致させる必要はない。例えば、アブラナ科のシロイヌナズナBIL5遺伝子を包含する核酸発現システムをナス科のタバコ（Nicotiana tabacum）の細胞に導入してもよい。これは、BRシグナル伝達経路が植物に広く存在すること、個々のシグナル伝達因子の保存性が種を超えて高いことから、異なる種類の核酸発現システムを導入しても、当該核酸発現システムに挿入された植物病害抵抗性核酸等のオルソログが、導入された植物種において同種の植物種に導入した場合と同様の機能を発揮し得るためである。
　本発明において、核酸発現システムを導入する植物は、少なくともBRシグナル伝達経路に関与する遺伝子群及びサリチル酸を介した自然免疫誘導シグナル伝達経路に関与する遺伝子群が野生型であることが好ましい。本発明の植物病害抵抗性能の増強は、これらの経路のシグナル増強に基づくものであり、シグナル伝達経路の上流に位置するポリペプチドの発現量を増大させてシグナルを増強した場合であっても、その下流の因子が機能欠損変異等を生じているとそれ以降のシグナルが伝達されず、病害抵抗性植物を得ることができないからである。
　本発明において、異なる植物病害抵抗性核酸等を包含する２つ以上の核酸発現システムを、互いに共存可能な範囲内において、一の植物細胞に導入することができる。例えば、イネBIL5遺伝子を包含する核酸発現システムとイネBNX1遺伝子を包含する核酸発現システム、又はイネBIL5遺伝子、イネBIL4遺伝子及びイネBIL6遺伝子をそれぞれ包含する核酸発現システムを一の植物細胞内（例えば、イネ細胞内）に導入してもよい。
　本工程後に、形質転換した植物細胞は、公知の方法に基づいてトランスジェニック植物に再生することができる。例えば、未分化増殖細胞から成るカルス形成を経て植物体に再生させるインビトロ再生方法が挙げられる。本方法は、当該分野では公知であり、上述の植物代謝工学ハンドブック（2002年、NTS社）又は新版モデル植物の実験プロトコル：遺伝学的手法からゲノム解析まで（2001年秀潤社）等を参照することができる。また、カルスや細胞培養のステップを経ることなく、目的の植物個体の細胞に直接、核酸発現システムを導入するin planta法を用いることもできる。形質転換細胞の増殖及び／又は分裂を促進するために、オーキシン、ジベレリン及び／又はサイトカイニンのような植物ホルモンを使用してもよい。
　上記方法によって得られたトランスジェニック植物第１世代が、病害抵抗性植物となる。本発明においては、このトランスジェニック植物第１世代には、それと同一の遺伝情報を有するクローン体も包含される。例えば、トランスジェニック植物第１世代から採取した植物体の一部を挿し木、接木若しくは取り木したもの、細胞培養した後、カルス形成を介して植物体に再生させたもの、又はトランスジェニック植物第１世代から無性生殖で得られる栄養繁殖器官（例えば、根茎、塊根、球茎、ランナー等）より新たに生じた新たな栄養体が該当する。
　この病害抵抗性植物に導入された核酸発現システムから植物病害抵抗性ポリペプチドが発現される。細胞あたりの発現量が、同種の野生型個体と比較してより高くなる結果、自然免疫系が増強され、病害抵抗性が向上される。
２．病害抵抗性植物の後代取得方法
　本発明の第２の実施形態は、病害抵抗性植物の後代取得方法である。本明細書において「病害抵抗性植物の後代」とは、前記第１実施形態の方法で得られたトランスジェニック植物第１世代の有性生殖を介した子孫であって、第１実施形態に記載の核酸発現システム保持したものをいう。例えば、トランスジェニック植物第１世代の実生が該当する。
　本発明の病害抵抗性植物から後代を得る方法は、公知の方法で取得することができる。例えば、トランスジェニック植物第１世代である病害抵抗性植物を結実させ、後代第１世代で、かつトランスジェニック植物第２世代の種子を得ればよい。本発明の後代第１世代から、さらに後代第２世代を得る方法の一例として、その種子を適当な培地上で発根させ、その発根体を、土を入れたポットに移植する。適当な栽培条件下で生育させることで後代第２世代を取得することができる。本実施形態の後代は、第１実施形態に記載の核酸発現システム保持する限りにおいてその世代を問わない。したがって、後代第３世代以降は、後代第２世代取得の方法と同様の方法を繰り返していけばよい。
３．病害抵抗性植物
　本発明の第３の実施形態は、病害抵抗性植物である。本発明の病害抵抗性植物は、前記第１実施形態の作出方法によって得られる病害抵抗性植物又は第２実施形態の取得方法によって得ら得る後代と、実質的に同一の構成を有する。
　すなわち、本実施形態の病害抵抗性植物は、４つの植物病害抵抗性ポリペプチド、すなわち野生型のBIL5、BNX1、BIL4及びBIL6のいずれか若しくは植物病害抵抗性を増強する活性を有するその変異ポリペプチド、又は該活性を有するその断片をコードする核酸を、発現可能な状態で包含する外因性の核酸発現システムを少なくとも一つ含む植物であれば、トランスジェニック植物世代を問わず、全て包含される。
　「外因性の核酸発現システム」とは、人為的操作を介して外部から導入された外来性の核酸発現システムのことをいう。したがって、植物のゲノム上の所定の遺伝子座に元々存在している内因性の核酸発現システムは、該当しない。ただし、そのような内因性の核酸発現システムであっても、突然誘発処理等の人為的操作を介して外部から変異を導入したものや、トランスジェニック植物の後代のように、その起源が外因性の核酸発現システムに由来する内因性核酸発現システムは、本発明の外因性の核酸発現システムに含まれる。
　病害抵抗性植物の各構成については、前記第１実施形態で説明した通りであることから、ここではその詳細な説明は省略する。
４．植物病害抵抗性増強剤
　本発明の第４の実施形態は、植物病害抵抗性増強剤である。本発明の植物病害抵抗性増強剤は、有効成分として、野生型BIL5、野生型BNX1、野生型BIL4若しくは野生型BIL6、植物病害抵抗性を増強する活性を有するその変異ポリペプチド、又は植物病害抵抗性を増強する活性を有するそのポリペプチド断片、を少なくとも一つ包含する。野生型BIL5、野生型BNX1、野生型BIL4又は野生型BIL6は、前述の通り、BRシグナル伝達経路において細胞内シグナル伝達因子として機能する。したがって、これらの野生型ポリペプチド若しくは植物病害抵抗性を増強する活性を有するその変異ポリペプチド、又は該活性を有するそのポリペプチド断片を目的の植物に施用し、その細胞内で機能させることにより、当該目的の植物の植物病害抵抗性を増強することができる。
　本発明の植物病害抵抗性増強剤中に含まれる前記野生型BIL5、野生型BNX1、野生型BIL4若しくは野生型BIL6、その変異ポリペプチド、又はそのポリペプチド断片の量は、含有するポリペプチドの種類、含有する担体の種類、施用対象植物の種類、施用目的、施用方法及び含有する場合には他の薬理効果を有する薬剤の種類等の諸条件によって左右される。植物病害抵抗性増強剤の施用後に対象とする植物に対して病害抵抗性を付与できる条件を勘案し、その含有量を決定すればよい。
　また、本発明の植物病害抵抗性増強剤は、必要に応じて農学上許容可能な担体を含むこともできる。「農学上許容可能な担体」とは、植物病害抵抗性増強剤の施用を容易にし、有効成分である前記ポリペプチドの分解を阻害若しくは抑制し又は／及びその作用速度を制御する物質をいう。目的の植物への施用により土壌及び水質等の環境に対する有害性及び動物、特にヒトに対する有害性がないかその影響が小さいものが好ましい。
　担体の例として、粉砕天然鉱物、粉砕合成鉱物、乳化剤、分散剤及び界面活性剤等が挙げられる。
　粉砕天然鉱物の例としては、例えば、カオリン、クレイ、タルク及びチョークが挙げられる。
　粉砕合成鉱物の例としては、例えば、高分散シリカ及びシリケートが挙げられる。乳化剤としては、非イオン性乳化剤やアニオン性乳化剤（例えば、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル、アルキルスルホネート及びアリールスルホネート）が挙げられる。
　分散剤の例としては、例えば、リグノ亜硫酸廃液及びメチルセルロースが挙げられる。
　界面活性剤の例としては、例えば、リグノスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、フェノールスルホン酸、ジブチルナフタレンスルホン酸のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩及びアンモニウム塩、アルキルアリールスルホネート、アルキルスルフェート、アルキルスルホネート、脂肪アルコールスルフェート、脂肪酸及び硫酸化脂肪アルコールグリコールエーテル、さらに、スルホン化ナフタレン及びナフタレン誘導体とホルムアルデヒドの縮合物、ナフタレン又はナフタレンスルホン酸とフェノール及びホルムアルデヒドの縮合物、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、エトキシル化イソオクチルフェノール、オクチルフェノール、ノニルフェノール、アルキルフェニルポリグリコールエーテル、トリブチルフェニルポリグリコールエーテル、トリステアリルフェニルポリグリコールエーテル、アルキルアリールポリエーテルアルコール、アルコール及び脂肪アルコール／エチレンオキシドの縮合物、エトキシル化ヒマシ油、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、エトキシル化ポリオキシプロピレン、ラウリルアルコールポリグリコールエーテルアセタール、ソルビトールエステル、リグノ亜硫酸廃液、及びメチルセルロースが挙げられる。
　本発明の植物病害抵抗性増強剤中に含まれる前記BIL5、BNX1、BIL4若しくはBIL6、その変異ポリペプチド、又はそのポリペプチド断片の量は、含有する植物分枝抑制剤の種類、含有する担体の種類、施用対象植物の種類、施用目的、施用方法及び含有する場合には他の薬理効果を有する薬剤の種類等の諸条件によって左右される。当該分野の技術常識の範囲において植物分枝抑制組成物に含有される植物分枝抑制剤が施用後に対象植物に対して所望の量となるように各条件を勘案し、該組成物における植物分枝抑制剤の含有量を決定することができる。
５．植物病害抵抗性増強方法
　本発明の第５の実施形態は、前記実施形態４に記載の植物病害抵抗性増強剤を目的の植物に施用し、該植物の植物病害抵抗性を増強させる方法である。
　実施形態４に記載の植物病害抵抗性増強剤の施用形態は、慣用の製剤形態、例えば、直接散布、塗布及び／又は浸漬可能な溶液剤、油性分散液剤、エマルション剤、懸濁製剤、粉剤、散剤、ペースト剤、ペレット剤、錠剤及び粒剤とすることができる。
　実施形態４に記載の植物病害抵抗性増強剤の施用方法は、目的とする植物の病害抵抗性を増強することができれば、特に限定はしない。当該分野で公知の方法によって施用すればよい。
　例えば、水耕栽培であれば、水耕液中に添加することができる。施用された植物病害抵抗性増強剤は、根部より吸収されて植物体全体に行き渡り、本発明の効果を発揮し得る。
　また、植物病害抵抗性増強剤を土中に直接又は間接的に施用することもできる。ただし、本発明の有効成分であるポリペプチドは、土中では微生物等の作用によって比較的短時間で分解されやすいことに留意する。そこで、前記ポリペプチドを除放性の封入体に封入して目的の植物に間接的に施用することもできる。この場合も、施用された本発明の植物病害抵抗性増強剤は、根部より吸収されて植物体全体に行き渡り、その後、各細胞において本発明の効果を発揮することができる。
　さらに、植物病害抵抗性増強剤を溶解した溶液を植物体に塗布、浸漬、注入又は散布することによって施用することもできる。前記塗布等する部位は、茎部、葉柄基部等所望の箇所に行えばよく、限定しない。
　本発明の植物病害抵抗性増強剤の施用量は、使用する植物病害抵抗性増強剤に包含される植物病害抵抗性ペプチド等の種類又は施用対象植物の種類によって変化する。また、同一種の対象植物に施用する場合であっても水耕栽培と土壌栽培でもその量は変化する。土中での微生物の分解作用により本発明の植物病害抵抗性増強剤の分解速度が水耕液中と比較して一般に早いためである。したがって、施用量は、当業者が状況、目的及び必要に応じて適宜定めればよい。
[実施例１]
＜機能獲得型bil5変異株におけるPR1遺伝子の発現誘導＞
　シロイヌナズナBIL5の機能獲得型変異株bil5-1Dにおける病原抵抗性マーカーPR1（Pathogen Relate 1D）の遺伝子発現を検証した。PR1は、一般に、病原菌の植物への感染によって、その発現が誘導される抗菌性タンパク質であり、通常はサリチル酸を介した病原抵抗性シグナル伝達経路の下流で機能することが知られている。したがって、bil5-1D株において、病原菌の非感染下でPR1遺伝子の発現が上昇していれば、bil5-1D株は、病害抵抗性を獲得していることが示唆される。
（方法）
　先ず、シロイヌナズナの野生株とbil5-1D株をそれぞれ土壌に播種した生育10日後の個体をRNA抽出に用いた。このとき、BR無添加（未処理）と添加（処理）のそれぞれのサンプルを調製した。BRは、シロイヌナズナへの投与によって、PR1遺伝子の発現を増加させることが、Nakashitaら(The Plant Jour., 2003, 33:887-898)により報告されている。それぞれの株のロゼッタ葉からRNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN社)を用いて、総RNAを抽出した。次に、Prime Script First-Strand cDNA Synthesis Kit（タカラ社）を用いて、抽出した総RNAからcDNA合成をした。総RNA抽出及びcDNA合成の具体的な方法については、各キットに添付のプロトコルに従った。続いて、合成したcDNAを鋳型にして、配列番号５で示す塩基配列からなるRT-PR1-F及び配列番号６で示す塩基配列からなるPR1-Rをプライマーに用いて、SYBR PremixEX taqキット（タカラ社）及びReal Time PCR機器Thermal Cycler Dice（タカラ社）により、PR1遺伝子の発現解析をリアルタイムPCRにより行った。
（結果）
　図１に結果を示す。この図では、PR1遺伝子の発現レベルを、BR未処理（-BR）の野生株（WT）における値を１としたときの相対値で示している。図１からも明らかなように、bil5-1D株は、BR未処理でも、BR処理をした（＋BR）野性株よりもPR1遺伝子の発現量が高かった。また、BR処理をしたbil5-1D株では、PR1遺伝子の発現量がさらに増強された。以上の結果から、bil5-1Dは、病害抵抗性を獲得していることが示唆された。
[実施例２]
＜過剰発現株におけるPR1遺伝子発現誘導＞
　実施例１では、BIL5の機能獲得型変異株でPR1遺伝子の発現が増加することが示された。そこで、BIL5遺伝子等の過剰発現でもPR１遺伝子発現が増加するかを検証した。本実施例では、シロイヌナズナの野生型BIL5遺伝子の過剰発現型トランスジェニック株BIL5-OX1とシロイヌナズナの野生型BNX1遺伝子の過剰発現型トランスジェニック株BNX1－OX1の二重トランスジェニック株BIL5-OX1×BNX1－OX1を用いた。この理由は、形態観察において、もっともbil5-1D変異株に近い形態を示した株を、PR1遺伝子の解析にも用いたためである。野生型株におけるBIL5遺伝子単独の過剰発現株では、胚軸の形態、成熟した葉や茎の形態がbil5-1D変異株の形態には類似するものの、緩やかな異常形質しか現れず、シロイヌナズナの野生型BIL5遺伝子の過剰発現型トランスジェニック株BIL5-OX1株とシロイヌナズナの野生型BNX1遺伝子の過剰発現型トランスジェニック株BNX1－OX1株の二重トランスジェニック株BIL5-OX1×BNX1－OX1を作製して初めてbil5-1D変異株の示す強い異常形質が再現されたためである。また、bil5-1D変異株では、BIL5遺伝子上の１箇所の脱メチル変異が、隣接するBNX1遺伝子の遺伝子発現プロモーターとして機能していると類推される原理によって、BIL5遺伝子と隣接するBNX1遺伝子も高発現を示すことが明らかとなったためである。
(方法)
（１）野生型BIL5遺伝子及びBNX1遺伝子のクローニング
　（総RNAの調製とcDNAの合成）
　総RNAの抽出には、RNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN）を用いた。まず、ロゼット葉を0.1mg（fresh weight）未満となるように採取し、液体窒素で凍結後、乳鉢で破砕した。破砕した試料にβ-Mercaptoethanol 10μL/buffer RLT 1μL混合液を450μL加えて、ボルテックスをした。具体的な方法は、キット添付のプロトコルに従った。最後にエタノール沈殿を行った後、得られた総RNAをRNase free water 50μLに溶解させた。
　cDNA合成には、Super Script III First-Strand Synthesis System for RT-PCR（Invitrogen）を用いた。具体的な方法は、添付のプロトコルに従った。
　（クローニングベクターの調製）
　BIL5遺伝子及びBNX1遺伝子の全長ORFを得るために、調製したcDNAライブラリーを用いて、KOD-plus-DNAポリメラーゼ(Toyobo)でPCR反応を行った。BIL5及びBNX1のフォワード及びリバースプライマーには、それぞれ配列番号７及び８、及び配列番号９及び１０で示される塩基配列からなるプライマーを用いた。
　BIL5遺伝子、BNX1遺伝子のクローニングは、pENTR/D TOPO cloning kit（Invitrogen)を用いて行った。具体的な方法については、キットに添付のプロトコルに従った。これによって、BIL5遺伝子のクローニングベクターpENTR-BIL5と、BNX1遺伝子のクローニングベクターpENTR-BNX1を得た。
　（発現ベクター調製）
　植物形質転換用発現ベクターは、pGWB5ベクター(Nakagawa et al., 2007, JBB, 104:34-41)を用いGateway技術を用いたLR反応によって作製した。pENTR-BIL5、pENTR-BNX1とpGWB5ベクター及びLR clonaseの混合液を調製し、25℃に１時間静置した後、Protease Kを1μL加え、37℃に１０分間静置した。続いて、85℃で１０分間インキュベーションした後、DH5αコンピテントセルと混合し、カナマイシン及びハイグロマイシンをそれぞれ25μL/mLずつ含むLB培地に塗布し、一晩培養した。形質転換体からプラスミドを抽出して、目的のpGWB5-BIL5及びpGWB5-BNX1ベクターを得た。
（２）トランスジェニックシロイヌナズナの作製
　（アグロバクテリウムへのpGWB5-BIL5、pGWB5-BNX1の導入）
　アグロバクテリウムコンピテントセル50μLに対し、2μLのpGWB5-BIL5又はpGWB5-BNX1を加え、よく混和して、氷中に３０分静置した。続いて、液体窒素中で１分間静置した後、37℃のブロックインキュベーターで融解した。YEP培地を250μL加え、200rpmで浸透しながら６０分間培養した。カナマイシン及びハイグロマイシンをそれぞれ25μLg/mL、リファンピシン50μg/mLを含むYEP培地に撒き、二晩培養した。ベクター導入の有無は、コロニーPCRを用いて確認した。
　（アグロバクテリウムの植物への感染）
　ベクターの導入されたコロニーをYEP液体培地で、一晩前培養した。培養液を500mlにスケールアップし、一晩培養した。培養液を5000rpm、１０分間遠心し、上清を捨てた。5%(w/v) スクロースを含むMS培地に懸濁した。鞘を除去したシロイヌナズナ野生株にflower dipping法により、pGWB5-BIL5、pGWB5-BNX1を形質転換した。得られたT1種子をカナマイシン25μg/mL含むMS培地で選抜を行った。得られた形質転換体の形態観察を行った。
（３）二重過剰発現株の作製
　BIL5過剰発現株及びBNX1過剰発現株をそれぞれ実施例１の方法に従ってリアルタイムPCRによって解析し、BIL5遺伝子、BNX1遺伝子の過剰発現の確認をもって、過剰発現株とした。二重過剰変異株は、各過剰発現株の一方の花粉を他方の雌しべへ付ける人工交配によって作製した。二重過剰発現株であることについては、実施例１の方法に従ってリアルタイムPCRによって解析した。
（４）二重過剰発現株におけるPR1遺伝子発現誘導
　シロイヌナズナの野生株、bil5-1D株及び前記BIL5-OX1×BNX1-OX1株をそれぞれ播種し、１４日間栽培した。各株からの総RNA抽出、cDNA合成、およびリアルタイムPCRによるPR1遺伝子の発現解析の具体的な方法については、実施例１の方法に準じた。
（結果）
　図２に結果を示す。BIL5-OX1×BNX1-OX1株では、BIL5機能獲得型変異株であるbil5-1Dを著しく上回るほどのPR1遺伝子の発現が検出された。したがって、bil5-1Dと同様に、BIL5遺伝子の過剰発現株においてもPR１遺伝子の発現が増加することが判明した。また、同時にゲノム上にBIL5遺伝子に隣接して存在するBNX1遺伝子がBIL5遺伝子と同様の活性を有し、その二重変異株はPR1遺伝子の発現を著しく増加することも明らかとなった。この結果から、BIL5及びBNX1遺伝子の過剰発現株は、植物に病害抵抗性を付与し得ることが示唆された。
[実施例３]
＜BIR5と病原抵抗性の関連性＞
　実施例１及び２において、BIL5の機能獲得型変異株及び過剰発現株においてPR1遺伝子の増加が確認されたことで、実際にこれらの株が病原抵抗性を獲得していることを検証した。
（方法）
　病原抵抗性の獲得の有無には、タバコ病原菌アッセイを用いた。植物は、シロイヌナズナの野生株、bil5-1D株、bil5-1Dとsid2の二重変異株（bil5-1D×sid2）及びsid2変異株を使用した。SID2は、サリチル酸生合成酵素で、この欠損変異体であるsid2変異株ではサリチル酸が合成されず、病害抵抗性が失われる。まず、各植物を土壌に播種した後、３週目の植物体に菌接種を行なった。タバコ病原菌であるPseudomonas syringae pv. tabasi(Pst)を栄養培地で28℃にて２日間培養し、細菌懸濁液を10mMのMgCl2で2×105CFU(Colony Forming Unit)/mlとなるように調製した。菌接種は、針なしの1mlシリンジを用いて細菌懸濁液の浸透によって行なった。葉の細菌浸透部から、ディスク状に葉を感染後０、１、３及び５日目に採取し、植物由来の３つのディスクを一緒にして10mMのMgCl2でホモジナイズした。CFU数は、希釈後に栄養培地のアガープレート上で生育させて評価した。各時点において３つの植物体を使用し、かつ２つのサンプルをそれぞれの植物体から調製した。
（結果）
　結果を図３に示す。図３の縦軸は、植物組織1gあたりの病原菌Pstのコロニー数であり、その数が少ない程、病原菌の生育が抑制されたこと、すなわち病害抵抗性を獲得していることを意味する。実施例１及び２で予想されたように、bil5-1D株では、野生株（WT）を上回る病害抵抗性を獲得していることが確認された。また、bil5-1Dとsid2の二重変異株（bil5-1D×sid2）では、病原菌の生育が野生型と同程度となった。これは、bil5-1Dの病害抵抗性がサリチル酸の生合成阻害によって抑制されたことを示している。
[実施例４]
＜BIR5とサリチル酸合成量との関連性＞
　実施例１～３の結果から、BIL5遺伝子の発現増加、すなわちBIL5の増加による病原抵抗性は、サリチル酸病害抵抗性シグナル伝達経路を介して獲得されていることが示唆された。そこで、bil5-1D株においてサリチル酸の合成量が増加しているか否かを検証するため、植物体中のサリチル酸量について検証した。
（方法）
　土壌に播種し生育した播種後３週間目の実施例３の各植物から、葉を採取して集め、遊離サリチル酸（SA）のレベルを測定した。SAの測定は、Nakashitaら（前述）及びYoshiokaら（Plant L., 2001, 25, 149-157）の方法に従った。
（結果）
　結果を図４に示す。予想通りbil5-1D株では、野生株の４倍以上の遊離サリチル酸量が検出された。bil5-1D株では通常よりも多量のサリチル酸が生合成される、及び／又は蓄積される結果、野生株以上の病原抵抗性が獲得されることが明らかとなった。一方、bil5-1D×sid2の二重変異株では、sid2変異単独変異株と同程度まで検出されるサリチル酸量が減少した。これらの結果は、BIL5による病害抵抗性の獲得には、サリチル酸が必要であり、BIL5は、サリチル酸病害抵抗性シグナル伝達経路においてSID2の上流で関与している可能性があることが明らかとなった。
[実施例５]
＜ブラシノステロイドシグナル伝達系変異株と病害抵抗性との関係＞
　本発明で開示した他の遺伝子であるBNX1遺伝子についてもBIL5遺伝子と同様に植物病原抵抗性が獲得されることを検証した。
（方法）
　実験には、シロイヌナズナの野生株、bil5-1D株、BIL5-OX1×BNX1-OX1株及びbil1株を用いた。
　ここで、bil1株は、BIL1タンパク質を安定化して高蓄積する機能獲得型変異体である。BIL1タンパク質は、ブラシノステロイド細胞内シグナル伝達経路の下流で機能する因子で、発生を制御する転写制御因子として知られているが、本発明者らの研究により、病害抵抗性を誘導できないことが明らかとなっている。
　病原抵抗性獲得の基本的な方法は、実施例３の方法に準じた。
（結果）
　結果を図５に示す。bil5-1D株及びBIL5-OX1×BNX1-OX1株では、野生株（WT）を上回る病害抵抗性が確認された。一方、病害抵抗性を誘導できないbil1株では、野生株と同程度の病害抵抗性であった。この結果ら、BIL5遺伝子及びBNX1遺伝子を植物体において過剰発現させた場合、病害抵抗性が獲得されることが明らかとなった。
[実施例６]
　実施例５で用いた各植物体において、サリチル酸の合成量が増加しているか否かを検証するため、植物体中のサリチル酸量について検証した。
（方法）
　基本的な方法は、実施例４に記載の方法に準じた。
（結果）
　結果を図６に示す。bil5-1D株とBIL5-OX1×BNX1-OX1株では野生型（WT）を上回るサリチル酸量が検出され、サリチル酸合成量及び／又は蓄積量の増加が実施例５及び図５で示す病害抵抗性の獲得と関連していることが明らかとなった。
[実施例７]
＜BIL4遺伝子過剰発現株におけるPR1遺伝子及びPR5遺伝子の発現誘導＞
　BIL4遺伝子の過剰発現で病原抵抗性マーカーPR１遺伝子及びPR5遺伝子の発現が増加するかを検証した。
（方法）
　基本的な方法は、実施例２に記載の方法に準じた。なお、本実施例では、シロイヌナズナの野生株、bil5-1D株、及び野生型BIL4遺伝子の過剰発現型トランスジェニック株BIL4-OX1を用いた。
（結果）
　図７に結果を示す。BIL4-OX1株では、BIL5機能獲得型変異株であるbil5-1Dほどではないが、野生株と比較するとPR1遺伝子では9倍以上、PR5遺伝子では5倍以上の発現が検出された。BIL4遺伝子の過剰発現株においてもbil5-1Dと同様に病原抵抗性マーカー遺伝子の発現が増加することから、BIL4遺伝子の過剰発現株は、植物に病害抵抗性を付与し得ることが示唆された。
[実施例８]
＜BIL6遺伝子過剰発現株におけるPR1遺伝子及びPR5遺伝子の発現誘導＞
　BIL6遺伝子の過剰発現で病原抵抗性マーカーPR１遺伝子及びPR5遺伝子の発現が増加するかを検証した。
（方法）
　基本的な方法は、実施例２に記載の方法に準じた。なお、本実施例では、シロイヌナズナの野生株、及び野生型BIL6遺伝子過剰発現型トランスジェニック株2株（BIL6-OX1及びBIL6-OX2）を用いた。
（結果）
　図８に結果を示す。BIL6遺伝子過剰発現株では、いずれの場合にも、野生株と比較するとPR1遺伝子では約10倍、PR5遺伝子では約15～25倍の発現が検出された。BIL6遺伝子の過剰発現株においても病原抵抗性マーカー遺伝子の発現が増加することから、BIL6遺伝子の過剰発現株は、植物に病害抵抗性を付与し得ることが示唆された。
　なお、本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (11)

  1. 　以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかのポリペプチド又は植物病害抵抗性を増強する活性を有するその断片をコードする核酸を発現可能な状態で包含する核酸発現システムを、目的とする植物に少なくとも一つ導入する工程を含む、病害抵抗性植物の作出方法。
    　（ａ）配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    　（ｂ）配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物病害抵抗性を増強する活性を有するポリペプチド、及び
    　（ｃ）配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列に対して40％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ植物病害抵抗性を増強する活性を有するポリペプチド
  2. 　核酸が配列番号３若しくは４で示される塩基配列からなる核酸、又は配列番号３若しくは４で示される塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物病害抵抗性を増強する活性を有するポリペプチドをコードする核酸である、請求項１に記載の作出方法。
  3. 　以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかのポリペプチド又は植物病害抵抗性を増強する活性を有するその断片をコードする核酸を発現可能な状態で包含する核酸発現システムを、目的とする植物に少なくとも一つ導入する工程を含む、病害抵抗性植物の作出方法。
    　（ａ）配列番号１１又は１２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    　（ｂ）配列番号１１又は１２で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物病害抵抗性を増強する活性を有するポリペプチド、及び
    　（ｃ）配列番号１１又は１２で示されるアミノ酸配列に対して40％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ植物病害抵抗性を増強する活性を有するポリペプチド
  4. 　核酸が配列番号１３若しくは１４で示される塩基配列からなる核酸、又は配列番号１３若しくは１４で示される塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物病害抵抗性を増強する活性を有するポリペプチドをコードする核酸である、請求項３に記載の作出方法。
  5. 　前記核酸発現システムが、包含する前記核酸を過剰発現する、請求項１～４のいずれか一項に記載の作出方法。
  6. 　前記核酸発現システムが、包含する前記核酸を構成的に発現する、請求項５に記載の作出方法。
  7. 　前記核酸発現システムが、包含する前記核酸を誘導性に発現する、請求項５に記載の作出方法。
  8. 　前記核酸発現システムが発現ベクターである、請求項１～７のいずれか一項に記載の作出方法。
  9. 　請求項１～８のいずれか一項に記載の作出方法で得られた病害抵抗性植物又はその後代。
  10. 　以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかのポリペプチド又は植物病害抵抗性を増強する活性を有するその断片をコードする核酸を発現可能な状態で包含する外因性の核酸発現システムを少なくとも一つ含む病害抵抗性植物。
    　（ａ）配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    　（ｂ）配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物病害抵抗性を増強する活性を有するポリペプチド、及び
    　（ｃ）配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列に対して40％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ植物病害抵抗性を増強する活性を有するポリペプチド
  11. 　以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかのポリペプチド又は植物病害抵抗性を増強する活性を有するその断片をコードする核酸を発現可能な状態で包含する外因性の核酸発現システムを少なくとも一つ含む病害抵抗性植物。
    　（ａ）配列番号１１又は１２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    　（ｂ）配列番号１１又は１２で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物病害抵抗性を増強する活性を有するポリペプチド、及び
    　（ｃ）配列番号１１又は１２で示されるアミノ酸配列に対して40％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ植物病害抵抗性を増強する活性を有するポリペプチド
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