WO2011157584A1 - Legionellen-test - Google Patents

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WO2011157584A1
WO2011157584A1 PCT/EP2011/059295 EP2011059295W WO2011157584A1 WO 2011157584 A1 WO2011157584 A1 WO 2011157584A1 EP 2011059295 W EP2011059295 W EP 2011059295W WO 2011157584 A1 WO2011157584 A1 WO 2011157584A1
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Jürgen BÜDDEFELD
Anna Nickisch-Hartfiel
Jan Consbruch
Peter Klauth
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Hochschule Niederrhein
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Definitions

  • the present invention relates to a device and a method for the qualitative and / or quantitative determination of Legionella (Legionella) in water or aqueous solutions.
  • Legionella are a genus of rod-shaped bacteria of the family Legionellaceae. They are aquatic Gram-negative nonspore-forming bacteria that are motile by one or more polar or subpolar flagella. All Legionella are potentially human pathogens. At present, more than 48 species and 70 serogroups are known. The most important species for human disease is Legionella pneumophila, which is considered the causative agent of Legionnaires' disease. Legionella can be found in freshwater as well as in saltwater and find optimal living conditions in a temperature range between 25 ° C and 50 ° C. So they often occur in facilities such as hot water production and - distribution systems, swimming pools, air cleaners in air conditioners, cooling towers, dead pipes, water tanks and the like.
  • a further habitat for legionella are biofilms, ie films of a thin layer of mucus in which microorganisms such as bacteria, fungi or protozoa are embedded and which are often found in wet rooms or at interfaces between water surface and a solid surface such as water. Piping, occur.
  • the invention proposes a device, in particular a portable device for the qualitative and / or quantitative determination of Legionella in water or aqueous solutions, which comprises at least one inlet for introducing a sample volume into a filtration cell, a filtration device, a device for separating immunomagnetically bound Legionella, a detection cell, a device for transferring immunomagnetically bound Legionella into the detection cell, a device for exciting a fluorescence of fluorescently labeled Legionella, and a detector unit for detecting the fluorescence of fluorescently labeled Legionella, wherein the microorganisms contained in a sample volume in the filtration cell by means of the filtration device from the sample volume can be filtered, wherein immuno magnetic labels for selective labeling of Legionella in the retentate of the filtration cell can be introduced, the i mmunomagnetically bound legionella by means of the device of other microorganisms separable and by means of a transfer device in the Detection cell are überilickbar, wherein the
  • the device according to the invention operates in several stages in which microorganisms contained in a defined amount of sample are separated by filtration, the legionella are selectively separated from the separated microorganisms by means of immunomagnetic methods, in order subsequently to be labeled by means of suitable fluorescence markers.
  • the labeled Legionella are excited by a suitable excitation source for fluorescence, which can then be registered by means of a detector and evaluated qualitatively and / or quantitatively by a computer system.
  • the device according to the invention is suitable for temporary or permanent integration into water-bearing systems, such as. Drinking water network, cooling towers, air conditioners, etc.
  • step 1 the device is connected to a water supply to be examined for possible contamination with Legionella, e.g. by means of a standard thread or a quick coupling (Gardena connection).
  • the drain of the device is connected to a drain.
  • Solenoid valves and a downstream flow meter now allow a predetermined amount, e.g. 10 L of water flow through the device according to the invention.
  • stage 2 the water flows through an ultrafiltration cell or a retentostat, for example, with a cell volume of 300 ml.
  • an agitator may be provided to the microorganisms in the volume of the filter cell in To hold suspension.
  • a defined amount of liquid sample for example 10 L, flows through the water-permeable filter membrane, the microorganisms contained are retained and concentrated.
  • the solenoid valves are closed and in the filter cell so-called immunomagnetic beads (eg Dynabeads MAX Legionella) are added, which attach to the Legionella via their antibody gates.
  • Test series with Immunomagnetic beads have shown that even a single cell can safely be removed from a sample volume of eg 300 mL. Due to the high permissible concentration of Legionella in drinking water ( ⁇ 100/100 mL) and the inventively provided filtration of large sample volumes can in the aforementioned example from 10 L of water, the theoretically tolerable 10,000 Legionella (concentrated in 300 mL) safely separated and a detection according to the invention be supplied.
  • stage 3 by means of a "magnetic finger", which can consist of a plastic sheath with internal neodymium-boron-iron magnets, for example, the immunomagnetic beads and thus the legionella attached to them are bound to the plastic outer sheath marked Legionella necessary magnetic field generated by an electromagnet.
  • a "magnetic finger” which can consist of a plastic sheath with internal neodymium-boron-iron magnets, for example, the immunomagnetic beads and thus the legionella attached to them are bound to the plastic outer sheath marked Legionella necessary magnetic field generated by an electromagnet.
  • step 4 the magnetic finger is moved out of the filter cell, e.g. by means of a servo-controlled arm, and into a detection cell, e.g. Transfer a 0.5 mL Eppendorf cuvette.
  • the internal magnet of the magnetic finger is removed, e.g. by means of a servo-controlled iron wire, which is guided into the interior of the magnetic finger, and the plastic outer shell is rinsed, for example, with 100 Ringer solution, wherein the rinsing liquid runs into the detection cell.
  • the adhering immunomagnetically labeled Legionella be transferred to the detection cell.
  • the power supply to the electromagnet can simply be interrupted to detach the bound Legionella.
  • the solution in the detection cell will add a fluorescent label, for example 10 of a SYBR Green solution 1/1000 stick.
  • the content of the detection cell is then excited to fluorescence by means of a suitable excitation source, such as a diode laser, for example, and these are measured.
  • a suitable excitation source such as a diode laser, for example
  • an avalanche diode or an array of avalanche diodes can be used as the detector, although all other types of suitable detectors, such as photomultipliers or CCD sensors, can also be used.
  • the detector unit has an avalanche diode or an array of avalanche diodes, in particular a linear array.
  • Such arrays are also known as multi-pixel photon counters (MPPC, Hamamatsu).
  • Avalanche diodes use the so-called avalanche Effect off. Accelerated by a sufficiently adjusted external field strength, electrons excited by the incident light have such a high energy that, after a collision with a valence electron, they not only make this electron hole pair available as a charge carrier in the conduction band, but they themselves do not recombine and remain in the conduction band. where they can once again generate free charge carriers. As a result, the number of free charge carriers in the conduction band increases in an avalanche-like and exponential manner.
  • An advantage of using avalanche diodes in the detector units of a device according to the invention is that even small light quanta occurring on the detector units lead to a signal that is easily detectable.
  • Individual avalanche diodes can be "blind" for a short time after the triggering of an avalanche (Geiger mode) for further events, so that, if necessary, fast successive photons are not recognized, bypassed by arrays of avalanche diodes, such as the the above-mentioned MPPCs, which exploit the low probability of multi-photon events, ie several photons at the same time in the same place, due to a high number of individual diode pixels in the micrometer grid.
  • the amount of fluorescent light emitted is proportional to the amount of DNA and thus the amount of Legionella.
  • the signal of the MPPC photo detector used can then be converted by means of externally recorded standard curve into a Legionella concentration in 100 mL volume, as required by DVGW worksheet W551.
  • kill of the Legionella in the device may be accomplished by adding a suitable disinfectant or by other means such as heating the contaminated areas of the device to a sufficiently high temperature (e.g.,> 50 ° C) or UV light irradiation.
  • a suitable disinfectant e.g., > 50 ° C
  • UV light irradiation e.g., UV light irradiation
  • a diode laser with a radiation wavelength of 340 nm to 520 nm, preferably 365 nm to 488 nm, in particular 365 nm or 405 nm is used as excitation source for the fluorescence.
  • Such diode lasers are cheap as standardized electronic components durable.
  • blue-emitting diode lasers with a wavelength of 405 nm are used as scanning lasers in Blue-Ray® players and are therefore easily and cheaply available on the market.
  • this has a separation cell into which the filtered-off microorganisms are transferred and in which the immunomagnetic separation of the Legionella from the other filtered-off microorganisms takes place.
  • the immunomagnetic separation and the subsequent fluorescence labeling and detection of the fluorescence takes place in a common cell, so that the separation cell and the detection cell coincide.
  • the immunomagnetically labeled Legionella can be held in such an embodiment by the magnetic finger and the other microorganisms can be flushed out.
  • a suitable fluorescence marker solution is added to the cell and fluorescence is excited by the above-described excitation sources, which can then be detected.
  • At least the filtration cell, the device for separation, the detection cell and the transfer device are arranged in a closed housing.
  • closed housing is to be understood in the context of the invention, such that prevents leakage of Legionella into the environment.
  • the device is designed as a transportable device, so that it can be set up mobile at different locations.
  • the latter has an integrated microprocessor unit which controls the device and on which an evaluation of the detected fluorescence signals takes place.
  • the latter has a communication device, such as a network interface or a GSM module or the like, by means of which the device can be remotely controlled and / or via which the device receives information, such as information. Operating conditions or measurement results can transmit.
  • a communication device such as a network interface or a GSM module or the like, by means of which the device can be remotely controlled and / or via which the device receives information, such as information. Operating conditions or measurement results can transmit.
  • the device according to the invention has a user interface, via which settings can be made on the device and / or measurement results can be read.
  • the object of the invention is achieved by a method for the qualitative and / or quantitative determination of Legionella in water or aqueous solutions, at least comprising the method steps:
  • Excitation of the fluorescence of the fluorescently labeled Legionella with an excitation source, preferably a laser, particularly preferably a diode laser, with a radiation wavelength of 340 nm to 520 nm, preferably 365 nm or 405 nm.
  • an excitation source preferably a laser, particularly preferably a diode laser, with a radiation wavelength of 340 nm to 520 nm, preferably 365 nm or 405 nm.
  • the inventive method is particularly suitable for implementation in a device according to the invention.
  • the inventive combination of filter cell for enrichment without cultivation with downstream immunoseparation and fluorescence measurement it is particularly possible to create as a mobile and autonomous device device for the qualitative and / or quantitative determination of Legionella.
  • MPPC detectors By using MPPC detectors, the measurement acquisition and evaluation can be carried out using standard microprocessors. This has a positive effect on the complexity of the detection process and thus on its costs. Another advantage results from the ever cheaper blue emitting laser diodes or UV diodes laser.
  • Fig. 1 shows the schematic representation of an immunomagnetic bead
  • Fig. 2 shows the schematic structure of an embodiment of an inventive
  • FIG. 3 shows the schematic structure of another embodiment of a device according to the invention.
  • FIG. 1 shows the functional principle of an immunomagnetic bead.
  • a microorganism 101 such as a Legionella
  • the antibody 102 is linked to the particle 103 via corresponding binding sites 105.
  • the particle 103 (bead) can be of different shape.
  • the particles 103 are magnetic and thus can be bonded to a magnet 104. As a result, a magnetic separation of the particles 103 and thus also a separation of the bound to the particles 103 via the antibodies 102 Legionella 101 are possible.
  • FIG. 2 shows an embodiment of a device 1 according to the invention.
  • a sample volume is fed to a filtration cell 3.
  • the filtration cell 3 has a filtration device 7, such as a membrane filter with a pore size of 0.2 ⁇ , on.
  • the permeate can escape via an outlet 5 from the filtration cell 3.
  • In the inlet 2 and / or the outlet 5 are flow meter and valves 4, 6, preferably solenoid valves, provided to interrupt the supply of sample volume upon reaching a predetermined volume.
  • a stirring device 8 is arranged above the filtration device in order to keep the microorganisms contained in the retentate in suspension. After reaching a predetermined sample volume, for example 10 L, the inlet 2 is closed by the solenoid valve 4.
  • the retentate is added from a supply 14 a sufficient amount (10 5 pieces) of legionella-specific immunomagnetic beads, (for example, Dynabeads® MAX Legionella from Invitrogen). After a corresponding reaction time (30 min.), The immunomagnetically labeled Legionella are separated from the other microorganisms present in the retentate by means of a separation device 11.
  • the separation device is designed as a "magnetic finger" which consists of a plastic sleeve 12 with internal neodymium-boron-iron magnets 13, whereby the immunomagnetic beads are bound to the plastic outer sheath 12.
  • This process takes about 30 minutes, during which the stirring device 8 continues to move, after which the separated legionella are transferred by transferring the magnetic finger 11 into a detection cell 17.
  • a transfer device 28 which in the example shown is designed as a servo arm Detection cell 17, which is formed in the example shown by a 0.5 mL Eppendorf cuvette, the internal magnet 13 is removed by means of a servo-driven iron wire, which is guided into the interior of the magnetic finger.
  • the servo arm of the transfer device 28 is used as a manipulator for guiding the iron wire.
  • the plastic outer casing 12 is rinsed with 100 Ringer's solution from storage container 30, the rinsing liquid running into the detection cell 17.
  • the detection cell 17 is supplied with a fluorescence marker from the supply 18, in this case a SYBR Green solution (1/1000 stick, 10 ⁇ ), and the contents of the detection cell 17 are stirred with the plastic outer casing for 10 minutes. Subsequently, the fluorescence is excited by means of an excitation source 20, here a diode laser with a wavelength of 375 nm or 473 nm. The emission wavelength of the system excited to fluorescence is 545 nm, which is detected by the detection unit 21, here an MPPC sensor. A 545/10 nm bandpass filter is provided to the detector. The amount of fluorescent light emitted is proportional to the amount of Legionella. A Legionella DNA has 3.4 x 10 6 base pairs.
  • the dark noise is 10 6 photons / ms at room temperature.
  • the remaining residual dynamics of 10 7 is sufficient for a reliable detection of a Legionella limit. In order to avoid contamination of the environment with Legionella at least the filtration cell 3 and the detection cell 17 are housed in a closed and microorganisms impermeable housing.
  • the legionella in the device is killed by addition of a disinfectant and / or thermal disinfection and / or UV disinfection.
  • the device has corresponding facilities such as storage containers for disinfectant solutions, heaters and UV lamps.
  • the device 1 according to the invention has a separation cell 10 separate from the filtration cell 3, into which the retentate of the filtration is transferred via a transfer line 9 controllable by means of a solenoid valve 29.
  • the immunomagnetic labeling and separation then takes place in the separation cell 10 in FIG previously described with reference to FIG.
  • the residue present in the separation cell which is contaminated with the further microorganisms filtered out, is transferred via a transfer line 16 controllable by means of a magnetic valve 15 into a disinfection chamber 24, in which a killing of the microorganisms contained in the residue by means of the already shown in FIG 1 described measures.
  • the sample in the detection cell which is contaminated with the Legionella is transferred via a controllable by a solenoid valve 22 transfer line 23 in the disinfection chamber 24, in which a killing of microorganisms contained in the residue by means of the already described to FIG Measures are taken.
  • a solenoid valve 25 By opening a solenoid valve 25, the decontaminated residue can then be discharged via line 26 into the outlet 5.
  • at least the separation cell 10, the detection cell 17 and the transfer device 28 are arranged in a closed housing.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung sowie ein Verfahren zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung von Legionellen (Legionella) in Wasser oder wässrigen Lösungen. Mit der Erfindung wird eine Vorrichtung, insbesondere portable Vorrichtung zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung von Legionellen in Wasser oder wässrigen Lösungen vorgeschlagen, welche zumindest einen Zulauf zum Einbringen eines Probevolumen in eine Filtrationszelle, eine Filtrationseinrichtung, eine Einrichtung zur Separation von immunomagnetisch gebundenen Legionellen, eine Detektionszelle, eine Einrichtung zur Überführung immunomagnetisch gebundener Legionellen in die Detektionszelle, eine Einrichtung zur Anregung einer Fluoreszenz fluoreszenzmarkierter Legionellen, sowie eine Detektoreinheit zur Detektion der Fluoreszenz fluoreszenzmarkierter Legionellen aufweist, wobei die in einem Probevolumen enthaltenen Mikroorganismen in der Filtrationszelle mittels der Filtrationseinrichtung aus dem Probevolumen abfiltrierbar sind, wobei immunomagnetische Bindung zur selektiven Markierung von Legionellen in das Retentat der Filtrationszelle einbringbar sind, wobei die immunomagnetisch gebundenen Legionellen mittels der Einrichtung von anderen Mikroorganismen abtrennbar und mittels einer Überführungseinrichtung in die Detektionszelle überführbar sind, wobei die überführten immunomagnetisch gebundenen Legionellen in der Detektionszelle mit einem Fluoreszenzmarker markierbar sind und eine mittels der Anregungsquelle angeregte Fluoreszenz der fluoreszenzmarkierten Legionellen durch den Detektor detektierbar ist.

Description

LEGIONELLEN-TEST
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung sowie ein Verfahren zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung von Legionellen (Legionella) in Wasser oder wässrigen Lösungen.
Legionellen sind eine Gattung stäbchenförmiger Bakterien der Familie der Legionellaceae. Sie sind im Wasser lebende gramnegative nicht sporenbildende Bakterien, die durch eine oder mehrere polare oder subpolare Geißeln beweglich sind. Alle Legionellen sind potenziell als humanpathogen anzusehen. Zurzeit kennt man mehr als 48 Arten und 70 Serogruppen. Die für Erkrankungen des Menschen bedeutsamste Art ist Legionella pneumophila, die als der Erreger der Legionärskrankheit gilt. Legionellen können sowohl in Süßwasser, als auch in Salzwasser vorkommen und finden in einem Temperaturbereich zwischen 25°C und 50°C optimale Lebensbedingungen. So kommen sie häufig in Einrichtungen wie Warmwassererzeugungs- und - Verteilungsanlagen, Schwimmbädern, Luftwäschern in Klimaanlagen, Kühltürmen, Totleitungen, Wassertanks und der gleichen vor. Insbesondere können sie in Warmwasserleitungen oder Kaltwasserleitungen mit Wärmeeinwirkung von außen, welche über längere Zeit nicht genutzt werden, auftreten. Dies kann beispielsweise in Hotels und Krankenhäusern mit unregelmäßiger Zimmernutzung, oder auch öffentlichen Gebäuden wie z.B. Schulen der Fall sein. Ein weiterer Lebensraum für Legionellen sind Biofilme, also Filme aus einer dünnen Schleimschicht, in welche Mikroorganismen wie Bakterien, Pilze oder Protozoen eingebettet sind und wie sie häufig in Feuchträumen oder an Grenzflächen zwischen Wasseroberfläche und einer festen Oberfläche, wie z.B. Rohrleitungen, auftreten.
Eine Übertragung von Legionellen auf Lebewesen wie dem Menschen ist prinzipiell durch Kontakt mit Leitungswasser oder Tröpfcheninfektion möglich, wenn hierbei die Legionellen in die tiefen Lungenabschnitte gelangen. Nicht jeder Kontakt mit legionellenhaltigem Wasser führt dabei jedoch zu einer Gesundheitsgefährdung. Erst durch das Einatmen bakterienhaltigen Wassers als Aerosol, wie beispielsweise die Inhalation kontaminierten Wassers beim Duschen, durch Klimaanlagen, durch Rasensprenger oder in Whirlpools kann zur Erkrankung führen.
In der Bundesrepublik Deutschland ist nach § 7 Infektionsschutzgesetz der direkte oder indirekte Nachweis einer akuten Infektion durch Legionellen durch das diagnostizierende Labor meldepflichtig. Seit 2001 werden solche meldepfhchtige Erkrankungen vom Robert-Koch- Institut in Berlin erfasst. Im Jahr 2004 wurden von diesem 475 gemeldete Legionellosen registriert. Von den bekannt gewordenen Krankheitsfällen mit Legionella-Pneumonie endete die Erkrankung bei vorher gesunden Menschen in etwa 15 % der Fälle tödlich, bei Menschen mit Immunschwäche und vorbestehenden Herz-/Lungenerkrankungen in bis zu 70 %. Der größte Ausbruch einer Legionellen-Epidemie in Deutschland und einer der größten weltweit ereignete sich Anfang Januar 2010 im Raum Ulm mit 5 Toten und 64 Infizierten, welche als Verursachungsquelle auf die zu einem Blockheizkraftwerk gehörigen Kühltürme in der Nähe des Ulmer Hauptbahnhofs zurückgeführt wurde.
Gemäß den Vorgaben des DVGW (Deutscher Verein des Gas- und Wasserfaches e. V) Arbeitsblatt W 551 gilt Trinkwasser bei einem Gehalt von 100 KbE (koloniebildende Einheiten)/ 100 ml als kontaminiert mit einem geringen Infektionsrisiko. Handlungsbedarf ist demnach geboten ab einem Wert von > 10.000 KbE/100 ml, welche Sofortmaßnahmen wie z.B. eine Desinfektion des Leitungsnetzes und die Verhängung eines vorläufigen Nutzungsverbots notwendig macht. Darüber hinaus regelt die Trinkwasserverordnung von 2001 , dass alle öffentlichen Gebäude wie z.B. Schulen, Kindergärten, Krankenhäusern, Gaststätten und sonstigen Gemeinschaftseinrichtungen durch die örtlichen Gesundheitsämter regelmäßig auf etwaige Kontaminationen durch Legionellen untersucht werden müssen. Auch Wohngebäude und industriell genutzte Anlagen können bei Bedarf in eine Überwachung einbezogen werden. Grundvoraussetzung hierfür ist die Beachtung der chemischen und physikalisch-technischen Parameter der Trinkwasserverordnung und die Berücksichtigung der allgemein anerkannten Regeln der Technik, u.a. div. DIN- Verordnungen, der VDE-Richtlinie 6023 und den Arbeitsblättern W 551 und W 553 des DVGW.
Von Yanez, M.A., et. al. wird in "Quantitative detection of Legionella pneumophila in water samples by immunomagnetic purification and real-time PCR amplification of the dotA gene", Applied and Enviromental Microbiology, Vol. 71 , Nr. 7, 07, S. 3434-3436, ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Legionella pneumophila in Wasserproben mittels immunomagnetischer Reinigung und echt-zeit PCR-Amplifikation von dotA Genen beschrieben. Von Füchslin et. al. wird in "Rapid and quantitative detection of Legionalla pneumophila applying immunomagnetic Separation and flow cytometry", Cytometry Part A, 77A, 03/2010, S.264-274, ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Legionella Pneumophilia in Wasserproben mittels einer Kombination aus immunomagnetischer Separation und Durchflusscytometrie beschrieben.
Der bisherige Stand der Technik sieht die Probenahme vor Ort und den Nachweis in einem für die Untersuchung auf Legionellen ausgerüstetes Handelslabor oder Labor des Gesundheitsamtes vor. Mit diesen Methoden können die großen zu untersuchenden Wassermengen, wie sie in der seit 2001 geltende Verordnung vorgeschrieben ist, nicht problemlos analysiert werden. Darüber hinaus müssen die Untersuchungen von entsprechend geschultem Fachpersonal durchgeführt werden, sind oftmals langwierig und dazu relativ kostspielig.
Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine Vorrichtung sowie ein Verfahren anzugeben, mit welchen eine kostengünstige und schnelle Untersuchung auf eine etwaige Kontamination mit Legionellen vor Ort ohne Einbeziehung von Fachpersonal möglich ist.
Gelöst wird diese Aufgabe hinsichtlich der Vorrichtung durch den Gegenstand des Anspruchs 1 und hinsichtlich des Verfahrens durch ein Verfahren gemäß Anspruch 10. Ausgestaltungen der Erfindung finden sich in den Unteransprüchen sowie der nachfolgenden Beschreibung.
Mit der Erfindung wird eine Vorrichtung, insbesondere portable Vorrichtung zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung von Legionellen in Wasser oder wässrigen Lösungen vorgeschlagen, welche zumindest einen Zulauf zum Einbringen eines Probevolumen in eine Filtrationszelle, eine Filtrationseinrichtung, eine Einrichtung zur Separation von immunomagnetisch gebundenen Legionellen, eine Detektionszelle, eine Einrichtung zur Überführung immunomagnetisch gebundener Legionellen in die Detektionszelle, eine Einrichtung zur Anregung einer Fluoreszenz fluoreszenzmarkierter Legionellen, sowie eine Detektoreinheit zur Detektion der Fluoreszenz fluoreszenzmarkierter Legionellen aufweist, wobei die in einem Probevolumen enthaltenen Mikroorganismen in der Filtrationszelle mittels der Filtrationseinrichtung aus dem Probevolumen abfiltrierbar sind, wobei immuno magnetische Markierungen zur selektiven Markierung von Legionellen in das Retentat der Filtrationszelle einbringbar sind, wobei die immunomagnetisch gebundenen Legionellen mittels der Einrichtung von anderen Mikroorganismen abtrennbar und mittels einer Überführungseinrichtung in die Detektionszelle überiührbar sind, wobei die überführten immunomagnetisch gebundenen Legionellen in der Detektionszelle mit einem Fluoreszenzmarker markierbar sind und eine mittels der Anregungsquelle angeregte Fluoreszenz der fluoreszenzmarkierten Legionellen durch den Detektor detektierbar ist.
Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist es erstmals möglich, den nach § 3 Nr. 2 Buchstabe c TrinkwV 2001 geforderten Nachweis auf Abwesenheit von Legionellen mittels eines vorzugsweise mobilen und automatisch arbeitenden Gerätes ohne Fachpersonal und ohne Verletzung des Infektionsschutzgesetzes § 44 ff. durchzuführen.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung arbeitet in mehreren Stufen, in welchen in einer definierten Probemenge enthaltene Mikroorganismen mittels Filtration abgetrennt, die Legionellen aus den abgetrennten Mikroorganismen selektiv mittels immunomagnetischer Methoden separiert werden, um anschließend mittels geeigneter Fluoreszenzmarker markiert zu werden. Die markierten Legionellen werden durch eine geeignete Anregungsquelle zur Fluoreszenz angeregt, welche anschließend mittels eines Detektors registriert und über ein Rechnersystem qualitativ und/oder quantitativ ausgewertet werden kann. Insbesondere eignet sich die erfindungsgemäße Vorrichtung zur temporären oder permanenten Integration in wasserführende Systeme, wie z.b:. Trinkwasserleitungsnetz, Kühltürme, Klimaanlagen etc.
In Stufe 1 wird die Vorrichtung an eine auf etwaige Kontamination mit Legionellen zu untersuchende Wasserversorgung angeschlossen, z.B. mittels eines Standardgewindes oder einer Schnellkupplung (Gardena-Anschluss). Der Ablauf der Vorrichtung wird mit einem Abfluss verbunden. Magnetventile und ein nachgeschalteter Durchflussmengenzähler lassen nun eine zuvor festgelegte Menge, z.B. 10 L an Wasser durch die erfindungsgemäße Vorrichtung fließen.
In Stufe 2 fließt das Wasser durch eine Ultrafiltrationszelle oder einen Retentostat, beispielsweise mit einem Zellenvolumen von 300 ml. Oberhalb der Filtermembran, welche beispielsweise eine Porenweite von 0,2 μιη aufweist, kann ein Rührwerk vorgesehen sein, um die Mikroorganismen im Volumen der Filterzelle in Suspension zu halten. Eine definierte Flüssigkeitsmenge an Probe, z.B. 10 L, fließt über die wasserdurchlässige Filtermembran ab, die enthaltenen Mikroorganismen werden zurückgehalten und aufkonzentriert. Nach Durchlauf des zuvor festgelegten Volumens werden die Magnetventile geschlossen und in die Filterzelle werden sogenannte immunomagnetische Beads (z.B. Dynabeads MAX Legionella) zugegeben, welche sich über ihre Antikörperanschnitte an die Legionellen anlagern. Versuchsreihen mit immunomagnetischen Beads haben gezeigt, dass selbst eine einzige Zelle aus einem Probevolumen von z.B. 300 mL sicher entfernt werden kann. Aufgrund der hohen zulässigen Konzentration an Legionellen im Trinkwasser (< 100/ 100 mL) und der erfindungsgemäß vorgesehenen Filtration von großen Probevolumina können im zuvor genannten Beispiel aus 10 L Wasser die theoretisch zulässigen 10.000 Legionellen (eingeengt in 300 mL)sicher separiert und einer erfindungsgemäßen Detektion zugeführt werden.
In Stufe 3 werden mittels eines „Magnetischen Fingers", welcher beispielsweise aus einer Kunststoffhülle mit innenliegenden Neodym-Bor-Eisen-Magneten bestehen kann, die immunomagnetischen Beads und damit die an sie angelagerten Legionellen an die Kunststoffaußenhülle gebunden. Alternativ kann das zur Anlagerung der immunomagnetisch markierten Legionellen notwendige Magnetfeld durch einen Elektromagneten erzeugt werden.
In Stufe 4 wird der magnetische Finger aus der Filterzelle heraus bewegt, z.B. mittels eines servo gesteuerten Arms, und in ein Detektionszelle, z.B. eine 0,5 mL Eppendorf-Küvette übertragen. Der innenliegende Magnet des magnetischen Fingers wird entfernt, z.B. mittels eines servo gesteuerten Eisendrahtes, der in das Innere des magnetischen Fingers geführt wird, und die Kunststoffaußenhülle wird abgespült, beispielsweise mit 100 Ringerlösung, wobei die Spülflüssigkeit in die Detektionszelle läuft. Hierdurch werden die anhaftenden immunomagnetisch markierten Legionellen in die Detektionszelle überführt. In einer Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit einem Elektromagneten der immunomagnetisch gebundenen Legionellen an einen magnetischen Finger kann zur Ablösung der gebundenen Legionellen einfach die Stromzufuhr zum Elektromagneten unterbrochen werden.
In Stufe 5 wird der in der Detektionszelle befindlichen Lösung ein Fluoreszenzmarker zugeben, z.B. 10 einer SYBR Green Lösung 1/1000 Stock. Der Inhalt der Detektionszelle wird danach mittels einer geeigneten Anregungsquelle, wie beispielsweise einem Dioden-Laser, zur Fluoreszenz angeregt und diese vermessen. Als Detektor kann hierbei beispielsweise eine Avalanche-Diode oder ein Array von Avalanche-Dioden zum Einsatz gelangen, wobei jedoch auch alle weiteren Arten von geeigneten Detektoren, wie z.B. Photomultiplier oder CCD- Sensoren eingesetzt werden können. In einer Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung weist die Detektoreinheit eine Avalanche-Diode oder ein Array von Avalanche-Dioden, insbesondere ein lineares Array, auf. Solche Arrays sind auch als Multi-Pixel-Photon-Counter (MPPC, Firma Hamamatsu) bekannt. Avalanche-Dioden nutzen den sogenannten Avalanche- Effekt aus. Beschleunigt durch eine hinreichend eingestellte äußerer Feldstärke besitzen durch das auftreffende Licht angeregten Elektronen eine so große Energie, dass sie nach einem Stoß mit einem Valenzelektron nicht nur dieses Elektronen-Lochpaar als Ladungsträger im Leitungsband verfügbar machen, sondern selbst nicht rekombinieren und weiterhin im Leitungsband verbleiben, wo sie nochmals freie Ladungsträger erzeugen können. Hierdurch wächst die Anzahl der freien Ladungsträger im Leitungsband lawinenartig und exponentiell an. Ein Vorteil bei der Verwendung von Avalanche-Dioden in den Detektoreinheiten einer erfindungsgemäßen Vorrichtung besteht darin, dass bereits geringe auf die Detektoreinheiten auftretende Lichtquanten zu einem gut detektierbaren Signal führen. Einzelne Avalanche-Dioden können nach dem auslösen einer Lawine (Geiger-Modus) kurze Zeit für weitere Ereignisse „blind" sein, so dass ggf. schnell aufeinander folgende Photonen nicht erkannt werden. Umgangen wird dies durch Arrays von Avalanche-Dioden, wie z.B. die die o.g. MPPCs, die durch eine hohe Zahl einzelner Dio den-Pixel im Mikrometerraster die geringe Wahrscheinlichkeit von Multiphotonenereigmssen, d.h. mehrere Photonen zur gleichen Zeit Am gleichen Ort, ausnutzen.
Die Menge an emittiertem Fluoreszenzlicht ist der Menge an DNS und somit der Menge an Legionellen proportional. Das Signal des beispielsweise verwendeten MPPC Photo detektors kann dann mittels extern aufgenommener Standardkurve in eine Legionellenkonzentration in 100 mL Volumen umgerechnet werden, wie sie nach DVGW Arbeitsblatt W551 gefordert ist.
In einer optionalen Stufe 6 kann eine Abtötung der Legionellen in der Vorrichtung durch Zugabe eines geeigneten Desinfektionsmittels oder durch andere Maßnahmen wie erwärmen der kontaminierten Bereiche der Vorrichtung auf eine hinreichend hohe Temperatur (z.B. >50°C) oder Bestrahlen mit UV-Licht erfolgen.
In einer Ausgestaltung der Erfindung wird als Anregungsquelle für die Fluoreszenz ein Dioden- Laser mit einer Strahlungswellenlänge von 340 nm bis 520 nm, vorzugsweise 365 nm bis 488 nm, insbesondere 365 nm oder 405 nm eingesetzt. Solche Dioden-Laser sind als standardisierte elektronische Bauteile günstig langlebig. So werden beispielsweise blau abstrahlende Dioden- Laser mit einer Wellenlänge von 405 nm als Abtastlaser in Blue-Ray®- Abspielgeräten verbaut und sind daher am Markt leicht und günstig verfügbar. In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung weist diese eine Separationszelle auf, in welche die abfiltrierten Mikroorganismen überführt werden und in welcher die immunomagnetische Separation der Legionellen von den anderen abfiltrierten Mikroorganismen erfolgt.
In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung erfolgt die immunomagnetische Separation und die anschließende Fluoreszenzmarkierung und Detektion der Fluoreszenz in einer gemeinsamen Zelle, so dass Separationszelle und Detektionszelle zusammenfallen. Die immunomagnetisch markierten Legionellen können in einer solchen Ausgestaltung durch den magnetischen Finger festgehalten werden und die übrigen Mikroorganismen können ausgespült werden. Anschließend wird eine geeignete Fluoreszenzmarker-Lösung der Zelle zugesetzt und eine Fluoreszenz durch die zuvor beschriebenen Anregungsquellen angeregt, welche dann detektiert werden kann.
In einer weiteren Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind zumindest die Filtrationszelle, die Einrichtung zur Separation, die Detektionszelle und die Überführungseinrichtung in einem geschlossenen Gehäuse angeordnet. Unter geschlossenem Gehäuse ist dabei im Sinne der Erfindung ein solches zu verstehen, welches ein Austreten von Legionellen in die Umwelt verhindert.
In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist die Vorrichtung als transportable Vorrichtung ausgeführt, so dass sie mobil an unterschiedlichen Einsatzorten aufgestellt werden kann.
In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung weist diese eine integrierte Mikroprozessoreinheit auf, welche die Vorrichtung steuert und auf welcher eine Auswertung der detektierten Fluoreszenzsignale erfolgt.
In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung weist diese eine Kommunikationseinrichtung, wie beispielsweise eine Netzwerkschnittstelle oder ein GSM-Modul oder dergleichen auf, mittels welcher die Vorrichtung ferngesteuert werden kann und/oder über welche die Vorrichtung Informationen, wie z.B. Betriebszustände oder Messergebnisse übermitteln kann.
In einer weiteren Ausgestaltung weist die erfindungsgemäße Vorrichtung eine Benutzerschnittstelle auf, über welche Einstellungen an der Vorrichtung erfolgen können und/oder Messergebnisse abgelesen werden können. Hinsichtlich des Verfahrens wird die Aufgabe der Erfindung durch ein Verfahren zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung von Legionellen in Wasser oder wässrigen Lösungen gelöst, zumindest aufweisend die Verfahrensschritte:
-Einleiten eines definierten Probevolumens in eine Filtrationszelle;
-Abtrennen der in dem Probenvolumen enthaltenen Mikroorganismen mittels Ultrafiltration; -Überführen der abgetrennten Mikroorganismen in eine Separationszelle;
-Selektive immunomagnetische Markierung der in den abgetrennten Mikroorganismen enthaltenen Legionellen;
-Separieren der immunomagnetisch markierten Legionellen;
-Überführen der separierten immunomagnetisch markierten Legionellen in eine Detektionszelle; -Markieren der überführten Legionellen mit einer Fluoreszenzmarkierung, vorzugsweise SYBR Green;
-Anregung der Fluoreszenz der fluoreszenzmarkierten Legionellen mit einer Anregungsquelle, vorzugsweise einem Laser, besonders bevorzugt einem Dioden-Laser, mit einer Strahlungswellenlänge von 340 nm bis 520 nm, vorzugsweise 365 nm oder 405 nm.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere zur Ausführung in einer erfindungsgemäßen Vorrichtung geeignet.
Durch die erfindungsgemäße Kombination aus Filterzelle zur Anreicherung ohne Kultivierung mit nachgeschalteter Immunoseparation und Fluoreszenzmessung ist es insbesondere möglich eine als mobiles und autonomes Gerät Vorrichtung zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung von Legionellen zu schaffen. Durch die Verwendung von MPPC-Detektoren kann die Messwertaufnahme und -auswertung mittels Standard-Mikroprozessoren durchgeführt werden. Dies hat eine positive Auswirkung auf die Komplexizität des Dektektionsverfahrens und somit auf dessen Kosten. Ein weiterer Vorteil ergibt sich durch die immer günstiger werdenden blauen emittierenden Laser Dioden oder UV-Dioden Laser.
Die Erfindung ist nachfolgend anhand von Figuren und Ausführungsbeispielen näher erläutert, ohne dass die Erfindung jedoch auf diese Ausführungsbeispiele begrenzt ist.
Fig. 1 zeigt die schematische Darstellung eines immunomagnetischen Beads;
Fig. 2 zeigt den schematischen Aufbau einer Ausgestaltung einer erfindungsgemäßen
Vorrichtung; Fig. 3 zeigt den schematischen Aufbau einer weiteren Ausgestaltung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung.
In Fig. l ist das Funktionsprinzip eines immunomagnetischen Beads gezeigt. Ein Mikroorganismus 101, wie beispielsweise eine Legionelle wird über einen spezifischen Antikörper 102 oder Antikörperabschnitt an ein Partikel 103 gebunden. Der Antikörper 102 ist mit dem Partikel 103 über entsprechende Bindungsstellen 105 verbunden. Durch sein spezifisches Anbinden an Epitope bestimmte Mikroorganismen kann so ein Mikroorganismus hochspezifisch an ein Partikel 103 gebunden werden. Das Partikel 103 (Bead) kann unterschiedlicher Gestalt sein. Im Fall der vorliegenden Erfindung sind die Partikel 103 magnetisch und können somit an einen Magneten 104 gebunden werden. Hierdurch sind eine magnetische Abtrennung der Partikel 103 und somit ebenfalls eine Abtrennung der an die Partikel 103 über die Antikörper 102 angebundenen Legionellen 101 möglich.
Fig. 2 zeigt eine Ausgestaltung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung 1. Über einen Einlauf 2 wird ein Probenvolumen einer Filtrationszelle 3 zugeführt. Die Filtrationszelle 3 weist eine Filtrationseinrichtung 7, wie beispielsweise einen Membranfilter mit einer Porenweite von 0,2 μιη, auf. Das Permeat kann über einen Auslauf 5 aus der Filtrationszelle 3 austreten. Im Zulauf 2 und/oder dem Auslauf 5 sind Durchflussmesser und Ventile 4, 6, vorzugsweise Magnetventile, vorgesehen, um den Zulauf von Probenvolumen bei Erreichung eines vorgebbaren Volumens zu unterbrechen. Oberhalb der Filtrationseinrichtung ist ein eine Rühreinrichtung 8 angeordnet, um die im Retentat enthaltenen Mikroorganismen in Suspension zu halten. Nach Erreichen eines vorgegeben Probenvolumens, z.B. 10 L, wird der Zulauf 2 durch das Magnetventil 4 geschlossen. Dem Retentat wird aus einem Vorrat 14 eine hinreichende Menge (105 Stück) an für Legionellen spezifischen immunomagnetischen Beads zugegeben, (beispielsweise Dynabeads® MAX Legionella der Firma Invitrogen). Nach einer entsprechenden Reaktionszeit (30 Min.) werden mittels einer Separationseinrichtung 11 die immunomagnetisch markierten Legionellen von den anderen im Retentat befindlichen Mikroorganismen separiert. Die Separationseinrichtung ist in der gezeigten Ausführungsform als„Magnetischer Finger" ausgebildet, welcher aus einer Kunststoffhülle 12 mit innenliegenden Neodym-Bor-Eisen- Magneten 13 besteht, wodurch die immunomagnetischen Beads an die Kunststoffaußenhülle 12 gebunden werden. Dieser Vorgang dauert ca. 30 Minuten, währenddessen die Rühreinrichtung 8 weiter rührt. Anschließend werden die separierten Legionellen durch Überführen des magnetischen Fingers 11 in eine Detektionszelle 17 überführt. Dies erfolgt mittels einer Überführungseinrichtung 28, welche im gezeigten Beispiel als Servoarm ausgebildet ist. In der Detektionszelle 17, welche im gezeigten Beispiel durch eine 0,5 mL Eppendorf- Küvette gebildet ist, wird der innenliegende Magnet 13 mittels eines durch einen servobewegten Eisendrahtes entfernt, der in das Innere des magnetischen Fingers geführt wird. Als Manipulator zu Führung des Eisendrahtes dient der Servoarm der Überführungseinrichtung 28. Die Kunststoffaußenhülle 12 wird mit 100 Ringerlösung aus Vorratsbehälter 30 abgespült, wobei die Spülflüssigkeit in die Detektionszelle 17 läuft. Der Detektionszelle 17 wird aus Vorrat 18 ein Fluoreszenzmarker, hier eine SYBR Green Lösung (1/1000 Stock, 10 μί) zugeführt und der Inhalt der Detektionszelle 17 wird mit der Kunststoffaußenhülle 10 min gerührt. Anschließend wird die Fluoreszenz mittels einer Anregungsquelle 20, hier einem Dioden-Laser mit einer Wellenlänge von 375 nm oder 473 nm, angeregt. Die Emissionswellenlänge des so zur Fluoreszenz angeregten Systems liegt bei 545 nm, welche über die Detektionseinheit 21 , hier ein MPPC- Sensor, detektiert wird. Ein Bandpassfilter für 545/10 nm ist dem Detektor vorgesetzt. Die Menge an emittiertem Fluoreszenzlicht ist der Menge an Legionellen proportional. Eine Legionellen-DNA besitzt 3,4 x 106 Basenpaare. SYBR Green fluoresziert bei 10 Molekülen pro Basenpaar am intensivsten. Der Grenzwert für Legionellen ist 104. Es werden somit bei der Fluoreszenz 3,4 x 106 x 10 x 104 = 3,4 x 1011 Photonen emittiert, abzüglich den folgenden Verluste:
Quantenausbeute 50 %; Verluste bei der Detektion durch die kugelförmige Ausbreitung der Fluoreszenz 90 % = 3,4 x 1011 x 0,5 x 0,1 = 1,7 x 1010 Photonen pro Fluoreszenzzyklus, also in 1 μβ. Durch Integration des MPPC Moduls auf 1 ms erhält man dann 1 ,7 x 1010 Photonen x 1.000 = 1 , 7 x 1 013 Photonen/ms. Das Dunkelrauschen beträgt bei Raumtemperatur 106 Photonen/ms. Die verbleibende Restdynamik von 107 ist für eine sichere Detektion eines Legionellen-Grenzwertes ausreichend. Um eine Kontaminierung der Umwelt mit Legionellen zu vermeiden sind zumindest die Filtrationszelle 3 und die Detektionszelle 17 in einem geschlossenen und für Mikroorganismen undurchlässigen Gehäuse untergebracht. Nach Abschluss der Messung erfolgt eine Abtötung der in der Vorrichtung befindlichen Legionellen durch Zugabe eines Desinfektionsmittels und/oder thermischer Desinfektion und/oder UV- Desinfektion. Hierzu weist die Vorrichtung entsprechende Einrichtungen wie Vorratsbehältnisse für Desinfektionslösungen, Heizeinrichtungen und UV-Lampen auf.
Fig. 3 zeigt eine weitere Ausgestaltung einer Erfindungsgemäßen Vorrichtung 1. In der gezeigten Ausführungsform weist die erfindungsgemäße Vorrichtung 1 eine von der Filtrationszelle 3 getrennte Separationszelle 10 auf, in welche das Retentat der Filtration über eine mittels eines Magnetventils 29 steuerbare Überführungsleitung 9 überführt wird. Die immunomagnetische Markierung und Separation erfolgt dann in der Separationszelle 10 in der zuvor zu Fig. 1 beschriebenen Weise. Nach der immunomagnetischen Separation wird der in der Separationszelle befindliche Rückstand, welcher mit den weiteren ausfiltrierten Mikroorganismen kontaminiert ist über eine mittels eines Magnetventils 15 steuerbare Überführungsleitung 16 in eine Desinfektionskammer 24 überführt, in welcher eine Abtötung der in dem Rückstand enthalten Mikroorganismen mittels der bereits zu Fig. 1 beschriebenen Maßnahmen erfolgt. Nach der Fluoreszenzmessung wird die in der Detektionszelle befindliche Probe, welche mit den Legionellen kontaminiert ist über eine mittels eines Magnetventils 22 steuerbare Überführungsleitung 23 in die Desinfektionskammer 24 überführt, in welcher eine Abtötung der in dem Rückstand enthalten Mikroorganismen mittels der bereits zu Fig. 1 beschriebenen Maßnahmen erfolgt. Durch Öffnen einen Magnetventils 25 kann dann der dekontaminierte Rückstand über Leitung 26 in den Auslauf 5 entlassen werden. In einer solchen Ausführungsform sind zumindest die Separationszelle 10, die Detektionszelle 17 und die Überführungseinrichtung 28 in einem geschlossenen Gehäuse angeordnet.

Claims

Patentansprüche
1. Vorrichtung, insbesondere portable Vorrichtung ( 1 ) zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung von Legionellen in Wasser oder wässrigen Lösungen, zumindest aufweisend einen Zulauf (2) zum Einbringen eines Probevolumen in eine Filtrationszelle (3), eine Filtrationseinrichtung (7), eine Einrichtung (11) zur Separation von immunomagnetisch gebundenen Legionellen, eine Detektionszelle (17), eine Einrichtung zur Überführung immunomagnetisch gebundener Legionellen in die Detektionszelle (17), eine Einrichtung (20) zur Anregung einer Fluoreszenz fluoreszenzmarkierter Legionellen, sowie einen Detektor (21) zur Detektion der Fluoreszenz fluoreszenzmarkierter Legionellen, wobei die in einem Probevolumen enthaltenen Mikroorganismen in der Filtrationszelle (3) mittels der Filtrationseinrichtung (7) aus dem Probevolumen abfiltrierbar sind, wobei immunomagnetische Bindungen zur selektiven Markierung von Legionellen in das Retentat der Filtrationszelle (3) einbringbar sind, wobei die immunomagnetisch gebundenen Legionellen mittels der Einrichtung ( 1 1 ) von anderen Mikroorganismen abtrennbar und mittels einer Überführungseinrichtung (28) in die Detektionszelle (17) überführbar sind, wobei die überführten immunomagnetisch gebundenen Legionellen in der Detektionszelle (17) mit einem Fluoreszenzmarker markierbar sind und eine mittels der Anregungsquelle (20) angeregte Fluoreszenz der fluoreszenzmarkierten Legionellen durch den Detektor (21) detektierbar ist.
2. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 , wobei die Filtrationszelle (3) als Filtrationseinrichtung (7) einen Membranfilter aufweist.
3. Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Einrichtung (1 1) zur Separation von immunomagnetisch markierten Legionellen eine äußere Hülle (12) und einen in dieser Hülle angeordneten Magneten (13) aufweist.
4. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei diese eine Einrichtung (24) zur Abtötung von in der Vorrichtung (1) nach einer qualitativen und/oder quantitativen Legionellenbestimmung befindlichen Mikroorganismen aufweist.
Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die in der Filtrationszelle (3) oberhalb der Filtrationseinrichtung (7) eine Rührwerk (8) aufweist.
Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei diese als Zulauf (2) einen Standardgewindeanschluss und/oder einen Standardgartenanschluss aufweist.
Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Detektor (21) einen MPPC-Sensor aufweist.
Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Anregungsquelle (20) durch einen Dioden-Laser mit einer Wellenlänge von 340 nm bis 520 nm, vorzugsweise 365 nm bis 488 nm, insbesondere 365 nm oder 405 nm aufweist.
Verfahren zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung von Legionellen in Wasser oder wässrigen Lösungen, zumindest aufweisend die Verfahrensschritte:
- Einleiten eines definierten Probevolumens in eine Filtrationszelle (3);
- Abtrennen der in dem Probenvolumen enthaltenen Mikroorganismen mittels Ultrafiltration;
- Überführen der abgetrennten Mikroorganismen in eine Separationszelle (10);
- Selektive immunomagnetische Bindung der in den abgetrennten Mikroorganismen enthaltenen Legionellen;
- Separieren der immunomagnetisch gebundenen Legionellen;
- Überführen der separierten immunomagnetisch gebundenen Legionellen in eine Detektionszelle;
- Markieren der überführten Legionellen mit einer Fluoreszenzmarkierung, vorzugsweise SYBR Green;
- Anregung der Fluoreszenz der fluoreszenzmarkierten Legionellen mit einer Anregungsquelle (20), vorzugsweise einem Laser, besonders bevorzugt einem Dioden- Laser, mit einer Strahlungswellenlänge von 340 nm bis 520 nm, vorzugsweise 365 nm bis 488 nm, insbesondere 365 nm, 375 nm, 405 nm oder 473 nm; - Detektion der angeregten Fluoreszenz mittels eines Detektors (21), vorzugsweise eines MPPC-Sensors; und
- Bestimmung der Legionellenkonzentration im Probenvolumen auf Basis der gemessenen Fluoreszenz.
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