WO2012060572A2 - 길항미생물 바실러스 섭틸러스로부터 신규 이튜린 생합성 유전자의 클로닝과 염기배열 결정 및 그 유전자의 특성 - Google Patents

길항미생물 바실러스 섭틸러스로부터 신규 이튜린 생합성 유전자의 클로닝과 염기배열 결정 및 그 유전자의 특성 Download PDF

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황인규
박병근
김성은
문제선
박호용
손광희
정태숙
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    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a novel iturin biosynthesis gene, and more particularly, to a novel iturin biosynthesis gene derived from a bacillus subtilus (fee // us subtil is subsp. Krictiensis ATCC 55079) strain and its use.
  • Biological control refers to control by other organisms that are antagonistic activity of pathogenic microorganisms that cause disease ( ⁇ ) to plant most for ', which is the target of biological pesticides directly using the microorganisms themselves or various plants using a microbial pathogens and It is mainly used to control seagrass 3 ⁇ 4 weeds, such as plow, ongae, and nematodes, which damage crops.
  • This biological control research began in the early 1900's and has been working hard to suppress plant pathogens using many kinds of bacteria and bears. However, due to the complex ecosystems in soils and the complex interactions between plants and microorganisms, research results have been very poor.
  • 2,4—flow Loglucinol 2,4-diacetyl phloroglucinol antibiotics
  • the team introduced genetic engineering techniques to develop genes of Pseudomonas sp. I. We succeeded in overcoming the irregularities of the wheat root rot control effect by maximizing the strings.
  • Bacillus subtilis strains have attracted the attention of many researchers because of their ability to produce various kinds of antibiotics as well as various enzymes. Saccharomyces cerevisiae and Lactobacillus ⁇ ⁇ Lactobacillus sp In addition, it is recognized by the US Food and Drug Administration as a strain that is harmless to humans and the environment. . Microbial agents developed using subtilis ⁇ include Epic, Kodiak, Companion, HiStick and Serenade. These are mainly seed treatment or post-harvest ( It is widely used for anti-corruption of post-harvest) and vegetables (BB McSpadden Gardener, et al., Plant Health Progress [Internet], May 10, 2002 [cited Aug.
  • B. subtil isA has an inhibitory effect on many food diseases (PL Pusey, et al., Pesticide Sci., 27: 133-140, 1989), and Phae et al.
  • the strain B. subtilis NB22 which exhibits a broad inhibitory effect, was isolated and proved to be an iturin-based material (CG Phae, et al., J. Ferment. Bioeng., 69: 1-7, 1990).
  • iturin an annular peptide antibiotic produced by Bacillus strains, has been around for a long time.
  • the present invention provides an iturin biosynthesis gene having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6 or an iturin biosynthesis gene having 95% or more sequence homology to the gene.
  • the present invention provides a turine biosynthesis gene having a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 5.
  • the present invention also provides an iturin biosynthesis gene having a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 3.
  • the present invention provides a turine biosynthesis gene having a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7.
  • the present invention also provides a leucine biosynthesis gene having a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 8.
  • the present invention also provides an iturin biosynthesis gene having a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 7.
  • the present invention also provides a leucine biosynthesis gene having a base sequence as set forth in SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 8.
  • the present invention also provides an iturin biosynthetic gene having a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8.
  • the present invention also provides an iturin biosynthetic gene having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the present invention also provides an iturin protein encoded by the gene according to the present invention.
  • the present invention also provides a vector comprising the nucleotide sequence of the iturin biosynthesis gene according to the present invention.
  • the present invention also provides a vector-transduced transformant comprising a nucleotide sequence of the leucine biosynthesis gene according to the present invention.
  • the present invention provides a biological control agent comprising a transformant or a culture medium for producing the iturin protein according to the present invention.
  • the present invention provides a leucine protein produced by the transformant of the present invention or its culture, or the transformant of the present invention, for use as a biological control agent.
  • a leucine protein produced by the transformant of the present invention or its culture, or the transformant of the present invention, for use as a biological control agent.
  • the present invention provides an iturin biosynthesis gene having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6 or an iturin biosynthesis gene having 95% or more sequence homology to the gene, or an iturin protein encoded by the gene.
  • the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 6 preferably contains 0RF 3 of the eryurin biosynthesis gene, and the protein encoded by the iturin gene is a conventionally known iturin biosynthesis protein.
  • the present inventors first generate sur f ac ti n , but do not produce iturin to identify novel iturin biosynthesis.
  • Known to. subtil is 168 strain was used.
  • Sulfactin and iturin are cyclic lipopeptide antibiotics consisting of seven amino acids and fatty acids, which are known to differ only in the order in which they are linked to the amino acid composition and have similar molecular weights.
  • the sulfatin gene is so large that it is 32 kb, it is thought that the iturin gene is similar, and that the same biosynthesis is performed at some stage rather than the two antibiotics are synthesized from different biosynthetic pathways from the beginning. It was estimated to be synthesized by pathways and then synthesized by different biosynthetic pathways from a certain stage. Because some of the B. subtilis strains are known to produce iturin and sulfactin at the same time, it is unlikely that each gene will be present separately, given the size of the two genes.
  • the chromosomal DNA of the krictiensis strain was used as a template, and PCR and electrophoresis were performed to determine the B. subtilis 168 strain and the B. subtilis subsp.
  • DNA fragments corresponding to about 1.8 kb of the same size were obtained from B. subtilis subsp. Obtained from the krictiensis strain (see FIG. 1).
  • the B.. subtilis subsp The amino acid sequence of the DNA fragment obtained from the krictiensis strain was compared with the amino acids of other peptide biosynthesis genes using NCBI database, and showed homology of 82-85% with three different sulfactin biosynthesis genes. , B. The licheniforwis strain produced 80% homology with the lichenysin biosynthetic gene.
  • a specific embodiment of the present invention about 0.4 kb obtained by PCR using about 20 types of primers designed for cloning the gene involved in the acylation (ay 1 at ion) process connecting the peptide and fatty acid Nucleotide sequence was determined for DNA fragments (see FIG. 3), and the NCBI database was searched for comparative analysis of amino acids.
  • the gene product was found to be 56-83% of the acyl transporter protein reductase from other microorganisms. Same sex (see Figure 4). In particular, it showed 83% homology with acyl transporter protein reductase derived from other B. subtilis strains. It could be useful for screening genome libraries of krictiensis strains.
  • B. subtilis subsp To clone the iturin biosynthetic gene from the genome library of the krictiensis strain, subtilis subsp. Genomic DNA of the krictiensis strain was partially digested using SaU restriction enzyme, and then a DNA fragment of 20 to 30 kb was inserted into PLARF3, a Cosmid vector, and transformed into ⁇ ? 7 / HB101. To prepare a genomic library. B. subtilis subsp. Colony hybridization and Southern hybridization were performed using the krictiensis strain ⁇ genome library and the 1.8 kb peptide biosynthesis gene cloned in Example 3-3 as a probe. As a result, two clones showing homology with the probe DNA at 27 kb and 32 kb positions were observed, which were named as pJJ815 and PJJ121, respectively (see FIG. 5).
  • the fragments of pJJ121 were examined as a result of examining the base sequence of some fragments. 57-90% homology with Factin synthase I, tyrosine synthase II, gramicidine S synthase I and peptide synthase 2 From these results, we found that two Cosmid clos The Loh points out that it contains some genes related to peptide synthesis during iturin biosynthesis.
  • B. subtilis subsp which produces iturin to determine whether the genes in the Cosmid clone are genes involved in iturin biosynthesis or sulfactin synthesis.
  • Southern kinetics were performed at 50 ° C and 65 ° C using the chromosomal DNA of the krictiensis strain and B. subtil is 168 strain.
  • the probe DNA used at this time was prepared by using fragments obtained by subcloning the six fragments obtained by cutting the cosmid clones pJJ121 and pJJ815 strains with ⁇ oRI. As a result, at 65 ° C., the B .. subtilis subsp.
  • the krictiensis strain showed homology to all six ⁇ cRI fragments, but the B. subtilis 168 strain showed no homology to all six cRI fragments. These results were the same when Southern oscillation was performed at 50 ° C, except that pJJ121E3 fragment was weakly reacted in B. subtilis strain. Therefore, the genes in the Cosmid clone showed little similarity with the sulfatin biosynthesis genes, and it was estimated that the genes involved in iturin biosynthesis were likely (see FIGS. 7 and 8).
  • the biclonal nucleotide sequence was cloned from the two Cosmid clones to determine 21,253 bp by using bidirectional nucleotide sequences, and some genes were found to be missing and nucleotide sequences of the missing portions were found.
  • genes were obtained through genome library screening and nucleotide sequences were determined, resulting in a total of 37,682 bp of nucleotide sequences. Seven 0RF were found to be involved in iturin biosynthesis within nucleotide sequences. (See FIG. 9).
  • the antimicrobial ability of iturin and sulfactin is magnaporte gricia _ ⁇ / ' 5 ⁇ ), which causes rice blast, and trichophyton mantagrophyte, which is athlete's foot. mentagrophytes) and the Fusarium Oxygen Forum, which is a causative agent of wilting disease of eggplants, 0 s ⁇ ? / OT oxysporum) were measured for three types of test bacteria.
  • B. subtil is subsp. Krictiensis strains showed antimicrobial activity against Magna Forte Gricia, Trichophyton mentagrophyte, and Fusarium oxis forum, but did not produce antibiotics. Fusarium showed no antimicrobial activity against the test strain in the strain and B. subtilis 168 strain, and B. subtilis C9 strain that is supposed to produce both sulfactin and iturin. It showed antimicrobial effect against Oxy Forum. Based on these results, the inventors decided to use the Fusarium oxis forum as a test bacterium when selecting an iturin mutant (see FIG. 11).
  • the inventors have found fragments of Cosmid clones.
  • B. subtilis subsp. After transformation into the krictiensis strain (see FIG. 12), the antimicrobial activity against the Fusarium oxis forum was observed.
  • B. subtilis subsp. Spp. Transformed with pBT6 (including 0RF 2-2 and 0RF 3) fragments.
  • the antibacterial activity against the Fusarium oxis forum was the greatest (see FIG. 13).
  • a pJJ121E2 fragment containing a pBT6 fragment is cloned into a pTZ18 vector.
  • the pl21E3 vector carrying the spectinomycin resistance gene was cut with fe3 ⁇ 4HI and bsl, and then attached to the Cla region by PCR, followed by CVal.
  • the fragment containing the spectinomycin gene cleaved with C / sI was inserted into the site of the pTZ18 vector into which the pJJ121E2 fragment was inserted.
  • Krictiensis strains were transformed (. subtilis subsp. krictiensis mutants, it was determined whether the iturin biosynthesis capacity was lost (see Fig. 14). As a result, B. subtilis subsp. The krictiensis strains showed strong antimicrobial activity, whereas B. subtilis subs.krictiensis mutant -10 was found to significantly reduce the antimicrobial activity (see Fig. 15). In the chromosome of the subtilis subsp. krictiensis mutant 10 strains, it was confirmed that the sustitinomycin resistance gene was inserted (see FIG. 16).
  • the metabolite of the krictiensis mutant -10 strain was analyzed using HPLC analysis.
  • the inventors of the invention B. subtil is subsp. Cloning this turin biosynthesis gene from the krictiensis strain and analyzing the sequence of the cloned gene, it was confirmed that it is a novel iturin biosynthesis gene that differs from the known annular lipopeptides biosynthesis genes.
  • the present invention provides an iturin biosynthesis gene having a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 5, or an iturin protein encoded by the aurin biosynthesis gene.
  • the present invention also provides an iturin biosynthetic gene having a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 3, or a leucine lean protein encoded by the eryurin biosynthetic gene.
  • the present invention also provides an iturin biosynthesis gene having a nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7, or an iturin protein encoded by the iturin biosynthesis gene.
  • the present invention also provides a leucine biosynthesis gene having a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 8, or iturin protein encoded by the iturin biosynthesis gene.
  • the base sequence described in SEQ ID NO: 6 preferably comprises 0RF 3 of the iturin biosynthesis gene, the base sequence described in SEQ ID NO: 3 preferably comprises 0RF 2,
  • the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 preferably includes a 0RF 2-2 moiety that is part of 0RF 2, but is not limited thereto.
  • the protein encoded by the iturin biosynthesis gene described in SEQ ID NO: 6 preferably has an amino acid sequence described in SEQ ID NO: 14, the protein encoded by the iturin biosynthesis gene described in SEQ ID NO: 3 stand preferably has the amino acid sequence represented by the column number 11, and "protein encoded by the Turin oil biosynthesis.
  • e described in SEQ ID NO: 5 are described in SEQ ID NO: 13 ⁇ Preferably has an amino acid sequence, but is not limited thereto. '
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 preferably contains 0RF 4 part of the iturin biosynthesis gene, and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 is 0RF 5 part of the iturin biosynthesis gene It is preferred to include, but is not limited thereto.
  • the protein encoded by the iturin biosynthesis gene described in SEQ ID NO: 7 preferably has an amino acid sequence described in SEQ ID NO: 15, the protein encoded by the base sequence described in SEQ ID NO: 8 is SEQ ID NO: It is preferred to have an amino acid sequence as described by 16, but is not limited thereto.
  • the base sequence described in SEQ ID NO: 3 is characterized in that the base sequence of the entire 0RF 2 of the iturin biosynthetic gene, the inventors divided the 0RF 2 site to identify a specific site for encoding the iturin biosynthetic gene ORF 2-1 (SEQ ID NO: 4) and 0RF 2-2 (SEQ ID NO: 5) were used in the examples.
  • the present inventors prepared a fragment containing 0RF constituting the iturin biosynthesis gene, and experimented to identify the site involved in the iturin biosynthetic protein, the fragment of 0RF 2-2 and the base sequence of 0RF 3
  • the present invention also provides an iturin biosynthesis gene having a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 7, or an iturin protein encoded by the iturin biosynthesis gene.
  • the present invention also provides an iturin biosynthetic gene having a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 8.
  • the present invention is a base sequence described in SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 It provides an iturin biosynthesis gene having a J4 row, or an eryurin protein encoded by the iturin biosynthesis gene.
  • the base sequence described in SEQ ID NO: 6 of the iturin biosynthesis gene preferably includes a base sequence of 0RF 3 site of the iturin biosynthetic gene, and the base sequence described in SEQ ID NO: 3 is a 0RF 2 site of the iturin biosynthetic gene
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 preferably comprises the nucleotide sequence of 0RF 4 of the iturin biosynthesis gene
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 is of the iturin biosynthesis. It is preferable to include the nucleotide sequence of 0RF 5 region of the gene, but is not limited thereto, and may include any gene sequencing within the iturin biosynthesis capable of producing the iturin protein. '
  • the protein encoded by the iturin biosynthesis gene described in SEQ ID NO: 6 preferably has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, and the iturin described in SEQ ID NO: 3
  • the protein encoded by the biosynthetic gene preferably has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11, and the protein encoded by the iturin biosynthetic gene described in SEQ ID NO: 7 preferably has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15.
  • the protein encoded by the iturin biosynthesis gene described in SEQ ID NO: 8 preferably has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, but is not limited thereto, and the gene sequence in the eryurin biosynthesis capable of producing iturin protein If all can be included.
  • the present invention also provides an iturin biosynthetic gene having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or an iturin protein encoded by the iturin biosynthetic gene.
  • the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1 preferably includes seven nucleotide sequences of ORF 1 to 6 included in the iturin biosynthesis gene shown in FIG. 9, but is not limited thereto. Do not.
  • the nucleotide sequence shows a significant difference when compared with a gene involved in conventional iturin biosynthesis, it was found by the inventors that it is a novel iturin biosynthetic gene, iturin Among the 0RF constituting the biosynthetic gene, the antimicrobial activity of the transformants including fragments containing 0RF 2 (0RF 2-2) and fragments containing 0RF3 increased most, including fragments containing other 0RF. The antimicrobial activity of the transformants could be confirmed.
  • the present inventors have identified a novel iturin biosynthesis gene having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the present invention also provides a vector comprising the nucleotide sequence of the iturin biosynthesis gene according to the present invention.
  • the base sequence of the iturin biosynthesis gene included in the vector preferably includes an iturin biosynthesis gene having a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, and more preferably, the base sequences of SEQ ID NOs: 6, 3, and 7 gene, SEQ ID NO: 6,3, and a gene comprising the nucleotide sequence of the 8 ', or SEQ ID NO: 6, 7, and a gene comprising a sequence of S, more preferably SEQ ID NO: 6 and described in 5, including A gene having a nucleotide sequence of interest, a gene having a nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 6 and 3, a gene having a nucleotide sequence of SEQ ID NOs.
  • the present invention also provides a transformant into which a vector comprising the base sequence of the iturin biosynthesis gene according to the present invention is introduced.
  • the transformants are Bacillus subtilus strains (fec /// i / s subtillus), Saccharoma Ises cerevisiae (5 ⁇ gcC3 ⁇ 4 o / »yces cerevisiae), and Bacillus amylo liquefaciens strain (Bacillus amylol iquefaciens) and the like can be used, but is not limited thereto.
  • the method of introducing a recombinant vector to the strain is preferably using a heat shock method, an electric shock method, and more preferably, using a Spizizen method, more preferably, but not limited to using a known technique Can be introduced.
  • the iturin protein encoded by the iturin biosynthesis gene it is preferable that the iturin protein is encoded by a vector or a transformant containing the gene, but is not limited thereto.
  • the culture medium of the transformed strain can be utilized as a biological control agent
  • the transgenic strain itself may be useful as a biological control agent.
  • the present invention also provides a biological control agent comprising a transformant or a culture medium for producing the iturin protein according to the present invention.
  • the present invention provides an iturin protein produced by the transformant of the present invention or its culture, or the transformant of the present invention, for use as a biological control agent.
  • the aryurin protein, the transformant for producing the iturin protein, and the culture medium thereof according to the present invention are bleeding disease ⁇ Uagnaporthe grisea, wilting pathogen (/ sar / uw oxysporum), gray fungus (b ryi / s cinerea) Barley powdery mildew (> rs / p; e graminis f. Sp.horde!), Tomato leaf fungus fulva, red pepper anthrax (Col letotri chum gloeospor ioides), ginseng root rot fungus
  • the inventors have identified fragments of the Cosmid clone in B. subtilis subsp. After transformation into the krictiensis strain, the antimicrobial activity against the Fusarium oxis forum was observed. As a result, B. subtilis subsp. In the krictiensis strain, B. subtilis subsp. B. subtilis subsp. Significant improvement was observed compared to the krictiensis strain.
  • the turine protein encoded by the novel eryurin biosynthesis gene identified in the present invention, the transformant producing the same, and its culture solution can be usefully used as a biological control agent.
  • iturin was purified by cloning, sequencing and antimicrobial activity assays of genes that synthesize iturin from B. ⁇ /// 5 strains producing the six types of iturin described in the present invention. It was confirmed that the gene is a biosynthesis. Mutagenesis and instrumental analysis also confirmed that the metabolite was iturin and confirmed that it was a new gene different from the previously reported gene. Based on these facts, it may be possible to use the iturin biosynthetic gene as a biological control agent by improving strains with enhanced antimicrobial activity. On the other hand, the new strain is transformed into bacteria that exhibit other biological control activities. It can be used for development.
  • Lane 1 lkb ladder
  • Lane 2 PCR product (product of sulfactin gene) obtained using SrfB 7 and SrfB 8 primers in B. subtilis 168 strain;
  • Lane 3 B. subtilis subsp. PCR products obtained using SrfB 7 and SrfB 8 primers in the krictiensis strain (presumed to be iturin gene products);
  • Lane 4 PCR product (sulfactin gene product) obtained using SrfB 9 and SrfB 10 primers in B. subtilis 168 strain;
  • Lane 5 B. subtilis subsp. PCR products obtained using SrfB 9 and SrfB 10 primers in krictiensis strains (estimated iturin gene products);
  • FIG. 3 shows B. subtilis subs. Genetic salts, sequences and peptide sequences for 0.4 kb of PCR products obtained using SrfA 5 and SrfA 6 primers in the krictiensis strain.
  • FIG. 5 shows B. subtilis subsp.
  • Figure shows the genome library screening results of the krictiensis strain:
  • FIG. 5A is a diagram showing the results of colony hybridization
  • FIG. 5B shows the result of agarose electrophoresis digested with cosmid clone DNA obtained through colony shaking
  • FIG. 5C is a diagram showing the result of Southern shake, and shows homology with the isotopically labeled probe DNA in two clones.
  • 6 is a restriction map of Cosmid clone obtained through genome library screening.
  • FIG. 7 shows A to F in B. subtilis subs.
  • Lane 1 lambda DNA digested with / 3 ⁇ 4 ⁇ ;
  • Lane 2 B. subtilis subs. genomic DNA of krictiensis strains
  • Lane 3 genomic DNA of B. subtilis 168 strain
  • FIG. 8 shows A to F in B. subtilis subsp. krictiensis ⁇ B. subtilis 168 Figure shows the results of the hybridization of pjJ815 and pJJ121 clones obtained from the genome library screening with Ec (enzyme digestion) at 50 ° C.
  • Lane 1 lambda DNA cleaved with UindUl
  • Lane 2 B. subtilis subsp. genomic DNA of krictiensis strains
  • Lane 3 genomic DNA of B. subtilis 168 strain
  • 0RF1 transcriptional regulator
  • 0FR6 Asparate tranaminase-1 ike protein.
  • Figure 10 is a comparison of the antimicrobial activity of the standard compound iturin and sulfanthin.
  • Figure 1 compares the antimicrobial activity of three different strains using krictiensis, B. subtilis 168, B. subtilis JH642, and B. subtilis C9 strains:
  • B. subtilis-168 a subtilis strain that has a sulfactin gene but does not produce sulfutin;
  • B. subtilis JH642 a subtilis strain that does not produce both iturin and sulfactin; R j
  • B. subtilis C9 A subtilis bacterium believed to produce both sulfactin and iturin
  • Figure 12 shows the construction of ⁇ cRI fragments of Cosmid clones and the vector containing the fragments.
  • FIG. 14 is a schematic showing the construction of a vector to prepare mutants lacking Iturin biosynthesis.
  • B. subtil is subsp. This is a comparison of the antimicrobial activity against Fusarium oxysporunf ⁇ in krictiensis strains and mutant strains that lacked iturin production.
  • FIG. 16 shows Southern hybridization results which examined whether spectinomycin inserted into the mutant strain was inserted on the chromosome:
  • Lane 1 lkb ladder
  • Lane 2 B. subtil is subsp. a fragment obtained by cutting genomic DNA of the krictiensis strain into 7al;
  • Lane 3 B. subtil is subsp. fragment of genomic DNA of krictiensis mutant -10 strain cut by C / al;
  • Lane 4 pl21E3 vector cut with a3 ⁇ 4HI.
  • FIG. 19 shows B. subtilis subsp.
  • LC-Mass is the result of the analysis of the production of iturin D to F among the six types of eryurin produced by krictiensis.
  • the krict / ens is ATCC 55079 strain is a strain isolated by the inventor. It is described in the US patent.
  • Cultures of Bacillus subtilis and E. coli strains were cultured with LB (10 g of Bacto-tryptone, 5 g of Bacto-yeast extract, and 10 g / £ sodium chloride). Used.
  • LB Bacto-tryptone
  • Bacto-yeast extract As the medium for producing the active substance of Bacillus subtilis strains, the mixed medium (sucrose 30 g, soytone 10 g, yeast extract) (yeast extract) 5 g, K 2 HP0 4 0.5 g, MgS0 4 2 g, MnCl 2 4 nig, CaCl 2 5 mg, FeS0 4 - a 7H 2 0 25 rag, pH) were used.
  • Spizzizen (10 ml of 50% glucose, 2% casein hydrolysate 10 lii ⁇ , 10% yeast extract 10 ⁇ £, 1M MgCl 2 2.25 KH 2 P0 4 6 g, 14 g of K2HPO4, (NH 4 ) 2 S0 4 2 g, citrate (Na citrate) 1 g MgS0 0.2 g / i) medium was used.
  • subtilis Subtilis Heterogeneous Crentiens 09. subtilis subsp. genome library of krictiensis) strains
  • the inventors of the present invention are iturin and sulfactin (cyclic lipopeptide) antibiotics of similar molecular weight, only the sequence linked to the composition of amino acids, and the size of the sulfatin gene that is because 32 kb or very large extent that, to be considered to be similar and install paekrin size of the Turin genes, two antibiotics doedaga synthesized by the same biosynthetic pathway by which stage synthesis with different biosynthetic 'path from a certain stage Estimated.
  • IfuriiiA Particularly, it is assumed that a combination of peptide cyclization and acyllat ion linking peptide and fatty acid will be used to produce sulfactin.
  • Various primers were designed and PCR were performed from the nucleotide sequences of known Bacillus subtilis 168 strains. B. subtil is subsp. PCR was carried out using the chromosomal DNA of the krictiensis strain and B. subtil is 168 strain as a template to obtain a 1.8 kb PCR product which is commonly produced in both strains, and the sequencing was performed to determine the sequence of the peptide product. ), And then cloned iturin biosynthetic gene using colony hybridization and Southern hybridization methods.
  • the B. subtil is subsp.
  • B. subtilis subsp In order to clone the leucine biosynthetic gene from the genome library of the krictiensis strain, B. subtilis subs. After chromosomal DNA of the krictiensis strain was subjected to Sau3A —partial digest ion, a DNA fragment of 20-30 kb was inserted into the Cosmid pLAFR3 vector (obtained from the Department of Oriental Biochemistry, Seoul National University). Cosmid PLAFR3 vector into which the fragment was inserted was transformed into E. co // HB101 to prepare a genomic library.
  • the present inventors reported that the gene molecular weights of iturin and sulfatin are similar, 7 peptides form a cyclic ring, and the size of sulfatin gene is reported to be 32 kb. I thought it would be about the same size. Also, among the strains of Bacillus subtilis, strains that produce both iturin and sulfactin have been reported. Considering the gene size of these leucine and sulfactin, peptide cyclization (acylation of fatty acid linkage with 0 (: 112 ⁇ 01 process) process Acylation was assumed to use the same biosynthetic process. Based on these assumptions, primers were prepared based on the sequence information of the sulfatin gene, and the B.
  • the primers used were as follows:
  • SrfAl (SEQ ID NO: 18): 5 '-CGG GAA AGC GCT GGG GAA TAA CCG C-3';
  • SrfA2 (SEQ ID NO: 19): 5 ' -CCT TCA AAG CTT TGA ACA GGT GGT C-3';
  • SrfA4 (SEQ ID NO: 21) : 5 ' -GTT CTG TCT CTT CAG CAG TCA GCG AG-3'
  • SrfA5 (SEQ ID NO: 22): 5 ' -GCG ATT GAT TAT GCG CTT GTT GAG-3';
  • SrfA6 (SEQ ID NO: 23): 5 ' -TCG GCA CAT ACG CTG ATT GAA CTG C-3';
  • SrfA7 (SEQ ID NO: 24): 5 -GGG TAA AGG ATC GCC TCA ATC GTT— 3 ';
  • SrfA8 (SEQ ID NO: 25): 5 '-CGA AAT AGG CTA TCT CGC ACT CAG-3 1;
  • SrfA9 (SEQ ID NO: 26): 5 ' -TTC AGA ATA GGG CTT ATC AAG CA-3';
  • SrfBl (SEQ ID NO: 28): 5 ' -ATG TCT CAG ATG CAT GGA GC-3';
  • SrfB2 (SEQ ID NO: 29): 5 ' -CTG GCA ACT AAT AGG CTG AC-3';
  • SrfB3 (SEQ ID NO: 30):. 5 '-ATT GAA GCT TGT GCC GCC TG-3';
  • SrfB4 (SEQ ID NO: 31): 5 '-TCC ⁇ AAA GCT TTG CAC AG-3 *;
  • SrfB5 (SEQ ID NO: 32): 5 ' -GAA ACA GCA GCG ATT ATG AAC GAC-3';
  • SrfB6 (SEQ ID NO: 33): 5 ' -AGA CAT CGA GCC AGT ATT CCT CAT C-3';
  • Sr.fB7 (SEQ ID NO: 34): 5'- -ATT TCG AGC GGC CAG CTG AAC G—3 ';
  • SrfB8 (SEQ ID NO: 35): 5'-TTT CAT CCG GCG CCG TAT AGG TTT-3 ';
  • SrfB9 (SEQ ID NO: 36) : 5 ' -GCA AAA ⁇ CCG GAC AGC GGG ATA T-3'
  • Example 3-3-1 B. subtilis subsp.
  • the NCBI database was searched for comparative analysis of the amino acids shown in FIG. 3.
  • the gene product showed 56-83% homology with other acyl carrier protein reductases derived from other microorganisms, especially those derived from other B. subtilis strains. Showed 83% homology (FIG. 4).
  • B. subtilis subsp. 1.8 kb DNA fragments obtained from the krictiensis strains were denatured by boiling at 100 ° C for 10 min to be used as probes for colony localization, rapidly cooled on ice and labeled buffer (5X) 5 ⁇ , dNTP Mixture 2 Denatured DNA template 7 / rf, BSA (10 mg / m ⁇ ) 2 ⁇ , 32 P-CTP 5 ⁇ , Klenow enzyme 1, DW 3 ⁇ to prepare a reaction solution, 1 hour at 37 ° C. I rebounded. After the reaction, the reaction was stopped with 0.5 M EDTA, 3 N NaOH 2.5 ⁇ was added, and the reaction was performed at 37 ° C for 1 hour, and then used as a probe.
  • B. subtilis subs The krict iensi ex genomic library was plated on LB plates containing tetracycline at a final concentration of 10 / g so that 100 to 200 colonies appeared per plate, and the colonies were approximately 1 mm in diameter. Incubate overnight at 37 ° C until enough.
  • the colonies were transferred to nylon membrane, 5 minutes in 10% SDS for membrane, 5 minutes in denaturing solution [0.5 N NaOH, 1.5 M NaCl], neutralizing solution [1.5 N Incubate for 5 min in NaCl, 0.5 M Tris-HCl, ⁇ 7.4], and use 2 ⁇ SSC solution [20 ⁇ SSC solution diluted 10-fold; 20x SSC composition was washed with 0.15 M NaCl, 0.01 M sodium citrate, 0.001 M EDTA] and dried. Baking at 80 ° C. in a vaccum oven for 1-2 hours.
  • Membrane was treated with prehybridization solution [1 mM EDTA, 250 mM Na 2 HP0 4 , 1% Casein hydrolysate, 7% SDS pH 7.4] and reacted at 65 ° C for 2 hours. Afterwards, a labeled probe mix [template DNA 14 5X labeling buffer (promega) 5 ⁇ l, dNTP (ATP, TTP, GTP) 1 ⁇ , Klenow enzyme 1, 32 P-dCTP 2,] was added and reacted overnight. Reaction solution after washing [washing solution I : 20 X SSC 10 mi ,.
  • washing solution II 20 X SSC 10 mi, 10% SDS 10 m £, distilled water 80 mi
  • Wash solution 111 washed with 20 SSC 0.5 mi, 10% SDS 1 mi, distilled water 98.5 and exposed to X-ray film to select photosensitive positive colonies.
  • FIG. 5A B. subtilis subsp. A clone showing homology with the DNA fragments obtained from the krictiensis strain was observed (FIG. 5A).
  • Wild B. subtilis subsp In order from the genomic library of the lamina krictiensis strain for cloning the Turin biosynthesis genes to obtain a variety of sizes of the DNA fragments obtained by cutting "portion of the genomic DNA in a wild state ⁇ ⁇ B. subtilis strain. Of these, 20 to 30 kb sized DNA fragments of cosmid pLAFR3 vector were constructed using a cosmid pLAFR3 vector, and the clones obtained by cutting various types of colonies obtained by ⁇ ⁇ . Were analyzed using Southern hybr idizat ion.
  • the membranes to which the DNA fragments were transferred were dried and hybridized.
  • the membrane is washed for 2 hours with probe-free buffering buffer [1 mM EDTA, 250 mM Na 2 HP0 4L 1% casein hydrolysate, 7% SDS H 7.4], and again 15 solution I , II, III and then washed twice in the order of removing the solution.
  • the labeled probe mix [template DNA 14 ⁇ 5X labeling supernatant (promega) 5 ⁇ , dNTP (ATP, TTP, GTP) l /, Klenow enzyme 1/32 P-dCTP 2] was added overnight. I rebounded.
  • the probe DNA was removed, the membrane was dried, placed on the X-ray ' film, and left at -70 ° C. overnight to develop the X-ray film (FIG. 5C).
  • B. subtilis subsp The DNA probe sequence obtained from the krictiensis strain was confirmed to exist, and these two clones were named as pJJ815 and pJJ121, respectively.
  • Restriction enzyme maps were prepared for the pJJ815 and pJJ121 clones obtained in Example 3. And a restriction enzyme map of the two clones, and as a result of mapping the restriction enzyme maps of the two clones, pJJ121 clone was identified as pJJ121E2 (part of 0RF 2—2 to 0RF 3, 8,020 to 2,3480 bp of SEQ ID NO: 1), pJJ121E3 (part of 0RF 3 to ORF 4), pJ815E4 (part of 0RF 4), P JJ815E6 (part of 0RF 4 to yczE, 29,167 bp 32,819 bp of SEQ ID NO: 1), pJJ815 clone is a pJJ121E2 fragment, pJJ121E3, pJJ815E4, pJJ815E6, PJJ815E5, P JJ815E2 (parts of yczE to
  • B. subtil is subsp. Southern hybridization was performed using chromosomal DNA of the krictiensis strain and B. subtil is 168 strain. In addition, in order to confirm whether the reaction affects the reaction according to the temperature during the Southern shake, Southern shake was performed at 50 ° C and 65 ° C.
  • B. subtilis subs Clones obtained from krictiensis strains and B. subtil is 168 strains with genomic DNA were digested with ⁇ I restriction enzymes and electrophoresed on 0.7% agarose gels, stained with ethidium bromide, and then solution I [ Tris_HCl 100 mM, NaCl 150 mM, pH 7.5] was reacted for 15 minutes, and solution II [Tris® HC1 100 mM, NaCl 150 mM, blocking reagent 0.5%, pH 7.5] was reacted for 30 minutes.
  • the genomic DNA of the B. subtilis 168 strain showed a weak homology to the pJJ121E3 fragment probe when the Southern isomerization reaction was performed at 50 ° C, but the Southern isomerization was performed at 65 ° C for the other fragments.
  • the results were the same (Fig. 8).
  • the 6 ⁇ oRI fragments were almost identical to the sulfactin biosynthesis gene isolated from B. subtilis 168 strain, except for the pJJ121E3 fragment, which showed a slight reaction when reacted at 50 ° C. B. subtilis subsp.
  • the krictiensis strain showed similarity
  • Bidirectional nucleotide sequences were determined using ccRI fragments cloned from the cosmid clones of PJJ815 and pJJ121 to obtain 21,253 bp, and genome library screening was performed to further secure nucleotide sequences for some missing genes. Get the gene and determine the nucleotide sequence. A total of 37,682 bp nucleotide sequence was obtained, and 7 0RF related to iturin biosynthesis was found in the nucleotide sequence (FIG. 9).
  • ORF 1 contains the 2868-3219 base sequence of SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 2), 0RF 2-1 represents the 3810-4353th nucleotide sequence (SEQ ID NO: 4), and 0RF 2-2 has 4632 to the Contains the 14559th base sequence (SEQ ID NO: 5).
  • 0RF 3 comprises the 14583-25341th base sequence (SEQ ID NO: 6) of SEQ ID NO: 1, and 0RF 4 comprises the nucleotide sequence of the 25378-29209th SEQ ID NO: 7; 0RF 5 includes the nucleotide sequence of 29231 to 29960 bp (SEQ ID NO: 8), and 0RF 6 includes the nucleotide sequence of 30084 to 31392 (SEQ ID NO: 9).
  • SEQ ID NO: 6 includes the nucleotide sequence of 30084 to 31392
  • the sulfactin gene from B. subtilis showed 76-86% similarity to 0RF, while the 92 to 100% similarity with the sulfactin gene from B. amyloliquefaciens.
  • 0RF 2- 1 (543 bp)
  • 0RF2-2 (9,927 bp)
  • ORF3U0 / 757 bp which are believed to be directly involved in iturin biosynthesis, were 92-98% of the sulfactin genes derived from B. amyloliquefaciens strains, respectively. Similarity was shown (Table 1).
  • B. amyloliquefaciens FZB42 strain which shows 98% similarity among these B. amyloliquefaciens strains, is known to produce cyclic peptides actin, fengycin, and bacillomycin D (baci 1 lomycin D). (Chen, et al., Nature Biotechnol., 25: 1007-1014, 2007), but does not produce iturin Reported as. Accordingly, the inventors of the present invention, B. amyloliguefaciens FZB42 strain and B. subtilis subsp. The homology of the entire genes of the krictiensis strain was compared (Table 2).
  • the two strains showed a homology of 983 ⁇ 4> when the overall gene sequences were compared, but considering the overall gene size of 37,682 bp, the 2% difference between the two strains was about 753 bp or more.
  • the B. amyloliquefaciens FZB42 strain has already been reported to produce no iturin (J. Bacteriol., 186: 1084-1096, 2004; Nature Biotechnol., 25: 107-1014, 2007).
  • B. subtilis subsp It showed a big difference from the krictiensis strain.
  • Table 4 shows ⁇ ⁇ subtil is subsp. of ORF 2-2 (9,940 bp) of the krictiensis strain ⁇
  • the base sequence is compared with other strains using Blast X.
  • Table 5 shows B. subtilis subsp.
  • the sequence of ORF 3 (10,770 bp) of the krictiensis strain is compared with other strains using Blast X. O / ⁇ A V , £ 090 ⁇ ⁇ : / l2 / n 0 2M / .s800
  • Plates of Magnaporte Griscia test bacteria were prepared using a middle-layer flat plate, first with 0.15% sucrose and 1.5% agar in rice leaf leachate.
  • each layer was overlayed and the assay flat tube was prepared.
  • the cells cultured in Sabouraud's agar slope media were used for 10 to 14 days, and Saborod agar was used as the basal medium.
  • Trichophyron the causative agent of athlete's foot, is inoculated with Tr j chophyt on ment agrophyt es strains in Sabouraud's dextrose broth and shaken for 2-3 days, followed by 3 ⁇ 4 germ blending blender. homogenization with a (waring blender), absorbance
  • Fusarium oxysporum strains grown on Potato dextrose agar medium were inoculated in potato dextrose broth and shaken for 2-3 days, followed by sterile Waring blender. Homogenize, adjust the absorbance (A 550nm ) to 1.5, sterilize, add uniform solution 10 1 to 50 d of potato dextrose agar adjusted to 50 ° C, uniformly mix, and pre-dispense the Potato Tex agar to solidify
  • the assay plate was prepared by layering 5-10 m £ depending on the size of the plate on the base layer.
  • B. subtil is subsp.
  • B. subtil is 168 strains containing the krictiensis strain and the surf act in gene.
  • Standard compounds were purchased from Sigma Co. and Wako Co ..
  • Magna Porte Grisia a causative agent of rice blast bacteria Antibacterial activity against the standard compounds Iturin A and sulfactin was investigated using Trichophyton mentagrophytes, the athlete's foot fungus, and three kinds of fungus, Fusarium oxysporum.
  • concentrations of sulfactin and iturin A compounds were different from 1.56 to rice filamentous bacteria on the plate of Magna Porte Gricia, Trichophyton mentagrophytes, and Fusarium oxis forum prepared in Example 7. 12.56 ug / mi t for athlete's foot Four concentration series were prepared by diluting each compound twice to 3.25-25 ⁇ g / mi, and Fusar m, which is a causative agent of wilt disease, of 6.25 to 50 // g /. Each compound prepared by concentration was placed in a sterile cup (outer diameter 6.6 ⁇ , height 8.6 ⁇ , stainless material, Fisher Co.) on a plate containing the test bacteria at 4 concentrations. After dispensing three times, and incubated for 1 to 3 days at 25 ° C to examine the growth inhibition of the test bacteria to investigate the antimicrobial activity.
  • subtilis subs which produce iturin.
  • krictiensis strain and iturin and sulfa B. subtilis JH642 strain which does not produce all lean antibiotics, was used as a control, and had the sulfactin gene but did not produce sulfatin by natural mutation of the sfp gene.
  • subtilis 168 strain and ⁇ estimated to produce sulfactin and ilein. subtilis C9 strain was used.
  • B. subtilis subsp The krictiensis strains showed strong antimicrobial activity in all of the specimens of Magnaporte gricia, Trichophyton mentagrophytes and Fusarium oxis forum, in the same manner as the results using the standard compound Iturin A.
  • B. subtilis JH642 strain or ⁇ mutated spontaneously sfp gene The subtilis 168 strain showed no antimicrobial activity against three types of test bacteria, but the B. subtilis C9 strain showed antimicrobial activity against three types of test bacteria.
  • the present inventors have in addition to A C9 subtilis antimicrobial activity of the strains, a sulfonic pectin shown in the results, was assumed to be caused to second class children production, it was used as the Turin mutations selected during two weeks with the test fungus F. oxysporum ⁇ Based on these results (FIG. 11).
  • Bacillus subtilis subsp. A single colony obtained by freshly incubating krictiensis strains in LB plate medium was obtained from 2 ⁇ Spizzizen medium (.50% glucose 10, 2% casein hydrolysate 10 mi, 10% yeast extract 10 ui ⁇ , 1M MgCl 2 2.25 m £). , K3 ⁇ 4P0 4 6 g, HP0 4 14 g, (N3 ⁇ 4) S0 4 2 g, sodium citrate 1 g, MgS0 4 0.2 g, distilled water 1 liter) and incubated at 37 ° C, 200 rpm for 16-18 hours.
  • Mutants comprising fragments of pBT6, pBTl, pBT2, and pBT3 were identified as ' B. subtilis subsp. krict / ensis (pBT6), ⁇ . subtilis subsp. krj '' ctiensjs (pB l), B, subti lis subsp. krictiensis (p 2) and B. subtilis subsp. It was named / c / fiv? s / s (pBT3) (FIG. 10).
  • B. subtilis subsp. krictiensis strain containing 0RF prepared in Example ⁇ 8-1> .
  • B. subtilis subsp. Transformed with fragments (pBTl, pBT3, and pBT6).
  • the antimicrobial activity of krictiensis strains (pBTl, pBT3, and pBT6) was determined.
  • the cells were centrifuged at 8,000Xg for 10 minutes to remove the cells, and the supernatant passed through the 0.2 rn membrane filter was placed on paper disks (thick, 8 mm in diameter, Toyo Roshi Co.) 100 ⁇ each. Addition to the assay plate medium prepared in Example 2 was added to incubate for 1 to 3 days at 25 ° C and examined the degree of growth inhibition of the Fusarium oxysporum test bacteria.
  • the pJJ121 fragment first cleaved into a pBC KS (+/-) vector
  • the pJJ121E2-2 clone inserted into (Stratagene) was cut into and cloned into pTZ18 vector (Promega), and the Sail site was removed.
  • the pl21E3 (Fig. 14) clone containing the pIC333 vector in the CM region of the vector was cleaved into regions 1 and AI containing the spectinomycin gene, and PCR was performed based on the nucleotide sequence of the pTZ18 vector. After attaching the cla ⁇ site using the cla ⁇ site, the cleavage was performed again.
  • the pJJ121E2-l vector was prepared by inserting the spectinomycin gene into B. subtilis subsp. krictiensis 6 ⁇ transformation. B. subtil is subsp.
  • the mutant inserted on the chromosome was selected from the spectinomycin-containing medium. Specifically, ⁇ .
  • subtilis mutant -10 had a 7,940 bp from 16,430 bp to 24,370 bp of 0RF3 portion is inserted, is the spectinomycin to the Cla I site of the 21,046 bp insert portion is inserted in it second-rate Rin and the biosynthesis occur believed 'that The / J site of PJJ121E2-1 vector was cut and removed to increase the efficiency during transformation.
  • the missing region of 0RF3 inserted in B. subtilis mutant -10 is Sal ⁇ -Ec (Rl-Sa ⁇ site, a? RI-5a / I site is derived from pJJ121E2 fragment, as described in FIG. 14, Total loss of base sequence was 8.41 kb (8,020 ⁇ 16,430bp) and total 8.443 kb up to the Sail site (33 bp) derived from the vector on the left side of EcdRl site.
  • the mutant strains selected in the spectinomycin containing medium were named B. subtilis mutant -10, and B. subtilis subsp.
  • the culture medium and the culture medium of the mutant -10 were measured for the antibacterial activity.
  • a certain amount was loaded on the plate medium of the test bacterium Fusarium oxysporum (v sa // ff oxysporum).
  • B. subtilis mutant -10 which lost the function of the iturin biosynthesis gene, exhibited only slight antifungal activity that could be identified, while B. subtilis subsp. krictiensis represents a potent antifungal activity, and the acquired gene is confirmed to be an iturin biosynthesis gene, B. subtilis subsp. It was confirmed that krictiensisA is directly related to the antimicrobial activity (Fig. 15).
  • subtilis mutant -10 strains and then digested with ⁇ / ⁇ and 3 ⁇ 4I from the P121E3 clone containing genomic DNA and spectinomycin genes digested with C / al restriction enzymes. Southern spectroscopy was performed using an isotopically labeled probe of one spectinomycin fragment.
  • the P121E3 clone containing the spectinomycin gene used as the probe was 3 ⁇ 4 /? It was confirmed that the spectinomycin gene is present at the 1.5 kb position of the fragments cut into and 3 ⁇ 4al, and the spectinomycin gene is present at the same position as the spectinomycin fragment derived from the pl21E3 clone in 10 strains of B. subtilis mutation. Thing. I could confirm it. In contrast, B. subtilis subsp. There was no spectinomycin gene in the krictiensis strain (FIG. 16). From these results, in Example ⁇ 10-2>, 10 strains of B. subtilis mutant strain did not show antimicrobial activity, so that the spectinomycin gene was inserted on the chromosome to produce iturin. I could see.
  • B. subtilis subs The purpose of this study was to determine whether there was a difference in the production of leucine antibiotics from the culture of krictiensis and B. subtilis mutant strains.
  • B. subtilis subsp The high-performance liquid chromatography chromatograms for the krictiensis strain and iturin A, a standard, show significant similar peak morphology, but in B. subtilis mutant -10 strains . Air A lean to "not applicable peaks are not detected at all (Fig. 17), in Example 10-2 B. subtilis mutant-10 mutant is the mutant Fusarium oxy's forum 0 sar / i /» oxysporum) the test fungus The absence of antimicrobial activity showed that the spectinomycin gene was inserted on the chromosome, so that iturin synthesis did not occur at all.
  • Example ⁇ 10-1> B. subtilis subsp.
  • the molecular weight of the chromatograms derived from krictiensis was investigated using LC-Mass to investigate the presence or absence of six types of iturin AF. HPLC analysis showed B. subtilis subs. In the krictiensis strains, it was confirmed by chromatogram that six kinds of iturin A-F were produced (Fig. 18).
  • the molecular weight of the produced iturin compounds A-F was determined by mass spectrometry [M + Na ] as a result each of the molecular weight of the Turin a ⁇ F analysis to + were detected peak corresponding to the (a: 1043, B-.1057 , C: 1057, D: 1071, E:: 1071, F 1085). From these LC-Mass results, B. subtil is subsp. In the presence of krictiensis 6 ⁇ , but peaks not present in the B. subtilis mutant -10 mutant line exactly match the iturin A-F (Figs. 19, 20), the B. subtilis mutations—in the F. oxysporum plate of the 10 mutant strains. It could be reconfirmed that the cause which did not exhibit antimicrobial activity was due to the inhibition of production of the iturin compound.

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Abstract

본 발명은 신규 이튜린(iturin) 생합성 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 바실러스 섭틸러스(Bacillus subtilis subsp. krictiensis ATCC 55079) 균주로부터 이튜린 생합성 유전자를 클로닝하고, 클로닝한 유전자가 이튜린 생합성 유전자인지의 여부를 확인한 후 염기배열을 결정하였으며, 이미 보고된 유전자와 비교분석하여 동정된 유전자는 기존에 보고된 유전자와는 다른 새로운 유전자라는 것을 확인함으로써, 신규 이튜린 생합성 유전자 및 이의 용도를 제공한다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
길항미생물 바실러스 섭틸러스로부터 신규 이류린 생합성 유전자의 클로닝과 염기배열 결정 및 그 유전자의 특성
I기슬분야】
본 발명은 신규 이튜린 생합성 유전자에 관한 것으로, 구체적으로 바실러스 섭틸러스 (fee// /us subtil is subsp. krictiensis ATCC 55079) 균주 유래 신규한 이튜린 (iturin) 생합성 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.
【배경기술】
생물학적 방제는 식물에 병해 (病害)를 유발하는 병원성 미생물을 길항작용 이 있는 다른 미생물을 이용하여 방제하는 것을 말하며 가장 대'표적인 생물농약은 미생물 자체를 직접 이용하거나 미생물을 이용하여 각종 식물 병원균과 농작물에 해를 주는 곤층, 옹애, 선충 등의 해층 ¾ 잡초 등을 방제하는 데 주로 사용되고 있다. 이러한 생물학적 방제 연구는 1900년대 초부터 시작되어 그 동안 많은 종류 의 세균， 곰광이를 이용하여 식물 병원균을 억제하려고 많은 노.력을 기을여 왔다. 그러나 토양 속의 생태계가 복잡하고 식물체와 미생물 간에는 복잡한 상호 작용이 연관되어 있기 때문에 그 동안 연구 결과들이 매우 미진하였으나, 최근 들어 식물 체와 미생물 간의 상호작용들이 하나씩 밝혀지고 있고, 분자생물학 등 생명공학 기 술의 발달로 인해 괄목할 만한 결과들이 발표되기 시작하여 현재 전 세계적으로 40 여종의 생물학적 방제제가 개발되었고 (H. D. Burges, Formulation of microbial biopesticides, Kluwer Academic Publisher, Dordrecht , The Netherlands, p.187- 202, 1998) , 미국에서만 25종의 종류가 등록되어 상품화되었다 (B. B. McSpadden Gardener , et al . , Plant Health Progress [ Internet ] ， May 10, 2002 [cited Aug.13， 2010 ] ， Available from: ht t : // www . i ant management net work . org/pub/php/review/biocontrol/) . 등록된 대부분의 제품들이 토양 전염에 의해 발생하는 푸사리움속
(Fusariuin) , 피시움속 (/ / ) , 라이족토니아속 ? ， 스클레로티니아속 Sclerotinia, Phytophthora) 등에 대한 식물병 방제용이나， 이들 제품들은 아직 큰 시장을 점유하지 못하고 있는 실정이다. 지금까지 가장 성공적인 생물학적 방 제의 예는 아그로박테리움 투메파시언스 ( §rob3c e /i/»
Figure imgf000004_0001
의해 발병 하는 과수 뿌리병인 근두암종병 (crown gall)의 방제이다 (A. Kerr, Plant Dis., 64： 25-30, 1980) . 이 식물병은 화학합성 농약으로는 방제가 불가능하나 아그로박테리 움 라디오박터 (4§ o«c er/i/ff radiobacter 7\ 생산하는 아그로신 (agrocin)이라는 항생물질이 A. twnefaciens^ 침입을 억제하는 것이 알려지게 되었고， 그 후 유전 공학 기법을 이용하여 A radiobacter^ 개량한 몇 가지 제품이 '개발되어 전 세계 시장의 상당 부분을 점유한 것으로. 추측된다 (제품명: Nogall, Norbac and Galltrol-A 등). 또 다른 성공 사례는 슈도모나스 플루오레센스 ( Pseudomonas
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이용한 밀의 뿌리썩음병 방제 연구로 미국의 USDA와 Washington 주 립대학 연구팀이 (D. M. Weller, Annu. Rev. Phytopathol . , 26： 379-407, 1988； D. M. ffeiier, et ai . , Can. J. Plant Pat oi . , 8: 328-334, 1986； R. 7. Cook, Can. J. Plant. Pathol. , 14： 76-85, 1992) 10여 년에 걸친 연구를 통해 밀의 뿌리병을 야기하는 게우만노마이세스 그라미니스 아종 트
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graminis var. ir/i/c/)에 강력한 길항작용을 나타내는 P. 7«^es^ 5#토양으로부터 분리 하는 데 성공하였다. 이 길항 미생물을 밀의 종자에 처리하여 파종하였을 경우 밀 의 수확량이 10 ~ 20% 증가함을 확인하였는데， 이러한 효과는 슈도모나스 {Pseudomonas) 7} 생산하는 페나진 (phenazine)계 (ᄂ. S. Thomasho , et al . , Ap l . Environ. Microbiol . , 56： 908-912, 1990； C. Keel, et al .， Mol . Plant-Microbe interact. , 5: 4-13, 1992)와 2,4—플로로글루시놀 (2 ,4-diacetyl phloroglucinol 항 생물질 (C. Keel, et al . ' Mol. PI ant -Microbe Interact. , 5： 4-13, 1992)에 의한 것으로 밝혀졌다. 8년에 걸친 포장 실험을 통해 드러난 살포시기와 지역에 따른 방제 활성의 차이점을 극복하기 위해 연구팀은 유전공학 기법을 도입하여 phenazine계 항생제 생산과 관련된 슈도모나스 종 iPseudomonas . sp.)의 유전자 발 현을 극대화하여 밀 뿌리 썩음병 방제 효과의 불규칙성을 극복하는 데 성공하였다
(M. H. Ryder , et al . , Improving plant productivity with Rhi.zobacter ia, CSIRO Divisions of soils, Adelaide, South Australia, p..24그 249， 1994) .
바실러스 섭틸리스 ( subtilis) 균주는 여러 종류의 항생물질뿐만 아니라 각종 효소들을 생산하는 특징으로 인해 많은 연구자의 주목을 받아 왔고， 사카로마 이세스 세레비제 (5. cerevisiae) 및 락토바실러스 ^{Lactobacillus sp.) 등과 더 불어 미국 식품의약국에 의해 인체 및 환경에 무해한 균주로 인정받고 있다. . subtilis^ 이용하여 개발된 미생물 제제로는 에픽 (Epic), 코디악 (Kodiak), 컴패니 언 (Companion), 하이스틱 (HiStick) 및 세레나데 (Serenade)등이 있으며 , 이들은 주 로 종자 처리제나 수확후 (post-harvest) 및 야채 등의 부패 방지용으로 널리 쓰이 고 있다 (B. B. McSpadden Gardener , et al . , Plant Health Progress [ Internet ] , May 10, 2002 [ cited Aug.13, 2010 ] ， Available from: ht tp : //www . p 1 ant management net work . org/pub/ hp/ revi ew/biocontrol /) . 특히 2, 000년대 초반에 아그라퀘스트 회사 (AgraQuest Co.)에서 등록한 Serenade는 B. subtilis QST713 균주를 이용하여 생산되며 살균제 (fungi ie)와 항세균제 (bactericide)로 25개국에 등록되었고， 현재 용도에 따라 다양한 제품들이 판매되 고 있다. 또한 미국 USDA의 연구팀은 B. subtilis7\ 생산하는 이류린 계열의 항생 물질이 복숭아 복숭아나무잿빛무늬병 (brown rot)의 병원균인 모닐리니아 프럭티콜 ^ ionilinia fructicol )^ 억제하는 것을 발견하고 B. subtilis균주를 과수저장 중 부패 방지제로 개발하려는 연구를 시도하였다 (R. C. Gueldner, et al .， J. Agric. Food Chem. , 36: 366-370, 1988) .
이외에 미국 USDA의 Dr. Pusey 연구팀은 B. subtil isA 많은 식불 병에 대 해 억제효과가 있는 것을 발견하였으며 (P. L. Pusey, et al. , Pesticide Sci. , 27： 133-140, 1989), Phae 등도 퇴비용 부숙 토양으로부터 식물 병원균에 광범위한 억 제효과를 나타내는 B. subtilis NB22 균주를 분리하고 그 활성 성분이 이튜린계 물 질임을 증명하였다 (C. G. Phae, et al . , J. Ferment . Bioeng. , 69: 1-7, 1990) . 이 처럼 바실러스 균주가 생산하는 환상형 펩타이드 항생물질인 이튜린은 오래 전부터 생물학적 방제제로 널리 이용되어 왔으나 분자 수준에서 이튜린 생합성 유전자에 대한 분자 수준에서의 연구는 1990년에 일본 연구팀에서 J. Ferment . Bioeng.에 발 표한 것을 제외하고는 거의 연구가 이루어지지 않았다ᅳ 이튜린 (iturin) 이외에 다른 환상형 펩타이드인 설팩틴 (surfactin) 생합성 유전자를 갖고 있는 B. subtilis 168 균주의 전체 유전자에 대한 염기배열이 1997 년에 발표되었고 (Kunst, F. , et al . , Nature, 390： 249-256, 1997) , Β. subtilis ATCC 6633 균주로부터 마이코섭틸린 (mycosubtilin)의 생합성 ^전자에 대한 연구 결과가 1990년대 후반 독일 연구팀에서 보고하였다 (E. H. Duitman, et al . Proc. Natl. Acad. Sci . , 96 13294-13299, 1999). 그 이후 2,000년대에 들어오면서 일 본 연구팀에 의해 B. subtilis RB14 균주로부터 이튜린 A 유전자의 클로닝과 염기 배열 및 그 특징에 대해 발표되었다 (K. Tsuge, et al . , J. Bacteriol. , 183: 6265- 6273, 2001). 또한， 독일 연구팀에서는 식물의 생장을 촉진하면서 동시에 식물 병 원균을 억제하는 B. amyloliquefaciem FZB42 균주가 이차 대사산물로 환상형 펩타 이드인 설팩틴, 펜지신 (fengycin) 및 바실로마이신 iXbac lomycin D)를 생산하는 것을 발견하고, 생산되는 이차 대사산물들의 유전자 구조와 기능적인 특성을 분자 수준에서 규명하고 보고하였다 (A. Koumoutsi, et al. , J. Bacteriol., 186： 1084- 1096, 2004) . 이외에도 상기의 독일 연구팀에서는 B. amyloliquefaciem FZB42 균 주가 상기 3종류의 환상형 펩타이드 이외에 폴리케니드 (polyketide)계 항생물질인 마크로락틴 (macrolactin) 바실래인 (baci Uaene) 및 디피시딘 (diff icidin)을 생산 한다고 보고하였다 (Chen, et al . Nature Biotechnol . , 25： 1007-1014, 2007) . 이 와 같이 다양한 환상형 펩타이드 항생물질에 대한 보고는 간헐적으로 이루어지고 있으나， 다양한 종류의 이튜린 생합성 유전자에 대한 보고는 거의 없는 실정이다. 이에， 본 발명자들은 국내 토양에서 분리한 다양한 식물 병원균에 효과적이 6종류의 이튜린 (iturin Aᅳ F)을 생산하여 1992년도에 미국 특허를 획득한 B. subtilis subsp. krictiensis ATCC 55079 균주 (S. H. Bok, et al . , 미국 특허 등록번호 5， 155,041, 1992. 10. 13)로부터. 이튜린 생합성 유전자를 클로닝하였고 유전자의 염기배열을 결정하여 이튜린 생합성 유전자를 동정하고 그 특성을 분석하였으며， 상기 이튜린 생합성 유전자는 종래의 이튜린 유전자와 염기서열에서 많은 차이를 나타내고 있는 신규한 이튜린 생합성 유전자임을 확인함으로써， 본 발명을 완성하였다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명의 목적은 신규한 이류린 (iturin) 생합성 유전자, 상기 유전자가 암호화하는 단백질 및 이들의 용도를 제공하는 것이다ᅳ .
【기술적 해결방법】
본 발명은 서열번호 6으로 기재되는 염기서열을 갖는 이튜린 (iturin) 생합 성 유전자 또는 상기 유전자에 대해 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 이튜린 생합성 유전자를 제공한다.
또한， 본 발명은 서열번호 6과 서열번호 5로 기재되는 염기서열을 갖는 이 튜린 생합성 유전자를 제공한다.
또한， 본 발명은 서열번호 6과 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 이튜린 생합성 유전자를 제공한다.
또한， 본 발명은 서열번호 6과 서열번호 7로 기재되는 염기서열을 갖는 이 튜린 생합성 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 6과 서열번호 8로 기재되는 염기서열을 갖는 이 류린 생합성 유전자를 제공한다.
또한， 본 발명은 서열번호 6， 서열번호 3 및 서열번호 7로 기재되는 염기서 열을 갖는 이튜린 생합성 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 6， 서열번호 3 및 서열번호 8로 기재되는.염기서 열을 갖는 이류린 생합성 유전자를 제공한다. 또한， 본 발명은 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 기재되는 염기서 열을 갖는 이튜린 생합성 유전자를 제공한다.
또한， 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 이튜린 생합성 유 전자를 제공한다.
또한， 본 발명은 본 발명볘 따른 유전자에 의해서 암호화되는 이튜린 단백 질을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 이튜린 생합성 유전자의 염기서열올 포함 하는 백터를 제공한다.
또한， 본 발명은 본 발명에 따른 이류린 생합성 유전자의 염기서열을 포함 하는 백터가도입된 형질전환체를 제공한다. ·
또한， 본 발명에 따른 형질전환체에 의해서 생성된 이튜린 단백질을 제공한 다.
또한， 본 발명은 본 발명에 따른 이튜린 단백질을 생산하는 형질전환체 또는 이의 배양액을 포함하는 생물학적 방제제를 제공한다.
아울러, 본 발명은 생물학적 방제제로 사용하기 위한, 본 발명의 형질전환체 또는 이의 배양액， 또는 본 발명의 형질전환체의 의해서 생성된 이류린 단백질을 제공한다. 이하， 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 서열번호 6으로 기재되는 염기서열을 갖는 이튜린 생합성 유전자 또는 상기 유전자에 대해 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 이튜린 생합성 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 암호화되는 이튜린 단백질을 제공한다..
. 상기 이튜린 생합성 유전자에 있어서， 서열번호 6으로 기재되는 염기서열은 이류린 생합성 유전자의 0RF 3을 포함하는 것이 바람직하며， 상기 이튜린 유전자에 의해서 암호화되는 단백질은 종래의 알려진 이튜린 생합성 단백질인 것이 바람직하 나， 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명자들은 신규한 이튜린 (iturin) 생 합성.ᅳ유전자를 동정하고자 우선， 설팩틴 (surfactin)을 생성하나， 이튜린 (iturin)은 생성하지 않은 것으로 알려진 . subtil is 168 균주를 이용하였다. 설팩틴과 이튜 린은 7개의 아미노산과 지방산으로 이루어진 환상형 리포펩타이드 항생물질로써， 아미노산의 조성과 연결된 순서만이 서로 상이하고 분자량도 유사하다고 알려져 있 다. 또한 설팩틴 유전자의 크기가 32 kb나 될 정도로 매우 크기 때문에, 이튜린 유전자의 크기도 이와 유사할 것으로 생각하고, 상기 두 항생물칠이 처음부터 서로 다른 생합성 경로로 합성되기보다는 어느 단계까지는 동일한 생합성 경로로 합성되 다가 일정한 단계부터 서로 다른 생합성 경로로 합성될 것으로 추정하였다. 왜냐 하면 B. subtilis균주 중 일부는 이튜린과 설팩틴을 동시에 생산한다고 알려진 균 주도 있기 때문에， 두 유전자의 크기를 감안하면 각각의 유전자가 별개로 존재할 가능성은 낮을 것으로 판단하였다. 즉, 설팩틴과 이튜린 각각의 유전자 크기를 고 려해블 때 특히 두 항생물질이 생합성되는 과정 중 펩타이드가 고리화 (cyclization)되는 과정과 펩타이드와 지방산이 연결되는 아실화 (acylat ion) 과정 은 설팩틴과 이튜린이 동일한 생합성 경로를 이용할 것으로 추정하였다. 이러한 추정을 토대로 Bacilhis genome project에 이용된 B. subtilis 168 균주에 대한 데 이타 베이스로부터 설팩틴 생합성 유전자를 확보하고, DNA 상동성 (homo logy)을 이 용한 방법으로 B. subtilis subsp. krictiensis 균주로부터 이튜린 생합성 유전자 를 클로닝하였다. 본 발명의 구체적인 실시예에서， B. subtilis 168 균주 및 B. subtilis subsp. krictiensis 균주의 염색체 DNA를 주형으로 삼고, PCR 및 전기영 동을 행하여 B. subtilis 168 균주와 B. subtilis subsp. krictiensis 균주로부터 얻은 각각의 유전자 산물 중에서 동일한 크기의 약 1.8 kb에 해당하는 DNA 단편을 B. subtilis subsp . krictiensis균주로부터 획득하였다 (도 1 참조).
또한， 본 발명의 구체적인 실시예에서， 상기 B. . subtilis subsp. krictiensis 균주로부터 획득한 DNA 단편에 대한 아미노산 서열을 NCBI 데이타 베 이스를 이용하여 다른 펩타이드 생합성 유전자의 아미노산들과 비교한 결과， 서로 다른 3개의 설팩틴 생합성 유전자와 82~85%의 상동성을 나타내었고， B. licheniforwis균주가 생산하는 리케니신 (lichenysin) 생합성 유전자와도 80%의 상 동성을 나타냈다.
또한， 본 발명의 구체적인 실시예에서, 펩타이드와 지방산을 연결하는 아실 화 (ay 1 at ion) 과정에 관여하는 유전자를 클로닝하기 위하여 고안한 20 여종의 프 라이머를 이용하여 PCR을 행하고 얻은 약 0.4 kb의 DNA 단편에 대한 염기배열을 결 정하고 (도 3 참조), 아미노산을 비교분석하기 위하여 NCBI 데이타 베이스를 탐색한 결과 이 유전자 산물은 다른 미생물에서 유래된 아실 전달체 단백질 환원 효소와 56 ~ 83%의 상동성을 나타냈다 (도 4 참조). 특히 다른 B. subtilis균주에서 유래 된 아실 전달체 단백질 환원효소와는 83%의 상동성을 나타내어 B. subtilis subsp. krictiensis 균주의 게놈 라이브러리 스크리닝 시에도 활용 가능할 것으로 사료되 었다.
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서 , B. subtilis subsp. krictiensis균 주의 게놈 라이브러리로부터 이튜린 생합성 유전자를 클로닝하기 위하여， subtilis subsp. krictiensis균주의 게놈 DNA를 SaU 제한효소를 이용하여， 부분 절단 (partial digestion)한 후， 20 ~ 30 kb 크기의 DNA 단편을 Cosmid 백터인 PLARF3에 삽입한 후, 이를 ^ «?7/ HB101에 형질전환시켜， 게놈 라이브러리를 제조 하였다. 상기 제조된 B. subtilis subsp. krictiensis균주^ 게놈 라이브러리와， 상기 실시예 <3ᅳ 1>에서 클로닝한 1.8 kb의 펩타이드 생합성 유전자를 프로브로 이용하여， 콜로니 혼성화 (colony hybridization)와 서던 흔성화 (Southern hybridization)를 수행하였다. 그 결과， 27 kb와 32 kb의 위치에서 상기 프로브 DNA와 상동성을 나타낸 2개의 클론들을 관찰할 수 있었으며， 이를 각각 pJJ815와 PJJ121로 명명하였다 (도 5 참조).
또한， 본 발명의 구체적인 실시예에서， Cosmid 클론들을 여러 종류의 제한 효소로 절단하여 서로 중복된 부분을 제외하고 제한효소 지도를 작성한 후 일부 단 편에 대한 염기배열을 조사한 결과 pJJ121의 일부 단편은 설팩틴 합성효소 I, 타이 로신 합성효소 II, 그라미시딘 (gramicidine) S 합성효소 I 및 펩타이드 합성효소 2와 57-90%의 상동성을 나타내었다. 상기 결과로부터 본 발명자들은 두 Cosmid 클 론 내에는 이튜린 생합성 과정 중 펩타이드 합성과 관련된 일부 유전자자 포함되어 있다고 추점하였다.
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 Cosmid 클론 내의 유전자들이 이튜린 생합성에 관여하는 유전자인지 설팩틴 합성에 관여하는 유전자인지의 여부 를 확인하기 위하여 이튜린을 생산하는 B. subtilis subsp. krictiensis균주와 B. subtil is 168 균주의 염색체 DNA를 이용하여， 50°C와 65°C에서 서던 흔성화를 수행 하였다. 이때 사용한 프로브 DNA는 Cosmid 클론인 pJJ121과 pJJ815 균주를 ^ oRI 으로 절단하여 얻은 6개의 단편들을 서브클로닝한 단편들을 프로브로 제조하 여 이용하였다. 그 결과， 65°C에서는 상기 프로브에 대하여 B.. subtilis subsp. krictiensis 균주는 6개의 ^cRI 단편 모두에 대하여 상동성을 나타냈으나， B. subtilis 168 균주에서는 6개의 cRI 단편 모두에 대해 상동성을 나타내지 않았다. 이러한 결과는 50°C에서 서던 흔성화를 수행하였을 때도 동일하였으며， 다만 B. subtilis 균주에서 pJJ121E3 단편이 미약한 반웅을 나타냈다. 따라서， Cosmid 클론 내의 유전자들이 설팩틴 생합성 유전자들과는 거의 유사성을 나타내지 않아 이튜린 생합성에 관여하는 유전자일 가능성이 클 것으로 추정되었다 (도 7 및 도 8 참조).
본 발명의 구체적인 실시예에서， 상기 두 개의 Cosmid 클론으로부터 클로닝 한 : cRI 단편들을 이용하여 양방향 염기배열을 결정하여 21,253 bp를 확보하였으 나， 일부 유전자가 누락되어 있는 것을 발견하고 누락된 부분의 염기배열을 추가로 확보하기 위하여 게놈 라이브러리 스크리닝을 통해 유전자를 확보하고 염기배열을 결정하여 총 37，682 bp의 염기배열을 확보하였으몌 염기배열 내에서 이튜린 생합 성에 관여할 것으로 추정되는 7개의 0RF가 발견되었다 (도 9 참조). Cosmid 클론의 이튜린 생합성에 관여할 것으로 추정되는 7종의 0RF 각각을 다른.환상형 리포펩타 이드 생합성 유전자와 비교한 결과 B. subtilis 유래의 설팩틴 유전자와는 76 ~ 86%의 유사성을 나타낸 반면 B. amyloliquefaciens유래의 설팩틴 유전자와는 92 ~ 100%의 유사성을 나타내었다. 특히 iturin 생합성에 직접적으로 관여할 것으로 추정되는 0RF 2-1(543 bp)과 2-2(9, 927bp) 및 0RF3(10,757 bp)는 B. amyloliquefaciens 균주 유래 설팩틴 유전자와 각각 92 ~ 98 >의 유사성을 나타내 었다 (표 1 참조). 표 1에 열거한 균주 중 CP000560.1 번호로 시작되는 B. amyloliquefaciens FZB42 균주와는 0RF 2-1의 유사성이 94%를 나타낸 반면 전체 염기서열 (37,682 bp)을 비교해보면 98%의 유사성을 나타내었다. 그러나 이 균주는 환상형 펩타이드인 설팩틴, 펜지신 (fengycin) 및 바실로마이신 D(baci 1 lomycin D) 를 생산하고 (Chen, et al .， Nature Biotechnol. , 25： 100그 1014·, 2007), 이튜린은 생산하지 않는 것으로 보고되었으므로， 본 발명자들은 상기 코스미드 클론의 0RF 2-1 과 2-2 및 0FR3을 신규한 이튜린 생합성 유전자일 것으로 추정하였다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 이튜린과 설팩틴의 항균 능력을 벼의 도열 병 원인균인 마그나포르테 그리시아 _^/ '5ί )와 무좀균인 트리코피톤 맨타그로파이트
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mentagrophytes) 및 가지과 식물의 시들음병 원인균 인 푸사리움 옥시스포럼 0 s<? /OT oxysporum) 3 종류의 피검균에 대하여 측정하였 다. 그 결과， 도 10에 나타난 바와 같이， 표준화합물인 이튜린 A와 설팩틴은 마그 나포르테 그리시아와 트리코피톤 맨타그로파이트에 대하여 항균력을 나타낸 반면， 푸사리움 옥시스포럼 균에 대해 이류린은 항균 활성을 나타냈으나, 설팩틴은 항균 활성을 나타내지 않았다 (도 10).
또한， 본 발명의 구체적인 실시예에서, 이튜린 또는 설팩틴을 생산하는 바 실러스 균주의 배양 상등액을 이용하여 항균능력을 측정한 결과, 이튜린을 생산하 는 B. subtil is subsp. krictiensis균주는 표준 화합물을 이용한 항균력 측정결과 와 동일하게, 마그나포르테 그리시아， 트리코피톤 멘타그로파이트 및 푸사리움 옥 시스포럼에 대하여 항균활성을 나타냈으나, 항생물질을 생산하지 않는 B. subtil is JH642 균주와 B. subtilis 168 균주에서는 상기 피검균주에 대하여 항균활성이 나 타나지 않았으며， 설팩틴과 이튜린을 모두 생산하는 균주로 추정되는 B. subtilis C9 균주에서는 이튜린의 항균 효과가 나타나는 푸사리움 옥시스포럼에 대하여 항균 효과를 나타냈다. 이러한 결과를 토대로 본 발명자들을 이튜린 돌연변이주 선발 시 피검균으로 푸사리움 옥시스포럼을 이용하기로 결정하였다 (도 11 참조).
또한， 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 Cosmid 클론의 단편 을 B. subtilis subsp. krictiensis 균주에 형질전환시킨 후 (도 12 참조)， 푸사리 움 옥시스포럼에 대한 항균력을 관찰하였다. 그 결과， pBT6(0RF 2-2와 0RF 3를 포 함) 단편이 형질전환된 B. subtilis subsp. krictiensis균주에서 푸사리움 옥시스 포럼에 대한 항균력이 가장 크게 나타났다 (도 13 참조).
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서 이튜린 생합성에 관련되는 Cosmid 클 론의 단편 중 pBT6가 이튜린 합성에 관여하는 부위임을 확인하기 위하여， pBT6 단 편이 포함되어 있는 pJJ121E2 단편을 pTZ18 백터에 클로닝하고， 스펙티노마이신 (spectinomycin) 저항성 유전자를 갖고 있는 pl21E3 백터를 fe¾HI과 bsl으로 절단 하고 PCR을 이용하여 Cla 부위를 부착한 후 CVal으로 절단하였다. 다시 C/sI으로 절단한 스펙티노마이신 유전자를 함유한 단편을 pJJ121E2 단편이 삽입된 pTZ18 벡 터의 부위에 삽입시키고， Sail 부위는 제거시켜 pJJ121E2ᅳ 1 백터를 제조한 후， B. subti lis subsp . krictiensis 균주에 형질전환시켜 ( . subtilis subsp. krictiensis 돌연변이 , 이튜린 생합성 능력이 소실되었는지의 여부를 확인하고 자 하였다 (도 14 참조). 그 결과, 푸사리움 옥시스포럼 균에 대하여 B. subtilis subsp. krictiensis 균주는 강력한 항균력을 나타낸 반면, B. subtilis subs . krictiensis 돌연변이 -10은 항균력이 현저하게 감소한 것을 확인할 수 있었다 (도 15 참조). 또한， 도 16에 나타난 바와 같이， 서던 흔성화를 통하여 B. subtilis subsp. krictiensis돌연변이ᅳ 10 균주의 염색체 내에， 스꿰티노마이신 저항성 유전 자가 삽입된 것을 확인할 수 있었다 (도 16 참조).
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서 B. subtilis subsp. krictiensis 균 주와 B. subtilis subsp. krictiensis돌연변이 -10 균주의 대사산물을 HPLC 분석방 법을 이용하여 분석한 결과， B. subtilis subsp. krictiensis 균주와 상업적으로 판매되고 있는 표준 화합물인 이튜린 A에서는 관찰되는 피크가 동일한 반면 B. subtilis subsp. krictiensis 돌연변이 -10 균주에서는 이튜린 A 피크가 관찰되지 않았으며 (도 17), 또한 이를 LC-Mass를 이용하여 분자량을 확인한 결과， B. subtilis subs . krictiensis 균주에서는 관찰되었으나 B. subtilis subsp. krictiensis 돌연변이-: L0 돌연변이 균주에서는 관찰되지 않는 피크들이 이튜린 A 내지 F와 정확하게 일치되는 것을 확인할 수 있었다 (도 18 내지 20 참조).
즉， 본 발명자들은 B. subtil is subsp. krictiensis 균주로부터 유래한 이 튜린 생합성 유전자를 클로닝하고， 상기 클로닝한 유전자의 서열을 분석하여 종래 의 알려진 환상형 리포펩타이드 생합성 유전자들과 서열이 상이한 신규한 이튜린 생합성 유전자임을 확인하였다. ' 또한, 본 발명은 서열번호 6과 서열번호 5로 기재되는 염기서열을 갖는 이 튜린 생합성 유전자， 또는 상기 이류린 생합성 유전자에 의해서 암호화되는 이튜린 단백질을 제공한다.
또한， 본 발명은 서열번호 6과 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 이튜린 생합성 유전자， 또는 상기 이류린 생합성 유전자에 의해서 암호화되는 이류 린 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 6과 서열번호 7로 기재되는 염기서열을 갖는 이 튜린 생합성 유전자， 또는 상기 이튜린 생합성 유전자에 의해서 암호화되는 이튜린 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 6과 서열번호 8로 기재되는 염기서열을 갖는 이 류린 생합성 유전자， 또는 상기 이튜린 생합성 유전자에 의해서 암호화되는 이튜린 단백질을 제공한다.
상기 이튜린 생합성' 유전자에 있어서， 서열번호 6으로 기재되는 염기서열은 이튜린 생합성 유전자의 0RF 3을 포함하는 것이 바람직하며， 서열번호 3으로 기재 되는 염기서열은 0RF 2를 포함하는 것이 바람직하며, 서열번호 5로 기재되는 염기 서열은 0RF 2의 일부인 0RF 2-2 부분을 포함하는 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다. 또한， 상기 서열번호 6으로 기재되는 이튜린 생합성 유전자에 의해서 암 호화되는 단백질은 서열번호 14로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하며 , 서열번호 3으로 기재되는 이튜린 생합성 유전자에 의해서 암호화되는 단백질은 서 열번호 11로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하며， '서열번호 5로 기재 되는 이튜린 생합성 유.전자에 의해서 암호화되는 단백질은 서열번호 13으로 기재되 ^ 는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. '
또한， 상기 이류린 생합성 유전자에 있어서， 서열번호 7로 기재된 염기서열 은 이튜린 생합성 유전자의 0RF 4 부분을 포함하는 것이 바람직하며, 서열번호 8로 기재되는 염기서열은 이튜린 생합성 유전자의 0RF 5 부분을 포함하는 것이 바람직 하나， 이에 한정되지 않는다. 또한， 상기 서열번호 7로 기재되는 이튜린 생합성 유전자에 의해서 암호화되는 단백질은 서열번호 15로 기재되는 아미노산서열을 갖 는 것이 바람직하며， 서열번호 8로 기재되는 염기서열에 의해서 암호화되는 단백질 은 서열번호 16으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되 지 않는다.
상기， 서열번호 3으로 기재되는 염기서열은 이튜린 생합성 유전자의 0RF 2 전체의 염기서열인 것을 특징으로 하며， 본 발명자들은 이튜린 생합성 유전자를 암 호화하는 특정 부위를 확인하고자, 0RF 2 부위를 나누어， ORF 2-1(서열번호 4)와 0RF 2— 2(서열번호 5)로 나누어 실시예에 이용하였다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 이튜린 생합성 유전자를 다른 환상형 리포 펩타이드 생합성 유전자의 아미노산과 비교한 결과, 이튜린 전체 유전자의 크기에 대하여 유의한 차이를 나타냈다. 이에， 본 발명자들은 이튜린 생합성 유전자를.구 성하는 0RF를 포함하는 단편을 제조하여， 이튜린 생합성 단백질에 관여하는 부위를 규명하고자 실험한 결과, 0RF 2-2의 단편과 0RF 3의 염기서열을 포함한 백터를 이 용하였을 때, 이튜린 단백질의 항균력이 상승됨을 확인함으로써， 이튜린 생합성에 관여하는 유전자를 규명하였다. 또한， 본 발명은 서열번호 6， 서열번호 3 및 서열번호 7로 기재되는 염기서 열을 갖는 이튜린 생합성 유전자, 또는 상기 이튜린 생합성 유전자에 의해서 암호 화되는 이튜린 단백질을 제공한다.
또한， 본 발명은 서열번호 6, 서열번호 3 및 서열번호 8로 기재되는 염기서 열을 갖는 이튜린 생합성 유전자를 제공한다.
또한， 본 발명은 서열번호 6， 서열번호 7 및 서열번호 8로 기재되는 염기서 J4 열을 갖는 이튜린 생합성 유전자， 또는 상기 이튜린 생합성 유전자에 의해서 암호 화되는 이류린 단백질을 제공한다.
상기 이튜린 생합성 유전자의 서열번호 6으로 기재되는 염기서열은 이튜린 생합성 유전자의 0RF 3 부위의 염기서열을 포함하는 것이 바람직하며, 서열번호 3 으로 기재되는 염기서열은 이튜린 생합성 유전자의 0RF 2 부위의 염기서열을 포함 하는 것이 바람직하며， 서열번호 7로 기재되는 염기서열은 이튜린 생합성 유전자의 0RF 4로 기재되는 염기서열을 포함하는 것이 바람직하며， 서열번호 8로 기재되는 염기서열은 이튜린 생합성 유전자의 0RF 5 부위의 염기서열을 포함하는 것이 바람 직하나， 이에 한정되지 않으며， 이튜린 단백질을 생성할 수 있는 이튜린 생합성 내 의 유전자 염기서열이라면 모두 포함될 수 있다. '
상기 이튜린 생합성 유전자에 의해서 암호화되는 단백질에 있어서， 서열번 호 6으로 기재되는 이튜린 생합성 유전자에 의해서 암호화되는 단백질은 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하며， 서열번호 3으로 기재되는 이튜린 생 합성 유전자에 의해서 암호화되는 단백질은 서열번호 11로 기재되는 아미노산 서열 을 갖는 것이 바람직하며， 서열번호 7로 기재되는 이튜린 생합성 유전자에 의해서 암호화되는 단백질은 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하며， 서열 번호 8로 기재되는 이튜린 생합성 유전자에 의해서 암호화되는 단백질은 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며， 이튜린 단백 질을 생성할 수 있는 이류린 생합성 내의 유전자 염기서열이라면 모두 포함될 수 있다. 또한, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 이튜린 생합성 유 전자， 또는 상기 이튜린 생합성 유전자에 의해서 암호화되는 이튜린 단백질을 제공 한다.
상기 이튜린 생합성 유전자에 있어서， 서열번호 1로 기재되는 염기서열은 도 9에 나타난， 이튜린 생합성 유전자에 포함되어 있는 7개의 ORF 1 내지 6의 염기 서열을 포함하고 있는 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시예에서， 상기 염기서열은 종래의 이튜린 생합성에 관여하는 유전자와 비교하였을 때， 유의한 차이를 나타냄으로써， 신규한 이튜린 생 합성 유전자임을 본 발명자에 의해서 밝혀졌으며， 이튜린 생합성 유전자를 구성하 고 있는 0RF 중， 0RF 2의 일부 (0RF 2-2)와 0RF3을 포함하는 단편을 포함한 형질전 환체의 항균력이 가장 많이 증가하였으며， 이 외의 다른 0RF를 포함하고 있는 단편 을 포함한 형질전환체의 항균력을 확인할 수 있었다.
따라서， 본 발명자들은 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 신규한 이 튜린 생합성 유전자를 규명하였다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 이튜린 생합성 유전자의 염기서열을 포함 하는 백터를 제공한다.
상기 백터에 포함되는 이튜린 생합성 유전자의 염기서열은 서열번호 1로 기 재되는 염기서열을 갖는 이튜린 생합성 유전자를 포함하는 것이 바람직하며， 더욱 바람직하게는 서열번호 6， 3, 및 7의 염기서열을 포함하는 유전자， 서열번호 6， 3， 및 8의 염기서열을 포함하는 유전자'， 또는 서열번호 6, 7， 및 S의 서열을 포함하는 유전자이며， 더욱 바람직하게는 서열번호 6과 5로 기재되는 염기서열을 갖는 유전 자, 서열번호 6과 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 유전자， 서열번호 6과 7로 기재 되는 염기서열을 갖는 유전자， 또는 서열번호 6과 서열번호 8로 기재되는 염기서열 을 갖는 유전자를 포함하는 것이 바람직하며， 가장 바람직하게는 서열번호 6으로 기재된 유전자， 또는 상기 유전자에 대해 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 이튜린 생합성 유전자를 포함하는 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 이튜린 생합성 유전자의 염기서열을 포함 하는 백터가 도입된 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명에 따른 형질전환체에 의해서 생성된 이튜린 단백질을 제공한 다.
상기 형질전환체는 바실러스 섭틸러스 균주 (fec///i/s subtillus), 사카로마 이세스 세레비지애 (5<gcC¾a o/»yces cerevisiae) , 및 바실러스 아미로리퀴훼시엔스 {Bacillus amylol iquefaciens) 균주 등을 이용할 수 있으며， 이에 한정되지 않는다. 또한， 상기 균주에 재조합 백터를 도입하는 방법은 열 충격법, 전기충격법 등을 이 용하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 Spizizen 방법을 이용하는 것이 더욱 바람직하나 , 이에 한정되지 않으며 공지된 기술을 이용하여 도입할 수 있다 .
본 발명에 따른 이튜린 생합성 유전자가 코딩하는 이튜린 단백질에 있어서, 이튜린 단백질은 상기 유전자를 포함하고 있는 백터 또는 형질전환체에 의해서 코 딩되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명에 따른 염기서열을 포함하고 있는 백터가도입된 균주의 항균력이 증가한 것을 확인할 수 있었으므로， 형질전환된 균 주의 배양액을 생물학적 방제제로 활용할 수 있으며， 또한 이러한 형질전환주 자체 를 생물학적 방제제로 유용하게 사용할 수 있을 것이다. 상기 형질전환주 자체를 이용함으로써， 이류린 단백질의 획득에 필요한 공정， 운반 및 보관을 감소시킬 수 있을 것이다. 또한 본 발명은 본 발명에 따른 이튜린 단백질을 생산하는 형질전환체 또 는 이의 배양액을 포함하는 생물학적 방제제를 제공한다.
아울러， 본 발명은 생물학적 방제제로 사용하기 위한， 본 발명의 형질전환 체 또는 이의 배양액， 또는 본 발명의 형질전환체의 의해서 생성된 이튜린 단백질 을 제공한다.
본 발명에 따른 이류린 단백질， 이튜린 단백질을 생산하는 형질전환체 및 이의 배양액은 도열병 ^^^Uagnaporthe grisea) , 시들음병 병원균 (/ sar/uw oxysporum) , 잿빛 곰팡이병균 ( b ryi/s cinerea) , 보리 흰가루병균 ( >rs/p;e graminis f . sp. horde!) , 토마토 잎곰광이병균 fulva) , 고추 탄저병균 {Col letotri chum gloeospor ioides) , 인삼 뿌리썩음병균
Figure imgf000018_0001
destructans) , 인삼 모잘록병균 (7 /_ >cic«/a solani) , 사들음병균 (/ sar/ oxysporum) , 파 검은무늬병균 C4/ier73ar/a p r/)， 사과 점무늬낙엽병균 G4/ie 2ar/s γη main, 인삼 점무늬병균 C4/ e 7ar/a panax) , 인삼 잘록병균 sp.) 또는 살 모넬라 타이피무리움 typhi murium)^ 대하여 방제효과가 있는 것이 바 람직하며 , 도열병 ^ ^균 Magnaporthe grisea) , 및 시들음병 ^ ^균 Fusari n oxysporum)^] 대하여 방제효과를 나타내는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. .
본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명자들은 Cosmid 클론의 단편을 B. subtilis subsp. krictiensis 균주에 형질전환시킨 후, 푸사리움 옥시스포럼에 대 한 항균능력을 관찰하였다. 그 결과， PBT6 단편이 형질전환된 B. subtilis subsp. krictiensis 균주에서는 푸사리움 옥시스포럼에 대한 항균력이 형질전환되지 않은 대조군 B. subtilis subsp. krictiensis균주에 비하여 크게 증진되는 것을 관찰할 수 있었다.
따라서， 본 발명에서 규명한 신규한 이류린 생합성 유전자가 암호화하는 이 튜린 단백질， 이를 생산하는 형질전환체 및 이의 배양액을 생물학적 방제제로써 유 용하게 사용할 수 있다.
【유리한 효과】
상술한 바와 같이， 본 발명에서 기술한 6종류의 이튜린 (iturin)을 생산하는 B. ^///5균주로부터 이튜린을 생합성하는 유전자의 클로닝과 염기서열 결정 및 항균력 검정을 통해 이튜린을 생합성하는 유전자라는 것을 확인하였다. 또한 돌연변이주와 기기분석을 통해 대사산물이 이튜린이라는 것을 재확인하였으며， 기존에 보고된 유전자와는 다른 새로운 유전자라는 것을 확인하였다. 이러한 사실올 토대로 이튜린 생합성 유전자를 이용하여 항균활성이 증진된 균주의 개량을 통해 생물학적 방제제로 활용 가능할 것으로 사료되며, 다른 한편으로는 이 유전자를 다른 생물학적 방제 활성을 나타내는 세균에 형질전환시켜 새로운 균주 개발에 웅용 가능할 것으로 사료된다.
【도면의 간단한 설명】 도 1은 B. subtilis subsp. krictiensis ATCC 55079와 B. subtilis 168 균 주로부터 얻은 PCR산물을 확인한 전기영동 사진이다:
1번 레인: lkb 래더;
2번 레인: B. subtilis 168 균주에서 SrfB 7과 SrfB 8 프라이머를 이용하여 획득한 PCR산물 (설팩틴 유전자의 산물);
3번 레인: B. subtilis subsp. krictiensis균주에서 SrfB 7과 SrfB 8 프라 이머를 이용하여 획득한 PCR산물 (이튜린 유전자 산물로 추정됨);
4번 레인: B. subtilis 168 균주에서 SrfB 9과 SrfB 10 프라이머를 이용하 여 획득한 PCR산물 (설팩틴 유전자 산물); 및
5번 레인: B. subtilis subsp. krictiensis 균주에서 SrfB 9과 SrfB 10 프 라이머를 이용하여 획득한 PCR산물' (이튜린 유전자 산물로 추정됨);
도 2는 B. subtilis subsp. krictiensis균주에서 SrfB 9과 SrfB 10 프라이 머를 이용하여 획득한 아미노산 서열과 설팩틴 및 리케니신 (lichenysin) 생합성 유 전자의 아미노산 서열을 CLUSTAL W를 이용하여 비교분석한 그림이다:
1번: B. subtilis subsp. krictiensis 균주에서 SrfB 9과 SrfB 10 프라이 머를 이용하여 획득한 PCR산물의 아미노산 서열 (이튜린 유전자의 아미노산서열로 추정됨);
2번 ~ 4번: 설팩틴 생합성 유전자의 3개의 다른 도메인의 아미노산 서열; 5번： 리케니신 (lichenysin) 생합성 유전자의 아미노산 서열.
도 3은 B. subtilis subs . krictiensis균주에서 SrfA 5과 SrfA 6 프라이 머를 이용하여 획득한 0.4 kb의 PCR 산물에 대한 유전자 염.기서열 및 펩타이드 서 열을 나타낸 그림이다.
도 4는 B. subtilis subs . krictiensis균주에서 SrfA .5과 SrfA 6 프라이 머를 이용하여 획득한 0.4 kb의 PCR 산물에 대한 아미노산 서열과 다른 균주들의 아미노산 서열을 CLUSTAL W를 이용하여 비교분석한 그림이다:
1번: Cuphea lanceolata 식물체의 아실 운반 단백질 (acyl carrier protein) 환원 효소의 아미노산 서열;
2번 : Bacillus subtilis균주의 아실 운반 단백질 환원 효소의 아미노산 서 cri · ᄆ J
3번 : Salmonella typhir irium균주^ 아실 운반 단백질 환원 효소의 아미노 산 서열;
4번: Deinococctis radiodurans 균주의 아실 운반 단백질 환원 효소의 아미 노산 서열; 및
5번: B. subtilis subs . krictiensis 균주에서 SrfA 5과 SrfA 6 프라이머 를 이용하여 획득한 PCR산물의 아미노산 서열.
도 5는 B. subtilis subsp. krictiensis 균주의 게놈 라이브러리 스크리닝 결과를 나타낸 그림이다:
도 5의 A는 콜로니 흔성화 (colony hybridization)결과를 나타낸 그림이다; 도 5의 B는 콜로니 흔성화를 통해서 얻은 코스미드 클론의 DNA를 으로 절단한 아가로스 (agarose) 전기영동을 행한 결과이다; 및
도 5의 C는 서던 흔성화 결과를 나타낸 그림으로 2개의 클론에서 동위원소 로 표지한 프로브 DNA와 상동성을 나타낸 결과이다.
도 6은 게놈 라이브러리 스크리닝을 통해 얻은 Cosmid 클론의 제한효소 지 도이다.
도 7은 A 내지 F는 B. subtilis subs . kriciiensis^\ B. subtilis 168 균 주에서 게놈 라이브러리 스크리닝을 통해 얻은 pJJ815와 pJJ121 클론을 Ec( 효소 를 이용하여 절단시킨 단편을 65°C에서 흔성화 (hybridization) 반응을 수행 결과를 나타낸 그림이다:
1번 레인: /¾ ΙΙ로 절단한 람다 (lambda) DNA;
2번 레인: B. subtilis subs . krictiensis균주의 게놈 DNA;
3번 레인: B. subtilis 168 균주의 게놈 DNA; 및
4번 레인: 프로브 DNA.
도 8은 A 내지 F는 B. subtilis subsp. krictiensis쫘 B. subtilis 168 균 주에서 게놈 라이브러리 스크리닝을 통해 얻은 pjJ815와 pJJ121 클론을 Ec( 효소 를 이용하여 절단시킨 단편을 50°C에서 흔성화 (hybridization) 반응을 수행 결과를 나타낸 그림이다:
1번 레인: UindUl로 절단한 람다 (lambda) DNA;
2번 레인: B. subtilis subsp. krictiensis균주의 게놈 DNA;
3번 레인: B. subtilis 168 균주의 게놈 DNA; 및
4번 레인: 프로브 DNA.
도 9는 게놈 라이브러리 스크리닝을 통해 B. subtilis subsp. krictiensis 균주로부터 얻은 이튜린 생합성 유전자의 구성도를 나타낸 것이다:
0RF1: 전사조절자;
0RF2-1： Itu A— 1；
0RF2-2: Itu A-2；
0 F3: Itu B;
0RF4: Itu C;.
0 F5: Itu D; 및
0FR6: 아스파레이트 트랜스아미네이즈 -유사 단백질 (Asparate tranaminase- 1 ike protein) .
도 10은 표준 화합물인 이튜린과 설맥틴의 항균력을 비교한 그림이다.
도 11은 B. subtilis subs . krictiensis, B. subtilis 168, B. subtilis JH642, 및 B. subtilis C9 균주를 이용하여 3종류의 피검균에 대한 항균력을 비교 한 그림이다:
Wild type-' 이튜린을 생산하는 B, subtilis subs . krictiensis균주;
B. subtilis- 168： 설팩틴 유전자를 가지고 있으나， 설꿰틴을 생성하지 않는 섭틸리스 균주;
B. subtilis JH642: 이튜린과 설팩틴 모두를 생산하지 않는 섭틸리스 균주; ᄆ j
B. subtilis C9: 설팩틴과 이튜린을 모두 생산한다고 추정되는 섭틸리스 균 도 12는 Cosmid 클론의 ^cRI 단편과 이 단편을 함유한 백터의 제작을 나타 낸 것이다.
도 13은 Cosmid 클론으로부터 유래된 여러 £ 0RI 단편을 함유한 β. subtil is subs . krictiensis 형질전환주들의 항균력을 비교한 그림이다:
1: pBTl 단편; Cosmid pJJ121의 과 coRI으로 절단한 단편
2： pBT3 단편; Cosmid pJJ815의 ^ oRI 단편
3： pBT6 단편; Cosmid pJJ121의 단편 및
4: 형질전환하지 않은 B. subtil is subsp. krictiensis균주.
도 14는 Iturin 생합성능이 소실된 돌연변이주를 제조하기 위한 백터의 제 작을 나타낸 도식이다.
도 15는 이튜린을 생산하는 B. subtil is subsp. krictiensis균주와 이튜린 생산능이 소실된 돌연변이주의 Fusarium oxysporunf^ 대한 항균력을 비교한 그림이 다.
도 16은 돌연변이주 내에 삽입된 스펙티노마이신 (spectinomycin)이 염색체 상에 삽입되었는지의 여부를 조사한 서던 흔성화 (Southern hybridization) 결과를 나타낸 것이다:
1번 레인: lkb 래더;
2번 레인: B. subtil is subsp. krictiensis균주의 게놈 DNA를 7al으로 절 단시킨 단편 ;
3번 레인: B. subtil is subsp . krictiensis돌연변이 -10 균주의 게놈 DNA를 C/al으로 절단시킨 단편 ; 및
4번 레인: a¾HI과 으로 절단한 pl21E3 백터 .
도 17은 B. subtilis subs . krictiensis쫘 이튜린이 소실된 돌연변이주로 부터 생산된 이튜린 생성 여부를 HPLC를 이용하여 조사한 크로마토그램이다.
도 18은 B. subtJ J is' subsp. krictiensis 균주가 생산하는 6종의 이튜린을 HPLC로 분석한 크로마토그램이다: A: Itur in A;
B: Itur in B;
C: Itur in C;
D: Itur in D;
E: Itur in E;
F: Itur in F.
도 19는 B. subtilis subsp. krict iensis7\ 생산하는 6 종류의 이튜린 중 이튜린 A 내지 C를 생산하는 지의 여부를 LC-Mass를 이용하여 분석한 결과이다. 도 20은 B. subtilis subsp. krictiensis 생산하는 6 종류의 이류린 중 이튜린 D 내지 F를 생산하는 지의 여부를 LC-Mass를 이용하여 분석한 결과이다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단， 하기 실시예.， 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
【실시예 1]
바실러스 균주의 배양
B. subtilis subs . krict /ens is ATCC 55079 균주는 본 발명자에 의해 분리 된 균주로서.， 미국특허에 기재되어 있다. 또한， 미국의 균주기탁기관인 ATCC에 기 탁되어 있으며， 본 발명의 실시예에 사용한 B. subtilis 168， B. subtilis JH642 및 B. subtilis 균주는 한국생명공학연구원 바이오화학연구센터로부터 분양받아 사용하였다.
Bacillus subtilis 균주와 E. coli 균주의 배양은 LB (박토—트립톤 (Bacto- tryptone) 10 g, 박토 -효모추출물 (Bacto—yeast extract) 5 g, 염화나트륨 (sodium chloride) 10 g/ £ ) 배지를 사용하였다. Bacillus subtilis균주들의 활성물질 생 산 배지로는 복합배지 (슈크로스 (sucrose) 30 g, 소이톤 (soytone) 10 g, 효모추출물 (yeast extract) 5 g, K2HP04 0.5 g, MgS04 2 g, MnCl2 4 nig, CaCl2 5 mg, FeS04 - 7H20 25 rag, pH )를 사용하였다.
ϋ
_ 형질전환시에는 Spizzizen(50% 글루코오스 (glucose) 10 ml, 2% 카제인 가수 분해물 (casein hydrolysate) 10 lii^ , 10% 효모추출물 (yeast extract) 10 ιη£ , 1M MgCl2 2.25 KH2P04 6 g, K2HPO4 14 g, (NH4)2S04 2 g, 구연산염 (Na citrate) 1 g MgS0 0.2 g/i ) 배지를 사용하였다.
【실시예 2】
서브틸리스 이종 크릭티엔시스 09. subtilis subsp. krictiensis) 균주의 게 놈 라이브러리 작성
<2-1> B. subtilis subsp. krictiensis균주의 염색체 DNA추출
본 발명자들은 이튜린 (iturin)과 설팩틴 (surfactin)은 환상형 리포펩타이드 (cyclic lipopeptide) 계열의 항생물질로 분자량이 유사하며， 아미노산의 조성과 연결된 순서만이 서로 상이하고, 설팩틴 유전자의 크기가 32 kb나 될 정도로 매우 크기 때문에, 이튜린 유전자의 크기도 설팩린과 유사할 것으로 생각하고， 두 항생물질은 어느 단계까지는 동일한 생합성 경로로 합성되다가 일정한 단계부터 서로 다른 생합성 '경로로 합성될 것으로 추정하였다.
Siirfactiii
L-JLeu J Leu■■ :L^k% L ¾
IfuriiiA ^ 특히 설팩틴과 이튜린 두 항생물질이 생합성되는 과정 중 펩타이드가 고리화 (cyclization)되는 과정과 펩타이드와 지방산이 연결되는 아실화 (acylat ion) 과정을 함께 이용할 것으로 가정하고， 설팩틴을 생성한다고 알려진 바실러스 섭틸리스 168( . subtil is 168) 균주의 염기서열로부터 여러 종류의 프라이머를 고안하고 PCR을 행하였다. B. subtil is subsp . krictiensis 균주와 B. subtil is 168 균주의 염색체 DNA을 주형으로 하여 PCR을 행하여 두 균주 모두에서 공통적으로 생산되는 1.8 kb의 PCR 산물을 얻고， 염기서열을 결정하여 이 유전자 산물이 펩타이드 생합성 효소 (peptide synthetase)와 관련이 있는지의 여부를 확인한 후, 집락 흔성화 (colony hybridization) 및 서던 흔성화 방법을 이용하여 이튜린 생합성 유전자를 클로닝하고자 하였다.
우선， 상기 B. subtil is subsp. krictiensis 균주와 B. subtilis 168 균주 로부터 DNA를 추출하기 위하예 상기 두 균주의 단일 집락을 각각 250 의 LB 배 지에 접종하여 30°C , 250 rpm으로 대수기 후반 (A600=1.0-2.0)까지 배양하여 원심분 리 (8,000xg, 10 min, RT)하였다. 그 후, 100 ^의 용해 (lysis) 완층액 [100 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 10% SDS, pH 8.0]으로 세척하고, 다시 40 ^의 용해 완충액 으로 현탁시킨 다음, 100 mg의 라이소자임 (lysozyme)을 첨가하여 30°C에서 10분간 정치배양 (stationary culture)하였다. 배양 후 20% SDS 3 m£를 첨가하여 5분간 배 양하고 TE-sa irated 페놀 40 ^을 첨가하여 잘 흔합한 후 원심분리 (10,000 x g, 10 분， 4°C)하여 DNA층을 분리하였다. 페놀 /클론로포름으로 다시 추출하여 DNA층 을 분리한 뒤, 0.1 부피의 3 M 아세트산나트륨 (sodium acetate)(pH 5, 2)와 2,5 부 피의 넁각된 에탄을 (ethanol)을 첨가하여 DNA를 침전시키고 70% 에탄을로 세척하여 풍건한 후， 획득한 DNA 펠렛을 TE 완층액에 용해하였다.
<2-2>부분 절단 (Partial digestion)
부분 절단 (Partial digestion) 조건을 결정하기 위하여 분리한 DNA 10 /g과 완층액을 혼합하여 150 ≠ — 조절한 후 9개의 에펜도르프 튜브 (effendorf tube)에 각각 15 ^씩 분배하고, 1번 튜브에는 30 βΐ를 분배한 다음 얼음 속에 방치하였다. 4 unit의 제한효소를 1번 튜브에 넣어 잘 흔합한 후 15 ^를 2번 튜브로 옮겨서 잘 흔합하고 다시 15 '를 각 튜브로 연속적으로 옮겨 8번 tube까지 잘 흔합하고 9번 tube는 무처리로 사용하였다. 1 ~ 8번 튜브를 30'C에서 1시간 동안 배양한 후 최 종농도 20 mM의 EDTA를 첨가하여 반응을 정지시켰으며 , 각 튜브에 3 ^의 젤 로딩 다이 (gel-loading dye)를 넣고 0.5%의 아가로우스 젤에 전기영동시켜 20 ~ 30 kb 크기의 DNA를 확보할 수 있는 Sa i 양을 결정하였으며 , 백터로 사용한 Cosmid는 PLAFR3 백터를 ^rfil으로 절단한 후 포스파타아제 (phosphatase)로 처리하였다.
<2-3> E. colH B. subtil is subsp. krictiensis 균주의 게놈 라이브러리 작성
B. subtilis subsp. krictiensis 균주의 게놈 라이브러리로부터 이류린 생 합성 유전자를 클로닝하기 위하여， 상기 실시예 <2-1>에서 추출한 B. subtilis subs . krictiensis균주의 염색체 DNA를 Sau3A — 부분 절단 (partial digest ion)시 킨 후， 20 ~ 30kb 크기의 DNA 단편을 Cosmid pLAFR3 백터 (서울대학교 농업생명과학 대학 웅용생물화학부로부터 입수)에 삽입시켰다. 상기 단편이 삽입된 Cosmid PLAFR3 백터를 E. co// HB101에 형질전환시켜 , 게놈 라이브러리를 작성하였다.
【실시예 3】
B. subtilis subsp. krictiensis 균주로부터 이튜린 생합성 유전자 스크리 닝
<3-1> DNA프로브 제조
본 발명자들은 이튜린과 설팩틴의 유전자 분자량이 유사하고， 7개의 펩타이 드가 환상형 고리를 이루고 있으며， 설팩틴 유전자의 크기가 32 kb나 된다고 보고 되어져 있어 이류린 생합성 유전자의 크기도 설팩틴과 대등할 정도의 크기일 것으 로 생각하였다. 또한 Bacillus subtilis 균주 중에는 이튜린과 설팩틴을 동시에 생산하는 균주도 보고되고 있어 이러한 이류린과 설팩틴의 유전자 크기를 고려해볼 때 펩타이드 고리화(0 (：112 }01 과정과 지방산이 연결되는 아실화 과정 (acylation)은 동일한 생합성 과정을 이용할 것으로 가정하였다. 이러한 가정을 기초로 설팩틴 유전자에 대한赚 염기서열 정보를 바탕으로 프라이머를 제작하고, 설팩틴 유전자를 가지고 있는 B. subtilis 168 균주와 이튜린을 생산하는 B. subtilis subsp. krictiensis 균주로부터 상기 실시예 <2-1>에서 획득한 게놈 DNA 를 주형으로 하고， 설팩틴 유전자에 대한 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR조건은 94°C에서 30 초， 50°C에서 30초， 72°C에서 60초 반웅을 30회 반복한 후 72°C에서 5분간 반웅하였으며 , 사용한 프라이머는 하기와 같다: .
SrfAl (서열번호 18)： 5' -CGG GAA AGC GCT GGG GAA TAA CCG C-3'；
SrfA2(서열번호 19)： 5' -CCT TCA AAG CTT TGA ACA GGT GGT C-3 '；
SrfA3(서열번호 20)： 5' -CTC GCT TGG CGG AGA TTC CAT CM AG-3'
SrfA4(서열번호 21)： 5' -GTT CTG TCT CTT CAG CAG TCA GCG AG-3'
SrfA5(서열번호 22): 5' -GCG ATT GAT TAT GCG CTT GTT GAG-3 '；
SrfA6(서열번호 23)： 5' -TCG GCA CAT ACG CTG ATT GAA CTG C-3 '；
SrfA7(서열번호 24)： 5 -GGG TAA AGG ATC GCC TCA ATC GTT— 3'；
SrfA8(서열번호 25)： 5' -CGA AAT AGG CTA TCT CGC ACT CAG-31;
SrfA9(서열번호 26)： 5' -TTC AGA ATA GGG CTT ATC AAG CA-3'；
SrfAlO (서열번호 27) ： 5' -GCT GTG TTG CCG CCT TTA TCT TTG A-3 '
SrfBl (서열번호 28)： 5' -ATG TCT CAG ATG CAT GGA GC-3 '；
SrfB2(서열번호 29)： 5' -CTG GCA ACT AAT AGG CTG AC-3 '；
SrfB3(서열번호 30)： 5' -ATT GAA GCT TGT GCC GCC TG-3 ' .;
SrfB4(서열번호 31)： 5' -TCC ΊΤΤ AAA GCT TTG CAC AG-3*；
SrfB5(서열번호 32)： 5' -GAA ACA GCA GCG ATT ATG AAC GAC-3'；
SrfB6(서열번호 33)： 5' -AGA CAT CGA GCC AGT ATT CCT CAT C-3 '；
Sr.fB7(서열번호 34)： 5'- -ATT TCG AGC GGC CAG CTG AAC G—3'；
SrfB8(서열번호 35)： 5' -TTT CAT CCG GCG CCG TAT AGG TTT-3'；
SrfB9(서열번호 36)： 5' - GCA AAA ΤΓΤ CCG GAC AGC GGG ATA T-3'
SrfBlO (서열번호 37) 5' ᅳ TCG ATC CGG CCG ATG TAT TCA AT-3' . PCR 산물을 전기영동 수행하여 B. subtil is 168 균주와 Β· subtil is subsp. krictiensis 균주로부터 얻은 각각의 유전자 산물을 확인한 결과， SrfB9와 SrfBlO 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였을 때, B. subtilis 168 균주와 B. subtilis subs . krictiensis균주로부터 약 1.8 kb에 해당하는 동일한 크기의 DNA 단편이 관찰되었다 (도 1). 본 발명자들은 상기의 DNA 단편을 프로브로 이용하여， 상기 실시예 2에서 작성한 게놈 라이브러리를 스크리닝하는데 이용하였다.
<3-2> 스크리닝된 이튜린 생합성 유전자와 펩타이드 생합성 유전자와의 서 열 비교
상기 실시예 <3ᅳ1>에서 B. subtilis subsp. krictiensis균주로부터 획득한 이튜린 생합성 유전자로 추정되는 프로브의 아미노산 서열을 다론 펩타이드 생합성 유전자의 아미노산 서열과 비교하였다.
NCBI 데이타 베이스를 이용하여 얻은 설팩틴 및 리케니신 (lichenysin) 생합 성 유전자의 아미노산 서열을 클러스탈 더블유 (CU/STAL ) 프로그램을 이용하여 비 교한 결과， 도 2에 나타난 바와 같이 B. subtilis subsp . krictiensis 균주로부터 획득한 아미노산 서열은 서로 다른 3개의 설팩틴 (surfactin) 생합성 유전자와 82 ~ 8¾의 ' 상동성을 나타냈으며， B. licheniformis 균주가 생산하는 리케니신 (lichenysin) 생합성 유전자와도 80%의 상동성을 나타냈다 (도 2).
<3-3> 이튜린의 펩타이드와 지방산의 아실화(^ 13^011) 과정에 관여하는 유전자의 스크리닝
펩타이드와 지방산을 연결하는 아실화 (acylation) 과정에 관여하는 유전자 를 클로닝하기 위하여 위에서 상기 실시예 <3-1>에서 고안한 20여종의' 프라이머를 이용하여 PCR을 행하고 얻은 약 0.4 kb의 DNA 단편에 대한 염기 배열을 분석하였다. 그 결과, B. subtilis subsp. krictiensis 균주에서 SrfA 5과 SrfA 6 프라 이머를 이용하여 획득한 0.4 kb의 PCR 산물에 대한 유전자 염기서열 및 펩타이드 서열을 분석하여 도 3에 나타냈다.
도 3에 나타난 아미노산을 비교분석하기 위하여 NCBI 데이타 베이스를 탐색 하였다. 그 결과 이 유전자 산물은 다른 미생물에서 유래된 아실 전달체 단백질 환 원 효소 (acyl carrier protein reductase)와 56~ 83%의 상동성을 나타내었으며 특 히 다른 B. subtilis균주에서 유래된 아실 전달체 단백질 환원 효소와는 83%의 상 동성을 나타냈다 (도 4).
<3-4>콜로니 하이브리드를 이용한 이튜린 생합성 유전자의 스크리닝 상기 실시예 <2-3>에서 작성된 B. subtilis subsp. krictiensis 균주의 게 놈 라이브러리를 이용하여, 이튜린 생합성 유전자를 탐색하기 위해 콜로니 흔성화 (colony hybridization)을 실시하였다.
상기 실시예 <3-1>의 B. subtilis subsp. krictiensis 균주로부터 획득한 1.8 kb DNA 단편을 콜로니 흔성화에 대한 프로브 (probe)로 이용하기 위하여 , 100°C 에서 10분간 끓여서 변성시킨 뒤， 얼음에 급속하게 냉각시키고 라벨링 완충액 (5X) 5 ≠, dNTP흔합액 2 씌 변성된 DNA 주형 7 /rf, BSA(10 mg/m^) 2 ≠, 32P-CTP 5≠, Klenow 효소 1 , D.W. 3 ^로 반웅액을 조제하여, 37°C에서 1시간 반웅 시켰다. 반응 후， 0.5 M EDTA로 반웅을 정지시키고， 3 N NaOH 2.5 ^를 첨가한 뒤 다시 37°C에서 1시간 반응 시킨 뒤 프로브로 사용하였다.
우선， 상기 <실시예 2>에서 작성한 B. subtilis subs . krict iensi s엑 게놈 라이브러리를 테트라사이클린 (tetracyclin)을 최종 농도가 10 /g이 되도록 첨가한 LB 평판배지에 한 평판 당 100 ~ 200개의 집락이 출현하도록 도말한 뒤, 집락의 크 기가 직경 약 1 瞧 정도 될 때까지 37°C에서 하룻밤 동안 배양하였다. 나일론 멤 브레인 (Nylon membrane)으로 집락을 옮기고， 멤브레인 (membrane)올 10% SDS에서 5 분, 변성 (denaturing) 용액 [0.5 N NaOH, 1.5 M NaCl]에서 5분, 중성화 (neutralizing) 용액 [1.5 N NaCl , 0.5 M Tris-HCl , Η 7.4]에서 5분 배양하고, 2Χ SSC용액 [20 X SSC 용액을 10배 희석하여 사용; 20x SSC 조성은 0.15 M NaCl, 0.01 M 시트르산 나트륨 (sodium citrate), 0.001 M EDTA]으로 세척한 후 건조시키 고ᅳ 80°C의 진공 건조기 (vaccum oven)에서 1 ~ 2시간 동안 베이킹시켰다. 멤브레 인을 전흔성화 (prehybridization) 용액 [1 mM EDTA, 250 mM Na2HP04, 1% 카제인 가 수분해물 (Casein hydrolysate), 7% SDS pH 7.4]으로 처리하고 65°C에서 2시간 반웅 시킨 후， 라벨된 프로브 믹스 [주형 DNA 14 5X라벨링 완충액 (프로메가) 5 μ , dNTP(ATP, TTP, GTP) 1 μί, Klenow 효소 1 ， 32P-dCTP 2 ,]를 넣고 하룻밤 동안 반웅 시켰다. 반웅 후 세척 용액 [세척용액 I： 20 X SSC 10 mi,. 10% SDS 1 ml, 증 류수 89 mi； 세척용액 II： 20 X SSC 10 mi, 10% SDS 10 m£, 증류수 80 mi; 세척용 액 111: 20 SSC 0.5 mi, 10% SDS 1 mi, 증류수 98.5 으로 세척하고 X-ray 필 름에 노출시켜 감광된 양성 콜로니를 선발하였다.
그 결과， 도 5의 A에 나타난 바와 같이, B. subtilis subsp. krictiensis 균주로부터 획득한 DNA 단편과 상동성을 나타내는 클론이 나타난 것을 관찰할 수 있었다 (도 5의 A).
<3-5>서던 흔성화를 이용한 이튜린 생합성 유전자의 스크리닝
야생주 B. subtilis subsp. krictiensis 균주의 게놈 라미브러리로부터 이 튜린 생합성 유전자를 클로닝하기 위하여 야생주 B. subtilis 균주의 '게놈 DNA를 ώ Α로 부분 절단하여 얻은 다양한 크기의 DNA 단편들을 획득하였다. 이들 중 20 ~ 30 kb 크기에 해당하는 여러 종류의 DNA 단편을 코스미드 pLAFR3 백터를 이용하 여， E. ?// HB101에 라이브러리를 작성하여 얻은 여러 종류의 집락들을 ^ΰίϋ으로 절단하여 얻은 각각의 클론들을 서던 흔성화 (Southern hybr idizat ion)를 이용하여 분석하였다.
도 5의 B에 나타난 바와 같이， EcoR 제한효소로 절단한 클론을 0.7% 아가 로우스 젤에 전기영동시키고， 브롬화 에티움 (ethidium bromide)으로 염색한 뒤， 용 액 I[Tris— HC1 100 mM, NaCl 150 mM, pH 그 5]로 15분간 반웅 시키고, 다시 용액 II[Tris-HCl 100 mM, NaCl 150 mM, blocking reagent 0.5%, 7.5]로 30분간 반응 시켰다. 반옹 후, 용액 III[Tris-HCl 100 mM' NaCl 100 mM/ ·β ， MgCl2 100 mM, pH 9.5]으로 30분간 반웅 시키고, 나일론 멤브레인 (nylon membrane)을 젤 위에 을려놓 고 DNA 단편들을 멤브레인으로 이동시켰다. DNA 단편들이 이동된 멤브레인을 건조 시키고 흔성화 (hybridization)를 실시하였다. 흔성화 반응 시에는 멤브레인을 프 로브가 들어 있지 않은 흔성화 완충액 [1 mM EDTA, 250 mM Na2HP04l 1% 카제인 가수 분해물, 7% SDS H 7.4]으로 2시간 동안 세척하고， 다시 15 용액 I， II, III 의 순서로 2회씩 세척한 후 용액을 제거하였다. 그 뒤， 라벨된 프로브 믹스 [주형 DNA 14 ≠, 5X라벨링 완층액 (프로메가) 5 μΑ, dNTP(ATP, TTP, GTP) l/ , Klenow 효소 1/ 32P-dCTP 2 ]를 첨가하여 하룻밤 동안 반웅 시켰다. 반응 후 프로브 DNA를 제거하고， 멤브레인을 건조시켜 X-ray'필름 위에 올려놓고 -70 °C에서 하룻 밤 방치한 후 X-ray 필름을 현상하였다 (도 5의 C) .
그 결과, 도 5의 B 및 C에 나타난 바와 같이， 2개의 레인에서 B. subtilis subsp. krictiensis균주로부터 획득한 DNA프로브의 서열이 존재하는 것을 확인할 수 있었으며, 이러한 두 개의 클론을 각각 pJJ815와 pJJ121로 명명하였다.
【실시예 4】
pJJ815와 PJJ121 클론의 제한효소 지도 작성
상기 <실시예 3>에서 획득한 pJJ815와 pJJ121 클론에 대한 제한효소 지도를 작성하였다. 과 £coRI의 제한효소를 이용하여 절단하고, 상기 두 클론의 제한 효소 지도를 작성한 결과， pJJ121 클론은 pJJ121E2(0RF 2—2 ~ 0RF 3의 부분， 서열 번호 1의 8,020 ~ 2,3480 bp), pJJ121E3(0RF 3 ~ ORF 4의 부분)， pJ815E4(0RF 4의 부분)， PJJ815E6(0RF 4 ~ yczE의 부분， 서열번호 1의 29,167bp 32,819 bp)로 구 분될 수 있으며， pJJ815 클론은 pJJ121E2 단편， pJJ121E3, pJJ815E4, pJJ815E6, PJJ815E5, PJJ815E2(yczE ~ ycyA의 부분)로 구분되었다 (도 9).
【실시예 5】
PJJ815와 pJJ121 클론의 단편을 이용한 서던 흔성화
B. subtilis subs . krictiensis 균주의 게놈 라이브러리 스크리닝을 통해 얻은 pJJ815와 pJJ121 Cosmid 클론들이 이튜린 생합성에 관여하는 유전자인지의 여 부를 확인하기 위하여 , pJJ815와 pJJ121 Cosmid 클론들을 으로 절단하여 설팩 틴을 생성한다고 알려진 B. subtil is 168 균주와 Β· subtil is subsp. krictiensis 균주를 이용하여 게놈 서던 흔성화를 수행하였다. <5-1>서던 혼성화에 필요한 프로브의 제작
게놈 서던 흔성화를 수행하기 위하여， 상기 클론을 ^ oRI 제한효소로 절단 한 6개의 단편 (pJJ121E2, pJJ121E3, pJJ815E4, pJJ815E5, pJJ815E6, 및 pJJ815E2) 단편들을 프로브로 제조하였다. 구체적으로 상기 실시예 <2-3>에 언급한 cosmid 클론 pJJ121과 pJJ815를 E. coli HB1이에 클로닝한 후 coRI으로 절단한 6개의 단 편들을 각각프로브로 이용하였으며， 이러한 각각의 단편들은 실시예 <3-4>에 기술 한 방법과 동일하게 32P_dCTP 동위원소로 표지를 행한 후 흔성화 실험에 사용하였 다.
<5-2>은도에 따른 서던 혼성화 반옹
상기 실시예 <5— 1>에서 제조한 6개의 단편 (pJJ121E2, pJJ121E3, pJJ815E4,
PJJ815E5, pJJ815E6, 및 pJJ815E2)을 프로브로 이용하여.， B. subtil is subsp. krictiensis균주와 B. subtil is 168 균주의 염색체 DNA를 이용하여 서던 흔성화를 수행하였다. 또한, 서던 흔성화 시 온도에 따라 반웅에 어떠한 영향을 나타내는지 의 여부를 확인하기 위하여, 50°C와 65°C에서 서던 흔성화를 수행하였다.
먼저， B. subtilis subs . krictiensis 균주와 B. subtil is 168 균주의 게 놈 DNA를 ^ I 제한효소로 절단한 클론을 0.7% 아가로우스 젤에 전기영동시키고， 에티디움 브롬마이드 (ethidium bromide)로 염색한 뒤, 용액 I[Tris_HCl 100 mM, NaCl 150 mM, pH 7.5]로 15분간 반웅 시키고， 다시 용액 II[Trisᅳ HC1 100 mM, NaCl 150 mM, blocking reagent 0.5%, pH 7.5]로 30분간 반웅 시켰다. 반응 후， 용액 III[Tris-HCl 100 mM, NaCl 100 mM/ ^， MgCl2 100 mM, pH 9.5]으로 30분간 반웅 시 키고， 나일론 멤브레인 (nylon membrane)을 젤 위에 올려놓고 DNA 단편들을 멤브레 인으로 이동시켰다. DNA 단편들이 이동된 멤브레인을 건조시키고 흔성화 (hybridization)를 실시하였다. 흔성화0 13^ 23 01 반웅 시에는 멤브레인을 프로브가 들어 있지 않은 흔성화 완충액 [1 mM EDTA, 250 mM Na2HP04, 1% 카제인 가 수분해물 (Casein hydrolysate), 7% SDS H 7.4]로 2시간 동안 세척하고， 다시 15 씩 용액 I， II， III의 순서로 2희씩 세척한 후 용액을 제거하였다. 그 뒤, 각각 의 32P-dCTP 동위원소로 표지 된 프로브 DNA를 첨가하여 하룻밤 동안 반응 시켰다. 반웅 후 프로브 DNA를 제거하고, 멤브레인을 건조시켜 X-ray 필름 위에 을려놓고 ᅳ
70 °C에서 하룻밤 방치한 후 X-ray 필름을 현상하였다.
도 7에 나타난 바와 같이， 65°C에서 서던 혼성화를 수행한 결과 B. subt i 1 i s subsp. krictiensis균주에서는 프로브 DNA의 서열이 존재하는 것을 관찰 할 수 있었으나， 설팩틴 생합성 유전자를 내포하고 있는 B. subt i lis 168 균주에서 는 프로브로 사용한 6개의 ccRI 단편 모두가 B. subtilis 168 균주의 게놈 DNA에 존재하지 않는 것을 관찰할 수 있었다 (도 7).
또한， 서던 흔성'화 반응을 50°C에서 하였을 때에는 B. subtilis 168 균주의 게놈 DNA에서 pJJ121E3 단편 프로브에 대하여 상동성이 미약하게 나타났으나， 그 외의 단편들에 대해서는 65°C에서 서던 흔성화시킨 결과와 동일하였다 (도 8). 따 라서， 도 7과 8의 결과를 통해서， 서던 흔성화 반웅 시 온도의 차이에 의한 영향이 없음을 확인할 수 있었다. 또한， 상기 결과들을 종합해 볼 때, 6개의 ^oRI 단편 들은 50°C로 반응 시 미약한 반웅을 나타낸 pJJ121E3 단편을 제외하고는， B. subtilis 168 균주로 부터 분리한 설팩틴 생합성 유전자와는 거의 유사성을 나타내 지 않았으나 B. subtilis subsp . krictiensis균주에서는 유사성을 나타냈으므로，
PJJ815와 pJJ121 Cosmid 클론으로부터 절단시킨 6개의 단편 (pJJ121E2, PJJ121E3,
PJJ815E4, pJJ815E5, pJJ815E6, 및 pJJ815E2)들이 이튜린 생합성에 관여하는 유전 자일 가능성이 높을 것으로 추정되었다. 【실시예 6】
이튜린 생합성 유전자 (PJJ815와 pJJ121 클론)의 염기 배열 결정과 특성 분 석 <6-l> 이튜린 생합성 유전자 (pJJ815와 pJJ121)의 염겨 서열 분석
PJJ815와 pJJ121의 코스미드 (Cosmid) 클론으로부터 클로닝한 ccRI 단편들 을 이용하여 양방향 염기배열을 결정하여 21,253 bp를 확보하였으며, 일부 누락된 유전자에 대한 염기배열을 추가로 확보하기 위하여 게놈 라이브러리 스크리닝을 통 해 유전자를 확보하고 염기배열을 결정하여. 총 37,682 bp의 염기배열을 확보하였으 며， 염기배열 내에서 이튜린 생합성과 관련된 7개의 0RF가 발견되었다 (도 9).
ORF 1은 서열번호 1의 2868 내지 3219 번째 염기서열 (서열번호 2)을 포함하 고 있으며， 0RF 2-1은 3810 내지 4353 번째의 염기서열 (서열번호 4)을， 0RF 2-2는 4632 내지 14559 번째의 염기서열 (서열번호 5)을 포함하고 있다. 0RF 3은 서열번 호 1의 14583 내지 25341 번째의 염기서열 (서열번호 6)을 포함하고 있으며, 0RF 4 는 25378 내지 29209 번째의 염기서열 (서열번호 7)을 포함하고; 있으며， 0RF 5는 29231 내지 29960 bp 번째의 염기서열 (서열번호 8)을 포함하고 있으며, 0RF 6은 30084 내지 31392 번째의 염기서열 (서열번호 9)을 포함하고 있다. <6-2> 이튜린 생합성 유전자 0RF와 환상형 펩타이드 생합성 유전자와의 염 기 서열 비교
이튜린 생합성에 관여할 것으로 추정되는 7종의 0RF 각각을 다른 환상형 펩 타이드 생합성 유전자와 비교하였다. '
그 결과， B. subtilis 유래의 설팩틴 유전자는 0RF와 76 - 86%의 유사성을 나타낸 반면 B. amyloliquefaciens 유래의 설팩틴 유전자와는 92 ~ 100%의 유사성 을 나타냈다. 특히， 이튜린 생합성에 직접적으로 관여할 것으로 추정되는 0RF 2- 1(543 bp), 0RF2-2(9,927 bp) 및 ORF3U0/757 bp)는 B. amyloliquefaciens 균주 유래 설팩틴 유전자와 각각 92 ~ 98%의 유사성을 나타냈다 (표 1).
그러나 이러한 B. amyloliquefaciens 균주 중 98%의 유사성을 나타낸 B. amyloliquefaciens FZB42 균주는 환상형 펩타이드 설팩틴 (surf act in)， 펜지신 (fengycin) 및 바실로마이신 D(baci 1 lomycin D)를 생산한다고 알려져 있으나 (Chen, et al. , Nature Biotechnol., 25： 1007-1014, 2007)， 이튜린은 생산하지 않는 것으 로 보고되었다. 이에， 본 발명자들은 B. amyloliguefaciens FZB42 균주와 B. subtilis subsp. krictiensis균주 전체 유전자의 상동성을 비교하였다 (표 2). 그 결과， 상기 두 균주는 전체적인 유전자 염기서열을 비교했을 때 98¾>의 상동성을 나타내었으나 37,682 bp인 전체적인 유전자의 크기를 감안해 볼 때, 두 균주의 2% 상이성은 대략 753 bp 이상의 차이를 나타내었으며， 특히 B. amyloliquefaciens FZB42 균주는 이튜린을 생산하지 않는다고 이미 보고되어 있어 (J. Bacteriol . , 186： 1084-1096, 2004; Nature Biotechnol . , 25： 1007-1014, 2007), 이튜린을 생산하는 B. subtilis subsp. krictiensis 균주와는 커다란 차이 점을 나타냈다.
특히 , 이튜린 합성에 핵심적인 역할을 할 것으로 추정되는 0RF2-1과는 92%，
0RF 2-2와는 98%， 0RF 3과는 98%를 나타내는 데도 불구하고 서로 생산하는 환상형 리포펩타이드 항생물질이 크게 다른 것을 고려해보면 이튜린과 설팩틴은 생합성 경 로 중 상당한 부분을 서로 공유할 가능성이 큰 것으로 생각되었다 (표 2 내지 표 4). 또한， 20이년도에 일본 연구팀에서 발표한 이튜린 A 유전자 (K. Tsuge, et al. , J. Bacteriol . , 183： 6265-6273 , 2001)와 Β· subtilis subsp. krictiensis 균주로부터 유래된 이튜린 생합성 유전자와는 유전자의 유사성이 41%를 나타내었고， 독일 연구팀이 발표한 이튜린 A 유전자와도 4 의 유사성을 나타내어， B. subtilis 균주로부터 유래된 이튜린 생합성 유전자는 새로운 유전자일 가능성이 높은 것으로 사료되었다 (표 5).
【표 1】
Max.
ORFs 유의한 염기서열 (significant alignment) Identity
(%)
0RF1 (CBI41437) transcriptional regulator {Bacillus 97
amylol iquefaciens]
(YP01419994) transcriptional regulator [Bacillus 96 awylol iquefaciens]
0RF2-1 (CP00560) 설팩틴 (surf act in) 합성효소 AA [Bacillus 94 amylol iquefaciens]
(FN597644)설팩틴 (surfact in) 합성효소 kk[Bacillus subtilis] 92
0RF2-2 (^^(^ 설팩틴^！！ ！!) 합성효소 AA, AB [Bacillus 97 amy I ol iguefaciens]
(AJ575642)설팩틴 (surfact in) 합성효소 M, AB {Bacillus 97 amylol iquefaciens]
(FN597644)설팩틴 (surfact in) 합성효소 kk, AB [Bacillus 93 amylol iquefaciens]
◦RF3 (YP0141996) 설팩린 (surfactin) 합성효소 AB {Bacillus 98 amylol iquefaciens]
(CBI41439)설팩틴 (surfact in) 합성효소
Figure imgf000037_0001
95 amylol iquefaciens
(ZP06875171)설팩틴 (surfactin) 합성효소 B[BaciIhis 76 subtilis]
0RF4 (YP01419998) 설팩틴 (surfactin) 합성효소 AC [Bacillus 96 amylol iquefaciens]
( 06875172)설팩틴(311 &^ 1) 합성효소 [Bacillus subtilis] 86
0RF5 (/ 099323)설팩틴(311 ^ 11) 합성효소 k)[Bacillus 100 awylol iquefaciens]
(YP0141999) 설팩틴 (surfact in) 합성효소 k)[Baci 1 h]s 99 amylol iquefaciens]
0RF6 (ACX10665)aspartate transaminase— 1 ike protein [Bacillus 99 amy] o J iquefaciens]
(CAE02535) amino transferase [Bacillus amylol iquefaciens] 99 하기 표 2는 이튜린 생합성 유전자 37,6822 bp 전체서열을 Blast N을 이용하여， B. subtilis subsp. krictiensis 균주를 포함한 다른 균주와 비교한 결과를 나타낸다.
【표 2】
Sequences producing significant aii men ;
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하기 표 3은 B. subtilis subsp. krictiensis 균주의 ORF 2-1(550 bp)의 염기서열을 B]asi X를 이용하여 다른 균주와 비교한 결과를 나타낸다. Λ！
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표 4는 β· subtil is subsp. krictiensis 균주의 ORF 2-2(9,940 bp)의 ^
염기서열을 Blast X를 이용하여 다른 균주와 비교한 결과를 나타낸다.
【표 4】
Hoiccule type
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하기 표 5는 B. subtilis subsp. krictiensis 균주의 ORF 3 (10,770 bp)의 염기서열을 Blast X를 이용하여 다른 균주와 비교한 결과를 나타낸다. O/ίAV,£090ζϊο:/l2/n02M /.s800
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【실시예 7】
검정용 평판배지의 조제
<7-1> Magnaporthe grisea 평 ^ 조제
포자 현탁액의 조제는 벼의 도열병 원인균인 마그나포르테 그리시아
(Magnaporthe grisea)를 포테이토 텍스트로스 아가 (Potato dextrose agar) 사면배 지에서 12 - 15일 동안 사면 배양한 후， 증류수 5 ra,를 가하고 파스테르 파이펫
(pasteur pipette)으로 현탁시킨 후 일정시간 정치하고 그 상등액의 홉광도 (A550nm)
를 1.5로 조절한 후 사용하였다. 마그나포르테 그리시아 시험균의 평판은 중층 평 판을 사용하는 데 먼저 벼 잎 침출액에 0.15% 슈크로스 (sucrose)와 1.5% 아가
(agar)를 첨가하여 멸균시킨 후 시트레이트 포스페이트 버퍼 (citrate phosphate buffer )(pH 5.0)와 1:1로 흔합하여 각 평판마다 25 씩 분주하였다. 분주한 배지 가 굳은 후 다시 벼 침출액에 0.15% 슈크로스 (sucrose)와 1.5% 아가 (agar)를 첨가 하여 멸균시키고， 시트레이트 포스페이트 버퍼와 1:1로 흔합하여 45°C로 유지시킨 중층배지에 조제한 포자 현탁액 5 를 멸균한 중층배지 50 m£에 첨가하여 잘 흔합 한 다음 미리 고형화시켜 놓은 베이스 레이어 (base !ayeiᅳ)에 평관의 크기에 따라
5~10 씩 중층 (overlay)하여 검정용 평관을 조제하였다.
<7-2> Trichophyton mentagrophytes평판의 조제
사보로드 아가 (Sabouraud's agar) 사면 배지에서 10 ~ 14일 동안 배양한 균 체를 이용하였으며， 평판용 배지로는 사보로드 아가를 기본 배지로 사용하였다.
무좀의 원인균인 트리코피론 ^^그로^^트 Tr j chophyt on ment agrophyt es) 균주를 사보로드 텍스트로스 브로스 (Sabouraud's dextrose broth)에 접종하고 2 ~ 3일 동 안 진탕배양시킨 후， ¾균한 와링 블렌더 (waring blender)로 균질화시키고, 흡광도
(A550nm)를 1.5로 조절한 후 멸균하여 5C C로 조절된 사보로드 덱스트로스 아가 50 ¬에 균액 5 을 첨가하여 잘 흔합시키고ᅳ 사보로드 덱스트로스 아가를 미리 분주 해 고형화시켜 놓은 베이스레이어 (base layer) 위에 평관의 크가에 따라 5 ~ 10 i 씩 중층하여 검정용 평판을 조제하였다. <7-3> Fusarium oxysporum평판의 조제
포테.이토 텍스트로스 아가 (Potato dextrose agar) 배지에서 자란 푸사리움 옥시스포럼 oxysporum) 균주를 포테이토 덱스트로스 브로스 (potato dextrose broth)에 접종하고 2 ~ 3일 동안 진탕배양한 후， 멸균한 와링 블렌더로 균질화시키고， 흡광도 (A550nm)를 1.5로 조절한 후 멸균하여 50°C로 조절된 포테이토 덱스트로스 아가 50 in,에 균액 10 1 을 첨가하여 균일하게 흔합하고， 포테이토 텍 스트로스 아가를 미리 분주하여 고형화시켜 놓은 베이스 레이어 (base layer) 위에 평판의 크기에 따라 5 ~ 10 m£씩 중층하여 검정용 평판을 조제하였다.
■ ·
【실시예 8】
바실러스 균주의 항균력 측정
<8-1>표준 화합물을 이용한 항균력 측정
이튜린 생산 균주를 돌연변이시키거나 재조합시켜 이튜린이 생산되는지의 여부를 검정하기 위해서는 기기분석에 의존하여야 하나 시간과 노력이 많이 소요되 기 때문에 실험실에서 간편하게 이튜린 생산여부를 검정할 수 있는 방법을 확립하 고자 하였다. 먼저 이류린을 생산하는 B. subtil is subsp. krictiensis균주와 설 팩틴 (surf act in) 유전자를 함유하고 있는 B. subtil is 168 균주의 항균력 차이를 비교하기 위하여， 설팩틴과 이튜린 A의. 표준 화합물을 시그마 (Sigma Co.)와 와코 (Wako Co.)로부터 구입하였다. 피검균으로는 벼의 도열병균 원인균인 마그나포르테 그리시아
Figure imgf000046_0001
무좀균인 트리코피톤 멘타그로피테스 {Trichophyton mentagrophytes) 및 시들음병의 원인균인 푸사리움 욱시스포럼 {Fusarium oxysporum) 둥 3 종류를 사용하여 표준 화합물인 이튜린 A와 설팩틴에 대한 항균력을 조사하였다.
설팩틴과 이튜린 A 화합물의 농도를 각각 달리하여 상기 <실시예 7>에서 제 조된 마그나포르테 그리시아, 트리코피톤 멘타그로피테스, 및 푸사리움 옥시스포럼 평판 위에 벼의 도열병균에 대해서는 1.56 ~ 12.56 ug/mit 무좀균에 대해서는 3.12 - 25 ^g/mi,, 가지과 식물의 시들음병 원인균인 Fusar m균에 대해서는 6.25 ~ 50 //g/ 가 되도록 각 화합물을 2배섹 회석하여 4개의 농도 계열을 제조하였다. 농도별로 제조한 각각의 화합물을 4 농도씩 피검균을 함유한 평판 위에 멸균된 컵 (cup) (외경 6.6 隱， 높이 8.6 画， stainless 재질, Fisher Co.)을 올려 놓은 후 컵 (cup) 속에 100 세씩 분주하고， 25°C에서 1 3일간 배양한 후 피검균의 생육저 해 여부를 관찰하여 항균력을 조사하였다.
그 결과, 이튜린 A는 마그나포르테 그리시아와 트리코피톤 멘타그로피테스 피검균에 대해 강한 항균력을 나타냈으며， 설팩틴은 이튜린 A 보다는 약하지만 약 간의 저해활성을 나타냈다. 이튜린 A와 설팩틴은 항균력의 차이를 나타내었으나 항균 스펙트럼에는 커다란 차이를 나타내지 않았다. 그러나 피검균 푸사리움옥시 스포럼에 대하여 이튜린 A는 강력한 항균력을 나타낸 반면， 설팩틴은 항균력을 나 타내지 않아， 두 화합물은 푸사리움 균주에 대해 명확한 항균력의 차이를 나타냈다 (도 10). <8~2>바실러스 균주의 배양상등액의 항균력 측정
'야생주 B. subtilise 이용하여 이튜린의 생성이나 소멸된 형질전환주를 선 별할 때 일일이 기기분석을 통하여 이튜린 생성 유무를 분석하려면 시간과 노력이 많이 소요되기 때문에 간편하게 피검균을 이용하여 검정할 수 있는 검정체계를 개 발하고자 하였다. 먼저 어센틱 이튜린 (authentic iturin)과 설팩틴을 이용한 항균 력 검정 시 이류린 만이 Fusanum균주에서만 항균력을 나타내는 것을 발견하고 당 실험실 및 한국생명공학연구원 바이오화학연구센터에서 보유하고 있는 이튜린과 설 팩틴 생성과 관련한 여러 종류의 B. subtlis 균주를 사용하여 항균력 검정을 하였 다. 되도록 다양한 균주를 이용하기 위하여 이튜린과 설팩틴을 생산한다고 알려진 균주들을 여러 연구자들로부터 수집하였으며 B. subtilis C9 균주도 이러한 차원에 서 수집하여 이용하였는데, 바실러스 균주를 액체 배양한 후, 3가지 종류의 피검균 에 대해 항균력을 조사하였다.
이튜린을 .생산하는 B. subtilis subs . krictiensis 균주와 이튜린과 설팩 린 항생물질을 모두 생산하지 않는 B. subtilis JH642 균주를 대조구로 사용하고, 설팩틴 유전자는 갖고 있으나 sfp유전자의 자연 돌연변이에 의해 설팩틴을 생산하 지 않는 β. subtilis 168 균주와 설팩틴과 이를린을 생산하는 것으로 추정되는 β. subtilis C9 균주를 이용하였다.
LB 한천배지에서 신선하게. 자란 상기 Bacillus 균주들의 단일 집락들을 모 아 활성물질 생산용 복합배지 [sucrose 30 g, soy tone 10 g, yeast extract 5 g, K2HPO4 0.5 g, MgS04 2 g, MnCl2 4 mg, CaCl2 5 mg, FeS04 · 7¾0 25 mg, pH 7.0, 증 류수 1 리테에 접종하여 30°C에서 200 rpm으로 48시간 동안 배양하였다. 배양액 을 8,000 xg에서 10^간 원심분리하여 균체를 제거하고 0.2 urn 멤브레인 필터 (membrane filter)를 통과한상등액을 페이퍼 디스크 (paper disk)에 각각 100 씩 첨가하여 상기 <실시예 7>에서 제조한 검정용 평판배지에 을려놓고 25°C에서 1 ~ 3 일간 배양한 후 피검균 (마그나포르테 그리시
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gr.isea), 트리코피톤 멘타그로피테스 (7r/c entagrophytes) 및 푸사리움 옥시스포럼 ( ^ / oxysponrn )^ 생육억제 정도를 조사하였다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이 B. subtilis subsp. krictiensis 균주 는 표준 화합물 이튜린 A를 이용한 결과와 등일하게， 마그나포르테 그리시아, 트리 코피톤 멘타그로피테스 및 푸사리움 옥시스포럼의 피검균 모두에서 강력한 항균력 을 나타냈다. 그러나 B. subtilis JH642 균주나 sfp유전자가 자연 돌연변이된 β. subtilis 168 균주에서는 3 종류의 피검균에 대하여 항균력이 나타나지 않았으나， B. subtilis C9 균주는 3 종류의 피검균에 대하여 항균력을 나타냈다. 이에, 본 발명자들은 상기 결과에서 나타난 A subtilis C9 균주의 항균력 '이 설팩틴 이외에， 이튜린이 생산되기 때문일 것으로 추정하였으며， 이러한 결과를 토대로 이튜린 돌 연변이주 선발 시 피검균으로 F. oxysporum^ 이용하였다 (도 11).
【실시예 9】
B. subtilis subsp. krictiensis형질전환 변이주의 항균활성 측정
<9一 1> B. subtilis subs . krictiensis^, 형질전 실시예 <2-2>의 B. subtilis subsp. krictiensis 균주로부터 획득한 cosmid 클론 pJJ121과 pJJ815의 DNA 단편들을 RI으로 절단하여 얻은 4개의 단편들 ( pBT6, pBTl, pBT2 및 pBT3, 도 12)을 각각 pT(II)PLK의 HCE promoter를 Afcfel으로 절단한 단편과 함께 Bacillus쏴 E. co//의 shuttle vector인 pHPS9(한국생명공학 연구원 바이오화학연구센터로부터 분양받아 사용함)에 클로닝하고 β. subtilis subsp. krictiensis 균주에 형질전환시킨 후 클로람페니콜 항생물질 (5 zg/ )을 함유한 평판에 도말하여 집락을 형성하는 집락돌을 형질전환주로 선별하였다.
구체적으로, Bacillus subtilis subsp. krictiensis 균주를 LB 평판배지에 서 신선하게 배양하여 얻은 단일 집락을 2 ^의 Spizzizen 배지 (.50% glucose 10 ， 2% casein hydro lysate 10 mi, 10% yeast extract 10 ui^, 1M MgCl2 2.25 m£ , K¾P04 6 g, HP0414 g, (N¾)S04 2 g, sodium citrate 1 g, MgS040.2 g, 증류수 1 리터) 에 접종하고 37 °C， 200 rpm에서 16 ~ 18시간 배양하였다. 다시 접종원이 1% 되도 록 신선한 배지에 다시 접종하고 같은 조건으로 배양하면서 , 580 nm에서 흡광도가 1.0일 때 배양액 0.5 과 약 1 의 DNA(pBT6, pBTl, pBT2, 및 pBT3)를 흔합하고, 1시간 동안 진탕배양하였다， 진탕베양한 후， 5 /m《의 클론람페니콜 (chloramphenicol)0] 함유된 평판배지에 도말하고， 37 °C에서 24 시간 동안 배양하 였다.
pBT6, pBTl, pBT2 및 pBT3의 단편을 포함한 변이주를 '각각 B. subtilis subsp. krict/ensis(pBT6) , Β. subtilis subsp. krj'ctiensjs(pB l) , B, subti lis subsp. krictiensis{p 2) 및 B. subtilis subsp. /c /fiv?s/s(pBT3)이라 명명하였 다 (도 10).
<9-2> B. subtilis subsp. krictiensis 、 항균력 측정
LB 한천배지에서 신선하게 자란 상기 대조군으로 형질전환되지 않은 B. subtilis subsp. krictiensis균주와， 상기 실시예 <8-1>에서 제조한 0RF를 포함하 고 있는 .단편들 (pBTl, pBT3, 및 pBT6)을 형질전환시킨 B. subtilis subsp. krictiensis균주 (pBTl, pBT3, 및 pBT6)의 항균력을 측정하고자 하였다. B. subtilis subsp. krictiensis균주 (pBTl, pBT3, 및 pBT6) 균주들의 단일 집락들을 모아 활성물질 생산용 복합배지 [sucrose 30 g, soy tone 10 g, yeast extract 5 g, K2HP04 0.5 g, MgS04 2g, MnCl2 4 mg, CaCl2 5 nig, FeS04.7H20 25 rag, pH 7.0, 증류수 1 리테에 접종하여 30°C에서 200 rpm으로 48시간 동안 배양하였다. 배양액을 8,000Xg에서 10분간 원심분리하여 균체를 제거하고 0.2 rn 멤브레인 필 터 (membrane filter)를 통과한 상등액을 페이퍼 디스크 (paper disk, thick, 직경 8 mm, Toyo Roshi Co.)에 각각 100 ^씩 첨가하여 상기 <실시예 2>에서 제조한 검정 용 평판배지에 을려놓고 25°C에서 1 ~ 3일간 배양한 후 푸사리움 옥시스포럼 {Fusarium oxysporum) 피검균의 생육억제 정도를 조사하였다.
그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이 , 형질전환하지 않은 .B. subtilis subsp. krictiensis 대조 균주에 비하여， pBT6 클론을 포함하고 있는 B. subtilis subsp.
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균주의 항균력이 2 - 3배 정도 증가한 것을 관찰할 수 있었다. 또한， 형질전환된 균주에 있어서 항균력의 세기는 PBT3, pBTl, pBT6의 순서로 증가 되는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 푸사리움 옥시스포럼에 대하여 설팩 틴은 항균활성을 나타내지 않으나， 이튜린은 항균활성을 나타내는 상기 결과와 일 치하였다. 즉， pBT6 클론의 형질전환에 의해서, B. subtilis subsp. krictiensis 대조균주에 비하여 B. subtilis subsp. ^r /c /a7s/s(pBT6)의 항균활성이 증가하였 으므로, 본 발명자들은 pBT6 클론에 이튜린 생합성 유전자가 포함되어 있을 것으로 추정하였다 (도 13).
【실시예 10】
이튜린 생합성능이 소실된 돌연변이주의 제조와 항균활성의 검정
<10-1> 이튜린 생합성능이 소실된 B. subtilis subsp. krictiensis 돌연변 이주의 제조
Cosmid 클론의 pJJ121E2 단편 내에 이튜린 생합성 유전자가 존재하는 것을 다시 확인하기 위하여, mini-TnlO을 이용한 상동재조합 (homologous recombination) 을 통해 염색체 상에 유전자를 삽입시켜 이튜린 생합성능이 소실된 돌연변이주를 11
49
제조하고자 하였다. 먼저 으로 절단된 pJJ121 단편이 pBC KS(+/-) 백터
(Stratagene)에 삽입되어 있는 pJJ121E2-2 클론으로부터 으로 절단하여 pTZ18 백터 (Promega)에 클로닝하고， Sail 부위는 제거하였다..
또한， 이 백터의 CM 부위에 pIC333 백터가 함유되어 있는 pl21E3(도 14) 클론으로부터 스펙티노마이신 (spectinomycin) 유전자가 함유된 부위를 1과 A I으로 절단하여， pTZ18 백터의 염기서열을 기초로 PCR을 이용하여 Cla\ 부ᅳ위를 붙인 후 다시 으로 절단하고， 스펙티노마이신 유전자를 삽빕시켜 pJJ121E2-l 백터를 제조한 후 B. subtilis subsp. krictiensis6^ 형질전환하였다. 이 때 B. subtil is subsp . krictiensis 내부에 들어간 mini-TnlO을 함유한 스펙티노마이신 유전자 부위는 바실러스 복제 개시점 replication origin)을 갖고 있지 않기 때문에 클론의 복제가 더 이상 이루어지지 않고 단지 유사한 부분들이 기주의 염색체와 상동재조합 (homologous recombination)을 통해 유전자의 삽입이 이루어지 기 때문에 염색체 상에 삽입된 변이주는 스펙티노마이신 함유 배지에서 선발하였다. 구체적으로, β. subtilis돌연변이 -10에는 0RF3의 16,430 bp부터 24,370 bp 부위까지 7,940 bp가 삽입되어 있고, 삽입되어 있는 부위 중 Cla I 부위인 21,046 bp에 스펙티노마이신이 삽입되어 있어 이류린 생합성이 일어나지' 않는 것으로 사료 되며ᅳ 형질전환 시 효율을 증대시키기 위하여 PJJ121E2— 1 백터의 /Ι 부위는 절단 하여 제거하였다. B. subtilis 돌연변이 -10에 삽입된 0RF3 중 소실된 부위는 도 14에 기재되어 있는 바와 같이 Sal\-Ec(Rl-Sa\\ site인 테 a?RI-5a/I site는 pJJ121E2 단편 유래이며， 전체적으로 소실된 염기배열의 크기는 8.41 kb(8,020~16,430bp)와 EcdRl site 좌측편에 백터 유래의 Sail 부위 (33 bp)까지 총 8.443 kb이다.
<10-2> B. subtilis돌연변이 -10의 항균력 측정
스펙티노마이신 함유 배지에서 선발된 변이주를 B. subtilis돌연변이 -10이 라 명명하고, 항진균 활성을 검정하기 위하여 B. subtilis subsp .
Figure imgf000051_0001
배양액과 돌연변이 -10의 배양액을 상기 항균력을 측정하는 <실시예 9>와 동일한 방 법으로 피검균 푸사리움 옥시스포럼 (v sa //ff oxysporum) 평판배지에 일정량을 로 딩하였다.
그 결과， 이튜린 생합성 유전자의 기능이 상실된 B. subtilis 돌연변이 -10 의 경우, 겨우 확인이 가능할 정도로 미미한 항진균 활성을 나타낸 반면, B. subtilis subsp . krictiensis는 강력한 항진균 활성올 나타내어， 확보한 유전자는 이튜린 생합성 유전자가 확실시되며， B. subtilis subsp . krictiensisA 나타내는 항균활성과 직접적인 관련이 있음을 확인할 수 있었다 (도 15).
<10-3>서던 혼성화를 이용한 스펙티노마이신 유전자의 삽입 확인
상기 실시예 <9-1> 에서 제조된 B. subtilis 돌연변이 -10에 스펙티노마이신 유전자가 염색체상에 삽입되었는지의 여부를 확인하기 위하여， Mini-TnlO을 함유하 고 있는 pIC333 백터를 함유하고 있는 pl21E3 클론으로부터 스펙티노마이신 (spectinomycin)을 함유하고 있는 부위를 I과 fel으로 절단한 후 얻은 스펙티 노마이신 함유 단편을 32P 동위원소로 표지하여 프로브로 제조한 후 서던 흔성화를 수행하였다. B. subtilis subsp. krict iensis쫘 B. subtilis 돌연변이 -10 균주로 부터 게놈 DNA를 추출한 후， C/al 제한효소를 이용하여 절단한 게놈 DNA와 스펙티 노마이신 유전자를 가지고 있는 P121E3 클론 유래의 ^/ΗΙ과 ¾I으로 절단한 스펙 티노마이신 단편을 동위원소로 표지한 프로브를 이용하여 서던 흔성화를 수행하였 다.
그 결과， 도' 16에 나타난 바와 같이 프로브로 이용한 스펙티노마이신 유전 자를 함유한 P121E3 클론을 ¾/? 과 ¾al으로 절단한 단편의 1.5 kb 위치에서 스펙 티노마이신 유전자가 존재하는 것을 확인할 수 있었으며， B. subtilis돌연변이ᅳ 10 균주에서도 스펙티노마이신 유전자가 pl21E3 클론 유래의 스펙티노마이신 단편과 동일한 위치에서 존재하는 것을. 확인할 수 있었다. 반면, B. subtilis subsp. krictiensis 균주에서는 스펙티노마이신 유전자가 존재하지 않았다 (도 16). 이러 한 결과로부터 실시예 <10-2>에서 B. subtilis 돌연변이ᅳ 10 균주가 항균력을 나타 내지 않은 것은 스펙티노마이신 유전자가 염색체 상에 삽입되어 이튜린이 생성되지 않았다는 것을 알 수 있었다.
【실시예 11】
B. subtilis subsp. krictiensis 균주와 B. subtilis 돌연변이— 10 돌연변이 주의 대사산물 분석
<11-1> HPLC를 이용한 대사산물 분석
B. subtilis subs . krictiensis균주와 B. subtilis돌연변이 -10 돌연변이 주의 배양액으로부터 이류린 항생물질 생성 유무에 차이가 나타나는 지를 규명하고 자 하였다. B. subtilis subsp . krictiensis 균주와 B. subtilis 돌연변이 -10 돌 연변이주의 배양액올 박막크라마토그래피 (Thinᅳ Layer Chromatography, TLC)에서 CHC13/MeOH/D.W. =75/25/5의 조건으로 전개시킨 후， 각 스팟들의 해당부분을 조제한 뒤, 고속액체크로마토그라피 (High performance liquid chromatography, HPLC)로 분 리하여 B. subtilis subsp. krictiensis균주와 B. subtilis돌연변이 -10 돌연변이 주 간의 이류린 생성 유무를 비교하였으며， 상업적으로 판매되고 있는 표준 화합물 인 이류린 A를 대조구로 사용하였다.
그 결과， B. subtilis subsp. krictiensis 균주와 표준물질인 이튜린 A에 대한 고속액체크로마토그라피 크로마토그램은 상당 부분 유사한 피크 형태를 나타 내고 있으나, B. subtilis 돌연변이 -10 균주에서는.이류린 A에 '해당되는 피크들이 전혀 검출되지 않아 (도 17), 상기 실시예 10-2에서 B. subtilis 돌연변이— 10 돌연 변이주가 푸사리움 옥시스포럼 0 sar/i/» oxysporum) 피검균에 항균력을 나타내지 않은 것은 염색체 상에 스펙티노마이신 유전자가 삽입되어 이튜린 합성이 전혀 일 어나지 않았다는 것을 알 수 있었다.
<11-2> LOMass를 이용한 대사산물 분석
상기 실시예 <10-1>에서 HPLC를 이용하여 관찰된 B. subtilis subsp. krictiensis유래의 크로마토그램들이 6 종류의 이튜린 A-F인지의 유무를 조사하기 위하여 LC-Mass를 이용하여 분자량을 조사하였다. HPLC로 분석한 결과 B. subtilis subs . krictiensis균주에서는 6종의 이튜린 A~F가 생산되는 것을 크로마토그램을 통해 확인할 수 있었으며 (도 18)， 이 때 .생산된 이튜린 화합물 A~F의 분자량을 Mass spectrometry를 이용하여 [M+Na]+로 분석한 결과 각각 이튜린 A~F의 분자량 (A: 1043， B-.1057, C: 1057， D: 1071， E: 1071, F: 1085)에 해당되는 피크가 검출 되었다. 이러한 LC-Mass의 결과로부터 B. subtil is subsp. krictiensis6^^ 존재 하나, B. subtilis돌연변이 -10 돌연변이주에는 존재하지 않는 피크들은 이튜린 A- F와 정확하게 일치하므로 (도 19, 20)， B. subtilis 돌연변이— 10 돌연변이주의 F. oxysporum 평판에서 항균력을 나타내지 않은 원인이 이튜린 화합물의 생산저해로 인한 것임을 재확인할 수 있었다.
이상의 결과를 종합하여 볼 때, 본 연구를 통해 확인한 0RF2-1과 2ᅳ 2 및 3 은 설팩틴 유전자와 74 ~ 98%의 유사성을 나타내었으나, 실제로 이 유전자가 암호 화하는 생산물은 설팩틴 (surf act in)이 아닌 이튜린임을 확인할 수 있었으며 , 이들 유전자는 현재까지 알려진 다른 이튜린 A 생합성 유전자와는 41 %의 낮은 유사성을 나타내고 있기 때문에， 본 실험에 이용된 B. subtilis subsp. krictiensis 균주의 이튜린 생합성 유전자는 현재까지 보고된 유전자와는 다른 형태의 새로운 유전자로 사료되었다 .

Claims

【청구의 범위]
【청구항 1】
서열번호 6으로 기재되는 염기서열을 갖는 이튜린 (iturin) 생합성 유전자 또는 상기 유전자에 대해 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 이튜린 생합성 유전자.
【청구항 2]
서열번호 6으로 기재되는 염기서열 및, 서열번호 3， 서열번호 5, 서열번호 7 및 서열번호 8로 기재되는 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 염기서열을 갖는 이튜린 생합성 유전자.
【청구항 3]
서열번호 6과 서열번호 5로 기재되는 염기서열을 갖는 이튜린 생합성 유전 자. '
【청구항 4】
서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 이튜린 생합성 유전자.
【청구항 5】
제 1항 내지 제 4항 중 어느 하나의 유전자에 의해 암호화되는 이튜린 단백 질. ■
【청구항 6】
서열번호 6으로 기재되는 염기서열을 포함하는 백터 .
【청구항 7】
서열번호 6으로 기재되는 염기서열， 및 서열번호 3， 서열번호 5， 서열번호 7 및 서열번호 8로 기재되는 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 염기서열을 포함하는 백터.
【청구항 8】
서열번호 6과 서열번호 5로 기재되는 염기서열을 포함하는 백터.
【청구항 9】
서열번호 1로 기재되는 염기서열을 포함하는 백터.
【청구항.10】
제 6항 내지 9항 중 어느 하나의 백터가 도입된 형질전환체.
【청구항 11]
제 10항의 형질전환체로부터 .생산된 이류린 단백질.
【청구항 12】
제 10항의 이튜린을 생산하는 형질전환체 또는 이의 배양액을 포함하는 생 물학적 방제제.
【청구항 13】
생물학적 방제제로 사용하기 위한， 제 10항의 형질전환체'또는 이의 배양액 .
【청구항 14]
' 생물학적 방제제로 사용하기 위한， 제 11항의 이튜린 단백질.
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