WO2012028753A1 - Procedimiento para la producción y purificación de proteínas recombinantes en plantas - Google Patents

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Javier Pozueta Romero
Francisco José MUÑOZ PEREZ
Bahaji Abdellatif
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Definitions

  • the present invention falls within the field of genetic engineering and biotechnology. Specifically, the invention relates to a process for obtaining purified recombinant heterologous proteins, by producing transgenic plants that express recombinant proteins fused with proteins associated with the starch granule through a sequence recognized by a protease. This procedure allows the purification of the protein by simple steps of homogenization, centrifugation and protease treatment. Likewise, the invention relates to the vectors, hosts, cells and plants used in said process. BACKGROUND OF THE INVENTION
  • biofactories molecular farming
  • proteins expressed in seeds can remain stable for years at room temperature without losing their activity (Giddings 2001; Ma et al. 2003).
  • proteins of therapeutic interest are being produced in a wide variety of plants including tobacco, cereals, oilseeds, fruits, vegetables, fodder and unicellular algae (Twyman et al. 2003; Fischer et al. 2004).
  • Recombinant proteins expressed in bacteria are proteins that do not require glycosylation to be active and generally accumulate in insoluble aggregates whose purification and renaturation costs are not sustainable.
  • recombinant proteins require post-translational modification processes, other expression systems are used, such as mammalian cell cultures that imply a high initial cost for obtaining them and large additional investments when increasing the production scale is required.
  • This problem can be solved through the use of plants as bio-factories, since the mechanisms of protein synthesis and secretion and post-translational modifications are those of eukaryotic cells and allow the production and assembly of complex proteins.
  • Fine purification of the protein is usually performed by chromatographic methods, affinity chromatography for recombinant proteins is quite popular. It is, however, an expensive methodology, which requires several steps until the purified protein is available.
  • Other non-chromatographic techniques, such as electrophoresis have practical utility as analytical tools rather than preparations, which facilitate the estimation of the purity of a protein, but that do not allow separating amounts greater than micrograms.
  • Another additional problem may be the integrity of the protein.
  • This problem is especially important when the protein is to be obtained for pharmaceutical applications, where it is necessary for the protein to be integrated and, in addition, in a stable conformation, in which it manifests its biological activity.
  • the importance of this problem is clearly manifested, for example, when attempts have been made to concentrate the production of recombinant proteins in certain plant organs or when resorting to expression technologies that locate recombinant proteins in a particular organelle of the cell that facilitate its purification.
  • fusion proteins polypeptide chains consisting of two or more polypeptides, bound in a single protein.
  • each of the polypeptides comes from a different origin and, in any case, the polypeptides that make up the hybrid polypeptide or fusion protein are not found naturally forming a single polypeptide.
  • the corresponding coding sequences are inserted into vectors with which microorganisms, plants or transgenic animals are transformed, in which the fusion proteins are synthesized as if they were their own proteins. Subsequently, the proteins are purified from the cultures of microorganisms or tissue samples of the corresponding transgenic plants or animals.
  • the concentration of fusion protein production in specific organs of plants or organelles of their cells has not solved the problem of the difficulty of purification and the need to resort to several stages, often expensive, until obtaining the required degree of purification .
  • the method of purification of recombinant proteins linked to oleosins is based on the homogenization of tissues and subsequent purification of the fatty bodies of transgenic plants after a simple step of centrifugation of the homogenate and flotation of the fatty bodies.
  • oleosins present the specific problem of having allergenic properties, so they must be completely eliminated during the purification process, especially if the protein to be purified wants to be used for administration to humans, all of which further complicates the purification process.
  • the synthesis of proteins fused to oleosins is also not a procedure with a high relative performance, because the oleosins are only located on the surface of the fatty bodies, not inside, so the total amount of fusion protein obtained with respect to the Total body fat weight is not high.
  • hydrophobins small hydrophobic proteins fused to the recombinant protein that facilitate their purification
  • the production of recombinant proteins containing integration sequences in the plasma membrane of cells Schoillberg et al. 2000
  • secretion of recombinant proteins into the extracellular space or apoplast Bosjuk et al. 1999.
  • all of these recombinant protein purification techniques present problems similar to those described above based on the use of recombinant oleosins, especially as regards the difficulty of obtaining the desired protein with a high degree of purity.
  • SER starch encapsulating region
  • This region allows the association with the starch granules of enzymes involved in its metabolism such as soluble starch synthases I, II or III (SSI, SSII or SSIII), granule-bound starch synthase (GBSS), branching enzymes I, lia and IIBb or glucoamylase.
  • SSI, SSII or SSIII soluble starch synthases I, II or III
  • GBSS granule-bound starch synthase
  • branching enzymes I, lia and IIBb branching enzymes I, lia and IIBb or glucoamylase
  • the main purpose of the application is to obtain modified starch granules, which can be used directly as such to enrich feed for animals with certain amino acids or to provide hormones or drugs of interest together with food, which will be protected from degradation in the stomach by the starch itself to which they are attached. With this, the purification of the protein of interest prior to its administration to an animal is avoided.
  • the application also suggests the possibility of purifying the fusion protein by affinity columns, analogously to what is mentioned in previous patents related to hybrid proteins capable of binding to a matrix of polysaccharides such as US Pat. US 5202247.
  • WO 98/14601 the possible presence of a cleavage sequence between the encapsulating region in the starch and the polypeptide of interest, which facilitates its separation from the remaining portion of the fusion protein and its subsequent purification independently .
  • excision is proposed by chemical methods such as lowering the pH or the use of cyanobromide.
  • ion exchange chromatography As an alternative method for purification of the desired polypeptide, another chromatographic method is proposed, ion exchange chromatography, when polyarginine tails have been added to the recombinant fusion protein.
  • WO 98/14601 even provides an outline of the structure that the DNA construction must have to express the hybrid polypeptide in the host, in which the order of the elements is as follows: Promoter - Intron (optional) - Region coding of the transit peptide - Region coding for the polypeptide of interest - SER-Terminator.
  • the inclusion of the transit peptide is justified to ensure that translocation of the protein to organelles such as plastids occurs, manifesting preference for amyloplasts.
  • this structure entails problems when purifying the polypeptide of interest bound to the starch granule, which also becomes apparent if the international application WO 00/77165 is analyzed.
  • the SBD-bound protein is not even required to be complete, although preference is expressed that the chosen fragment results in a fusion protein that maintains the biological activity of the protein of interest. Even so, the possibility of using the method to produce proteins in commercial quantities is suggested, isolating it with the starch granule, or separating it from the fusion protein, taking advantage of the presence of a cleavage site.
  • SBDs offer the possibility of using them as affinity tails with which to facilitate the purification of proteins bound to such SBDs by affinity chromatography through starch columns, which seems to be the preferred purification method, as it is referred to several times.
  • the protein purification system suggested in application WO 00/77165, as in WO 98/14601 would consist of: (a) the production of recombinant proteins linked to a "starch binding" domain "(SBD) in bacteria, plant or animal cells, (b) extraction by rupture / homogenization / milling of the cell / tissue / organ and (c) purification of the protein by affinity chromatography on a starch column to which specifically, recombinant proteins possessing an SBD will bind. The subsequent release of the starch protein can take place by the addition of an endoprotease that specifically recognizes an amino acid sequence between the SBD and the protein of interest.
  • the purification of the recombinant protein depends on the use of a well-known system at the time when WO 98/14601, affinity chromatography through starch columns, was deposited.
  • chloroplast proteins are synthesized as precursors in the cytosol. These precursors contain cleavable signals at the amino terminus called transit peptides, which direct them to the chloroplasts.
  • the translocation of the precursor proteins through the chloroplast membrane is achieved by the combined action of the Toe (in the outer membrane) and Tic translocks in the inner membrane of the chloroplasts, constituting the toe-tic system (Jarvis and Sol ⁇ , 2002).
  • the toe-tic system of plastidial protein processing is not absolutely accurate. It is based on the recognition of hydrophobic domains, not being predictable to effect the cut to cleave the transit peptide at an exact point.
  • the prediction programs of the subcellular location and the processing site of a protein linked to a transit peptide usually have quite a few problems when predicting (a) the exact subcellular location of the protein and (b) the place of cutting / processing of the transit peptide (Bahaji et al. 2011). It is very difficult to find a sequence that acts as a transit peptide to plastide that, after being eliminated, allows the protein incorporated into the amyloplate to completely and exactly enter the sequence desired at its N-terminal end. Moreover, there is no "model" amino acid sequence that, fused to any protein, guarantees the transport of the protein to plastide in its entirety.
  • the protein of interest incorporated has at its N-terminal end a "residue" or vestige of the C-terminal end. of the transit peptide.
  • This is a problem for the practical application of the methods of applications WO98 / 14601 and WO 00/77165, when they are intended to be used to purify the protein of interest if, as indicated in said applications, the starch binding domain is placed at the carboxyl end of the fusion protein. As depicted in Fig.
  • the present invention presents a solution to these problems.
  • the present invention solves the problem of purifying large-scale recombinant proteins through a simple and low-cost system, suitable for being used to purify proteins of interest from fusion polypeptides expressed in plants and, if necessary, making possible obtain the complete protein, without loss of amino acids or additional fragments at some extreme.
  • the proposed solution consists of a procedure based on the purification of fusion proteins from transgenic plants that ectopically express the recombinant protein (the industrial / commercial interest polypeptide) fused with a polypeptide fragment that has a starch binding domain.
  • the fusion protein has several important peculiarities:
  • polypeptide fragment that has the starch binding domain is attached to the protein of interest by means of a fragment that has a cut-off sequence of a protease, which facilitates the separation of both;
  • the protein of interest is in the carboxyl end region of the fusion protein, the polypeptide fragment having the starch binding domain in the amino end region; the fragment presenting the cut-off sequence of a protease binds, therefore, the carboxyl end of the polypeptide fragment that has the starch binding domain with the amino end of the polypeptide of interest;
  • polypeptide fragment presenting the starch binding domain may comprise:
  • a plant protein eg GBSS
  • GBSS plant protein chosen from the group known to be associated with the starch granule (a protein that, therefore, will not only naturally present a starch binding domain but also , in its precursor form synthesized in the cytosol, it will have its own transit peptide that will direct it to plastid, where it will be associated with starch)
  • a bacterial amylase starch binding domain which will be preceded by a transit peptide of some plant protein that is associated with the starch granule that will allow the form synthesized in the cytosol to reach plastid, where it will be associated with starch .
  • the purification procedure starts from transgenic plants that ectopically express proteins fused with proteins bound to the starch granule (eg, GBSS) through a sequence recognized by a protease.
  • the protein of interest together with the rest of the fusion protein, will be anchored to the starch granule.
  • the high density of the starch granules allows an easy purification of the rest of the cellular components after a simple step of homogenization of the tissue and centrifugation. Subsequent protease treatment allows the protein of interest to be released, which can be obtained pure simply after a new centrifugation and removal of the protease.
  • the new method proposes the solubilization of the protein of interest linked to a non-soluble structure, easily separable from the soluble proteins of the medium, a method that is much more efficient than the methods used to date, since it is based on a simple precipitation step.
  • the method also makes it possible to reduce costs with respect to the currently used methodologies, mostly based on chromatographic methods, especially those based on purification by affinity chromatography.
  • the starch binding domain is that of a bacterial amylase
  • the fusion protein is initially synthesized in the form of a precursor protein that has a transit peptide that directs the fusion protein to plastidium and , with it, to the starch granule.
  • the careful choice of the fragment containing the protease recognition site will finally allow obtaining the protein of interest not only integral, but lacking additional amino acids, which will allow its use in such demanding sectors as the pharmaceutical sector .
  • the invention also relates to the vector from which a transgenic plant suitable for carrying out the process of the invention can be obtained, to a host organism containing said vector, as well as plant cells transformed with the vector and transgenic plants. obtained from them.
  • a first aspect of the invention relates to a process for obtaining purified recombinant proteins from a transgenic plant or cells in transgenic cultures, comprising the following stages:
  • step b) treating the fraction selected in step b) with the protease that recognizes the cut-off site included in the linker fragment;
  • the additional purification step will be carried out by any method known to the person skilled in the art, such as any size separation, immunoabsorption, ion exchange or fluorescence detection technique.
  • an embodiment of the method of the invention included in the scope thereof, is that which comprises the steps by which the transgenic plant is obtained and cultivated. Therefore, in a possible embodiment, the process of the invention comprises the previous steps of:
  • starch binding domain is a binding domain of a bacterial amylase, as well as those in which the binding domain belongs to a plant protein, generally a enzyme, which naturally binds to starch.
  • the fusion protein comprises the complete polypeptide sequence of said plant protein and that it is synthesized in the cytosol in the form of a precursor that comprises the complete amino acid sequence of the precursor form of said plant protein, is that is, a precursor that comprises the natural transit peptide of said protein, so that the coding sequence of the fusion protein will not need any additional transit peptide to that which is proper to said protein.
  • the starch binding domain belongs to a bacterial amylase
  • said domain can be chosen from any of the known SBDs, such as those found in Figure 1 of the Janecek and Sevcik article (Janacek and Sevcik, 1999).
  • Minimum sequences can be selected, for example, those cited in Figure 1 of the application WO 00/77165, that is, those having the sequences represented by SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 5 and SEQ ID NO: 6.
  • the coding sequence of the fusion protein contains, in 5 'respect to the coding sequence of the SBD, the fragment encoding a transit peptide.
  • the invention also relates to the vector by which the transgenic plants are obtained, as well as to the host transformed therewith, to the intermediate vectors that allow obtaining the plant transformation vector and the hosts transformed with them. .
  • one aspect of the invention relates to a vector for use in the process of the present invention which comprises, in the 5'-3 'sense, a promoter that allows expression in plants, to which the coding sequence is operatively linked.
  • a fusion protein comprising, in the amino to carboxyl sense, a cytosol to plastid transit peptide, a starch binding domain, a linker fragment that contains the cleavage site of a protease and the polypeptide corresponding to the recombinant protein to be purified following the process of the invention.
  • said vector is a plasmid.
  • another aspect of the invention is an organism transformed with the above vector.
  • the organism is the bacterium Agrobacterium tumefaciens.
  • Another aspect is a plant cell transformed with the previous host organism.
  • a further aspect of the invention is a transgenic plant, its seeds or propagation material, obtained from the previous vector and / or whose cells are transformed with said organism.
  • the intermediate plasmids from which the transformation vector can be obtained are also an aspect of the invention, since they will be the plasmids that will allow the process of the invention to be applied for the amplification and purification of very different proteins.
  • Gateway® technology from Invitrogen was used, which avoids the use of digestion with endonucleases and ligaments, replacing them with successive recombination events in the presence of recombinases that recognize complementary recombination site pairs , as described in the Gateway ® Technology protocol: (http://www.invitroaen.com/site/us/en/home/Products-and- Services / Applicat ⁇ ons / Clonina / Gatewav-Clonina / GatewavC- Misc / Protocols.html # bp).
  • GBSS was used as an example of protein bound to the starch granule.
  • an intermediate vector was used, which allows the coding sequence of any protein of interest to be fused with GBSS using GATEWAY ® technology. Therefore, a further aspect of the invention describes a specifically designed for use in the method of the invention vector comprising, in the 5 '-3, a promoter, a sequence encoding the GBSS and a nucleotide sequence flanked by sequences attR1 and attR2, which allows cloning downstream of GBSS any nucleotide sequence flanked by sequences attl_1 and attl_2.
  • the invention also relates to a host organism that houses the vector described above, specifically E. coli.
  • Fig. 1 Scheme of synthesis in the cytosol, translocation to plastide (stroma), starch binding, release of the starch granule and purification of a recombinant polypeptide synthesized as part of a fusion protein in which the encapsulation region in starch (SER: starch encapsulating domain) is located in the carboxyl fragment of the fusion protein, while the polypeptide of interest (represented here by the green fluorescent protein, GFP) is located in the zone amino, then the transit peptide (TP). GFP and SER are separated by a linker amino acid sequence specifically recognized by an endoprotease.
  • SER starch encapsulating domain
  • Translocation to the stroma through the toe-tic system involves the excision of an undetermined number of amino acids (modification represented by the irregular arrow end) that can result in the GFP protein losing part of its amino acids from the amino end or maintaining a portion of the transit peptide, modification that is maintained once the polypeptide is released and purified.
  • Fig. 2 Scheme of cytosol synthesis, plastid translocation (stroma), starch binding, starch granule release and purification of a recombinant polypeptide synthesized as part of a fusion protein in which the polypeptide of interest (represented here by the green fluorescent protein, GFP) is located in the carboxyl region of the fusion protein, while in the amino zone there is a plant protein that has a starch binding domain (represented here by the GBSS: starch synthase attached to the granule) which possesses, in its precursor form, its own transition peptide (TP).
  • GFP green fluorescent protein
  • TP transition peptide
  • Fig. 3 Scheme of synthesis in the cytosol, translocation to plastide (stroma), starch binding, release of the starch granule and purification of a recombinant polypeptide synthesized as part of a fusion protein in which a domain of starch binding (SBD: starch binding domain) of bacterial origin that is located in the amino fragment of the fusion protein, preceded by the transit peptide (TP), while the polypeptide of interest (represented here by the green fluorescent protein , GFP) is located in the carboxyl zone.
  • SBD starch binding domain of bacterial origin that is located in the amino fragment of the fusion protein, preceded by the transit peptide (TP), while the polypeptide of interest (represented here by the green fluorescent protein , GFP) is located in the carboxyl zone.
  • TP transit peptide
  • GFP green fluorescent protein
  • Translocation to the stroma through the toe-tic system can affect the SBD, although it should not extend to the GFP which, again, would recover intact once the digestion with the endoprotease (in this case, enterokinase) and purified the corresponding polypeptide to the GFP.
  • endoprotease in this case, enterokinase
  • Fig. 4 Stages for obtaining a polypeptide of interest (recombinant protein following the method of the present invention from potato tubers expressing the protein of interest bound to the GBSS: homogenization of the tubers, filtering, washing and centrifugation , obtaining the granules of pure starch, digestion with the corresponding protease, new centrifugation and separation of W
  • Fig. 5 Detection by anti-GFP immunoblotting of the GBSS-thrombin-GFP protein in transgenic N. benthamiana plants expressing GBSS-thr-GFP.
  • Fig. 6 Subcellular localization of GBSS-thrombin-GFP.
  • the photographs show fluorescence in Arabidopsis plant cells expressing GBSS-thr-GFP, which have been subjected to analysis by a D-Eclipse C1 confocal microscope (NIKON) equipped with an Ar 488 excitation laser, a green emission filter BA515 / 30 and a filter for BA650LP red emission.
  • NIKON D-Eclipse C1 confocal microscope
  • Fig. 7 Stages for the construction of plasmid pGWB2-GBSS gtw, which allows the introduction of the coding sequence of any protein of interest linked to that of the GBSS.
  • Fig. 7A generation using GATEWAY technology of the pGWB2-GBSS construct, which contains the GBSS gene under the control of the 35S promoter.
  • Fig. 7B generation of plasmid pGWB2-GBSS gtw, which incorporates the GATEWAY recombination cassette.
  • Fig. 8 Stages for the construction of plasmid pGWB2-GBSS-Thr-GFP, necessary for the production of plants via A. tumefaciens that ectopically express GBSS-linked GFP through an amino acid sequence recognized by an endoprotease, in This case thrombin. Introduction of the Thr-GFP sequence, using GATEWAY technology, into the vector pGWB2-GBSS gtw of Fig. 7.
  • Fig. 9 Analysis by immunoblotting of the GFP protein using anti-GFP antibodies.
  • the purified starch granules of transgenic plants expressing GBSS-Thr-GFP were subjected to treatment with or without the thrombin protease. After that they were subjected to a centrifugation step at .000 g for 10 minutes. From left to right: starch granules and supernatants obtained after centrifugation of untreated starch granules and treated with thrombin, respectively.
  • Fig. 10 Confocal microscopy photographs of starch granules of potato tubers expressing a fusion protein with GBSS-thrombin recognition sequence - GFP. The photo below shows green fluorescence in all the granules and in all the surface of the same, indicating the presence of the GFP in active form.
  • Fig. 11 Checking the purity and concentration of the GFP isolated from starch granules expressing the fusion protein between GBSS and GFP.
  • Fig. 11 A SDS-PAGE gel electrophoresis (polyacrylamide with SDS) and Coomasie Blue staining.
  • Fig. 11 B Photography after Western blot. Streets: (1): Protein extract of potato tuber expressing GFP bound to GBSS by a linker fragment with the thrombin recognition sequence. (2) Protein extract of purified starch from the same plant. (3) protein released from starch after thrombin digestion and centrifugation. The positions corresponding to the GBSS-GFP fusion protein and the free GFP are indicated with arrows.
  • Fig. 12 Stages for the construction, using GATEWAY technology, of the plasmid pGBSS-Entk-Palifermin, which allows the generation of transgenic plants that express a fusion protein in which the coding sequence of palifermin is linked to the GBSSI by means of a linker fragment with the enterokinase recognition sequence.
  • a PCR product corresponding to the palifermine coding sequence associated with the enterokinase recognition coding sequence is generated, the entire fragment flanked by attB1 and attB2 sequences.
  • the fragment is inserted into plasmid pDONR / Zeo by a recombination reaction in the presence of the corresponding recombinase, giving rise to plasmid pDONR Entk-Palifermin.
  • a new recombination reaction with a plasmid that has the GBSS coding sequence followed by a GATEWAY recombination cassette (in this case the plasmid used is pGBSS gtw) operatively linked to the 35S promoter of the cauliflower mosaic virus, allows to create a plasmid (pGBSS-Entk-Palifermin) with the coding sequence of the GBSS-palifermin fusion protein, separated by the enterokinase recognition sequence, the entire coding sequence being under the control of the 35S promoter.
  • Fig. 13 Stages for the construction, using GATEWAY technology, of plasmid pGBSS-Entk-Mecasermin, which allows the generation of transgenic plants that express a fusion protein in which mecasermin is bound to GBSS by means of a linker fragment with the enterokinase recognition sequence, following a procedure analogous to that of Fig. 12.
  • Fig. 14 Stages for the construction, using GATEWAY technology, of the plasmid pGBSSI-Entk-Albumin, which allows the generation of transgenic plants that express a fusion protein in which mature albumin is bound to GBSSI by means of a linker fragment with the enterokinase recognition sequence, following a procedure analogous to that of Fig. 12.
  • Fig. 15 Stages for the construction, using GATEWAY technology, of the plasmid pGBSS-Entk-GFP, which allows the generation of transgenic plants that express a fusion protein in which the GFP is linked to the GBSS by means of a linker fragment with the enterokinase recognition sequence, following a procedure analogous to that of Fig. 12.
  • the present invention provides an alternative for large-scale purification of recombinant proteins produced in transgenic plants or cultivation of transgenic plants that express the recombinant protein to be purified.
  • the new protein purification method is based on the production of starch accumulator plants or cells that express proteins of interest fused with proteins with motifs of binding to the starch granule such as the GBSS (Granule Bound Starch Synthase: granule-bound starch synthase ), or with starch binding domains of bacterial enzymes, through a linker fragment containing a sequence specifically recognized by endoproteases such as thrombin or enterokinase.
  • GBSS Gramule Bound Starch Synthase: granule-bound starch synthase
  • the protein of interest is anchored to the starch granule, whose high density allows an easy purification of the rest of the cellular components after a simple step of homogenization of the tissue, centrifugation and solubilization of the recombinant protein of interest after a digestion treatment with endoprotease
  • the method is exemplified in Fig. 4. As can be seen, it is a simple method, cheaper than the chromatographic methods that are usually used for the purification of recombinant proteins (especially fusion proteins), particularly if compared with affinity columns that are used frequently.
  • the fusion protein is isolated initially bound to the starch granule has the additional advantage of avoiding the risks posed by the association with, for example, oleosins, which often presented contamination with possible allergenic effect. Therefore, the association with the starch granule is an additional advantage for the purification of proteins that are desired to be used for delivery to humans.
  • This method has been developed using potato plants that express the green fluorescent protein (GFP) fused to the carboxyl terminus of the GBSS through an amino acid sequence specifically recognized by an endoprotease. It is very important, as previously mentioned, that the polypeptide of interest to be purified binds to the carboxyl terminus of the fusion protein fragment comprising the starch binding domain because, otherwise, as schematized in Fig. 1, the performance of the toc-tic system of translocation of cytosol to plastide could result in the polypeptide of interest being obtained at the end with the absence of part of its sequence, or with additional amino acids. Since the entire sequence is not present, the polypeptide could not be used as such in pharmaceutical or other applications in which the integrity of the amino acid sequence of the protein of interest is required.
  • GFP green fluorescent protein
  • This condition with respect to the organization of the elements in the fusion protein supposes an important difference with respect to the systems suggested in the applications WO 98/14601 and WO 00/77165, especially the first, where the granule binding element is preferably located in the region of the carboxyl end.
  • This condition with respect to the organization of the elements in the fusion protein also makes it possible for the method to be used in a real way for the purification of proteins, having guarantees that they will finally be isolated not only completely, but also being able to provide if the purified final polypeptide may or may not contain any additional amino acid at any of its ends.
  • the expression system based on the use of the 35S promoter of cauliflower mosaic virus (CaMV) allows levels of GFP accumulation of approximately 6 mg per kg of tuber fresh. It is estimated that GFP accounts for approximately 0.1% of the total protein of the transgenic tubers.
  • the system can be optimized with embodiments included within the scope of the invention, in which stronger promoters are used, which allow to increase the accumulation levels of the polypeptide of interest.
  • Another possible embodiment of the method of the invention interesting to result in an increase in the yield of the purified protein finally obtained is the application of an additional stage, prior to the digestion of the starch granules with the endoprotease, stage in which they are applied treatments that break or digest the starch granule, so that the endoproteases have access to most of the recombinant protein of interest bound to the granule and not only to that existing on the surface of the starch granule.
  • the transit peptide whose sequence is represented by SEQ ID NO: 8 can be used, using the sequence represented by SEQ ID NO: 7 as a possible coding sequence thereof. It is a peptide used in previous occasions by the group of the present inventors, whose utility has been proven to send to the plastidium proteins such as green fluorescent protein (GFP) (Bahaji et al., 2011a) or bacterial proteins such as GlgC (Bahaji et al., 2011 b). It is the transit peptide that, in nature, allows the P541 protein to be incorporated into the pepper chromoplast (Houlné et al., 1994).
  • GFP green fluorescent protein
  • the fusion protein comprises the complete polypeptide sequence of said plant protein and that it is synthesized in the cytosol in the form of a precursor comprising the complete sequence of amino acids of the precursor form of said vegetable protein, that is, a precursor comprising the natural transit peptide of said protein.
  • the fusion protein coding sequence will comprise the complete natural coding sequence of the selected starch binding vegetable protein, coding sequence that will include its natural precursor peptide, no additional transit peptide prior to said protein being necessary.
  • the presence of the complete natural sequence of a plant protein that binds to starch is preferable to the presence of fragments thereof, because it is a guarantee that the amino acids removed from the system toe-tic in the process of translocation to plastid they will belong to said protein, not being affected nor the sequence of recognition of the protease to be used to separate the polypeptide of interest from the fusion protein, nor said fusion protein.
  • the vegetable protein comprising a starch binding domain can be selected from the group of:
  • the coding sequence of said plant protein may be identical to a natural sequence or it may be a sequence that has at least 60% homology with a natural sequence, as long as the protein synthesized from said coding sequence maintains the ability to bind to starch and to present a signaling sequence capable of acting as a transit peptide that leads the precursor initially synthesized to plastide.
  • Preferred embodiments of the invention are those in which the natural sequence of any of the above enzymes is used, as is the case, for example, in Examples 1 and 2 of the present application, where the natural sequence has been used after cloning. of the GBSS of Arabidopsis thaliana, which is encoded by the At1g32900 gene.
  • Solanum tuberosum can be used, for example (No. access in UniProt: Q00775; No. access in EMBL to the coding sequence: CAA41359.1).
  • the sequence corresponding to the species from which the transgenic plant is obtained is used, although it is not essential.
  • the protease may be any protease.
  • the cutting site must be chosen so that it is not also present in the internal sequence of the protein of interest.
  • a possible protease to consider is thrombin (which cuts the polypeptide sequences after the amino acid arginine, Arg, considering that the optimal recognition sequences for cutting are Gly-Arg // Gly and AB- Pro-Arg - // - XY, where A and B are hydrophobic amino acids and X and Y are non-acidic amino acids).
  • a protease whose recognition sequence is all at the carboxyl end after cutting is particularly preferred, with no amino acid remaining at the amino end that may result in a modification to the polypeptide sequence. of interest.
  • An example could be enterokinase, a specific protease that makes a cut after the amino acid lysine when it finds the Asp-Asp-Asp-Asp-Lys sequence; thus, the amino acid after which it makes the cut is the last amino acid of its recognition sequence, of which there is no residue left at the amino end generated after the cut.
  • the option of using the enterokinase and its recognition sequence are of special interest, as already mentioned, when the polypeptide of interest wants to be used in the pharmaceutical sector or in any other sector in which the complete integrity of the amino acid sequence of The recombinant protein, therefore, is a guarantee that the polypeptide obtained at the end of the procedure will have its complete sequence, without traces of the enzyme's cutting sequence and without lacking part of its amino acids. That is why it is the endoprotease chosen in Example 4, referring to the use of the method of the invention for proteins of clinical and therapeutic interest, such as palifermin, mecasermin and albumin.
  • the method in which any of said proteins is the polypeptide of interest to be amplified and purified, as well as the vectors of the invention comprising the coding sequence of fusion proteins of which said polypeptides are part, are within the scope of the present invention
  • GFP polypeptide model of interest
  • the recombinant protein to be amplified and purified GFP
  • GFP is a protein that emits green fluorescence whose expression, therefore, is easy to determine, allowing easy viewing of results. Being a common tool in trials, it is easy to find data on its characteristics and useful reagents to work with it, such as specific antibodies.
  • a specific embodiment of the method of the invention of special interest is that in which the GFP acts as a polypeptide of interest, the linker fragment being one having a thrombin cut site and the vegetable protein may be GBSS, as in Examples 1, 2 and 3 of the present application.
  • the vectors of the present invention that have the coding sequence (SEQ ID NO: 1) of the corresponding fusion protein (SEQ ID NO: 2) to that GBSS-thrombin-GFP cleavage site.
  • any plant could be used, although it is preferred that it be a plant that accumulates starch such as, for example, a cereal plant such as rice, barley, wheat and corn, potato plants, tobacco, tomato or Arabidopsis thaliana.
  • a cereal plant such as rice, barley, wheat and corn, potato plants, tobacco, tomato or Arabidopsis thaliana.
  • the present application shows trials carried out with Nicotiana benthamiana (one of the species of the tobacco plant) or Solanum tuberosum (potato), but the technical effects shown in the present application are extrapolated to any plant that accumulates starch, as well as they are to any organ of the plant that accumulates starch (tubers, leaves, fruits, seeds ).
  • one aspect of the invention relates to an expression vector for the transformation of plants comprising, in the 5'-3 ⁇ sense, a promoter that allows expression in plants, to which the coding sequence of a protein is operatively linked. fusion comprising, in the amino to carboxyl sense, a cytosol to plastid transit peptide, a starch binding domain, a linker fragment containing the cut-off site of a protease and the polypeptide corresponding to the recombinant protein to be purified following The process of the invention.
  • said vector is a plasmid.
  • the vectors in which the promoter to which the fusion protein coding sequence is operatively linked is 35S,
  • the vectors in which the linker fragment comprises the coding sequence of the thrombin or enterokinase recognition site - the vectors comprising the coding sequence of a polypeptide selected from the group of GFP, palifermin, mecasermin and mature form of human albumin.
  • the vector has been obtained using GATEWAY ® technology. For that reason, there is also a preference for the fusion protein coding sequence to be flanked by aatB: attB1 and attB2 sequences.
  • GATEWAY ® technology considerably simplifies the cloning procedure, however, the expression vector used in the process of the invention can be obtained by any other known cloning strategy, eg, cutting and gluing by restriction enzymes, ligases , and any other employee in the sector.
  • An important part of the invention is also the host organism that includes said vector, both because it will allow its amplification and because its possible intermediary role in the achievement of the transgenic plant. That is why the bacterial host in which said vector is introduced is also an aspect of the invention. For that same reason, it is preferred that the host is Agrobacterium tumefaciens, as it is the appropriate route to introduce the construct comprising the coding sequence of the fusion protein and the promoter into a plant.
  • Transformed cells expressing the fusion protein bound to starch granules could also be used to carry out the process of the invention, purifying the protein from cultures thereof.
  • Cultures of other cell lines of plants transformed with a vector of the invention could also be used, which can be grown by methods well known to those skilled in the art, preferably lines. Rapidly growing cells, such as the line derived from BY-2 tobacco plants, preferably grown in the presence of cytokines (Enami et al., 2011). Plant cells are usually grown as suspension cells in liquid medium, or also in solid medium in the form of callus (mass of undifferentiated cells).
  • transgenic plants within the scope of the invention, can be defined as those transgenic plants comprising, integrated in their genome, a DNA fragment comprising a promoter for expression in plants, to which the coding sequence is operatively linked. of a fusion protein of the invention.
  • a transgenic plant its seeds or propagation material is also included within the scope of the invention, characterized in that its genome has an integrated 5'-3 'sense, a promoter that allows expression in plants, to which it is operably linked the coding sequence of a fusion protein comprising, in the amino to carboxyl sense, a cytosol to plastid transit peptide, a starch binding domain, a linker fragment containing the protease cleavage site and the Polypeptide sequence of a protein that is not expressed naturally in the species to which the transgenic plant belongs.
  • This last protein will logically be the recombinant protein that one wants to amplify and purify.
  • Transgenic plant plant whose genome has been modified by genetic engineering in order to achieve different and / or improved biological characteristics compared to those of the wild control plant (WT).
  • Transformed plant cell these are plant cells that have a genetic alteration resulting from the introduction and expression of external genetic material in their genome.
  • Ectopic expression of the GBSS-thrombin-GFP Chimeric protein a plant ectopically expresses the GBSS-thrombin-GFP chimeric protein when an anti-GFP immunoblot detects a band in a transformed plant extract that is not detected in a WT plant extract grown under the same conditions and at the same time.
  • Fig. 5 it can be seen that in a protein extract of transgenic Nicotiana benthamiana plants expressing GBSS-thr-GFP a band of the size corresponding to the chimeric protein is detected that is not detected in extracts of WT plants using a GFP specific antibody.
  • Another method to confirm that a plant expresses the GBSS-thrombin-GFP protein is by detecting the fluorescence emitted by the GFP protein. As shown in Fig. 6 the fluorescence is located solely and exclusively in the starch granule, confirming that the GFP is bound to the GBSS.
  • GBSS was used as an example of starch granule bound protein, specifically the Arabidopsis thaliana GBSS.
  • intermediate vectors specifically designed for use in said procedure were used, obtained by GATEWAY ® technology, in which the GBSS coding sequence is already operatively linked to the chosen promoter (in this case, the 35S ), vectors that allow to fuse with the GBSS the coding sequence of any protein of interest. Said vectors therefore represent a quite useful tool when applying the method of the invention to any protein, assuming an intermediate tool to which it is only necessary to add the coding sequence of the specific polypeptide of interest at any time.
  • another aspect of the invention is an expression vector comprising, in the 5'-3 'sense, a promoter that allows expression in plants, to which the coding sequence of a plant protein that binds to the plant is operatively linked.
  • starch coding sequence that is followed by a fragment flanked by attR1 and attR2 sequences, a fragment that preferably contains an indicator gene or a selection gene. This allows any nucleotide sequence flanked by attL1 and attL2 sequences to be cloned downstream of the vegetable protein coding sequence with a starch binding domain.
  • Said vector could include any promoter commonly used for this purpose, as well as any appropriate terminator, and different antibiotic resistance markers, without altering the essence of the invention.
  • said vector is a plasmid.
  • the encoded vegetable protein is GBSS, with particular preference for Arabidopsis thaliana or Solanum tuberosum.
  • the vector is, specifically, a vector comprising, in the 5 '-3, the 35S promoter, sequence encoding the GBSS and a nucleotide sequence flanked by attFM and attR2 sequences, such as the vector pGWB2-GBSS gtw, described in detail in Example 1 and in Fig. 7, and also the vector pGBSS gtw represented in Fig. 12-15 and used in Example 4.
  • a bacterial host transformed with said vector also constitutes a further aspect of the invention.
  • the most preferred case is one in which the host is E. coli.
  • the examples are then presented, in which the procedure for obtaining transgenic plants expressing recombinant proteins fused to the GBSS protein through a sequence specifically recognized by a protease is shown in detail.
  • the fluorescent protein GFP was used as an example of GBSS bound protein.
  • the amino acid sequence recognized by thrombin was initially used.
  • Example 1 Obtaining and characterizing transgenic plants that express GBSS-thrombin-GFP
  • GBSS is encoded by the At1g32900 gene of A. thaliana. From its nucleotide sequence oligonucleotides specific for the GBSS gene were synthesized. These oligonucleotides were used to amplify the complete cDNA fragment encoding GBSS by means of RT-PCR from total RNA of Arabidopsis leaves.
  • the amplified fragment was cloned into the vector pGEM-T easy (Promega), giving rise to plasmid pGBSS that was amplified in the host bacterium XL1 Blue.
  • the cDNA encoding the GBSS flanked by attB recombination sites was amplified using the oligonucleotides GBSS-attB1 (5'-ggggacaagtttgtacaaaaagcaggcttaatggcaactgtgactgcttctc-3 ') and GBSS- attB2 (5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtatcacggcgtcgctacgttctc-3 ').
  • the generated PCR product was cloned into the pDONR / Zeo vector by GATEWAY ® recombination with the attP1 and attP2 recombination sites, giving rise to plasmid pDONR-GBSS.
  • GATEWAY ® recombination reaction the GBSS gene was transferred from plasmid pDONR-GBSS to plasmid pGWB2 generating the pGWB2-GBSS construct containing the GBSS gene under the control of the 35S promoter.
  • the PCRS-amplified sequence was amplified 35S fused to the GBSS gene flanked by the Hindlll and Xbal restriction sites).
  • plasmid pGWB2 In plasmid pGWB2, the 35S promoter was replaced by the 35S-GBSS PCR product by the Hindlll and Xbal restriction sites, creating plasmid pGWB2-GBSS gtw, which comprises the 35S constitutive promoter, the GBSS gene and a recombination cassette GATEWAY ® flanked by attR1 and attR2 sequences that allows the introduction of any gene of interest to produce a recombinant protein formed by the protein of interest fused to the C-terminal end of the GBSS protein.
  • the pGWB2-GBSS gtw vector was introduced by electroporation in E. coli. 1.2. Obtaining plasmid pGWB2-GBSS-Thr-GFP
  • the sequence described as the GFP-Thr was amplified by PCR from a cDNA encoding the GFP protein using Thr-EGFP-attB1 (5'- ggggacaagtttgtacaaaaaacaqqcttaatgctggtqccacacgacagcatggtqagcaaggqcgaggagc- 3 ') and EGFP-attB2 oligonucleotides (5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtattacttgtacagctcgtccatgc -3').
  • Thr-EGFP-attB1 oligonucleotide has the attB1 (sequence 5 '- ggggacaagtttgtacaaaaagcaggctta-3-) followed by the sequence (5' - atqctqgtqccgcgcgqcaqc-3) encoding a cleavage site of thrombin protease and a (5 '- catggtgagcaagggcgaggagc-3 ' ) that codes for the N-terminal end of the protein of interest (in this case the GFP).
  • the oligonucleotide Egfp-attB2 has a nucleotide sequence (5 ' -ggggaccactttgtacaagaaagctgggta-3 ' ) that encodes the C-terminal end of the protein of interest (in this case the GFP) followed by the sequence attB2 (5 ' -ttacttgtacagctcgtccatgc-3 ' ).
  • the generated PCR product was cloned by GATEWAY ® recombination in the pDONR / Zeo vector, giving rise to plasmid pDONR-Thr-GFP.
  • Plasmid pGWB2-GBSS-Thr-GFP was introduced by electroporation in A. tumefaciens. The resulting strain was used to transform Nicotiana benthamiana, Solanum tuberosum and A. thaliana plants according to protocols described in the literature (Rocha-Sosa et al. 1989; Clough and Bent 1998; Voinnet et al. 1999).
  • Plasmid pGWB2-GBSS-Thr-GFP contains the cassette formed by the GBSS gene of A. thaliana, a sequence that encodes the thrombin protease cleavage site and the gene that encodes GFP.
  • the nucleotide sequence of this expression cassette is represented in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence deduced from the GBSS-thrombin-GFP protein is represented in SEQ ID NO: 2.
  • transgenic plants of N. benthamiana, A. thaliana and potato that express GBSS-thr-GFP were obtained constitutively.
  • plants that express the chimeric protein GBSS-thrombin-GFP accumulate an approximately 96 kDa protein that is recognized by the GFP-specific polyclonal antibody that does not appear in non-transformed plants (Fig. 5) .
  • the transformed plants were subjected to analysis of the subcellular location of the GFP fluorescence by means of a D-Eclipse C1 confocal microscope (NIKON) equipped with an Ar 488 excitation laser, a BA515 / 30 green emission filter, a red emission filter BA650LP and a light detector.
  • NIKON D-Eclipse C1 confocal microscope
  • the supernatant was discarded and the starch-enriched pellet was resuspended in 300 ⁇ of thrombin digestion buffer (20 mM Tris-HCI, pH 8.4, 150 mM NaCI, 2.5 mM CaCI 2 ). 150 ⁇ of this suspension were digested with 0.16 U of thrombin for 12 h at 22 Q C. The remaining 150 ⁇ of the suspension was used as a negative control.
  • the sample was centrifuged at 10,000 g for 10 minutes. The supernatant was subjected to electrophoresis in acrylamide gels SDS-PAGE and immunodetection of GFP by immunoblotting using a primary anti-GFP antibody.
  • GFP identification can be done in any of the following ways: (a) by immunoblots using specific antibodies against GFP and (b) by detection of fluorescence emitted by the GFP protein.
  • N. benthamiana plants were transformed with the GBSS-thr-GFP chimeric construction obtained according to the procedure illustrated in Fig. 7 and in Fig. 8.
  • the starch granules obtained from these leaves after a homogenization step and subsequent centrifugation at Low acceleration were subjected to thrombin digestion to release the GFP protein.
  • An additional step of centrifugation separated the soluble GFP protein from the starch granules, obtaining a supernatant enriched in GFP protein.
  • an immunoblot was performed using a specific anti-GFP antibody. As seen in Fig.
  • the transgenic plants accumulated starch expressing the GFP (in this case, the recombinant protein of interest to be purified) fused to the GBSS of Arabidopsis thaliana as a protein for binding to the starch granule.
  • the protein of interest should be anchored to the starch granule, whose high density allows easy purification of the rest of cellular components after a simple step of tissue homogenization, centrifugation and solubilization of the recombinant protein of interest after an endoprotease digestion treatment.
  • the system is divided into two main phases: (1) obtaining starch granules after homogenization of potato tubers, subsequent filtration of the homogenate through a "cheesecloth” type fabric and centrifugation at 1000g for 5 minutes and (2) release of the GFP after a starch treatment with the corresponding endoprotease (in this case thrombin) and subsequent centrifugation step.
  • a buffer containing 50 mM Tris-CIH (pH 8), 1 mM EDTA, 5 mM DTT and 0.05% Triton was used, in a ratio of 1 ml of buffer per 1 gram of tuber.
  • the expression system based on the use of the 35S promoter used in the constructions with which the transgenic plants were obtained allows levels of GFP accumulation of approximately 6 mg per kg of fresh tuber weight (approximately 60 mg of GFP per kg of starch of potato tuber). Taking into account that 1 kg of fresh weight of potato tuber has approximately 6 g of protein, it is estimated that GFP accounts for approximately 0.1% of the total protein of transgenic tubers.
  • the new method allows the GFP to be purified 600-1000 times, obtaining a minimum of 50-100 ng of GFP simply and quickly highly purified from 1 Kg of transgenic potato tuber (0.5-1 mg of highly purified GFP from 1 Kg of transgenic potato tuber starch).
  • the protease used to release the GFP was biotinylated, so that its elimination from the final preparation is simple.
  • SDS-PAGE and subsequent protein staining show that the GFP preparation obtained after the "release" phase of the starch granule shows a small contamination of a protein (see again Fig. 11).
  • the additional purification step that is considered as a possible optional step of the method could be convenient.
  • one of the main utilities of the method of the invention is its application for the amplification and purification of proteins of interest in the pharmaceutical sector, many of which are currently being prepared by recombinant methods in which the amplification is It produces in microorganisms, especially Escherichia coli.
  • the recombinant polypeptide of interest when intended to be used in the pharmaceutical sector, it must be complete, without lacking any of the amino acids of its characteristic sequence, but without presenting additional amino acids to it. .
  • polypeptides of pharmaceutical interest were the following:
  • KGF human keratinocyte growth factor
  • human IGF-I insulin-like growth factor 1 obtained by recombinant growth techniques in Escher ⁇ chia coli.
  • the sequence is equal to that of human IGF-I, 70 amino acids.
  • the specific sequence can be found at: http://www.drugbank.ca/drugs/DB01277 (GenBank Access No. for cDNA: X57025).
  • - Albumin produced in yeasts from the coding sequence of mature human protein (in humans, it is synthesized as a precursor). It is preferred to use the recombinant form to avoid contamination with hepatitis and HIV when extracted from serum. It is purified in columns (mature sequence: http://www.drugbank.ca/drugs/DB00062; GenBank Access No. for the complete CDS: M12523).
  • Example 2 With the above data regarding the sequence of therapeutic interest and its coding sequence, a procedure analogous to that described in Example 1 was carried out, although using as an intermediate plasmid pGBSS gtw, a plasmid analogous to pGWB2-GBSS gtw, which also contained the coding sequence of the Arabidopsis thaliana GBSS under the control of the 35S promoter.
  • the application of the procedure allowed to generate transgenic potato plants in which a GBSS fusion protein was expressed with the peptide coding sequence of the corresponding interest.
  • the process for obtaining the plasmids necessary for this is outlined in Figs. 12, 13 and 14, where the structure of the intermediate plasmid pGBSS gtw can also be seen.
  • the development of the methodology was carried out, again, with an analogous procedure in which the protein of interest was again the GFP.
  • the process for obtaining the necessary plasmid is schematized in Fig. 15.
  • the system as outlined in Fig. 4, is divided into two main phases: (1) obtaining starch granules after homogenization of the tubers of potato and subsequent filtration of the homogenate through a "cheesecloth” type fabric and centrifugation at 1000 g for 5 minutes and (2) release of the GFP after a starch treatment with the corresponding endoprotease (in this case enterokinase) and subsequent passage of centrifugation
  • a buffer containing 50 mM Tris-CIH (pH 8), 1 mM EDTA, 5 mM DTT and 0.05% Triton was used, in a ratio of 1 ml of buffer per 1 gram of tuber.
  • Floral dip a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16: 735-43.

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Abstract

La invención se refiere a un procedimiento para la producción y purificación de proteínas recombinantes en plantas, mediante la producción de plantas transgénicas que expresan las proteínas recombinantes fusionadas con proteínas asociadas al gránulo de almidón a través de una secuencia reconocida por una proteasa. Este procedimiento permite la purificación de la proteína mediante etapas simples de homogeneización, centrifugación y tratamiento con la proteasa. Así mismo, la invención se refiere a los vectores, hospedadores, células y plantas empleados en dicho procedimiento.

Description

PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
RECOMBINANTES EN PLANTAS
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se engloba dentro del campo de la ingeniería genética y de la biotecnología. Concretamente, la invención se refiere a un procedimiento de obtención de proteínas heterólogas recombinantes purificadas, mediante la producción de plantas transgénicas que expresan las proteínas recombinantes fusionadas con proteínas asociadas al gránulo de almidón a través de una secuencia reconocida por una proteasa. Este procedimiento permite la purificación de la proteína mediante etapas simples de homogeneización, centrifugación y tratamiento con la proteasa. Así mismo, la invención se refiere a los vectores, hospedadores, células y plantas empleados en dicho procedimiento. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La utilización de plantas como biofactorías (molecular farming) se refiere al empleo de plantas para producir compuestos de alto valor añadido que puedan aplicarse a las diferentes industrias, como la farmacéutica, alimenticia, química, etc. Se trata de modificar genéticamente las plantas con el fin de producir el compuesto de interés.
Los sistemas de producción de proteínas recombinantes de interés industrial actualmente emplean bacterias, levaduras y células de mamíferos en cultivo, pero cada uno de estos sistemas presenta sus limitaciones. La utilización de plantas como biofactorías presenta ventajas económicas (costes menores en la producción a gran escala), de seguridad del producto (se evita el riesgo de arrastrar patógenos desde tejidos animales en los procesos de extracción y purificación) y técnicas (en algunos casos las plantas pueden constituir el único sistema capaz de producir eficientemente ciertas proteínas humanas, tales como reguladores del crecimiento e inhibidores del ciclo celular, que tendrían un impacto negativo en los animales transgénicos o en las células animales cultivadas en las que se expresaran) (Giddings 2001 ; Ma et al. 2003; Twyman et al. 2003). Por otro lado, proteínas expresadas en semillas pueden permanecer estables durante años a temperatura ambiente sin perder su actividad (Giddings 2001 ; Ma et al. 2003). Actualmente se están produciendo proteínas de interés terapéutico en una amplia variedad de plantas que incluyen tabaco, cereales, oleaginosas, frutas, hortalizas, forrajeras y algas unicelulares (Twyman et al. 2003; Fischer et al. 2004).
Las proteínas recombinantes expresadas en bacterias son proteínas que no requieren glicosilación para ser activas y generalmente se acumulan en agregados insolubles cuyos costes de purificación y renaturalización no son sostenibles. Cuando las proteínas recombinantes requieren procesos de modificación postraduccionales se utilizan otros sistemas de expresión tales como cultivos celulares de mamíferos que implican un alto costo inicial para su obtención y grandes inversiones adicionales cuando se requiere incrementar la escala de producción. Este problema puede ser solucionado mediante la utilización de plantas como biofactorías, ya que los mecanismos de síntesis y secreción de proteínas y las modificaciones post- traduccionales son los propios de las células eucariotas y permiten la producción y ensamblado de proteínas complejas.
Los objetivos actuales de la industria del "molecular farming" van encaminados a la obtención de nuevos productos y al incremento de la productividad. Ésta última está determinada en gran medida por los procesos de producción y purificación (Twyman et al. 2005).
La mayoría de los costes de producción de una proteína recombinante no recaen en la fase de producción, sino en los procesos posteriores de purificación del producto. Tal como indicaban en su reciente revisión Ward and Swiatek (Ward and Swiatek, 2009), obtener la proteína pura no es sencillo. Incluso en el caso de las proteínas recombinantes producidas en un sistema de expresión, para las cuales se diseñan y optimizan previamente los métodos de producción, relativamente pocas proteínas se pueden purificar hasta una pureza del 99% mediante métodos que consten de una única etapa, siendo necesarias habitualmente una o más etapas adicionales. La mayor parte de los protocolos de purificación comienzan con etapas rápidas, de baja resolución, que permiten un alto grado de recuperación de la proteína de interés y la eliminación de la turbidez, tales como la precipitación diferencial con sulfato de amonio seguida de centrifugación. La purificación fina de la proteína se realiza habitualmente por métodos cromatográficos, siendo bastante popular la cromatografía de afinidad para las proteínas recombinantes. Se trata, sin embargo, de una metodología cara, que requiere varios pasos hasta que se dispone de la proteína purificada. Otras técnicas no cromatográficas, tales como la electroforesis, tienen utilidad práctica como herramientas analíticas en lugar de preparativas, que facilitan la estimación de la pureza de una proteína, pero que no permiten separar cantidades superiores a los microgramos.
Además del coste de los métodos de purificación, y del número de etapas que pueden ser necesarias hasta obtener una proteína con el grado de pureza requerido, otro problema adicional puede ser la integridad de la proteína. Este problema es especialmente importante cuando la proteína se desea obtener para aplicaciones farmacéuticas, donde es necesario que la proteína esté integra y, además, en una conformación estable, en la que manifieste su actividad biológica. La importancia de esta problemática se manifiesta claramente, por ejemplo, cuando se ha intentado concentrar la producción de proteínas recombinantes en ciertos órganos de las plantas o al recurrir a tecnologías de expresión que localicen a las proteínas recombinantes en un orgánulo en particular de la célula que facilite su purificación. Para ello, es habitual recurrir al diseño de las llamadas "proteínas de fusión", cadenas polipeptídicas que consisten en dos o más polipéptidos, unidas en una única proteína. Habitualmente, cada uno de los polipéptidos proviene de un origen diferente y, en cualquier caso, los polipéptidos que componen el polipéptido híbrido o proteína de fusión no se encuentran de forma natural formando un único polipéptido. Para producir proteínas de fusión, las correspondientes secuencias codificantes se insertan en vectores con los que se transforman microorganismos, plantas o animales transgénicos, en los que se sintetizan las proteínas de fusión como si fueran proteínas propias. Posteriormente, las proteínas se purifican a partir de los cultivos de microorganismos o de muestras de tejido de las plantas o animales transgénicos correspondientes.
La concentración de producción de proteínas de fusión en órganos de plantas u orgánulos específicos de sus células, no ha solucionado el problema de la dificultad de la purificación y la necesidad de recurrir a varias etapas, a menudo costosas, hasta obtener el grado de purificación requerido. Así ha sucedido, por ejemplo, con la fusión de proteínas de interés a la oleosina, un tipo de proteína de membrana que forma parte de los cuerpos grasos, que son orgánulos existentes en el citosol de algunas semillas especializadas en acumular grasa (Markley et al. 2006). El método de purificación de proteínas recombinantes unidas a oleosínas está basado en la homogeneización de tejidos y posterior purificación de los cuerpos grasos de plantas transgénicas tras un simple paso de centrifugación del homogeneizado y flotación de los cuerpos grasos. Ello, sin embargo, no impide que muchas proteínas solubles contaminen las preparaciones de cuerpos grasos, dificultando la purificación posterior de proteínas recombinantes unidas a las oleosinas. Además, las oleosinas presentan la problemática específica de tener propiedades alérgenas , por lo que deben ser eliminadas totalmente durante el proceso de purificación, especialmente si la proteína que se desea purificar quiere utilizarse para su administración a seres humanos, todo lo cual complica aún más el proceso de purificación. La síntesis de proteínas fusionadas a oleosinas tampoco es un procedimiento con un alto rendimiento relativo, porque las oleosinas tan sólo se localizan en la superficie de los cuerpos grasos, no en su interior, por lo que la cantidad total de proteína de fusión obtenida respecto al peso total del cuerpo graso no es elevada.
Otras técnicas similares empleadas son la utilización de pequeñas proteínas de carácter hidrofóbico (hidrofobinas) fusionadas a la proteína recombinante que facilitan su purificación (Joensuu et al. 2010), la producción de proteínas recombinantes que contengan secuencias de integración en la membrana plasmática de las células (Schillberg et al. 2000) o la secreción de las proteínas recombinantes al espacio extracelular o apoplasto (Borisjuk et al. 1999). Sin embargo, todas estas técnicas de purificación de proteínas recombinantes presentan problemáticas similares a la descrita anteriormente basada en la utilización de oleosinas recombinantes, especialmente en lo que se refiere a la dificultad de obtener con un alto grado de pureza la proteína deseada.
La solicitud de patente internacional WO 98/14601 describe proteínas de fusión en las que el polipéptido de interés está unido a lo que ellos denominan "región encapsulante en el almidón" (SER: starch-encapsulating región). Esta región permite la asociación con los gránulos de almidón de enzimas implicadas en su metabolismo tales como las almidón sintasas solubles I, II o III (SSI, SSII o SSIII), la almidón sintasa unida al gránulo (GBSS), las enzimas ramificantes I, lia y IIBb o la glucoamilasa. De esta forma, cuando la proteína de fusión se expresa en una planta, queda encapsulada en el gránulo de almidón. La solicitud tiene como propósito principal la obtención de gránulos de almidón modificados, que pueden ser utilizados directamente como tales para enriquecer piensos para animales con ciertos aminoácidos o para proporcionar junto con la alimentación hormonas o fármacos de interés, que quedarán protegidos de la degradación en el estómago por el propio almidón al que van unidos. Con ello, se evita la purificación de la proteína de interés previamente a su administración a un animal. La solicitud también sugiere la posibilidad de purificar la proteína de fusión mediante columnas de afinidad, de forma análoga a lo que se menciona en patentes previas relacionadas con proteínas híbridas capaces de unirse a una matriz de polisacáridos tales como la patente de EE.UU. US 5202247. También se sugiere en el documento WO 98/14601 la posible presencia de una secuencia de escisión entre la región encapsulante en el almidón y el polipéptido de interés, que facilite su separación de la porción restante de la proteína de fusión y su posterior purificación de forma independiente. Además de la escisión mediante proteolisis, se plantea la escisión mediante métodos químicos como el descenso del pH o el uso de cianobromuro. Como método alternativo para la purificación del polipéptido deseado se propone otro método cromatográfico, la cromatografía de intercambio iónico, cuando a la proteína recombínante de fusión se le han añadido colas de poliarginina.
La descripción de WO 98/14601 aporta incluso un esquema de la estructura que debe tener la construcción de DNA para expresar el polipéptido híbrido en el hospedador, en el que el orden de los elementos es el siguiente: Promotor - Intrón (opcional) - Región codificante del péptido de tránsito - Región codificante del polipéptido de interés - SER- Terminador. La inclusión del péptido de tránsito, correctamente, se justifica para conseguir que se produzca la traslocacion de la proteína a orgánulos tales como los plastidios, manifestando preferencia por los amiloplastos. Sin embargo, tal y como se comentará posteriormente, esta estructura conllevas problemas a la hora de purificar el polipéptido de interés unido al gránulo de almidón, que también se ponen de manifiesto si se analiza la solicitud internacional WO 00/77165.
La solicitud internacional WO 00/77165 sí se refiere específicamente a la expresión de proteínas de fusión en plantas, en las que la proteína de fusión posee SBD (starch-binding domain: dominio de unión al almidón). En dicha solicitud internacional se considera como SBD tanto las regiones de encapsulación en el almidón a las que se hace referencia en la solicitud internacional WO 98/14601 como los dominios de unión al almidón que poseen algunas enzimas amilolíticas expresadas por microorganismos. Sin embargo, se expresa preferencia por que la proteína de interés unida al SBD sea una enzima que pueda interaccionar con el almidón, de manera que se obtenga almidón modificado en sus propiedades, no sólo por la simple presencia de la proteína exógena, sino por la actividad de la misma. Ni siquiera se requiere que la proteína unida al SBD esté completa, aunque se manifiesta preferencia por que el fragmento elegido dé lugar a una proteína de fusión que mantenga la actividad biológica de la proteína de interés. Aún así, se sugiere la posibilidad de utilizar el método para producir proteínas en cantidades comerciales, aislándola con el gránulo del almidón, o separándola de la proteína de fusión, aprovechando la presencia de un sitio de escisión. Para la purificación en forma de proteína de fusión, se menciona que el uso de los SBD ofrece la posibilidad de utilizarlos como colas de afinidad con las cuales facilitar la purificación de las proteínas unidas a tales SBD mediante cromatografía de afinidad a través de columnas de almidón, que parece ser el método de purificación preferido, pues se hace referencia al mismo en varias ocasiones. Por tanto, se puede considerar que el sistema de purificación de proteínas sugerido en la solicitud WO 00/77165, al igual que sucedía en la WO 98/14601 , consistiría en: (a) la producción de proteínas recombinantes unidas a un "starch binding domain" (SBD) en bacterias, células vegetales o animales, (b) extracción mediante ruptura/homogeneización/molienda de la célula/tejido/órgano y (c) purificación de la proteína mediante cromatografía de afinidad en una columna de almidón a la que, específicamente, se unirán las proteínas recombinantes poseedoras de un SBD. La posterior liberación de la proteína del almidón puede tener lugar mediante la adición de una endoproteasa que específicamente reconozca una secuencia aminoacídica existente entre el SBD y la proteína de interés. La purificación de la proteína recombinante depende de la utilización de un sistema muy conocido en el momento en que se depositó WO 98/14601 , la cromatografía de afinidad a través de columnas de almidón.
La mayoría de las proteínas de los cloroplastos se sintetizan en forma de precursores en el citosol. Estos precursores contienen unas señales escindibles en el extremo amino denominadas péptidos de tránsito, que los dirigen a los cloroplastos. La traslocación de las proteínas precursoras a través de la membrana del cloroplasto se logra mediante la acción combinada de los traslocones Toe (en la membrana exterior) y Tic en la membrana interior de los cloroplastos), constituyendo el sistema toe-tic (Jarvis and Solí, 2002). El sistema toe-tic de procesamiento de proteínas plastidiales no es absolutamente exacto. Se basa en el reconocimiento de dominios hidrofóbicos, no siendo predecible que efectúen el corte para escindir el péptido de tránsito en un punto exacto. Así, los programas de predicción de la localización subcelular y del lugar de procesamiento de una proteína unida a un péptido de tránsito suelen tener bastantes problemas a la hora de pronosticar (a) la localización subcelular exacta de la proteína y (b) el lugar de corte/procesamiento del péptido de tránsito (Bahaji et al. 2011). Es muy difícil encontrar una secuencia que actúe de péptido de tránsito al plastidio que, tras ser eliminada, permita que la proteína incorporada al amiloplasto entre completa y exactamente con la secuencia que se desee en su extremo N- terminal. Es más, no existe una secuencia aminoacídica "modelo" que, fusionada a cualquier proteína, garantice el transporte de la proteína al plastidio de manera íntegra. Por tanto, es altísimamente probable que, tras ser procesada la proteína híbrida por el sistema toe-tic existente en la membrana del plastidio, la proteína de interés incorporada tenga en su extremo N-terminal un "resto" o vestigio del extremo C-terminal del péptido de tránsito. Esto supone un problema para la aplicación práctica de los métodos de las solicitudes WO98/14601 y WO 00/77165, cuando se pretenden utilizar para purificar la proteína de interés si, como se indica en dichas solicitudes, el dominio de unión al almidón se coloca en el extremo carboxilo de la proteína de fusión. Tal como se representa en la Fig. 1 , cuando la proteína de fusión penetre en el plastidio con el dominio de unión al almidón (representado en este caso por un SER, un dominio de encapsulación el almidón), es altamente probable que el péptido de tránsito se haya escindido de manera que el polipéptido de interés (representada en este caso por la GFP) presente parte de los aminoácidos del péptido de tránsito, o carezca de algunos de los aminoácidos de su extremo amino, defecto que permanecerá una vez que se purifique la proteína de fusión y se proceda a la escisión final, separándola de la parte que contenga el dominio de unión al almidón. Si la proteína quiere utilizarse en el sector farmacéutico, (donde no se admiten modificaciones en las secuencias aminoacídicas de péptidos terapéuticos, como se ha explicado anteriormente), esto sería inaceptable y la proteína sería rechazada para su utilización en ese ámbito.
Este no es el único problema de la solicitud WO 98/14601. Además de no presentar ningún ejemplo concreto de producción de proteínas de fusión en plantas y bacterias y posterior purificación de la proteína de interés, la descripción presenta otros pasajes que hacen dudar de la utilidad que un experto en la técnica concedería a sus enseñanzas como información fiable y que capacite a un experto para desarrollar y llevar a cabo, basándose en el contenido de dicha solicitud, un método de purificación de proteínas a partir de polipéptidos de fusión expresados en plantas y asociados al almidón. En dicha solicitud WO 98/14601 se comenta que el polipéptido híbrido (producido en plantas o bacterias) puede incluir modificaciones postraduccionales conocidas en la técnica tales como glicosilación, acilación, y otras modificaciones que sean necesarias para la actividad del polipéptido. Esta declaración es difícil de compatibilizar con la propuesta/idea de producir plantas destinadas a la purificación de proteínas recombinantes tras liberarlas del gránulo de "almidón transgénico" ya que la glicosilación (particularmente la N-glicosilación) tiene lugar en sistema retículo endoplásmico/sistema de Golgi. Las proteínas glicosiladas son secretadas o bien permanecen en membranas (membrana plasmática, tonoplasto, etc) u orgánulos de la ruta secretora. En el momento de la solicitud de WO 98/14601 no se sabía sobre la existencia de proteínas plastidiales glicosiladas. Y, aunque muy posteriormente, Villarejo et al. (2005), Nanjo et al. (2006) y Kitajima et al. (2009) demostraron la existencia de una ruta secretora de proteínas N-glicosiladas entre el RE/Golgi y el compartimento plastidial, hasta el momento no se ha logrado producir plantas transgénicas que acumulen en sus plastidios proteínas de interés glicosiladas. Además, esta declaración es incompatible con la propuesta de producir proteínas glicosiladas en bacterias ya que, como es bien sabido, las bacterias no glicosilan las proteínas.
En resumen, existe una necesidad de encontrar métodos alternativos de purificación de proteínas que formen parte de proteínas de fusión que sean sencillos de realizar, que requieran un número reducido de etapas hasta llegar hasta una proteína con un alto grado de pureza (especialmente en el caso de las proteínas que vayan a utilizarse en el sector farmacéutico) y que, preferiblemente, resulten más económicos que los métodos cromatográficos a los que en la actualidad se recurre mayoritariamente, especialmente la cromatografía de afinidad. La expresión de las correspondientes proteínas de fusión asociadas a orgánulos concretos no ha solucionado este problema y en algunos casos, como en el de la asociación a oleosinas, presenta problemas adicionales como la potencial alergenicidad. Las metodologías relacionadas en las que proteínas de fusión se han dirigido al gránulo de almidón tampoco presentan alternativas de purificación reales y efectivas que sustituyan a las columnas de afinidad y, además, dejan pendientes algunos problemas sin resolver para la aplicación en campos concretos, como puede ser el diseño de sistemas que garanticen la obtención de la proteína de interés de forma íntegra, que posibilite su utilización en el sector farmacéutico. La resolución de estos problemas es importante para plantearse el "molecular farming" como un negocio rentable.
La presente invención presenta una solución estos problemas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención resuelve el problema de purificar a gran escala proteínas recombinantes mediante un sistema sencillo y de bajo coste, apto para ser utilizado para purificar proteínas de interés a partir de polipéptidos de fusión expresados en plantas y, en caso de ser necesario, haciendo posible obtener la proteína íntegra, sin pérdidas de aminoácidos o fragmentos adicionales en algún extremo. La solución planteada consiste en un procedimiento basado en la purificación de las proteínas de fusión a partir de plantas transgénicas que expresan ectópicamente la proteína recombinante (el polipéptido de interés industrial/comercial) fusionada con un fragmento polipeptídico que presenta un dominio de unión al almidón. La proteína de fusión presenta varias particularidades importantes:
a) el fragmento polipeptídico que presenta el dominio de unión al almidón se encuentra unido a la proteína de interés por medio de un fragmento que presenta una secuencia de corte de una proteasa, lo cual facilita la separación de ambos;
b) la proteína de interés se encuentra en la región del extremo carboxilo de la proteína de fusión, estando el fragmento polipeptídico que presenta el dominio de unión al almidón en la región del extremo amino; el fragmento que presenta la secuencia de corte de una proteasa enlaza, por tanto, el extremo carboxilo del fragmento polipeptídico que presenta el dominio de unión al almidón con el extremo amino del polipéptido de interés;
c) el fragmento polipeptídico que presenta el dominio de unión al almidón puede comprender:
i) bien una proteína de plantas (p.ej. GBSS) elegida del grupo que se conoce que se asocian al gránulo de almidón (proteína que, por tanto, no sólo presentará de forma natural un dominio de unión al almidón sino que, además, en su forma precursora sintetizada en el citosol, contará con un péptido de tránsito propio que la dirigirá al plastidio, donde se asociará al almidón), o
ii) un dominio de unión al almidón de amilasas bacterianas, que irá precedido por un péptido de tránsito de alguna proteína de plantas que se asocie al gránulo de almidón que permitirá que la forma sintetizada en el citosol llegue al plastidio, donde se asociará al almidón.
Con esta estrategia, el procedimiento de purificación parte de plantas transgénicas que expresan ectópicamente proteínas fusionadas con proteínas unidas al gránulo de almidón (p.ej.: GBSS) a través de una secuencia reconocida por una proteasa. Así, la proteína de interés, junto con el resto de la proteína de fusión, estará anclada al gránulo de almidón. La elevada densidad de los gránulos de almidón permite una fácil purificación del resto de componentes celulares tras un simple paso de homogeneización del tejido y centrifugación. El posterior tratamiento con proteasa permite liberar la proteína de interés, que puede obtenerse pura simplemente tras una nueva centrifugación y eliminación de la proteasa. Por tanto, el nuevo método propone la solubilización de la proteína de interés unida a una estructura no soluble, fácilmente separable de las proteínas solubles del medio, método que es mucho más eficiente que los métodos empleados hasta la fecha, ya que se basa en un simple paso de precipitación. El método permite, además, abaratar costes con respecto a las metodologías actualmente más utilizadas, mayoritariamente basadas en métodos cromatográficos, especialmente las basadas en la purificación mediante cromatografía de afinidad. Además, colocando el dominio de unión al almidón en la región del extremo amino de la proteína de fusión, precedido por el péptido de tránsito, mientras que el polipéptido / proteína de interés queda en el extremo carboxilo, se garantiza que la proteína de interés no haya sufrido escisiones de aminoácidos durante la traslocación al plastidio, siendo mayor la probabilidad de que su secuencia de aminoácidos se encuentre íntegra, formando parte de la proteína de fusión unida al gránulo de almidón, cuando se comienza el proceso de purificación a partir de la planta transgénica o extracto de la misma. Esto se esquematiza en la Fig. 2 (donde el dominio de unión al almidón y el péptido de tránsito forman parte de forma natural de una proteína de plantas que se une al almidón, la GBSS) así, como en la Fig. 3, correspondiente a una realización en la que el dominio de unión al almidón es el de una amilasa bacteriana, realización en la que la proteína de fusión se sintetiza inicialmente en forma de proteína precursora que presenta un péptido de tránsito que dirige la proteína de fusión al plastidio y, con ello, al gránulo de almidón. En cualquiera de las realizaciones, la elección cuidadosa del fragmento que contiene el sitio de reconocimiento de la proteasa permitirá obtener finalmente la proteína de interés no sólo íntegra, sino carente de aminoácidos adicionales, lo que posibilitará su uso en sectores tan exigentes como el sector farmacéutico.
Dentro del alcance del procedimiento de la invención están las realizaciones que comprenden las etapas previas en las que se obtiene y cultiva la planta transgénica que expresa la proteína de fusión que contiene el polipéptido de interés. La invención se refiere también al vector a partir del cual se puede obtener una planta transgénica adecuada para llevar a cabo el procedimiento de la invención, a un organismo hospedador que contenga dicho vector, así como las células vegetales transformadas con el vector y las plantas transgénicas obtenidas a partir de las mismas.
Consecuentemente, un primer aspecto de la invención se refiere a un procedimiento de obtención de proteínas recombinantes purificadas a partir de una planta transgénica o células en cultivo transgénicas, que comprende las siguientes etapas:
a) homogeneizar las células en cultivo o un tejido de la planta que acumule almidón al que esté asociado una proteína de fusión caracterizada por que comprende:
i) en la región del extremo carboxilo, el polipéptido correspondiente a la proteína recombinante a purificar,
ii) en la región del extremo amino, un dominio de unión al almidón, iii) un fragmento enlazador que contiene el sitio de corte de una proteasa, fragmento enlazador que está situado entre la región del extremo amino y la región del extremo carboxilo;
b) centrifugar y seleccionar la fracción de densidad más elevada, que contiene las proteínas del gránulo de almidón;
c) tratar la fracción seleccionada en la etapa b) con la proteasa que reconoce el sitio de corte comprendido en el fragmento enlazador;
d) centrifugar y seleccionar el sobrenadante;
e) opcionalmente, purificar en mayor grado la proteína recombinante contenida en el sobrenadante.
En caso de realizarse, la etapa de purificación adicional se realizará por cualquier método conocido por el experto en la técnica, tal como cualquier técnica de separación por tamaños, inmunoabsorción, intercambio iónico o detección de fluorescencia.
Tal como se ha comentado, una realización del método de la invención, incluido en el alcance de la misma, es aquélla que comprende las etapas mediante las cuales se obtiene y cultiva la planta transgénica. Por tanto, en una posible realización, el procedimiento de la invención comprende las etapas previas de:
a) i) obtener una planta transgénica mediante transformación de una planta silvestre con un vector de expresión que comprende un promotor de expresión en plantas, operativamente unido a una secuencia codificante que comprende, en dirección 5'-3\ un péptido que dirige la transición del citosol a plastidios, un dominio de unión al almidón, un sitio de corte de una proteasa, y el polipéptido correspondiente a la proteína recombinante a purificar;
a) ii) cultivar la planta transgénica obtenida en la etapa anterior en condiciones apropiadas para su crecimiento. Tal como se comentó previamente, son realizaciones posibles de la invención aquellas en las que el dominio de unión al almidón es un dominio de unión de una amilasa bacteriana, así como aquellas en las que el dominio de unión pertenece a una proteína vegetal, generalmente una enzima, que se une de forma natural al almidón. En este segundo caso, se prefiere que la proteína de fusión comprenda la secuencia polipeptídica completa de dicha proteína vegetal y que se sintetice en el citosol en forma de un precursor que comprenda la secuencia completa de aminoácidos de la forma precursora de dicha proteína vegetal, es decir, un precursor que comprenda el péptido de tránsito natural de dicha proteína, por lo que la secuencia codificante de la proteína de fusión no necesitará ningún péptido de tránsito adicional al que es propio de dicha proteína.
En el caso de que el dominio de unión al almidón pertenezca a una amilasa bacteriana, dicho dominio puede elegirse entre cualquiera de los SBDs conocidos, como por ejemplo los que se encuentran en la Figura 1 del artículo de Janecek and Sevcik (Janacek and Sevcik, 1999). Pueden seleccionarse como secuencias mínimas, por ejemplo, las que se citan en la Figura 1 de la solicitud WO 00/77165, es decir, los que tienen las secuencias representadas por SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:6. En ese caso, sí es necesario que la secuencia codificante de la proteína de fusión contenga, en 5' respecto a la secuencia codificante del SBD, el fragmento codificante de un péptido de tránsito.
Como se ha comentado, la invención se refiere también al vector mediante el cual se obtienen las plantas transgénicas, así como al hospedador transformado con el mismo, a los vectores intermedios que permitan la obtención del vector de transformación de plantas y los hospedadores transformados con ellos.
Así, un aspecto de la invención se refiere a un vector para uso en el procedimiento de la presente invención que comprende, en sentido 5'-3', un promotor que permite la expresión en plantas, al que está operativamente unida la secuencia codificante de una proteína de fusión que comprende, en el sentido amino a carboxilo, un péptido de tránsito del citosol al plastidio, un dominio de unión al almidón, un fragmento enlazador que contiene el sitio de corte de una proteasa y el polipéptido correspondiente a la proteína recombinante a purificar siguiendo el procedimiento de la invención. Preferiblemente, dicho vector es un plásmido.
Igualmente, otro aspecto de la invención es un organismo transformado con el vector anterior. Preferiblemente, el organismo es la bacteria Agrobacterium tumefaciens. Otro aspecto más es una célula vegetal transformada con el organismo hospedador anterior. Igualmente, un aspecto más de la invención es una planta transgénica sus semillas o material de propagación, obtenida a partir del vector anterior y/o cuyas células están transformadas con dicho organismo.
Finalmente, es también un aspecto de la invención los plásmidos intermedios a partir de los cuales se puede obtener el vector de transformación, pues serán los plásmidos que permitirán que el procedimiento de la invención pueda aplicarse para la amplificación y purificación de muy distintas proteínas. En particular, en los ejemplos de la presente invención, se recurrió a la tecnología Gateway® de Invitrogen, que evita el uso de digestiones con endonucleasas y ligaciones, sustityéndolas por sucesivos eventos de recombinación en presencia de recombinasas que reconocen parejas de sitios de recombinación complementarios, tal como se describe en el protocolo de Gateway® Technology: (http://www.invitroaen.com/site/us/en/home/Products-and- Services/Applicat¡ons/Clonina/Gatewav-Clonina/GatewavC-Misc/Protocols.html#bp).
En el procedimiento de la invención, se utilizó la GBSS como ejemplo de proteína unida al gránulo de almidón. Para obtener el vector de transformación, se empleó un vector intermedio, que permite fusionar con GBSS la secuencia codificadora de cualquier proteína de interés mediante la tecnología GATEWAY®. Por tanto, un aspecto adicional de la invención describe un vector diseñado específicamente para su uso en el procedimiento de la invención, que comprende, en sentido 5'-3-, un promotor, una secuencia que codifica la GBSS y una secuencia nucleotídica flanqueada por secuencias attR1 y attR2, el cual permite clonar aguas abajo de GBSS cualquier secuencia nucleotídica flanqueada por secuencias attl_1 y attl_2.
La invención se refiere así mismo a un organismo hospedador que alberga el vector anteriormente descrito, concretamente E. coli.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1 : Esquema de la síntesis en el citosol, traslocación al plastidio (estroma), unión al almidón, liberación del gránulo de almidón y purificación de un polipéptido recombinante sintetizado como parte de una proteína de fusión en la que la región de encapsulación en el almidón (SER: starch encapsulating domain) está situado en el fragmento carboxilo de la proteína de fusión, mientras que el polipéptido de interés (representado aquí por la proteína verde fluorescente, GFP) está situado en la zona amino, a continuación del péptido de tránsito (TP). GFP y SER están separadas por una secuencia aminoacídica enlazante específicamente reconocida por una endoproteasa. La traslocación al estroma mediante el sistema toe-tic implica la escisión de un número indeterminado de aminoácidos (modificación representada mediante el extremo de flecha irregular) que pueden dar lugar a que la proteína GFP pierda parte de sus aminoácidos del extremo amino o que mantenga una porción del péptido de tránsito, modificación que se mantiene una vez liberado y purificado el polipéptido.
Fig. 2. Esquema de la síntesis en el citosol, traslocación al plastidio (estroma), unión al almidón, liberación del gránulo de almidón y purificación de un polipéptido recombinante sintetizado como parte de una proteína de fusión en la que el polipéptido de interés (representado aquí por la proteína verde fluorescente, GFP) está situado en la región carboxilo de la proteína de fusión, mientras que en la zona amino se sitúa una proteína vegetal que posee un dominio de unión al almidón (representada aquí por la GBSS: almidón sintasa unida al gránulo) que posee, en su forma precursora, su propio péptido de tránstio (TP). La traslocación al estroma mediante el sistema toe-tic no afecta a la proteína GFP, que se recupera intacta una vez realizada la digestión con la endoproteasa (en este caso, enteroquinasa) y purificado el polipéptido.
Fig. 3: Esquema de la síntesis en el citosol, traslocación al plastidio (estroma), unión al almidón, liberación del gránulo de almidón y purificación de un polipéptido recombinante sintetizado como parte de una proteína de fusión en la que está presente un dominio de unión al almidón (SBD: starch binding domain) de origen bacteriano que está situado en el fragmento amino de la proteína de fusión, precedido por el péptido de tránsito (TP), mientras que el polipéptido de interés (representado aquí por la proteína verde fluorescente, GFP) está situado en la zona carboxilo. La traslocación al estroma mediante el sistema toe-tic puede afectar al SBD, aunque no debería extenderse hasta la GFP que, de nuevo, se recuperaría intacta una vez realizada la digestión con la endoproteasa (en este caso, enteroquinasa) y purificado el polipéptido correspondiente a la GFP.
Fig. 4: Etapas para la obtención de un polipéptido de interés (proteína recombinante siguiendo el método de la presente invención a partir de tubérculos de patata que expresan la proteína de interés unida a la GBSS: homogeneización de los tubérculos, filtrado, lavados y centrifugación, obtención de los gránulos de almidón puro, digestión con la proteasa correspondiente, nueva centrifugación y separación de W
15 la proteína de interés en el sobrenadante, mientras los granulos de almidón quedan en el pellet.
Fig. 5: Detección mediante inmunotransferencia anti-GFP de la proteína GBSS-trombina-GFP en plantas transgénicas de N. benthamiana que expresan GBSS-thr-GFP.
Fig. 6: Localización subcelular de GBSS-trombina-GFP. Las fotografías muestran la fluorescencia en células de plantas de Arabidopsis que expresan GBSS- thr-GFP, que han sido sometidas a análisis mediante un microscopio confocal D- Eclipse C1 (NIKON) equipado con un láser con excitación Ar 488, un filtro para emisión verde BA515/30 y un filtro para emisión roja BA650LP. En las fotografías puede observarse que la fluorescencia verde emitida por GBSS-trombina-GFP está asociada a los gránulos de almidón, confirmando así la unión de la GFP a la proteína GBSS. La fluorescencia roja es emitida por la clorofila existente en los plastidios.
Fig. 7: Etapas para la construcción del plásmido pGWB2-GBSS gtw, que permite la introducción de la secuencia codificante de cualquier proteína de interés unida a la de la GBSS. Fig. 7A: generación mediante tecnología GATEWAY de la construcción pGWB2-GBSS, que contiene el gen GBSS bajo el control del promotor 35S. Fig. 7B: generación del plásmido pGWB2-GBSS gtw, que incorpora el cásete de recombinación GATEWAY.
Fig. 8: Etapas para la construcción del plásmido pGWB2-GBSS-Thr-GFP, necesario para la producción de plantas vía A. tumefaciens que expresen ectópicamente la GFP unida a la GBSS a través de una secuencia de aminoácidos reconocida por una endoproteasa, en este caso la trombina. Introducción de la secuencia Thr-GFP, mediante tecnología GATEWAY, en el vector pGWB2-GBSS gtw de la Fig. 7.
Fig. 9: Análisis mediante inmunotransferencia de la proteína GFP usando anticuerpos anti-GFP. Los gránulos de almidón purificados de plantas transgénicas que expresan GBSS-Thr-GFP fueron sometidos a tratamiento con o sin la proteasa trombina. Tras ello fueron sometidos a un paso de centrifugación a .000 g durante 10 minutos. De izquierda a derecha: gránulos de almidón y sobrenadantes obtenidos tras centrifugación de gránulos de almidón no tratados y tratados con trombina, respectivamente.
Fig. 10: Fotografías de microscopía confocal de gránulos de almidón de tubérculos de patata que expresan una proteína de fusión con GBSS- secuencia de reconocimiento de trombina - GFP. La fotografía inferior muestra fluorescencia verde en todos los gránulos y en toda la superficie de los mismos, indicando la presencia de la GFP en forma activa.
Fig. 11 : Comprobación de la pureza y concentración de la GFP aislada de gránulos de almidón que expresaban la proteína de fusión entre la GBSS y la GFP. Fig. 11 A: Electroforesis en gel SDS-PAGE (poliacrilamida con SDS) y tinción con Coomasie Blue. Fig. 11 B: Fotografía tras Western blot. Calles: (1 ): extracto proteico de tubérculo de patata que expresaba GFP unida a la GBSS mediante un fragmento enlazador con la secuencia de reconocimiento de la trombina. (2) extracto proteico de almidón purificado de la misma planta. (3) proteína liberada del almidón tras digestión con trombina y centrifugación. Se indican con flechas las posiciones correspondientes a la proteína de fusión GBSS-GFP y la GFP libre.
Fig. 12: Etapas para la construcción, mediante tecnología GATEWAY, del plásmido pGBSS-Entk-Palifermin, que permite la generación de plantas transgénicas que expresen una proteína de fusión en la que la secuencia codificante de la palifermina está unida a la GBSSI mediante un fragmento enlazador con la secuencia de reconocimiento de la enteroquinasa. Se genera un producto de PCR correspondiente a la secuencia codificante de la palifermina asociada a la secuencia codificante de reconocimiento de la enteroquinasa, quedando todo el fragmento flanqueado por secuencias attB1 y attB2. El fragmento se inserta en el plásmido pDONR/Zeo mediante una reacción de recombinación en presencia de la correspondiente recombinasa, dando lugar al plásmido pDONR Entk-Palifermin. Una nueva reacción de recombinación con un plásmido que posea la secuencia codificante de la GBSS seguida de un cásete de recombinación GATEWAY (en este caso el plásmido utilizado es pGBSS gtw) unida operativamente al promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor, permite crear un plásmido (pGBSS-Entk-Palifermin) con la secuencia codificante de la proteína de fusión GBSS-palifermina, separadas por la secuencia de reconocimiento de la enteroquinasa, estando toda la secuencia codificante bajo el control del promotor 35S.
Fig. 13: Etapas para la construcción, mediante tecnología GATEWAY, del plásmido pGBSS-Entk-Mecasermin, que permite la generación de plantas transgénicas que expresen una proteína de fusión en la que la mecasermina está unida a la GBSS mediante un fragmento enlazador con la secuencia de reconocimiento de la enteroquinasa, siguiendo un procedimiento análogo al de la Fig. 12. Fig. 14. Etapas para la construcción, mediante tecnología GATEWAY, del plásmido pGBSSI-Entk-Albumin, que permite la generación de plantas transgénicas que expresen una proteína de fusión en la que la albúmina madura está unida a la GBSSI mediante un fragmento enlazador con la secuencia de reconocimiento de la enteroquinasa, siguiendo un procedimiento análogo al de la Fig. 12.
Fig. 15: Etapas para la construcción, mediante tecnología GATEWAY, del plásmido pGBSS-Entk-GFP, que permite la generación de plantas transgénicas que expresen una proteína de fusión en la que la GFP está unida a la GBSS mediante un fragmento enlazador con la secuencia de reconocimiento de la enteroquinasa, siguiendo un procedimiento análogo al de la Fig. 12.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Tal como se ha comentado previamente, la presente invención proporciona una alternativa para la purificación a gran escala proteínas recombinantes producidas en plantas transgénicas o cultivo de plantas transgénicas que expresan la proteína recombinante que se quiere purificar.
El nuevo método de purificación de proteínas está basado en la producción de plantas o células acumuladoras de almidón que expresen proteínas de interés fusionadas con proteínas con motivos de unión al gránulo de almidón tales como la GBSS (Granule Bound Starch Synthase: almidón sintasa unida al gránulo), o con dominios de unión al almidón de enzimas bacterianas, a través de un fragmento enlazador que contiene una secuencia específicamente reconocida por endoproteasas tales como la trombina o la enteroquinasa. De este modo la proteína de interés queda anclada al gránulo de almidón, cuya elevada densidad permite una fácil purificación del resto de componentes celulares tras un simple paso de homogeneización del tejido, centrifugación y solubilización de la proteína recombinante de interés tras un tratamiento de digestión con endoproteasa. El método se ejemplifica en la Fig. 4. Como se puede ver, se trata de un método sencillo, más económico que los métodos cromatográficos que habitualmente se emplean para la purificación de proteínas recombinantes (especialmente las proteínas de fusión), particularmente si se compara con las columnas de afinidad que se utilizan con frecuencia. El tiempo, además, es inferior a un día: en el caso concreto del Ejemplo 3 que se presenta más adelante, 12 horas fueron suficientes para la obtención de 1 mg de GFP (ejemplo, en este caso, de proteína recombinante de interés a purificar) altamente purificada a partir de 10 kg de tubérculos de patata.
El hecho de que la proteína de fusión se aisle inicialmente unida al gránulo de almidón tiene la ventaja adicional de evitar los riesgos que suponía la asociación con, por ejemplo, oleosinas, que a menudo presentaban contaminaciones con posible efecto alérgeno. Por tanto, la asociación al gránulo de almidón es una ventaja adicional para la purificación de proteínas que se deseen utilizar para ser suministradas a seres humanos.
Este método se ha puesto a punto utilizando plantas de patata que expresan la proteína verde fluorescente (GFP: green fluorescent protein) fusionada al extremo carboxilo terminal de la GBSS a través de una secuencia aminoacídica específicamente reconocida por una endoproteasa. Es muy importante, como se comentó previamente, que el polipéptido de interés a purificar se una al extremo carboxilo terminal del fragmento de la proteína de fusión que comprenda el dominio de unión al almidón porque, de lo contrario, como se esquematiza en la Fig. 1 , la actuación del sistema toc-tic de traslocacion del citosol al plastidio podría dar lugar a que el polipéptido de interés se obtuviera al final con ausencia de parte de su secuencia, o con aminoácidos adicionales. Al no estar la secuencia íntegra, el polipéptido no podría utilizarse como tal en aplicaciones farmacéuticas o de otro tipo en el que se exija la integridad de la secuencia aminoacídica de la proteína de interés. Esta condición con respecto a la organización de los elementos en la proteína de fusión supone una diferencia importante con respecto a los sistemas sugeridos en las solicitudes WO 98/14601 y WO 00/77165, especialmente la primera, donde el elemento de unión al gránulo se situaba preferentemente en la región del extremo carboxilo. Esta condición con respecto a la organización de los elementos en la proteína de fusión posibilita además que el método pueda utilizarse de forma real para la purificación de proteínas, teniendo garantías de que las mismas van a aislarse finalmente no sólo de forma íntegra, sino pudiendo prever si el polipéptido final purificado puede o no contener algún aminoácido adicional en alguno de sus extremos.
Tal como puede verse en los Ejemplos 2 y 3, el almidón puro recombinante, tratado con la endoproteasa adecuada, libera GFP altamente purificada. Por lo tanto, el principal reto de este método de producción y purificación de proteína recombinante reside en la obtención de almidón puro. Es importante señalar también, tal y como se muestra en la Fig. 6 y la Fig. 10, que la GFP permanece activa en el gránulo de almidón que lleva unida la proteína de fusión, por lo que este nuevo método permite producir y purificar proteínas correctamente plegadas y ensambladas a partir de almidón obtenido de órganos de reserva.
El sistema utilizado en los Ejemplos que se presentan en la siguiente solicitud, basados en la utilización del promotor 35S, permite niveles de acumulación de GFP de aproximadamente 6 mg por Kg de peso fresco de tubérculo (aproximadamente 60 mg de GFP por Kg de almidón de tubérculo de patata). Como se puede comprobar en el Ejemplo 3, en un solo paso, el nuevo método permite purificar 600-1000 veces la GFP obteniendo de manera simple y rápida un mínimo de 50-100 ng de GFP altamente purificada a partir de 1 Kg de tubérculo de patata transgénica. Se trata, por tanto, de un método eficaz, rápido y simple, que supone una alternativa interesante a las costosas metodologías actualmente utilizadas.
Tal como se comenta en el Ejemplo 3, el sistema de expresión basado en la utilización del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) permite niveles de acumulación de GFP de aproximadamente 6 mg por Kg de fresco de tubérculo. Se estima que la GFP supone aproximadamente un 0,1% de la proteína total de los tubérculos transgénicos. El sistema puede optimizarse con realizaciones incluidas dentro del alcance de la invención, en la que se utilicen promotores más fuertes, que permitan incrementar los niveles de acumulación del polipéptido de interés.
Otra posible realización del procedimiento de la invención interesante para dar lugar a un aumento del rendimiento de la proteína purificada finalmente obtenida es la aplicación de una etapa adicional, previa a la digestión de los gránulos de almidón con la endoproteasa, etapa en la que se apliquen tratamientos que rompan o digieran el gránulo de almidón, de modo que las endoproteasas tengan acceso a la mayor parte de la proteína recombinante de interés unida al gránulo y no sólo a la existente en la superficie del gránulo de almidón. Se trata de una realización particularmente interesante porque, de los aproximadamente 6 mg de GFP existente en 1 kg de tubérculo, tan sólo un 1% (50-100 ng de GFP concretamente) son extraídos mediante un simple tratamiento de digestión del gránulo de almidón nativo e intacto. Una posibilidad es el uso de digestión enzimática, por ejemplo mediante amílasas, aunque también pueden utilizarse tratamientos físicos de ruptura que disgreguen los gránulos de almidón, como fragmentación o trituración. Son diversas las variaciones que pueden realizarse en el procedimiento de la invención, sin modificar sus elementos básicos estando todas incluidas, por tanto, dentro del alcance de la invención.
Por una parte, como ya se comentó, puede utilizarse como dominio de unión al almidón el de una enzima bacteriana que posea tal dominio, a los que se suele aludir de forma abreviada como SBD. Como anteriormente se ha comentado, existe abundante literatura en la que encontrar ejemplos de SBDs bacterianos. En las realizaciones que incluyan SBDs de origen bacteriano, es importante tener en cuenta que, la traslocación al plastidio de la proteína de fusión requerirá la presencia, en la proteína de fusión precursora sintetizada en el citosol, de un péptido de tránsito. Por tanto, el vector de expresión con el que se prepare la planta transgénica deberá contar, como parte de la secuencia codificante de la proteína de fusión, con la parte codificante correspondiente a un péptido de tránsito adecuado. Puede utilizarse, por ejemplo, el péptido de tránsito cuya secuencia está representada por SEQ ID NO:8, utilizando como posible secuencia codificante del mismo la secuencia representada por SEQ ID NO:7. Se trata de un péptido utilizado en anteriores ocasiones por el grupo de los presentes inventores, cuya utilidad se ha comprobado para enviar al plastidio proteínas tales como la proteína verde fluorescente (GFP) (Bahaji et al., 2011a) o proteínas bacterianas tales como la GlgC (Bahaji et al., 2011 b). Se trata del péptido de tránsito que, en la naturaleza, permite que la proteína P541 se incorpore dentro del cromoplasto de pimiento (Houlné et al., 1994).
En el caso de que el dominio de unión al almidón pertenezca a una proteína vegetal, se prefiere que la proteína de fusión comprenda la secuencia polipeptídica completa de dicha proteína vegetal y que se sintetice en el citosol en forma de un precursor que comprenda la secuencia completa de aminoácidos de la forma precursora de dicha proteína vegetal, es decir, un precursor que comprenda el péptido de tránsito natural de dicha proteína. De esta manera, la secuencia codificante de la proteína de fusión comprenderá la secuencia codificante natural completa de la proteína vegetal de unión al almidón seleccionada, secuencia codificante que incluirá su péptido precursor natural, no siendo necesario un péptido de tránsito adicional previo al de dicha proteína.
Aunque no es imprescindible para los propósitos de la invención, la presencia de la secuencia natural completa de una proteína vegetal que se una al almidón es preferible a la presencia de fragmentos de la misma, porque es una garantía de que los aminoácidos que elimine el sistema toe-tic en el proceso de traslocación al plastidio pertenecerán a dicha proteína, no viéndose afectadas ni la secuencia de reconocimiento de la proteasa que vaya a utilizarse para separar el polipéptido de interés de la proteína de fusión, ni tampoco dicha proteína de fusión.
La proteína vegetal que comprende un dominio de unión al almidón puede seleccionarse del grupo de:
- almidón sintasa unida al gránulo (GBSS) (EC 2.4.1.242),
- glucano-diquinasa (R1 ) (EC 2.7.9.4)
- una de las enzimas ramificantes del almidón del grupo de BEI, BEIIa, BEIIb, (EC 2.4.1.18),
- una de las almidón sintasas solubles del grupo de SSI, SSII, SSIII (EC
2.4.1.21 ),
y la almidón fosforilasa plastidial (EC 2.4.1.1 ).
La secuencia codificante de dicha proteína vegetal puede ser idéntica a una secuencia natural o puede ser una secuencia que presente al menos un 60% de homología con una secuencia natural, siempre y cuando la proteína sintetizada a partir de dicha secuencia codificante mantenga la capacidad de unirse al almidón y de presentar una secuencia señalizadora capaz de actuar como péptido de tránsito que conduzca el precursor inicialmente sintetizado al plastidio. Son realizaciones preferidas de la invención aquellas en las que se recurre a la secuencia natural de cualquiera de las enzimas anteriores como sucede, por ejemplo, en los Ejemplos 1 y 2 de la presente solicitud, donde se ha utilizado, tras clonarla, la secuencia natural de la GBSS de Arabidopsis thaliana, que está codificada por el gen At1g32900. Igualmente puede utilizarse la de Solanum tuberosum, por ejemplo (No. acceso en UniProt: Q00775; No. acceso en EMBL a la secuencia codificante: CAA41359.1).
Cuando se utiliza la secuencia natural de una proteína vegetal con dominio de unión al almidón, se prefiere que se recurra a la secuencia correspondiente a la especie a partir de la cual se obtiene la planta transgénica, aunque no es imprescindible.
Respecto al fragmento enlazador que posee un sitio de corte reconocido por una proteasa, en principio, la proteasa podrá ser cualquier proteasa. Sin embargo, si se quiere obtener intacto el péptido interés al final del proceso, el sitio de corte debe elegirse de manera que no esté también presente en la secuencia interna de la proteína de interés. Una posible proteasa a considerar es la trombina (que corta las secuencias polipeptídicas tras el aminoácido arginina, Arg, considerándose que las secuencias de reconocimiento óptimas para efectuar el corte son Gly-Arg//Gly y A-B- Pro-Arg-//-X-Y, donde A y B son aminoácidos hidrofóbicos y X e Y son aminoácidos no ácidos). Cuando el polipéptido de interés está destinado a uso farmacéutico, se prefiere particularmente una proteasa cuya secuencia de reconocimiento quede toda ella en el extremo carboxilo tras efectuar el corte, no quedando ningún aminoácido en el extremo amino que pueda suponer una modificación a la secuencia del polipéptido de interés. Un ejemplo podría ser la enteroquinasa, una proteasa específica que efectúa un corte tras el aminoácido lisina cuando encuentra la secuencia Asp-Asp- Asp-Asp-Lys; así, el aminoácido tras el cual efectúa el corte es el último aminoácido de su secuencia de reconocimiento, de la cual no queda ningún resto en el extremo amino generado tras el corte.
La opción de utilizar la enteroquinasa y su secuencia de reconocimiento tienen especial interés, como ya se ha comentado, cuando el polipéptido de interés quiere utilizarse en el sector farmacéutico o en cualquier otro sector en el que se exija la total integridad de la secuencia aminoacídica de la proteína recombinante, pues es una garantía de que el polipéptido obtenido al final del procedimiento presentará su secuencia íntegra, sin vestigios de la secuencia de corte de la enzima y sin carecer de parte de sus aminoácidos. Es por ello que es la endoproteasa elegida en el Ejemplo 4, referido a la utilización del procedimiento de la invención para proteínas de interés clínico y terapéutico, como son palifermina, mecasermina y albúmina. El procedimiento en el que es alguna de dichas proteínas el polipéptido de interés a amplificar y purificar, así como los vectores de la invención que comprende la secuencia codificante de proteínas de fusión de las que forman parte dichos polipéptidos, están comprendidos dentro del alcance de la presente invención.
Tal como se comenta más adelante, el sistema se ha desarrollado utilizando como modelo de polipéptido de interés (la proteína recombinante que se desea amplificar y purificar), la GFP, por tratarse de una proteína que emite fluorescencia verde cuya expresión, por tanto, es fácil de determinar, permitiendo una fácil visualización de los resultados. Al ser una herramienta habitual en ensayos, en fácil encontrar datos sobre sus características y reactivos útiles para trabajar con ella, como anticuerpos específicos. Dado su interés, se considera que una realización específica del procedimiento de la invención de especial interés es aquella en la que la GFP actúa como polipéptido de interés, pudiendo ser el fragmento enlazador uno que presente un sitio de corte de trombina y la proteína vegetal la GBSS, como en los Ejemplos 1 , 2 y 3 de la presente solicitud. Igualmente tienen interés especial los vectores de la presente invención que presenten la secuencia codificante (SEQ ID NO:1 ) de la proteína de fusión correspondiente (SEQ ID NO:2) a esa fusión GBSS-sitio de corte de trombina-GFP.
Respecto a la especie a partir de la cual se obtiene la planta transgénica, en principio, podría utilizarse cualquier planta, aunque se prefiere que sea una planta que acumule almidón tal como, por ejemplo, una planta de un cereal como arroz, cebada, trigo y maíz, plantas de patata, tabaco, tomate o Arabidopsis thaliana. En la presente solicitud se muestran ensayos realizados con Nicotiana benthamiana (una de las especies de la planta del tabaco) o Solanum tuberosum (patata), pero los efectos técnicos mostrados en la presente solicitud son extrapolables a cualquiera planta que acumule almidón, como también lo son a cualquier órgano de la planta que acumule almidón (tubérculos, hojas, frutos, semillas...).
La obtención de la planta transgénica empleada en el procedimiento de la presente invención requiere la transformación con vectores de expresión específicamente diseñados para los propósitos de la invención. Así, un aspecto de la invención se refiere a un vector de expresión para la transformación de plantas que comprende, en sentido 5'-3\ un promotor que permite la expresión en plantas, al que está operativamente unida la secuencia codificante de una proteína de fusión que comprende, en el sentido amino a carboxilo, un péptido de tránsito del citosol al plastidio, un dominio de unión al almidón, un fragmento enlazador que contiene el sitio de corte de una proteasa y el polipéptido correspondiente a la proteína recombinante a purificar siguiendo el procedimiento de la invención. Preferiblemente, dicho vector es un plásmido.
Todas las posibles alternativas y preferencias previamente mencionadas respecto a los elementos que componen la proteína de fusión, su secuencia codificante y el promotor desde la cual se expresan son igualmente aplicables a los vectores de la invención mediante los cuales se genera la planta transgénica. Son realizaciones importantes de dicho aspecto de la invención los vectores específicos que responden a las alternativas utilizadas en los Ejemplos que se presentan más adelante en la presente solicitud:
- los vectores en los que el promotor al que está operativamente unida la secuencia codificante de la proteína de fusión es el 35S,
los vectores en los que la secuencia del péptido de tránsito del citosol al plastidio y el dominio de unión al almidón están comprendidos dentro de la secuencia codificante natural de una proteína vegetal que se une al almidón, con especial preferencia por la GBSS (muy particularmente la de Arabidopsis thaliana o la GBSSI de Solanum tuberosum);
- los vectores en los que el fragmento enlazador comprende la secuencia codificante del sitio de reconocimiento de la trombina o de la enteroquinasa; - los vectores que comprenden la secuencia codificante de un polipéptido seleccionado del grupo de GFP, palifermina, mecasermina y forma madura de la albúmina humana.
Por operatividad, se prefiere también que el vector se haya obtenido utilizando la tecnología GATEWAY® . Por esa razón, se tiene también preferencia por que la secuencia codificante de la proteína de fusión esté flanqueada por secuencias aatB: attB1 y attB2.
La tecnología GATEWAY® simplifica considerablemente el procedimiento de clonaje, sin embargo, el vector de expresión utilizado en el procedimiento de la invención se puede obtener mediante cualquier otra estrategia de clonaje conocida, p.ej.: corte y pegado mediante enzimas de restricción, ligasas, y cualquier otra empleada en el sector.
Las realizaciones del procedimiento de la invención en las que la planta transgénica se obtiene mediante uno de dichos vectores de la invención están también comprendidas dentro del alcance de la invención.
Parte importante de la invención es también el organismo hospedador que incluya dicho vector, tanto porque permitirá su amplificación como porque su posible papel intermediario en la consecución de la planta transgénica. Es por ello que el hospedador bacteriano en el que esté introducido dicho vector es también un aspecto de la invención. Por esa misma razón, se prefiere que el hospedador sea Agrobacterium tumefaciens, por ser la vía adecuada para introducir la construcción que comprende la secuencia codificante de la proteína de fusión y el promotor en una planta.
En aspectos adicionales de la invención se describen las células vegetales transformadas con el hospedador citado y las plantas transgénicas constituidas por dichas células u obtenida a partir de ellas. Las células transformadas que expresen la proteína de fusión unida a gránulos de almidón, podrían utilizarse también para llevar a cabo el procedimiento de la invención, purificando la proteína a partir de cultivos de las mismas. También podrían utilizarse cultivos de otras líneas celulares de plantas transformadas con un vector de la invención, que puedan cultivarse por procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica, preferiblemente líneas celulares de crecimiento rápido, como pueden ser la línea derivada de plantas de tabaco BY-2, preferiblemente cultivada en presencia de citoquinas (Enami et al., 2011 ). Las células de plantas se cultivan habitualmente como células en suspensión en medio líquido, o también en medio sólido en forma de callo (masa de células no diferenciadas). En caso de células indeferenciadas, es necesario procurar el equilibrio necesario entre auxinas y citoquinas. Para información más detallada, puede consultarse bibliografía sobre el cultivo de células vegetales en general (Bhojwani and Razdan, 1996; Georgiev et al., 2009; Singh and Seema, 2009), o a las células BY-2 en particular (Nagaka et al., 2004).
Igualmente, dichas plantas transgénicas, comprendidas en el alcance de la invención, pueden definirse como aquellas plantas transgénicas que comprendan, integrado en su genoma, un fragmento de ADN que comprenda un promotor para la expresión en plantas, al que esté operativamente unida la secuencia codificante de una proteína de fusión de la invención. Por tanto, está también incluida dentro del alcance de la invención una planta transgénica, sus semillas o material de propagación, caracterizada por que su genoma lleva integrada en sentido 5'-3', un promotor que permite la expresión en plantas, al que está operativamente unida la secuencia codificante de una proteína de fusión que comprende, en el sentido amino a carboxilo, un péptido de tránsito del citosol al plastidio, un dominio de unión al almidón, un fragmento enlazador que contiene el sitio de corte de una proteasa y la secuencia polipeptídica de una proteína que no se expresa de forma natural en la especie a la que pertenece la planta transgénica. Esta última proteína será, lógicamente, la proteína recombinante que se quiere amplificar y purificar.
A efectos de la presente invención, se hacen constar los siguientes términos:
· Planta transgénica: planta cuyo genoma ha sido modificado mediante ingeniería genética con el objetivo de conseguir características biológicas diferentes y/o mejoradas respecto a las de la planta silvestre control (WT).
• Célula vegetal transformada: son células vegetales que presentan una alteración genética resultado de la introducción y expresión de material genético externo en su genoma.
• Expresión ectópica de la proteína Quimérica GBSS-trombina- GFP: una planta expresa ectópicamente la proteína quimérica GBSS-trombina- GFP cuando una inmunotransferencia anti-GFP detecta una banda en un extracto de planta transformada que no se detecta en un extracto de planta WT cultivadas en las mismas condiciones y en el mismo momento. A modo ilustrativo, en la Fíg. 5 se puede observar que en un extracto proteico de plantas transgénicas de Nicotiana benthamiana que expresan GBSS-thr-GFP se detecta una banda del tamaño correspondiente a la proteína quimérica que no se detecta en extractos de plantas WT utilizando un anticuerpo específico de GFP. Otro método para confirmar que una planta expresa la proteína GBSS-trombina-GFP es mediante la detección de la fluorescencia emitida por la proteína GFP. Como muestra la Fig. 6 la fluorescencia está localizada única y exclusivamente en el gránulo de almidón, confirmando que la GFP está unida a la GBSS.
En los Ejemplos que se presentan más adelante en la presente solicitud, se utilizó la GBSS como ejemplo de proteína unida al gránulo de almidón, concretamente la GBSS de Arabidopsis thaliana. Para obtener el vector de transformación, se emplearon vectores intermedios diseñados específicamente para su uso en dicho procedimiento, obtenidos mediante la tecnología GATEWAY®, en los que la secuencia codificante de la GBSS está ya operativamente unida al promotor elegido (en este caso, el 35S), vectores que permiten fusionar con la GBSS la secuencia codificante de cualquier proteína de interés. Dichos vectores suponen, por tanto, una herramienta bastante útil a la hora de aplicar el procedimiento de la invención a cualquier proteína, suponiendo un útil intermedio al que sólo es necesario agregar la secuencia codificante del polipéptido específico de interés en cada momento. Por tanto, otro aspecto de la invención lo constituye un vector de expresión que comprende, en sentido 5'-3', un promotor que permite la expresión en plantas, al que está operativamente unida la secuencia codificante de una proteína vegetal que se une al almidón, secuencia codificante que va seguida por un fragmento flanqueado por secuencias attR1 y attR2, fragmento que, preferiblemente, contiene un gen indicador o un gen de selección. Esto permite clonar aguas debajo de la secuencia codificante de la proteína vegetal con un dominio de unión al almidón cualquier secuencia nucleotídica flanqueada por secuencias attL1 y attL2. Dicho vector, podría incluir cualquier promotor habitualmente utilizado al efecto, así como cualquier terminador apropiado, y distintos marcadores de resistencia a antibióticos, sin alterar la esencia de la invención. Preferiblemente, dicho vector es un plásmido. Preferiblemente, la proteína vegetal codificada es la GBSS, con especial preferencia por la de Arabidopsis thaliana o la de Solanum tuberosum. Una posibilidad es que el vector sea, concretamente, un vector que comprende, en sentido 5'-3-, el promotor 35S, una secuencia que codifica la GBSS y una secuencia nucleotídica flanqueada por secuencias attFM y attR2, como es el vector pGWB2-GBSS gtw, descrito en detalle en el Ejemplo 1 y en la Fig. 7, y también el vector pGBSS gtw representado en las Fig. 12-15 y utilizado en el Ejemplo 4.
También constituyen un aspecto adicional de la invención un hospedador bacteriano trasformado con dicho vector. El caso más preferido es aquel en el que el hospedador es E. coli.
Los siguientes ejemplos ilustran en detalle la invención. No deben interpretarse como una limitación del alcance de la invención.
EJEMPLOS
A continuación se procede a la exposición de los ejemplos, en los que se muestra detalladamente el procedimiento para la obtención de las plantas transgénicas que expresan proteínas recombinantes fusionadas a la proteína GBSS a través de una secuencia específicamente reconocida por una proteasa. Como ejemplo de proteína unida a la GBSS se utilizó la proteína fluorescente GFP. Como ejemplo de secuencia específicamente reconocida por una proteasa se utilizó inicialmente la secuencia aminoacídica reconocida por la trombina.
Ejemplo 1 : Obtención y caracterización de plantas transgénicas que expresan GBSS-trombina-GFP
1.1. Obtención del plásmido DGWB2-GBSS atw
La producción de plantas transgénicas que expresen proteínas unidas a la GBSS a través de una secuencia aminoacídica reconocida específicamente por proteasas requiere la producción previa de un plásmido binario cuyas etapas de elaboración se ilustran en la Fig. 7. La GBSS está codificada por el gen At1g32900 de A. thaliana. A partir de su secuencia nucleotídica se sintetizaron oligonucleótidos específicos para el gen GBSS. Estos oligonucleótidos se emplearon para amplificar mediante RT-PCR a partir de RNA total de hojas de Arabidopsis el fragmento completo de cDNA que codifica la GBSS. El fragmento amplificado se clonó en el vector pGEM- T easy (Promega), dando lugar al plásmido pGBSS que fue amplificado en la bacteria hospedadora XL1 Blue. A partir del plásmido pGBSS se amplificó el cDNA que codifica la GBSS flanqueado por sitios de recombinación attB utilizando los oligonucleótidos GBSS-attB1 (5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaatggcaactgtgactgcttcttc-3') y GBSS- attB2 (5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtatcacggcgtcgctacgttctc-3'). El producto de PCR generado se clonó en el vector pDONR/Zeo mediante recombinación GATEWAY® con los sitios de recombinación attP1 y attP2, dando lugar al plásmido pDONR-GBSS. Mediante una reacción de recombinación GATEWAY® el gen GBSS fue transferido del plásmido pDONR-GBSS al plásmido pGWB2 generando la construcción pGWB2-GBSS que contiene el gen GBSS bajo el control del promotor 35S. Utilizando como molde el plásmido pGWB2-GBSS y los oligonucleótidos 35S- Hindlll (5'-cgtgctcccaagcttactagagccaagctgatctcc-3') y GBSS-Xbal (5'- ggctctagactcggcgtcgctacgttctcc-3') se amplificó mediante PCR la secuencia 35S-GBSS (formada por el promotor 35S fusionado al gen GBSS flanqueada por los sitios de restricción Hindlll y Xbal). En el plásmido pGWB2 se reemplazó el promotor 35S por el producto de PCR 35S-GBSS mediante los sitios de restricción Hindlll y Xbal, creándose el plásmido pGWB2-GBSS gtw, el cual comprende el promotor constitutivo 35S, el gen GBSS y un cásete de recombinación GATEWAY® flanqueado por secuencias attR1 y attR2 que permite la introducción de cualquier gen de interés para producir una proteína recombinante formada por la proteína de interés fusionada al extremo C-terminal de la proteína GBSS. El vector pGWB2-GBSS gtw se introdujo por electroporación en E. coli. 1.2. Obtención del plásmido pGWB2-GBSS-Thr-GFP
La secuencia designada con el nombre GFP-Thr fue amplificada por PCR a partir de un cDNA que codifica para la proteína GFP utilizando los oligonucleótidos Thr-Egfp-attB1 (5'- ggggacaagtttgtacaaaaaaacaqqcttaatgctggtqccacacgacagcatggtqagcaaggqcgaggagc- 3') y Egfp-attB2 (5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtattacttgtacagctcgtccatgc-3'). El oligonucleótido Thr-Egfp-attB1 posee la secuencia attB1 (5'- ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctta-3-) seguida de la secuencia (5'- atqctqgtqccgcgcgqcaqc-3) que codifica para un sitio de corte de la proteasa trombina y una secuencia (5'-catggtgagcaagggcgaggagc-3') que codifica para el extremo N- terminal de la proteína de interés (en este caso la GFP). El oligonucleótido Egfp-attB2 posee una secuencia nucleotídica (5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggta-3') que codifica para el extremo C-terminal de la proteína de interés (en este caso la GFP) seguida de la secuencia attB2 (5'-ttacttgtacagctcgtccatgc-3'). El producto de PCR generado se clonó mediante recombinación GATEWAY® en el vector pDONR/Zeo, dando lugar al plásmido pDONR- Thr-GFP. A partir de pDONR- Thr-GFP y pGWB2- GBSS gtw se obtuvo por recombinación GATEWAY® el plásmido pGWB2-GBSS-Thr- GFP, el cual comprende el promotor constitutivo 35S, el gen quimérico GBSS-thromb- GFPy el terminador Nos. 1.3. Obtención de plantas transaénicas que expresan ectópicamente proteínas unidas a GBSS a través de una secuencia reconocida por trombina
El plásmido pGWB2-GBSS-Thr-GFP se introdujo por electroporación en A. tumefaciens. La cepa resultante se utilizó para transformar plantas de Nicotiana benthamiana, Solanum tuberosum y A. thaliana según protocolos descritos en la literatura (Rocha-Sosa et al. 1989; Clough and Bent 1998; Voinnet et al. 1999).
El plásmido pGWB2-GBSS-Thr-GFP contiene el cásete formado por el gen GBSS de A. thaliana, una secuencia que codifica el sitio de corte de la proteasa trombina y el gen que codifica para la GFP. La secuencia nucleotídica de este cásete de expresión se representa en SEQ ID NO:1. La secuencia aminoacídica deducida de la proteína GBSS-trombina-GFP se representa en SEQ ID NO:2. Utilizando una cepa de A. tumefaciens (que alberga al plásmido pGWB2-GBSS-Thr-GFP) se obtuvieron plantas transgénicas de N. benthamiana, A. thaliana y patata que expresan GBSS-thr- GFP de manera constitutiva. Cuando se comparan con plantas no transformadas, las plantas que expresan la proteína quimérica GBSS-trombina-GFP acumulan una proteína de aproximadamente 96 kDa que es reconocida por el anticuerpo policlonal específico de la GFP que no aparece en plantas no transformadas (Fig. 5). Las plantas transformadas fueron sometidas a análisis de la localización subcelular de la fluorescencia de GFP mediante un microscopio confocal D-Eclipse C1 (NIKON) equipado con un láser con excitación Ar 488, un filtro para emisión verde BA515/30, un filtro para emisión roja BA650LP y un detector de luz. En las fotografías de la Fig. 6 puede observarse que la proteína GFP está localizada en los gránulos de almidón.
Ejemplo 2: Purificación e identificación de la proteína GFP de las plantas transformadas con la construcción GBSS-thromb-GFP
2.1. Purificación de la proteína GFP a partir de plantas transaénicas
El protocolo para la purificación de la proteína GFP a partir de gránulos de almidón de plantas transformadas con 35S-GBSS-thr-GFP se describe a continuación:
- 1 g de hojas de plantas transformadas con 35S-GBSS-thr-GFP fue homogeneizado con una batidora en 10 mi de tampón de extracción (50 mM Tris-HCI (pH 8,0), 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 0,05% Tritón). El homogeneizado se filtró a través de dos capas de Miracloth y se dejó sedimentar a 4QC.
Se descartó el sobrenadante y el pellet enriquecido en almidón se resuspendió en 300 μΙ de tampón de digestión de trombina (20 mM Tris-HCI, pH 8.4, 150 mM NaCI, 2.5 mM CaCI2). 150 μΙ de esta suspensión fueron sometidos a digestión con 0.16 U de trombina durante 12 h a 22QC. Los restantes 150 μΙ de la suspensión fueron utilizados como control negativo.
Finalizada la digestión con trombina la muestra se centrifugó a 10,000 g durante 10 minutos. El sobrenadante fue sometido a electroforesis en geles de acrilamida SDS-PAGE y a immunodetección de GFP mediante inmunotransferencia haciendo uso de un anticuerpo primario anti-GFP.
2.2. Identificación de la proteína GFP
La identificación de GFP puede realizarse de cualquiera de las maneras siguientes: (a) mediante immunoblots haciendo uso de anticuerpos específicos contra GFP y (b) mediante detección de la fluorescencia emitida por la proteína GFP.
Por inmunotransferencia: La detección de la GFP se llevó a cabo haciendo uso de un anticuerpo específico anti-GFP según la metodología de inmunotransferencia descrita en (Towbin et al. 1979). El complejo antígeno-anticuerpo se detectó mediante incubación con un anticuerpo secundario anti-lgG de conejo conjugado con fosfatasa alcalina.
Por análisis de su fluorescencia mediante microscopía confocal. Plantas de patata y Arabidopsis fueron transformadas con la construcción quimérica GBSS-thr- GFP obtenida según se ilustra en la Fig. 8. Las plantas fueron sometidas a observación mediante microscopía confocal para identificar la localización subcelular de la fluorescencia de GFP (Fig. 6).
Plantas de N. benthamiana fueron transformadas con la construcción quimérica GBSS-thr-GFP obtenida según el procedimiento ilustrado en la Fig. 7 y en la Fig. 8. Los gránulos de almidón obtenidos de estas hojas tras un paso de homogeneización y posterior centrifugación a baja aceleración fueron sometidos a la digestión con trombina para liberar la proteína GFP. Mediante un paso adicional de centrifugación se separó la proteína soluble GFP de los gránulos de almidón, obteniéndose un sobrenadante enriquecido en proteína GFP. Para confirmar la liberación de GFP de los gránulos de almidón se realizó un inmunotransferencia usando un anticuerpo específico anti-GFP. Como se observa en la Fig. 9, en el sobrenadante de la muestra tratada con trombina se detecta una proteína de aproximadamente 29 kDa que corresponde a la GFP liberada de los granos de almidón. Esta proteína no aparece cuando los granos de almidón no son tratados con trombina, lo cual indica que la liberación de la proteína unida a la GBSS tan solo tiene lugar en presencia de la proteasa trombina. En los gránulos de almidón insolubles, el anticuerpo anti-GFP reconoce una proteína de 96 kDa que corresponde a la proteína de fusión GBSS- trombina-GFP.
Ejemplo 3: Confirmación de la reproducibilidad del método en plantas de patata
Para comprobar la reproducibilidad del método, se llevó a cabo de nuevo el procedimiento de obtención de plantas transgénicas del apartado .3, en este caso en plantas de patata {Solanum tuberosum)
De forma análoga a los Ejemplos 1 y 2, las plantas transgénicas acumulaban almidón que expresaban la GFP (en este caso, la proteína recombinante de interés a purificar) fusionada a la GBSS de Arabidopsis thaliana como proteína con motivo de unión al gránulo de almidón. De este modo, como en el Ejemplo anterior, la proteína de interés debería quedar anclada al gránulo de almidón, cuya elevada densidad permite una fácil purificación del resto de componentes celulares tras un simple paso de homogeneizacion del tejido, centrifugación y solubilización de la proteína recombinante de interés tras un tratamiento de digestión con endoproteasa.
El sistema, tal como se esquematiza en la Fig. 4, se divide en dos fases principales: (1) obtención de gránulos de almidón tras la homogeneizacion de los tubérculos de patata, posterior filtración del homogeneizado a través de una tela tipo "cheesecloth" y centrifugación a 1000g durante 5 minutos y (2) liberación de la GFP tras un tratamiento del almidón con la endoproteasa correspondiente (en este caso trombina) y posterior paso de centrifugación. Para la homogeneizacion de los tubérculos se empleó un buffer que contenía Tris-CIH 50 mM (pH 8), EDTA 1 mM, DTT 5 mM y Tritón 0,05%, en una relación de 1 mi de buffer por 1 gramo de tubérculo. Para la digestión del almidón con trombina, éste se resuspendió en una solución tamponada que contenía Tris-CIH 20 mM (pH 8.4), NaCI 150 mM, CaCI2 2,5 mM, en una relación de 10 ml de buffer por 1 gramo de almidón. Está solución tamponada contenía 0,3 unidades de trombina por ml. El tiempo requerido para la obtención de 1 mg de GFP altamente purificada a partir de 10 Kg de tubérculos fue de 12 horas (5 horas para la fase 1 y 7 horas para la fase 2).
Se llevó a cabo un análisis por microscopía confocal de los gránulos de almidón de tubérculos, al cual corresponde la microfotografía de la Fig. 10. En la misma puede apreciarse como la GFP permanece activa en el gránulo de almidón de tubérculo de patata, dando lugar a su fluorescencia verde característica, por lo que este nuevo método permite producir y purificar proteínas correctamente plegadas y ensambladas a partir de almidón obtenido de órganos de reserva.
El sistema de expresión basado en la utilización del promotor 35S utilizado en las construcciones con las cuales se obtuvieron las plantas transgénicas permite niveles de acumulación de GFP de aproximadamente 6 mg por Kg de peso fresco de tubérculo (aproximadamente 60 mg de GFP por Kg de almidón de tubérculo de patata). Teniendo en cuenta que 1 Kg de peso fresco de tubérculo de patata posee aproximadamente 6 g de proteína, se estima que la GFP supone aproximadamente un 0,1% de la proteína total de los tubérculos transgénicos.
La pureza de la proteína, una vez llevada a cabo la etapa de digestión con la endoproteasa y posterior centrifugación, se comprobó mediante electroforesis. Los resultados pueden observarse en la Fig. 11 , donde se representa los resultados de electroforesis en geles de SDS- poliacrilamida (PAGE) y posterior tinción con Coomasie Blue (A) o análisis por transferencia tipo Western (B) de extractos obtenidos desde (1 ) tubérculo de patata que expresa GFP unida a GBSS a través de una secuencia aminoacídica específicamente reconocida por trombina, (2) almidón puro y (3) proteína liberada tras el tratamiento del almidón puro con trombina. En (1 ) se cargó 0 μg de proteína proveniente de 1.6 mg de peso fresco de tubérculo. En (2) se cargó 1 μg de proteína de almidón purificado y en (3) se cargó 0,15 μg de proteína liberada del almidón purificado tras el tratamiento con trombina. El immunoblot del panel "B" comparado con una ensayo patrón en el que se cargaron cantidades conocidas de GFP muestra que los 10 μg de proteína cargada en (1 ) contienen aproximadamente 10 ng de GFP (0,1% de la proteína total), mientras que los 150 ng de proteína cargada en (3) poseen aproximadamente 100 ng de GFP (66% de la proteína). Es decir, en un solo paso (purificación de almidón y tratamiento con endoproteasa) la GFP (a) se ha liberado del gránulo de almidón y (b) se ha purificado entre 600 y 1000 veces.
Se destaca que en un solo paso el nuevo método permite purificar 600-1000 veces la GFP, obteniendo de manera simple y rápida un mínimo de 50-100 ng de GFP altamente purificada a partir de 1 Kg de tubérculo de patata transgénica (0,5-1 mg de GFP altamente purificada a partir de 1 Kg de almidón de tubérculo de patata transgénica).
En el presente Ejemplo, la proteasa utilizada para liberar la GFP estaba biotinilada, de modo que su eliminación de la preparación final es sencilla. Sin embargo, SDS-PAGE y posterior tinción de proteínas muestran que la preparación de GFP obtenida tras la fase de "liberación" del gránulo de almidón presenta una pequeña contaminación de una proteína (véase de nuevo la Fig. 11). En este caso, podría ser conveniente el paso de purificación adicional que se contempla como posible etapa opcional del método.
Ejemplo 4: Extensión a proteínas de interés clínico / terapéutico
Como ya se ha comentado, una de las principales utilidades del método de la invención es su aplicación para la amplificación y purificación de proteínas de interés en el sector farmacéutico, muchas de las cuales se están preparando actualmente por métodos recombinantes en los que la amplificación se produce en microorganismos, sobre todo Escherichia coli.
Como ya se comentó, cuando el polipéptido recombinante de interés se pretende utilizar para ser utilizado en el sector farmacéutico, el mismo debe estar íntegro, sin carecer de ninguno de los aminoácidos propios de su secuencia característica, pero sin presentar tampoco aminoácidos adicionales a la misma.
Por ello, se decidió preparar líneas de patata que expresaran la GBSS de Arabidopsis thaliana, unida a proteínas de interés terapéutico. La metodología fue análoga a la descrita en los Ejemplos anteriores, con la salvedad de que, en este caso, el fragmento enlazador que conecta la GBSS con el polipéptido de interés no contenía la secuencia de reconocimiento de la trombina, sino la de la enteroquinasa (Asp-Asp- Asp-Asp-Lys), estando la Lys directamente unida al primer aminoácido del polipéptido de interés en la proteína de fusión. De esta forma, dado que la enteroquinasa corta inmediatamente a continuación de la Lys, los polipéptidos de interés pueden obtenerse intactos, sin aminoácidos adicionales.
Los polipéptidos de interés farmacéutico elegidos fueron los siguientes:
- Palifermina: es una forma recombinante, N-truncada, de 140 residuos, del factor humano de crecimiento de queratinocitos, KGF (No. Acceso UníProt: P21781 ; No. Acceso GenBank: M60828). Actualmente se produce en Escherichia coli. Su secuencia concreta puede consultarse en: http://www.drugbank.ca/drugs/BTD00042. Se trata de un fármaco utilizado para potenciar el desarrollo de la mucosa del aparato digestivo en pacientes de cáncer tratados con quimioterapia.
- Mecasermina: IGF-I humano (factor de crecimiento similar a insulina 1) obtenido mediante técnicas de crecimiento recombinante en Escheríchia coli. La secuencia es igual a la del IGF-I humano, 70 aminoácidos. La secuencia concreta puede consultarse en: http://www.drugbank.ca/drugs/DB01277 (No. Acceso GenBank para el cDNA: X57025).
- Albúmina: producida en levaduras a partir de la secuencia codificante de la proteína humana madura (en humanos, se sintetiza en forma de precursor). Se prefiere utilizar la forma recombinante para evitar contaminaciones con hepatitis y HIV al extraerla de suero. Se purifica en columnas (secuencia madura: http://www.drugbank.ca/drugs/DB00062; No. Acceso GenBank para la CDS completa: M12523).
Con los datos anteriores respecto a la secuencia de interés terapéutico y su secuencia codificante, se llevó a cabo un procedimiento análogo al descrito en el Ejemplo 1 , aunque utilizándose como plásmido intermediario pGBSS gtw, un plásmido análogo a pGWB2-GBSS gtw, que contenía también la secuencia codificante de la GBSS de Arabidopsis thaliana bajo el control del promotor 35S. La aplicación del procedimiento permitió generar plantas transgénicas de patata en las que se expresaba una proteína de fusión de la GBSS con la secuencia codificante del péptido del interés correspondiente. El proceso de obtención de los plásmidos necesarios para ello se esquematiza en las Fig. 12, 13 y 14, donde puede verse también la estructura del plásmido intermediario pGBSS gtw.
La puesta a punto de la metodología se llevó a cabo, de nuevo, con una procedimiento análogo en el que la proteína de interés era nuevamente la GFP. El proceso de obtención del plásmido necesario se esquematiza en la Fig. 15. El sistema, tal como se esquematiza en la Fig. 4, se divide en dos fases principales: (1 ) obtención de gránulos de almidón tras la homogeneización de los tubérculos de patata y posterior filtración del homogeneizado a través de una tela tipo "cheesecloth" y centrifugación a 1000 g durante 5 minutos y (2) liberación de la GFP tras un tratamiento del almidón con la endoproteasa correspondiente (en este caso enteroquinasa) y posterior paso de centrifugación. Para la homogeneización de los tubérculos se empleó un buffer que contenía Tris-CIH 50 mM (pH 8), EDTA 1 mM, DTT 5 mM y Tritón 0,05%, en una relación de 1 mi de buffer por 1 gramo de tubérculo. Para la digestión del almidón con enteroquinasa éste se resuspendió en una solución tamponada en una relación de 10 mi de buffer por 1 gramo de almidón que contenía 0,3 unidades de enteroquinasa por mi. Posteriormente se comprobó que la GFP liberada tras el tratamiento con la enteroquinasa llegaba al final de proceso íntegra desde el punto de vista de su secuencia aminoacídica (ni le faltaban aminoácidos ni presentaba aminoácidos en exceso en la parte amino-terminal). Para ello, se secuenció el extremo amino terminal de la GFP purificada, confirmando que se correspondía exactamente con la secuencia del extremo amino de la GFP (aminoácidos 632 a 661 de SEQ ID NO:2)
El procedimiento de aislamiento, liberación de los polipéptidos de interés con enteroquinasa y comprobación de pureza análogo a los de los Ejemplos 2 y 3 anteriores demostró que los péptidos de interés se obtenían en la forma deseada, con su secuencia íntegra y sin vestigios de la secuencia aminoacídica reconocida por la endoproteasa.
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Claims

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento de obtención de proteínas recombinantes purificadas a partir de una planta transgénica o células en cultivo transgénicas, que comprende las siguientes etapas:
a) homogeneizar las células en cultivo o un tejido de la planta que acumule almidón al que esté asociado una proteína de fusión caracterizada por que comprende:
i) en la región del extremo carboxilo, el polipéptido correspondiente a la proteína recombinante a purificar,
ii) en la región del extremo amino, un dominio de unión al almidón, iii) un fragmento enlazador que contiene el sitio de corte de una proteasa, fragmento enlazador que está situado entre la región del extremo amino y la región del extremo carboxilo;
b) centrifugar y seleccionar la fracción de densidad más elevada, que contiene las proteínas del gránulo de almidón;
c) tratar la fracción seleccionada en la etapa b) con la proteasa que reconoce el sitio de corte comprendido en el fragmento enlazador;
d) centrifugar y seleccionar el sobrenadante;
e) opcionalmente, purificar en mayor grado la proteína recombinante contenida en el sobrenadante.
2. Procedimiento según la reivindicación 1 , que comprende las etapas previas a) i) obtener una planta transgénica mediante transformación de una planta silvestre con un vector de transformación que comprende un promotor de expresión en plantas, operativamente unido a una secuencia codificante de una proteína de fusión que comprende, en dirección 5'-3', un péptido que dirige la transición del citosol a plastidios, un dominio de unión al almidón, un sitio de corte de una proteasa, y el polipéptido correspondiente a la proteína recombinante a purificar;
a) ii) cultivar la planta transgénica obtenida en la etapa anterior en condiciones apropiadas para su crecimiento.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que el dominio de unión al almidón es un dominio de unión de una amilasa bacteriana.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el dominio de unión al almidón de una amilasa bacteriana se selecciona del grupo de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4,
SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:6.
5. Procedimiento según la reivindicación 3 ó 4, en el que el vector de expresión con el que se prepara la planta transgénica comprende la parte codificante correspondiente a un péptido de tránsito adecuado entre el promotor y el dominio de unión al almidón.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que el péptido de tránsito es el representado por SEQ ID NO:8.
7. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que el dominio de unión al almidón pertenece a una proteína vegetal.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que la proteína de fusión comprende la secuencia polipeptídica completa de la proteína vegetal que se une al almidón y que se sintetice en el citosol en forma de un precursor que comprende la secuencia completa de aminoácidos de la forma precursora de dicha proteína vegetal.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que el vector de expresión con el que se prepara la planta transgénica comprende la secuencia codificante natural completa de la proteína vegetal de unión al almidón, incluido la parte correspondiente al péptido de tránsito al plastidio.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que la proteína vegetal que comprende un dominio de unión al almidón puede seleccionarse del grupo de: almidón sintasa unida al gránulo de almidón (GBSS), glucano-diquinasa (R1 ), una de las enzimas ramificantes del almidón del grupo de BEI, BEIIa, BEIIb, una de las almidón sintasas solubles del grupo de SSI, SSII, SSIII, y la almidón fosforilasa plastidial.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que la secuencia codificante de la proteína vegetal presenta al menos un 60% de homología con la secuencia codificante natural de una enzima seleccionada del grupo de: almidón sintasa unida al gránulo de almidón (GBSS), glucano-diquinasa (R1 ), una de las enzimas ramificantes del almidón del grupo de BEI, BEIIa, BEIIb, una de las almidón sintasas solubles del grupo de SSI, SSII, SSIII, y la almidón fosforilasa plastidial, con la condición de que la enzima sintetizada a partir de dicha secuencia codificante posea un dominio de unión al almidón y de que presente una secuencia señalizadora capaz de actuar como péptido de tránsito que conduzca el precursor inicialmente sintetizado al plastidio.
12. Procedimiento según la reivindicación 11 , en el que la secuencia codificante de la proteína vegetal es la secuencia codificante natural de una enzima seleccionada del grupo de GBSS, R1 , BEI, BEIIa, BEIIb, SSI, SSII, SSIII, y almidón fosforilasa plastidial.
13. Procedimiento según la reivindicación 12, en que la proteína vegetal es la
GBSS.
14. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la proteasa utilizada en la etapa c) efectúa el corte tras el último aminoácido de su secuencia de reconocimiento.
15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que la proteasa es la enteroquinasa, el fragmento enlazador tiene por extremo carboxilo la secuencia de reconocimiento de la enteroquinasa, Asp-Asp-Asp-Asp-Lys y el extremo amino del polipéptido de interés está unido directamente a la secuencia de reconocimiento de la enteroquinasa antes de que actúe la proteasa.
16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que el polipéptido de interés se selecciona del grupo de: palifermina, mecasermina y albúmina.
17. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que la proteína vegetal que posee un dominio de unión al almidón es la GBSS de Arabidopsis thaliana.
18. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la proteasa utilizada en la etapa c) es la trombina.
19. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el promotor que dirige la expresión de la proteína de fusión es el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor.
20. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que la proteína vegetal que posee un dominio de unión al almidón es la GBSS de Arabidopsis thaliana, el fragmento enlazador contiene un sitio de corte de trombina, el polipéptido de interés unido al fragmento enlazador es la proteína verde fluorescente (GFP), el promotor que dirige la expresión de la proteína de fusión es el del RNA 35S, la secuencia codificante de la proteína de fusión es la secuencia representada por SEQ ID NO:1 y la proteína de fusión sintetizada está representada por SEQ ID NO:2.
21. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 20, en el que la planta transgénica se obtiene mediante un vector que comprende, en sentido 5'- 3', un promotor que permite la expresión en plantas, al que está operativamente unida la secuencia codificante de una proteína de fusión que comprende, en el sentido amino a carboxilo, un péptido de tránsito del citosol al plastidio, un dominio de unión al almidón, un fragmento enlazador que contiene el sitio de corte de una proteasa y el polipéptido correspondiente a la proteína recombinante a purificar.
22. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 , en el que la etapa e) opcional se lleva a cabo por una técnica que se elige del grupo de separación por tamaños, inmunoabsorción, intercambio iónico o detección de fluorescencia.
23. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que los gránulos de almidón obtenidos en la etapa b) se someten a digestión enzimática o a tratamientos físicos de ruptura que disgreguen los gránulos de almidón, previamente a la aplicación de la etapa c) de aplicación de la proteasa.
24. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en el que la especie a partir de la cual se obtiene la planta transgénica se selecciona del grupo de arroz, cebada, trigo y maíz, plantas de patata, tabaco, tomate o Arabidopsis thaliana.
25. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en el que el tejido que acumula almidón sobre el cual se aplica la etapa a) del procedimiento se selecciona del grupo de tubérculos, hojas, frutos y semillas.
26. Un vector de expresión para la transformación de plantas para uso en el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, que comprende, en sentido 5'-3\ un promotor que permite la expresión en plantas, al que está operativamente unida la secuencia codificante de una proteína de fusión que comprende, en el sentido amino a carboxilo, un péptido de tránsito del citosol al plastidio, un dominio de unión al almidón, un fragmento enlazador que contiene el sitio de corte de una proteasa y el polipéptido correspondiente a la proteína recombinante a purificar.
27. Vector según la reivindicación 26, que es un plásmido.
28. Vector según la reivindicación 27, en el que el promotor al que está operativamente unida la secuencia codificante de la proteína de fusión es el 35S.
29. Vector según una cualquiera de las reivindicaciones 27 ó 28, en el que la secuencia del péptido de tránsito del citosol al plastidio y el dominio de unión al almidón están comprendidos dentro de la secuencia codificante natural de una proteína vegetal que se une al almidón.
30. Vector según la reivindicación 29, en el que la proteína vegetal que se une al almidón es la GBSS.
31. Vector según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 30, en el que el fragmento enlazador comprende la secuencia codificante del sitio de reconocimiento de la trombina o de la enteroquinasa.
32. Vector según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 31 , que comprende, unida al extremo carboxilo del fragmento enlazador, la secuencia codificante de un polipéptido seleccionado del grupo de GFP, palifermina, mecasermina, péptido precursor de la insulina humana y forma madura de la albúmina humana.
33. Vector según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 32, en el que la secuencia codificante de la proteína de fusión esté flanqueada por secuencias attB: attB1 y attB2.
34. Un organismo hospedador para uso en el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 25, transformado con un vector de una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 33.
35. Organismo hospedador según la reivindicación 34, que es Agrobacterium tumefaciens.
36. Una célula vegetal transformada con el organismo hospedador de la reivindicación 34 ó 35.
37. Una planta transgénica, sus semillas o material de propagación, obtenida a partir de células de la reivindicación 36.
38. Una planta transgénica, sus semillas o material de propagación, caracterizada por que su genoma lleva integrada en sentido 5'-3', un promotor que permite la expresión en plantas, al que está operativamente unida la secuencia codificante de una proteína de fusión que comprende, en el sentido amino a carboxilo, un péptido de tránsito del citosol al plastidio, un dominio de unión al almidón, un fragmento enlazador que contiene el sitio de corte de una proteasa y la secuencia polipeptídica de una proteína que no se expresa de forma natural en la especie a la que pertenece la planta transgénica.
39. Un vector intermedio para la generación de un vector de una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 33, caracterizado por que comprende, en sentido 5'-3', un promotor que permite la expresión en plantas, al que está operativamente unida la secuencia codificante de una proteína vegetal que se une almidón, secuencia codificante que va seguida por un fragmento flanqueado por secuencias attR1 y attR2.
40. Vector según la reivindicación 39, que es un plásmido.
41. Vector según la reivindicación 40, en el que la proteína vegetal codificada es la GBSS.
42. Vector según la reivindicación 41 , en el que la GBSS es la de Arabidopsis thaliana o la de Solanum tuberosum.
43. Un hospedador bacteriano transformado con un vector de una cualquiera de las reivindicaciones 39 a 42.
44. Hospedador según la reivindicación 43, que pertenece a la especie bacteriana Escherichia coli.
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