WO2012023838A2 - 전사인자의 전사활성 조절도메인 및 단백질 운반 도메인을 가지는 융합단백질 및 이를 포함하는 전사인자 기능억제제 - Google Patents
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- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/73—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing coiled-coiled motif (leucine zippers)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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- C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor
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- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor
- C07K2319/81—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor containing a Zn-finger domain for DNA binding
Definitions
- the present invention relates to a fusion protein having a transcriptional activity regulatory domain and a protein transport domain of a transcription factor, and a transcription factor inhibitor including the same.
- Transcription factors which regulate transcription, bind electrons or interact with other proteins to regulate electrons, and when they are not regulated, they cause various diseases according to transcription factors.
- PTD Protein Transduction Domain
- the protein transport domain can pass the BBB (Blood Brain Barrier) to deliver bioactive substances to the brain, and new biomarkers that can deliver these bioactive substances in vivo through the skin, airways, and eyes, the topical drug delivery pathways.
- BBB Breast Brain Barrier
- the present inventors realized that the transcription factor functions through interaction with DNA or other proteins, thereby completing a fusion protein in which a portion of the transcription factor is combined with the protein transfer domain.
- the present invention provides a transcription factor functional inhibitor comprising a fusion protein having a transcriptional activity regulatory domain and a protein transport domain of a transcription factor and a transcription factor-related disease treatment comprising the fusion protein and a pharmaceutically acceptable excipient.
- a transcription factor functional inhibitor comprising a fusion protein having a transcriptional activity regulatory domain and a protein transport domain of a transcription factor and a transcription factor-related disease treatment comprising the fusion protein and a pharmaceutically acceptable excipient.
- Another object of the present invention is to provide a method for treating a transcription factor-related disease by administering an effective amount of a fusion protein having a transcriptional activity regulatory domain and a protein transport domain of a transcription factor to a patient having a transcription factor-related disease.
- the present invention also provides a fusion protein comprising a transcriptional activity regulatory domain and a protein transport domain of a transcription factor and a nucleic acid encoding the same, and a vector comprising the nucleic acid and a host cell comprising the same.
- an object of the present invention is to provide a method for preparing a fusion protein by expressing in a host cell a vector obtained by binding a gene encoding a transcriptional activity regulatory domain of a transcription factor to a gene encoding a protein transport domain.
- transcriptional modulation domain interactome is part of a transcription factor and other molecules present in the transcription factor during transcription of the transcription factor, such as, but not limited to, DNA , Domains that bind to RNA, transcription donor activators, transcription inhibitors, enhancer-binding factors and ligands, participate in dimerization / multimerization, or participate in nuclear localization.
- a transcription factor inhibitor comprising a fusion protein having a transcriptional activity regulatory domain of the transcription factor and a protein transport domain.
- the transcription factors of the above embodiments are ROR ⁇ t (Retinoic acid-related orphan receptor gamma t), Tbet (T-box 21), GATA-3 (GATA binding protein 3), FOXP3 (Forkhead box P3), ROR ⁇ 4 (Retinoic acid-related orphan receptor alpha 4), HIF-1 / 2 ⁇ (Hypoxia inducible factor 1 / 2 ⁇ ), Signal transducers and activators of transcription (STAT), peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR ⁇ ), p53, AP-1, NF ⁇ B (nuclear factor) kappa-B), NKx2.5 (NK2 transcription factor related, locus 5), FOXO (Forkhead box O), RELA (v-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog
- a fusion protein comprising a transcriptional activity regulatory domain and a protein transport domain of a transcription factor.
- the transcription factors of the above embodiments are ROR ⁇ t (Retinoic acid-related orphan receptor gamma t), Tbet (T-box 21), GATA-3 (GATA binding protein 3), FOXP3 (Forkhead box P3), ROR ⁇ 4 (Retinoic acid-related orphan receptor alpha 4), HIF-1 / 2 ⁇ (Hypoxia inducible factor 1 / 2 ⁇ ), Signal transducers and activators of transcription (STAT), peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR ⁇ ), p53, AP-1, NF ⁇ B (nuclear factor) kappa-B), NKx2.5 (NK2 transcription factor related, locus 5), FOXO (Forkhead box O), RELA (v-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A) and Runx
- nucleic acid encoding a fusion protein of the above embodiment, a vector comprising the nucleic acid and a host cell comprising the vector, wherein the protein transport domain of the embodiment has a sequence represented by SEQ ID NO: 1 Cells, the transcriptional activity regulatory domain of the transcription factor of the embodiment is a host cell characterized by having a sequence represented by SEQ ID NOS: 2 to 6, and the fusion protein of the embodiment has a sequence represented by SEQ ID NOs: 7-11 It is a host cell, characterized in that the host cell of the embodiment is a host cell characterized in that BL21 star (DE3) pLys S.
- a method for producing a fusion protein by expressing in a host cell a vector that binds a gene encoding a transcriptional activity regulatory domain of a transcription factor to a gene encoding a protein transport domain.
- a pharmaceutical composition for treating a transcription factor-related disease comprising a fusion protein comprising a transcriptional activity regulatory domain and a protein transport domain of a transcription factor and a pharmaceutically acceptable excipient.
- the transcription factor of the embodiment is NKx2.5 (NK2 transcription factor related, locus 5) or HIF-1 ⁇ (Hypoxia inducible factor 1 ⁇ ) provides a pharmaceutical composition characterized in that the transcription factor-related disease is a heart disease
- HIF-1 ⁇ Hypoxia inducible factor 1 ⁇
- the transcription factor-related disease is a brain disease
- PPAR ⁇ peroxisome proliferator-activated receptor gamma transcription-related disease
- the transcription factor of the above-described embodiment is a transcription factor-related disease is ROR ⁇ t (Retinoic acid-related orphan receptor gamma t), ROR ⁇ 4 (Ret
- the fusion protein of the present invention can be used to effectively treat various diseases associated with transcription factors.
- tRORgt-TMD a fusion protein of RORgt-TMD and HP4-PTD
- LBD instead of RORgt-TMD
- RORgt-TMD which cannot be delivered into cells without PTD
- Figure 2 is a Coomassie blue staining picture of the tRORgt-TMD, RORgt-TMD, and tRORgt-LBD fusion protein used as an embodiment of the invention.
- Figure 3 is a Western blot photograph confirming that the tRORgt-TMD fusion protein used as an embodiment of the invention was delivered to the packet T cells by concentration and time.
- Figure 4 is a photograph of the tRORgt-TMD fusion protein used as an embodiment of the invention was seen through the fluorescence microscope delivered to the nucleus of HeLa cells.
- tRORgt-LBD fusion protein with LBD for TMD and RORgt without PTD.
- RR-AG mutant form of tRORgt-TMD
- Figure 6 shows that the tRORgt-TMD fusion protein used as an embodiment of the invention selectively inhibits IL-17A secreted from Th17 cells by TcR activation by anti-CD3 and anti-CD28 mAb in splenocytes, but Th1 cell
- tRORgt-TMD fusion protein used as an embodiment of the present invention inhibits CD4 + CD25-CD62L + immature T cells from being differentiated into Th17 cells, thereby specifically inhibiting the expression and secretion of Il-17A and IL-17F.
- IFN-g secretion by the differentiation of Th1 cells and IL-13 secretion by the differentiation of Th2 cells is not affected.
- tRORgt-LBD without tRORgt-LBD and PTD is the result of no differentiation inhibitory function of Th17 T cells.
- tRORgt-TMD (RR-AG), which cannot bind to DNA by mutating amino acids involved in DNA binding in tRORgt-TMD, has a partial differentiation of Th17 T cells.
- FIG. 8 is a concentration-dependent inhibition of binding of RORgt to IL-17A promoter in tRORgt-TMD to cells in one embodiment of the present invention, a fusion protein with LBD (tRORgt-LBD), RORgt- without PTD In TMD, there is no inhibitory effect, but the mutant type of tRORgt-TMD (RR-AG), which cannot bind to DNA by mutating amino acids involved in DNA binding, is partially inhibited through other mechanisms.
- tRORgt-LBD fusion protein with LBD
- RR-AG mutant type of tRORgt-TMD
- FIG. 10 is a bar graph showing the result of FIG. 9.
- tRORgt-TMD fusion protein used as an embodiment of the invention has an excellent disease treatment and prevention effect in EAE, an animal model of multiple sclerosis.
- tRORgt-TMD fusion protein used as an embodiment of the invention inhibits the differentiation of Th17 cells in EAE, a multiple sclerosis animal model, inhibits the secretion of IL-17, the inhibitory effect is IFN in Th1 cells
- ELg inhibition also inhibits -g secretion.
- tRORgt-TMD fusion protein inhibits the secretion of IL-17 by inhibiting the differentiation of Th17 cells in EAE animal model of multiple sclerosis, this inhibitory effect is IFN-g in Th1 cells Inhibition of secretion also results from intracellular staining.
- tRORgt-TMD fusion protein used as an embodiment of the invention has an effect of inhibiting demyelination of the CNS in EAE, which is an animal model of multiple sclerosis, by Luxol Fast Blue staining staining the myelination portion. The result is.
- Figure 15 shows the results of the tRORgt-TMD fusion protein used as an embodiment of the invention inhibits the infiltration of inflammatory cells from EAE in the multiple sclerosis animal model to the CNS in terms of tissue organization, Hematoxylin & Eosin staining method This is a confirmed picture.
- FIG. 16 shows that the tRORgt-TMD fusion protein used as an embodiment of the present invention inhibits infiltration of inflammatory cells from EAE, which is a multiple sclerosis animal model, to the CNS in terms of histological aspect, using Periodic acid Schiff staining. This is a confirmed picture.
- 17 is a cell differentiation staining method, which shows that when the tGT3-TMD recombinant fusion protein used as an embodiment of the present invention is sprayed through the airways in an allergic asthma model, it effectively reduces the infiltration of various inflammatory cells and immune cells. Checked graph.
- Figure 18 is a therapeutic effect by reducing the secretion of TH2 specific cytokines IL-4 and IL-5 when the tGT3-TMD recombinant fusion protein used as an embodiment of the invention when sprayed through the airways in an allergic asthma model It is a graph confirmed by showing whether the ELISA.
- Figure 19 shows that the therapeutic effect of the tGT3-TMD recombinant fusion protein used in one embodiment of the invention inhibits the infiltration of inflammatory cells in histological aspects Hematoxylin & Eosin staining method This is a confirmed picture.
- RORgt-TMD (SEQ ID NO: 2, transcriptional activity regulatory domain of the transcription factor RORgt) or RORgt-LBD, which is the transcriptional activity regulatory domain of RORgt, was cloned by PCR to form a protein transport domain with HP4 (SEQ ID NO: 1).
- Three recombinant DNAs such as tRORgt-TMD, tRORgt-LBD, or RORgt-TMD without HP4 PTD, were prepared (FIG. 1). These three recombinant DNAs were cloned into the pRSETb vector and the three recombinant vectors transformed the BL21 star (DE3) pLys S strain.
- IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
- tRORgt-TMD tRORgt-LBD
- RORgt-TMD proteins for 8 hours.
- the cultured cells were then harvested and lysed with digestion buffer (10 mM imidazole, 300 mM NaCl, 50 mM NaH 2 PO 4, pH 8.0) and the cells were digested with a grinder.
- the fusion proteins were bound to Ni-NTA beads using six histidines labeled in front of these tRORgt-TMD, tRORgt-LBD and RORgt-TMD fusion proteins.
- tGT3-TMD comprising the transcriptional activity regulatory domain of GATA-3 (SEQ ID NO: 3), and tTbet-TMD and FoxP3, the transcriptional activity regulatory domain comprising the transcriptional activity regulatory domain of Tbet (SEQ ID NO: 4) TFoxp3-TMD was prepared (SEQ ID NOS: 5 and 6) (see FIGS. 1B, 1C, 1D).
- tGT3-TMD including the transcriptional activity regulatory domain of GATA-3 SEQ ID NO: 3
- tTbet-TMD and the transcription activity of FoxP3 including the transcriptional activity regulatory domain of Tbet SEQ ID NO: 4
- tFoxp3-TMD including a regulatory domain SEQ ID NOs: 5 and 6
- tRORgt-TMD protein When the tRORgt-TMD protein is delivered intracellularly, expression of the luciferase gene is regulated by the IL-17 promoter to determine whether intracellular RORgt competitively and specifically inhibits binding to the IL-17 promoter.
- DNA and RORgt expressing DNA were transfected into Hela cells and then cultured with tRORgt-TMD fusion protein. Transfection of Hela cells was performed using lipofectamine and 1 ⁇ g luciferase reporter construct and 1 ⁇ g pROR ⁇ t-N1 plasmid were mixed with positive reagent (Invitrogen) and then serum-free Opti-MEM (Gibco) Diluted with.
- HeLa cells (1 x 10 5 cells per well) were mixed with DNA-Plus-Lipofectamine Reagent complexe, and then 3 hours later, 100 nM-2 ⁇ M tROR ⁇ t-TMD, tROR ⁇ t Incubated overnight with -LBD or non-transducible ROR ⁇ t-TMD fusion proteins. Cells were washed and eluted and then luciferase activity was measured using a luciferase detection system (Promega). Each transfection experiment was performed three times and luciferase activity was measured by a luminator (Promega).
- tROR ⁇ t-TMD fusion protein reduced luciferase activity by 6-fold, but tROR ⁇ t-LBD or non-transducible ROR ⁇ t-TMD had no effect.
- the tROR ⁇ t-TMD (RR-AG) variant which does not bind DNA by mutating amino acids that bind DNA in tROR ⁇ t-TMD, did not bind to the IL-17 promoter and did not inhibit luciferase activity (FIG. 5).
- the tROR ⁇ t-TMD fusion protein specifically inhibited the intracellular RORgt binding to the IL-17 promoter, and this inhibitory function was selective for the IL-17 promoter.
- tGT3-TMD comprising the transcriptional activity regulatory domain of GATA-3 (SEQ ID NO: 3) and tTbet-TMD comprising the transcriptional activity regulatory domain of Tbet (SEQ ID NO: 4) as described above It was confirmed to inhibit the activity (see Fig. 4b, 4c).
- Splenocytes were isolated from the spleens of 7-week-old female C57BL / 6 mice and incubated for 72 hours with 0.5 ⁇ g / ml of anti-CD28 antibody in 12 wells coated with 1 ⁇ g / ml of anti-CD3 antibody.
- the amount of cytokines secreted in Th1, Th2, and Th17 cells was measured by ELISA.
- IL-17A representing TH17
- IL-2 which are known to be activated, were activated by TcR activation through anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. It was found that secretion increases.
- splenocytes were treated with 200 nM tROR ⁇ t-TMD fusion protein for 1 hour before activating TcR with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies.
- the protein was delivered to cells by first incubating the cells, and the undelivered proteins were washed and activated using anti-CD3 and anti-CD28 antibodies in the same manner as above to confirm the amount of cytokines.
- IFN- ⁇ , IL-4, and IL-2 were not changed by intracellular delivery of tROR ⁇ t-TMD, but the amount of IL-17A was significantly reduced in a concentration-dependent manner.
- the tROR ⁇ t-TMD fusion protein did not affect IFN-g or IL-4 cytokine secretion in Th1 and Th2 and IL-2 secretion by T cell activation, and selectively secreted IL-17A secreted in TH17 cells. It was confirmed to inhibit (see Fig. 6).
- Splenocytes were isolated from 7-week-old female C57BL / 6 mice as in Example 3-1, and then CD4 + CD25- CD62L + immature T cells, which were cells exposed to no antigen using MACS (Magnetic Cell Sorting).
- MACS Magnetic Cell Sorting
- IL-12 10 ng / ml and anti IL-4 antibody were added to differentiate to TH1, IL-4, IL-5 ng / ml and anti-IFN- ⁇ antibody were added to differentiate to TH2, TH17
- 3 ng / ml TGF ⁇ 1, 30 ng / ml IL-6 and 100 ng / ml IL-21 and anti-IL-4 antibody and anti-IFN- ⁇ antibody were added.
- the amount of each cytokine was confirmed by ELISA of the culture medium, and the representative cytokines of TH1 and TH2 were not changed, but IL-17A and IL-17F, which are representative cytokines of TH17 cells induced by RORgt, were significantly reduced.
- the tROR ⁇ t-TMD fusion protein can selectively inhibit the differentiation process into TH17 cells in which RORgt plays an important role and cytokines induced by Th17 cells (see FIG. 7).
- tROR ⁇ t-TMD DNA binding present in tROR ⁇ t-TMD to determine whether tROR ⁇ t-TMD fusion protein is important for the direct inhibition of tROR ⁇ t-TMD with promoters of genes induced by RORgt in the differentiation of Th17 cells induced by RORgt TROR ⁇ t-TMD (RR-AG) mutated amino acids were treated with immature cells instead of tROR ⁇ t-TMD under the same conditions. Although tROR ⁇ t-TMD (RR-AG) did not bind to the promoter of IL-17 gene induced by RORgt, it was found to partially inhibit the differentiation into Th17 cells.
- Example 3-2 In order to confirm the regulatory function of differentiation of the ligand binding domain located at the carboxyl terminus of ROR ⁇ t into Th17 cells, the same experiment as in Example 3-2 was performed with 100 nM tROR ⁇ t-LBD fusion protein. As a result, no change occurred in all of the differentiation into TH1, TH2, and TH17 cells. This result confirmed that only tROR ⁇ t-TMD can specifically inhibit the TH17 differentiation. Since ROR ⁇ t-TMD without PTD was not delivered in the cell, the same 100 nM delivery had no effect on differentiation into Th17 cells.
- tTbet-TMD protein In order to investigate the function of inhibiting Th1 cell differentiation of tTbet-TMD protein, immature T cells were isolated and treated with tTbet-TMD, and then analyzed for differentiation by Tbet under conditions that induce differentiation into Th1 cells. Rat splenocytes were removed and CD4 + CD62L + inactive T cells were isolated using a magnetic cell separator, and then treated with 4 uM of tTbet-TMD protein for 2 hours.
- the cells permeated with tTbet-TMD protein were activated with CD3 (1 ug) and CD28 (1 ug) and IL-12 (10 ng / ml) and anti-IL-4 (5ug / ml) to create a Th1 differentiation environment.
- cells were harvested and reactivated with PMA (50ng / ml) and ionomycin (1ug / ml) for 4 hours.
- Active and Th1 differentiated cells were harvested to infiltrate the cell membranes and the amount of IFN- ⁇ present in the cells was measured by an fluorescence cell separator with an anti-IFN- ⁇ antibody fused with FITC fluorescent material.
- the tTbet-TMD protein may be a substance capable of preventing chronic inflammatory reactions and autoimmune diseases by inhibiting T-bet's transcriptional function and preventing Th1 cell activity and differentiation.
- each tFoxp3-TMD fusion protein competitively inhibited the function of Foxp3 in the natural regulator T cells and analyzed whether there was a change in the immune response and function inhibition of T cells.
- Natural regulator T cells were evicted from mouse splenocytes through a magnetic cell separator and then promoted proliferation of natural regulator cells into myeloid dendritic cells with allogenic MHC, followed by spontaneous regulator cells with respective tFoxp3-TMD fusion proteins.
- CD4 + CD25-acting T cells and natural regulator T cells treated with each tFoxp3-TMD fusion protein were incubated for 72 hours in the same manner, and then the thymidine detection reaction suppressed the immune response of natural regulator T cells.
- each tFoxp3-TMD fusion protein competitively inhibited the function of Foxp3 in the inducer regulator T cells, and analyzed whether there was a change in the immune response and function inhibition of the functioning T cells.
- CD4 + T cells were removed from the splenocytes of the FoxP3-GFP knock-in mouse model through a magnetic cell separator, and then CD4 + GFP-CD62L2 + cells were separated by a fluorescent cell separator.
- Each tFoxp3-TMD fusion protein was administered to isolated cells, activated by ⁇ CD3 and ⁇ CD28 in proliferation medium containing TGF (10 ng / ml) and IL-2 (100 U / ml), and differentiated into regulatory T cells. Induced.
- induction regulator T cells administered with each tFoxp3-TMD fusion protein was analyzed by thymidine detection reaction.
- Induction regulator T cells to which tFoxp3-F-TMD protein was administered were similar to 96% of intracellular FoxP3 expression in differentiated cells.
- most of the modulator T cells treated with the tFoxp3-TMD fusion protein effectively inhibited the proliferation of the acting T cells, whereas the ratio of the acting T cells and the modulator T cells was 1: 4 from tFoxp3-F-TMD.
- EAE experimental autoimmune encephalomyelitis
- the degree of disease is evaluated by scoring the degree (1 point). : Slight paralysis on tail, 2 points: complete paralysis on tail and some paralysis on hind legs, 3 points: full hind limb paralysis, 4 points: full hind limb paralysis, 5 points: full hind limb paralysis and slight / complete paralysis, 6 points: death).
- the disease animal model was administered intraperitoneally with 50 ⁇ g of tROR ⁇ t-TMD fusion protein three times a week from day two. As a result, the incidence was reduced to 50% in the rats to which the tROR ⁇ t-TMD fusion protein was administered.
- tROR ⁇ t-TMD has a therapeutic effect on multiple sclerosis in which Th17 cells play an important role in disease induction
- the symptom of disease progresses sufficiently in the same model of EA ⁇ disease, resulting in a clinical score of 3 (one hind limb paralysis).
- 50 ⁇ g of tROR ⁇ t-TMD fusion protein was administered to the abdominal cavity three times a week.
- the clinical score of the disease was significantly reduced, and almost all symptom of the disease disappeared on day 22. Therefore, tROR ⁇ t-TMD has both therapeutic and prophylactic effects on EAE, an autoimmune disease induced by Th17 cells. (See Figure 11).
- mice treated with tROR ⁇ t-TMD were isolated and CD4 T cells were reactivated using MOG peptides that acted as antigens. In this case, since the mouse has already been exposed to the antigen, stimulation again in vitro results in stronger activity, and the differentiated CD4 T cells secrete their respective cytokines.
- tROR ⁇ t-TMD fusion protein from day 2
- splenocytes were obtained on day 10 after disease induction and reactivated with 40 ⁇ g / ml of MOG peptide for 48 hours.
- IL-17A As a result of confirming the amount of cytokine present in the culture by ELISA, IL-17A was significantly reduced, and it was confirmed that the secretion of IFN-g specifically secreted from Th1 cells was also significantly reduced (see FIG. 12).
- the cytokine levels were measured by intracellular staining and FACS with fluorescently labeled antibodies that were selective for cytokines present in cells after treatment with an inhibitor called Golgi PLUG to prevent cytokines from secreting the cells. The same result was obtained (see FIG. 13).
- the treatment and prevention of EAE by tROR ⁇ t-TMD inhibits the function of RORgt selectively in the cells of tROR ⁇ t-TMD, thereby inhibiting the differentiation and action of Th17 cells, thereby suppressing cytokines secreted from Th17 cells such as IL-17.
- Th17 cells such as IL-17.
- the differentiation and impairment of Th17 cells by RORgt inhibits the secretion of Th1 cytokines such as IFN-g, which induces the activation and function of Th1 cells after Th17 cells initially activate and function in EAE animal diseases. I think.
- the present inventors immunohistochemically analyzed the inflammatory cells using H & E and PAS staining, and confirmed that the inflammatory cells penetrated into the myelin sheath when EAE disease was induced, and the mice treated with tROR ⁇ t-TMD The case confirmed that there were only cells similar to normal. All these results indicate that tROR ⁇ t-TMD inhibits the differentiation and function of Th17 cells through RORgt in vitro and in vivo, thereby reducing cytokines such as IL-17 that are specifically secreted by Th17 cells. It was proved to play a role in preventing the induction (see FIGS. 14, 15 and 16).
- tGT3-TMD fusion protein in a Th2 cell-induced asthma model in vivo, 6-week-old male BALB / c mice were treated with 100 ⁇ g of egg albumin and 20 mg on days 1 and 14.
- the aluminum hydroxide of (aluminum hydroxide) was injected into the abdominal cavity to stimulate.
- 75 ⁇ g of tGT3-TMD protein was locally delivered to the lung and bronchus by intranasal injection, and then stimulated locally with 150 ⁇ g of egg albumin.
- the cells were separated from BAL fluid from rats and the number of various inflammatory and immune cells was determined by differential staining.
- the present inventors used immunohistochemistry to find out how lung and bronchial morphology and inflammation vary with the effect of disease treatment by tGT3-TMD, as in Example 5-1.
- Induction of diseased animals and tGT3 After treatment with -TMD, the lungs and bronchus of the animal model from which red blood cells were removed by PBS washing were stored in formaldehyde for 24 hours before making paraffin tissue sections.
- the paraffin tissue sections were observed by staining with H & E and PAS, and the treatment of the tGT3-TMD recombinant fusion protein showed that the tissues of the bronchus returned to normal compared to the disease-causing model in which many tissues were destroyed.
- tGT3-TMD fusion protein plays a role in treating allergic asthma by inhibiting the response of TH2 by inhibiting the transcriptional function of GATA-3 (see FIG. 19).
- Acute toxicity test was performed using 6-week-old specific pathogen-free (SPF) SD rats from the Korea Experimental Supply Center.
- tROR ⁇ t-TMD fusion protein of the present invention Two animals in each group were orally administered with tROR ⁇ t-TMD fusion protein of the present invention at a dose of 1 g / kg once, and then observed the mortality, clinical symptoms, and weight changes of the animals, and hematological and blood biochemical tests. Necropsy was performed to visually observe abnormalities in the organs and thoracic organs.
- the tROR ⁇ t-TMD fusion protein of the present invention did not show a change in toxicity even in rats up to 1 g / kg, and the minimum lethal dose (LD50) of the present invention was determined to be a safe substance of 1 g / kg or more.
- composition comprising the fusion protein according to the present invention is in the form of powder, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols and the like, oral preparations, suppositories, or sterile injectable solutions, respectively, according to a conventional method.
- Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose in the protein.
- Lactose, gelatin and the like can be mixed.
- lubricants such as magnesium stearate, talc can also be used.
- Liquid preparations for oral use include suspensions, solvents, emulsions, and syrups, and include various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin.
- Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations and suppositories.
- non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used.
- injectable ester such as ethyl oleate and the like
- suppositories witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
- the protein of the present invention may vary depending on the age, sex, and weight of the patient, but generally in an amount of 0.01 to 500 mg / kg, preferably 0.1 to 100 mg / kg, divided once or several times daily May be administered.
- the dosage of the protein can also be increased or decreased depending on the route of administration, the severity of the disease, sex, weight, age and the like. Therefore, the above dosage does not limit the scope of the present invention in any aspect.
- the fusion protein of the present invention can be used to effectively treat various diseases associated with transcription factors.
- SEQ ID NO: 1 represents the protein transport domain
- SEQ ID NO: 2 to 6 represents the transcriptional activity regulatory domain of the transcription factor
- SEQ ID NO: 7 to 11 represents the fusion protein.
Landscapes
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Abstract
본 발명은 전사인자의 전사활성 조절도메인 및 단백질 운반 도메인을 가지는 융합단백질, 이를 포함하는 전사인자 기능억제제 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 융합단백질을 이용하여 전사인자와 관련된 다양한 질병을 효과적으로 치료할 수 있다.
Description
전사인자의 전사활성 조절도메인 및 단백질 운반 도메인을 가지는 융합단백질 및 이를 포함하는 전사인자 기능억제제에 관한 것이다.
전사인자는 전사를 조절하는 인자로써, DNA에 결합하거나, 다른 단백질과 상호작용을 통하여 전자를 조절하며, 이것이 조절되지 않은 경우에 전사인자에 따른 여러가지 질병을 유발하고 있다.
한편, 단백질 운반 도메인(Protein Transduction Domain: PTD)은 1998년 HIV 바이러스에서 발견된 TAT 단백질의 일부분이 숙주세포 내로 생리활성분자를 침투시킬 수 있다는 것이 확인되면서 최초로 보고되었다. 지금까지 약 50개정도의 단백질 운반 도메인들이 발견되었으며, Tat, VP22, Antp HP4, Hph-1등이 많은 기초연구 및 신약개발에 주로 사용되고 있다. 이들 PTD는 120 kDa 이상 되는 단백질들도 단시간 내에 세포 내로 전달할 수 있을 정도로 매우 효율적인 물질전달 펩타이드이며, 단백질뿐만 아니고 DNA나 RNA, 세포내로 전달이 불가능한 화학물질들도 세포 내로 전달할 수 있다는 보고가 이루어지면서 활발한 연구가 진행되었다. 단백질 운반 도메인은 BBB (Blood Brain Barrier)를 통과하여 뇌로도 생리활성물질들을 전달 할 수 있으며, 생체의 국부약물전달경로인 피부, 기도 및 눈을 통하여 이들 생리활성물질들을 생체내로 전달 할 수 있는 새로운 약물전달시스템이다.
따라서, 본 발명자들은 전사인자가 DNA 또는 다른 단백질과의 상호작용을 통하여 기능을 발휘한다는 점을 착안하여 전사인자의 일부분과 단백질 전달 도메인을 결합시킨 융합단백질을 완성하였다.
본 발명은 전사인자의 전사활성 조절도메인 및 단백질 운반 도메인을 가지는 융합단백질을 포함하는 전사인자 기능억제제와 상기 융합단백질 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 전사인자 관련 질병 치료용 약학 조성물을 제공하는데 목적이 있다.
또한, 본 발명은 전사인자의 전사활성 조절도메인 및 단백질 운반 도메인을 가지는 융합단백질의 유효량을 전사인자 관련 질병을 가지는 환자에게 투여하여 전사인자 관련 질병을 치료하는 방법을 제공하는데 목적이 있다.
또한, 본 발명은 전사인자의 전사활성조절 도메인 및 단백질 운반 도메인을 포함하는 융합단백질 및 이를 코딩하는 핵산을 제공하며, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 이를 포함하는 숙주세포를 제공하는데 목적이 있다.
또한, 본 발명은 전사인자의 전사활성조절 도메인 코딩하는 유전자를 단백질 운반 도메인을 코딩하는 유전자에 결합시킨 벡터를 숙주세포에서 발현시켜서 융합단백질을 제조하는 방법을 제공하는데 목적이 있다.
일 구체예에서, "전사활성 조절 도메인"(transcriptional modulation domain: interactome)이라 함은 전사인자의 일부분으로써 전사인자의 전사과정에서 전사인자에 존재하는 다른 분자, 이에 한정하지 않지만, 예를 들어, DNA, RNA, 전사 공여 활성자, 전사 억제인자, 인핸서-결합 인자 및 리간드와 결합하거나, 이합체/다중합체(dimerization/multimerization)에 관여하거나 핵내 위치선정(nuclear localization)에 관여하는 도메인을 말한다.
일 구체예에서 전사인자의 전사활성 조절도메인 및 단백질 운반 도메인을 가지는 융합단백질을 포함하는 전사인자 기능억제제를 제공한다. 또한 상기 구체예의 전사인자는 RORγt (Retinoic acid-related orphan receptor gamma t), Tbet (T-box 21), GATA-3 (GATA binding protein 3), FOXP3 (Forkhead box P3), RORα4 (Retinoic acid-related orphan receptor alpha 4), HIF-1/2α (Hypoxia inducible factor 1/2α), STAT (Signal transducers and activators of transcription), PPARγ (peroxisome proliferator-activated receptor gamma), p53, AP-1, NFκB (nuclear factor kappa-B), NKx2.5 (NK2 transcription factor related, locus 5), FOXO (Forkhead box O), RELA (v-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A) 및 Runx (runt-related transcription factor)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나임을 특징으로 하고, 상기 구체예의 전사인자는 RORγt (Retinoic acid-related orphan receptor gamma t), Tbet (T-box 21), GATA-3 (GATA binding protein 3) 및 FOXP3 (Forkhead box P3)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나임을 특징으로 하며, 상기 구체에의 단백질 운반 도메인은 HP4, Hph-1, Mph-1, Sim-2, Tat, VP22, Antp (Antennapedia), Pep-1 (peptide), PTD-5, R9 (arginine), 7R 및 CTP(Cytoplamic transduction peptide)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나임을 특징으로 하며, 상기 구체예의 단백질 운반 도메인은 서열번호 1로 표시되는 서열을 가지는 것을 특징으로 하며, 상기 구체예의 전사인자의 전사활성조절 도메인은 DNA 결합 도메인 또는 단백질 상호작용 도메인인 것을 특징으로 하며, 상기 구체예의 전사인자의 전사활성조절 도메인은 헬릭스-턴-헬릭스(Helix-turn-helix) 도메인, 징크 핑거(Zinc finger) 도메인, 류신 지퍼(Leucine zipper) 도메인, 윙드 헬릭스(Winged helix) 도메인, 윙그 헬릭스 턴 헬릭스(Winged helix turn helix) 도메인, 헬릭스-루프-헬릭스(Helix-loop-helix) 도메인, HMG-박스(HMG-box) 도메인, 및 포크헤드(forkhead) 도메인으로 구성된 군으로 부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 구체예의 전사인자의 전사활성조절 도메인은 DNA, RNA, 전사 공여 활성자, 전사 억제인자, 인핸서-결합 인자 및 리간드와 결합하는 도메인, 이합체/다중합체(dimerization/multimerization)에 관여하는 도메인 및 핵내 위치선정(nuclear localization)에 관여하는 도메인으로 구성된 군으로 부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 구체예의 전사인자의 전사활성조절 도메인은 서열번호 2 내지 6로 표시되는 서열을 가지는 것을 특징으로 하며, 상기 구체예의 융합단백질은 서열번호 7 내지 11로 표시되는 서열을 가지는 것을 특징으로 한다.
일 구체예에서 전사인자의 전사활성조절 도메인 및 단백질 운반 도메인을 포함하는 융합단백질을 제공한다. 또한 상기 구체예의 전사인자는 RORγt (Retinoic acid-related orphan receptor gamma t), Tbet (T-box 21), GATA-3 (GATA binding protein 3), FOXP3 (Forkhead box P3), RORα4 (Retinoic acid-related orphan receptor alpha 4), HIF-1/2α (Hypoxia inducible factor 1/2α), STAT (Signal transducers and activators of transcription), PPARγ (peroxisome proliferator-activated receptor gamma), p53, AP-1, NFκB (nuclear factor kappa-B), NKx2.5 (NK2 transcription factor related, locus 5), FOXO (Forkhead box O), RELA (v-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A) 및 Runx (runt-related transcription factor)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나임을 특징으로 하고, 상기 구체예의 전사인자는 RORγt (Retinoic acid-related orphan receptor gamma t), Tbet (T-box 21), GATA-3 (GATA binding protein 3) 및 FOXP3 (Forkhead box P3)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나임을 특징으로 하며, 상기 구체예의 단백질 운반 도메인은 HP4, Hph-1, Mph-1, Sim-2, Tat, VP22, Antp (Antennapedia), Pep-1 (peptide), PTD-5, R9 (arginine), 7R 및 CTP(Cytoplamic transduction peptide)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나임을 특징으로 하며, 상기 구체예의 단백질 운반 도메인은 서열번호 1로 표시되는 서열을 가지는 것을 특징으로 하며, 상기 구체예의 전사인자의 전사활성조절 도메인은 DNA 결합 도메인 또는 단백질 상호작용 도메인인 것을 특징으로 하며, 상기 구체예의 전사인자의 전사활성조절 도메인은 헬릭스-턴-헬릭스(Helix-turn-helix) 도메인, 징크 핑거(Zinc finger) 도메인, 류신 지퍼(Leucine zipper) 도메인, 윙드 헬릭스(Winged helix) 도메인, 윙그 헬릭스 턴 헬릭스(Winged helix turn helix) 도메인, 헬릭스-루프-헬릭스(Helix-loop-helix) 도메인, HMG-박스(HMG-box) 도메인, 및 포크헤드(forkhead) 도메인으로 구성된 군으로 부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 구체예의 전사인자의 전사활성조절 도메인은 DNA, RNA, 전사 공여 활성자, 전사 억제인자, 인핸서-결합 인자 및 리간드와 결합하는 도메인, 이합체/다중합체(dimerization/multimerization)에 관여하는 도메인 및 핵내 위치선정(nuclear localization)에 관여하는 도메인으로 구성된 군으로 부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 구체예의 전사인자의 전사활성조절 도메인은 서열번호 2 내지 6로 표시되는 서열을 가지는 것을 특징으로 하며, 상기 구체예의 융합단백질은 서열번호 7 내지 11로 표시되는 서열을 가지는 것을 특징으로 한다. 또한 상기 구체예의 융합단백질을 코딩하는 핵산, 이 핵산을 포함하는 벡터 및 이 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공하고, 상기 구체예의 단백질 운반 도메인은 서열번호 1로 표시되는 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 숙주세포이며, 상기 구체예의 전사인자의 전사활성조절 도메인은 서열번호 2 내지 6으로 표시되는 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 숙주세포이며, 상기 구체예의 융합단백질은 서열번호 7-11로 표시되는 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 숙주세포이며, 상기 구체예의 숙주세포는 BL21 star (DE3) pLys S임을 특징으로 하는 숙주세포이다.
일 구체예에서 전사인자의 전사활성조절 도메인 코딩하는 유전자를 단백질 운반 도메인을 코딩하는 유전자에 결합시킨 벡터를 숙주세포에서 발현시켜서 융합단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
일 구체예에서 전사인자의 전사활성조절 도메인 및 단백질 운반 도메인을 포함하는 융합단백질 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 전사인자 관련 질병 치료용 약학 조성물을 제공한다. 또한, 상기 구체예의 전사인자가 NKx2.5 (NK2 transcription factor related, locus 5) 또는 HIF-1α (Hypoxia inducible factor 1α)인 경우 전사인자 관련 질병은 심장질환임을 특징으로 하는 약학 조성물을 제공하고, 상기 구체예의 전사인자가 HIF-1α (Hypoxia inducible factor 1α)인 경우 전사인자 관련 질병은 뇌질환임 특징으로 하며, 상기 구체예의 전사인자가 PPARγ (peroxisome proliferator-activated receptor gamma)인 경우 전사인자 관련 질병은 당뇨병임을 특징으로 하며, 상기 구체예의 전사인자가 RORγt (Retinoic acid-related orphan receptor gamma t), RORα4 (Retinoic acid-related orphan receptor alpha 4), FOXO (Forkhead box O)인 경우 전사인자 관련 질병은 자가면역질환 및 염증질환임을 특징으로 하며, 상기 구체예의 전사인자가 HIF-2α (Hypoxia inducible factor 2α) 또는 STAT (Signal transducers and activators of transcription)인 경우 전사인자 관련 질병은 자가면역질환 및 염증질환임을 특징으로 하며, 상기 구체예의 전사인자가 AP-1 또는 NFκB (nuclear factor kappa-B)인 경우 전사인자 관련 질병은 혈관질환 및 염증질환임을 특징으로 하며, 상기 구체예의 전사인자가 p53, SP1 또는 RELA (v-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A)인 경우 전사인자 관련 질병은 암 또는 종양 질환임을 특징으로 하며, 상기 구체예의 전사인자가 GATA-3 (GATA binding protein 3)인 경우 전사인자 관련 질병은 천식 및 아토피임을 특징으로 하며, 상기 구체예의 전사인자가 RORγt인 경우 전사인자 관련 질병은 다발성 경화증, RA, IBD임을 특징으로 하며, 상기 구체예의 전사인자가 Foxp3인 경우 전사인자 관련 질병은 암 또는 종양 질환임을 특징으로 하며, 상기 구체예의 전사인자가 Tbet인 경우 전사인자 관련 질병은 RA, IBD 및 EAE임을 특징으로 한다.
본 발명의 융합단백질을 이용하여 전사인자와 관련된 다양한 질병을 효과적으로 치료할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구체예로 사용된 RORgt-TMD와 HP4-PTD의 융합단백질(이하, tRORgt-TMD 라고 함), PTD가 없어 세포내로의 전달이 불가능한 RORgt-TMD, RORgt-TMD 대신 LBD (라이겐드 바인딩 도메인)을 가진 tRORgt-LBD 융합단백질의 구조이다.
도 2는 발명의 일 구체예로 사용된 tRORgt-TMD, RORgt-TMD, 그리고 tRORgt-LBD 융합단백질에 대한 코마시 블루 염색 사진이다.
도 3은 발명의 일 구체예로 사용된 tRORgt-TMD 융합단백질이 절켓 T 세포에 농도별, 시간별로 전달된 것을 확인한 웨스턴 블롯 사진이다.
도 4는 발명의 일 구체예로 사용된 tRORgt-TMD 융합 단백질이 HeLa 세포의 핵 내로 전달된 것을 형광현미경을 통해서 본 사진이다.
도 5는 발명의 일 구체예로 tRORgt-TMD가 세포내에 존재하는 RORgt가 IL-17 promoter에 결합하는 것을 농도의존적으로 저해하며, TMD대한 LBD을 가진 융합단백질(tRORgt-LBD), PTD가 없는 RORgt-TMD 및 tRORgt-TMD에서 DNA와의 결합에 관여하는 아미노산을 변이하여 DNA에 결합하지 못하는 mutant 형태의 tRORgt-TMD (RR-AG)는 저해하지 못한다는 결과이다.
도 6은 발명의 일 구체예로 사용된 tRORgt-TMD 융합 단백질이 비장세포에서 anti-CD3와 anti-CD28 mAb에 의한 TcR 활성화에 의하여 Th17 cell에서 분비하는 IL-17A을 선택적으로 저해하지만, Th1 cell에서 분비하는 IFN-γ, Th2 cell 에서 분비하는 IL-4, T cell이 활성화되었을 때 분비하는 IL-2의 조절에는 영향을 미치지 않는다는 결과이다.
도 7은 발명의 일 구체예로 사용된 tRORgt-TMD 융합 단백질이 CD4+CD25-CD62L+ 미성숙 T 세포가 Th17 세포로 분화되는 것을 억제하여 Il-17A and IL-17F의 발현 및 분비를 특이적으로 저해하며, Th1 cell의 분화저해에 의한 IFN-g 분비 및 Th2 cell의 분화저해에 의한 IL-13의 분비에는 영향이 없다는 결과이다. 그러나 tRORgt-LBD, PTD가 없는 tRORgt-TMD는 Th17 T cell의 분화저해기능이 없다는 결과이다. 또한 tRORgt-TMD에서 DNA 결합에 관여하는 아미노산을 변이시켜 DNA에 결합하지 못하는 tRORgt-TMD(RR-AG)는 Th17 T cell의 분화를 부분적으로 가지고 있다는 결과이다.
도 8은 발명의 일 구체예로 tRORgt-TMD가 세포내에 존재하는 RORgt가 IL-17A promoter에 결합하는 것을 농도의존적으로 저해하며, LBD을 가진 융합단백질, (tRORgt-LBD), PTD가 없는 RORgt-TMD 에서는 저해효과가 없지만, DNA와의 결합에 관여하는 아미노산을 변이하여 DNA에 결합하지 못하는 mutant 형태의 tRORgt-TMD (RR-AG)는 다른 기작을 통하여 일부 저해한다는 결과이다.
도 9는 발명의 일 구체예로 tFoxp3-TMD 융합 단백질의 전달에 의하여 자연 조절자 T 세포내의 Foxp3의 기능을 경쟁적으로 저해하여 작용 T 세포의 면역반응 및 기능의 저해에 변화에 대한 결과이다.
도 10은 상기 도 9의 결과를 막대그래프로 표시한 것이다.
도 11은 발명의 일 구체예로 사용된 tRORgt-TMD 융합 단백질이 다발성 경화증 동물모델인 EAE에서 뛰어난 질환치료 및 예방효과가 있다는 것을 나타낸 결과이다.
도 12는 발명의 일 구체예로 사용된 tRORgt-TMD 융합 단백질이 다발성 경화증 동물모델인 EAE에서 Th17 cell의 분화를 억제하여 IL-17의 분비를 저해하고, 이 같은 저해효과는 Th1세포에서의 IFN-g분비도 저해한다는 것을 ELISA 방법으로 분석한 결과이다.
도 13은 발명의 일 구체예로 tRORgt-TMD 융합 단백질이 다발성 경화증 동물모델인 EAE에서 Th17 cell의 분화를 억제하여 IL-17의 분비를 저해하고, 이 같은 저해효과는 Th1세포에서의 IFN-g분비도 저해한다는 것을 intracellular staining 방법으로 분석한 결과이다.
도 14은 발명의 일 구체예로 사용된 tRORgt-TMD 융합 단백질이 다발성 경화증 동물모델인 EAE에서 CNS의 demyelination을 저해하는 효과가 있다는 것을 myelination 부분을 염색하는 룩솔 패스트 블루(Luxol Fast Blue) 염색법으로 확인한 결과이다.
도 15는 발명의 일 구체예로 사용된 tRORgt-TMD 융합 단백질이 다발성 경화증 동물모델인 EAE에서 CNS로의 염증세포의 침윤을 저해한다는 결과를 조직할적 측면에서 해마톡실 & 에오신(Hematoxylin & Eosin) 염색법으로 확인한 사진이다.
도 16은 발명의 일 구체예로 사용된 tRORgt-TMD 융합 단백질이 다발성 경화증 동물모델인 EAE에서 CNS로의 염증세포의 침윤을 저해한다는 결과를 조직학적 측면에서 페리오딕 산 쉬프(Periodic acid Schiff) 염색법으로 확인한 사진이다.
도 17은 발명의 일 구체예로 사용된 tGT3-TMD 재조합 융합 단백질이 알러지성 천식 동물모델에서 기도를 통하여 분무하였을 때, 여러 가지 염증 세포 및 면역세포들의 침윤을 효과적으로 줄인다는 것을 세포 감별 염색법을 통해 확인한 그래프이다.
도 18은 발명의 일 구체예로 사용된 tGT3-TMD 재조합 융합 단백질이 알러지성 천식 동물모델에서 기도를 통하여 분무하였을 때, TH2 특이적인 싸이토카인인 IL-4와 IL-5의 분비를 줄임으로써 치료효과를 나타내는지를 ELISA를 통해 확인한 그래프이다.
도 19는 발명의 일 구체예로 사용된 tGT3-TMD 재조합 융합 단백질의 알러지성 천식 동물모델에서의 치료 효과를 조직학적 측면에서 염증세포의 침윤을 저해한다는 것을 해마톡실 & 에오신(Hematoxylin & Eosin) 염색법으로 확인한 사진이다.
실시예 1: 전사활성조절 도메인 및 단백질 운반 도메인의 융합단백질의 제작 및 분리정제
RORgt의 전사활성조절 도메인인 RORgt-TMD(서열번호: 2, 전사인자 RORgt의 전사활성조절 도메인) 또는 RORgt-LBD을 PCR을 이용하여 클로닝하여, 이들과 단백질 운반 도메인인 HP4 (서열번호: 1)가 융합된 tRORgt-TMD, tRORgt-LBD, 또는 HP4 PTD가 없는 RORgt-TMD와 같은 3개의 재조합 DNA를 제작하였다(도 1). 이들 3개의 재조합 DNA들을 pRSETb 벡터에 클로닝하고, 3개의 재조합 벡터로 BL21 star (DE3) pLys S 균주를 형질전환시켰다. 형질전환 균주를 배양한 후 1 mM IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 넣어서 8시간 동안 tRORgt-TMD, tRORgt-LBD 및 RORgt-TMD단백질을 발현하도록 유도하였다. 그 후 배양된 세포를 모아서 분해용 완충액 (10 mM 이미다졸, 300 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, pH 8.0)으로 용해시킨 후 분쇄기로 세포를 분해시켰다. 이들 tRORgt-TMD, tRORgt-LBD 및 RORgt-TMD 융합단백질 앞 부분에 표지시켜 놓은 6개의 히스티딘(Histidine)을 이용하여 Ni-NTA 비드에 융합단백질들을 결합시켰다. Ni-NTA 비드를 가지고 있는 컬럼에 단백질을 넣고 세척용 완충액 (30 mM 이미다졸, 300 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, pH 8.0)으로 충분히 세척하고, 용출용 완충액(3M 이미다졸, 30 0mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, pH 8.0)로 단백질을 비드에서 분리하였다. PD-10을 이용하여 완충액을 10 % 글리세롤 PBS로 바꾸어주면서 NaCl과 이미다졸을 제거하였다. 얻어진 융합단백질에는 LPS와 같은 엔도톡신이 존재하므로 이를 제거하기 위해 SP비드를 통하여 한번 더 정제를 하였다. 이를 다시 결합용 완충액 (300 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, pH 7.2)으로 결합시킨 후 이를 컬럼에 넣고 용출용 완충액 (2M NaCl, 50 mM NaH2PO4, pH 8.0)으로 단백질을 분리하였다. 마지막으로 PD-10 컬럼을 통하여 NaCl을 제거하고 완충액을 PBS로 바꾸어준 후 실험 전까지 80℃에서 보관하였다. 분리정제된 tRORgt-TMD, tRORgt-LBD, RORgt-TMD 융합단백질을 SDS-PAGE에서 분석하여 이들 단백질들이 크기 및 순도를 분석하였다 (도 2).
상기와 같은 방법으로, GATA-3의 전사활성 조절도메인(서열번호 3)을 포함하는 tGT3-TMD, Tbet의 전사활성 조절도메인(서열번호 4)을 포함하는 tTbet-TMD 및 FoxP3의 전사활성 조절도메인(서열번호 5 및 6)을 포함하는 tFoxp3-TMD를 제조하였다(도 1b, 1c, 1d 참조).
실시예 2: 융합 단백질의 세포 내 전달 확인
<2-1. 웨스턴 블롯을 이용하여 세포내 전달 확인>
절켓 T 세포 또는 C57BL/6 쥐의 비장세포를 이용하여 농도별 (0, 100nM, 200nM, 500nM, 1μM, 2μM, 5μM)로 또는 시간별 (0, 1, 3, 6, 12, 24, 48h)로 tRORgt-TMD 융합단백질을 1시간씩 함께 배양한 후, 세포내로 들어가지 않은 단백질들을 제거하기 위하여 이들 세포들을 PBS로 여러 차례 세척하였다, 세포들을 용출시키고 용출물에 있는 단백질들을 SDS-PAGE에서 분리한 후, tRORgt-TMD을 인식할 수 있는 mAb를 이용하여 웨스턴 블롯으로 단백질 전달 여부를 확인하였다(도 3 참조). tRORgt-TMD이 농도에 의존적으로 세포내로 잘 전달되는 것을 확인하였고, 1시간 내에 대부분의 단백질이 세포 내로 전달이 되었으며, 세포 내에서 분해가 일어나면서 세포내로의 전달 후 48시간이 지나면 대부분의 단백질이 분해되는 것을 확인하였다. tRORgt-TMD 단백질이 오랫동안 분해가 되지 않아 생겨나는 부작용은 발생하지 않을 것임을 확인하였다.
<2-2. 항체를 이용하여 세포의 핵까지 전달되는지 여부 확인>
tRORgt-TMD 융합단백질 500 nM을 1시간 동안 HeLa 세포와 함께 배양을 한 후 PBS로 세포들을 세척한 다음, Triton X-100을 이용하여 세포막의 투과성을 중가시킨 후 형광 표지 항체를 세포내로 전달한 후 상기 융합단백질에 결합시켰다. 그 다음에 DAPI 염색제를 이용하여 세포의 핵을 염색한 후, 형광현미경을 통해서 형광의 위치를 확인하여 융합단백질이 전달된 위치를 확인하였다. 그 결과 tRORgt-TMD 단백질은 PTD의 세포의 핵까지 전달되었다는 것을 확인하였다(도 4a참조).
상기와 같은 방법으로 도 1의 GATA-3의 전사활성 조절도메인(서열번호 3)을 포함하는 tGT3-TMD, Tbet의 전사활성 조절도메인(서열번호 4)을 포함하는 tTbet-TMD 및 FoxP3의 전사활성 조절도메인(서열번호 5 및 6)을 포함하는 tFoxp3-TMD가 세포내로 전달되는 것을 확인하였다(도 4b, 4c, 4d 참조).
실시예3: 융합단백질에의한 특이적 전사활성 억제 효과
<3-1. 사이토카인 IL-17A 의 생성 억제>
tRORgt-TMD 단백질이 세포내로 전달되었을 때, 세포내의 RORgt가 IL-17 프로모터에 결합하는 것을 경쟁적으로 그리고 특이적으로 저해하는 지를 확인하기 위하여, 루시퍼레이즈 유전자의 발현이 IL-17 프로모터에 의하여 조절되는 DNA와 RORgt를 발현하는 DNA를 Hela 세포에 트랜스팩션시킨 다음, tRORgt-TMD 융합단백질과 같이 배양하였다. Hela 세포의 트랜스팩션은 리포펙타민을 사용하였으며 1 μg 루시퍼라아제 리포터 컨스트럭트와 1 μg pRORγt-N1 플라즈미드를 플러스 시약 (Invitrogen)과 혼합한 후, 혈청이 없는 상태에서 Opti-MEM (Gibco)로 희석하였다. 이 전-혼합물을 실온에서 15분 정도 인큐베이션한 후, HeLa cells (1 x 105cells per well)과 DNA-Plus-Lipofectamine Reagent complexe를 혼합한 다음, 3시간 후에 100nM - 2μM의 tRORγt-TMD, tRORγt-LBD 또는 non-transducible RORγt-TMD 융합단백질과 혼합하여 밤새 배양하였다. 세포들을 세척한 후 용출시킨 다음 루시퍼라아제 검출 시스템 (Promega)을 이용하여 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. 각 트랜스팩션 실험은 세 번을 하였으며 루미네이터(Promega)로 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. tRORγt-TMD 융합단백질은 루시퍼라아제 활성을 6배정도 감소시켰으나, tRORγt-LBD 또는 non-transducible RORγt-TMD는 전혀 효과가 없었다. 또한 tRORγt-TMD에서 DNA와 결합하는 아미노산을 변이시켜 DNA와 결합하지 못하는 tRORγt-TMD (RR-AG) 변이체는 IL-17 프로모터에 결합하지 못하여 루시퍼라아제 활성을 저해하지 못하였다(도 5). 따라서 tRORγt-TMD 융합단백질은 특이적으로 세포내의 RORgt가 IL-17 프로모터에 결합하는 것을 저해하며 이 저해기능은 IL-17 프로모터에 선택적이었다.
상기와 같은 방법으로 도 1의 GATA-3의 전사활성 조절도메인(서열번호 3)을 포함하는 tGT3-TMD 및 Tbet의 전사활성 조절도메인(서열번호 4)을 포함하는 tTbet-TMD에 의하여 루시퍼라아제 활성을 저해하는 것을 확인하였다(도 4b, 4c 참조).
7주령 된 암컷 C57BL/6 쥐의 비장에서 비장세포를 분리하고 이 세포를 항 CD3 항체 1μg/ml로 코팅한 12 웰(well)에 항 CD28 항체 0.5μg/ml과 함께 72시간 동안 배양한 후 배양액에 존재하는 사이토카인을 ELISA를 이용하여 Th1, Th2, Th17 cell에서 분비하는 사이토카인의 양을 측정하였다. TH1을 대표하는 IFN-γ와 TH2를 대표하는 IL-4, TH17을 대표하는 IL-17A 및 T 세포의 활성화가 되었음을 알 수 있는 IL-2가 모두 항 CD3 및 항 CD28 항체를 통한 TcR 활성화에 의하여 분비가 증가한다는 것을 알았다.
IL-17A를 발현하게 하는 RORγt의 작용을 tRORγt-TMD 융합단백질이 억제할 수 있는지 확인하기 위하여, 항 CD3 및 항 CD28 항체로 TcR을 활성화시키기 전에 비장세포를 200 nM tRORγt-TMD 융합단백질과 1시간 동안 먼저 배양시켜 단백질을 세포 내로 전달시킨 후, 전달되지 못한 단백질들은 세척하고 상기와 동일한 방법으로 항 CD3 및 항 CD28 항체를 이용하여 활성화시켜서 싸이토카인의 양을 확인하였다. 그 결과 IFN-γ, IL-4, IL-2 모두tRORγt-TMD의 세포내 전달에 의하여 변화가 없었지만, IL-17A의 양은 농도 의존적으로 확연하게 줄어들었음을 확인하였다. 이를 통해 tRORγt-TMD 융합단백질이 Th1 과 Th2에서의 IFN-g 또는 IL-4 사이토카인 분비 및 T 세포 활성화의한 IL-2 분비에는 영향을 주지 않고, TH17세포에서 분비하는 IL-17A를 선택적으로 저해한다는 것을 확인하였다 (도 6 참조).
<3-2. TH17 cell로의 분화에 대한 선택적인 억제 효과>
실시예 3-1에서와 같이 7주령 된 암컷 C57BL/6의 쥐에서 비장세포를 분리한 후 MACS(Magnetic Cell Sorting)를 이용하여 어떠한 항원에도 노출되지 않은 상태의 세포인 CD4+ CD25- CD62L+ 미성숙 T 세포를 분리하였다. 미성숙 CD4 T 세포에 tRORγt-TMD 융합단백질을 100 nM 및 100 fM을 1시간 동안 배양시킨 후, 항 CD3 항체 1 μg/ml가 코팅되어있는 12웰에 항 CD28 항체 0.5 μg/ml와 각 Th1, Th2 or Th17 세포로 분화를 유도시킬 수 있는 사이토카인을 함께 넣고 72시간 동안 배양하였다. TH1로 분화시키기 위하여 IL-12 10 ng/ml 및 항 IL-4 항체를 첨가하였고, TH2로 분화시키기 위하여 IL-4, IL-5 ng/ml 및 항-IFN-γ항체를 첨가하였으며, TH17로 분화시키기 위하여 TGFβ1 3 ng/ml, IL-6 30 ng/ml 및 IL-21 100 ng/ml와 항 IL-4 항체 및 항-IFN-γ항체를 첨가하였다. 72시간 뒤에 배양액을 ELISA로 각 싸이토카인의 양을 확인해본 결과 TH1, TH2의 대표적인 싸이토카인은 아무런 변화가 없는 반면, RORgt에 의하여 유도되는 TH17 세포의 대표적인 싸이토카인인 IL-17A 및 IL-17F이 확연하게 줄어들었음을 확인하였다. 이 결과로부터 RORgt가 중요한 역할을 하는 TH17 세포로의 분화과정 및 Th17 cell에서 유도분비되는 사이토카인에서도 tRORγt-TMD 융합단백질이 선택적으로 억제기능을 할 수 있다는 것을 알 수 있었다 (도 7참조).
tRORγt-TMD 융합단백질이 RORgt에 의하여 유도되는 Th17 세포의 분화저해기능에서, tRORγt-TMD가 RORgt에 의하여 유도되는 유전자들의 프로모터와의 직접적인 결합이 중요한 지를 알아 보기위하여, tRORγt-TMD에 존재하는 DNA 결합 아미노산들을 변이시킨 tRORγt-TMD(RR-AG)을 위와 동일한 조건에서 tRORγt-TMD 대신 미성숙세포를 처리하였다. tRORγt-TMD(RR-AG)가 RORgt에 의하여 유도발현되는 IL-17 유전자의 프로모터 에는 전혀 결합을 못하지만, Th17 cell로의 분화는 부분적으로 저해하는 것을 알수 있었다. 이같은 결과는 tRORγt-TMD 융합단백질이 RORgt에 의하여 유도되는 유전자들의 프로모터에 RORgt가 결합하는 것을 선택적으로 저해할 뿐만 아니라, RORgt에 의하여 유도되는 유전자들의 프로모터에 RORgt에 의하여 recruit되는 interactome의 기능을 저해하여 Th17 cell로의 분화를 저해한다는 것을 알수 있었음 (도 8 참조).
RORγt의 카르복실 말단에 위치하는 리간드 결합 도메인의 Th17 cell로의 분화에 대한 조절기능을 확인하기 위하여, tRORγt-LBD 융합단백질 100 nM로 실시예 3-2와 동일한 실험을 수행하였다. 그 결과 TH1, TH2, 및 TH17세포로의 분화 모두에서 어떠한 변화도 일어나지 않았다. 이 결과를 통해 tRORγt-TMD만이 특이적으로 TH17 분화에 억제효과를 나타낼 수 있다는 것을 확인하였다. PTD가 없는 RORγt-TMD는 세포 내에 전달이 되지 않기 때문에 같은 100 nM를 전달하여도 Th17 cell로의 분화에 아무런 효과가 없다는 것을 함께 확인하였다.
<Th1 세포 분화 억제 기능>
tTbet-TMD단백질의 Th1 세포 분화 억제 기능을 알아보기 위하여, 미성숙 T 세포를 분리하여 tTbet-TMD를 처리한 다음, Th1세포로의 분화를 유도하는 조건에서 Tbet에 의하여 분화가 잘 이루어지는 지를 분석하였다. 쥐의 비장세포를 축출하여 자석세포분리기를 이용해 CD4+CD62L+ 비활성 T 세포를 분리한 후 4 uM의 tTbet-TMD단백질을 2시간 동안 처리하였다. PBS로 씻어내 세포 내로 투과되지 못한 단백질들을 제거한 후 tTbet-TMD 단백질이 투과된 세포를 CD3(1 ug)과 CD28(1 ug)로 활성화 시키고 IL-12(10ng/ml)과 anti-IL-4(5ug/ml)로 Th1 분화환경을 조성하였다. 72시간의 세포배양 후 세포를 걷어 4시간 동안 PMA(50ng/ml)과 ionomycin(1ug/ml)로 재활성화 시켰다. 활성 및 Th1 분화가 된 세포를 걷어 세포막을 침투화시키고 FITC 형광물질이 융합된 안티 IFN-γ 안티바디로 세포 내 존재하는 IFN-γ의 양을 형광세포분리기로 측정하였다. 그 결과, 활성 및 Th1 분화가 되기 전 tTbet-TMD단백질이 전달되어 있던 세포는 그렇지 않은 세포보다 Th1 분화가 확연히 적게 이루어 진 것으로 나타났다. 따라서, tTbet-TMD단백질이 세포내 존재하는 T-bet의 전사기능을 억제하여 Th1세포의 활성 및 분화를 방지하여 만성염증반응 및 자가면역질환을 예방할 수 있는 물질이 될 수 있음을 알 수 있었다.
<자연 조절자 T 세포 기능 억제>
각각의 tFoxp3-TMD 융합 단백질의 전달에 의하여 자연 조절자 T 세포내의 Foxp3의 기능을 경쟁적으로 저해하여 작용 T 세포의 면역반응 및 기능의 저해에 변화가 있는 지를 분석하였다. 자연 조절자 T 세포를 쥐의 비장세포로부터 자석세포분리기를 통해 축출한 다음 allogenic MHC 를 가지고 있는 골수 수지상 세포로 자연조절자 세포의 증식을 촉진시킨 후 각각의 tFoxp3-TMD 융합 단백질로 자연조절자 세포를 처리하였다. 같은 방법으로 분리된 CD4+CD25- 작용 T 세포와 각 tFoxp3-TMD 융합 단백질이 처리된 자연 조절자 T세포를 함께 72시간 동안 배양시킨 후, 티미딘 검출 반응으로 자연 조절자 T세포의 면역 반응 억제기능을 확인하였다. 그 결과, tFoxp3-TMD 융합 단백질이 처리 된 대부분의 조절자 T세포가 작용 T 세포의 증식을 효과적으로 억제하는 반면, 작용 T세포와 조절자 T세포의 비율이 1:4일때부터 tFoxp3-F-TMD 단백질이 처리된 조절자 T세포의 작용 T 세포 증식 억제 기능이 현저하게 줄어든 것을 확인 할 수 있다. 이는 DNA 결합에 관여하는 아미노산잔기를 포함하고 있는 Foxp3-F-TMD가 세포내 자연적으로 존재하는 FoxP3의 기능을 저해하거나, Foxp3에 의하여 유도발현하는 유전자들의 프로모터로 접근하는 전사 활성인자의 기능을 저해하여, 자연 조절자 T 세포의 기능을 억제할 수 있음을 알 수 있었다(도 9 참조)
<유도 조절자 T세포 기능 억제>
각각의 tFoxp3-TMD 융합 단백질의 전달에 의해 유도 조절자 T 세포내의 Foxp3의 기능을 경쟁적으로 저해하여, 작용 T세포의 면역반응 및 기능의 저해에 변화가 있는 지를 분석하였다. FoxP3-GFP 녹-인 쥐 모델의 비장세포로부터 자석세포분리기를 통해 CD4+ T 세포를 축출한 후 CD4+GFP-CD62L2+ 세포를 형광세포분리기로 분리하였다. 각의 tFoxp3-TMD 융합 단백질을 분리된 세포에 투여한 후 TGF(10 ng/ml)과 IL-2(100 U/ml)가 있는 증식배지에서 αCD3와 αCD28로 활성화 시키고 조절자 T세포로의 분화를 유도하였다. 72시간 동안 세포배양 후 티미딘 검출 반응을 통해 각각의 tFoxp3-TMD 융합 단백질이 투여된 유도 조절자 T 세포의 효과 T 세포 증식억제 기능을 비교 분석하였다. tFoxp3-F-TMD 단백질이 투여된 유도 조절자 T세포와 그렇지 않은 상태에서 분화된 세포의 세포내 FoxP3 발현양은 96%로 유사하였다. 그 결과, tFoxp3-TMD 융합 단백질이 처리 된 대부분의 조절자 T세포가 작용 T 세포의 증식을 효과적으로 억제하는 반면, 작용 T세포와 조절자 T세포의 비율이 1:4일때부터 tFoxp3-F-TMD 또는 tFoxp3-R-TMD 단백질이 처리된 조절자 T세포의 작용 T 세포 증식 억제 기능이 현저하게 줄어든 것을 확인 할 수 있다. 이는 DNA 결합에 관여하는 아미노산잔기를 포함하고 있는 Foxp3-F-TMD가 세포내 자연적으로 존재하는 FoxP3의 기능을 저해하거나, Foxp3에 의하여 유도발현하는 유전자들의 프로모터로 접근하는 전사활성 조절 도메인의 기능을 저해하여, 자연 조절자 T 세포의 면역억제기능을 저해함음을 나타낸다. 또한 DNA 결합 아미노산을 포함하는 F(Forkhead binding domain) 도메인이 아닌 R (Repressor) 도메인을 전달하였을 때에도 자연조절자세포의 면역억제효과를 효과적으로 저해한 것은, DNA와 결합에 전혀 관여하지 않는 것으로 알려진 저해(repressor)도메인을 조절자 T세포내로 전달하였을 때에도 조절자 T세포의 Foxp3의 전사활성 및 기능을 효과적으로 저해할 수 있다는 것을 증명하는 것이다.
하지만 다른 tFoxp3-TMD 단백질이 투여된 세포는 효과 T 세포의 증식을 억제하지 못하는 것이 확인되었다. 따라서, 이는 FoxP3의 DNA 결합 아미노산잔기를 포함하고 있는 Foxp3-F-TMD가 조절자 T세포내 자연적으로 존재하는 FoxP3의 기능을 저해하거나, Foxp3에 의하여 유도 발현하는 유전자들의 프로모터로 접근되는 전사 활성인자의 기능을 저해하여, 자연 조절자 T 세포 뿐만 아니라 유도 조절자 T세포의 면역반응 및 기능을 억제할 수 있음을 알 수 있었다 (도 10 참조).
실시예 4: 다발성 경화증 동물모델에서의 tRORγt-TMD 융합단백질의 질환 치료효과
<4-1. tRORγt-TMD의 다발성 경화증 동물모델에서 치료효과 분석>
Th17 cell이 질병유도에 중요한 역할을 하는 다발성 경화증의 동물모델인 실험용 자가면역 뇌척수염 (EAE)라 하는 모델에서 tRORγt-TMD의 질환치료효과를 분석하기 위하여,. 6주령 된 암컷 C57BL/6 쥐를 2주 동안 안정기를 준 후 0 일과 2일째에 페르투시스 톡신(Pertussis Toxin) 500 ng씩을 복강에 주입하고, 0일과 7일째에 MOG 펩타이드 150 ng+CFA 200 μg을 각각 피하지방에 각각 주입하였다. 일반적으로 9일째부터 쥐의 행동학적 측면에서 반응이 오기 시작하며, 가장 먼저 꼬리에 마비가 오고 그 다음 뒷다리, 그 후 심하면 앞다리까지 마비가 오게 되는데 그 정도를 점수화하여 질환 정도를 평가하였다 (1점: 꼬리에 약간의 마비, 2점: 꼬리에 완전한 마비와 뒷다리에 약간의 마비, 3점: 한쪽 뒷다리 완전 마비, 4점: 양쪽 뒷다리 완전 마비, 5점: 뒷다리 완전 마비와 앞다리 약간/완전 마비, 6점: 죽음). 이러한 질환 동물 모델에 2일째부터 일주일에 3차례씩 50 μg의 tRORγt-TMD 융합단백질을 복강에 투여하였다. 그 결과 tRORγt-TMD 융합단백질을 투여한 쥐의 경우 발병율이 50%로 줄었고 그 심한 정도 또한 미비할 정도로 질환이 완화되었다. 아무것도 투여하지 않은 쥐의 경우 발병율은 100 %이고, 심한 정도 또한 3.05±0.23임에 반해, tRORγt-TMD투여 쥐는 0.55±0.27이였다. 이 같은 결과는 tRORγt-TMD이 Th17 cell이 질환유도에 중요한 역할을 하는 다발성 경화증에 탁월한 예방효과를 가지고 있다는 결과이다.
tRORγt-TMD가 Th17 cell이 질환유도에 중요한 역할을 하는 다발성 경화증에 치료효과가 있는 지를 분석하기 위하여, 위와 동일한 EAㄸ질환 모델에서 질환의 symptom이 충분히 진전이 되어 clinical score가 3(한쪽 뒷다리 완전마비상태)이 되었을 때부터 tRORγt-TMD를 일주일에 3차례씩 50 μg의 tRORγt-TMD 융합단백질을 복강에 투여하였다. tRORγt-TMD를 투여한 직 후부터 질환의 clinical score가 확연히 감소하여 22일째에는 질환의 symptom이 거의 다 사라지는 것이 관찰되었다. 따라서 tRORγt-TMD는 Th17 세포에 의하여 유도되는 자가면역질환인 EAE에 대한 치료효과 및 예방효과를 동시에 가지고 있는 것이다. (도 11 참조).
<4-2. tRORγt-TMD의 다발성 경화증 치료효과에 대한 세포수준의 작용기작 >
tRORγt-TMD에 의하여 치료효과를 나타낸 쥐의 비장세포를 분리하고 항원으로 작용했던 MOG 펩타이드를 이용하여 CD4 T 세포들을 재활성화시켰다. 이 경우 쥐의 체내에서 이미 항원에 노출되었기 때문에 체외에서 다시 자극을 주면 더 강한 활성이 일어나 분화를 마친 CD4 T세포들이 각자의 대표 싸이토카인을 분비하게 된다. tRORγt-TMD 융합단백질을 2일부터 주입해준 EAE 동물모델쥐의 경우 질환 유도 후 10일째 되는 날에 비장세포를 얻어내어 40 μg/ml의 MOG 펩타이드로 48시간 동안 재 활성화시켰다. 배양액에 존재하는 싸이토카인의 양을 ELISA를 통하여 확인해본 결과, IL-17A가 확연하게 줄어들었으며, Th1 세포에서 특이적으로 분비하는 IFN-g의 분비도 확연하게 줄어들었음 확인하였다 (도 12 참조). ELISA 결과뿐만이 아니라, 싸이토카인을 세포 밖으로 분비하지 못하게 Golgi PLUG라는 억제제를 처리한 후 세포내에 존재하는 싸이토카인에 선택성을 가지고 있는 형광표지된 항체로 사이토카인의 양을 intracellular staining 과 FACS로 측정하였을 경우에도 위와 동일한 결과를 얻었다(도 13 참조). 따라서 tRORγt-TMD에 의한 EAE 치료 및 예방효과는 tRORγt-TMD가 선택적으로 세포에 존재하는 RORgt의 기능을 억제하여 Th17 세포의 분화 및 작용을 억제하여 IL-17과 같은 Th17 세포에서 분비되는 사이토카인을 저해한다. 이 같은 RORgt에 의한 Th17 세포의 분화 및 기능저해가 IFN-g와 같은 Th1 사이토카인의 분비억제효과는 EAE 동물질환에서 Th17세포가 초기에 활성화 및작용을 시작한 후 Th1 세포의 활성화 및 기능을 유도하는 것으로 생각 된다.
<4-3. tRORγt-TMD의 다발성 경화증 치료효과에 대한 조직학적 효과>
tRORγt-TMD에 의한 EAE 치료효과를 조직학적으로 분석하기 위하여, 질환 clinical score가 최고인 4점 ( 양쪽 뒷다리 완전 마비)인 21일에 쥐의 척수를 얻어 수초의 파괴 정도와 염증 세포들의 침투 정도를 확인하였다. 수초의 파괴정도를 확인하기 위하여 수초부위를 염색해 주는 염색제인 록솔 패스트 블루(Luxol Fast Blue) 염색제를 사용하였으며, EAE 질환이 많이 진행되어 demyelination 된 경우 염색이 제대로 이루어 지지 않는다. tRORγt-TMD 융합단백질을 투여한 쥐의 경우는 척수의 myelination상태가 정상에 가까운 것을 확인하였다. 또한 본 발명자들은 H&E 및 PAS staining을 이용하여 염증세포를 면역조직화학적으로 분석을 한 결과, EAE질환이 유도된 경우 염증세포들이 수초 쪽으로 많이 침투했다는 것을 확인하였고, tROR γt-TMD를 투여한 쥐의 경우는 정상과 비슷할 정도의 세포들만 존재한다는 것을 확인하였다. 이런 모든 결과로 볼 때 tRORγt-TMD는 in vitro and in vivo에서 RORgt를 통한 Th17 세포들의 분화 및 기능을 억제하여, Th17세포에서 특이적으로 분비하는 IL-17과 같은 사이토카인을 줄여줌으로써 다발성 경화증이 유발되지 않도록 막아주는 역할을 한다는 것을 입증하였다(도 14, 15, 16 참조).
실시예 5: 알러지성 천식 동물모델에서 tGT3-TMD 재조합 융합 단백질의 질환치료 효과
<5-1. 알러지성 천식 동물모델에서 tGT3-TMD 질환 치료 효과의 세포학적 분석>
tGT3-TMD 융합단백질이 in vivo에서 Th2 세포에 의하여 유도되는 천식모델에서 치료효과가 있는 지를 조사하기 위하여, 6주령 된 수컷 BALB/c 쥐를 1일과 14일째에 100 μg씩의 난알부민과 20 mg의 알루미늄 하이드록사이드(aluminum hydroxide)를 복강에 주입하여 자극을 주었다. 그리고 21, 22, 23일째에 75 μg의 tGT3-TMD 단백질을 비강내 주입을 통해 폐와 기관지에 국소적으로 전달되도록 하고, 다시 150 μg의 난알부민으로 국소 자극을 주었다. 25일째에 쥐로부터 얻은 BAL fluid에서 세포를 분리하고 감별 염색법을 통해 여러 가지 염증 세포 및 면역세포들의 수를 셌다. 그 결과 tGT3-TMD 처리에 의해 각종 염증 세포들의 수가 크게 줄었음을 확인할 수 있었다 (도 17 참조). 한편 tGT3-TMD 재조합 융합 단백질에 의해 치료된 쥐의 비장세포를 분리하고 항-CD3/CD28 항체로 다시 활성화시켰다. 이 경우 쥐의 체내에서 이미 항원에 한 번 노출되었기 때문에 체외에서 다시 자극을 주면 더 강한 활성이 일어나 다시 싸이토카인을 분비하게 된다. 배양액에 존재하는 싸이토카인의 양을 ELISA를 통하여 확인해 본 결과 tGT3-TMD 재조합 융합 단백질을 주입한 쥐에서 TH2의 대표 싸이토카인인 IL-4, IL-5, IL-13이 확연하게 줄어들었음을 확인하였다. (도 18 참조).
<5-2. 알러지성 천식 동물모델에서 tGT3-TMD 질환 치료 효과의 조직학적 분석>
본 발명자들은 면역조직화학법을 이용하여 폐와 기관지의 형태와 염증 정도가 tGT3-TMD에 의한 질환치료효과에 의하여 어떻게 변화하는지를 알아보기 위해, 실시예 5-1에서와 같이 질환동물의 유도 및 tGT3-TMD 처리를 한 다음, PBS 세척을 통해 적혈구가 제거된 동물 모델의 폐와 기관지를 24시간동안 포름 알데하이드에 보관한 뒤 파라핀 조직 섹션을 제작하였다. 이 파라핀 조직 섹션을 H&E와 PAS로 염색하여 관찰한 결과 tGT3-TMD 재조합 융합 단백질을 처리한 경우에는 조직이 많이 파괴된 질병 유발 모델에 비해서 기관지의 조직이 정상에 가깝게 회복된 것을 확인할 수 있었다. 또한 염증세포의 침투 또한 질병 유발 모델에 비해 확연히 감소하였음을 확인하였다. 이러한 결과들을 토대로 tGT3-TMD 융합단백질은 GATA-3의 전사기능을 저해하여 TH2의 반응을 억제함으로써 알러지성 천식을 치료하는 역할을 한다는 것을 입증하였다(도 19 참조).
실시예 6: tRORγt-TMD 및 tGT3-TMD 융합단백질의 급성독성실험
대한실험공급센터에서 공급받은 6주령의 특정병원체부재(specific pathogen-free, SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 하기와 같이 실시하였다.
각 그룹당 2마리씩의 동물에 본 발명의 tRORγt-TMD 융합단백질을 1 g/㎏의 용량으로 1회 경구 투여 후, 동물의 폐사여부, 임상증상 및 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 강장기와 흉강 장기의 이상 여부를 관찰하였다.
실험결과, 실험 물질을 투여한 모든 동물에서 특이할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사 및 부검 소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과, 본 발명의 tRORγt-TMD 융합단백질은 랫트에서 각각 1 g/㎏까지도 독성변화를 나타내지 않았으며, 경구투여 최소치사량(LD50)은 1 g/㎏이상인 안전한 물질로 판단됨을 확인할 수 있었다.
본 발명에 따른 융합단백질을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 단백질에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 단백질은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 0.01 내지 500 mg/㎏의 양, 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 그 단백질의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
이상에서 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 반드시 이러한 실시예로 국한되는 것은 아니고, 본 발명의 기술사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양하게 변형 실시될 수 있다. 따라서 본 발명에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술적 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술적 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호범위는 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술적 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.
본 발명의 융합단백질을 이용하여 전사인자와 관련된 다양한 질병을 효과적으로 치료할 수 있다.
서열번호 1은 단백질 운반 도메인을 나타내고 서열번호 2 내지 6은 전사인자의 전사활성조절 도메인을 나타내며 서열번호 7 내지 11은 융합 단백질을 나타낸다.
Claims (40)
- 전사인자의 전사활성 조절도메인 및 단백질 운반 도메인을 가지는 융합단백질을 포함하는 전사인자 기능억제제.
- 제 1항에 있어서,전사인자는 RORγt (Retinoic acid-related orphan receptor gamma t), Tbet (T-box 21), GATA-3 (GATA binding protein 3), FOXP3 (Forkhead box P3), RORα4 (Retinoic acid-related orphan receptor alpha 4), HIF-1/2α (Hypoxia inducible factor 1/2α), STAT (Signal transducers and activators of transcription), PPARγ (peroxisome proliferator-activated receptor gamma), p53, AP-1, NFκB (nuclear factor kappa-B), NKx2.5 (NK2 transcription factor related, locus 5), FOXO (Forkhead box O), RELA (v-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A) 및 Runx (runt-related transcription factor)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나임을 특징으로 하는 전사인자 기능억제제.
- 제 1항에 있어서,전사인자는 RORγt (Retinoic acid-related orphan receptor gamma t), Tbet (T-box 21), GATA-3 (GATA binding protein 3) 및 FOXP3 (Forkhead box P3)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나임을 특징으로 하는 전사인자 기능억제제.
- 제 1항에 있어서,단백질 운반 도메인은 HP4, Hph-1, Mph-1, Sim-2, Tat, VP22, Antp (Antennapedia), Pep-1 (peptide), PTD-5, R9 (arginine), 7R 및 CTP(Cytoplamic transduction peptide)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나임을 특징으로 하는 전사인자 기능억제제.
- 제 1항에 있어서,단백질 운반 도메인은 서열번호 1로 표시되는 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 전사인자 기능억제제.
- 제 1항에 있어서,전사인자의 전사활성조절 도메인은 DNA 결합 도메인 또는 단백질 상호작용 도메인인 것을 특징으로 하는 전사인자 기능억제제.
- 제 1항에 있어서,전사인자의 전사활성조절 도메인은 헬릭스-턴-헬릭스(Helix-turn-helix) 도메인, 징크 핑거(Zinc finger) 도메인, 류신 지퍼(Leucine zipper) 도메인, 윙드 헬릭스(Winged helix) 도메인, 윙그 헬릭스 턴 헬릭스(Winged helix turn helix) 도메인, 헬릭스-루프-헬릭스(Helix-loop-helix) 도메인, HMG-박스(HMG-box) 도메인, 및 포크헤드(forkhead) 도메인으로 구성된 군으로 부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 전사인자 기능억제제.
- 제 1항에 있어서,전사인자의 전사활성조절 도메인은 DNA, RNA, 전사 공여 활성자, 전사 억제인자, 인핸서-결합 인자 및 리간드와 결합하는 도메인, 이합체/다중합체(dimerization/multimerization)에 관여하는 도메인 및 핵내 위치선정(nuclear localization)에 관여하는 도메인으로 구성된 군으로 부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 전사인자 기능억제제.
- 제 1항에 있어서,전사인자의 전사활성조절 도메인은 서열번호 2 내지 6로 표시되는 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 전사인자 기능억제제.
- 제 1항에 있어서,융합단백질은 서열번호 7 내지 11로 표시되는 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 전사인자 기능억제제.
- 전사인자의 전사활성조절 도메인 및 단백질 운반 도메인을 포함하는 융합단백질.
- 제 11항에 있어서,전사인자는 RORγt (Retinoic acid-related orphan receptor gamma t), Tbet (T-box 21), GATA-3 (GATA binding protein 3), FOXP3 (Forkhead box P3), RORα4 (Retinoic acid-related orphan receptor alpha 4), HIF-1/2α (Hypoxia inducible factor 1/2α), STAT (Signal transducers and activators of transcription), PPARγ (peroxisome proliferator-activated receptor gamma), p53, AP-1, NFκB (nuclear factor kappa-B), NKx2.5 (NK2 transcription factor related, locus 5), FOXO (Forkhead box O), RELA (v-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A) 및 Runx (runt-related transcription factor)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나임을 특징으로 하는 융합단백질.
- 제 11항에 있어서,전사인자는 RORγt (Retinoic acid-related orphan receptor gamma t), Tbet (T-box 21), GATA-3 (GATA binding protein 3) 및 FOXP3 (Forkhead box P3)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나임을 특징으로 하는 융합단백질.
- 제 11항에 있어서,단백질 운반 도메인은 HP4, Hph-1, Mph-1, Sim-2, Tat, VP22, Antp (Antennapedia), Pep-1 (peptide), PTD-5, R9 (arginine), 7R 및 CTP(Cytoplamic transduction peptide)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나임을 특징으로 하는 융합단백질.
- 제 11항에 있어서,단백질 운반 도메인은 서열번호 1로 표시되는 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
- 제 11항에 있어서,전사인자의 전사활성조절 도메인은 DNA 결합 도메인 또는 단백질 상호작용 도메인인 것을 특징으로 하는 융합단백질.
- 제 11항에 있어서,전사인자의 전사활성조절 도메인은 헬릭스-턴-헬릭스(Helix-turn-helix) 도메인, 징크 핑거(Zinc finger) 도메인, 류신 지퍼(Leucine zipper) 도메인, 윙드 헬릭스(Winged helix) 도메인, 윙그 헬릭스 턴 헬릭스(Winged helix turn helix) 도메인, 헬릭스-루프-헬릭스(Helix-loop-helix) 도메인, HMG-박스(HMG-box) 도메인, 및 포크헤드(forkhead) 도메인으로 구성된 군으로 부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
- 제 11항에 있어서,전사인자의 전사활성조절 도메인은 DNA, RNA, 전사 공여 활성자, 전사 억제인자, 인핸서-결합 인자 및 리간드와 결합하는 도메인, 이합체/다중합체(dimerization/multimerization)에 관여하는 도메인 및 핵내 위치선정(nuclear localization)에 관여하는 도메인으로 구성된 군으로 부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
- 제 11항에 있어서,전사인자의 전사활성조절 도메인은 서열번호 2 내지 6로 표시되는 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
- 제 11항에 있어서,융합단백질은 서열번호 7 내지 11로 표시되는 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
- 제 11항의 융합단백질을 코딩하는 핵산.
- 제 21항의 핵산을 포함하는 벡터.
- 제 22항의 벡터를 포함하는 숙주세포.
- 제 23항에 있어서,단백질 운반 도메인은 서열번호 1로 표시되는 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 숙주세포.
- 제 23항에 있어서,전사인자의 전사활성조절 도메인은 서열번호 2 내지 6으로 표시되는 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 숙주세포.
- 제 23항에 있어서,융합단백질은 서열번호 7-11로 표시되는 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 숙주세포.
- 제 23항에 있어서,숙주세포는 BL21 star (DE3) pLys S임을 특징으로 하는 숙주세포.
- 전사인자의 전사활성조절 도메인 코딩하는 유전자를 단백질 운반 도메인을 코딩하는 유전자에 결합시킨 벡터를 숙주세포에서 발현시켜서 융합단백질을 제조하는 방법.
- 전사인자의 전사활성조절 도메인 및 단백질 운반 도메인을 포함하는 융합단백질 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 전사인자 관련 질병 치료용 약학 조성물.
- 제 29항에 있어서,상기 전사인자가 NKx2.5 (NK2 transcription factor related, locus 5) 또는 HIF-1α (Hypoxia inducible factor 1α)인 경우 전사인자 관련 질병은 심장질환임을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 29항에 있어서,상기 전사인자가 HIF-1α (Hypoxia inducible factor 1α)인 경우 전사인자 관련 질병은 뇌질환임 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 29항에 있어서,상기 전사인자가 PPARγ (peroxisome proliferator-activated receptor gamma)인 경우 전사인자 관련 질병은 당뇨병임을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 29항에 있어서,상기 전사인자가 RORγt (Retinoic acid-related orphan receptor gamma t), RORα4 (Retinoic acid-related orphan receptor alpha 4), FOXO (Forkhead box O)인 경우 전사인자 관련 질병은 자가면역질환 및 염증질환임을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 29항에 있어서,상기 전사인자가 HIF-2α (Hypoxia inducible factor 2α) 또는 STAT (Signal transducers and activators of transcription)인 경우 전사인자 관련 질병은 자가면역질환 및 염증질환임을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 29항에 있어서,상기 전사인자가 AP-1 또는 NFκB (nuclear factor kappa-B)인 경우 전사인자 관련 질병은 혈관질환 및 염증질환임을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 29항에 있어서,상기 전사인자가 p53, SP1 또는 RELA (v-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A)인 경우 전사인자 관련 질병은 암 또는 종양 질환임을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 29항에 있어서,상기 전사인자가 GATA-3 (GATA binding protein 3)인 경우 전사인자 관련 질병은 천식 및 아토피임을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 29항에 있어서,상기 전사인자가 RORγt인 경우 전사인자 관련 질병은 다발성 경화증, RA, IBD임을 특징으로 하는 치료용 약학 조성물.
- 제 29항에 있어서,상기 전사인자가 Foxp3인 경우 전사인자 관련 질병은 암 또는 종양 질환임을 특징으로 하는 치료용 약학 조성물.
- 제 29항에 있어서,상기 전사인자가 Tbet인 경우 전사인자 관련 질병은 RA, IBD 및 EAE임을 특징으로 하는 치료용 약학 조성물.
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