WO2012061914A2

WO2012061914A2 - Método e kit para diagnóstico de condições neuropsiquiátricas, método para avaliação de tratamentos de condições neuropsiquiátricas e método de identificação de fármacos potencialmente úteis no tratamento de condições neuropsiquiátricas.

Info

Publication number: WO2012061914A2
Application number: PCT/BR2011/000417
Authority: WO
Inventors: Mirian Akemi Furuie Hayashi; Rodrigo Affonseca Bressan; Vitor Marcelo SILVEIRA BUENO BRANDÃO DE OLIVEIRA; Ary Gadelha De Alencar Araripe Neto; Mauricio Ferreira Marcondes Machado
Original assignee: Universidade Federal De São Paulo - Unifesp
Priority date: 2010-11-09
Filing date: 2011-11-09
Publication date: 2012-05-18
Also published as: BRPI1004231A2; WO2012061914A3

Abstract

A presente invenção está relacionada a um teste diagnóstico e um kit para realização deste teste, que são úteis para diagnóstico de condições neuropsiquiátricas, em especial no diagnóstico da esquizofrenia, baseado na atividade da enzima Ndel1. A presente invenção ainda proporciona um método para a avaliação da eficácia de tratamentos dessas condições, bem como a identificação de fármacos com potencial no tratamento dessas condições.

Description

BR2011/000417

1

Relatório Descritivo de Patente de Invenção

MÉTODO E KIT PARA DIAGNÓSTICO DE CONDIÇÕES NEUROPSIQUIÁTRICAS, MÉTODO PARA AVALIAÇÃO DE TRATAMENTOS DE CONDIÇÕES NEUROPSIQUIÁTRICAS E MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE FÁRMACOS POTENCIALMENTE ÚTEIS NO TRATAMENTO DE CONDIÇÕES NEUROPSIQUIÁTRICAS.

Campo da Invenção

A presente invenção está relacionada a um teste diagnóstico e um kit para realização deste teste, que são úteis para diagnóstico de condições neuropsiquiátricas, em especial no diagnóstico da esquizofrenia, baseado na atividade da enzima NdeM (SEQ ID 1).

A presente invenção ainda proporciona um método para a avaliação da eficácia de tratamentos dessas condições, bem como a identificação de fármacos com potencial no tratamento dessas condições.

Antecedentes da Invenção

A esquizofrenia é um transtorno mental que acomete entre 0,3 a 1 ,6% da população ao longo da vida. Os indivíduos geralmente são acometidos no auge do seu potencial produtivo e o curso costuma ser crónico e debilitante. Segundo dados da Organização Mundial da Saúde (OMS), esta patologia é a 8^a principal causa de perda de anos de vida saudável. Os custos diretos com o tratamento da doença representam 1,3 a 2,5% do total de gastos em saúde em países ocidentais, sendo o principal custo entre os transtornos mentais. Além dos custos diretos com o tratamento da doença, existem os custos indiretos, representados pela perda de capacidade produtiva dos indivíduos acometidos e também dos familiares envolvidos no cuidado destes pacientes. Em 2002, os custos totais da doença nos Estados Unidos foram estimados em 62,7 bilhões de dólares, sendo que os custos indiretos foram estimados em 32,4 bilhões de dólares, representando 52% do total. O fator que mais contribuiu na composição dos custos indiretos foi o desemprego. 11 000417

2

Apesar da importância do tema e sua relevância em termos de saúde pública, o conhecimento sobre ás bases biológicas da doença ainda são limitados. Existem evidências sugerindo que se trata de uma alteração no processo de neurodesenvolvimento, gerada pela interação de fatores genéticos e ambientais, que levam a uma profunda alteração no funcionamento cerebral normal.

Até o presente momento, o diagnóstico da esquizofrenia está principalmente baseado em avaliações subjetivas, como a descrição de sintomas pelo paciente e/ou relatos de seus parentes e familiares. Isto claramente pode levar a diagnósticos imprecisos, por ser altamente suscetível a diferenças individuais na percepção do problema reportado. O conhecimento do mecanismo molecular envolvido nessa disfunção neuronal certamente melhoraria não só o diagnóstico como também o tratamento desses sintomas.

A hipótese fisiopatológica mais aceita atualmente sugere que a esquizofrenia é o resultado de uma alteração no neurodesenvolvimento que leva a uma estruturação do sistema nervoso central (SNC) vulnerável ao desenvolvimento e perpetuação da psicose. Mais recentemente, estudos têm demonstrado alterações do neurodesenvolvimento em outros transtornos psiquiátricos graves como o Transtorno Afetivo Bipolar, autismo, transtorno obsessivo-compulsivo e transtorno de déficit de atenção e hiperatividade. Dessa forma, a identificação de marcadores de alterações de neurodesenvolvimento podem levar a criação de um teste diagnóstico para transtornos psiquiátricos graves.

A enzima NdeM possui múltiplos papéis no desenvolvimento neuronal, e a sua atividade cisteíno protease parece ser importante nesses processos. Uma interação cooperativa identificada entre a NdeM e o gene DISC1 regula a morfogênese neuronal, e o seu posicionamento durante a integração neuronal foi mostrada. A ausência de NdeM e DISC1 em neurónios recém-gerados do hipocampo de adultos compartilha diversas características incluindo déficits no posicionamento neuronal. A relação entre NdeM e neurodesenvolvimento em nível genético e bioquímico sugere que a atividadé endooligopeptidásica da NdeM participe na etiologia dos distúrbios psiquiátricos.

Sugere-se o desenvolvimento de um método de diagnóstico de doenças neurodegenerativas baseado no conhecimento científico acumulado durante anos sobre o papel funcional de uma proteína citosólica neuro-específica, descoberta e inicialmente descrita pelos inventores. Essa proteína, inicialmente descrita como uma oligopeptidase, foi associada a diversas doenças neurodegenerativas, como esquizofrenia e lisencefalia. Recentemente foi demonstrado que essa proteína possui um papel importante para a maturação e diferenciação de células neuronais. Seu envolvimento na migração neuronal também foi demonstrado.

Métodos de diagnóstico de desordens psiquiátricas já são comuns no mercado e são objeto de diversos documentos de patente disponíveis no estado da técnica.

Podemos citar o documento WO 2010/095113, que propõe o diagnóstico de um estado neuropsiquiátrico, distúrbio psiquiátrico e problema comportamental baseado na determinação dos níveis de expressão genética de diversos genes.

A presente invenção difere deste documento por ser um método de diagnóstico baseado na atividadé enzimática, e não de expressão celular, e ainda pela enzima NdeM , não considerada ou sugerida pelo referido documento.

O documento WO 05/055813 é também relacionado à esquizofrenia, mas ao invés de ser direcionado ao diagnóstico da doença, tem como objeto a identificação de um agente terapêutico baseado na inibição do receptor NMDA- R.

O mesmo ocorre com o documento US 2010/077493, que tem como objeto a identificação de um agente terapêutico baseado na avaliação da expressão gênica de nArgBP2 em uma célula. O documento US 7807362 descreve um método para determinação do transtorno do déficit de atenção com hiperatividade baseado na redução da expressão de hNET (transportador de norepinefrina humano).

O documento US 7488576 descreve um método diagnóstico de distúrbios psiquiátricos como psicose, mania e distúrbio bipolar baseado na detecção da variação de GRK3, DBP FDFT1 , VELM . SULT1A1 ou IFG1. O documento US 7736852 também proporciona o diagnóstico dos referidos distúrbios por meio da detecção da variação de VMAT1.

O documento US 7790396 descreve um método para avaliar a eficácia de tratamentos de distúrbios psiquiátricos, como a esquizofrenia, baseado na determinação do haplótipo de SULT4A1 -1.

O documento US 7776551 descreve um método para diagnosticar retardo mental em um indivíduo baseado na determinação e análise de C22D1A, onde a redução na expressão gênica é significado de retardo mental.

Embora a presente invenção também seja capaz de diagnosticar distúrbios psiquiátricos como esquizofrenia, ela difere destes 5 documentos mencionados acima pelo diagnóstico ser feito pela medição da atividade enzimática de EOPA, indicador esse sequer mencionado no estado da técnica.

Portanto, percebe-se que não há descrito nenhum documento que descreva ou sequer sugira a correlação da atividade de NdeM com a presença de distúrbios neuropsiquiátricos, como a esquizofrenia. Os únicos relatos existentes sugerem, de forma vaga, um papel de NdeM em tais distúrbios.

Havashi, M.A.F.. Portaro, F.C.V., Tambourgi, D.V., Sucupira, M., Yamane, T., Fernandes, B.L., Ferro, E.S., Rebouças, NA, and Camargo, A.C.M. (2000) Endooligopeptidase A, the predominant neuropeptide- metabolizing metallo-oligopeptidase of rabbit nervous tissue. Biochem. Biophys.Res. Commun. 269, 7 - 13.

Havashi. M.A.F.. Pires, R.S., Rebouças, N.A., Britto, L.R.G., and Camargo, A.C.M. (2001) Expression of endo-oligopeptidase A in the rat central nervous system: a non-radioactive in situ hybridization study. Mol. Brain Res. 89, 86 - 93. 11 000417

Havashi, M.A.F., Portara, F.C., Bastos, M.F., Guerreiro, J.R., Oliveira, V., Gorrao, S.S., Tambourgi, D.V., SanfAnna, O.A., Whiting, P.J., Camargo, L.M., Konno, K., Brandon, N.J., and Camargo, A.C. (2005) Inhibition of NUDEL (nuclear distribution element-like)-oligopeptidase activity by disrupted-in- schizophrenia 1. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 102(10), 3828-33.

Havashi. M.A.F., Portaro, F.C.V., and Camargo, A.C. (2005) Cytosolic oligopeptidases: features and possible physiopathological roles in the immune and nervous systems. Curr. Med. Chem. - Central Nervous System Agents 4, 269-277.

Havashi. M.A.F., Guerreiro, J.R., Charych, E., Kamiya, A., Barbosa, R.L,

Machado, M.F., Campeiro, J.D., Oliveira, V., Sawa, A., Camargo, A.C.M., and Brandon, N.J. (2010) Assessing the role of Endooligopeptidase Activity of NdeM (Nuclear-distribution gene E homolog like-1) in Neurite Outgrowth.

Molec. Celi. Neurosci., online [Epub ahead of print].

Sumário da Invenção

Em um primeiro aspecto, a presente invenção proporciona uma forma de diagnóstico de condições neuropsiquiátricas baseada na medição da atividade enzimática de NdeM . Em especial, contribui de forma significativa para o diagnóstico de pacientes esquizofrênicos representando uma importante ferramenta para um diagnóstico mais preciso, já que o mesmo é baseado em conhecimentos moleculares que determinam esta patologia.

É um objeto da presente invenção um método para determinar a presença, ausência e/ou severidade de condições neuropsiquiátricas compreendendo as etapas de:

a) obter uma amostra de um paciente, onde a amostra compreende a uma enzima com pelo menos 80% de similaridade com SEQ ID 1 ;

b) monitorar a hidrólise de um substrato na presença e ausência de anticorpos específicos para NdeM ;

c) comparar o resultado de b) com valores pré-determinados, Em uma realização preferencial, o valores pré-determinados são valores obtidos de indivíduos normais e/ou indivíduos sofrendo da condição neuropsiquiátrica. Em especial, a atividade elevada da enzima Ndell está associada à ausência de condições neuropsiquiátricas e uma atividade baixa da enzima NdeM está associada à presença de condições neuropsiquiátricas.

É um adicional objeto da presente invenção um kit para diagnóstico de condições neuropsiquiátricas compreendendo:

a) um substrato para uma enzima com pelo menos 80% de similaridade com SEQ ID 1 ; e

b) anticorpos específicos para uma enzima com pelo menos 80% de similaridade com SEQ ID 1.

Esses e outros objetos serão melhor compreendidos pela descrição detalhada a seguir.

Em um segundo aspecto, por correlacionar a atividade da enzima NdeM com a presença/ausência e severidade das condições neuropsiquiátricas, a presente invenção possibilita a monitoração de tratamentos convencionais quanto à sua eficiência no paciente, auxiliando a decisão de médicos quanto à continuidade ou não dos tratamentos.

É portanto um adicional objeto da presente invenção um método para monitorar tratamentos de condições neuropsiquiátricas compreendendo as etapas de:

a) administrar pelo menos um fármaco para o tratamento de condições neuropsiquiátricas a um paciente; e

b) determinar a atividade uma enzima com pelo menos 80% de similaridade com SEQ ID 1 em uma amostra do paciente ao longo do tratamento.

Em um terceiro aspecto, a presente invenção proporciona um método para identificação de fármacos potencialmente úteis no tratamento de condições neuropsiquiátricas por correlacionar a atividade enzimática e a presença/ausência das condições neuropsiquiátricas. É um adicional objeto da presente invenção um método para identificação de fármacos potencialmente úteis no tratamento de condições neuropsiquiátricas compreendendo as etapas de:

a) administrar um fármaco potencialmente útil para o tratamento de condições neuropsiquiátricas a um paciente; e

b) determinar a atividade uma enzima com pelo menos 80% de similaridade com SEQ ID 1 em uma amostra do paciente.

Descrição das Figuras

Figura 1 - Análise de 70 pacientes comparados com indivíduos normais de ambos os sexos.

Descrição Detalhada da Invenção

Os exemplos aqui descritos têm o intuito apenas de exemplificar algumas das inúmeras formas de se realizar a invenção, não devendo portanto ser encarada de forma restritiva, mas sim ilustrativa.

Por questões de simplicidade, sempre que se falar na enzima Ndell ao longo do texto, entende-se que sua sequência é como descrita em SEQ ID 1.

Método de Diagnóstico

O método de diagnóstico da presente invenção é um método que compreende as etapas de:

c) comparar o resultado de b) com valores pré-determinados,

Os valores pré-determinados são valores obtidos de indivíduos normais e/ou indivíduos sofrendo da condição neuropsiquiátrica. Especificamente, uma atividade elevada da enzima Ndell está associada à ausência de condições neuropsiquiátricas e uma atividade baixa da enzima NdeM está associada à presença de condições neuropsiquiátricas. A distância do valor obtido da amostra para os valores de referência permitem concluir a severidade, quando presente, da condição neuropsiquiátrica no indivíduo.

Para efeitos da presente invenção, entende-se por "amostra do paciente" um fluido que contém a enzima NdeU ou um peptídeo que contem pelo menos 80% de similaridade com a NdeU . Exemplos de fluidos que podem ser utilizados na presente invenção são plasma, líquor, líquido cefalo-raquidiano, linfoblastóides, células perféricas, células tronco e derivadas, células mesenquimais e derivadas, homogenatos de tecidos obtidos por biopsia.

O monitoramento da atividade da enzima na amostra do paciente é preferencialmente feito por dosagem da atividade enzimática, conforme descrito abaixo. Porém pode ainda ser avaliado também por imunoensaio, onde a quantidade protéica de NdeU na amostra do paciente seria indicativo da atividade enzimática total desta proteína neste material. Em especial o imunoensaio é escolhido do grupo que compreende ELISA (enzyme-linked imunosorbent assay), radioimunoensaio, western blot e ensaio de imunofluorescência, sendo o ELISA o preferido da presente invenção.

O substrato utilizado no método da presente invenção compreende qualquer substrato conhecido do estado da técnica que possua um grupo em sua estrutura capaz de emitir luz e que possa ser, posteriormente, detectada e quantificada, e que apresente sequencia primaria contendo sitio de reconhecimento e clivagem pela NdeU . Exemplos de substratos úteis incluem os substratos fluorogênicos e substratos cromogênicos, sendo os substratos FRET preferidos.

Em especial, um exemplo de substrato FRET útil na presente invenção é o Abz-GFSPFRQ-EDDnp.

A expressão "anticorpo" ou "anticorpos" utilizada na presente invenção designa uma proteína pertencente à superfamília das imunoglobulinas (Ig) que se ligam de forma não-covalente a certas substâncias (ex. antígenos) para formar o complexo antígeno-anticorpo, as quais incluem, sem limitações, anticorpos produzidos por hibridomas, imunização capaz de gerar uma BR2011/000417

9

resposta imune, síntese química e por células recombinantes que foram transformadas por um vetor codificante para o anticorpo.

Assim, a expressão "anticorpo" inclui dentro de seu escopo (a) qualquer uma das classes e subclasses de imunoglobulinas, como por exemplo IgG, IgM, IgE derivados que qualquer um dos animais convencionalmente utilizados, e (b) anticorpos policlonais e monoclonais, como os anticorpos murinos, quiméricos ou humanizados, assim como os sintetizados quimicamente ou por meio de métodos recombinantes e de expressão in vitro e in vivo.

A expressão "anticorpo" também engloba fragmentos de anticorpos que mantém as características de ligação seletiva do anticorpo completo. Exemplos de fragmentos são bem conhecidos no estado da técnica, como Fab, Fab' e F(ab')2, que podem ser obtidos por digestão com várias proteases e que não possuem o fragmento Fc de um anticorpo completo, ou ainda pela redução de pontes dissulfeto que conectam as cadeias do anticorpo intacto, ou pela simples síntese química ou por expressão de cada um destes fragmentos separadamente. Além disso, fragmentos arbitrários podem ser gerados através de tecnologia recombinante, mantendo as características de reconhecimento de antígeno.

Os anticorpos utilizados na presente invenção são anticorpos que possuem afinidade para a NdeM , e podem ser obtidos por meios conhecidos do estado da técnica, podendo ser monoclonais ou policlonais.

Em especial, os anticorpos preferidos são os anticorpos policlonais, porem não se limitando a eles e não excluindo o uso de monoclonais ou a combinação deles.

A expressão "afinidade" é definida nessa invenção como a força da interação de duas moléculas, como por exemplo um antígeno e seu anticorpo. Embora a força da ligação não seja tão forte quanto uma ligação covalente, considera-se que um anticorpo possui afinidade por seu substrato quando a constante de afinidade (K_a) é maior que 10⁴ M^" , tipicamente 10⁵-10¹¹ M^"1.

Outra característica importante para estes anticorpos é o fato de serem capazes de inibir especificamente a atividade enzimática da NdeM tanto na sua forma pura como quando presente em mistura complexas, como é o caso da amostra de pacientes como exemplificado acima.

As condições neuropsiquiátricas englobadas pela presente invenção são condições que são comumente descritas como "perda do contato com a realidade", como alucinações, delírios, mudanças de comportamento e desordens de pensamento, que se refletem na fala e na escrita. Em especial, a condição neuropsiquiátrica a ser diagnosticada é a esquizofrenia.

Kit diagnóstico

O kit diagnóstico da presente invenção é um kit que compreende os principais reagentes e soluções a serem utilizadas no método descrito acima.

Em especial, o kit para diagnóstico de condições neuropsiquiátricas compreende:

Adicionalmente, o kit compreende instruções de como utilizar e/ou realizar o método descrito bem como soluções tampões e controles positivo e negativo.

Aplicações em tratamentos

As técnicas aqui descritas podem ser utilizadas para monitorar a evolução do tratamento de um paciente para as condições neuropsiquiátricas, permitindo assim que o médico avalie a eficácia do tratamento e/ou determine a duração do tratamento.

Preferencialmente o método para monitorar tratamentos de condições neuropsiquiátricas compreendendo as etapas de:

b) determinar a atividade uma enzima com pelo menos 80% de similaridade com SEQ ID 1 em uma amostra do paciente ao longo do tratamento. A presente invenção descreve que a atividade da enzima NdeM está relacionada à presença/ausência de condições neuropsiquiátricas. Dessa forma, é possível que administrando um fármaco que interfira na atividade da enzima NdeM seja útil no tratamento dessas desordens. Assim, a presente invenção proporciona ainda um método para identificação de fármacos úteis no tratamento de condições neuropsiquiátricas onde a determinação da eficácia do fármaco candidato é feita pelo método descrito nessa invenção.

O método para identificação de fármacos potencialmente úteis no tratamento de condições neuropsiquiátricas compreende as etapas de:

b) determinar a atividade uma enzima com pelo menos 80% de similaridade com SEQ ID 1 em uma amostra do paciente. Exemplo 1

Foram avaliados 70 pacientes que preencheram o critério DSM IV para esquizofrenia determinado com a entrevista diagnostica estruturada (SCID) por entrevistadores experientes com boa confiabilidade. Todos os pacientes participaram do programa de esquizofrenia (PROESQ) da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) e seu diagnóstico de esquizofrenia foi confirmado por 2 médicos experientes, estando estável por pelo menos 2 anos.

Os indivíduos foram avaliados na escala positiva e negativa para esquizofrenia (PANSS), escala Calgary para depressão em esquizofrenia, Clinicai Global Impression, Clinicai Global Impression para esquizofrenia e escala de efeitos colaterais (AIMS, Barnes and Simpson and Angus). Os indivíduos passaram por uma extensa bateria neuropsicológica e ressonância magnética do cérebro.

A atividade de NdeM em amostras de plasma humano de pacientes normais e esquizofrênicos foi medida por um ensaio fluorimétrico, utilizando o substrato FRET Abz-GFSPFRQ-EDDnp (10 μΜ). A hidrólise do substrato, a 37°C, foi seguida da medida de fluorescência em um espectrofluorímetro a _em = 420 nm and λ_βχ =320 nm. A cubeta de 1 cm de caminho ótico contendo 1 ml da solução de substrato (tampão 50 mM Tris, 100 mM NaCI pH 7.4) foi colocada em um compartimento termostaticamente controlado por 5 min antes da adição das amostras de plasma e o aumento da fluorescência (AFU, unidades de fluorescência arbitrária) com o tempo foi monitorado continuamente por 5-10 min, na ausência e presença de anticorpo específico para Ndell (50 μΙ). A atividade medida de NdeM é diferença entre a taxa de hidrólise na ausência do anticorpo específico e a taxa de hidrólise na presença do anticorpo específico. A atividade específica é a atividade enzimática pela concentração total de proteína.

O resultado do teste pode ser visualizado na Figura 1 , mostrando claramente que os pacientes considerados esquizofrênicos possuem atividade de Ndell reduzida quando comparados a pacientes normais.

Claims

Reivindicações

1. Método de diagnóstico de condições neuropsiquiátricas caracterizado por compreender as etapas de:

c) comparar o resultado de b) com valores pré-determinados.

2. Método de diagnóstico, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelos valores pré-determinados serem obtidos de indivíduos normais e/ou indivíduos sofrendo da condição neuropsiquiátrica.

3. Método de diagnóstico, de acordo , com a reivindicação 1 , caracterizado pela condição neuropsiquiátrica ser esquizofrenia.

4. Método de diagnóstico, de acordo com a reivindicação 1 , compreende plasma, liquor, liquido cefalo-raquidiano, linfoblastóides, células perféricas e homogenatos de tecidos obtidos por biopsia.

5. Método de diagnóstico, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelo substrato ser um substrato fluorogênico ou cromogênico.

6. Método de diagnóstico, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo substrato ser Abz-GFSPFRQ-EDDnp.

7. Kit para diagnóstico de condições neuropsiquiátricas caracterizado por compreender:

8. Kit para diagnóstico, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo substrato ser um substrato fluorogênico ou cromogênico.

9. Kit para diagnóstico, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo substrato ser Abz-GFSPFRQ-EDDnp.

10. Kit para diagnóstico, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por adicionalmente compreendeer

- instruções de como utilizar e/ou realizar o método descrito; e/ou

- soluções tampões; e/ou

- controles positivo e negativo.

11. Método para avaliação de tratamentos de condições neuropsiquiátricas caracterizado por compreender as etapas de:

12. Método para avaliação, de acordo com a reivindicação 11 , caracterizado pela determinação da etapa b) ser realizada por um método conforme reivindicações 1-6.

13. Método para identificação de fármacos potencialmente úteis no tratamento de condições neuropsiquiátricas caracterizado por compreender as etapas de:

14. Método para identificação, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pela determinação da etapa b) ser realizada por um método conforme reivindicações 1-6.