WO2012007625A1 - Compuestos útiles como lanzaderas a través de la barrera hematoencefálica y construcciones lanzadera-cargo - Google Patents

Compuestos útiles como lanzaderas a través de la barrera hematoencefálica y construcciones lanzadera-cargo Download PDF

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WO2012007625A1
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equiv
resin
dmf
conh
amino acid
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PCT/ES2011/070513
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Ernest GIRALT LLEDÓ
Meritxell TEIXIDÓ TURÀ
Morteza Malakoutikhah
Original Assignee
Universitat De Barcelona
Institut De Recerca Biomèdica De Barcelona
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    • C07K5/1024—Tetrapeptides with the first amino acid being heterocyclic
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Definitions

  • Useful compounds such as shuttles across the blood-brain barrier and shuttle-cargo constructions
  • This invention relates to the fields of medicine, research and diagnosis, and more specifically to new compounds that act as shuttles through the blood brain barrier (BBB) for the release of substances that cannot cross the BBB by themselves. It also refers to BBB shuttle-cargo constructions and their use as medications.
  • BBB blood brain barrier
  • brain treatment includes neurodegenerative diseases such as Parkinson's and Alzheimer's disease, but also
  • Central nervous system diseases such as schizophrenia, epilepsy and bipolar disorder.
  • brain cancer human immunodeficiency virus (HIV) and even certain aspects of obesity can be included as pharmacological targets located within the brain.
  • HIV human immunodeficiency virus
  • the BBB is a natural filter inside the body that only allows certain substances to pass from the blood to the brain. It is a natural defense mechanism designed to keep harmful substances out of the brain. It controls the composition of the extracellular fluid of the brain independent of fluctuations within the blood. It is also waterproof for many environmental compounds and medications.
  • the brain could serve as a hidden reservoir for HIV viral replication. HIV in the brain and in the cerebrospinal fluid could be particularly resistant to chemotherapy due to the failure of anti-retroviral drugs to penetrate the BBB.
  • the virus can cross the BBB during primary infection or at a late stage. The resulting infection leads to a number of central nervous system disorders such as AIDS-related dementia complex and HIV encephalopathy. Brain cancer can be counted among the most deadly and intractable diseases.
  • the treatment of brain cancer consists of surgery, radiotherapy using high-energy x-rays or other types of radiation and chemotherapy using anticancer or cytotoxic drugs.
  • anticancer drugs can reach cancer cells where they are in the body, but in the case of brain tumors, not all chemotherapeutic drugs are appropriate, because most chemotherapeutic drugs cannot cross the blood brain barrier (cf. D. Fort ⁇ n et al. ., "Enhanced chemotherapy delivery by intraarterial infusion and blood brain barrier disruption in malignant brain tumors", Cancer 2005, vol. 103, pp. 2606-15).
  • Schizophrenia affects almost 1% of the population. Although anti-psychotic medications are being used, there is a need to find new and better medications without the unwanted side effects of existing ones. In the search for these novel medicines, the BBB is the barrier that the medicine will need to cross to reach its target site.
  • Parkinson's disease is one of the biggest neurodegenerative disorders, affecting 3% of the population over 65 years old There is currently no preventive therapy for
  • Parkinson's disease Current treatment is to improve motor symptoms by supplementation of the dopamine deficient neurotransmitter. Since dopamine does not cross the BBB, a dopamine precursor, L-dopa, has been used since the 1960s in the treatment of Parkinson's disease. However, severe side effects are frequently observed after a few years of L-dopa therapy. L-dopa crosses the BBB using the amino acid transporter and once inside it is transformed to dopamine by the aromatic L-amino acid decarboxylase.
  • Some methods of administering medications to the brain for therapy or diagnosis are invasive techniques, such as administration
  • Another approach is administration by conjugation to a biological carrier.
  • These strategies use monoclonal antibodies (“Monoclonal anti-bodies", Mab) that bind to the transferrin receptor and undergo receptor-mediated endocytosis as molecular Trojan horses of compounds with therapeutic use that cannot cross the BBB by themselves.
  • Another approach comprises a strategy mediated by a peptide vector in which untranslated drugs bind peptides that have the ability to cross the BBB.
  • this conjugation even increased the solubility of the drug and bordered P-glycoprotein, consequently ruling out the need for solubilizers, which can cause side effects, and P-gp inhibitors, which limit the clinical application of drugs.
  • WO 2008/025867 describes several diketopiperazine compounds that act as vehicles for the delivery of pharmaceutical active ingredients through the BBB because they have the ability to passively diffuse drugs to the brain without the ability to pass the BBB. It also describes the shuttle constructs for the release of charges that transport drugs, for example, through the PAMPA membrane, an in vitro model of BBB. Finally, M. Malakoutikhah et al., In J. Med. Chem. 2008, vol. 51, pp.
  • GABA 4-aminobutanoic acid
  • Nip nipecotic acid
  • ALA 5-aminolevulinic acid
  • shuttle compounds which have the ability to cross the BBB and are capable of introducing into the brain drugs or other substances useful for diagnosis, to which it is made. reference as “charges”, which cannot cross the BBB by themselves.
  • the shuttle compounds are biodegradable and biocompatible, have no intrinsic toxicity or antigenicity, since they are made of amino acids.
  • the shuttles of the present invention show good water solubility. This property allows to improve the administered dose, since the amount of solution contained in the construction to be administered will be less.
  • a first aspect of the present invention relates to providing shuttle compounds of formula (I), or their pharmaceutically acceptable salts, including stereoisomers or mixtures of stereoisomers,
  • R- ⁇ , R 2 and R3 are independently selected from the group consisting of: H and (CH 2 ) q -R6;
  • R 4 is a C-radical derived from one of the known ring systems with 1-4 rings; the rings being saturated, partially unsaturated or aromatic; the rings being isolated or partially / fully fused and having 5-6 members; each member being independently selected from C, CH, CH 2 , N, NH, O and S; the hydrogen atoms of these members being optionally substituted by substituents selected from (Ci-C 6 ) -alkyl, (CrC 6 ) -alkoxy and halogen;
  • R 5 is H or CH 3 CO-;
  • R 6 is a C-radical derived from one of the known ring systems with 1-2 rings; the rings being saturated, partially unsaturated or aromatic; the rings being isolated or partially / fully fused and having 5-6 members; each member being independently selected from C, CH, CH 2 , N, NH, O and S; the hydrogen
  • the compounds of formula (I) or their salts may exist in solvated form, as well as in non-solvated forms, including hydrated forms. Thus, they may contain stoichiometric amounts of solvent in the case of solvates, or of water in the case of hydrates. It should be understood that this invention encompasses all solvated, as well as non-solvated forms. Obtaining solvates and hydrates depends on the solvent used and the crystallization conditions that can be determined by the person skilled in the art.
  • the compounds of formula (I) are those where n is an integer from 2 to 6, more preferably from 2 to 5, and even more preferably from 2 to 4.
  • the compounds of formula (I) are those where Y is -NH 2 , -OH or -NHR 7 . In another more preferred embodiment, the compounds of formula (I) are those where Y is -NH 2 .
  • the compounds of formula (I) are those where the ring members in R 6 , R 4 , or both R 6 and R 4 are selected from C, CH and CH 2 .
  • the compounds of formula (I) are those where R 6 is a C-radical derived from one of the ring systems
  • the compounds of formula (I) are those where Ri, R 2 and R 3 are independently selected from the group consisting of H, phenyl, cyclohexyl, and 2-naphthyl.
  • the compounds of formula (I) are those where Ri and R 2 are H, and R 3 is a radical (CH 2 ) q -R 6 .
  • the compounds of formula (I) are those where R 3 is phenyl, cyclohexyl or 2-naphthyl.
  • the compounds of formula (I) are those where R 3 is phenyl.
  • the compounds of formula (I) are those where R 4 is selected from the group consisting of phenyl, cyclohexyl and 2-naphthyl.
  • Preferred compounds of formula (I) of those mentioned above are those where R 4 is cyclohexyl or 2-naphthyl.
  • the compounds of formula (I) are selected from those mentioned above where m is 1. In another particular embodiment, the compounds of formula (I) are selected from among the
  • the compounds of formula (I) are those where k is 0 or 1.
  • the most preferred compounds of formula (I) are those that are selected from the following list: Ac-PhPro- (PhPro) 3 -CONH 2 ;
  • the compounds of formula (I) have the ability to transport substances to the brain, referred to as charges, which cannot pass through the BBB themselves.
  • Another aspect of the invention relates to the use of these compounds of formula (I) as BBB-shuttles.
  • the use of these compounds makes it possible, for example, that the investigation of new drugs is not limited only to compounds that can pass through the BBB themselves.
  • the compounds of formula (I) are better BBB shuttles than those closest to the prior art.
  • the mechanism of transport through the BBB of the compounds of formula (I) is by passive diffusion, and this mechanism is independent of the L or D configuration of the amino acids.
  • one of the main advantages of the compounds of formula (I) is that they can be prepared from L or D amino acids or even racemic mixtures. This increases the half-life of constructions in the body, preventing degradation by different peptidases in the blood or associated with brain microvessels.
  • the compounds of formula (I) have appropriate functional groups for the covalent union of charges maintaining the original activity of the charge, until it reaches the place of action.
  • another aspect of the present invention is to provide constructs of formula (II), or pharmaceutically acceptable salts thereof, including any stereoisomer or mixtures of
  • Ri, R 2 , R 3 , R 4 , X, Y, k, m, and n are as defined above; and Z is a radical derived from a substance capable of forming an amide bond or an ester bond or a disulfide bond with X, said substance being unable to cross the blood brain barrier (BBB) by itself.
  • BBB blood brain barrier
  • the substances from which the Z radical derives include a wide variety of substances that have pharmacological or diagnostic utility. These substances may be pharmaceutical active ingredients, in particular antiretroviral agents, anticancer agents, anti-psychotic agents, antineurodegenerative agents or antiepileptic agents. Examples of pharmaceutical active ingredients are nipecotic acid and dopamine. Dopamine is a Key neurotransmitter in the central nervous system, in particular, the decrease in striatal dopamine is associated with clinical conditions of parkinsonism. Nipecotic acid is one of the most potent GABA reuptake inhibitors and also a GABA receptor agonist. However, the BBB does not penetrate.
  • the substances from which Z is derived also include other substances that would be interesting to transport to the brain but that do not do so properly alone, for example contrast agents for nuclear magnetic resonance ("Magnetic Resonance Imaging", MRI).
  • MRI Magnetic Resonance Imaging
  • Contrast agents can be used as diagnostic methods for diseases of the central nervous system such as Alzheimer's disease, brain cancer, or as a tool for a pre-operative MRI scan that will guide the surgeon. In all these cases the contrast agent used needs to pass through the BBB.
  • contrast agents include magnetic nanoparticles such as iron oxide nanoparticles.
  • diagnostic agents include fluorescent dyes or probes such as carboxyfluorescein and derivatives, lucifer yellow, rhodamine or Texas red.
  • the shuttle compounds of formula (I) may be formed by natural and non-natural amino acids and / or their derivatives.
  • the compounds of formula (I) and the shuttle-cargo constructions of formula (II) can be generated totally or partially by chemical synthesis. Appropriate amino acids for the preparation of compounds of formula (I) are available
  • the compounds of formula (I) and the constructs of formula (II) can be easily prepared, for example, according to liquid phase synthesis or, preferably, solid phase peptide synthesis methods, of which general descriptions are widely available ( cf. eg M. Amblard, et al., "Methods and protocols of modern solid phase peptide synthesis. Molecular Biotechnoloqy 2006, vol. 33, pp. 239-254); or they can be prepared in solution by phase methods liquid or by any combination of solid phase, liquid and chemical phase in solution, for example, first completing the BBB-shuttle portion and then after removing any of the protecting groups if present, by introduction of the solution charge.
  • shuttle-cargo constructs of formula (II) together with appropriate amounts of pharmaceutically acceptable excipients or carriers will choose the appropriate route of administration by usual methods.
  • the speed and time of administration will depend on the nature and severity of what is being treated.
  • the precise nature of the carrier or other excipients will depend on the route of administration, which may be oral, nasal or by injection, eg cutaneous, subcutaneous or
  • terapéuticaally effective amount refers to the amount of a compound that, when administered, is sufficient to prevent the development of, or relieve to some degree, one or more of the symptoms of the disease a The one that goes.
  • the particular dose of compound administered according to this invention will of course be determined by the particular conditions surrounding the case, including the compound administered, the route of administration, the particular condition being treated, and similar considerations.
  • pharmaceutical composition refers to a mixture of a compound described herein with other chemical components, such as diluents or bearers The pharmaceutical composition facilitates the administration of the compound to an organism.
  • pharmaceutically acceptable excipients or carriers refer to pharmaceutically acceptable material, composition or vehicle. Each component must be pharmaceutically acceptable in the sense of being compatible with the other ingredients of the pharmaceutical composition. It must also be suitable for use in contact with tissues or organs of humans and animals without too much toxicity, irritation, allergic response, immunogenicity or other problems or complications in accordance with a reasonable benefit / risk ratio.
  • composition comprising a construction according to the present invention can be administered alone or in combination with others.
  • Another aspect of the present invention relates to the constructions of the present invention for use as a medicament.
  • Another aspect of the invention relates to the constructs of formula (II) where Z is a dopamine radical for use in the treatment of Parkinson's disease.
  • This aspect can also be formulated as the use of the constructions of formula (II) where Z is a dopamine radical for the preparation of a medicament for the treatment of Parkinson's disease. Therefore, this aspect is also related to a method of treatment and / or prophylaxis of a mammal, including a human, who suffers or is susceptible to Parkinson's disease, said method comprising the administration of a therapeutically effective amount of a compound of formula (II) with Z derived from dopamine, together with pharmaceutically acceptable excipients or carriers.
  • Another aspect of the invention relates to the constructions of formula (II) where Z is a radical of the nipecotic acid for use as an anticonvulsant.
  • Anticonvulsants are drugs used in the treatment of
  • This aspect can also be formulated as the use of the constructions of formula (II) where Z is a radical of the nipecotic acid for the preparation of a medicament for the treatment of seizures or diseases that cause seizures. Therefore, this aspect is also related to a method of treatment and / or prophylaxis of a mammal, including a human, who suffers or is susceptible to seizures, said method comprising administering to a patient a therapeutically effective amount of a compound of formula (II) with Z derived from nipecotic acid, together with pharmaceutically acceptable excipients or carriers.
  • the DCM was passed through a column of AI 2 O 3 .
  • the DMF was stored on a 4A molecular sieve and nitrogen was bubbled to remove volatile agents.
  • DIEA V-diisopropylethylannine
  • PVDF Millipore Polyvinylidine Difluoride
  • TBME tert-butyl methyl ether
  • NMP V-methyl pyrrolidone
  • the De Clercq test is performed by first washing a small sample of the resin (approx. 1 mg) with DMF (4x1 minutes) and DCM (4x1 minutes). Ten drops of reagent solution (0.002 M p-nitrophenyl ester of red dispersed 1 in MeCN) is added to the resin and the resulting mixture is heated at 70 ° C for 10 minutes. The solution is then decanted and the resin washed with DMF until a clear supernatant is obtained. The presence of secondary amines is indicated by red resin balls.
  • Protocols used during the synthesis of the constructs of formula (II) They were synthesized on a scale of 100 ⁇ using the following methods and protocols;
  • N-terminal amino acid acetylation In some cases, acetylation was performed in solid phase using a standard protocol of Ac 2 O (50 equiv) and DIEA (50 equiv) for 20 min.
  • the protected amino acid derivative of the second amino acid was coupled to the first amino acid already anchored to the resin using the following protocol:
  • the protected amino acid was sequentially added (Fmoc-PhPro-OH, 4 equiv., 400 ⁇ , 165 mg), PyBOP (4 equiv., 400 ⁇ , 208 mg) and HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) dissolved in DMF (1-3 ml / g resin) to the resin followed by DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 ⁇ _).
  • the mixture was allowed to react with intermittent manual stirring for 1.5 h.
  • the solvent was removed by suction, the resin was washed thoroughly and the coupling was repeated two more times.
  • the extension of the coupling was checked by the De Clercq test.
  • the Fmoc group was removed with 20% (v / v) piperidine in DMF using 2 treatments of 10 minutes each.
  • Two additional treatments with DBU, toluene, piperidine, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 x 5 min) were performed to ensure the removal of the Fmoc group from secondary amines.
  • the same protocol was used to couple the third amino acid derivative.
  • the protected amino acid 4 equiv., 400 ⁇ (Fmoc-PhPro-OH, 165 mg) (Fmoc-Cha-OH, 157 mg) or (Fmoc-) was added sequentially 2Nal-OH, 175 mg), PyBOP (4 equiv., 400 ⁇ , 208 mg) and HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) dissolved in DMF (1 -3 ml / g resin) to the resin followed by DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 ⁇ ). The mixture was allowed to react with intermittent manual stirring for 1.5 h. The solvent was removed by suction, the resin was washed thoroughly and the coupling was repeated two more times. The extension of the coupling was checked by the De test
  • the synthesis was performed on a 100 ⁇ scale.
  • the amino acid derivative of the first amino acid (Fmoc-PhPro-OH, 4 equiv., 400 ⁇ , 165 mg), PyBOP (4 equiv., Was sequentially added 400 ⁇ , 208 mg) and HOAt (12 equiv., 1, 2 mmols, 163 mg) dissolved in DMF (1 - 3 ml / g resin) to the resin followed by DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 ⁇ ). The mixture was allowed to react with intermittent manual stirring for 1.5 h. The solvent was removed by suction, the resin was washed thoroughly.
  • the extent of the coupling was checked by the ninhydrin colorimetric assay.
  • the Fmoc group was removed with 20% (v / v) piperidine in DMF using 2 treatments of 10 minutes each.
  • Two additional treatments with DBU, toluene, piperidine, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 x 5 min) were performed to ensure the removal of the Fmoc group from secondary amines.
  • the protected amino acid derivative of the second amino acid was coupled to the first amino acid already anchored to the resin using the following protocol:
  • the protected amino acid was sequentially added (Fmoc-PhPro-OH, 4 equiv., 400 ⁇ , 165 mg), PyBOP (4 equiv., 400 ⁇ , 208 mg) and HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) dissolved in DMF (1-3 ml / g resin) to the resin followed by DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 ⁇ _).
  • the mixture was allowed to react with intermittent manual stirring for 1.5 h.
  • the solvent was removed by suction, the resin was washed thoroughly and the coupling was repeated two more times.
  • the extension of the coupling was checked by the De test
  • Fmocq The Fmoc group was removed with 20% (v / v) piperidine in DMF using 2 treatments of 10 minutes each. Two additional treatments were performed with DBU, toluene, piperidine, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2.5 min) to ensure the removal of the Fmoc group from secondary amines. The same protocol was used to couple the third amino acid derivative.
  • the cleavage stage was performed by treating the resin with 2% TFA in DCM (6 x 3 min). The filtrate was collected and the DCM evaporated under N 2 . The residue was dissolved in H 2 O: MeCN (1: 1) and lyophilized.
  • the synthesis was performed on a 100 ⁇ scale.
  • the amino acid derivative of the first amino acid (Fmoc-PhPro-OH, 4 equiv., 400 ⁇ , 165 mg), PyBOP (4 equiv., Was sequentially added 400 ⁇ , 208 mg) and HOAt (12 equiv., 1, 2 mmols, 163 mg) dissolved in DMF (1 -3 ml / g resin) to the resin followed by DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 ⁇ ). The mixture was allowed to react with intermittent manual stirring for 1.5 h. The solvent was removed by suction, the resin was washed thoroughly.
  • the extent of the coupling was checked by the ninhydrin colorimetric assay.
  • the Fmoc group was removed with 20% (v / v) piperidine in DMF using 2 treatments of 10 minutes each. Two additional treatments were performed with DBU, toluene, piperidine, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2.5 min) to ensure the removal of the Fmoc group from secondary amines.
  • the protected amino acid derivative of the second amino acid was coupled to the first amino acid already anchored to the resin using the following protocol:
  • the protected amino acid was sequentially added (Fmoc-PhPro-OH, 4 equiv., 400 ⁇ , 165 mg), PyBOP (4 equiv., 400 ⁇ , 208 mg) and HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) dissolved in DMF (1-3 ml / g resin) to the resin followed by DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 ⁇ ).
  • the mixture was allowed to react with intermittent manual stirring for 1.5 h.
  • the solvent was then removed by suction, the resin washed thoroughly and the coupling was repeated two more times.
  • the extension of the coupling was checked by the De Clercq test.
  • the Fmoc group was removed with 20% (v / v) piperidine in DMF using 2 treatments of 10 minutes each.
  • Two additional treatments with DBU, toluene, piperidine, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 x 5 min) were performed to ensure the removal of the Fmoc group from secondary amines.
  • the same protocol was used to couple the third amino acid derivative.
  • the cleavage stage was performed by treating the resin with 2% TFA in DCM (6 x 3 min). The filtrate was collected and the DCM evaporated under N 2 . The residue was dissolved in H 2 O: MeCN (1: 1) and lyophilized.
  • the synthesis was performed on a 100 ⁇ scale.
  • the amino acid derivative of the first amino acid (Fmoc-PhPro-OH, 4 equiv., 400 ⁇ , 165 mg), PyBOP (4 equiv., Was sequentially added 400 ⁇ , 208 mg) and HOAt (12 equiv., 1, 2 mmols, 163 mg) dissolved in DMF (1 - 3 ml / g resin) to the resin followed by DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 ⁇ _). The mixture was allowed to react with intermittent manual stirring for 1.5 h.
  • the solvent was removed by suction, the resin was washed thoroughly. The extent of the coupling was checked by the ninhydrin colorimetric assay.
  • the Fmoc group was removed with 20% (v / v) piperidine in DMF using 2 treatments of 10 minutes each. Two additional treatments with DBU, toluene, piperidine, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 x 5 min) were performed to ensure the removal of the Fmoc group from secondary amines.
  • the protected amino acid derivative of the second amino acid was coupled to the first amino acid already anchored to the resin using the following protocol:
  • the protected amino acid was sequentially added (Fmoc-PhPro-OH, 4 equiv., 400 ⁇ , 165 mg), PyBOP (4 equiv., 400 ⁇ , 208 mg) and HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) dissolved in DMF (1-3 ml / g resin) to the resin followed by DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 ⁇ ).
  • the mixture was allowed to react with intermittent manual stirring for 1.5 h.
  • the solvent was removed by suction, the resin was washed thoroughly and the coupling was repeated two more times.
  • the extension of the coupling was checked by the De Clercq test.
  • the Fmoc group was removed with 20% (v / v) piperidine in DMF using 2 treatments of 10 minutes each.
  • Two additional treatments were performed with DBU, toluene, piperidine, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2.5 min) to ensure the removal of the Fmoc group from secondary amines.
  • the same protocol was used to couple the third and fourth amino acid derivative.
  • Example 5 Preparation of the compound of formula (II) with Z derived from Levodopa: L-Dopa-PhPro- (PhPro) 3 -CONH ? (lid) The synthesis was performed on a 100 ⁇ scale.
  • the following protocol was used: The amino acid derivative of the first amino acid (Fmoc-PhPro-OH, 4 equiv., 400 ⁇ , 165 mg), PyBOP (4 equiv., Was sequentially added 400 ⁇ , 208 mg) and HOAt (12 equiv., 1, 2 mmols, 163 mg) dissolved in DMF (1 -3 ml / g resin) to the resin followed by DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 ⁇ ). The mixture was allowed to react with intermittent manual stirring for 1.5 h. The solvent was removed by suction, the resin was washed thoroughly.
  • the extension was checked by the ninhydrin colorimetric assay.
  • the Fmoc group was removed with 20% (v / v) piperidine in DMF using 2 treatments of 10 minutes each. Two additional treatments were performed with DBU, toluene, piperidine, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2.5 min) to ensure the removal of the Fmoc group from secondary amines.
  • the protected amino acid derivative of the second amino acid was coupled to the first amino acid already anchored to the resin using the following protocol:
  • the protected amino acid was sequentially added (Fmoc-PhPro-OH, 4 equiv., 400 ⁇ , 165 mg), PyBOP (4 equiv., 400 ⁇ , 208 mg) and HOAt (1 2 equiv., 1 .2 mmols, 1 63 mg) dissolved in DMF (1 -3 ml / g resin) to the resin followed by DIEA (1 2 equiv., 1 .2 mmols, 204 ⁇ _).
  • the mixture was allowed to react with intermittent manual stirring for 1.5 h.
  • the solvent was then removed by suction, the resin washed thoroughly and the coupling repeated two more times.
  • the extension of the coupling was checked by the De Clercq test.
  • the Fmoc group was removed with 20% (v / v) piperidine in DMF using 2 treatments of 10 minutes each.
  • Two additional treatments with DBU, toluene, piperidine, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 x 5 min) were performed to ensure the removal of the Fmoc group from secondary amines.
  • the same protocol was used to couple the third and fourth amino acid derivative.
  • the cleavage stage was performed by treating the resin with 2% TFA in DCM (6 x 3 min). The filtrate was collected and the DCM evaporated under N 2 . The residue was dissolved in H 2 O: MeCN (1: 1) and lyophilized.
  • Product characterization Reverse phase HPLC: linear gradient from 30 to 60% MeCN in 8 minutes using a Sunfire Ci 8 column (100 x 4.6 mm x 3.5 ⁇ , 100 ⁇ , Waters), L-Dopa-PhPro- (PhPro) 3 -CONH 2 tr: 3.5-6.9 min (diastereomers).
  • the synthesis was performed on a 100 ⁇ scale.
  • the amino acid derivative of the first amino acid (Fmoc-PhPro-OH, 4 equiv., 400 ⁇ , 165 mg), PyBOP (4 equiv., Was sequentially added 400 ⁇ , 208 mg) and HOAt (12 equiv., 1, 2 mmols, 163 mg) dissolved in DMF (1 - 3 ml / g resin) to the resin followed by DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 ⁇ _). The mixture was allowed to react with intermittent manual stirring for 1.5 h.
  • the solvent was removed by suction, the resin was washed thoroughly. The extent of the coupling was checked by the ninhydrin colorimetric assay.
  • the Fmoc group was removed with 20% (v / v) piperidine in DMF using 2 treatments of 10 minutes each. Two additional treatments with DBU, toluene, piperidine, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 x 5 min) were performed to ensure the removal of the Fmoc group from secondary amines.
  • the protected amino acid derivative of the second amino acid was coupled to the first amino acid already anchored to the resin using the following protocol:
  • the protected amino acid was sequentially added (Fmoc-PhPro-OH, 4 equiv., 400 ⁇ , 165 mg), PyBOP (4 equiv., 400 ⁇ , 208 mg) and HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) dissolved in DMF (1-3 ml / g resin) to the resin followed by DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 ⁇ ).
  • the mixture was allowed to react with intermittent manual stirring for 1.5 h.
  • the solvent was removed by suction, the resin was washed thoroughly and the coupling was repeated two more times.
  • the extension of the coupling was checked by the De Clercq test.
  • the Fmoc group was removed with 20% (v / v) piperidine in DMF using 2 treatments of 10 minutes each.
  • Two additional treatments were carried out with DBU, toluene, piperidine, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 5 min) to ensure the removal of the Fmoc group from secondary amines.
  • the same protocol was used to couple the third amino acid derivative.
  • the cleavage stage was performed by treating the resin with 2% TFA in DCM (6 x 3 min). The filtrate was collected and the DCM evaporated under N 2 . The residue was dissolved in H 2 O: MeCN (1: 1) and lyophilized.
  • the synthesis was performed on a 100 ⁇ scale.
  • the amino acid derivative of the first amino acid (Fmoc-PhPro-OH, 4 equiv., 400 ⁇ , 165 mg), PyBOP (4 equiv., Was sequentially added 400 ⁇ , 208 mg) and HOAt (12 equiv., 1, 2 mmols, 163 mg) dissolved in DMF (1 -3 ml / g resin) to the resin followed by DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 ⁇ _). The mixture was allowed to react with intermittent manual stirring for 1.5 h. The solvent was removed by suction, the resin was washed thoroughly.
  • the extent of the coupling was checked by the ninhydrin colorimetric assay.
  • the Fmoc group was removed with 20% (v / v) piperidine in DMF using 2 treatments of 10 minutes each. Two additional treatments were performed with DBU, toluene, piperidine, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2.5 min) to ensure the removal of the Fmoc group from secondary amines.
  • the protected amino acid derivative of the second amino acid was coupled to the first amino acid already anchored to the resin using the following protocol:
  • the protected amino acid was sequentially added (Fmoc-PhPro-OH, 4 equiv., 400 ⁇ , 165 mg), PyBOP (4 equiv., 400 ⁇ , 208 mg) and HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) dissolved in DMF (1-3 ml / g resin) to the resin followed by DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 ⁇ ).
  • the mixture was allowed to react with intermittent manual stirring for 1.5 h.
  • the solvent was then removed by suction, the resin washed thoroughly and the coupling repeated two more times.
  • the extension of the coupling was checked by the De Clercq test.
  • the Fmoc group was removed with 20% (v / v) piperidine in DMF using 2 treatments of 10 minutes each.
  • Two additional treatments with DBU, toluene, piperidine, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 x 5 min) were performed to ensure the removal of the Fmoc group from secondary amines.
  • the same protocol was used to couple the third amino acid derivative.
  • the mixture was allowed to react with intermittent manual stirring for 2 h.
  • the cleavage stage was performed by treating the resin with 2% TFA in DCM (6 x 3 min). The filtrate was collected and the DCM evaporated under N 2 . The residue was dissolved in H 2 O: MeCN (1: 1) and lyophilized.
  • the synthesis was performed on a 100 ⁇ scale.
  • the following protocol was used for coupling the first amino acid to the Sieber resin:
  • the amino acid derivative of the first amino acid (Fmoc-N-MePhe-OH, 4 equiv., 400 ⁇ , 161 mg), PyBOP (4 equiv. ., 400 ⁇ , 208 mg) and HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) dissolved in DMF (1 -3 ml / g resin) to the resin followed by DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols , 204 ⁇ ).
  • the mixture was allowed to react with intermittent manual agitation for 1.5 h.
  • the solvent was removed by suction, the resin was washed thoroughly. The extent of the coupling was checked by the ninhydrin colorimetric assay.
  • the Fmoc group was removed with 20% (v / v) piperidine in DMF using 2 treatments of 10 minutes each. Two additional treatments were performed with DBU, toluene, piperidine, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2.5 min) to ensure the removal of the Fmoc group from secondary amines.
  • the protected amino acid derivative of the second amino acid was coupled to the first amino acid already anchored to the resin using the following protocol:
  • the protected amino acid (Fmoc-N-MePhe-OH, 4 equiv., 400 ⁇ , 161 mg), PyBOP was added sequentially (4 equiv., 400 ⁇ , 208 mg) and HOAt (12 equiv., 1.2 mmols, 163 mg) dissolved in DMF (1-3 ml / g resin) to the resin followed by DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 ⁇ _). The mixture was allowed to react with intermittent manual stirring for 1.5 h. The solvent was removed by suction, the resin was washed thoroughly and the coupling was repeated two more times.
  • the extension of the coupling was checked by the De Clercq test.
  • the Fmoc group was removed with 20% (v / v) piperidine in DMF using 2 treatments of 10 minutes each.
  • Two additional treatments were performed with DBU, toluene, piperidine, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2.5 min) to ensure the removal of the Fmoc group from secondary amines.
  • the same protocol was used to couple the third and fourth amino acid derivative. Acetylation was performed in solid phase using a standard protocol of
  • the synthesis was performed on a 1,00 ⁇ scale.
  • the amino acid derivative of the first amino acid (Fmoc-Pro-OH, 4 equiv., 400 ⁇ , 1 35 mg), PyBOP (4 equiv. , 400 ⁇ , 208 mg) and HOAt (1 2 equiv., 1 .2 mmols, 1 63 mg) dissolved in DMF (1 -3 ml / g resin) to the resin followed by DIEA (1 2 equiv., 1. 2 mmols, 204 ⁇ _). The mixture was allowed to react with intermittent manual stirring for 1.5 h. The solvent was removed by suction, the resin was washed thoroughly.
  • the extent of the coupling was checked by the ninhydrin colorimetric assay.
  • the Fmoc group was removed with 20% (v / v) piperidine in DMF using 2 treatments of 10 minutes each. Two additional treatments were performed with DBU, toluene, piperidine, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2.5 min) to ensure the removal of the Fmoc group from secondary amines.
  • the protected amino acid derivative of the second amino acid was coupled to the first amino acid already anchored to the resin using the following protocol:
  • the protected amino acid (Fmoc-Pro-OH, 4 equiv., 400 ⁇ , 135 mg), PyBOP (4 were sequentially added equiv., 400 ⁇ , 208 mg) and HOAt (1 2 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) dissolved in DMF (1 -3 ml / g resin) to the resin followed by DIEA (1 2 equiv., 1 .2 mmols, 204 ⁇ ).
  • the mixture was allowed to react with intermittent manual stirring for 1.5 h.
  • the solvent was removed by suction, the resin was washed thoroughly and the coupling was repeated two more times.
  • the extent of the coupling was checked by the De Clercq test.
  • the Fmoc group was removed with 20% (v / v) piperidine in DMF using 2 treatments of 10 minutes each. Two additional treatments were performed with DBU, toluene, piperidine, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2.5 min) to ensure the removal of the Fmoc group from secondary amines.
  • Acetylation was performed in solid phase using a standard protocol of Ac 2 O (50 equiv., 5 mmols, 471 ⁇ ) and DIEA (50 equiv., 5 mmols, 850 ⁇ ) for 20 min.
  • the cleavage stage was performed by treating the resin with 2% TFA in DCM (6 x 3 min). The filtrate was collected and the DCM evaporated. under N 2 . The residue was dissolved in H 2 O: MeCN (1: 1) and lyophilized. To remove salts, a desalting step was performed using the DOWEX MR-3 Mixed Bed resin overnight.
  • the synthesis was performed on a 100 ⁇ scale.
  • the following protocol was used for coupling the first amino acid to the sieber resin:
  • the amino acid derivative of the first amino acid (Fmoc-N-MePhe-OH, 4 equiv., 400 ⁇ , 161 mg), PyBOP (4 equiv. ., 400 ⁇ , 208 mg) and HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) dissolved in DMF (1 - 3 ml / g resin) to the resin followed by DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols , 204 ⁇ _).
  • the mixture was allowed to react with intermittent manual stirring for 1.5 h.
  • the solvent was removed by suction, the resin was washed thoroughly. The extent of the coupling was checked by the ninhydrin colorimetric assay.
  • the Fmoc group was removed with 20% (v / v) piperidine in DMF using 2 treatments of 10 minutes each. Two additional treatments were carried out with DBU, toluene, piperidine, DMF (5%, 5%, 20%,
  • the protected amino acid derivative of the second amino acid was coupled to the first amino acid already anchored to the resin using the following protocol: the protected amino acid (Fmoc-N-MePhe-OH, 4 equiv., 400 ⁇ , 161 mg), PyBOP was added sequentially (4 equiv., 400 ⁇ , 208 mg) and HOAt (12 equiv., 1.2 mmols, 163 mg) dissolved in DMF (1-3 ml / g resin) to the resin followed by DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 ⁇ ). The mixture was allowed to react with intermittent manual stirring for 1.5 h. The solvent was removed by suction, the resin was washed thoroughly and the coupling was repeated two more times.
  • the protected amino acid Fmoc-N-MePhe-OH, 4 equiv., 400 ⁇ , 161 mg
  • PyBOP was added sequentially (4 equiv., 400 ⁇ , 208 mg) and HOAt (12
  • the extension of the coupling was checked by the De test Clercq.
  • the Fmoc group was removed with 20% (v / v) piperidine in DMF using 2 treatments of 10 minutes each. Two additional treatments were performed with DBU, toluene, piperidine, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2.5 min) to ensure the removal of the Fmoc group from secondary amines.
  • the same protocol was used to couple the third amino acid derivative.
  • Acetylation was performed in solid phase using a standard protocol of Ac 2 O (50 equiv., 5 mmols, 471 ⁇ ) and DIEA (50 equiv., 5 mmols, 850 ⁇ ) for 20 min.
  • the cleavage stage was performed by treating the resin with 2% TFA in DCM (6 x 3 min). The filtrate was collected and the DCM evaporated under N 2 . The residue was dissolved in H 2 O: MeCN (1: 1) and lyophilized. To remove salts, a desalting step was performed using the DOWEX MR-3 Mixed Bed resin overnight.
  • the synthesis was performed on a 100 ⁇ scale.
  • the amino acid derivative of the first amino acid (Fmoc-N-MePhe-OH, 4 equiv., 400 ⁇ , 161 mg), PyBOP (4 equiv. ., 400 ⁇ , 208 mg) and HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) dissolved in DMF (1 - 3 ml / g resin) to the resin followed by DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols , 204 ⁇ _). The mixture was allowed to react with intermittent manual stirring for 1.5 h.
  • the solvent was removed by suction, the resin was washed thoroughly. The extent of the coupling was checked by the ninhydrin colorimetric assay.
  • the Fmoc group was eliminated with 20% (v / v) piperidine in DMF using 2 treatments of 10 minutes each. Two additional treatments with DBU, toluene, piperidine, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 x 5 min) were performed to ensure the removal of the Fmoc group from secondary amines.
  • the protected amino acid derivative of the second amino acid was coupled to the first amino acid already anchored to the resin using the following protocol:
  • the protected amino acid (Fmoc-N-MePhe-OH, 4 equiv., 400 ⁇ , 161 mg), PyBOP was added sequentially (4 equiv., 400 ⁇ , 208 mg) and HOAt
  • Fmocq The Fmoc group was removed with 20% (v / v) piperidine in DMF using 2 treatments of 10 minutes each. Two additional treatments were performed with DBU, toluene, piperidine, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2.5 min) to ensure the removal of the Fmoc group from secondary amines. The same protocol was used to couple the third amino acid derivative.
  • the solvent was removed by suction, the resin was washed thoroughly and the coupling was repeated two more times.
  • the extension of the coupling was checked by the De Clercq test.
  • the Fmoc group was removed with 20% (v / v) piperidine in DMF using 2 treatments of 10 minutes each.
  • two additional treatments were performed with DBU, toluene, piperidine, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 x 5 min) to ensure the removal of the Fmoc group from the amines high schools.
  • the cleavage stage was performed by treating the resin with 2% TFA in DCM (6 x 3 min). The filtrate was collected and the DCM evaporated under N 2 . The residue was dissolved in H 2 O: MeCN (1: 1) and lyophilized.
  • Comparative Example 4a L-Dopa-N-MePhe- (N-MePhe) 3 - CONH 2 5.4%; Comparative Example 4b: L-Dopa-Cha- (N-MePhe) 3 -CONH 2 10.6%; Comparative Example 4c: L-Dopa-2Nal- (N-MePhe) 3 -CONH 2 26%.
  • the protected amino acid derivative of the second amino acid was coupled to the first amino acid already anchored to the resin using the following protocol:
  • the protected amino acid (Fmoc-N-MePhe-OH, 4 equiv., 400 ⁇ , 161 mg), PyBOP was added sequentially (4 equiv., 400 ⁇ , 208 mg) and HOAt (12 equiv., 1.2 mmols, 163 mg) dissolved in DMF (1 - 3 ml / g resin resin followed by DIEA (12 equiv., 1. 2 mmols, 204 ⁇ ) The mixture was allowed to react with intermittent manual stirring for 1.5 h.The solvent was removed by suction, the resin was washed thoroughly and the coupling was repeated two more times.
  • the Fmoc group was removed with 20% (v / v) piperidine in DMF using 2 treatments of 10 minutes each. Two additional treatments were performed with DBU, toluene, piperidine, DMF (5%, 5 %, 20%, 70%) (2 5 min) to ensure the removal of the Fmoc group from secondary amines.
  • the protocol was used to couple the third amino acid derivative.
  • the cleavage stage was performed by treating the resin with 2% TFA in DCM (6 x 3 min). The filtrate was collected and the DCM evaporated under N 2 . The residue was dissolved in H 2 O: MeCN (1: 1) and lyophilized.
  • Comparative 5b Nip-Cha- (N-MePhe) 3 -CONH 2 91%; Comparative Example 5c: Nip-2Nal- (N-MePhe) 3 -CONH 2 75%.
  • Example 8 Evaluation of BBB transport using the parallel artificial membrane permeability test (PAMPA)
  • the evaluation method chosen to prove that the compounds of formula (I) of the invention are BBB-shuttles capable of crossing passive diffusion charges is the parallel artificial membrane permeability test (PAMPA), which allows predicting or evaluating only this transport mechanism
  • PAMPA parallel artificial membrane permeability test
  • the PAMPA method originally introduced by Kansy in Roche uses an artificial membrane in the form of phospholipid bilayers supported on a filter (cf. M. Kansy et al., "Physicochemical high throughput screening: Parallel artificial membrane permeability assay in the description of the absorption processes "J. Med. Chem. 1998, vol. 41, pp. 1007-1010).
  • the phospholipid membrane mimics the cell membrane, but does not have the means for active or paracellular transport of drug molecules. It is a very practical tool to evaluate the transport of compounds by passive diffusion. This technique allows the evaluation of pure, raw compounds and even mixtures of compounds.
  • the PAMPA test is used to determine the capacity of the
  • the effective permeability of the compounds was measured in triplicate at an initial concentration of 200 ⁇ .
  • the buffer solution was prepared from the concentrate sold by plON following its indications. The pH was adjusted to 7.4 using a 0.5M NaOH solution. The compound of interest was dissolved in buffer solution and 2-propanol (20% cosolvent) at
  • the PAMPA sandwich was separated and the donor well was filled with 200 ⁇ of the solution of the compound to be studied.
  • the acceptor plate was placed on the donor plate making sure that the bottom of the membrane was in contact with the buffer.
  • 4 ⁇ of phospholipid mixture (20 mg / mL) in dodecane was added to each well and 160 ⁇ of the buffer solution and 40 ⁇ L of 1-propanol were added to each acceptor well.
  • the plate was covered and incubated at room temperature in a humid atmosphere saturated for 4 hours under orbital agitation of 100 rpm.
  • composition phosphatidylcholine (PC) 12.6%, phosphatidylethanolamine (PE) 33.1%, phosphatidylserine (PS) 18.5%, phosphatidylinositol (Pl) 4.1%, phosphatidic acid 0.8% and 30.9% of other compounds.
  • Effective permeability was calculated using the following equation:
  • the different compounds were evaluated by PAMPA assay.
  • the PAMPA assay only measures passive diffusion transport, thus the positive transport measured for these compounds indicates that these compounds have a positive transport through the BBB in vivo by passive diffusion.
  • Tables 2, 3 and 4 it can be seen how the use of the BBB shuttle-cargo construction allows charges that do not cross by themselves, such as nipecotic acid and dopamine, can now cross the membrane by passive diffusion.

Abstract

Compuestos de fórmula (I), donde, R1, R2 y R3 son independientemente seleccionados entre: H y un (CH2)q-R6, R4 es un C-radical derivado de uno de los sistemas de anillo conocidos con 1 -4 anillos; R5 es H o CH3CO-; R6 es un C-radical derivado de uno de los sistemas de anillo conocidos con 1 -2 anillos; X se selecciona entre -NH-(CH2)r-CO-, -CO(CH2)rCO-, -S-(CH2)r-, -S-(CH2).CO-, -O-(CH2)r- y -O-(CH2)r-CO-; Y es -NH2, -OH, -OR7 o -NHR7; k es un entero de 0 a 1; m es un entero de 0 a 1; n es un entero de 2 a 10; q es un entero de 0 a 1; r es un entero de 1 a 3; R7 es un radical (C1-C6)-alquilo; con la condición de que al menos un radical R seleccionado entre R1, R2 y R3 es (CH2)q-R6 y con la condición de que cuando X es -CO(CH2)rCO-, R5 es H, son útiles como lanzaderas a través de la barrera hematoencefálica (BBB). Las construcciones BBB-lanzadera-cargo, son útiles como medicamentos.

Description

Compuestos útiles como lanzaderas a través de la barrera hematoencefálica y construcciones lanzadera-cargo
Esta invención se refiere a los campos de la medicina, investigación y diagnóstico, y más específicamente a compuestos nuevos que actúan como lanzaderas a través de la barrera hematoencefálica ("blood brain barrier", BBB) para la liberación de sustancias que no pueden atravesar la BBB por sí mismas. También se refiere a construcciones BBB lanzadera-cargo y a su uso como medicamentos.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Muchos de los mayores problemas terapéuticos actuales requieren el tratamiento del cerebro. Esto incluye enfermedades neurodegenerativas como el Parkinson y la enfermedad de Alzheimer, pero también
enfermedades del sistema nervioso central como la esquizofrenia, la epilepsia y el desorden bipolar. También el cáncer cerebral, el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) y hasta ciertos aspectos de la obesidad pueden ser incluidas como dianas farmacológicas localizadas dentro del cerebro. En muchos casos hay compuestos prometedores para su
tratamiento, pero debido a sus problemas de transporte en la BBB más del 98% de estos medicamentos potenciales no llegan a la etapa de desarrollo.
La BBB es un filtro natural dentro del cuerpo que sólo permite que ciertas substancias pasen de la sangre al cerebro. Es un mecanismo de defensa natural diseñado para mantener las substancias nocivas fuera del cerebro. Controla la composición del fluido extracelular del cerebro independiente de las fluctuaciones dentro de la sangre. Es también impermeable para muchos compuestos ambientales y medicamentos.
La base anatómica de la BBB es primeramente las uniones herméticas en las células endoteliales de los microvasos cerebrales. Los microvasos cerebrales forman una membrana continua sin fenestraciones y las uniones herméticas entre ellas son responsables de la alta resistencia eléctrica transendotelial. Transportadores específicos median el acceso de ciertas moléculas importantes para el cerebro, como la glucosa, aminoácidos aislados e iones. Otros compuestos o medicamentos son dependientes de la difusión a través de las bicapas lipídicas de las membranas endoteliales lo que requiere un cierto grado de lipofilicidad de estos compuestos.
Hay diferentes campos terapéuticos donde hay la necesidad de encontrar nuevos medicamentos que puedan cruzar la BBB para llegar a su sitio diana. Por ejemplo, el cerebro podría servir de reservorio oculto para la replicación viral del HIV. El HIV en el cerebro y en el líquido cerebro-espinal podría ser particularmente resistente a la quimioterapia debido al fracaso de los medicamentos anti-retrovirales a penetrar la BBB. El virus puede cruzar la BBB durante la infección primaria o en un estadio tardío. La infección resultante lleva a un número de desórdenes del sistema nervioso central como el complejo de demencia relacionado con el SIDA y la encefalopatía por VIH. El cáncer cerebral puede ser contado entre las enfermedades más mortales e intratables. En la actualidad el tratamiento del cáncer cerebral consiste en cirugía, radioterapia utilizando rayos X de alta energía u otros tipos de radiación y quimioterapia utilizando medicamentos anticancerígenos o citotóxicos. Estos medicamentos anticancerígenos pueden alcanzar las células cancerígenas donde estén en el cuerpo, pero en el caso de los tumores cerebrales no todos los medicamentos quimioterapéuticos son apropiados, porque la mayoría de medicamentos quimioterapéuticos no pueden cruzar la barrera hematoencefálica (cf. D. Fortín et al., "Enhanced chemotherapy delivery by intraarterial infusión and blood brain barrier disruption in malignant brain tumors", Cáncer 2005, vol. 103, pp. 2606-15).
Otro campo de interés son las enfermedades psiquiátricas, como la esquizofrenia. La esquizofrenia afecta a casi un 1 % de la población. Aunque medicamentos anti-psicóticos se están utilizando, hay la necesidad de encontrar nuevos y mejores medicamentos sin los efectos secundarios no deseados de los existentes. En la búsqueda de estos medicamentos novedosos la BBB es la barrera que el medicamento necesitará cruzar para llegar a su sitio diana.
Otro campo de interés son las enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Parkinson. La enfermedad de Parkinson es uno de los mayores desórdenes neurodegenerativos, afectando a un 3% de la población mayor de 65 años. Actualmente no hay terapia preventiva para la
enfermedad de Parkinson. El tratamiento actual consiste en mejorar los síntomas motores por suplementación del neurotransmisor deficiente dopamina. Como la dopamina no cruza la BBB, desde los años 60 se ha utilizado un precursor de la dopamina, la L-dopa, en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. Sin embargo, frecuentemente se observan efectos secundarios severos al cabo de unos pocos años de terapia con L-dopa. La L-dopa cruza la BBB utilizando el transportador de aminoácidos y una vez dentro es transformada a dopamina por la descarboxilasa de L-aminoácidos aromáticos.
Por último, otro campo de interés es la epilepsia, un síndrome de
disfunciones episódicas del cerebro que afecta a casi un 1 % de la población general. Alrededor de un 30% de las epilepsias se clasifican como
sintomáticas ya que son asociadas a una lesión identificable del sistema nervioso central, mientras que el resto de ellas no tienen causas
identificadas. La terapia médica actual para la epilepsia es en gran parte sintomática y esta dirigida a controlar los ataques en individuos afectados. Si los medicamentos antiepilépticos fallan, la lobectomía temporal, una operación que implica extirpar la región del cerebro donde se originan los ataques, proporciona un tratamiento alternativo. Esta operación es muy exitosa en la mayoría de los casos, pero falla en algunos, y además muchos individuos son reacios a someterse a cirugía que implique extirpar partes del cerebro.
En todos estos casos, se conocen muchos compuestos prometedores para su tratamiento, aunque, debido a sus problemas de transporte en la BBB, no se desarrollan más. La investigación en estos campos ha seguido varias aproximaciones.
Algunos métodos de administración de medicamentos al cerebro sea para terapia o diagnosis son técnicas invasivas, como la administración
intracraneal, la administración por alteración de la integridad de la BBB o la disrupción osmótica. Estos métodos implican riesgo de infección y toxicidad, y además requieren un personal cualificado. Otra aproximación es la modificación del medicamento. Estas modificaciones incluyen por ejemplo la reducción del tamaño del medicamento o el incremento de la lipofilicidad del medicamento, pero no es siempre posible introducir estas modificaciones. En el caso de introducir una modificación irreversible es necesario que no altere la actividad del medicamento una vez llegue al sitio diana. En el caso de una modificación bioreversible, es necesario encontrar un enzima o proceso químico que recupere el medicamento activo una vez el profármaco está dentro del sistema nervioso central.
Otra aproximación es la administración por conjugación a un portador biológico. Estas estrategias usan anticuerpos monoclonales ("Monoclonal anti-bodies", Mab) que se unen al receptor de transferrina y sufren una endocitosis mediada por receptor a modo de caballos de Troya moleculares de los compuestos con un uso terapéutico que no pueden cruzar la BBB por sí mismos.
Finalmente, otra aproximación comprende una estrategia mediada por un vector peptídico en la que fármacos no transportados se unen a péptidos que tienen la capacidad de cruzar la BBB. C. Rousselle et al., en J. Pharmacol. Exp. Ther. 2005 vol. 313, pp. 712-719, revelan su uso para mejorar la absorción al cerebro de varios fármacos, como la doxorubicina, penicilina, dalargin análogo de encefalina, paclitaxel y morfina-6-glucurónido. En algunos casos, esta conjugación incluso aumentó la solubilidad del fármaco y bordeó la P-glicoproteina, en consecuencia descartando la necesidad de solubilizantes, que pueden causar efectos secundarios, e inhibidores de P- gp, que limitan la aplicación clínica de fármacos.
WO 2008/025867 describe varios compuestos dicetopiperazinas que actúan como vehículos para la entrega de principios activos farmacéuticos a través de la BBB debido a que tienen la capacidad de llevar al cerebro por difusión pasiva fármacos sin la capacidad de pasar la BBB. También describe las construcciones lanzadera para liberación de cargos que transportan por ejemplo fármacos a través de la membrana PAMPA, un modelo in vitro de BBB. Finalmente, M. Malakoutikhah et al., en J. Med. Chem. 2008, vol. 51 , pp. 4881 -4889, describe el uso de tres péptidos ricos en /V-MePhe, A/-MePhe-(/V- MePhe)3-CONH2, Cha-(A/-MePhe)3-CONH2 y 2Nal-(A/-MePhe)3-CONH2 como porteadores que pasan a través de un modelo de barrera hematoencefálica por difusión pasiva. Además, M. Malakoutikhah et al., en J. Med. Chem.
2010, vol. 53, pp. 2354-2363, describe el uso de los péptidos anteriores para transportar a través de la barrera PAMPA una serie de fármacos no relacionados estructuralmente como el ácido 4-aminobutanoico (GABA), ácido nipecótico (Nip) y el ácido 5-aminolevulínico (ALA).
Desafortunadamente, estas BBB-lanzaderas muestran una muy baja solubilidad en agua, una propiedad que influye en las dosis a administrar.
Así, a pesar de todos los esfuerzos en investigación invertidos en el pasado, todavía es deseable encontrar compuestos con utilidad farmacológica o de diagnóstico que puedan atravesar la BBB.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
Los inventores han encontrado nuevos compuestos, a los que se hace referencia como compuestos "lanzadera" , los cuales tienen la habilidad de atravesar la BBB y son capaces de introducir en el cerebro fármacos u otras sustancias útiles para el diagnóstico, a las que se hace referencia como "cargos", que no pueden atravesar la BBB por sí mismas. Los compuestos lanzadera son biodegradables y biocompatibles, no tienen toxicidad intrínseca ni antigenicidad, ya que están hechos de aminoácidos.
También muestran una permeabilidad mejorada y un transporte alto.
Además, las lanzaderas de la presente invención muestran una buena solubilidad en agua. Esta propiedad permite mejorar la dosis administrada, ya que será menor la cantidad de solución que contiene la construcción a ser administrada.
Así, un primer aspecto de la presente invención se refiere a proporcionar compuestos lanzadera de fórmula (I), o sus sales farmacéuticamente aceptables, incluyendo estereoisómeros o mezclas de estereoisómeros,
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(I) donde R-ι , R2 y R3 son independientemente seleccionados entre el grupo formado por: H y (CH2)q-R6; R4 es un C-radical derivado de uno de los sistemas de anillo conocidos con 1 -4 anillos; los anillos siendo saturados, parcialmente insaturados o aromáticos; los anillos siendo aislados o parcialmente/totalmente fusionados y teniendo 5-6 miembros; cada miembro siendo independientemente seleccionado entre C, CH , CH2, N, NH, O y S; los átomos de hidrógeno de estos miembros estando opcionalmente sustituidos por sustituyentes seleccionados entre (Ci-C6)-alquilo, (CrC6)-alcoxilo y halógeno; R5 es H o CH3CO-; R6 es un C-radical derivado de uno de los sistemas de anillo conocidos con 1 -2 anillos; los anillos siendo saturados, parcialmente insaturados o aromáticos; los anillos siendo aislados o parcialmente/totalmente fusionados y teniendo 5-6 miembros; cada miembro siendo independientemente seleccionado entre C, CH , CH2, N , N H , O y S; los átomos de hidrógeno de estos miembros estando opcionalmente sustituidos por sustituyentes seleccionados entre (CrC6)-alquilo, (CrC6)-alcoxilo, y halógeno; X es un birradical seleccionado entre el grupo formado por -N H-(CH2)r-CO-, -CO(CH2)rCO-, -S-(CH2) r-, -S-(CH2)r-CO-, -O-(CH2)r- y -O-(CH2)r-CO-; Y se selecciona entre el grupo formado por -N H2, -OH , -OR7 y -N H R7; k es un entero de 0 a 2; m es un entero de 0 a 1 ; n es un entero de 2 a 10; q es un entero de 0 a 1 ; r es un entero de 1 a 3; R7 es un radical (CrC6)-alquilo; con la condición de que al menos un radical R seleccionado entre R-i , R2, y R3 es un radical (CH2)q-R6. El birradical X está unido a R5 y al N H de la manera siguiente: R5-N H-
(CH2)r-CO-N H-, R5-CO(CH2)rCO-N H-, R5-S-(CH2)r-N H-, R5-S-(CH2)r-CO-N H ; R5-O-(CH2)r-N H- y R5-O-(CH2)r-CO-N H-. Por "sistema de anillo conocido" se entiende un sistema de anillo descrito en el estado de la técnica, lo que implica que su estructura es químicamente factible.
Los compuestos de fórmula (I) o sus sales pueden existir en forma solvatada, así como en formas no solvatadas, incluyendo formas hidratadas. Así, pueden contener en su estructura cantidades estequiométricas de disolvente en el caso de solvatos, o de agua en el caso de hidratos. Se debe entender que esta invención engloba todas las formas solvatadas, así como las no solvatadas. La obtención de solvatos e hidratos depende del disolvente utilizado y de las condiciones de cristalización que pueden ser determinadas por la persona experta en la materia. Preferiblemente, los compuestos de fórmula (I) son aquéllos donde n es un entero de 2 a 6, más preferiblemente de 2 a 5, y aún más preferiblemente de 2 a 4.
En una realización preferida, los compuestos de fórmula (I) son aquéllos donde Y es -NH2, -OH o -NHR7. En otra realización más preferida, los compuestos de fórmula (I) son aquéllos donde Y es -NH2.
En otra realización preferida, los compuestos de fórmula (I) son aquéllos donde los miembros de los anillos en R6, en R4, o tanto en R6 como en R4 son seleccionados entre C, CH y CH2.
En otra realización preferida, los compuestos de fórmula (I) son aquéllos donde R6 es un C-radical derivado de uno de los sistemas de anillo
conocidos con 1 -2 anillos que son aromáticos.
Preferiblemente, los compuestos de fórmula (I) son aquéllos donde R-i, R2 y R3 son independientemente seleccionados del grupo que consiste en H, fenilo, ciclohexilo, y 2-naftilo. En una realización preferida, los compuestos de fórmula (I) son aquéllos donde Ri y R2 son H, y R3 es un radical (CH2)q-R6. En una realización más preferida, los compuestos de fórmula (I) son aquéllos donde R3 es fenilo, ciclohexilo o 2-naftilo. En una realización aún más preferida, los compuestos de fórmula (I) son aquéllos donde R3 es fenilo.
Preferiblemente, los compuestos de fórmula (I) son aquéllos donde R4 se selecciona del grupo que consiste en fenilo, ciclohexilo y 2-naftilo. Los compuestos preferidos de formula (I) de los mencionados anteriormente son aquéllos donde R4 es ciclohexilo o 2-naftilo.
En una realización particular, los compuestos de fórmula (I) se seleccionan entre los mencionados anteriormente donde m es 1 . En otra realización particular, los compuestos de fórmula (I) se seleccionan entre los
mencionados anteriormente donde m es 0.
Preferiblemente, los compuestos de fórmula (I) son aquéllos donde k es 0 o 1 .
Los compuestos más preferidos de fórmula (I) son aquéllos que son seleccionados de la lista siguiente: Ac-PhPro-(PhPro)3-CONH2;
Ac-Cha-(PhPro)3-CONH2; y
Ac-2Nal-(PhPro)3-CONH2.
Los compuestos de fórmula (I) tienen la capacidad de transportar al cerebro sustancias, a las que se hace referencia como cargos, que no pueden atravesar la BBB por sí mismas. Así, otro aspecto de la invención se refiere al uso de estos compuestos de fórmula (I) como BBB-lanzaderas. El uso de estos compuestos hace posible por ejemplo que la investigación de nuevos fármacos no esté limitada sólo a compuestos que pueden atravesar la BBB por sí mismos. Tal como se ilustra mediante ejemplos comparativos, los compuestos de fórmula (I) son mejores lanzaderas BBB que los compuestos más próximos del estado de la técnica.
El mecanismo de transporte a través de la BBB de los compuestos de fórmula (I) es por difusión pasiva, y este mecanismo es independiente de la configuración L o D de los aminoácidos. Así, una de las principales ventajas de los compuestos de fórmula (I) es que se pueden preparar a partir de L o D aminoácidos o incluso de mezclas racémicas. Esto aumenta la vida media de las construcciones en el cuerpo, evitando la degradación por diferentes peptidasas en la sangre o asociadas con los microvasos cerebrales. Los compuestos de fórmula (I) tienen grupos funcionales apropiados para la unión covalente de cargos manteniendo la actividad original del cargo, hasta que alcanza el lugar de acción. Así, otro aspecto de la presente invención es proporcionar construcciones de fórmula (II), o sus sales farmacéuticamente aceptables, incluyendo cualquier estereoisómero o mezclas de
estereoisómeros, a las que se hace referencia como construcciones BBB lanzadera-cargo,
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donde: R-i, R2, R3, R4, X, Y, k, m, y n son como se definen anteriormente; y Z es un radical derivado de una sustancia susceptible de formar un enlace amida o un enlace éster o un enlace disulfuro con X , dicha sustancia siendo incapaz de atravesar la barrera hematoencefálica (BBB) por sí misma.
Los valores preferidos de R1, R2, R3, R4, X, Y, k, m, y n para el compuesto de fórmula (I) son también valores preferidos para la construcción de fórmula (II).
Las sustancias de las que deriva el radical Z incluyen una gran variedad de sustancias que tienen utilidad farmacológica o de diagnóstico. Estas sustancias puede ser principios activos farmacéuticos, en particular agentes antiretrovirales, agentes anticancerígenos, agentes anti-psicóticos, agentes antineurodegenerativos o agentes antiepilépticos. Ejemplos de principios activos farmacéuticos son ácido nipecótico y dopamina. La dopamina es un neurotransmisor clave en el sistema nervioso central, en particular, la disminución de la dopamina estriatal se asocia con condiciones clínicas del parkinsonismo. El ácido nipecótico es uno de los más potentes inhibidores de la recaptación de GABA y también un agonista del receptor de GABA. Sin embargo, no penetra la BBB.
Ambos compuestos muestran propiedades interesantes pero no pueden atravesar la barrera hematoencefálica. En particular, como se ilustra en los ejemplos, las construcciones de fórmula (II) permiten que tanto la dopamina como el ácido nipecótico puedan ser útiles como fármacos evitando los efectos secundarios de la terapia actual, y siendo una técnica sencilla y no invasiva comparada con las existentes.
Las sustancias de las que deriva Z también incluyen otras sustancias que seria interesante transportar al cerebro pero que no lo hacen de manera adecuada solas, por ejemplo agentes de contraste para resonancia magnética nuclear ("Magnetic Resonance Imaging", MRI). Entre los aparatos clínicos utilizados para diagnosticar cáncer, MRI destaca como una potente modalidad de obtención de imágenes no invasiva ni destructiva que proporciona imágenes internas de organismos vivos sin límite de profundidad del análisis y con una resolución de 10-100 μιτι. Es una técnica muy valiosa ampliamente utilizada en investigación y diagnóstico de cáncer. Para llevar a cabo la MRI se necesitan agentes de contraste. Los agentes de contraste se pueden utilizar como métodos de diagnóstico para enfermedades del sistema nervioso central tales como la enfermedad de Alzheimer, el cáncer cerebral, o como herramienta para una exploración pre-operativa con MRI que guiará al cirujano. En todos estos casos el agente de contraste utilizado necesita atravesar la BBB. Ejemplos de agentes de contraste incluyen nanopartículas magnéticas tales como nanopartículas de óxido de hierro
superparamagnético. Otros agentes de diagnóstico incluyen colorantes o sondas fluorescentes tales como la carboxifluoresceina y derivados, el amarillo lucifer, la rodamina o el rojo Texas.
Los compuestos lanzadera de fórmula (I) pueden estar formados por aminoácidos naturales y no-naturales y/o sus derivados. Los compuestos de fórmula (I) y las construcciones lanzadera-cargo de fórmula (II) se pueden generar total o parcialmente por síntesis química. Aminoácidos apropiados para la preparación de compuestos de fórmula (I) son disponibles
comercialmente. Los compuestos de fórmula (I) y las construcciones de fórmula (II) se pueden preparar fácilmente, por ejemplo, según síntesis en fase líquida o, preferiblemente, métodos de síntesis de péptidos en fase sólida, de los cuales descripciones generales son ampliamente disponibles (cf. p.ej. M. Amblard, et al., "Methods and protocols of modern solid phase peptide synthesis. Molecular Biotechnoloqy 2006, vol. 33, pp. 239-254); o se pueden preparar en solución por métodos de fase líquida o por cualquier combinación de fase sólida, fase líquida y química en solución. Por ejemplo, primero completando la porción BBB-lanzadera y entonces después de eliminar cualquiera de los grupos protectores si están presente, por introducción del cargo en solución.
Otro aspecto de la invención se refiere a las composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de las
construcciones lanzadera-cargo de fórmula (II) junto con cantidades apropiadas de excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables. La persona experta en la materia escogerá la vía de administración adecuada mediante métodos usuales. La cantidad de la construcción a ser
administrada, la velocidad y el tiempo de administración, dependerá de la naturaleza y la gravedad de lo que se está tratando. La naturaleza precisa del portador u otros excipientes dependerá de la ruta de administración, que puede ser oral, nasal o por inyección, p.ej. cutánea, subcutánea o
intravenosa.
El término "cantidad terapéuticamente efectiva" como se usa aquí, se refiere a la cantidad de un compuesto que, cuando se administra, es suficiente para prevenir el desarrollo de, o aliviar en cierto grado, uno o más de los síntomas de la enfermedad a la que se dirige. La dosis particular de compuesto administrado según esta invención será por supuesto determinada por las condiciones particulares que rodean el caso, incluyendo el compuesto administrado, la ruta de administración, la condición particular que se está tratando, y las consideraciones similares. El término "composición farmacéutica" se refiere a una mezcla de un compuesto descrito aquí con otros componentes químicos, como diluyentes o portadores. La composición farmacéutica facilita la administración del compuesto a un organismo.
Los términos "excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables" se refieren a material farmacéuticamente aceptable, composición o vehículo. Cada componente debe ser farmacéuticamente aceptable en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la composición farmacéutica. Debe ser también apto para el uso en contacto con tejidos o órganos de humanos y animales sin demasiada toxicidad, irritación, respuesta alérgica, immunogenicidad u otros problemas o complicaciones acorde con una relación beneficio/riesgo razonable.
Una composición que comprende una construcción según la presente invención se puede administrar sola o en combinación con otros
tratamientos, tanto simultáneamente o secuencialmente dependiendo de la condición a tratar.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a las construcciones de la presente invención para uso como medicamento.
Otro aspecto de la invención refiere a las construcciones de fórmula (II) donde Z es un radical de dopamina para el uso en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. Este aspecto también puede ser formulado como el uso de las construcciones de fórmula (II) donde Z es un radical de dopamina para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. Por lo tanto, este aspecto también está relacionado con un método de tratamiento y/o profilaxis de un mamífero, incluyendo un humano, que padece o es susceptible de padecer la enfermedad Parkinson, dicho método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de fórmula (II) con Z derivado de dopamina, junto con excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables.
Otro aspecto de la invención refiere a las construcciones de fórmula (II) donde Z es un radical del ácido nipecótico para el uso como anticonvulsivo. Los anticonvulsivos son fármacos usados en el tratamiento de las
convulsiones epilépticas, o el desorden bipolar. Este aspecto también puede ser formulado como el uso de las construcciones de fórmula (II) donde Z es un radical del ácido nipecótico para la preparación de un medicamento para el tratamiento de convulsiones o enfermedades que producen convulsiones. Por lo tanto, este aspecto también está relacionado con un método de tratamiento y/o profilaxis de un mamífero, incluyendo un humano, que padece o es susceptible de padecer convulsiones, dicho método comprende la administración a un paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de fórmula (II) con Z derivado del ácido nipecótico, junto con excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. Además, la presente invención cubre todas las posibles combinaciones de realizaciones particulares y preferidas aquí indicadas. EXPOSICION DETALLADA DE MODOS DE REALIZACIÓN
Los aminoácidos protegidos, espaciadores bifuncionales y resinas fueron suministrados por: Luxembourg Industries (Tel-Aviv, Israel), Neosystem (Strasbourg, Francia), Calbiochem-Novabiochem AG (Laüfelfingen, Suiza), Bachem AG (Bubendorf, Suiza) o Iris Biotech (Marktredwitz, Alemania). Otros reactivos y solventes utilizados se resumen en la Tabla 1 .
Tabla 1 Suministradores comerciales y reactivos utilizados. El DCM fue pasado por una columna de AI2O3. La DMF se guardó sobre tamiz molecular de 4Á y nitrógeno se burbujeó para eliminar los agentes volátiles.
Suministrador
Reactivos y disolventes
Comercial
Albatros Chem. Inc. /V-hidroxibenzotriazol (HOBt) dopamina, L-dopa, piperidina, ácido 2,5- dihidroxibenzoico (DHB), ácido a-ciano-4-
Aldrich hidroxicinámico (ACH), DOWEX MR-3 Mixed Bed, rojo disperso 1, etil diazoacetato, 1 ,8-diazabiciclo-[5.4.0]- undec-7-ene (DBU), propranolol, carbamazepina hexafluorofosfato de (7-azabenzotriazol-1 -iloxi)
Applied Biosystems
tris(pirrolidin) fosfonio (PyAOP)
Applied GL
1 -hidroxi-7-azabenzotriazol (HOAt)
Biochem Shangai
Avantis Extracto polar de lípidos de cerebro porcino (PBLEP)
Λ/,/V-diisopropiletilannina (DIEA), ninhidrina, 1 -propanol,
Fluka
Fmoc-L-Nip-COOH, ácido nipecótico
Jescuder NaOH
KaliChemie ácido trifluoroacético (TFA)
tamiz Molecular 4Á, láminas para cromatografía en
Merck
capa fina (TLC)
Millipore Filtros de polivinilidina difluoruro (PVDF) 0.45 μιτι
hexafluorofosfato de benzotriazol-1 -il-/V-oxi-
Novabiochem
tris(pirrolidin) fosfonio (PyBOP)
plON placas de PAMPA, solución sistema para PAMPA
diclorometano (DCM), dimetilformamida (DMF), MeOH,
Scharlau
tert-butilmetiléter (TBME), /V-metil pirrolidona (NMP),
SDS Acetona, MeCN, tolueno
Consideraciones generales sobre la síntesis. La elongación del péptido en fase sólida y otras manipulaciones en fase sólida se realizaron manualmente en jeringas de polipropileno provistas de un disco poroso de polietileno. Los disolventes y reactivos solubles se eliminaron por succión. Los lavados entre las diferentes etapas sintéticas se realizaron con dimetilformamida (DMF) (5 x 0.5 min) y diclorometano (DCM) (5 x 0.5 min) utilizando 10 mL de
disolvente/g de resina cada vez. Tests identificativos. Los tests utilizados para la identificación y control de las síntesis fueron los siguientes: A) Ensayo colorimétrico de Kaiser para la detección en fase sólida de aminas primarias unidas (cf: E. Kaiser et al., "Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides"; Anal. Biochem. 1970, vol. 34, pp. 595-598); B) Test de De Clercq para aminas secundarias unidas a fase sólida (cf. A. Madder et al., "A novel sensitive colorimetric assay for visual detection of solid-phase bound amines". Eur. J. Orq. Chem. 1999, pp. 2787-2791 ). El ensayo de De Clercq se realiza lavando primero una pequeña muestra de la resina (aprox. 1 mg) con DMF (4x1 minutos) y DCM (4x1 minutos). A la resina se le añaden diez gotas de solución del reactivo (0.002 M p-nitrofenil éster de rojo disperso 1 en MeCN) y la mezcla resultante se calienta a 70 °C durante 10 minutos. La solución es entonces decantada y la resina lavada con DMF hasta que se obtiene un sobrenadante transparente. La presencia de aminas secundarias es indicada por bolas de resina de color rojo.
Protocolos utilizados durante la síntesis de las construcciones de fórmula (II): Fueron sintetizadas en una escala de 100 μηηοΐβε utilizando los siguientes métodos y protocolos;
Condicionado inicial de la resina. La resina Sieber se condicionó por lavado con DCM (5 χ 30 s) y DMF (5 χ 30 s) seguida por una solución 20%
piperidina en DMF (2 χ 1 min y 1 χ 10 min) para eliminar el grupo Fmoc. Finalmente, la resina se lavó con DMF (5 χ 30 s).
Eliminación del grupo Fmoc. La eliminación del grupo protector 9- fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc) se hizo con 20% (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno. Se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU, tolueno, piperidina, DMF (5%, 5%, 20%,
70%) (2 x 5 min) para asegurar la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias.
Métodos de acoplamiento:
Acoplamiento del primer aminoácido a la resina Sieber: Se añadieron secuencialmente el aminoácido N-protegido (4 eq), PyBOP (4 eq) y HOAt (12 eq) a la resina en DMF seguidos de DIEA (12 eq). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 .5 h. El disolvente se eliminó por succión; la resina se lavó con DMF (5 χ 30 s) y DCM (5 χ 30 s). La extensión del acoplamiento fue comprobada por el ensayo colorimétrico de ninhidrina.
Acoplamiento del segundo aminoácido y los siguientes aminoácidos a la resina Sieber: El procedimiento fue el mismo que para el primero, excepto que el acoplamiento se repitió dos veces más y la extensión del acoplamiento se comprobó por el test de De Clercq.
Acoplamiento del cargo. Dependiendo de la naturaleza del cargo, estará unido a la BBB lanzadera a través de diferentes tipos de enlaces químicos. Para cargos con un grupo COOH (p.ej. ácido nipecótico, L-dopa): Se utilizó la correspondiente BBB lanzadera provista con un grupo NH2 y se hizo reaccionar con 5 equiv. de Cargo-COOH, utilizando 5 equiv.
hexafluorofosfato de benzotriazol-1 -il-A -oxi-tris(pirrolidin) fosfonio (PyBOP) y 15 equiv. 1 -hidroxi-7-azabenzotriazol (HOAt) como reactivos de
acoplamiento y 15 equiv. de Λ/,/V-diisopropiletilamina (DIEA) como base en DMF durante 2h. La mezcla se dejo reaccionar con agitación manual intermitente. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y DCM (5 χ 30 s). El acoplamiento se repitió 2 veces más. La extensión del acoplamiento se comprobó por el test de De Clercq o el ensayo colorimétrico de ninhidrina.
Acetilación del aminoácido N-terminal: En algunos casos la acetilación se realizó en fase sólida utilizando un protocolo estándar de Ac2O (50 equiv) y DIEA (50 equiv) durante 20 min.
Etapa de escisión: Se realizó por tratamiento de la resina con TFA 2% en DCM (6 x 3 min). El filtrado se colectó y el DCM se evaporó bajo N2. El residuo se disolvió en H2O: MeCN (1 :1 ) y se liofilizó. La identidad de los diferentes compuestos sintetizados se confirmó utilizando la espectrometría de masas "Matrix Assisted Láser Desorption/lonization" (MALDI) (Instrumento: MALDI Voyager DE RP time-of-flight (TOF) PE Biosystem) o HPLC-MS (Instrumento: Waters modelo Alliance 2796, bomba cuaternaria, detector UVA/is modelo 2487, ESI-MS modelo Micromass ZQ y software Masslynx versión 4.0) utilizando una columna Symmetry 300 d8 (150 x 3.9 mm x 5 μηη), 300 Á. 1 mL/min flujo, solventes: A: H2O con 0.1 % ácido fórmico; B: MeCN con 0.07 % ácido fórmico. Su pureza se controló por HPLC de fase inversa utilizando una columna Symmetry Ci8 (150 x 4.6 mm x 5 μητι, 100 Á, Waters) y una columna Sunfire C18 (100 x 4.6 mm x 3.5 μητι, 100 Á, Waters), 1 mL/min flujo, solventes: A: H2O con 0.045% TFA; B: MeCN con 0.036% TFA, Instrumento: Waters modelo Alliance 2695 formado por una bomba cuaternaria, un detector diodo array modelo 966, controlado por el software Millenium versión 3.5.
Los compuestos se purificaron si fue necesario por HPLC fase inversa utilizando una columna Symmetry Ci8 (100 x 30 mm x 5 μητι, 100 Á, Waters), 10 mL/min flujo, disolventes: A: H2O con 0.1 % TFA; B: MeCN con 0.1 % TFA, Instrumento: Waters system con una bomba cuaternaria, autoinjector Simple Manager 2700, detector UVA/is modelo 2487 y un Fraction collector II, controlado por el software Masslynx versión 3.5. EJEMPLOS
En los ejemplos siguientes se han utilizado L-aminoácidos excepto para Fmoc-PhPro-COOH que se ha usado como mezcla racémica. Ejemplo 1 : Preparación de compuestos de fórmula (I): Ac-PhPro-(PhPro)3-
CONH? (la); Ac-Cha-(PhPro)a-CONH? (Ib), v Ac-2Nal-(PhPro)a-CONH? (lc).
La síntesis se realizó en una escala 100 μηηοΐβε. Para el acoplamiento del primer aminoácido a la resina Sieber se utilizó el siguiente protocolo:
Derivado de aminoácido del primer aminoácido (Fmoc-PhPro-OH, 4 equiv.,
400 μηηοΐε, 165 mg), PyBOP (4 equiv., 400 μηηοΐε, 208 mg) y HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF (1 -3 ml/g resina) se añadieron secuencialmente a la resina seguidos de DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 μί). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 .5 h. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó a fondo. La extensión del acoplamiento se comprobó por el ensayo colorimétrico de ninhidrina. El grupo Fmoc se eliminó con 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno. Se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU, tolueno, piperidina, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 x 5 min) para asegurar la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias.
El derivado de aminoácido protegido del segundo aminoácido se acopló al primer aminoácido ya anclado a la resina utilizando el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el aminoácido protegido (Fmoc-PhPro-OH, 4 equiv., 400 μηηοΐε, 165 mg), PyBOP (4 equiv., 400 μηηοΐε, 208 mg) y HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF (1 -3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 μΙ_). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 .5 h. Se eliminó el disolvente por succión, la resina se lavó a fondo y el acoplamiento se repetió dos veces más. La extensión del acoplamiento se comprobó por el test de De Clercq. El grupo Fmoc se eliminó con 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno. Se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU, tolueno, piperidina, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 x 5 min) para asegurar la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias. El mismo protocolo se utilizó para acoplar el tercer derivado de aminoácido.
Para el acoplamiento del cuarto derivado de aminoácido se utilizó el siguiente protocolo: se añadieron secuencialmente el aminoácido protegido 4 equiv., 400 μηηοΐε (Fmoc-PhPro-OH, 165 mg) (Fmoc-Cha-OH, 157 mg) o (Fmoc-2Nal-OH, 175 mg), PyBOP (4 equiv., 400 μηηοΐε, 208 mg) y HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF (1 -3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 μΐ). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 .5 h. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó a fondo y el acoplamiento se repitió dos veces más. La extensión del acoplamiento se comprobó por el test de De
Clercq. El grupo Fmoc se eliminó con 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno. En el caso de PhPro, se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU, tolueno, piperidina, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 x 5 min) para asegurar la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias. La acetilación se realizó en fase sólida utilizando un protocolo estándar de Ac2O (50 equiv., 5 mmols, 471 μΙ_) y DIEA (50 equiv., 5 mmols, 850 μΙ_) durante 20 min. La etapa de escisión se realizó por tratamiento de la resina con TFA 2% en DCM (6 x 3 min). El filtrado se colectó y el DCM se evaporó bajo N2. El residuo se disolvió en H2O: MeCN (1 :1 ) y se liofilizó. Para eliminar las sales se realizó un paso de desalado utilizando la resina DOWEX MR-3 Mixed Bed toda la noche.
Caracterización del producto: HPLC de fase inversa: gradiente lineal de 50 a 80% MeCN en 15 minutos utilizando una columna Symmetry d8 (150 x 4.6 mm x 5 μηη, 100 Á, Waters), Compuesto (la): Ac-PhPro-(PhPro)3-CONH2 tr: 3- 9 min (diastereómeros); Compuesto (Ib): Ac-Cha-(PhPro)3-CONH2 tr: 4-10.1 min (diastereómeros); Compuesto (le): Ac-2Nal-(PhPro)3-CONH2 6.5-13.3 min (diastereómeros). Espectrometría de masas (MALDI-TOF): Compuesto (la): Ac-PhPro-(PhPro)3-CONH2 (M+Na)+: 774.3; Compuesto (Ib):
Ac-Cha-(PhPro)3-CONH2 (M+Na)+: 754.4; Compuesto (le): Ac-2Nal-(PhPro)3- CONH2 (M+Na)+: 798.3. Rendimiento: Compuesto (la): Ac-PhPro-(PhPro)3- CONH2 65%; Compuesto (Ib): Ac-Cha-(PhPro)3-CONH2 63.7%; Compuesto (le): Ac-2Nal-(PhPro)3-CONH2 49.8%.
Ejemplo 2: Preparación del compuesto de fórmula (II) con Z derivado de ácido nipecótico: Nip-Cha-(PhPro)3-CONH? (lia)
La síntesis se realizó en una escala 100 μηηοΐβε. Para el acoplamiento del primer aminoácido a la resina Sieber se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el derivado de aminoácido del primer aminoácido (Fmoc-PhPro-OH, 4 equiv., 400 μηηοΐε, 165 mg), PyBOP (4 equiv., 400 μηηοΐε, 208 mg) y HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF (1 - 3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 μί). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 .5 h. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó a fondo. La extensión del acoplamiento se comprobó por el ensayo colorimétrico de ninhidrina. El grupo Fmoc se eliminó con 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno. Se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU, tolueno, piperidina, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 x 5 min) para asegurar la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias. El derivado de aminoácido protegido del segundo aminoácido se acopló al primer aminoácido ya anclado a la resina utilizando el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el aminoácido protegido (Fmoc-PhPro-OH, 4 equiv., 400 μηηοΐε, 165 mg), PyBOP (4 equiv., 400 μηηοΐε, 208 mg) y HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF (1 -3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 μΙ_). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 .5 h. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó a fondo y el acoplamiento se repitió dos veces más. La extensión del acoplamiento se comprobó por el test de De
Clercq. El grupo Fmoc se eliminó con 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno. Se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU, tolueno, piperidina, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 5 min) para asegurar la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias. El mismo protocolo se utilizó para acoplar el tercer derivado de aminoácido.
Para el acoplamiento del cuarto derivado de aminoácido se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el aminoácido protegido (Fmoc-Cha-OH, 4 equiv., 400 μηηοΐε, 157 mg), PyBOP (4 equiv., 400 μηηοΐε, 208 mg) y HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF (1 -3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 μί). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 .5 h. El disolvente se eliminó por succión, la resina lavada a fondo y el acoplamiento se repitió dos veces más. La extensión del acoplamiento se comprobó por el test de De Clercq. El grupo Fmoc se eliminó con 20 % (v/v) piperidina en
DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno.
Para el acoplamiento del cargo (ácido nipecótico) a la BBB-lanzadera anclada a la resina se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron
secuencialmente el Cargo-COOH (Fmoc-L-Nip-OH) (4 equiv., 400 μηηοΐε, 140 mg) en DMF (1-3 mL/g resina), PyBOP (4 equiv., 400 μηηοΐε, 208 mg) y HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) a la resina seguido de 12 equiv. DIEA (1 .2 mmols, 204 μί). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 2 h. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó a fondo y el acoplamiento se repitió una vez. La extensión del acoplamiento se controló por el test de Kaiser. El grupo Fmoc se eliminó con 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno.
La etapa de escisión se realizó por tratamiento de la resina con TFA 2% en DCM (6 x 3 min). El filtrado se colectó y el DCM se evaporó bajo N2. El residuo se disolvió en H2O: MeCN (1 :1 ) y se liofilizó.
Caracterización del producto: HPLC de fase inversa: gradiente lineal de 30 a 60% MeCN en 8 minutos utilizando una columna Sunfire d8 (100 x 4.6 mm x 3.5 μηη, 100 Á, Waters), Nip-Cha-(PhPro)3-CONH2 tr: 3.9-7.3 min
(diastereómeros). Espectrometría de masas (MALDI-TOF): Nip-Cha-(PhPro)3- CONH2 (M+H)+: 801 .5. Rendimiento: Nip-Cha-(PhPro)3-CONH2 65%.
Ejemplo 3: Preparación del compuesto de formula (II) con Z derivado de Levodopa: L-Dopa-Cha-(PhPro)3-CONH? (llb)
La síntesis se realizó en una escala 100 μηηοΐβε. Para el acoplamiento del primer aminoácido a la resina Sieber se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el derivado de aminoácido del primer aminoácido (Fmoc-PhPro-OH, 4 equiv., 400 μηηοΐε, 165 mg), PyBOP (4 equiv., 400 μηηοΐε, 208 mg) y HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF (1 -3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 μί). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 .5 h. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó a fondo. La extensión del acoplamiento se comprobó por el ensayo colorimétrico de ninhidrina. El grupo Fmoc se eliminó con 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno. Se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU, tolueno, piperidina, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 5 min) para asegurar la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias.
El derivado de aminoácido protegido del segundo aminoácido se acopló al primer aminoácido ya anclado a la resina utilizando el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el aminoácido protegido (Fmoc-PhPro-OH, 4 equiv., 400 μηηοΐε, 165 mg), PyBOP (4 equiv., 400 μηηοΐε, 208 mg) y HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF (1 -3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 μί). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 .5 h. El solvente fue entonces eliminado por succión, la resina lavada a fondo y el acoplamiento se repitió dos veces más. La extensión del acoplamiento se comprobó por el test de De Clercq. El grupo Fmoc se eliminó con 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno. Se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU, tolueno, piperidina, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 x 5 min) para asegurar la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias. El mismo protocolo se utilizó para acoplar el tercer derivado de aminoácido. Para el acoplamiento del cuarto derivado de aminoácido se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el aminoácido protegido (Fmoc-Cha-OH, 4 equiv., 400 μηηοΐε, 157 mg), PyBOP (4 equiv., 400 μηηοΐε, 208 mg) y HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF (1 -3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 μΙ_). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 .5 h. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó a fondo y el acoplamiento se repitió dos veces más. La extensión del acoplamiento se comprobó por el test de De Clercq. El grupo Fmoc se eliminó con 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno.
Para el acoplamiento del cargo (levodopa) a la BBB-lanzadera anclada a la resina se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el Cargo-COOH (Fmoc-L-Dopa-OH) (4 equiv., 400 μηηοΐε, 167 mg) en DMF (1-3 mL/g resina), PyBOP (4 equiv., 400 μηηοΐε, 208 mg) y HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) a la resina seguido de 12 equiv. DIEA (1 .2 mmols, 204 μί). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 2 h. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó a fondo y el
acoplamiento se repitió una vez. La extensión del acoplamiento se controló por el test de Kaiser. El grupo Fmoc se eliminó con 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno.
La etapa de escisión se realizó por tratamiento de la resina con TFA 2% en DCM (6 x 3 min). El filtrado se colectó y el DCM se evaporó bajo N2. El residuo se disolvió en H2O: MeCN (1 :1 ) y se liofilizó.
Caracterización del producto: HPLC de fase inversa: gradiente lineal de 30 a 60% MeCN en 8 minutos utilizando una columna Sunfire d8 (100 x 4.6 mm x 3.5 μηη, 100 A, Waters), L-Dopa-Cha-(PhPro)3-CONH2 tr: 3.8-7.5 min
(diastereómeros). Espectrometría de masas (MALDI-TOF): L-Dopa-Cha- (PhPro)3-CONH2 (M+Na)+: 891 .5. Rendimiento: L-Dopa-Cha-(PhPro)3- CONH2 63.7%.
Ejemplo 4: Preparación del compuesto de fórmula (II) con Z derivado de ácido nipecótico: Nip-PhPro-(PhPro)3-CONH? (lie)
La síntesis se realizó en una escala 100 μηηοΐβε. Para el acoplamiento del primer aminoácido a la resina Sieber se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el derivado de aminoácido del primer aminoácido (Fmoc-PhPro-OH, 4 equiv., 400 μηηοΐε, 165 mg), PyBOP (4 equiv., 400 μηηοΐε, 208 mg) y HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF (1 - 3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 μΙ_). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 .5 h. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó a fondo. La extensión del acoplamiento se comprobó por el ensayo colorimétrico de ninhidrina. El grupo Fmoc se eliminó con 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno. Se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU, tolueno, piperidina, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 x 5 min) para asegurar la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias.
El derivado de aminoácido protegido del segundo aminoácido se acopló al primer aminoácido ya anclado a la resina utilizando el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el aminoácido protegido (Fmoc-PhPro-OH, 4 equiv., 400 μηηοΐε, 165 mg), PyBOP (4 equiv., 400 μηηοΐε, 208 mg) y HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF (1 -3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 μί). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 .5 h. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó a fondo y el acoplamiento se repitió dos veces más. La extensión del acoplamiento se comprobó por el test de De Clercq. El grupo Fmoc se eliminó con 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno. Se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU, tolueno, piperidina, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 5 min) para asegurar la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias. El mismo protocolo se utilizó para acoplar el tercer y cuarto derivado de aminoácido.
Para el acoplamiento del cargo (ácido nipecótico) a la BBB-lanzadera anclada a la resina se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron
secuencialmente el Cargo-COOH (Fmoc-L-Nip-OH) (4 equiv., 400 μηηοΐε, 140 mg) en DMF (1-3 mL/g resina), PyBOP (4 equiv., 400 μηηοΐε, 208 mg) y HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) a la resina seguido de 12 equiv. DIEA (1 .2 mmols, 204 μΙ_). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 2 h. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó a fondo y el acoplamiento se repitió una vez. La extensión del acoplamiento se controló por el test de Kaiser. El grupo Fmoc se eliminó con 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno.
La etapa de escisión se realizó por tratamiento de la resina con TFA 2% en DCM (6 x 3 min). El filtrado se colectó y el DCM se evaporó bajo N2. El residuo se disolvió en H2O: MeCN (1 :1 ) y se liofilizó. Caracterización del producto: HPLC de fase inversa: gradiente lineal de 30 a 60% MeCN en 8 minutos utilizando una columna Sunfire C-i8 (100 x 4.6 mm x 3.5 μηη, 100 A, Waters), Nip-PhPro-(PhPro)3-CONH2 tr: 3-7.2 min
(diastereómeros). Espectrometría de masas (MALDI-TOF): Nip-PhPro- (PhPro)3-CONH2 (M+H)+: 821 .5. Rendimiento: Nip-PhPro-(PhPro)3-CONH2 19%.
Ejemplo 5: Preparación del compuesto de formula (II) con Z derivado de Levodopa: L-Dopa-PhPro-(PhPro)3-CONH? (lid) La síntesis se realizó en una escala 100 μηηοΐβε. Para el acoplamiento del primer aminoácido a la resina Sieber se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el derivado de aminoácido del primer aminoácido (Fmoc-PhPro-OH, 4 equiv., 400 μηηοΐε, 165 mg), PyBOP (4 equiv., 400 μηηοΐε, 208 mg) y HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF (1 -3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 μί). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 .5 h. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó a fondo. La extensión del acoplamiento se comprobó por el ensayo colorimétrico de ninhidrina. El grupo Fmoc se eliminó con 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 1 0 minutos cada uno. Se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU, tolueno, piperidina, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 5 min) para asegurar la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias.
El derivado de aminoácido protegido del segundo aminoácido se acopló al primer aminoácido ya anclado a la resina utilizando el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el aminoácido protegido (Fmoc-PhPro-OH, 4 equiv., 400 μηηοΐε, 165 mg), PyBOP (4 equiv., 400 μηηοΐε, 208 mg) y HOAt (1 2 equiv., 1 .2 mmols, 1 63 mg) disueltos en DMF (1 -3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (1 2 equiv., 1 .2 mmols, 204 μΙ_). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 .5 h. El solvente fue entonces eliminado por succión, la resina lavada a fondo y el acoplamiento se repitió dos veces más. La extensión del acoplamiento se comprobó por el test de De Clercq. El grupo Fmoc se eliminó con 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 1 0 minutos cada uno. Se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU, tolueno, piperidina, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 x 5 min) para asegurar la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias. El mismo protocolo se utilizó para acoplar el tercer y cuarto derivado de aminoácido.
Para el acoplamiento del cargo (levodopa) a la BBB-lanzadera anclada a la resina se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el Cargo-COOH (Fmoc-L-Dopa-OH) (4 equiv., 400 μηηοΐε, 1 67 mg) en DMF (1 -3 mL/g resina), PyBOP (4 equiv., 400 μηηοΐε, 208 mg) y HOAt (1 2 equiv., 1 .2 mmols, 1 63 mg) a la resina seguido de 1 2 equiv. DIEA (1 .2 mmols, 204 μί). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 2 h. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó a fondo y el
acoplamiento se repitió una vez. La extensión del acoplamiento se controló por el test de Kaiser. El grupo Fmoc se eliminó con 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 1 0 minutos cada uno.
La etapa de escisión se realizó por tratamiento de la resina con TFA 2% en DCM (6 x 3 min). El filtrado se colectó y el DCM se evaporó bajo N2. El residuo se disolvió en H2O: MeCN (1 : 1 ) y se liofilizó. Caracterización del producto: HPLC de fase inversa: gradiente lineal de 30 a 60% MeCN en 8 minutos utilizando una columna Sunfire C-i8 (100 x 4.6 mm x 3.5 μηη, 100 Á, Waters), L-Dopa-PhPro-(PhPro)3-CONH2 tr: 3.5-6.9 min (diastereómeros). Espectrometría de masas (MALDI-TOF): L-Dopa-PhPro- (PhPro)3-CONH2 (M+Na)+: 889.6. Rendimiento: L-Dopa-PhPro-(PhPro)3- CONH2 18%.
Ejemplo 6: Preparación del compuesto de fórmula (II) con Z derivado de ácido nipecótico: Nip-2Nal-(PhPro)3-CONH? (Me)
La síntesis se realizó en una escala 100 μηηοΐβε. Para el acoplamiento del primer aminoácido a la resina Sieber se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el derivado de aminoácido del primer aminoácido (Fmoc-PhPro-OH, 4 equiv., 400 μηηοΐε, 165 mg), PyBOP (4 equiv., 400 μηηοΐε, 208 mg) y HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF (1 - 3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 μΙ_). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 .5 h. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó a fondo. La extensión del acoplamiento se comprobó por el ensayo colorimétrico de ninhidrina. El grupo Fmoc se eliminó con 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno. Se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU, tolueno, piperidina, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 x 5 min) para asegurar la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias.
El derivado de aminoácido protegido del segundo aminoácido se acopló al primer aminoácido ya anclado a la resina utilizando el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el aminoácido protegido (Fmoc-PhPro-OH, 4 equiv., 400 μηηοΐε, 165 mg), PyBOP (4 equiv., 400 μηηοΐε, 208 mg) y HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF (1 -3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 μί). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 .5 h. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó a fondo y el acoplamiento se repitió dos veces más. La extensión del acoplamiento se comprobó por el test de De Clercq. El grupo Fmoc se eliminó con 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno. Se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU, tolueno, piperidina, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 5 min) para asegurar la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias. El mismo protocolo se utilizó para acoplar el tercer derivado de aminoácido.
Para el acoplamiento del cuarto derivado de aminoácido se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el aminoácido protegido (Fmoc-2Nal-OH, 4 equiv., 400 μηηοΐε, 141 mg), PyBOP (4 equiv., 400 μηηοΐε, 208 mg) y HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF (1 -3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 μΙ_). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 .5 h. El disolvente se eliminó por succión, la resina lavada a fondo y el acoplamiento se repitió dos veces más. La extensión del acoplamiento se comprobó por el test de De Clercq. El grupo Fmoc se eliminó con 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno. Para el acoplamiento del cargo (ácido nipecótico) a la BBB-lanzadera anclada a la resina se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron
secuencialmente el Cargo-COOH (Fmoc-L-Nip-OH) (4 equiv., 400 μηηοΐε, 140 mg) en DMF (1-3 mL/g resina), PyBOP (4 equiv., 400 μηηοΐε, 208 mg) y HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) a la resina seguido de 12 equiv. DIEA (1 .2 mmols, 204 μί). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 2 h. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó a fondo y el acoplamiento se repitió una vez. La extensión del acoplamiento se controló por el test de Kaiser. El grupo Fmoc se eliminó con 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno.
La etapa de escisión se realizó por tratamiento de la resina con TFA 2% en DCM (6 x 3 min). El filtrado se colectó y el DCM se evaporó bajo N2. El residuo se disolvió en H2O: MeCN (1 :1 ) y se liofilizó.
Caracterización del producto: HPLC de fase inversa: gradiente lineal de 30 a 60% MeCN en 8 minutos utilizando una columna Sunfire C-i8 (100 x 4.6 mm x 3.5 μηη, 100 A, Waters), Nip-2Nal-(PhPro)3-CONH2 tr: 3.9-7.4 min
(diastereómeros). Espectrometría de masas (MALDI-TOF): Nip-2Nal- (PhPro)3-CONH2 (M+H)+: 845.6. Rendimiento: Nip-2Nal-(PhPro)3-CONH2 20%. Ejemplo 7: Preparación del compuesto de formula (II) con Z derivado de Levodopa: L-Dopa-2Nal-(PhPro)a-CONH? (llf)
La síntesis se realizó en una escala 100 μηηοΐβε. Para el acoplamiento del primer aminoácido a la resina Sieber se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el derivado de aminoácido del primer aminoácido (Fmoc-PhPro-OH, 4 equiv., 400 μηηοΐε, 165 mg), PyBOP (4 equiv., 400 μηηοΐε, 208 mg) y HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF (1 -3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 μΙ_). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 .5 h. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó a fondo. La extensión del acoplamiento se comprobó por el ensayo colorimétrico de ninhidrina. El grupo Fmoc se eliminó con 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno. Se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU, tolueno, piperidina, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 5 min) para asegurar la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias.
El derivado de aminoácido protegido del segundo aminoácido se acopló al primer aminoácido ya anclado a la resina utilizando el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el aminoácido protegido (Fmoc-PhPro-OH, 4 equiv., 400 μηηοΐε, 165 mg), PyBOP (4 equiv., 400 μηηοΐε, 208 mg) y HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF (1 -3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 μί). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 .5 h. El solvente fue entonces eliminado por succión, la resina lavada a fondo y el acoplamiento se repitió dos veces más. La extensión del acoplamiento se comprobó por el test de De Clercq. El grupo Fmoc se eliminó con 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno. Se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU, tolueno, piperidina, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 x 5 min) para asegurar la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias. El mismo protocolo se utilizó para acoplar el tercer derivado de aminoácido.
Para el acoplamiento del cuarto derivado de aminoácido se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el aminoácido protegido (Fmoc-2Nal-OH, 4 equiv., 400 μηηοΐε, 141 mg), PyBOP (4 equiv., 400 μηηοΐε, 208 mg) y HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF (1 -3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 μΙ_). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 .5 h. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó a fondo y el acoplamiento se repitió dos veces más. La extensión del acoplamiento se comprobó por el test de De Clercq. El grupo Fmoc se eliminó con 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno.
Para el acoplamiento del cargo (levodopa) a la BBB-lanzadera anclada a la resina se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el Cargo-COOH (Fmoc-L-Dopa-OH) (4 equiv., 400 μηηοΐε, 167 mg) en DMF (1-3 mL/g resina), PyBOP (4 equiv., 400 μηηοΐε, 208 mg) y HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) a la resina seguido de 12 equiv. DIEA (1 .2 mmols, 204 μί).
La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 2 h.
El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó a fondo y el
acoplamiento se repitió una vez. La extensión del acoplamiento se controló por el test de Kaiser. El grupo Fmoc se eliminó con 20 % (v/v) piperidina en
DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno.
La etapa de escisión se realizó por tratamiento de la resina con TFA 2% en DCM (6 x 3 min). El filtrado se colectó y el DCM se evaporó bajo N2. El residuo se disolvió en H2O: MeCN (1 :1 ) y se liofilizó.
Caracterización del producto: HPLC de fase inversa: gradiente lineal de 30 a 60% MeCN en 8 minutos utilizando una columna Sunfire C-i8 (100 x 4.6 mm x 3.5 μΐτι, 100 Á, Waters), L-Dopa-2Nal-(PhPro)3-CONH2 tr: 3.8-7.6 min
(diastereómeros). Espectrometría de masas (MALDI-TOF): L-Dopa-2Nal- (PhPro)3-CONH2 (M+Na)+: 913.6. Rendimiento: L-Dopa-2Nal-(PhPro)3- CONH2 26%. Ejemplo Comparativo 1 : Preparación de Ac-(N-MePhe)4-CONH?
La síntesis se realizó en una escala 100 μηηοΐβε. Para el acoplamiento del primer aminoácido a la resina Sieber se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el derivado de aminoácido del primer aminoácido (Fmoc-N-MePhe-OH, 4 equiv., 400 μηηοΐε, 161 mg), PyBOP (4 equiv., 400 μηηοΐε, 208 mg) y HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF (1 -3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 μί). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 .5 h. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó a fondo. La extensión del acoplamiento se comprobó por el ensayo colorimétrico de ninhidrina. El grupo Fmoc se eliminó con 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno. Se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU, tolueno, piperidina, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 5 min) para asegurar la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias.
El derivado de aminoácido protegido del segundo aminoácido se acopló al primer aminoácido ya anclado a la resina utilizando el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el aminoácido protegido (Fmoc-N-MePhe-OH, 4 equiv., 400 μηηοΐε, 161 mg), PyBOP (4 equiv., 400 μηηοΐε, 208 mg) y HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF (1 -3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 μΙ_). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 .5 h. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó a fondo y el acoplamiento se repitió dos veces más. La extensión del acoplamiento se comprobó por el test de De Clercq. El grupo Fmoc se eliminó con 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno. Se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU, tolueno, piperidina, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 5 min) para asegurar la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias. El mismo protocolo se utilizó para acoplar el tercer y cuarto derivado de aminoácido. La acetilación se realizó en fase sólida utilizando un protocolo estándar de
Ac2O (50 equiv., 5 mmols, 471 μΐ) y DIEA (50 equiv., 5 mmols, 850 μΐ) durante 20 min. La etapa de escisión se realizó por tratamiento de la resina con TFA 2% en DCM (6 x 3 min). El filtrado se colectó y el DCM se evaporó bajo N2. El residuo se disolvió en H2O: MeCN (1 :1 ) y se liofilizó. Para eliminar las sales se realizó un paso de desalado utilizando la resina DOWEX MR-3
Mixed Bed toda la noche.
Caracterización del producto: HPLC de fase inversa: gradiente lineal de 0 a 100% MeCN en 15 minutos utilizando una columna Symmetry d8 (150 x 4.6 Γτιηπ χ δ μΐ , 100 Á, Waters), Ac-(N-MePhe)4-CONH2 tr: 12.2 min .
Espectrometría de masas (MALDI-TOF): Ac-(N-MePhe)4-CONH2 (M+Na)+: 726.9. Rendimiento: Ac-(N-MePhe)4-CONH2 32.8%. Ejemplo Comparativo 2: Preparación de Ac-(Pro)4-CONH?
La síntesis se realizó en una escala 1 00 μηηοΐβε. Para el acoplamiento del primer aminoácido a la resina sieber se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el derivado de aminoácido del primer aminoácido (Fmoc-Pro-OH, 4 equiv., 400 μηηοΐε, 1 35 mg), PyBOP (4 equiv., 400 μηηοΐε, 208 mg) y HOAt (1 2 equiv., 1 .2 mmols, 1 63 mg) disueltos en DMF (1 -3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (1 2 equiv., 1 .2 mmols, 204 μΙ_). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 .5 h. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó a fondo. La extensión del acoplamiento se comprobó por el ensayo colorimétrico de ninhidrina. El grupo Fmoc se eliminó con 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 1 0 minutos cada uno. Se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU, tolueno, piperidina, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 5 min) para asegurar la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias.
El derivado de aminoácido protegido del segundo aminoácido se acopló al primer aminoácido ya anclado a la resina utilizando el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el aminoácido protegido (Fmoc-Pro-OH, 4 equiv., 400 μηηοΐε, 135 mg), PyBOP (4 equiv., 400 μηηοΐε, 208 mg) y HOAt (1 2 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF (1 -3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (1 2 equiv., 1 .2 mmols, 204 μΐ). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 .5 h. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó a fondo y el acoplamiento se repitió dos veces más. La extensión del acoplamiento se comprobó por el test de De Clercq El grupo Fmoc se eliminó con 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 1 0 minutos cada uno. Se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU, tolueno, piperidina, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 5 min) para asegurar la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias.
El mismo protocolo se utilizó para acoplar el tercer y cuarto derivado de aminoácido.
La acetilación se realizó en fase sólida utilizando un protocolo estándar de Ac2O (50 equiv., 5 mmols, 471 μΐ) y DIEA (50 equiv., 5 mmols, 850 μΐ) durante 20 min. La etapa de escisión se realizó por tratamiento de la resina con TFA 2% en DCM (6 x 3 min). El filtrado se colectó y el DCM se evaporó bajo N2. El residuo se disolvió en H2O: MeCN (1 :1 ) y se liofilizó. Para eliminar las sales se realizó un paso de desalado utilizando la resina DOWEX MR-3 Mixed Bed toda la noche. Caracterización del producto: HPLC de fase inversa: gradiente lineal de 0 a 100% MeCN en 15 minutos utilizando una columna Symmetry d8 (150 x 4.6 mm x 5 μητι, 100 Á, Waters), Ac-(Pro)4-CONH2 tr: 5.4 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): Ac-(Pro)4-CONH2 (M+Na)+: 470.2. Rendimiento: Ac- (Pro)4-CONH2 15.2%.
Ejemplo Comparativo 3: Preparación de Ac-P-(N-MePhe)^-CONH? (P = Cha (3a) v de P = 2Nal (3b))
La síntesis se realizó en una escala 100 μηηοΐβε. Para el acoplamiento del primer aminoácido a la resina sieber se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el derivado de aminoácido del primer aminoácido (Fmoc-N-MePhe-OH, 4 equiv., 400 μηηοΐε, 161 mg), PyBOP (4 equiv., 400 μηηοΐε, 208 mg) y HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF (1 - 3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 μΙ_). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 .5 h. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó a fondo. La extensión del acoplamiento se comprobó por el ensayo colorimétrico de ninhidrina. El grupo Fmoc se eliminó con 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno. Se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU, tolueno, piperidina, DMF (5%, 5%, 20%,
70%) (2 x 5 min) para asegurar la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias.
El derivado de aminoácido protegido del segundo aminoácido se acopló al primer aminoácido ya anclado a la resina utilizando el siguiente protocolo: se añadieron secuencialmente el aminoácido protegido (Fmoc-N-MePhe-OH, 4 equiv., 400 μηηοΐε, 161 mg), PyBOP (4 equiv., 400 μηηοΐε, 208 mg) y HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF (1 -3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 μί). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 .5 h. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó a fondo y el acoplamiento se repitió dos veces más. La extensión del acoplamiento se comprobó por el test de De Clercq. El grupo Fmoc se eliminó con 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno. Se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU, tolueno, piperidina, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 5 min) para asegurar la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias. El mismo protocolo se utilizó para acoplar el tercer derivado de aminoácido.
Para el acoplamiento del cuarto derivado de aminoácido se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el aminoácido protegido (Fmoc-Cha-OH, 4 equiv., 400 μηηοΐε, 157 mg) o (Fmoc-2Nal-OH, 4 equiv., 400 μηηοΐε, 141 mg), PyBOP (4 equiv., 400 μηηοΐε, 208 mg) y HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF (1 -3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 μΙ_). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 .5 h. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó a fondo y el acoplamiento se repitió dos veces más. La extensión del acoplamiento se comprobó por el test de De
Clercq. El grupo Fmoc se eliminó con 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno.
La acetilación se realizó en fase sólida utilizando un protocolo estándar de Ac2O (50 equiv., 5 mmols, 471 μΐ) y DIEA (50 equiv., 5 mmols, 850 μΐ) durante 20 min. La etapa de escisión se realizó por tratamiento de la resina con TFA 2% en DCM (6 x 3 min). El filtrado se colectó y el DCM se evaporó bajo N2. El residuo se disolvió en H2O: MeCN (1 :1 ) y se liofilizó. Para eliminar las sales se realizó un paso de desalado utilizando la resina DOWEX MR-3 Mixed Bed toda la noche.
Caracterización del producto (Ejemplo comparativo 3a): HPLC de fase inversa: gradiente lineal de 0 a 100% MeCN en 15 minutos utilizando una columna Symmetry d8 (150 x 4.6 mm x 5 μητι, 100 Á, Waters), Ac-Cha-(N- MePhe)3-CONH2 tr: 12.9 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): Ac-
Cha-(N-MePhe)3-CONH2 (M+Na)+: 718.4. Rendimiento: Ac-Cha-(N-MePhe)3- CONH2 1 1 .8%.
Caracterización del producto (Ejemplo comparativo 3b): HPLC de fase inversa: gradiente lineal de 0 a 100% MeCN en 8 minutos utilizando una columna Symmetry Cíe (150 x 4.6 mm x 5 μηη, 100 Á, Waters), Ac-2Nal-(N- MePhe)3-CONH2 tr: 5.8 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): Ac- 2Nal-(N-MePhe)3-CONH2 (M+Na)+: 740.5. Rendimiento: Ac-2Nal-(N- MePhe)3-CONH2 32.4%.
Ejemplo Comparativo 4: Preparación de L-Dopa-P-(N-MePhe):rCONH? (P= N-MePhe (4a). de P= Cha (4b) v de P= 2Nal (4c))
La síntesis se realizó en una escala 100 μηηοΐβε. Para el acoplamiento del primer aminoácido a la resina sieber se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el derivado de aminoácido del primer aminoácido (Fmoc-N-MePhe-OH, 4 equiv., 400 μηηοΐε, 161 mg), PyBOP (4 equiv., 400 μηηοΐε, 208 mg) y HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF (1 - 3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 μΙ_). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1.5 h. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó a fondo. La extensión del acoplamiento se comprobó por el ensayo colorimétrico de ninhidrina. El grupo Fmoc fue eliminado con 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno. Se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU, tolueno, piperidina, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 x 5 min) para asegurar la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias.
El derivado de aminoácido protegido del segundo aminoácido se acopló al primer aminoácido ya anclado a la resina utilizando el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el aminoácido protegido (Fmoc-N-MePhe-OH, 4 equiv., 400 μηηοΐε, 161 mg), PyBOP (4 equiv., 400 μηηοΐε, 208 mg) y HOAt
(12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF (1 -3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 μί). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1.5 h. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó a fondo y el acoplamiento se repitió dos veces más. La extensión del acoplamiento se comprobó por el test de De
Clercq. El grupo Fmoc se eliminó con 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno. Se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU, tolueno, piperidina, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 5 min) para asegurar la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias. El mismo protocolo se utilizó para acoplar el tercer derivado de aminoácido. Para el acoplamiento del cuarto derivado de aminoácido se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el aminoácido protegido 4 equiv., 400 μηηοΐε (Fmoc-N-MePhe-OH, 161 mg) (Fmoc-Cha-OH, 157 mg) o (Fmoc-2Nal-OH, 175 mg), PyBOP (4 equiv., 400 μηηοΐε, 208 mg) y HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF (1 -3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 μΙ_). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 .5 h. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó a fondo y el acoplamiento se repitió dos veces más. La extensión del acoplamiento se comprobó por el test de De Clercq. El grupo Fmoc se eliminó con 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno. En el caso de N-MePhe, se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU, tolueno, piperidina, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 x 5 min) para asegurar la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias.
Para el acoplamiento del cargo (levodopa) a la resina se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el cargo-COOH (Fmoc-L-Dopa-OH) (4 equiv., 400 μηηοΐε, 167 mg) en DMF (1-3 mL/g resina), PyBOP (4 equiv., 400 μηηοΐε, 208 mg) y HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) a la resina seguido de 12 equiv. DIEA (1 .2 mmols, 204 μί). La mezcla se dejó
reaccionar con agitación manual intermitente durante 2 h. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó a fondo y el acoplamiento se repitió una vez. La extensión del acoplamiento se controló por el test de Kaiser. El grupo Fmoc se eliminó con 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno.
La etapa de escisión se realizó por tratamiento de la resina con TFA 2% en DCM (6 x 3 min). El filtrado se colectó y el DCM se evaporó bajo N2. El residuo se disolvió en H2O: MeCN (1 : 1 ) y liofilizado.
Caracterización del producto: HPLC de fase inversa: gradiente lineal de 0 a 100% MeCN en 15 minutos utilizando una columna Symmetry d8 (150 x 4.6 mm x 5 μητι, 100 Á, Waters), Ejemplo Comparativo 4a: L-Dopa-N-MePhe-(N- MePhe)3-CONH2 tr: 8.8 min; Ejemplo Comparativo 4b: L-Dopa-Cha-(N- MePhe)3-CONH2 tr: 9.5 min; Ejemplo Comparativo 4c: L-Dopa-2Nal-(N-
MePhe)3-CONH2 tr: 9.3 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): Ejemplo Comparativo 4a: L-Dopa-N-MePhe-(N-MePhe)3-CONH2 (M+Na)+: 863.5; Ejemplo Comparativo 4b: L-Dopa-Cha-(N-MePhe)3-CONH2 (M+Na)+: 855.5; Ejemplo Comparativo 4c: L-Dopa-2Nal-(N-MePhe)3-CONH2 (M+Na)+: 899.6. Rendimiento: Ejemplo Comparativo 4a: L-Dopa-N-MePhe-(N-MePhe)3- CONH2 5.4%; Ejemplo Comparativo 4b: L-Dopa-Cha-(N-MePhe)3-CONH2 10.6%; Ejemplo Comparativo 4c: L-Dopa-2Nal-(N-MePhe)3-CONH2 26%.
Ejemplo Comparativo 5: Preparación de Nip-P-(N-MePhe) -CONH? (P= N- MePhe (5a). de P= Cha (5b) v de P= 2Nal (5c)) La síntesis se realizó en una escala 100 μηηοΐβε. Para el acoplamiento del primer aminoácido a la resina sieber se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el derivado de aminoácido del primer aminoácido (Fmoc-N-MePhe-OH, 4 equiv., 400 μηηοΐε, 161 mg), PyBOP (4 equiv., 400 μηηοΐε, 208 mg) y HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF (1 -3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 μΙ_). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 .5 h. El disolvente se eliminó por succión, la resina lavada a fondo. La extensión del acoplamiento se comprobó por el ensayo colorimétrico de ninhidrina. El grupo Fmoc se eliminó con 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno. Se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU, tolueno, piperidina, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 5 min) para asegurar la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias.
El derivado de aminoácido protegido del segundo aminoácido se acopló al primer aminoácido ya anclado a la resina utilizando el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el aminoácido protegido (Fmoc-N-MePhe-OH, 4 equiv., 400 μηηοΐε, 161 mg), PyBOP (4 equiv., 400 μηηοΐε, 208 mg) y HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF (1 -3 ml/g resina a la resina seguidos de DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 μΐ). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 .5 h. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó a fondo y el acoplamiento se repitió dos veces más. La extensión del acoplamiento se comprobó por el test de De Clercq. El grupo Fmoc se eliminó con 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno. Se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU, tolueno, piperidina, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 5 min) para asegurar la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias. El mismo protocolo se utilizó para acoplar el tercer derivado de aminoácido. Para el acoplamiento del cuarto derivado de aminoácido se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el aminoácido protegido 4 equiv., 400 μηηοΐε (Fmoc-N-MePhe-OH, 161 mg) (Fmoc-Cha-OH, 157 mg) o (Fmoc-2Nal-OH, 175 mg), PyBOP (4 equiv., 400 μηηοΐε, 208 mg) y HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF (1 -3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12 equiv., 1 .2 mmols, 204 μΙ_). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1 .5 h. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó a fondo y el acoplamiento se repitió dos veces más. La extensión del acoplamiento se comprobó por el test de De
Clercq. El grupo Fmoc se eliminó con 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno. En el caso de N-MePhe, se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU, tolueno, piperidina, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 x 5 min) para asegurar la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias.
Para el acoplamiento del cargo (ácido nipecótico) a la resina se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el cargo-COOH (Fmoc-L- Nip-OH) (4 equiv., 400 μηηοΐε, 140 mg) en DMF (1-3 mL/g resina), PyBOP (4 equiv., 400 μηηοΐε, 208 mg) y HOAt (12 equiv., 1 .2 mmols, 163 mg a la resina seguido de 12 equiv. DIEA (1 .2 mmols, 204 μί). La mezcla se dejó
reaccionar con agitación manual intermitente durante 2h. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó a fondo y el acoplamiento se repitió una vez. La extensión del acoplamiento se controló por el test de Kaiser. El grupo Fmoc se eliminó con 20 % (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno.
La etapa de escisión se realizó por tratamiento de la resina con TFA 2% en DCM (6 x 3 min). El filtrado se colectó y el DCM se evaporó bajo N2. El residuo se disolvió en H2O: MeCN (1 :1 ) y liofilizado.
Caracterización del producto: HPLC de fase inversa: gradiente lineal de 0 a 100% MeCN en 8 minutos utilizando una columna Sunfire d8 (100 x 4.6 mm x 3.5 μητι, 100 Á, Waters), Ejemplo Comparativo 5a: Nip-N-MePhe-(N- MePhe)3-CONH2 tr: 5.3 min; Ejemplo Comparativo 5b: Nip-Cha-(N-MePhe)3- CONH2 tr: 5.5 min; Ejemplo Comparativo 5c: Nip-2Nal-(N-MePhe)3-CONH2 tr: 5.4 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): Ejemplo Comparativo 5a: Nip-N-MePhe-(N-MePhe)3-CONH2 (M+Na)+: 795.4; Ejemplo Comparativo 5b: Nip-Cha-(N-MePhe)3-CONH2 (M+Na)+: 787.4; Ejemplo Comparativo 5c: Nip- 2Nal-(N-MePhe)3-CONH2 (M+Na)+: 831 .4. Rendimiento: Ejemplo
Comparativo 5a: Nip-N-MePhe-(N-MePhe)3-CONH2 90%; Ejemplo
Comparativo 5b: Nip-Cha-(N-MePhe)3-CONH2 91 %; Ejemplo Comparativo 5c: Nip-2Nal-(N-MePhe)3-CONH2 75%.
Ejemplo 8: Evaluación del transporte BBB utilizando el ensayo paralelo de permeabilidad en membrana artificial (PAMPA)
El método de evaluación escogido para probar que los compuestos de fórmula (I) de la invención son BBB-lanzaderas capaces de cruzar cargos por difusión pasiva es el ensayo paralelo de permeabilidad en membrana artificial (PAMPA), el cual permite predecir o evaluar solo este mecanismo de transporte. En términos generales, este método es simple, automatizable con alta eficacia, tiene un bajo coste y requiere solo una cantidad pequeña de compuesto a testar. El método PAMPA originariamente introducido por Kansy en Roche utiliza una membrana artificial en forma de bicapas de fosfolípidos soportadas en un filtro (cf. M. Kansy et al., " Physicochemical high throughput screening: Parallel artificial membrane permeability assay in the description of the absorption processes" J. Med. Chem. 1998, vol. 41 , pp. 1007-1010). La membrana de fosfolípidos mimetiza la membrana celular, pero no tiene los medios para el transporte activo o paracelular de las moléculas fármaco. Es una herramienta muy práctica para evaluar el transporte de compuestos por difusión pasiva. Esta técnica permite la evaluación de compuestos puros, crudos e incluso mezclas de compuestos.
El ensayo PAMPA se utiliza para determinar la capacidad de las
construcciones BBB lanzadera-cargo para cruzar la BBB por difusión pasiva. La permeabilidad efectiva de los compuestos se midió por triplicado a una concentración inicial de 200 μΜ. La solución tampón se preparó a partir de la concentrada comercializada por plON siguiendo sus indicaciones. El pH fue ajustado a 7.4 utilizando una solución NaOH 0.5M. El compuesto de interés se disolvió en solución tampón y 2-propanol (20%, cosolvente) a la
concentración deseada (200 μΜ). El sándwich de PAMPA se separó y el pocilio donador se rellenó con 200 μΙ_ de la solución del compuesto a estudiar. La placa aceptora se colocó en la placa donadora asegurándose que la parte inferior de la membrana estuviera en contacto con el tampón. 4 μί de mezcla de fosfolípidos (20mg/mL) en dodecano se añadieron a cada pocilio y 160 μΐ de la solución tampón y 40}L de 1 -propanol se añadieron a cada pocilio aceptor. La placa se cubrió e incubó a temperatura ambiente en una atmósfera saturada de humedad durante 4 horas bajo agitación orbital de 100 rpm. Después de 4 horas, 150 L/pocillo de la placa donadora y 150 L/pocillo de la placa aceptora se transfirieron a viales de HPLC y 100 L/cada muestra se inyectaron en una columna de HPLC fase inversa, columna Symmetry d8 (150 x 4.6 mm x 5 μητι, 100 Á, Waters). El transporte también se confirmó por espectrometría MALDI-TOF y HPLC-MS de alícuotas de los pocilios aceptores. La mezcla de fosfolípidos utilizada es un extracto polar de lípidos de cerebro porcino.
Composición: fosfatidilcolina (PC) 12.6%, fosfatidiletanolamina (PE) 33.1 %, fosfatidilserina (PS) 18.5%, fosfatidilinositol (Pl) 4.1 %, ácido fosfatídico 0.8% y 30.9 % de otros compuestos. La permeabilidad efectiva se calculó utilizando la siguiente ecuación:
Figure imgf000041_0001
donde:
t tiempo (horas)
CA(t) Concentración de compuesto en el pocilio aceptor a tiempo t
CD(to) Concentración de compuesto en el pocilio donador a 0 h
Como control, se evaluó en paralelo el transporte de propranolol y se calculó el balance de materia para todos los compuestos estudiados para detectar si tenía lugar retensión de compuesto en los fosfolípidos.
Los diferentes compuestos se evaluaron por ensayo PAMPA. El ensayo PAMPA solo mide el transporte por difusión pasiva, así el transporte positivo medido para estos compuestos indica que estos compuestos tienen un transporte positivo a través de la BBB in vivo por difusión pasiva. En las Tablas 2, 3 y 4, se puede ver como el uso de la construcción BBB lanzadera-cargo permite que cargos que no cruzan por ellos mismos, como el ácido nipecótico y la dopamina, pueden ahora cruzar la membrana por difusión pasiva.
Tabla 2: Permeabilidad efectiva (Pe) y porcentaje de transporte después de 4h encontrada en el ensayo PAMPA para las versiones acetiladas de las BBB- lanzaderas basadas en PhPro. Como controles Ac-(N-MePhe)4-CONH2 (Ejemplo Comparativo 1 ) y Ac-(Pro)4-CONH2 (Ejemplo Comparativo 2).
Figure imgf000042_0001
Tabla 3: Permeabilidad efectiva (Pe) y porcentaje de transporte después de 4h encontrada en el ensayo PAMPA para las construcciones BBB- lanzaderas con ácido nipecótico como cargo. El ácido nipecótico no se detectó en el pocilio aceptor del ensayo PAMPA después de 4 h.
Ejemplo Comparativo 5a: Nip-N-MePhe-(N-MePhe)3-CONH2 tr: 5.3 min;
Ejemplo Comparativo 5b: Nip-Cha-(N-MePhe)3-CONH2 tr: 5.5 min; Ejemplo Comparativo 5c: Nip-2Nal-(N-MePhe)3-CONH2 tr: 5.4 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF): Referencia Compuesto Pe Transporte compuesto (x 1 06) (%) (4h) cm/s
(lia) Nip-Cha-(PhPro)3-CONH2 6.1 1 1 .4
(lie) Nip-PhPro-(PhPro)3-CONH2 9.8 16.7
(He) Nip-2Nal-(PhPro)3-CONH2 9.7 16.2
Cargo Ácido nipecótico —
Ejemplo
Nip- N-MePhe-(N-MePhe)3-CONH2 1 .4 2.8
Comparativo 5a
Ejemplo
Nip-Cha-(N-MePhe)3-CONH2 1 .2 2.5
Comparativo 5b
Ejemplo
Nip-2Nal-(N-MePhe)3-CONH2 1 .1 2.4
Comparativo 5c
Tabla 4: Permeabilidad efectiva (Pe) y porcentaje de transporte después de 4h encontrada en el ensayo PAMPA para las construcciones BBB- lanzaderas con L-Dopa como cargo. Dopamina y L-Dopa no se detectaron en el pocilio aceptor del ensayo PAMPA después de 4 h.
Referencia Compuesto Pe Transporte compuesto (x 106) (%) (4h) cm/s
(llb) L-Dopa-Cha-(PhPro)3-CONH2 1 .2 2.4
(lid) L-Dopa- PhPro-(PhPro)3-CONH2 9.4 16
(llf) L-Dopa- 2Nal-(PhPro)3-CONH2 9.3 15.9
Ejemplo L-Dopa-Cha-(N-MePhe)3-CONH2 0.7 1 .4
Comparativo 4b
Ejemplo L-Dopa-2Nal-(N-MePhe)3-CONH2 0.3 0.7
Comparativo 4c
Ejemplo L-Dopa- N-MePhe-(N-MePhe)3- 1 .1 2.4
Comparativo 4a CONH2 Dopamina o L-Dopa y ácido nipecótico son cargos difíciles que no pueden cruzar la BBB por difusión pasiva en absoluto. Las construcciones BBB lanzadera-cargo basadas en PhPro han sido óptimas para hacer cruzar estos cargos. De los resultados comparativos anteriores se puede derivar que los compuestos de la invención son claramente mejores BBB-lanzaderas que los compuestos más próximos del estado de la técnica.
Ejemplo 5: Solubilidad en agua
Para establecer la solubilidad en agua de las BBB-lanzaderas se realizaron los ensayos siguientes. En un vial se pesaron 5 mg de cada versión acetilada de la BBB-lanzadera. Entonces se añadieron 1 ml_ H2O y la muestra se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. Después de este periodo de tiempo, las muestras se filtraron y un volumen conocido del sobrenadante se liofilizó y se redisolvió en el mismo volumen de H2O: MeCN (1 :1 ) entonces, 50 μΙ_ se inyectaron en el HPLC. Utilizando una curva de calibrado, se cuantificó la concentración de la muestra. En la Tabla 5, se puede ver como las BBB-lanzaderas basadas en PhPro tienen una mejor solubilidad en agua a temperatura ambiente.
Tabla 5: Solubilidad en agua a temperatura ambiente.
Referencia Compuesto Máxima Solubilidad en compuesto agua
Ejemplo Ac-(N-MePhe)-(/V-MePhe)3-
<1 μΜ
Comparativo 1 CONH2
(la) Ac-PhPro-(PhPro)3-CONH2 725 μΜ
Ejemplo
Ac-Cha-(A/-MePhe)3-CONH2 38 μΜ
Comparativo 3a
(Ib) Ac-Cha-(PhPro)3-CONH2 239μΜ
Ejemplo
Ac-2Nal-(/V-MePhe)3-CONH2 4 JJM
Comparativo 3b
(le) Ac-2Nal-(PhPro)3-CONH2 15 JJ Estos resultados muestran que los compuestos de fórmula (I) de la invención son mucho más solubles en agua que los compuestos lanzadera más próximos del estado de la técnica. Así, el compuesto (Ib) es seis veces más soluble que el compuesto lanzadera más próximo del estado de la técnica descrito por Morteza et al., el compuesto (la) es unas setecientas veces más soluble que el compuesto lanzadera más próximo del estado de la técnica descrito por Morteza et al., y el compuesto (le) es unas cuatro veces más soluble que el compuesto lanzadera más próximo del estado de la técnica descrito por Morteza et al .

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Compuesto de fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, incluyendo cualquier estereoisómero o mezclas de estereoisómeros,
Figure imgf000046_0001
(I) donde:
R-i , R2 y R3 se seleccionan independientemente entre el grupo formado por: H y (CH2)q-R6;
R4 es un C-radical derivado de uno de los sistemas de anillo conocidos con 1 -4 anillos; los anillos siendo saturados, parcialmente insaturados o aromáticos; los anillos siendo aislados o parcialmente/totalmente fusionados y teniendo 5-6 miembros; cada miembro siendo independientemente seleccionado entre C, CH, CH2, N, NH, O, y S; los átomos de hidrógeno de estos miembros estando opcionalmente sustituidos por sustituyentes seleccionados entre (d-C6)-alquilo, (CrC6)-alcoxilo y halógeno;
Figure imgf000046_0002
R6 es un C-radical derivado de uno de los sistemas de anillo conocidos con 1 -2 anillos; los anillos siendo saturados, parcialmente insaturados o aromáticos; los anillos siendo aislados o parcialmente/totalmente fusionados y teniendo 5-6 miembros; cada miembro siendo independientemente seleccionado entre C, CH, CH2, N, NH, O, y S; los átomos de hidrógeno de estos miembros estando opcionalmente sustituido por sustituyentes seleccionados entre (CrC6)-alquilo, (CrC6)-alcoxilo y halógeno; X es un birradical seleccionado entre el grupo formado por -NH-(CH2)r-CO-, -CO(CH2)rCO-, -S-(CH2) r-, -S-(CH2)r-CO-, -O-(CH2)r- y -O-(CH2)r-CO-; Y se selecciona entre el grupo formado por -NH2, -OH, -OR7 y -NHR7; k es un entero de 0 a 2; m es un entero de 0 a 1 ; n es un entero de 2 a 10; q es un entero de 0 a 1 ; r es un entero de 1 a 3;
R7 es un radical (CrC6)-alquilo; a condición de que al menos un radical R seleccionado entre R-i, R2 y R3 es un radical (CH2)q-R6 y con la condición de que cuando el birradical X es -CO(CH2)rCO-, entonces R5 es H.
2. Compuesto según la reivindicación 1 , donde n es un entero de 2 a 4.
3. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 -2, donde Y es -NH2.
4. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, donde los miembros del anillo en R6, en R4, o tanto en R6 como en R4 se seleccionan entre C, CH, y CH2.
5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, donde R-i, R2 y R3 se seleccionan entre el grupo formado por H, fenilo, ciclohexilo y 2-naftilo.
6. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 -3 ó 5, donde Ri y R2 son H.
7. Compuesto según la reivindicación 6, donde R3 es fenilo.
8. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 -7, donde R4 selecciona entre el grupo formado por H, fenilo, ciclohexilo y 2-naftilo.
9. Compuesto de fórmula (I) que se selecciona de la siguiente lista:
Ac-PhPro-(PhPro)3-CONH2; Ac-Cha-(PhPro)3-CONH2; y
Ac-2Nal-(PhPro)3-CONH2.
10. Construcción de fórmula (II), o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, incluyendo cualquier estereoisómero o mezclas de estereoisómeros,
Figure imgf000048_0001
(II) donde: R-i , R2, R3, R4, X, Y, k, m, y n son como se definen en la reivindicación 1 ; y Z es un radical derivado de una sustancia susceptible de formar un enlace amida o un enlace éster o un enlace disulfuro con X , dicha sustancia siendo incapaz de atravesar la barrera hematoencefálica (BBB) por sí misma.
1 1 . Construcción según la reivindicación 10, donde n es un entero de 2 a 4.
12. Construcción según cualquiera de las reivindicaciones 10-1 1 , donde Y es -NH2.
13. Construcción según cualquiera de las reivindicaciones 10-12, donde los miembros del anillo en R6, en R4, o tanto en R6 como en R4 se seleccionan entre C, CH, y CH2..
14. Construcción según cualquiera de las reivindicaciones 10-12, donde R-i , R2 y R3, son independientemente seleccionados entre el grupo formado por H, fenilo, ciclohexilo y 2-naftilo.
15. Construcción según cualquiera de las reivindicaciones 10-12 o 14, donde
Figure imgf000049_0001
16. Construcción según la reivindicación 15, donde R3 es fenilo.
17. Construcción según cualquiera de las reivindicaciones 10-16, donde R4 se selecciona entre el grupo formado por fenilo, ciclohexilo y 2-naftilo.
18. Construcción según cualquiera de las reivindicaciones 10-17, donde Z es un radical derivado de un principio activo farmacéutico seleccionado entre el grupo formado por agentes antiretrovirales, agentes anticancerígenos, agentes anti-psicóticos, agentes antineurodegenerativos y agentes
antiepilépticos.
19. Construcción según la reivindicación 18, donde el principio activo farmacéutico es dopamina.
20. Construcción según la reivindicación 18, donde el principio activo farmacéutico es el ácido nipecótico.
21 . Composición farmacéutica que comprende una cantidad
terapéuticamente efectiva de la construcción como se define en cualquiera de las reivindicaciones 10-20, junto con cantidades apropiadas de
excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables.
22. Uso de un compuesto de fórmula (I), tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 -9, como lanzadera a través de la barrera
hematoencefálica.
23. Construcción de fórmula (II) tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 10-20, para su uso como medicamento.
24. Uso de la construcción tal como se define en la reivindicación 19, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.
25. Uso de la construcción tal como se define en la reivindicación 20, para la preparación de un medicamento como anticonvulsivo.
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Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MALAKOUTIKHAH, M. ET AL.: "N-Methyl phenylalanine rich peptides as highly versatile blood brain barrier shuttles", J. MED. CHEM., vol. 53, 2010, pages 2354 - 2363 *
MORADI, M.: "A classical molecular dynamics investigation of the free energy and structurre of short polyproline conformers", JOURNAL OF CHEMICAL PHYSICS, vol. 133, no. 12, 2010, pages 125104/1 - 125104/18 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013127829A1 (en) 2012-02-27 2013-09-06 Universitat De Barcelona Protease-resistant compounds useful as shuttles through the blood-brain barrier and shuttle-cargo constructs
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