WO2012035250A1 - Procede de traitement de cellules en vue de leur cryogenisation et procede de cryopreservation de cellules mettant en oeuvre un tel procede. - Google Patents

Procede de traitement de cellules en vue de leur cryogenisation et procede de cryopreservation de cellules mettant en oeuvre un tel procede. Download PDF

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Frédéric SALDMANN
Gérard FRIEDLANDER
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Immunobank N.V.
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
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    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients

Definitions

  • the present invention relates to a method of treating cells for cryopreservation. It also relates to a cryopreservation method for cells implementing such a method.
  • the field of the invention is the field of the cryopreservation of human or animal cells for reuse on the same subject or on a different subject.
  • cryopreservation uses substances known as cryoprotectants that protect cells from unwanted effects associated with freezing and thawing.
  • the main objective of cryopreservation techniques is to obtain, after thawing, the largest number of viable cells.
  • the secondary objective is to preserve the viability of different cell subpopulations and in particular those that are least represented.
  • An object of the present invention is to propose a method for treating human or animal cells in cryopreservation to improve cryopreservation.
  • Another object of the invention is to provide a method for treating human or animal cells making it possible to obtain a larger number of living cells after cryogenization compared with the state of the art.
  • the invention achieves at least one of these objects by a method of treating cells for cryopreservation of said cells, characterized in that it comprises the following steps:
  • the method according to the invention makes it possible to prepare the cells to better protect them during cryopreservation and makes it possible to obtain a larger number of living cells after cryopreservation.
  • the method according to the invention also makes it possible to improve the viability different cell subpopulations and in particular those that are least represented.
  • cryoprotectants reduce the cellular toxicity while maintaining the cryoprotective properties.
  • the combination of high and low molecular weight cryoprotectants makes it possible to reduce ice crystal formations in the extra and intracellular compartments and thus protect the cells during the phase in which they are frozen.
  • the plant substance protecting the cells during the freezing and thawing phases provides mechanical protection for the cells against the mechanical stresses created by the formation of ice crystals in the extracellular medium and which can cause irreversible deformations on the cells.
  • the substance improving the oxygenation of the cells before and after freezing can preserve a large number of living cells during the phases before and after cryopreservation.
  • the process according to the invention makes it possible to provide protection before, between and after the freezing and thawing phases of the cells during cryopreservation of the cells and thus making it possible to improve the cryopreservation of cells.
  • the cell oxygenation enhancing substance may be a saturated oxygen (0 2 ) transporter.
  • the substance improving the oxygenation of the cells may comprise human or animal hemoglobin.
  • the substance improving the oxygenation of the cells may comprise a substitute for human or animal hemoglobin.
  • such a substitute for hemoglobin may be selected from the family of fluorocarbons which are particularly effective oxygen carriers.
  • the combination of cryoprotectants may comprise:
  • cryoprotectant with oncotic property that protects the cells from edema
  • the step of adding the cryoprotectant combination comprising the following sub-steps:
  • the overall toxicity of the combination of cryoprotectants is lower than in the case where a single cryoprotectant is used.
  • cryoprotectants may comprise the following cryoprotectants:
  • the concentration of the different cryoprotectants can be as follows:
  • the dimethylsulfoxide concentration is between 1 and 5% by volume
  • the concentration of trehalose is between 0.05 and 1.5 moles
  • the concentration of polyethylene glycol is between 5 and 30 g / l.
  • the method according to the invention may further comprise a step of incubating the cells for a period of time. proportional to the final volume to cryopreserve. Such an incubation step allows the balance of the intracellular and extracellular concentration of the cryoprotectant (s) (intracellular type)
  • DMSO is a widely used cryoprotectant but exhibits significant cellular toxicity. This toxicity increases with the concentration of DMSO.
  • trehalose which has lower cytotoxic effects than DMSO, makes it possible to use a lower concentration of DMSO, which is therefore less cytotoxic, while retaining a cryoprotective effect of the same nature.
  • cryoprotectants has low toxicity.
  • PEG has oncotic potency in solution which protects the cells from edema.
  • the substance of plant origin may advantageously be a substance whose gelling point is less than or equal to 12 ° C.
  • DMSO has a significant cellular toxicity. This toxicity is moderate at a temperature of less than or equal to 12 ° C.
  • the polysaccharide gels have a variable gelation temperature generally greater than 20 ° C. It is therefore advantageous to use a polysaccharide gel whose gel point is less than 12 ° C., a temperature above which the toxicity of DMSO is significant (or greater).
  • a method of cryopreservation of cells characterized in that it comprises a cryopreservation phase comprising the following steps:
  • the freezing step may comprise:
  • a step of slow cooling to a temperature between -30 and -50 ° C, for example from 0.5 to 3 ° C per minute
  • a faster cooling step to a temperature of -130 ° C, for example 5 to 10 ° C per minute).
  • cryopreserved cells thus obtained can then be transferred to a temperature-controlled cryogenic chamber.
  • the cryopreservation method according to the invention may further comprise a thawing phase of the cryopreserved cells, said thawing phase comprising:
  • the rapid thawing step can be carried out in a water bath at a temperature between 36-42 ° C.
  • the cryopreservation method according to the invention may also comprise a step of washing the thawed cells with a cell washing solution.
  • the method may include a step of adding a saturated oxygen carrier.
  • the example which will be described in the rest of the application relates to the treatment and cryopreservation of human lymphocyte cells.
  • Human lymphocyte cells are treated according to a treatment method for their cryopreservation. This method of treatment comprises the following steps:
  • an oxygen carrier for example a perfluorocarbon perfluorodecalin type, previously loaded with oxygen at a dose between 1 and 10% by volume at a temperature between 20 and 25 ° C and with slow stirring;
  • Poly Ethylene Glycol for example, of molecular weight MW 20,000 between 10 and 20 g / L finally at a temperature between 20 and 25 ° C. and with slow stirring; - Gradual addition of trehalose to reach a final concentration between 0.1 and 0.5 M in 30 minutes at a temperature between 20 and 25 ° C and with slow stirring;
  • a gel for example an agarose gel with a very low gelation temperature, at a concentration of between 0.2 and 0.8% in the final solution at a temperature between 8 and 12 ° C .;
  • the different components are added to the cells as a liquid solution
  • the freezing comprises a first phase of slow cooling between 0.5 and 3 ° C per minute to a temperature between -30 and -50 ° C and then a second phase of rapid cooling, between 5 to 10 ° C per minute to, at a temperature of the order of -130 ° C.
  • the cryopreserved cells are transferred to a temperature-controlled cryogenic chamber.
  • the cryopreservation method also includes a defrosting step prior to reuse of cells.
  • the thawing step is carried out in several phases:
  • the cell cryopreservation method also comprises a step of gradually adding a cellular washing solution, such as a buffered solution containing glucose, for example based on Ringer's solution.
  • a cellular washing solution such as a buffered solution containing glucose, for example based on Ringer's solution.
  • the method comprises a step of adding the saturated oxygen carrier.

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Abstract

L'invention concerne un procédé de traitement de cellules en vue de la cryopréservation desdites cellules, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: -addition audites cellules d'au moins un transporteur d'oxygène saturé avant la congélation et après la décongélation, ledit transporteur d'oxygène comprenant de l'hémoglobine humaine ou animale et/ou un substitut de l'hémoglobine humaine ou animale, -addition audites cellules d'une combinaison de cryoprotectants de haut et de bas poids moléculaires réduisant la formation de cristaux de glace dans les compartiments extra et intra cellulaires, et -addition audites cellules au moins un gel d'origine végétale pour la protection des cellules pendant les phases de congélation et de décongélation, ledit gel d'origine végétale comprenant de l'agarose et/ou de l'alginate. Elle concerne également un procédé de cryopréservation de cellules mettant en œuvre un tel procédé de traitement.

Description

« Procédé de traitement de cellules en vue de leur cryogénisation et procédé de cryopréservation de cellules mettant en œuvre un tel procédé »
La présente invention concerne un procédé de traitement de cellules en vue de leur cryogénisation. Elle concerne également un procédé de cryopréservation de cellules mettant en œuvre un tel procédé.
Le domaine de l'invention est le domaine de la cryopréservation de cellules humaines ou animales en vue de leur réutilisation sur le même sujet ou sur un sujet différent .
Le processus menant à une greffe d'organes, de tissus ou de cellules comporte plusieurs étapes plus ou moins complexes dont une étape de conservation de durée plus ou moins longue. La cryopréservation en froid profond reste la technique de choix pour la conservation à long terme, par exemple plusieurs années, de la viabilité des cellules. La cryopréservation fait appel à des substances, appelées cryoprotectants , qui protègent les cellules des effets indésirables liés à la congélation et à la décongélation.
L'objectif principal des techniques de cryopréservation est d' obtenir après décongélation le plus grand nombre de cellules viables. Lorsque l'échantillon initial est composé de populations hétérogènes de cellules, l'objectif secondaire est de préserver la viabilité des différentes sous-populations cellulaires et en particulier celles qui sont les moins représentées.
Un but de la présente invention est de proposer un procédé de traitement de cellules humaines ou animales en vue de leur cryopréservation permettant d'améliorer la cryopréservation .
Un autre but de l'invention est de proposer un procédé de traitement de cellules humaines ou animales permettant d'obtenir un plus grand nombre de cellules vivantes après cryogénisation par rapport à l'état de la technique.
Enfin, il est également un but de la présente invention de proposer un procédé de traitement de cellules humaines ou animales permettant de mieux préserver la viabilité des différentes sous-populations cellulaires et en particulier celles qui sont les moins représentées lors d'une cryopréservation.
L'invention permet d'atteindre au moins l'un de ces buts par un procédé de traitement de cellules en vue de la cryopréservation desdites cellules, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- addition audites cellules d'au moins une substance améliorant l'oxygénation des cellules avant la congélation et après la décongélation,
- addition audites cellules d'une combinaison de cryoprotectant s de haut et de bas poids moléculaires réduisant la formation de cristaux de glace dans les compartiments extra et intra cellulaires, et
- addition audites cellules au moins une substance d'origine végétale pour la protection des cellules pendant les phases de congélation et de décongélation .
Le procédé selon l'invention permet de préparer les cellules pour mieux les protéger lors d'une cryopréservation et permet d' obtenir un plus grand nombre de cellules vivantes après cryopréservation. Le procédé selon l'invention permet également d'améliorer la viabilité des différentes sous-populations cellulaires et en particulier celles qui sont les moins représentées.
En effet, l'utilisation de plusieurs cryoprotectants permet de diminuer la toxicité cellulaire tout en conservant les propriétés cryoprotectrices . La combinaison de cryoprotectants de haut et de bas poids moléculaires permet de réduire les formations de cristaux de glace dans les compartiments extra et intra cellulaire et donc de protéger les cellules pendant la phase où elles sont congelées .
Par ailleurs, la substance végétale protégeant les cellules lors des phases de congélation et de décongélation apporte une protection mécanique pour les cellules contre les contraintes mécaniques créées par la formation de cristaux de glace dans le milieu extracellulaire et pouvant entraîner des déformations irréversibles sur les cellules.
De plus, la substance améliorant l'oxygénation des cellules avant et après la congélation permet de préserver un grand nombre de cellules vivantes pendant les phases précédant et suivant la cryogénisation .
Ainsi, le procédé selon l'invention permet d'apporter une protection avant, entre et après les phases de congélation et de décongélation des cellules lors d'une cryopréservation des cellules et permettant ainsi d'améliorer la cryopréservation de cellules.
Avantageusement, la substance d'origine végétale peut être un gel d'origine végétale, par exemple un gel d' agarose à faible température de gélification, par exemple entre 2 et 25°C, ou de l'alginate. Aux températures proches de 0°C, la formation de cristaux de glace dans le milieu extracellulaire entraine des contraintes mécaniques sur les cellules en suspension et par conséquent des déformations qui peuvent être irréversibles. L'utilisation d'un gel d' origine végétale prodigue une protection mécanique pour les cellules.
Avantageusement, la substance améliorant l'oxygénation des cellules peut être un transporteur d'oxygène (02) saturé .
Selon un mode de réalisation de la composition selon l'invention, la substance améliorant l'oxygénation des cellules peut comprendre de l'hémoglobine humaine ou animale .
Selon une autre version du procédé l'invention, la substance améliorant l'oxygénation des cellules peut comprendre un substitut de l'hémoglobine humaine ou animale .
Par exemple, un tel substitut de l'hémoglobine peut être choisi dans la famille des fluorocarbones qui sont des transporteur d'oxygène particulièrement efficaces.
Avantageusement, la combinaison de cryoprotectants peut comprendre :
un premier cryoprotectant,
un deuxième cryoprotectant présentant une toxicité plus faible que la toxicité dudit premier cryoprotectant,
un troisième cryoprotectant présentant une propriété oncotique qui protège les cellules de 1 ' œdème ;
l'étape d'addition de la combinaison de cryoprotectant comprenant les sous étapes suivantes :
-ajout du troisième cryoprotectant,
- ajout du deuxième cryoprotectant après ajout du troisième cryoprotectant, et - ajout du premier cryoprotectant après ajout du deuxième cryoprotectant.
Ainsi, la toxicité globale de la combinaison de cryoprotectants est plus faible que dans le cas où un seul cryoprotectant est utilisé.
Selon une version avantageuse de l'invention, l'étape d' addition de la substance d' origine végétale peut être réalisée avant ou pendant l'ajout du premier cryoprotectant et après ajout du troisième cryoprotectant.
Selon un mode de réalisation particulier, la combinaison de cryoprotectants peut comprendre les cryoprotectants suivants :
- diméthylsulfoxyde (DMSO) , par exemple en tant que premier cryoprotectant
- Tréhalose, par exemple en tant que deuxième cryoprotectant et
- Polyéthylène glycol (PEG) de masse moléculaire comprise entre 10 et 30 kDa, par exemple en tant que troisième cryoprotectant.
Selon un exemple de réalisation, la concentration des différents cryoprotectants peut être comme suit :
- la concentration de diméthylsulfoxyde est comprise entre 1 et 5% en volume,
- la concentration de Tréhalose est comprise entre 0.05 et 1.5 moles, et
- la concentration de Polyéthylène glycol est comprise entre 5 et 30g/L.
Le procédé selon l'invention peut en outre comprendre une étape d' incubation des cellules pendant une durée proportionnelle au volume final à cryopréserver . Une telle étape d'incubation permet l'équilibre de la concentration intra et extracellulaire du/des cryoprotectant ( s ) (de type intracellulaire)
Le DMSO est un cryoprotectant largement utilisé mais qui présente une toxicité cellulaire significative. Cette toxicité augmente avec la concentration du DMSO.
L'addition du tréhalose, qui présente des effets cytotoxiques plus faibles que le DMSO, permet d'utiliser une concentration de DMSO plus faible, donc moins cytotoxique, en conservant un effet cryoprotecteur de même nature. Ainsi, la combinaison de cryoprotectants présente une faible toxicité.
Outre sa propriété cryoprotectante, le PEG possède un pouvoir oncotique en solution qui protège les cellules de 1 ' œdème .
Selon une version avantageuse de l'invention, l'étape d'addition de la substance végétale, qui peut préférentiellement être un gel polysaccharidique, peut être réalisée après l'ajout du premier cryoprotectant.
LA substance d' origine végétale peut avantageusement être une substance dont le point de gélification est inférieur ou égale à 12°C. En effet, le DMSO présente une toxicité cellulaire significative. Cette toxicité est modérée à une température inférieure ou égale à 12 °C. Les gels polysaccharidiques ont une température de gélification variable en général supérieure à 20°C. Il est donc avantageux d'utiliser un gel polysacharidique dont le point de gélification est inférieur à 12°C, température au-delà de laquelle la toxicité du DMSO est significative (ou plus importante) . Selon un autre aspect de l'invention, il est proposé un procédé de cryopréservation de cellules, caractérisé en ce qu' il comprend une phase de cryogénisation comprenant les étapes suivantes :
traitement des cellules conformément au procédé de traitement selon l'invention,
congélation desdits cellules traitées jusqu'à cryogénisation.
Avantageusement, l'étape de congélation peut comprendre :
une étape de refroidissement lente jusqu'à une température comprise entre -30 et -50 °C, par exemple de 0.5 à 3 °C par minute), et
une étape de refroidissement plus rapide jusqu'à une température de -130 °C, par exemple de 5 à 10°C par minute) .
Les cellules cryogénisées ainsi obtenues peuvent ensuite être transférées dans une enceinte cryogénique contrôlée en température.
Le procédé de cryopréservation selon l'invention peut en outre comprendre une phase de décongélation des cellules cryogénisées, ladite phase de décongélation comprenant :
une étape de décongélation lente jusqu'à une température comprise entre -80 et -100 °C, par exemple de 5 à 10 °C par minute, et
une étape de décongélation rapide plus rapide jusqu'à une température de l'ordre de 20°C, par exemple de 10 à 20 °C par minute. Selon un mode de mise en œuvre particulier du procédé de cryopréservation selon l'invention, l'étape de décongélation rapide peut être réalisée dans un bain marie à une température comprise entre 36-42°C.
Le procédé de cryopréservation selon l'invention peut également comprendre une étape de lavage des cellules décongelées avec une solution de lavage cellulaire.
Après la phase de lavage cellulaire, le procédé peut comprendre une étape d'addition d'un transporteur d'oxygène saturé .
D'autres avantages et caractéristiques apparaîtront à l'examen de la description détaillée d'un mode de réalisation nullement limitatif.
L'exemple qui sera décrit dans la suite de la demande concerne le traitement et la cryopréservation de cellules lymphocytaires humaines.
Les cellules lymphocytaires humaines sont traitées selon un procédé de traitement en vue leur cryopréservation. Ce procédé de traitement comprend les étapes suivantes :
-addition d'un transporteur d'oxygène, par exemple un perfluorocarbone de type perfluorodecalin, préalablement chargé en oxygène à une dose entre 1 et 10% en volume à une température entre 20 et 25°C et sous agitation lente ;
- addition de Poly Ethylène Glycol par exemple de poids moléculaire PM 20 000 entre 10 et 20 g/L en final à une température entre 20 et 25°C et sous agitation lente ; - addition progressive de tréhalose pour atteindre une concentration finale comprise entre 0.1 et 0.5 M en 30 minutes à une température entre 20 et 25°C et sous agitation lente ;
- addition progressive de DMSO à une concentration finale comprise entre 1 et 5% en volume à une température entre 8 et 12 °C ;
- incubation entre 8 et 12 °C pendant une durée proportionnelle au volume final du produit à cryopréserver, par exemple 4 minutes pour une poche de 100ml ;
- addition progressive d'un gel, par exemple un gel d'agarose à très faible température de gélification, à une concentration comprise entre 0.2 et 0.8% dans la solution finale à une température entre 8 et 12°C ;
- transfert dans le système assurant la congélation programmée préalablement refroidi à +4°C et démarrage de la procédure de congélation.
Les différents composants sont ajoutés aux cellules sous forme de solution liquide
Ce procédé de cryopréservation comprend une étape de congélation des cellules réalisant une descente en température contrôlée pour amener les cellules traitées à une température de l'ordre de -130 °C.
La congélation comprend une première phase de refroidissement lente entre 0.5 et 3°C par minute jusqu'à une température entre -30 et -50 °C puis une deuxième phase de refroidissement rapide, entre 5 à 10°C par minute jusqu'à, à une température de l'ordre de -130°C.
Les cellules ainsi cryogénisées sont transférées dans une enceinte cryogénique contrôlée en température. Le procédé de cryopréservation comprend également une étape de décongélation avant la réutilisation de cellules. L'étape de décongélation est réalisée en plusieurs phases :
-une phase de décongélation lente jusqu'à une température comprise entre -100 et -80°C, et
- une phase de décongélation rapide dans un bain marie à 38-40°C jusqu'à une température proche de 20°C.
Après la phase de décongélation rapide, le procédé de cryopréservation de cellules comprend également une étape d'addition progressive d'une solution de lavage cellulaire, telle qu'une solution tamponnée et contenant du glucose par exemple à base de solution Ringer.
Après la phase de lavage cellulaire, le procédé comprend une étape d' addition du transporteur d' oxygène saturé .
Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux exemples qui viennent d'être décrits.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de traitement de cellules en vue de la cryopréservation desdites cellules, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
addition audites cellules d'au moins un transporteur d' oxygène saturé avant la congélation et après la décongélation, ledit transporteur d' oxygène comprenant de l'hémoglobine humaine ou animale et/ou un substitut de l'hémoglobine humaine ou animale, addition audites cellules d'une combinaison de cryoprotectants de haut et de bas poids moléculaires réduisant la formation de cristaux de glace dans les compartiments extra et intra cellulaires, et
addition audites cellules au moins un gel d' origine végétale pour la protection des cellules pendant les phases de congélation et de décongélation, ledit gel d'origine végétale comprenant de l'agarose et/ou de l'alginate.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le substitut de l'hémoglobine est choisi dans la famille des fluorocarbones .
3. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la combinaison de cryoprotectants comprend :
un premier cryoprotectant ,
un deuxième cryoprotectant présentant une toxicité plus faible que la toxicité dudit premier cryoprotectant, un troisième cryoprotectant présentant une propriété oncotique qui protège les cellules de 1 ' œdème .
l'étape d'addition de la combinaison de cryoprotectant comprenant les sous étapes suivantes
-ajout du troisième cryoprotectant,
- ajout du deuxième cryoprotectant après ajout du troisième cryoprotectant, et
-ajout du premier cryoprotectant après ajout du deuxième cryoprotectant.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'étape d'addition du gel d'origine végétale est réalisée avant ou pendant l'ajout du premier cryoprotectant et après ajout du troisième cryoprotectant.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la combinaison de cryoprotectants comprend les cryoprotectants suivants :
- diméthylsulfoxyde (DMSO) ,
- Tréhalose, et
- Polyéthylène glycol (PEG) de masse moléculaire comprise entre 10 et 30 kDa .
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que :
- la concentration de diméthylsulfoxyde est comprise entre 1 et 5% en volume,
- la concentration de Tréhalose est comprise entre 0.05 et 2 moles, et
- la concentration de Polyéthylène glycol est comprise entre 5 et 30g/L.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d' incubation des cellules pendant une durée proportionnelle au volume final à cryopréserver .
8. Procédé de cryopréservation de cellules, caractérisé en ce qu' il comprend une phase de cryogénisation comprenant les étapes suivantes :
traitement des cellules conformément au procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes ,
congélation desdits cellules traitées jusqu'à cryogénisation.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'étape de congélation comprend :
une étape de refroidissement lente jusqu'à une température comprise entre -30 et -50 °C, (0.5-3 °C/minute) , et
une étape de refroidissement plus rapide jusqu'à une température de -130°C (5-10°C /minute).
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une phase de décongélation des cellules cryogénisées, ladite étape de décongélation comprenant :
une étape de décongélation lente jusqu'à une température comprise entre -80 et -100 °C, et une étape de décongélation rapide plus rapide jusqu'à une température de l'ordre de 20 °C.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu' il comprend une étape de lavage des cellules décongelées avec une solution de lavage cellulaire.
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