WO2012062949A1 - Liposomas con anticuerpos contra marcadores de la zona peri-infarto cerebral - Google Patents

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WO2012062949A1
WO2012062949A1 PCT/ES2011/070769 ES2011070769W WO2012062949A1 WO 2012062949 A1 WO2012062949 A1 WO 2012062949A1 ES 2011070769 W ES2011070769 W ES 2011070769W WO 2012062949 A1 WO2012062949 A1 WO 2012062949A1
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liposomes
cells
peri
protein
hsp72
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PCT/ES2011/070769
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José CASTILLO SÁNCHEZ
Pedro Ramos Cabrer
Tomás SOBRINO MOREIRAS
Jesús AGULLA FREIRE
David BREA LÓPEZ
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Servizo Galego De Saúde (Sergas)
Fundación Idichus
Universidade De Santiago De Compostela
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    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Definitions

  • the invention relates to the field of Biotechnology, particularly directed to the identification and application of tissue markers. More specifically, the invention relates to liposomes that present on their surface antibodies directed against proteins that are expressed in the peri-infarction zone and their use for the identification of said region, both from images taken from patients and in brain tissue samples processed in vitro.
  • Stroke is called the loss of brain functions as a result of the interruption of blood flow to the brain. According to their etiology, strokes have two variants: ischemic and hemorrhagic.
  • Ischemic stroke also called cerebral infarction or cerebral ischemia
  • cerebral infarction is due to the occlusion of some of the arteries that supply the brain mass, either by atherosclerosis or by the presence of a plunger (cerebral embolism) that comes from another location.
  • Hemorrhagic stroke (also known as cerebral hemorrhage or stroke) is due to the rupture of a brain blood vessel, a rupture that has as its most frequent causes an elevation in blood pressure or a congenital aneurysm. Hemorrhage, in addition to depriving the brain area dependent on the affected blood vessel, also causes the extravasated blood to compress the brain structures, thereby affecting its functionality and even its viability.
  • Stroke is becoming one of the leading causes of death and disability in developed countries. Due to the progressive aging of the population and life habits, its incidence is increasing in these countries. The advances on its treatment, however, are not even.
  • thrombolytic treatments present a significant risk of worsening the patient's condition and, even, of causing death, so its use is currently limited to a small fraction of patients (less than 3%) (Kleindorfer et al., 2009). Given this circumstance, neurologists are forced to decide whether or not to apply thrombolytic treatment depending on the risk / benefit ratio that would entail.
  • peri-infarction zone This is the name of the area of tissue that is adjacent to the nucleus of the lesion and that is considered to be tissue that, although at risk, is potentially recoverable, being possible to induce neuroprotection and neuroreparation processes, in contrast to what happens with the adjacent ischemic tissue (ischemic nucleus), which is already dead tissue, basically unrecoverable. If the "salvageable" tissue zone (the peri-infarction zone) is very small, it is normal not to apply thrombolytic treatment, because the risks outweigh the benefit. When the dimensions of the peri-infarction zone are larger, it is considered that the risks associated with thrombolytic treatments are worth taking.
  • peri-infarction zone an area that is sometimes It is associated with the peri-infarction area but it is not exactly the same and, in many cases, does not indicate the actual extent of potentially recoverable tissue.
  • the penumbra concept responds to an area that has a rapid expiration in time, appearing at the same time as the ischemic tissue and disappearing within a few hours, either because it becomes part of the final total lesion or because it has recovered, becoming viable tissue.
  • the concept responds to the practice of conducting radiological studies of patients admitted to the emergency department during the first hours (1 to 6 hours, for example) after cerebral infarction.
  • CT brain computerized tomography
  • Diffusion MRI provides images based on the assessment of proton diffusion in brain water and, in general, is considered to detect the area of tissue called the heart of the infarct, with irreversible lesions.
  • Perfusion MRI is based on the effect produced by intravenous administration of paramagnetic contrast during its first passage through the cerebral parenchymal capillary network, which is proportional to cerebral blood volume and allows different perfusion maps to be created. , the most used being those of medium transit time (MTT) or time to peak (TTP), due to its great sensitivity to detect hypoperfused brain regions after vascular occlusion.
  • MTT medium transit time
  • TTP time to peak
  • DWI-PWI disengagement term
  • ischemic penumbra that is, tissue at risk but potentially recoverable through reperfusion treatments.
  • This twilight zone is often associated with the peri-infarction zone, but it is not exactly the same, among other reasons, because the twilight zone often does not indicate the actual extent of tissue known as "salvageable.”
  • the concept of penumbra responds to an area that has a rapid expiration in time, appearing at the same time as the ischemic tissue and disappearing within a few hours, recovering to become viable tissue or forming part of the final total lesion, while the peri-infarction zone would exist in a patient who had suffered a cerebral infarction hours, and even days after the twilight zone disappeared. Therefore, it has been thought that it would be more appropriate to define the peri-infarction area using molecular markers.
  • the application WO 2006/020269 refers to the diagnosis and prognosis of neurodegenerative diseases through the use of biomarkers, citing cerebral infarction and ischemia as examples of acute neurodegenerative diseases:
  • the examples of the application refer to Parkinson's disease and Alzheimer's disease, which are considered chronic diseases.
  • WO 2008/008846 does describe a method for the diagnosis of cerebral infarction by imaging by administering labeled antibodies directed against specific proteins to the patient.
  • the request refers mainly to hemorrhagic infarction, not to ischemic stroke (in fact, the definition of the term "evaluate a heart attack" that begins on page 20 of that international application cites only hemorrhagic infarctions), with particularly preference for intracerebral hemorrhagic infarctions.
  • ischemic stroke in fact, the definition of the term "evaluate a heart attack” that begins on page 20 of that international application cites only hemorrhagic infarctions
  • application WO 2008/008846 indicates that it is necessary for the individual to present alteration in the expression of at least four genes (present in Tables 15 or 17-18 of said application WO 2008/008846).
  • samples from which the diagnosis could be carried out they are only provided examples referring to the use of PBMCs (peripheral blood mononuclear cells), although it is pointed out that brain samples could be used.
  • the identification of the peri-infarction zone is not contemplated in WO 2008/008846, or in brain samples, much less from neuroimaging obtained in vivo; Nor is any relationship established between said area and the diagnosis of ischemic stroke or, rather, the evaluation of its situation and the most recommended therapy depending on it.
  • the application WO 2009/075863 also refers to the diagnosis of cerebral infarction by determining the presence of a marker in a sample.
  • Cerebral infarction the way of referring to it throughout the description makes it clear that reference is being made to the ischemic type. But the determination of markers is always made in samples taken from individuals, not appearing to consider their possible determination in vivo at an early stage. In addition, it is the absence or relative abundance of one or more of these markers in the sample that determines the likelihood that a stroke in an individual has not existed or occurred, respectively.
  • HSP70 protein is not considered.
  • any of the markers mentioned can be used to discriminate, within a sample taken from a possible patient, the presence and extent of the peri-infarction area, nor is it considered that such markers can serve to make any determination in living patients, in particular, the location and extent of the peri-infarction area.
  • liposomes cross the blood brain barrier, even conjugated to other compounds such as, for example, with maleimide and polyethylene glycol (Huwyler et al, 1996; Lu, et al, 2007). Therefore, its use has been proposed both as a vehicle for useful drugs for the treatment of disorders or disorders of the Central Nervous System and for their diagnosis.
  • WO 2009/022756 refers to a composition for both the treatment or prevention of ischemic damage in the Nervous System Central (CNS) as for its diagnosis.
  • the composition contains a liposome and sialyl-Lewis X (SLX) or an SLX group.
  • SLX sialyl-Lewis X
  • the invention provides a means for distributing a target substance into the cells. It is not mentioned, however, that liposomes present any remains that facilitate their accumulation in any specific region of the brain.
  • One of the marker substances that have been used to detect the presence of liposomes in the CNS is gadolinium, which has proven useful for obtaining magnetic resonance imaging of the Central Nervous System (Saito et al., 2004; Saito et al, 2005).
  • the vehicle of the neurotherapeutic agent is a liposome
  • the pharmaceutical composition contains a traceable agent, which can be a contrast agent for magnetic resonance, citing as especially preferred embodiment the one in which the pharmaceutical composition contains a liposome that It contains a gadolinium chelate.
  • traceable agents based on liposomes are very precise direct indicators of the distribution of high molecular weight neurotherapeutic agents based on liposomes. As in the previous case, the document does not propose that liposomes present any molecule that preferentially directs them to any specific area of the brain.
  • the invention provides a solution to these problems.
  • the present invention is based on the fact, reflected in Example 1 of the present invention, that the peri-infarction zone has overexpression of the HSP70 thermal shock protein with respect to the expression detected in the contralateral zone of brain samples taken of the same individuals (animal models of cerebral infarction).
  • HSP70 This protein, HSP70, has the characteristic that, in certain situations, it can appear anchored to the membrane because, in cooperation with other chaperones, it participates in the processes of recognition of misfolded proteins, stabilizes the pre-existing proteins against aggregation, and half the folding of misfolded proteins and, for this, they join extended peptide segments with hydrophobic character, exposed by various polypeptides during translation and membrane translocation.
  • liposomes with a structure that allows them to cross the blood-brain barrier and, in addition, have anti-HSP70 antibodies on their surface
  • these liposomes will preferentially accumulate in the region of the brain where the HSP70 protein is overexpressed, that is, the peri-infarction region.
  • the marking of said liposomes with a marker that allows to easily detect the presence of liposomes, such as gadolinium complexes that allow their detection by magnetic resonance, would allow the obtaining of neuroimaging in which to determine the location and extent of the peri-infarction area as that area where there is a greater signal associated with gadolinium complexes, that is, less relaxation time.
  • liposomes in addition, could be used for the in vitro identification of any type of cell present in a sample that overexpressed said protein, which could be indicative, for example, of having been subjected to thermal shock (as is the case with astrocytes that are used later in Example 3 of the present invention) or, likewise, the identification could serve to distinguish different types of cells present in a sample.
  • the cells could be part of an in vitro culture or, likewise, could be in a tissue sample.
  • Said tissue could be, for example, brain tissue, so that the liposomes could also be used to determine the area corresponding to the peri- infarct region in a sample of brain tissue.
  • liposomes with a double marking would be an additional advantage, since the use of such liposomes would allow the analysis of in vitro samples by two different techniques, as preference is given in every moment: by analysis of the fluorescence signal emitted by the samples or by magnetic resonance studies.
  • HSP70 protein there are two known forms for the HSP70 protein, whose nomenclature is not always clear.
  • HSP70c a constitutive form of the HSP70 protein
  • HSC70 or HSPA8 present in both humans (Gen 3312 Identifier, with GenBank accession number NM_006597, current version: NM 006597.4, also represented by the accession number NM l 53201, current version: NM_153201.2) as, for example, in other mammals such as mice ⁇ Mus musculus) (GenBank accession number NM_031165 NR_015570, current version: NM_031165.4) or rats (Rattus norvegicus) (number of GenBank access NM_024351, current version: NM_024351.2), which is expressed in all brain cells.
  • HSP70 ⁇ another form of this protein called inducible
  • HSP72 another form of this protein called inducible
  • HSP70 ⁇ , HSP72 or HSPA1A which can also be found in humans (accession number in GenBank NM 031971, current version: NM 031971.2) as in other mammals such as mice (GenBank accession number NM O 10479, current version: NM O 10479.2) or rats (Rattus norvegicus) (GenBank accession number NM 212504, current version: NM 212504.1).
  • mice GenBank accession number NM O 10479, current version: NM O 10479.2
  • rats Rat
  • NM 212504 current version: NM 212504.1
  • the deepening of the characteristics of this differential expression of HSP70 in brain tissue samples disclosed in the present invention has allowed us to verify that the inducible form of the HSP70 protein, specifically the HSP72 form, shows a clear expression exclusively in the pre-infarcted area of brain tissue, expressing itself in a very insignificant and sporadic way in the region of the lesion nucleus.
  • the authors of the present invention have studied the temporal space expression of the HSP72 protein in animal models of cerebral ischemia whose behavior is extrapolated to that of humans. As shown in Example 5, they obtained a temporal profile, observing elevated levels at 6 hours after the induction of the lesion, with a maximum expression of this protein at 12 hours after the induction of the lesion, which remains elevated at 24 hours, and progressively decreases until sporadic presence at 10 days. According to the profile obtained, it can be considered that there is differential expression in the peri- infarct area between 12 hours and 7 days after the induction of the lesion.
  • liposomes that carry specific antibodies against the HSP72 protein can serve to determine the peri-infarction region in an individual (both human and any other mammal) in a wide range of time since the ischemic stroke occurs, for example, between 6 hours and 7 days since the same occurs, it being preferable that the determination is made between 12 hours and 72 hours since the stroke occurs.
  • the invention relates to liposomes that have on their surface an antibody against HSP70 heat shock protein bound to the liposome by a maleimide group and which, in addition, are labeled with a fluorophore (preferably rhodamine) and / or with a gadolinium complex, as well as the use thereof both for the in vitro identification of cells that overexpress the HSP70 protein (including cells that are part of the peri-infarction region of a sample of brain tissue, an option that allows the determination of the same) and to a procedure for the determination of the peri-infarction zone in an individual by means of magnetic resonance studies in which neuroimaging is taken and the area in which there is greater accumulation of liposomes (greater accumulation of gadolinium) is identified.
  • a fluorophore preferably rhodamine
  • the antibody in all cases, there is a special preference for the antibody to recognize the HSP72 form and, more preferably, to be specific against it. Because of its clinical and veterinary utility, it is preferred that the antibody can recognize the protein of a mammal, especially by humans, although liposomes of the invention with antibodies that recognize the HSP72 form of animals from animals may also be of interest. Research such as mouse or rat.
  • the study on which the present invention is based is the first study that establishes differences between two different parts of the same brain in ischemic animals, analyzing the ipsilesional zone (the one corresponding to the hemisphere in which the peri-infarction region, which is the area at risk, in which it is necessary to induce neurorreparation processes) and the contralateral zone (corresponding to healthy tissue, which is in the other hemisphere) and that this has great interest from the point of diagnostic and therapeutic design view.
  • twilight zone The only studies that have a certain relationship with this comparative analysis performed by the authors of the present invention are those referred to the so-called twilight zone. But the twilight zone, as previously discussed, has less relation to the real situation of a patient in whom a cerebral infarction would have occurred, since the concept of twilight responds to an area that has a rapid expiration in time. Thus, the fact that the authors have carried out studies 48 hours after the injury is a significant difference with respect to the previous studies, with respect to those that supposes a great advantage, since it makes it possible to carry out studies and draw conclusions. about the therapies to be applied afterwards as it had been done until now, which was a few hours after the cerebral infarction.
  • the spatio-temporal study of the expression of the HSP72 form disclosed in the present invention demonstrates that the liposomes of the present invention allow Perform studies on the peri-infarction region for a wide period of time since the ischemic stroke occurs, and can be carried out, for example, in the interval between 12 hours and 7 days from the stroke. It is a remarkable fact that there are differences in the expression of the HSP72 protein between the peri-infarction zone and the ischemic nucleus, not only in the acute phase of the stroke (less than 24 hours after the injury occurs) but, especially, that the expression of HSP72 remains high and detectable after 48 hours from the induction of the lesion and even after 72 hours, which may have a relevant clinical utility.
  • the invention relates to a liposome based on 1,2-Diestearoyl-sn-Glycerol-3-phosphocholine (DSPC), cholesterol, l, 2-Diestearoyl-sn-Glycerol-3-phosphetranolamine-N - [Methoxy (polyethylene glycol) -2000] (PEG2000-DSPE) and maleimide- PEG2000-DSPE, characterized in that the liposome has antibodies directed against the 70 kDa thermal shock protein (anti-HSP70) bound to the liposome by the maleimide group.
  • DSPC 1,2-Diestearoyl-sn-Glycerol-3-phosphocholine
  • cholesterol 1,2-Diestearoyl-sn-Glycerol-3-phosphocholine
  • PEG2000-DSPE 2-Diestearoyl-sn-Glycerol-3-phosphetranolamine-N - [Methoxy (polyethylene glycol) -2000]
  • Preferred embodiments of the invention are those in which the molar ratios between DSPC and cholesterol in the liposomes vary between 2.5: 1 and 1.5: 1, as well as those in which the molar ratio of total phospholipids with PEG2000- DSPE in its composition varies between 0.05: 1 and 0.25: 1.
  • Liposomes are especially preferred in which the DSPC: cholesterol: PEG2000-DSPE ratio is 0.62: 0.33: 0.05, because The present inventors have proven their usefulness in providing neuroimaging of the brain in the Examples shown below in the present invention.
  • the maleimide-PEG2000-DSPE it is preferred that the maleimide-PEG2000-DSPE be in a 2.5 molar proportion with respect to the total phospholipids with PEG2000-DSPE.
  • the most preferred size is the average size of 100 nm, the diameter may be in the range of 45 to 450 nm, although more preferably in the range of 90 to 140 nm.
  • the liposome comprises phospholipids that have a fluorophore compound attached, preferably by rhodamine
  • Said rhodamine may be part of the liposome, for example, as 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycerol-3-phosphoethanolamine-N- (Lysamine Rhodamine B Sulfonyl) (rhodamine-PE), as in liposomes used in Examples 3 and 6 of this application.
  • Liposomes can also comprise as part of their structure phospholipids comprising a gadolinium salt.
  • Said gadolinium salt can be, for example, the salt of diethylenetriaminepentaacetic acid a, üJ-bis (8-stearoylamido-3,6-dioxaoctylamide) gado linio (Gd-DTPA-SADA) or, the gadolinium salt of acid 1 , 2- dimiristoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine-N-diethylenetriaminepentaacetic acid (PE-DTPA-Gd), with preference for the latter.
  • P-DTPA-Gd 2- dimiristoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine-N-diethylenetriaminepentaacetic acid
  • the liposomes have a double dizziness, as they comprise in their structure both a fluorophore and a gadolinium salt. These liposomes will have the advantage of being more versatile, as they can be used in both fluorescence and magnetic resonance studies.
  • the presence of the aforementioned marker molecules allows a very simple identification of the cells that overexpress HSP70, which will be those to which the liposome will bind, which it will penetrate them, leading to an increase in the concentration of the marker molecule in the cell: the fluorophore or gadolinium salt, having special interest in those liposomes with antibodies capable of recognizing the inducible form, HSP72, and which will recognize the cells that express it.
  • the detection of the corresponding signal will identify the cells that overexpress the heat shock protein as those in which the signal obtained corresponds to a higher concentration in the cell of the marker molecule.
  • the invention in a second aspect, also refers to the use of the liposomes of the invention for the in vitro identification of cells in which the HSP70 protein is overexpressed, especially with regard to the cells in which it is overexpressed the HSP72 form.
  • the detection of the fluorescence signal in the use of the present invention will identify the cells that overexpress said thermal shock protein as those in which the signal of fluorescence is higher.
  • the cells come into contact with the liposomes in vitro, after a simple incubation of the cells (10 'to 1 hour) with the liposomes, it is enough to observe the samples under a fluorescence microscope and the simple detection of said signal of Fluorescence, using the appropriate wavelength according to the fluorophore used, allows to easily identify the cells that overexpress the protein recognized by the antibodies present in the liposome, such as the cells in which the fluorophore fluorescence signal in the liposomes is greater than the signal from the rest of the cells present in the sample
  • liposomes after anchoring to the cell surface, are mostly incorporated into the cell cytoplasm by endocytosis-type mechanisms and / or membrane liposome membrane fusion with cell membrane; after transfection of the cells with the liposomes, the fluorescent particles would remain inside the cell, along with the liposomes; therefore, the detection sensitivity can be expected to be higher than with current immunohistochemical techniques.
  • the injection of liposomes into a live animal would allow the in vivo tissue to be marketed, tissue that could subsequently be extracted and processed ex vivo, contrary to what is done in conventional histology, where the whole process is ex vivo.
  • the expression "contacting the cells with the liposomes” should be understood to encompass both the cases in which the cells are incubated with the liposomes in vitro and those cases in which contact occurs in vivo, because the liposomes reach the corresponding cells while they are still part of a live animal to which the liposomes have been injected.
  • the tissue sample containing the cells to be analyzed will be taken from the animal once they have already come into contact with the liposomes and have been able to incorporate them.
  • liposomes comprise phospholipids comprising a gadolinium salt
  • the cells in which HSP70 preferably, specifically, the inducible form HSP72
  • the decrease will be proportional to the concentration of gadolinium present in the cells, so the cells with more gadolinium will be the ones that present the greatest decrease in the time of relaxation IT: the more gadolinium there is in the cells , greater contrast.
  • the liposomes of the invention can be carried out both for cell cultures or for tissue samples, such as brain tissue, where the area of cells that overexpress HSP70 (or, preferably, specifically, the inducible form HSP72 ) would be identified as the cells that would make up the peri- infarction region.
  • HSP70 or, preferably, specifically, the inducible form HSP72
  • the use of the liposomes of the invention makes it possible to identify the peri- infarct region in brain tissue samples. Since the necessary treatment for the application of the samples does not affect future proteomic studies and the greater security in the identification of the peri-infarction area, they represent a great advantage over the current methodologies.
  • the liposomes of the present invention are useful for obtaining magnetic resonance imaging of the brain of animals, not only when said liposomes are administered directly to the brain, but also when administered by systemic route (intravenous injection, for example) allowing the identification of areas in the brain.
  • the fact that they present anti-HSP70 antibodies (preferably, specific against HSP72) on their surface results in a greater accumulation thereof in the areas where said HSP70 protein overexpresses (or, preferably, the HSP72 form). Therefore, these liposomes must accumulate to a greater extent in the peri-infarction area.
  • the use of the liposomes of the invention that contain gadolinium salts in their composition makes it possible to obtain neuroimaging in which the peri-infarction region can be identified, as there is a greater accumulation of HSP70 protein (and, in particular, of the HSP72 form thereof).
  • This determination of the peri-infarction zone may be useful in deciding the most appropriate treatments to provide an individual who has suffered a cerebral infarction, facilitating the decision of whether or not to administer a thrombolytic treatment.
  • liposomes with structures similar to the liposomes of the present invention are capable of crossing the blood brain barrier, even when they are coupled antibodies, the liposomes of the invention do not need direct administration to the Central Nervous System in order to obtain images thereof, as demonstrated in Example 6, but may cross the blood brain barrier when administered by a simpler way of using and less traumatic for the patient, such as the systemic route (intravenously, for example). Therefore, the liposomes of the invention are especially interesting for the determination of the peri-infarct area present in an individual from magnetic resonance neuroimaging taken from it. From these neuroimaging, the extent of the peri-infarction area can be determined. This determination, once made, can be used to decide whether or not to administer thrombolytic treatments according to their extension.
  • a further aspect of the invention would be a method for the determination of the peri-infarction region of an individual from magnetic resonance neuroimaging taken therefrom comprising the following steps:
  • composition comprising liposomes of the invention labeled with a gadolinium salt
  • c) identify as a peri-infarct region the region of neuroimaging that corresponds to the lowest relaxation times.
  • the liposome composition would be administered systemically.
  • the individual is a mammal that has suffered an ischemic stroke, with particular preference for humans.
  • the magnetic resonance images are obtained, for example, in the range of 12 hours to 7 days since it was produced.
  • Ischemic stroke They can be obtained within 24 hours after the ischemic stroke occurred or, also, between 24 and 72 hours after the ischemic stroke occurred, such as, for example, after 48 hours.
  • the form of the HSP70 protein that has demonstrated special utility as a marker of the peri-infarction region is the HSP72 form
  • special preference is given that, in any of the embodiments of the method of the invention, liposomes are delivered to the individual. contain antibodies capable of recognizing HSP72, with particular preference for specific antibodies against it.
  • Fig. 1 Representative scheme of the brain regions selected for proteomic analysis: peri-infarction region and contralateral region.
  • Fig. 2 Two-dimensional electrophoresis gel fragments of the proteins of the insoluble fraction of brain samples of the cerebral infarction model, corresponding to the peri-infarction (left column) and contralateral (right column) regions.
  • Fig. 3 Graphical representation of protein expression between the contralateral (0) and peri-infarction (1) regions of the differential spot S3716.
  • Fig. 5 Transmission electron microscope image (cryo-TEM image) of base liposomes for the liposomes of the invention
  • Fig. 6 Liposome size distribution determined by dynamic laser light scattering techniques (DLS).
  • Fig. 7 Results observed in trials performed with gadolinium liposomes.
  • Panel A Variation of the relaxivity (inverse of the relaxation times) of the liposome solutions of different composition (different amount of Gd lipids incorporated in the membranes), depending on the total concentration of gadolinium.
  • Panel B TI and Rl maps of a rat brain (in vivo) obtained from images of different IT weights. The letters indicate the injection site of the four formulations prepared.
  • Fig. 8 Schematic representation of the performance of vectorized liposomes.
  • A Vectorized liposomes against cells that do not overexpress the target protein.
  • B When liposomes express the target protein, the liposomes are anchored and incorporated into the cell.
  • C un vectorized liposomes, against cells that overexpress the target.
  • D cells without liposomes in the middle.
  • Fig. 9 Images obtained in a fluorescence microscope showing the signal obtained at 30 minutes (left column) or after 1 hour
  • HSP70 and HSP70 (-) indicates absence of said induction.
  • Panel A HSP70 (+) astrocytes transfected with liposomes with anti-HSP70 antibodies.
  • Panel B HSP70 (+) astrocytes transfected with liposomes without anti-HSP70 antibody.
  • Panel C HSP70 (-) astrocytes transfected with liposomes with anti-HSP70 antibody.
  • Panel D HSP70 (-) astrocytes transfected with liposomes without anti-HSP70 antibody.
  • Fig. 10 Results of the magnetic resonance studies carried out with the astrocytes of Fig. 9, a control group is also shown.
  • Panel A magnetic resonance images obtained with each of the cultures.
  • Panel B IT relaxation time values, expressed in seconds, observed in each group of cells.
  • Liposomes H02 or regular LIPO control liposomes (without anti-HSP70 antibody)
  • Fig. 11 Results of the MRI studies carried out with endothelial cells in which (HSP70 (+)) or not (HSP70 (-)) was induced the expression of HSP70 thermal shock protein, while "anti -HSP70 "indicates that the liposomes used were coupled with an antibody directed against the HSP70 protein.
  • Panel A magnetic resonance images obtained with each of the cultures.
  • Panel B IT relaxation time values, expressed in seconds, observed in each group of cells.
  • Liposomes H02 or regular LIPO control liposomes (without anti-HSP70 antibody)
  • Fig. 12 Western blot of tissue from the region contralateral to the lesion.
  • - Fig. 12a Photograph of the bands obtained in the Western Blot. Lanes: healthy tissue (a), tissue from the peri-infarction region (b) and tissue from the area of the ischemic lesion
  • Fig. 13 Immuno-histological study of ischemic rat brain tissue.
  • the photos correspond to the side of the brain contralateral to the lesion (A), peri-infarction area (B) or the nucleus of the lesion (C).
  • - Fig. 13b Immuno-histochemical study of HSP72 protein (ENZO) expression in brain tissue.
  • A Negative control.
  • B Zone contralateral to the lesion (healthy tissue).
  • C Peri-infarction zone, and
  • D core area of the ischemic lesion.
  • Fig 14a Immuno-histochemical study of HSC70 and HSP72 protein expression.
  • A-C expression of GFAP (astrocytes), in healthy tissue (A), peri-infarction (B) and nucleus of injury (C).
  • the solid line marks the limit of GFAP expression, which separates the nucleus from the peri-infarction region.
  • D-F staining of HSP72 in the same areas. The protein is specifically expressed in the area that borders the lesion (peri-infarction area).
  • G-I staining of HSC70 in the same areas, showing the constitutive expression of this protein in all tissue areas.
  • the expression in the peri-infarction zone (H) is slightly higher than the other zones.
  • Fig. 14b Magnetic Resonance Imaging showing the lesion in vivo, prior to the extraction of the animal's brain.
  • Fig. 15 Photographs obtained after double immuno-fluorescent staining of GFAP-positive cells (green in the original) and HSP72 positive cells (red in the original) in the peri-infarction area.
  • Top row healthy tissue (contralateral); intermediate row: nucleus of the lesion; lower row: peri-infarction zone.
  • Left column staining for HSP72 positive cells, with the typical morphology of neurons, in which no expression is observed in the contralateral area (upper photo of the series).
  • Second column staining for positive GFAP cells, that is, astrocytes, in this case absent in the area of the ischemic nucleus (photograph of the intermediate row).
  • FIG. 16 Two-dimensional Western-blot studies in which the expression of HSP72 protein (only in the peri-infarction zone) was determined by separating it from the HSC70 protein by its different isoelectric point. ⁇ -Actin (bands located on the right) was used as a positive charge control in both tissues (peri-infarction and contralateral).
  • Fig. 17 Coronal section of a rat brain located in the spatial position
  • Bregma +0.5 (according to the anatomical atlas of Paxinos and Watson: (The rat brain in stereotaxic coordinates. 4th ed. George Paxinos and Charles Watson. Elsevier, New York, 2004.), corresponding to the section of brain tissue selected in each rat for the immuno-histochemical analysis (panel A), next to it (panel B), an MRI image of a typical ischemic lesion caused by the surgical model used, zones 1 and 3 are usually considered peri-infarction zone, while the 2 and 4 are usually core areas of injury.
  • Fig. 18 Density of cells labeled for HSP72 in cell tissue.
  • Upper graph (A) averaged cell density in the total of the 4 zones analyzed.
  • Lower graph (B) cell density in the peri-infarction zone (zones 1 and 3: first bar of each couple) and in the area of injury (zones 2 and 4: second bar of each couple).
  • Fig. 19 Pseudo-color maps of the density of cells expressing HSP72 at different times after cerebral ischemia, superimposed on an MRI image of the cerebral cut in which they have been calculated. Next to the density maps, the immuno-histochemical micrographs for the area named 1 are presented in Fig. 17.
  • Fig. 20 Images obtained in a fluorescence microscope showing the signal obtained at 30 minutes (left column) or after 1 hour (right column) of astrocyte incubation with liposomes, under different conditions, in which HSP72 (+) indicates prior induction of HSP72 protein expression and HSP72 (-) indicates absence of said induction.
  • Panel A HSP72 (+) astrocytes transfected with liposomes with anti-HSP72 antibodies.
  • Panel B HSP72 (+) astrocytes transfected with liposomes without anti-HSP72 antibody.
  • Panel C HSP72 (-) astrocytes transfected with liposomes with anti-HSP72 antibody.
  • Panel D HSP72 (-) astrocytes transfected with liposomes without anti-HSP72 antibody.
  • Fig. 21 Results of the MRI studies carried out with the astrocytes of Fig. 20; a control group is also shown.
  • Panel A magnetic resonance images obtained with each of the cultures.
  • Panel B values of IT relaxation time, expressed in seconds, observed in each group of cells.
  • Lipos H02 or regular LIPO control liposomes (without anti-HSP72 antibody).
  • Fig. 22 Results of the MRI studies carried out with endothelial cells in which (HSP72 (+)) or not (HSP72 (-)) was induced the expression of HSP72 heat shock protein, while "anti -HSP72 "indicates that the liposomes used were coupled with an antibody directed against the HSP72 protein.
  • Panel A magnetic resonance images obtained with each of the cultures.
  • Panel B IT relaxation time values, expressed in seconds, observed in each group of cells.
  • Lipos H02 or regular LIPO control liposomes (without anti-HSP72 antibody).
  • Fig. 23 Representative scheme of the experimental procedure followed to check the ability of liposomes with antibodies against HSP72 protein to detect the peri-infarction area.
  • MCAO permanent occlusion of the middle cerebral artery in rat; IHC: histological study. The times of injection of the liposomes from the moment the MCAO was performed (second line of the scheme) are indicated, as well as the moments at which magnetic resonance imaging (MRI) was also taken with respect to the time of realization of the MCAO (third line of the scheme).
  • MRI magnetic resonance imaging
  • MRI Magnetic Resonance Imaging
  • Relaxivity is enhanced by the presence of gadolinium-doped liposomes, (d) pseudo-color image of the Rl relaxivity map, in which the area of accumulation of gadolino-doped liposomes has been enlarged (red in the original, darker in the figure), (e) Image composed of photographs taken in the liposome accumulation zone by means of a fluorescence microscope, showing the signal produced by the liposomes, doped with rhodamine.
  • the project for the synthesis of vectorized nanoparticles towards the peri- infarction region was based on the identification of a marker of said region in a rat cerebral ischemia model.
  • the model of cerebral infarction (cerebral ischemia) was called pMCAO: permanent occlusion of the middle cerebral artery in rats. 1.1. Infarction model generation
  • the animal After closing the incision, the animal was placed on its right side to make a cut from the end of the left ear to the corner of the eye, exposing the temporal muscle that retracted to expose the bone.
  • MCA middle cerebral artery
  • Betadine and lidocaine were applied as a topical analgesic.
  • the animals were sacrificed by introducing them into an anesthesia cabinet with 5% isoflurane, and the brain was removed. A cold phosphate buffer was applied to the brain to clean and cool it and it was cut into 2 mm thick sheets. 1.2. Staining of brain samples and selection of the peri-infarction zone
  • TTC tetrazolium chloride
  • the dyed sheets were observed under a microscope by placing a ruler near them, taking pictures of each cut. Each sheet was turned with the help of two spatulas and the cuts were photographed again.
  • the infarct volume measurement was performed using Image J software, drawing on each image, using the StraightLine tool, a line that covered 5 mm. The contour of the infarction was drawn using the Polygon tool, then measuring its area using the Measure function. Once the process was carried out in all the cuts, the data was copied into an Excel sheet and the areas were added to obtain the infarct volume.
  • TTC assuming that said region comprises a 2 mm line of healthy tissue adjacent to the infarcted tissue.
  • the contralateral region was selected considering that it includes a 2 mm line of contralateral healthy tissue exactly symmetrical to the peri-infarcted region. An outline of the selected regions can be seen in Fig. 1.
  • the infarction area was removed and a 2 mm thick strip was cut around the infarction (peri-infarction).
  • the contralateral side was removed from the opposite side of the brain, a fragment symmetrical to the infarct, which was discarded, and a symmetric fragment to the peri-infarction, which was conserved as contralateral tissue.
  • Example 1 The fundamental objective sought in the trials described in this Example 1 was the identification of a marker of the peri-infarction zone, but it was considered that it would be It is very useful that the marker was a membrane protein, so a subfractionation strategy was carried out consisting of separating the proteins into three fractions: membrane fraction, soluble fraction and insoluble fraction. Of these, the best result was that of the insoluble fraction (liposoluble).
  • eppendorf tubes were prepared with 2 ml of extraction buffer I of the cold ProteoExtract Native Membrane protein extraction kit (Calbiochem) commercial kit (4 ° C) and 10 ⁇ of proteases inhibitors at room temperature and subfractionation was initiated .
  • the tissue was homogenized with liquid nitrogen and mortar, preventing the tissue from thawing.
  • the homogenate was taken with a previously cooled spatula and thrown into the tube with extraction buffer I. It was incubated with stirring at 4 ° C for 10 minutes. After these, it was centrifuged at 16,000 xg for 15 'at 4 ° C.
  • the supernatant was separated to a tube with the label: "soluble” which was frozen, and the pellet was redissolved with 1 ml of cold extraction buffer II from the same commercial protein extraction kit (4 ° C) and 5 ⁇ of inhibitors of proteases. It was incubated for 30 'with stirring at 4 ° C. It was centrifuged at 16000 xg for 15 'at 4 ° C. The supernatant was separated to a tube with the label: "membrane”. The supernatant and pellet (which constituted the insoluble fraction) were frozen.
  • the membrane and soluble samples were thawed and concentrated in centricon tubes (millipore) by centrifugation from 45 'to 14000 xg, until the volume of each tube was 500 ⁇ or less. Then 1.5 ml of cold acetone was added, it was incubated 2 hours at -20 ° C and centrifuged at 14,000 rpm at 4 ° C for 45 '. The supernatant (acetone) was discarded and the pellet was redissolved in 100 ⁇ lysis buffer (7M urea, 2M thiourea, 4% CHAPS, 3% DTT) with stirring for 1 hour at 29 ° C. The amount of protein was then calculated using the modified Bradford method (10 ⁇ of each unknown standard or sample, with 10 ⁇ of 0.1 N HC1 and 200 ⁇ of Bradford reagent).
  • the plate was placed in the PROTEAN IEF CELL (Bio Rad), PRESET METHOD was selected, doing an active rehydration at 50 V for 12 hours, and then applying a voltage of 500 V for 15 'and then applying a voltage of 10,000 V until reaching 30,000 Vh. The last step was 10,000 V to reach a voltage of 27,000 V. In this way the accumulated voltage was 57,000 Vh.
  • the strips can be frozen at -20 ° C or equilibrated. Balancing is a process whereby proteins are negatively charged. This ensures that the separation in the second dimension will be carried out by molecular weight and not by load.
  • the IPG strips are placed with the gel facing up on the balancing trays and 7 ml of DTT equilibration solution is added (50 mM Tris, 6M urea, 30%> glycerol, 2%> SDS , 10 mg / ml DTT), incubating at room temperature for 15 '.
  • iodoacetamide 50 mM Tris, 6M urea, 30% glycerol, 2% SDS, 25 mg / ml iodoacetamide is added, incubating another 15 'at room temperature.
  • Second dimension Once the strips are balanced, the second dimension can be loaded or the strips can be frozen at -20 ° C. To carry out the second dimension, the previous day must be left gels 2 a dimension made. Depending on the number of gels that were wanted to run, Protean XII from Bio Rad (2 gels) or GE ETTAN-SIX (6 gels) was used. The gels were prepared following the following recipes:
  • the IPG strip attached to the large glass was placed on the 12.5% acrylamide gel>.
  • the strip was sealed with sealing solution (0.5% agarose in electrolyte IX with traces of bromophenol), then the crystals were placed in the second dimension housing, electrolyte IX (50mM Tris, 384mM glycine, 0.2% SDS) was added in the lower reservoir to the mark and then added (to same time) electrolyte IX in the lower reservoir and 2X electrolyte to the upper reservoir until the two levels were at the same height and between the maximum and minimum levels.
  • the cooling source was then connected at 25 ° C and the power supply was connected.
  • a program was applied to keep the work constant 5 W / gel for 15 'and then at 15 W / gel the time necessary for the bromophenol front to reach the end of the gel. When the front reached the end of the gel, the electrophoresis was stopped and the gel stained.
  • Fig. 3 shows the difference in expression of spot S3716.
  • Fig. 4 shows the mass spectrum of spot S3716 and the corresponding identification, which in this case corresponded to a heat shock protein, the "heat shock protein" of 70 kDa 1A / 1B (HSP70).
  • the developed liposomes participate in cell recognition processes with the cells that are expressing the target marker, it is a requirement that the proteins to be recognized by the antibodies bound to the liposomes are present in the cell membrane, either because they are a constitutive part of it, or because they are associated with the plasma membrane at least at some point in its cycle.
  • the HSP70 protein fulfills that requirement, because in certain occasions it can appear anchored to the membrane.
  • the liposomes used in the present invention are based on the phospholipid l, 2-Diestearoyl-sn-Glycerol-3-phosphocholine (DSPC) and cholesterol, in portions ranging from 2.5: 1 to 1, 5: 1. To these a ratio of 0.05: 1 to 0.25: 1 of l, 2-Diestearoyl-sn-Glycer-3-phosphetranolamine-N- [Methoxy (polyethylene glycol) - 2000] (PEG2000-DSPE) is added for the purpose that PEG chains mask liposomes to the immune response of organisms in vivo and thus facilitate long residence times in the bloodstream in vivo.
  • PEG2000-DSPE 2-Diestearoyl-sn-Glycerol-3-phosphocholine
  • the film rehydration method was used in which the components are mixed in a solid state in the appropriate proportions and then dissolved in a chloroform / methanol mixture of 1: 1 to 1.5: 1 (v: v). The solution was evaporated to dryness in a rotary evaporator at 313 K. Once the organic solvents had evaporated and a film formed at the bottom of the rotary evaporator balloon, the mixture was redissolved in HBS (20 mM HEPES Buffer Solution, NaCl 135 mM, pH 7.4, Sigma-Aldrich).
  • the resulting suspension was passed 4 to 6 times through an extruder with 200 nm pore polycarbonate membrane filters and then passed 8 to 14 times through 100 nm membrane pore filters.
  • the entire extrusion process was carried out at 333 K.
  • an HBS solution of spherical liposomes of size around 100 nm was obtained, as can be seen in Fig. 5, obtained with an electron microscope of transmission, and in Fig. 6, a graph with the size distribution of the liposomes, in which it is seen that the diameter thereof ranges between 45 and 450 nm, the average size being 100 nm.
  • the next step consisted of the synthesis of bimodal contrast probes for molecular imaging.
  • the base liposomes mentioned above were taken as a base and during the preparation phase they were added (Rodamine-PE). These rhodamine phospholipids become part of their membrane, which gives the liposome set the fluorescence capacity.
  • molecular probes allow the detection of liposomes by magnetic resonance.
  • a magnetic resonance contrast agent specifically based on gadolinium
  • these liposomes can be used to be administered to living individuals and, since they cross the blood brain barrier, they can be used to obtain magnetic resonance images of their brains. This is because, although free gadolinium cannot be administered to humans, chelated gadolinium does not pose risks, so its administration is permissible, and in fact, it is one of the usual contrast agents used in MRI studies. in clinical practice.
  • liposomes loaded with gadolinium are obtained from liposomes already labeled with rhodamine, liposomes with double functionality are obtained, which can be detected by fluorescence studies (which will be especially indicated for ex vivo studies, where said fluorescence is easy to detect) and in vivo studies, after providing liposomes to an individual, detecting their presence and location by magnetic resonance imaging.
  • fluorescence studies which will be especially indicated for ex vivo studies, where said fluorescence is easy to detect
  • in vivo studies after providing liposomes to an individual, detecting their presence and location by magnetic resonance imaging.
  • the anchored protein was an anti-HSP70 antibody, specifically the HSP-70 Antibody Rabbit Polyclonal, of Abbiotec, which recognizes the HSP70 of humans, mice and rats.
  • Vivaspin TM 50,000 (Sartorius Stedim Biotech) soaking it once in 1 ml of buffer (3000g, 5 min)
  • the liposome suspension can be washed twice by means of ultra-centrifugation at 55000-65000 rpm for 45 minutes.
  • the desired lipid concentration can be obtained by resuspending the lipid pellet in a specific amount of buffer with the desired pH.
  • liposomes were synthesized that in PEG chains with termination in maleimide, covalently bound an anti-HSP70 antibody (HSP-70 Antibody Rabbit Polyclonal, from Abbiotec, which recognizes HSP70 from humans, mice and rats), and They were marked with gadolinium and rhodamine.
  • HSP70 Antibody Rabbit Polyclonal from Abbiotec, which recognizes HSP70 from humans, mice and rats
  • rat primary astrocyte cultures overexpress significant amounts of HSP70 protein when subjected to thermal shock (Freitas et al., 2002).
  • thermal shock Two plates of rat astrocytes were prepared until they reached 70-80% confluence. One of the plates was subjected to thermal shock, placing it for 30 minutes in an incubator at 42 ° C. The second plate (control) was maintained under normal culture conditions (incubator at 37 ° C). After the stress period, the first plate was returned to the original incubator (37 ° C) and both plates were kept in it for a recovery period of 6 h.
  • astrocytes were transfected with liposomes, adding 10 ⁇ of H02 liposome solution (with maleimide, but without antibody, negative control) or anti-HSP70 (vectorized liposomes with anti-HSP70 protein) per well (containing 200 ⁇ of culture medium each), achieving a total lipid concentration of 15 mM per well (12 wells in total), according to the following scheme:
  • the astrocyte plates were washed (3 times each with culture medium) and it was observed if cell transfection with liposomes had occurred by means of a fluorescence microscope (rhodamine is present present in liposomes). The observation of the astrocytes under the microscope allowed to obtain the images shown in Fig. 9
  • astrocytes were observed under a microscope, they were treated with acutase (200 ⁇ ) to detach them from the culture plates and were taken to 0.5 ml Eppendorf tubes. These tubes were taken to the MR imaging equipment to characterize their relaxation times. Since liposomes contain gadolinium, it is expected that the greater the amount of liposomes present in the cells (at that time already in the Eppendorf tubes), the shorter the relaxation times observed. As a control, astrocytes were studied to which no liposomes were added.
  • the experiment was repeated with cultures of rat micro-endothelial cells.
  • An experimental procedure identical to the previous one was performed except that the induction of HSP70 expression in these cells was performed by subjecting them to 45 ° C for 15 minutes (respecting a recovery period of 6 h post-thermal shock).
  • the cells were transfected again with liposomes (10 ⁇ of solution of liposomes H02 or anti-HSP70 per well containing 200 ⁇ of culture medium each, achieving a total lipid concentration of 15 mM per well).
  • liposomes (10 ⁇ of solution of liposomes H02 or anti-HSP70 per well containing 200 ⁇ of culture medium each, achieving a total lipid concentration of 15 mM per well.
  • As the endothelial cells were more sensitive than astrocytes, they were lifted from the plates during manipulation, so it was not possible to observe their fluorescence under a microscope.
  • the contents of the wells were transferred to Eppendorf tubes and centrifuged (5 min, 3000 rpm). The supernatant was removed and the cells washed with medium. The centrifugation process, supernatant removal and washing with medium was repeated 3 times. The resulting cell pellets (which must contain gadolinium of the liposomes if there has been transfection) in culture medium, were analyzed by MRI, obtaining the corresponding relaxation times.
  • a male rats (250-300 g weight) of the Sprague Dawley strain are taken and after inducing anesthesia in an induction box under 6% sevofluoran atmosphere, it is transferred to the surgery table where sevofluoran anesthesia is continued at 3% with a gas stream N 2 0: 0 2 in 65:35 proportions and ischemia induction surgery using the permanent suture model of the middle cerebral artery.
  • sevofluoran anesthesia is continued at 3% with a gas stream N 2 0: 0 2 in 65:35 proportions and ischemia induction surgery using the permanent suture model of the middle cerebral artery.
  • an incision is made ventrally in the neck, about 3cm in length, above the sternum. After removing the omioid muscle, the left common carotid artery is dissected and then ligated with a double 4/0 suture.
  • the animal After closing the incision, the animal is placed on its side (right in this case) to make a cut from the end of the left ear to the corner of the eye, exposing the temporal muscle that retracts to expose the bone.
  • the meninges After performing a trephine in it using a microsurgery lathe, the meninges will be removed and the middle cerebral artery (ACM) is isolated. With a hook located in a micromanipulator, the artery is slightly lifted away from the cerebral parenchyma and sutured with a 10/0 silk making a double loop.
  • ACM middle cerebral artery
  • the animal is returned to its cage to recover from anesthesia and allowed to stand, with water and food ad limitum, for 48 hours.
  • the animal that has been induced an ischemic lesion 48 hours before, anesthesia is induced with Sevoflurane (3% in N 2 0: 0 2 in 65:35 proportions) and an Insyte Autogard catheter of 22 G (of the commercial house BD) in one of the two veins of the tail, interchangeably. If it is necessary to dilate the vein, an elastic band can be placed in its upper part to compress it during insertion of the catheter.
  • a 1-ml syringe containing 0.5 ml of anti-HSp70 liposome solution (Hepes Buffer Solution, HBS vehicle, concentration 100-300 mg lipids / kg animal weight) is then connected to the catheter and the animal is introduced into the resonance magnetic
  • This image is the baseline image with the relaxation times of brain tissue (healthy and ischemic) before injecting liposomes. Once this is done, the liposome is injected into the animal's tail and is expected to circulate through the bloodstream.
  • the set of images with IT weight mentioned above is repeated 1 h after injection and repeated at 6, 12 and 24 h (after 1 h post injection and after each session that follows the animal is removed from the resonance and returned to its cage to recover).
  • the entry of gadolinium-labeled liposomes can be followed, observing that their accumulation in the peri-infarction zone causes the IT relaxation times in said area of the tissue to decrease significantly, which allows it to be distinguished from the rest of the tissue ( both healthy and core of the ischemic lesion).
  • MCA left middle cerebral artery
  • MCA middle cerebral artery
  • the MCA is retracted from the surface of the brain by means of a Sinskey hook connected to a micromanipulator (World Precision Instruments Inc., FI , USA) and the artery was ligated with a 10-0 Ethilon suture (polyamide 6 from Ethicon Inc, NJ. USA).
  • the hook was removed leaving the artery back on the brain surface, and the absence of flow Blood was visually confirmed by a surgical magnifying glass.
  • the temporal muscle was repositioned, and a suture was performed to close the area of surgery. The entire procedure was carried out after the previous suture of the ipsilateral carotid artery.
  • the animals were sacrificed 48 h after induction of ischemia.
  • the animals were subjected to intracardiac perfusion with 100 ml of PBS at pH 7.4, followed by 300 ml of 4% formaldehyde and pH 7.4.
  • the brains were carefully removed, and post-fixed in 4% formaldehyde overnight.
  • the brains were cryoprotected with 20% sucrose in PBS at 4 ° C for an additional 24 hours, and finally embedded in O.C.T., and quickly frozen in liquid nitrogen-cooled 2-methylbutane. Brains were stored at -80 ° C until use.
  • the first step was the development of Western-blot techniques for HSP70 protein (adequate concentrations of antibodies, concentration of base gels, etc.), using rat brain samples, stored at -80 ° C, obtained from animals slaughtered 48 hours after being subjected to permanent cerebral ischemia, by means of a suture of the middle cerebral artery.
  • Tissue homogenization was performed in 0.5 ml of the "Cell Extraction Buffer” extraction buffer (Invitrogen) by sonication (50 pulses at 100% intensity and with 0.5 intervals). Samples were centrifuged at 18,000 xg to remove cell debris and the supernatant was collected. The protein concentration of the supernatant was calculated by the Bradford method and the samples were diluted with "Cell Extraction Buffer” to reach a concentration of 2 mg / ml. A 1: 1 dilution of part of the sample was then made with Laemmli Buffer 2X (Laemmli et al., 1970) (purchased from Santa Cruz Biotechnology, Inc, catalog number: sc-286962).
  • Laemmli Buffer 2X Laemmli et al., 1970
  • the samples were shaken at 99 ° C for 5 minutes.
  • the electro foresis was carried out in acrylamide gels with 10% separating gel and 5% concentrating gel, applying a constant voltage of 120 V until the bromophenol front (progression staining dye) reached the end of the gel .
  • 0.75 mm thick gels were loaded, with 10 wells each. In each of the gels one of the wells with molecular weight marker was loaded. Then an empty well was left and in the rest of the wells, the contralateral region and the infarction region alternated.
  • the load was approximately 20 micrograms of protein (20 microliters of sample), per well.
  • the gels were cut, leaving in each one a sample of contralateral region and a sample of peri-infarction region.
  • the proteins were transferred to PVDF membranes in a "Semy-Dry" system by applying a voltage of 15V for 30 minutes.
  • the membranes were blocked in 5% milk powder dissolved in TBS for 2 hours, washed 3 times in TBST for 5 minutes each of the washes and incubated with HSP70 primary antibodies (Ab5439 from Abcam, Cambridge, UK) .
  • HSP70 primary antibodies Ab5439 from Abcam, Cambridge, UK
  • Each of the membranes was simultaneously incubated with actin antibody (Anti-b-actin, Abcam, Cambridge, UK) (antibody that comes from rabbit and, the others from mouse), as a charge control, overnight at 4 ° C.
  • Fig. 12a the results of Western blot obtained for HSP70 can be seen, using actin as a reference, for healthy tissue, tissue of the peri-infarction region and area of the ischemic lesion.
  • Fig. 12b shows a quantification of the Western-blot bands of the previous figure. In view of the figure it could be concluded, in In principle, the results obtained by Western-blot contradict those previous results of Example 1, since the expression of the HSP70 protein in the peri-infarction zone does not seem to be different from the expression in the contralateral region.
  • the brains were cut into sections of 20 ⁇ with a cryostat and the cuts were dried in an oven at 37 ° C, and then stored at -20 ° C until use.
  • the sections were rehydrated in PBS and incubated with 0.3% H202 for 15 min, to block the activity of the endogenous peroxide. After washing the cuts in PBS for three times (5 min), they were incubated in 2%> serum in 0.2%> Triton X-100 PBS for 2 h, to block the nonspecific antibody binding sites.
  • anti-mouse primary monoclonal antibodies HSP70 (Ab5439, 1: 50, Abcam, Cambridge, UK), HSP72 (1: 50, clone C92F3A-5, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY), and ⁇ -Tubulin were used (1: 50, Abcam, Cambridge, UK), and polyclonal primary antibodies of anti albumin sheep (1: 100, Abcam, Cambridge, UK).
  • HSC70 and HSP72 proteins were deepened, through a new experiment with sections of brain tissue of ischemic animals, in which stains were made for GFAP (polyclonal anti-GFAP, Sigma-Aldrich) (of astrocytes, which at 48 after the lesion do not express themselves in the ischemic nucleus, thus delimiting said zone), and also for HSC70 and HSP72 proteins, in consecutive tissue sections.
  • GFAP polyclonal anti-GFAP, Sigma-Aldrich
  • the HSP72 protein (photographs D to F) is expressed exclusively in the peri-infarction zone and is a specific marker of said area: the protein is specifically expressed in the area bordering the lesion. (peri- infarction zone).
  • the use of anti HSC70 antibodies shows constitutive expression in the entire brain tissue, and although there is greater expression in the peri-infarction zone, this protein does not serve as a marker of said area, due to the small difference in expression between the peri-infarction area and the rest of the tissue.
  • HSP72 is very high in the peri-infarction area, and much less in the area of the lesion nucleus, as well as nonexistent in the area of healthy tissue.
  • the fusion of the fluorescence signals of HSP72 and GFAP shows that there is no colocalization of both markers (HSP72 and GFAP), which indicates that astrocytes are not the cell type that is expressing this heat shock protein , HSP72.
  • the morphology of cells expressing HSP72 seems typical of neurons.
  • the animals were subjected to a transient focal ischemia of 90 min by intraluminal collusion of the middle cerebral artery (CMMA), according to the model described by Longa (Longa et al. 1989), slightly modified.
  • CMMA middle cerebral artery
  • the common carotid artery, the left and internal left carotid artery of the animal were isolated from the connective tissue, through a section in the animal's neck.
  • the external branch of the carotid and the pterygopalatine artery with 6-0 suture are ligated, after which a 3-0 nylon filament of about 23 mm in length and with the tip is inserted into the internal branch of the carotid thickened by heat.
  • the filament is advanced through the external-internal, to occlude the origin of the ACM.
  • a doppler probe PeriFlux 5000; Perimed AB, Sweden
  • the intraluminal filament is removed to allow reperfusion of brain tissue (monitored by the doppler probe), the animal is sutured, and this is allowed to recover from surgery.
  • Whole brains extracted from the skull were subsequently post-fixed in 4% formaldehyde and at 4 ° C overnight, and cryoprotected by immersion in 20% sucrose in PBS at 4 ° C for another 48 h. After this period, the brains (cut into 2 mm thick coronal sections) were embedded in O.C.T. and frozen in 2-methyl-butane cooled with liquid nitrogen. Frozen sections were stored at -80 ° C until used in histology.
  • coronal sections of the brain 20 microns thick were cut in a cryotome and dried in an oven at 37 ° C. Until later use, the sections were preserved at -20 ° C. Each section was rehydrated with PBS and incubated in 0.3% H202 for 15 min, to block endogenous peroxidase activity. After three 5-minute washes in PBS, the sections were incubated in 2% serum in 0.2% Triton X-100 in PBS for 2 h, to block nonspecific antibody junctions.
  • the next step consisted of incubation for 1 h with a 1: 100 dilution of avidin-DH and biotinylated peroxidase (Vertor Laboratories, Burlingame, CA), followed by a triplicate washing of the sections with PBS (5 min) and the incubation with 2% diaminobenzidine solution (Dako Diagnnosis, SA, Barcelona) for 2 min. After a new triplicate wash with PBS (5 min), the sections were dehydrated with ethanol solutions in water, of increasing concentration (from 50% to 100%) and washed with xylol. Finally the sections were assembled with entellan, and stored at room temperature.
  • first equivalent brain sections were selected in each of the brains (coronal sections at a distance of approximately Bregma + 0.5, corresponding to the middle area of the typical ischemic lesion caused by the surgical model used), extracted at different times after the induction of ischemia (6, 12, 24, 48 and 72 hours and at 5, 7, 10 and 14 days). In these sections, four different regions were selected, representative of areas of brain tissue usually affected by the surgery performed, as shown in Fig. 17.
  • Table 5 shows the density of positive cells in coronal sections of ischemic animals at different times after the induction of ischemia.
  • the zones named 1 and 3 correspond to the peri-infarction zone and zones 2 and 4 are associated with the nucleus of the lesion, and correspond to the regions presented in Fig. 17.
  • Table 5 Density of cells marked with HSP 72, detected in each of 4 zones marked in Fig. 17.
  • the expression of the chosen marker remains high at 48 h, and in any case, sufficient to be detected by the techniques employed. This confirms the validity of this time point as the time chosen for the initial proteomic study, and a study of the temporal expression profile of one or a few selected proteins. It also confirms that it is a valid time point to identify the peri-infarction area in a patient who has suffered an ischemic attack. In addition, conducting studies of acute protein expression of stroke ( ⁇ 24 h) could have resulted in the identification of markers that were only expressed in that phase.
  • the mean expression of the HSP72 marker (upper graph of Fig. 18) shows a typical evolution profile that indicates that the maximum protein expression point is at 12 h, when it is not only expressed in the peri-infarction zone, but also in areas of tissue corresponding to the ischemic nucleus.
  • This analysis is completed with the from the second graph presented in Fig. 18 where, first, it can be concluded that the expression of the HSP72 protein is greater in the peri-infarct area than in the ischemic core itself. This difference is very clear from the first 24-48 hours, since during the acute phase of the stroke ( ⁇ 24h) there are cells from the area of the ischemic nucleus that still survive, and that express the heat shock protein.
  • the vectorized liposome functionality studies shown in Example 3 were repeated, this time using vectorized liposomes with a specific antibody directed against the HSP72 protein, instead of being vectorized with the polyclonal antibody used in the previous Examples. In this way, the functional utility of the liposomes that carry antibodies directed specifically against the HSP72 protein was definitively validated.
  • vectorized liposomes were prepared following the procedure described in Example 2, particularly in section 2.3, with the difference that, on this occasion, it was used as an anti-HSP72 antibody of clone C92F3A-5, from Enzo Life Sciences Farmingdale, NY (which recognizes human, mouse, rat, bovine, beluga, C. elegans, dog, chicken, Drosophila, fish, gerbil, guinea pig, hamster, monkey, pig, rabbit, sheep, and Xenopus HSP72) .
  • the liposomes obtained were referred to in this case as "anti-HSP72 lipos". With them the tests performed in Example 3 were repeated.
  • rat astrocytes were prepared until they reached 70-80% confluence.
  • One of the plates was subjected to thermal shock, placing it for 30 minutes in an incubator at 42 ° C.
  • the second plate was maintained under normal culture conditions (incubator at 37 ° C).
  • the first plate was returned to the original incubator (37 ° C) and both plates were kept in it for a recovery period of 6 hours, at which time, as already mentioned, rat astrocytes overexpress considerably the HSP70 protein.
  • the culture was used as a model of the peri-cerebral infarction zone.
  • the astrocytes were transfected with liposomes, adding per well 10 ⁇ of the solution of the non-vectorized H02 control liposomes previously described in Example 3, or vectorized with anti-HSP72 (containing 200 ⁇ of culture medium each), achieving a total lipid concentration of 15 mM per well (12 wells in total), according to the scheme shown in the following table:
  • HSP72 (+) is referred to astrocytes subjected to thermal stress (overexpression of the HSP72 protein) and HSP72 (-) to those not subjected to stress thermal:
  • the astrocyte plates were washed (3 times each with culture medium) and it was observed if cell transfection with liposomes had occurred by means of a fluorescence microscope, taking advantage of the rhodamine present in liposomes.
  • astrocytes were observed under a microscope, they were treated with acutase (200 ⁇ ) to detach them from the culture plates and were taken to 0.5 ml Eppendorf tubes. These tubes were taken to the MR imaging equipment to characterize their relaxation times. Since liposomes contain gadolinium, it is expected that the greater the amount of liposomes present in the cells (at that time already in the Eppendorf tubes), the shorter the relaxation times observed. As a control, astrocytes were studied to which no liposomes were added.
  • the experiment was repeated with cultures of rat micro-endothelial cells.
  • An experimental procedure identical to the previous one was performed except that the induction of HSP70 expression in these cells was performed by subjecting them to 45 ° C for 15 minutes (respecting a recovery period of 6 h post-thermal shock).
  • the cells were transfected again with liposomes (10 ⁇ of solution of liposomes H02 or anti-HSP72 per well containing 200 ⁇ of culture medium each, achieving a total lipid concentration of 15 mM per well) and the assay described in section 3.2.
  • MR images were obtained with IT weight of the animals before any procedure, as a control image, and to rule out possible abnormalities before starting.
  • the animals were subjected to a permanent ACM occlusion model by suture, as described for the time-space study of HSP72 protein expression described in Example 5 herein.
  • a series of injections of liposome dissolution in the jugular veins of the animals injections every 6 h alternating the artery, to allow a recovery time of 12 h between injections in the same vein was started .
  • a total of 6 injections of liposomes (25 mM solution) of 1 ml each were made, for a total of 150 micromoles of injected liposomes.
  • RARE factor 4
  • Inversion times (IT saturation-recovery protocol) TR 900, 1500, 3000, 6000 and 9000 ms
  • Field of view FOV 19.2 x 19.2 mm in coronal orientation and 25.6 x 19.2 mm in axial orientation
  • the animals were sacrificed, and the brain was removed for study by ex vivo fluorescence microscopy, as described in the validation section of the HSP72 marker by immunohistochemical technique.
  • Fig. 24 shows representative images of the results obtained.
  • Said Fig. 24 is the demonstration that intravenous injection of liposomes vectorized with HSP72 leads to their accumulation over time in the expression zone of this protein, that is, the peri-infarction zone. After successive injections of these liposomes, their concentration makes it possible to detect them in the MR system of 9.4 Teslas in a non-invasive way.
  • the rhodamine present in the liposomes has also allowed to detect the presence of liposomes in the peri-infarct area by ex vivo studies of the tissue. It can be concluded, therefore, that the diagnostic capacity of vectorized liposomes with anti-HSP72 antibodies for the delimitation of the peri-infarction zone in cerebral ischemia is shown.

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Abstract

Liposomas con anticuerpos contra marcadores de la zona peri-infarto cerebral. La invención se refiere a liposomas, marcados con una sustancia fluorófora como la rodamina o con un agente de resonancia magnética como el gadolinio, que incorporan en su superficie un anticuerpo dirigido contra la proteína de choque térmico HSP70, preferiblemente la forma HSP72, unido al liposoma por un resto maleimida, y que incorporan también en su composición PEG para aumentar su estabilidad y evitar respuestas inmunes. Dichos liposomas se acumulan en las células que sobreexpresan la citada proteína, por lo que sirven para identificar dichas células, incluidas las que forman parte de la región peri-infarto cerebral, en la que se sobreexpresa dicha proteína. Los liposomas con gadolinio puede también utilizarse en un procedimiento para obtener imágenes del cerebro por resonancia magnética a partir de las cuales se puede determinar la región peri-infarto, que será aquella en la que se acumulará más gadolinio (mayor contraste).

Description

LIPOSOMAS CON ANTICUERPOS CONTRA MARCADORES
DE LA ZONA PERI-INFARTO CEREBRAL
CAMPO TÉCNICO
La invención se refiere al campo de la Biotecnología, particularmente dirigida a la identificación y aplicación de marcadores de tejidos. Más concretamente, la invención se refiere a liposomas que presentan en su superficie anticuerpos dirigidos contra proteínas que se expresan en la zona peri-infarto y a la utilización de los mismos para la identificación de dicha región, tanto a partir de imágenes tomadas de pacientes como en muestras de tejido cerebral procesadas in vitro.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Se denomina ictus a la pérdida de las funciones cerebrales como resultado de la interrupción del flujo sanguíneo al cerebro. Según su etiología, los ictus tienen dos variantes: isquémicos y hemorrágicos.
El ictus isquémico, también llamado infarto cerebral o isquemia cerebral, se debe a la oclusión de alguna de las arterias que irrigan la masa encefálica, bien sea por arteroesclerosis o bien por la presencia de un émbolo (embolia cerebral) que procede de otra localización.
El ictus hemorrágico (también conocido como hemorragia cerebral o apoplejía), se debe a la ruptura de un vaso sanguíneo encefálico, ruptura que tiene como causas más frecuentes una elevación de la presión sanguínea o un aneurisma congénito. La hemorragia, además de privar de riego al área cerebral dependiente del vaso sanguíneo afectado, provoca también que la sangre extravasada comprima las estructuras cerebrales, afectando con ello a su funcionalidad e, incluso, a su viabilidad.
El ictus se están convirtiendo en una de las principales causas de muerte e incapacidad en los países desarrollados. Debido al progresivo envejecimiento de la población y los hábitos de vida, su incidencia está incrementándose en dichos países. Los avances sobre su tratamiento, en cambio, no van parejos.
Hasta ahora, el único tratamiento que ha demostrado ser eficaz contra la isquemia cerebral es la trombólisis pero, desgraciadamente, los tratamientos trombolíticos presentan un riesgo importante de empeorar el estado del paciente e, incluso, de provocarle la muerte, por lo que su uso se limita en la actualidad a una fracción reducida de pacientes (menor del 3%) (Kleindorfer et al., 2009). Ante esta circunstancia, los neurólogos se ven obligados a tomar la decisión de aplicar o no el tratamiento trombolítico en función de la relación riesgo/beneficio que ello supondría.
Uno de los criterios más utilizados para evaluar esa relación riesgo/beneficio es la determinación del tamaño de la llamada "zona peri-infarto". Se llama así a la zona de tejido que está adyacente al núcleo de la lesión y que se considera tejido que, aunque está en riesgo, es potencialmente recuperable, siendo posible inducir en el mismo procesos de neuroprotección y neurorreparación, en contraposición a lo que sucede con el tejido isquémico adyacente (núcleo isquémico), que es tejido ya muerto, básicamente irrecuperable. Si la zona de tejido "salvable" (la zona peri-infarto) es muy pequeña, lo normal es no aplicar el tratamiento trombolítico, porque los riesgos superan el beneficio. Cuando las dimensiones de la zona peri-infarto van siendo mayores, se considera que merece la pena correr los riesgos asociados a los tratamientos trombolíticos.
Así, la correcta identificación de la zona peri-infarto y la determinación de su tamaño resulta ser muy importante para tomar una decisión adecuada sobre la aplicación de tratamientos trombolíticos.
En la actualidad, sin embargo, las decisiones respecto al tratamiento se están tomando a partir de la aplicación de técnicas de neuroimagen en las que no se determina la zona peri-infarto, sino la llamada "zona de penumbra", zona que en ocasiones se asocia con la zona peri-infarto pero que no es exactamente lo mismo y que, en muchas ocasiones, no indica la extensión real del tejido potencialmente recuperable. El concepto de penumbra responde a una zona que tiene una rápida caducidad en el tiempo, apareciendo al tiempo que el tejido isquémico y desapareciendo a las pocas horas, bien porque pase a formar parte de la lesión total final o porque se haya recuperado, convirtiéndose en tejido viable. El concepto, efectivamente, responde a la práctica de efectuar estudios radiológicos a pacientes ingresados en urgencias durante las primeras horas (1 a 6 horas, por ejemplo) posteriores al infarto cerebral. En primer lugar, se recurre a técnicas de tomografía computerizada (TC) cerebral, para confirmar que se trata de un ictus; posteriormente, durante la exploración que sigue, se decide si procede o no hacer una resonancia. Si se considera conveniente, se aplican entonces técnicas de resonancia magnética (RM) craneal en las que se comparan las imágenes obtenidas mediante RM de perfusión (PWI) y RM de difusión (DWI).
La RM de difusión proporciona imágenes basadas en la valoración de la difusión protónica en el agua del cerebro y, en general, se considera que permite detectar la zona de tejido denominada núcleo del infarto, con lesiones irreversibles. La RM de perfusión, por su parte, se basa en el efecto que produce la administración por vía intravenosa de contraste paramagnético durante su primer paso por la red capilar parenquimatosa cerebral, que es proporcional al volumen sanguíneo cerebral y que permite crear distintos mapas de perfusión, siendo los más utilizados los de tiempo de tránsito medio (MTT) o de tiempo hasta pico (TTP), por su gran sensibilidad para detectar regiones cerebrales hipoperfundidas tras una oclusión vascular. Pero la principal aplicación clínica de la RM de perfusión se basa en su capacidad para identificar tejido isquémico potencialmente viable cuando se combina con RM de difusión pues dentro de las primeras horas de evolución del ictus, una gran proporción de pacientes con una oclusión arterial aguda presenta un volvumen de tejido hipoperfundido, detectable por RM de perfusión, mayor que el volumen de la lesión detectada mediante RM de difusión (Schellinger et al., 2001). Esta diferencia o desacoplamiento entre ambos volúmenes se conoce con el término de des acoplamiento (mismatch) DWI-PWI, y representa un región con hipoperfusión crítica (alteración de los resultados de RM de perfusión), pero sin edema citotóxico (RM de difusión normal). El mismatch DWI-PWI es lo que se asocia con la penumbra isquémica, es decir, tejido en riesgo pero potencialmente recuperable mediante tratamientos de reperfusión.
Dicha zona de penumbra se asocia a menudo con la zona peri-infarto, pero no es exactamente lo mismo, entre otras razones, porque la zona de penumbra muchas veces no indica la extensión real del tejido conocido como "salvable". Además, el concepto de penumbra, como se ha apuntado previamente, responde a una zona que tiene una rápida caducidad en el tiempo, apareciendo al tiempo que el tejido isquémico y desapareciendo a las pocas horas, recuperándose para convertirse en tejido viable o pasando a formar parte de la lesión total final, mientras que la zona peri-infarto existiría en un paciente que hubiera padecido un infarto cerebral horas, e incluso días después de haber desaparecido la zona de penumbra. Por todo ello, se ha pensado que sería más adecuado definir la zona peri-infarto mediante marcadores moleculares. Sin embargo, los estudios encaminados a conocer las particularidades de la zona peri-infarto y a la determinación de marcadores moleculares característicos presentes en ella está tropezando también con dificultades metodológicas. Las metodologías actuales de identificación histológica de la zona peri- infarto en muestras de tejido cerebral implica un procesado de las muestras que podría afectar a la integridad del tejido para posteriores técnicas de procesado. Esto es especialmente importante en los estudios de proteómica, en los que el tratamiento del tejido podría afectar a las proteínas presentes en el mismo, dificultando su extracción y análisis posterior, razón por la cual en los estudios proteómicos realizados, por ejemplo, en muestras de tejido cerebral extraídas de modelos animales, la zona peri-infarto se define previamente como el tejido que rodea la zona de infarto a una cierta distancia arbitraria del mismo (los 2 mm adyacentes al tejido, por ejemplo). Esa estrategia deja un margen de incertidumbre importante respecto a que el tejido analizado corresponda totalmente a la zona peri-infarto o si realmente dicha región se extiende más allá o es más reducida.
Las técnicas inmunohistoquímicas actuales, por su parte, son lentas y requieren varios pasos: incubación con un anticuerpo durante un mínimo de una o dos horas (o, incluso, durante toda la noche), luego con una anticuerpo secundario marcado con biotina (1 hora), posteriormente con complejos avidina-biotina (1 h), y, por último, revelando el color con un kit de tinción (Kato et al., 1995). Así, la aplicación de las mismas es lenta y engorrosa. Aun así, los estudios inmunohistoquímicos de Kato et al. sirvieron para detectar una expresión predominante de una proteína del choque térmico, la proteína HSP70, en neuronas del área peri-infarto.
Así, sería conveniente desarrollar una herramienta que facilitara tanto la obtención de neuroimágenes para determinar la zona peri-infarto de pacientes que han sufrido un infarto cerebral como la identificación de dicha zona en muestras de cerebro in vitro, mediante una metodología que no afectara al posterior procesamiento de dicha zona para estudios proteómicos y que, preferiblemente, fuera sencilla y rápida. Todo ello redundaría en un mayor conocimiento de la región peri-infarto, de sus características, sus marcadores específicos, las proteínas que presentan expresión diferencial en la misma y la posible relación entre dicha zona peri-infarto y la conveniencia o no de administrar tratamientos trombolíticos (o de cualquier otro tipo) según las dimensiones de la misma. Con ello, se tendría mayor información para decidir el tratamiento más adecuado para cada paciente según sus características específicas. Además, se facilitaría la obtención de información sobre la expresión diferencial de proteínas en dicha zona y las posibles dianas terapéuticas que se expresen en la misma, posibilitando el diseño de tratamientos complementarios a la trombolisis, específicamente dirigidos a la zona peri-infarto.
En la línea de la utilización de marcadores moleculares para el estudio de pacientes que han padecido un infarto cerebral, y de muestras extraídas de dichos pacientes, la solicitud WO 2006/020269 se refiere al diagnóstico y pronóstico de enfermedades neurodegenerativas mediante el uso de biomarcadores, citándose el infarto cerebral y la isquemia como ejemplos de enfermedades neurodegenerativas agudas: Los ejemplos de la solicitud, sin embargo, se refieren a la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer, que se consideran enfermedades crónicas. En ningún momento se hace ninguna indicación de que las enseñanzas específicas de la solicitud WO 2006/020269 puedan extrapolarse a lo que en ella se consideran enfermedades neurodegenerativas agudas, como el infarto cerebral y la isquemia, por lo que dicha solicitud no aporta marcadores con los que diagnosticar estar enfermedades y, menos aún, para la identificación específica de la zona peri-infarto in vivo o en muestras tomadas de cerebro.
La solicitud WO 2008/008846 sí describe un método para el diagnóstico del infarto cerebral mediante obtención de imágenes administrando al enfermo anticuerpos marcados dirigidos contra proteínas específicas. La solicitud, sin embargo, se refiere principalmente al infarto hemorrágico, no al ictus isquémico (de hecho, la definición de la expresión "evaluar un infarto" con que comienza la pág. 20 de dicha solicitud internacional cita sólo los infartos hemorrágicos), con particularmente preferencia por los infartos hemorrágicos intracerebrales. Tal como se repite en distintos puntos de la descripción (véase por ejemplo la pág. 39, líneas 32 a 34), para determinar que un individuo ha sufrido un ictus isquémico, la solicitud WO 2008/008846 indica que es necesario que el individuo presente alteración en la expresión de al menos cuatro genes (presentes en las Tablas 15 ó 17-18 de dicha solicitud WO 2008/008846). En cuanto a las muestras a partir de las cuales podría llevarse a cabo del diagnóstico, sólo se aportan ejemplos referidos al uso de PBMCs (células mononucleares de sangre periférica), aunque se apunta que se podría usar muestras de cerebro. Por tanto, la identificación de la zona peri-infarto no se contempla en la solicitud WO 2008/008846, ni en muestras de cerebro, ni mucho menos a partir de neuroimágenes obtenidas in vivo; tampoco se establece relación alguna entre dicha zona y el diagnóstico del ictus isquémico o, más bien, la evaluación de su situación y de la terapia más recomendable en función de la misma.
La solicitud WO 2009/075863 se refiere también al diagnóstico del infarto cerebral mediante la determinación de la presencia de un marcador en una muestra. Aunque no hay una definición específica de "infarto cerebral", la manera de referirse al mismo a lo largo de la descripción deja claro que se está haciendo referencia al tipo isquémico. Pero la determinación de marcadores se hace siempre en muestras extraídas de individuos, no pareciendo considerar su posible determinación in vivo en un estadio temprano. Además, es la ausencia o relativa abundancia de uno o más de esos marcadores en la muestra lo que determina la probabilidad de que no haya existido o se haya producido, respectivamente, un infarto cerebral en un individuo. Entre los posibles marcadores a analizar no se considera la proteína HSP70. En ningún momento se considera tampoco la posibilidad de que alguno de los marcadores citados pueda servir para discriminar, dentro de una muestra tomada de un posible paciente, la presencia y extensión de la zona peri-infarto, ni tampoco se plantea que dichos marcadores puedan servir para hacer ningún tipo de determinación en pacientes vivos, en particular, la localización y extensión de la zona peri-infarto.
En cuanto al diseño de herramientas para ser dirigidas al Sistema Nervioso Central, ya sea con fines analíticos, diagnósticos o terapéuticos, el uso de liposomas se presenta como una opción interesante. Es bien conocido que los liposomas atraviesan la barrera hematoencefálica, incluso conjugados a otros compuestos como, por ejemplo, con maleimida y polietilenglicol (Huwyler et al, 1996; Lu, et al, 2007). Por ello, se ha propuesto su utilización tanto como vehículo de fármacos útiles para el tratamiento de alteraciones o trastornos del Sistema Nervioso Central como para el diagnóstico de los mismos.
Así, por ejemplo, el documento WO 2009/022756, se refiere a una composición tanto para el tratamiento o la prevención de un daño isquémico en el Sistema Nervioso Central (SNC) como para el diagnóstico del mismo. La composición contiene un liposoma y sialil-Lewis X (SLX) o un grupo SLX. En el caso de utilizarse para diagnóstico, incluye además una sustancia marcadora. Se menciona además que la invención proporciona un medio para distribuir una sustancia diana al interior de las células. No se menciona, sin embargo, que los liposomas presenten ningún resto que facilite su acumulación en alguna región específica del cerebro.
Una de las sustancias marcadoras que se han utilizado para detectar la presencia de los liposomas en el SNC es el gadolinio, que ha demostrado ser útil para la obtención de imágenes de resonancia magnética del Sistema Nervioso Central (Saito et al., 2004; Saito et al, 2005).
El documento US 2007/0254842, por su parte, describe, en general, un sistema para la administración de agentes neuroterapéuticos al Sistema Nervioso Central de mamíferos para tratar trastornos asociados con la muerte y/o la disfunción neuronal, comentando la posibilidad de que la población de células a tratar esté afectada por un infarto cerebral. En una realización preferida, el vehículo del agente neuroterapéutico es un liposoma, y la composición farmacéutica contiene un agente trazable, que puede ser un agente de contraste para resonancia magnética, citándose como realización especialmente preferida aquella en la que la composición farmacéutica contiene un liposoma que contiene un quelato de gadolinio. En la solicitud se afirma que los agentes trazables basados en liposomas son indicadores directos muy precisos de la distribución de los neuroterapéuticos de alto peso molecular basados en liposomas. Como en el caso anterior, en el documento no se propone que los liposomas presenten ninguna molécula que los dirija preferencialmente a una ninguna zona específica del cerebro.
Ninguno de los documentos discutidos menciona marcadores específicos que permitan la identificación específica de la zona peri-infarto in vivo. Tampoco se mencionan moléculas cuya expresión diferencial ayudara a que los liposomas suministrados a un individuo se localizaran preferentemente en la zona peri-infarto, facilitando la determinación de dicha zona. Por otra parte, las desventajas de los actuales métodos de identificación de dicha zona ex vivo, en muestras de cerebro previamente extraídas de individuos, no quedan solventadas a partir de las enseñanzas de los documentos discutidos. Así, como se mencionó previamente, sería interesante desarrollar una herramienta, que facilitara tanto la obtención de neuroimágenes para determinar la zona peri-infarto de pacientes que han sufrido un infarto cerebral como la identificación de dicha zona en muestras de cerebro ex vivo mediante una metodología que no afectara al posterior procesamiento de dicha zona para estudios proteómicos y que, preferiblemente, fuera sencilla y rápida.
La invención proporciona una solución a estos problemas.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se basa en el hecho, reflejado en el Ejemplo 1 de la presente invención, de que la zona peri-infarto presenta sobreexpresión de la proteína de choque térmico HSP70 con respecto a la expresión detectada en la zona contralateral de muestras de cerebro tomadas de los mismos individuos (modelos animales de infarto cerebral).
Esta proteína, HSP70, presenta la característica de que, en determinadas situaciones, puede aparecer anclada a la membrana pues, en cooperación con otras chaperonas, participa en los procesos de reconocimiento de proteínas mal plegadas, estabiliza las proteínas pre-existentes contra la agregación, y media el plegamiento de proteínas mal plegadas y, para ello, unen segmentos peptídicos extendidos con carácter hidrofóbico, expuestos por diversos polipéptidos durante la traducción y la traslocación a la membrana.
De esta manera, si a un individuo se le suministran liposomas con una estructura que les permita atravesar la barrera hematoencefálica y que, además, presenten en su superficie anticuerpos anti-HSP70, dichos liposomas se acumularán preferentemente en la región del cerebro donde la proteína HSP70 esté sobreexpresada, es decir, la región peri-infarto. El mareaje de dichos liposomas con un marcador que permita detectar fácilmente la presencia de los liposomas, tal como complejos de gadolinio que permitan su detección por resonancia magnética, permitiría la obtención de neuroimágenes en las que determinar la localización y extensión de la zona peri-infarto como aquella zona en la que se presente mayor señal asociada a los complejos de gadolinio, es decir, menor tiempo de relajación.
Dichos liposomas, además, podrían servir para la identificación in vitro de cualquier tipo de célula presente en una muestra que sobreexpresara dicha proteína, lo cual podría ser indicativo, por ejemplo, de haber sido sometidas a un choque térmico (como sucede con los astrocitos que se utilizan más adelante en el Ejemplo 3 de la presente invención) o, igualmente, la identificación podría servir para distinguir distintos tipos de células presentes en una muestra. De esta manera, las células podrían formar parte de un cultivo in vitro o, igualmente, podrían estar en una muestra de tejido. Dicho tejido podría ser, por ejemplo tejido cerebral, de manera que los liposomas podrían servir igualmente para determinar la zona correspondiente a la región peri- infarto en una muestra de tejido cerebral. De esta manera, al contrario de lo que está sucediendo con los estudios proteómicos actuales, el análisis de las proteínas con expresión diferencial en la zona peri-infarto podría hacerse directamente sobre la zona identificada, con una mayor seguridad de que la zona analizada es realmente la región peri-infarto de esa muestra, teniendo los resultados obtenidos una mayor fiabilidad. Además, la sencillez del tratamiento con liposomas y la rapidez del procedimiento necesario para el análisis de las muestras tratadas con liposomas supone una gran ventaja respecto a los tratamientos inmunohistoquímicos actuales, que necesitan varias etapas y requieren muchas horas para llegar al resultado final.
El uso de liposomas con un doble mareaje (con complejos de gadolinio y con un fluoróforo, como la rodamina) supondría una ventaja adicional, pues la utilización de dichos liposomas permitiría el análisis de muestras in vitro mediante dos técnicas diferentes, según se tenga preferencia en cada momento: por análisis de la señal de fluorescencia emitida por las muestras o por estudios de resonancia magnética.
Por otra parte, los autores de la invención han tenido en cuenta también que, en eucariotias, y específicamente en mamíferos, existen dos formas conocidas para la proteína HSP70, cuya nomenclatura no siempre es clara. Existe una forma constitutiva de la proteína HSP70, también conocida como HSP70c o HSC70 o HSPA8, presente tanto en seres humanos (Identificador de Gen 3312, con número de acceso en GenBank NM_006597, versión actual: NM 006597.4, también representado por el número de acceso NM l 53201, versión actual: NM_153201.2) como, por ejemplo, en otros mamíferos como ratones {Mus musculus) (número de acceso en GenBank NM_031165 NR_015570, versión actual: NM_031165.4) o ratas (Rattus norvegicus) (número de acceso en GenBank NM_024351, versión actual: NM_024351.2), que se expresa en todas las células cerebrales. Y, además se conoce otra forma de esta proteína denominada inducible, conocida como HSP70Í, HSP72 o HSPA1A, que también puede encontrarse tanto en seres humanos (número de acceso en GenBank NM 031971, versión actual: NM 031971.2) como en otros mamíferos tales como los ratones (número de acceso en GenBank NM O 10479, versión actual: NM O 10479.2) o ratas (Rattus norvegicus) (número de acceso en GenBank NM 212504, versión actual: NM 212504.1). Para mayor claridad y una mejor comprensión, se hará alusión a cada una de dichas formas de aquí en adelante con una única nomenclatura, usando HSC70 para la forma constitutiva y HSP72 para la forma inducible.
Como se demuestra en estos ejemplos, la profundización sobre las características de esta expresión diferencial de la HSP70 en muestras de tejido cerebral divulgada en la presente invención ha permitido comprobar que la forma inducible de la proteína HSP70, concretamente la forma HSP72, muestra una expresión clara de forma exclusiva en la zona preinfarto del tejido cerebral, expresándose de una manera muy poco significativa y esporádica en la región del núcleo de la lesión. Esto confirma, claramente, el valor de la forma HSP72 de la proteína HSP70 como marcador específico de la zona preinfarto, preferido sobre la forma constitutiva HSC70 o sobre la determinación simultánea de ambas formas de la proteína HSP70.
Además, los autores de la presente invención han estudiado la expresión espacio temporal de la proteína HSP72 en modelos animales de isquemia cerebral cuyo comportamiento es extrapolable al de seres humanos. Tal como se muestra en el Ejemplo 5, obtuvieron un perfil temporal, observando niveles elevados a las 6 horas de la inducción de la lesión, con un máximo de expresión de esta proteína a las 12 horas de la inducción de la lesión, que sigue siendo elevado a las 24 horas, y que progresivamente disminuye hasta la presencia esporádica a los 10 días. De acuerdo con el perfil obtenido, puede considerarse que existe expresión diferencial en la zona peri- infarto entre 12 horas y 7 días después de la inducción de la lesión. Es un hecho destacable que existen diferencias en la expresión de la proteína HSP72 entre la zona peri-infarto y el núcleo isquémico, no sólo en la fase aguda del ictus (a menos de 24 horas desde que se produce la lesión) sino, especialmente, que la expresión de HSP72 sigue siendo elevada y detectable pasadas 48 horas desde la inducción de la lesión e, incluso, transcurridas 72 horas. Por tanto, los liposomas que llevan unidos anticuerpos específicos contra la proteína HSP72 pueden servir para la determinación de la región peri-infarto en un individuo (tanto humano como cualquier otro mamífero) en un amplio intervalo de tiempo desde que se produce el ictus isquémico, por ejemplo, entre 6 horas y 7 días desde que se produce el mismo, siendo preferible que la determinación se haga entre 12 horas y 72 horas desde que se produce el ictus. El hecho de que la determinación puede realizarse entre 24 horas y 48 horas desde que se produce el ictus es especialmente interesante desde el punto de visto clínico, particularmente si se compara con los estudios de resonancia en los que se determina la zona de penumbra la cual, como se ha comentado previamente, tiene una rápida caducidad en el tiempo, desapareciendo a las pocas horas de producirse el ictus isquémico.
Por todo ello, la invención se refiere a liposomas que presentan en su superficie un anticuerpo contra la proteína de choque térmico HSP70 unida al liposoma por un grupo maleimida y que, además, están marcados con un fluoróforo (preferiblemente rodamina) y/o con un complejo de gadolinio, así como al uso de los mismos tanto para la identificación in vitro de células que sobreexpresan la proteína HSP70 (incluidas las células que forman parte de la región peri-infarto de una muestra de tejido cerebral, opción que permite la determinación de la misma) y a un procedimiento para la determinación de la zona peri-infarto en un individuo mediante estudios de resonancia magnética en los que se tomen neuroimágenes y se identifique la zona en la que la hay mayor acumulación de liposomas (mayor acumulación de gadolinio). En todos los casos, se tiene especial preferencia por que el anticuerpo reconozca la forma HSP72 y, más preferiblemente, que sea específico frente a la misma. Por su utilidad clínica y veterinaria, se prefiere que el anticuerpo pueda reconocer la proteína de un mamífero, con especial preferencia por seres humanos, aunque también pueden tener interés para la investigación los liposomas de la invención con anticuerpos que reconozcan la forma HSP72 de animales de investigación tales como ratón o rata.
Ninguna de las anterioridades mencionadas en el apartado de "Antecedentes de la invención" hacía referencia a liposomas que presentaran en su superficie anticuerpos anti-HSP70 o, específicamente, anti-HSP72, particularmente si se consideran los liposomas que presenten en su composición PEG, DTPA y gadolinio, por lo que los liposomas de la presente invención suponen una ventaja para el estudio del infarto cerebral que no se había contemplado hasta ahora. Además, ninguna de dichos documentos hacía referencia a la posibilidad de utilizar la proteína HSP70, o la forma de dicha proteína conocida como HSP72, como un marcador de la región peri-infarto. Sólo el grupo de Kato et al. (Kato el al, 1995), había apuntado a la sobreexpresión de HSP70 en la zona peri-infarto, pero no se había propuesto su uso como marcador de dicha región, ni se había sugerido que pudiera ser de utilidad utilizar anticuerpos dirigidos contra la proteína HSP70 para la determinación de dicha zona.
Debe mencionarse, además, que el estudio en el que se basa la presente invención es el primer estudio que establece diferencias entre dos partes diferentes de un mismo cerebro en animales isquémicos, analizando la zona ipsilesional (la correspondiente al hemisferio en el que se encuentra la región peri-infarto, que es la zona en riesgo, en la que conviene inducir procesos de neurorreparación) y la zona contralateral (que corresponde a tejido sano, que se encuentra en el otro hemisferio) y que esto tiene gran interés desde el punto de vista diagnóstico y de diseño de terapias. Los estudios previos realizados pretendían diagnosticar la producción y el tipo de ictus que ha tenido lugar a partir de muestras de tejidos o en sangre, mientras que en la presente invención no se pretende detectar la presencia de un ictus, que se asume como ya diagnosticado, sino identificar la zona peri-infarto, objetivo no planteado previamente. La identificación de esta zona a partir de neuroimágenes tomadas de pacientes permitirá hacer una elección más adecuada de las terapias administrar a cada paciente y, especialmente, determinar con mayor certeza cuándo puede ser conveniente administrarle una terapia trombolítica y cuándo el pequeño tamaño de dicha zona hace desaconsejable dichas terapias, por no verse compensado su posible beneficio por el riesgo asociado.
Los únicos estudios que tienen cierta relación con este análisis comparativo realizado por los autores de la presente invención son los referidos a la llamada zona de penumbra. Pero la zona de penumbra, como se ha discutido previamente, tiene menos relación con la situación real de un paciente en el que se hubiera producido un infarto cerebral, pues el concepto de penumbra responde a una zona que tiene una rápida caducidad en el tiempo. Así, el hecho de que los autores hayan realizado estudios a las 48 horas de la lesión supone una diferencia significativa con respecto a los estudios previos, con respecto a los que supone una gran ventaja, pues posibilita la realización de estudios y la extracción de conclusiones sobre las terapias a aplicar con posterioridad a como se venía haciendo hasta ahora, que era a las pocas horas del infarto cerebral. Además, el estudio espacio-temporal de la expresión de la forma HSP72 divulgado en la presente invención demuestra que los liposomas de la presente invención permiten realizar estudios sobre la región peri-infarto durante un amplio espacio de tiempo desde que sucede el ictus isquémico, pudiendo realizarse, por ejemplo, en el intervalo de entre 12 horas y 7 días desde el ictus. Es un hecho destacable que existen diferencias en la expresión de la proteína HSP72 entre la zona peri-infarto y el núcleo isquémico, no sólo en la fase aguda del ictus (a menos de 24 horas desde que se produce la lesión) sino, especialmente, que la expresión de HSP72 sigue siendo elevada y detectable pasadas 48 horas desde la inducción de la lesión e, incluso, transcurridas 72 horas, lo cual puede tener una utilidad clínica relevante. Por tanto, tanto los liposomas de la presente invención como los usos propuestos para los mismos (identificación de células in vitro que sobreexpresan HSP70, especialmente la forma inducible HSP72 y obtención de neuroimágenes a partir de la cuales determinar la región peri-infarto), suponen un avance interesante, no sugerido por otros autores.
Así, en un primer aspecto, la invención se refiere a un liposoma basado en 1,2- Diestearoil-sn-Glicero-3-fosfocolina (DSPC), colesterol, l,2-Diestearoil-sn-Glicero-3- fosfetranolamina-N-[Metoxi(polietilenglicol)-2000] (PEG2000-DSPE) y maleimida- PEG2000-DSPE, caracterizado porque el liposoma presenta anticuerpos dirigidos contra la proteína de choque térmico de 70 kDa (anti-HSP70) unidos al liposoma por el grupo maleimida.
Son realizaciones preferidas de la invención aquellas en las que las proporciones molares entre DSPC y colesterol en los liposomas varían entre 2,5: 1 y 1,5: 1, así como aquellas en las que la proporción molar del total de fosfolípidos con PEG2000-DSPE en su composición varía entre 0,05: 1 y 0,25: 1. Se prefieren especialmente los liposomas en los que la proporción DSPC:colesterol:PEG2000-DSPE es 0,62:0,33:0,05, por haber comprobado los presentes inventores su utilidad para proporcionar neuroimágenes del cerebro en los Ejemplos que se muestran más adelante en la presente invención. En cuanto a la maleimida, se prefiere que la maleimida-PEG2000-DSPE esté en una proporción 2,5% molar respecto al total de fosfolípidos con PEG2000-DSPE.
En cuanto al tamaño, el tamaño más preferido es el tamaño medio de 100 nm, pudiendo estar el diámetro comprendido en el intervalo de 45 a 450 nm, aunque con mayor preferencia en el intervalo de 90 a 140 nm.
Respecto a la posible molécula marcadora, una posibilidad es que el liposoma comprenda fosfolípidos que llevan unido un compuesto fluoróforo, con preferencia por la rodamina. Dicha rodamina puede formar parte del liposoma, por ejemplo, como 1,2- Dipalmitoil-sn-Glicero-3-fosfoetanolamina-N-(Lisamina Rodamina B Sulfonilo) (rodamina-PE), como sucede en liposomas utilizados en los Ejemplos 3 y 6 de la presente solicitud.
Los liposomas pueden igualmente comprender como parte de su estructura fosfolípidos que comprenden una sal de gadolinio. Dicha sal de gadolinio puede ser, por ejemplo, la sal del ácido dietilenetriaminopentaacético a,üJ-bis(8-estearoilamido-3,6- dioxaoctilamide)gado linio (Gd-DTPA-SADA) o bien, la sal de gadolinio del ácido 1,2- dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-dietilentriaminopentaacético (PE-DTPA- Gd), teniéndose preferencia por esta última. Esto permitirá utilizar los liposomas para estudios de resonancia magnética de las muestras de células que entren en contracto con ellos. Puede darse el caso de que los liposomas posean un doble mareaje, al comprender en su estructura tanto un fluoróforo como una sal de gadolinio. Estos liposomas presentarán la ventaja de ser más versátiles, pues pueden utilizarse tanto en estudios de fluorescencia como de resonancia magnética.
La presencia de las moléculas marcadoras citadas (bien sea un fluoróforo, una sal de gadolinio o ambas), como se ha comentado, permite una identificación muy sencilla de las células que sobreexpresen HSP70, que serán aquéllas a las que se unirá el liposoma, que penetrará en las mismas, dando lugar a un aumento de la concentración de la molécula marcadora en la célula: el fluoróforo o la sal de gadolinio, teniéndose especial interés por aquellos liposomas con anticuerpos capaces de reconocer la forma inducible, HSP72, y que reconocerán las células que la expresen. La detección de la señal correspondiente permitirá identificar las células que sobreexpresen la proteína de choque térmico como aquellas en las que la señal obtenida corresponda a una mayor concentración en la célula de la molécula marcadora. Es por eso que la invención, en un segundo aspecto, se refiere también al uso de los liposomas de la invención para la identificación in vitro de células en las que la proteína HSP70 está sobreexpresada, con especial preferencia por las células en las que se sobreexprese la forma HSP72.
En el caso concreto de que los liposomas utilizados presenten un compuesto fluoróforo en su estructura, la detección de la señal de fluorescencia en el uso de la presente invención permitirá identificar las células que sobreexpresen dicha proteína de choque térmico como aquellas en las que la señal de fluorescencia sea mayor. En el caso de que las células se pongan en contacto con los liposomas in vitro, tras una simple incubación de las células (de 10' a 1 hora) con los liposomas, basta con observar las muestras al microscopio de fluorescencia y la simple detección de dicha señal de fluorescencia, utilizando la longitud de onda adecuada según el fluoróforo utilizado, permite identificar fácilmente las células que sobreexpresan la proteína reconocida por los anticuerpos presentes en el liposoma, como las células en las que la señal de fluorescencia del fluoróforo comprendido en los liposomas es superior a la señal del resto de las células presentes en la muestra
Además de la sencillez, hay que tener en cuenta que los liposomas, tras anclarse a la superficie celular son incorporados en su mayoría en el interior del citoplasma celular por mecanismos tipo endocitosis y/o fusión de membrana del liposoma con membrana celular; tras la transfección de las células con los liposomas, las partículas fluorescentes quedarían en el interior de la célula, junto con los liposomas; por tanto, puede esperarse que la sensibilidad de detección sea mayor que con las técnicas inmunohistoquímicas actuales. Es más, la inyección de liposomas en un animal vivo permitiría el mareaje del tejido in vivo, tejido que posteriormente podría extraerse y procesarse ex vivo, al contrario de lo que se hace en histología convencional, donde todo el proceso es ex vivo. Es por ello, que tal como se utiliza en la presente solicitud, la expresión "poner en contacto las células con los liposomas" debe entenderse que abarca tanto los casos en que las células son incubadas con los liposomas in vitro como aquellos casos en los que el contacto se produce in vivo, porque los liposomas llegan a las células correspondientes mientras aún forman parte de un animal vivo al que se le han inyectado los liposomas. En este segundo caso, la muestra de tejido que contenga las células a analizar, se tomará del animal una vez que hayan entrado ya en contacto con los liposomas y hayan podido incorporarlos.
Cuando los liposomas comprenden fosfolípidos que comprenden una sal de gadolinio, las células en las que HSP70 (preferiblemente, de forma específica, la forma inducible HSP72) está sobreexpresada se identifican con las células que presentan los menores tiempos de relajación TI al hacer un estudio de resonancia magnética de la muestra. Esto es así porque dichas células serán las que presenten una mayor concentración de gadolinio acumulado en su interior. Como cualquiera de las dos sales de gadolinio que se proponen para los liposomas de la invención dan lugar a una disminución del tiempo de relajación de resonancia magnética, la disminución será proporcional a la concentración de gadolinio presente en las células, por lo que las células con más gadolinio serán las que presenten mayor disminución del tiempo de relajación TI : cuanto más gadolinio haya en las células, mayor contraste.
Este uso de los liposomas de la invención puede realizarse tanto para cultivos de células o como para muestras de tejido, como pueda ser el tejido cerebral, donde la zona de células que sobreexpresan HSP70 (o, preferiblemente, de forma específica, la forma inducible HSP72) se identificarían como las células que conformarían la región peri- infarto. Así, el uso de los liposomas de la invención permite identificar la región peri- infarto en muestras de tejido cerebral. Dado que el tratamiento necesario para la aplicación de las muestras no afecta a futuros estudios proteómicos y a la mayor seguridad en la identificación de la zona peri-infarto, suponen una gran ventaja respecto a las metodologías actuales.
Los liposomas de la presente invención, además, tal como se demuestra en los Ejemplos 3 y 6, son útiles para obtener imágenes de resonancia magnética del cerebro de animales, no sólo cuando dichos liposomas se administran directamente al cerebro, sino también cuando se administran por vía sistémica (inyección intravenosa, por ejemplo) permitiendo la identificación de zonas en el cerebro. En el caso de los liposomas de la invención, además, el hecho de que presenten anticuerpos anti-HSP70 (preferiblemente, específicos frente a HSP72) en su superficie, como demuestran los estudios in vitro, da lugar a una mayor acumulación de los mismos en las zonas en las que sobreexpresa dicha proteína HSP70 (o, preferiblemente, la forma HSP72). Por tanto, dichos liposomas deben acumularse en mayor medida en la zona peri-infarto. Así, el uso de los liposomas de la invención que contienen sales de gadolinio en su composición posibilita la obtención de neuroimágenes en las que puede identificarse la región peri-infarto, por darse en la misma mayor acumulación de proteína HSP70 (y, en particular, de la forma HSP72 de la misma). Esa determinación de la zona peri-infarto puede ser de utilidad para decidir los tratamientos más adecuados para suministrar a un individuo que ha sufrido un infarto cerebral, facilitando la decisión de si conviene o no administrarle un tratamiento trombolítico. Como, además, es conocido que los liposomas con estructuras similares a los liposomas de la presente invención son capaces de atravesar la barrera hematoencefálica, incluso cuando llevan acoplados anticuerpos, los liposomas de la invención no necesitan la administración directa al Sistema Nervioso Central para poder obtener imágenes de los mismos, tal como se demuestra en el Ejemplo 6, sino que pueden atravesar la barrera hematoencefálica cuando se administran por una vía más sencilla de utilizar y menos traumática para el paciente, como es la vía sistémica (por vía intravenosa, por ejemplo). Por todo ello, los liposomas de la invención son especialmente interesantes para la determinación de la zona peri-infarto presente en un individuo a partir de neuroimágenes de resonancia magnética tomadas del mismo. A partir de dichas neuroimágenes puede determinarse la extensión de la zona peri-infarto. Esta determinación, una vez hecha, puede servir para decidir la administración o no tratamientos trombolíticos según la extensión de la misma.
Así, un aspecto más de la invención sería un método para la determinación de la región peri-infarto de un individuo a partir de neuroimágenes de resonancia magnética tomadas del mismo que comprende las siguientes etapas:
a) suministrar al individuo una composición que comprende liposomas de la invención marcados con una sal de gadolinio;
b) obtener imágenes de resonancia magnética del cerebro del individuo;
c) identificar como región peri-infarto la región de las neuroimágenes que corresponda a los tiempos de relajación más bajos.
En una realización preferida de la invención, la composición de los liposomas se administraría por vía sistémica.
En otra realización preferida de la invención, compatible con la anterior, el individuo es un mamífero que ha sufrido un ictus isquémico, con especial preferencia por los seres humanos.
De acuerdo con los estudios de expresión espacio-temporal divulgados en la presente solicitud, es una realización posible del método de la invención que las imágenes de resonancia magnética se obtengan, por ejemplo, en el intervalo de 12 horas a 7 días desde que se produjo el ictus isquémico. Pueden obtenerse transcurridas menos de 24 horas desde que se produjo el ictus isquémico o, también, transcurridas entre 24 y 72 horas desde que se produjo el ictus isquémico, como puede ser, por ejemplo, transcurridas 48 horas.. Dado que la forma de la proteína HSP70 que ha demostrado especial utilidad como marcador de la región peri-infarto es la forma HSP72, se tiene especial preferencia por que, en cualquiera de las realizaciones del método de la invención, se suministren al individuo liposomas que contengan anticuerpos capaces de reconocer la HSP72, con particular preferencia por los anticuerpos específicos frente a la misma.
La invención se explicará ahora con mayor detalle por medio de las Figuras y los Ejemplos que se presentan a continuación BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1 : Esquema representativo de las regiones de cerebro seleccionadas para el análisis proteómico: región peri-infarto y región contralateral.
Fig. 2: Fragmentos de gel de electroforesis en dos dimensiones de las proteínas de la fracción insoluble de las muestras de cerebro del modelo de infarto cerebral, correspondientes a las regiones peri-infarto (columna izquierda) y contralateral (columna derecha).
Fig. 3: Representación gráfica de la expresión proteica entre las regiones contralateral (0) y peri-infarto (1) del spot diferencial S3716.
Fig. 4: Espectro de masas del spot S3716
Fig. 5: Imagen de microscopio electrónico de transmisión (imagen crio-TEM) de liposomas base para los liposomas de la invención
Fig. 6: Distribución de tamaños de los liposomas determinada por técnicas de dispersión de luz láser dinámicas (DLS).
Fig. 7: Resultados observados en los ensayos realizados con liposomas con gadolinio. Panel A: Variación de la relaxividad (inversa de los tiempos de relajación) de las disoluciones de liposomas de diferente composición (diferente cantidad de lípidos de Gd incorporados en las membranas), en función de la concentración total de gadolinio. Panel B: mapas TI y Rl de un cerebro de rata (in vivo) obtenidas a partir de imágenes de diferentes pesos TI . Las letras indican el sitio de inyección de las cuatro formulaciones preparadas.
Fig. 8:. Representación esquemática de la actuación de liposomas vectorizados. A, Liposomas vectorizados frente a células que no sobreexpresan la proteína diana. B, cuando los liposoma expresan la proteína diana, los liposomas se anclan y son incorporados en la célula. C, liposomas sin vectorizar, frente a células que sobreexpresan la diana. D, células sin liposomas en el medio.
Fig. 9: Imágenes obtenidas en un microscopio de fluorescencia en las que se muestra la señal obtenida a los 30 minutos (columna de la izquierda) o tras 1 hora
(columna de la derecha) de incubación de astrocitos con liposomas, en distintas condiciones, en las que HSP70(+) indica inducción previa de la expresión de la proteína
HSP70 y HSP70 (-) indica ausencia de dicha inducción. Panel A: astrocitos HSP70(+) transfectados con liposomas con anticuerpos anti-HSP70. Panel B: astrocitos HSP70(+) transfectados con liposomas sin anticuerpo anti-HSP70. Panel C: astrocitos HSP70(-) transfectados con liposomas con anticuerpo anti-HSP70. Panel D: astrocitos HSP70(-) transfectados con liposomas sin anticuerpo anti-HSP70.
Fig. 10: Resultados de los estudios de resonancia magnética llevados a cabo con los astrocitos de la Fig. 9, se muestra también un grupo control.. Panel A: imágenes de resonancia magnética obtenida con cada uno de los cultivos. Panel B: valores del tiempo de relajación TI, expresados en segundos, observados en cada grupo de células.
Lipos H02 o regular LIPO: liposomas control (sin anticuerpo anti-HSP70)
Fig. 11 : Resultados de los estudios de resonancia magnética llevados a cabo con células endoteliales en las que se indujo (HSP70(+)) o no (HSP70(-)) la expresión de la proteína de choque térmico HSP70, mientras que "anti-HSP70" indica que los liposomas utilizados llevaban acoplado un anticuerpo dirigido contra la proteína HSP70.
Panel A: imágenes de resonancia magnética obtenida con cada uno de los cultivos.
Panel B: valores del tiempo de relajación TI, expresados en segundos, observados en cada grupo de células. Lipos H02 o regular LIPO: liposomas control (sin anticuerpo anti-HSP70)
Fig. 12: Western blot de tejido de la región contralateral a la lesión.
- Fig. 12a: Fotografía de las bandas obtenidas en el Western Blot. Carriles: tejido sano (a), tejido de la región peri-infarto (b) y tejido de la zona de la lesión isquémica
(c). Los estudios se realizaron por duplicado (parte izquierda y parte derecha) y se usó β-Actina como referencia (parte inferior de la figura). - Fig. 12b: Cuantificación de las bandas de Western-blot mostradas en la Fig. 12a, expresadas como la relación entre la intensidad de las bandas de HSP70 y la correspondiente banda de actina obtenida para el mismo tejido.
Fig. 13: Estudio inmuno-histológico de tejido cerebral de rata isquémica.
- Fig. 13a: Estudio inmuno-histoquímico con el anticuerpo anti-HSP70 de
Abcam. Las fotos corresponden al lado del cerebro contralateral a la lesión (A), zona peri-infarto (B) o el núcleo de la lesión (C).
- Fig. 13b: Estudio inmuno-histoquímico de expresión de la proteína HSP72 (de ENZO) en tejido cerebral. (A) Control negativo. (B) Zona contralateral a la lesión (tejido sano). (C) Zona peri-infarto, y (D) zona del núcleo de la lesión isquémica.
Fig 14a : Estudio inmuno-histoquímico de expresión de las proteínas HSC70 y HSP72. (A-C) expresión de GFAP (astrocitos), en tejido sano (A), peri-infarto (B) y núcleo de lesión (C). La línea continua (rojo en el original) marca el límite de expresión de GFAP, que separa núcleo de región peri-infarto. (D-F) tinción de HSP72 en las mismas zonas. La proteína se expresa de forma específica en la zona que bordea la lesión (zona peri-infarto). (G-I) tinción de HSC70 en las mismas zonas, mostrando la expresión constitutiva de esta proteína en todas las zonas de tejido. La expresión en la zona peri-infarto (H) es ligeramente superior a las otras zonas. Fig. 14b: Imagen de Resonancia Magnética mostrando la lesión in vivo, previa a la extracción del cerebro del animal.
Fig. 15: Fotografías obtenidas tras doble tinción inmuno-fluorescente de células GFAP -positivas (verde en el original) y células HSP72 positivas (rojo en el original) en la zona peri-infarto. Fila superior: tejido sano (contralateral); fila intermedia: núcleo de la lesión;fila inferior: zona peri-infarto. Columna izquierda: tinción para células HSP72 positivas, con la típica morfología de las neuronas, en la que no se observa expresión en la zona contralateral (fotografía superior de la serie). Segunda columna: tinción para células GFAP positivas, es decir astrocitos, en este caso ausentes en la zona del núcleo isquémico (fotografía de la fila intermedia). Columna derecha: fusión de canales de fluorescencia (fusión de las señales positivas para HSP72 y para GFAP), que muestra que no hay colocalización de estos marcadores, lo que indica que no son los astrocitos las células que expresan el marcador HSP72. Fig. 16: Estudios bidimensionales de Western-blot en los que se determinó la expresión de proteína HSP72 (sólo en la zona peri-infarto) al separarla de la proteína HSC70 por su distinto punto isoeléctrico. Se usó β-Actina (bandas situadas a la derecha) como control positivo de carga en ambos tejidos (peri-infarto y contralateral).
Fig. 17: Corte coronal de un cerebro de rata localizado en la posición espacial
Bregma +0.5 (según atlas anatómico de Paxinos y Watson: (The rat brain in stereotaxic coordinates. 4th ed. George Paxinos and Charles Watson. Elsevier, New York, 2004. ), correspondiente a la sección de tejido cerebral seleccionado en cada rata para el análisis inmuno-histoquímico (panel A). A su lado (panel B), imagen de resonancia magnética de una típica lesión isquémica causada por el modelo qurúrgico empleado. Las zonas 1 y 3 son habitualmente consideradas zona peri-infarto, mientras que las 2 y 4 son habitualmente zonas de núcleo de lesión.
Fig. 18: Densidad de células marcadas para HSP72 en el tejido celular. Gráfica superior (A), densidad celular promediada en el total de las 4 zonas analizadas. Gráfica inferior (B), densidad celular en la zona peri-infarto (zonas 1 y 3: primera barra de cada pareja) y en la zona de lesión (zonas 2 y 4: segunda barra de cada pareja).
Fig. 19: Mapas de pseudo-color de la densidad de células que expresan HSP72 a diferentes tiempos tras la isquemia cerebral, superpuestos en una imagen de RM del corte cerebral en el que han sido calculadas. Junto a los mapas de densidad se presentan las micrografías de inmuno-histoquímica para la zona denominada 1 en la Fig. 17.
Fig. 20: Imágenes obtenidas en un microscopio de fluorescencia en las que se muestra la señal obtenida a los 30 minutos (columna de la izquierda) o tras 1 hora (columna de la derecha) de incubación de astrocitos con liposomas, en distintas condiciones, en las que HSP72(+) indica inducción previa de la expresión de la proteína HSP72 y HSP72 (-) indica ausencia de dicha inducción. Panel A: astrocitos HSP72(+) transfectados con liposomas con anticuerpos anti-HSP72. Panel B: astrocitos HSP72(+) transfectados con liposomas sin anticuerpo anti-HSP72. Panel C: astrocitos HSP72(-) transfectados con liposomas con anticuerpo anti-HSP72. Panel D: astrocitos HSP72(-) transfectados con liposomas sin anticuerpo anti-HSP72.
Fig. 21 : Resultados de los estudios de resonancia magnética llevados a cabo con los astrocitos de la Fig. 20; se muestra también un grupo control. Panel A: imágenes de resonancia magnética obtenida con cada uno de los cultivos. Panel B: valores del tiempo de relajación TI, expresados en segundos, observados en cada grupo de células. Lipos H02 o regular LIPO: liposomas control (sin anticuerpo anti-HSP72).
Fig. 22: Resultados de los estudios de resonancia magnética llevados a cabo con células endoteliales en las que se indujo (HSP72(+)) o no (HSP72(-)) la expresión de la proteína de choque térmico HSP72, mientras que "anti-HSP72" indica que los liposomas utilizados llevaban acoplado un anticuerpo dirigido contra la proteína HSP72. Panel A: imágenes de resonancia magnética obtenida con cada uno de los cultivos. Panel B: valores del tiempo de relajación TI, expresados en segundos, observados en cada grupo de células. Lipos H02 o regular LIPO: liposomas control (sin anticuerpo anti-HSP72).
Fig. 23: Esquema representativo del procedimiento experimental seguido para comprobar la capacidad de los liposomas con anticuerpos frente a la proteína HSP72 para poder detectar la zona peri-infarto. MCAO: oclusión permanente de la arteria cerebral media en rata; IHC: estudio histológico. Se indican los tiempos de inyección de los liposomas desde el momento que se llevó a cabo la MCAO (segunda línea del esquema), así como los momentos en los que se tomaron imágenes de resonancia magnética (RM) también respecto al momento de realización de la MCAO (tercera línea del esquema).
Fig. 24: Estudio de imagen por Resonancia Magnética (RM) de la zona peri- infarto en un modelo de rata, (a) Imagen de RM con peso T2 de un animal a las 48 h de la inducción de una lesión isquémica (zona hiperintensa). (b) Imagen de densidad protónica, donde la lesión es apenas es perceptible, (c) Mapa de relaxividades Rl (Rl= 1/T1, siendo el tiempo de relajación longitudinal en RM), obtenido a partir de una serie de imágenes con peso TI . La relaxividad se ve aumentada por la presencia de liposomas dopados con gadolinio, (d) imagen de pseudo-color del mapa de relaxividad Rl, en el que se ha ampliado la zona de acumulación de liposomas dopados con gadolino (color rojo en el original, más oscuro en la figura), (e) Imagen compuesta por fotografías tomadas en la zona de acumulación de liposomas mediante un microscopio de fluorescencia, mostrando la señal producida por los liposomas, dopados con rodamina. EJEMPLOS
- Ejemplo 1: Identificación de marcadores proteicos de la región peri- infarto
El proyecto de síntesis de nanopartículas vectorizadas hacia la región peri- infarto partió de la identificación de un marcador de dicha región en un modelo de isquemia cerebral en rata. El modelo de infarto cerebral (isquemia cerebral) utilizado fue el llamado pMCAO: oclusión permanente de la arteria cerebral media en rata. 1.1. Generación del modelo de infarto
En el presente proyecto se incluyeron 6 ratas Sprague-Dawley de aproximadamente 250 gramos de peso. Los animales sometieron a la oclusión permanente de la arteria cerebral media. Brevemente, a los animales se les indujo anestesia mediante isoflurano al 5% y fueron operados manteniendo la anestesia al 2% en Ο2:Ν2Ο/30:70. En primer lugar se realizó una incisión ventralmente en el cuello, de unos 3cm de longitud, por encima del esternón. Tras retirar el músculo omioide se disecó la arteria carótida común izquierda para, a continuación, ligarla mediante una doble sutura de 4/0.
Tras cerrar la incisión se colocó al animal sobre su costado derecho para realizar un corte desde el extremo de la oreja izquierda hasta la comisura del ojo, dejando expuesto el músculo temporal que se retrajo para exponer el hueso. Tras realizar un trépano en el mismo mediante un torno de microcirugía se retiraron las meninges y se aisló la arteria cerebral media (MCA). Con un gancho situado en un micromanipulador se levantó ligeramente la arteria separándola del parénquima cerebral. Se rellenó la incisión con suero salino hasta cubrir el gancho, y mediante un electrocoagulador bipolar, se coaguló la MCA siempre en el mismo punto.
Terminado el proceso se suturó la incisión y se aplicó Betadine y lidocaína como analgésico tópico. Transcurridas 48 horas de la oclusión, los animales fueron sacrificados introduciéndolos en una cabina de anestesia con isoflurano al 5%, y se les extrajo el cerebro. Al cerebro se le aplicó un tampón fosfato frío para limpiarlo y enfriarlo y se cortó en láminas de 2 mm de grosor. 1.2. Tinción de las muestras de cerebro y selección de la zona peri-infarto
La visualización del infarto se hizo por tinción con sales de tetrazolio (TTC: cloruro de tetrazolio). Para ello, las láminas de cerebro se introdujeron en pocilios de una placa de cultivo que contenía TTC y se incubaron a 37°C durante 5 minutos. El TTC es una sal que se intercala en la cadena de transporte electrónico en las mitocondrias de las células vivas, donde queda fijado, tomando un color rojo; la zona de infarto, compuesta principalmente por células muertas, no se tiñe y adquiere un color blanco.
Las láminas teñidas se observaron al microscopio colocando una regla cerca de las mismas, realizando fotos de cada corte. A cada lámina se le dio la vuelta con ayuda de dos espátulas y se fotografiaron de nuevo los cortes.
La medición del volumen de infarto se realizó mediante el software Image J, dibujando en cada imagen, mediante la herramienta StraightLine, una línea que abarcaba 5 mm. Mediante la herramienta Polygon se dibujó el contorno del infarto, midiendo luego su área mediante la función Measure. Una vez realizado el proceso en todos los cortes, se copiaron los datos en una hoja de Excel y se sumaron las áreas para obtener el volumen de infarto.
La selección de la región de peri-infarto se realizó sobre las muestras teñidas con
TTC asumiendo que dicha región comprende una línea de 2 mm de tejido sano adyacente al tejido infartado. Por su parte, la región contralateral se seleccionó considerando que incluye una línea de 2 mm de tejido sano contralateral exactamente simétrico a la región periinfarto. En la Fig. 1 puede verse un esquema de las regiones seleccionadas.
Para recoger las muestras seleccionadas, se extrajo la zona de infarto y se recortó una franja de 2 mm de grosor alrededor del infarto (peri-infarto). A continuación se retiró de lado contrario del cerebro, el lado contralateral, un fragmento simétrico al del infarto, que se desechó , y un fragmento simétrico al peri-infarto, que se conservó como tejido contralateral. 1.3. Subfraccionamiento de la muestra
El objetivo fundamental buscado en los ensayos descritos en este Ejemplo 1 era la identificación de un marcador de la zona peri-infarto, pero se consideró que sería de gran utilidad que el marcador fuese una proteína de membrana, por lo que se llevó a cabo una estrategia de subfraccionamiento consistente en separar las proteínas en tres fracciones: fracción de membrana, fracción soluble y fracción insoluble. De estas, la que mejores resultado dio fue el de la fracción insoluble (liposoluble).
Para realizar el subfraccionamiento, se prepararon tubos eppendorf con 2 mi de tampón de extracción I del kit comercial ProteoExtract Native Membrane protein extraction kit (Calbiochem) frío (4°C) y 10 μΐ de inhibidores de proteasas a temperatura ambiente y se inició el subfraccionamiento. Se homogenizó el tejido con nitrógeno líquido y mortero, evitando que el tejido se descongelara. Se cogió el homogenizado con una espátula previamente enfriada y se echó en el tubo con tampón de extracción I. Se incubó en agitación a 4°C durante 10 minutos. Transcurridos éstos, se centrifugó a 16000 xg durante 15' a 4°C. Se separó el sobrenadante a un tubo con el rótulo: "soluble" que se congeló, y se redisolvió el pellet con 1 mi de tampón de extracción II frío del mismo kit comercial de extracción de proteínas (4°C) y 5 μΐ de inhibidores de proteasas. Se incubó durante 30' en agitación a 4°C. Se centrifugó a 16000 xg durante 15' a 4°C. Se separó el sobrenadante a un tubo con el rótulo: "membrana". Se congeló el sobrenadante y el pellet (que constituyó la fracción insoluble).
Se descongelaron las muestras de membrana y solubles y se concentraron en tubos centricon (millipore) mediante centrifugación de 45' a 14000 xg, hasta que el volumen de cada tubo fue de 500 μΐ o inferior. A continuación se añadieron 1,5 mi de acetona fría, se incubó 2 horas a -20°C y se centrifugó a 14.000 rpm a 4°C durante 45'. Se desechó el sobrenadante (acetona) y se redisolvió el pellet en 100 μΐ de tampón de lisis (urea 7M, tiourea 2M, 4% CHAPS, 3% DTT) agitando durante 1 hora a 29°C. A continuación se calculó la cantidad de proteína mediante el método de Bradford modificado (10 μΐ de cada patrón o muestra desconocida, con 10 μΐ de HC1 0,1 N y 200 μΐ de reactivo de Bradford).
En el caso de la fracción insoluble, una vez descongelada se añadió 1 mi de tampón de lisis (urea 7M, tiourea 2M, 4% CHAPS, 3% DTT) y se redisolvió el pellet agitando durante 3 horas a 29°C. A continuación se centrifugó 30' a 14.000 rpm y se extrajo el sobrenadante (al desechando el pellet se desechan restos celulares). Se realizó la concentración en tubos centricon (millipore) mediante centrifugación de 45' a 14000 xg, hasta que el volumen de cada tubo fue de 500 μΐ o inferior. A continuación se añadieron 1,5 mi de acetona fría, se incubó 2 horas a -20°C y se centrifugó a 14.000 rpm a 4°C durante 45'. Se Desechó el sobrenadante (acetona) y se redisolvió el pellet en 100 μΐ de tampón de lisis (urea 7M, tiourea 2M, 4% CHAPS, 3% DTT) agitando durante 1 hora a 29°C. A continuación se calculó la cantidad de proteína mediante el método de Bradford modificado (10 μΐ de cada patrón o muestra desconocida, con 10 μΐ de HC1 0,1 N y 200 μΐ de reactivo de Bradford).
1.4. Electroforesis bidimensional
A continuación se describe el proceso de electroforesis bidimensional llevado a cabo tanto con la fracción insoluble como con la fracción soluble.
Para cada rata se realizaron 2 geles de la región contralateral y 2 geles de la región peri-infarto.
- Primera dimensión: En cada gel se cargaron 40 μg de proteína en tampón de lisis (tras calcular el volumen a cargar a partir de los resultados obtenidos del método de Bradford) y se le añade el tampón de rehidratación (7M de urea, 2M de tiourea, 4% CHAPS, 0,3% DTT, 0,5% biolitos) hasta 330 μΐ. En cada una de las calles del soporte de la primera dimensión se cargaron 300 μΐ. A continuación se sacaron dos tiras IPG (de pH 3-10 y 17 cm) (Bio-Rad) del congelador de -20°C, se les extrajo el plástico protector y se colocaron con el gel hacia abajo, sobre el tampón de rehidratación. Posteriormente se añadieron 2 mi de aceite mineral encima de cada tira, para evitar la desecación. La placa se colocó en la PROTEAN IEF CELL (Bio Rad), se seleccionó PRESET METHOD, haciendo una rehidratación activa a 50 V durante 12 horas, y aplicando a continuación un voltaje de 500 V durante 15' para después aplicar un voltaje de 10.000 V hasta alcanzar 30.000 Vh. El último paso fue de 10.000 V hasta alcanzar un voltaje de 27.000 V. De esta forma el voltaje acumulado fue de 57.000 Vh.
- Equilibrado: Una vez finalizada la primera dimensión las tiras pueden congelarse a -20°C o bien equilibrarse. El equilibrado es un proceso por el que las proteínas se cargan negativamente. De esta forma se garantiza que la separación en la segunda dimensión se llevará a cabo por peso molecular y no por carga. Para realizar el equilibrado se colocan las tiras de IPG con el gel hacia arriba en las bandejas de equilibrado y se le añaden 7 mi de solución de equilibrado con DTT (Tris 50 mM, 6M de urea, 30%> glicerol, 2%>SDS, 10 mg/ml DTT), incubando a temperatura ambiente durante 15'. A continuación se dejan escurrir un poco las tiras y se añade solución de equilibrado con yodoacetamida (Tris 50 mM, 6M de urea, 30% glicerol, 2% SDS, 25 mg/ml yodoacetamida), incubando otros 15' a temperatura ambiente.
- Segunda dimensión: Una vez equilibradas las tiras se puede cargar la segunda dimensión o bien se pueden congelar las tiras a -20°C. Para llevar a cabo la segunda dimensión, el día anterior se deben dejar los geles de 2a dimensión hechos. Dependiendo del número de geles que se quiso correr se utilizó la Protean XII de Bio Rad (2 geles) o la ETTAN-SIX de GE (6 geles). Los geles se prepararon siguiendo las siguientes recetas:
Protean XII ETTAN-6
Acrilamida 50 mi 250 mi
Tris Stock (1,5 M) 30 mi 150 mi
SDS (20%) 600 μΐ 3 mi
H20 destilada 38,7 mi 193,5 ml
APS (10%) 600 μΐ 3 mi
TEMED 40 μΐ 200 μΐ
Para cargar la segunda dimensión, se colocó la tira de IPG pegada al cristal grande, sobre el gel de acrilamida al 12,5 %>., se selló la tira con solución de sellado (0,5% de agarosa en electrolito IX con trazas de bromofenol), a continuación se colocaron los cristales en la carcasa de la segunda dimensión, se añadió el electrolito IX (50mM Tris, 384 mM glicina, 0,2% SDS) en el reservorio inferior hasta la marca y a continuación se añadieron (al mismo tiempo) electrolito IX en el reservorio inferior y electrolito 2X al reservorio superior hasta que los dos niveles quedaron a la misma altura y entre los niveles máximo y mínimo. Se conectó entonces la fuente de refrigeración a 25 °C y se conectó la fuente de alimentación. Se aplicó un programa para mantener el trabajo constante 5 W/gel durante 15' y a continuación a 15 W/gel el tiempo necesario para que el frente de bromofenol alcanzara el final del gel. Cuando el frente lleguó al final del gel, se paró la electroforesis y se tiñó el gel.
- Tinción: Los geles se tiñeron con FLAMINGO FLUORESCENT STAIN (Bio Rad), con excepción de los geles preparativos que se tiñeron con azul de Coomasie. La tinción con FLAMINGO se inició con un paso de fijación de 2 horas en una solución 40% etanol, 10% acético, a continuación se añadieron 500 mi de FLAMINGO por cada gel y se dejó durante 3 horas en agitación. Finalmente se hizo un paso de lavado con agua y se escaneó en un escáner FX (BioRad) a través del programa PDQuest. La tinción con azul de Coomassie se llevó a cabo en los geles preparativos y se hizo mediante inmersión de los geles durante 3 horas en una solución (0,1% CBB, 40% etanol, 10% acético). De esta forma el gel quedó completamente azul y, a continuación, se destiñó haciendo múltiples pases con solución de destinción (etanol 30%>, acético 10%>), hasta que el gel quedó totalmente transparente.
- Conservación de los geles: Los geles se conservaron envasados al vacío a 4°C y en oscuridad, especialmente los teñidos con fluorescencia.
- Análisis de los geles 2-D de la fracción insoluble: El análisis de los geles, tanto de los correspondientes a la fracción insoluble, como los correspondientes a la fracción soluble, se llevó a cabo a través del programa PDQuest. En los geles de la fracción insoluble se encontró una media de 1632 "spots" (manchas), mientras que en los de la fracción soluble se encontró una media de 814 spots. Cada spot corresponde a una proteína o fracción de proteína.
1.5. Comparación cuantitativa y espectrometría de masas
La comparación cualitativa de los geles correspondientes a la región contralateral y a la zona peri-infarto no reveló la presencia de inguna diferencia en la expresión de proteínas insolubles. Sin embargo, el análisis cuantitativo/ estadístico demuestro la existencia de 9 spots cuya expresión era significativamente diferente en las regiones periinfarto y contralateral (Fig. 2) siendo, como poco al menos 3 veces mayor en la región de periinfarto. La Tabla 1 muestra las diferencias de 4 de esos 9 spots.
Tabla 1.- Diferencias en los spots de las regiones contralateral y peri-infarto
Figure imgf000029_0001
La Fig. 3 muestra la diferencia de expresión del spot S3716.
Para terminar el análisis proteómico se llevó a cabo la identificación de los spots diferenciales mediante espectrometría de masas. La Fig. 4 muestra el espectro de masas del spot S3716 y la correspondiente identificación, que en este caso correspondió a una proteína de choque térmico, la "heat shock protein" de 70 kDa 1A/1B (HSP70).
Puesto que uno de los objetivos de la invención es que los liposomas desarrollados participen en procesos de reconocimiento celular con las células que están expresando el marcador diana, es requisito para ello que las proteínas que vayan a ser reconocidas por los anticuerpos unidos a los liposomas estén presentes en la membrana celular, bien porque sean parte constitutiva de la misma, o bien porque estén asociadas a la membrana plasmática al menos en algún momento de su ciclo. La proteína HSP70, como se comentó previamente, cumple ese requisito, pues en determinadas ocasiones puede aparecer anclada a la membrana.
Dada la importancia de las proteínas de choque térmico en la respuesta a la agresión celular, y teniendo en cuenta la gran diferencia de expresión encontrada (32 veces mayor en la región peri-infarto respecto a la región contralateral), se decidió continuar el estudio con la proteína HSP70.
- Ejemplo 2: Síntesis de liposomas
Los liposomas utilizados en la presente invención tienen como base el fosfolípido l,2-Diestearoil-sn-Glicero-3-fosfocolina (DSPC) y colesterol, en porporciones que varían de 2,5 : 1 a 1 ,5 : 1. A éstos se les añade una proporción de 0,05 : 1 a 0,25: 1 de l,2-Diestearoil-sn-Glicero-3-fosfetranolamina-N-[Metoxi(polietilenglicol)- 2000] (PEG2000-DSPE) con la finalidad de que las cadenas de PEG enmascaren los liposomas a la respuesta inmune de los organismos in vivo y así facilitar largos tiempos de permanencia en el torrente sanguíneo in vivo.
2.1. Preparación de los liposomas base
Para preparar los liposomas se usó el método de rehidratación de película en la que los componentes se mezclan en estado sólido en las proporciones adecuadas y acto seguido se disuelven en una mezcla cloroformo/metanol de 1 : 1 a 1,5: 1 (v:v). La disolución se evaporó hasta sequedad en un rotavapor a 313 K. Una vez que los disolventes orgánicos se han evaporado y se ha formado una película en el fondo del balón del rotavapor, se redisolvió la mezcla en HBS (HEPES Buffer Solution 20 mM, NaCl 135 mM, pH 7.4, Sigma-Aldrich). Para definir el tamaño de los liposomas (-100 nm de forma habitual), la suspensión resultante se pasó de 4 a 6 veces por un extrusor con filtros de membrana de policarbonato de 200 nm de poro y después se pasó de 8 a 14 veces por filtros de 100 nm de poro de membrana. Todo el proceso de extrusión se llevó a cabo a 333 K. De esta manera se obtuvo una disolución en HBS de liposomas esféricos de tamaño en torno a 100 nm, tal y como puede observarse en la Fig. 5, obtenida con un microscopio electrónico de transmisión, y en la Fig. 6, una gráfica con la distribución de tamaños de los liposomas, en la que se ve que el diámetro de los mismos oscila entre 45y 450 nm, siendo 100 nm el tamaño medio.
2.2. Liposomas con sondas de imagen molecular
El siguiente paso consistió en la síntesis de sondas de contraste bimodales para imagen molecular. Para ello, se tomó como base los liposomas base mencionados con anterioridad y durante la fase de preparación se les añadió (Rodamine-PE). Estos fosfolípidos con rodamina entran a formar parte de la membrana de los mismos, lo que confiere al conjunto de liposomas la capacidad de fluorescencia.
La otra posibilidad es que las sondas moleculares permitan la detección de los liposomas mediante resonancia magnética. Para ello, se puede partir bien de los liposomas base o bien de los liposomas que ya llevan incluido el compuesto fluorescente, y se les incorporó un agente de contraste de resonancia magnética, concretamente basado en gadolinio: la sal del ácido dietilenetriaminopentaacético 0C,üJ- bis(8-estearoilamido-3,6-dioxaoctilamide)gado linio (Gd-DTPA-SADA) o bien, preferiblemente, la sal de gadolinio del ácido l,2-dimiristoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina-N-dietilentriamino pentaacético (PE-DTPA-Gd). Cualquiera de estos dos lípidos complejados con Gd se incorporan en la mezcla de preparado de liposomas, y se incorporan en su membrana, confiriendo a todo el conjunto del liposoma la capacidad de reducir los tiempos de relajación longitudinal (TI, también llamado spin- lattice) en resonancia magnética.
Para comprobar que realmente estos liposomas servían para obtener imágenes de tejido cerebral, se realizaron experimentos in vivo con ratas sometidas a oclusión de la arteria cerebral media tal como se ha explicado previamente. Las imágenes de resonancia magnética se tomaron a 9,4 T utilizando un Bruker Biospec. Los mapas TI y T2 se construyeron a partir de juegos de imágnes con 16 ecos (TE=6-9 ms) y 5 ó 10 valores de TR (que oscilaba entre 0,1-15 s). Los mapas de tiempos de relajación se calcularon ajustando las imágenes píxel a píxel (modelo exponencial simple para T2 y modelo de saturación-recuperación para TI) utilizando Image-J. Las soluciones de concentración variable de liposomas se prepararon utilizando el método de dilución- extracción descrito por Jo ver et al. (1990), refiriéndolas a la concentración total de gadolinio en las soluciones (recta calibrado usando dicho método con [Gd]o=120 microMolar, V=l mi ; v=0.2 mi ; factor Vf=0.8, n=13 diluciones, usando HBS como disolvente, usado también usado como vehículo para administración in vivo). Una vez inyectados en tejido cerebral, en imágenes de RM se observa perfectamente la presencia de los liposomas en mapas de tiempos de relajación o de relaxividad (Fig. 7, donde se indican los sitios de inyección de las cuatro formulaciones preparadas, puntos A y B [Gd] =70 microMolar, puntos C y D [Gd]=20 microMolar ), así como en imágenes con peso TI en RM (no mostradas), lo que permite su localización in vivo. A mayor concentración de liposomas en el tejido, mayor contraste. Como se ve en la Fig. 7, concentraciones crecientes de liposomas dopados con complejos de gadolinio, producen una disminución de los tiempos de relajación TI o lo que es lo mismo un crecimiento lineal de la relaxividad, que es la inversa del tiempo de relajación (Rl = 1/T1). Los estudios realizados indican que la concentración mínima de gadolinio necesaria en el parénquima cerebral para obtener una señal fue de 70 nM ([liposomas]=2,8 picomolar).
De esta manera, estos liposomas pueden ser utilizados para ser administrados a individuos vivos y, dado que atraviesan la barrera hematoencefálica, pueden ser utilizados para obtener imágenes de resonancia magnética de los cerebros de los mismos. Esto es así porque, si bien el gadolinio libre no puede administrarse a seres humanos, el gadolinio quelado no supone riesgos, por lo que su administración es permisible, y de hecho, es uno de los agentes de contraste habituales utilizados en estudios de resonancia magnética en la práctica clínica.
Si la obtención de los liposomas cargados con gadolinio se realiza a partir de liposomas ya marcados con rodamina, se obtienen liposomas con una doble funcionalidad, que pueden ser detectados mediante estudios de fluorescencia (que serán especialmente indicados para estudios ex vivo, donde dicha fluorescencia sea fácil de detectar) y en estudios in vivo, tras suministrar los liposomas a un individuo, detectando su presencia y localización mediante resonancia magnética. 2.3. Liposomas vectorizados
Como paso siguiente, se procedió a anclar proteínas en la superficie de los liposomas, proteínas que sirven como vectores en procesos de reconocimiento molecular con diferentes dianas en células o tejidos in vivo. El concepto se esquematiza en la Fig. 8, tomada de Mulder et al. (Mulder et al, 2004). Lo más significativo es que, cuando las células expresan la proteína diana, los liposomas se anclan y son incorporados en la célula.
En este caso, como lo que se desea es dirigir los liposomas preferentemente a la zona peri-infarto, en la que se sobreexpresa la proteína HSP70, la proteína anclada fue un anticuerpo anti-HSP70, concretamente el HSP-70 Antibody Rabbit Polyclonal, de Abbiotec, que reconoce la HSP70 de humanos, ratones y ratas.
Para la funcionalización de liposomas con dicha proteína se siguió el siguiente procedimiento:
a) Preparación de liposomas conjugados a proteínas:
- Preparar los liposomas tal como se describió en los apartados 2.1 y 2.2, pero reemplazando 2,5% en moles del PEG-lípido (PEG2000-DSPE) con Maleimida-PEG-lípido .
- Utilizar el siguiente tampon para hidratar los liposomas:
o HEPES: 2,38 g/1
o NaCl: 8,0 g/1
o pH: 6,7
b) Modificación de los grupos NH2 libres de la proteína (el anticuerpo con SATA: N- succinimidll-S-acetlltioacetatO), para unirla al grupo maleimida:
- Preparar el siguiente tampón:
o HEPES: 2,38 g/1
o NaCl: 8,0 g/1
o EDTA: 0,37 g/1
o pH: 7,0
- Disolver el anticuerpo en este tampón
- Preparar una solución nueva con 3 mg de SATA por cada 125 μΐ de DMF, comenzando con al menos 5 mg de SATA. - Añadir la solución de SATA/DMF la solución de proteína/tampón -1 : 100, v:v y SATA:proteína -1 : 10, peso:peso.
- Colocar en un agitador rotatorio de mesa durante 45 minutos
- Preparar un Vivaspin™ 50.000 (Sartorius Stedim Biotech) empapándolo una vez en 1 mi de tampón (3000g, 5 min)
- Utilizar el siguiente tampón para empapar el Vivaspin y lavar la solución de proteínas:
o HEPES: 2,38 g/1
o NaCl: 8,0 g/1
o pH: 7,4
- Poner la solución de proteínas en el Vivaspin y centrifugar a 3000 g durante 10 min.
- Lavar 2 veces con 1 mi de tampón a 3000g durante 10 min.
- Utilizar 200 μΐ de tampón para resuspender la proteína y pipetear en un tubo Eppendorf.
- Utilizar otros 200 μΐ para lavar el Vivaspin y pipetear en el mismo tubo Eppendorf.
- Este procedimiento da lugar a aproximadamente 0,5 mi de solución de anticuerpo modificado con SATA que se puede almacenar en la nevera.
c) Desacetilación de los grupos SATA.
- Preparar una solución nueva de:
o Hidroxilamina: 34,8 g/1
o HEPES: 119 g/1
o EDTA: 9,4 g/1
o pH: 7,0 (preparar por ejemplo 20 mi y añadir algunas lentejas de NaOH)
- Añadir esta solución de hidroxilamina a la solución de proteínas 1 : 10, v:v. (p. ej., 50 μΐ de solución de hidroxilamina por cada 500 μΐ de solución de proteínas)
- Colocarlo en el agitador rotatorio de sobremesa
d) Conjugación de la proteína a los liposomas de Maleimida y PEG - Añadir la solución de proteínas a la suspensión de liposomas y agitarla en un vórtex.
- Colocar N2 sobre ella y dejarlo durante toda la noche en la nevera, e) Lavado tras conjugación
- La suspensión de liposomas se puede lavar dos veces por medio de ultrancentrifugación a 55000-65000 rpm durante 45 minutos.
- Después de lavar, la concentración de lípidos deseada se puede obtener resuspendiendo el pellet lipídico en una cantidad específica de tampón con el pH deseado.
Siguiendo este procedimiento, se sintetizaron liposomas que en las cadenas PEG con terminación en maleimida, presentaban unido covalentemente un anticuerpo anti- HSP70 (el HSP-70 Antibody Rabbit Polyclonal, de Abbiotec, que reconoce la HSP70 de humanos, ratones y ratas), y que estaban marcados con gadolinio y rodamina. - Ejemplo 3: Estudio de la funcionalidad de los liposomas vectorizados con anti-HSP70
3.1. Estudios de transfección de astrocitos
Es conocido que cultivos de astrocitos primarios de rata sobre-expresan cantidades importantes de proteína HSP70 cuando son sometidos a un choque térmico (Freitas et al., 2002). De acuerdo con la bibliografía, se prepararon dos placas de astrocitos de rata hasta que alcanzaron un 70-80% de confluencia. Una de las placas se sometió a un choque térmico, colocándola durante 30 minutos en un incubador a 42°C. La segunda placa (control) se mantuvo en condiciones normales de cultivo (incubador a 37°C). Tras el periodo de estrés, la primera placa se devolvió al incubador original (37°C) y ambas placas se mantuvieron en él durante un periodo de recuperación de 6 h. Los autores antes señalados demostraron (mediante técnicas de Western-blot e inmuno- histoquímica) que transcurridas esas 6 horas, los astrocitos de rata sobre-expresan de forma considerable la proteína HSP70. En este caso, este cultivo se usó como modelo de zona peri-infarto de cerebro, donde se sabe que hay sobre-expresión de dicha proteína por la bibliografía existente, y por los estudios de proteómica realizados con anterioridad en los laboratorios del grupo de los presentes inventores. Una vez transcurridas las 6 horas de recuperación al estrés, los astrocitos fueron transfectados con liposomas, añadiendo 10 μΐ de disolución de liposomas H02 (con maleimida, pero sin anticuerpo, control negativo) o anti-HSP70 (liposomas vectorizados con proteína anti-HSP70) por pocilio (que contenían 200 μΐ de medio de cultivo cada uno), logrando una concentración total de lípidos de 15 mM por pocilio (12 pocilios en total), según el siguiente esquema:
Tabla 2: Esquema de tiempos y distribución del ensayo de liposomas
Figure imgf000036_0001
Así pues se obtuvieron los siguientes grupos experimentales (hasta 4 réplicas combinación):
Tabla 3: Grupos experimentales
Figure imgf000036_0002
Transcurrido el tiempo de incubación (30 min o 1 h) se procedió al lavado de las placas de astrocitos (3 veces cada una con medio de cultivo) y se observó si había ocurrido la transfección celular con liposomas mediante un microscopio de fluorescencia (hay rodamina presente en los liposomas). La observación de los astrocitos al microscopio permitió obtener las imágenes que se muestran en la Fig. 9
Una vez observados los astrocitos al microscopio, se trataron con acutasa (200 μΐ) para despegarlos de las placas de cultivo y se llevaron a tubos Eppendorf de 0,5 mi. Estos tubos se llevaron al equipo de imagen por RM para la caracterización de los tiempos de relajación de los mismos. Puesto que los liposomas contienen gadolinio, es de esperar que cuanta mayor cantidad de liposomas estuviera presente en las células (en ese momento ya en los tubos Eppendorf) menores serán los tiempos de relajación observados. Como control se estudiaron astrocitos a los que no se les añadieron liposomas.
Para la realización de estos estudios, se utilizó una secuencia RARE (factor 2) con un tiempo de eco de 12 ms y se obtuvieron imágenes con 8 tiempos de recuperación diferentes (variación exponencial entre 450 y 10000 ms), calculándose los tiempos de relajación TI mediante una ecuación exponencial simple (modelo de inversión- recuperación). Los resultados obtenidos se muestran en la Fig. 10.
Como puede observarse, el tratamiento con liposomas que presentan anticuerpos anti-HSP70 da lugar a una sensible disminución en el tiempo de relajación en los astrocitos tratados con los mismos. 3.3. Estudio de transfección de células endoteliales
Para confirmar los resultados obtenidos, se repitió el experimento con cultivos de células micro-endoteliales de rata. Se realizó un procedimiento experimental idéntico al anterior salvo en que la inducción de la expresión de HSP70 en estas células se realizó sometiendo a las mismas a 45°C durante 15 minutos (respetando un período de recuperación de 6 h post-choque térmico). Las células fueron transfectadas nuevamente con liposomas (10 μΐ de disolución de liposomas H02 o anti-HSP70 por pocilio conteniendo 200 μΐ de medio de cultivo cada uno, logrando una concentración total de lípidos de 15 mM por pocilio). Al ser las células endoteliales más sensibles que los astrocitos, durante su manipulación se levantaron de las placas, por lo que no fue posible observar su fluorescencia en el microscopio. No obstante, el contenido de los pocilios (suspensión de células en medio de cultivo) se traspasaron a tubos Eppendorf y se centrifugaron (5 min, 3000 rpm). Se retiró el sobrenadante y las células se lavaron con medio. El proceso de centrifugación, retirada de sobrenadante y lavado con medio se repitió 3 veces. Los pellets de células resultantes (que han de contener gadolinio de los liposomas si ha habido transfección) en medio de cultivo, fueron analizados por RM, obteniéndose los tiempos de relajación correspondientes.
Los resultados se muestran en la Fig. 11.
Los resultados obtenidos confirman la utilidad de los liposomas de la invención para diferenciar células que sobreexpresan HSP70 en muestras que las contienen, ya sea realizando análisis de fluorescencia o mediante resonancia magnética.
3.4. Estudio in vivo de mareaje de zona peri-infarto.
Para demostrar la efectividad de los liposomas anti-HSP70 sintetizados para mareaje de la zona peri-infarto in vivo se realiza el siguiente estudio,
a) inducción de lesión isquémica.
Se toman una ratas macho (250-300 g de peso) de la cepa Sprague Dawley y tras inducirle anestesia en una caja de inducción bajo atmósfera de sevofluorano al 6%, se traslada a la mesa de cirugía donde se continua con la anestesia con sevofluorano al 3% con una corriente de gas N20:02 en proporciones 65:35 y se procede a la cirugía de inducción de isquemia cerebral usando el modelo de sutura permanente de la arteria cerebral media. En breve, en primer lugar se realiza una incisión ventralmente en el cuello, de unos 3cm de longitud, por encima del esternón. Tras retirar el músculo omioide se diseca la arteria carótida común izquierda para, a continuación, ligarla mediante una doble sutura de 4/0. Tras cerrar la incisión se coloca al animal sobre su costado (derecho en este caso) para realizar un corte desde el extremo de la oreja izquierda hasta la comisura del ojo, dejando expuesto el músculo temporal que se retrae para exponer el hueso. Tras realizar un trépano en el mismo mediante un torno de microcirugía se retiraran las meninges y se aisla la arteria cerebral media (MCA). Con un gancho situado en un micromanipulador se levanta ligeramente la arteria separándola del parénquima cerebral y se sutura con una seda de 10/0 haciendo una doble lazada. A continuación re retira con cuidado el micromanipulador, dejando descansar de nuevo la MCA sobre la superficie cerebral, se vuelve a colocar el músculo temporal en su sitio, y se sutura la piel del animal, cerrando la herida. Acabada la cirugía se traslada el animal al equipo de resonancia magnética manteniendo la anestesia gaseosa, y se realiza una Angio-RM sin contraste (técnica 2D TOF-MRA) con un campo de visión de 32x32x14 mm que cubre por completo el cerebro desde la entrada de arteria carótida hasta el vértice del círculo de Willis. De esta manera es posible observar la oclusión de la MCA. Así mismo se realiza una imagen de difusión (imagen EPI-DWI en 5 cortes coronales de 2 mm de grosor, con gradientes de difusión en la dirección Perpendicular al eje rostro-caudal del animal , y usando los valores de b=600 y b=1500 s/mm2), para observar la extensión del núcleo de la lesión isquémica (al igual que se hace en la clínica humana).
El animal se devuelve a su jaula para que se recupere de la anestesia y se le deja reposar, con agua y comida ad limitum, durante 48 horas.
b) Estudio de la zona peri-infarto por RM
Al animal al que se le ha inducido una lesión isquémica 48 h antes, se le induce anestesia con Sevoflurano (3% en N20:02 en proporciones 65:35) y se le coloca un catéter Insyte Autogard de 22 G (de la casa comercial BD) en una de las dos venas de la cola, indistintamente. Si se necesita dilatar la vena se puede colocar una banda elástica en su parte superior para comprimirla durante la inserción del catéter.
A continuación se conecta al catéter una jeringa de 1 mi que contiene 0.5 mi de disolución de liposomas anti-HSp70 (vehículo Hepes Buffer Solution, HBS, concentración 100-300 mg lípidos /kg peso animal) y se introduce al animal dentro de la resonancia magnética.
Se obtiene una serie de imágenes con diferente peso TI (imágenes RARE, con factor 2, TE=20 ms, 14 cortes coronales de 1 mm de grosor, cubriendo todo el cerebro desde el bulbo olfatorio hasta el cerebelo, con una resolución en el plano de 100x100 mieras, y tiempos de repetición TR=0.5, 1.5, 3, 6 y 9 segundos), a partir de las cuales se realiza un mapa de tiempos de relajación TI y de relaxividades (1/T1) ajustando pixel a pixel las 5 imágenes de RM de TR variable a un modelo de saturación-recuperación, usando el software Image-J. Esta imagen es la imagen basal con los tiempos de relajación del tejido cerebral (sano e isquémico) antes de inyectar los liposomas. Una vez hecho esto, se inyectan los liposoma en la cola del animal y se espera a que circulen por el torrente sanguíneo. El set de imágenes con peso TI antes mencionado se repite 1 h tras la inyección y se repite a las 6, 12 y 24 h (tras 1 h post inyección y tras cada sesión que le sigue el animal se retira de la resonancia y se devuelve a su jaula para que se recupere). De esta manera se puede seguir la entrada de liposomas marcados con gadolinio, observando que su acumulación en la zona peri-infarto hace que los tiempos de relajación TI en dicha zona del tejido desciendan de forma significativa, lo que permite distinguirla del resto del tejido (tanto sano como núcleo de la lesión isquémica).
- Ejemplo 4: Validación de HSP70 como marcador de zona peri-infarto
Una vez realizados los estudios anteriores, se decidió llevar a cabo ensayos adicionales para validar a la proteína HSP70 como marcador de zona peri-infarto.
Para ello, se llevaron a cabo sobre otros animales.
Se usaron tres ratas macho de la cepa Sprague-Dawley (Harían Laboratories) de peso 261±12 g, mantenidas en condiciones controladas de temperatura (22±1 °C), humedad (60±5%) y en ciclos circadianos de luz/oscuridad de 12 horas cada uno. Los animales fueron alimentados ad libitum con pellets de comida comerciales, y agua. Para la cirugía y las exploraciones de imagen por RM los animales fueron anestesiados con sevofluorano (3% en 70% N20 y 30% 02). La temperatura rectal fue monitorizada y mantenida durante los procedimientos, mediante un sistema de control de temperatura con retroalimentación (1025 system, SA Instruments, NY, USA). Los animales fueron sacrificados en el punto final mediante sobredosis de sevofluorano (8%>). Todos los procedimientos fueron realizados siguiendo las regulaciones de la UE (European Communities Council Directive of 24 November 1986 - 86/609/EEC).
Para obtener el modelo de isquemia, se procedió a la oclusión de la arteria cerebral media. Se realizó una oclusión permanente de la arteria cerebral media (ACM) izquierda por sutura de la arteria, siguiendo el método descrito por Shigeno et al. (Shigeno et al, 1985). En breve, se practicó una incisión en el músculo temporal de la rata. Se retrajo y se expuso el hueso del cráneo, en el que se practicó un pequeño agujero (3 mm) con un torno de cirugía. Tras exponer la arteria cerebral media (ACM) en su zona proximal, en donde se bifurca en sus ramas frontal y parietal, la ACM es retraída de la superficie del encéfalo mediante un gancho Sinskey conectado a un micromanipulador (World Precisión Instruments Inc., FI, USA) y la arteria fue ligada con una sutura Ethilon 10-0 (poliamida 6 de Ethicon Inc, NJ. USA). El gancho fue retirado dejando la arteria de nuevo sobre la superficie cerebral, y la ausencia de flujo sanguíneo fue visualmente confirmada mediante una lupa quirúrgica. Finalmente, el músculo temporal fue recolocado en su sitio, y se practicó una sutura para cerrar la zona de la cirugía. Todo el procedimiento fue llevado a cabo tras la previa sutura de la arteria carótida ipsilateral.
Los animales fueron sacrificados 48 h tras la inducción de la isquemia. Los animales fueron sometidos a perfusión intracardíaca con 100 mi de PBS a pH 7,4, seguido de 300 mi de formaldehído al 4% y pH 7.4. Tras la perfusión, los cerebros fueron extraídos con cuidado, y post-fijados en formaldehído al 4% durante toda la noche. Al día siguiente, los cerebros fueron crioprotegidos con sacarosa al 20% en PBS a 4°C durante 24 horas más, y finalmente embebidos en O.C.T., y rápidamente congelados en 2-metilbutano enfriado por nitrógeno líquido. Los cerebros se almacenaron a -80°C hasta su utilización.
4.1 Estudios de validación por técnicas de Western-Blot
Se procedió a validar los resultados obtenidos en los estudios proteómicos previos por técnicas de western-blot.
El primer paso fue la puesta a punto de las técnicas Western-blot para la proteína HSP70 (concentraciones adecuadas de los anticuerpos, concentración de los geles de base, etc.), utilizando muestras de cerebro de rata, almacenadas a -80°C, obtenidas de animales sacrificados a las 48 horas de haber sido sometidos a una isquemia cerebral permanente, mediante sutura de la arteria cerebral media.
Se realizó la homogenización de tejidos en 0,5 mi del tampón de extracción "Cell Extraction Buffer" (Invitrogen) mediante sonicación (50 pulsos a 100% de intensidad y con intervalos de 0,5). Se centrifugaron las muestras a 18.000 x g para eliminar los restos celulares y se recogió el sobrenadante. Se calculó la concentración proteica del sobrenadante mediante el método de Bradford y se diluyeron las muestras con "Cell Extraction Buffer" hasta alcanzar una concentración de 2 mg/ml. A continuación se hizo una dilución 1 : 1 de parte de la muestra con Laemmli Buffer 2X (Laemmli et al., 1970) (adquirido a Santa Cruz Biotechnology, Inc, número de catálogo: sc-286962). Antes de iniciar la electroforesis se agitaron las muestras a 99 °C durante 5 minutos. La electro foresis se llevó a cabo en geles de acrilamida con gel separador al 10% y gel concentrador al 5%, aplicando un voltaje constante de 120 V hasta que el frente de bromofenol (colorante marcador del estado de progresión) alcanzó el final del gel. Se cargaron los geles de 0,75 mm de grosor, con 10 pocilios cada uno. En cada uno de los geles se cargó uno de los pocilios con marcador de peso molecular. A continuación se dejó un pocilio vacío y en el resto de los pocilios se alternó región contralateral y región de infarto. La carga fue de aproximadamente 20 microgramos de proteína (20 microlitros de muestra), por cada pocilio. Finalizada la electroforesis se recortaron los geles, dejando en cada uno una muestra de región contralateral y una muestra de región peri-infarto. Las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF en un sistema "Semy- Dry" mediante la aplicación de un voltaje de 15V durante 30 minutos. Las membranas se bloquearon en 5% de leche en polvo disuelta en TBS durante 2 horas, se lavaron 3 veces en TBST durante 5 minutos cada uno de los lavados y se incubaron con los anticuerpos primarios de HSP70 (Ab5439 de Abcam, Cambridge, UK). Cada una de las membranas fue incubada simultáneamente con anticuerpo frente a la actina (Anti-b- actin, Abcam, Cambridge, UK) (anticuerpo que procede de conejo y, los otros de ratón), como control de carga, durante toda la noche a 4°C. Tras esta incubación se lavaron de nuevo las membranas en TBST 3 veces durante 5 minutos cada lavado. Finalmente se incubó cada membrana con anticuerpo secundario anti-ratón marcado con Cy3 (GE Lifesciences) para revelar cada una de las proteínas específicas y con anticuerpo secundario anti-conejo marcado con Cy5 (GE Lifesciences) para revelar el control de carga (actina) (Anti-b-actin, Abcam, Cambridge, UK). La concentración de cada uno de los anticuerpos secundarios utilizada fue de 1 :3000. Las condiciones de trabajo optimizadas se presentan en la siguiente tabla:
Tabla 4: Condiciones de trabajo con el anticuerpo anti-HSP70 inicial
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Anti-HSP70 1 :666
En la Fig. 12a se pueden ver los resultados de Western-blot obtenido para la HSP70, usando actina como referencia, para tejido sano, tejido de la región peri-infarto y zona de la lesión isquémica. La Fig. 12b muestra una cuantificación de las bandas de Western-blot de la figura anterior. A la vista de la figura se podría concluir, en principio, que los resultados obtenidos por Western-blot contradicen aquellos resultados previos del Ejemplo 1, ya que la expresión de la proteína HSP70 en la zona peri-infarto no parece ser diferente de la expresión en la región contralateral. 4.2 Estudios de validación por técnicas de inmuno-histoquímica e inmuno- fluorescencia
Ante los resultados obtenidos con el Western-blot, se planteó la realización de un estudio inmuno-histopatológico de expresión de esta proteína.
Para ello, los cerebros fueron cortados en secciones de 20μιη con un criostato y los cortes fueron secados en una estufa a 37 °C, y posteriormente almacenados a -20°C hasta su uso. Los cortes fueron rehidratados en PBS e incubados con 0.3% de H202 durante 15 min, para bloquear la actividad de la peroxidada endógena. Tras lavar por tres veces (5 min) los cortes en PBS, éstos fueron incubados en 2%> de suero en 0,2%> Tritón X-100 PBS durante 2 h, para bloquear los lugares de unión de anticuerpos inespecíficos. A continuación, se usaron anticuerpos primarios monoclonales de ratón anti HSP70 (Ab5439, 1 :50, Abcam, Cambridge, UK), HSP72 (1 :50, clone C92F3A-5, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY), y β-Tubulina (1 :50, Abcam, Cambridge, UK), y anticuerpos primarios policlonales de oveja anti Pre albúmina (1 : 100, Abcam, Cambridge, UK). Tras incubación por 1 h con los correspondientes anticuerpos primarios, se lavó 3 veces con PBS (5min), y se realizó una incubación durante 1 h con un anticuerpo IgG de caballo anti-ratón biotinilado, adsorbido a rata (1 :200, Vertor Laboratories, Burlingame, CA), o un anticuerpo secundario de conejo anti-oveja conjugado con HRP para pre albúmina, seguido de tres lavados de 5 min. A continuación, se usó una dilución 1 : 100 de avidin-DH y peroxidasa biotiniladae (Vertor Laboratories, Burlingame, CA) durante 1 h (excepto para la pre albúmina). Tras tres nuevos lavados de 5 min con PBS, las muestras se incubaron con solución de diaminobencidina al 2% (Dako Diagnósticos, S.A., Barcelona) durante 2 min. Tras tres nuevos lavados de 5 min con PBS, las muestras fueron deshidratadas con diluciones progresivas de etanol (50%- 100%) y lavado con xilol. Finalmente las secciones fueron montadas en vidrio con enthellan y almacenadas a temperatura ambiente hasta su uso.
Para el análisis inmuno-histoquímico, de cada cerebro se usaron cuatro secciones de 20 μιη de grosor, y separadas entre sí 100 μιη. Se tomaron imágenes representativas de la zona del infarto y de la zona contralateral usando un microscopio Olympus, a un factor de magnificación lOx.
Los resultados del análisis histopatológico de tejido cerebral de ratas isquémicas, realizado con el anticuerpo anti-HSP70 de Abcam, confirmaron los estudios de Western-blot anteriores, contradiciendo a los estudios proteómicos previos (véase la Fig. 13a): la expresión de la proteína resultó ser constitutiva en todo el tejido, presentando un gran número de células marcadas con anti-HSP70 en el lado del cerebro contralateral a la lesión, en la zona peri-infarto y en el núcleo de la lesión.. Esto hizo pensar que podría haber una expresión diferencial de las formas constitutiva (HSC70) e inducible (HSP72) de la proteína HSP70.
Partiendo de esta premisa, se procedió entonces a repetir los estudios inmuno- histoquímicos, usando esta vez el anticuerpo correspondiente a la forma inducible de la proteína, la HSP72 y no los anticuerpos correspondientes a la forma constitutiva HSC70. El resultado se muestra en la Fig. 13b
En este caso, se ve claramente que existe una expresión clara de la proteína de forma exclusiva en la zona peri-infarto del tejido cerebral, y una expresión muy esporádica y significativa en la zona del núcleo de la lesión isquémica. Así, la forma inducible de la proteína HSP70, HSP72, se confirma como un marcador específico de zona peri-infarto.
Una vez obtenido este resultado, se profundizó en el estudio de las diferencias de expresión entre las proteínas HSC70 y HSP72, mediante un nuevo experimento con secciones de tejido cerebral de animales isquémicos, en las que se realizaron tinciones para GFAP (polyclonal anti-GFAP, Sigma-Aldrich) (de astrocitos, que a las 48 tras la lesión no se expresan en el núcleo isquémico, delimitando así dicha zona), y también para las proteínas HSC70 y HSP72, en cortes de tejido consecutivos.
Como se aprecia en la Fig. 14, la proteína HSP72 (fotografías D a F) se expresa exclusivamente en la zona peri-infarto y es un marcador específico de dicha zona: la proteína se expresa de forma específica en la zona que bordea la lesión (zona peri- infarto). El uso de anticuerpos anti HSC70 (fotografías G a l) muestra expresión constitutiva en la totalidad del tejido cerebral, y aunque existe mayor expresión en la zona peri-infarto, esta proteína no sirve como marcador de dicha zona, por la escasa diferencia de expresión entre la zona peri-infarto y el resto del tejido. Un estudio detallado de los cortes histológicos, especialmente las secciones (B) y (C) de la Fig. 14, indica que en la zona de expresión de la proteína HSP72 existe una marcada expresión de células GFAP positivas (astrocitos), aunque por la morfología de las células que expresan HSP72 parece la típica de las neuronas. Para tener certeza del tipo celular que expresa la forma inducible de la proteína HSP72, se realizó una tinción doble con dos marcadores fluorescentes diferentes: un anticuerpo secundario con el fluoróforo daylight 488 (VERDE) fue usado para marcar las células GFAP positivas (astrocitos) y otro marcador secundario marcado con el fluoróforo daylight 594 (ROJO) fue usado para marcar las células HSP72 positivas. Los resultados pueden observarse en la Fig. 15.
Estos estudios confirman que la expresión de HSP72 es muy elevada en la zona peri-infarto, y mucho menor en la zona del núcleo de la lesión, así como inexistente en la zona de tejido sano. La fusión de las señales de fluorescencia de HSP72 y GFAP (columna derecha de fotografías) demuestra que no hay colocalización de ambos marcadores (HSP72 y GFAP), lo que indica que no son los astrocitos el tipo celular que está expresando esta proteína de choque térmico, HSP72. La morfología de las células que expresan HSP72 parece la típica de las neuronas.
4.3.Estudios de validación por técnicas de Western-blot bidimensionales
Para corroborar los resultados anteriores se realizaron estudios bidimensionales, puesto que con técnicas ordinarias de Western-blot no es posible separar las dos formas de la HSP70, aplicando el simple criterio de masa molecular (misma fracción de masa). Así pues, se preparó un experimento de Western-blot en el que las proteínas de tejido cerebral de la zona peri-infarto y zona de tejido contralateral se separaron mediante electroforesis bidimensional, de forma análoga a la descrita en el punto 1.4, en el que las proteínas fueron separadas primero por su punto isoeléctrico (primera dimensión), y por su masa molecular después (segunda dimensión). Los resultados se muestran en la Fig. 16.
Estos nuevos estudios de Western-blot concuerdan y confirman totalmente los resultados hallados en los estudios de proteómica e inmuno-histoquímico realizados previamente. Asimismo, queda confirmada la existencia de un marcador especifico de la zona peri-infarto, que corresponde a la forma inducible de la proteína HSP70, denominada con mayor propiedad como proteína HSP72.
- Ejemplo 5: Análisis expresión espacio-temporal del marcador específico HSP72
Una vez aclarada la existencia de resultados aparentemente contradictorios obtenidos, y una vez validada HSP72 como marcador específico de la zona peri-infarto, se procedió al estudio espacio-temporal de dicho marcador en la isquemia cerebral, realizando para ello un estudio inmuno-histoquímico en un modelo animal de isquemia cerebral.
5.1 Procedimiento técnico y quirúrgico
Se emplearon 10 ratas Sprague-Dawley macho (Harían Laboratories) de peso 361±12 g, mantenidas en condiciones controladas de temperatura (22±1 °C), humedad (60±5%) y en ciclos circadianos de luz/oscuridad de 12 horas cada uno. Los animales fueron alimentados ad libitum con pellets de comida comerciales, y agua. Un animal muró durante la cirugía. Para la cirugía y las exploraciones de imagen por RM los animales fueron anestesiados con sevofluorano (3% en 70% N20 y 30% 02). La temperatura rectal fue monitorizada y mantenida durante los procedimientos, mediante un sistema de control de temperatura con retroalimentación (1025 system, SA Instruments, NY, USA). Los animales fueron sacrificados en el punto final mediante sobredosis de sevofluorano (8%>). Todos los procedimientos fueron realizados siguiendo las regulaciones de la UE (European Communities Council Directive of 24 November 1986 - 86/609/EEC).
Los animales fueron sometidos a una isquemia focal transitoria de 90 min por colusión intraluminal de la arteria cerebral media (oACM), según el modelo descrito por Longa (Longa et al. 1989), ligeramente modificada. Según este procedimiento, se aislaron del tejido conjuntivo la arteria carótida común, la externa y la interna izquierdas del animal, a través de una sección practicada en el cuello del animal. A continuación se ligan la rama externa de la carótida y la arteria pterigopalatina con sutura de 6-0, tras lo que se introduce en la rama interna de la carótida un filamento 3-0 de nylon de unos 23 mm de longitud y con la punta engrosada por calor. El filamento se avanza a través de la externa-interna, para ocluir el origen de la ACM. Se usa una sonda de doppler (PeriFlux 5000; Perimed AB, Stockholm, Suecia) para medir el flujo cerebral durante toda la operación, y poder monitorizar así el punto exacto en el que tiene que ser situado el filamento, para causar la oclusión de la ACM y observar una caída significativa (>75%) del flujo sanguíneo cerebral del tejido irrigado por la ACM. Tras la observación de una reducción mantenida de flujo por un periodo de 90 min, el filamento intraluminal es retirado para permitir la reperfusión del tejido cerebral (monitorizada por la sonda doppler), se suturan al animal, y este se deja recuperar de la cirugía.
Los animales fueron sacrificados a diferentes tiempos tras la cirugía de oclusión, en concreto a las 6, 12, 24, 48 y 72 horas y a los 5, 7, 10 y 14 días tras la cirugía, y sus cerebros fueron extraídos tras perfusión intracardiaca con 100 mi de PBS (pH 7.4) y con 300 mi de formaldehido al 4% (pH=7.4). Los cerebros enteros extraídos del cráneo fueron posteriormente post-fijados en formaldehido al 4% y a 4 °C durante toda una noche, y crio-protegidos por inmersión en sacarosa al 20% en PBS a 4 °C durante otras 48 h. Tras este periodo, se embebieron los cerebros (cortados en secciones coronales de 2 mm de grosor) en O.C.T. y se congelaron en 2-metil-butano enfriado con nitrógeno líquido. Las secciones congeladas se conservaron a -80 °C hasta su uso en histología.
Para los estudios inmuno-histológicos, se cortaron secciones coronales del cerebro de 20 mieras de grosor en un criotomo y se secaron en una estufa a 37 °C. Hasta su posterior uso, las secciones se preservaron a -20 °C. Cada sección fue rehidratada con PBS e incubada en H202 al 0.3% durante 15 min, para bloquear la actividad de peroxidasa endógena. Tras tres lavados de 5 minutos en PBS, las secciones fueron incubadas en suero al 2% en Tritón X-100 al 0.2% en PBS durante 2 h, para bloquear las uniones de anticuerpo inespecíficas. A continuación se usaron anticuerpos monoclonales primarios anti HSP72 (1 :50, clone C92F3A-5, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY) durante 1 h, y se continuó con un lavado de 5 min por triplicado con PBS. Se prosiguió con una incubación de 1 h con un anticuerpo IgG de caballo antiratón biotinilado y adsorbido a anticuerpo de rata (1 :200, Vertor Laboratories, Burlingame, CA), seguido de un lavado por triplicado de PBS (5min). El siguiente paso consistió en la incubación durante 1 h con una dilución 1 : 100 de avidin-DH y de peroxidasa biotinilada (Vertor Laboratories, Burlingame, CA), seguido de un lavado por triplicado de las secciones con PBS (5 min) y la incubación con 2% diaminobenzidine solution (Dako Diagnósticos, S.A., Barcelona) durante 2 min. Tras un nuevo lavado por triplicado con PBS (5 min), las secciones fuero deshidratadas con disoluciones de etanol en agua, de concentración creciente (desde el 50% al 100%) y lavadas con xylol. Finalmente las secciones fueron montadas con entellan, y almacenadas a temperatura ambiente.
5.2 Análisis de expresión de la proteína HSP72
Para la realización del estudio espacio-temporal de la expresión de la proteína HSP72 tras la isquemia cerebral, en primer lugar se seleccionaron secciones cerebrales equivalentes en cada uno de los cerebros (secciones coronales a la distancia Bregma + 0.5, aproximadamente, que corresponde a la zona media de la típica lesión isquémica causada con el modelo qurúrgico empleado), extraídos a diferentes tiempos tras la inducción de la isquemia (6, 12, 24, 48 y 72 horas y a los 5, 7, 10 y 14 días). En esas secciones se seleccionaron cuatro regiones diferentes, representativas de zonas de tejido cerebral habitualmente afectadas por la cirugía practicada, tal y como se representa en la Fig. 17.
Para cada corte de tejido se tomaron imágenes digitales de microscopía (200x) de las 4 zonas marcadas en la Fig. 17 y se realizó un recuento de la densidad de células marcadas para HSP72 en cada una de ellas.
La Tabla 5 recoge la densidad de células positivas en secciones coronales de animales isquémicos a diferentes tiempos tras la inducción de las isquémia. Las zonas denominadas 1 y 3 corresponden a la zona peri-infarto y las zonas 2 y 4 se asocian con el núcleo de la lesión, y se corresponden con las regiones presentadas en la Fig. 17.
Tabla 5: Densidad de células marcadas con HSP 72, detectada en cada una de 4 zonas marcadas en la Fig. 17.
Densidad (células por mm2)
Tiempo región peri-infarto núcleo lesión
TOTAL
1 3 2 4
6h 14 14 320 20 92
12h 313 102 333 1 16 216
24h 136 231 156 41 141
48 h 102 177 34 34 87
72h 102 150 61 14 82
5d 48 88 20 0 39
7d 41 68 0 0 27
10d 0 7 0 48 14
14d 41 0 0 0 10
Los resultados reflejados en dicha Tabla se presentan a su vez en la Fig. 18, Como se observa en la figura, y en lo que se refiera a la densidad de células que expresan HSP72 en todo el territorio afectado (promedio de las 4 zonas estudiadas), se obtiene un perfil temporal con un máximo de expresión de esta proteína a las 12 h (0.5 días) de la inducción de la lesión, y que progresivamente disminuye hasta la presencia esporádica a los 10 días. Así, resulta significativo el diferente perfil temporal de expresión en la zona del infarto (rápida expresión en las primeras 12 h y destrucción del tejido a partir de ahí) y la zona peri-infarto (expresión entre 12 h y 7 días del marcador).
La expresión del marcador elegido (HSP72) sigue siendo elevada a las 48 h, y en todo caso, suficiente para ser detectado por las técnicas empleadas. Esto confirma la validez de este punto temporal como el momento elegido para el estudio proteómico inicial, y un estudio del perfil temporal de expresión de una o unas pocas proteínas seleccionadas. Igualmente confirma que es punto temporal válido para identificar la zona peri-infarto en un paciente que haya sufrido un atque isquémico. Además, la realización de estudios de expresión proteica en fase aguda del ictus (<24 h) podría haber resultado en la identificación de marcadores que sólo se expresasen en esa fase.
La expresión media del marcador HSP72 (gráfica superior de la Fig. 18) muestra un típico perfil de evolución que indica que el punto máximo de expresión de la proteína es a las 12 h, cuando no sólo se expresa en la zona peri-infarto, sino también en zonas del tejido correspondientes al núcleo isquémico. Este análisis se completa con el de la segunda gráfica presentada en la Fig. 18 donde, en primer lugar, se puede concluir que la expresión de la proteína HSP72 es mayor en la zona peri-infarto que en propio núcleo isquémico. Esta diferencia es muy clara a partir de las 24-48 primeras horas, ya que durante la fase aguda del ictus (< 24h) existen células de la zona del núcleo isquémico que aun sobreviven, y que expresan la proteína de choque térmico. Dicho en un lenguaje coloquial, existirían islas de tejido peri-infarto en medio del núcleo isquémico. A las 24 h casi todas ellas habrían sido reclutadas ya para la zona de núcleo. A partir del décimo día, la expresión de HSP72 es anecdótica, y los resultados son poco significativos.
Finalmente, y teniendo en cuenta los datos reflejados en la Tabla 5, se ha realizado una imagen en la que se refleja un mapa de densidad de expresión temporal de proteína HSP72 en el cerebro isquémico, superponiendo una imagen de Resonancia Magnética de la lesión isquémica típica del modelo animal empleado. La imagen obtenida se muestra en la Fig. 19.
- Ejemplo 6: Estudio de la funcionalidad de los liposomas vecto rizados con anti-HSP72
6.1. Obtención de liposomas vectorizados con anti-HSP72
Una vez validada la proteína HSP72 como marcador molecular de la zona peri- infarto, se repitieron los estudios de funcionalidad de liposomas vectorizados mostrados en el Ejemplo 3, utilizando esta vez liposomas vectorizados con un anticuerpo específico dirigido contra la proteína HSP72, en lugar de estar vectorizados con el anticuerpo policlonal utilizado en los Ejemplos previos. De esta manera, se quiso validar definitivamente la utilidad funcional de los liposomas que llevan unidos anticuerpos dirigidos específicamente contra la proteína HSP72.
Para ello, se prepararon liposomas vectorizados siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 2, particularmente en la sección 2.3., con la diferencia de que, en esta ocasión, se utilizó como anticuerpo anti-HSP72 del clon C92F3A-5, de Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY (que reconoce HSP72 humana, de ratón, de rata, bovina, beluga, C. elegans, perro, pollo, Drosophila, pez, gerbo, guinea pig, hámster, mono, cerdo, conejo, oveja, y Xenopus) . Los liposomas obtenidos se denominaron en este caso "Lipos anti-HSP72". Con ellos se repitieron los ensayos realizados en el Ejemplo 3.
6.2. Estudio de transfección de astrocitos
De forma análoga a la descrita en la sección 3.1, se prepararon dos placas de astrocitos de rata hasta que alcanzaron un 70-80% de confluencia. Una de las placas se sometió a un choque térmico, colocándola durante 30 minutos en un incubador a 42°C. La segunda placa (control) se mantuvo en condiciones normales de cultivo (incubador a 37°C). Tras el período de estrés, la primera placa se devolvió al incubador original (37°C) y ambas placas se mantuvieron en él durante un período de recuperación de 6 horas, momento en el que, como ya se comentó, los astrocitos de rata sobreexpresan de forma considerable la proteína HSP70. En este caso, de nuevo, el cultivo se usó como modelo de la zona peri-infarto de cerebro.
Una vez transcurridas 6 horas tras la inducción de estrés, los astrocitos fueron transfectados con liposomas, añadiendo por pocilio 10 μΐ de disolución de los liposomas control no vectorizados H02 previamente descritos en el Ejemplo 3, o vectorizados con anti-HSP72 (que contenían 200 μΐ de medio de cultivo cada uno), logrando una concentración total de lípidos de 15 mM por pocilio (12 pocilios en total), según el esquema que se muestra en la siguiente tabla:
Tabla 6: Esquema de tiempos y distribución del ensayo de liposomas
Placa I : control, astrocitos I I SI*7 <-)
Tiempo incubación Pocilios
:IÍIÍÜ Lipos anti-HSP72 Lipos H02 No lipos
Hilii!IS Lipos anti-HSP72 Lipos H02 No lipos
iüi Lipos anti-HSP72 Lipos H02 No lipos
Lipos anti-HSP72 Lipos H02 No lipos
Placa 2: choque térmico, astrocitos I ISP70(+)
Tiempo incubación Pocilios
30 niin Lipos anti-HSP72 Lipos H02 No lipos
30 min Lipos anti-HSP72 Lipos H02 No lipos
lü Lipos anti-HSP72 Lipos H02 No lipos
ili Lipos anti-HSP72 Lipos H02 No lipos Así pues se obtuvieron los siguientes grupos experimentales (hasta 4 réplicas por combinación), en los que se denomina HSP72(+) a los astrocitos sometidos a estrés térmico (sobreexpresión de la proteína HSP72) y HSP72(-) a los no sometidos a estrés térmico:
Tabla 7: Grupos experimentales
Figure imgf000052_0001
Transcurrido el tiempo de incubación (30 min o 1 h) se procedió al lavado de las placas de astrocitos (3 veces cada una con medio de cultivo) y se observó si había ocurrido la transfección celular con liposomas mediante un microscopio de fluorescencia, aprovechando la rodamina presente en los liposomas.
La observación de los astrocitos al microscopio permitió obtener las imágenes que se muestran en la Fig. 20.
Una vez observados los astrocitos al microscopio, se trataron con acutasa (200 μΐ) para despegarlos de las placas de cultivo y se llevaron a tubos Eppendorf de 0,5 mi. Estos tubos se llevaron al equipo de imagen por RM para la caracterización de los tiempos de relajación de los mismos. Puesto que los liposomas contienen gadolinio, es de esperar que cuanta mayor cantidad de liposomas estuviera presente en las células (en ese momento ya en los tubos Eppendorf) menores serán los tiempos de relajación observados. Como control se estudiaron astrocitos a los que no se les añadieron liposomas.
Para la realización de estos estudios, se utilizó una secuencia RARE (factor 2) con un tiempo de eco de 12 ms y se obtuvieron imágenes con 8 tiempos de recuperación diferentes (variación exponencial entre 450 y 10000 ms), calculándose los tiempos de relajación TI mediante una ecuación exponencial simple (modelo de inversión- recuperación). Los resultados obtenidos se muestran en el panel A de la Fig. 21. La cuantificación de los tiempos de relajación observados en el ensayo se representa en el panel B de dicha figura. Como puede observarse, el tratamiento con liposomas que presentan anticuerpos anti-HSP72 da lugar a una sensible disminución en el tiempo de relajación en los astrocitos tratados con los mismos, de forma coincidente a lo que se observó con el anticuerpo policlonal anti-HSP70 del Ejemplo 3.
6.3.. Estudio de transfección de células endoteliales
Para confirmar los resultados obtenidos, se repitió el experimento con cultivos de células micro-endoteliales de rata. Se realizó un procedimiento experimental idéntico al anterior salvo en que la inducción de la expresión de HSP70 en estas células se realizó sometiendo a las mismas a 45°C durante 15 minutos (respetando un período de recuperación de 6 h post-choque térmico). Las células fueron transfectadas nuevamente con liposomas (10 μΐ de disolución de liposomas H02 o anti-HSP72 por pocilio conteniendo 200 μΐ de medio de cultivo cada uno, logrando una concentración total de lípidos de 15 mM por pocilio) y se repitió el ensayo descrito en la sección 3.2.
Los resultados se muestran en la Fig. 22.
Los resultados obtenidos confirman la utilidad de los liposomas de la invención para diferenciar células que sobreexpresan HSP72 en muestras que las contienen, ya sea realizando análisis de fluorescencia o mediante resonancia magnética.
6.4. Estudio in vivo de la capacidad diagnóstica de los liposomas vectorizados. La visualización in vivo de la zona peri-infarto, definida en términos moleculares, es algo que no se había podido realizar hasta el desarrollo de la presente invención. En este sentido, como ya se había discutido, se suele hacer un paralelismo entre la denominada zona de penumbra isquémica, concepto radiológico ampliamente difundido a nivel clínico, y la zona peri-infarto. Pero ni su definición, ni su extensión, ni su evolución temporal coinciden exactamente. La zona de penumbra isquémica es una región de escasa persistencia en el tiempo (menos de 6 h tras la isquemia cerebral) mientras que la zona peri-infarto permanece hasta prácticamente una semana después. Puesto que el tejido incluido en la definición de zona peri-infarto es aun viable, y por lo tanto salvable, es imperativo el desarrollo de metodologías experimentales que permitan visualizar in vivo dicha zona. Los liposomas vectorizados frente a la proteína HSP72 cuya construcción se describe en la presente solicitud contienen sondas de imagen, que los hace detectables tanto por técnicas de imagen in vivo como ex vivo. La carga de complejos de gadolinio trivalente (Gd3 ) hace que sean detectables mediante técnicas de imagen por RM, en concreto, en imágenes ponderadas en TI . Por ello, se llevó a cabo un estudio en el que animales isquémicos (ratas) fueron inyectados con los liposomas vectorizados con anticuerpos anti-HSP72, obtenidos y utilizados según se describe en secciones anteriores del presente Ejemplo 6, y estudiados por técnicas de imagen por RM, según el protocolo experimental que se muestra en la Fig. 23. De acuerdo con el mismo, se realizaron 6 inyecciones de 1 mi de liposomas vectorizados con HSP 72 durante las primeras 30 horas, siguiendo el protocolo descrito por Ramos- Cabrer P. et al. (Ramos- Cabrer et al., 2011). Las imágenes ponderadas en TI se realizaron siguiendo el perfil temporal descrito en la Fig. 18, mediante la misma metodología previamente descrita para la obtención de dicha figura (ver Ejemplo 5, especialmente la sección 5.2). Al final del estudio se realizó un estudio histológico (IHC).
En primer lugar se obtuvieron imágenes de RM con peso TI de los animales antes de cualquier procedimiento, a modo de imagen de control, y para descartar posibles anormalidades antes de comenzar. A continuación, los animales fueron sometidos a un modelo de oclusión permanente de la ACM por sutura, tal y como se ha sido descrito para el estudio espacio temporal de la expresión de la proteína HSP72 descrito en el Ejemplo 5 de la presente memoria. Tras la oclusión de la arteria, se comenzó con una serie de inyecciones de disolución de liposomas en las venas yugulares de los animales (inyecciones cada 6 h alternando la arteria, para permitir un tiempo de recuperación de 12 h entre inyecciones en la misma vena). Se realizaron un total de 6 inyecciones de liposomas (disolución 25 mM) de 1 mi cada una, para un total de 150 micromoles de liposomas inyectados. Este esquema es el utilizado en estudios previos de neuroprotección/neuroreparación inducida por citicolina encapsulada en liposomas de la misma bas lipídica que los descritos en esta invención (Ramos-Cabrer P. et al, 2011),.
En paralelo a las inyecciones se realizaron una serie de imágenes de RM ponderadas en TI en un equipo de imagen de 9.4 Tesla. Es importante recomendar que la sensibilidad de detección de sondas de imagen molecular depende mucho de la intensidad del campo magnético aplicado (a mayor campo, mayor sensibilidad), por lo que el uso del sistema de 9.4 T ha resultado importante para la detección del gadolinio incluido en los liposomas. El uso de sistemas de campo más bajo puede requerir de una mayor cantidad de gadolinio para ser detectable. Para las imágenes se usó una secuencia RARE con los siguientes parámetros de imagen: factor RARE = 4; Tiempo de eco TE = 16.5 ms en orientación coronal y TE = 19 ms en orientación axial; Tiempos de inversión (protocolo TI saturación-recuperación) TR = 900, 1500, 3000, 6000 y 9000 ms; Campo de visión FOV = 19.2 x 19.2 mm en orientación coronal y 25.6 x 19.2 mm en orientación axial; tamaño de matriz de 192 x 192 o 256 x 192 puntos, para una resolución espacial isotrópica de 100 mieras en el plano de imagen. Se obtuvieron 11 cortes consecutivos de 1 mm de grosor, y el tiempo de escaneado fue de 24 minutos por set de imágenes.
Una vez obtenidas las imágenes ponderadas en TI a diferentes tiempos de inversión, siguiendo un esquema de preparación de la señal de inversión-recuperación, se construyeron mapas de tiempos de relajación TI para cada tiempo, usando software desarrollado en nuestros laboratorios para la plataforma IDL (Interactive Data Language, ITT Visual Information Solutions, NY, USA).
Al finalizar los experimentos in vivo, se sacrificaron los animales, y se extrajo el cerebro para su estudio por microscopía de fluorescencia ex vivo, tal y como se describió en la sección de validación del marcador HSP72 por técnica inmunohistoquímicas
La Fig. 24 muestra imágenes representativas de los resultados obtenidos. Dicha Fig. 24 es la demostración de que la inyección intravenosa de liposomas vectorizados con HSP72 lleva a su acumulación en el tiempo en la zona de expresión de esta proteína, esto es, la zona peri-infarto. Tras sucesivas inyecciones de estos liposomas, la concentración de los mismos hace posible su detección en el sistema de RM de 9.4 Teslas de forma no invasiva. La rodamina presente en los liposomas también ha permitido detectar la presencia de liposomas en la zona peri-infarto por estudios ex vivo del tejido. Puede concluirse, por tanto, que queda mostrada la capacidad diagnóstica de los liposomas vectorizados con anticuerpos anti-HSP72 para la delimitación de la zona peri-infarto en la isquemia cerebral.
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Claims

REIVINDICACIONES
1. Un liposoma basado en l,2-Diestearoil-sn-Glicero-3-fosfocolina (DSPC), colesterol, l,2-Diestearoil-sn-Glicero-3-fosfetranolamina-N-[Metoxi(polietilenglicol)- 2000] (PEG2000-DSPE) y maleimida-PEG2000-DSPE, caracterizado porque el liposoma presenta anticuerpos dirigidos contra la proteína de choque térmico de 70 kDa (anti-HSP70) unidos al liposoma por el grupo maleimida.
2. Liposoma según la reivindicación 1, en el que las proporciones molares entre DSPC y colesterol varían entre 2,5: 1 y 1,5: 1.
3. Liposoma según la reivindicación 2, en el que la proporción molar del total de fosfolípidos con PEG2000-DSPE en su composición varía entre 0,05: 1 y 0,25: 1.
4. Liposoma según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la proporción DSPC:colesterol:PEG2000-DSPE es 0,62:0,33:0,05.
5. Liposoma según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la maleimida-PEG2000-DSPE está en una proporción 2,5% molar respecto al total de fosfolípidos con PEG2000-DSPE.
6. Liposoma según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, cuyo diámetro está en el intervalo de 45 a 450 nm.
7. Liposoma según la reivindicación 6, cuyo diámetro está en el intervalo de 90 a
140 nm.
8. Liposoma según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende fosfolípidos que llevan unido un compuesto fluoróforo.
9. Liposoma según la reivindicación 8, en el que el compuesto fluoróforo es rodamina.
10. Liposoma según la reivindicación 8 ó 9, que comprende 1 ,2-Dipalmitoil-sn- Glicero-3-fosfoetanolamina-N-(Lisamina Rodamina B Sulfonilo) (rodamina-PE).
11. Liposoma según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende fosfolípidos que comprenden una sal de gadolinio.
12. Liposoma según la reivindicación 11, que comprende la sal del ácido dietilenetriaminopentaacético a,tD-bis(8-estearoilamido-3,6-dioxaoctilamide)gadolinio (Gd-DTPA-SADA) o bien, la sal de gadolinio del ácido l,2-dimiristoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina-N-dietilentriaminopentaacético (PE-DTP A-Gd) .
13. Liposoma según las reivindicaciones 10 y 12, que comprende 1,2- Dipalmitoil-sn-Glicero-3-fosfoetanolamina-N-(Lisamina Rodamina B Sulfonilo) (rodamina-PE) y la sal de gadolinio del ácido l,2-dimiristoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina-N-dietilentriaminopentaacético (PE-DTP A-Gd) .
14. Liposoma según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los anticuerpos reconocen la forma HSP72 de la proteína HSP70.
15. Liposoma según la reivindicación 14, en el que los anticuerpos son anticuerpos específicos contra la forma HSP72.
16. Liposoma según la reivindicación 14 ó 15, en el que los anticuerpos reconocen la proteína HSP72 humana, de ratón o de rata.
17. Uso de los liposomas de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 16, para la identificación in vitro de células en las que la proteína HSP70 está sobreexpresada.
18. Uso según la reivindicación 17, en el que los liposomas comprenden fosfolípidos que comprenden un compuesto fluoróforo y en el que las células en las que la proteína HSP70 está sobreexpresada se identifican con las células en las que la señal de fluorescencia del fluoróforo comprendido en los liposomas es superior a la señal del resto de las células presentes en la muestra, tras haber puesto en contacto todas las células de la muestra con los liposomas.
19. Uso según la reivindicación 17, en el que los liposomas comprenden fosfolípidos que comprenden una sal de gadolinio y las células en las que HSP70 está sobreexpresada se identifican con las células que presentan los menores tiempos de relajación tras haber puesto en contacto las células con los liposomas y al hacer un estudio de resonancia magnética de la muestra.
20. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en el que las células en las que la proteína HSP70 está sobreexpresada son células presentes en una muestra de tejido cerebral.
21. Uso según la reivindicación 20, en el que se identifica la región peri-infarto como la región de la muestra de tejido cerebral en la que las que la proteína HSP70 está sobreexpresada.
22. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21; en el que las células se ponen en contacto con los liposomas incubando in vitro las células con los liposomas.
23. Uso según la reivindicación 22, en el que las células se incuban con los liposomas entre 10 minutos y 1 hora.
24. Uso según la reivindicación 20 ó 21, en el que las células se ponen en contacto con los liposomas inyectando los liposomas al animal en el que están presentes las células previamente a la toma de una muestra de tejido en la que están presentes dichas células, determinándose posteriormente in vitro tras haber extraído la muestra de tejido del individuo, las células en las que la proteína HSP70 está sobreexpresada.
25. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 24, en el que se identifican células en las que está sobreexpresada la forma HSP72 de la proteína HSP70.
26. Un método para la determinación de la región peri-infarto de un individuo a partir de neuroimágenes de resonancia magnética que comprende las siguientes etapas: a) suministrar al individuo una composición que comprende liposomas de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16;
b) obtener imágenes de resonancia magnética del cerebro del individuo;
c) identificar como región peri-infarto la región de las neuroimágenes que corresponda a los tiempos de relajación TI más bajos.
27. Método según la reivindicación 26, en el que la composición que comprende liposomas se administra por vía sistémica.
28. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 26 ó 27, en el que el individuo es un mamífero que ha sufrido un ictus isquémico.
29. Método según la reivindicación 28, en el que las imágenes de resonancia magnética se obtienen en el intervalo de 12 horas a 7 días desde que se produjo el ictus isquémico.
30. Método según la reivindicación 29, en el que las imágenes de resonancia magnética se obtienen transcurridas menos de 24 horas desde que se produjo el ictus isquémico.
31. Método según la reivindicación 29, en el que las imágenes de resonancia magnética se obtienen transcurridas entre 24 y 72 horas desde que se produjo el ictus isquémico.
32. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 31, en el que el individuo es un ser humano.
33. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 32, en el que se suministran al individuo liposomas de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16.
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