KR20120048211A

KR20120048211A - 길항미생물 바실러스 섭티리스로부터 신규 이튜린 생합성 유전자의 클로닝과 염기배열 결정 및 그 유전자의 특성

Info

Publication number: KR20120048211A
Application number: KR1020100109724A
Authority: KR
Inventors: 김성욱; 황인규; 박병근; 김성은; 문제선; 박호용; 손광희; 정태숙
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2010-11-05
Filing date: 2010-11-05
Publication date: 2012-05-15
Also published as: WO2012060572A9; WO2012060572A3; KR101411430B1; WO2012060572A2; US20130165635A1; US9068010B2

Abstract

본 발명은 신규 이튜린 생합성 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 바실러스 섭틸러스(Bacillus subtilis subsp. krictiensis ATCC 55079) 균주로부터 이튜린 생합성 유전자를 클로닝하고, 클로닝한 유전자가 이튜린 생합성 유전자인지의 여부를 확인한 후 염기배열을 결정하였으며, 이미 보고된 유전자와 비교분석하여 동정된 유전자는 기존에 보고된 유전자와는 다른 새로운 유전자라는 것을 확인함으로써, 신규 이튜린 생합성 유전자 및 이의 용도를 제공한다.

Description

길항미생물 바실러스 섭티리스로부터 신규 이튜린 생합성 유전자의 클로닝과 염기배열 결정 및 그 유전자의 특성{Cloning and determination of sequence of novel iturin biosynthetic genes from antagonistic microorganism Bacillus}

본 발명은 신규 이튜린 생합성 유전자에 관한 것으로, 구체적으로 바실러스 섭틸러스 균주 유래 신규한 이튜린 생합성 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.

생물학적 방제는 식물에 병해(病害)를 유발하는 병원성 미생물을 길항작용이 있는 다른 미생물을 이용하여 방제하는 것을 말하며 가장 대표적인 생물농약은 미생물 자체를 직접 이용하거나 미생물을 이용하여 각종 식물 병원균과 농작물에 해를 주는 곤충, 응애, 선충 등의 해충 및 잡초 등을 방제하는 데 주로 사용되고 있다. 이러한 생물학적 방제 연구는 1900년대 초부터 시작되어 그동안 많은 종류의 세균, 곰팡이를 이용하여 식물 병원균을 억제하려고 많은 노력을 기울여 왔다. 그러나 토양 속의 생태계가 복잡하고 식물체와 미생물 간에는 복잡한 상호 작용이 연관되어 있기 때문에 그동안 연구 결과들이 매우 미진하였으나, 최근 들어 식물체와 미생물 간의 상호작용들이 하나씩 밝혀지고 있고, 분자생물학 등 생명공학 기술의 발달로 인해 괄목할 만한 결과들이 발표되기 시작하여 현재 전 세계적으로 40여종의 생물학적 방제제가 개발되었고(H. D. Burges, Formulation of microbial biopesticides, Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, The Netherlands, p.187-202, 1998), 미국에서만 25종의 종류가 등록되어 상품화되었다(B. B. McSpadden Gardener, et al., Plant Health Progress〔Internet〕, May 10, 2002 〔cited Aug.13, 2010〕, Available from: http://www.plantmanagementnetwork. org/pub/php/review/biocontrol/).

등록된 대부분의 제품들이 토양 전염에 의해 발생하는 푸사리움속(Fusarium ), 피시움속( Pythium ), 라이족토니아속( Rhizoctonia ), 스클레로티니아속(Sclerotinia , Phytophthora ) 등에 대한 식물병 방제용이나, 이들 제품들은 아직 큰 시장을 점유하지 못하고 있는 실정이다. 지금까지 가장 성공적인 생물학적 방제의 예는 아그로박테리움 투메파시언스(Agrobacterium tumefaciens )에 의해 발병하는 과수 뿌리병인 근두암종병(crown gall)의 방제이다(A. Kerr, Plant Dis., 64: 25-30, 1980). 이 식물병은 화학합성 농약으로는 방제가 불가능하나 아그로박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter)가 생산하는 아그로신(agrocin)이라는 항생물질이 A. tumefaciens의 침입을 억제하는 것이 알려지게 되었고, 그 후 유전공학 기법을 이용하여 A. radiobacter를 개량한 몇 가지 제품이 개발되어 전 세계 시장의 상당 부분을 점유한 것으로 추측된다(제품명: Nogall, Norbac and Galltrol-A 등). 또 다른 성공 사례는 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)를 이용한 밀의 뿌리썩음병 방제 연구로 미국의 USDA와 Washington 주립대학 연구팀이(D. M. Weller, Annu. Rev. Phytopathol., 26: 379-407, 1988; D. M. Weller, et al., Can. J. Plant Pathol., 8: 328-334, 1986; R. J. Cook, Can. J. Plant. Pathol., 14: 76-85, 1992) 10여년에 걸친 연구를 통해 밀의 뿌리병을 야기하는 게우만노마이세스 그라미니스 아종 트리티시(Gaeumannomyces graminis var. tritici)에 강력한 길항작용을 나타내는 P. fluorescens 를 토양으로부터 분리하는 데 성공하였다. 이 길항 미생물을 밀의 종자에 처리하여 파종하였을 경우 밀의 수확량이 10 ~ 20% 증가함을 확인하였는데, 이러한 효과는 슈도모나스(Pseudomonas)가 생산하는 페나진(phenazine)계(L. S. Thomashow, et al., Appl. Environ. Microbiol., 56: 908-912, 1990; C. Keel, et al., Mol. Plant-Microbe Interact., 5: 4-13, 1992)와 2,4-플로로글루시놀(2,4-diacetyl phloroglucinol 항생물질(C. Keel, et al., Mol. Plant-Microbe Interact., 5: 4-13, 1992)에 의한 것으로 밝혀졌다. 8년에 걸친 포장 실험을 통해 드러난 살포시기와 지역에 따른 방제 활성의 차이점을 극복하기 위해 연구팀은 유전공학 기법을 도입하여 phenazine계 항생제 생산과 관련된 슈도모나스 종(Pseudomonas sp.)의 유전자 발현을 극대화하여 밀 뿌리 썩음병 방제 효과의 불규칙성을 극복하는 데 성공하였다(M. H. Ryder, et al., Improving plant productivity with Rhizobacteria, CSIRO Divisions of soils, Adelaide, South Australia, p.247-249, 1994).

바실러스 섭틸리스(B. subtilis) 균주는 여러 종류의 항생물질뿐만 아니라 각종 효소들을 생산하는 특징으로 인해 많은 연구자의 주목을 받아 왔고, 사카로마이세스 세레비제(S. cerevisiae ) 및 락토바실러스 종(Lactobacillus sp.) 등과 더불어 미국 식품의약국에 의해 인체 및 환경에 무해한 균주로 인정받고 있다. B. subtilis를 이용하여 개발된 미생물 제제로는 에픽(Epic), 코디악(Kodiak), 컴패니언(Companion), 하이스틱(HiStick) 및 세레나데(Serenade)등이 있으며, 이들은 주로 종자 처리제나 수확후(post-harvest) 및 야채 등의 부패 방지용으로 널리 쓰이고 있다(B. B. McSpadden Gardener, et al., Plant Health Progress〔Internet〕, May 10, 2002 〔cited Aug.13, 2010〕, Available from: http://www.plantmanagementnetwork.org/pub/php/ review/biocontrol/). 특히 2,000년대 초반에 아그라퀘스트 회사(AgraQuest Co.)에서 등록한 Serenade는 B. subtilis QST713 균주를 이용하여 생산되며 살균제(fungicide)와 항세균제(bactericide)로 25개국에 등록되었고, 현재 용도에 따라 다양한 제품들이 판매되고 있다. 또한 미국 USDA의 연구팀은 B. subtilis가 생산하는 이튜린 계열의 항생물질이 복숭아 복숭아나무잿빛무늬병(brown rot)의 병원균인 모닐리니아 프럭티콜라(Monilinia fructicola)를 억제하는 것을 발견하고 B. subtilis 균주를 과수저장 중 부패 방지제로 개발하려는 연구를 시도하였다(R. C. Gueldner, et al., J. Agric. Food Chem., 36: 366-370, 1988).

이외에 미국 USDA의 Dr. Pusey 연구팀은 B. subtilis가 많은 식물 병에 대해 억제효과가 있는 것을 발견하였으며(P. L. Pusey, et al., Pesticide Sci., 27: 133-140, 1989), Phae 등도 퇴비용 부숙 토양으로부터 식물 병원균에 광범위한 억제효과를 나타내는 B. subtilis NB22 균주를 분리하고 그 활성 성분이 이튜린계 물질임을 증명하였다(C. G. Phae, et al., J. Ferment. Bioeng., 69: 1-7, 1990). 이처럼 바실러스 균주가 생산하는 환상형 펩타이드 항생물질인 이튜린은 오래 전부터 생물학적 방제제로 널리 이용되어 왔으나 분자 수준에서 이튜린 생합성 유전자에 대한 분자 수준에서의 연구는 1990년에 일본 연구팀에서 J. Ferment. Bioeng.에 발표한 것을 제외하고는 거의 연구가 이루어지지 않았다.

이튜린(iturin) 이외에 다른 환상형 펩타이드인 설팩틴(surfactin) 생합성 유전자를 갖고 있는 B. subtilis 168 균주의 전체 유전자에 대한 염기배열이 1997년에 발표되었고(Kunst, F., et al., Nature, 390: 249-256, 1997), B. subtilis ATCC 6633 균주로부터 마이코섭틸린(mycosubtilin)의 생합성 유전자에 대한 연구 결과가 1990년대 후반 독일 연구팀에서 보고하였다(E. H. Duitman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 96: 13294-13299, 1999). 그 이후 2,000년대에 들어오면서 일본 연구팀에 의해 B. subtilis RB14 균주로부터 이튜린 A 유전자의 클로닝과 염기배열 및 그 특징에 대해 발표되었다(K. Tsuge, et al., J. Bacteriol., 183: 6265-6273, 2001). 또한, 독일 연구팀에서는 식물의 생장을 촉진하면서 동시에 식물 병원균을 억제하는 B. amyloliquefaciens FZB42 균주가 이차 대사산물로 환상형 펩타이드인 설팩틴, 펜지신(fengycin) 및 바실로마이신 D(bacillomycin D)를 생산하는 것을 발견하고, 생산되는 이차 대사산물들의 유전자 구조와 기능적인 특성을 분자 수준에서 규명하고 보고하였다(A. Koumoutsi, et al., J. Bacteriol., 186: 1084-1096, 2004). 이외에도 상기의 독일 연구팀에서는 B. amyloliquefaciens FZB42 균주가 상기 3종류의 환상형 펩타이드 이외에 폴리케니드(polyketide)계 항생물질인 마크로락틴(macrolactin), 바실래인(bacillaene) 및 디피시딘(difficidin)을 생산한다고 보고하였다(Chen, et al., Nature Biotechnol., 25: 1007-1014, 2007). 이와 같이 다양한 환상형 펩타이드 항생물질에 대한 보고는 간헐적으로 이루어지고 있으나, 다양한 종류의 이튜린 생합성 유전자에 대한 보고는 거의 없는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 국내 토양에서 분리한 다양한 식물 병원균에 효과적이며, 6종류의 이튜린(iturin A-F)을 생산하여 1992년도에 미국 특허를 획득한 B. subtilis subsp. krictiensis ATCC 55079 균주(S. H. Bok, et al., 미국 특허 등록번호 5,155,041, 1992. 10. 13)로부터 이튜린 생합성 유전자를 클로닝하였고, 유전자의 염기배열을 결정하여 이튜린 생합성 유전자를 동정하고 그 특성을 분석하였으며, 상기 이튜린 생합성 유전자는 종래의 이튜린 유전자와 염기서열에서 많은 차이를 나타내고 있는 신규한 이튜린 생합성 유전자임을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 신규한 이튜린 생합성 유전자, 상기 유전자가 암호화하는 단백질 및 이들의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명은 서열번호 6으로 기재되는 염기서열을 갖는 이튜린 생합성 유전자 또는 상기 유전자에 대해 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 이튜린 생합성 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 6과 서열번호 5로 기재되는 염기서열을 갖는 이튜린 생합성 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 6과 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 이튜린 생합성 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 6과 서열번호 7로 기재되는 염기서열을 갖는 이튜린 생합성 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 6과 서열번호 8로 기재되는 염기서열을 갖는 이튜린 생합성 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 6, 서열번호 3 및 서열번호 7로 기재되는 염기서열을 갖는 이튜린 생합성 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 6, 서열번호 3 및 서열번호 8로 기재되는 염기서열을 갖는 이튜린 생합성 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 기재되는 염기서열을 갖는 이튜린 생합성 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 이튜린 생합성 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 유전자에 의해서 암호화되는 이튜린 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 이튜린 생합성 유전자의 염기서열을 포함하는 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 이튜린 생합성 유전자의 염기서열을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.

또한, 본 발명에 따른 형질전환체에 의해서 생성된 이튜린 단백질을 제공한다.

아울러, 본 발명은 본 발명에 따른 이튜린 단백질을 생산하는 형질전환 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 생물학적 방제제를 제공한다.

상술한 바와 같이, 본 발명에서 기술한 6종류의 이튜린을 생산하는 B. subtilis 균주로부터 이튜린을 생합성하는 유전자의 클로닝과 염기서열 결정 및 항균력 검정을 통해 이튜린을 생합성하는 유전자라는 것을 확인하였다. 또한 돌연변이주와 기기분석을 통해 대사산물이 이튜린이라는 것을 재확인하였으며, 기존에 보고된 유전자와는 다른 새로운 유전자라는 것을 확인하였다. 이러한 사실을 토대로 이튜린 생합성 유전자를 이용하여 항균활성이 증진된 균주의 개량을 통해 생물학적 방제제로 활용 가능할 것으로 사료되며, 다른 한편으로는 이 유전자를 다른 생물학적 방제 활성을 나타내는 세균에 형질전환시켜 새로운 균주 개발에 응용 가능할 것으로 사료된다.

도 1은 B. subtilis subsp. krictiensis ATCC 55079와 B. subtilis 168 균주로부터 얻은 PCR 산물을 확인한 전기영동 사진이다:
1번 레인: 1kb 래더;
2번 레인: B. subtilis 168 균주에서 SrfB 7과 SrfB 8 프라이머를 이용하여 획득한 PCR 산물(설팩틴 유전자의 산물);
3번 레인: B. subtilis subsp. krictiensis 균주에서 SrfB 7과 SrfB 8 프라이머를 이용하여 획득한 PCR 산물(이튜린 유전자 산물로 추정됨);
4번 레인: B. subtilis 168 균주에서 SrfB 9과 SrfB 10 프라이머를 이용하여 획득한 PCR 산물(설팩틴 유전자 산물); 및
5번 레인: B. subtilis subsp. krictiensis 균주에서 SrfB 9과 SrfB 10 프라이머를 이용하여 획득한 PCR 산물(이튜린 유전자 산물로 추정됨);
도 2는 B. subtilis subsp. krictiensis 균주에서 SrfB 9과 SrfB 10 프라이머를 이용하여 획득한 아미노산 서열과 설팩틴 및 리케니신(lichenysin) 생합성 유전자의 아미노산 서열을 CLUSTAL W를 이용하여 비교분석한 그림이다:
1번: B. subtilis subsp. krictiensis 균주에서 SrfB 9과 SrfB 10 프라이머를 이용하여 획득한 PCR 산물의 아미노산 서열(이튜린 유전자의 아미노산 서열로 추정됨);
2번 ~ 4번: 설팩틴 생합성 유전자의 3개의 다른 도메인의 아미노산 서열; 및
5번: 리케니신(lichenysin) 생합성 유전자의 아미노산 서열.
도 3은 B. subtilis subsp. krictiensis 균주에서 SrfA 5과 SrfA 6 프라이머를 이용하여 획득한 0.4 kb의 PCR 산물에 대한 유전자 염기서열 및 펩타이드 서열을 나타낸 그림이다.
도 4는 B. subtilis subsp. krictiensis 균주에서 SrfA 5과 SrfA 6 프라이머를 이용하여 획득한 0.4 kb의 PCR 산물에 대한 아미노산 서열과 다른 균주들의 아미노산 서열을 CLUSTAL W를 이용하여 비교분석한 그림이다:
1번: Cuphea lanceolata 식물체의 아실 운반 단백질(acyl carrier protein) 환원 효소의 아미노산 서열;
2번: Bacillus subtilis 균주의 아실 운반 단백질 환원 효소의 아미노산 서열; 및
3번: Salmonella typhimurium 균주의 아실 운반 단백질 환원 효소의 아미노산 서열;
4번: Deinococcus radiodurans 균주의 아실 운반 단백질 환원 효소의 아미노산 서열; 및
5번: B. subtilis subsp. krictiensis 균주에서 SrfA 5과 SrfA 6 프라이머를 이용하여 획득한 PCR 산물의 아미노산 서열.
도 5는 B. subtilis subsp. krictiensis 균주의 게놈 라이브러리 스크리닝 결과를 나타낸 그림이다:
도 5의 A는 콜로니 혼성화(colony hybridization)결과를 나타낸 그림이다;
도 5의 B는 콜로니 혼성화를 통해서 얻은 코스미드 클론의 DNA를 EcoRI으로 절단한 아가로스(agarose) 전기영동을 행한 결과이다; 및
도 5의 C는 서던 혼성화 결과를 나타낸 그림으로 2개의 클론에서 동위원소로 표지한 프로브 DNA와 상동성을 나타낸 결과이다.
도 6은 게놈 라이브러리 스크리닝을 통해 얻은 Cosmid 클론의 제한효소 지도이다.
도 7은 A 내지 F는 B. subtilis subsp. krictiensis와 B. subtilis 168 균주에서 게놈 라이브러리 스크리닝을 통해 얻은 pJJ815와 pJJ121 클론을 EcoRI 효소를 이용하여 절단시킨 단편을 65℃에서 혼성화(hybridization) 반응을 수행 결과를 나타낸 그림이다:
1번 레인: HindIII로 절단한 람다(lambda) DNA;
2번 레인: B. subtilis subsp. krictiensis 균주의 게놈 DNA;
3번 레인: B. subtilis 168 균주의 게놈 DNA; 및
4번 레인: 프로브 DNA.
도 8은 A 내지 F는 B. subtilis subsp. krictiensis와 B. subtilis 168 균주에서 게놈 라이브러리 스크리닝을 통해 얻은 pJJ815와 pJJ121 클론을 EcoRI 효소를 이용하여 절단시킨 단편을 50℃에서 혼성화(hybridization) 반응을 수행 결과를 나타낸 그림이다:
1번 레인: HindIII로 절단한 람다(lambda) DNA;
2번 레인: B. subtilis subsp. krictiensis 균주의 게놈 DNA;
3번 레인: B. subtilis 168 균주의 게놈 DNA; 및
4번 레인: 프로브 DNA.
도 9는 게놈 라이브러리 스크리닝을 통해 B. subtilis subsp. krictiensis 균주로부터 얻은 이튜린 생합성 유전자의 구성도를 나타낸 것이다:
ORF1: 전사조절자;
ORF2-1: Itu A-1;
ORF2-2: Itu A-2;
ORF3: Itu B;
ORF4: Itu C;
ORF5: Itu D; 및
OFR6: 아스파레이트 트랜스아미네이즈-유사 단백질(Asparate tranaminase- like protein).
도 10은 표준 화합물인 이튜린과 설팩틴의 항균력을 비교한 그림이다.

도 11은 B. subtilis subsp. krictiensis , B. subtilis 168, B. subtilis JH642, 및 B. subtilis C9 균주를 이용하여 3종류의 피검균에 대한 항균력을 비교한 그림이다:
Wild type: 이튜린을 생산하는 B. subtilis subsp. krictiensis 균주;
B. subtilis 168: 설팩틴 유전자를 가지고 있으나, 설팩틴을 생성하지 않는 섭틸리스 균주;
B. subtilis JH642: 이튜린과 설팩틴 모두를 생산하지 않는 섭틸리스 균주; 및
B. subtilis C9: 설팩틴과 이튜린을 모두 생산한다고 추정되는 섭틸리스 균주.
도 12는 Cosmid 클론의 EcoRI 단편과 이 단편을 함유한 벡터의 제작을 나타낸 것이다.
도 13은 Cosmid 클론으로부터 유래된 여러 EcoRI 단편을 함유한 B. subtilis subsp. krictiensis 형질전환주들의 항균력을 비교한 그림이다:
1: pBT1 단편; Cosmid pJJ121의 SmaI과 EcoRI으로 절단한 단편
2: pBT3 단편; Cosmid pJJ815의 EcoRI 단편
3: pBT6 단편; Cosmid pJJ121의 EcoRI 단편 및
4: 형질전환하지 않은 B. subtilis subsp. krictiensis 균주.
도 14는 Iturin 생합성능이 소실된 돌연변이주를 제조하기 위한 벡터의 제작을 나타낸 도식이다.

도 15는 이튜린을 생산하는 B. subtilis subsp. krictiensis 균주와 이튜린 생산능이 소실된 돌연변이주의 Fusarium oxysporum에 대한 항균력을 비교한 그림이다.
도 16은 돌연변이주 내에 삽입된 스펙티노마이신(spectinomycin)이 염색체상에 삽입되었는지의 여부를 조사한 서던 혼성화(Southern hybridization) 결과를 나타낸 것이다:
1번 레인: 1kb 래더;
2번 레인: B. subtilis subsp. krictiensis 균주의 게놈 DNA를 ClaI으로 절단시킨 단편;
3번 레인: B. subtilis subsp. krictiensis 돌연변이-10 균주의 게놈 DNA를 ClaI으로 절단시킨 단편; 및
4번 레인: BamHI과 XbaI으로 절단한 p121E3 벡터.
도 17은 B. subtilis subsp. krictiensis와 이튜린이 소실된 돌연변이주로부터 생산된 이튜린 생성 여부를 HPLC를 이용하여 조사한 크로마토그램이다.
도 18은 B. subtilis subsp. krictiensis 균주가 생산하는 6종의 이튜린을 HPLC로 분석한 크로마토그램이다:
A: Iturin A;
B: Iturin B;
C: Iturin C;
D: Iturin D;
E: Iturin E; 및
F: Iturin F.
도 19는 B. subtilis subsp. krictiensis가 생산하는 6 종류의 이튜린 중 이튜린 A 내지 C를 생산하는 지의 여부를 LC-Mass를 이용하여 분석한 결과이다.
도 20은 B. subtilis subsp. krictiensis가 생산하는 6 종류의 이튜린 중 이튜린 D 내지 F를 생산하는 지의 여부를 LC-Mass를 이용하여 분석한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 6으로 기재되는 염기서열을 갖는 이튜린 생합성 유전자 또는 상기 유전자에 대해 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 이튜린 생합성 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 암호화되는 이튜린 단백질을 제공한다.

상기 이튜린 생합성 유전자에 있어서, 서열번호 6으로 기재되는 염기서열은 이튜린 생합성 유전자의 ORF 3을 포함하는 것이 바람직하며, 상기 이튜린 유전자에 의해서 암호화되는 단백질은 종래의 알려진 이튜린 생합성 단백질인 것이 바직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 신규한 이튜린(iturin) 생합성 유전자를 동정하고자 우선, 설팩틴(surfactin)을 생성하나, 이튜린(iturin)은 생성하지 않은 것으로 알려진 B. subtilis 168 균주를 이용하였다. 설팩틴과 이튜린은 7개의 아미노산과 지방산으로 이루어진 환상형 리포펩타이드 항생물질로써, 아미노산의 조성과 연결된 순서만이 서로 상이하고 분자량도 유사하다고 알려져 있다. 또한 설팩틴 유전자의 크기가 32 kb나 될 정도로 매우 크기 때문에, 이튜린 유전자의 크기도 이와 유사할 것으로 생각하고, 상기 두 항생물질이 처음부터 서로 다른 생합성 경로로 합성되기보다는 어느 단계까지는 동일한 생합성 경로로 합성되다가 일정한 단계부터 서로 다른 생합성 경로로 합성될 것으로 추정하였다. 왜냐하면 B. subtilis 균주 중 일부는 이튜린과 설팩틴을 동시에 생산한다고 알려진 균주도 있기 때문에, 두 유전자의 크기를 감안하면 각각의 유전자가 별개로 존재할 가능성은 낮을 것으로 판단하였다. 즉, 설팩틴과 이튜린 각각의 유전자 크기를 고려해볼 때 특히 두 항생물질이 생합성되는 과정 중 펩타이드가 고리화(cyclization)되는 과정과 펩타이드와 지방산이 연결되는 아실화(acylation) 과정은 설팩틴과 이튜린이 동일한 생합성 경로를 이용할 것으로 추정하였다. 이러한 추정을 토대로 Bacillus genome project에 이용된 B. subtilis 168 균주에 대한 데이타 베이스로부터 설팩틴 생합성 유전자를 확보하고, DNA 상동성(homology)을 이용한 방법으로 B. subtilis subsp. krictiensis 균주로부터 이튜린 생합성 유전자를 클로닝하였다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, B. subtilis 168 균주 및 B. subtilis subsp. krictiensis 균주의 염색체 DNA를 주형으로 삼고, PCR 및 전기영동을 행하여 B. subtilis 168 균주와 B. subtilis subsp. krictiensis 균주로부터 얻은 각각의 유전자 산물 중에서 동일한 크기의 약 1.8 kb에 해당하는 DNA 단편을 B. subtilis subsp. krictiensis 균주로부터 획득하였다(도 1 참조).

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 B. subtilis subsp. krictiensis 균주로부터 획득한 DNA 단편에 대한 아미노산 서열을 NCBI 데이타 베이스를 이용하여 다른 펩타이드 생합성 유전자의 아미노산들과 비교한 결과, 서로 다른 3개의 설팩틴 생합성 유전자와 82~85%의 상동성을 나타내었고, B. licheniformis 균주가 생산하는 리케니신(lichenysin) 생합성 유전자와도 80%의 상동성을 나타냈다.

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 펩타이드와 지방산을 연결하는 아실화(aylation) 과정에 관여하는 유전자를 클로닝하기 위하여 고안한 20 여종의 프라이머를 이용하여 PCR을 행하고 얻은 약 0.4 kb의 DNA 단편에 대한 염기배열을 결정하고(도 3 참조), 아미노산을 비교분석하기 위하여 NCBI 데이타 베이스를 탐색한 결과 이 유전자 산물은 다른 미생물에서 유래된 아실 전달체 단백질 환원 효소와 56 ~ 83%의 상동성을 나타냈다(도 4 참조). 특히 다른 B. subtilis 균주에서 유래된 아실 전달체 단백질 환원효소와는 83%의 상동성을 나타내어 B. subtilis subsp. krictiensis 균주의 게놈 라이브러리 스크리닝 시에도 활용 가능할 것으로 사료되었다.

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, B. subtilis subsp. krictiensis 균주의 게놈 라이브러리로부터 이튜린 생합성 유전자를 클로닝하기 위하여, B. subtilis subsp. krictiensis 균주의 게놈 DNA를 Sau3A 제한효소를 이용하여, 부분절단(partial digestion)한 후, 20 ~ 30 kb 크기의 DNA 단편을 Cosmid 벡터인 pLARF3에 삽입한 후, 이를 E. coli HB101에 형질전환시켜, 게놈 라이브러리를 제조하였다. 상기 제조된 B. subtilis subsp. krictiensis 균주의 게놈 라이브러리와, 상기 실시예 <3-1>에서 클로닝한 1.8 kb의 펩타이드 생합성 유전자를 프로브로 이용하여, 콜로니 혼성화(colony hybridization)와 서던 혼성화(Southern hybridization)를 수행하였다. 그 결과, 27 kb와 32 kb의 위치에서 상기 프로브 DNA와 상동성을 나타낸 2개의 클론들을 관찰할 수 있었으며, 이를 각각 pJJ815와 pJJ121로 명명하였다(도 5 참조).

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, Cosmid 클론들을 여러 종류의 제한효소로 절단하여 서로 중복된 부분을 제외하고 제한효소 지도를 작성한 후 일부 단편에 대한 염기배열을 조사한 결과 pJJ121의 일부 단편은 설팩틴 합성효소 I, 타이로신 합성효소 II, 그라미시딘(gramicidine) S 합성효소 I 및 펩타이드 합성효소 2와 57-90%의 상동성을 나타내었다. 상기 결과로부터 본 발명자들은 두 Cosmid 클론 내에는 이튜린 생합성 과정 중 펩타이드 합성과 관련된 일부 유전자자 포함되어 있다고 추정하였다.

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 Cosmid 클론 내의 유전자들이 이튜린 생합성에 관여하는 유전자인지 설팩틴 합성에 관여하는 유전자인지의 여부를 확인하기 위하여 이튜린을 생산하는 B. subtilis subsp. krictiensis 균주와 B. subtilis 168 균주의 염색체 DNA를 이용하여, 50℃와 65℃에서 서던 혼성화를 수행하였다. 이때 사용한 프로브 DNA는 Cosmid 클론인 pJJ121과 pJJ815 균주를 EcoRI으로 절단하여 얻은 6개의 EcoRI 단편들을 서브클로닝한 단편들을 프로브로 제조하여 이용하였다. 그 결과, 65℃에서는 상기 프로브에 대하여 B. subtilis subsp. krictiensis 균주는 6개의 EcoRI 단편 모두에 대하여 상동성을 나타냈으나, B. subtilis 168 균주에서는 6개의 EcoRI 단편 모두에 대해 상동성을 나타내지 않았다. 이러한 결과는 50℃에서 서던 혼성화를 수행하였을 때도 동일하였으며, 다만 B. subtilis 168 균주에서 pJJ121E3 단편이 미약한 반응을 나타냈다. 따라서, Cosmid 클론 내의 유전자들이 설팩틴 생합성 유전자들과는 거의 유사성을 나타내지 않아 이튜린 생합성에 관여하는 유전자일 가능성이 클 것으로 추정되었다(도 7 및 도 8 참조).

본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 두 개의 Cosmid 클론으로부터 클로닝한 EcoRI 단편들을 이용하여 양방향 염기배열을 결정하여 21,253 bp를 확보하였으나, 일부 유전자가 누락되어 있는 것을 발견하고 누락된 부분의 염기배열을 추가로 확보하기 위하여 게놈 라이브러리 스크리닝을 통해 유전자를 확보하고 염기배열을 결정하여 총 37,682 bp의 염기배열을 확보하였으며, 염기배열 내에서 이튜린 생합성에 관여할 것으로 추정되는 7개의 ORF가 발견되었다(도 9 참조). Cosmid 클론의 이튜린 생합성에 관여할 것으로 추정되는 7종의 ORF 각각을 다른 환상형 리포펩타이드 생합성 유전자와 비교한 결과 B. subtilis 유래의 설팩틴 유전자와는 76 ~ 86%의 유사성을 나타낸 반면 B. amyloliquefaciens 유래의 설팩틴 유전자와는 92 ~ 100%의 유사성을 나타내었다. 특히 iturin 생합성에 직접적으로 관여할 것으로 추정되는 ORF 2-1(543 bp)과 2-2(9,927bp) 및 ORF3(10,757 bp)는 B. amyloliquefaciens 균주 유래 설팩틴 유전자와 각각 92 ~ 98%의 유사성을 나타내었다(표 1 참조). 표 1에 열거한 균주 중 CP000560.1 번호로 시작되는 B. amyloliquefaciens FZB42 균주와는 ORF 2-1의 유사성이 94%를 나타낸 반면 전체 염기서열(37,682 bp)을 비교해보면 98%의 유사성을 나타내었다. 그러나 이 균주는 환상형 펩타이드인 설팩틴, 펜지신(fengycin) 및 바실로마이신 D(bacillomycin D)를 생산하고(Chen, et al., Nature Biotechnol., 25: 1007-1014, 2007), 이튜린은 생산하지 않는 것으로 보고되었으므로, 본 발명자들은 상기 코스미드 클론의 ORF 2-1 과 2-2 및 OFR3을 신규한 이튜린 생합성 유전자일 것으로 추정하였다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 이튜린과 설팩틴의 항균 능력을 벼의 도열병 원인균인 마그나포르테 그리시아(Magnaporthe grisea)와 무좀균인 트리코피톤 멘타그로파이트(Trichophyton mentagrophytes) 및 가지과 식물의 시들음병 원인균인 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum) 3 종류의 피검균에 대하여 측정하였다. 그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 표준화합물인 이튜린 A와 설팩틴은 마그나포르테 그리시아와 트리코피톤 멘타그로파이트에 대하여 항균력을 나타낸 반면, 푸사리움 옥시스포럼 균에 대해 이튜린은 항균 활성을 나타냈으나, 설팩틴은 항균활성을 나타내지 않았다(도 10).

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 이튜린 또는 설팩틴을 생산하는 바실러스 균주의 배양 상등액을 이용하여 항균능력을 측정한 결과, 이튜린을 생산하는 B. subtilis subsp. krictiensis 균주는 표준 화합물을 이용한 항균력 측정결과와 동일하게, 마그나포르테 그리시아, 트리코피톤 멘타그로파이트 및 푸사리움 옥시스포럼에 대하여 항균활성을 나타냈으나, 항생물질을 생산하지 않는 B. subtilis JH642 균주와 B. subtilis 168 균주에서는 상기 피검균주에 대하여 항균활성이 나타나지 않았으며, 설팩틴과 이튜린을 모두 생산하는 균주로 추정되는 B. subtilis C9 균주에서는 이튜린의 항균 효과가 나타나는 푸사리움 옥시스포럼에 대하여 항균효과를 나타냈다. 이러한 결과를 토대로 본 발명자들을 이튜린 돌연변이주 선발 시 피검균으로 푸사리움 옥시스포럼을 이용하기로 결정하였다(도 11 참조).

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 Cosmid 클론의 단편을 B. subtilis subsp. krictiensis 균주에 형질전환시킨 후(도 12 참조), 푸사리움 옥시스포럼에 대한 항균력을 관찰하였다. 그 결과, pBT6(ORF 2-2와 ORF 3를 포함) 단편이 형질전환된 B. subtilis subsp. krictiensis 균주에서 푸사리움 옥시스포럼에 대한 항균력이 가장 크게 나타났다(도 13 참조).

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서 이튜린 생합성에 관련되는 Cosmid 클론의 단편 중 pBT6가 이튜린 합성에 관여하는 부위임을 확인하기 위하여, pBT6 단편이 포함되어 있는 pJJ121E2 단편을 pTZ18 벡터에 클로닝하고, 스펙티노마이신(spectinomycin) 저항성 유전자를 갖고 있는 p121E3 벡터를 BamHI과 XbaI으로 절단하고 PCR을 이용하여 ClaI 부위를 부착한 후 ClaI으로 절단하였다. 다시 ClaI으로 절단한 스펙티노마이신 유전자를 함유한 단편을 pJJ121E2 단편이 삽입된 pTZ18 벡터의 ClaI 부위에 삽입시키고, SalI 부위는 제거시켜 pJJ121E2-1 벡터를 제조한 후, B. subtilis subsp. krictiensis 균주에 형질전환시켜(B. subtilis subsp. krictiensis 돌연변이-10), 이튜린 생합성 능력이 소실되었는지의 여부를 확인하고자 하였다(도 14 참조). 그 결과, 푸사리움 옥시스포럼 균에 대하여 B. subtilis subsp. krictiensis 균주는 강력한 항균력을 나타낸 반면, B. subtilis subsp. krictiensis 돌연변이-10은 항균력이 현저하게 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 15 참조). 또한, 도 16에 나타난 바와 같이, 서던 혼성화를 통하여 B. subtilis subsp. krictiensis 돌연변이-10 균주의 염색체 내에, 스펙티노마이신 저항성 유전자가 삽입된 것을 확인할 수 있었다(도 16 참조).

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서 B. subtilis subsp. krictiensis 균주와 B. subtilis subsp. krictiensis 돌연변이-10 균주의 대사산물을 HPLC 분석방법을 이용하여 분석한 결과, B. subtilis subsp. krictiensis 균주와 상업적으로 판매되고 있는 표준 화합물인 이튜린 A에서는 관찰되는 피크가 동일한 반면 B. subtilis subsp. krictiensis 돌연변이-10 균주에서는 이튜린 A 피크가 관찰되지 않았으며 (도 17), 또한 이를 LC-Mass를 이용하여 분자량을 확인한 결과, B. subtilis subsp. krictiensis 균주에서는 관찰되었으나 B. subtilis subsp. krictiensis 돌연변이-10 돌연변이 균주에서는 관찰되지 않는 피크들이 이튜린 A 내지 F와 정확하게 일치되는 것을 확인할 수 있었다(도 18 내지 20 참조).

즉, 본 발명자들은 B. subtilis subsp. krictiensis 균주로터 유래한 이튜린 생합성 유전자를 클로닝하고, 상기 클로닝한 유전자의 서열을 분석하여 종래의 알려진 환상형 리포펩타이드 생합성 유전자들과 서열이 상이한 신규한 이튜린 생합성 유전자임을 확인하였다.

또한, 본 발명은 서열번호 6과 서열번호 5로 기재되는 염기서열을 갖는 이튜린 생합성 유전자, 또는 상기 이튜린 생합성 유전자에 의해서 암호화되는 이튜린 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 6과 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 이튜린 생합성 유전자, 또는 상기 이튜린 생합성 유전자에 의해서 암호화되는 이튜린 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 6과 서열번호 7로 기재되는 염기서열을 갖는 이튜린 생합성 유전자, 또는 상기 이튜린 생합성 유전자에 의해서 암호화되는 이튜린 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 6과 서열번호 8로 기재되는 염기서열을 갖는 이튜린 생합성 유전자, 또는 상기 이튜린 생합성 유전자에 의해서 암호화되는 이튜린 단백질을 제공한다.

상기 이튜린 생합성 유전자에 있어서, 서열번호 6으로 기재되는 염기서열은 이튜린 생합성 유전자의 ORF 3을 포함하는 것이 바람직하며, 서열번호 3으로 기재되는 염기서열은 ORF 2를 포함하는 것이 바람직하며, 서열번호 5로 기재되는 염기서열은 ORF 2의 일부인 ORF 2-2 부분을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 서열번호 6으로 기재되는 이튜린 생합성 유전자에 의해서 암호화되는 단백질은 서열번호 14로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하며, 서열번호 3으로 기재되는 이튜린 생합성 유전자에 의해서 암호화되는 단백질은 서열번호 11로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하며, 서열번호 5로 기재되는 이튜린 생합성 유전자에 의해서 암호화되는 단백질은 서열번호 13으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 상기 이튜린 생합성 유전자에 있어서, 서열번호 7로 기재된 염기서열은 이튜린 생합성 유전자의 ORF 4 부분을 포함하는 것이 바람직하며, 서열번호 8로 기재되는 염기서열은 이튜린 생합성 유전자의 ORF 5 부분을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 서열번호 7로 기재되는 이튜린 생합성 유전자에 의해서 암호화되는 단백질은 서열번호 15로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하며, 서열번호 8로 기재되는 염기서열에 의해서 암호화되는 단백질은 서열번호 16으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기, 서열번호 3으로 기재되는 염기서열은 이튜린 생합성 유전자의 ORF 2 전체의 염기서열인 것을 특징으로 하며, 본 발명자들은 이튜린 생합성 유전자를 암호화하는 특정 부위를 확인하고자, ORF 2 부위를 나누어, ORF 2-1(서열번호 4)와 ORF 2-2(서열번호 5)로 나누어 실시예에 이용하였다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 이튜린 생합성 유전자를 다른 환상형 리포펩타이드 생합성 유전자의 아미노산과 비교한 결과, 이튜린 전체 유전자의 크기에 대하여 유의한 차이를 나타냈다. 이에, 본 발명자들은 이튜린 생합성 유전자를 구성하는 ORF를 포함하는 단편을 제조하여, 이튜린 생합성 단백질에 관여하는 부위를 규명하고자 실험한 결과, ORF 2-2의 단편과 ORF 3의 염기서열을 포함한 벡터를 이용하였을 때, 이튜린 단백질의 항균력이 상승됨을 확인함으로써, 이튜린 생합성에 관여하는 유전자를 규명하였다.

또한, 본 발명은 서열번호 6, 서열번호 3 및 서열번호 7로 기재되는 염기서열을 갖는 이튜린 생합성 유전자, 또는 상기 이튜린 생합성 유전자에 의해서 암호화되는 이튜린 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 기재되는 염기서열을 갖는 이튜린 생합성 유전자, 또는 상기 이튜린 생합성 유전자에 의해서 암호화되는 이튜린 단백질을 제공한다.

상기 이튜린 생합성 유전자의 서열번호 6으로 기재되는 염기서열은 이튜린 생합성 유전자의 ORF 3 부위의 염기서열을 포함하는 것이 바람직하며, 서열번호 3으로 기재되는 염기서열은 이튜린 생합성 유전자의 ORF 2 부위의 염기서열을 포함하는 것이 바람직하며, 서열번호 7로 기재되는 염기서열은 이튜린 생합성 유전자의 ORF 4로 기재되는 염기서열을 포함하는 것이 바람직하며, 서열번호 8로 기재되는 염기서열은 이튜린 생합성 유전자의 ORF 5 부위의 염기서열을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 이튜린 단백질을 생성할 수 있는 이튜린 생합성 내의 유전자 염기서열이라면 모두 포함될 수 있다.

상기 이튜린 생합성 유전자에 의해서 암호화되는 단백질에 있어서, 서열번호 6으로 기재되는 이튜린 생합성 유전자에 의해서 암호화되는 단백질은 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하며, 서열번호 3으로 기재되는 이튜린 생합성 유전자에 의해서 암호화되는 단백질은 서열번호 11로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하며, 서열번호 7로 기재되는 이튜린 생합성 유전자에 의해서 암호화되는 단백질은 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하며, 서열번호 8로 기재되는 이튜린 생합성 유전자에 의해서 암호화되는 단백질은 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 이튜린 단백질을 생성할 수 있는 이튜린 생합성 내의 유전자 염기서열이라면 모두 포함될 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 이튜린 생합성 유전자, 또는 상기 이튜린 생합성 유전자에 의해서 암호화되는 이튜린 단백질을 제공한다.

상기 이튜린 생합성 유전자에 있어서, 서열번호 1로 기재되는 염기서열은 도 9에 나타난, 이튜린 생합성 유전자에 포함되어 있는 7개의 ORF 1 내지 6의 염기서열을 포함하고 있는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 염기서열은 종래의 이튜린 생합성에 관여하는 유전자와 비교하였을 때, 유의한 차이를 나타냄으로써, 신규한 이튜린 생합성 유전자임을 본 발명자에 의해서 밝혀졌으며, 이튜린 생합성 유전자를 구성하고 있는 ORF 중, ORF 2의 일부(ORF 2-2)와 ORF3을 포함하는 단편을 포함한 형질전환체의 항균력이 가장 많이 증가하였으며, 이 외의 다른 ORF를 포함하고 있는 단편을 포함한 형질전환체의 항균력을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명자들은 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 신규한 이튜린 생합성 유전자를 규명하였다.

상기 벡터에 포함되는 이튜린 생합성 유전자의 염기서열은 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 이튜린 생합성 유전자를 포함하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 서열번호 6, 3, 및 7의 염기서열을 포함하는 유전자, 서열번호 6, 3, 및 8의 염기서열을 포함하는 유전자, 또는 서열번호 6, 7, 및 8의 서열을 포함하는 유전자이며, 더욱 바람직하게는 서열번호 6과 5로 기재되는 염기서열을 갖는 유전자, 서열번호 6과 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 유전자, 서열번호 6과 7로 기재되는 염기서열을 갖는 유전자, 또는 서열번호 6과 서열번호 8로 기재되는 염기서열을 갖는 유전자를 포함하는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 서열번호 6으로 기재된 유전자, 또는 상기 유전자에 대해 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 이튜린 생합성 유전자를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 형질전환체는 바실러스 섭틸러스 균주(Bacillus subtillus), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 및 사카로마이세스 세레비지애(Bacillus amyloliquefaciens) 균주 등을 이용할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 균주에 재조합 벡터를 도입하는 방법은 열 충격법, 전기충격법 등을 이용하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 Spizizen 방법을 이용하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않으며 공지된 기술을 이용하여 도입할 수 있다.

본 발명에 따른 이튜린 생합성 유전자가 코딩하는 이튜린 단백질에 있어서, 이튜린 단백질은 상기 유전자를 포함하고 있는 벡터 또는 형질전환체에 의해서 코딩되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명에 따른 염기서열을 포함하고 있는 벡터가 도입된 균주의 항균력이 증가한 것을 확인할 수 있었으므로, 형질전환된 균주의 배양액을 생물학적 방제제로 활용할 수 있으며, 또한 이러한 형질전환주 자체를 생물학적 방제제로 유용하게 사용할 수 있을 것이다. 상기 형질전환주 자체를 이용함으로써, 이튜린 단백질의 획득에 필요한 공정, 운반 및 보관을 감소시킬 수 있을 것이다.

본 발명에 따른 이튜린 단백질, 이튜린 단백질을 생산하는 형질전환 균주 및 이의 배양액은 도열병 병원균(Magnaporthe grisea), 시들음병 병원균(Fusarium oxysporum), 잿빛 곰팡이병균(Botrytis cinerea), 보리 흰가루병균(Erysiphe graminis f. sp. hordei), 토마토 잎곰팡이병균(Fulvia fulva), 고추 탄저병균(Colletotrichum gloeosporioides), 인삼 뿌리썩음병균(Cylindrocarpon destructans), 인삼 모잘록병균(Rhizoctonia solani), 시들음병균(Fusarium oxysporum), 파 검은무늬병균(Alternaria porri), 사과 점무늬낙엽병균(Alternaria mali), 인삼 점무늬병균(Alternaria panax), 인삼 잘록병균(Pythium sp.) 또는 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium)에 대하여 방제효과가 있는 것이 바람직하며, 도열병 병원균(Magnaporthe grisea ) , 및 시들음병 병원균(Fusarium oxysporum)에 대하여 방제효과를 나타내는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 Cosmid 클론의 단편을 B. subtilis subsp. krictiensis 균주에 형질전환시킨 후, 푸사리움 옥시스포럼에 대한 항균능력을 관찰하였다. 그 결과, pBT6 단편이 형질전환된 B. subtilis subsp. krictiensis 균주에서는 푸사리움 옥시스포럼에 대한 항균력이 형질전환되지 않은 대조군 B. subtilis subsp. krictiensis 균주에 비하여 크게 증진되는 것을 관찰할 수 있었다.

따라서, 본 발명에서 규명한 신규한 이튜린 생합성 유전자가 암호화하는 이튜린 단백질, 이를 생산하는 형질전환 균주 및 이의 배양액을 생물학적 방제제로써 유용하게 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

바실러스 균주의 배양

B. subtilis subsp. krictiensis ATCC 55079 균주는 본 발명자에 의해 분리된 균주로서, 미국특허에 기재되어 있다. 또한, 미국의 균주기탁기관인 ATCC에 기탁되어 있으며, 본 발명의 실시예에 사용한 B. subtilis 168, B. subtilis JH642 및 B. subtilis C9 균주는 한국생명공학연구원 바이오화학연구센터로부터 분양받아 사용하였다.

Bacillus subtilis 균주와 E. coli 균주의 배양은 LB(박토-트립톤(Bacto-tryptone) 10 g, 박토-효모추출물(Bacto-yeast extract) 5 g, 염화나트륨(sodium chloride) 10 g/ℓ) 배지를 사용하였다. Bacillus subtilis 균주들의 활성물질 생산 배지로는 복합배지(슈크로스(sucrose) 30 g, 소이톤(soytone) 10 g, 효모추출물(yeast extract) 5 g, K₂HPO₄ 0.5 g, MgSO₄ 2 g, MnCl₂ 4 ㎎, CaCl₂ 5 ㎎, FeSO₄ㆍ7H₂O 25 ㎎, pH 7.0/ℓ)를 사용하였다.

형질전환시에는 Spizzizen(50% 글루코오스(glucose) 10 ㎖, 2% 카제인 가수분해물(casein hydrolysate) 10 ㎖, 10% 효모추출물(yeast extract) 10 ㎖, 1M MgCl₂ 2.25 ㎖, KH₂PO₄ 6 g, K₂HPO₄ 14 g, (NH₄)₂SO₄ 2 g, 구연산염(Na citrate) 1 g, MgSO₄ 0.2 g/ℓ) 배지를 사용하였다.

서브틸리스 이종 크릭티엔시스 ( B. subtilis subsp . krictiensis ) 균주의 게놈 라이브러리 작성

<2-1> B. subtilis subsp . krictiensis 균주의 염색체 DNA 추출

본 발명자들은 이튜린(iturin)과 설팩틴(surfactin)은 환상형 리포펩타이드(cyclic lipopeptide) 계열의 항생물질로 분자량이 유사하며, 아미노산의 조성과 연결된 순서만이 서로 상이하고, 설팩틴 유전자의 크기가 32 kb나 될 정도로 매우 크기 때문에, 이튜린 유전자의 크기도 설팩틴과 유사할 것으로 생각하고, 두 항생물질은 어느 단계까지는 동일한 생합성 경로로 합성되다가 일정한 단계부터 서로 다른 생합성 경로로 합성될 것으로 추정하였다.

특히 설팩틴과 이튜린 두 항생물질이 생합성되는 과정 중 펩타이드가 고리화(cyclization)되는 과정과 펩타이드와 지방산이 연결되는 아실화(acylation) 과정을 함께 이용할 것으로 가정하고, 설팩틴을 생성한다고 알려진 바실러스 섭틸리스 168(B. subtilis 168) 균주의 염기서열로부터 여러 종류의 프라이머를 고안하고 PCR을 행하였다. B. subtilis subsp. krictiensis 균주와 B. subtilis 168 균주의 염색체 DNA을 주형으로 하여 PCR을 행하여 두 균주 모두에서 공통적으로 생산되는 1.8 kb의 PCR 산물을 얻고, 염기서열을 결정하여 이 유전자 산물이 펩타이드 생합성 효소(peptide synthetase)와 관련이 있는지의 여부를 확인한 후, 집락 혼성화(colony hybridization) 및 서던 혼성화 방법을 이용하여 이튜린 생합성 유전자를 클로닝하고자 하였다.

우선, 상기 B. subtilis subsp. krictiensis 균주와 B. subtilis 168 균주로부터 DNA를 추출하기 위하여, 상기 두 균주의 단일 집락을 각각 250 ㎖의 LB 배지에 접종하여 30℃, 250 rpm으로 대수기 후반(A₆₀₀=1.0-2.0)까지 배양하여 원심분리(8,000×g, 10 min, RT)하였다. 그 후, 100 ㎖의 용해(lysis) 완충액[100 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 10% SDS, pH 8.0]으로 세척하고, 다시 40 ㎖의 용해 완충액으로 현탁시킨 다음, 100 mg의 라이소자임(lysozyme)을 첨가하여 30℃에서 10분간 정치배양(stationary culture)하였다. 배양 후 20% SDS 3 ㎖를 첨가하여 5분간 배양하고 TE-saturated 페놀 40 ㎖을 첨가하여 잘 혼합한 후 원심분리(10,000 × g, 10 분, 4℃)하여 DNA층을 분리하였다. 페놀/클론로포름으로 다시 추출하여 DNA층을 분리한 뒤, 0.1 부피의 3 M 아세트산나트륨(sodium acetate)(pH 5.2)와 2.5 부피의 냉각된 에탄올(ethanol)을 첨가하여 DNA를 침전시키고 70% 에탄올로 세척하여 풍건한 후, 획득한 DNA 펠렛을 TE 완충액에 용해하였다.

<2-2> 부분 절단( Partial digestion )

부분 절단(Partial digestion) 조건을 결정하기 위하여 분리한 DNA 10 ㎍과 완충액을 혼합하여 150 ㎕로 조절한 후 9개의 에펜도르프 튜브(effendorf tube)에 각각 15 ㎕씩 분배하고, 1번 튜브에는 30 ㎕를 분배한 다음 얼음 속에 방치하였다. 4 unit의 제한효소를 1번 튜브에 넣어 잘 혼합한 후 15 ㎕를 2번 튜브로 옮겨서 잘 혼합하고 다시 15 ㎕를 각 튜브로 연속적으로 옮겨 8번 tube까지 잘 혼합하고 9번 tube는 무처리로 사용하였다. 1 ~ 8번 튜브를 30℃에서 1시간 동안 배양한 후 최종농도 20 mM의 EDTA를 첨가하여 반응을 정지시켰으며, 각 튜브에 3 ㎕의 젤 로딩 다이(gel-loading dye)를 넣고 0.5%의 아가로우스 젤에 전기영동시켜 20 ~ 30 kb 크기의 DNA를 확보할 수 있는 Sau3A 양을 결정하였으며, 벡터로 사용한 Cosmid는 pLAFR3 벡터를 BamHI으로 절단한 후 포스파타아제(phosphatase)로 처리하였다.

<2-3> E. coli 에 B. subtilis subsp . krictiensis 균주의 게놈 라이브러리 작성

B. subtilis subsp. krictiensis 균주의 게놈 라이브러리로부터 이튜린 생합성 유전자를 클로닝하기 위하여, 상기 실시예 <2-1>에서 추출한 B. subtilis subsp. krictiensis 균주의 염색체 DNA를 Sau3A로 부분 절단(partial digestion)시킨 후, 20 ~ 30kb 크기의 DNA 단편을 Cosmid pLAFR3 벡터(서울대학교 농업생명과학대학 응용생물화학부로부터 입수)에 삽입시켰다. 상기 DNA 단편이 삽입된 Cosmid pLAFR3 벡터를 E. coli HB101에 형질전환시켜, 게놈 라이브러리를 작성하였다.

B. subtilis subsp . krictiensis 균주로부터 이튜린 생합성 유전자 스크리닝

<3-1> DNA 프로브 제조

본 발명자들은 이튜린과 설팩틴의 유전자 분자량이 유사하고, 7개의 펩타이드가 환상형 고리를 이루고 있으며, 설팩틴 유전자의 크기가 32 kb나 된다고 보고되어져 있어 이튜린 생합성 유전자의 크기도 설팩틴과 대등할 정도의 크기일 것으로 생각하였다. 또한 Bacillus subtilis 균주 중에는 이튜린과 설팩틴을 동시에 생산하는 균주도 보고되고 있어 이러한 이튜린과 설팩틴의 유전자 크기를 고려해볼 때 펩타이드의 고리화(cyclization) 과정와 지방산이 연결되는 아실화 과정(acylation)은 동일한 생합성 과정을 이용할 것으로 가정하였다. 이러한 가정을 기초로 설팩틴 유전자에 대한 DNA 염기서열 정보를 바탕으로 프라이머를 제작하고, 설팩틴 유전자를 가지고 있는 B. subtilis 168 균주와 이튜린을 생산하는 B. subtilis subsp. krictiensis 균주로부터 상기 실시예 <2-1>에서 획득한 게놈 DNA를 주형으로 하고, 설팩틴 유전자에 대한 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 94℃에서 30 초, 50℃에서 30초, 72℃에서 60초 반응을 30회 반복한 후 72℃에서 5분간 반응하였으며, 사용한 프라이머는 하기와 같다:

SrfA1(서열번호 18): 5′-CGG GAA AGC GCT GGG GAA TAA CCG C-3';

SrfA2(서열번호 19): 5′-CCT TCA AAG CTT TGA ACA GGT GGT C-3';　

SrfA3(서열번호 20): 5′-CTC GCT TGG CGG AGA TTC CAT CAA AG-3';　

SrfA4(서열번호 21): 5′-GTT CTG TCT CTT CAG CAG TCA GCG AG-3';　

SrfA5(서열번호 22): 5′-GCG ATT GAT TAT GCG CTT GTT GAG-3';　

SrfA6(서열번호 23): 5′-TCG GCA CAT ACG CTG ATT GAA CTG C-3';　

SrfA7(서열번호 24): 5′-GGG TAA AGG ATC GCC TCA ATC GTT-3';　

SrfA8(서열번호 25): 5′-CGA AAT AGG CTA TCT CGC ACT CAG-3';　

SrfA9(서열번호 26): 5′-TTC AGA ATA GGG CTT ATC AAG CA-3';　

SrfA10(서열번호 27): 5′-GCT GTG TTG CCG CCT TTA TCT TTG A-3';　

SrfB1(서열번호 28): 5′-ATG TCT CAG ATG CAT GGA GC-3';　　

SrfB2(서열번호 29): 5′-CTG GCA ACT AAT AGG CTG AC-3';　　

SrfB3(서열번호 30): 5′-ATT GAA GCT TGT GCC GCC TG-3';　

SrfB4(서열번호 31): 5′-TCC TTT AAA GCT TTG CAC AG-3';

SrfB5(서열번호 32): 5′-GAA ACA GCA GCG ATT ATG AAC GAC-3';

SrfB6(서열번호 33): 5′-AGA CAT CGA GCC AGT ATT CCT CAT C-3';　

SrfB7(서열번호 34): 5'-ATT TCG AGC GGC CAG CTG AAC G-3';

SrfB8(서열번호 35): 5' -TTT CAT CCG GCG CCG TAT AGG TTT-3';

SrfB9(서열번호 36): 5′- GCA AAA TTT CCG GAC AGC GGG ATA T-3'; 및

SrfB10(서열번호 37): 5′- TCG ATC CGG CCG ATG TAT TCA AT-3'.

PCR 산물을 전기영동 수행하여 B. subtilis 168 균주와 B. subtilis subsp. krictiensis 균주로부터 얻은 각각의 유전자 산물을 확인한 결과, SrfB9와 SrfB10 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였을 때, B. subtilis 168 균주와 B. subtilis subsp. krictiensis 균주로부터 약 1.8 kb에 해당하는 동일한 크기의 DNA 단편이 관찰되었다(도 1). 본 발명자들은 상기의 DNA 단편을 프로브로 이용하여, 상기 실시예 2에서 작성한 게놈 라이브러리를 스크리닝하는데 이용하였다.

<3-2> 스크리닝된 이튜린 생합성 유전자와 펩타이드 생합성 유전자와의 서열 비교

상기 실시예 <3-1>에서 B. subtilis subsp. krictiensis 균주로부터 획득한 이튜린 생합성 유전자로 추정되는 프로브의 아미노산 서열을 다른 펩타이드 생합성 유전자의 아미노산 서열과 비교하였다.

NCBI 데이타 베이스를 이용하여 얻은 설팩틴 및 리케니신(lichenysin) 생합성 유전자의 아미노산 서열을 클러스탈 더블유(CLUSTAL W) 프로그램을 이용하여 비교한 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 B. subtilis subsp. krictiensis 균주로부터 획득한 아미노산 서열은 서로 다른 3개의 설팩틴(surfactin) 생합성 유전자와 82 ~ 85%의 상동성을 나타냈으며, B. licheniformis 균주가 생산하는 리케니신(lichenysin) 생합성 유전자와도 80%의 상동성을 나타냈다(도 2).

<3-3> 이튜린의 펩타이드와 지방산의 아실화 ( acylation ) 과정에 관여하는 유전자의 스크리닝

펩타이드와 지방산을 연결하는 아실화(acylation) 과정에 관여하는 유전자를 클로닝하기 위하여 위에서 상기 실시예 <3-1>에서 고안한 20여종의 프라이머를 이용하여 PCR을 행하고 얻은 약 0.4 kb의 DNA 단편에 대한 염기 배열을 분석하였다.

그 결과, B. subtilis subsp. krictiensis 균주에서 SrfA 5과 SrfA 6 프라이머를 이용하여 획득한 0.4 kb의 PCR 산물에 대한 유전자 염기서열 및 펩타이드 서열을 분석하여 도 3에 나타냈다.

도 3에 나타난 아미노산을 비교분석하기 위하여 NCBI 데이타 베이스를 탐색하였다. 그 결과 이 유전자 산물은 다른 미생물에서 유래된 아실 전달체 단백질 환원 효소(acyl carrier protein reductase)와 56~ 83%의 상동성을 나타내었으며 특히 다른 B. subtilis 균주에서 유래된 아실 전달체 단백질 환원 효소와는 83%의 상동성을 나타냈다(도 4).

<3-4> 콜로니 하이브리드를 이용한 이튜린 생합성 유전자의 스크리닝

상기 실시예 <2-3>에서 작성된 B. subtilis subsp. krictiensis 균주의 게놈 라이브러리를 이용하여, 이튜린 생합성 유전자를 탐색하기 위해 콜로니 혼성화(colony hybridization)을 실시하였다.

상기 실시예 <3-1>의 B. subtilis subsp. krictiensis 균주로부터 획득한 1.8 kb DNA 단편을 콜로니 혼성화에 대한 프로브(probe)로 이용하기 위하여, 100℃에서 10분간 끓여서 변성시킨 뒤, 얼음에 급속하게 냉각시키고 라벨링 완충액(5×) 5 ㎕, dNTP 혼합액 2 ㎕, 변성된 DNA 주형 7 ㎕, BSA(10 mg/㎖) 2 ㎕, ³²P-CTP 5㎕, Klenow 효소 1 ㎕, D.W. 3 ㎕로 반응액을 조제하여, 37℃에서 1시간 반응 시켰다. 반응 후, 0.5 M EDTA로 반응을 정지시키고, 3 N NaOH 2.5 ㎕를 첨가한 뒤 다시 37℃에서 1시간 반응 시킨 뒤 프로브로 사용하였다.

우선, 상기 <실시예 2>에서 작성한 B. subtilis subsp. krictiensis의 게놈 라이브러리를 테트라사이클린(tetracyclin)을 최종 농도가 10 ㎍이 되도록 첨가한 LB 평판배지에 한 평판 당 100 ~ 200개의 집락이 출현하도록 도말한 뒤, 집락의 크기가 직경 약 1 mm 정도 될 때까지 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 나일론 멤브레인(Nylon membrane)으로 집락을 옮기고, 멤브레인(membrane)을 10% SDS에서 5분, 변성(denaturing) 용액[0.5 N NaOH, 1.5 M NaCl]에서 5분, 중성화(neutralizing) 용액[1.5 N NaCl, 0.5 M Tris-HCl, pH 7.4]에서 5분 배양하고, 2× SSC용액[20 × SSC 용액을 10배 희석하여 사용; 20× SSC 조성은 0.15 M NaCl, 0.01 M 시트르산 나트륨(sodium citrate), 0.001 M EDTA]으로 세척한 후 건조시키고, 80℃의 진공 건조기(vaccum oven)에서 1 ~ 2시간 동안 베이킹시켰다. 멤브레인을 전혼성화(prehybridization) 용액[1 mM EDTA, 250 mM Na₂HPO₄, 1% 카제인 가수분해물(Casein hydrolysate), 7% SDS pH 7.4]으로 처리하고 65℃에서 2시간 반응 시킨 후, 라벨된 프로브 믹스[주형 DNA 14 ㎕, 5×라벨링 완충액(프로메가) 5 ㎕, dNTP(ATP, TTP, GTP) 1 ㎕, Klenow 효소 1 ㎕, ³²P-dCTP 2 ㎕]를 넣고 하룻밤 동안 반응 시켰다. 반응 후 세척 용액[세척용액 I: 20× SSC 10 ㎖, 10% SDS 1 ㎖, 증류수 89 ㎖; 세척용액 II: 20× SSC 10 ㎖, 10% SDS 10 ㎖, 증류수 80 ㎖; 세척용액 III: 20× SSC 0.5 ㎖, 10% SDS 1 ㎖, 증류수 98.5 ㎖]으로 세척하고 X-ray 필름에 노출시켜 감광된 양성 콜로니를 선발하였다.

그 결과, 도 5의 A에 나타난 바와 같이, B. subtilis subsp. krictiensis 균주로부터 획득한 DNA 단편과 상동성을 나타내는 클론이 나타난 것을 관찰할 수 있었다(도 5의 A).

<3-5> 서던 혼성화를 이용한 이튜린 생합성 유전자의 스크리닝

야생주 B. subtilis subsp. krictiensis 균주의 게놈 라이브러리로부터 이튜린 생합성 유전자를 클로닝하기 위하여 야생주 B. subtilis 균주의 게놈 DNA를 Sau3A로 부분 절단하여 얻은 다양한 크기의 DNA 단편들을 획득하였다. 이들 중 20 ~ 30 kb 크기에 해당하는 여러 종류의 DNA 단편을 코스미드 pLAFR3 벡터를 이용하여, E. coli HB101에 라이브러리를 작성하여 얻은 여러 종류의 집락들을 EcoRI으로 절단하여 얻은 각각의 클론들을 서던 혼성화(Southern hybridization)를 이용하여 분석하였다.

도 5의 B에 나타난 바와 같이, EcoRI 제한효소로 절단한 클론을 0.7% 아가로우스 젤에 전기영동시키고, 브롬화 에티윰(ethidium bromide)으로 염색한 뒤, 용액 I[Tris-HCl 100 mM, NaCl 150 mM, pH 7.5]로 15분간 반응 시키고, 다시 용액 II[Tris-HCl 100 mM, NaCl 150 mM, blocking reagent 0.5%, pH 7.5]로 30분간 반응 시켰다. 반응 후, 용액 III[Tris-HCl 100 mM, NaCl 100 mM/ℓ, MgCl₂ 100 mM, pH 9.5]으로 30분간 반응 시키고, 나일론 멤브레인(nylon membrane)을 젤 위에 올려놓고 DNA 단편들을 멤브레인으로 이동시켰다. DNA 단편들이 이동된 멤브레인을 건조시키고 혼성화(hybridization)를 실시하였다. 혼성화 반응 시에는 멤브레인을 프로브가 들어 있지 않은 혼성화 완충액[1 mM EDTA, 250 mM Na₂HPO₄, 1% 카제인 가수분해물, 7% SDS pH 7.4]으로 2시간 동안 세척하고, 다시 15 ㎖씩 용액 I, II, III의 순서로 2회씩 세척한 후 용액을 제거하였다. 그 뒤, 라벨된 프로브 믹스[주형 DNA 14 ㎕, 5×라벨링 완충액(프로메가) 5 ㎕, dNTP(ATP, TTP, GTP) 1㎕, Klenow 효소 1㎕, ³²P-dCTP 2 ㎕]를 첨가하여 하룻밤 동안 반응 시켰다. 반응 후 프로브 DNA를 제거하고, 멤브레인을 건조시켜 X-ray 필름 위에 올려놓고 -70 ℃에서 하룻밤 방치한 후 X-ray 필름을 현상하였다(도 5의 C).

그 결과, 도 5의 B 및 C에 나타난 바와 같이, 2개의 레인에서 B. subtilis subsp. krictiensis 균주로부터 획득한 DNA 프로브의 서열이 존재하는 것을 확인할 수 있었으며, 이러한 두 개의 클론을 각각 pJJ815와 pJJ121로 명명하였다.

pJJ815 와 pJJ121 클론의 제한효소 지도 작성

상기 <실시예 3>에서 획득한 pJJ815와 pJJ121 클론에 대한 제한효소 지도를 작성하였다. SmaI과 EcoRI의 제한효소를 이용하여 절단하고, 상기 두 클론의 제한효소 지도를 작성한 결과, pJJ121 클론은 pJJ121E2(ORF 2-2 ~ ORF 3의 부분, 서열번호 1의 8,020 ~ 2,3480 bp), pJJ121E3(ORF 3 ~ ORF 4의 부분), pJ815E4(ORF 4의 부분), pJJ815E6(ORF 4 ~ yczE의 부분, 서열번호 1의 29,167bp ~ 32,819 bp)로 구분될 수 있으며, pJJ815 클론은 pJJ121E2 단편, pJJ121E3, pJJ815E4, pJJ815E6, pJJ815E5, pJJ815E2(yczE ~ ycyA의 부분)로 구분되었다(도 9).

pJJ815 와 pJJ121 클론의 단편을 이용한 서던 혼성화

B. subtilis subsp. krictiensis 균주의 게놈 라이브러리 스크리닝을 통해 얻은 pJJ815와 pJJ121 Cosmid 클론들이 이튜린 생합성에 관여하는 유전자인지의 여부를 확인하기 위하여, pJJ815와 pJJ121 Cosmid 클론들을 EcoRI으로 절단하여 설팩틴을 생성한다고 알려진 B. subtilis 168 균주와 B. subtilis subsp. krictiensis 균주를 이용하여 게놈 서던 혼성화를 수행하였다.

<5-1> 서던 혼성화에 필요한 프로브의 제작

게놈 서던 혼성화를 수행하기 위하여, 상기 클론을 EcoRI 제한효소로 절단한 6개의 단편(pJJ121E2, pJJ121E3, pJJ815E4, pJJ815E5, pJJ815E6, 및 pJJ815E2) 단편들을 프로브로 제조하였다. 구체적으로 상기 실시예 <2-3>에 언급한 cosmid 클론 pJJ121과 pJJ815를 E. coli HB101에 클로닝한 후 EcoRI으로 절단한 6개의 단편들을 각각 프로브로 이용하였으며, 이러한 각각의 단편들은 실시예 <3-4>에 기술한 방법과 동일하게 ³²P-dCTP 동위원소로 표지를 행한 후 혼성화 실험에 사용하였다.

<5-2> 온도에 따른 서던 혼성화 반응

상기 실시예 <5-1>에서 제조한 6개의 단편(pJJ121E2, pJJ121E3, pJJ815E4, pJJ815E5, pJJ815E6, 및 pJJ815E2)을 프로브로 이용하여, B. subtilis subsp. krictiensis 균주와 B. subtilis 168 균주의 염색체 DNA를 이용하여 서던 혼성화를 수행하였다. 또한, 서던 혼성화 시 온도에 따라 반응에 어떠한 영향을 나타내는지의 여부를 확인하기 위하여, 50℃와 65℃에서 서던 혼성화를 수행하였다.

먼저, B. subtilis subsp. krictiensis 균주와 B. subtilis 168 균주의 게놈 DNA를 EcoRI 제한효소로 절단한 클론을 0.7% 아가로우스 젤에 전기영동시키고, 에티디움 브롬마이드(ethidium bromide)로 염색한 뒤, 용액 I[Tris-HCl 100 mM, NaCl 150 mM, pH 7.5]로 15분간 반응 시키고, 다시 용액 II[Tris-HCl 100 mM, NaCl 150 mM, blocking reagent 0.5%, pH 7.5]로 30분간 반응 시켰다. 반응 후, 용액 III[Tris-HCl 100 mM, NaCl 100 mM/ℓ, MgCl₂ 100 mM, pH 9.5]으로 30분간 반응 시키고, 나일론 멤브레인(nylon membrane)을 젤 위에 올려놓고 DNA 단편들을 멤브레인으로 이동시켰다. DNA 단편들이 이동된 멤브레인을 건조시키고 혼성화(hybridization)를 실시하였다. 혼성화(hybridization) 반응 시에는 멤브레인을 프로브가 들어 있지 않은 혼성화 완충액[1 mM EDTA, 250 mM Na₂HPO₄, 1% 카제인 가수분해물(Casein hydrolysate), 7% SDS pH 7.4]로 2시간 동안 세척하고, 다시 15 ㎖씩 용액 I, II, III의 순서로 2회씩 세척한 후 용액을 제거하였다. 그 뒤, 각각의 ³²P-dCTP 동위원소로 표지된 프로브 DNA를 첨가하여 하룻밤 동안 반응 시켰다. 반응 후 프로브 DNA를 제거하고, 멤브레인을 건조시켜 X-ray 필름 위에 올려놓고 -70 ℃에서 하룻밤 방치한 후 X-ray 필름을 현상하였다.

도 7에 나타난 바와 같이, 65℃에서 서던 혼성화를 수행한 결과, B. subtilis subsp. krictiensis 균주에서는 프로브 DNA의 서열이 존재하는 것을 관찰할 수 있었으나, 설팩틴 생합성 유전자를 내포하고 있는 B. subtilis 168 균주에서는 프로브로 사용한 6개의 EcoRI 단편 모두가 B. subtilis 168 균주의 게놈 DNA에 존재하지 않는 것을 관찰할 수 있었다(도 7).

또한, 서던 혼성화 반응을 50℃에서 하였을 때에는 B. subtilis 168 균주의 게놈 DNA에서 pJJ121E3 단편 프로브에 대하여 상동성이 미약하게 나타났으나, 그 외의 단편들에 대해서는 65℃에서 서던 혼성화시킨 결과와 동일하였다(도 8). 따라서, 도 7과 8의 결과를 통해서, 서던 혼성화 반응 시 온도의 차이에 의한 영향이 없음을 확인할 수 있었다. 또한, 상기 결과들을 종합해 볼 때, 6개의 EcoRI 단편들은 50℃로 반응 시 미약한 반응을 나타낸 pJJ121E3 단편을 제외하고는, B. subtilis 168 균주로 부터 분리한 설팩틴 생합성 유전자와는 거의 유사성을 나타내지 않았으나, B. subtilis subsp. krictiensis 균주에서는 유사성을 나타냈으므로, pJJ815와 pJJ121 Cosmid 클론으로부터 절단시킨 6개의 단편(pJJ121E2, pJJ121E3, pJJ815E4, pJJ815E5, pJJ815E6, 및 pJJ815E2)들이 이튜린 생합성에 관여하는 유전자일 가능성이 높을 것으로 추정되었다.

이튜린 생합성 유전자( pJJ815 와 pJJ121 클론)의 염기 배열 결정과 특성 분석

<6-1> 이튜린 생합성 유전자( pJJ815 와 pJJ121 )의 염기 서열 분석

pJJ815와 pJJ121의 코스미드(Cosmid) 클론으로부터 클로닝한 EcoRI 단편들을 이용하여 양방향 염기배열을 결정하여 21,253 bp를 확보하였으며, 일부 누락된 유전자에 대한 염기배열을 추가로 확보하기 위하여 게놈 라이브러리 스크리닝을 통해 유전자를 확보하고 염기배열을 결정하여 총 37,682 bp의 염기배열을 확보하였으며, 염기배열 내에서 이튜린 생합성과 관련된 7개의 ORF가 발견되었다(도 9).

ORF 1은 서열번호 1의 2868 내지 3219 번째 염기서열(서열번호 2)을 포함하고 있으며, ORF 2-1은 3810 내지 4353 번째의 염기서열(서열번호 4)을, ORF 2-2는 4632 내지 14559 번째의 염기서열(서열번호 5)을 포함하고 있다. ORF 3은 서열번호 1의 14583 내지 25341 번째의 염기서열(서열번호 6)을 포함하고 있으며, ORF 4는 25378 내지 29209 번째의 염기서열(서열번호 7)을 포함하고 있으며, ORF 5는 29231 내지 29960 bp 번째의 염기서열(서열번호 8)을 포함하고 있으며, ORF 6은 30084 내지 31392 번째의 염기서열(서열번호 9)을 포함하고 있다.

<6-2> 이튜린 생합성 유전자 ORF 와 환상형 펩타이드 생합성 유전자와의 염기 서열 비교

이튜린 생합성에 관여할 것으로 추정되는 7종의 ORF 각각을 다른 환상형 펩타이드 생합성 유전자와 비교하였다.

그 결과, B. subtilis 유래의 설팩틴 유전자는 ORF와 76 ~ 86%의 유사성을 나타낸 반면 B. amyloliquefaciens 유래의 설팩틴 유전자와는 92 ~ 100%의 유사성을 나타냈다. 특히, 이튜린 생합성에 직접적으로 관여할 것으로 추정되는 ORF 2-1(543 bp), ORF2-2(9,927 bp) 및 ORF3(10,757 bp)는 B. amyloliquefaciens 균주 유래 설팩틴 유전자와 각각 92 ~ 98%의 유사성을 나타냈다(표 1).

그러나 이러한 B. amyloliquefaciens 균주 중 98%의 유사성을 나타낸 B. amyloliquefaciens FZB42 균주는 환상형 펩타이드 설팩틴(surfactin), 펜지신(fengycin) 및 바실로마이신 D(bacillomycin D)를 생산한다고 알려져 있으나(Chen, et al., Nature Biotechnol., 25: 1007-1014, 2007), 이튜린은 생산하지 않는 것으로 보고되었다. 이에, 본 발명자들은 B. amyloliquefaciens FZB42 균주와 B. subtilis subsp. krictiensis 균주 전체 유전자의 상동성을 비교하였다(표 2).

그 결과, 상기 두 균주는 전체적인 유전자 염기서열을 비교했을 때 98%의 상동성을 나타내었으나 37,682 bp인 전체적인 유전자의 크기를 감안해 볼 때, 두 균주의 2% 상이성은 대략 753 bp 이상의 차이를 나타내었으며, 특히 B. amyloliquefaciens FZB42 균주는 이튜린을 생산하지 않는다고 이미 보고되어 있어(J. Bacteriol., 186: 1084-1096, 2004; Nature Biotechnol., 25: 1007-1014, 2007), 이튜린을 생산하는 B. subtilis subsp. krictiensis 균주와는 커다란 차이점을 나타냈다.

특히, 이튜린 합성에 핵심적인 역할을 할 것으로 추정되는 ORF2-1과는 92%, ORF 2-2와는 98%, ORF 3과는 98%를 나타내는 데도 불구하고 서로 생산하는 환상형 리포펩타이드 항생물질이 크게 다른 것을 고려해보면 이튜린과 설팩틴은 생합성 경로 중 상당한 부분을 서로 공유할 가능성이 큰 것으로 생각되었다(표 2 내지 표 4).

또한, 2001년도에 일본 연구팀에서 발표한 이튜린 A 유전자(K. Tsuge, et al., J. Bacteriol., 183: 6265-6273, 2001)와 B. subtilis subsp. krictiensis 균주로부터 유래된 이튜린 생합성 유전자와는 유전자의 유사성이 41% 를 나타내었고, 독일 연구팀이 발표한 이튜린 A 유전자와도 40%의 유사성을 나타내어, B. subtilis 균주로부터 유래된 이튜린 생합성 유전자는 새로운 유전자일 가능성이 높은 것으로 사료되었다(표 5).

ORFs	유의한 염기서열(significant alignment)	Max. Identity(%)
ORF1	(CBI41437) transcriptional regulator [Bacillus amyloliquefaciens]	97
ORF1	(YP01419994) transcriptional regulator [Bacillus amyloliquefaciens]	96
ORF2-1	(CP00560) 설팩틴(surfactin) 합성효소 AA [Bacillus amyloliquefaciens]	94
ORF2-1	(FN597644)설팩틴(surfactin) 합성효소 AA[Bacillus subtilis]	92
ORF2-2	(CP000560)설팩틴(surfactin) 합성효소 AA, AB [Bacillus amyloliquefaciens]	97
	(AJ575642)설팩틴(surfactin) 합성효소 AA, AB [Bacillus amyloliquefaciens]	97
	(FN597644)설팩틴(surfactin) 합성효소 AA, AB [Bacillus amyloliquefaciens]	93
ORF3	(YP0141996) 설팩틴(surfactin) 합성효소 AB [Bacillus amyloliquefaciens]	98
	(CBI41439)설팩틴(surfactin) 합성효소 AB[Bacillus amyloliquefaciens]	95
	(ZP06875171)설팩틴(surfactin) 합성효소 AB[Bacillus subtilis]	76
ORF4	(YP01419998) 설팩틴(surfactin) 합성효소 AC [Bacillus amyloliquefaciens]	96
ORF4	(ZP06875172)설팩틴(surfactin) 합성효소 [Bacillus subtilis]	86
ORF5	(AC099323)설팩틴(surfactin) 합성효소 AD[Bacillus amyloliquefaciens]	100
ORF5	(YP0141999) 설팩틴(surfactin) 합성효소 AD[Bacillus amyloliquefaciens]	99
ORF6	(ACX10665)aspartate transaminase-like protein [Bacillus amyloliquefaciens]	99
ORF6	(CAE02535) amono transferase [Bacillus amyloliquefaciens]	99

하기 표 2는 이튜린 생합성 유전자 37,6822 bp 전체서열을 Blast N을 이용하여, B. subtilis subsp. krictiensis 균주를 포함한 다른 균주와 비교한 결과를 나타낸다.

하기 표 3은 B. subtilis subsp. krictiensis 균주의 ORF 2-1(550 bp)의 염기서열을 Blast X를이용하여 다른 균주와 비교한 결과를 나타낸다.

하기 표 4는 B. subtilis subsp. krictiensis 균주의 ORF 2-2(9,940 bp)의 염기서열을 Blast X를 이용하여 다른 균주와 비교한 결과를 나타낸다.

하기 표 5는 B. subtilis subsp. krictiensis 균주의 ORF 3 (10,770 bp)의 염기서열을 Blast X를 이용하여 다른 균주와 비교한 결과를 나타낸다.

검정용 평판배지의 조제

<7-1> Magnaporthe grisea 평판의 조제

포자 현탁액의 조제는 벼의 도열병 원인균인 마그나포르테 그리시아(Magnaporthe grisea ) 를 포테이토 덱스트로스 아가(Potato dextrose agar) 사면배지에서 12 ~ 15일 동안 사면배양한 후, 증류수 5 ㎖를 가하고 파스테르 파이펫(pasteur pipette)으로 현탁시킨 후 일정시간 정치하고 그 상등액의 흡광도(A_550nm)를 1.5로 조절한 후 사용하였다. 마그나포르테 그리시아 시험균의 평판은 중층 평판을 사용하는 데 먼저 벼 잎 침출액에 0.15% 슈크로스(sucrose)와 1.5% 아가(agar)를 첨가하여 멸균시킨 후 시트레이트 포스페이트 버퍼(citrate phosphate buffer)(pH 5.0)와 1:1로 혼합하여 각 평판마다 25 ㎖씩 분주하였다. 분주한 배지가 굳은 후 다시 벼 침출액에 0.15% 슈크로스(sucrose)와 1.5% 아가(agar)를 첨가하여 멸균시키고, 시트레이트 포스페이트 버퍼와 1:1로 혼합하여 45℃로 유지시킨 중층배지에 조제한 포자 현탁액 5 ㎖를 멸균한 중층배지 50 ㎖에 첨가하여 잘 혼합한 다음 미리 고형화시켜 놓은 베이스 레이어(base layer)에 평판의 크기에 따라 5~10 ㎖씩 중층(overlay)하여 검정용 평판을 조제하였다.

<7-2> Trichophyton mentagrophytes 평판의 조제

사보로드 아가(Sabouraud's agar) 사면 배지에서 10 ~ 14일 동안 배양한 균체를 이용하였으며, 평판용 배지로는 사보로드 아가를 기본 배지로 사용하였다. 무좀의 원인균인 트리코피톤 멘타그로피테트(Trichophyton mentagrophytes) 균주를 사보로드 덱스트로스 브로스(Sabouraud's dextrose broth)에 접종하고 2 ~ 3일 동안 진탕배양시킨 후, 멸균한 와링 블렌더(waring blender)로 균질화시키고, 흡광도(A_550nm)를 1.5로 조절한 후 멸균하여 50℃로 조절된 사보로드 덱스트로스 아가 50 ㎖에 균액 5 ㎖을 첨가하여 잘 혼합시키고, 사보로드 덱스트로스 아가를 미리 분주해 고형화시켜 놓은 베이스레이어(base layer) 위에 평판의 크기에 따라 5 ~ 10 ㎖씩 중층하여 검정용 평판을 조제하였다.

<7-3> Fusarium oxysporum 평판의 조제

포테이토 덱스트로스 아가(Potato dextrose agar) 배지에서 자란 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum) 균주를 포테이토 덱스트로스 브로스(potato dextrose broth)에 접종하고 2 ~ 3일 동안 진탕배양한 후, 멸균한 와링 블렌더로 균질화시키고, 흡광도(A_550nm)를 1.5로 조절한 후 멸균하여 50℃로 조절된 포테이토 덱스트로스 아가 50 ㎖에 균액 10 ㎖을 첨가하여 균일하게 혼합하고, 포테이토 덱스트로스 아가를 미리 분주하여 고형화시켜 놓은 베이스 레이어(base layer) 위에 평판의 크기에 따라 5 ~ 10 ㎖씩 중층하여 검정용 평판을 조제하였다.

바실러스 균주의 항균력 측정

<8-1> 표준 화합물을 이용한 항균력 측정

이튜린 생산 균주를 돌연변이시키거나 재조합시켜 이튜린이 생산되는지의 여부를 검정하기 위해서는 기기분석에 의존하여야 하나 시간과 노력이 많이 소요되기 때문에 실험실에서 간편하게 이튜린 생산여부를 검정할 수 있는 방법을 확립하고자 하였다. 먼저 이튜린을 생산하는 B. subtilis subsp. krictiensis 균주와 설팩틴(surfactin) 유전자를 함유하고 있는 B. subtilis 168 균주의 항균력 차이를 비교하기 위하여, 설팩틴과 이튜린 A의 표준 화합물을 시그마(Sigma Co.)와 와코(Wako Co.)로부터 구입하였다. 피검균으로는 벼의 도열병균 원인균인 마그나포르테 그리시아(Magnaporthe grisea)와 무좀균인 트리코피톤 멘타그로피테스(Trichophyton mentagrophytes) 및 시들음병의 원인균인 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum) 등 3 종류를 사용하여 표준 화합물인 이튜린 A와 설팩틴에 대한 항균력을 조사하였다.

설팩틴과 이튜린 A 화합물의 농도를 각각 달리하여 상기 <실시예 7>에서 제조된 마그나포르테 그리시아, 트리코피톤 멘타그로피테스, 및 푸사리움 옥시스포럼 평판 위에 벼의 도열병균에 대해서는 1.56 ~ 12.56 ㎍/㎖, 무좀균에 대해서는 3.12 ~ 25 ㎍/㎖, 가지과 식물의 시들음병 원인균인 Fusarium 균에 대해서는 6.25 ~ 50 ㎍/㎖가 되도록 각 화합물을 2배씩 희석하여 4개의 농도 계열을 제조하였다. 농도별로 제조한 각각의 화합물을 4 농도씩 피검균을 함유한 평판 위에 멸균된 컵(cup) (외경 6.6 mm, 높이 8.6 mm, stainless 재질, Fisher Co.)을 올려 놓은 후 컵(cup) 속에 100 씩 분주하고, 25에서 1 ~ 3일간 배양한 후 피검균의 생육저해 여부를 관찰하여 항균력을 조사하였다.

그 결과, 이튜린 A는 마그나포르테 그리시아와 트리코피톤 멘타그로피테스 피검균에 대해 강한 항균력을 나타냈으며, 설팩틴은 이튜린 A 보다는 약하지만 약간의 저해활성을 나타냈다. 이튜린 A와 설팩틴은 항균력의 차이를 나타내었으나 항균 스펙트럼에는 커다란 차이를 나타내지 않았다. 그러나 피검균 푸사리움 옥시스포럼에 대하여 이튜린 A는 강력한 항균력을 나타낸 반면, 설팩틴은 항균력을 나타내지 않아, 두 화합물은 푸사리움 균주에 대해 명확한 항균력의 차이를 나타냈다(도 10).

<8-2> 바실러스 균주의 배양 상등액의 항균력 측정

야생주 B. subtilis를 이용하여 이튜린의 생성이나 소멸된 형질전환주를 선별할 때 일일이 기기분석을 통하여 이튜린 생성 유무를 분석하려면 시간과 노력이 많이 소요되기 때문에 간편하게 피검균을 이용하여 검정할 수 있는 검정체계를 개발하고자 하였다. 먼저 어센틱 이튜린(authentic iturin)과 설팩틴을 이용한 항균력 검정 시 이튜린 만이 Fusarium 균주에서만 항균력을 나타내는 것을 발견하고 당 실험실 및 한국생명공학연구원 바이오화학연구센터에서 보유하고 있는 이튜린과 설팩틴 생성과 관련한 여러 종류의 B. subtlis 균주를 사용하여 항균력 검정을 하였다. 되도록 다양한 균주를 이용하기 위하여 이튜린과 설팩틴을 생산한다고 알려진 균주들을 여러 연구자들로부터 수집하였으며 B. subtilis C9 균주도 이러한 차원에서 수집하여 이용하였는데, 바실러스 균주를 액체 배양한 후, 3가지 종류의 피검균에 대해 항균력을 조사하였다.

이튜린을 생산하는 B. subtilis subsp. krictiensis 균주와 이튜린과 설팩틴 항생물질을 모두 생산하지 않는 B. subtilis JH642 균주를 대조구로 사용하고, 설팩틴 유전자는 갖고 있으나 sfp 유전자의 자연 돌연변이에 의해 설팩틴을 생산하지 않는 B. subtilis 168 균주와 설팩틴과 이튤린을 생산하는 것으로 추정되는 B. subtilis C9 균주를 이용하였다.

LB 한천배지에서 신선하게 자란 상기 Bacillus 균주들의 단일 집락들을 모아 활성물질 생산용 복합배지[sucrose 30 g, soytone 10 g, yeast extract 5 g, K₂HPO₄ 0.5 g, MgSO₄ 2 g, MnCl₂ 4 ㎎, CaCl₂ 5 ㎎, FeSO₄ㆍ7H₂0 25 ㎎, pH 7.0, 증류수 1 리터]에 접종하여 30℃에서 200 rpm으로 48시간 동안 배양하였다. 배양액을 8,000 ×g에서 10분간 원심분리하여 균체를 제거하고 0.2 ㎛ 멤브레인 필터(membrane filter)를 통과한 상등액을 페이퍼 디스크(paper disk)에 각각 100 ㎕씩 첨가하여 상기 <실시예 7>에서 제조한 검정용 평판배지에 올려놓고 25℃에서 1 ~ 3일간 배양한 후 피검균(마그나포르테 그리시아(Magnaporthe grisea ), 트리코피톤 멘타그로피테스(Trichophyton mentagrophytes) 및 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum))의 생육억제 정도를 조사하였다.

그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이 B. subtilis subsp. krictiensis 균주는 표준 화합물 이튜린 A를 이용한 결과와 동일하게, 마그나포르테 그리시아, 트리코피톤 멘타그로피테스 및 푸사리움 옥시스포럼의 피검균 모두에서 강력한 항균력을 나타냈다. 그러나 B. subtilis JH642 균주나 sfp 유전자가 자연 돌연변이된 B. subtilis 168 균주에서는 3 종류의 피검균에 대하여 항균력이 나타나지 않았으나, B. subtilis C9 균주는 3 종류의 피검균에 대하여 항균력을 나타냈다. 이에, 본 발명자들은 상기 결과에서 나타난 B. subtilis C9 균주의 항균력이 설팩틴 이외에, 이튜린이 생산되기 때문일 것으로 추정하였으며, 이러한 결과를 토대로 이튜린 돌연변이주 선발 시 피검균으로 F. oxysporum을 이용하였다(도 11).

B. subtilis subsp . krictiensis 형질전환 변이주의 항균활성 측정

<9-1> B. subtilis subsp . krictiensis 의 형질전환

실시예 <2-2>의 B. subtilis subsp. krictiensis 균주로부터 획득한 cosmid 클론 pJJ121과 pJJ815의 DNA 단편들을 EcoRI으로 절단하여 얻은 4개의 단편들( pBT6, pBT1, pBT2 및 pBT3, 도 12)을 각각 pT(II)PLK의 HCE promoter를 NdeI으로 절단한 단편과 함께 Bacillus와 E. coli의 shuttle vector인 pHPS9(한국생명공학연구원 바이오화학연구센터로부터 분양받아 사용함)에 클로닝하고 B. subtilis subsp. krictiensis 균주에 형질전환시킨 후 클로람페니콜 항생물질(5 ㎍/㎖)을 함유한 평판에 도말하여 집락을 형성하는 집락들을 형질전환주로 선별하였다.

구체적으로, Bacillus subtilis subsp. krictiensis 균주를 LB 평판배지에서 신선하게 배양하여 얻은 단일 집락을 2 ㎖의 Spizzizen 배지(50% glucose 10 ㎖, 2% casein hydrolysate 10 ㎖, 10% yeast extract 10 ㎖, 1M MgCl₂ 2.25 ㎖, KH₂PO₄ 6 g, K₂HPO₄ 14 g, (NH₂)SO₄ 2 g, sodium citrate 1 g, MgSO₄ 0.2 g, 증류수 1 리터)에 접종하고 37 ℃, 200 rpm에서 16 ~ 18시간 배양하였다. 다시 접종원이 1% 되도록 신선한 배지에 다시 접종하고 같은 조건으로 배양하면서, 580 nm에서 흡광도가 1.0일 때 배양액 0.5 ㎖과 약 1 ㎍의 DNA(pBT6, pBT1, pBT2, 및 pBT3)를 혼합하고, 1시간 동안 진탕배양하였다. 진탕배양한 후, 5 ㎍/㎖의 클론람페니콜(chloramphenicol)이 함유된 평판배지에 도말하고, 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다.

pBT6, pBT1, pBT2 및 pBT3의 단편을 포함한 변이주를 각각 B. subtilis subsp. krictiensis(pBT6), B. subtilis subsp. krictiensis(pBT1), B. subtilis subsp. krictiensis(pBT2) 및 B. subtilis subsp. krictiensis(pBT3)이라 명명하였다(도 10).

<9-2> B. subtilis subsp . krictiensis 의 항균력 측정

LB 한천배지에서 신선하게 자란 상기 대조군으로 형질전환되지 않은 B. subtilis subsp. krictiensis 균주와, 상기 실시예 <8-1>에서 제조한 ORF를 포함하고 있는 단편들(pBT1, pBT3, 및 pBT6)을 형질전환시킨 B. subtilis subsp. krictiensis 균주(pBT1, pBT3, 및 pBT6)의 항균력을 측정하고자 하였다.

B. subtilis subsp. krictiensis 균주(pBT1, pBT3, 및 pBT6) 균주들의 단일 집락들을 모아 활성물질 생산용 복합배지[sucrose 30 g, soytone 10 g, yeast extract 5 g, K₂HPO₄ 0.5 g, MgSO₄ 2g, MnCl₂ 4 ㎎, CaCl₂ 5 ㎎, FeSO₄ㆍ7H₂0 25 ㎎, pH 7.0, 증류수 1 리터]에 접종하여 30℃에서 200 rpm으로 48시간 동안 배양하였다. 배양액을 8,000×g에서 10분간 원심분리하여 균체를 제거하고 0.2 ㎛ 멤브레인 필터(membrane filter)를 통과한 상등액을 페이퍼 디스크(paper disk, thick, 직경 8 mm, Toyo Roshi Co.)에 각각 100 ㎕씩 첨가하여 상기 <실시예 2>에서 제조한 검정용 평판배지에 올려놓고 25℃에서 1 ~ 3일간 배양한 후 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum) 피검균의 생육억제 정도를 조사하였다.

그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 형질전환하지 않은 B. subtilis subsp. krictiensis 대조 균주에 비하여, pBT6 클론을 포함하고 있는 B. subtilis subsp. krictiensis(pBT6) 균주의 항균력이 2 ~ 3배 정도 증가한 것을 관찰할 수 있었다. 또한, 형질전환된 균주에 있어서 항균력의 세기는 pBT3, pBT1, pBT6의 순서로 증가되는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 푸사리움 옥시스포럼에 대하여 설팩틴은 항균활성을 나타내지 않으나, 이튜린은 항균활성을 나타내는 상기 결과와 일치하였다. 즉, pBT6 클론의 형질전환에 의해서, B. subtilis subsp. krictiensis 대조균주에 비하여 B. subtilis subsp. krictiensis(pBT6)의 항균활성이 증가하였으므로, 본 발명자들은 pBT6 클론에 이튜린 생합성 유전자가 포함되어 있을 것으로 추정하였다(도 13).

이튜린 생합성능이 소실된 돌연변이주의 제조와 항균활성의 검정

<10-1> 이튜린 생합성능이 소실된 B. subtilis subsp . krictiensis 돌연변이주의 제조

Cosmid 클론의 pJJ121E2 단편 내에 이튜린 생합성 유전자가 존재하는 것을 다시 확인하기 위하여, mini-Tn10을 이용한 상동재조합(homologous recombination)을 통해 염색체 상에 유전자를 삽입시켜 이튜린 생합성능이 소실된 돌연변이주를 제조하고자 하였다. 먼저 EcoRI으로 절단된 pJJ121 단편이 pBC KS(+/-) 벡터(Stratagene)에 삽입되어 있는 pJJ121E2-2 클론으로부터 EcoRI으로 절단하여 pTZ18 벡터(Promega)에 클로닝하고, SalI 부위는 제거하였다.

또한, 이 벡터의 ClaI 부위에 pIC333 벡터가 함유되어 있는 p121E3(도 14) 클론으로부터 스펙티노마이신(spectinomycin) 유전자가 함유된 부위를 BamHI과 XbaI으로 절단하여, pTZ18 벡터의 염기서열을 기초로 PCR을 이용하여 ClaI 부위를 붙인 후 다시 ClaI으로 절단하고, 스펙티노마이신 유전자를 삽입시켜 pJJ121E2-1 벡터를 제조한 후 B. subtilis subsp. krictiensis에 형질전환하였다. 이 때 B. subtilis subsp. krictiensis 내부에 들어간 mini-Tn10을 함유한 스펙티노마이신 유전자 부위는 바실러스 복제 개시점(Bacillus replication origin)을 갖고 있지 않기 때문에 클론의 복제가 더 이상 이루어지지 않고 단지 유사한 부분들이 기주의 염색체와 상동재조합(homologous recombination)을 통해 유전자의 삽입이 이루어지기 때문에 염색체 상에 삽입된 변이주는 스펙티노마이신 함유 배지에서 선발하였다.

구체적으로, B. subtilis 돌연변이-10에는 ORF3의 16,430 bp부터 24,370 bp 부위까지 7,940 bp가 삽입되어 있고, 삽입되어 있는 부위 중 Cla I 부위인 21,046 bp에 스펙티노마이신이 삽입되어 있어 이튜린 생합성이 일어나지 않는 것으로 사료되며, 형질전환 시 효율을 증대시키기 위하여 pJJ121E2-1 벡터의 SalI 부위는 절단하여 제거하였다. B. subtilis 돌연변이-10에 삽입된 ORF3 중 소실된 부위는 도 14에 기재되어 있는 바와 같이 SalI-EcoRI-SalI site인 데 EcoRI-SalI site는 pJJ121E2 단편 유래이며, 전체적으로 소실된 염기배열의 크기는 8.41 kb(8,020~16,430bp)와 EcoRI site 좌측편에 벡터 유래의 SalI 부위 (33 bp)까지 총 8.443 kb이다.

<10-2> B. subtilis 돌연변이-10의 항균력 측정

스펙티노마이신 함유 배지에서 선발된 변이주를 B. subtilis 돌연변이-10이라 명명하고, 항진균 활성을 검정하기 위하여 B. subtilis subsp. krictiensis의 배양액과 돌연변이-10의 배양액을 상기 항균력을 측정하는 <실시예 9>와 동일한 방법으로 피검균 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum) 평판배지에 일정량을 로딩하였다.

그 결과, 이튜린 생합성 유전자의 기능이 상실된 B. subtilis 돌연변이-10의 경우, 겨우 확인이 가능할 정도로 미미한 항진균 활성을 나타낸 반면, B. subtilis subsp. krictiensis는 강력한 항진균 활성을 나타내어, 확보한 유전자는 이튜린 생합성 유전자가 확실시되며, B. subtilis subsp. krictiensis가 나타내는 항균활성과 직접적인 관련이 있음을 확인할 수 있었다(도 15).

<10-3> 서던 혼성화 를 이용한 스펙티노마이신 유전자의 삽입 확인

상기 실시예 <9-1> 에서 제조된 B. subtilis 돌연변이-10에 스펙티노마이신 유전자가 염색체상에 삽입되었는지의 여부를 확인하기 위하여, Mini-Tn10을 함유하고 있는 pIC333 벡터를 함유하고 있는 p121E3 클론으로부터 스펙티노마이신(spectinomycin)을 함유하고 있는 부위를 BamHI과 XbaI으로 절단한 후 얻은 스펙티노마이신 함유 단편을 ³²P 동위원소로 표지하여 프로브로 제조한 후 서던 혼성화를 수행하였다. B. subtilis subsp. krictiensis와 B. subtilis 돌연변이-10 균주로부터 게놈 DNA를 추출한 후, ClaI 제한효소를 이용하여 절단한 게놈 DNA와 스펙티노마이신 유전자를 가지고 있는 p121E3 클론 유래의 BamHI과 XbaI으로 절단한 스펙티노마이신 단편을 동위원소로 표지한 프로브를 이용하여 서던 혼성화를 수행하였다.

그 결과, 도 16에 나타난 바와 같이 프로브로 이용한 스펙티노마이신 유전자를 함유한 p121E3 클론을 BamHI과 XbaI으로 절단한 단편의 1.5 kb 위치에서 스펙티노마이신 유전자가 존재하는 것을 확인할 수 있었으며, B. subtilis 돌연변이-10 균주에서도 스펙티노마이신 유전자가 p121E3 클론 유래의 스펙티노마이신 단편과 동일한 위치에서 존재하는 것을 확인할 수 있었다. 반면, B. subtilis subsp. krictiensis 균주에서는 스펙티노마이신 유전자가 존재하지 않았다(도 16). 이러한 결과로부터 실시예 <10-2>에서 B. subtilis 돌연변이-10 균주가 항균력을 나타내지 않은 것은 스펙티노마이신 유전자가 염색체 상에 삽입되어 이튜린이 생성되지 않았다는 것을 알 수 있었다.

B. subtilis subsp . krictiensis 균주와 B. subtilis 돌연변이-10 돌연변이주의 대사산물 분석

<11-1> HPLC 를 이용한 대사산물 분석

B. subtilis subsp. krictiensis 균주와 B. subtilis 돌연변이-10 돌연변이주의 배양액으로부터 이튜린 항생물질 생성 유무에 차이가 나타나는 지를 규명하고자 하였다. B. subtilis subsp. krictiensis 균주와 B. subtilis 돌연변이-10 돌연변이주의 배양액을 박막크라마토그래피(Thin-Layer Chromatography, TLC)에서 CHC_l3/MeOH/D.W.=75/25/5의 조건으로 전개시킨 후, 각 스팟들의 해당부분을 조제한 뒤, 고속액체크로마토그라피(High performance liquid chromatography, HPLC)로 분리하여 B. subtilis subsp. krictiensis 균주와 B. subtilis 돌연변이-10 돌연변이주 간의 이튜린 생성 유무를 비교하였으며, 상업적으로 판매되고 있는 표준 화합물인 이튜린 A를 대조구로 사용하였다.

그 결과, B. subtilis subsp. krictiensis 균주와 표준물질인 이튜린 A에 대한 고속액체크로마토그라피 크로마토그램은 상당 부분 유사한 피크 형태를 나타내고 있으나, B. subtilis 돌연변이-10 균주에서는 이튜린 A에 해당되는 피크들이 전혀 검출되지 않아(도 17), 상기 실시예 10-2에서 B. subtilis 돌연변이-10 돌연변이주가 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum) 피검균에 항균력을 나타내지 않은 것은 염색체 상에 스펙티노마이신 유전자가 삽입되어 이튜린 합성이 전혀 일어나지 않았다는 것을 알 수 있었다.

<11-2> LC - Mass 를 이용한 대사산물 분석

상기 실시예 <10-1>에서 HPLC를 이용하여 관찰된 B. subtilis subsp. krictiensis 유래의 크로마토그램들이 6 종류의 이튜린 A-F인지의 유무를 조사하기 위하여 LC-Mass를 이용하여 분자량을 조사하였다. HPLC로 분석한 결과 B. subtilis subsp. krictiensis 균주에서는 6종의 이튜린 A~F가 생산되는 것을 크로마토그램을 통해 확인할 수 있었으며(도 18), 이 때 생산된 이튜린 화합물 A~F의 분자량을 Mass spectrometry를 이용하여 [M+Na]⁺로 분석한 결과 각각 이튜린 A~F의 분자량(A: 1043, B:1057, C: 1057, D: 1071, E: 1071, F: 1085)에 해당되는 피크가 검출되었다. 이러한 LC-Mass의 결과로부터 B. subtilis subsp. krictiensis에는 존재하나, B. subtilis 돌연변이-10 돌연변이주에는 존재하지 않는 피크들은 이튜린 A-F와 정확하게 일치하므로(도 19, 20), B. subtilis 돌연변이-10 돌연변이주의 F. oxysporum 평판에서 항균력을 나타내지 않은 원인이 이튜린 화합물의 생산저해로 인한 것임을 재확인할 수 있었다.

이상의 결과를 종합하여 볼 때, 본 연구를 통해 확인한 ORF2-1과 2-2 및 3은 설팩틴 유전자와 74 ~ 98%의 유사성을 나타내었으나, 실제로 이 유전자가 암호화하는 생산물은 설팩틴(surfactin)이 아닌 이튜린임을 확인할 수 있었으며, 이들 유전자는 현재까지 알려진 다른 이튜린 A 생합성 유전자와는 41 %의 낮은 유사성을 나타내고 있기 때문에, 본 실험에 이용된 B. subtilis subsp. krictiensis 균주의 이튜린 생합성 유전자는 현재까지 보고된 유전자와는 다른 형태의 새로운 유전자로 사료되었다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Cloning and determination of sequence of novel iturin biosynthetic genes from antagonistic microorganism Bacillus subtilis and its characterization isolated from same <160> 37 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 34830 <212> DNA <213> Bacillus subtilis subsp. krictiensis <400> 1 cagcttgcat gcctgcaggt cgactctaga ggatcccacc tggctgaacg gctatcaaaa 60 acgctacgtg ttttgtgtat atcaatcgag atgaagaaga tgaaaaagat ttgaaacgga 120 tcaggaaaaa agtttttatt ggtaccagaa tgtaattgaa acaaacggta aaagtttata 180 aaagttccct gagagaaata tgattctctc agggatttct tttacattgc gtctgcatca 240 attatatacg tatccgcatg aagatcggat atttcggcag gcactgaata acaggtaagg 300 ctgtatcggc ctttcggaat attaaagaaa agccgctttg acatcacgct ttcaatctca 360 attccatctt ttacagcctc aaagggaaca gtcgcttttt tctcatagga tagtaccggt 420 tcacttgtgt taagcctgag gacgataaat gccctcgtat ttctccttgc ttcgaatgaa 480 acagctccgt cagcttccgc atatcctttt tcaatggctt catcggtcca atcgataaca 540 ggcggttctg aatctttttg gaagattgta aattgatgat acgaaatggc cagttcttgc 600 ggtttccatg atttattcaa tgcgctgttc ctcctgtttt tttacttgat tttaaataat 660 actctcgttc cgtcgggatc attggtaagc tggtgtccga cccaagagcc ggctccgcgg 720 ttgtctgccg gagaaatata ttctacggag gcattgtttc cgccctgttt acaaaccgcc 780 atcggccatt catccctatc gtatcccgtt ttgacaggca catgtttaag agattgctca 840 cgccgcttat gtactccgtc tctgtcaatg gtgcatatgc tggaatgccc ttcttttatc 900 gcgtccttaa tatgctttgc tgtttccgga tatcgatcgg acggaaatag gattactttg 960 tcgtaatcac tcttctgaac ggtctgctcg ttatctgaga aaagatcacc cttgatcagg 1020 gccgcgactg ctccggcaat gatgataaga acaagcagca gtgcttttaa tgttttcaag 1080 agtatcaatc acctccagtt ttaaattgct gtaaagctgg tccaagaata aagcagaatc 1140 ggccggctgt aaagctgtta aaatatattt ctcagccgca attcagctga atatctgtaa 1200 aaccatccgc acaaatcaat tttattcatt aaatatccga tcagaaagtg ttttttgccg 1260 tttccctatt cagaaatgaa cggttgcggc cgtatcgtca attgacttat tatagcgata 1320 agctcaccgg caggatatct tcgtctgcga gtgtccgacc cgaaaacctt ggcctgcatg 1380 accgtgcgca acaagacgat aaaaagacgg ccatctgata agaaggccgt cagtaaatca 1440 ttccagattc gcatgctttg taaacatgtc tgctgaattc agttcttttt tctccatgat 1500 ttttagaata accgcatcgt aaaacagcag aagagtttgt tcgaataaag aacccatcgg 1560 ctgaatcgtc tttctgtctc cgccggtctc ttccttagga gagccgggaa tcgttatcgt 1620 aagatccgca agtttgccga gacttgaatc ggggttaatc gttaatgcag tgatgatgcc 1680 gttaaggctt ttggcttttt cagccgtatg aagcagactt tttgtttcgc ctgagcctga 1740 gccgatgatg acgagaccgc cttcttggag gggaggggta agcgtctcac cgacgatgta 1800 agcgttcagg ccgatgtgca tcatcctcat ggcgaacgct ttagccataa agccggaacg 1860 ccccgctccg gacgtgaaga tttgatctgc cgataaaatc tcatctgcaa gcttgtcagc 1920 ttcactgtcg gctattaatg ctgcggtgcg ggatatttca ttgagtattt catgtaagta 1980 ttcagtcgtt ttcatgatcc ttgtgaaatc agctgtttca ttttagcagc agcatccgct 2040 ttattgtcag ctcccgtaat gcctccgccg acaatgatta aatctgggtt ttgtttgatg 2100 gcttcaggaa gcgtatcaag tttaatgcct ccggcaattg cggttttagc gctcttgacc 2160 gcttttttaa tcgccgtcag ttcctcgaat gaattctttc cttctgcttg aagatcataa 2220 cctgtgtgaa cacaaatata atcaacaccg agttggtcaa tttcttttgc ccgtgtttca 2280 aggtttttta cgttaatcat gtcgacgaga atttttttct gctgtttttt tgcttcggca 2340 accgcccctt tgatcgttga gtcgtctgtc gctcctaaaa cggtgatgat gtcggcgccc 2400 gcttctgccg ctttcatgat ctcgtagccg cctgcatcca tgattttaag atcggcaagc 2460 actttcaggt gaggaaaggc tgatttcatt tcctgtacgg ctttcaggcc ttcattaatg 2520 acaacgggag tgccgatttc tacaacatct atatattgtt cgacctcttt cacaagttca 2580 attgcttccg ggatattcac taagtctaat gccagctgta attccacttt atatccactc 2640 ctctttttca tgtatttaca ttctatagag tgccccgcat gttgagaagt acgcactttg 2700 aagtctaata gttactttga ggatactgtc cccgcaggca atgcgctgtg tttcagcaaa 2760 actgcgtggt agtataaact gatgaaagtt gtgtaaaaaa gtaagcgtgt atgaatagat 2820 gatgaacgta caaaaagtaa gaggaaggag aatggcccgt gagccgaatg gatgagaaaa 2880 cgtttaattg cgaaaaggaa ttgacgcttg ccgtgatagg cgggaagtgg aaaatgctga 2940 ttatgtggca cctggggaaa gaaggaacaa agcggtttaa tgagctgaaa gctttaattc 3000 cggatattac gcacaaaatt cttgtgaatc agctcaggga gctggagcag gatctgatcg 3060 ttcacaggga agtttaccct gtcgtccctc cgaaagtgga gtactcatta acagagcaag 3120 gagagaccct tatgccgatt ttggacgcca tgtataagtg gggaaaagaa tatatggaat 3180 taatcaacat tgataaaact gcaataaagg aatctttttg aagcgctcta tgtaaaatag 3240 agtgcttttt ttgcggttta atgaaatcat attgcgaacg attaaatctc ctgtttcggt 3300 tcttgcgctg ttttttcccc atcatctcat atatgaaaac tattttcatt ctgccataac 3360 tggatattcg agagatttat actatagttt aaagattttt aattttacat aaataatatt 3420 tttaaaaata aattgcggga tgccgcaaaa taccctctgg aattgtcgga atttttttcg 3480 gtgtgccgaa tgaaactttt cacccatttt tcggtgataa aaacaataat ttcatataaa 3540 gtgaacgtaa gtagatatat agtaattcat gaagaaatag gtaaaccctg ttgcttacaa 3600 acattggatt cttgtcttga tttctcataa atttgagccg catttcggac tgtgcgggtg 3660 agtggattgc ggatttcggc ggtgattgaa tcgggatcgt tttggaggta agtggttctt 3720 ttggcttgat aatgagttag ggacattgag ggaggctgtt tctaagggag aattgacaat 3780 tttatcttaa aaaggggagg cgcacacata tggaaataac tttttatcct ttaacaaatg 3840 ctcaaaaacg tatctggtat acagaaaaat tctatccgaa cacaagtatt tcaaatcttg 3900 ccgggttcgg gaaactcatt tctgacgacg gcgtacaggc tcattacgtt gagaaagcga 3960 tacaggaatt cgtccggcgg tatgagtcga tgagaatccg tctgcggctt gatgatgagg 4020 gggagcccgt tcaatatgtg agcgattacc gtccgctgac tatcgaacat acagacatca 4080 ggcaagccgg ctgctctgcg gaagagctgt caaaatgggg acgtgacgag gcaagcaagc 4140 ctctggcatt atatgatcag gatttattcc gtttttccgt gtataccatc agcgaaaatg 4200 aggtctggtt ttacgttaat gtgcatcaca ttatttcaga cgggatttcc atgacgattc 4260 tgggcaatgc gattactgat atttatttgg agctttcggg cggagcaagt atggaacaga 4320 cggagattcc tccttatcga gcatgtgctg actgagcagg aatatgtgca gtcgaagcgg 4380 ttaaaaagga tcgggatttt tggaacgggc agttcgagac cgtgccggag cttgtgtccc 4440 tgaaacggag ccaggcagat gcgggtcttg atgcgaaacg gttttctcaa gaaattcctc 4500 acgacttata tggccgcatt cattcattct gcgaggagca taaagtcagc gtactatctc 4560 tgttccaatc agctttgatc acttatctct acaaagtgac cggccgggat gacgttgtta 4620 cgggtacgtt tatgggaaac cggacaaatg cgaaagaaaa gcagatgctc gggatgttcg 4680 tatctacggt tcctgtgcgg acaagcgttg acggaggaca gtcgttcttg gaattcgtta 4740 aaggccggat gaaggatctg atgaaaattc tccgccacca aaagtatccg tataacctgc 4800 ttgtcaatga tttgcgcgct tcgaaaagtt cgctgagcag attgtttacg gtggctctgg 4860 agtaccaggt gatgcagtgg cagaaaaaag agaatctgtc cttcctgaca gaccctattt 4920 tcagcggaag cggtacaaat gatatttcga ttcatgtgaa ggaacgatgg gacactggga 4980 aattgacgat tgattttgac tatcgcagcg acatattcaa gggagaggag attgtatctg 5040 tttctgaacg tttgatcacg ctgattgaag atgcgatttc atctcctgat cgcataattg 5100 atgagcttac tcttctttct gaatccgaga aagagcggct gttgacacgg gcctcaggca 5160 atccggtgaa ttaccgcggg gagatgacga taccggggct gtttgaagag aaagtgaagt 5220 cactgtctga caaaccggcg gtggtgtatg aaggccgaac attgtcctat cgcacattgc 5280 atgaacagtc aggccgaatt gccggacgtc ttcttaatgc cgggatatca gccgattctc 5340 ctgtcgcggt gctgcttggc cgttctgagc gtgttattgc ggcaatattg ggaattttga 5400 aagcgggcgg cgcctatgtg ccgatagatc ctgactttcc ggcggatcgg attcagtaca 5460 ttttggagga cagcggagcg aaggctgttc tgacagaggc cggaatacag gcgcctgcag 5520 cggatgccga acggattgat tttgacgagg ctgttcagtt tgaaacggct gcggacggtg 5580 tcagtacaca atcagaccgg ctggcttaca tcatctacac gtcaggtaca acggggcggc 5640 cgaaaggcgt gatgattgag caccggcaag ttcatcatct ggtgcaatca ctgcagcagg 5700 agatttatca atgcggtgag cagacattaa gaatggcgct tttggctccg tttcattttg 5760 atgcgtccgt caaacagatt tttgcctcgc ttcttttggg acagacgctt tatatcgtgc 5820 cgaaaacgac tgtaacgaat ggctcggcac tgctggacta ttatcgtcaa aaccggattg 5880 aagccactga cggaacccct gcgcatctgc agatgatggt tgcggcggga gatgtcagcg 5940 gaattgaatt gcgccacatg ctcattgggg gagagggcct gtccgccgct gttgctgaac 6000 agctgatgaa cctctttcat caatcgggca gggcgccgcg tctgacgaat gtctacgggc 6060 cgacagaaac gtgcgtagat gcgtccgtgc atcaggtgtc agccgataac ggaatgaatc 6120 aacaggcggc gtacgttccg atcggaaaac cgctcggcaa cgcccgtctg tatatattgg 6180 ataagcacca gaggcttcag cccgacggga cggccggtga gctgtatatc gcgggtgacg 6240 gtgtaggccg cggctattta aatcttccgg atttgaccgc agagaagttt ttgcaagatc 6300 cgtttaacgg aagcggccgc atgtaccgca cgggtgatat ggcgcgctgg ctgccggacg 6360 ggacgatcga atatatcggc cgtgaagatg atcaggtgaa agtccgcggc taccgtattg 6420 agctgggaga aattgaaacg gtgctcagaa aagctccggg ggcggcgcag gccgtcgtgc 6480 tggcacggcc ggatcagcag ggcagcttag atgtttgcgc atatatcgtt caggaaaaag 6540 gaaccgagtt tcaccctgcc gagtacaggg agtatgtgtc caagcacctt cctgattaca 6600 tggtgcccgc ttactttaca aaaacggacg aaattccgct cacgccgagc gggaaggcgg 6660 accgcaaaaa gctgtttgcg cttgatgtgc aggctgtcag ctcatccgaa tatgccgcgc 6720 cgagaaacga aacggaggaa acgctcaccg tcatctggca ggaagtcctc ggaatggaca 6780 aggcgggcat ttatgatcat ttcttcgagt caggcggtca ttcattaaag gcaatgacgc 6840 ttctgacgaa aattcataag caaatgggcg ttgaaattcc gctgcaatac ttgtttgagc 6900 atccgacgat tgcggcgctt gccgattatg cggaaaaccg aaacgaagga ccggcattca 6960 gggcgattga gccggctgag aagcaggcga gctatccgct ttcgctcgct cagcagcgga 7020 cttatatcgc gagccaattt gaagatgcgg gagtcggata taacatgccg gctgcggccg 7080 tgattgaggg cgctttagac cttgaaaagc tcgagcgtgc attttctgcc ttaatcagca 7140 ggcatgaagc gctcagaaca tcgtttcaat cggaggacgg cacgccgaga caggtggttc 7200 acgaacatgt tccgtttcat attgaaatgc tcgaagcgcg cggaagaacg aatgaacagg 7260 tcatgaagga ctttgtgcgc cgttttgatt tatctgaggc gccgctgttc agaatcggcc 7320 tgcaaacgct cggtcacaat cgccatatgc tgctgtttga tatgcatcac ctgatttctg 7380 acggggtgtc tatttccatc atgctgaagg aactggctga catctacggc ggaaatcagc 7440 tgcctgaatt gcgcattcaa tataaagatt atgccgtatg gcaggcggaa cgggcgaaag 7500 aaggctacaa gaaggagcgg gcgtactgga aagaagtctt cagcggcgaa ctgccggtgc 7560 ttcagctgct ccctgattat ccgcggccgc aaatgcaaag ctttgaaggt gaccgcgtgt 7620 ccgccaagct gccgaaaatg ctgcgggaac ggctgcagaa gcttgccgag aaaaacggag 7680 ccacccttta catggtgctg ttatcggcat actatacgct gctttctaag tattcgggac 7740 aggaagacat catcgtggga acaccgtcag cgggaagaaa tcactctgat accgaggggc 7800 ttatcgggat gtttgtcaac acgcttgcgc tgcgaagctc cgtgaagcag gatcagacat 7860 ttgccggctt gttaggtcat gtgcgcaaac aggtgctgga cgcgttttcc catcaggatt 7920 atccgtttga gtggctgacc gaggagctga acgtgccccg ggacatgagc aggcatccga 7980 tatttgacac gatgttcagt ctgcaaaatg cttcggacgg aattccggag atcggcaacc 8040 tgacgctgtc tcttcatgaa accaacttca atatcgctaa attcgatctg acaatgcagg 8100 cccgggaaac agcggaaggc attgcgctcg atttggatta ttgcacgaag ctgtttaagc 8160 gctcaactgc ggatcgcatg cttgcgcact atgtccgtct gctggagagt gcggcagctc 8220 agccggatgc gaaaatcagc gaatatgatc tgctttctga acgggaggct ttgaaccaat 8280 tacagcggtt caatccggag cgcacggcat acccgaaaga gcaaacgatc gtgcagatct 8340 ttgaagaaca ggcccgaaag aaccctgacc ggacggctct tcagttcgaa ggggaaactc 8400 tgtcgtatca gcagctgaat gaacgcgcca acaggcttgc gcggcatatt ctttcggtcg 8460 gaggcggcgg gaaaaccgcg gctgttttat gtgaacggtc aatggacatg attgtttcca 8520 ttatggctgt gttaaaagcg gggtccgcct atgtgccgat tgatcctgag catccggttc 8580 agcggattca gcatttcttc cgcgacagcg gggcgaaagt gctcctgact cagcaaagcc 8640 tcaagccgct tgcggaaaag gccggttttc aaggcgccat tgtgcttgct gatgatgagg 8700 cgagctatga aaaggactct cgcaatccag cattgccgtt tgactccagc acaattgcca 8760 atcttactta tacatcaggc acgacgggaa cgccgaaagg gaacatcgtc acacatgcca 8820 acattttgcg gacggtaaaa aacacgaact atttgaccgt ttctgaagag gacacagtgc 8880 tcggtctgtc aaactacgtc tttgacgctt ttatgtttga tatgttcggt tcgctgttaa 8940 acggtgcaaa gcttgtgatc gtcccgaaag atacggtgct ggacatgtcg cgcctgtccc 9000 gtgtgatcaa acgggagaac gtcagcattc tgatgattac gacggccctg ttccacctgc 9060 ttgttgatat ggagccgtcc tgtctgacga cgcttcggaa aatcatgttc gggggcgaaa 9120 gagcgtctgt agaacatgtc aaaaaggcgc tggcggcagt cgggaaagga agactgcttc 9180 atatgtacgg tccgtcggaa agcacggtgt ttgcgacata ccatccggtg gatgtcattg 9240 aagaggatac gctctccgtt ccgatcggta aaccggtcag caatacggaa gtctttatta 9300 tgaactcagc cggacgcatt cagccggcgg gtatcgcggg agagctgtgc gtcagcgggg 9360 aaggtctcgt agaaggctac tacaaccgtc ctgaactgac ggaagaaaaa tttgtaaagc 9420 atccgtttaa ggaaggtgaa cggatgtata aaacgggcga cttggccaga tggcttccga 9480 atggcgatat cgagtttatc ggacgcatcg accatcaggt gaaaatccgc ggtcagcgga 9540 ttgagcttgg cgaaattgag catcagcttc aaagccatga tcagattcag gaatgcatag 9600 tgctcgctgt ggatcagggc gcgggtgaca aacttctttg cgcgtatttt gtcggcctca 9660 gggaaatatc ttcccgggag ctgagggagc atacggcgaa ggatcttccg gcttatatga 9720 ttccgtccgt ctttattcaa ttggatgaac tgcctcttac agggaacgga aaaatcgaca 9780 ggcgggcgct gccgatgccg gatgtgaccg cagcgaatgc cgtgtcatat acggcgccgc 9840 gcaatgaaac agaaaaaaaa ctggcggata tttgggctga ggtgctgcaa atggaacggg 9900 tcggcgtcca tgatcagttc tttgagatcg ggggccactc gttagcgggg atgaaactgc 9960 tggcccttat ccagaagaca ttcggcgtgc agcttacctt aaaggacctg ttcacttctc 10020 cgacggctgc tgggctggcg cagctgattg aaggggctga gcggaaggcg gctgagagca 10080 tcgcaccggc tgccgagcgg gaaacgtatc cggtttcttc accgcagaag cggatgttcg 10140 tgcttcagca gctggaaggc gctgaaacaa gctataacat gccgtctgtg ctccgcttaa 10200 aaggaaagct tgatgcagaa aagctgaaat ccgtcatgaa acagctgaca gaacgccatg 10260 aagccttcag aacgacattt gacataaagg atggagaaac ggttcagcgt atatgggcgg 10320 aagcttatat cgacatggaa tattatgaag cctctgaaga agatgctgaa cagattattc 10380 agagctttat ccggccgttc cgtctggatc agcttcctct cgtcagaacg gggctggtca 10440 agctggctga acatgaccac ctgctgctgt ttgatatgca ccatatcatt tcggacggcg 10500 cttcagtcgg cgtgctgata gatgaactgt cccgcttgta tggcggcgaa acgcttgagc 10560 cgctgcggat tcattataaa gactatgcgg tatggcagca gaaatttatt caatcagagc 10620 agtaccgcaa gcaggaggag cattggcttc gggagcttga cggcgagctt ccggtattga 10680 cgctgccggc tgattacagc cgtccggccg tgcaaacctt tgaaggagac aagctggtct 10740 tttctctgac tgaggaacag acgtcggctc ttcgcagtct tgcgaaacaa acggattcta 10800 ccatgtacat ggtgctcctg gcgtcgtaca gcgcctttct ctcaaaactg agcggacagc 10860 atgacatcat tgtcggctcg ccggctgcgg gacggtcaca tgcggatctc gcaaacgtca 10920 tcggtgtttt tgtgaataca ctcgcgctgc gtacgtatcc ggaagcggac aaaacgttca 10980 cggactatct taaagaagtg aaacaaaccg ctttacatgc atttgacgcg caggattatc 11040 cgcttgaaga ccttctgcaa aaggttgagg tgcagcgtga tacgagccga aatccgctgt 11100 ttgatgcggt attctcaatg caaaatgcaa atgctgaaga tctggtcatg gaaggaattg 11160 agctgaagca ccatccgttt gacagaaaaa cagccaagtt tgacctgacg ctgacggctg 11220 aggacacaga cgaaggctta acgtttgtgc ttgaatataa caccgcgctg tttaaaccgg 11280 aaacagcaga gacgtggaag cattattggc ttcaactgtt aaaagccgca acggaaaatc 11340 cggctgcgaa gctttctgag ctttccttgg tgaatgaaac agaaaaacaa gccctccttg 11400 acgcatggaa aggaaaaaca ctctctgtgc cgcaggacaa aacggttcac cgtctctttg 11460 aagaaacagc cgcccgctac gcgaatcggc cggccgcggc atataacggc gcgaaatgga 11520 cgtacggcga gctgaacgca agggcgaacc ggatcgcgcg cattctcata gactgcggcg 11580 tcacggctga cgaacgtgtc ggcattttga cgaaaccgtc cttggaaatg gccgcgggcg 11640 tactcggcgt cctgaaagcg ggcgcggcat ttgtgccgat tgaccccgac tacccacaag 11700 agcggatcag ctacattctg caggacagcg gcgccaagct ccttctcaca caggaagcgc 11760 tggacgtgcc ggatggctac acaggagaaa cgatcctgct tgacggcgga cgctccattc 11820 tgagcctgcc gcttgatgaa aacgatgaag cgaacccgca gactgaaaca acggcggatc 11880 atctcgctta tatgatttac acgtcaggaa cgaccggaca gccgaagggt gtcatggtcg 11940 aacaccatgc gctggtgaac ctgtgcttct ggcatcacga cgcattcgcc atgacggcgg 12000 atgataaaag cgccaaatac gcgggcttcg gttttgacgc ctccatctgg gagatgttcc 12060 cgacatggac catcggcgcg gaacttcacg tcattgacga agcgatccgg ctggatatca 12120 cccgcttaaa tcactatttc gaggagcacg gcgtgaccat caccttcctg ccgacgcagc 12180 tggccgaaca atttatggag ctggaaaata cctctctccg catgcttctc gtcggcggcg 12240 acaagctgaa gcgggcggtg aaacagccgt acacgatcgt caacaactac ggcccgacgg 12300 aaaacaccgt cgtcgcgaca agcggcgtca tcaatcctga ggaaggatcg ctttcgatcg 12360 gacgggcgat tgccaatacg agagcttata ttctcggcga cggcgatcag gtgcagccgg 12420 aaggcattgc cggtgaattg tgcgtggccg gccgcggtct ggcacgcgga tacctgaacc 12480 gtgaagaaga gacggcgaag cggtttaccg cagatccgtt cgtgcccggc gagcgcatgt 12540 accggaccgg cgacctcgtc aaatggaacg cgcagagcgg catcgaatac atcggccgta 12600 tcgaccagca ggtcaaagtg cggggctacc ggatcgagct ttcagaaatc gaagtccgcc 12660 tcgcccagct tgcggatgtt catgacgcag cggtgacggc ggtggaagac aaagcaggca 12720 atgccgcgct ttgcgcctat gtcgcgcctc agcaggacga tattgaagcg ctcaaagccg 12780 cgctgaaaga cacgcttccg gactacatgg tgccggcgtt ctgggtggag atggacgagc 12840 ttccggtcac cgcaaacgga aagattgaca aaaaagccct gccggaaccg gacattgaag 12900 cgggaagcgc cgcttacaaa gcgccggaaa cggagatgga gacgctgctt tccgacattt 12960 gggaggaagt gctcggtctt gatcagatcg gcgtaagcga taatttcttc acgctcggcg 13020 gcgactcaat caaaggcatc caaatggcga gccgcctgaa ccagcacggc tacaagctgg 13080 agatgaaaga tctcttccag cacccgacca tcgaagagct cgtctcttat gtggagcgga 13140 cggaaggcaa gcaggccgac cagggacctg tcgaaggcaa agcggagtta acgccgatcc 13200 agcgctggtt ctttgagaaa aacttcacgg acaaacacca ctggaaccaa tccgtcatgc 13260 ttcacgcgaa agacggcttt gatccggaga taacagaaaa aacattacat gtcctgacgg 13320 tgcaccatga tgcgctccgg atgatttatc gtgaacaaaa accgtactac agagggcttg 13380 aggatgcgtc tgttgaactg aacgtctttg agctgaacgg acctgctgaa gatcatgaga 13440 accgtatcga acgggaagca gaccgtcttc aaagcagtat ttcactggaa acaggacatc 13500 tgctgaaggc cgggctcttc cgggccgaag atggagacca ccttcttctc gcaatccatc 13560 atttagtcgt ggatggtgta tcttggcgga ttttactgga ggacttcacg tccgtttata 13620 cgcagctgaa gcaaggcaat gaaccggcgc tgcctccgaa aacacattca ttcgccgaat 13680 ttgctgagag aatcaaagag tacgcaaata cgaaggcgtt tctgaaagaa gcggattact 13740 ggagggagct tgaggagaaa gaggtatgca ctcagcttcc gaaagacagg cagtctggcg 13800 atcagcgcat gagacatacg agaacggtca gtttctctct gacgcctgaa caaactgaac 13860 agctgacgac gaacgtacat gaagcctacc atacggaaat gaacgacatc ctgctcacgg 13920 cgctcggact ggcgctgaaa gagtggacgg gtgaagacac gatcggcgtt catttggaag 13980 gccacgggcg cgaagacatt cttgacgggc tgaatatcac ccggacggtc ggatggttta 14040 cgagcatgta tccgatgatc cttgagatga agcacgccga cgatctttca tatcagctga 14100 aacaaatgaa agaagacatc agacacatcc cgaacaaagg agtcggctac ggcattctgc 14160 gttatgtaac ggcgcctgag cataaagagg gtctttcatt tgagattgat ccggatatca 14220 gctttaacta cttaggccag tttaatgaga tgtcggattc cggcttattt acaagatccg 14280 ggatgccgtc aggacaatcg ctgagccctg acacagagaa gccgaatgcg cttgatattg 14340 tcggatttat agaaaatggg cagatgacga tgacgtttgc ctatcattct ctcgaatttc 14400 atgaaaaaac cattcaatcg ttcagtgaca gctttaaagg gcacctcttg aaaatcatag 14460 atcactgcct ggcccaagac ggacctgagc ttacgcctag cgatcttggc gatgatgatc 14520 tgacgcttga tgaacttgat aaattaatgg aaattctcta acagaaaaga cagaggtgac 14580 atatgagcaa aaaatcgatt caaaaggtgt atgcactcac accgatgcag gagggaatgc 14640 tgtatcatgc gctgcttgat ccgcattctt cctcctactt cacacaatta gagcttagga 14700 ttcacggaag ctttcagctt gagctttttg aaaaaagtgt caatgagctg attcggacat 14760 atgacatcct gcgtacggta ttcgtgcacc agcagcttca aaaaccgcgc caagtcgtat 14820 tagcagagcg gaagacgaag gtgcactatg aagatatcag tcaattagat gaagcgcgcc 14880 aaaccgaata tattgaacgc tataaacgcg atgtgcagca gcagggcttt catctggcga 14940 aggatattct ctttaaagcg gcggtgttca ggctcagtga gaaggaactg tatctcgtct 15000 ggagcaatca tcatatcgtc atggacggct ggagtatggg cgttttgatg aaaagcctgt 15060 ttcaaaacta tgaagcgctt cgtgccggcc ggcccgccgg gggaagccag ggcaaacctt 15120 actctgacta tatcaaatgg ctcggaggca gggattatga ggaggcggaa caatattgga 15180 gcagccgcct ggcggatttc gaacagccga gcctgctccc gggccgtctg gcaccagaaa 15240 agaaagacta ccaaaatgaa gaatattctt ttgtctggga tgaagagctg gtcgcgcaga 15300 ttcagcagac cgccaaccgg catcaagtca cggggcctaa cctgtttcag gccgtttggg 15360 gtgcggtgct cagcaaatac aactatacag acgatgtggt gttcggcacc gtcgtatcag 15420 gccgtccttc agaaatcaac ggcattgaaa cgatggcggg gctgttcatc aatacgattc 15480 ccgtcagaat caagattgac aaagatgcag ccttttctga cgtgatggcg gcagttcaga 15540 aaaacgccgt ggaagccgag cgctatgatt atgtgccgct ctatgacatt caaaagcgct 15600 ccgctctgga cggcagcctc ttgaatcatt tggtcgcgtt tgaaaactat ccgctggaca 15660 aagagctgga aaacgggggc atggaggaaa gactcggctt ttccattaaa gttgaacatg 15720 cttttgagca gacgagcttt gatttcaatc tcatcgtgta tccgggaaaa acgtggactg 15780 tcaaaatcaa atacaacgga gcggctttcg ctcatgatgc catcgaacga acggcgcatc 15840 atctgacctg catgatgaaa gcggcggtcg gaacgcctga tgcgcccgtg cgggaactcg 15900 gccttgtttc aggcgaagaa gagcggcaga ttgttgagat attcaatgat acaaaaacgg 15960 cgcttccgga agaggaggcc gttcaccgtt tgtttgaagc acaggcaaac cggacgcctg 16020 caagcatcgc gataaaagaa gcgggacgcg aatggaccta ccgtgaagtg aacgaagcgg 16080 ccaaccgcct ggcgagacac tttgtgaaga gcgggctgga aaaaggccgg accgccgcta 16140 ttatgaacga ccggtctgcg gaaaccgtta tcggaatgct tgccgtccta aaagcaggcg 16200 gcgcctatgt gccgattgat ccggcttttc cggaggaccg tctccgcttt atggcggaag 16260 acagctcgat tcggcttgtg ctgacagttc aggactatca agaacaagcg ggcacattgc 16320 aagtcccgat tgtcatgctg gatgaaagcg aggatgaaac gctaagcgga acagacttga 16380 atcttccggc cggcggcaac gacttggcgt atatcatgta tacatccggg tcgaccggaa 16440 aaccgaaagg cgtcatgatt gaacacagaa atatcatcag gctcgtcaaa cattcgaatt 16500 acgtgccggt tcatgaagaa gaccggatgg cgcaaacggg agccgtcagc tttgatgccg 16560 gaaccttcga agtcttcggc gcattgctga acggagcggc attgcacccg gtgaaaaaag 16620 agacgctgct tgacgccgga cgattcgccc aatttctgaa agagcagcgg atcacgacca 16680 tgtggctgac gtctccgctg tttaatcagc ttgcccaaaa ggatgccggc atgtttaaca 16740 cgctccggca cctcatcatc ggcggtgatg cgcttgtgcc gcatatcgtc agcaaagtga 16800 ggaaggcatc accggagctg tcgctttgga acggctacgg gccgacggag aatacgacgt 16860 tttcgacgag ttttctcatt gatcaggact acgacggttc gatcccgatc gggaagccga 16920 tcggaaattc cactgcgtac attatggacg aaaaccgcaa cctccagccg atcggcgcgc 16980 ccggggagct gtgcgtcggc ggaagcggag tggcaagagg ctatgtgaat ctgcctgaat 17040 taacggagaa gcagtttgtc cgcgatccgt tcagaccgga tgaaatgata taccggacgg 17100 gggacttggc gaagtggctt ccggacggca cgatcgagtt tctcggcaga attgacaacc 17160 aagtaaaggt ccgcggtttc agaatcgagc tcggcgaaat tgaggcgaaa atcagccagg 17220 cggagaatgt gacggaatct gcggctgtga tccggaaaaa taaagcggat gaaaatgaaa 17280 tctgcgctta ctttaccgca gaccaagccc tttcgccgga agacctgcgc aaaacgcttt 17340 cggaatcact tccggaatac atgattcccg cgcacttcat ccagatgaat cagtttccgc 17400 tgacggcgaa cggaaagatt gataaaaaag cgctgcctga gcctcaggct gaagccgttc 17460 aaaaagaata cgaagcgccg aaaacggaag cggagcagaa actcgcggac atttgggaag 17520 gtattctcgg tgtaaaagcg ggtgtgactg acaatttctt cacgattggc ggacattctt 17580 taaaagccat gatgatgacc gctaaaatcc aggagcactt tcaaaaagaa gtgccgatta 17640 aagtgttatt tgaaaagccg accattcagg agcttgcgca ttatttggag catgagaccg 17700 aggaggaaca gcagtttgaa ccgatccgac aagcgcctta tcagaagcat tatcctgttt 17760 cctcagcaca gcgcaggatg tatatcctta atcagctcgg acaggccagc acgagctaca 17820 acgtccctgc tgtacttctg ctggaaggat cagtagacaa aaaccgtctt gaagaggcca 17880 tgcaggcatt aatcaaccgt catgagacac tgcgtacgtc gtttgacatg gcagatggag 17940 aagtcgtgca gaccattcat aaaaatgtgt cgtttgagct tgaaaccgcc gagggccggg 18000 aagaagatgc agaagagctg acaaaagcct ttatcaggcc gtttgcgctc aatcgtgcgc 18060 cgctggtccg ttcgaagctg atccggcttg aagaagaccg gcatcttctg ctgattgaca 18120 tgcaccacat tattacggac ggaagctcaa tgggcatttt catcggtgat cttgcgaagc 18180 tttatcaagg cacggagctt gagctgccaa agattcatta taaggatttt tcagtctggc 18240 agcgtgaaaa agcaaatctt gatcagcacg aagcttactg gcttgatacg ttcaaaggcg 18300 atctgccggt gctggatctg ccgcttgatt tcccgcgtcc tgccgagcgc agttttgaag 18360 gggaacgcgt catcttcggg cttgataaac aggtgacggc gcagattaag aagctgctgg 18420 ctgatacgga tacgacgatg tacatgttct tgttagccgc ttttcaagtg ctgctgtcca 18480 aatattcggg gcaggaagac atcatagtcg ggtctccggc ggccggaaga cagcatcctg 18540 atctccaaga cgtgccgggc atgtttgtca acacagttgc gcttcggtcg catcctgccg 18600 gcaaaaaaac gttcaagcaa tttctggatg aagtgaaaac ggcgagcctt caagcttttg 18660 agcatcaaag ctatccgctt gaagaattaa ttgaaaaact gccgttaacg agggacacaa 18720 gccggagtcc gctgttcagc gtgttattta atatgcagaa catggagatc ccggccctgc 18780 ggctcggaga tttggagatt tcttcttact ccatgcatca tcatgtcgct aaatttgatc 18840 tttccttaga agcggctgag cgcggagaag aggtcggatt gagctttgat tacgcgaaag 18900 ccttatttgc ggacgaaacc atccgccgct ggagcgctca ttttgtcaat ctgattaaag 18960 cctgcgccga aaatccggat attcagctgg ccgacgcaag cctgctgtcc gctcctgagc 19020 gggaagcgct cctttctgat gaaaaacgga cggaagcgga tctgcctgag ggcacttttg 19080 tttcgctgtt tgaacggcaa gcgcaaaaaa cgcctgatct cacggcggtt gcgggcggaa 19140 caagtctgac atatcgtgag cttgatgaac gctcgaaccg gtttgcccga caccttcagg 19200 cttgcggaac gggcagtgag gacatcgtgg ccattatgat ggatcgttcg gccgacttga 19260 ttaccgcgat tctcggcgtc atgaaagccg gagcggcatt tctcccgatt gatccggaga 19320 ctcctgaaga gagaatccgc tactctctcg aagacagcgg aacgaagctt ctggtcgtca 19380 atgagagaaa catgaccgcg gccgccgttt ataaagaaaa aacggtcgta atggaagacg 19440 gagaatggca gaacgaaagc gccgaccggc ttgaaacgga gcccggcgcc gaccggcttg 19500 cctatatcat ttatacctcg ggaacaacgg gcaaaccgaa aggcgtccag ctggagcacc 19560 gcaatctaat caattatgtc acatggttca gccgtgaagc cggtttgacc gaagctgaca 19620 aatccgtgct gctgtcttct tatgcatttg atctcggcta tacggccata ttcccgattc 19680 ttcaggcggg cggcgagctg cacattgtgc cgaaggagac gtacaccgcg cctgatcagc 19740 ttggtgagta tatacagaaa aacggcatta cgtatatgaa actgacgccg tcattgttcc 19800 atatgatcgt caatacagcc cgttttacgt cagaatgccg tttcagcccg cttcgtttag 19860 tggtgctcgg cggagaaaag atcatcacgt ccgatgtccg caagtttcat gacgtatacg 19920 cccataccga ctttatcaat cactacggac cgacggaaac gacgatcggc gccattgcgg 19980 aacggatcaa tatggagtgt cttgatcaat atgagcagcg tcccgtcatc ggccgcccga 20040 tcgcaaatac cggcgcgctt gtattggacg gagcaatgca gctcgttcct ccgggcgcaa 20100 gcggcgagct ttatattacc gggaaggggc ttgccagagg atatcttcac cgtccgcagc 20160 tgacggcgga gaaatttctc tcaaatcctt tttcaccgga cagcctgatg tacaaaacgg 20220 gagatatcgt ccgcaggctt cctgacggga cgattgaatt tatcggccgt gcggatgatc 20280 aggtgaaaat ccggggctac cgcattgaat taaaagaggt tgaaaccgtg ctgttaagcg 20340 taaacggcat tcaggaggcg gtcgttctcg cagtcagcga aggcgggctg ccggaactgt 20400 gcgcgtacta taaagccgac agcgggctga aaggctctga gcttcgcaaa cggctttccg 20460 aaacactgcc gtctcatatg cttccggcct atttcgtgca agtagaccgc attccgctca 20520 cagccaacgg aaaaaccgat aaaaacgccc tcccgaaacc gggcgtcagc caaacggcgc 20580 aaattgcttc agccttgccg gaaacggaat tggaggaaaa gctgtgccgc atttggaaac 20640 agacactcgg tacggatacg ctcggcatcg acgataattt cttcgattac ggcgggcact 20700 ctttaaaagg aatgatgctc ctcgccaata ttcaggctga actggacaaa acggttccgt 20760 taaaagcgct gttcgaacag ccgactgtcc gcctgcttgc cgcatatatc gaaaaatcgg 20820 cggtatctga gggatatcgg atgatcacac cggcagacag tgcagacgcg tacccgttat 20880 catccgccca aaaacggatg tacgtcctga accagcttga ccgggagaca atcagctata 20940 atatgccgtc cgttcttctg atggaaggag aagtcaatat ttcaaagctt caggaagcgc 21000 tcaatcagat gatcaaccgc cacgaatctt tgcggacgtc ctttatcgat aaaaaaggcc 21060 agccgatgca gcagatcgca gaacaggctg acattgacct gcacatcttt gaagcagcgg 21120 acgaggagaa agcggatctt atcattcagg cattcattaa gccgtttgat ctgagcgcgg 21180 ctccgctcat tcgggccgct cttgtcagac tgaatgaaaa gaaacacctg ctgctgctgg 21240 atatgcatca tatcattgcc gacggcgtgt ccagaagcat gctggtcaaa gagctcgctc 21300 acctttacaa aggcggaagt ctgccgtcgc cgaacctgca ctataaagac ttcgccgtct 21360 ggcagaatga acctgagcag gccgaacgga tgaaagacca tgagcgttat tggctctccg 21420 cattttccgg cgagcttcct gaattgaatc tgccgaccga ttttccccgt ccgccggttc 21480 aaagttttaa aggacagtcc gtccgtttca gagcggggcg tgagacggaa aaagcggtgc 21540 gtgaattaat ggaatcatcg ggagcgactc ttcatatggt gcttcacgcc gcgttccatg 21600 tctttttgag caaaatcacg ggccagcgcg atatcattat cggttcggtg accgccggaa 21660 gaacgagcgc cgaagttcag gaaatgccgg ggatgtttgt caatacgctt gcgcttcgca 21720 atgaaacgca aaaagagcag accttcgccg ggctgctcga acgggtgaaa caaaccaatc 21780 tcgacgcgct ggcgcatcag gattatccgt ttgaggatct gatcggaaag cttgacctgc 21840 cgagagatat gagccgcaac ccgctgttcc aggtgatggt gacgacagaa gatccggata 21900 aagaaacact ggaactggag aacctgcgca tcactccgta tgagtcaaac caaggcacgg 21960 cgaaattcga tctgacactc ggcggcttta cggatcaaga aggtctcggc cttcagtttg 22020 aatatgcgac tgatctgttt aaaaaagaaa ccattgaaaa gtggagcgcc gggttcctgc 22080 ggattctgaa gcaagcggcg gaaagcccgg acagaaagct gcctgagatt tcactgatca 22140 gcgatgctga aaaacaagcc ctccttgacg catggaaagg aaaaacactc tctgtgccgc 22200 aggacaaaac ggttcaccgt ctctttgaag aaacggccgc ccgatacgcg aaccggccgg 22260 ccgcggcata taacggcgcg aaatggacgt acggcgagct gaacgcaagg gcgaaccgga 22320 tcgcgcgcat tctcatagac tgcggcgtca cggctgacga acgtgtcggc attttgacga 22380 aaccgtcctt ggaaatggcc gcgggcgtac tcggcgtcct gaaagcgggc gcggcatttg 22440 tgccgattga ccccgactac ccacaagagc ggatcagcta cattctgcag gacagcggcg 22500 ccaagcttct tctcacacag gaagcgctgg acgtgccgga aagctacaaa ggagaaacga 22560 tcctgcttga cggcggacgc tccattctga gcctgccgct tgatgaaaac gatgaagcga 22620 acccgcagac ggaaacaacg gcggatcatc tcgcttatat gatttacacg tcaggaacga 22680 ccggacagcc gaagggtgtc atggtcgaac accatgcgct ggtgaacctg tgcttctggc 22740 atcacgacgc attcgccatg acggcggatg ataaaagcgc caaatacgcg ggcttcggtt 22800 ttgacgcctc catctgggag atgttcccga catggaccat cggcgcggag cttcatgtca 22860 ttgacgaagc gatccggctg gatatcaccc gcttaaatca ctatttcgaa gagcacggcg 22920 taaccatcac cttcctgccg acgcagctgg ccgaacaatt tatggagctg gaaaatacct 22980 ctctccgcat gcttctcgtc ggcggcgaca agctgaagcg ggcggtgaaa cagccgtaca 23040 cgatcgtcaa caactacggc ccgacggaaa acaccgtcgt cgcgacaagc ggcgtcatca 23100 atcctgagga aggatcgctt tcgatcggac gggcgattgc caatacgaga gcttatattc 23160 tcggcgacgg cgatcaggtg cagccggaag gcattgccgg cgaattgtgc gtggccggcc 23220 gcggtctggc acgcggatac ctgaaccgtg aagaagagac ggcgaagcgg tttaccgcag 23280 atccgttcgt gcccggcgag cgcatgtacc ggaccggcga cctcgtcaaa tggaacgcgc 23340 agagcggcat cgaatacatc ggccgtatcg accagcaggt caaagtgcgg ggctaccgga 23400 tcgagctttc agaaatcgaa gtccgcctcg cccagcttgc ggatgttcat gacgcagcgg 23460 tgacggcggt ggaagacaaa gcgggcaatg ccgcgctttg cgcctatgtc gcgcctcggc 23520 aggacgatat tgaagcgctc aaagccgcgc tgaaagacac gctgcctgac tacatggtgc 23580 cggcgttctg ggtggagatg gacgagcttc cggtcaccgc aaacggaaag attgacaaaa 23640 aagccctgcc ggaaccggac attgaagcgg gaagcgccgc ttacaaagcg ccggaaacgg 23700 agatggagac gctgctttcc gacatttggc aggaagtgct cggtcttgat cagatcggcg 23760 taagcgataa tttcttcacc ctcggcggtg actcgatcaa aggcatccaa atggcgagcc 23820 gcctgaacca gcacggctac aagctggaaa tgaaggatct cttccagcac ccgaccatcg 23880 aagagctcgt ctcctatgtg gagcggacgg aaggcaagca ggccgatcag ggacctgtcg 23940 aaggcgaagc ggagttaacg ccgatccagc gctggttctt tgagaaaaac ttcacggaca 24000 aacaccactg gaaccaatcc gtcatgcttc atgcgaaaga cggctttgat ccggacctgg 24060 tggaaaaaac cctgcaagca ttgattgaac accatgatgc gctccgcatg gtttaccgtg 24120 aagaaaggga aggcatcatt cagacatacc tccctgtcac agaatgcaag gcaagctttg 24180 aaatcgttga tctgtacgga acggacgagg atatgctgaa aagccagatt cagcggcttg 24240 ccgatcatct tcagggcagt cttgatctgg agaacggccc gctgttaaaa gcggagcaat 24300 accggacaga acaaggcgat catctgttaa tcgcggttca ccatctcgtc gtggacgggg 24360 tttcatggag aattctgctt gaggatttcg cttcaggtta taaacaggcg cagcagcaaa 24420 acagcatcgt tctcccgcaa aaaacccact cctttaaaga ttgggcggag gcgctgaaca 24480 cgtttgcgca atcagaagag ctgaaaaagc aggcggatta ttgggcgcag gcagatgcgg 24540 aagaactgcg gccgctgccg aaagaccatg atccggacaa acggctcgtc aaacatacgg 24600 cggccgtgaa atgtgaattg actgaggaag aaacggcaca gctgctgaca gatgttcatc 24660 atccgtacgg aacggaaatc aacgacattc tgctcagcgc gctcggctta acgatcggtg 24720 aatggacgga aaacggcaaa gtcggcatca acttagaagg acacggccgg gaagaaatca 24780 taccgaatgt caatatttca cggacggtcg gctggtttac ggcccaatat ccgttgattc 24840 tgcagatcag caaggaagac ggcgtctctt ccgtcattaa aacggtaaaa gagacagtgc 24900 ggcgcgttcc agataaaggt gtaggatacg ggattctccg gtatctgtca tccgatgaaa 24960 cagaaaaagg cgccgcgcct gaaatcagtt ttaactactt ggggcagttt gacaatgaag 25020 tgaaaacgga atggtttgag ccgtctccat atgatatggg acgtcaagtc agcgaagagt 25080 cagaggcgtt atacgcactg agcttcagcg ggatggttac aggcggccgc ttcgtcattt 25140 cctgctcata caatcaggaa gaatatgaaa gaagcaccgt cgaaacacag atgcagcggt 25200 ttaaagacaa tcttttaatg atcatccgcc attgcacggc caaagaggag aaagaattta 25260 cgccgagcga tttcagcgcg caggatcttg agatggatga aatgggagac atctttgaca 25320 tgcttgagga gaatttaacg tgacaaaaac agttaacaga aggggggagc ggagcagatg 25380 agccagttca aaaaagatca agttcaggac atgtattatt tgtcgccgat gcaggaggga 25440 atgctgtttc atactctcct gaatcccggc caaagctttt acatcgaaca aatgacaatg 25500 agagtaaaag gcagcttgaa tatcaaatgc cttgaagaaa gcatgaatgt gatcatggac 25560 cggtacgatg tatttcgtac cgtgttcatt cacgaaaaag taaaaaggcc ggtccaagtc 25620 gtattgaaaa aacggcagtt tcagatagaa gaaatcgatc tgacacactt aacgggcagc 25680 gagcaagcat ccaaaattaa tgaatacaaa gaacaggata agatcaaggg ctttgatttg 25740 acgcgggata ttccgatgcg ggcagccatc tttaaaaaat cggaagaaag ctttgaatgg 25800 gtgtggagct accaccacat cattttggac ggctggtgct tcggcatcgt cgtgcaggat 25860 ctgtttaagg tatacaatgc cctgcgagaa caaaagccgt acagcctgcc gccggtcaaa 25920 ccgtataaag actatatcaa gtggcttgaa aagcaggata aacaagcatc actgcattac 25980 tggcgcgggt acttagaaga ttttgaagga caaacgacat ttgcggagca aagaaagaaa 26040 caagagaacg gctatgagcc gaaagagctg ctcttctcac tgccggaggc ggaaacaaaa 26100 gcatttaccg agcttgcaaa atcgcagcat actactttga gtacggcgct gcaggcggtt 26160 tggagtgtat taatcagccg ctaccagcag tccggcgatt tgatcttcgg cacagtcgtt 26220 tccgggcgtc ccgcagaaat caaaggcgtt gaacatatgg tcgggctgtt tatcaatgct 26280 gttccgaggc gggtgaagct gtctgaggat accacattta acggcttgct caagcagctg 26340 caggagcaat cgctggagtc tgagcctcat caatatgtgc cgctctatga catccaaagc 26400 caggccgatc agccaaagct gattgaccac atcattgtgt ttgaaaatta tccgcttcag 26460 gatgcaaaaa atgaagaaaa cagtgaaaac ggctttgata tggaggacgt ccatgttttt 26520 gagaaatcga attatgatct caacctgatg gcttctccag gtgatgagat gctgattaag 26580 cttgcctata acgggaatgt gtttgatgag gcgtttatcc tacgcttaaa atctcagctt 26640 cttacagcga ttcagcagct catccagaag ccggatcagc ctgtcaatac gatcagactt 26700 gttgatgaaa aggaaagaga gcttctgctt accggcttaa acccgccggc tgagactcat 26760 caggcgaagc ctctgacgga ttggttcaag gaagcggtga atgtaaatcc tgatgcaccg 26820 gcgcttacgt attccggcca gactctttcc tatcgcgaat tagatgagga agcgaaccgt 26880 cttgcgcgcc gtttgcaaaa gcaaggtgcg ggtaaagaca ccgttgtcgc gttgtacacg 26940 aagcgctcgc ttgaactggt gatcggcatt ctcggcgtat taaaagcagg agcggcttat 27000 ctgccggttg atccgaagct gccggaggac cgaatctcgt acatgctgac tgacagtgcg 27060 gcagcctgtc tgctgacaca tcaggagatg aaagaaaaag cggctcagct gccgtataca 27120 ggaacaacac tcatcatcga tgatcaagca cggtttgagg aacaggcaag cgatcctgca 27180 gccgcaattg atcccgatga tccggcgtat attatgtata cgtccggcac aaccggaaag 27240 ccgaagggca atatcaccac tcatgccaat atacaaggat tggtcaagca tgtagactat 27300 atggcatttt ctgaacaaga tacgttctta tctgtttcga attacgcctt tgacgcattt 27360 acttttgatt tctacgcatc aatcctgaat gcggcacggc tcattatcgc agatgaacat 27420 acactgcttg atacagaacg gctcactgat ctgatccggc aggagaatgt caatgtcatg 27480 tttgcgacaa ccgcactttt taatcttctc accgatgcgg gagaggagtg gctgaagggg 27540 ctccgctgtg tgttattcgg gggtgagcgc gcgtctgtgc ctcacgtcag aaaggcgctt 27600 gagatcatgg ggcccggcaa gctgattaat tgctacgggc cgactgaggg aacggtgttt 27660 gcgacagctc acgtcgtgca tgatataccg gattccattt cctcattgcc gatcggaaag 27720 ccgatcagca atgcaagtat ttatattctt aacgggcaaa accagcttca gccgttcgga 27780 gctgtcggtg aactgtgcat cagcggaatg ggtgtatcaa aagggtatct gaaccgtcac 27840 gacctgacga agcaaacgtt tatcccaaat ccgttcaagc cgggagaaac gctttaccgc 27900 acaggggatt tagcacgctg gctgccggat gaacgattga atacgccggg cgtattgacg 27960 accaggtcaa atacgcgtca ccggattgaa cttgaagaaa tcgaaaagca gctgcaggaa 28020 tacccgggtg tgaaagatgc ggtcgttgtt gcagaccgcc atgagtccgg agatgcatca 28080 atcaacgcct atctcgtgaa ccggacgccg ctttcagctg aagacgtaaa gaggcacttg 28140 aaaaaacagc ttcctgctta catggtgccg caaaccttta ctttcttaga agagcttcct 28200 ttaacgacaa acgggaaggt caataaacgg cagctgccga aaccggatca ggctcaggcg 28260 gcgaaagaat ggatcgggcc tcgaaacgcg acggaagaaa cgattgcaca catctggtcc 28320 gagattctcg gcagacagca gatcgggatt catgatgatt tcttcgcgct cggaggccat 28380 tccttaaaag cgatgacggc agcgtcgcgc attaaaaaag agctcggtac ggacatcccg 28440 gtgcagctgt tattcgaagc gacgacaatc gcagacattg ccggttatct gcttcacggt 28500 gaagaaaaag gaatgaaaga tctcaccatc atgaataaaa atcagtctga cacactgttt 28560 gcgttcccgc cggttctcgg ttacgggctg atgtaccagc cgctggcaaa acagctgtcc 28620 ggctatagaa tctgtgcgtt tgattttatc gaggaagaca accgcatcga acgctacaca 28680 gagctgatca atcagctcca gccggaagga ccggtcaagc tgttcggata ctcggcaggc 28740 tgcacgctcg cctttgaaac ggccaaacgg cttgaagccg aaggacgtaa agtggagcgg 28800 ctgatcatgg ttgattccta taaaaaacaa ggcgtcagcg acttggaagg ccgcaccgta 28860 gaaagcgatg tccaggcgct gatgaaggta aaccgggata acgaagcgct gaatgacgaa 28920 gccgtcaaag aaggtctcgc caaaaaaaca aacgcgtttt attcttattt cgtgcatacc 28980 gtcagcaccg gcacggtcaa tgcggatata gatctattaa cgtcagaacc ggactttgcg 29040 atgccgccgt ggctcgcttc gtgggaggaa gccacgacag gtgaataccg tgtgaaaaaa 29100 ggctgcggca gtcacgcaga aatgctacag ggagaatgtc tcgaaaggaa tgcggcatat 29160 ttgctcgaat tcctaaggaa ggaacatccg aagctgacag cttcacgata gaaaaggagg 29220 aagcccgcca atggtccagc tctttaaatc gttcgatacc acggaaaaaa cgcagcttat 29280 ctgttttccg ttcgcaggag gctattccgc atcattccgc ccgctccaca cctatcttca 29340 aggtgagtgt gagatgcttg ccgcggaacc gccgggacac ggaacaaatc aaatgtccgc 29400 cgttgaggat tttgaacagc ttgtcagttt atacaagcag gagttgaatc tccatcctga 29460 ccgcccgttt gtcctgttcg gccacagtat gggaggcatg gtcgctttca ggctggcgca 29520 aaagctggag cgggagggga tttacccgca ggccgtgatc atctcagcca ttcagccgcc 29580 gcatgttgaa aggaaaaaag tgtctcatct tgatgatgaa aaatttctcg cccatattat 29640 cgagctgggc ggaatgccgc aggagttagt ggagaataag gaggtcatgt catttttcct 29700 gccttctttc aggtccgact accgcgcgct tgaaagcttc cgtccgtctg attctcacat 29760 gattcaatca cccgtccata tttttaacgg gcggaaagat aaaaaatgta tcaaagatgc 29820 ggacggatgg aaaaaatggg ccgacaatcc cgtatttcat gagttttcgg acggccacat 29880 gttcatatta agtgaaactg aaaaagtggc ggaacgaata tatgagatta ttaacaggag 29940 cactgcaggc caattgttat aggatatgac agacagcatt cgctgtctgt tttttgtaac 30000 aaaatctgcc cgtgagtttt ctcatttatc aaaaatttta tgttatgatt tgatggaata 30060 taattttgaa gggattgtcg tacatgaatg atgcagcaaa agagctgaac agaacattat 30120 cggaagaaaa cccgcacgtg cttcatatgc tttctgattt gggcagagag ttgttttatc 30180 cgaaaggggt gctgacacaa tcggcggaag cgaaagccaa ggccggaaag tataatgcca 30240 cgatcgggat tgccacctca caaggcgagt ccatgcactt ttcccatatt caagagacac 30300 tgtccgccta taaccccgat gatatctacg attatgctcc gccgcaggga aaagagccgc 30360 tcagacagga atggctgaaa aaaatgcgtc tcgaaaatcc ttcattagcc ggcaaagaca 30420 tcagcacgcc gatcgtgaca aacgctttaa cacacgggct gagcattgcc gccgacttgt 30480 tcgtcaatga aggggatgcg ctgcttctgc cggataaata ttggggaaat tacaatttta 30540 ttttcggtgt ccggcgcaag gcatccattg agacgtaccc gctttttcag caggatgggc 30600 gttttaatgc ggcggggctg tccgagctgc tgaaaaagca ggaagaaaag gcgattgtcg 30660 tgctgaattt cccgaataat ccgacaggct atacgccggg ggaagaggaa gcgtcagaaa 30720 tcgtcagtgt gatcctggag gcggcggagg ccggcaaaga gattgtcgtg ctcgtagacg 30780 atgcgtatta caatctgttt tacgatgaaa cggccattca ggaatccatc ttcagcaaac 30840 tcgcccaagt gcacgaccgg gtgctttgcg taaaaataga cggcgcgacg aaggaaaatt 30900 atgcgtgggg cttccgcgtc ggttttatta cgtacagcac aaaaagcgaa aaagcgctgc 30960 gcgtgctcga ggaaaaaaca aaagggatta tcaggggaac gatttcaagc gccccgcatc 31020 cgtcccaaac gtttatgctg cgggcgatgc agtcaccgga atacgagaaa gaaaaatcgc 31080 tgaaatataa tatcatgaaa aaacgggctg acaaagtgaa agccgttctt gcagaaaaca 31140 agcactatga agacgtatgg acgccttatc cgtttaactc gggttatttc atgtgtgtcc 31200 ggctgagaga cataaacgcc ggtgaattaa gagtgtcatt gcttgaaaag agaggaatcg 31260 ggacgatatc cattaatgaa accgatttgc gaatcgcatt ttcatgtgtt gaagaagaat 31320 acatcgcgga tctgttcgaa gaaatttatc aagaagcaaa gcagctgcag aaacaggcgg 31380 aaatatcagg ctgacaaaaa aaggaggggg ataccctcct ttttctatgc ttacagcagc 31440 tcttcatacg ttttcatctc aatcccgtca caaaaatcgg gatgcgccgc acaaacggcc 31500 agcttatatt cctcgtccgc atcatatgtg cggatgaaac aaggttcatg tccgtccggg 31560 agctcaatgg acacatggcc gtcgtctttg aggcggacgc tgaatgaatc aagcggaagg 31620 gaaagccctt ttccggcctg cttgataaag ctttctttca tcgaccacag gtggtaaaaa 31680 taatcggtct gctgatcggg gtgtttcgct tgcagatcac tgtattccgt cggcgaaaaa 31740 aaacgtttgg cgatatcaat cgtgccgggc ttcatttttt caatatctat gccgatcggt 31800 tttgaatcaa cggcacacac gatccagcgc ccggagtggg aaatgttaaa gtgcatgtcc 31860 ggaagcgcgg ggatgtacgg ctttccgtat tcctggacgc tgaatgaaat cccggccgga 31920 tcaagtccgt aagccttcgc cgcagcggtg cggatcagca tgtcgccgat caaggtgcgg 31980 tgagcatcct ccttatggta aaagcgccgg catttttccc gcttttcggc ggacacggcc 32040 gccatcatcc gatcctcttc ccctgcagaa agcgggcggt ccatatatac tccgtaaatc 32100 ttcatgtcca gatcctccgt ctgaaaatat tgtcaaaacc atcctaccat atcagacgaa 32160 agctgtccga aaataaaaaa acaaaaccgt ttcggctttg tttttaatga acggacgttg 32220 cccgcccgga gatcgcgtat gttaacagtt tagaggactg cggcaaagaa aaacgcagaa 32280 tcagccccgt caaaacagcc gtaataatgg ttccggcgcc gatcggtccg cccatcaccc 32340 aggctgcggc aagaatcgtc agctcaatgc cgttccgcac ccattgcacg ttccagcccg 32400 ttttttcaga tatcagcatc atcagagagt cccgggggcc cgcgccgagc cctgctgata 32460 cgtaaatacc gacgccgcag ccgatcagca gcaatccgat agaaaaaaac acggccgcta 32520 aggaaaaagc gtgcgcctca ggaagcagaa acgagaagaa atcaataaac attcccatca 32580 gcaccatgtt taagatagcg ccgattttcg ggagtgtcct cgtgaacagg caggttaaag 32640 ccacgatgac cgcgccgacc aagatggacc attggccgac agatagcccg aaatgctgaa 32700 aaagcccata atgaaaggca tcccaagggt tgatgccgag agcttttcct ttaatggtta 32760 acgatacccc gaaagacaaa atcaacagac cggcaaaata aaacgtccag cgcatcaaga 32820 attcccgctt caaagaggtc ccttctttca taacattcat taattgtcat tgtagcataa 32880 ccgcccaaaa aaagaagaag cgaaatcagt gtttcgcttc ttctccggct actacaaagg 32940 attcagtata cgatttaaaa accgctgcgt gcgttcttct ttcggcgcgg aaaaaatctg 33000 ggccggcggt ccttgttcca caatgacgcc gccgtcaatg aagatgactt catcggccac 33060 ttcctgcgcg aatttgattt catgggtgac gacgaccatc gtccagcctt cgttcgccag 33120 atccttaatc actttgagca cctcgccgac cagctccgga tcaagtgctg acgtcggttc 33180 gtcaaacagc atcagctcgg gctgaatcgc aagcgcgcgg gcgatgccga cccgctgctg 33240 ctgaccgccg gaaagctgga acggatataa atccattttg tctttcagtc cgactttttc 33300 cagaagctct atcgcttctt ttctgacttg ctccttgtcg cgcttttgca cttgaacggg 33360 tccttccatg acgttttcaa gcgccgtgcg gtgaggaaac agatgatacg cctgaaagac 33420 catgcctgat ttgcggcgga ggcggagaat atcagcctgc ttcacttttt tggagaaatc 33480 tattgaaaaa tcggagaatg ccagctcgcc gcgattgggg atctcaagcg cgttcagaca 33540 gcgcagaagc gtcgtttttc ctgaaccgga cggtcccaga atggcgatga ctttcccttt 33600 ttctatctcc atatctatct tttttaaaat ttcattctgt ccgaatgatt tatttaatcc 33660 tttgacggaa agcatatcga aacctcctta tttggccaca taacggtcga gacgccgttc 33720 gatcacatgc tgtacgattg acagcaagaa gcagatgatc caatagataa aggcggcttc 33780 aatatagatg accaagattt gatcaaggtt ttgcgcgccg atttcctgcg cttttctgaa 33840 cagctccgcg acgagaatct gtgacgcgag agatgtatcc ttgatcaggc tgataaatgt 33900 atttgataat ggcggaatgg acacgcgaaa cgcctgcggc aggatcacgc ggaacaatgt 33960 ctttcgatag gtcatgccga tcgtataacc ggcttcccat tgccctttcg gcacggatga 34020 aatagatgcc cggatgattt cagaagcata ggcgcccacg tttaatgaaa acgcgatgac 34080 tgcgcttggg aaagggtcca gcgtaatatt aaatgtcggg aacagataaa aaatgatgaa 34140 caattgaacg agaagaggag tgccgcgcac cgctgatacg tatacgctga acacccatct 34200 caatggtttc atatttgaca ttctggcgag cgccgtaatc agcgcgatga tcattccgaa 34260 aataaaggaa agaatggtaa ggggaatcga gtaatagatt cccccggaaa gaatcggcca 34320 gaatgactgc tgcaccaaat cccacggaat ggctgttgca atcacgggtt ccggcatgtt 34380 acttagaaac atcttcgccg aaccattttt tcgctatttt agaaagagtc ccgtcctctt 34440 tcatttcttt taacgctttg ttgacgtgag tcacaagttc gccgcttcct tttcggaatg 34500 cgaaatatgt ctgctgcggc tggcctgctt caaacgcgat tttcacgttt ttattgccgg 34560 acgtttttaa gtagttcagt acggcaagct tatcgttgta agtcagatca gcgcggccct 34620 gctgaatgag ctgaagggat tgcgccatgc cttcaacgcc ttcaattttc gcgccggctt 34680 ctttcgctaa tttattgtaa ttgcttgtta atgactgagc cgctgttttt cctttgacat 34740 cagcctcttt cgcaatcgtg ctgtcttttt tcgtcacgac gactgcattt gacgttgtgt 34800 atttatcaga aaaatcatat tggttctcac 34830 <210> 2 <211> 420 <212> DNA <213> Bacillus subtilis subsp. krictiensis <400> 2 gatgaacgta caaaaagtaa gaggaaggag aatggcccgt gagccgaatg gatgagaaaa 60 cgtttaattg cgaaaaggaa ttgacgcttg ccgtgatagg cgggaagtgg aaaatgctga 120 ttatgtggca cctggggaaa gaaggaacaa agcggtttaa tgagctgaaa gctttaattc 180 cggatattac gcacaaaatt cttgtgaatc agctcaggga gctggagcag gatctgatcg 240 ttcacaggga agtttaccct gtcgtccctc cgaaagtgga gtactcatta acagagcaag 300 gagagaccct tatgccgatt ttggacgcca tgtataagtg gggaaaagaa tatatggaat 360 taatcaacat tgataaaact gcaataaagg aatctttttg aagcgctcta tgtaaaatag 420 420 <210> 3 <211> 10500 <212> DNA <213> Bacillus subtilis subsp. krictiensis <400> 3 tttatcttaa aaaggggagg cgcacacata tggaaataac tttttatcct ttaacaaatg 60 ctcaaaaacg tatctggtat acagaaaaat tctatccgaa cacaagtatt tcaaatcttg 120 ccgggttcgg gaaactcatt tctgacgacg gcgtacaggc tcattacgtt gagaaagcga 180 tacaggaatt cgtccggcgg tatgagtcga tgagaatccg tctgcggctt gatgatgagg 240 gggagcccgt tcaatatgtg agcgattacc gtccgctgac tatcgaacat acagacatca 300 ggcaagccgg ctgctctgcg gaagagctgt caaaatgggg acgtgacgag gcaagcaagc 360 ctctggcatt atatgatcag gatttattcc gtttttccgt gtataccatc agcgaaaatg 420 aggtctggtt ttacgttaat gtgcatcaca ttatttcaga cgggatttcc atgacgattc 480 tgggcaatgc gattactgat atttatttgg agctttcggg cggagcaagt atggaacaga 540 cggagattcc tccttatcga gcatgtgctg actgagcagg aatatgtgca gtcgaagcgg 600 cgggtacgtt tatgggaaac cggacaaatg cgaaagaaaa gcagatgctc gggatgttcg 660 tatctacggt tcctgtgcgg acaagcgttg acggaggaca gtcgttcttg gaattcgtta 720 aaggccggat gaaggatctg atgaaaattc tccgccacca aaagtatccg tataacctgc 780 ttgtcaatga tttgcgcgct tcgaaaagtt cgctgagcag attgtttacg gtggctctgg 840 agtaccaggt gatgcagtgg cagaaaaaag agaatctgtc cttcctgaca gaccctattt 900 tcagcggaag cggtacaaat gatatttcga ttcatgtgaa ggaacgatgg gacactggga 960 aattgacgat tgattttgac tatcgcagcg acatattcaa gggagaggag attgtatctg 1020 tttctgaacg tttgatcacg ctgattgaag atgcgatttc atctcctgat cgcataattg 1080 atgagcttac tcttctttct gaatccgaga aagagcggct gttgacacgg gcctcaggca 1140 atccggtgaa ttaccgcggg gagatgacga taccggggct gtttgaagag aaagtgaagt 1200 cactgtctga caaaccggcg gtggtgtatg aaggccgaac attgtcctat cgcacattgc 1260 atgaacagtc aggccgaatt gccggacgtc ttcttaatgc cgggatatca gccgattctc 1320 ctgtcgcggt gctgcttggc cgttctgagc gtgttattgc ggcaatattg ggaattttga 1380 aagcgggcgg cgcctatgtg ccgatagatc ctgactttcc ggcggatcgg attcagtaca 1440 ttttggagga cagcggagcg aaggctgttc tgacagaggc cggaatacag gcgcctgcag 1500 cggatgccga acggattgat tttgacgagg ctgttcagtt tgaaacggct gcggacggtg 1560 tcagtacaca atcagaccgg ctggcttaca tcatctacac gtcaggtaca acggggcggc 1620 cgaaaggcgt gatgattgag caccggcaag ttcatcatct ggtgcaatca ctgcagcagg 1680 agatttatca atgcggtgag cagacattaa gaatggcgct tttggctccg tttcattttg 1740 atgcgtccgt caaacagatt tttgcctcgc ttcttttggg acagacgctt tatatcgtgc 1800 cgaaaacgac tgtaacgaat ggctcggcac tgctggacta ttatcgtcaa aaccggattg 1860 aagccactga cggaacccct gcgcatctgc agatgatggt tgcggcggga gatgtcagcg 1920 gaattgaatt gcgccacatg ctcattgggg gagagggcct gtccgccgct gttgctgaac 1980 agctgatgaa cctctttcat caatcgggca gggcgccgcg tctgacgaat gtctacgggc 2040 cgacagaaac gtgcgtagat gcgtccgtgc atcaggtgtc agccgataac ggaatgaatc 2100 aacaggcggc gtacgttccg atcggaaaac cgctcggcaa cgcccgtctg tatatattgg 2160 ataagcacca gaggcttcag cccgacggga cggccggtga gctgtatatc gcgggtgacg 2220 gtgtaggccg cggctattta aatcttccgg atttgaccgc agagaagttt ttgcaagatc 2280 cgtttaacgg aagcggccgc atgtaccgca cgggtgatat ggcgcgctgg ctgccggacg 2340 ggacgatcga atatatcggc cgtgaagatg atcaggtgaa agtccgcggc taccgtattg 2400 agctgggaga aattgaaacg gtgctcagaa aagctccggg ggcggcgcag gccgtcgtgc 2460 tggcacggcc ggatcagcag ggcagcttag atgtttgcgc atatatcgtt caggaaaaag 2520 gaaccgagtt tcaccctgcc gagtacaggg agtatgtgtc caagcacctt cctgattaca 2580 tggtgcccgc ttactttaca aaaacggacg aaattccgct cacgccgagc gggaaggcgg 2640 accgcaaaaa gctgtttgcg cttgatgtgc aggctgtcag ctcatccgaa tatgccgcgc 2700 cgagaaacga aacggaggaa acgctcaccg tcatctggca ggaagtcctc ggaatggaca 2760 aggcgggcat ttatgatcat ttcttcgagt caggcggtca ttcattaaag gcaatgacgc 2820 ttctgacgaa aattcataag caaatgggcg ttgaaattcc gctgcaatac ttgtttgagc 2880 atccgacgat tgcggcgctt gccgattatg cggaaaaccg aaacgaagga ccggcattca 2940 gggcgattga gccggctgag aagcaggcga gctatccgct ttcgctcgct cagcagcgga 3000 cttatatcgc gagccaattt gaagatgcgg gagtcggata taacatgccg gctgcggccg 3060 tgattgaggg cgctttagac cttgaaaagc tcgagcgtgc attttctgcc ttaatcagca 3120 ggcatgaagc gctcagaaca tcgtttcaat cggaggacgg cacgccgaga caggtggttc 3180 acgaacatgt tccgtttcat attgaaatgc tcgaagcgcg cggaagaacg aatgaacagg 3240 tcatgaagga ctttgtgcgc cgttttgatt tatctgaggc gccgctgttc agaatcggcc 3300 tgcaaacgct cggtcacaat cgccatatgc tgctgtttga tatgcatcac ctgatttctg 3360 acggggtgtc tatttccatc atgctgaagg aactggctga catctacggc ggaaatcagc 3420 tgcctgaatt gcgcattcaa tataaagatt atgccgtatg gcaggcggaa cgggcgaaag 3480 aaggctacaa gaaggagcgg gcgtactgga aagaagtctt cagcggcgaa ctgccggtgc 3540 ccgccaagct gccgaaaatg ctgcgggaac ggctgcagaa gcttgccgag aaaaacggag 3600 ccacccttta catggtgctg ttatcggcat actatacgct gctttctaag tattcgggac 3660 aggaagacat catcgtggga acaccgtcag cgggaagaaa tcactctgat accgaggggc 3720 ttatcgggat gtttgtcaac acgcttgcgc tgcgaagctc cgtgaagcag gatcagacat 3780 ttgccggctt gttaggtcat gtgcgcaaac aggtgctgga cgcgttttcc catcaggatt 3840 atccgtttga gtggctgacc gaggagctga acgtgccccg ggacatgagc aggcatccga 3900 tatttgacac gatgttcagt ctgcaaaatg cttcggacgg aattccggag atcggcaacc 3960 tgacgctgtc tcttcatgaa accaacttca atatcgctaa attcgatctg acaatgcagg 4020 cccgggaaac agcggaaggc attgcgctcg atttggatta ttgcacgaag ctgtttaagc 4080 gctcaactgc ggatcgcatg cttgcgcact atgtccgtct gctggagagt gcggcagctc 4140 agccggatgc gaaaatcagc gaatatgatc tgctttctga acgggaggct ttgaaccaat 4200 tacagcggtt caatccggag cgcacggcat acccgaaaga gcaaacgatc gtgcagatct 4260 ttgaagaaca ggcccgaaag aaccctgacc ggacggctct tcagttcgaa ggggaaactc 4320 tgtcgtatca gcagctgaat gaacgcgcca acaggcttgc gcggcatatt ctttcggtcg 4380 gaggcggcgg gaaaaccgcg gctgttttat gtgaacggtc aatggacatg attgtttcca 4440 ttatggctgt gttaaaagcg gggtccgcct atgtgccgat tgatcctgag catccggttc 4500 agcggattca gcatttcttc cgcgacagcg gggcgaaagt gctcctgact cagcaaagcc 4560 tcaagccgct tgcggaaaag gccggttttc aaggcgccat tgtgcttgct gatgatgagg 4620 cgagctatga aaaggactct cgcaatccag cattgccgtt tgactccagc acaattgcca 4680 atcttactta tacatcaggc acgacgggaa cgccgaaagg gaacatcgtc acacatgcca 4740 acattttgcg gacggtaaaa aacacgaact atttgaccgt ttctgaagag gacacagtgc 4800 tcggtctgtc aaactacgtc tttgacgctt ttatgtttga tatgttcggt tcgctgttaa 4860 acggtgcaaa gcttgtgatc gtcccgaaag atacggtgct ggacatgtcg cgcctgtccc 4920 gtgtgatcaa acgggagaac gtcagcattc tgatgattac gacggccctg ttccacctgc 4980 ttgttgatat ggagccgtcc tgtctgacga cgcttcggaa aatcatgttc gggggcgaaa 5040 gagcgtctgt agaacatgtc aaaaaggcgc tggcggcagt cgggaaagga agactgcttc 5100 atatgtacgg tccgtcggaa agcacggtgt ttgcgacata ccatccggtg gatgtcattg 5160 aagaggatac gctctccgtt ccgatcggta aaccggtcag caatacggaa gtctttatta 5220 tgaactcagc cggacgcatt cagccggcgg gtatcgcggg agagctgtgc gtcagcgggg 5280 aaggtctcgt agaaggctac tacaaccgtc ctgaactgac ggaagaaaaa tttgtaaagc 5340 atccgtttaa ggaaggtgaa cggatgtata aaacgggcga cttggccaga tggcttccga 5400 atggcgatat cgagtttatc ggacgcatcg accatcaggt gaaaatccgc ggtcagcgga 5460 ttgagcttgg cgaaattgag catcagcttc aaagccatga tcagattcag gaatgcatag 5520 tgctcgctgt ggatcagggc gcgggtgaca aacttctttg cgcgtatttt gtcggcctca 5580 gggaaatatc ttcccgggag ctgagggagc atacggcgaa ggatcttccg gcttatatga 5640 ttccgtccgt ctttattcaa ttggatgaac tgcctcttac agggaacgga aaaatcgaca 5700 ggcgggcgct gccgatgccg gatgtgaccg cagcgaatgc cgtgtcatat acggcgccgc 5760 gcaatgaaac agaaaaaaaa ctggcggata tttgggctga ggtgctgcaa atggaacggg 5820 tcggcgtcca tgatcagttc tttgagatcg ggggccactc gttagcgggg atgaaactgc 5880 tggcccttat ccagaagaca ttcggcgtgc agcttacctt aaaggacctg ttcacttctc 5940 cgacggctgc tgggctggcg cagctgattg aaggggctga gcggaaggcg gctgagagca 6000 tcgcaccggc tgccgagcgg gaaacgtatc cggtttcttc accgcagaag cggatgttcg 6060 tgcttcagca gctggaaggc gctgaaacaa gctataacat gccgtctgtg ctccgcttaa 6120 aaggaaagct tgatgcagaa aagctgaaat ccgtcatgaa acagctgaca gaacgccatg 6180 aagccttcag aacgacattt gacataaagg atggagaaac ggttcagcgt atatgggcgg 6240 aagcttatat cgacatggaa tattatgaag cctctgaaga agatgctgaa cagattattc 6300 agagctttat ccggccgttc cgtctggatc agcttcctct cgtcagaacg gggctggtca 6360 agctggctga acatgaccac ctgctgctgt ttgatatgca ccatatcatt tcggacggcg 6420 cttcagtcgg cgtgctgata gatgaactgt cccgcttgta tggcggcgaa acgcttgagc 6480 cgctgcggat tcattataaa gactatgcgg tatggcagca gaaatttatt caatcagagc 6540 agtaccgcaa gcaggaggag cattggcttc gggagcttga cggcgagctt ccggtattga 6600 cgctgccggc tgattacagc cgtccggccg tgcaaacctt tgaaggagac aagctggtct 6660 tttctctgac tgaggaacag acgtcggctc ttcgcagtct tgcgaaacaa acggattcta 6720 ccatgtacat ggtgctcctg gcgtcgtaca gcgcctttct ctcaaaactg agcggacagc 6780 atgacatcat tgtcggctcg ccggctgcgg gacggtcaca tgcggatctc gcaaacgtca 6840 tcggtgtttt tgtgaataca ctcgcgctgc gtacgtatcc ggaagcggac aaaacgttca 6900 cggactatct taaagaagtg aaacaaaccg ctttacatgc atttgacgcg caggattatc 6960 cgcttgaaga ccttctgcaa aaggttgagg tgcagcgtga tacgagccga aatccgctgt 7020 ttgatgcggt attctcaatg caaaatgcaa atgctgaaga tctggtcatg gaaggaattg 7080 agctgaagca ccatccgttt gacagaaaaa cagccaagtt tgacctgacg ctgacggctg 7140 aggacacaga cgaaggctta acgtttgtgc ttgaatataa caccgcgctg tttaaaccgg 7200 aaacagcaga gacgtggaag cattattggc ttcaactgtt aaaagccgca acggaaaatc 7260 cggctgcgaa gctttctgag ctttccttgg tgaatgaaac agaaaaacaa gccctccttg 7320 acgcatggaa aggaaaaaca ctctctgtgc cgcaggacaa aacggttcac cgtctctttg 7380 aagaaacagc cgcccgctac gcgaatcggc cggccgcggc atataacggc gcgaaatgga 7440 cgtacggcga gctgaacgca agggcgaacc ggatcgcgcg cattctcata gactgcggcg 7500 tcacggctga cgaacgtgtc ggcattttga cgaaaccgtc cttggaaatg gccgcgggcg 7560 tactcggcgt cctgaaagcg ggcgcggcat ttgtgccgat tgaccccgac tacccacaag 7620 agcggatcag ctacattctg caggacagcg gcgccaagct ccttctcaca caggaagcgc 7680 tggacgtgcc ggatggctac acaggagaaa cgatcctgct tgacggcgga cgctccattc 7740 tgagcctgcc gcttgatgaa aacgatgaag cgaacccgca gactgaaaca acggcggatc 7800 atctcgctta tatgatttac acgtcaggaa cgaccggaca gccgaagggt gtcatggtcg 7860 aacaccatgc gctggtgaac ctgtgcttct ggcatcacga cgcattcgcc atgacggcgg 7920 atgataaaag cgccaaatac gcgggcttcg gttttgacgc ctccatctgg gagatgttcc 7980 cgacatggac catcggcgcg gaacttcacg tcattgacga agcgatccgg ctggatatca 8040 cccgcttaaa tcactatttc gaggagcacg gcgtgaccat caccttcctg ccgacgcagc 8100 tggccgaaca atttatggag ctggaaaata cctctctccg catgcttctc gtcggcggcg 8160 acaagctgaa gcgggcggtg aaacagccgt acacgatcgt caacaactac ggcccgacgg 8220 aaaacaccgt cgtcgcgaca agcggcgtca tcaatcctga ggaaggatcg ctttcgatcg 8280 gacgggcgat tgccaatacg agagcttata ttctcggcga cggcgatcag gtgcagccgg 8340 aaggcattgc cggtgaattg tgcgtggccg gccgcggtct ggcacgcgga tacctgaacc 8400 gtgaagaaga gacggcgaag cggtttaccg cagatccgtt cgtgcccggc gagcgcatgt 8460 accggaccgg cgacctcgtc aaatggaacg cgcagagcgg catcgaatac atcggccgta 8520 tcgaccagca ggtcaaagtg cggggctacc ggatcgagct ttcagaaatc gaagtccgcc 8580 tcgcccagct tgcggatgtt catgacgcag cggtgacggc ggtggaagac aaagcaggca 8640 atgccgcgct ttgcgcctat gtcgcgcctc agcaggacga tattgaagcg ctcaaagccg 8700 cgctgaaaga cacgcttccg gactacatgg tgccggcgtt ctgggtggag atggacgagc 8760 ttccggtcac cgcaaacgga aagattgaca aaaaagccct gccggaaccg gacattgaag 8820 cgggaagcgc cgcttacaaa gcgccggaaa cggagatgga gacgctgctt tccgacattt 8880 gggaggaagt gctcggtctt gatcagatcg gcgtaagcga taatttcttc acgctcggcg 8940 gcgactcaat caaaggcatc caaatggcga gccgcctgaa ccagcacggc tacaagctgg 9000 agatgaaaga tctcttccag cacccgacca tcgaagagct cgtctcttat gtggagcgga 9060 cggaaggcaa gcaggccgac cagggacctg tcgaaggcaa agcggagtta acgccgatcc 9120 agcgctggtt ctttgagaaa aacttcacgg acaaacacca ctggaaccaa tccgtcatgc 9180 ttcacgcgaa agacggcttt gatccggaga taacagaaaa aacattacat gtcctgacgg 9240 tgcaccatga tgcgctccgg atgatttatc gtgaacaaaa accgtactac agagggcttg 9300 aggatgcgtc tgttgaactg aacgtctttg agctgaacgg acctgctgaa gatcatgaga 9360 accgtatcga acgggaagca gaccgtcttc aaagcagtat ttcactggaa acaggacatc 9420 tgctgaaggc cgggctcttc cgggccgaag atggagacca ccttcttctc gcaatccatc 9480 atttagtcgt ggatggtgta tcttggcgga ttttactgga ggacttcacg tccgtttata 9540 cgcagctgaa gcaaggcaat gaaccggcgc tgcctccgaa aacacattca ttcgccgaat 9600 ttgctgagag aatcaaagag tacgcaaata cgaaggcgtt tctgaaagaa gcggattact 9660 ggagggagct tgaggagaaa gaggtatgca ctcagcttcc gaaagacagg cagtctggcg 9720 atcagcgcat gagacatacg agaacggtca gtttctctct gacgcctgaa caaactgaac 9780 agctgacgac gaacgtacat gaagcctacc atacggaaat gaacgacatc ctgctcacgg 9840 cgctcggact ggcgctgaaa gagtggacgg gtgaagacac gatcggcgtt catttggaag 9900 gccacgggcg cgaagacatt cttgacgggc tgaatatcac ccggacggtc ggatggttta 9960 cgagcatgta tccgatgatc cttgagatga agcacgccga cgatctttca tatcagctga 10020 aacaaatgaa agaagacatc agacacatcc cgaacaaagg agtcggctac ggcattctgc 10080 gttatgtaac ggcgcctgag cataaagagg gtctttcatt tgagattgat ccggatatca 10140 gctttaacta cttaggccag tttaatgaga tgtcggattc cggcttattt acaagatccg 10200 ggatgccgtc aggacaatcg ctgagccctg acacagagaa gccgaatgcg cttgatattg 10260 tcggatttat agaaaatggg cagatgacga tgacgtttgc ctatcattct ctcgaatttc 10320 atgaaaaaac cattcaatcg ttcagtgaca gctttaaagg gcacctcttg aaaatcatag 10380 atcactgcct ggcccaagac ggacctgagc ttacgcctag cgatcttggc gatgatgatc 10440 tgacgcttga tgaacttgat aaattaatgg aaattctcta acagaaaaga cagaggtgac 10500 10500 <210> 4 <211> 600 <212> DNA <213> Bacillus subtilis subsp. krictiensis <400> 4 tttatcttaa aaaggggagg cgcacacata tggaaataac tttttatcct ttaacaaatg 60 ctcaaaaacg tatctggtat acagaaaaat tctatccgaa cacaagtatt tcaaatcttg 120 ccgggttcgg gaaactcatt tctgacgacg gcgtacaggc tcattacgtt gagaaagcga 180 tacaggaatt cgtccggcgg tatgagtcga tgagaatccg tctgcggctt gatgatgagg 240 gggagcccgt tcaatatgtg agcgattacc gtccgctgac tatcgaacat acagacatca 300 ggcaagccgg ctgctctgcg gaagagctgt caaaatgggg acgtgacgag gcaagcaagc 360 ctctggcatt atatgatcag gatttattcc gtttttccgt gtataccatc agcgaaaatg 420 aggtctggtt ttacgttaat gtgcatcaca ttatttcaga cgggatttcc atgacgattc 480 tgggcaatgc gattactgat atttatttgg agctttcggg cggagcaagt atggaacaga 540 cggagattcc tccttatcga gcatgtgctg actgagcagg aatatgtgca gtcgaagcgg 600 600 <210> 5 <211> 9900 <212> DNA <213> Bacillus subtilis subsp. krictiensis <400> 5 cgggtacgtt tatgggaaac cggacaaatg cgaaagaaaa gcagatgctc gggatgttcg 60 tatctacggt tcctgtgcgg acaagcgttg acggaggaca gtcgttcttg gaattcgtta 120 aaggccggat gaaggatctg atgaaaattc tccgccacca aaagtatccg tataacctgc 180 ttgtcaatga tttgcgcgct tcgaaaagtt cgctgagcag attgtttacg gtggctctgg 240 agtaccaggt gatgcagtgg cagaaaaaag agaatctgtc cttcctgaca gaccctattt 300 tcagcggaag cggtacaaat gatatttcga ttcatgtgaa ggaacgatgg gacactggga 360 aattgacgat tgattttgac tatcgcagcg acatattcaa gggagaggag attgtatctg 420 tttctgaacg tttgatcacg ctgattgaag atgcgatttc atctcctgat cgcataattg 480 atgagcttac tcttctttct gaatccgaga aagagcggct gttgacacgg gcctcaggca 540 atccggtgaa ttaccgcggg gagatgacga taccggggct gtttgaagag aaagtgaagt 600 cactgtctga caaaccggcg gtggtgtatg aaggccgaac attgtcctat cgcacattgc 660 atgaacagtc aggccgaatt gccggacgtc ttcttaatgc cgggatatca gccgattctc 720 ctgtcgcggt gctgcttggc cgttctgagc gtgttattgc ggcaatattg ggaattttga 780 aagcgggcgg cgcctatgtg ccgatagatc ctgactttcc ggcggatcgg attcagtaca 840 ttttggagga cagcggagcg aaggctgttc tgacagaggc cggaatacag gcgcctgcag 900 cggatgccga acggattgat tttgacgagg ctgttcagtt tgaaacggct gcggacggtg 960 tcagtacaca atcagaccgg ctggcttaca tcatctacac gtcaggtaca acggggcggc 1020 cgaaaggcgt gatgattgag caccggcaag ttcatcatct ggtgcaatca ctgcagcagg 1080 agatttatca atgcggtgag cagacattaa gaatggcgct tttggctccg tttcattttg 1140 atgcgtccgt caaacagatt tttgcctcgc ttcttttggg acagacgctt tatatcgtgc 1200 cgaaaacgac tgtaacgaat ggctcggcac tgctggacta ttatcgtcaa aaccggattg 1260 aagccactga cggaacccct gcgcatctgc agatgatggt tgcggcggga gatgtcagcg 1320 gaattgaatt gcgccacatg ctcattgggg gagagggcct gtccgccgct gttgctgaac 1380 agctgatgaa cctctttcat caatcgggca gggcgccgcg tctgacgaat gtctacgggc 1440 cgacagaaac gtgcgtagat gcgtccgtgc atcaggtgtc agccgataac ggaatgaatc 1500 aacaggcggc gtacgttccg atcggaaaac cgctcggcaa cgcccgtctg tatatattgg 1560 ataagcacca gaggcttcag cccgacggga cggccggtga gctgtatatc gcgggtgacg 1620 gtgtaggccg cggctattta aatcttccgg atttgaccgc agagaagttt ttgcaagatc 1680 cgtttaacgg aagcggccgc atgtaccgca cgggtgatat ggcgcgctgg ctgccggacg 1740 ggacgatcga atatatcggc cgtgaagatg atcaggtgaa agtccgcggc taccgtattg 1800 agctgggaga aattgaaacg gtgctcagaa aagctccggg ggcggcgcag gccgtcgtgc 1860 tggcacggcc ggatcagcag ggcagcttag atgtttgcgc atatatcgtt caggaaaaag 1920 gaaccgagtt tcaccctgcc gagtacaggg agtatgtgtc caagcacctt cctgattaca 1980 tggtgcccgc ttactttaca aaaacggacg aaattccgct cacgccgagc gggaaggcgg 2040 accgcaaaaa gctgtttgcg cttgatgtgc aggctgtcag ctcatccgaa tatgccgcgc 2100 cgagaaacga aacggaggaa acgctcaccg tcatctggca ggaagtcctc ggaatggaca 2160 aggcgggcat ttatgatcat ttcttcgagt caggcggtca ttcattaaag gcaatgacgc 2220 ttctgacgaa aattcataag caaatgggcg ttgaaattcc gctgcaatac ttgtttgagc 2280 atccgacgat tgcggcgctt gccgattatg cggaaaaccg aaacgaagga ccggcattca 2340 gggcgattga gccggctgag aagcaggcga gctatccgct ttcgctcgct cagcagcgga 2400 cttatatcgc gagccaattt gaagatgcgg gagtcggata taacatgccg gctgcggccg 2460 tgattgaggg cgctttagac cttgaaaagc tcgagcgtgc attttctgcc ttaatcagca 2520 ggcatgaagc gctcagaaca tcgtttcaat cggaggacgg cacgccgaga caggtggttc 2580 acgaacatgt tccgtttcat attgaaatgc tcgaagcgcg cggaagaacg aatgaacagg 2640 tcatgaagga ctttgtgcgc cgttttgatt tatctgaggc gccgctgttc agaatcggcc 2700 tgcaaacgct cggtcacaat cgccatatgc tgctgtttga tatgcatcac ctgatttctg 2760 acggggtgtc tatttccatc atgctgaagg aactggctga catctacggc ggaaatcagc 2820 tgcctgaatt gcgcattcaa tataaagatt atgccgtatg gcaggcggaa cgggcgaaag 2880 aaggctacaa gaaggagcgg gcgtactgga aagaagtctt cagcggcgaa ctgccggtgc 2940 ccgccaagct gccgaaaatg ctgcgggaac ggctgcagaa gcttgccgag aaaaacggag 3000 ccacccttta catggtgctg ttatcggcat actatacgct gctttctaag tattcgggac 3060 aggaagacat catcgtggga acaccgtcag cgggaagaaa tcactctgat accgaggggc 3120 ttatcgggat gtttgtcaac acgcttgcgc tgcgaagctc cgtgaagcag gatcagacat 3180 ttgccggctt gttaggtcat gtgcgcaaac aggtgctgga cgcgttttcc catcaggatt 3240 atccgtttga gtggctgacc gaggagctga acgtgccccg ggacatgagc aggcatccga 3300 tatttgacac gatgttcagt ctgcaaaatg cttcggacgg aattccggag atcggcaacc 3360 tgacgctgtc tcttcatgaa accaacttca atatcgctaa attcgatctg acaatgcagg 3420 cccgggaaac agcggaaggc attgcgctcg atttggatta ttgcacgaag ctgtttaagc 3480 gctcaactgc ggatcgcatg cttgcgcact atgtccgtct gctggagagt gcggcagctc 3540 agccggatgc gaaaatcagc gaatatgatc tgctttctga acgggaggct ttgaaccaat 3600 tacagcggtt caatccggag cgcacggcat acccgaaaga gcaaacgatc gtgcagatct 3660 ttgaagaaca ggcccgaaag aaccctgacc ggacggctct tcagttcgaa ggggaaactc 3720 tgtcgtatca gcagctgaat gaacgcgcca acaggcttgc gcggcatatt ctttcggtcg 3780 gaggcggcgg gaaaaccgcg gctgttttat gtgaacggtc aatggacatg attgtttcca 3840 ttatggctgt gttaaaagcg gggtccgcct atgtgccgat tgatcctgag catccggttc 3900 agcggattca gcatttcttc cgcgacagcg gggcgaaagt gctcctgact cagcaaagcc 3960 tcaagccgct tgcggaaaag gccggttttc aaggcgccat tgtgcttgct gatgatgagg 4020 cgagctatga aaaggactct cgcaatccag cattgccgtt tgactccagc acaattgcca 4080 atcttactta tacatcaggc acgacgggaa cgccgaaagg gaacatcgtc acacatgcca 4140 acattttgcg gacggtaaaa aacacgaact atttgaccgt ttctgaagag gacacagtgc 4200 tcggtctgtc aaactacgtc tttgacgctt ttatgtttga tatgttcggt tcgctgttaa 4260 acggtgcaaa gcttgtgatc gtcccgaaag atacggtgct ggacatgtcg cgcctgtccc 4320 gtgtgatcaa acgggagaac gtcagcattc tgatgattac gacggccctg ttccacctgc 4380 ttgttgatat ggagccgtcc tgtctgacga cgcttcggaa aatcatgttc gggggcgaaa 4440 gagcgtctgt agaacatgtc aaaaaggcgc tggcggcagt cgggaaagga agactgcttc 4500 atatgtacgg tccgtcggaa agcacggtgt ttgcgacata ccatccggtg gatgtcattg 4560 aagaggatac gctctccgtt ccgatcggta aaccggtcag caatacggaa gtctttatta 4620 tgaactcagc cggacgcatt cagccggcgg gtatcgcggg agagctgtgc gtcagcgggg 4680 aaggtctcgt agaaggctac tacaaccgtc ctgaactgac ggaagaaaaa tttgtaaagc 4740 atccgtttaa ggaaggtgaa cggatgtata aaacgggcga cttggccaga tggcttccga 4800 atggcgatat cgagtttatc ggacgcatcg accatcaggt gaaaatccgc ggtcagcgga 4860 ttgagcttgg cgaaattgag catcagcttc aaagccatga tcagattcag gaatgcatag 4920 tgctcgctgt ggatcagggc gcgggtgaca aacttctttg cgcgtatttt gtcggcctca 4980 gggaaatatc ttcccgggag ctgagggagc atacggcgaa ggatcttccg gcttatatga 5040 ttccgtccgt ctttattcaa ttggatgaac tgcctcttac agggaacgga aaaatcgaca 5100 ggcgggcgct gccgatgccg gatgtgaccg cagcgaatgc cgtgtcatat acggcgccgc 5160 gcaatgaaac agaaaaaaaa ctggcggata tttgggctga ggtgctgcaa atggaacggg 5220 tcggcgtcca tgatcagttc tttgagatcg ggggccactc gttagcgggg atgaaactgc 5280 tggcccttat ccagaagaca ttcggcgtgc agcttacctt aaaggacctg ttcacttctc 5340 cgacggctgc tgggctggcg cagctgattg aaggggctga gcggaaggcg gctgagagca 5400 tcgcaccggc tgccgagcgg gaaacgtatc cggtttcttc accgcagaag cggatgttcg 5460 tgcttcagca gctggaaggc gctgaaacaa gctataacat gccgtctgtg ctccgcttaa 5520 aaggaaagct tgatgcagaa aagctgaaat ccgtcatgaa acagctgaca gaacgccatg 5580 aagccttcag aacgacattt gacataaagg atggagaaac ggttcagcgt atatgggcgg 5640 aagcttatat cgacatggaa tattatgaag cctctgaaga agatgctgaa cagattattc 5700 agagctttat ccggccgttc cgtctggatc agcttcctct cgtcagaacg gggctggtca 5760 agctggctga acatgaccac ctgctgctgt ttgatatgca ccatatcatt tcggacggcg 5820 cttcagtcgg cgtgctgata gatgaactgt cccgcttgta tggcggcgaa acgcttgagc 5880 cgctgcggat tcattataaa gactatgcgg tatggcagca gaaatttatt caatcagagc 5940 agtaccgcaa gcaggaggag cattggcttc gggagcttga cggcgagctt ccggtattga 6000 cgctgccggc tgattacagc cgtccggccg tgcaaacctt tgaaggagac aagctggtct 6060 tttctctgac tgaggaacag acgtcggctc ttcgcagtct tgcgaaacaa acggattcta 6120 ccatgtacat ggtgctcctg gcgtcgtaca gcgcctttct ctcaaaactg agcggacagc 6180 atgacatcat tgtcggctcg ccggctgcgg gacggtcaca tgcggatctc gcaaacgtca 6240 tcggtgtttt tgtgaataca ctcgcgctgc gtacgtatcc ggaagcggac aaaacgttca 6300 cggactatct taaagaagtg aaacaaaccg ctttacatgc atttgacgcg caggattatc 6360 cgcttgaaga ccttctgcaa aaggttgagg tgcagcgtga tacgagccga aatccgctgt 6420 ttgatgcggt attctcaatg caaaatgcaa atgctgaaga tctggtcatg gaaggaattg 6480 agctgaagca ccatccgttt gacagaaaaa cagccaagtt tgacctgacg ctgacggctg 6540 aggacacaga cgaaggctta acgtttgtgc ttgaatataa caccgcgctg tttaaaccgg 6600 aaacagcaga gacgtggaag cattattggc ttcaactgtt aaaagccgca acggaaaatc 6660 cggctgcgaa gctttctgag ctttccttgg tgaatgaaac agaaaaacaa gccctccttg 6720 acgcatggaa aggaaaaaca ctctctgtgc cgcaggacaa aacggttcac cgtctctttg 6780 aagaaacagc cgcccgctac gcgaatcggc cggccgcggc atataacggc gcgaaatgga 6840 cgtacggcga gctgaacgca agggcgaacc ggatcgcgcg cattctcata gactgcggcg 6900 tcacggctga cgaacgtgtc ggcattttga cgaaaccgtc cttggaaatg gccgcgggcg 6960 tactcggcgt cctgaaagcg ggcgcggcat ttgtgccgat tgaccccgac tacccacaag 7020 agcggatcag ctacattctg caggacagcg gcgccaagct ccttctcaca caggaagcgc 7080 tggacgtgcc ggatggctac acaggagaaa cgatcctgct tgacggcgga cgctccattc 7140 tgagcctgcc gcttgatgaa aacgatgaag cgaacccgca gactgaaaca acggcggatc 7200 atctcgctta tatgatttac acgtcaggaa cgaccggaca gccgaagggt gtcatggtcg 7260 aacaccatgc gctggtgaac ctgtgcttct ggcatcacga cgcattcgcc atgacggcgg 7320 atgataaaag cgccaaatac gcgggcttcg gttttgacgc ctccatctgg gagatgttcc 7380 cgacatggac catcggcgcg gaacttcacg tcattgacga agcgatccgg ctggatatca 7440 cccgcttaaa tcactatttc gaggagcacg gcgtgaccat caccttcctg ccgacgcagc 7500 tggccgaaca atttatggag ctggaaaata cctctctccg catgcttctc gtcggcggcg 7560 acaagctgaa gcgggcggtg aaacagccgt acacgatcgt caacaactac ggcccgacgg 7620 aaaacaccgt cgtcgcgaca agcggcgtca tcaatcctga ggaaggatcg ctttcgatcg 7680 gacgggcgat tgccaatacg agagcttata ttctcggcga cggcgatcag gtgcagccgg 7740 aaggcattgc cggtgaattg tgcgtggccg gccgcggtct ggcacgcgga tacctgaacc 7800 gtgaagaaga gacggcgaag cggtttaccg cagatccgtt cgtgcccggc gagcgcatgt 7860 accggaccgg cgacctcgtc aaatggaacg cgcagagcgg catcgaatac atcggccgta 7920 tcgaccagca ggtcaaagtg cggggctacc ggatcgagct ttcagaaatc gaagtccgcc 7980 tcgcccagct tgcggatgtt catgacgcag cggtgacggc ggtggaagac aaagcaggca 8040 atgccgcgct ttgcgcctat gtcgcgcctc agcaggacga tattgaagcg ctcaaagccg 8100 cgctgaaaga cacgcttccg gactacatgg tgccggcgtt ctgggtggag atggacgagc 8160 ttccggtcac cgcaaacgga aagattgaca aaaaagccct gccggaaccg gacattgaag 8220 cgggaagcgc cgcttacaaa gcgccggaaa cggagatgga gacgctgctt tccgacattt 8280 gggaggaagt gctcggtctt gatcagatcg gcgtaagcga taatttcttc acgctcggcg 8340 gcgactcaat caaaggcatc caaatggcga gccgcctgaa ccagcacggc tacaagctgg 8400 agatgaaaga tctcttccag cacccgacca tcgaagagct cgtctcttat gtggagcgga 8460 cggaaggcaa gcaggccgac cagggacctg tcgaaggcaa agcggagtta acgccgatcc 8520 agcgctggtt ctttgagaaa aacttcacgg acaaacacca ctggaaccaa tccgtcatgc 8580 ttcacgcgaa agacggcttt gatccggaga taacagaaaa aacattacat gtcctgacgg 8640 tgcaccatga tgcgctccgg atgatttatc gtgaacaaaa accgtactac agagggcttg 8700 aggatgcgtc tgttgaactg aacgtctttg agctgaacgg acctgctgaa gatcatgaga 8760 accgtatcga acgggaagca gaccgtcttc aaagcagtat ttcactggaa acaggacatc 8820 tgctgaaggc cgggctcttc cgggccgaag atggagacca ccttcttctc gcaatccatc 8880 atttagtcgt ggatggtgta tcttggcgga ttttactgga ggacttcacg tccgtttata 8940 cgcagctgaa gcaaggcaat gaaccggcgc tgcctccgaa aacacattca ttcgccgaat 9000 ttgctgagag aatcaaagag tacgcaaata cgaaggcgtt tctgaaagaa gcggattact 9060 ggagggagct tgaggagaaa gaggtatgca ctcagcttcc gaaagacagg cagtctggcg 9120 atcagcgcat gagacatacg agaacggtca gtttctctct gacgcctgaa caaactgaac 9180 agctgacgac gaacgtacat gaagcctacc atacggaaat gaacgacatc ctgctcacgg 9240 cgctcggact ggcgctgaaa gagtggacgg gtgaagacac gatcggcgtt catttggaag 9300 gccacgggcg cgaagacatt cttgacgggc tgaatatcac ccggacggtc ggatggttta 9360 cgagcatgta tccgatgatc cttgagatga agcacgccga cgatctttca tatcagctga 9420 aacaaatgaa agaagacatc agacacatcc cgaacaaagg agtcggctac ggcattctgc 9480 gttatgtaac ggcgcctgag cataaagagg gtctttcatt tgagattgat ccggatatca 9540 gctttaacta cttaggccag tttaatgaga tgtcggattc cggcttattt acaagatccg 9600 ggatgccgtc aggacaatcg ctgagccctg acacagagaa gccgaatgcg cttgatattg 9660 tcggatttat agaaaatggg cagatgacga tgacgtttgc ctatcattct ctcgaatttc 9720 atgaaaaaac cattcaatcg ttcagtgaca gctttaaagg gcacctcttg aaaatcatag 9780 atcactgcct ggcccaagac ggacctgagc ttacgcctag cgatcttggc gatgatgatc 9840 tgacgcttga tgaacttgat aaattaatgg aaattctcta acagaaaaga cagaggtgac 9900 9900 <210> 6 <211> 10800 <212> DNA <213> Bacillus subtilis subsp. krictiensis <400> 6 atatgagcaa aaaatcgatt caaaaggtgt atgcactcac accgatgcag gagggaatgc 60 tgtatcatgc gctgcttgat ccgcattctt cctcctactt cacacaatta gagcttagga 120 ttcacggaag ctttcagctt gagctttttg aaaaaagtgt caatgagctg attcggacat 180 atgacatcct gcgtacggta ttcgtgcacc agcagcttca aaaaccgcgc caagtcgtat 240 tagcagagcg gaagacgaag gtgcactatg aagatatcag tcaattagat gaagcgcgcc 300 aaaccgaata tattgaacgc tataaacgcg atgtgcagca gcagggcttt catctggcga 360 aggatattct ctttaaagcg gcggtgttca ggctcagtga gaaggaactg tatctcgtct 420 ggagcaatca tcatatcgtc atggacggct ggagtatggg cgttttgatg aaaagcctgt 480 ttcaaaacta tgaagcgctt cgtgccggcc ggcccgccgg gggaagccag ggcaaacctt 540 actctgacta tatcaaatgg ctcggaggca gggattatga ggaggcggaa caatattgga 600 gcagccgcct ggcggatttc gaacagccga gcctgctccc gggccgtctg gcaccagaaa 660 agaaagacta ccaaaatgaa gaatattctt ttgtctggga tgaagagctg gtcgcgcaga 720 ttcagcagac cgccaaccgg catcaagtca cggggcctaa cctgtttcag gccgtttggg 780 gtgcggtgct cagcaaatac aactatacag acgatgtggt gttcggcacc gtcgtatcag 840 gccgtccttc agaaatcaac ggcattgaaa cgatggcggg gctgttcatc aatacgattc 900 ccgtcagaat caagattgac aaagatgcag ccttttctga cgtgatggcg gcagttcaga 960 aaaacgccgt ggaagccgag cgctatgatt atgtgccgct ctatgacatt caaaagcgct 1020 ccgctctgga cggcagcctc ttgaatcatt tggtcgcgtt tgaaaactat ccgctggaca 1080 aagagctgga aaacgggggc atggaggaaa gactcggctt ttccattaaa gttgaacatg 1140 cttttgagca gacgagcttt gatttcaatc tcatcgtgta tccgggaaaa acgtggactg 1200 tcaaaatcaa atacaacgga gcggctttcg ctcatgatgc catcgaacga acggcgcatc 1260 atctgacctg catgatgaaa gcggcggtcg gaacgcctga tgcgcccgtg cgggaactcg 1320 gccttgtttc aggcgaagaa gagcggcaga ttgttgagat attcaatgat acaaaaacgg 1380 cgcttccgga agaggaggcc gttcaccgtt tgtttgaagc acaggcaaac cggacgcctg 1440 caagcatcgc gataaaagaa gcgggacgcg aatggaccta ccgtgaagtg aacgaagcgg 1500 ccaaccgcct ggcgagacac tttgtgaaga gcgggctgga aaaaggccgg accgccgcta 1560 ttatgaacga ccggtctgcg gaaaccgtta tcggaatgct tgccgtccta aaagcaggcg 1620 gcgcctatgt gccgattgat ccggcttttc cggaggaccg tctccgcttt atggcggaag 1680 acagctcgat tcggcttgtg ctgacagttc aggactatca agaacaagcg ggcacattgc 1740 aagtcccgat tgtcatgctg gatgaaagcg aggatgaaac gctaagcgga acagacttga 1800 atcttccggc cggcggcaac gacttggcgt atatcatgta tacatccggg tcgaccggaa 1860 aaccgaaagg cgtcatgatt gaacacagaa atatcatcag gctcgtcaaa cattcgaatt 1920 acgtgccggt tcatgaagaa gaccggatgg cgcaaacggg agccgtcagc tttgatgccg 1980 gaaccttcga agtcttcggc gcattgctga acggagcggc attgcacccg gtgaaaaaag 2040 agacgctgct tgacgccgga cgattcgccc aatttctgaa agagcagcgg atcacgacca 2100 tgtggctgac gtctccgctg tttaatcagc ttgcccaaaa ggatgccggc atgtttaaca 2160 cgctccggca cctcatcatc ggcggtgatg cgcttgtgcc gcatatcgtc agcaaagtga 2220 ggaaggcatc accggagctg tcgctttgga acggctacgg gccgacggag aatacgacgt 2280 tttcgacgag ttttctcatt gatcaggact acgacggttc gatcccgatc gggaagccga 2340 tcggaaattc cactgcgtac attatggacg aaaaccgcaa cctccagccg atcggcgcgc 2400 ccggggagct gtgcgtcggc ggaagcggag tggcaagagg ctatgtgaat ctgcctgaat 2460 taacggagaa gcagtttgtc cgcgatccgt tcagaccgga tgaaatgata taccggacgg 2520 gggacttggc gaagtggctt ccggacggca cgatcgagtt tctcggcaga attgacaacc 2580 aagtaaaggt ccgcggtttc agaatcgagc tcggcgaaat tgaggcgaaa atcagccagg 2640 cggagaatgt gacggaatct gcggctgtga tccggaaaaa taaagcggat gaaaatgaaa 2700 tctgcgctta ctttaccgca gaccaagccc tttcgccgga agacctgcgc aaaacgcttt 2760 cggaatcact tccggaatac atgattcccg cgcacttcat ccagatgaat cagtttccgc 2820 tgacggcgaa cggaaagatt gataaaaaag cgctgcctga gcctcaggct gaagccgttc 2880 aaaaagaata cgaagcgccg aaaacggaag cggagcagaa actcgcggac atttgggaag 2940 gtattctcgg tgtaaaagcg ggtgtgactg acaatttctt cacgattggc ggacattctt 3000 taaaagccat gatgatgacc gctaaaatcc aggagcactt tcaaaaagaa gtgccgatta 3060 aagtgttatt tgaaaagccg accattcagg agcttgcgca ttatttggag catgagaccg 3120 aggaggaaca gcagtttgaa ccgatccgac aagcgcctta tcagaagcat tatcctgttt 3180 cctcagcaca gcgcaggatg tatatcctta atcagctcgg acaggccagc acgagctaca 3240 acgtccctgc tgtacttctg ctggaaggat cagtagacaa aaaccgtctt gaagaggcca 3300 tgcaggcatt aatcaaccgt catgagacac tgcgtacgtc gtttgacatg gcagatggag 3360 aagtcgtgca gaccattcat aaaaatgtgt cgtttgagct tgaaaccgcc gagggccggg 3420 aagaagatgc agaagagctg acaaaagcct ttatcaggcc gtttgcgctc aatcgtgcgc 3480 cgctggtccg ttcgaagctg atccggcttg aagaagaccg gcatcttctg ctgattgaca 3540 tgcaccacat tattacggac ggaagctcaa tgggcatttt catcggtgat cttgcgaagc 3600 tttatcaagg cacggagctt gagctgccaa agattcatta taaggatttt tcagtctggc 3660 agcgtgaaaa agcaaatctt gatcagcacg aagcttactg gcttgatacg ttcaaaggcg 3720 atctgccggt gctggatctg ccgcttgatt tcccgcgtcc tgccgagcgc agttttgaag 3780 gggaacgcgt catcttcggg cttgataaac aggtgacggc gcagattaag aagctgctgg 3840 ctgatacgga tacgacgatg tacatgttct tgttagccgc ttttcaagtg ctgctgtcca 3900 aatattcggg gcaggaagac atcatagtcg ggtctccggc ggccggaaga cagcatcctg 3960 atctccaaga cgtgccgggc atgtttgtca acacagttgc gcttcggtcg catcctgccg 4020 gcaaaaaaac gttcaagcaa tttctggatg aagtgaaaac ggcgagcctt caagcttttg 4080 agcatcaaag ctatccgctt gaagaattaa ttgaaaaact gccgttaacg agggacacaa 4140 gccggagtcc gctgttcagc gtgttattta atatgcagaa catggagatc ccggccctgc 4200 ggctcggaga tttggagatt tcttcttact ccatgcatca tcatgtcgct aaatttgatc 4260 tttccttaga agcggctgag cgcggagaag aggtcggatt gagctttgat tacgcgaaag 4320 ccttatttgc ggacgaaacc atccgccgct ggagcgctca ttttgtcaat ctgattaaag 4380 cctgcgccga aaatccggat attcagctgg ccgacgcaag cctgctgtcc gctcctgagc 4440 gggaagcgct cctttctgat gaaaaacgga cggaagcgga tctgcctgag ggcacttttg 4500 tttcgctgtt tgaacggcaa gcgcaaaaaa cgcctgatct cacggcggtt gcgggcggaa 4560 caagtctgac atatcgtgag cttgatgaac gctcgaaccg gtttgcccga caccttcagg 4620 cttgcggaac gggcagtgag gacatcgtgg ccattatgat ggatcgttcg gccgacttga 4680 ttaccgcgat tctcggcgtc atgaaagccg gagcggcatt tctcccgatt gatccggaga 4740 ctcctgaaga gagaatccgc tactctctcg aagacagcgg aacgaagctt ctggtcgtca 4800 atgagagaaa catgaccgcg gccgccgttt ataaagaaaa aacggtcgta atggaagacg 4860 gagaatggca gaacgaaagc gccgaccggc ttgaaacgga gcccggcgcc gaccggcttg 4920 cctatatcat ttatacctcg ggaacaacgg gcaaaccgaa aggcgtccag ctggagcacc 4980 gcaatctaat caattatgtc acatggttca gccgtgaagc cggtttgacc gaagctgaca 5040 aatccgtgct gctgtcttct tatgcatttg atctcggcta tacggccata ttcccgattc 5100 ttcaggcggg cggcgagctg cacattgtgc cgaaggagac gtacaccgcg cctgatcagc 5160 ttggtgagta tatacagaaa aacggcatta cgtatatgaa actgacgccg tcattgttcc 5220 atatgatcgt caatacagcc cgttttacgt cagaatgccg tttcagcccg cttcgtttag 5280 tggtgctcgg cggagaaaag atcatcacgt ccgatgtccg caagtttcat gacgtatacg 5340 cccataccga ctttatcaat cactacggac cgacggaaac gacgatcggc gccattgcgg 5400 aacggatcaa tatggagtgt cttgatcaat atgagcagcg tcccgtcatc ggccgcccga 5460 tcgcaaatac cggcgcgctt gtattggacg gagcaatgca gctcgttcct ccgggcgcaa 5520 gcggcgagct ttatattacc gggaaggggc ttgccagagg atatcttcac cgtccgcagc 5580 tgacggcgga gaaatttctc tcaaatcctt tttcaccgga cagcctgatg tacaaaacgg 5640 gagatatcgt ccgcaggctt cctgacggga cgattgaatt tatcggccgt gcggatgatc 5700 aggtgaaaat ccggggctac cgcattgaat taaaagaggt tgaaaccgtg ctgttaagcg 5760 taaacggcat tcaggaggcg gtcgttctcg cagtcagcga aggcgggctg ccggaactgt 5820 gcgcgtacta taaagccgac agcgggctga aaggctctga gcttcgcaaa cggctttccg 5880 aaacactgcc gtctcatatg cttccggcct atttcgtgca agtagaccgc attccgctca 5940 cagccaacgg aaaaaccgat aaaaacgccc tcccgaaacc gggcgtcagc caaacggcgc 6000 aaattgcttc agccttgccg gaaacggaat tggaggaaaa gctgtgccgc atttggaaac 6060 agacactcgg tacggatacg ctcggcatcg acgataattt cttcgattac ggcgggcact 6120 ctttaaaagg aatgatgctc ctcgccaata ttcaggctga actggacaaa acggttccgt 6180 taaaagcgct gttcgaacag ccgactgtcc gcctgcttgc cgcatatatc gaaaaatcgg 6240 cggtatctga gggatatcgg atgatcacac cggcagacag tgcagacgcg tacccgttat 6300 catccgccca aaaacggatg tacgtcctga accagcttga ccgggagaca atcagctata 6360 atatgccgtc cgttcttctg atggaaggag aagtcaatat ttcaaagctt caggaagcgc 6420 tcaatcagat gatcaaccgc cacgaatctt tgcggacgtc ctttatcgat aaaaaaggcc 6480 agccgatgca gcagatcgca gaacaggctg acattgacct gcacatcttt gaagcagcgg 6540 acgaggagaa agcggatctt atcattcagg cattcattaa gccgtttgat ctgagcgcgg 6600 ctccgctcat tcgggccgct cttgtcagac tgaatgaaaa gaaacacctg ctgctgctgg 6660 atatgcatca tatcattgcc gacggcgtgt ccagaagcat gctggtcaaa gagctcgctc 6720 acctttacaa aggcggaagt ctgccgtcgc cgaacctgca ctataaagac ttcgccgtct 6780 ggcagaatga acctgagcag gccgaacgga tgaaagacca tgagcgttat tggctctccg 6840 cattttccgg cgagcttcct gaattgaatc tgccgaccga ttttccccgt ccgccggttc 6900 aaagttttaa aggacagtcc gtccgtttca gagcggggcg tgagacggaa aaagcggtgc 6960 gtgaattaat ggaatcatcg ggagcgactc ttcatatggt gcttcacgcc gcgttccatg 7020 tctttttgag caaaatcacg ggccagcgcg atatcattat cggttcggtg accgccggaa 7080 gaacgagcgc cgaagttcag gaaatgccgg ggatgtttgt caatacgctt gcgcttcgca 7140 atgaaacgca aaaagagcag accttcgccg ggctgctcga acgggtgaaa caaaccaatc 7200 tcgacgcgct ggcgcatcag gattatccgt ttgaggatct gatcggaaag cttgacctgc 7260 cgagagatat gagccgcaac ccgctgttcc aggtgatggt gacgacagaa gatccggata 7320 aagaaacact ggaactggag aacctgcgca tcactccgta tgagtcaaac caaggcacgg 7380 cgaaattcga tctgacactc ggcggcttta cggatcaaga aggtctcggc cttcagtttg 7440 aatatgcgac tgatctgttt aaaaaagaaa ccattgaaaa gtggagcgcc gggttcctgc 7500 ggattctgaa gcaagcggcg gaaagcccgg acagaaagct gcctgagatt tcactgatca 7560 gcgatgctga aaaacaagcc ctccttgacg catggaaagg aaaaacactc tctgtgccgc 7620 aggacaaaac ggttcaccgt ctctttgaag aaacggccgc ccgatacgcg aaccggccgg 7680 ccgcggcata taacggcgcg aaatggacgt acggcgagct gaacgcaagg gcgaaccgga 7740 tcgcgcgcat tctcatagac tgcggcgtca cggctgacga acgtgtcggc attttgacga 7800 aaccgtcctt ggaaatggcc gcgggcgtac tcggcgtcct gaaagcgggc gcggcatttg 7860 tgccgattga ccccgactac ccacaagagc ggatcagcta cattctgcag gacagcggcg 7920 ccaagcttct tctcacacag gaagcgctgg acgtgccgga aagctacaaa ggagaaacga 7980 tcctgcttga cggcggacgc tccattctga gcctgccgct tgatgaaaac gatgaagcga 8040 acccgcagac ggaaacaacg gcggatcatc tcgcttatat gatttacacg tcaggaacga 8100 ccggacagcc gaagggtgtc atggtcgaac accatgcgct ggtgaacctg tgcttctggc 8160 atcacgacgc attcgccatg acggcggatg ataaaagcgc caaatacgcg ggcttcggtt 8220 ttgacgcctc catctgggag atgttcccga catggaccat cggcgcggag cttcatgtca 8280 ttgacgaagc gatccggctg gatatcaccc gcttaaatca ctatttcgaa gagcacggcg 8340 taaccatcac cttcctgccg acgcagctgg ccgaacaatt tatggagctg gaaaatacct 8400 ctctccgcat gcttctcgtc ggcggcgaca agctgaagcg ggcggtgaaa cagccgtaca 8460 cgatcgtcaa caactacggc ccgacggaaa acaccgtcgt cgcgacaagc ggcgtcatca 8520 atcctgagga aggatcgctt tcgatcggac gggcgattgc caatacgaga gcttatattc 8580 tcggcgacgg cgatcaggtg cagccggaag gcattgccgg cgaattgtgc gtggccggcc 8640 gcggtctggc acgcggatac ctgaaccgtg aagaagagac ggcgaagcgg tttaccgcag 8700 atccgttcgt gcccggcgag cgcatgtacc ggaccggcga cctcgtcaaa tggaacgcgc 8760 agagcggcat cgaatacatc ggccgtatcg accagcaggt caaagtgcgg ggctaccgga 8820 tcgagctttc agaaatcgaa gtccgcctcg cccagcttgc ggatgttcat gacgcagcgg 8880 tgacggcggt ggaagacaaa gcgggcaatg ccgcgctttg cgcctatgtc gcgcctcggc 8940 aggacgatat tgaagcgctc aaagccgcgc tgaaagacac gctgcctgac tacatggtgc 9000 cggcgttctg ggtggagatg gacgagcttc cggtcaccgc aaacggaaag attgacaaaa 9060 aagccctgcc ggaaccggac attgaagcgg gaagcgccgc ttacaaagcg ccggaaacgg 9120 agatggagac gctgctttcc gacatttggc aggaagtgct cggtcttgat cagatcggcg 9180 taagcgataa tttcttcacc ctcggcggtg actcgatcaa aggcatccaa atggcgagcc 9240 gcctgaacca gcacggctac aagctggaaa tgaaggatct cttccagcac ccgaccatcg 9300 aagagctcgt ctcctatgtg gagcggacgg aaggcaagca ggccgatcag ggacctgtcg 9360 aaggcgaagc ggagttaacg ccgatccagc gctggttctt tgagaaaaac ttcacggaca 9420 aacaccactg gaaccaatcc gtcatgcttc atgcgaaaga cggctttgat ccggacctgg 9480 tggaaaaaac cctgcaagca ttgattgaac accatgatgc gctccgcatg gtttaccgtg 9540 aagaaaggga aggcatcatt cagacatacc tccctgtcac agaatgcaag gcaagctttg 9600 aaatcgttga tctgtacgga acggacgagg atatgctgaa aagccagatt cagcggcttg 9660 ccgatcatct tcagggcagt cttgatctgg agaacggccc gctgttaaaa gcggagcaat 9720 accggacaga acaaggcgat catctgttaa tcgcggttca ccatctcgtc gtggacgggg 9780 tttcatggag aattctgctt gaggatttcg cttcaggtta taaacaggcg cagcagcaaa 9840 acagcatcgt tctcccgcaa aaaacccact cctttaaaga ttgggcggag gcgctgaaca 9900 cgtttgcgca atcagaagag ctgaaaaagc aggcggatta ttgggcgcag gcagatgcgg 9960 aagaactgcg gccgctgccg aaagaccatg atccggacaa acggctcgtc aaacatacgg 10020 cggccgtgaa atgtgaattg actgaggaag aaacggcaca gctgctgaca gatgttcatc 10080 atccgtacgg aacggaaatc aacgacattc tgctcagcgc gctcggctta acgatcggtg 10140 aatggacgga aaacggcaaa gtcggcatca acttagaagg acacggccgg gaagaaatca 10200 taccgaatgt caatatttca cggacggtcg gctggtttac ggcccaatat ccgttgattc 10260 tgcagatcag caaggaagac ggcgtctctt ccgtcattaa aacggtaaaa gagacagtgc 10320 ggcgcgttcc agataaaggt gtaggatacg ggattctccg gtatctgtca tccgatgaaa 10380 cagaaaaagg cgccgcgcct gaaatcagtt ttaactactt ggggcagttt gacaatgaag 10440 tgaaaacgga atggtttgag ccgtctccat atgatatggg acgtcaagtc agcgaagagt 10500 cagaggcgtt atacgcactg agcttcagcg ggatggttac aggcggccgc ttcgtcattt 10560 cctgctcata caatcaggaa gaatatgaaa gaagcaccgt cgaaacacag atgcagcggt 10620 ttaaagacaa tcttttaatg atcatccgcc attgcacggc caaagaggag aaagaattta 10680 cgccgagcga tttcagcgcg caggatcttg agatggatga aatgggagac atctttgaca 10740 tgcttgagga gaatttaacg tgacaaaaac agttaacaga aggggggagc ggagcagatg 10800 10800 <210> 7 <211> 3900 <212> DNA <213> Bacillus subtilis subsp. krictiensis <400> 7 tgcttgagga gaatttaacg tgacaaaaac agttaacaga aggggggagc ggagcagatg 60 agccagttca aaaaagatca agttcaggac atgtattatt tgtcgccgat gcaggaggga 120 atgctgtttc atactctcct gaatcccggc caaagctttt acatcgaaca aatgacaatg 180 agagtaaaag gcagcttgaa tatcaaatgc cttgaagaaa gcatgaatgt gatcatggac 240 cggtacgatg tatttcgtac cgtgttcatt cacgaaaaag taaaaaggcc ggtccaagtc 300 gtattgaaaa aacggcagtt tcagatagaa gaaatcgatc tgacacactt aacgggcagc 360 gagcaagcat ccaaaattaa tgaatacaaa gaacaggata agatcaaggg ctttgatttg 420 acgcgggata ttccgatgcg ggcagccatc tttaaaaaat cggaagaaag ctttgaatgg 480 gtgtggagct accaccacat cattttggac ggctggtgct tcggcatcgt cgtgcaggat 540 ctgtttaagg tatacaatgc cctgcgagaa caaaagccgt acagcctgcc gccggtcaaa 600 ccgtataaag actatatcaa gtggcttgaa aagcaggata aacaagcatc actgcattac 660 tggcgcgggt acttagaaga ttttgaagga caaacgacat ttgcggagca aagaaagaaa 720 caagagaacg gctatgagcc gaaagagctg ctcttctcac tgccggaggc ggaaacaaaa 780 gcatttaccg agcttgcaaa atcgcagcat actactttga gtacggcgct gcaggcggtt 840 tggagtgtat taatcagccg ctaccagcag tccggcgatt tgatcttcgg cacagtcgtt 900 tccgggcgtc ccgcagaaat caaaggcgtt gaacatatgg tcgggctgtt tatcaatgct 960 gttccgaggc gggtgaagct gtctgaggat accacattta acggcttgct caagcagctg 1020 caggagcaat cgctggagtc tgagcctcat caatatgtgc cgctctatga catccaaagc 1080 caggccgatc agccaaagct gattgaccac atcattgtgt ttgaaaatta tccgcttcag 1140 gatgcaaaaa atgaagaaaa cagtgaaaac ggctttgata tggaggacgt ccatgttttt 1200 gagaaatcga attatgatct caacctgatg gcttctccag gtgatgagat gctgattaag 1260 cttgcctata acgggaatgt gtttgatgag gcgtttatcc tacgcttaaa atctcagctt 1320 cttacagcga ttcagcagct catccagaag ccggatcagc ctgtcaatac gatcagactt 1380 gttgatgaaa aggaaagaga gcttctgctt accggcttaa acccgccggc tgagactcat 1440 caggcgaagc ctctgacgga ttggttcaag gaagcggtga atgtaaatcc tgatgcaccg 1500 gcgcttacgt attccggcca gactctttcc tatcgcgaat tagatgagga agcgaaccgt 1560 cttgcgcgcc gtttgcaaaa gcaaggtgcg ggtaaagaca ccgttgtcgc gttgtacacg 1620 aagcgctcgc ttgaactggt gatcggcatt ctcggcgtat taaaagcagg agcggcttat 1680 ctgccggttg atccgaagct gccggaggac cgaatctcgt acatgctgac tgacagtgcg 1740 gcagcctgtc tgctgacaca tcaggagatg aaagaaaaag cggctcagct gccgtataca 1800 ggaacaacac tcatcatcga tgatcaagca cggtttgagg aacaggcaag cgatcctgca 1860 gccgcaattg atcccgatga tccggcgtat attatgtata cgtccggcac aaccggaaag 1920 ccgaagggca atatcaccac tcatgccaat atacaaggat tggtcaagca tgtagactat 1980 atggcatttt ctgaacaaga tacgttctta tctgtttcga attacgcctt tgacgcattt 2040 acttttgatt tctacgcatc aatcctgaat gcggcacggc tcattatcgc agatgaacat 2100 acactgcttg atacagaacg gctcactgat ctgatccggc aggagaatgt caatgtcatg 2160 tttgcgacaa ccgcactttt taatcttctc accgatgcgg gagaggagtg gctgaagggg 2220 ctccgctgtg tgttattcgg gggtgagcgc gcgtctgtgc ctcacgtcag aaaggcgctt 2280 gagatcatgg ggcccggcaa gctgattaat tgctacgggc cgactgaggg aacggtgttt 2340 gcgacagctc acgtcgtgca tgatataccg gattccattt cctcattgcc gatcggaaag 2400 ccgatcagca atgcaagtat ttatattctt aacgggcaaa accagcttca gccgttcgga 2460 gctgtcggtg aactgtgcat cagcggaatg ggtgtatcaa aagggtatct gaaccgtcac 2520 gacctgacga agcaaacgtt tatcccaaat ccgttcaagc cgggagaaac gctttaccgc 2580 acaggggatt tagcacgctg gctgccggat gaacgattga atacgccggg cgtattgacg 2640 accaggtcaa atacgcgtca ccggattgaa cttgaagaaa tcgaaaagca gctgcaggaa 2700 tacccgggtg tgaaagatgc ggtcgttgtt gcagaccgcc atgagtccgg agatgcatca 2760 atcaacgcct atctcgtgaa ccggacgccg ctttcagctg aagacgtaaa gaggcacttg 2820 aaaaaacagc ttcctgctta catggtgccg caaaccttta ctttcttaga agagcttcct 2880 ttaacgacaa acgggaaggt caataaacgg cagctgccga aaccggatca ggctcaggcg 2940 gcgaaagaat ggatcgggcc tcgaaacgcg acggaagaaa cgattgcaca catctggtcc 3000 gagattctcg gcagacagca gatcgggatt catgatgatt tcttcgcgct cggaggccat 3060 tccttaaaag cgatgacggc agcgtcgcgc attaaaaaag agctcggtac ggacatcccg 3120 gtgcagctgt tattcgaagc gacgacaatc gcagacattg ccggttatct gcttcacggt 3180 gaagaaaaag gaatgaaaga tctcaccatc atgaataaaa atcagtctga cacactgttt 3240 gcgttcccgc cggttctcgg ttacgggctg atgtaccagc cgctggcaaa acagctgtcc 3300 ggctatagaa tctgtgcgtt tgattttatc gaggaagaca accgcatcga acgctacaca 3360 gagctgatca atcagctcca gccggaagga ccggtcaagc tgttcggata ctcggcaggc 3420 tgcacgctcg cctttgaaac ggccaaacgg cttgaagccg aaggacgtaa agtggagcgg 3480 ctgatcatgg ttgattccta taaaaaacaa ggcgtcagcg acttggaagg ccgcaccgta 3540 gaaagcgatg tccaggcgct gatgaaggta aaccgggata acgaagcgct gaatgacgaa 3600 gccgtcaaag aaggtctcgc caaaaaaaca aacgcgtttt attcttattt cgtgcatacc 3660 gtcagcaccg gcacggtcaa tgcggatata gatctattaa cgtcagaacc ggactttgcg 3720 atgccgccgt ggctcgcttc gtgggaggaa gccacgacag gtgaataccg tgtgaaaaaa 3780 ggctgcggca gtcacgcaga aatgctacag ggagaatgtc tcgaaaggaa tgcggcatat 3840 ttgctcgaat tcctaaggaa ggaacatccg aagctgacag cttcacgata gaaaaggagg 3900 3900 <210> 8 <211> 780 <212> DNA <213> Bacillus subtilis subsp. krictiensis <400> 8 aagcccgcca atggtccagc tctttaaatc gttcgatacc acggaaaaaa cgcagcttat 60 ctgttttccg ttcgcaggag gctattccgc atcattccgc ccgctccaca cctatcttca 120 aggtgagtgt gagatgcttg ccgcggaacc gccgggacac ggaacaaatc aaatgtccgc 180 cgttgaggat tttgaacagc ttgtcagttt atacaagcag gagttgaatc tccatcctga 240 ccgcccgttt gtcctgttcg gccacagtat gggaggcatg gtcgctttca ggctggcgca 300 aaagctggag cgggagggga tttacccgca ggccgtgatc atctcagcca ttcagccgcc 360 gcatgttgaa aggaaaaaag tgtctcatct tgatgatgaa aaatttctcg cccatattat 420 cgagctgggc ggaatgccgc aggagttagt ggagaataag gaggtcatgt catttttcct 480 gccttctttc aggtccgact accgcgcgct tgaaagcttc cgtccgtctg attctcacat 540 gattcaatca cccgtccata tttttaacgg gcggaaagat aaaaaatgta tcaaagatgc 600 ggacggatgg aaaaaatggg ccgacaatcc cgtatttcat gagttttcgg acggccacat 660 gttcatatta agtgaaactg aaaaagtggc ggaacgaata tatgagatta ttaacaggag 720 cactgcaggc caattgttat aggatatgac agacagcatt cgctgtctgt tttttgtaac 780 780 <210> 9 <211> 1380 <212> DNA <213> Bacillus subtilis subsp. krictiensis <400> 9 taattttgaa gggattgtcg tacatgaatg atgcagcaaa agagctgaac agaacattat 60 cggaagaaaa cccgcacgtg cttcatatgc tttctgattt gggcagagag ttgttttatc 120 cgaaaggggt gctgacacaa tcggcggaag cgaaagccaa ggccggaaag tataatgcca 180 cgatcgggat tgccacctca caaggcgagt ccatgcactt ttcccatatt caagagacac 240 tgtccgccta taaccccgat gatatctacg attatgctcc gccgcaggga aaagagccgc 300 tcagacagga atggctgaaa aaaatgcgtc tcgaaaatcc ttcattagcc ggcaaagaca 360 tcagcacgcc gatcgtgaca aacgctttaa cacacgggct gagcattgcc gccgacttgt 420 tcgtcaatga aggggatgcg ctgcttctgc cggataaata ttggggaaat tacaatttta 480 ttttcggtgt ccggcgcaag gcatccattg agacgtaccc gctttttcag caggatgggc 540 gttttaatgc ggcggggctg tccgagctgc tgaaaaagca ggaagaaaag gcgattgtcg 600 tgctgaattt cccgaataat ccgacaggct atacgccggg ggaagaggaa gcgtcagaaa 660 tcgtcagtgt gatcctggag gcggcggagg ccggcaaaga gattgtcgtg ctcgtagacg 720 atgcgtatta caatctgttt tacgatgaaa cggccattca ggaatccatc ttcagcaaac 780 tcgcccaagt gcacgaccgg gtgctttgcg taaaaataga cggcgcgacg aaggaaaatt 840 atgcgtgggg cttccgcgtc ggttttatta cgtacagcac aaaaagcgaa aaagcgctgc 900 gcgtgctcga ggaaaaaaca aaagggatta tcaggggaac gatttcaagc gccccgcatc 960 cgtcccaaac gtttatgctg cgggcgatgc agtcaccgga atacgagaaa gaaaaatcgc 1020 tgaaatataa tatcatgaaa aaacgggctg acaaagtgaa agccgttctt gcagaaaaca 1080 agcactatga agacgtatgg acgccttatc cgtttaactc gggttatttc atgtgtgtcc 1140 ggctgagaga cataaacgcc ggtgaattaa gagtgtcatt gcttgaaaag agaggaatcg 1200 ggacgatatc cattaatgaa accgatttgc gaatcgcatt ttcatgtgtt gaagaagaat 1260 acatcgcgga tctgttcgaa gaaatttatc aagaagcaaa gcagctgcag aaacaggcgg 1320 aaatatcagg ctgacaaaaa aaggaggggg ataccctcct ttttctatgc ttacagcagc 1380 1380 <210> 10 <211> 117 <212> PRT <213> Bacillus subtilis subsp. krictiensis <400> 10 Met Asp Glu Lys Thr Phe Asn Cys Glu Lys Glu Leu Thr Leu Ala Val 1 5 10 15 Ile Gly Gly Lys Trp Lys Met Leu Ile Met Trp His Leu Gly Lys Glu 20 25 30 Gly Thr Lys Arg Phe Asn Glu Leu Lys Ala Leu Ile Pro Asp Ile Thr 35 40 45 His Lys Ile Leu Val Asn Gln Leu Arg Glu Leu Glu Gln Asp Leu Ile 50 55 60 Val His Arg Glu Val Tyr Pro Val Val Pro Pro Lys Val Glu Tyr Ser 65 70 75 80 Leu Thr Glu Gln Gly Glu Thr Leu Met Pro Ile Leu Asp Ala Met Tyr 85 90 95 Lys Trp Gly Lys Glu Tyr Met Glu Leu Ile Asn Ile Asp Lys Thr Ala 100 105 110 Ile Lys Glu Ser Phe 115 <210> 11 <211> 3470 <212> PRT <213> Bacillus subtilis subsp. krictiensis <400> 11 Met Glu Ile Thr Phe Tyr Pro Leu Thr Asn Ala Gln Lys Arg Ile Trp 1 5 10 15 Tyr Thr Glu Lys Phe Tyr Pro Asn Thr Ser Ile Ser Asn Leu Ala Gly 20 25 30 Phe Gly Lys Leu Ile Ser Asp Asp Gly Val Gln Ala His Tyr Val Glu 35 40 45 Lys Ala Ile Gln Glu Phe Val Arg Arg Tyr Glu Ser Met Arg Ile Arg 50 55 60 Leu Arg Leu Asp Asp Glu Gly Glu Pro Val Gln Tyr Val Ser Asp Tyr 65 70 75 80 Arg Pro Leu Thr Ile Glu His Thr Asp Ile Arg Gln Ala Gly Cys Ser 85 90 95 Ala Glu Glu Leu Ser Lys Trp Gly Arg Asp Glu Ala Ser Lys Pro Leu 100 105 110 Ala Leu Tyr Asp Gln Asp Leu Phe Arg Phe Ser Val Tyr Thr Ile Ser 115 120 125 Glu Asn Glu Val Trp Phe Tyr Val Asn Val His His Ile Ile Ser Asp 130 135 140 Gly Ile Ser Met Thr Ile Leu Gly Asn Ala Ile Thr Asp Ile Tyr Leu 145 150 155 160 Glu Leu Ser Gly Gly Ala Ser Met Glu Gln Thr Glu Ile Pro Pro Tyr 165 170 175 Arg Ala Cys Ala Asp Met Gly Asn Arg Thr Asn Ala Lys Glu Lys Gln 180 185 190 Met Leu Gly Met Phe Val Ser Thr Val Pro Val Arg Thr Ser Val Asp 195 200 205 Gly Gly Gln Ser Phe Leu Glu Phe Val Lys Gly Arg Met Lys Asp Leu 210 215 220 Met Lys Ile Leu Arg His Gln Lys Tyr Pro Tyr Asn Leu Leu Val Asn 225 230 235 240 Asp Leu Arg Ala Ser Lys Ser Ser Leu Ser Arg Leu Phe Thr Val Ala 245 250 255 Leu Glu Tyr Gln Val Met Gln Trp Gln Lys Lys Glu Asn Leu Ser Phe 260 265 270 Leu Thr Asp Pro Ile Phe Ser Gly Ser Gly Thr Asn Asp Ile Ser Ile 275 280 285 His Val Lys Glu Arg Trp Asp Thr Gly Lys Leu Thr Ile Asp Phe Asp 290 295 300 Tyr Arg Ser Asp Ile Phe Lys Gly Glu Glu Ile Val Ser Val Ser Glu 305 310 315 320 Arg Leu Ile Thr Leu Ile Glu Asp Ala Ile Ser Ser Pro Asp Arg Ile 325 330 335 Ile Asp Glu Leu Thr Leu Leu Ser Glu Ser Glu Lys Glu Arg Leu Leu 340 345 350 Thr Arg Ala Ser Gly Asn Pro Val Asn Tyr Arg Gly Glu Met Thr Ile 355 360 365 Pro Gly Leu Phe Glu Glu Lys Val Lys Ser Leu Ser Asp Lys Pro Ala 370 375 380 Val Val Tyr Glu Gly Arg Thr Leu Ser Tyr Arg Thr Leu His Glu Gln 385 390 395 400 Ser Gly Arg Ile Ala Gly Arg Leu Leu Asn Ala Gly Ile Ser Ala Asp 405 410 415 Ser Pro Val Ala Val Leu Leu Gly Arg Ser Glu Arg Val Ile Ala Ala 420 425 430 Ile Leu Gly Ile Leu Lys Ala Gly Gly Ala Tyr Val Pro Ile Asp Pro 435 440 445 Asp Phe Pro Ala Asp Arg Ile Gln Tyr Ile Leu Glu Asp Ser Gly Ala 450 455 460 Lys Ala Val Leu Thr Glu Ala Gly Ile Gln Ala Pro Ala Ala Asp Ala 465 470 475 480 Glu Arg Ile Asp Phe Asp Glu Ala Val Gln Phe Glu Thr Ala Ala Asp 485 490 495 Gly Val Ser Thr Gln Ser Asp Arg Leu Ala Tyr Ile Ile Tyr Thr Ser 500 505 510 Gly Thr Thr Gly Arg Pro Lys Gly Val Met Ile Glu His Arg Gln Val 515 520 525 His His Leu Val Gln Ser Leu Gln Gln Glu Ile Tyr Gln Cys Gly Glu 530 535 540 Gln Thr Leu Arg Met Ala Leu Leu Ala Pro Phe His Phe Asp Ala Ser 545 550 555 560 Val Lys Gln Ile Phe Ala Ser Leu Leu Leu Gly Gln Thr Leu Tyr Ile 565 570 575 Val Pro Lys Thr Thr Val Thr Asn Gly Ser Ala Leu Leu Asp Tyr Tyr 580 585 590 Arg Gln Asn Arg Ile Glu Ala Thr Asp Gly Thr Pro Ala His Leu Gln 595 600 605 Met Met Val Ala Ala Gly Asp Val Ser Gly Ile Glu Leu Arg His Met 610 615 620 Leu Ile Gly Gly Glu Gly Leu Ser Ala Ala Val Ala Glu Gln Leu Met 625 630 635 640 Asn Leu Phe His Gln Ser Gly Arg Ala Pro Arg Leu Thr Asn Val Tyr 645 650 655 Gly Pro Thr Glu Thr Cys Val Asp Ala Ser Val His Gln Val Ser Ala 660 665 670 Asp Asn Gly Met Asn Gln Gln Ala Ala Tyr Val Pro Ile Gly Lys Pro 675 680 685 Leu Gly Asn Ala Arg Leu Tyr Ile Leu Asp Lys His Gln Arg Leu Gln 690 695 700 Pro Asp Gly Thr Ala Gly Glu Leu Tyr Ile Ala Gly Asp Gly Val Gly 705 710 715 720 Arg Gly Tyr Leu Asn Leu Pro Asp Leu Thr Ala Glu Lys Phe Leu Gln 725 730 735 Asp Pro Phe Asn Gly Ser Gly Arg Met Tyr Arg Thr Gly Asp Met Ala 740 745 750 Arg Trp Leu Pro Asp Gly Thr Ile Glu Tyr Ile Gly Arg Glu Asp Asp 755 760 765 Gln Val Lys Val Arg Gly Tyr Arg Ile Glu Leu Gly Glu Ile Glu Thr 770 775 780 Val Leu Arg Lys Ala Pro Gly Ala Ala Gln Ala Val Val Leu Ala Arg 785 790 795 800 Pro Asp Gln Gln Gly Ser Leu Asp Val Cys Ala Tyr Ile Val Gln Glu 805 810 815 Lys Gly Thr Glu Phe His Pro Ala Glu Tyr Arg Glu Tyr Val Ser Lys 820 825 830 His Leu Pro Asp Tyr Met Val Pro Ala Tyr Phe Thr Lys Thr Asp Glu 835 840 845 Ile Pro Leu Thr Pro Ser Gly Lys Ala Asp Arg Lys Lys Leu Phe Ala 850 855 860 Leu Asp Val Gln Ala Val Ser Ser Ser Glu Tyr Ala Ala Pro Arg Asn 865 870 875 880 Glu Thr Glu Glu Thr Leu Thr Val Ile Trp Gln Glu Val Leu Gly Met 885 890 895 Asp Lys Ala Gly Ile Tyr Asp His Phe Phe Glu Ser Gly Gly His Ser 900 905 910 Leu Lys Ala Met Thr Leu Leu Thr Lys Ile His Lys Gln Met Gly Val 915 920 925 Glu Ile Pro Leu Gln Tyr Leu Phe Glu His Pro Thr Ile Ala Ala Leu 930 935 940 Ala Asp Tyr Ala Glu Asn Arg Asn Glu Gly Pro Ala Phe Arg Ala Ile 945 950 955 960 Glu Pro Ala Glu Lys Gln Ala Ser Tyr Pro Leu Ser Leu Ala Gln Gln 965 970 975 Arg Thr Tyr Ile Ala Ser Gln Phe Glu Asp Ala Gly Val Gly Tyr Asn 980 985 990 Met Pro Ala Ala Ala Val Ile Glu Gly Ala Leu Asp Leu Glu Lys Leu 995 1000 1005 Glu Arg Ala Phe Ser Ala Leu Ile Ser Arg His Glu Ala Leu Arg Thr 1010 1015 1020 Ser Phe Gln Ser Glu Asp Gly Thr Pro Arg Gln Val Val His Glu His 1025 1030 1035 1040 Val Pro Phe His Ile Glu Met Leu Glu Ala Arg Gly Arg Thr Asn Glu 1045 1050 1055 Gln Val Met Lys Asp Phe Val Arg Arg Phe Asp Leu Ser Glu Ala Pro 1060 1065 1070 Leu Phe Arg Ile Gly Leu Gln Thr Leu Gly His Asn Arg His Met Leu 1075 1080 1085 Leu Phe Asp Met His His Leu Ile Ser Asp Gly Val Ser Ile Ser Ile 1090 1095 1100 Met Leu Lys Glu Leu Ala Asp Ile Tyr Gly Gly Asn Gln Leu Pro Glu 1105 1110 1115 1120 Leu Arg Ile Gln Tyr Lys Asp Tyr Ala Val Trp Gln Ala Glu Arg Ala 1125 1130 1135 Lys Glu Gly Tyr Lys Lys Glu Arg Ala Tyr Trp Lys Glu Val Phe Ser 1140 1145 1150 Gly Glu Leu Pro Val Leu Gln Leu Leu Pro Asp Tyr Pro Arg Pro Gln 1155 1160 1165 Met Gln Ser Phe Glu Gly Asp Arg Val Ser Ala Lys Leu Pro Lys Met 1170 1175 1180 Leu Arg Glu Arg Leu Gln Lys Leu Ala Glu Lys Asn Gly Ala Thr Leu 1185 1190 1195 1200 Tyr Met Val Leu Leu Ser Ala Tyr Tyr Thr Leu Leu Ser Lys Tyr Ser 1205 1210 1215 Gly Gln Glu Asp Ile Ile Val Gly Thr Pro Ser Ala Gly Arg Asn His 1220 1225 1230 Ser Asp Thr Glu Gly Leu Ile Gly Met Phe Val Asn Thr Leu Ala Leu 1235 1240 1245 Arg Ser Ser Val Lys Gln Asp Gln Thr Phe Ala Gly Leu Leu Gly His 1250 1255 1260 Val Arg Lys Gln Val Leu Asp Ala Phe Ser His Gln Asp Tyr Pro Phe 1265 1270 1275 1280 Glu Trp Leu Thr Glu Glu Leu Asn Val Pro Arg Asp Met Ser Arg His 1285 1290 1295 Pro Ile Phe Asp Thr Met Phe Ser Leu Gln Asn Ala Ser Asp Gly Ile 1300 1305 1310 Pro Glu Ile Gly Asn Leu Thr Leu Ser Leu His Glu Thr Asn Phe Asn 1315 1320 1325 Ile Ala Lys Phe Asp Leu Thr Met Gln Ala Arg Glu Thr Ala Glu Gly 1330 1335 1340 Ile Ala Leu Asp Leu Asp Tyr Cys Thr Lys Leu Phe Lys Arg Ser Thr 1345 1350 1355 1360 Ala Asp Arg Met Leu Ala His Tyr Val Arg Leu Leu Glu Ser Ala Ala 1365 1370 1375 Ala Gln Pro Asp Ala Lys Ile Ser Glu Tyr Asp Leu Leu Ser Glu Arg 1380 1385 1390 Glu Ala Leu Asn Gln Leu Gln Arg Phe Asn Pro Glu Arg Thr Ala Tyr 1395 1400 1405 Pro Lys Glu Gln Thr Ile Val Gln Ile Phe Glu Glu Gln Ala Arg Lys 1410 1415 1420 Asn Pro Asp Arg Thr Ala Leu Gln Phe Glu Gly Glu Thr Leu Ser Tyr 1425 1430 1435 1440 Gln Gln Leu Asn Glu Arg Ala Asn Arg Leu Ala Arg His Ile Leu Ser 1445 1450 1455 Val Gly Gly Gly Gly Lys Thr Ala Ala Val Leu Cys Glu Arg Ser Met 1460 1465 1470 Asp Met Ile Val Ser Ile Met Ala Val Leu Lys Ala Gly Ser Ala Tyr 1475 1480 1485 Val Pro Ile Asp Pro Glu His Pro Val Gln Arg Ile Gln His Phe Phe 1490 1495 1500 Arg Asp Ser Gly Ala Lys Val Leu Leu Thr Gln Gln Ser Leu Lys Pro 1505 1510 1515 1520 Leu Ala Glu Lys Ala Gly Phe Gln Gly Ala Ile Val Leu Ala Asp Asp 1525 1530 1535 Glu Ala Ser Tyr Glu Lys Asp Ser Arg Asn Pro Ala Leu Pro Phe Asp 1540 1545 1550 Ser Ser Thr Ile Ala Asn Leu Thr Tyr Thr Ser Gly Thr Thr Gly Thr 1555 1560 1565 Pro Lys Gly Asn Ile Val Thr His Ala Asn Ile Leu Arg Thr Val Lys 1570 1575 1580 Asn Thr Asn Tyr Leu Thr Val Ser Glu Glu Asp Thr Val Leu Gly Leu 1585 1590 1595 1600 Ser Asn Tyr Val Phe Asp Ala Phe Met Phe Asp Met Phe Gly Ser Leu 1605 1610 1615 Leu Asn Gly Ala Lys Leu Val Ile Val Pro Lys Asp Thr Val Leu Asp 1620 1625 1630 Met Ser Arg Leu Ser Arg Val Ile Lys Arg Glu Asn Val Ser Ile Leu 1635 1640 1645 Met Ile Thr Thr Ala Leu Phe His Leu Leu Val Asp Met Glu Pro Ser 1650 1655 1660 Cys Leu Thr Thr Leu Arg Lys Ile Met Phe Gly Gly Glu Arg Ala Ser 1665 1670 1675 1680 Val Glu His Val Lys Lys Ala Leu Ala Ala Val Gly Lys Gly Arg Leu 1685 1690 1695 Leu His Met Tyr Gly Pro Ser Glu Ser Thr Val Phe Ala Thr Tyr His 1700 1705 1710 Pro Val Asp Val Ile Glu Glu Asp Thr Leu Ser Val Pro Ile Gly Lys 1715 1720 1725 Pro Val Ser Asn Thr Glu Val Phe Ile Met Asn Ser Ala Gly Arg Ile 1730 1735 1740 Gln Pro Ala Gly Ile Ala Gly Glu Leu Cys Val Ser Gly Glu Gly Leu 1745 1750 1755 1760 Val Glu Gly Tyr Tyr Asn Arg Pro Glu Leu Thr Glu Glu Lys Phe Val 1765 1770 1775 Lys His Pro Phe Lys Glu Gly Glu Arg Met Tyr Lys Thr Gly Asp Leu 1780 1785 1790 Ala Arg Trp Leu Pro Asn Gly Asp Ile Glu Phe Ile Gly Arg Ile Asp 1795 1800 1805 His Gln Val Lys Ile Arg Gly Gln Arg Ile Glu Leu Gly Glu Ile Glu 1810 1815 1820 His Gln Leu Gln Ser His Asp Gln Ile Gln Glu Cys Ile Val Leu Ala 1825 1830 1835 1840 Val Asp Gln Gly Ala Gly Asp Lys Leu Leu Cys Ala Tyr Phe Val Gly 1845 1850 1855 Leu Arg Glu Ile Ser Ser Arg Glu Leu Arg Glu His Thr Ala Lys Asp 1860 1865 1870 Leu Pro Ala Tyr Met Ile Pro Ser Val Phe Ile Gln Leu Asp Glu Leu 1875 1880 1885 Pro Leu Thr Gly Asn Gly Lys Ile Asp Arg Arg Ala Leu Pro Met Pro 1890 1895 1900 Asp Val Thr Ala Ala Asn Ala Val Ser Tyr Thr Ala Pro Arg Asn Glu 1905 1910 1915 1920 Thr Glu Lys Lys Leu Ala Asp Ile Trp Ala Glu Val Leu Gln Met Glu 1925 1930 1935 Arg Val Gly Val His Asp Gln Phe Phe Glu Ile Gly Gly His Ser Leu 1940 1945 1950 Ala Gly Met Lys Leu Leu Ala Leu Ile Gln Lys Thr Phe Gly Val Gln 1955 1960 1965 Leu Thr Leu Lys Asp Leu Phe Thr Ser Pro Thr Ala Ala Gly Leu Ala 1970 1975 1980 Gln Leu Ile Glu Gly Ala Glu Arg Lys Ala Ala Glu Ser Ile Ala Pro 1985 1990 1995 2000 Ala Ala Glu Arg Glu Thr Tyr Pro Val Ser Ser Pro Gln Lys Arg Met 2005 2010 2015 Phe Val Leu Gln Gln Leu Glu Gly Ala Glu Thr Ser Tyr Asn Met Pro 2020 2025 2030 Ser Val Leu Arg Leu Lys Gly Lys Leu Asp Ala Glu Lys Leu Lys Ser 2035 2040 2045 Val Met Lys Gln Leu Thr Glu Arg His Glu Ala Phe Arg Thr Thr Phe 2050 2055 2060 Asp Ile Lys Asp Gly Glu Thr Val Gln Arg Ile Trp Ala Glu Ala Tyr 2065 2070 2075 2080 Ile Asp Met Glu Tyr Tyr Glu Ala Ser Glu Glu Asp Ala Glu Gln Ile 2085 2090 2095 Ile Gln Ser Phe Ile Arg Pro Phe Arg Leu Asp Gln Leu Pro Leu Val 2100 2105 2110 Arg Thr Gly Leu Val Lys Leu Ala Glu His Asp His Leu Leu Leu Phe 2115 2120 2125 Asp Met His His Ile Ile Ser Asp Gly Ala Ser Val Gly Val Leu Ile 2130 2135 2140 Asp Glu Leu Ser Arg Leu Tyr Gly Gly Glu Thr Leu Glu Pro Leu Arg 2145 2150 2155 2160 Ile His Tyr Lys Asp Tyr Ala Val Trp Gln Gln Lys Phe Ile Gln Ser 2165 2170 2175 Glu Gln Tyr Arg Lys Gln Glu Glu His Trp Leu Arg Glu Leu Asp Gly 2180 2185 2190 Glu Leu Pro Val Leu Thr Leu Pro Ala Asp Tyr Ser Arg Pro Ala Val 2195 2200 2205 Gln Thr Phe Glu Gly Asp Lys Leu Val Phe Ser Leu Thr Glu Glu Gln 2210 2215 2220 Thr Ser Ala Leu Arg Ser Leu Ala Lys Gln Thr Asp Ser Thr Met Tyr 2225 2230 2235 2240 Met Val Leu Leu Ala Ser Tyr Ser Ala Phe Leu Ser Lys Leu Ser Gly 2245 2250 2255 Gln His Asp Ile Ile Val Gly Ser Pro Ala Ala Gly Arg Ser His Ala 2260 2265 2270 Asp Leu Ala Asn Val Ile Gly Val Phe Val Asn Thr Leu Ala Leu Arg 2275 2280 2285 Thr Tyr Pro Glu Ala Asp Lys Thr Phe Thr Asp Tyr Leu Lys Glu Val 2290 2295 2300 Lys Gln Thr Ala Leu His Ala Phe Asp Ala Gln Asp Tyr Pro Leu Glu 2305 2310 2315 2320 Asp Leu Leu Gln Lys Val Glu Val Gln Arg Asp Thr Ser Arg Asn Pro 2325 2330 2335 Leu Phe Asp Ala Val Phe Ser Met Gln Asn Ala Asn Ala Glu Asp Leu 2340 2345 2350 Val Met Glu Gly Ile Glu Leu Lys His His Pro Phe Asp Arg Lys Thr 2355 2360 2365 Ala Lys Phe Asp Leu Thr Leu Thr Ala Glu Asp Thr Asp Glu Gly Leu 2370 2375 2380 Thr Phe Val Leu Glu Tyr Asn Thr Ala Leu Phe Lys Pro Glu Thr Ala 2385 2390 2395 2400 Glu Thr Trp Lys His Tyr Trp Leu Gln Leu Leu Lys Ala Ala Thr Glu 2405 2410 2415 Asn Pro Ala Ala Lys Leu Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Glu Thr Glu 2420 2425 2430 Lys Gln Ala Leu Leu Asp Ala Trp Lys Gly Lys Thr Leu Ser Val Pro 2435 2440 2445 Gln Asp Lys Thr Val His Arg Leu Phe Glu Glu Thr Ala Ala Arg Tyr 2450 2455 2460 Ala Asn Arg Pro Ala Ala Ala Tyr Asn Gly Ala Lys Trp Thr Tyr Gly 2465 2470 2475 2480 Glu Leu Asn Ala Arg Ala Asn Arg Ile Ala Arg Ile Leu Ile Asp Cys 2485 2490 2495 Gly Val Thr Ala Asp Glu Arg Val Gly Ile Leu Thr Lys Pro Ser Leu 2500 2505 2510 Glu Met Ala Ala Gly Val Leu Gly Val Leu Lys Ala Gly Ala Ala Phe 2515 2520 2525 Val Pro Ile Asp Pro Asp Tyr Pro Gln Glu Arg Ile Ser Tyr Ile Leu 2530 2535 2540 Gln Asp Ser Gly Ala Lys Leu Leu Leu Thr Gln Glu Ala Leu Asp Val 2545 2550 2555 2560 Pro Asp Gly Tyr Thr Gly Glu Thr Ile Leu Leu Asp Gly Gly Arg Ser 2565 2570 2575 Ile Leu Ser Leu Pro Leu Asp Glu Asn Asp Glu Ala Asn Pro Gln Thr 2580 2585 2590 Glu Thr Thr Ala Asp His Leu Ala Tyr Met Ile Tyr Thr Ser Gly Thr 2595 2600 2605 Thr Gly Gln Pro Lys Gly Val Met Val Glu His His Ala Leu Val Asn 2610 2615 2620 Leu Cys Phe Trp His His Asp Ala Phe Ala Met Thr Ala Asp Asp Lys 2625 2630 2635 2640 Ser Ala Lys Tyr Ala Gly Phe Gly Phe Asp Ala Ser Ile Trp Glu Met 2645 2650 2655 Phe Pro Thr Trp Thr Ile Gly Ala Glu Leu His Val Ile Asp Glu Ala 2660 2665 2670 Ile Arg Leu Asp Ile Thr Arg Leu Asn His Tyr Phe Glu Glu His Gly 2675 2680 2685 Val Thr Ile Thr Phe Leu Pro Thr Gln Leu Ala Glu Gln Phe Met Glu 2690 2695 2700 Leu Glu Asn Thr Ser Leu Arg Met Leu Leu Val Gly Gly Asp Lys Leu 2705 2710 2715 2720 Lys Arg Ala Val Lys Gln Pro Tyr Thr Ile Val Asn Asn Tyr Gly Pro 2725 2730 2735 Thr Glu Asn Thr Val Val Ala Thr Ser Gly Val Ile Asn Pro Glu Glu 2740 2745 2750 Gly Ser Leu Ser Ile Gly Arg Ala Ile Ala Asn Thr Arg Ala Tyr Ile 2755 2760 2765 Leu Gly Asp Gly Asp Gln Val Gln Pro Glu Gly Ile Ala Gly Glu Leu 2770 2775 2780 Cys Val Ala Gly Arg Gly Leu Ala Arg Gly Tyr Leu Asn Arg Glu Glu 2785 2790 2795 2800 Glu Thr Ala Lys Arg Phe Thr Ala Asp Pro Phe Val Pro Gly Glu Arg 2805 2810 2815 Met Tyr Arg Thr Gly Asp Leu Val Lys Trp Asn Ala Gln Ser Gly Ile 2820 2825 2830 Glu Tyr Ile Gly Arg Ile Asp Gln Gln Val Lys Val Arg Gly Tyr Arg 2835 2840 2845 Ile Glu Leu Ser Glu Ile Glu Val Arg Leu Ala Gln Leu Ala Asp Val 2850 2855 2860 His Asp Ala Ala Val Thr Ala Val Glu Asp Lys Ala Gly Asn Ala Ala 2865 2870 2875 2880 Leu Cys Ala Tyr Val Ala Pro Gln Gln Asp Asp Ile Glu Ala Leu Lys 2885 2890 2895 Ala Ala Leu Lys Asp Thr Leu Pro Asp Tyr Met Val Pro Ala Phe Trp 2900 2905 2910 Val Glu Met Asp Glu Leu Pro Val Thr Ala Asn Gly Lys Ile Asp Lys 2915 2920 2925 Lys Ala Leu Pro Glu Pro Asp Ile Glu Ala Gly Ser Ala Ala Tyr Lys 2930 2935 2940 Ala Pro Glu Thr Glu Met Glu Thr Leu Leu Ser Asp Ile Trp Glu Glu 2945 2950 2955 2960 Val Leu Gly Leu Asp Gln Ile Gly Val Ser Asp Asn Phe Phe Thr Leu 2965 2970 2975 Gly Gly Asp Ser Ile Lys Gly Ile Gln Met Ala Ser Arg Leu Asn Gln 2980 2985 2990 His Gly Tyr Lys Leu Glu Met Lys Asp Leu Phe Gln His Pro Thr Ile 2995 3000 3005 Glu Glu Leu Val Ser Tyr Val Glu Arg Thr Glu Gly Lys Gln Ala Asp 3010 3015 3020 Gln Gly Pro Val Glu Gly Lys Ala Glu Leu Thr Pro Ile Gln Arg Trp 3025 3030 3035 3040 Phe Phe Glu Lys Asn Phe Thr Asp Lys His His Trp Asn Gln Ser Val 3045 3050 3055 Met Leu His Ala Lys Asp Gly Phe Asp Pro Glu Ile Thr Glu Lys Thr 3060 3065 3070 Leu His Val Leu Thr Val His His Asp Ala Leu Arg Met Ile Tyr Arg 3075 3080 3085 Glu Gln Lys Pro Tyr Tyr Arg Gly Leu Glu Asp Ala Ser Val Glu Leu 3090 3095 3100 Asn Val Phe Glu Leu Asn Gly Pro Ala Glu Asp His Glu Asn Arg Ile 3105 3110 3115 3120 Glu Arg Glu Ala Asp Arg Leu Gln Ser Ser Ile Ser Leu Glu Thr Gly 3125 3130 3135 His Leu Leu Lys Ala Gly Leu Phe Arg Ala Glu Asp Gly Asp His Leu 3140 3145 3150 Leu Leu Ala Ile His His Leu Val Val Asp Gly Val Ser Trp Arg Ile 3155 3160 3165 Leu Leu Glu Asp Phe Thr Ser Val Tyr Thr Gln Leu Lys Gln Gly Asn 3170 3175 3180 Glu Pro Ala Leu Pro Pro Lys Thr His Ser Phe Ala Glu Phe Ala Glu 3185 3190 3195 3200 Arg Ile Lys Glu Tyr Ala Asn Thr Lys Ala Phe Leu Lys Glu Ala Asp 3205 3210 3215 Tyr Trp Arg Glu Leu Glu Glu Lys Glu Val Cys Thr Gln Leu Pro Lys 3220 3225 3230 Asp Arg Gln Ser Gly Asp Gln Arg Met Arg His Thr Arg Thr Val Ser 3235 3240 3245 Phe Ser Leu Thr Pro Glu Gln Thr Glu Gln Leu Thr Thr Asn Val His 3250 3255 3260 Glu Ala Tyr His Thr Glu Met Asn Asp Ile Leu Leu Thr Ala Leu Gly 3265 3270 3275 3280 Leu Ala Leu Lys Glu Trp Thr Gly Glu Asp Thr Ile Gly Val His Leu 3285 3290 3295 Glu Gly His Gly Arg Glu Asp Ile Leu Asp Gly Leu Asn Ile Thr Arg 3300 3305 3310 Thr Val Gly Trp Phe Thr Ser Met Tyr Pro Met Ile Leu Glu Met Lys 3315 3320 3325 His Ala Asp Asp Leu Ser Tyr Gln Leu Lys Gln Met Lys Glu Asp Ile 3330 3335 3340 Arg His Ile Pro Asn Lys Gly Val Gly Tyr Gly Ile Leu Arg Tyr Val 3345 3350 3355 3360 Thr Ala Pro Glu His Lys Glu Gly Leu Ser Phe Glu Ile Asp Pro Asp 3365 3370 3375 Ile Ser Phe Asn Tyr Leu Gly Gln Phe Asn Glu Met Ser Asp Ser Gly 3380 3385 3390 Leu Phe Thr Arg Ser Gly Met Pro Ser Gly Gln Ser Leu Ser Pro Asp 3395 3400 3405 Thr Glu Lys Pro Asn Ala Leu Asp Ile Val Gly Phe Ile Glu Asn Gly 3410 3415 3420 Gln Met Thr Met Thr Phe Ala Tyr His Ser Leu Glu Phe His Glu Lys 3425 3430 3435 3440 Thr Ile Gln Ser Phe Ser Asp Ser Phe Lys Gly His Leu Leu Lys Ile 3445 3450 3455 Ile Leu Thr Leu Asp Glu Leu Asp Lys Leu Met Glu Ile Leu 3460 3465 3470 <210> 12 <211> 181 <212> PRT <213> Bacillus subtilis subsp. krictiensis <400> 12 Met Glu Ile Thr Phe Tyr Pro Leu Thr Asn Ala Gln Lys Arg Ile Trp 1 5 10 15 Tyr Thr Glu Lys Phe Tyr Pro Asn Thr Ser Ile Ser Asn Leu Ala Gly 20 25 30 Phe Gly Lys Leu Ile Ser Asp Asp Gly Val Gln Ala His Tyr Val Glu 35 40 45 Lys Ala Ile Gln Glu Phe Val Arg Arg Tyr Glu Ser Met Arg Ile Arg 50 55 60 Leu Arg Leu Asp Asp Glu Gly Glu Pro Val Gln Tyr Val Ser Asp Tyr 65 70 75 80 Arg Pro Leu Thr Ile Glu His Thr Asp Ile Arg Gln Ala Gly Cys Ser 85 90 95 Ala Glu Glu Leu Ser Lys Trp Gly Arg Asp Glu Ala Ser Lys Pro Leu 100 105 110 Ala Leu Tyr Asp Gln Asp Leu Phe Arg Phe Ser Val Tyr Thr Ile Ser 115 120 125 Glu Asn Glu Val Trp Phe Tyr Val Asn Val His His Ile Ile Ser Asp 130 135 140 Gly Ile Ser Met Thr Ile Leu Gly Asn Ala Ile Thr Asp Ile Tyr Leu 145 150 155 160 Glu Leu Ser Gly Gly Ala Ser Met Glu Gln Thr Glu Ile Pro Pro Tyr 165 170 175 Arg Ala Cys Ala Asp 180 <210> 13 <211> 3289 <212> PRT <213> Bacillus subtilis subsp. krictiensis <400> 13 Met Gly Asn Arg Thr Asn Ala Lys Glu Lys Gln Met Leu Gly Met Phe 1 5 10 15 Val Ser Thr Val Pro Val Arg Thr Ser Val Asp Gly Gly Gln Ser Phe 20 25 30 Leu Glu Phe Val Lys Gly Arg Met Lys Asp Leu Met Lys Ile Leu Arg 35 40 45 His Gln Lys Tyr Pro Tyr Asn Leu Leu Val Asn Asp Leu Arg Ala Ser 50 55 60 Lys Ser Ser Leu Ser Arg Leu Phe Thr Val Ala Leu Glu Tyr Gln Val 65 70 75 80 Met Gln Trp Gln Lys Lys Glu Asn Leu Ser Phe Leu Thr Asp Pro Ile 85 90 95 Phe Ser Gly Ser Gly Thr Asn Asp Ile Ser Ile His Val Lys Glu Arg 100 105 110 Trp Asp Thr Gly Lys Leu Thr Ile Asp Phe Asp Tyr Arg Ser Asp Ile 115 120 125 Phe Lys Gly Glu Glu Ile Val Ser Val Ser Glu Arg Leu Ile Thr Leu 130 135 140 Ile Glu Asp Ala Ile Ser Ser Pro Asp Arg Ile Ile Asp Glu Leu Thr 145 150 155 160 Leu Leu Ser Glu Ser Glu Lys Glu Arg Leu Leu Thr Arg Ala Ser Gly 165 170 175 Asn Pro Val Asn Tyr Arg Gly Glu Met Thr Ile Pro Gly Leu Phe Glu 180 185 190 Glu Lys Val Lys Ser Leu Ser Asp Lys Pro Ala Val Val Tyr Glu Gly 195 200 205 Arg Thr Leu Ser Tyr Arg Thr Leu His Glu Gln Ser Gly Arg Ile Ala 210 215 220 Gly Arg Leu Leu Asn Ala Gly Ile Ser Ala Asp Ser Pro Val Ala Val 225 230 235 240 Leu Leu Gly Arg Ser Glu Arg Val Ile Ala Ala Ile Leu Gly Ile Leu 245 250 255 Lys Ala Gly Gly Ala Tyr Val Pro Ile Asp Pro Asp Phe Pro Ala Asp 260 265 270 Arg Ile Gln Tyr Ile Leu Glu Asp Ser Gly Ala Lys Ala Val Leu Thr 275 280 285 Glu Ala Gly Ile Gln Ala Pro Ala Ala Asp Ala Glu Arg Ile Asp Phe 290 295 300 Asp Glu Ala Val Gln Phe Glu Thr Ala Ala Asp Gly Val Ser Thr Gln 305 310 315 320 Ser Asp Arg Leu Ala Tyr Ile Ile Tyr Thr Ser Gly Thr Thr Gly Arg 325 330 335 Pro Lys Gly Val Met Ile Glu His Arg Gln Val His His Leu Val Gln 340 345 350 Ser Leu Gln Gln Glu Ile Tyr Gln Cys Gly Glu Gln Thr Leu Arg Met 355 360 365 Ala Leu Leu Ala Pro Phe His Phe Asp Ala Ser Val Lys Gln Ile Phe 370 375 380 Ala Ser Leu Leu Leu Gly Gln Thr Leu Tyr Ile Val Pro Lys Thr Thr 385 390 395 400 Val Thr Asn Gly Ser Ala Leu Leu Asp Tyr Tyr Arg Gln Asn Arg Ile 405 410 415 Glu Ala Thr Asp Gly Thr Pro Ala His Leu Gln Met Met Val Ala Ala 420 425 430 Gly Asp Val Ser Gly Ile Glu Leu Arg His Met Leu Ile Gly Gly Glu 435 440 445 Gly Leu Ser Ala Ala Val Ala Glu Gln Leu Met Asn Leu Phe His Gln 450 455 460 Ser Gly Arg Ala Pro Arg Leu Thr Asn Val Tyr Gly Pro Thr Glu Thr 465 470 475 480 Cys Val Asp Ala Ser Val His Gln Val Ser Ala Asp Asn Gly Met Asn 485 490 495 Gln Gln Ala Ala Tyr Val Pro Ile Gly Lys Pro Leu Gly Asn Ala Arg 500 505 510 Leu Tyr Ile Leu Asp Lys His Gln Arg Leu Gln Pro Asp Gly Thr Ala 515 520 525 Gly Glu Leu Tyr Ile Ala Gly Asp Gly Val Gly Arg Gly Tyr Leu Asn 530 535 540 Leu Pro Asp Leu Thr Ala Glu Lys Phe Leu Gln Asp Pro Phe Asn Gly 545 550 555 560 Ser Gly Arg Met Tyr Arg Thr Gly Asp Met Ala Arg Trp Leu Pro Asp 565 570 575 Gly Thr Ile Glu Tyr Ile Gly Arg Glu Asp Asp Gln Val Lys Val Arg 580 585 590 Gly Tyr Arg Ile Glu Leu Gly Glu Ile Glu Thr Val Leu Arg Lys Ala 595 600 605 Pro Gly Ala Ala Gln Ala Val Val Leu Ala Arg Pro Asp Gln Gln Gly 610 615 620 Ser Leu Asp Val Cys Ala Tyr Ile Val Gln Glu Lys Gly Thr Glu Phe 625 630 635 640 His Pro Ala Glu Tyr Arg Glu Tyr Val Ser Lys His Leu Pro Asp Tyr 645 650 655 Met Val Pro Ala Tyr Phe Thr Lys Thr Asp Glu Ile Pro Leu Thr Pro 660 665 670 Ser Gly Lys Ala Asp Arg Lys Lys Leu Phe Ala Leu Asp Val Gln Ala 675 680 685 Val Ser Ser Ser Glu Tyr Ala Ala Pro Arg Asn Glu Thr Glu Glu Thr 690 695 700 Leu Thr Val Ile Trp Gln Glu Val Leu Gly Met Asp Lys Ala Gly Ile 705 710 715 720 Tyr Asp His Phe Phe Glu Ser Gly Gly His Ser Leu Lys Ala Met Thr 725 730 735 Leu Leu Thr Lys Ile His Lys Gln Met Gly Val Glu Ile Pro Leu Gln 740 745 750 Tyr Leu Phe Glu His Pro Thr Ile Ala Ala Leu Ala Asp Tyr Ala Glu 755 760 765 Asn Arg Asn Glu Gly Pro Ala Phe Arg Ala Ile Glu Pro Ala Glu Lys 770 775 780 Gln Ala Ser Tyr Pro Leu Ser Leu Ala Gln Gln Arg Thr Tyr Ile Ala 785 790 795 800 Ser Gln Phe Glu Asp Ala Gly Val Gly Tyr Asn Met Pro Ala Ala Ala 805 810 815 Val Ile Glu Gly Ala Leu Asp Leu Glu Lys Leu Glu Arg Ala Phe Ser 820 825 830 Ala Leu Ile Ser Arg His Glu Ala Leu Arg Thr Ser Phe Gln Ser Glu 835 840 845 Asp Gly Thr Pro Arg Gln Val Val His Glu His Val Pro Phe His Ile 850 855 860 Glu Met Leu Glu Ala Arg Gly Arg Thr Asn Glu Gln Val Met Lys Asp 865 870 875 880 Phe Val Arg Arg Phe Asp Leu Ser Glu Ala Pro Leu Phe Arg Ile Gly 885 890 895 Leu Gln Thr Leu Gly His Asn Arg His Met Leu Leu Phe Asp Met His 900 905 910 His Leu Ile Ser Asp Gly Val Ser Ile Ser Ile Met Leu Lys Glu Leu 915 920 925 Ala Asp Ile Tyr Gly Gly Asn Gln Leu Pro Glu Leu Arg Ile Gln Tyr 930 935 940 Lys Asp Tyr Ala Val Trp Gln Ala Glu Arg Ala Lys Glu Gly Tyr Lys 945 950 955 960 Lys Glu Arg Ala Tyr Trp Lys Glu Val Phe Ser Gly Glu Leu Pro Val 965 970 975 Leu Gln Leu Leu Pro Asp Tyr Pro Arg Pro Gln Met Gln Ser Phe Glu 980 985 990 Gly Asp Arg Val Ser Ala Lys Leu Pro Lys Met Leu Arg Glu Arg Leu 995 1000 1005 Gln Lys Leu Ala Glu Lys Asn Gly Ala Thr Leu Tyr Met Val Leu Leu 1010 1015 1020 Ser Ala Tyr Tyr Thr Leu Leu Ser Lys Tyr Ser Gly Gln Glu Asp Ile 1025 1030 1035 1040 Ile Val Gly Thr Pro Ser Ala Gly Arg Asn His Ser Asp Thr Glu Gly 1045 1050 1055 Leu Ile Gly Met Phe Val Asn Thr Leu Ala Leu Arg Ser Ser Val Lys 1060 1065 1070 Gln Asp Gln Thr Phe Ala Gly Leu Leu Gly His Val Arg Lys Gln Val 1075 1080 1085 Leu Asp Ala Phe Ser His Gln Asp Tyr Pro Phe Glu Trp Leu Thr Glu 1090 1095 1100 Glu Leu Asn Val Pro Arg Asp Met Ser Arg His Pro Ile Phe Asp Thr 1105 1110 1115 1120 Met Phe Ser Leu Gln Asn Ala Ser Asp Gly Ile Pro Glu Ile Gly Asn 1125 1130 1135 Leu Thr Leu Ser Leu His Glu Thr Asn Phe Asn Ile Ala Lys Phe Asp 1140 1145 1150 Leu Thr Met Gln Ala Arg Glu Thr Ala Glu Gly Ile Ala Leu Asp Leu 1155 1160 1165 Asp Tyr Cys Thr Lys Leu Phe Lys Arg Ser Thr Ala Asp Arg Met Leu 1170 1175 1180 Ala His Tyr Val Arg Leu Leu Glu Ser Ala Ala Ala Gln Pro Asp Ala 1185 1190 1195 1200 Lys Ile Ser Glu Tyr Asp Leu Leu Ser Glu Arg Glu Ala Leu Asn Gln 1205 1210 1215 Leu Gln Arg Phe Asn Pro Glu Arg Thr Ala Tyr Pro Lys Glu Gln Thr 1220 1225 1230 Ile Val Gln Ile Phe Glu Glu Gln Ala Arg Lys Asn Pro Asp Arg Thr 1235 1240 1245 Ala Leu Gln Phe Glu Gly Glu Thr Leu Ser Tyr Gln Gln Leu Asn Glu 1250 1255 1260 Arg Ala Asn Arg Leu Ala Arg His Ile Leu Ser Val Gly Gly Gly Gly 1265 1270 1275 1280 Lys Thr Ala Ala Val Leu Cys Glu Arg Ser Met Asp Met Ile Val Ser 1285 1290 1295 Ile Met Ala Val Leu Lys Ala Gly Ser Ala Tyr Val Pro Ile Asp Pro 1300 1305 1310 Glu His Pro Val Gln Arg Ile Gln His Phe Phe Arg Asp Ser Gly Ala 1315 1320 1325 Lys Val Leu Leu Thr Gln Gln Ser Leu Lys Pro Leu Ala Glu Lys Ala 1330 1335 1340 Gly Phe Gln Gly Ala Ile Val Leu Ala Asp Asp Glu Ala Ser Tyr Glu 1345 1350 1355 1360 Lys Asp Ser Arg Asn Pro Ala Leu Pro Phe Asp Ser Ser Thr Ile Ala 1365 1370 1375 Asn Leu Thr Tyr Thr Ser Gly Thr Thr Gly Thr Pro Lys Gly Asn Ile 1380 1385 1390 Val Thr His Ala Asn Ile Leu Arg Thr Val Lys Asn Thr Asn Tyr Leu 1395 1400 1405 Thr Val Ser Glu Glu Asp Thr Val Leu Gly Leu Ser Asn Tyr Val Phe 1410 1415 1420 Asp Ala Phe Met Phe Asp Met Phe Gly Ser Leu Leu Asn Gly Ala Lys 1425 1430 1435 1440 Leu Val Ile Val Pro Lys Asp Thr Val Leu Asp Met Ser Arg Leu Ser 1445 1450 1455 Arg Val Ile Lys Arg Glu Asn Val Ser Ile Leu Met Ile Thr Thr Ala 1460 1465 1470 Leu Phe His Leu Leu Val Asp Met Glu Pro Ser Cys Leu Thr Thr Leu 1475 1480 1485 Arg Lys Ile Met Phe Gly Gly Glu Arg Ala Ser Val Glu His Val Lys 1490 1495 1500 Lys Ala Leu Ala Ala Val Gly Lys Gly Arg Leu Leu His Met Tyr Gly 1505 1510 1515 1520 Pro Ser Glu Ser Thr Val Phe Ala Thr Tyr His Pro Val Asp Val Ile 1525 1530 1535 Glu Glu Asp Thr Leu Ser Val Pro Ile Gly Lys Pro Val Ser Asn Thr 1540 1545 1550 Glu Val Phe Ile Met Asn Ser Ala Gly Arg Ile Gln Pro Ala Gly Ile 1555 1560 1565 Ala Gly Glu Leu Cys Val Ser Gly Glu Gly Leu Val Glu Gly Tyr Tyr 1570 1575 1580 Asn Arg Pro Glu Leu Thr Glu Glu Lys Phe Val Lys His Pro Phe Lys 1585 1590 1595 1600 Glu Gly Glu Arg Met Tyr Lys Thr Gly Asp Leu Ala Arg Trp Leu Pro 1605 1610 1615 Asn Gly Asp Ile Glu Phe Ile Gly Arg Ile Asp His Gln Val Lys Ile 1620 1625 1630 Arg Gly Gln Arg Ile Glu Leu Gly Glu Ile Glu His Gln Leu Gln Ser 1635 1640 1645 His Asp Gln Ile Gln Glu Cys Ile Val Leu Ala Val Asp Gln Gly Ala 1650 1655 1660 Gly Asp Lys Leu Leu Cys Ala Tyr Phe Val Gly Leu Arg Glu Ile Ser 1665 1670 1675 1680 Ser Arg Glu Leu Arg Glu His Thr Ala Lys Asp Leu Pro Ala Tyr Met 1685 1690 1695 Ile Pro Ser Val Phe Ile Gln Leu Asp Glu Leu Pro Leu Thr Gly Asn 1700 1705 1710 Gly Lys Ile Asp Arg Arg Ala Leu Pro Met Pro Asp Val Thr Ala Ala 1715 1720 1725 Asn Ala Val Ser Tyr Thr Ala Pro Arg Asn Glu Thr Glu Lys Lys Leu 1730 1735 1740 Ala Asp Ile Trp Ala Glu Val Leu Gln Met Glu Arg Val Gly Val His 1745 1750 1755 1760 Asp Gln Phe Phe Glu Ile Gly Gly His Ser Leu Ala Gly Met Lys Leu 1765 1770 1775 Leu Ala Leu Ile Gln Lys Thr Phe Gly Val Gln Leu Thr Leu Lys Asp 1780 1785 1790 Leu Phe Thr Ser Pro Thr Ala Ala Gly Leu Ala Gln Leu Ile Glu Gly 1795 1800 1805 Ala Glu Arg Lys Ala Ala Glu Ser Ile Ala Pro Ala Ala Glu Arg Glu 1810 1815 1820 Thr Tyr Pro Val Ser Ser Pro Gln Lys Arg Met Phe Val Leu Gln Gln 1825 1830 1835 1840 Leu Glu Gly Ala Glu Thr Ser Tyr Asn Met Pro Ser Val Leu Arg Leu 1845 1850 1855 Lys Gly Lys Leu Asp Ala Glu Lys Leu Lys Ser Val Met Lys Gln Leu 1860 1865 1870 Thr Glu Arg His Glu Ala Phe Arg Thr Thr Phe Asp Ile Lys Asp Gly 1875 1880 1885 Glu Thr Val Gln Arg Ile Trp Ala Glu Ala Tyr Ile Asp Met Glu Tyr 1890 1895 1900 Tyr Glu Ala Ser Glu Glu Asp Ala Glu Gln Ile Ile Gln Ser Phe Ile 1905 1910 1915 1920 Arg Pro Phe Arg Leu Asp Gln Leu Pro Leu Val Arg Thr Gly Leu Val 1925 1930 1935 Lys Leu Ala Glu His Asp His Leu Leu Leu Phe Asp Met His His Ile 1940 1945 1950 Ile Ser Asp Gly Ala Ser Val Gly Val Leu Ile Asp Glu Leu Ser Arg 1955 1960 1965 Leu Tyr Gly Gly Glu Thr Leu Glu Pro Leu Arg Ile His Tyr Lys Asp 1970 1975 1980 Tyr Ala Val Trp Gln Gln Lys Phe Ile Gln Ser Glu Gln Tyr Arg Lys 1985 1990 1995 2000 Gln Glu Glu His Trp Leu Arg Glu Leu Asp Gly Glu Leu Pro Val Leu 2005 2010 2015 Thr Leu Pro Ala Asp Tyr Ser Arg Pro Ala Val Gln Thr Phe Glu Gly 2020 2025 2030 Asp Lys Leu Val Phe Ser Leu Thr Glu Glu Gln Thr Ser Ala Leu Arg 2035 2040 2045 Ser Leu Ala Lys Gln Thr Asp Ser Thr Met Tyr Met Val Leu Leu Ala 2050 2055 2060 Ser Tyr Ser Ala Phe Leu Ser Lys Leu Ser Gly Gln His Asp Ile Ile 2065 2070 2075 2080 Val Gly Ser Pro Ala Ala Gly Arg Ser His Ala Asp Leu Ala Asn Val 2085 2090 2095 Ile Gly Val Phe Val Asn Thr Leu Ala Leu Arg Thr Tyr Pro Glu Ala 2100 2105 2110 Asp Lys Thr Phe Thr Asp Tyr Leu Lys Glu Val Lys Gln Thr Ala Leu 2115 2120 2125 His Ala Phe Asp Ala Gln Asp Tyr Pro Leu Glu Asp Leu Leu Gln Lys 2130 2135 2140 Val Glu Val Gln Arg Asp Thr Ser Arg Asn Pro Leu Phe Asp Ala Val 2145 2150 2155 2160 Phe Ser Met Gln Asn Ala Asn Ala Glu Asp Leu Val Met Glu Gly Ile 2165 2170 2175 Glu Leu Lys His His Pro Phe Asp Arg Lys Thr Ala Lys Phe Asp Leu 2180 2185 2190 Thr Leu Thr Ala Glu Asp Thr Asp Glu Gly Leu Thr Phe Val Leu Glu 2195 2200 2205 Tyr Asn Thr Ala Leu Phe Lys Pro Glu Thr Ala Glu Thr Trp Lys His 2210 2215 2220 Tyr Trp Leu Gln Leu Leu Lys Ala Ala Thr Glu Asn Pro Ala Ala Lys 2225 2230 2235 2240 Leu Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Glu Thr Glu Lys Gln Ala Leu Leu 2245 2250 2255 Asp Ala Trp Lys Gly Lys Thr Leu Ser Val Pro Gln Asp Lys Thr Val 2260 2265 2270 His Arg Leu Phe Glu Glu Thr Ala Ala Arg Tyr Ala Asn Arg Pro Ala 2275 2280 2285 Ala Ala Tyr Asn Gly Ala Lys Trp Thr Tyr Gly Glu Leu Asn Ala Arg 2290 2295 2300 Ala Asn Arg Ile Ala Arg Ile Leu Ile Asp Cys Gly Val Thr Ala Asp 2305 2310 2315 2320 Glu Arg Val Gly Ile Leu Thr Lys Pro Ser Leu Glu Met Ala Ala Gly 2325 2330 2335 Val Leu Gly Val Leu Lys Ala Gly Ala Ala Phe Val Pro Ile Asp Pro 2340 2345 2350 Asp Tyr Pro Gln Glu Arg Ile Ser Tyr Ile Leu Gln Asp Ser Gly Ala 2355 2360 2365 Lys Leu Leu Leu Thr Gln Glu Ala Leu Asp Val Pro Asp Gly Tyr Thr 2370 2375 2380 Gly Glu Thr Ile Leu Leu Asp Gly Gly Arg Ser Ile Leu Ser Leu Pro 2385 2390 2395 2400 Leu Asp Glu Asn Asp Glu Ala Asn Pro Gln Thr Glu Thr Thr Ala Asp 2405 2410 2415 His Leu Ala Tyr Met Ile Tyr Thr Ser Gly Thr Thr Gly Gln Pro Lys 2420 2425 2430 Gly Val Met Val Glu His His Ala Leu Val Asn Leu Cys Phe Trp His 2435 2440 2445 His Asp Ala Phe Ala Met Thr Ala Asp Asp Lys Ser Ala Lys Tyr Ala 2450 2455 2460 Gly Phe Gly Phe Asp Ala Ser Ile Trp Glu Met Phe Pro Thr Trp Thr 2465 2470 2475 2480 Ile Gly Ala Glu Leu His Val Ile Asp Glu Ala Ile Arg Leu Asp Ile 2485 2490 2495 Thr Arg Leu Asn His Tyr Phe Glu Glu His Gly Val Thr Ile Thr Phe 2500 2505 2510 Leu Pro Thr Gln Leu Ala Glu Gln Phe Met Glu Leu Glu Asn Thr Ser 2515 2520 2525 Leu Arg Met Leu Leu Val Gly Gly Asp Lys Leu Lys Arg Ala Val Lys 2530 2535 2540 Gln Pro Tyr Thr Ile Val Asn Asn Tyr Gly Pro Thr Glu Asn Thr Val 2545 2550 2555 2560 Val Ala Thr Ser Gly Val Ile Asn Pro Glu Glu Gly Ser Leu Ser Ile 2565 2570 2575 Gly Arg Ala Ile Ala Asn Thr Arg Ala Tyr Ile Leu Gly Asp Gly Asp 2580 2585 2590 Gln Val Gln Pro Glu Gly Ile Ala Gly Glu Leu Cys Val Ala Gly Arg 2595 2600 2605 Gly Leu Ala Arg Gly Tyr Leu Asn Arg Glu Glu Glu Thr Ala Lys Arg 2610 2615 2620 Phe Thr Ala Asp Pro Phe Val Pro Gly Glu Arg Met Tyr Arg Thr Gly 2625 2630 2635 2640 Asp Leu Val Lys Trp Asn Ala Gln Ser Gly Ile Glu Tyr Ile Gly Arg 2645 2650 2655 Ile Asp Gln Gln Val Lys Val Arg Gly Tyr Arg Ile Glu Leu Ser Glu 2660 2665 2670 Ile Glu Val Arg Leu Ala Gln Leu Ala Asp Val His Asp Ala Ala Val 2675 2680 2685 Thr Ala Val Glu Asp Lys Ala Gly Asn Ala Ala Leu Cys Ala Tyr Val 2690 2695 2700 Ala Pro Gln Gln Asp Asp Ile Glu Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys Asp 2705 2710 2715 2720 Thr Leu Pro Asp Tyr Met Val Pro Ala Phe Trp Val Glu Met Asp Glu 2725 2730 2735 Leu Pro Val Thr Ala Asn Gly Lys Ile Asp Lys Lys Ala Leu Pro Glu 2740 2745 2750 Pro Asp Ile Glu Ala Gly Ser Ala Ala Tyr Lys Ala Pro Glu Thr Glu 2755 2760 2765 Met Glu Thr Leu Leu Ser Asp Ile Trp Glu Glu Val Leu Gly Leu Asp 2770 2775 2780 Gln Ile Gly Val Ser Asp Asn Phe Phe Thr Leu Gly Gly Asp Ser Ile 2785 2790 2795 2800 Lys Gly Ile Gln Met Ala Ser Arg Leu Asn Gln His Gly Tyr Lys Leu 2805 2810 2815 Glu Met Lys Asp Leu Phe Gln His Pro Thr Ile Glu Glu Leu Val Ser 2820 2825 2830 Tyr Val Glu Arg Thr Glu Gly Lys Gln Ala Asp Gln Gly Pro Val Glu 2835 2840 2845 Gly Lys Ala Glu Leu Thr Pro Ile Gln Arg Trp Phe Phe Glu Lys Asn 2850 2855 2860 Phe Thr Asp Lys His His Trp Asn Gln Ser Val Met Leu His Ala Lys 2865 2870 2875 2880 Asp Gly Phe Asp Pro Glu Ile Thr Glu Lys Thr Leu His Val Leu Thr 2885 2890 2895 Val His His Asp Ala Leu Arg Met Ile Tyr Arg Glu Gln Lys Pro Tyr 2900 2905 2910 Tyr Arg Gly Leu Glu Asp Ala Ser Val Glu Leu Asn Val Phe Glu Leu 2915 2920 2925 Asn Gly Pro Ala Glu Asp His Glu Asn Arg Ile Glu Arg Glu Ala Asp 2930 2935 2940 Arg Leu Gln Ser Ser Ile Ser Leu Glu Thr Gly His Leu Leu Lys Ala 2945 2950 2955 2960 Gly Leu Phe Arg Ala Glu Asp Gly Asp His Leu Leu Leu Ala Ile His 2965 2970 2975 His Leu Val Val Asp Gly Val Ser Trp Arg Ile Leu Leu Glu Asp Phe 2980 2985 2990 Thr Ser Val Tyr Thr Gln Leu Lys Gln Gly Asn Glu Pro Ala Leu Pro 2995 3000 3005 Pro Lys Thr His Ser Phe Ala Glu Phe Ala Glu Arg Ile Lys Glu Tyr 3010 3015 3020 Ala Asn Thr Lys Ala Phe Leu Lys Glu Ala Asp Tyr Trp Arg Glu Leu 3025 3030 3035 3040 Glu Glu Lys Glu Val Cys Thr Gln Leu Pro Lys Asp Arg Gln Ser Gly 3045 3050 3055 Asp Gln Arg Met Arg His Thr Arg Thr Val Ser Phe Ser Leu Thr Pro 3060 3065 3070 Glu Gln Thr Glu Gln Leu Thr Thr Asn Val His Glu Ala Tyr His Thr 3075 3080 3085 Glu Met Asn Asp Ile Leu Leu Thr Ala Leu Gly Leu Ala Leu Lys Glu 3090 3095 3100 Trp Thr Gly Glu Asp Thr Ile Gly Val His Leu Glu Gly His Gly Arg 3105 3110 3115 3120 Glu Asp Ile Leu Asp Gly Leu Asn Ile Thr Arg Thr Val Gly Trp Phe 3125 3130 3135 Thr Ser Met Tyr Pro Met Ile Leu Glu Met Lys His Ala Asp Asp Leu 3140 3145 3150 Ser Tyr Gln Leu Lys Gln Met Lys Glu Asp Ile Arg His Ile Pro Asn 3155 3160 3165 Lys Gly Val Gly Tyr Gly Ile Leu Arg Tyr Val Thr Ala Pro Glu His 3170 3175 3180 Lys Glu Gly Leu Ser Phe Glu Ile Asp Pro Asp Ile Ser Phe Asn Tyr 3185 3190 3195 3200 Leu Gly Gln Phe Asn Glu Met Ser Asp Ser Gly Leu Phe Thr Arg Ser 3205 3210 3215 Gly Met Pro Ser Gly Gln Ser Leu Ser Pro Asp Thr Glu Lys Pro Asn 3220 3225 3230 Ala Leu Asp Ile Val Gly Phe Ile Glu Asn Gly Gln Met Thr Met Thr 3235 3240 3245 Phe Ala Tyr His Ser Leu Glu Phe His Glu Lys Thr Ile Gln Ser Phe 3250 3255 3260 Ser Asp Ser Phe Lys Gly His Leu Leu Lys Ile Ile Leu Thr Leu Asp 3265 3270 3275 3280 Glu Leu Asp Lys Leu Met Glu Ile Leu 3285 <210> 14 <211> 3586 <212> PRT <213> Bacillus subtilis subsp. krictiensis <400> 14 Met Ser Lys Lys Ser Ile Gln Lys Val Tyr Ala Leu Thr Pro Met Gln 1 5 10 15 Glu Gly Met Leu Tyr His Ala Leu Leu Asp Pro His Ser Ser Ser Tyr 20 25 30 Phe Thr Gln Leu Glu Leu Arg Ile His Gly Ser Phe Gln Leu Glu Leu 35 40 45 Phe Glu Lys Ser Val Asn Glu Leu Ile Arg Thr Tyr Asp Ile Leu Arg 50 55 60 Thr Val Phe Val His Gln Gln Leu Gln Lys Pro Arg Gln Val Val Leu 65 70 75 80 Ala Glu Arg Lys Thr Lys Val His Tyr Glu Asp Ile Ser Gln Leu Asp 85 90 95 Glu Ala Arg Gln Thr Glu Tyr Ile Glu Arg Tyr Lys Arg Asp Val Gln 100 105 110 Gln Gln Gly Phe His Leu Ala Lys Asp Ile Leu Phe Lys Ala Ala Val 115 120 125 Phe Arg Leu Ser Glu Lys Glu Leu Tyr Leu Val Trp Ser Asn His His 130 135 140 Ile Val Met Asp Gly Trp Ser Met Gly Val Leu Met Lys Ser Leu Phe 145 150 155 160 Gln Asn Tyr Glu Ala Leu Arg Ala Gly Arg Pro Ala Gly Gly Ser Gln 165 170 175 Gly Lys Pro Tyr Ser Asp Tyr Ile Lys Trp Leu Gly Gly Arg Asp Tyr 180 185 190 Glu Glu Ala Glu Gln Tyr Trp Ser Ser Arg Leu Ala Asp Phe Glu Gln 195 200 205 Pro Ser Leu Leu Pro Gly Arg Leu Ala Pro Glu Lys Lys Asp Tyr Gln 210 215 220 Asn Glu Glu Tyr Ser Phe Val Trp Asp Glu Glu Leu Val Ala Gln Ile 225 230 235 240 Gln Gln Thr Ala Asn Arg His Gln Val Thr Gly Pro Asn Leu Phe Gln 245 250 255 Ala Val Trp Gly Ala Val Leu Ser Lys Tyr Asn Tyr Thr Asp Asp Val 260 265 270 Val Phe Gly Thr Val Val Ser Gly Arg Pro Ser Glu Ile Asn Gly Ile 275 280 285 Glu Thr Met Ala Gly Leu Phe Ile Asn Thr Ile Pro Val Arg Ile Lys 290 295 300 Ile Asp Lys Asp Ala Ala Phe Ser Asp Val Met Ala Ala Val Gln Lys 305 310 315 320 Asn Ala Val Glu Ala Glu Arg Tyr Asp Tyr Val Pro Leu Tyr Asp Ile 325 330 335 Gln Lys Arg Ser Ala Leu Asp Gly Ser Leu Leu Asn His Leu Val Ala 340 345 350 Phe Glu Asn Tyr Pro Leu Asp Lys Glu Leu Glu Asn Gly Gly Met Glu 355 360 365 Glu Arg Leu Gly Phe Ser Ile Lys Val Glu His Ala Phe Glu Gln Thr 370 375 380 Ser Phe Asp Phe Asn Leu Ile Val Tyr Pro Gly Lys Thr Trp Thr Val 385 390 395 400 Lys Ile Lys Tyr Asn Gly Ala Ala Phe Ala His Asp Ala Ile Glu Arg 405 410 415 Thr Ala His His Leu Thr Cys Met Met Lys Ala Ala Val Gly Thr Pro 420 425 430 Asp Ala Pro Val Arg Glu Leu Gly Leu Val Ser Gly Glu Glu Glu Arg 435 440 445 Gln Ile Val Glu Ile Phe Asn Asp Thr Lys Thr Ala Leu Pro Glu Glu 450 455 460 Glu Ala Val His Arg Leu Phe Glu Ala Gln Ala Asn Arg Thr Pro Ala 465 470 475 480 Ser Ile Ala Ile Lys Glu Ala Gly Arg Glu Trp Thr Tyr Arg Glu Val 485 490 495 Asn Glu Ala Ala Asn Arg Leu Ala Arg His Phe Val Lys Ser Gly Leu 500 505 510 Glu Lys Gly Arg Thr Ala Ala Ile Met Asn Asp Arg Ser Ala Glu Thr 515 520 525 Val Ile Gly Met Leu Ala Val Leu Lys Ala Gly Gly Ala Tyr Val Pro 530 535 540 Ile Asp Pro Ala Phe Pro Glu Asp Arg Leu Arg Phe Met Ala Glu Asp 545 550 555 560 Ser Ser Ile Arg Leu Val Leu Thr Val Gln Asp Tyr Gln Glu Gln Ala 565 570 575 Gly Thr Leu Gln Val Pro Ile Val Met Leu Asp Glu Ser Glu Asp Glu 580 585 590 Thr Leu Ser Gly Thr Asp Leu Asn Leu Pro Ala Gly Gly Asn Asp Leu 595 600 605 Ala Tyr Ile Met Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Gly Lys Pro Lys Gly Val 610 615 620 Met Ile Glu His Arg Asn Ile Ile Arg Leu Val Lys His Ser Asn Tyr 625 630 635 640 Val Pro Val His Glu Glu Asp Arg Met Ala Gln Thr Gly Ala Val Ser 645 650 655 Phe Asp Ala Gly Thr Phe Glu Val Phe Gly Ala Leu Leu Asn Gly Ala 660 665 670 Ala Leu His Pro Val Lys Lys Glu Thr Leu Leu Asp Ala Gly Arg Phe 675 680 685 Ala Gln Phe Leu Lys Glu Gln Arg Ile Thr Thr Met Trp Leu Thr Ser 690 695 700 Pro Leu Phe Asn Gln Leu Ala Gln Lys Asp Ala Gly Met Phe Asn Thr 705 710 715 720 Leu Arg His Leu Ile Ile Gly Gly Asp Ala Leu Val Pro His Ile Val 725 730 735 Ser Lys Val Arg Lys Ala Ser Pro Glu Leu Ser Leu Trp Asn Gly Tyr 740 745 750 Gly Pro Thr Glu Asn Thr Thr Phe Ser Thr Ser Phe Leu Ile Asp Gln 755 760 765 Asp Tyr Asp Gly Ser Ile Pro Ile Gly Lys Pro Ile Gly Asn Ser Thr 770 775 780 Ala Tyr Ile Met Asp Glu Asn Arg Asn Leu Gln Pro Ile Gly Ala Pro 785 790 795 800 Gly Glu Leu Cys Val Gly Gly Ser Gly Val Ala Arg Gly Tyr Val Asn 805 810 815 Leu Pro Glu Leu Thr Glu Lys Gln Phe Val Arg Asp Pro Phe Arg Pro 820 825 830 Asp Glu Met Ile Tyr Arg Thr Gly Asp Leu Ala Lys Trp Leu Pro Asp 835 840 845 Gly Thr Ile Glu Phe Leu Gly Arg Ile Asp Asn Gln Val Lys Val Arg 850 855 860 Gly Phe Arg Ile Glu Leu Gly Glu Ile Glu Ala Lys Ile Ser Gln Ala 865 870 875 880 Glu Asn Val Thr Glu Ser Ala Ala Val Ile Arg Lys Asn Lys Ala Asp 885 890 895 Glu Asn Glu Ile Cys Ala Tyr Phe Thr Ala Asp Gln Ala Leu Ser Pro 900 905 910 Glu Asp Leu Arg Lys Thr Leu Ser Glu Ser Leu Pro Glu Tyr Met Ile 915 920 925 Pro Ala His Phe Ile Gln Met Asn Gln Phe Pro Leu Thr Ala Asn Gly 930 935 940 Lys Ile Asp Lys Lys Ala Leu Pro Glu Pro Gln Ala Glu Ala Val Gln 945 950 955 960 Lys Glu Tyr Glu Ala Pro Lys Thr Glu Ala Glu Gln Lys Leu Ala Asp 965 970 975 Ile Trp Glu Gly Ile Leu Gly Val Lys Ala Gly Val Thr Asp Asn Phe 980 985 990 Phe Thr Ile Gly Gly His Ser Leu Lys Ala Met Met Met Thr Ala Lys 995 1000 1005 Ile Gln Glu His Phe Gln Lys Glu Val Pro Ile Lys Val Leu Phe Glu 1010 1015 1020 Lys Pro Thr Ile Gln Glu Leu Ala His Tyr Leu Glu His Glu Thr Glu 1025 1030 1035 1040 Glu Glu Gln Gln Phe Glu Pro Ile Arg Gln Ala Pro Tyr Gln Lys His 1045 1050 1055 Tyr Pro Val Ser Ser Ala Gln Arg Arg Met Tyr Ile Leu Asn Gln Leu 1060 1065 1070 Gly Gln Ala Ser Thr Ser Tyr Asn Val Pro Ala Val Leu Leu Leu Glu 1075 1080 1085 Gly Ser Val Asp Lys Asn Arg Leu Glu Glu Ala Met Gln Ala Leu Ile 1090 1095 1100 Asn Arg His Glu Thr Leu Arg Thr Ser Phe Asp Met Ala Asp Gly Glu 1105 1110 1115 1120 Val Val Gln Thr Ile His Lys Asn Val Ser Phe Glu Leu Glu Thr Ala 1125 1130 1135 Glu Gly Arg Glu Glu Asp Ala Glu Glu Leu Thr Lys Ala Phe Ile Arg 1140 1145 1150 Pro Phe Ala Leu Asn Arg Ala Pro Leu Val Arg Ser Lys Leu Ile Arg 1155 1160 1165 Leu Glu Glu Asp Arg His Leu Leu Leu Ile Asp Met His His Ile Ile 1170 1175 1180 Thr Asp Gly Ser Ser Met Gly Ile Phe Ile Gly Asp Leu Ala Lys Leu 1185 1190 1195 1200 Tyr Gln Gly Thr Glu Leu Glu Leu Pro Lys Ile His Tyr Lys Asp Phe 1205 1210 1215 Ser Val Trp Gln Arg Glu Lys Ala Asn Leu Asp Gln His Glu Ala Tyr 1220 1225 1230 Trp Leu Asp Thr Phe Lys Gly Asp Leu Pro Val Leu Asp Leu Pro Leu 1235 1240 1245 Asp Phe Pro Arg Pro Ala Glu Arg Ser Phe Glu Gly Glu Arg Val Ile 1250 1255 1260 Phe Gly Leu Asp Lys Gln Val Thr Ala Gln Ile Lys Lys Leu Leu Ala 1265 1270 1275 1280 Asp Thr Asp Thr Thr Met Tyr Met Phe Leu Leu Ala Ala Phe Gln Val 1285 1290 1295 Leu Leu Ser Lys Tyr Ser Gly Gln Glu Asp Ile Ile Val Gly Ser Pro 1300 1305 1310 Ala Ala Gly Arg Gln His Pro Asp Leu Gln Asp Val Pro Gly Met Phe 1315 1320 1325 Val Asn Thr Val Ala Leu Arg Ser His Pro Ala Gly Lys Lys Thr Phe 1330 1335 1340 Lys Gln Phe Leu Asp Glu Val Lys Thr Ala Ser Leu Gln Ala Phe Glu 1345 1350 1355 1360 His Gln Ser Tyr Pro Leu Glu Glu Leu Ile Glu Lys Leu Pro Leu Thr 1365 1370 1375 Arg Asp Thr Ser Arg Ser Pro Leu Phe Ser Val Leu Phe Asn Met Gln 1380 1385 1390 Asn Met Glu Ile Pro Ala Leu Arg Leu Gly Asp Leu Glu Ile Ser Ser 1395 1400 1405 Tyr Ser Met His His His Val Ala Lys Phe Asp Leu Ser Leu Glu Ala 1410 1415 1420 Ala Glu Arg Gly Glu Glu Val Gly Leu Ser Phe Asp Tyr Ala Lys Ala 1425 1430 1435 1440 Leu Phe Ala Asp Glu Thr Ile Arg Arg Trp Ser Ala His Phe Val Asn 1445 1450 1455 Leu Ile Lys Ala Cys Ala Glu Asn Pro Asp Ile Gln Leu Ala Asp Ala 1460 1465 1470 Ser Leu Leu Ser Ala Pro Glu Arg Glu Ala Leu Leu Ser Asp Glu Lys 1475 1480 1485 Arg Thr Glu Ala Asp Leu Pro Glu Gly Thr Phe Val Ser Leu Phe Glu 1490 1495 1500 Arg Gln Ala Gln Lys Thr Pro Asp Leu Thr Ala Val Ala Gly Gly Thr 1505 1510 1515 1520 Ser Leu Thr Tyr Arg Glu Leu Asp Glu Arg Ser Asn Arg Phe Ala Arg 1525 1530 1535 His Leu Gln Ala Cys Gly Thr Gly Ser Glu Asp Ile Val Ala Ile Met 1540 1545 1550 Met Asp Arg Ser Ala Asp Leu Ile Thr Ala Ile Leu Gly Val Met Lys 1555 1560 1565 Ala Gly Ala Ala Phe Leu Pro Ile Asp Pro Glu Thr Pro Glu Glu Arg 1570 1575 1580 Ile Arg Tyr Ser Leu Glu Asp Ser Gly Thr Lys Leu Leu Val Val Asn 1585 1590 1595 1600 Glu Arg Asn Met Thr Ala Ala Ala Val Tyr Lys Glu Lys Thr Val Val 1605 1610 1615 Met Glu Asp Gly Glu Trp Gln Asn Glu Ser Ala Asp Arg Leu Glu Thr 1620 1625 1630 Glu Pro Gly Ala Asp Arg Leu Ala Tyr Ile Ile Tyr Thr Ser Gly Thr 1635 1640 1645 Thr Gly Lys Pro Lys Gly Val Gln Leu Glu His Arg Asn Leu Ile Asn 1650 1655 1660 Tyr Val Thr Trp Phe Ser Arg Glu Ala Gly Leu Thr Glu Ala Asp Lys 1665 1670 1675 1680 Ser Val Leu Leu Ser Ser Tyr Ala Phe Asp Leu Gly Tyr Thr Ala Ile 1685 1690 1695 Phe Pro Ile Leu Gln Ala Gly Gly Glu Leu His Ile Val Pro Lys Glu 1700 1705 1710 Thr Tyr Thr Ala Pro Asp Gln Leu Gly Glu Tyr Ile Gln Lys Asn Gly 1715 1720 1725 Ile Thr Tyr Met Lys Leu Thr Pro Ser Leu Phe His Met Ile Val Asn 1730 1735 1740 Thr Ala Arg Phe Thr Ser Glu Cys Arg Phe Ser Pro Leu Arg Leu Val 1745 1750 1755 1760 Val Leu Gly Gly Glu Lys Ile Ile Thr Ser Asp Val Arg Lys Phe His 1765 1770 1775 Asp Val Tyr Ala His Thr Asp Phe Ile Asn His Tyr Gly Pro Thr Glu 1780 1785 1790 Thr Thr Ile Gly Ala Ile Ala Glu Arg Ile Asn Met Glu Cys Leu Asp 1795 1800 1805 Gln Tyr Glu Gln Arg Pro Val Ile Gly Arg Pro Ile Ala Asn Thr Gly 1810 1815 1820 Ala Leu Val Leu Asp Gly Ala Met Gln Leu Val Pro Pro Gly Ala Ser 1825 1830 1835 1840 Gly Glu Leu Tyr Ile Thr Gly Lys Gly Leu Ala Arg Gly Tyr Leu His 1845 1850 1855 Arg Pro Gln Leu Thr Ala Glu Lys Phe Leu Ser Asn Pro Phe Ser Pro 1860 1865 1870 Asp Ser Leu Met Tyr Lys Thr Gly Asp Ile Val Arg Arg Leu Pro Asp 1875 1880 1885 Gly Thr Ile Glu Phe Ile Gly Arg Ala Asp Asp Gln Val Lys Ile Arg 1890 1895 1900 Gly Tyr Arg Ile Glu Leu Lys Glu Val Glu Thr Val Leu Leu Ser Val 1905 1910 1915 1920 Asn Gly Ile Gln Glu Ala Val Val Leu Ala Val Ser Glu Gly Gly Leu 1925 1930 1935 Pro Glu Leu Cys Ala Tyr Tyr Lys Ala Asp Ser Gly Leu Lys Gly Ser 1940 1945 1950 Glu Leu Arg Lys Arg Leu Ser Glu Thr Leu Pro Ser His Met Leu Pro 1955 1960 1965 Ala Tyr Phe Val Gln Val Asp Arg Ile Pro Leu Thr Ala Asn Gly Lys 1970 1975 1980 Thr Asp Lys Asn Ala Leu Pro Lys Pro Gly Val Ser Gln Thr Ala Gln 1985 1990 1995 2000 Ile Ala Ser Ala Leu Pro Glu Thr Glu Leu Glu Glu Lys Leu Cys Arg 2005 2010 2015 Ile Trp Lys Gln Thr Leu Gly Thr Asp Thr Leu Gly Ile Asp Asp Asn 2020 2025 2030 Phe Phe Asp Tyr Gly Gly His Ser Leu Lys Gly Met Met Leu Leu Ala 2035 2040 2045 Asn Ile Gln Ala Glu Leu Asp Lys Thr Val Pro Leu Lys Ala Leu Phe 2050 2055 2060 Glu Gln Pro Thr Val Arg Leu Leu Ala Ala Tyr Ile Glu Lys Ser Ala 2065 2070 2075 2080 Val Ser Glu Gly Tyr Arg Met Ile Thr Pro Ala Asp Ser Ala Asp Ala 2085 2090 2095 Tyr Pro Leu Ser Ser Ala Gln Lys Arg Met Tyr Val Leu Asn Gln Leu 2100 2105 2110 Asp Arg Glu Thr Ile Ser Tyr Asn Met Pro Ser Val Leu Leu Met Glu 2115 2120 2125 Gly Glu Val Asn Ile Ser Lys Leu Gln Glu Ala Leu Asn Gln Met Ile 2130 2135 2140 Asn Arg His Glu Ser Leu Arg Thr Ser Phe Ile Asp Lys Lys Gly Gln 2145 2150 2155 2160 Pro Met Gln Gln Ile Ala Glu Gln Ala Asp Ile Asp Leu His Ile Phe 2165 2170 2175 Glu Ala Ala Asp Glu Glu Lys Ala Asp Leu Ile Ile Gln Ala Phe Ile 2180 2185 2190 Lys Pro Phe Asp Leu Ser Ala Ala Pro Leu Ile Arg Ala Ala Leu Val 2195 2200 2205 Arg Leu Asn Glu Lys Lys His Leu Leu Leu Leu Asp Met His His Ile 2210 2215 2220 Ile Ala Asp Gly Val Ser Arg Ser Met Leu Val Lys Glu Leu Ala His 2225 2230 2235 2240 Leu Tyr Lys Gly Gly Ser Leu Pro Ser Pro Asn Leu His Tyr Lys Asp 2245 2250 2255 Phe Ala Val Trp Gln Asn Glu Pro Glu Gln Ala Glu Arg Met Lys Asp 2260 2265 2270 His Glu Arg Tyr Trp Leu Ser Ala Phe Ser Gly Glu Leu Pro Glu Leu 2275 2280 2285 Asn Leu Pro Thr Asp Phe Pro Arg Pro Pro Val Gln Ser Phe Lys Gly 2290 2295 2300 Gln Ser Val Arg Phe Arg Ala Gly Arg Glu Thr Glu Lys Ala Val Arg 2305 2310 2315 2320 Glu Leu Met Glu Ser Ser Gly Ala Thr Leu His Met Val Leu His Ala 2325 2330 2335 Ala Phe His Val Phe Leu Ser Lys Ile Thr Gly Gln Arg Asp Ile Ile 2340 2345 2350 Ile Gly Ser Val Thr Ala Gly Arg Thr Ser Ala Glu Val Gln Glu Met 2355 2360 2365 Pro Gly Met Phe Val Asn Thr Leu Ala Leu Arg Asn Glu Thr Gln Lys 2370 2375 2380 Glu Gln Thr Phe Ala Gly Leu Leu Glu Arg Val Lys Gln Thr Asn Leu 2385 2390 2395 2400 Asp Ala Leu Ala His Gln Asp Tyr Pro Phe Glu Asp Leu Ile Gly Lys 2405 2410 2415 Leu Asp Leu Pro Arg Asp Met Ser Arg Asn Pro Leu Phe Gln Val Met 2420 2425 2430 Val Thr Thr Glu Asp Pro Asp Lys Glu Thr Leu Glu Leu Glu Asn Leu 2435 2440 2445 Arg Ile Thr Pro Tyr Glu Ser Asn Gln Gly Thr Ala Lys Phe Asp Leu 2450 2455 2460 Thr Leu Gly Gly Phe Thr Asp Gln Glu Gly Leu Gly Leu Gln Phe Glu 2465 2470 2475 2480 Tyr Ala Thr Asp Leu Phe Lys Lys Glu Thr Ile Glu Lys Trp Ser Ala 2485 2490 2495 Gly Phe Leu Arg Ile Leu Lys Gln Ala Ala Glu Ser Pro Asp Arg Lys 2500 2505 2510 Leu Pro Glu Ile Ser Leu Ile Ser Asp Ala Glu Lys Gln Ala Leu Leu 2515 2520 2525 Asp Ala Trp Lys Gly Lys Thr Leu Ser Val Pro Gln Asp Lys Thr Val 2530 2535 2540 His Arg Leu Phe Glu Glu Thr Ala Ala Arg Tyr Ala Asn Arg Pro Ala 2545 2550 2555 2560 Ala Ala Tyr Asn Gly Ala Lys Trp Thr Tyr Gly Glu Leu Asn Ala Arg 2565 2570 2575 Ala Asn Arg Ile Ala Arg Ile Leu Ile Asp Cys Gly Val Thr Ala Asp 2580 2585 2590 Glu Arg Val Gly Ile Leu Thr Lys Pro Ser Leu Glu Met Ala Ala Gly 2595 2600 2605 Val Leu Gly Val Leu Lys Ala Gly Ala Ala Phe Val Pro Ile Asp Pro 2610 2615 2620 Asp Tyr Pro Gln Glu Arg Ile Ser Tyr Ile Leu Gln Asp Ser Gly Ala 2625 2630 2635 2640 Lys Leu Leu Leu Thr Gln Glu Ala Leu Asp Val Pro Glu Ser Tyr Lys 2645 2650 2655 Gly Glu Thr Ile Leu Leu Asp Gly Gly Arg Ser Ile Leu Ser Leu Pro 2660 2665 2670 Leu Asp Glu Asn Asp Glu Ala Asn Pro Gln Thr Glu Thr Thr Ala Asp 2675 2680 2685 His Leu Ala Tyr Met Ile Tyr Thr Ser Gly Thr Thr Gly Gln Pro Lys 2690 2695 2700 Gly Val Met Val Glu His His Ala Leu Val Asn Leu Cys Phe Trp His 2705 2710 2715 2720 His Asp Ala Phe Ala Met Thr Ala Asp Asp Lys Ser Ala Lys Tyr Ala 2725 2730 2735 Gly Phe Gly Phe Asp Ala Ser Ile Trp Glu Met Phe Pro Thr Trp Thr 2740 2745 2750 Ile Gly Ala Glu Leu His Val Ile Asp Glu Ala Ile Arg Leu Asp Ile 2755 2760 2765 Thr Arg Leu Asn His Tyr Phe Glu Glu His Gly Val Thr Ile Thr Phe 2770 2775 2780 Leu Pro Thr Gln Leu Ala Glu Gln Phe Met Glu Leu Glu Asn Thr Ser 2785 2790 2795 2800 Leu Arg Met Leu Leu Val Gly Gly Asp Lys Leu Lys Arg Ala Val Lys 2805 2810 2815 Gln Pro Tyr Thr Ile Val Asn Asn Tyr Gly Pro Thr Glu Asn Thr Val 2820 2825 2830 Val Ala Thr Ser Gly Val Ile Asn Pro Glu Glu Gly Ser Leu Ser Ile 2835 2840 2845 Gly Arg Ala Ile Ala Asn Thr Arg Ala Tyr Ile Leu Gly Asp Gly Asp 2850 2855 2860 Gln Val Gln Pro Glu Gly Ile Ala Gly Glu Leu Cys Val Ala Gly Arg 2865 2870 2875 2880 Gly Leu Ala Arg Gly Tyr Leu Asn Arg Glu Glu Glu Thr Ala Lys Arg 2885 2890 2895 Phe Thr Ala Asp Pro Phe Val Pro Gly Glu Arg Met Tyr Arg Thr Gly 2900 2905 2910 Asp Leu Val Lys Trp Asn Ala Gln Ser Gly Ile Glu Tyr Ile Gly Arg 2915 2920 2925 Ile Asp Gln Gln Val Lys Val Arg Gly Tyr Arg Ile Glu Leu Ser Glu 2930 2935 2940 Ile Glu Val Arg Leu Ala Gln Leu Ala Asp Val His Asp Ala Ala Val 2945 2950 2955 2960 Thr Ala Val Glu Asp Lys Ala Gly Asn Ala Ala Leu Cys Ala Tyr Val 2965 2970 2975 Ala Pro Arg Gln Asp Asp Ile Glu Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys Asp 2980 2985 2990 Thr Leu Pro Asp Tyr Met Val Pro Ala Phe Trp Val Glu Met Asp Glu 2995 3000 3005 Leu Pro Val Thr Ala Asn Gly Lys Ile Asp Lys Lys Ala Leu Pro Glu 3010 3015 3020 Pro Asp Ile Glu Ala Gly Ser Ala Ala Tyr Lys Ala Pro Glu Thr Glu 3025 3030 3035 3040 Met Glu Thr Leu Leu Ser Asp Ile Trp Gln Glu Val Leu Gly Leu Asp 3045 3050 3055 Gln Ile Gly Val Ser Asp Asn Phe Phe Thr Leu Gly Gly Asp Ser Ile 3060 3065 3070 Lys Gly Ile Gln Met Ala Ser Arg Leu Asn Gln His Gly Tyr Lys Leu 3075 3080 3085 Glu Met Lys Asp Leu Phe Gln His Pro Thr Ile Glu Glu Leu Val Ser 3090 3095 3100 Tyr Val Glu Arg Thr Glu Gly Lys Gln Ala Asp Gln Gly Pro Val Glu 3105 3110 3115 3120 Gly Glu Ala Glu Leu Thr Pro Ile Gln Arg Trp Phe Phe Glu Lys Asn 3125 3130 3135 Phe Thr Asp Lys His His Trp Asn Gln Ser Val Met Leu His Ala Lys 3140 3145 3150 Asp Gly Phe Asp Pro Asp Leu Val Glu Lys Thr Leu Gln Ala Leu Ile 3155 3160 3165 Glu His His Asp Ala Leu Arg Met Val Tyr Arg Glu Glu Arg Glu Gly 3170 3175 3180 Ile Ile Gln Thr Tyr Leu Pro Val Thr Glu Cys Lys Ala Ser Phe Glu 3185 3190 3195 3200 Ile Val Asp Leu Tyr Gly Thr Asp Glu Asp Met Leu Lys Ser Gln Ile 3205 3210 3215 Gln Arg Leu Ala Asp His Leu Gln Gly Ser Leu Asp Leu Glu Asn Gly 3220 3225 3230 Pro Leu Leu Lys Ala Glu Gln Tyr Arg Thr Glu Gln Gly Asp His Leu 3235 3240 3245 Leu Ile Ala Val His His Leu Val Val Asp Gly Val Ser Trp Arg Ile 3250 3255 3260 Leu Leu Glu Asp Phe Ala Ser Gly Tyr Lys Gln Ala Gln Gln Gln Asn 3265 3270 3275 3280 Ser Ile Val Leu Pro Gln Lys Thr His Ser Phe Lys Asp Trp Ala Glu 3285 3290 3295 Ala Leu Asn Thr Phe Ala Gln Ser Glu Glu Leu Lys Lys Gln Ala Asp 3300 3305 3310 Tyr Trp Ala Gln Ala Asp Ala Glu Glu Leu Arg Pro Leu Pro Lys Asp 3315 3320 3325 His Asp Pro Asp Lys Arg Leu Val Lys His Thr Ala Ala Val Lys Cys 3330 3335 3340 Glu Leu Thr Glu Glu Glu Thr Ala Gln Leu Leu Thr Asp Val His His 3345 3350 3355 3360 Pro Tyr Gly Thr Glu Ile Asn Asp Ile Leu Leu Ser Ala Leu Gly Leu 3365 3370 3375 Thr Ile Gly Glu Trp Thr Glu Asn Gly Lys Val Gly Ile Asn Leu Glu 3380 3385 3390 Gly His Gly Arg Glu Glu Ile Ile Pro Asn Val Asn Ile Ser Arg Thr 3395 3400 3405 Val Gly Trp Phe Thr Ala Gln Tyr Pro Leu Ile Leu Gln Ile Ser Lys 3410 3415 3420 Glu Asp Gly Val Ser Ser Val Ile Lys Thr Val Lys Glu Thr Val Arg 3425 3430 3435 3440 Arg Val Pro Asp Lys Gly Val Gly Tyr Gly Ile Leu Arg Tyr Leu Ser 3445 3450 3455 Ser Asp Glu Thr Glu Lys Gly Ala Ala Pro Glu Ile Ser Phe Asn Tyr 3460 3465 3470 Leu Gly Gln Phe Asp Asn Glu Val Lys Thr Glu Trp Phe Glu Pro Ser 3475 3480 3485 Pro Tyr Asp Met Gly Arg Gln Val Ser Glu Glu Ser Glu Ala Leu Tyr 3490 3495 3500 Ala Leu Ser Phe Ser Gly Met Val Thr Gly Gly Arg Phe Val Ile Ser 3505 3510 3515 3520 Cys Ser Tyr Asn Gln Glu Glu Tyr Glu Arg Ser Thr Val Glu Thr Gln 3525 3530 3535 Met Gln Arg Phe Lys Asp Asn Leu Leu Met Ile Ile Arg His Cys Thr 3540 3545 3550 Ala Lys Glu Glu Lys Glu Phe Thr Pro Ser Asp Phe Ser Ala Gln Asp 3555 3560 3565 Leu Glu Met Asp Glu Met Gly Asp Ile Phe Asp Met Leu Glu Glu Asn 3570 3575 3580 Leu Thr 3585 <210> 15 <211> 1277 <212> PRT <213> Bacillus subtilis subsp. krictiensis <400> 15 Met Ser Gln Phe Lys Lys Asp Gln Val Gln Asp Met Tyr Tyr Leu Ser 1 5 10 15 Pro Met Gln Glu Gly Met Leu Phe His Thr Leu Leu Asn Pro Gly Gln 20 25 30 Ser Phe Tyr Ile Glu Gln Met Thr Met Arg Val Lys Gly Ser Leu Asn 35 40 45 Ile Lys Cys Leu Glu Glu Ser Met Asn Val Ile Met Asp Arg Tyr Asp 50 55 60 Val Phe Arg Thr Val Phe Ile His Glu Lys Val Lys Arg Pro Val Gln 65 70 75 80 Val Val Leu Lys Lys Arg Gln Phe Gln Ile Glu Glu Ile Asp Leu Thr 85 90 95 His Leu Thr Gly Ser Glu Gln Ala Ser Lys Ile Asn Glu Tyr Lys Glu 100 105 110 Gln Asp Lys Ile Lys Gly Phe Asp Leu Thr Arg Asp Ile Pro Met Arg 115 120 125 Ala Ala Ile Phe Lys Lys Ser Glu Glu Ser Phe Glu Trp Val Trp Ser 130 135 140 Tyr His His Ile Ile Leu Asp Gly Trp Cys Phe Gly Ile Val Val Gln 145 150 155 160 Asp Leu Phe Lys Val Tyr Asn Ala Leu Arg Glu Gln Lys Pro Tyr Ser 165 170 175 Leu Pro Pro Val Lys Pro Tyr Lys Asp Tyr Ile Lys Trp Leu Glu Lys 180 185 190 Gln Asp Lys Gln Ala Ser Leu His Tyr Trp Arg Gly Tyr Leu Glu Asp 195 200 205 Phe Glu Gly Gln Thr Thr Phe Ala Glu Gln Arg Lys Lys Gln Glu Asn 210 215 220 Gly Tyr Glu Pro Lys Glu Leu Leu Phe Ser Leu Pro Glu Ala Glu Thr 225 230 235 240 Lys Ala Phe Thr Glu Leu Ala Lys Ser Gln His Thr Thr Leu Ser Thr 245 250 255 Ala Leu Gln Ala Val Trp Ser Val Leu Ile Ser Arg Tyr Gln Gln Ser 260 265 270 Gly Asp Leu Ile Phe Gly Thr Val Val Ser Gly Arg Pro Ala Glu Ile 275 280 285 Lys Gly Val Glu His Met Val Gly Leu Phe Ile Asn Ala Val Pro Arg 290 295 300 Arg Val Lys Leu Ser Glu Asp Thr Thr Phe Asn Gly Leu Leu Lys Gln 305 310 315 320 Leu Gln Glu Gln Ser Leu Glu Ser Glu Pro His Gln Tyr Val Pro Leu 325 330 335 Tyr Asp Ile Gln Ser Gln Ala Asp Gln Pro Lys Leu Ile Asp His Ile 340 345 350 Ile Val Phe Glu Asn Tyr Pro Leu Gln Asp Ala Lys Asn Glu Glu Asn 355 360 365 Ser Glu Asn Gly Phe Asp Met Glu Asp Val His Val Phe Glu Lys Ser 370 375 380 Asn Tyr Asp Leu Asn Leu Met Ala Ser Pro Gly Asp Glu Met Leu Ile 385 390 395 400 Lys Leu Ala Tyr Asn Gly Asn Val Phe Asp Glu Ala Phe Ile Leu Arg 405 410 415 Leu Lys Ser Gln Leu Leu Thr Ala Ile Gln Gln Leu Ile Gln Lys Pro 420 425 430 Asp Gln Pro Val Asn Thr Ile Arg Leu Val Asp Glu Lys Glu Arg Glu 435 440 445 Leu Leu Leu Thr Gly Leu Asn Pro Pro Ala Glu Thr His Gln Ala Lys 450 455 460 Pro Leu Thr Asp Trp Phe Lys Glu Ala Val Asn Val Asn Pro Asp Ala 465 470 475 480 Pro Ala Leu Thr Tyr Ser Gly Gln Thr Leu Ser Tyr Arg Glu Leu Asp 485 490 495 Glu Glu Ala Asn Arg Leu Ala Arg Arg Leu Gln Lys Gln Gly Ala Gly 500 505 510 Lys Asp Thr Val Val Ala Leu Tyr Thr Lys Arg Ser Leu Glu Leu Val 515 520 525 Ile Gly Ile Leu Gly Val Leu Lys Ala Gly Ala Ala Tyr Leu Pro Val 530 535 540 Asp Pro Lys Leu Pro Glu Asp Arg Ile Ser Tyr Met Leu Thr Asp Ser 545 550 555 560 Ala Ala Ala Cys Leu Leu Thr His Gln Glu Met Lys Glu Lys Ala Ala 565 570 575 Gln Leu Pro Tyr Thr Gly Thr Thr Leu Ile Ile Asp Asp Gln Ala Arg 580 585 590 Phe Glu Glu Gln Ala Ser Asp Pro Ala Ala Ala Ile Asp Pro Asp Asp 595 600 605 Pro Ala Tyr Ile Met Tyr Thr Ser Gly Thr Thr Gly Lys Pro Lys Gly 610 615 620 Asn Ile Thr Thr His Ala Asn Ile Gln Gly Leu Val Lys His Val Asp 625 630 635 640 Tyr Met Ala Phe Ser Glu Gln Asp Thr Phe Leu Ser Val Ser Asn Tyr 645 650 655 Ala Phe Asp Ala Phe Thr Phe Asp Phe Tyr Ala Ser Ile Leu Asn Ala 660 665 670 Ala Arg Leu Ile Ile Ala Asp Glu His Thr Leu Leu Asp Thr Glu Arg 675 680 685 Leu Thr Asp Leu Ile Arg Gln Glu Asn Val Asn Val Met Phe Ala Thr 690 695 700 Thr Ala Leu Phe Asn Leu Leu Thr Asp Ala Gly Glu Glu Trp Leu Lys 705 710 715 720 Gly Leu Arg Cys Val Leu Phe Gly Gly Glu Arg Ala Ser Val Pro His 725 730 735 Val Arg Lys Ala Leu Glu Ile Met Gly Pro Gly Lys Leu Ile Asn Cys 740 745 750 Tyr Gly Pro Thr Glu Gly Thr Val Phe Ala Thr Ala His Val Val His 755 760 765 Asp Ile Pro Asp Ser Ile Ser Ser Leu Pro Ile Gly Lys Pro Ile Ser 770 775 780 Asn Ala Ser Ile Tyr Ile Leu Asn Gly Gln Asn Gln Leu Gln Pro Phe 785 790 795 800 Gly Ala Val Gly Glu Leu Cys Ile Ser Gly Met Gly Val Ser Lys Gly 805 810 815 Tyr Leu Asn Arg His Asp Leu Thr Lys Gln Thr Phe Ile Pro Asn Pro 820 825 830 Phe Lys Pro Gly Glu Thr Leu Tyr Arg Thr Gly Asp Leu Ala Arg Trp 835 840 845 Leu Pro Asp Glu Arg Leu Asn Thr Pro Gly Val Leu Thr Thr Arg Ser 850 855 860 Asn Thr Arg His Arg Ile Glu Leu Glu Glu Ile Glu Lys Gln Leu Gln 865 870 875 880 Glu Tyr Pro Gly Val Lys Asp Ala Val Val Val Ala Asp Arg His Glu 885 890 895 Ser Gly Asp Ala Ser Ile Asn Ala Tyr Leu Val Asn Arg Thr Pro Leu 900 905 910 Ser Ala Glu Asp Val Lys Arg His Leu Lys Lys Gln Leu Pro Ala Tyr 915 920 925 Met Val Pro Gln Thr Phe Thr Phe Leu Glu Glu Leu Pro Leu Thr Thr 930 935 940 Asn Gly Lys Val Asn Lys Arg Gln Leu Pro Lys Pro Asp Gln Ala Gln 945 950 955 960 Ala Ala Lys Glu Trp Ile Gly Pro Arg Asn Ala Thr Glu Glu Thr Ile 965 970 975 Ala His Ile Trp Ser Glu Ile Leu Gly Arg Gln Gln Ile Gly Ile His 980 985 990 Asp Asp Phe Phe Ala Leu Gly Gly His Ser Leu Lys Ala Met Thr Ala 995 1000 1005 Ala Ser Arg Ile Lys Lys Glu Leu Gly Thr Asp Ile Pro Val Gln Leu 1010 1015 1020 Leu Phe Glu Ala Thr Thr Ile Ala Asp Ile Ala Gly Tyr Leu Leu His 1025 1030 1035 1040 Gly Glu Glu Lys Gly Met Lys Asp Leu Thr Ile Met Asn Lys Asn Gln 1045 1050 1055 Ser Asp Thr Leu Phe Ala Phe Pro Pro Val Leu Gly Tyr Gly Leu Met 1060 1065 1070 Tyr Gln Pro Leu Ala Lys Gln Leu Ser Gly Tyr Arg Ile Cys Ala Phe 1075 1080 1085 Asp Phe Ile Glu Glu Asp Asn Arg Ile Glu Arg Tyr Thr Glu Leu Ile 1090 1095 1100 Asn Gln Leu Gln Pro Glu Gly Pro Val Lys Leu Phe Gly Tyr Ser Ala 1105 1110 1115 1120 Gly Cys Thr Leu Ala Phe Glu Thr Ala Lys Arg Leu Glu Ala Glu Gly 1125 1130 1135 Arg Lys Val Glu Arg Leu Ile Met Val Asp Ser Tyr Lys Lys Gln Gly 1140 1145 1150 Val Ser Asp Leu Glu Gly Arg Thr Val Glu Ser Asp Val Gln Ala Leu 1155 1160 1165 Met Lys Val Asn Arg Asp Asn Glu Ala Leu Asn Asp Glu Ala Val Lys 1170 1175 1180 Glu Gly Leu Ala Lys Lys Thr Asn Ala Phe Tyr Ser Tyr Phe Val His 1185 1190 1195 1200 Thr Val Ser Thr Gly Thr Val Asn Ala Asp Ile Asp Leu Leu Thr Ser 1205 1210 1215 Glu Pro Asp Phe Ala Met Pro Pro Trp Leu Ala Ser Trp Glu Glu Ala 1220 1225 1230 Thr Thr Gly Glu Tyr Arg Val Lys Lys Gly Cys Gly Ser His Ala Glu 1235 1240 1245 Met Leu Gln Gly Glu Cys Leu Glu Arg Asn Ala Ala Tyr Leu Leu Glu 1250 1255 1260 Phe Leu Arg Lys Glu His Pro Lys Leu Thr Ala Ser Arg 1265 1270 1275 <210> 16 <211> 243 <212> PRT <213> Bacillus subtilis subsp. krictiensis <400> 16 Met Val Gln Leu Phe Lys Ser Phe Asp Thr Thr Glu Lys Thr Gln Leu 1 5 10 15 Ile Cys Phe Pro Phe Ala Gly Gly Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Pro Leu 20 25 30 His Thr Tyr Leu Gln Gly Glu Cys Glu Met Leu Ala Ala Glu Pro Pro 35 40 45 Gly His Gly Thr Asn Gln Met Ser Ala Val Glu Asp Phe Glu Gln Leu 50 55 60 Val Ser Leu Tyr Lys Gln Glu Leu Asn Leu His Pro Asp Arg Pro Phe 65 70 75 80 Val Leu Phe Gly His Ser Met Gly Gly Met Val Ala Phe Arg Leu Ala 85 90 95 Gln Lys Leu Glu Arg Glu Gly Ile Tyr Pro Gln Ala Val Ile Ile Ser 100 105 110 Ala Ile Gln Pro Pro His Val Glu Arg Lys Lys Val Ser His Leu Asp 115 120 125 Asp Glu Lys Phe Leu Ala His Ile Ile Glu Leu Gly Gly Met Pro Gln 130 135 140 Glu Leu Val Glu Asn Lys Glu Val Met Ser Phe Phe Leu Pro Ser Phe 145 150 155 160 Arg Ser Asp Tyr Arg Ala Leu Glu Ser Phe Arg Pro Ser Asp Ser His 165 170 175 Met Ile Gln Ser Pro Val His Ile Phe Asn Gly Arg Lys Asp Lys Lys 180 185 190 Cys Ile Lys Asp Ala Asp Gly Trp Lys Lys Trp Ala Asp Asn Pro Val 195 200 205 Phe His Glu Phe Ser Asp Gly His Met Phe Ile Leu Ser Glu Thr Glu 210 215 220 Lys Val Ala Glu Arg Ile Tyr Glu Ile Ile Asn Arg Ser Thr Ala Gly 225 230 235 240 Gln Leu Leu <210> 17 <211> 436 <212> PRT <213> Bacillus subtilis subsp. krictiensis <400> 17 Met Asn Asp Ala Ala Lys Glu Leu Asn Arg Thr Leu Ser Glu Glu Asn 1 5 10 15 Pro His Val Leu His Met Leu Ser Asp Leu Gly Arg Glu Leu Phe Tyr 20 25 30 Pro Lys Gly Val Leu Thr Gln Ser Ala Glu Ala Lys Ala Lys Ala Gly 35 40 45 Lys Tyr Asn Ala Thr Ile Gly Ile Ala Thr Ser Gln Gly Glu Ser Met 50 55 60 His Phe Ser His Ile Gln Glu Thr Leu Ser Ala Tyr Asn Pro Asp Asp 65 70 75 80 Ile Tyr Asp Tyr Ala Pro Pro Gln Gly Lys Glu Pro Leu Arg Gln Glu 85 90 95 Trp Leu Lys Lys Met Arg Leu Glu Asn Pro Ser Leu Ala Gly Lys Asp 100 105 110 Ile Ser Thr Pro Ile Val Thr Asn Ala Leu Thr His Gly Leu Ser Ile 115 120 125 Ala Ala Asp Leu Phe Val Asn Glu Gly Asp Ala Leu Leu Leu Pro Asp 130 135 140 Lys Tyr Trp Gly Asn Tyr Asn Phe Ile Phe Gly Val Arg Arg Lys Ala 145 150 155 160 Ser Ile Glu Thr Tyr Pro Leu Phe Gln Gln Asp Gly Arg Phe Asn Ala 165 170 175 Ala Gly Leu Ser Glu Leu Leu Lys Lys Gln Glu Glu Lys Ala Ile Val 180 185 190 Val Leu Asn Phe Pro Asn Asn Pro Thr Gly Tyr Thr Pro Gly Glu Glu 195 200 205 Glu Ala Ser Glu Ile Val Ser Val Ile Leu Glu Ala Ala Glu Ala Gly 210 215 220 Lys Glu Ile Val Val Leu Val Asp Asp Ala Tyr Tyr Asn Leu Phe Tyr 225 230 235 240 Asp Glu Thr Ala Ile Gln Glu Ser Ile Phe Ser Lys Leu Ala Gln Val 245 250 255 His Asp Arg Val Leu Cys Val Lys Ile Asp Gly Ala Thr Lys Glu Asn 260 265 270 Tyr Ala Trp Gly Phe Arg Val Gly Phe Ile Thr Tyr Ser Thr Lys Ser 275 280 285 Glu Lys Ala Leu Arg Val Leu Glu Glu Lys Thr Lys Gly Ile Ile Arg 290 295 300 Gly Thr Ile Ser Ser Ala Pro His Pro Ser Gln Thr Phe Met Leu Arg 305 310 315 320 Ala Met Gln Ser Pro Glu Tyr Glu Lys Glu Lys Ser Leu Lys Tyr Asn 325 330 335 Ile Met Lys Lys Arg Ala Asp Lys Val Lys Ala Val Leu Ala Glu Asn 340 345 350 Lys His Tyr Glu Asp Val Trp Thr Pro Tyr Pro Phe Asn Ser Gly Tyr 355 360 365 Phe Met Cys Val Arg Leu Arg Asp Ile Asn Ala Gly Glu Leu Arg Val 370 375 380 Ser Leu Leu Glu Lys Arg Gly Ile Gly Thr Ile Ser Ile Asn Glu Thr 385 390 395 400 Asp Leu Arg Ile Ala Phe Ser Cys Val Glu Glu Glu Tyr Ile Ala Asp 405 410 415 Leu Phe Glu Glu Ile Tyr Gln Glu Ala Lys Gln Leu Gln Lys Gln Ala 420 425 430 Glu Ile Ser Gly 435 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SrfA1 primer <400> 18 cgggaaagcg ctggggaata accgc 25 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SrfA2 primer <400> 19 ccttcaaagc tttgaacagg tggtc 25 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SrfA3 primer <400> 20 ctcgcttggc ggagattcca tcaaag 26 <210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SrfA4 primer <400> 21 gttctgtctc ttcagcagtc agcgag 26 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SrfA5 primer <400> 22 gcgattgatt atgcgcttgt tgag 24 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SrfA6 primer <400> 23 tcggcacata cgctgattga actgc 25 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SrfA7 primer <400> 24 gggtaaagga tcgcctcaat cgtt 24 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SrfA8 primer <400> 25 cgaaataggc tatctcgcac tcag 24 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SrfA9 primer <400> 26 ttcagaatag ggcttatcaa gca 23 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SrfA10 primer <400> 27 gctgtgttgc cgcctttatc tttga 25 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SrfB1 primer <400> 28 atgtctcaga tgcatggagc 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SrfB2 primer <400> 29 ctggcaacta ataggctgac 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SrfB3 primer <400> 30 attgaagctt gtgccgcctg 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SrfB4 primer <400> 31 tcctttaaag ctttgcacag 20 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SrfB5 primer <400> 32 gaaacagcag cgattatgaa cgac 24 <210> 33 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SrfB6 primer <400> 33 agacatcgag ccagtattcc tcatc 25 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SrfB7 primer <400> 34 atttcgagcg gccagctgaa cg 22 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SrfB8 primer <400> 35 tttcatccgg cgccgtatag gttt 24 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SrfB9 primer <400> 36 gcaaaatttc cggacagcgg gatat 25 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SrfB10 primer <400> 37 tcgatccggc cgatgtattc aat 23

Claims

서열번호 6으로 기재되는 염기서열을 갖는 이튜린 생합성 유전자 또는 상기 유전자에 대해 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 이튜린 생합성 유전자.
서열번호 6과 서열번호 5로 기재되는 염기서열을 갖는 이튜린 생합성 유전자.
서열번호 6과 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 이튜린 생합성 유전자.
서열번호 6과 서열번호 7로 기재되는 염기서열을 갖는 이튜린 생합성 유전자.
서열번호 6과 서열번호 8로 기재되는 염기서열을 갖는 이튜린 생합성 유전자.
서열번호 6, 서열번호 3 및 서열번호 7로 기재되는 염기서열을 갖는 이튜린 생합성 유전자.
서열번호 6, 서열번호 3 및 서열번호 8로 기재되는 염기서열을 갖는 이튜린 생합성 유전자.
서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 기재되는 염기서열을 갖는 이튜린 생합성 유전자.
서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 이튜린 생합성 유전자.
제 1항 내지 제 9항의 유전자에 의해 암호화되는 이튜린 단백질.
서열번호 6으로 기재되는 염기서열을 포함하는 벡터.
서열번호 6과 서열번호 3(ItuA)로 기재되는 염기서열을 포함하는 벡터.
서열번호 6과 서열번호 7(ItuD)로 기재되는 염기서열을 포함하는 벡터.
서열번호 6과 서열번호 8로 기재되는 염기서열을 포함하는 벡터.
서열번호 6, 서열번호 3(ItuA) 및 서열번호 7(ItuD)으로 기재되는 염기서열을 포함하는 벡터.
서열번호 5, 서열번호 2(ItuA) 및 서열번호 7(ItuD)로 기재되는 염기서열을 포함하는 벡터.
서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 기재되는 염기서열을 포함하는 벡터.
서열번호 1로 기재되는 염기서열을 포함하는 벡터.
제 11항 내지 18항 중 어느 하나의 벡터가 도입된 형질전환체.
제 19항의 형질전환체로부터 생산된 이튜린 단백질.
제 19항의 이튜린을 생산하는 형질전환 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 생물학적 방제제.