WO2012015327A1 - Тест-система для определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты, и тропонина i (варианты) - Google Patents

Тест-система для определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты, и тропонина i (варианты) Download PDF

Info

Publication number
WO2012015327A1
WO2012015327A1 PCT/RU2010/000422 RU2010000422W WO2012015327A1 WO 2012015327 A1 WO2012015327 A1 WO 2012015327A1 RU 2010000422 W RU2010000422 W RU 2010000422W WO 2012015327 A1 WO2012015327 A1 WO 2012015327A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
test
strip
troponin
conjugate
monoclonal
Prior art date
Application number
PCT/RU2010/000422
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Сабир Насирович ВЕЛИЕВ
Борис Павлович ЧЕЛОБАНОВ
Николай Александрович ШЕВЧУК
Галина Николаевна АФИНОГЕНОВА
Original Assignee
Veliev Sabir Nasirovich
Chelobanov Boris Pavlovich
Shevchuk Nikolai Aleksandrovich
Afinogenova Galina Nikolaevna
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Veliev Sabir Nasirovich, Chelobanov Boris Pavlovich, Shevchuk Nikolai Aleksandrovich, Afinogenova Galina Nikolaevna filed Critical Veliev Sabir Nasirovich
Priority to PCT/RU2010/000422 priority Critical patent/WO2012015327A1/ru
Priority to RU2011107712/15A priority patent/RU2464572C1/ru
Publication of WO2012015327A1 publication Critical patent/WO2012015327A1/ru

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
    • G01N33/54388—Immunochromatographic test strips based on lateral flow

Definitions

  • the invention relates to devices for immunochromatographic simultaneous detection of a cardiac protein that binds fatty acids and troponin I protein in whole venous blood for the rapid diagnosis of myocardial infarction and, can be used in biotechnology, immunology and healthcare.
  • Cardiac BSA is a cardiospecific cytoplasmic low molecular weight protein (15 kDa), contained in large quantities in cardiomyocytes, carries out the binding and transport of fatty acids inside the cell and quickly enters the bloodstream with myocardial necrosis.
  • the advantage of sBSSF is its high cardiospecificity due to the maximum concentration of sBFSFA in myocardial tissue.
  • Cardiac BSA is an early marker of myocardial necrosis, it has kinetics similar to myoglobin, but it has great specificity. Diagnostically significant increase in the level of sBSLC is observed after 1 hour from the onset of pain.
  • the level of sBSLC in the blood reaches its maximum value 6 hours after myocardial damage and returns to its normal value after 16-24 hours.
  • the amount of sBSLC in the blood increases in proportion to the vastness and depth of the infarct zone, and reaches a level of more than 200-300 ng / ml at the upper limit of normal 15 ng / ml.
  • the cardiomarker sBSLC is the earliest of all markers of myocardial necrosis, which is especially important given the swiftness of events developing in ACS and its high level of adverse outcomes precisely on its first day.
  • the test system for the determination of sBCLC provides significant assistance in the diagnosis of ACS, especially in situations with an atypical clinical picture and the absence of significant diagnostic changes in the electrocardiogram.
  • Troponin I is a protein that is part of the troponin complex, the difference in isoforms of which in the myocardium and skeletal muscle is about 90%. Due to this, cardiac troponin-1 (cTn- ⁇ ) is a highly sensitive and highly specific marker of myocardial damage. Normally, troponin I is not detected in the bloodstream. With ischemic myocardial damage, troponins enter the peripheral bloodstream, where they can be determined after 6-8 hours. The maximum concentration is noted after 14-28 hours and persists for 3-7 days, forming a long “diagnostic window”. The release of troponin I has a single-phase character, which is due to the high content of its cytoplasmic fraction.
  • a device for chromatographic analysis for detecting analyte in a sample is known (RF patent jV 2124729, IPC G01N33 / 53, publ. 01/10/1999).
  • the device includes (1) at least two strictly flat opposed blocks, one of which contains a chromatographic medium on its surface; and (2) means for mounting opposing blocks against each other and applying sufficient pressure there to transfer fluid from one opposing block to another in a direction strictly perpendicular to the opposing block in order to deposit a sample on a chromatographic medium to detect and / or determine thereafter analyte.
  • the device may also include: (1) at least three strictly flat opposed blocks, characterized in that one of them contains on its surface a chromatographic medium having first and second ends; (2) means for mounting opposing blocks against each other in at least two different combinations and applying enough pressure there to transfer fluid from one opposing block to another in a direction strictly perpendicular to the opposing blocks so that the sample is applied to the chromatographic medium and flows through it from the first end to the second end to detect and / or determine the analyte on a chromatographic medium; and (3) at least one applicator and one absorber located on one of the opposing blocks and arranged so that when an opposing block with an applicator and an absorber is mounted on it opposite the opposing block containing the chromatographic medium, a liquid is applied to the latter, which flows through it from the second end to the first, as a result of which the direction of flow through the chromatographic medium is reversed, in order to detect and / or determine the analyte, carried out after reverse flow through romathyroidhesku
  • this device has a sufficiently complex structure, includes a source of high pressure to ensure the passage of the liquid sample along its porous elements, and also does not contain components to ensure the detection of SBSC and troponin I in blood samples.
  • the invention has a simple preparation, action and high sensitivity (1.0 ng / ml), with a stable result.
  • An increase in the concentration of troponin I with myocardial infarction is observed after 4-6 hours.
  • the kinetics of its release into the blood may represent a two-phase curve with an initial peak after 15-20 hours and a lower second peak after 60-80 hours after the development of myocardial infarction.
  • this test system does not allow detecting an early marker of sBFLC, the level of which is significantly higher (from 15 ng / ml and higher) compared with healthy people in the first 1-6 hours after myocardial infarction.
  • the level of sBSLC in the blood reaches its maximum value 6 hours after myocardial damage and returns to its normal value after 16-24 hours.
  • the cardiomarker sBSLC is present in the blood of healthy people.
  • the individual protein content ranges from 5 to 7 ng / ml. Diagnostically, the value (level of pathological values) of sBSSF varies from 10 to 15 ng / ml. As a result of these protein features, non-specific marker detection occurs.
  • the immunochromatographic test proposed in this analogue allows the detection of an early marker of sBSLC in the amount of 5 ng / ml, i.e. it has too high sensitivity, which leads to the appearance of a large number of false positive results and, as a result, to low specificity and low accuracy of the test, which allows them to be used only as an indicative test.
  • this test system does not allow the detection of the late marker troponin I, which narrows its functionality.
  • test system for immunochromatographic determination of cardiac protein that binds fatty acids in whole blood for rapid diagnosis of myocardial infarction RF patent for utility model JV287262, IPC G01 N 33/558, publ. 09/27/2009
  • test system does not allow the detection of the late marker troponin I, which narrows its functionality.
  • the closest analogue is a combined test microchip for the diagnosis of eight cardiovascular diseases (Chinese Patent jY ° 2783324, IPC G01N33 / 543, published on 05.24.2006) and contains antibodies such as anti-crp, anti-Myoglobin, anti-cTnl (cardiac troponin I), anti- cTnT (cardiac troponin T), anti-nt-probnp, anti-ck-mb (creatine kinase isozymes-MB), anti-h-fabp (cardiac fatty acid binding protein), anti-GPBB (glycogen phosphorylase isoenzyme BB).
  • antibodies such as anti-crp, anti-Myoglobin, anti-cTnl (cardiac troponin I), anti- cTnT (cardiac troponin T), anti-nt-probnp, anti-ck-mb (creatine kinase isozymes-MB), anti-
  • the technical result of the invention is the creation of a simpler and more reliable "bedside" combined immunochromatographic express test system for the simultaneous rapid determination of sBSLC and troponin I.
  • the test system for immunochromatographic determination of a cardiac protein that binds fatty acids and troponin I in whole blood for rapid diagnosis of myocardial infarction
  • it contains an immunological tablet with a window for making the sample and a window for viewing the results, inside which there is a substrate for laminating porous materials, on which a pillow from the conjug is arranged sequentially along the length and lap s for the application of the test sample of blood, the filter pad for separating the blood of the test sample, the porous membrane for the immunochromatographic reaction and an absorption pad for generating a fluid flow, wherein, on the pillow with conjugates and across the latter, a first band of conjugate of colloidal gold particles with the first monoclonal mouse antibodies (F9) specific to the cardiac protein that binds the fatty acids and the second band of the conjugate of colloidal gold particles with the first with a monoclonal mouse antibody specific for troponin I (1-60), a
  • the test system for immunochromatographic determination of a cardiac protein that binds fatty acids and troponin I in whole blood for express diagnosis of myocardial infarction, according to the invention, it contains an immunological tablet with a window for introducing the sample and a window for viewing the results, inside which there is a substrate for laminating porous materials, on which a pillow with nyugates for applying a test blood sample, a filter pad for separating a test blood sample, a porous membrane for carrying out an immunochromatographic reaction and an absorption pad for creating a fluid flow, the first band of conjugate of colloidal gold particles with the first monoclonal mouse antibodies formed on the pillow with conjugates and across F9) specific for a cardiac protein that binds fatty acids and the second band of the conjugate of colloidal gold particles to the first murine monoclonal antibodies specific for troponin I (1-60), a strip of conjugate of the second monoclonal antibodies to troponin
  • the test system for immunochromatographic determination of a cardiac protein that binds fatty acids and troponin I in whole blood for rapid diagnosis of myocardial infarction
  • it contains an immunological tablet with a window for introducing the sample and a window for viewing the results, inside which there is a substrate for laminating porous materials, on which a pillow with nyugates for applying a test blood sample, a filter pad for separating a test blood sample, a porous membrane for carrying out an immunochromatographic reaction and an absorption pad for creating a fluid flow, the first band of conjugate of colloidal gold particles with the first monoclonal mouse antibodies formed on the pillow with conjugates and across F9) specific for a cardiac protein that binds fatty acids and the second band of the conjugate of colloidal gold particles to the first murine mo oklonalnymi antibodies specific to troponin I (1-60), on the filter pad and the last applied across the second strip competing mouse monoclo
  • the bands on the pillow with conjugates, on the filter pad and on the porous membrane are formed in parallel and at a distance from each other by impregnation with appropriate reagents, followed by removal of moisture.
  • the pillow for applying the conjugate is made of cellulose or glass microfibre, or polyester microfibre 15 mm long with a pore size of 20-25 ⁇ m, a thickness of 350 ⁇ m and an absorption capacity of at least 55 mg / cm.
  • the filtration pad is made of a porous polysulfone material 20 mm long, 600-650 ⁇ m thick and pore size 55-57 ⁇ l / cm.
  • the porous membrane is made of nitrocellulose or polyethersulfone with a length of 20 mm, a thickness of 125-155 microns, an absorption capacity of at least 30 mg / cm 2 , a flow rate of 90-1 10 sec / 40 mm.
  • the absorption pillow is made of porous material of cotton fluff, or glass cellulose fiber with a length of 15 mm and a thickness of 400-450 microns.
  • the lamination substrate is made of polystyrene or acrylic adhesive material 60 mm long, 230-270 microns thick.
  • the specified technical characteristics of the elements of the test system allow reliable operation, reduce the number of false-positive results by increasing the specificity and accuracy of the test and at the same time determine sBSLC and troponin I.
  • FIG. 1 shows a diagram of the appearance of a test system made in the form of an immunological tablet.
  • FIG. 2 shows a layout internal elements of the test system in an immunological tablet (first embodiment).
  • FIG. 3 shows a layout of the internal elements of the test system in an immunological tablet (second embodiment).
  • FIG. 4 shows a layout of the internal elements of the test system in an immunological tablet (third embodiment).
  • the Cardiotest test system for immunochromatographic analysis contains an immunological plate 1 with a receiving oval window 2 for introducing a sample of whole blood and a rectangular window 3 for viewing the results. Inside the immunological plate 1, a substrate 4 for laminating porous materials is placed, on which a pillow 5 with conjugates for applying the test blood sample, a filter pad 6 for separating the test blood sample, a porous chromatographic membrane 7 for carrying out an immunochromatographic reaction and an absorption pad are arranged sequentially in length and lap 8 to create fluid flow.
  • a competing band 11 is formed on the porous membrane 7, across the last, containing a layer of adsorbed first (F9) or second (F10) monoclonal mouse antibodies specific for a cardiac fatty acid binding protein, first test strip 12 containing adsorbed second monoclonal mouse antibodies (F10) specific for a cardiac fatty acid binding protein, second test lane 13 containing adsorbed monoclonal antibodies to troponin I (1C-19) and a control lane 14 containing adsorbed mono specific polyclonal rabbit antibodies against mouse immunoglobulins (RAM).
  • the bands 9 and 10 on the pillow 5 with conjugates and the bands 11, 12, 13 and 14 on the porous membrane 7 are formed parallel and at a distance from each other by impregnation with appropriate reagents, followed by removal of moisture.
  • the competing strip 11 on the porous membrane 7 is located along and at the edge of the filtering pad 6 for the separation of the test blood sample.
  • the first band 9 of the conjugate of colloidal gold particles with monoclonal murine antibodies (F9) specific for the cardiac protein binding fatty acids and the second band of 10 conjugate particles are formed colloidal gold with murine monoclonal antibodies specific for troponin I (1-60).
  • a competing band And containing a layer of adsorbed first (F9) or second (F10) monoclonal mouse antibodies specific for a cardiac fatty acid binding protein the first test strip 12 containing adsorbed second monoclonal mouse antibodies is formed on the porous chromatographic membrane 7 and across the last ( F10) specific for a cardiac fatty acid binding protein, a second test strip 13 containing adsorbed avidin or streptavidin, specific for biotin and a control strip 14 containing adsorbed monospecific polyclonal rabbit antibodies against mouse immunoglobulins (RAM).
  • a strip 16 of the conjugate of monoclonal antibodies to troponin I (1C-19) associated with biotin is applied on the filter pad 6 and across the latter.
  • the first band 9 of the conjugate of colloidal gold particles with monoclonal murine antibodies (F9) specific to the cardiac protein binding fatty acids and the second band of 10 conjugate particles are formed colloidal gold with mouse monoclonal antibodies specific to troponin I (1-60).
  • a competing band 11 was formed on the filter pad 6 and across the latter, containing a layer of adsorbed second monoclonal murine antibodies (F10) specific for the cardiac protein binding fatty acids and band 16 of the monoclonal anti-troponin I conjugate (1C-19) coupled to biotin.
  • a first test strip 12 was formed containing adsorbed second monoclonal murine antibodies (F10) specific for a cardiac fatty acid binding protein, a second test strip 13 containing adsorbed avidin or streptavidin specific for biotin and a control strip 14, containing adsorbed monospecific polyclonal rabbit antibodies against mouse immunoglobulins (RAM).
  • F10 second monoclonal murine antibodies
  • a control strip 14 containing adsorbed monospecific polyclonal rabbit antibodies against mouse immunoglobulins (RAM).
  • Table 1 shows the characteristics of the materials from which the elements of the test system are made.
  • polysulfone pad 6 pore volume 56.8 ⁇ l / cm 2 ;
  • nylon or an absorption capacity of not polyvinylidene chloride of less than 30 mg / cm 2 ,
  • bands 9 and 10 on the pad 5 with conjugates, band 16 on the filter pad, bands 12, 13 and 14 on the porous membrane 7 and strip 11 on the membrane 7 (1 and 2 test system options) or filter cushion 6 (3rd embodiment of the test system) are formed in parallel and at a distance from each other by impregnation with appropriate reagents, followed by removal of moisture.
  • a competing strip 11 on the porous chromatographic membrane 7 is located along and at the edge of the filter pad 6 for separation of the blood sample to be studied, and in the third embodiment of the test system ( Fig. 4) a competing strip 11 on the filter pad 6 is applied along and at the edge of the conjugate pad 5.
  • the design of the immunological tablet 1 provides a contact between the pillows 5 and 6, the porous membrane 7 and the absorption pillow 8 with each other and allows the blood sample to freely pass through all porous materials due to the action of capillary forces.
  • lane 16 contains a conjugate of monoclonal antibodies to troponin I with biotin in a ratio of 1: 8 to 1: 16.
  • the competing band 1 1 contains 0.9-1, 0 mg / ml monoclonal antibodies;
  • test strip 12 contains 1.0-1, 1 mg / ml monoclonal antibodies;
  • test strip 13 in the third embodiment of the test system contains avidin (streptavidin) at a concentration of 0.8-1.5 mg / ml, and
  • control strip 14 contains polyclonal antibodies in an amount of 1.3-1.5 mg / ml.
  • Monoclone F9 specific for the whole molecule of cardiac FABP, type IgGl - used in band 9 (conjugated to colloidal gold particles) and competing band 11.
  • Avidin-biotin reaction The reaction between avidin (streptavidin) and biotin allows the connection between the various components of a specific complex on the solid phase. It is characterized by a high binding constant (10 15 M "1 ), ease of attachment of biotin to antibodies without a noticeable violation of their antibody activity, and high stability of avidin (streptavidin).
  • Biotin is one of the many water-soluble components of the vitamin B complex and is a coenzyme for carboxylation enzymes. Its molecular weight is 244.3 D.
  • the inventive test system "Cardiotest" (first option) works as follows. Blood in a volume of 100-150 ⁇ l (3-5 drops) is applied through the intake window 2 to the pillow 5 with conjugates. The blood sample, passing through pillow 5, impregnates bands 9 and 10 under the action of capillary forces, where the marker proteins present in the blood (sBSLC and / or troponin I) react with the corresponding protein monoclonal antibodies labeled with colloidal gold, forming a colored immune complex antigen antibody. Next, the immune complex is absorbed by a filter pad 6, where blood separation occurs (erythrocyte mass separation).
  • a high sensitivity of the test system is required - 1 ng / ml and the identification of both the whole molecule and its various fragments.
  • the ultimate ability of a colloidal gold marker to detect a substance ranges from 0.5 to 1 ng / ml of a detectable agent.
  • antigen + antibody complexes labeled with colloidal gold particles are formed immediately on the conjugate pad 5 and, thereby, sufficient contact time is provided and the likelihood of hydrolysis of the labile molecules of the troponin I protein is reduced.
  • the function of lane 11 is to reduce the analytical sensitivity of the test to 15 ng / ml due to the competitive binding of sBSLC with F9 or F10 monoclonal antibodies immobilized in this lane 1 1. This band is not stained because an increase in blood sBSLC from 15 ng / ml is considered to be diagnostically significant .
  • a decrease in the analytical sensitivity of the test to 15 ng / ml leads to an increase in specificity while maintaining the necessary level of diagnostic sensitivity.
  • the immune complex moving under the action of capillary forces, crosses the first test strip 12 and interacts with the second F10 monoclonal mouse antibodies to BSAI immobilized on it.
  • the first test strip 12 is colored purple. If the blood sample does not contain sBSLC in a concentration above the threshold, the first test strip 12 remains unstained. Further, the complex not bound in the first test strip 12 moves further along the porous membrane 7 to the second test strip 13 with the N ° 2 antibodies to troponin I deposited. If the sample contains troponin I at a concentration of 1.1 ng / ml or higher, then the second test strip 13 is colored purple (second colored strip). If troponin I in the sample is below the threshold value (below 1.1 ng / ml), then test strip 13 is not stained.
  • control strip 14 is also colored purple (third colored strip). Control strip 14 is the internal control of the test and, if the analysis is carried out correctly, should always occur, regardless of the presence of sBSLC and troponin I in the blood sample.
  • Results are determined visually within 5-30 minutes. With a positive test result, sBSLC and troponin I appear three colored bands - two test and control. If in the sample U2010 / 000422
  • the first line is colored. This occurs in the time interval from 1 to 24 hours from the onset of the disease. If a later marker, troponin I, is present in the sample, the second test line is colored. The time interval from 6 to 48 hours from the onset of pain. If the sample is taken in the range from 6 to 24 hours from the onset of the disease, then all three bands appear. The color intensity of the control and test stripes may be different. With a negative result, only one band appears - the control. If the control strip does not appear, the test results are considered invalid.
  • Blood in a volume of 100-150 ⁇ l (3-5 drops) is applied through the intake window 2 to the pillow 5 with conjugates, which is absorbed by the porous material.
  • the blood sample passes due to capillary forces along the conjugate pad 5.
  • the sample contains sBCLC, it interacts with the conjugate of colloidal gold and F9 antibody in band 9.
  • a colored antigen-antibody immune complex is formed.
  • the resulting colored immune complex moves under the action of capillary forces along the filter pad 6 and membrane 7, crosses the competing strip 11 (in the second embodiment of the test system on the membrane 7, and in the third version of the test system on the filter pad 6) and interacts with the applied on it adsorbed monoclonal murine antibodies F9, or F10 specific for sBSLC.
  • this band 11 is to reduce the analytical sensitivity of the test not lower than 15 ng / ml due to competitive binding of sBSLC with F9 or F10 monoclonal antibodies immobilized on line 1 1 without decreasing the color intensity of this test strip. Since an increase in the level of sBSLC in the blood to 15 ng / ml is considered to be diagnostically significant, a decrease in the analytical sensitivity of the test to 15 ng / ml leads to an increase T / RU2010 / 000422
  • a competing band 11 with F10 monoclonal antibodies to the filter pad 6 allows them to be used in a lower concentration, which saves reagents.
  • concentration of F10 antibodies on the competing line 1 1 located on the membrane 7 is 1 mg / ml
  • concentration of F10 antibodies on the band 1 1 of about 0.3 mg / ml is required. This property is determined by the location of the strip 1 1 on the tablet 1, the response time of the components, the washout of antibodies from the material.
  • the immune complex moves under the action of capillary forces along the nitrocellulose membrane 7, crosses the first test strip 12 and interacts with monoclonal mouse antibodies F10 to BSCH immobilized on line.
  • the first test strip 12 is colored purple. If the blood sample does not contain sBSLC in a concentration above the threshold, the first test strip 12 remains unstained.
  • troponin I is present in the sample, then this marker protein under the action of capillary forces is absorbed by the porous material of conjugate pad 5, upon passage of which, troponin I interacts in band 10 with conjugate of colloidal gold and monoclonal antibodies (I -60). As a result, a colored antigen-antibody complex is formed. The resulting colored immune complex moves under the action of capillary forces along the porous materials of pillows 5 and 6, crosses band 16 on the filter pad 6, with a conjugate of monoclonal antibodies to troponin I (1C-19) coupled to biotin applied to it. The triple complex antibody (I-60) is formed - the troponin antigen I-antibody (I C-19).
  • the bound complex moves along the nitrocellulose membrane 7 to the second test line 13 coated with avidin (or streptavidin).
  • the complex binds through the affinity of biotin from the complex and avidin (streptavidin) applied to test strip 13. If the sample contains troponin I at a concentration of 0.9-1 ng / ml, then the second test line is colored in purple (second colored strip 13) . If troponin I in the sample is below the threshold value, then test strip 13 is not stained.
  • control band 14 is also colored purple (third colored strip 14).
  • Control strip 14 is the internal control of the test and, if the analysis is carried out correctly, should always occur, regardless of the presence of sBSLC or troponin I in the blood sample.
  • Results are determined visually within 10-30 minutes.
  • three colored bands appear - two test and control ones. If the sample contains only an early marker sBLC, then the first test line is colored. This occurs if blood sampling was carried out in a period of 1 to 24 hours from the onset of the disease. If only one later marker, troponin I, is present in the sample, only the second test line is stained. The time period for identifying this marker is from 6 to 48 hours from the onset of pain. If the sample is taken in the range from 6 to 24 hours from the onset of the disease, then all three bands appear. The color intensity of the control and test stripes may be different.
  • the cardiomarker sBSLC is present in the blood of healthy people.
  • the individual protein content ranges from 5 to 7 ng / ml.
  • Diagnostic Level (Level pathological values) sBCLC varies from 12 to 15 ng / ml.
  • high sensitivity is not always necessary, which allows them to be used only as an indicative test.
  • the competing lane 11 provides a decrease in the analytical sensitivity of the test to 15 ng / ml due to the competitive binding of BSAAs to F9 monoclonal antibodies immobilized in this band 11.
  • the test system for determining Troponin I requires high sensitivity up to 1 ng / ml.
  • the ultimate ability of a colloidal gold marker to detect a substance is from 1 ng / ml of detectable agent.
  • the inventive test system allows you to increase the sensitivity in the range of 0.9-1 ng / ml. PT / RU2010 / 000422
  • TPR TP / (TP + FN);
  • N is the number of all patients.
  • the use of the triple complex antibody (1-60) colloidal gold-antigen troponin I - antibody (1C-19) biotin, which then binds to avidin on the test line, can significantly reduce the number of false negative results, while not increasing the number of false positive results and, this way while saving a high level of specificity provides an increase in the sensitivity of the determination of troponin I.
  • the simultaneous determination of the specific sBCLC and troponin I in the claimed test system allows for a reliable and quick diagnosis and an increase in the diagnostic time interval up to 48 hours.
  • the combination of these markers avoids the disadvantages of tests containing only one of these markers.
  • non-specific (false positive) reactions can be avoided.
  • the use of the test will allow the doctor, in the absence of a clearly defined clinical picture of myocardial infarction in the patient and the absence of clear signs in the cardiogram, regardless of the time interval from the onset of pain, to decide on urgent hospitalization of the patient.
  • a positive analysis will allow you to reasonably call an ambulance or emergency crew from the nearest location.
  • the small size and weight of immunochromatographic tests allow their use by a local doctor or general practitioner when visiting a patient at home.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

Изобретение относится к медицине. Тест-система для одновременного иммунохроматографического определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты, и белка тропонин I в цельной венозной крови для экспресс-диагностики инфаркта миокарда, содержит иммунологическую планшету с подложкой, на которой расположены подушка с конъюгатами, фильтрационная подушка, пористая мембрана и абсобционная подушка для создания тока жидкости. На подушке с конъюгатами сформирована первая полоса конъюгата частиц коллоидного золота с моноклональными мышиными антителами специфичными к сердечному белку и вторая полоса конъюгата частиц коллоидного золота с мышиными моноклональными антителами специфичными к тропонину I. На пористой мембране сформирована конкурирующая полоса, две тестовых полосы и контрольная полоса. Во втором и третьем вариантах тест-системы на фильтрационной подушке сформирована полоса конъюгата вторых моноклональных антител к тропонину I, связанных с биотином. В третьем варианте тест-системы конкурирующая полоса расположена на фильтрационной подушке.

Description

ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СЕРДЕЧНОГО БЕЛКА, СВЯЗЫВАЮЩЕГО ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ, И ТРОПОНИНА I (ВАРИАНТЫ)
Изобретение относится к устройствам для иммунохроматографического одновременного выявления сердечного белка, связывающего жирные кислоты и белка тропонин I в цельной венозной крови для экспресс-диагностики инфаркта миокарда и, может быть использовано в биотехнологии, иммунологии и здравоохранении.
Сердечный БСЖК - кардиоспецифический цитоплазматический низкомолекулярный белок (15 кДа), в большом количестве содержащийся в кардиомиоцитах, осуществляет связывание и транспортировку жирных кислот внутри клетки и при некрозе миокарда быстро попадает в кровоток. Достоинством сБСЖК является высокая кардиоспецифичность вследствие максимальной концентрации сБСЖК именно в ткани миокарда. Сердечный БСЖК является ранним маркером некроза миокарда, он обладает сходной с миоглобином кинетикой, однако имеет большую специфичность. Диагностически значимое повышение уровня сБСЖК наблюдается через 1 час от начала болевого синдрома. Уровень сБСЖК в крови достигает максимальных значений через 6 часов после повреждения миокарда и возвращается к нормальному значению через 16-24 ч. Количество сБСЖК в крови увеличивается пропорционально обширности и глубине зоны инфаркта, и достигает уровня более 200-300 нг/мл при верхней границе нормы 15 нг/мл. Таким образом, кардиомаркер сБСЖК является наиболее ранним из всех маркеров некроза миокарда, что особенно актуально учитывая стремительность событий, развивающихся при ОКС и высокий уровень неблагоприятных исходов именно первые его сутки. Тест-система по определению сБСЖК оказывает существенную помощь в диагностике ОКС, особенно в ситуациях с нетипичной клинической картиной и отсутствием значимых диагностических изменений электрокардиограммы. Кроме того, повышение уровня сБСЖК является предиктором неблагоприятный событий у больных с ОКС (инфаркт миокарда и сердечно-сосудистая смерть) в течение 1 года. Определение содержания сБСЖК в крови больных с подозрением на ОКС с целью раннего выявления некроза миокарда рекомендовано решением ежегодного конгресса Европейского кардиологического общества в 2000 г.
Тропонин I - белок, входящий в тропониновый комплекс, различие изоформ которого в миокарде и скелетных мышцах составляет около 90 %. Благодаря этому, сердечный тропонин-1 (сТн-Ι) является высокочувствительным и высокоспецифичным маркером повреждения миокарда. В норме тропонин I в кровотоке не обнаруживаются. При ишемическом повреждении миокарда тропонины поступают в периферический кровоток, где могут определяться через 6-8 часов. Максимальная концентрация отмечается через 14-28 часов и сохраняется в течение 3-7 суток, образуя длительное «диагностическое окно». Процесс освобождения тропонина I имеет однофазный характер, что обусловлено большим содержанием его цитоплазменной фракции. Если растворенный в цитозоле сБСЖК относительно быстро вымывается из зоны некроза, деструкция сократительного аппарата кардиомиоцитов более продолжительна по времени, поэтому увеличение уровня тропонинов определяется до 3-7 дней после начала ИМ. Этот длительный период выхода тропонинов в кровь увеличивает вероятность того, что положительный результат его определения был правильным, особенно в подострой фазе ИМ. Специфичность и чувствительность методов определения тропонинов в крови при ИМ составляет 92-95%.
Известно устройство для хроматографического анализа для обнаружения аналита в образце (патент РФ jV 2124729, МПК G01N33/53, опубл. 10.01.1999 г.). Устройство включает в себя (1) по меньшей мере, два строго плоских противоблока, один из которых содержит на своей поверхности хроматографическую среду; и (2) средство для установки противоблоков друг против друга и приложения туда давления, достаточного для переноса жидкости с одного противоблока на другой в направлении строго перпендикулярном к противоблоку с целью нанесения образца на хроматографическую среду для обнаружения и/или определения вслед за тем аналита. Устройство может также включать: (1) по меньшей мере три строго плоских противоблока, отличающихся тем, что один из них содержит на своей поверхности хроматографическую среду, имеющую первый и второй концы; (2) средство для установки противоблоков друг против друга, по меньшей мере, в двух различных комбинациях и приложения туда давления, достаточного для переноса жидкости с одного противоблока к другому в направлении строго перпендикулярном к противоблокам так, что образец прикладывается к хроматографической среде и перетекает через нее от первого конца ко второму концу для обнаружения и/или определения аналита на хроматографической среде; и (3) по меньшей мере один аппликатор и один абсорбер, локализованные на одном из противоблоков и расположенные таким образом, что когда противоблок с аппликатором и абсорбером на нем устанавливается напротив противоблока, содержащего хроматографическую среду, на последнюю наносится жидкость, которая перетекает через нее от второго конца к первому, вследствие чего направление движения потока через хроматографическую среду изменяется на обратное, с целью обнаружения и/или определения аналита, осуществляемого после реверса потока через хроматографическую среду.
Однако данное устройство имеет достаточной сложную конструкцию, включает в себя источник повышенного давления для обеспечения прохождения жидкого образца вдоль пористых его элементов, а также не содержит компонентов для обеспечения обнаружения сБСЖК и тропонина I в образцах крови.
Известна тест-система для иммунохроматографического определения сердечного тропонина I для экспресс-диагностики инфаркта миокарда (патент Китая JV°101059519, МПК G01N 33/558, опубл. 24.10.2007 г.), содержащая иммунологическую планшету с окном для внесения образца и окном для просмотра результатов, внутри которой размещена подложка для ламинирования пористых материалов, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены фильтрационная подушка для нанесения исследуемого образца крови, подушка для нанесения конъюгата, пористая мембрана и абсорбционная подушка, причем подушка для нанесения конъюгата пропитана конъюгатом наночастиц коллоидного золота (размер 15-25 нм) с первыми моноклональными мышиными антителами, специфичными к сердечному тропонину I, на пористой мембране, поперек последней и параллельно друг другу, сформированы тестовая полоса, содержащая адсорбированные вторые моноклональные мышиные антитела и контрольная полоса, содержащая адсорбированные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши. Изобретение имеет простую подготовку, действие и высокую чувствительность (1,0 нг/мл), с устойчивым результатом. Повышение концентрации тропонина I при инфаркте миокарда отмечается через 4-6 часов. Кинетика его выхода в кровь может представлять двухфазную кривую с начальным пиком через 15-20 часов и менее высоким вторым пиком через 60-80 часов после развития инфаркта миокарда.
Однако данная тест-система не позволяет выявлять ранний маркер сБСЖК, уровень которого значительно превышает (от 15 нг/мл и выше) по сравнению со здоровыми людьми в первые 1-6 часов после инфаркта миокарда. Уровень сБСЖК в крови достигает максимальных значений через 6 часов после повреждения миокарда и возвращается к нормальному значению через 16 - 24 ч.
Известна тест-система для иммунохроматографического определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты для экспресс- диагностики инфаркта миокарда (патент Китая N21704757, МПК G01N 33/558, опубл. 07.12.2005 г.), содержащая иммунологическую планшету с окном для внесения образца и окном для просмотра результатов, внутри которой размещена подложка для ламинирования пористых материалов, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены фильтрационная подушка для нанесения исследуемого образца крови, подушка для нанесения конъюгата, пористая мембрана и абсорбционная подушка, причем подушка для нанесения конъюгата пропитана конъюгатом частиц коллоидного золота с первыми моноклональными мышиными антителами, специфичными к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, на пористой мембране, поперек последней и параллельно друг другу, сформированы тестовая полоса, "содержащая адсорбированные вторые P T/RU2010/000422
5 моноклональные мышиные антитела и контрольная полоса, содержащая адсорбированные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши. Кардиомаркер сБСЖК присутствует в крови здоровых людей. Индивидуальная норма содержания белка варьирует от 5 до 7 нг/мл. Диагностически значение (уровень патологических значений) сБСЖК варьирует от 10 до 15 нг/мл. В результате таких особенностей белка возникает неспецифическое выявления маркера.
В этой связи предлагаемый в данном аналоге иммунохроматографический тест позволяет выявлять ранний маркер сБСЖК в количестве 5 нг/мл, т.е. обладает слишком высокой чувствительностью, что приводит к появлению большого количества ложноположительных результатов и, как следствие, к низкой специфичности и низкой точности теста, что позволяет применять их лишь в качестве ориентировочного теста. Кроме того, данная тест-система не позволяет выявлять поздний маркер тропонин I, что сужает ее функциональные возможности.
Известна тест-система для иммунохроматографического определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты в цельной крови для экспресс- диагностики инфаркта миокарда (патент РФ на полезную модель JV287262, МПК G01 N 33/558, опубл. 27.09.2009 г.), содержащая иммунологическую планшету с окном для внесения образца и окном для просмотра результатов, внутри которой размещена подложка для ламинирования пористых материалов, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены фильтрационная подушка для нанесения исследуемого образца крови, подушка для нанесения конъюгата, пористая мембрана и абсорбционная подушка, причем подушка для нанесения конъюгата пропитана конъюгатом частиц коллоидного золота с первыми моноклональными мышиными антителами, специфичными к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, на пористой мембране, поперек последней и параллельно друг другу, сформированы тестовая полоса, содержащая адсорбированные вторые моноклональные мышиные антитела и контрольная полоса, содержащая адсорбированные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши. На пористой мембране, поперек последней сформирована конкурирующая полоса, расположенная вдоль края подушки для нанесения конъюгата и содержащая слой адсорбированных первых моноклональных мышиных антител, специфичных к сердечному белку, связывающему жирные кислоты. Данная тест-система лишена недостатков предыдущего аналога.
Однако тест-система не позволяет выявлять поздний маркер тропонин I, что сужает ее функциональные возможности.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является комбинированный тест- микрочип для диагностики восьми сердечно-сосудистых заболеваний (Патент Китая jY°2783324, МПК G01N33/543, опубл. 24.05.2006 г.) и содержит антитела типа anti-crp, anti-Myoglobin, anti-cTnl (сердечный troponin I), anti- cTnT (сердечный troponin T), anti-nt-probnp, anti-ck-mb (creatine kinase isozymes-MB), anti-h-fabp (сердечный белок связывающий жирные кислоты), anti-GPBB (glycogen phosphorylase isoenzyme BB).
Однако такой тест является сложным в изготовлении и дорогостоящим изделием, требует специального оборудования для прочтения результатов, что не обеспечивает требованиям «прикроватной» экспресс- диагностики.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание более простой и надежной «прикроватной» комбинированной иммунохроматографической экспресс тест-системы для одновременного быстрого определения сБСЖК и тропонина I.
Указанный технический результат достигается тем, что в тест-системе (первый вариант ее выполнения) для иммунохроматографического определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты и тропонина I в цельной крови для экспресс-диагностики инфаркта миокарда, согласно изобретения, она содержит иммунологическую планшету с окном для внесения образца и окном для просмотра результатов, внутри которой размещена подложка для ламинирования пористых материалов, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены подушка с конъюгатами для нанесения исследуемого образца крови, фильтрационная подушка для сепарации исследуемого образца крови, пористая мембрана для проведения иммунохроматографической реакции и абсорбционная подушка для создания тока жидкости, причем, на подушке с конъюгатами и поперек последней сформированы первая полоса конъюгата частиц коллоидного золота с первыми моноклональными мышиными антителами (F9), специфичными к сердечному белку, связывающему жирные кислоты и вторая полоса конъюгата частиц коллоидного золота с первыми мышиными моноклональными антителами, специфичными к тропонину I (1-60), на пористой мембране и поперек последней сформированы конкурирующая полоса, содержащая слой адсорбированных первых (F9) или вторых (F10) моноклональных мышиных антител, специфичных к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, первая тестовая полоса, содержащая адсорбированные вторые моноклональные мышиные антитела (F10), специфичные к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, вторая тестовая полоса, содержащая адсорбированные вторые моноклональные антитела к тропонину I (1С- 19) и контрольная полоса, содержащая адсорбированные моноспецифичные поликлональные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши (RAM).
Указанный технический результат достигается также тем, что в тест-системе (второй вариант ее выполнения) для иммунохроматографического определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты и тропонина I в цельной крови для экспресс-диагностики инфаркта миокарда, согласно изобретения, она содержит иммунологическую планшету с окном для внесения образца и окном для просмотра результатов, внутри которой размещена подложка для ламинирования пористых материалов, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены подушка с конъюгатами для нанесения исследуемого образца крови, фильтрационная подушка для сепарации исследуемого образца крови, пористая мембрана для проведения иммунохроматографической реакции и абсорбционная подушка для создания тока жидкости, причем на подушке с конъюгатами и поперек последней сформированы первая полоса конъюгата частиц коллоидного золота с первыми моноклональными мышиными антителами (F9), специфичными к сердечному белку, связывающему жирные кислоты и вторая полоса конъюгата частиц коллоидного золота с первыми мышиными моноклональными антителами, специфичными к тропонину I (1-60), на фильтрационной подушке и поперек последней нанесена полоса конъюгата вторых моноклональных антител к тропонину I (IC-19), связанных с биотином, на пористой мембране и поперек последней сформированы конкурирующая полоса, содержащая слой адсорбированных первых (F9) или вторых (F10) моноклональных мышиных антител, специфичных к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, первая тестовая полоса, содержащая адсорбированные вторые моноклональные мышиные антитела (F10), специфичные к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, вторая тестовая полоса, содержащая адсорбированный авидин или стрептавидин, специфичный к биотину и контрольная полоса, содержащая адсорбированные моноспецифичные поликлональные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши (RAM).
Указанный технический результат достигается также тем, что в тест-системе (третий вариант ее выполнения) для иммунохроматографического определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты и тропонина I в цельной крови для экспресс-диагностики инфаркта миокарда, согласно изобретения, она содержит иммунологическую планшету с окном для внесения образца и окном для просмотра результатов, внутри которой размещена подложка для ламинирования пористых материалов, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены подушка с конъюгатами для нанесения исследуемого образца крови, фильтрационная подушка для сепарации исследуемого образца крови, пористая мембрана для проведения иммунохроматографической реакции и абсорбционная подушка для создания тока жидкости, причем на подушке с конъюгатами и поперек последней сформированы первая полоса конъюгата частиц коллоидного золота с первыми моноклональными мышиными антителами (F9), специфичными к сердечному белку, связывающему жирные кислоты и вторая полоса конъюгата частиц коллоидного золота с первыми мышиными моноклональными антителами, специфичными к тропонину I (1-60), на фильтрационной подушке и поперек последней нанесены конкурирующая полоса вторых моноклональных мышиных антител (F10), специфичных к сердечному белку, связывающему жирные кислоты и полоса конъюгата вторых моноклональных антител к тропонину I (1С- 19), связанных с биотином, на пористой мембране и поперек последней сформированы, первая тестовая полоса, содержащая адсорбированные вторые моноклональные мышиные антитела (F10), специфичные к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, вторая тестовая полоса, содержащая адсорбированный авидин или стрептавидин, специфичный к биотину и контрольная полоса, содержащая адсорбированные моноспецифичные поликлональные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши (RAM).
Полосы на подушке с конъюгатами, на фильтрующей подушке и на пористой мембране сформированы параллельно и на расстоянии друг от друга путем пропитки соответствующими реагентами с последующим удалением влаги.
Подушка для нанесения конъюгата выполнена из целлюлоза или стеклянного микроволокна, или полиэфирного микроволокна длиной 15 мм с размером пор 20-25мкм, толщиной 350 мкм и абсорбционной емкостью не менее 55 мг/см .
Фильтрационная подушка выполнена из пористого материала полисульфона длиной 20 мм, толщиной 600-650 мкм и размером пор 55-57 мкл/см . Пористая мембрана выполнена из нитроцеллюлозы, или полиэфирсульфона длиной 20 мм, толщиной 125-155 мкм, абсорбционной емкостью не менее 30 мг/см2 , скоростью течения 90-1 10 сек/40мм. Абсорбционная подушка выполнена из пористого материала хлопкового пуха, или стеклоцеллюлозного волокна длиной 15 мм и толщиной 400-450 мкм. Подложка для ламинирования выполнена из полистирола или акрилового адгезивного материала длиной 60 мм, толщиной 230-270 мкм.
Указанные технические характеристики элементов тест-системы позволяют надежно функционировать, снижать количество ложноположительных результатов путем повышения специфичности и точности теста и одновременно определять сБСЖК и тропонина I.
Изобретение поясняется следующими графическими материалами. На фиг. 1 приведена схема внешнего вида тест системы, выполненной в виде иммунологической планшеты. На фиг. 2 представлена схема расположения внутренних элементов тест-системы в иммунологической планшете (первый вариант выполнения). На фиг. 3 представлена схема расположения внутренних элементов тест-системы в иммунологической планшете (второй вариант выполнения). На фиг. 4 представлена схема расположения внутренних элементов тест-системы в иммунологической планшете (третий вариант выполнения).
Тест-система «Кардиотест» для проведения ммунохроматографического анализа содержит иммунологическую планшету 1 с приемным овальным окном 2 для внесения образца цельной крови и прямоугольным окном 3 для просмотра результатов. Внутри иммунологической планшеты 1 размещена подложка 4 для ламинирования пористых материалов, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены подушка 5 с конъюгатами для нанесения исследуемого образца крови, фильтрационная подушка 6 для сепарации исследуемого образца крови, пористая хроматографическая мембрана 7 для проведения иммунохроматографической реакции и абсорбционная подушка 8 для создания тока жидкости .
В первом варианте выполнения тест-системы (фиг. 2) на подушке 5 с конъюгатами и поперек последней сформированы первая полоса 9 конъюгата частиц коллоидного золота с монокл ональными мышиными антителами (F9), специфичными к сердечному белку, связывающему жирные кислоты и вторая полоса 10 конъюгата частиц коллоидного золота с мышиными монокл ональными антителами, специфичными к тропонину I (1-60). На пористой мембране 7, поперек последней, сформированы конкурирующая полоса 11, содержащая слой адсорбированных первых (F9) или вторых (F10) монокл ональных мышиных антител, специфичных к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, первая тестовая полоса 12, содержащая адсорбированные вторые моноклональные мышиные антитела (F10), специфичные к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, вторая тестовая полоса 13, содержащая адсорбированные моноклональные антитела к тропонину I (1С- 19) и контрольная полоса 14, содержащая адсорбированные моноспецифичные поликлональные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши (RAM). Полосы 9 и 10 на подушке 5 с конъюгатами и полосы 11, 12, 13 и 14 на пористой мембране 7 сформированы параллельно и на расстоянии друг от друга путем пропитки соответствующими реагентами с последующим удалением влаги. Конкурирующая полоса 11 на пористой мембране 7 расположена вдоль и у края фильтрационной подушки 6 для сепарации исследуемого образца крови.
Кроме того, имеется участок 15 для нанесения образца цельной крови на подложке 5, расположенный перед полосами 9 и 10 конъюгатов частиц коллоидного золота с моноклональными антителами. Причем, овальное окно 2 планшеты 1 расположено над участком 15 на подложке 5.
Во втором варианте выполнения тест-системы (фиг. 3) на подушке 5 с конъюгатами и поперек последней сформированы первая полоса 9 конъюгата частиц коллоидного золота с моноклональными мышиными антителами (F9), специфичными к сердечному белку, связывающему жирные кислоты и вторая полоса 10 конъюгата частиц коллоидного золота с мышиными моноклональными антителами, специфичными к тропонину I (1-60). На пористой хроматографической мембране 7 и поперек последней сформированы конкурирующая полоса И, содержащая слой адсорбированных первых (F9) или вторых (F10) моноклональных мышиных антител, специфичных к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, первая тестовая полоса 12, содержащая адсорбированные вторые моноклональные мышиные антитела (F10), специфичные к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, вторая тестовая полоса 13, содержащая адсорбированный авидин или стрептавидин, специфичный к биотину и контрольная полоса 14, содержащая адсорбированные моноспецифичные поликлональные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши (RAM). На фильтрационной подушке 6 и поперек последней нанесена полоса 16 конъюгата моноклональных антител к тропонину I (1С- 19), связанных с биотином.
В третьем варианте выполнения тест-системы (фиг. 4) на подушке 5 с конъюгатами и поперек последней сформированы первая полоса 9 конъюгата частиц коллоидного золота с моноклональными мышиными антителами (F9), специфичными к сердечному белку, связывающему жирные кислоты и вторая полоса 10 конъюгата частиц коллоидного золота с мышиными моноклональными антителами, специфичными к тропонину I (1-60). На фильтрационной подушке 6 и поперек последней сформированы конкурирующая полоса 11, содержащая слой адсорбированных вторых моноклональных мышиных антител (F10), специфичных к сердечному белку, связывающему жирные кислоты и полоса 16 конъюгата моноклональных антител к тропонину I (1С- 19), связанных с биотином. На пористой хроматографической мембране 7 и поперек последней сформированы первая тестовая полоса 12, содержащая адсорбированные вторые моноклональные мышиные антитела (F10), специфичные к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, вторая тестовая полоса 13, содержащая адсорбированный авидин или стрептавидин, специфичный к биотину и контрольная полоса 14, содержащая адсорбированные моноспецифичные поликлональные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши (RAM).
В таблице 1 приведена характеристика материалов, из которых изготовлены элементы тест-системы.
Таблица 1. Характеристика материалов тест-системы
Наименование Состав материалов Характеристики материалов элемента тест- системы
Подушка 5 с целлюлоза или - размер пор 20-25 мкм;
конъюгатами для стеклянное микроволокно; -абсорбционная емкость нанесения образца или полиэфирное 55мг/см ;
крови микроволокно; -высвобождение конъюгата
(спустя 90сек) 89%;
- толщиной 350 мкм;
Фильтрационная пористый материал из - толщиной 600-650 мкм;
подушка 6 полисульфона -объем пор 56,8мкл/см2;
Пористая нитроцеллюлоза или толщина мембраны 125-155 км мембрана 7 полиэфирсуль-фон, или -толщина подложки 100 мкм;
нейлон, или абсорбционной емкостью не поливинилиденхлорид на менее 30 мг/см2,
полистирольной подложке -скорость потока образца
90-110 сек/40мм;
Абсорбционная пористый материал из - толщина 429мкм;
подушка 8 хлопкового пуха, или -сухой вес 12,4мг/см ;
стеклоцеллюлозное волокно
Подложка 4 для белый полистирол или -толщина подложки
ламинирования акриловый адгезивный 254 мкм +/-10%;
материал. T U2010/000422
13
Во всех вариантах выполнения тест-системы полосы 9 и 10 на подушке 5 с конъюгатами, полоса 16 на фильтрационной подушке, полосы 12, 13 и 14 на пористой мембране 7 и полоса 11 на мембране 7 (1 и 2 варианты тест-системы) или на фильтрационной подушке 6 (3-й вариант выполнения тест системы) сформированы параллельно и на расстоянии друг от друга путем пропитки соответствующими реагентами с последующим удалением влаги.
В первом (фиг. 2) и втором (фиг. 3) вариантах выполнения тест-системы конкурирующая полоса 11 на пористой хроматографической мембране 7 расположена вдоль и у края фильтрационной подушки 6 для сепарации исследуемого образца крови, а в третьем варианте выполнения тест-системы (фиг. 4) конкукурирующая полоса 11 на фильтрационной подушке 6 нанесена вдоль и у края конъюгатной подушки 5.
Конструкция иммунологической планшеты 1 обеспечивает контакт подушек 5 и 6, пористой мембраны 7 и абсорбционной подушки 8 друг с другом и позволяет образцу крови, свободно проходить все пористые материалы за счет действия капиллярных сил.
На конъюгатной подушке на линиях 9 и 10 содержание конъюгатов моноклональных антител с частицами коллоидного золота составляет 8-10 единиц оптической плотности (ОП ед). На фильтрационной подушке полоса 16 содержит конъюгат моноклональных антител к тропонину I с биотином в соотношении 1 :8 - 1 : 16.
На мембране 7 конкурирующая полоса 1 1 содержит 0,9-1 ,0 мг/мл моноклональных антител; тестовая полоса 12 содержит 1,0-1 ,1 мг/мл моноклональных антител; тестовая полоса 13 в третьем варианте выполнения тест - системы содержит авидина (стрептавидина) в концентрации 0,8-1,5 мг/мл, а контрольная полоса 14 содержит поликлональные антитела в количестве 1,3-1,5 мг/мл.
Ниже приведена характеристика антител, используемых в тест-системе для иммунохроматографического определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты и тропонина I в цельной крови. 1. Мышиные моноклональные антитела, специфичные к белку сБСЖК (FABP).
1.1. Моноклон F9, специфичен к целой молекуле сердечного FABP, тип IgGl - применяется в полосе 9 (конъюгирован с коллоидными частицами золота) и конкурирующей полосе 11.
1.2. Моноклон F10, специфичен к целой молекуле сердечного FABP, тип IgGl (наносится на первую тестовую полосу 12 и конкурирующую полосу 11).
2. Мышиные моноклональные антитела, специфичные к белку тропонина I
2.1. Моноклон N°l (I -60) cTnl , тип IgGl, полученный иммунизацией молекулой тропонина I, специфичный к отдельным антигенным детерминантам молекулы cTnl .
2.2. Моноклон N°2 (1С- 19) cTnl, тип IgG2b, полученный иммунизацией молекулой тропонина I, специфичен к центральной части молекулы с устойчивой антигенной детерминантой, протестированный от протеолитической деградации антигена (наносится на тестовую полосу 13 в первом варианте) и применяется в полосе 16 (связанный с биотином)
3. Моноспецифичные поликлональные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши (RAM). Аффинно-очищенная фракция иммуноглобулинов кроличьей антисыворотки против к Fc-фрагментов иммуноглобулинов мыши. Применяется для связывания конъюгатов мышиных моноклональных антител на контрольной полосе 14.
Реакция авидин-биотин. Реакция между авидином (стрептавидином) и биотином позволяет осуществлять связь между различными компонентами специфического комплекса на твердой фазе. Для нее характерны высокое значение константы связывания (1015 М"1), легкость присоединения биотина к антителам без заметного нарушения их антительной активности, высокая стабильность авидина (стрептавидина).
Биотин представляет собой один из многих водорастворимых компонентов комплекса витамина В и является коферментом для ферментов карбоксилирования. Его молекулярная масса равна 244,3 Д. Стрептавидин - белок, вырабатываемый бактерией Streptomycces avidinii. Авидин, получаемый из яиц, представляет собой белок с молекулярной массой 62400 Д и изоэлектрической точкой pi = 10,5. Один мг авидина связывает до 14 мкг биотина. Образующийся при этом комплекс устойчив в интервале рН 2 - 13. Авидин имеет 4 сайта связывания с биотином. Однако, из-за стерических напряжений может взаимодействовать только с двумя молекулами биотинилированного белка.
Заявляемая тест-система «Кардиотест» (первый вариант) работает следующим образом. Кровь в объеме 100-150 мкл (3-5 капель) наносится через приемное окно 2 на подушку 5 с конъюгатами. Образец крови, пройдя через подушку 5, под действием капиллярных сил пропитывает полосы 9 и 10, где присутствующие в крови белки-маркеры (сБСЖК и/или тропонин I) вступают в реакцию с соответствующими белку моноклональнми антителами, меченными коллоидным золотом, образуя окрашенный иммунный комплекс антиген-антитело. Далее иммунный комплекс впитываются фильтрационной подушкой 6, где происходит сепарация крови (отделение эритрацитарной массы). При определении тропонина I требуется высокая чувствительность тест-системы - 1 нг/мл и выявление как цельной молекулы, так различных ее фрагментов. Предельная способность маркера коллоидного золота выявлять вещество колеблется от 0, 5 до 1 нг/мл выявляемого агента. В предлагаемой конструкции комплексы антиген + антитело, меченное частицами коллоидного золота, формируются сразу на конъюгатной подушке 5 и, тем самым, обеспечивается достаточное время этого контакта и снижается вероятность гидролиза лабильных молекул белка тропонина I. Проходя через конъюгатную подушку 5 и фильтрационную подушку 6, связанный комплекс в некоторой степени концентрируется, не распадается и не оседает на них вместе с эритроцитами, свободно проходит с потоком плазмы на пористую хроматографическую мембрану 7. Образовавшийся окрашенный иммунный комплекс (состоящий из одного иммунного комплекса или двух комплексов) движется под действием капиллярных сил вдоль пористой мембраны 7, пересекает конкурирующую полосу 11 и взаимодействует с нанесенными на ней адсорбированными первыми или вторыми моноклональными мышиными T RU2010/000422
16 антителами F9 или F10, специфичными к сБСЖК. Функция полосы 11 является снижение аналитической чувствительности теста до 15 нг/мл за счет конкурентного связывания сБСЖК с моноклональными антителами F9 или F10, иммобилизованными на этой полосе 1 1. Указанная полоса не окрашивается поскольку диагностически значимым считается повышение уровня сБСЖК в крови от 15 нг/мл. Уменьшение аналитической чувствительности теста до 15 нг/мл приводит к увеличению специфичности при сохранении необходимого уровня диагностической чувствительности. Далее иммунный комплекс, перемещаясь под действием капиллярных сил пересекает первую тестовую полосу 12 и взаимодействует с иммобилизованными на ней вторыми моноклональными мышиными антителами F10 к БСЖК. В результате при наличии сБСЖК в образце крови выше порогового значения первая тестовая полоса 12 окрашивается в пурпурный цвет. Если образец крови не содержит сБСЖК в концентрации выше пороговой, первая тестовая полоса 12 остается не окрашенной. Далее не связавшийся на первой тестовой полосе 12 комплекс движется далее вдоль пористой мембраны 7 до второй тестовой полосы 13 с нанесенными антителами N°2 к тропонину I. Если в образце тропонин I содержится в концентрации 1,1 нг/мл и выше, то вторая тестовая полоса 13 окрашивается в пурпурный цвет (вторая окрашенная полоса). Если же тропонин I в пробе ниже порогового значения (ниже 1,1 нг/мл), то тестовая полоса 13 не окрашивается. Далее не связавшиеся конъюгаты доходят до контрольной полосы 14 и взаимодействуют с иммобилизованными кроличьими поликлональными антителами к иммуноглобулинам мыши. В результате контрольная полоса 14 также окрашивается в пурпурный цвет (третья окрашенная полоса). Контрольная полоса 14 является внутренним контролем теста и, если анализ проведен правильно, должна проявляться всегда, независимо от присутствия сБСЖК и тропонина I в образце крови.
Результаты определяются визуально в течение 5-30 минут. При положительном результате тестирования сБСЖК и тропонина I появляются три окрашенные полосы - две тестовых и контрольная. Если в образце U2010/000422
17 присутствует только ранний маркер сБСЖК, то окрашивается первая линия. Это происходит во временном промежутке от 1 до 24 часов от начала заболевания. Если в образце присутствует более поздний маркер тропонин I, то окрашивается вторая тестовая линия. Временной промежуток от 6 до 48 часов от начало болевого синдрома. Если образец взят в промежутке от 6 до 24 часов от начала заболевания, то проявляются все три полосы. Интенсивность цвета контрольной и тестовых полос может быть различной. При отрицательном результате появляется только одна полоса - контрольная. Если контрольная полоса не проявилась, результаты теста считаются недействительными.
Заявляемая тест-система «Кардиотест» (второй и третий вариант) работает следующим образом.
Кровь в объеме 100-150 мкл (3-5 капель) наносится через приемное окно 2 на подушку 5 с конъюгатами, которая впитывается пористым материалом. Образец крови проходит за счет капиллярных сил вдоль конъюгатной подушки 5. Если в образце присутствует сБСЖК, то он взаимодействует с конъюгатом коллоидного золота и антитела F9 на полосе 9. В результате образуется окрашенный иммунный комплекс антиген-антитело. Образовавшийся окрашенный иммунный комплекс движется под действием капиллярных сил вдоль фильтрационной подушки 6 и мембраны 7, пересекает конкурирующую полосу 11 (во втором варианте конструкции тест-системы на мембране 7, и в третьем варианте конструкции тест-системы на фильтрующей подушке 6) и взаимодействует с нанесенными на ней адсорбированными моноклональными мышиными антителами F9, или F10, специфичными к сБСЖК. Функцией данной полосы 11 является снижение аналитической чувствительности теста не ниже 15 нг/мл за счет конкурентного связывания сБСЖК с моноклональными антителами F9 или F10, иммобилизованными на линии 1 1, не уменьшая интенсивности окрашивания этой тестовой полосы. Поскольку диагностически значимым считается повышение уровня сБСЖК в крови до 15 нг/мл, то уменьшение аналитической чувствительности теста до 15 нг/мл приводит к увеличению T/RU2010/000422
18 специфичности при сохранении необходимого уровня диагностической чувствительности.
Нанесение на фильтрующую подушку 6 конкурирующей полосы 11 с моноклональными антителами F10 (3-й вариант тест-ситемы), позволяет использовать их в меньшей концентрации, что позволяет экономить реагенты. Например, концентрация антител F10 на конкурирующей линии 1 1, расположенной на мембране 7, составляет 1 мг/мл, а на фильтрационной подушке 6 требуется концентрация антител F10 на полосе 1 1 около 0,3 мг/мл. Это свойство определяется местоположением полосы 1 1 на планшете 1, временем реагирования компонентов, смываемостью антител с материала.
Далее иммунный комплекс движется под действием капиллярных сил вдоль нитроцеллюлозной мембраны 7, пересекает первую тестовую полосу 12 и взаимодействует с иммобилизованными на линии моноклональными мышиными антителами F10 к БСЖК. В результате при наличии сБСЖК в образце крови выше порогового значения первая тестовая полоса 12 окрашивается в пурпурный цвет. Если образец крови не содержит сБСЖК в концентрации выше пороговой, первая тестовая полоса 12 остается не окрашенной.
Если в образце присутствует тропонин I, то данный белок-маркер под действием капиллярных сил впитывается пористым материалом конъюгатной подушки 5, при прохождении которой, тропонин I взаимодействует на полосе 10 с конъюгатом коллоидного золота и моноклональных антител (I -60). В результате образуется окрашенный иммунный комплекс антиген-антитело. Образовавшийся окрашенный иммунный комплекс движется под действием капиллярных сил вдоль пористых материалов подушек 5 и 6, пересекает полосу 16 на фильтрационной подушке 6, с нанесенным на нее конъюгатом моноклональных антител к тропонину I (1С- 19), связанных с биотином. Образуется тройной комплекс антитело (I -60)- антиген тропонин I- антитело (I С-19).
Далее связавшийся комплекс движется по нитроцеллюлозной мембране 7 до второй тестовой линии 13 с нанесенным авидином (или стрептавидином). Комплекс связывается посредством сродства биотина из комплекса и авидина (стрептавидина), нанесенного на тестовую полосу 13. Если в образце тропонин I содержится в концентрации 0,9- 1 нг/мл, то вторая тестовая линия окрашивается в пурпурный цвет (вторая окрашенная полоса 13). Если же тропонин I в пробе ниже порогового значения, то тестовая полоса 13 не окрашивается.
Затем не связавшиеся конъюгаты реагентов доходят до контрольной полосы 14 и взаимодействуют с иммобилизованными кроличьими антителами к иммуноглобулинам мыши. В результате контрольная линия 14 также окрашивается в пурпурный цвет (третья окрашенная полоса 14). Контрольная полоса 14 является внутренним контролем теста и, если анализ проведен правильно, должна проявляться всегда, независимо от присутствия сБСЖК или тропонина I в образце крови.
Результаты определяются визуально в течение 10-30 минут. При наличии в образце сБСЖК и тропонина I появляются три окрашенные полосы - две тестовых и контрольная. Если в образце присутствует только ранний маркер сБСЖК, то окрашивается первая тестовая линия. Это происходит, если забор крови осуществляли во временном промежутке от 1 до 24 часов от начала заболевания. Если в образце присутствует только один более поздний маркер тропонин I, то окрашивается только вторая тестовая линия. Временной промежуток для выявления этого маркера от 6 до 48 часов от начало болевого синдрома. Если образец взят в промежутке от 6 до 24 часов от начала заболевания, то проявляются все три полосы. Интенсивность цвета контрольной и тестовых полос может быть различной.
При отрицательном результате появляется только одна полоса - контрольная. Если контрольная полоса не проявилась, результаты теста считаются недействительными.
Данные исследований, подтверждающие технический результат, достигаемый заявляемой тест-системой. Кардиомаркер сБСЖК присутствует в крови здоровых людей. Индивидуальная норма содержания белка варьирует от 5 до 7 нг/мл. Диагностический уровень (уровень патологических значений) сБСЖК варьирует от 12 до 15 нг/мл. В результате таких особенностей белка возникает неспецифическое выявление маркера. При использовании теста для экспресс-диагностики высокая чувствительность не всегда необходима, что позволяет применять их лишь в качестве ориентировочного теста. Конкурирующая полоса 11 обеспечивает снижение аналитической чувствительности теста до 15 нг/мл за счет конкурентного связывания БСЖК с моноклональными антителами F9, иммобилизованными на этой полосе 11. Поскольку диагностическим значимым считается уровкнь сБСЖК в крови от 15 нг/мл, то уменьшение аналитической чувствительности теста до 15 нг/мл приводит к увеличению специфичности теста при сохранении необходимого уровня диагностической чувствительности. Действительно, применение конкурирующей полосы 11 позволяет значительно уменьшить количество ложноположительных результатов, при этом, не увеличивая количество ложноотрицательных и, таким образом, при сохранении прежнего уровня диагностической чувствительности увеличивается специфичность и, как следствие, точность теста. В таблице 2 (первый вариант) и таблице 3 (второй и третий варианты) приведены данные диагностических показателей заявляемой тест-системы, которые подтверждают заявляемый технический результат.
. Тест система для определения Тропонина I, требует высокой чувствительности до 1 нг/мл. Предельная способность маркера коллоидного золота выявлять вещество от 1 нг/мл выявляемого агента.
Во втором и третьем варианте выполнения тест-системы повышение чувствительности теста обеспечивается за счет взаимодействия биотина и авидина (стрептавидина). Биотин, связанный с антителом, смывается с фильтрационной подушки 6, связывается на тестируемой полосе 13 с авидином (как вариант стрептавидином). Визуализацию этого комплекса обеспечивает конъюгат коллоидного золота.
Заявляемая тест-система позволяет увеличить чувствительность в диапазоне 0,9-1 нг/мл. P T/RU2010/000422
21
Таблица 2. Данные диагностических показателей заявляемой тест-системы (первый вариант)
Figure imgf000023_0001
Диагностические показатели рассчитывались по формулам:
Чувствительность -
TPR = TP/(TP+FN);
Специфичность -
SPC =TN/ (FP+TN);
Точность -
ACC=(TP+TN)/ N,
где TP достоверно положительный результат,
FN достоверно отрицательный результат,
FP ложноположительный результат
FN ложно отрицательный результат
N количество всех пациентов.
Применение тройного комплекса антитело (1-60) коллоидное золото- антиген тропонин I - антитело (1С- 19) биотин, который затем связывается с авидином на тестовой линии, позволяет значительно уменьшить количество ложноотрицательных результатов, при этом, не увеличивая количество ложноположительных результатов и, таким образом, при сохранении высокого уровня специфичности обеспечивается увеличение чувствительности определения тропонина I.
Таблица 3. Данные диагностических показателей заявляемой тест-системы (второй и третий варианты)
Figure imgf000024_0001
Одновременное определение в заявляемой тест-системе специфичного сБСЖК и тропонина I позволяет обеспечить надежный и быстрый диагноз и увеличить временной интервал диагностики до 48 часов. Комбинация этих маркеров позволяет избежать недостатков тестов, содержащих только один из указанных маркеров. При наличии почечной недостаточности у пациента позволит избежать неспецифических (ложноположительных) реакций. Применение теста позволит врачу при отсутствии у пациента четко выраженной клинической картины инфаркта миокарда и отсутствии четких признаков в кардиограмме, независимо от временного интервала от начала болевого синдрома, принять решение о срочной госпитализации больного. По тем же причинам необходимо иметь комбинированные тесты для диагностики инфаркта миокарда в фелыперско-акушерских пунктах. Положительный результат анализа позволит обоснованно вызвать скорую помощь или бригаду санавиации из ближайшего места ее нахождения. Малые размеры и вес иммунохроматографических тестов позволяют использовать их участковым врачом или врачом общей практики при посещении больного на дому.

Claims

23 Формула изобретения
1. Тест-система для иммунохроматографического определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты и тропонина I в цельной крови для экспресс-диагностики инфаркта миокарда, характеризующаяся тем, что она содержит иммунологическую планшету (1) с окном (2) для внесения исследуемого образца крови и окном (3) для просмотра результатов, внутри которой размещена подложка (4) для ламинирования пористых материалов, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены подушка (5) с конъюгатами для нанесения исследуемого образца крови, фильтрационная подушка (6) для сепарации исследуемого образца крови, пористая мембрана (7) для проведения иммунохроматографической реакции и абсорбционная подушка (8) для создания тока жидкости, причем на подушке (5) с конъюгатами и поперек последней сформированы первая полоса (9) конъюгата частиц коллоидного золота с первыми моноклональными мышиными антителами, специфичными к сердечному белку, связывающему жирные кислоты и вторая полоса (10) конъюгата частиц коллоидного золота с первыми мышиными моноклональными антителами, специфичными к тропонину I, на пористой мембране (7) поперек последней, сформированы конкурирующая полоса (11), содержащая слой адсорбированных первых или вторых моноклональных мышиных антител, специфичных к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, первая тестовая полоса (12), содержащая адсорбированные вторые моноклональные мышиные антитела, специфичные к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, вторая тестовая полоса (13), содержащая адсорбированные вторые моноклональные антитела к тропонину I и контрольная полоса (14), содержащая адсорбированные моноспецифичные поликлональные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши (RAM).
2. Тест-система для иммунохроматографического определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты и тропонина I в цельной крови для экспресс-диагностики инфаркта миокарда, характеризующаяся тем, что она содержит иммунологическую планшету (1) с окном (2) для внесения исследуемого образца крови и окном (3) для просмотра результатов, внутри которой размещена подложка (4) для ламинирования пористых материалов, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены подушка (5) с конъюгатами для нанесения исследуемого образца крови, фильтрационная подушка (6) для сепарации исследуемого образца крови, пористая мембрана (7) для проведения иммунохроматографической реакции и абсорбционная подушка (8) для создания тока жидкости, причем на подушке (5) с конъюгами и поперек последней сформированы первая полоса (9) конъюгата частиц коллоидного золота с первыми моноклональными мышиными антителами, специфичными к сердечному белку, связывающему жирные кислоты и вторая полоса (10) конъюгата частиц коллоидного золота с первыми мышиными моноклональными антителами, специфичными к тропонину I, на фильтрационной подушке (6) и поперек последней нанесена полоса (16) конъюгата вторых моноклональных антител к тропонину I, связанных с биотином, на пористой мембране (7) поперек последней сформированы конкурирующая полоса (11), содержащая слой адсорбированных первых или вторых моноклональных мышиных антител, специфичных к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, первая тестовая полоса (12), содержащая адсорбированные вторые моноклональные мышиные антитела, специфичные к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, вторая тестовая полоса (13), содержащая адсорбированный авидин или стрептавидин, специфичный к биотину и контрольная полоса (14), содержащая адсорбированные моноспецифичные поликлональные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши (RAM).
3. Тест-система для иммунохроматографического определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты и тропонина I в цельной крови для экспресс-диагностики инфаркта миокарда, характеризующаяся тем, что она содержит иммунологическую планшету (1) с окном (2) для внесения исследуемого образца крови и окном (3) для просмотра результатов, внутри которой размещена подложка (4) для ламинирования пористых материалов, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены подушка (5) с конъюгатами для нанесения исследуемого образца крови, фильтрационная подушка (6) для сепарации исследуемого образца крови, пористая мембрана (7) для проведения иммунохроматографической реакции и абсорбционная подушка (8) для создания тока жидкости, причем на подушке (6) с конъюгатами и поперек последней сформированы первая полоса (9) конъюгата частиц коллоидного золота с первыми моноклональными мышиными антителами, специфичными к сердечному белку, связывающему жирные кислоты и вторая полоса (10) конъюгата частиц коллоидного золота с первыми мышиными моноклональными антителами, специфичными к тропонину I, на фильтрационной подушке (6) и поперек последней нанесены конкурирующая полоса (11) вторых моноклональных мышиных антител, специфичных к сердечному белку, связывающему жирные кислоты и полоса (16) конъюгата вторых моноклональных антител к тропонину I, связанных с биотином, на пористой мембране (7) поперек последней сформированы первая тестовая полоса (12), содержащая адсорбированные вторые моноклональные мышиные антитела, специфичные к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, вторая тестовая полоса (13), содержащая адсорбированный авидин или стрептавидин, специфичный к биотину и контрольная полоса (14), содержащая адсорбированные моноспецифичные поликлональные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши (RAM).
4. Тест-система по п.п. 1-3, отличающаяся тем, что полосы на подушке (5) с конъюгатами, на фильтрационной подушке (6) и на пористой мембране (7) сформированы параллельно и на расстоянии друг от друга путем пропитки соответствующими реагентами с последующим удалением влаги.
5. Тест-система по п.п. 1-3, отличающаяся тем, что подушка (5) для нанесения конъюгата выполнена из целлюлоза или стеклянного микроволокна, или полиэфирного микроволокна длиной 15 мм с размером пор 20-25мкм, толщиной 350 мкм и абсорбционной емкостью не менее 55 мг/см .
6. Тест-система по п.п. 1-3, отличающаяся тем, что фильтрационная подушка (6) выполнена из пористого материала полисульфона длиной 20 мм, толщиной 600-650 мкм и размером пор 55-57 мкл/см .
7. Тест-система по п.п. 1-3, отличающаяся тем, что пористая мембрана (7) выполнена из нитроцеллюлозы, или полиэфирсульфона длиной 20 мм, толщиной 125-155 мкм, абсорбционной емкостью не менее 30 мг/см , скоростью течения 90-110 сек/40 мм.
8. Тест-система по п.п. 1-3, отличающаяся тем, что абсорбционная подушка (8) выполнена из пористого материала хлопкового пуха, или стеклоцеллюлозного волокна длиной 15 мм и толщиной 400-450 мкм
9. Тест-система по п.п. 1-3, отличающаяся тем, что подложка (4) для ламинирования выполнена из полистирола или акрилового адгезивного материала длиной 60 мм, толщиной 230-270 мкм.
PCT/RU2010/000422 2010-07-29 2010-07-29 Тест-система для определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты, и тропонина i (варианты) WO2012015327A1 (ru)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2010/000422 WO2012015327A1 (ru) 2010-07-29 2010-07-29 Тест-система для определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты, и тропонина i (варианты)
RU2011107712/15A RU2464572C1 (ru) 2010-07-29 2010-07-29 Тест-система для иммунохроматографического определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты, и тропонина i в образце цельной крови для экспресс-диагностики инфаркта миокарда (варианты)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2010/000422 WO2012015327A1 (ru) 2010-07-29 2010-07-29 Тест-система для определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты, и тропонина i (варианты)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012015327A1 true WO2012015327A1 (ru) 2012-02-02

Family

ID=45530334

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2010/000422 WO2012015327A1 (ru) 2010-07-29 2010-07-29 Тест-система для определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты, и тропонина i (варианты)

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2464572C1 (ru)
WO (1) WO2012015327A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2545909C2 (ru) * 2013-03-19 2015-04-10 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии имени А.Н. Баха РАН Российской академии наук (ИНБИ РАН) Способ иммунохроматографического определения специфических антител

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL245091B (en) * 2016-04-13 2020-02-27 Novamed Ltd Single stage cardiac test device

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101059519A (zh) * 2007-05-23 2007-10-24 南京博天科智生物技术有限公司 心肌肌钙蛋白i纳米金标检测试纸条及其制备方法
RU87262U1 (ru) * 2009-04-27 2009-09-27 Общество С Ограниченной Ответственностью Научно-Производственное Объединение "Биотест" (Ооо Нпо "Биотест") Тест-система "кардиобсжк" для иммунохроматографического определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты в образце цельной крови для экспресс-диагностики инфаркта миокарда

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2373542C1 (ru) * 2008-04-22 2009-11-20 Государственное учреждение Научный центр клинической и экспериментальной медицины Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ГУ НЦКЭМ СО РАМН) Способ прогнозирования развития осложнений инфаркта миокарда

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101059519A (zh) * 2007-05-23 2007-10-24 南京博天科智生物技术有限公司 心肌肌钙蛋白i纳米金标检测试纸条及其制备方法
RU87262U1 (ru) * 2009-04-27 2009-09-27 Общество С Ограниченной Ответственностью Научно-Производственное Объединение "Биотест" (Ооо Нпо "Биотест") Тест-система "кардиобсжк" для иммунохроматографического определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты в образце цельной крови для экспресс-диагностики инфаркта миокарда

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WEISS E. ET AL.: "In vivo biotinylated recombinant antibodies: construction, characterization, and application of a bifunctional Fab-BCCP fusion protein produced in Escherichia coli", PROTEIN EXPR PURIF., vol. 5, no. 5, October 1994 (1994-10-01), pages 509 - 517 *
XIE PY. ET AL.: "A one-step immunotest for rapid detection of heart-type fatty acid-binding protein in patients with acute coronary syndromes", J IMMUNOASSAY IMMUNOCHEM., vol. 31, no. 1, January 2010 (2010-01-01), pages 24 - 32 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2545909C2 (ru) * 2013-03-19 2015-04-10 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии имени А.Н. Баха РАН Российской академии наук (ИНБИ РАН) Способ иммунохроматографического определения специфических антител

Also Published As

Publication number Publication date
RU2011107712A (ru) 2012-09-10
RU2464572C1 (ru) 2012-10-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2592418B1 (en) Diagnostic detecting device
EP1891447B1 (en) Two step lateral flow assay methods and devices
US6663833B1 (en) Integrated assay device and methods of production and use
EP1143248B1 (de) Verfahren zu Immobilisierung von Konjugaten in diagnostischen Tests
JP4619372B2 (ja) 改良された対照区画を有する免疫学的試験素子
US8999728B2 (en) Diagnostic detection device
US20070087450A1 (en) Immuno-gold lateral flow assay
US8431405B2 (en) Hyperglycosylated hCG detection device
US20100112725A1 (en) Method to increase specificity and/or accuracy of lateral flow immunoassays
EP0465266A1 (en) Complementary visual signal immunoassay
US6689317B1 (en) Immunoassay apparatus for diagnosis
US20040018576A1 (en) Bence Jones protein testing cassette
US20150212080A1 (en) Saturation assay
US20060246522A1 (en) C-reactive protein immunoassay and method
EP1536232A2 (de) Analytischer Sandwichtest zur Bestimmung von NT-proBNP
KR20120017884A (ko) 자성입자의 항체고정화 방법 및 이를 이용해 제조되는 진단스트립, 진단키트
US9207248B2 (en) Diagnostic detection devices and methods
US9201065B2 (en) Agglutination assay
EP0888547B1 (en) Immunoassay with whole blood
EA013943B1 (ru) Тест-система "кардиотест" для иммунохроматографического определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты, и тропонина i в образце цельной крови для экспресс-диагностики инфаркта миокарда
RU113847U1 (ru) КОМБИНИРОВАННАЯ ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ-МАРКЕРОВ ИНФАРКТА МИОКАРДА сБСЖК И ТРОПОНИНА I В ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ
RU2464572C1 (ru) Тест-система для иммунохроматографического определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты, и тропонина i в образце цельной крови для экспресс-диагностики инфаркта миокарда (варианты)
RU169868U1 (ru) Тест-система для иммунохроматографического определения прокальцитонина в образцах цельной крови, сыворотке или плазме с целью экспресс-диагностики сепсиса
JPH09500962A (ja) 試験装置
RU87262U1 (ru) Тест-система "кардиобсжк" для иммунохроматографического определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты в образце цельной крови для экспресс-диагностики инфаркта миокарда

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011107712

Country of ref document: RU

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10855404

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 10855404

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1