ES2372847A1 - Compuestos útiles como lanzaderas a través de la barrera hematoencefálica y construcciones lanzadera-cargo. - Google Patents
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Abstract
Compuestos útiles como lanzaderas a través de la
barrera hematoencefálica y construcciones
lanzadera-cargo.
Compuestos de fórmula (I), donde, R_{1}
R_{2} y R_{3} son independientemente seleccionados entre: H y un
(CH_{2})_{q}-R_{6}, R_{4} es un
C-radical derivado de uno de los sistemas de anillo
conocidos con 1-4 anillos; R_{5} es H o
CH_{3}CO-;
R_{6} es un C-radical derivado de uno de los sistemas de anillo conocidos con 1-2 anillos; X se selecciona entre -NH-(CH_{2})_{r}-CO-, -CO(CH_{2})_{r}CO-, -S-(CH_{2})_{r}-, -S-(CH_{2})_{r}-CO-,
-O-(CH_{2})_{r}- y -O-(CH_{2})_{r}-CO-; Y es –NH_{2}, -OH, -OR_{7} o
-NHR_{7}; k es un entero de 0 a 1; m es un entero de 0 a 1; n es un entero de 2 a 10; q es un entero de O a 1; r es un entero de 1 a 3; R_{7} es un radical (C_{1}-C_{6})-alquilo; con la condición de que al menos un radical R seleccionado entre R_{1} R_{2} y R_{3} es (CH_{2})_{q}-R_{6} y con la condición de que cuando X es -CO(CH_{2})_{r}CO-, R_{5} es H, son útiles como lanzaderas a través de la barrera hematoencefálica (BBB). Las construcciones BBB-lanzadera-cargo, son útiles como medicamentos.
R_{6} es un C-radical derivado de uno de los sistemas de anillo conocidos con 1-2 anillos; X se selecciona entre -NH-(CH_{2})_{r}-CO-, -CO(CH_{2})_{r}CO-, -S-(CH_{2})_{r}-, -S-(CH_{2})_{r}-CO-,
-O-(CH_{2})_{r}- y -O-(CH_{2})_{r}-CO-; Y es –NH_{2}, -OH, -OR_{7} o
-NHR_{7}; k es un entero de 0 a 1; m es un entero de 0 a 1; n es un entero de 2 a 10; q es un entero de O a 1; r es un entero de 1 a 3; R_{7} es un radical (C_{1}-C_{6})-alquilo; con la condición de que al menos un radical R seleccionado entre R_{1} R_{2} y R_{3} es (CH_{2})_{q}-R_{6} y con la condición de que cuando X es -CO(CH_{2})_{r}CO-, R_{5} es H, son útiles como lanzaderas a través de la barrera hematoencefálica (BBB). Las construcciones BBB-lanzadera-cargo, son útiles como medicamentos.
Description
Compuestos útiles como lanzaderas a través de la
barrera hematoencefálica y construcciones
lanzadera-cargo.
Esta invención se refiere a los campos de la
medicina, investigación y diagnóstico, y más específicamente a
compuestos nuevos que actúan como lanzaderas a través de la barrera
hematoencefálica ("blood brain barrier", BBB) para la
liberación de sustancias que no pueden atravesar la BBB por sí
mismas. También se refiere a construcciones BBB
lanzadera-cargo y a su uso como medicamentos.
Muchos de los mayores problemas terapéuticos
actuales requieren el tratamiento del cerebro. Esto incluye
enfermedades neurodegenerativas como el Parkinson y la enfermedad de
Alzheimer, pero también enfermedades del sistema nervioso central
como la esquizofrenia, la epilepsia y el desorden bipolar. También
el cáncer cerebral, el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) y
hasta ciertos aspectos de la obesidad pueden ser incluidas como
dianas farmacológicas localizadas dentro del cerebro. En muchos
casos hay compuestos prometedores para su tratamiento, pero debido a
sus problemas de transporte en la BBB más del 98% de estos
medicamentos potenciales no llegan a la etapa de desarrollo.
La BBB es un filtro natural dentro del cuerpo
que sólo permite que ciertas substancias pasen de la sangre al
cerebro. Es un mecanismo de defensa natural diseñado para mantener
las substancias nocivas fuera del cerebro. Controla la composición
del fluido extracelular del cerebro independiente de las
fluctuaciones dentro de la sangre. Es también impermeable para
muchos compuestos ambientales y medicamentos.
La base anatómica de la BBB es primeramente las
uniones herméticas en las células endoteliales de los microvasos
cerebrales. Los microvasos cerebrales forman una membrana continua
sin fenestraciones y las uniones herméticas entre ellas son
responsables de la alta resistencia eléctrica transendotelial.
Transportadores específicos median el acceso de ciertas moléculas
importantes para el cerebro, como la glucosa, aminoácidos aislados e
iones. Otros compuestos o medicamentos son dependientes de la
difusión a través de las bicapas lipídicas de las membranas
endoteliales lo que requiere un cierto grado de lipofilicidad de
estos compuestos.
Hay diferentes campos terapéuticos donde hay la
necesidad de encontrar nuevos medicamentos que puedan cruzar la BBB
para llegar a su sitio diana. Por ejemplo, el cerebro podría servir
de reservorio oculto para la replicación viral del HIV. El HIV en el
cerebro y en el líquido cerebro-espinal podría ser
particularmente resistente a la quimioterapia debido al fracaso de
los medicamentos anti-retrovirales a penetrar la
BBB. El virus puede cruzar la BBB durante la infección primaria o en
un estadio tardío. La infección resultante lleva a un número de
desórdenes del sistema nervioso central como el complejo de demencia
relacionado con el SIDA y la encefalopatía por VIH.
El cáncer cerebral puede ser contado entre las
enfermedades más mortales e intratables. En la actualidad el
tratamiento del cáncer cerebral consiste en cirugía, radioterapia
utilizando rayos X de alta energía u otros tipos de radiación y
quimioterapia utilizando medicamentos anticancerígenos o
citotóxicos. Estos medicamentos anticancerígenos pueden alcanzar las
células cancerígenas donde estén en el cuerpo, pero en el caso de
los tumores cerebrales no todos los medicamentos quimioterapéuticos
son apropiados, porque la mayoría de medicamentos quimioterapéuticos
no pueden cruzar la barrera hematoencefálica (cf. D. Fortín et
al., "Enhanced chemotherapy delivery by intraarterial
infusión and blood brain barrier disruption in malignant brain
tumors", Cancer 2005. vol. 103, pp.
2606-15).
Otro campo de interés son las enfermedades
psiquiátricas, como la esquizofrenia. La esquizofrenia afecta a casi
un 1% de la población. Aunque medicamentos
anti-psicóticos se están utilizando, hay la
necesidad de encontrar nuevos y mejores medicamentos sin los efectos
secundarios no deseados de los existentes. En la búsqueda de estos
medicamentos novedosos la BBB es la barrera que el medicamento
necesitará cruzar para llegar a su sitio diana.
Otro campo de interés son las enfermedades
neurodegenerativas, como la enfermedad de Parkinson. La enfermedad
de Parkinson es uno de los mayores desórdenes neurodegenerativos,
afectando a un 3% de la población mayor de 65 años. Actualmente no
hay terapia preventiva para la enfermedad de Parkinson. El
tratamiento actual consiste en mejorar los síntomas motores por
suplementación del neurotransmisor deficiente dopamina. Como la
dopamina no cruza la BBB, desde los años 60 se ha utilizado un
precursor de la dopamina, la L-dopa, en el
tratamiento de la enfermedad de Parkinson. Sin embargo,
frecuentemente se observan efectos secundarios severos al cabo de
unos pocos años de terapia con L-dopa. La
L-dopa cruza la BBB utilizando el transportador de
aminoácidos y una vez dentro es transformada a dopamina por la
descarboxilasa de L-aminoácidos aromáticos.
Por último, otro campo de interés es la
epilepsia, un síndrome de disfunciones episódicas del cerebro que
afecta a casi un 1% de la población general. Alrededor de un 30% de
las epilepsias se clasifican como sintomáticas ya que son asociadas
a una lesión identificable del sistema nervioso central, mientras
que el resto de ellas no tienen causas identificadas. La terapia
médica actual para la epilepsia es en gran parte sintomática y esta
dirigida a controlar los ataques en individuos afectados. Si los
medicamentos antiepilépticos fallan, la lobectomía temporal, una
operación que implica extirpar la región del cerebro donde se
originan los ataques, proporciona un tratamiento alternativo. Esta
operación es muy exitosa en la mayoría de los casos, pero falla en
algunos, y además muchos individuos son reacios a someterse a
cirugía que implique extirpar partes del cerebro.
En todos estos casos, se conocen muchos
compuestos prometedores para su tratamiento, aunque, debido a sus
problemas de transporte en la BBB, no se desarrollan más. La
investigación en estos campos ha seguido varias aproximaciones.
Algunos métodos de administración de
medicamentos al cerebro sea para terapia o diagnosis son técnicas
invasivas, como la administración intracraneal, la administración
por alteración de la integridad de la BBB o la disrupción osmótica.
Estos métodos implican riesgo de infección y toxicidad, y además
requieren un personal cualificado.
Otra aproximación es la modificación del
medicamento. Estas modificaciones incluyen por ejemplo la reducción
del tamaño del medicamento o el incremento de la lipofilicidad del
medicamento, pero no es siempre posible introducir estas
modificaciones. En el caso de introducir una modificación
irreversible es necesario que no altere la actividad del medicamento
una vez llegue al sitio diana. En el caso de una modificación
bioreversible, es necesario encontrar un enzima o proceso químico
que recupere el medicamento activo una vez el profármaco está dentro
del sistema nervioso central.
Otra aproximación es la administración por
conjugación a un portador biológico. Estas estrategias usan
anticuerpos monoclonales ("Monoclonal
anti-bodies", Mab) que se unen al receptor de
transferrina y sufren una endocitosis mediada por receptor a modo de
caballos de Troya moleculares de los compuestos con un uso
terapéutico que no pueden cruzar la BBB por sí mismos.
Finalmente, otra aproximación comprende una
estrategia mediada por un vector peptídico en la que fármacos no
transportados se unen a péptidos que tienen la capacidad de cruzar
la BBB. C. Rousselle et al., en J. Pharmacol. Exp.
Ther. 2005 vol. 313, pp. 712-719, revelan su uso
para mejorar la absorción al cerebro de varios fármacos, como la
doxorubicina, penicilina, dalargin análogo de encefalina, paclitaxel
y morfina-6-glucurónido. En algunos
casos, esta conjugación incluso aumentó la solubilidad del fármaco y
bordeó la P-glicoproteina, en consecuencia
descartando la necesidad de solubilizantes, que pueden causar
efectos secundarios, e inhibidores de P-gp, que
limitan la aplicación clínica de fármacos.
WO 2008/025867 describe varios compuestos
dicetopiperazinas que actúan como vehículos para la entrega de
principios activos farmacéuticos a través de la BBB debido a que
tienen la capacidad de llevar al cerebro por difusión pasiva
fármacos sin la capacidad de pasar la BBB. También describe las
construcciones lanzadera para liberación de cargos que transportan
por ejemplo fármacos a través de la membrana PAMPA, un modelo in
vitro de BBB.
Finalmente, M. Malakoutikhah et al., en
J. Med. Chem. 2008, vol. 51, pp. 4881-4889,
describe el uso de tres péptidos ricos en N-MePhe,
N-MePhe-(N-MePhe)_{3}-CONH_{2},
Cha-(N-MePhe)_{3}-CONH_{2} y
2Nal-(N-MePhe)_{3}-CONH_{2} como
porteadores que pasan a través de un modelo de barrera
hematoencefálica por difusión pasiva. Además, M. Malakoutikhah et
al., en J. Med. Chem. 2010, vol. 53, pp.
2354-2363, describe el uso de los péptidos
anteriores para transportar a través de la barrera PAMPA una serie
de fármacos no relacionados estructuralmente como el ácido
4-aminobutanoico (GABA), ácido nipecótico (Nip) y el
ácido 5-aminolevulínico (ALA). Desafortunadamente,
estas BBB-lanzaderas muestran una muy baja
solubilidad en agua, una propiedad que influye en las dosis a
administrar.
Así, a pesar de todos los esfuerzos en
investigación invertidos en el pasado, todavía es deseable encontrar
compuestos con utilidad farmacológica o de diagnóstico que puedan
atravesar la BBB.
\vskip1.000000\baselineskip
Los inventores han encontrado nuevos compuestos,
a los que se hace referencia como compuestos "lanzadera", los
cuales tienen la habilidad de atravesar la BBB y son capaces de
introducir en el cerebro fármacos u otras sustancias útiles para el
diagnóstico, a las que se hace referencia como "cargos", que no
pueden atravesar la BBB por sí mismas. Los compuestos lanzadera son
biodegradables y biocompatibles, no tienen toxicidad intrínseca ni
antigenicidad, ya que están hechos de aminoácidos. También muestran
una permeabilidad mejorada y un transporte alto. Además, las
lanzaderas de la presente invención muestran una buena solubilidad
en agua. Esta propiedad permite mejorar la dosis administrada, ya
que será menor la cantidad de solución que contiene la construcción
a ser administrada.
Así, un primer aspecto de la presente invención
se refiere a proporcionar compuestos lanzadera de fórmula (I), o sus
sales farmacéuticamente aceptables, incluyendo estereoisómeros o
mezclas de estereoisómeros,
donde R_{1}, R_{2} y R_{3}
son independientemente seleccionados entre el grupo formado por: H y
(CH_{2})_{q}-R_{6}; R_{4} es un
C-radical derivado de uno de los sistemas de anillo
conocidos con 1-4 anillos; los anillos siendo
saturados, parcialmente insaturados o aromáticos; los anillos siendo
aislados o parcialmente/totalmente fusionados y teniendo
5-6 miembros; cada miembro siendo independientemente
seleccionado entre C, CH, CH_{2}, N, NH, O y S; los átomos de
hidrógeno de estos miembros estando opcionalmente sustituidos por
sustituyentes seleccionados entre
(C_{1}-C_{6})-alquilo,
(C_{1}-C_{6})-alcoxilo y
halógeno; R_{5} es H o CH_{3}CO-; R_{6} es un
C-radical derivado de uno de los sistemas de anillo
conocidos con 1-2 anillos; los anillos siendo
saturados, parcialmente insaturados o aromáticos; los anillos
siendo aislados o parcialmente/totalmente fusionados y teniendo
5-6 miembros; cada miembro siendo independientemente
seleccionado entre C, CH, CH_{2}, N, NH, O y S; los átomos de
hidrógeno de estos miembros estando opcionalmente sustituidos por
sustituyentes seleccionados entre
(C_{1}-C_{6})-alquilo,
(C_{1}-C_{6})-alcoxilo, y
halógeno; X es un birradical seleccionado entre el grupo formado por
-NH-(CH_{2})_{r}-CO-,
-CO(CH_{2})_{r}CO-, -S-(CH_{2})_{r}-,
-S-(CH_{2})_{r}-CO-,
-O-(CH_{2})_{r}- y
-O-(CH_{2})_{r}-CO-; Y se selecciona
entre el grupo formado por -NH_{2}, -OH, -OR_{7} y -NHR_{7}; k
es un entero de 0 a 2; m es un entero de 0 a 1; n es un entero de 2
a 10; q es un entero de 0 a 1; r es un entero de 1 a 3; R_{7} es
un radical
(C_{1}-C_{6})-alquilo; con la
condición de que al menos un radical R seleccionado entre R_{1},
R_{2}, y R_{3} es un radical
(CH_{2})_{q}-R_{6}.
\vskip1.000000\baselineskip
El birradical X está unido a R_{5} y al NH de
la manera siguiente:
R_{5}-NH-(CH_{2})_{r}-CO-NH-,
R_{5}-CO(CH_{2})_{r}CO-NH-,
R_{5}-S-(CH_{2})_{r}-NH-,
R_{5}-S-(CH_{2})_{r}-CO-NH;
R_{5}-O-(CH_{2})_{r}-NH-
y
R_{5}-O-(CH_{2})_{r}-CO-NH-.
Por "sistema de anillo conocido" se
entiende un sistema de anillo descrito en el estado de la técnica,
lo que implica que su estructura es químicamente factible.
Los compuestos de fórmula (I) o sus sales pueden
existir en forma solvatada, así como en formas no solvatadas,
incluyendo formas hidratadas. Así, pueden contener en su estructura
cantidades estequiométricas de disolvente en el caso de solvatos, o
de agua en el caso de hidratos. Se debe entender que esta invención
engloba todas las formas solvatadas, así como las no solvatadas. La
obtención de solvatos e hidratos depende del disolvente utilizado y
de las condiciones de cristalización que pueden ser determinadas por
la persona experta en la materia.
Preferiblemente, los compuestos de fórmula (I)
son aquéllos donde n es un entero de 2 a 6, más preferiblemente de 2
a 5, y aún más preferiblemente de 2 a 4.
En una realización preferida, los compuestos de
fórmula (I) son aquéllos donde Y es -NH_{2}, -OH o -NHR_{7}. En
otra realización más preferida, los compuestos de fórmula (I) son
aquéllos donde Y es -NH_{2}.
En otra realización preferida, los compuestos de
fórmula (I) son aquéllos donde los miembros de los anillos en
R_{6}, en R_{4}, o tanto en R_{6} como en R_{4} son
seleccionados entre C, CH y CH_{2}.
En otra realización preferida, los compuestos de
fórmula (I) son aquéllos donde R_{6} es un
C-radical derivado de uno de los sistemas de anillo
conocidos con 1-2 anillos que son aromáticos.
Preferiblemente, los compuestos de fórmula (I)
son aquéllos donde R_{1}, R_{2} y R_{3} son independientemente
seleccionados del grupo que consiste en H, fenilo, ciclohexilo y
2-naftilo.
En una realización preferida, los compuestos de
fórmula (I) son aquéllos donde R_{1} y R_{2} son H, y R_{3} es
un radical (CH_{2})_{q}-R_{6}. En una
realización más preferida, los compuestos de fórmula (I) son
aquéllos donde R_{3} es fenilo, ciclohexilo o
2-naftilo. En una realización aún más preferida, los
compuestos de fórmula (I) son aquéllos donde R_{3} es fenilo.
Preferiblemente, los compuestos de fórmula (I)
son aquéllos donde R_{4} se selecciona del grupo que consiste en
fenilo, ciclohexilo y 2-naftilo. Los compuestos
preferidos de formula (I) de los mencionados anteriormente son
aquéllos donde R_{4} es ciclohexilo o
2-naftilo.
En una realización particular, los compuestos de
fórmula (I) se seleccionan entre los mencionados anteriormente donde
m es 1. En otra realización particular, los compuestos de fórmula
(I) se seleccionan entre los mencionados anteriormente donde m es
0.
Preferiblemente, los compuestos de fórmula (I)
son aquéllos donde k es 0 o 1.
Los compuestos más preferidos de fórmula (I) son
aquéllos que son seleccionados de la lista siguiente:
Ac-PhPro-(PhPro)_{3}-CONH_{2};
Ac-Cha-(PhPro)_{3}-CONH_{2};
y
Ac-2Nal-(PhPro)_{3}-CONH_{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos de fórmula (I) tienen la
capacidad de transportar al cerebro sustancias, a las que se hace
referencia como cargos, que no pueden atravesar la BBB por sí
mismas. Así, otro aspecto de la invención se refiere al uso de estos
compuestos de fórmula (I) como BBB-lanzaderas. El
uso de estos compuestos hace posible por ejemplo que la
investigación de nuevos fármacos no esté limitada sólo a compuestos
que pueden atravesar la BBB por sí mismos. Tal como se ilustra
mediante ejemplos comparativos, los compuestos de fórmula (I) son
mejores lanzaderas BBB que los compuestos más próximos del estado de
la técnica.
El mecanismo de transporte a través de la BBB de
los compuestos de fórmula (I) es por difusión pasiva, y este
mecanismo es independiente de la configuración L o D de los
aminoácidos. Así, una de las principales ventajas de los compuestos
de fórmula (I) es que se pueden preparar a partir de L o D
aminoácidos o incluso de mezclas racémicas. Esto aumenta la vida
media de las construcciones en el cuerpo, evitando la degradación
por diferentes peptidasas en la sangre o asociadas con los
microvasos cerebrales.
Los compuestos de fórmula (I) tienen grupos
funcionales apropiados para la unión covalente de cargos manteniendo
la actividad original del cargo, hasta que alcanza el lugar de
acción. Así, otro aspecto de la presente invención es proporcionar
construcciones de fórmula (II), o sus sales farmacéuticamente
aceptables, incluyendo cualquier estereoisómero o mezclas de
estereoisómeros, a las que se hace referencia como construcciones
BBB lanzadera-cargo,
donde: R_{1}, R_{2}, R_{3},
R_{4}, X, Y, k, m, y n son como se definen anteriormente; y Z es
un radical derivado de una sustancia susceptible de formar un enlace
amida o un enlace éster o un enlace disulfuro con X, dicha sustancia
siendo incapaz de atravesar la barrera hematoencefálica (BBB) por sí
misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Los valores preferidos de R_{1}, R_{2},
R_{3}, R_{4}, X, Y, k, m, y n para el compuesto de fórmula (I)
son también valores preferidos para la construcción de fórmula
(II).
Las sustancias de las que deriva el radical Z
incluyen una gran variedad de sustancias que tienen utilidad
farmacológica o de diagnóstico. Estas sustancias puede ser
principios activos farmacéuticos, en particular agentes
antiretrovirales, agentes anticancerígenos, agentes
anti-psicóticos, agentes antineurodegenerativos o
agentes antiepilépticos. Ejemplos de principios activos
farmacéuticos son ácido nipecótico y dopamina. La dopamina es un
neurotransmisor clave en el sistema nervioso central, en particular,
la disminución de la dopamina estriatal se asocia con condiciones
clínicas del parkinsonismo. El ácido nipecótico es uno de los más
potentes inhibidores de la recaptación de GABA y también un agonista
del receptor de GABA. Sin embargo, no penetra la BBB.
Ambos compuestos muestran propiedades
interesantes pero no pueden atravesar la barrera hematoencefálica.
En particular, como se ilustra en los ejemplos, las construcciones
de fórmula (II) permiten que tanto la dopamina como el ácido
nipecótico puedan ser útiles como fármacos evitando los efectos
secundarios de la terapia actual, y siendo una técnica sencilla y no
invasiva comparada con las existentes.
Las sustancias de las que deriva Z también
incluyen otras sustancias que sería interesante transportar al
cerebro pero que no lo hacen de manera adecuada solas, por ejemplo
agentes de contraste para resonancia magnética nuclear ("Magnetic
Resonance Imaging", MRI). Entre los aparatos clínicos utilizados
para diagnosticar cáncer, MRI destaca como una potente modalidad de
obtención de imágenes no invasiva ni destructiva que proporciona
imágenes internas de organismos vivos sin límite de profundidad del
análisis y con una resolución de 10-100 \mum. Es
una técnica muy valiosa ampliamente utilizada en investigación y
diagnóstico de cáncer. Para llevar a cabo la MRI se necesitan
agentes de contraste. Los agentes de contraste se pueden utilizar
como métodos de diagnóstico para enfermedades del sistema nervioso
central tales como la enfermedad de Alzheimer, el cáncer cerebral, o
como herramienta para una exploración pre-operativa
con MRI que guiará al cirujano. En todos estos casos el agente de
contraste utilizado necesita atravesar la BBB. Ejemplos de agentes
de contraste incluyen nanopartículas magnéticas tales como
nanopartículas de óxido de hierro superparamagnético. Otros agentes
de diagnóstico incluyen colorantes o sondas fluorescentes tales como
la carboxifluoresceina y derivados, el amarillo lucifer, la rodamina
o el rojo Texas.
Los compuestos lanzadera de fórmula (I) pueden
estar formados por aminoácidos naturales y
no-naturales y/o sus derivados. Los compuestos de
fórmula (I) y las construcciones lanzadera-cargo de
fórmula (II) se pueden generar total o parcialmente por síntesis
química. Aminoácidos apropiados para la preparación de compuestos de
fórmula (I) son disponibles comercialmente. Los compuestos de
fórmula (I) y las construcciones de fórmula (II) se pueden preparar
fácilmente, por ejemplo, según síntesis en fase líquida o,
preferiblemente, métodos de síntesis de péptidos en fase sólida, de
los cuales descripciones generales son ampliamente disponibles (cf.
p. ej. M. Amblard, et al., "Methods and protocols of modern
solid phase peptide synthesis". Molecular Biotechnology
2006, vol. 33, pp. 239-254); o se pueden preparar en
solución por métodos de fase líquida o por cualquier combinación de
fase sólida, fase líquida y química en solución. Por ejemplo,
primero completando la porción BBB-lanzadera y
entonces después de eliminar cualquiera de los grupos protectores si
están presente, por introducción del cargo en solución.
Otro aspecto de la invención se refiere a las
composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad
terapéuticamente efectiva de las construcciones
lanzadera-cargo de fórmula (II) junto con cantidades
apropiadas de excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables.
La persona experta en la materia escogerá la vía de administración
adecuada mediante métodos usuales. La cantidad de la construcción a
ser administrada, la velocidad y el tiempo de administración,
dependerá de la naturaleza y la gravedad de lo que se está tratando.
La naturaleza precisa del portador u otros excipientes dependerá de
la ruta de administración, que puede ser oral, nasal o por
inyección, p. ej. cutánea, subcutánea o intravenosa.
El término "cantidad terapéuticamente
efectiva" como se usa aquí, se refiere a la cantidad de un
compuesto que, cuando se administra, es suficiente para prevenir el
desarrollo de, o aliviar en cierto grado, uno o más de los síntomas
de la enfermedad a la que se dirige. La dosis particular de
compuesto administrado según esta invención será por supuesto
determinada por las condiciones particulares que rodean el caso,
incluyendo el compuesto administrado, la ruta de administración, la
condición particular que se está tratando, y las consideraciones
similares.
El término "composición farmacéutica" se
refiere a una mezcla de un compuesto descrito aquí con otros
componentes químicos, como diluyentes o portadores. La composición
farmacéutica facilita la administración del compuesto a un
organismo.
Los términos "excipientes o portadores
farmacéuticamente aceptables" se refieren a material
farmacéuticamente aceptable, composición o vehículo. Cada componente
debe ser farmacéuticamente aceptable en el sentido de ser compatible
con los otros ingredientes de la composición farmacéutica. Debe ser
también apto para el uso en contacto con tejidos o órganos de
humanos y animales sin demasiada toxicidad, irritación, respuesta
alérgica, immunogenicidad u otros problemas o complicaciones acorde
con una relación beneficio/riesgo razonable.
Una composición que comprende una construcción
según la presente invención se puede administrar sola o en
combinación con otros tratamientos, tanto simultáneamente o
secuencialmente dependiendo de la condición a tratar.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a las construcciones de la presente invención para uso como
medicamento.
Otro aspecto de la invención refiere a las
construcciones de fórmula (II) donde Z es un radical de dopamina
para el uso en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. Este
aspecto también puede ser formulado como el uso de las
construcciones de fórmula (II) donde Z es un radical de dopamina
para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la
enfermedad de Parkinson. Por lo tanto, este aspecto también está
relacionado con un método de tratamiento y/o profilaxis de un
mamífero, incluyendo un humano, que padece o es susceptible de
padecer la enfermedad Parkinson, dicho método comprende la
administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un
compuesto de fórmula (II) con Z derivado de dopamina, junto con
excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables.
\newpage
Otro aspecto de la invención refiere a las
construcciones de fórmula (II) donde Z es un radical del ácido
nipecótico para el uso como anticonvulsivo.
Los anticonvulsivos son fármacos usados en el
tratamiento de las convulsiones epilépticas, o el desorden bipolar.
Este aspecto también puede ser formulado como el uso de las
construcciones de fórmula (II) donde Z es un radical del ácido
nipecótico para la preparación de un medicamento para el tratamiento
de convulsiones o enfermedades que producen convulsiones. Por lo
tanto, este aspecto también está relacionado con un método de
tratamiento y/o profilaxis de un mamífero, incluyendo un humano, que
padece o es susceptible de padecer convulsiones, dicho método
comprende la administración a un paciente de una cantidad
terapéuticamente efectiva de un compuesto de fórmula (II) con Z
derivado del ácido nipecótico, junto con excipientes o portadores
farmacéuticamente aceptables.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se
pretende que sean limitativos de la presente invención. Además, la
presente invención cubre todas las posibles combinaciones de
realizaciones particulares y preferidas aquí indicadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Los aminoácidos protegidos, espaciadores
bifuncionales y resinas fueron suministrados por: Luxembourg
Industries (Tel-Aviv, Israel), Neosystem
(Strasbourg, Francia), Calbiochem-Novabiochem AG
(Laüfelfingen, Suiza), Bachem AG (Bubendorf, Suiza) o Iris Biotech
(Marktredwitz, Alemania). Otros reactivos y solventes utilizados se
resumen en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Consideraciones generales sobre la
síntesis. La elongación del péptido en fase sólida y otras
manipulaciones en fase sólida se realizaron manualmente en jeringas
de polipropileno provistas de un disco poroso de polietileno. Los
disolventes y reactivos solubles se eliminaron por succión. Los
lavados entre las diferentes etapas sintéticas se realizaron con
dimetilformamida (DMF) (5 \times 0.5 min) y diclorometano (DCM)
(5 \times 0.5 min) utilizando 10 mL de disolvente/g de resina cada
vez.
Tests identificativos. Los tests
utilizados para la identificación y control de las síntesis fueron
los siguientes: A) Ensayo colorimétrico de Kaiser para la detección
en fase sólida de aminas primarias unidas (cf: E. Kaiser et
al., "Color test for detection of free terminal amino groups
in the solid-phase synthesis of peptides";
Anal. Biochem. 1970. vol. 34, pp. 595-598);
B) Test de De Clercq para aminas secundarias unidas a fase sólida
(cf. A. Madder et al., "A novel sensitive colorimetric
assay for visual detection of solid-phase bound
amines". Eur. J. Org. Chem. 1999. pp.
2787-2791). El ensayo de De Clercq se realiza
lavando primero una pequeña muestra de la resina (aprox. 1 mg) con
DMF (4x1 minutos) y DCM (4x1 minutos). A la resina se le añaden diez
gotas de solución del reactivo (0.002 M p-nitrofenil éster de
rojo disperso 1 en MeCN) y la mezcla resultante se calienta a 70ºC
durante 10 minutos. La solución es entonces decantada y la resina
lavada con DMF hasta que se obtiene un sobrenadante transparente. La
presencia de aminas secundarias es indicada por bolas de resina de
color rojo.
Protocolos utilizados durante la síntesis de las
construcciones de fórmula (II); Fueron sintetizadas en una escala de
100 \mumoles utilizando los siguientes métodos y protocolos;
Condicionado inicial de la resina. La
resina Sieber se condicionó por lavado con DCM (5 \times 30 s) y
DMF (5 \times 30 s) seguida por una solución 20% piperidina en DMF
(2 \times 1 min y 1 \times 10 min) para eliminar el grupo Fmoc.
Finalmente, la resina se lavó con DMF (5 \times 30 s).
Eliminación del grupo Fmoc. La
eliminación del grupo protector
9-fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc) se hizo con 20%
(v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada
uno. Se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU, tolueno,
piperidina, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 \times 5 min) para asegurar
la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias.
\vskip1.000000\baselineskip
Acoplamiento del primer aminoácido a la
resina Sieber: Se añadieron secuencialmente el aminoácido
N-protegido (4 eq), PyBOP (4 eq) y HOAt (12 eq) a la
resina en DMF seguidos de DIEA (12 eq). La mezcla se dejó reaccionar
con agitación manual intermitente durante 1.5 h. El disolvente se
eliminó por succión; la resina se lavó con DMF (5 \times 30 s) y
DCM (5 \times 30 s). La extensión del acoplamiento fue comprobada
por el ensayo colorimétrico de ninhidrina.
Acoplamiento del segundo aminoácido y los
siguientes aminoácidos a la resina Sieber: El procedimiento fue
el mismo que para el primero, excepto que el acoplamiento se repitió
dos veces más y la extensión del acoplamiento se comprobó por el
test de De Clercq.
Acoplamiento del cargo. Dependiendo de la
naturaleza del cargo, estará unido a la BBB lanzadera a través de
diferentes tipos de enlaces químicos.
Para cargos con un grupo COOH (p. ej. ácido
nipecótico, L-dopa): Se utilizó la correspondiente
BBB lanzadera provista con un grupo NH_{2} y se hizo reaccionar
con 5 equiv. de Cargo-COOH, utilizando 5 equiv.
hexafluorofosfato de
benzotriazol-1-il-N-oxi-tris(pirrolidin)fosfonio
(PyBOP) y 15 equiv.
1-hidroxi-7-azabenzotriazol
(HOAt) como reactivos de acoplamiento y 15 equiv. de
N,N-diisopropiletilamina (DIEA) como base en DMF durante 2 h.
La mezcla se dejo reaccionar con agitación manual intermitente. El
disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó con DMF (5
\times 30 s) y DCM (5 \times 30 s). El acoplamiento se repitió 2
veces más. La extensión del acoplamiento se comprobó por el test de
De Clercq o el ensayo colorimétrico de ninhidrina.
Acetilación del aminoácido
N-terminal: En algunos casos la acetilación se
realizó en fase sólida utilizando un protocolo estándar de Ac_{2}O
(50 equiv) y DIEA (50 equiv) durante 20 min.
Etapa de escisión: Se realizó por
tratamiento de la resina con TFA 2% en DCM (6 \times 3 min). El
filtrado se colectó y el DCM se evaporó bajo N_{2}. El residuo se
disolvió en H_{2}O: MeCN (1:1) y se liofilizó.
La identidad de los diferentes compuestos
sintetizados se confirmó utilizando la espectrometría de masas
"Matrix Assisted Láser Desorption/Ionization" (MALDI)
(Instrumento: MALDI Voyager DE RP
time-of-flight (TOF) PE Biosystem) o
HPLC-MS (Instrumento: Waters modelo Alliance 2796,
bomba cuaternaria, detector UV/Vis modelo 2487,
ESI-MS modelo Micromass ZQ y software Masslynx
versión 4.0) utilizando una columna Symmetry 300 C_{18} (150
\times 3.9 mm \times 5 \mum), 300 \ring{A}. 1 mL/min flujo,
solventes: A: H_{2}O con 0.1% ácido fórmico; B: MeCN con 0.07%
ácido fórmico. Su pureza se controló por HPLC de fase inversa
utilizando una columna Symmetry C_{18} (150 \times 4.6 mm
\times 5 \mum, 100 \ring{A}, Waters) y una columna Sunfire
C18 (100 \times 4.6 mm \times 3.5 \mum, 100 \ring{A},
Waters), 1 mL/min flujo, solventes: A: H_{2}O con 0.045% TFA; B:
MeCN con 0.036% TFA, Instrumento: Waters modelo Alliance 2695
formado por una bomba cuaternaria, un detector diodo array modelo
966, controlado por el software Millenium versión 3.5.
Los compuestos se purificaron si fue necesario
por HPLC fase inversa utilizando una columna Symmetry C_{18} (100
\times 30 mm \times 5 \mum, 100 \ring{A}, Waters), 10 mL/min
flujo, disolventes: A: H_{2}O con 0.1% TFA; B: MeCN con 0.1% TFA,
Instrumento: Waters system con una bomba cuaternaria, autoinjector
Simple Manager 2700, detector UV/Vis modelo 2487 y un Fraction
collector II, controlado por el software Masslynx versión 3.5.
\vskip1.000000\baselineskip
En los ejemplos siguientes se han utilizado
L-aminoácidos excepto para
Fmoc-PhPro-COOH que se ha usado como
mezcla racémica.
\vskip1.000000\baselineskip
La síntesis se realizó en una escala 100
\mumoles. Para el acoplamiento del primer aminoácido a la resina
Sieber se utilizó el siguiente protocolo: Derivado de aminoácido del
primer aminoácido (Fmoc-PhPro-OH, 4
equiv., 400 \mumols, 165 mg), PyBOP (4 equiv., 400 \mumols, 208
mg) y HOAt (12 equiv., 1.2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF
(1-3 ml/g resina) se añadieron secuencialmente a la
resina seguidos de DIEA (12 equiv., 1.2 mmols, 204 \muL). La
mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante
1.5 h. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó a
fondo. La extensión del acoplamiento se comprobó por el ensayo
colorimétrico de ninhidrina. El grupo Fmoc se eliminó con 20% (v/v)
piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno.
Se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU, tolueno,
piperidina, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 \times 5 min) para asegurar
la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias.
El derivado de aminoácido protegido del segundo
aminoácido se acopló al primer aminoácido ya anclado a la resina
utilizando el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el
aminoácido protegido (Fmoc-PhPro-OH,
4 equiv., 400 \mumols, 165 mg), PyBOP (4 equiv., 400 \mumols,
208 mg) y HOAt (12 equiv., 1.2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF
(1-3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12
equiv., 1.2 mmols, 204 \muL). La mezcla se dejó reaccionar con
agitación manual intermitente durante 1.5 h. Se eliminó el
disolvente por succión, la resina se lavó a fondo y el acoplamiento
se repitió dos veces más. La extensión del acoplamiento se comprobó
por el test de De Clercq. El grupo Fmoc se eliminó con 20% (v/v)
piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno.
Se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU, tolueno,
piperidina, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 \times 5 min) para asegurar
la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias. El mismo
protocolo se utilizó para acoplar el tercer derivado de
aminoácido.
Para el acoplamiento del cuarto derivado de
aminoácido se utilizó el siguiente protocolo: se añadieron
secuencialmente el aminoácido protegido 4 equiv., 400 \mumols
(Fmoc-PhPro-OH, 165 mg)
(Fmoc-Cha-OH, 157 mg) o
(Fmoc-2Nal-OH, 175 mg), PyBOP (4
equiv., 400 \mumols, 208 mg) y HOAt (12 equiv., 1.2 mmols, 163 mg)
disueltos en DMF (1-3 ml/g resina) a la resina
seguidos de DIEA (12 equiv., 1.2 mmols, 204 \muL). La mezcla se
dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1.5 h. El
disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó a fondo y el
acoplamiento se repitió dos veces más. La extensión del acoplamiento
se comprobó por el test de De Clercq. El grupo Fmoc se eliminó con
20% (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos
cada uno. En el caso de PhPro, se realizaron dos tratamientos
adicionales con DBU, tolueno, piperidina, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2
\times 5 min) para asegurar la eliminación del grupo Fmoc de las
aminas secundarias.
La acetilación se realizó en fase sólida
utilizando un protocolo estándar de Ac_{2}O (50 equiv., 5 mmols,
471 \muL) y DIEA (50 equiv., 5 mmols, 850 \muL) durante 20 min.
La etapa de escisión se realizó por tratamiento de la resina con TFA
2% en DCM (6 \times 3 min). El filtrado se colectó y el DCM se
evaporó bajo N_{2}. El residuo se disolvió en H_{2}O: MeCN (1:1)
y se liofilizó. Para eliminar las sales se realizó un paso de
desalado utilizando la resina DOWEX MR-3 Mixed Bed
toda la noche.
Caracterización del producto: HPLC de fase
inversa: gradiente lineal de 50 a 80% MeCN en 15 minutos utilizando
una columna Symmetry C_{18} (150 \times 4.6 mm \times 5
\mum, 100 \ring{A}, Waters), Compuesto (Ia):
Ac-PhPro-(PhPro)_{3}-CONH_{2}
tr: 3-9 min (diastereómeros); Compuesto (Ib):
Ac-Cha-(PhPro)_{3}-CONH_{2}
tr: 4-10.1 min (diastereómeros); Compuesto (Ie):
Ac-2Nal-(PhPro)_{3}-CONH_{2}
6.5-13.3 min (diastereómeros). Espectrometría de
masas (MALDI-TOF): Compuesto (Ia):
Ac-PhPro-(PhPro)_{3}-CONH_{2}
(M+Na)+: 774.3; Compuesto (Ib):
Ac-Cha-(PhPro)_{3}-CONH_{2}
(M+Na)+: 754.4; Compuesto (Ie):
Ac-2Nal-(PhPro)_{3}-CONH_{2}
(M+Na)+: 798.3. Rendimiento: Compuesto (Ia):
Ac-PhPro-(PhPro)_{3}-CONH_{2}
65%; Compuesto (Ib):
Ac-Cha-(PhPro)_{3}-CONH_{2}
63.7%; Compuesto (Ie):
Ac-2Nal-(PhPro)_{3}-CONH_{2}
49.8%.
\vskip1.000000\baselineskip
La síntesis se realizó en una escala 100
\mumoles. Para el acoplamiento del primer aminoácido a la resina
Sieber se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron
secuencialmente el derivado de aminoácido del primer aminoácido
(Fmoc-PhPro-OH, 4 equiv., 400
\mumols, 165 mg), PyBOP (4 equiv., 400 \mumols, 208 mg) y HOAt
(12 equiv., 1.2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF (1-3
ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12 equiv., 1.2 mmols, 204
\muL). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual
intermitente durante 1.5 h. El disolvente se eliminó por succión, la
resina se lavó a fondo. La extensión del acoplamiento se comprobó
por el ensayo colorimétrico de ninhidrina. El grupo Fmoc se eliminó
con 20% (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10
minutos cada uno. Se realizaron dos tratamientos adicionales con
DBU, tolueno, piperidina, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 \times 5 min)
para asegurar la eliminación del grupo Fmoc de las aminas
secundarias.
El derivado de aminoácido protegido del segundo
aminoácido se acopló al primer aminoácido ya anclado a la resina
utilizando el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el
aminoácido protegido (Fmoc-PhPro-OH,
4 equiv., 400 \mumols, 165 mg), PyBOP (4 equiv., 400 \mumols,
208 mg) y HOAt (12 equiv., 1.2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF
(1-3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12
equiv., 1.2 mmols, 204 \muL). La mezcla se dejó reaccionar con
agitación manual intermitente durante 1.5 h. El disolvente se
eliminó por succión, la resina se lavó a fondo y el acoplamiento se
repitió dos veces más. La extensión del acoplamiento se comprobó por
el test de De Clercq. El grupo Fmoc se eliminó con 20% (v/v)
piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno.
Se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU, tolueno,
piperidina, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 \times 5 min) para asegurar
la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias. El mismo
protocolo se utilizó para acoplar el tercer derivado de
aminoácido.
Para el acoplamiento del cuarto derivado de
aminoácido se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron
secuencialmente el aminoácido protegido
(Fmoc-Cha-OH, 4 equiv., 400
\mumols, 157 mg), PyBOP (4 equiv., 400 \mumols, 208 mg) y HOAt
(12 equiv., 1.2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF (1-3
ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12 equiv., 1.2 mmols, 204
\muL). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual
intermitente durante 1.5 h. El disolvente se eliminó por succión, la
resina lavada a fondo y el acoplamiento se repitió dos veces más. La
extensión del acoplamiento se comprobó por el test de De Clercq. El
grupo Fmoc se eliminó con 20% (v/v) piperidina en DMF utilizando 2
tratamientos de 10 minutos cada uno.
Para el acoplamiento del cargo (ácido
nipecótico) a la BBB-lanzadera anclada a la resina
se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el
Cargo-COOH
(Fmoc-L-Nip-OH) (4
equiv., 400 \mumols, 140 mg) en DMF (1-3 mL/g
resina), PyBOP (4 equiv., 400 \mumols, 208 mg) y HOAt (12 equiv.,
1.2 mmols, 163 mg) a la resina seguido de 12 equiv. DIEA (1.2 mmols,
204 \muL). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual
intermitente durante 2 h. El disolvente se eliminó por succión, la
resina se lavó a fondo y el acoplamiento se repitió una vez. La
extensión del acoplamiento se controló por el test de Kaiser. El
grupo Fmoc se eliminó con 20% (v/v) piperidina en DMF utilizando 2
tratamientos de 10 minutos cada uno.
La etapa de escisión se realizó por tratamiento
de la resina con TFA 2% en DCM (6 \times 3 min). El filtrado se
colectó y el DCM se evaporó bajo N_{2}. El residuo se disolvió en
H_{2}O: MeCN (1:1) y se liofilizó.
Caracterización del producto: HPLC de fase
inversa: gradiente lineal de 30 a 60% MeCN en 8 minutos utilizando
una columna Sunfire C_{18} (100 \times 4.6 mm \times 3.5
\mum, 100 \ring{A}, Waters),
Nip-Cha-(PhPro)_{3}-CONH_{2}
tr: 3.9-7.3 min (diastereómeros). Espectrometría de
masas (MALDI-TOF):
Nip-Cha-(PhPro)_{3}-CONH_{2}
(M+H)+: 801.5. Rendimiento:
Nip-Cha-(PhPro)_{3}-CONH_{2}
65%.
\vskip1.000000\baselineskip
La síntesis se realizó en una escala 100
\mumoles. Para el acoplamiento del primer aminoácido a la resina
Sieber se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron
secuencialmente el derivado de aminoácido del primer aminoácido
(Fmoc-PhPro-OH, 4 equiv., 400
\mumols, 165 mg), PyBOP (4 equiv., 400 \mumols, 208 mg) y HOAt
(12 equiv., 1.2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF (1-3
ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12 equiv., 1.2 mmols, 204
\muL). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual
intermitente durante 1.5 h. El disolvente se eliminó por succión, la
resina se lavó a fondo. La extensión del acoplamiento se comprobó
por el ensayo colorimétrico de ninhidrina. El grupo Fmoc se eliminó
con 20% (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10
minutos cada uno. Se realizaron dos tratamientos adicionales con
DBU, tolueno, piperidina, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 \times 5 min)
para asegurar la eliminación del grupo Fmoc de las aminas
secundarias.
El derivado de aminoácido protegido del segundo
aminoácido se acopló al primer aminoácido ya anclado a la resina
utilizando el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el
aminoácido protegido (Fmoc-PhPro-OH,
4 equiv., 400 \mumols, 165 mg), PyBOP (4 equiv., 400 \mumols,
208 mg) y HOAt (12 equiv., 1.2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF
(1-3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12
equiv., 1.2 mmols, 204 \muL). La mezcla se dejó reaccionar con
agitación manual intermitente durante 1.5 h. El solvente fue
entonces eliminado por succión, la resina lavada a fondo y el
acoplamiento se repitió dos veces más. La extensión del acoplamiento
se comprobó por el test de De Clercq. El grupo Fmoc se eliminó con
20% (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos
cada uno. Se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU,
tolueno, piperidina, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 \times 5 min) para
asegurar la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias. El
mismo protocolo se utilizó para acoplar el tercer derivado de
aminoácido.
Para el acoplamiento del cuarto derivado de
aminoácido se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron
secuencialmente el aminoácido protegido
(Fmoc-Cha-OH, 4 equiv., 400
\mumols, 157 mg), PyBOP (4 equiv., 400 \mumols, 208 mg) y HOAt
(12 equiv., 1.2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF (1-3
ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12 equiv., 1.2 mmols, 204
\muL). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual
intermitente durante 1.5 h. El disolvente se eliminó por succión, la
resina se lavó a fondo y el acoplamiento se repitió dos veces más.
La extensión del acoplamiento se comprobó por el test de De Clercq.
El grupo Fmoc se eliminó con 20% (v/v) piperidina en DMF utilizando
2 tratamientos de 10 minutos cada uno.
Para el acoplamiento del cargo (levodopa) a la
BBB-lanzadera anclada a la resina se utilizó el
siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el
Cargo-COOH
(Fmoc-L-Dopa-OH) (4
equiv., 400 \mumols, 167 mg) en DMF (1-3 mL/g
resina), PyBOP (4 equiv., 400 \mumols, 208 mg) y HOAt (12 equiv.,
1.2 mmols, 163 mg) a la resina seguido de 12 equiv. DIEA (1.2 mmols,
204 \muL). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual
intermitente durante 2 h. El disolvente se eliminó por succión, la
resina se lavó a fondo y el acoplamiento se repitió una vez. La
extensión del acoplamiento se controló por el test de Kaiser. El
grupo Fmoc se eliminó con 20% (v/v) piperidina en DMF utilizando 2
tratamientos de 10 minutos cada uno.
La etapa de escisión se realizó por tratamiento
de la resina con TFA 2% en DCM (6 \times 3 min). El filtrado se
colectó y el DCM se evaporó bajo N_{2}. El residuo se disolvió en
H_{2}O: MeCN (1:1) y se liofilizó.
Caracterización del producto: HPLC de fase
inversa: gradiente lineal de 30 a 60% MeCN en 8 minutos utilizando
una columna Sunfire C_{18} (100 \times 4.6 mm \times 3.5
\mum, 100 A, Waters),
L-Dopa-Cha-(PhPro)_{3}-CONH_{2}
tr: 3.8-7.5 min (diastereómeros). Espectrometría de
masas (MALDI-TOF):
L-Dopa-Cha-(PhPro)_{3}-CONH_{2}
(M+Na)+: 891.5. Rendimiento:
L-Dopa-Cha-(PhPro)_{3}-CONH_{2}
63.7%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo Comparativo
1
La síntesis se realizó en una escala 100
\mumoles. Para el acoplamiento del primer aminoácido a la resina
Sieber se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron
secuencialmente el derivado de aminoácido del primer aminoácido
(Fmoc-N-Me-Phe-OH,
4 equiv., 400 \mumols, 161 mg), PyBOP (4 equiv., 400 \mumols,
208 mg) y HOAt (12 equiv., 1.2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF
(1-3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12
equiv., 1.2 mmols, 204 \muL). La mezcla se dejó reaccionar con
agitación manual intermitente durante 1.5 h. El disolvente se
eliminó por succión, la resina se lavó a fondo. La extensión del
acoplamiento se comprobó por el ensayo colorimétrico de ninhidrina.
El grupo Fmoc se eliminó con 20% (v/v) piperidina en DMF utilizando
2 tratamientos de 10 minutos cada uno. Se realizaron dos
tratamientos adicionales con DBU, tolueno, piperidina, DMF (5%, 5%,
20%, 70%) (2 \times 5 min) para asegurar la eliminación del grupo
Fmoc de las aminas secundarias.
El derivado de aminoácido protegido del segundo
aminoácido se acopló al primer aminoácido ya anclado a la resina
utilizando el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el
aminoácido protegido
(Fmoc-N-Me-Phe-OH,
4 equiv., 400 \mumols, 161 mg), PyBOP (4 equiv., 400 \mumols,
208 mg) y HOAt (12 equiv., 1.2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF
(1-3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12
equiv., 1.2 mmols, 204 \muL). La mezcla se dejó reaccionar con
agitación manual intermitente durante 1.5 h. El disolvente se
eliminó por succión, la resina se lavó a fondo y el acoplamiento se
repitió dos veces más. La extensión del acoplamiento se comprobó por
el test de De Clercq. El grupo Fmoc se eliminó con 20% (v/v)
piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno.
Se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU, tolueno,
piperidina, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 \times 5 min) para asegurar
la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias. El mismo
protocolo se utilizó para acoplar el tercer y cuarto derivado de
aminoácido.
La acetilación se realizó en fase sólida
utilizando un protocolo estándar de Ac_{2}O (50 equiv., 5 mmols,
471 \muL) y DIEA (50 equiv., 5 mmols, 850 \muL) durante 20 min.
La etapa de escisión se realizó por tratamiento de la resina con TFA
2% en DCM (6 \times 3 min). El filtrado se colectó y el DCM se
evaporó bajo N_{2}. El residuo se disolvió en H_{2}O: MeCN (1:1)
y se liofilizó. Para eliminar las sales se realizó un paso de
desalado utilizando la resina DOWEX MR-3 Mixed Bed
toda la noche.
Caracterización del producto: HPLC de fase
inversa: gradiente lineal de 0 a 100% MeCN en 15 minutos utilizando
una columna Symmetry C_{18} (150 \times 4.6 mm \times 5
\mum, 100 \ring{A}, Waters),
Ac-(N-Me-Phe)_{4}-CONH_{2}
tr: 12.2 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF):
Ac-(N-Me-Phe)_{4}-CONH_{2}
(M+Na)+: 726.9. Rendimiento:
Ac-(N-Me-Phe)_{4}-CONH_{2}
32.8%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo Comparativo
2
La síntesis se realizó en una escala 100
\mumoles. Para el acoplamiento del primer aminoácido a la resina
sieber se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron
secuencialmente el derivado de aminoácido del primer aminoácido
(Fmoc-Pro-OH, 4 equiv., 400
\mumols, 135 mg), PyBOP (4 equiv., 400 \mumols, 208 mg) y HOAt
(12 equiv., 1.2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF (1 -3 ml/g resina) a
la resina seguidos de DIEA (12 equiv., 1.2 mmols, 204 \muL). La
mezcla se dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante
1.5 h. El disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó a
fondo. La extensión del acoplamiento se comprobó por el ensayo
colorimétrico de ninhidrina. El grupo Fmoc se eliminó con 20% (v/v)
piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno.
Se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU, tolueno,
piperidina, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 \times 5 min) para asegurar
la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias.
El derivado de aminoácido protegido del segundo
aminoácido se acopló al primer aminoácido ya anclado a la resina
utilizando el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el
aminoácido protegido (Fmoc-Pro-OH, 4
equiv., 400 \mumols, 135 mg), PyBOP (4 equiv., 400 \mumols, 208
mg) y HOAt (12 equiv., 1.2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF
(1-3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12
equiv., 1.2 mmols, 204 \muL). La mezcla se dejó reaccionar con
agitación manual intermitente durante 1.5 h. El disolvente se
eliminó por succión, la resina se lavó a fondo y el acoplamiento se
repitió dos veces más. La extensión del acoplamiento se comprobó por
el test de De Clercq El grupo Fmoc se eliminó con 20% (v/v)
piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno.
Se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU, tolueno,
piperidina, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 \times 5 min) para asegurar
la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias. El mismo
protocolo se utilizó para acoplar el tercer y cuarto derivado de
aminoácido.
La acetilación se realizó en fase sólida
utilizando un protocolo estándar de Ac_{2}O (50 equiv., 5 mmols,
471 \muL) y DIEA (50 equiv., 5 mmols, 850 \muL) durante 20 min.
La etapa de escisión se realizó por tratamiento de la resina con
TFA 2% en DCM (6 \times 3 min). El filtrado se colectó y el DCM se
evaporó bajo N_{2}. El residuo se disolvió en H_{2}O: MeCN (1:1)
y se liofilizó. Para eliminar las sales se realizó un paso de
desalado utilizando la resina DOWEX MR-3 Mixed Bed
toda la noche.
Caracterización del producto: HPLC de fase
inversa: gradiente lineal de 0 a 100% MeCN en 15 minutos utilizando
una columna Symmetry C_{18} (150 \times 4.6 mm \times 5
\mum, 100 \ring{A}, Waters),
Ac-(Pro)_{4}-CONH_{2} tr: 5.4 min.
Espectrometría de masas (MALDI-TOF):
Ac-(Pro)_{4}-CONH_{2} (M+Na)+: 470.2.
Rendimiento:
Ac-(Pro)_{4}-CONH_{2}15.2%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo Comparativo
3
La síntesis se realizó en una escala 100
\mumoles. Para el acoplamiento del primer aminoácido a la resina
sieber se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron
secuencialmente el derivado de aminoácido del primer aminoácido
(Fmoc-N-Me-Phe-OH,
4 equiv., 400 \mumols, 161 mg), PyBOP (4 equiv., 400 \mumols,
208 mg) y HOAt (12 equiv., 1.2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF
(1-3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12
equiv., 1.2 mmols, 204 \muL). La mezcla se dejó reaccionar con
agitación manual intermitente durante 1.5 h. El disolvente se
eliminó por succión, la resina se lavó a fondo. La extensión del
acoplamiento se comprobó por el ensayo colorimétrico de ninhidrina.
El grupo Fmoc se eliminó con 20% (v/v) piperidina en DMF utilizando
2 tratamientos de 10 minutos cada uno. Se realizaron dos
tratamientos adicionales con DBU, tolueno, piperidina, DMF (5%, 5%,
20%, 70%) (2 \times 5 min) para asegurar la eliminación del grupo
Fmoc de las aminas secundarias.
El derivado de aminoácido protegido del segundo
aminoácido se acopló al primer aminoácido ya anclado a la resina
utilizando el siguiente protocolo: se añadieron secuencialmente el
aminoácido protegido
(Fmoc-N-Me-Phe-OH,
4 equiv., 400 \mumols, 161 mg), PyBOP (4 equiv., 400 \mumols,
208 mg) y HOAt (12 equiv., 1.2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF
(1-3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12
equiv., 1.2 mmols, 204 \muL). La mezcla se dejó reaccionar con
agitación manual intermitente durante 1.5 h. El disolvente se
eliminó por succión, la resina se lavó a fondo y el acoplamiento se
repitió dos veces más. La extensión del acoplamiento se comprobó por
el test de De Clercq. El grupo Fmoc se eliminó con 20% (v/v)
piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno.
Se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU, tolueno,
piperidina, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 \times 5 min) para asegurar
la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias. El mismo
protocolo se utilizó para acoplar el tercer derivado de
aminoácido.
Para el acoplamiento del cuarto derivado de
aminoácido se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron
secuencialmente el aminoácido protegido
(Fmoc-Cha-OH, 4 equiv., 400
\mumols, 157 mg), PyBOP (4 equiv., 400 \mumols, 208 mg) C y HOAt
(12 equiv., 1.2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF (1-3
ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12 equiv., 1.2 mmols,
204 \muL). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual
intermitente durante 1.5 h. El disolvente se eliminó por succión, la
resina se lavó a fondo y el acoplamiento se repitió dos veces más.
La extensión del acoplamiento se comprobó por el test de De Clercq.
El grupo Fmoc se eliminó con 20% (v/v) piperidina en DMF utilizando
2 tratamientos de 10 minutos cada uno.
La acetilación se realizó en fase sólida
utilizando un protocolo estándar de Ac_{2}O (50 equiv., 5 mmols,
471 \muL) y DIEA (50 equiv., 5 mmols, 850 \muL) durante 20 min.
La etapa de escisión se realizó por tratamiento de la resina con TFA
2% en DCM (6 \times 3 min). El filtrado se colectó y el DCM se
evaporó bajo N_{2}. El residuo se disolvió en H_{2}O: MeCN (1:1)
y se liofilizó. Para eliminar las sales se realizó un paso de
desalado utilizando la resina DOWEX MR-3 Mixed Bed
toda la noche.
Caracterización del producto: HPLC de fase
inversa: gradiente lineal de 0 a 100% MeCN en 15 minutos utilizando
una columna Symmetry C_{18} (150 \times 4.6 mm \times 5
\mum, 100 \ring{A}, Waters),
Ac-Cha-(N-Me-Phe)_{3}-CONH_{2}
tr: 12.9 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF):
Ac-Cha-(N-Me-Phe)_{3}-CONH_{2}
(M+Na)+: 718.4. Rendimiento:
Ac-Cha-(N-Me-Phe)_{3}-CONH_{2}11.8%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo Comparativo
4
La síntesis se realizó en una escala 100
\mumoles. Para el acoplamiento del primer aminoácido a la resina
sieber se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron
secuencialmente el derivado de aminoácido del primer aminoácido
(Fmoc-N-MePhe-OH, 4
equiv., 400 \mumols, 161 mg), PyBOP (4 equiv., 400 \mumols, 208
mg) y HOAt (12 equiv., 1.2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF
(1-3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12
equiv., 1.2 mmols, 204 \muL). La mezcla se dejó reaccionar con
agitación manual intermitente durante 1.5 h. El disolvente se
eliminó por succión, la resina se lavó a fondo. La extensión del
acoplamiento se comprobó por el ensayo colorimétrico de ninhidrina.
El grupo Fmoc fue eliminado con 20% (v/v) piperidina en DMF
utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno. Se realizaron dos
tratamientos adicionales con DBU, tolueno, piperidina, DMF (5%, 5%,
20%, 70%) (2 \times 5 min) para asegurar la eliminación del grupo
Fmoc de las aminas secundarias.
El derivado de aminoácido protegido del segundo
aminoácido se acopló al primer aminoácido ya anclado a la resina
utilizando el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el
aminoácido protegido
(Fmoc-N-MePhe-OH, 4
equiv., 400 \mumols, 161 mg), PyBOP (4 equiv., 400 \mumols, 208
mg) y HOAt (12 equiv., 1.2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF
(1-3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12
equiv., 1.2 mmols, 204 \muL). La mezcla se dejó reaccionar con
agitación manual intermitente durante 1.5 h. El disolvente se
eliminó por succión, la resina se lavó a fondo y el acoplamiento se
repitió dos veces más. La extensión del acoplamiento se comprobó por
el test de De Clercq. El grupo Fmoc se eliminó con 20% (v/v)
piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno.
Se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU, tolueno,
piperidina, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 \times 5 min) para asegurar
la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias. El mismo
protocolo se utilizó para acoplar el tercer derivado de
aminoácido.
Para el acoplamiento del cuarto derivado de
aminoácido se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron
secuencialmente el aminoácido protegido 4 equiv., 400 \mumols
(Fmoc-N-MePhe-OH,
161 mg) (Fmoc-Cha-OH, 157 mg) o
(Fmoc-2Nal-OH, 175 mg), PyBOP (4
equiv., 400 \mumols, 208 mg) y HOAt (12 equiv., 1.2 mmols, 163 mg)
disueltos en DMF (1-3 ml/g resina) a la resina
seguidos de DIEA (12 equiv., 1.2 mmols, 204 \muL). La mezcla se
dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1.5 h. El
disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó a fondo y el
acoplamiento se repitió dos veces más. La extensión del acoplamiento
se comprobó por el test de De Clercq. El grupo Fmoc se eliminó con
20% (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos
cada uno. En el caso de N-MePhe, se realizaron dos
tratamientos adicionales con DBU, tolueno, piperidina, DMF (5%, 5%,
20%, 70%) (2 \times 5 min) para asegurar la eliminación del grupo
Fmoc de las aminas secundarias.
Para el acoplamiento del cargo (levodopa) a la
resina se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron
secuencialmente el cargo-COOH
(Fmoc-L-Dopa-OH) (4
equiv., 400 \mumols, 167 mg) en DMF (1-3 mL/g
resina), PyBOP (4 equiv., 400 \mumols, 208 mg) y HOAt (12 equiv.,
1.2 mmols, 163 mg) a la resina seguido de 12 equiv. DIEA (1.2 mmols,
204 \muL). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual
intermitente durante 2 h. El disolvente se eliminó por succión, la
resina se lavó a fondo y el acoplamiento se repitió una vez. La
extensión del acoplamiento se controló por el test de Kaiser. El
grupo Fmoc se eliminó con 20% (v/v) piperidina en DMF utilizando 2
tratamientos de 10 minutos cada uno.
La etapa de escisión se realizó por tratamiento
de la resina con TFA 2% en DCM (6 \times 3 min). El filtrado se
colectó y el DCM se evaporó bajo N_{2}. El residuo se disolvió en
H_{2}O: MeCN (1:1) y liofilizado.
Caracterización del producto: HPLC de fase
inversa: gradiente lineal de 0 a 100% MeCN en 15 minutos utilizando
una columna Symmetry C_{18} (150 \times 4.6 mm \times 5
\mum, 100 \ring{A}, Waters), Ejemplo Comparativo 4a:
L-Dopa-N-MePhe-(N-MePhe)_{3}-CONH_{2}
tr: 8.8 min; Ejemplo Comparativo 4b:
L-Dopa-Cha-(N-MePhe)_{3}-CONH_{2}
tr: 9.5 min; Ejemplo Comparativo 4c:
L-Dopa-2Nal-(N-MePhe)_{3}-CONH_{2}
tr: 9.3 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF):
Ejemplo Comparativo 4a:
L-Dopa-N-MePhe-(N-MePhe)_{3}-CONH_{2}
(M+Na)+: 863.5; Ejemplo Comparativo 4b:
L-Dopa-Cha-(N-MePhe)_{3}-CONH_{2}
(M+Na)+: 855.5; Ejemplo Comparativo 4c:
L-Dopa-2Nal-(N-MePhe)_{3}-CONH_{2}
(M+Na)+: 899.6. Rendimiento: Ejemplo Comparativo 4a:
L-Dopa-N-MePhe-(N-MePhe)_{3}-CONH_{2}
5.4%; Ejemplo Comparativo 4b:
L-Dopa-Cha-(N-MePhe)_{3}-CONH_{2}10.6%;
Ejemplo Comparativo 4c:
L-Dopa-2Nal-(N-MePhe)_{3}-CONH_{2}
26%.
\newpage
Ejemplo Comparativo
5
La síntesis se realizó en una escala 100
\mumoles. Para el acoplamiento del primer aminoácido a la resina
sieber se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron
secuencialmente el derivado de aminoácido del primer aminoácido
(Fmoc-N-MePhe-OH, 4
equiv., 400 \mumols, 161 mg), PyBOP (4 equiv., 400 \mumols, 208
mg) y HOAt (12 equiv., 1.2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF
(1-3 ml/g resina) a la resina seguidos de DIEA (12
equiv., 1.2 mmols, 204 \muL). La mezcla se dejó reaccionar con
agitación manual intermitente durante 1.5 h. El disolvente se
eliminó por succión, la resina lavada a fondo. La extensión del
acoplamiento se comprobó por el ensayo colorimétrico de ninhidrina.
El grupo Fmoc se eliminó con 20% (v/v) piperidina en DMF utilizando
2 tratamientos de 10 minutos cada uno. Se realizaron dos
tratamientos adicionales con DBU, tolueno, piperidina, DMF (5%, 5%,
20%, 70%) (2 \times 5 min) para asegurar la eliminación del grupo
Fmoc de las aminas secundarias.
El derivado de aminoácido protegido del segundo
aminoácido se acopló al primer aminoácido ya anclado a la resina
utilizando el siguiente protocolo: Se añadieron secuencialmente el
aminoácido protegido
(Fmoc-N-MePhe-OH, 4
equiv., 400 \mumols, 161 mg), PyBOP (4 equiv., 400 \mumols, 208
mg) y HOAt (12 equiv., 1.2 mmols, 163 mg) disueltos en DMF
(1-3 ml/g resina a la resina seguidos de DIEA (12
equiv., 1.2 mmols, 204 \muL). La mezcla se dejó reaccionar con
agitación manual intermitente durante 1.5 h. El disolvente se
eliminó por succión, la resina se lavó a fondo y el acoplamiento se
repitió dos veces más. La extensión del acoplamiento se comprobó por
el test de De Clercq. El grupo Fmoc se eliminó con 20% (v/v)
piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos cada uno.
Se realizaron dos tratamientos adicionales con DBU, tolueno,
piperidina, DMF (5%, 5%, 20%, 70%) (2 \times 5 min) para asegurar
la eliminación del grupo Fmoc de las aminas secundarias. El mismo
protocolo se utilizó para acoplar el tercer derivado de
aminoácido.
Para el acoplamiento del cuarto derivado de
aminoácido se utilizó el siguiente protocolo: Se añadieron
secuencialmente el aminoácido protegido 4 equiv., 400 \mumols
(Fmoc-N-MePhe-OH,
161 mg) (Fmoc-Cha-OH, 157 mg) o
(Fmoc-2Nal-OH, 175 mg), PyBOP (4
equiv., 400 \mumols, 208 mg) y HOAt (12 equiv., 1.2 mmols, 163 mg)
disueltos en DMF (1-3 ml/g resina) a la resina
seguidos de DIEA (12 equiv., 1.2 mmols, 204 \muL). La mezcla se
dejó reaccionar con agitación manual intermitente durante 1.5 h. El
disolvente se eliminó por succión, la resina se lavó a fondo y el
acoplamiento se repitió dos veces más. La extensión del acoplamiento
se comprobó por el test de De Clercq. El grupo Fmoc se eliminó con
20% (v/v) piperidina en DMF utilizando 2 tratamientos de 10 minutos
cada uno. En el caso de N-MePhe, se realizaron dos
tratamientos adicionales con DBU, tolueno, piperidina, DMF (5%, 5%,
20%, 70%) (2 \times 5 min) para asegurar la eliminación del grupo
Fmoc de las aminas secundarias.
Para el acoplamiento del cargo (ácido
nipecótico) a la resina se utilizó el siguiente protocolo: Se
añadieron secuencialmente el cargo-COOH
(Fmoc-L-Nip-OH) (4
equiv., 400 \mumols, 140 mg) en DMF (1-3 mL/g
resina), PyBOP (4 equiv., 400 \mumols, 208 mg) y HOAt (12 equiv.,
1.2 mmols, 163 mg a la resina seguido de 12 equiv. DIEA (1.2 mmols,
204 \muL). La mezcla se dejó reaccionar con agitación manual
intermitente durante 2 h. El disolvente se eliminó por succión, la
resina se lavó a fondo y el acoplamiento se repitió una vez. La
extensión del acoplamiento se controló por el test de Kaiser. El
grupo Fmoc se eliminó con 20% (v/v) piperidina en DMF utilizando 2
tratamientos de 10 minutos cada uno.
La etapa de escisión se realizó por tratamiento
de la resina con TFA 2% en DCM (6 \times 3 min). El filtrado se
colectó y el DCM se evaporó bajo N_{2}. El residuo se disolvió en
H_{2}O: MeCN (1:1) y liofilizado.
Caracterización del producto: HPLC de fase
inversa: gradiente lineal de 0 a 100% MeCN en 8 minutos utilizando
una columna Sunfire C_{18} (100 \times 4.6 mm x 3.5 \mum, 100
\ring{A}, Waters), Ejemplo Comparativo 5a:
Nip-N-MePhe-(N-MePhe)_{3}-CONH_{2}
tr: 5.3 min; Ejemplo Comparativo 5b:
Nip-Cha-(N-MePhe)_{3}-CONH_{2}tr:
5.5 min; Ejemplo Comparativo 5c:
Nip-2Nal-(N-MePhe)_{3}-CONH_{2}
tr: 5.4 min. Espectrometría de masas (MALDI-TOF):
Ejemplo Comparativo 5a:
Nip-N-MePhe-(N-MePhe)_{3}-CONH_{2}
(M+Na)+: 795.4; Ejemplo Comparativo 5b:
Nip-Cha-(N-MePhe)_{3}-CONH_{2}
(M+Na)+: 787.4; Ejemplo Comparativo 5c:
Nip-2Nal-(N-MePhe)_{3}-CONH_{2}
(M+Na)+: 831.4. Rendimiento: Ejemplo Comparativo 5a:
Nip-N-MePhe-(N-MePhe)_{3}-CONH_{2}
90%; Ejemplo Comparativo 5b:
Nip-Cha-(N-MePhe)_{3}-CONH_{2}
91%; Ejemplo Comparativo 5c:
Nip-2Nal-(N-MePhe)_{3}-CONH_{2}
75%.
\vskip1.000000\baselineskip
El método de evaluación escogido para probar que
los compuestos de fórmula (I) de la invención son
BBB-lanzaderas capaces de cruzar cargos por difusión
pasiva es el ensayo paralelo de permeabilidad en membrana artificial
(PAMPA), el cual permite predecir o evaluar solo este mecanismo de
transporte. En términos generales, este método es simple,
automatizable con alta eficacia, tiene un bajo coste y requiere
solo una cantidad pequeña de compuesto a testar. El método PAMPA
originariamente introducido por Kansy en Roche utiliza una membrana
artificial en forma de bicapas de fosfolípidos soportadas en un
filtro (cf. M. Kansy et al.," Physicochemical high
throughput screening: Parallel artificial membrane permeability
assay in the description of the absorption processes" J. Med.
Chem. 1998, vol. 41, pp. 1007-1010). La
membrana de fosfolípidos mimetiza la membrana celular, pero no tiene
los medios para el transporte activo o paracelular de las moléculas
fármaco. Es una herramienta muy práctica para evaluar el transporte
de compuestos por difusión pasiva. Esta técnica permite la
evaluación de compuestos puros, crudos e incluso mezclas de
compuestos.
El ensayo PAMPA se utiliza para determinar la
capacidad de las construcciones BBB lanzadera-cargo
para cruzar la BBB por difusión pasiva. La permeabilidad efectiva de
los compuestos se midió por triplicado a una concentración inicial
de 200 \muM. La solución tampón se preparó a partir de la
concentrada comercializada por plON siguiendo sus indicaciones. El
pH fue ajustado a 7.4 utilizando una solución NaOH 0.5M. El
compuesto de interés se disolvió en solución tampón y
2-propanol (20%, cosolvente) a la concentración
deseada (200 \muM).
El sándwich de PAMPA se separó y el pocillo
donador se rellenó con 200 \muL de la solución del compuesto a
estudiar. La placa aceptora se colocó en la placa donadora
asegurándose que la parte inferior de la membrana estuviera en
contacto con el tampón. 4 \muL de mezcla de fosfolípidos (20
mg/mL) en dodecano se añadieron a cada pocillo y 160 \muL de la
solución tampón y 40 \muL de 1-propanol se
añadieron a cada pocillo aceptor. La placa se cubrió e incubó a
temperatura ambiente en una atmósfera saturada de humedad durante 4
horas bajo agitación orbital de 100 rpm. Después de 4 horas, 150
\muL/pocillo de la placa donadora y 150 \muL/pocillo de la placa
aceptora se transfirieron a viales de HPLC y 100 \muL/cada muestra
se inyectaron en una columna de HPLC fase inversa, columna Symmetry
C_{18} (150 \times 4.6 mm \times 5 \mum, 100 \ring{A},
Waters). El transporte también se confirmó por espectrometría
MALDI-TOF y HPLC-MS de alícuotas de
los pocillos aceptores. La mezcla de fosfolípidos utilizada es un
extracto polar de lípidos de cerebro porcino. Composición:
fosfatidilcolina (PC) 12.6%, fosfatidiletanolamina (PE) 33.1%,
fosfatidilserina (PS) 18.5%, fosfatidilinositol (Pl) 4.1%, ácido
fosfatídico 0.8% y 30.9% de otros compuestos. La permeabilidad
efectiva se calculó utilizando la siguiente ecuación:
donde:
- t
- tiempo (horas)
- CA(t)
- Concentración de compuesto en el pocillo aceptor a tiempo t
- C_{D}(t_{0})
- Concentración de compuesto en el pocillo donador a 0 h
\vskip1.000000\baselineskip
Como control, se evaluó en paralelo el
transporte de propranolol y se calculó el balance de materia para
todos los compuestos estudiados para detectar si tenía lugar
retensión de compuesto en los fosfolípidos.
Los diferentes compuestos se evaluaron por
ensayo PAMPA. El ensayo PAMPA solo mide el transporte por difusión
pasiva, así el transporte positivo medido para estos compuestos
indica que estos compuestos tienen un transporte positivo a través
de la BBB in vivo por difusión pasiva.
En las Tablas 2, 3 y 4, se puede ver como el uso
de la construcción BBB lanzadera-cargo permite que
cargos que no cruzan por ellos mismos, como el ácido nipecótico y la
dopamina, pueden ahora cruzar la membrana por difusión pasiva.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Ejemplo Comparativo 5a:
Nip-N-MePhe-(N-MePhe)_{3}-CONH_{2}
tr: 5.3 min; Ejemplo Comparativo 5b:
Nip-Cha-(N-MePhe)_{3}-CONH_{2}
tr: 5.5 min; Ejemplo Comparativo 5c:
Nip-2Nal-(N-MePhe)_{3}-CONH_{2}
tr: 5.4 min. Espectrometría de masas
(MALDI-TOF):
Dopamina o L-Dopa y ácido
nipecótico son cargos difíciles que no pueden cruzar la BBB por
difusión pasiva en absoluto. Las construcciones BBB
lanzadera-cargo basadas en PhPro han sido óptimas
para hacer cruzar estos cargos. De los resultados comparativos
anteriores se puede derivar que los compuestos de la invención son
claramente mejores BBB-lanzaderas que los compuestos
más próximos del estado de la técnica.
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Para establecer la solubilidad en agua de las
BBB-lanzaderas se realizaron los ensayos siguientes.
En un vial se pesaron 5 mg de cada versión acetilada de la
BBB-lanzadera. Entonces se añadieron 1 mL H_{2}O y
la muestra se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. Después de
este periodo de tiempo, las muestras se filtraron y un volumen
conocido del sobrenadante se liofilizó y se redisolvió en el mismo
volumen de H_{2}O: MeCN (1:1) entonces, 50 \muL se inyectaron en
el HPLC. Utilizando una curva de calibrado, se cuantificó la
concentración de la muestra.
En la Tabla 5, se puede ver como las
BBB-lanzaderas basadas en PhPro tienen una mejor
solubilidad en agua a temperatura ambiente.
Estos resultados muestran que el compuesto (IIb)
es seis veces más soluble que el compuesto lanzadera más próximo del
estado de la técnica descrito por Morteza et al.
Claims (25)
1. Compuesto de fórmula (I), o una sal
farmacéuticamente aceptable del 3 mismo, incluyendo cualquier
estereoisómero o mezclas de estereoisómeros,
donde:
R_{1}, R_{2} y R_{3} se seleccionan
independientemente entre el grupo formado por: H y
(CH_{2})_{q}-R_{6};
R_{4} es un C-radical derivado
de uno de los sistemas de anillo conocidos con 1-4
anillos; los anillos siendo saturados, parcialmente insaturados o
aromáticos; los anillos siendo aislados o parcialmente/totalmente
fusionados y teniendo 5-6 miembros; cada miembro
siendo independientemente seleccionado entre C, CH, CH_{2}, N,
NH, O, y S; los átomos de hidrógeno de estos miembros estando
opcionalmente sustituidos por sustituyentes seleccionados entre
(C_{1}-C_{6})-alquilo,
(C_{1}-C_{6})-alcoxilo y
halógeno;
R_{5} es H o CH_{3}CO-;
R_{6} es un C-radical derivado
de uno de los sistemas de anillo conocidos con 1-2
anillos; los anillos siendo saturados, parcialmente insaturados o
aromáticos; los anillos siendo aislados o parcialmente/totalmente
fusionados y teniendo 5-6 miembros; cada miembro
siendo independientemente seleccionado entre C, CH, CH_{2}, N, NH,
O, y S; los átomos de hidrógeno de estos miembros estando
opcionalmente sustituido por sustituyentes seleccionados entre
(C_{1}-C_{6})-alquilo,
(C_{1}-C_{6})-alcoxilo y
halógeno;
X es un birradical seleccionado entre el grupo
formado por -NH-(CH_{2})_{r}-CO-,
-CO(CH_{2})_{r}CO-,
-S-(CH_{2})_{r},
-S-(CH_{2})_{r}-CO-, -O-(CH_{2})_{r}- y -O-(CH_{2})_{r}-CO-;
-S-(CH_{2})_{r}-CO-, -O-(CH_{2})_{r}- y -O-(CH_{2})_{r}-CO-;
Y se selecciona entre el grupo formado
por-NH_{2}, -OH, -OR_{7} y -NHR_{7};
k es un entero de 0 a 2;
m es un entero de 0 a 1;
n es un entero de 2 a 10;
q es un entero de 0 a 1;
r es un entero de 1 a 3;
R_{7} es un radical
(C_{1}-C_{6})-alquilo;
a condición de que al menos un radical R
seleccionado entre R_{1}, R_{2} y R_{3} es un radical
(CH_{2})_{q}-R_{6} y con la condición
de que cuando el birradical X es
-CO(CH_{2})_{r}CO-, entonces R_{5} es H.
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2. Compuesto según la reivindicación 1, donde n
es un entero de 2 a 4.
3. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1-2, donde Y es -NH_{2}.
\newpage
4. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, donde los miembros del anillo
en R_{6}, en R_{4}, o tanto en R_{6} como en R_{4} se
seleccionan entre C, CH, y CH_{2}.
5. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, donde R_{1}, R_{2} y
R_{3} se seleccionan entre el grupo formado por H, fenilo,
ciclohexilo y 2-naftilo.
6. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1-3 ó 5, donde R_{1} y R_{2}
son H.
7. Compuesto según la reivindicación 6, donde
R_{3} es fenilo.
8. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1-7, donde R_{4} se selecciona
entre el grupo formado por H, fenilo, ciclohexilo y
2-naftilo.
9. Compuesto de fórmula (I) que se selecciona de
la siguiente lista:
Ac-PhPro-(PhPro)_{3}-CONH_{2};
Ac-Cha-(PhPro)_{3}-
CONH_{2}; y Ac-2Nal-(PhPro)_{3}-CONH_{2}.
CONH_{2}; y Ac-2Nal-(PhPro)_{3}-CONH_{2}.
10. Construcción de fórmula (II), o una sal
farmacéuticamente aceptable de la misma, incluyendo cualquier
estereoisómero o mezclas de estereoisómeros,
donde:
R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, X, Y, k, m,
y n son como se definen en la reivindicación 1; y Z es un radical
derivado de una sustancia susceptible de formar un enlace amida o un
enlace éster o un enlace disulfuro con X, dicha sustancia siendo
incapaz de atravesar la barrera hematoencefálica (BBB) por sí
misma.
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11. Construcción según la reivindicación 10,
donde n es un entero de 2 a 4.
12. Construcción según cualquiera de las
reivindicaciones 10-11, donde Yes -NH_{2}.
13. Construcción según cualquiera de las
reivindicaciones 10-12, donde los miembros del
anillo en R_{6}, en R_{4}, o tanto en R_{6} como en R_{4} se
seleccionan entre C, CH, y CH_{2}.
14. Construcción según cualquiera de las
reivindicaciones 10-12, donde R_{1}, R_{2} y
R_{3}, son independientemente seleccionados entre el grupo formado
por H, fenilo, ciclohexilo y 2-naftilo.
15. Construcción según cualquiera de las
reivindicaciones 10-12 o 14, donde R_{1} y R_{2}
son H.
16. Construcción según la reivindicación 15,
donde R_{3} es fenilo.
17. Construcción según cualquiera de las
reivindicaciones 10-16, donde R_{4} se selecciona
entre el grupo formado por fenilo, ciclohexilo y
2-naftilo.
18. Construcción según cualquiera de las
reivindicaciones 10-17, donde Z es un radical
derivado de un principio activo farmacéutico seleccionado entre el
grupo formado por agentes antiretrovirales, agentes
anticancerígenos, agentes anti-psicóticos, agentes
antineurodegenerativos y agentes antiepilépticos.
19. Construcción según la reivindicación 18,
donde el principio activo farmacéutico es dopamina.
20. Construcción según la reivindicación 18,
donde el principio activo farmacéutico es el ácido nipecótico.
21. Composición farmacéutica que comprende una
cantidad terapéuticamente efectiva de la construcción como se define
en cualquiera de las reivindicaciones 10-20, junto
con cantidades apropiadas de excipientes o portadores
farmacéuticamente aceptables.
22. Uso de un compuesto de fórmula (I), tal como
se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-9,
como lanzadera a través de la barrera hematoencefálica.
23. Construcción de fórmula (II) tal como se
define en cualquiera de las reivindicaciones 10-20,
para su uso como medicamento.
24. Uso de la construcción tal como se define en
la reivindicación 19, para la preparación de un medicamento para el
tratamiento de la enfermedad de Parkinson.
25. Uso de la construcción tal como se define en
la reivindicación 20, para la preparación de un medicamento como
anticonvulsivo.
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ES201000930A ES2372847B1 (es) | 2010-07-13 | 2010-07-13 | Compuestos útiles como lanzaderas a través de la barrera hematoencefálica y construcciones lanzadera-cargo. |
PCT/ES2011/070513 WO2012007625A1 (es) | 2010-07-13 | 2011-07-12 | Compuestos útiles como lanzaderas a través de la barrera hematoencefálica y construcciones lanzadera-cargo |
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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ES201000930A ES2372847B1 (es) | 2010-07-13 | 2010-07-13 | Compuestos útiles como lanzaderas a través de la barrera hematoencefálica y construcciones lanzadera-cargo. |
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ID=45446407
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ES201000930A Withdrawn - After Issue ES2372847B1 (es) | 2010-07-13 | 2010-07-13 | Compuestos útiles como lanzaderas a través de la barrera hematoencefálica y construcciones lanzadera-cargo. |
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EP2819700B1 (en) | 2012-02-27 | 2016-12-21 | Universitat de Barcelona | Protease-resistant compounds useful as shuttles through the blood-brain barrier and shuttle-cargo constructs |
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- 2010-07-13 ES ES201000930A patent/ES2372847B1/es not_active Withdrawn - After Issue
-
2011
- 2011-07-12 WO PCT/ES2011/070513 patent/WO2012007625A1/es active Application Filing
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
MALAKOUTIKHAH, M. ET AL.: N-Methyl phenylalanine rich peptides as highly versatile blood brain barrier shuttles". J. Med. Chem. 2010, vol.53, páginas 2354-2363, página 2355, fígura1, página 2359, columna 1, tabla 3. * |
MORADI, M.:"A classical molecular dynamics investigation of the free energy and structurre of short polyproline conformers". Journal of Chemical Physics, 2010, vol. 133 (12) páginas125104/1-125104/18, figura 1. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2012007625A1 (es) | 2012-01-19 |
ES2372847B1 (es) | 2012-12-03 |
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Legal Events
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