WO2011147797A2 - Hybrid-verbindung, deren verwendung und verfahren zu deren herstellung - Google Patents

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WO2011147797A2
WO2011147797A2 PCT/EP2011/058396 EP2011058396W WO2011147797A2 WO 2011147797 A2 WO2011147797 A2 WO 2011147797A2 EP 2011058396 W EP2011058396 W EP 2011058396W WO 2011147797 A2 WO2011147797 A2 WO 2011147797A2
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peptide
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hybrid compound
compound
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Thomas Schrader
Julia MÄRZ-BERBERICH
Andreas Müller-Schiffmann
Carsten Korth
Susanne Aileen Funke
Luitgard Nagel-Steger
Dirk Bartnik
Oleksandr Brener
Dieter Willbold
Anselm Horn
Heinrich Sticht
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Forschungszentrum Jülich GmbH
Universität Duisburg-Essen
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/545—Heterocyclic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to a hybrid compound based on aminopyrazoles and peptides for use as a therapeutic in the treatment of diseases in which an aberrant protein aggregation or multimerization or a protein misfolding plays a role. Furthermore, the invention relates to a process for the preparation of these compounds.
  • AD Alzheimer's disease
  • the A beta-peptide is formed by the activity of at least two different proteases from a precursor protein called "amyloid precursor protein” (APP), which is localized in the cell wall of neurons and is produced by the proteolytic degradation of APP and subsequent modification. beta-fragments of different length and type
  • APP amyloid precursor protein
  • beta-fragments of different length and type The amyloid cascade hypothesis was postulated in the 1990's and postulates that the deposition of A-beta in the form of plaques is the cause of the disease symptoms. Different studies indicate that smaller, freely diffusible A- beta-oligomers are more toxic than the plaque-deposited A-beta fibrils.
  • TSE transmissible spongiform encephalopathies
  • CJD human Creutzfeldt-Jakob disease
  • BSE bovine spongiform encephalopathy
  • Alzheimer's disease and prion diseases differ markedly at the pathophysiological level, it has been shown that beta-sheet-rich A-beta oligomers and beta-sheet-rich PrP Sc are recognized by the same conformation-specific antibody.
  • A-beta oligomers are e.g. Peptides as described in PCT / EP 02/03862 A or WO 02/081505 A2.
  • the object of the present invention is to provide those compounds which, by virtue of their specific mode of action, show no side effects which could later lead to any undesired side effects. Furthermore, the compounds of the invention should be effective even in small concentrations in order to avoid side effects in this way.
  • the compounds according to the invention are intended to specifically recognize toxic preventive and, where appropriate, dissolve or convert into non-toxic compounds toxic A-beta oligomers or multimers or aggregates thereof or protein misfoldings.
  • hybrid compound of the formula AB which is characterized characterized in that A is an aminopyrazole derivative, and B is a peptide, wherein A and B are covalently linked to each other directly or by means of a linker.
  • An aminopyrazole derivative according to the invention is 3-aminopyrazole-5-carboxylic acid or 3-nitropyrazole-5-carboxylic acid and all derivatives in which the heterocyclic CH group is replaced by -CR- or -N- or -O- or -S- and all derived peptidic dimers, trimers or tetramers.
  • aminopyrazole derivative is used as a generic term for the above-mentioned derivatives of 3-aminopyrazole-5-carboxylic acid and its dimers, trimers and tetramers.
  • the aminopyrazole trimer is used as compound A.
  • peptide B is a D-peptide.
  • D-peptides are peptides which preferably contain only or consist of D-amino acids.
  • the D-peptides also have partial L-amino acids.
  • "Partial" L-amino acids means that 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more amino acids are homologous to the amino acid sequence of the D-amino acid D-peptide through the same amino acid in each case L-conformation are replaced.
  • D-peptides in one variant consist of a retro-inverse sequence to the amyloid beta-peptide or amyloid beta-peptide subfragments and all of D-amino acids.
  • a "partial fragment” consists of 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 or more amino acids homologous to the amino acid sequence of the amyloid beta peptide
  • the D-peptides have the sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 in a further variant of the D-peptides according to the invention D to the multimerization of the amyloid beta peptide and consist entirely of D-amino acids.
  • the peptide comprises the sequence motif SHYRHISP (SEQ ID NO: 3) or active fragments thereof.
  • the peptide comprises the sequence motif GISWQQSHHLVA (SEQ ID NO: 4) or active fragments thereof.
  • the peptide comprises the Sequence motif PRTRLHTH (SEQ ID NO: 5) or active fragments thereof.
  • the peptide is selected from the group consisting of peptides having the D-amino acid sequences: a) QSHYRHISPAQV (SEQ ID NO: 6); b) QSHYRHISPDQV (SEQ ID NO: 7); c) QSHYRHISPAR (SEQ ID NO: 8); d) KSHYRHISPAKV (SEQ ID NO: 9); e) RPRTRLHTHRNR (SEQ ID NO: 10); i) RPRTRLHTHRTE (SEQ ID NO: 11); and g) KPRTRLHTHRNR (SEQ ID NO: 12); Also preferred are sequences which differ from the sequences a) to g) by up to three amino acids; and sequences comprising sequences a) to g) and sequences differing from sequences a) to g) by up to three amino acids.
  • the D-peptides have fragments of the abovementioned sequences or have homologous sequences to the abovementioned sequences.
  • Homologous sequences in the sense of the invention means that an amino acid sequence has an identity with at least one of the abovementioned sequences of at least 70%, 75%, 80%, particularly preferably 85%, 90%, in particular 91%, 92%, 93%. , 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% Homologous sequences to the sequences according to the invention consisting of D-amino acids may also contain partial L-amino acids instead of the term "identity" The identity between two nucleic acid sequences or polypeptide sequences is determined by comparison with the aid of the BESTFIT program based on the algorithm of Smith, TF and Waterman, M.S. (Adv. Appl. Math.
  • the identity between two nucleic acid sequences or polypeptide sequences is defined by the identity of the nucleic acid sequence / polypeptide sequence over the entire sequence length, as determined by comparison using the GAP program based on the algorithm of Needleman, S.B. and wish, CD. (J. Mol. Biol. 48: 443-453) is calculated by setting the following parameters for amino acids: gap creation penalty: 8 and gap extension penalty: 2; and the following parameters for nucleic acid gap creation penalty: 50 and gap extension penalty: 3.
  • the linker is selected from the group of compounds consisting of: GABA ( ⁇ -aminobutyric acid), TEG (triethylene glycol), TEG 2 (triethylene glycol dimer), PEG (polyethylene glycol), o Amino acid.
  • Exemplary embodiments are: a) Zerolinker (direct binding); b) GABA; c) TEG; d) TEG 2 (structures below):
  • Preferred subject matter of the present invention are hybrid compounds with aminopyrazole trimer as A and D3 peptide (SEQ ID NO 1) as B which are directly covalently linked together.
  • Preferred subject of the present invention are hybrid Verbi whatsoever with aminopyrazole trimer as A and D3 peptide (SEQ ID NO 1) as B which are covalently linked together via GABA as a linker.
  • Preferred subject matter of the present invention are hybrid compounds with aminopyrazole trimer as A and D3 peptide (SEQ ID NO 1) as B which are covalently linked via TEG 2 (TEG dimer) as a linker.
  • Preferred subject matter of the present invention are hybrid compounds with aminopyrazole trimer as A and D3 peptide (SEQ ID NO 1) as B which are covalently linked to one another via TEG as linker, of the formula I:
  • Another object of the present invention is a process for the preparation of the hybrid compound of the formula A-B.
  • the synthesis is characterized in that a capped aminopyrazole derivative having a free C-terminal carboxyl group is coupled to the N-terminal amino group of a protected peptide, the peptide being bound to a solid phase.
  • PMB paramethoxybenzyl
  • the coupling of the aminopyrazole to the peptide is accomplished by means of peptide coupling reagents known in the literature, e.g. selected from the group consisting of: HCTU (2- (6-chloro-1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethylammonium hexafluorophosphate), diisopropylethylamine, BOP reagent, CDI, DEPBT, EDC.HCl , HATU, HPTU, HCTU, HOAt, PyBOP, PyBrOp, TATU, TBTU, TDBTU, TSTU, BopCl, PyClop.
  • HCTU (2- (6-chloro-1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethylammonium hexafluorophosphate
  • BOP reagent CDI
  • DEPBT EDC.HCl
  • HATU HPTU
  • HCTU H
  • Fmoc (9-fluorenylmethyloxycarbonyl) is used as the protecting group of compound B in the synthesis.
  • Another embodiment of the present invention is a compound of Formula AB, wherein between the aminopyrazole and the peptide, a linker, as described above, is covalently bound.
  • this linker-containing hybrid compound is characterized in that the compound A, which is provided with protective groups as described above, is first coupled with its C-terminal carboxyl group to the linker, and then this unit consisting of an aminopyrazole, preferably trimer , and a linker, with the free carboxyl group of the linker attached to the protected peptide.
  • the peptide is bound to a resin as a solid phase during synthesis of the hybrid compounds.
  • the protecting groups of the peptide are first removed by acid and the entire hybrid compound wherein the aminopyrazole moiety is still deprotected is provided detached from the resin. Thereafter, the PMB protecting groups of the pyrazole unit are also removed by means of hot acid. Trifloroacetic acid is preferably used in the removal of the protective groups with acids (70 ° C., 3 hours).
  • Another object of the invention is a use of a hybrid compound according to the invention for the prevention of toxic amyloid beta-peptide multimers or oligomers.
  • Another object of the invention is the use of the hybrid compound of the invention in the prevention and / or treatment of diseases in which an aberrant protein aggregation or -multimermaschine or protein misfolding toxic.
  • Another object of the invention is the use of the hybrid compound for the preparation of an agent for the prevention or treatment of diseases in which aberrant protein aggregation or multimerization or protein malformations are toxic.
  • TSE transmissible spongiform encephalopathies
  • CJD human Creutzfeldt-Jakobs disease
  • BSE bovine spongiform encephalopathy
  • Parkinson's disease also included are type II diabetes and congenital angiopathy.
  • the invention further relates to the use of the hybrid compound according to the invention for the preparation of an agent for the prevention and / or therapy of Alzheimer's disease.
  • the invention furthermore relates to a pharmaceutical composition comprising a hybrid compound according to the invention, in particular a pharmaceutical composition for dissolving or preventing toxic amyloid beta-peptide multimers or aggregation of peptides or protein misfolding leading to neurodegenerative diseases.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is characterized in that it is used intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, intrarectally, intravesically, topically or as an aerosol.
  • the hybrid compounds of the invention show synergistic effects that are superior to the single molecules A and B.
  • the hybrid compounds according to the invention inhibit the aggregation of A-beta oligomers in low concentrations, in which the individual compounds A and B still have no effect.
  • Toxic amyloid beta-peptide multimers or aggregation of peptides or proteinaceous pathways in the present invention are present when cytotoxicity can be detected in an MTT assay (see van Groen et al., 2008).
  • the toxicity is detected in a long-term potentiation test.
  • Additional and / or alternative effect of the hybrid compounds according to the invention is a distinct anti-prion effect. This is an effect on prions, the infectious agents of the above-mentioned prion diseases, such that by preventing multimerization respectively. The attachment of the infectious agents to the educts prevents their replication.
  • hybrid compounds of the invention cause a repeal synaptic pathologies caused by A-beta oligomers.
  • the hybrid compounds of this invention can reverse the LTP (long-term potentiation) caused by A-beta oligomers, a form of synaptic plasticity.
  • the compound was synthesized in a convergent semi-automatic method.
  • the aminopyrazole trimer-OH which has PMB protecting groups, was extended at the C-terminus with a linker, GABA, TEG, TEG 2 .
  • the trimer-linker OH unit was coupled to the D3 peptide which is bound to a resin. This step represents the final step of a peptide solid phase synthesis.
  • the hybrid compound was dissolved from the resin under mild conditions at room temperature, followed by cleavage of the PMB protecting groups with hot trifluoroacetic acid (TFA).
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the D3 peptide was synthesized by Fmoc solid-phase peptide synthesis in an automatic microwave peptide synthesizer (CEM, Liberty, Kamp-Lintfort, Germany).
  • CEM automatic microwave peptide synthesizer
  • a Wang resin was used as a polymer support loaded with Fmoc-D-Arg (Pbf) with an average loading of 0.51 mmol / g.
  • Each coupling step was carried out with D-amino acids (0.20 M in DM F) protected with Fmoc (9-fluoronyl-metoxycarbonyl).
  • the deprotection of the amino acid silk chain was carried out by an acidic mixture consisting of 93% TFA, 5% triisopropylsilane and 2% water at room temperature for 3.5 hours.
  • the solution was cooled to 0 ° C and the PMB-protected hybrid compound was precipitated by addition of cold diethyl ether and washed with cold diethyl ether. Subsequently, the solid, colorless compound was dried in vacuo.
  • the compound was heated under argon in TFA for 3 hours at 70 degrees Celsius.
  • the product was then precipitated with the addition of cold diethyl ether.
  • the precipitate was filtered, with diethyl ether washed and dried in vacuo.
  • the resulting hybrid compound was analyzed by ESI-TOF and HPLC and stored as a lyophilized powder at minus 18 degrees C.
  • Example 2 Effect of Hybrid Compounds of the Invention on A-Beta Oligomerization
  • 7PA2 cells overexpressing APP751 Val717Phe were cultured in DMEM medium with 10% FBS.
  • 0.3 x 10 5 cells were transferred to a 10 cm cell culture dish and cultured.
  • the cells were treated with the following substances: Addition of the hybrid compound according to formula 1 in concentrations of 0, 1, 5 and 10 ⁇ over 3 days.
  • D3 peptide, aminopyrazole trimer, and D3 peptide and aminopyrazole trimer were all together, all in a concentration of 10 ⁇ .
  • Example 3 Abrogation of synaptic pathologies caused by A-beta oligomers by means of the hybrid compound of the formula I.
  • the culture of C57BL / 6J mouse fetal cells until day 19 of embryonic development is described by Mohrmann et al. (Neuriscience, 17, 7-18, 2003).
  • the neurons were cultured in Neurobal A medium (GIBCO) with 2% NS-21, 100 U / ml penicillin, 100 g ml streptomycin and GlutaMAX on poly-L-ornithine (1 mg / ml) coated slides.
  • GEBCO Neurobal A medium
  • the hybrid compound of the formula I according to the invention abolishes the decrease in the mEPSC frequency induced by A-beta oligomers.
  • Example 4 Hybrid compound of the formula I reverse the reversal of LTP (long-term potentiation) caused by A-beta oligomers
  • Amyloid beta-peptide was dissolved in DMSO to a concentration of 100 ⁇ and treated with ultrasound.
  • the oligomers are obtained by diluting this stock solution with F12 / DMEM (without glutamine, from Biochrom) to a concentration of 20 ⁇ and incubation at 4 degrees for 24 hours.
  • the hybrid compound of the formula 1 according to the invention was added in a concentration of 10 ⁇ of this oligomer preparation. Oligomer regeneration was assessed by SDS-PAGE and then by Coomassie dyeing with the Constant Blue Coomassie Stain Kit (Expedion).
  • mice were kept under constant environmental conditions, i. at a temperature of 21 +/- 2 degrees C, a humidity of 40%, a 12-hour light / dark cycle and free access to food and water. All animal experiments comply with European Community Directive 86/609 / EEC.
  • Hippocampus sections 400 ⁇ thick were obtained from a male 4-month-old mouse C57 / BI6. First, both hippocampi were transferred isolated in a chamber with artificial brain fluid. The A-beta oligomers were added to the sections at a concentration of 500 nM for 2 hours at room temperature. The Sections were transferred to a receiving chamber and allowed to stand for at least 30 minutes before the experiment. The chamber was constantly perfused by the Artificial Brain Spinal Fluid (ACSF) at a flow rate of 2.5 ml / minute at 33 + 1-1 degrees Celsius.
  • ACSF Artificial Brain Spinal Fluid
  • the synaptic response was obtained by stimulation of the Schaffer collaterals in the stratum radiatum of the CA1 region by means of painted stainless steel stimulation electrodes. Glass electrodes (filled with artificial cerebrospinal fluid, 1-4 M omega) were placed in the apical-dentritic layer to accommodate the fEPSP (field excitatory postsynaptic potential). The original slope of the fEPSP was used to measure this potential. The test pulse was set to 30% of the EPSP maximum. During baseline recording, individual stimuli were set at 0.0166 Hz every minute and averaged every 5 minutes. Once a stable baseline was obtained, long-term potentiation was induced by applying strong stimuli to 3 trains of 100 pulses at an interval of 10 minutes between trains and an interval of 10 ms between each pulse.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Hybrid-Verbindung basierend auf Aminopyrazolderivaten und Peptiden zur Verwendung als Therapeutikum bei der Behandlung von Krankheiten, bei denen eine aberrante Proteinaggregation oder -multimerisierung bzw. eine Proteinfehlfaltung eine Rolle spielt. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen.

Description

Hybrid-Verbindung,
deren Verwendung und Verfahren zu deren Herstellung
Die Erfindung betrifft eine Hybrid-Verbindung basierend auf Aminopyrazolen und Peptiden zur Verwendung als Therapeutikum bei der Behandlung von Krankheiten, bei denen eine aberrante Proteinaggregation oder -multimerisierung bzw. eine Proteinfehlfaltung eine Rolle spielt. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen.
Erkrankungen, bei denen die Proteinaggregation oder Proteinfehlfaltungen beziehungsweise die Amyloidedegeneration eine Rolle spielen, sind eine heterogene Gruppe klinischer Zustände, die als ein gemeinsames Merkmal die Ablagerung spezifischer Proteine in der Konformation von Beta-Faltblattstrukturen haben. Zu dieser Gruppe von Proteinaggregationserkrankungen bzw. Proteinfehlfaltungserkrankungen gehört auch die Morbus Alzheimer Krankheit umgangssprachlich auch als Alzheimer Krankheit bezeichnet, bzw. Alzheimersche Demenz (AD). Die Alzheimersche Demenz ist die häufigste Demenzform und betrifft heute mehr als 60% der geschätzten 24 Millionen demenzkranken Menschen weltweit. Als pathologisches Hauptmerkmal der AD ist die Bildung von senilen oder amyloiden Plaques, bestehend aus dem A (Amyloid) -beta- Peptid und neurofibrillösen Ablagerungen aus dem Tau-Protein. Das A -beta-Peptid entsteht durch die Aktivität mindestens zweier verschiedener Proteasen aus einem Vorläuferprotein, genannt„Amyloid precursor protein" (APP). Dieses ist in der Zellwand von Neuronen lokalisiert. Bei dem proteolytischen Abbau von APP und durch nachträgliche Modifikation entstehen A-beta-Fragmente unterschiedlicher Länge und Art. Die Amyloid-Kaskadenhypothese wurde in den 90er Jahren aufgestellt und postuliert, dass die Ablagerung von A-beta in Form von Plaques Auslöser der Krankheitssymptome ist. Unterschiedliche Studien weisen darauf hin, dass kleinere, frei diffundierbare A-beta- Oligomere toxischer sind als die in den Plaques abgelagerten A -beta-Fibrillen.
Bisher gibt es nur palliative Therapien der Alzheimerschen Demenz. Die Ursachen für diese Erkrankung können bisher nicht behandelt werden, obgleich mit Hochdruck an unterschiedlichen Therapiemöglichkeiten geforscht wird. Häufig steht hierbei die Verhinderung der A-beta-Aggregation im Fokus, zum Beispiels durch Substanzen, die an A-beta-Peptide binden und so eine Aggregation unmöglich machen , bzw. bereits bestehende Aggregate auflösen. Ein solcher Ansatz ist aus der WO 2007/112922 bekannt, in der nicht-peptidische Wirkstoffe auf Aminopyrazolbasis beschrieben werden.
Eine andere Gruppe von letalen neurodegenerativen Krankheiten sind die Transmissiblen Spongiformen Enzephalopatien (TSE) oder Prion-Erkrankungen, wie die humane Creutzfeld-Jakob-Krankheit (CJD), die Schafskrankheit Scrapie und die bovine spongiforme Enzephalopatie (BSE). Sie stellen eine besondere Gruppe von neurodegenerativen Erkrankungen dar, weil sie neben der spontanen oder genetisch bedingten Form, wie der Name sagt, auch durch Infektion hervorgerufen werden können. Die strukturelle Umwandlung von zellulärem Prionprotein (PrPc) in krankheitsassoziiert.es, beta-Faltblatt reiches PrPSc führt zur tödlichen Akkumulation von PrPSc in amyloiden Proteindepots. Wie auch für die Alzheimische Demenz gibt es für diese Krankheiten aktuell keine kausalen Therapien.
Obwohl sich die Alzheimersche Demenz und die Prion-Erkrankungen auf den pathophysiologischen Niveau deutlich unterscheiden, konnte gezeigt werden, dass beta- Faltblatt-reiche A-beta-Oligomere und beta-Faltblatt-reiches PrPSc durch die gleiche konformations-spezifischen Antikörper erkannt werden.
Verbindungen, die solche A -beta-Oligomere vermindern, sind z.B. Peptide wie sie in der PCT/EP 02/03862 A oder aus der WO 02/081505 A2 beschrieben werden.
Bisher können allerdings nur die Symptome solcher Krankheiten wie z.B. der Alzheimerschen Demenz oder der Prion-Erkrankung behandelt werden. Es gibt noch keine zugelassenen Medikamente, die diese Krankheitsprozesse aufhalten oder rückgängig machen können.
Außerdem zeigen einige der bisher eingesetzten Medikamente unerwünschte Nebenwirkungen wie z.B. Übelkeit, Magen-Darm-Beschwerden, Schwindel oder Schlafstörungen.
Es besteht somit ein Bedarf an Verbindungen, welche z.B. toxische A -beta-Oligomere bzw. -Multimere oder -Aggregate davon oder Proteinfehlfaltungen spezifisch erkennen, vorbeugend verhindern und gegebenenfalls auflösen oder in nicht-toxische Verbindungen zu überführen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, solche Verbindungen zur Verfügung zu stellen, die durch ihre spezifische Wirkungsweise keine Nebeneffekte zeigen, die später zu evtl. unerwünschten Nebenwirkungen führen könnten. Des Weiteren sollen die erfindungsgemäßen Verbindungen schon in kleinen Konzentrationen wirksam sein, um auch auf diesem Wege Nebeneffekte zu vermeiden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sollen toxische A-beta-Oligomere bzw. -Multimere oder -Aggregate davon oder Proteinfehlfaltungen spezifisch erkennen, vorbeugend verhindern und gegebenenfalls auflösen oder in nicht-toxische Verbindungen überführen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch die Hybrid-Verbindung der Formel A-B, die dadurch gekennzeichnet ist, dass A ein Aminopyrazolderivat ist, und B ein Peptid, wobei A und B unmittelbar oder mittels eines Linkers kovalent miteinander verbunden sind.
Ein Aminopyrazolderivat im Sinne der Erfindung ist 3-Aminopyrazol-5-carbonsäure oder 3-Nitropyrazol-5-carbonsäure sowie alle Abkömmlinge, in denen die heterocyclische CH- Gruppe gegen -CR- oder -N- oder -O- oder -S- ausgetauscht wurde, sowie alle daraus abgeleiteten peptidischen Dimere, Trimere oder -Tetramere.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird der Begriff „Aminopyrazolderivat" als Oberbegriff für die o.g. Derivate der 3-Aminopyrazol-5-carbonsäure und ihre Dimere, Trimere und Tetramere verwendet.
Des Weiteren wird in einer bevorzugten Variante der vorliegenden Erfindung das Aminopyrazol-Trimer als Verbindung A eingesetzt.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung ist das Peptid B ein D-Peptid.
D-Peptide sind Peptide, die bevorzugt nur D-Aminosäuren enthalten oder daraus bestehen.
In einer Variante der Erfindung weisen die D-Peptide auch teilweise L-Aminosäuren auf. „Teilweise" L-Aminosäuren bedeutet, dass 1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10 oder mehr Aminosäuren homolog zur Aminosäuresequenz des aus D-Aminosäuren bestehenden D-Peptids durch jeweils die gleiche Aminosäure in der L-Konformation ersetzt sind.
„D-Peptide" bestehen in einer Variante aus einer retro-inversen Sequenz zum Amyloid beta-Peptid oder Amyloid beta-Peptid-Teilfragmenten und vollständig aus D- Aminosäuren.
Ein„Teilfragment" besteht aus 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16 oder mehr Aminosäuren homolog zur Aminosäuresequenz des Amyloid beta-Peptids. I n ei n er weiteren Va ria nte bi n den d ie erfi nd u n gsgem ä ßen D-Peptide an die Multimerisierungsdomäne des Amyloid beta-Peptids. In einer weiteren Variante weisen die D-Peptide die Sequenz SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 auf und bestehen vollständig aus D-Aminosäuren.
„D3"-Peptid: rprtr Ihthr nr (SEQ ID NO:1 )
retro-inverso-A-beta(1 -16): kqhhv eygsd hrfea d (SEQ ID NO:2)
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Peptid das Sequenzmotiv SHYRHISP (SEQ ID NO: 3)oder aktive Fragmente davon.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Peptid das Sequenzmotiv GISWQQSHHLVA (SEQ ID NO: 4)oder aktive Fragmente davon.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Peptid das Sequenzmotiv PRTRLHTH (SEQ ID NO: 5) oder aktive Fragmente davon.
In einer weiteren Variante wird das Peptid ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Peptiden mit den D-Aminosäure-Sequenzen : a) QSHYRHISPAQV (SEQ ID NO: 6); b) QSHYRHISPDQV (SEQ ID NO: 7); c) QSHYRHISPAR (SEQ ID NO: 8); d) KSHYRHISPAKV (SEQ ID NO: 9); e) RPRTRLHTHRNR (SEQ ID NO: 10); i) RPRTRLHTHRTE (SEQ ID NO: 11 ); und g) KPRTRLHTHRNR (SEQ ID NO: 12); Bevorzugt sind ferner Sequenzen, die sich von den Sequenzen a) bis g) um bis zu drei Aminosäuren unterscheiden ; sowie Sequenzen, die die Sequenzen a) bis g) sowie Sequenzen, die sich von den Sequenzen a) bis g) um bis zu drei Aminosäuren unterscheiden, umfassen.
In einer weiteren Variante weisen die D-Peptide Fragmente der oben genannten Sequenzen auf oder weisen homologe Sequenzen zu den oben genannten Sequenzen auf.
„Homologe Sequenzen" bedeutet im Sinne der Erfindung, dass eine Aminosäuresequenz eine Identität mit mindestens einer der oben genannten Sequenzen von mindestens 70%, 75%, 80%, besonders bevorzugt 85%, 90%, insbesondere 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% aufweist. Homologe S e q u e n ze n z u d e n erfindungsgemäßen Sequenzen bestehend aus D-Aminosäuren können auch teilweise L-Aminosäuren enthalten. Anstelle des Begriffs "Identität" werden in der vorliegenden Beschreibung die Begriffe "homolog" oder "Homologie" gleichbedeutend verwendet. Die Identität zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptidsequenzen wird durch Vergleich mit Hilfe des Programms BESTFIT basierend auf dem Algorithmus von Smith, T. F. u nd Waterman , M .S (Adv. Appl . Math . 2 : 482-489 (1981 )) berechnet unter Einstellung folgender Parameter für Aminosäuren: Gap creation penalty: 8 und Gap extension penalty: 2; und folgender Parameter für Nukleinsäuren: Gap creation penalty: 50 und Gap extension penalty: 3. Bevorzugt wird die Identität zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptidsequenzen durch die Identität der Nukleinsäuresequenz / Polypeptidsequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge definiert, wie sie durch Vergleich mit Hilfe des Programms GAP basierend auf dem Algorithmus von Needleman, S.B. und Wunsch, CD. (J. Mol. Biol. 48: 443-453) unter Einstellung folgender Parameter für Aminosäuren berechnet wird: Gap creation penalty: 8 und Gap extension penalty: 2; und die folgenden Parameter für Nukleinsäuren Gap creation penalty: 50 und Gap extension penalty: 3.
Unter dem Begriff "Retro-inverses Peptid" oder „Retro-inverso Peptid" wird erfindungsgemäß ein Peptid bezeichnet, welches sich aus Aminosäuren in der D-Form zusammensetzt (invers: Chiralität des alpha-C-Atoms invers zur L-Form), bei dem zusätzlich die Sequenzreihenfolge zum ursprünglichen Peptid umgekehrt wurde (retro = rückwärts; siehe auch Regenmortel und Muller, 1998; Current Opinion in Biotechnology 9:377-382).
In einer weiteren Ausführung der vorliegenden Erfindung wird der Linker ausgewählt aus der G ru ppe der Verbi nd u ngen bestehend aus : GABA (γ-Aminobuttersäure), TEG (Triethylenglykol), TEG2 (Triethylenglykol-Dimer), PEG (Polyethylenglykol), o Aminosäure. In einer bevorzugten Ausführung ist der Linker eine a(alpha)-Amino- (ö(omega)-carbonsäure sein, wobei die zentralen Kettenglieder wahlweise ganz oder nur zum Teil aus Alkylenresten bestehen (-CH2)n-. Alternativ können einzelne CH2-Gruppen durch -O-, -N- und -S-Atome bzw. durch Carbonylgruppen oder CHR-Gruppen ersetzt werden (mit R= sämtliche proteinogenen Aminosäurereste). Ausführungsbeispiele sind: a) Zerolinker (direkte Anbindung); b) GABA; c) TEG; d) TEG2 (Strukturen siehe unten):
o
GABA
Figure imgf000007_0001
Figure imgf000007_0002
TEG,
Bevorzugter Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Hybrid-Verbidungen mit Aminopyrazol-Trimer als A und D3-Peptid (SEQ ID NO 1 ) als B die unmittelbar kovalent miteinander verknüpft sind.
Bevorzugter Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Hybrid-Verbidungen mit Aminopyrazol-Trimer als A und D3-Peptid (SEQ ID NO 1 ) als B die über GABA als Linker kovalent miteinander verknüpft sind. Bevorzugter Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Hybrid-Verbidungen mit Aminopyrazol-Trimer als A und D3-Peptid (SEQ I D NO 1 ) als B die über TEG2 (TEG- Dimer) als Linker kovalent miteinander verknüpft sind.
Bevorzugter Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Hybrid-Verbidungen mit Aminopyrazol-Trimer als A und D3-Peptid (SEQ I D NO 1 ) als B die über TEG als Linker kovalent miteinander verknüpft sind, der Formel I:
Figure imgf000008_0001
Die Herstellung der Aminopyrazole und deren Derivate ist zum Beispiel in der WO 2007/112922 A1 , WO 03/095429 A1 oder von Rzepecki et al (J. Biol. Chem., Vol. 279, No. 46, pp 47497-47505, 2004) beschrieben.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der Hybrid-Verbindung der Formel A-B.
Die Synthese ist dadurch gekennzeichnet, dass ein mit Schutzgruppen versehenes Aminopyrazolderivat mit einer freien C-terminalen Carboxylgruppe an die N-terminale Aminogruppe eines mit Schutzgruppen versehenen Peptids gekuppelt wird, wobei das Peptid an eine feste Phase gebunden ist.
In einer Ausführung der Erfindung wird PMB (Paramethoxybenzyl) als Schutzgruppe für die heterocyclische NH-Funktion verwendet.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Hybridverbindungen der Formel A-B erfolgt prinzipiell unter Synthesebedingungen und in Lösungsmitteln sowie gemäß Verfahren wie sie aus der Literatur bekannt sind (J. Org. Chem., Vol. 72, pp 3614-3624, 2007).
In einer Ausführung der Erfindung erfolgt die Kupplung des Aminopyrazols an das Peptid mittels Peptidkupplungsreagenzien, wie sie aus der Literatur bekannt sind, z.B. ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: HCTU (2-(6-Chloro-1 H-Benzotriazol-1 -yl)- 1 ,1 ,3,3-Tetramethylamonium Hexafluorophosphat), Diisopropylethylamin, BOP Reagenz, CDI, DEPBT, EDC.HCI, HATU, HPTU, HCTU, HOAt, PyBOP, PyBrOp, TATU, TBTU, TDBTU, TSTU, BopCI, PyClop.
In einer weiteren Ausführungform der vorliegenden Erfindung wird bei der Synthese Fmoc (9-Fluorenylmethyloxycarbonyl) als Schutzgruppe der Verbindung B eingesetzt.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Verbindung der Formel A-B, wobei zwischen dem Aminopyrazol und dem Peptid ein Linker, wie oben beschrieben, kovalent gebunden wird.
Die Herstellung dieser mit einem Linker versehenen Hybridverbindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung A, welche mit Schutzgruppen wie oben beschrieben versehen ist, mit ihrer C-terminalen Carboxylgruppe zunächst an den Linker gekoppelt wird, und anschließend diese Einheit bestehend aus einem Aminopyrazol, bevorzugt Trimer, und einem Linker, mit der freien Carboxylgruppe des Linkers an das mit Schutzgruppen versehene Peptid gebunden wird. In einer Variante der vorliegenden Erfindung ist das Peptid während der Synthese der Hybridverbindungen an ein Harz als feste Phase gebunden.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung werden bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Hybridverbindung nach der erfolgreichen Kopplung der Verbindungen A und B (ggf. mit einem Linker dazwischen) zunächst mittels Säure die Schutzgruppen des Peptids entfernt und die gesamte Hybridverbindung, bei der die Aminopyrazoleinheit noch mit Schutzgruppen versehen ist, von dem Harz gelöst. Danach werden auch die PMB-Schutzgruppen der Pyrazoleinheit mittels heißer Säure entfernt. Bevorzugt wird bei der Entfernung der Schutzgruppen mit Säuren Trifloressigsäure eingesetzt (70°C, 3h).
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Verwendung einer erfindungsgemäßen Hybrid-Verbindung zur Verhinderung von toxischen Amyloid beta-Peptid-Multimeren beziehungsweise Oligomeren.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Hybrid-Verbindung bei der Vorbeugung und/oder Therapie von Krankheiten bei denen eine aberrante Proteinaggregation oder -multimerisierung oder Proteinfehlfaltungen toxisch wirken.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der Hybrid-Verbindung zur Herstellung eines Mittels zur Vorbeugung oder Behandlung von Krankheiten, bei denen eine aberrante Proteinaggregation oder -multimerisierung oder Proteinfehlfaltungen toxisch wirken.
Zu diesen Krankheiten gehören die Transmissiblen Spongiforme Enzephalopatien (TSE) oder Prion-Erkrankungen, wie die humane Creutzfeld-Jakobs-Krankheit (CJD), die Schafskrankheit Scrapie und die bovine spongiforme Enzephalopatie (BSE) oder die Parkinson-Erkrankung. Ferner zählen auch die Diabetis Typ I I und die Congophile Angiopathie dazu. Ferner ist Gegenstand der Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Hybrid- Verbindung zur Herstellung eines Mittels zur Vorbeugung und/oder Therapie von Morbus Alzheimer. Gegenstand der Erfindung ist ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend eine erfindungsgemäße Hybridverbindung, insbesondere eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Auflösung oder Verhinderung von toxischen Amyloid-beta-peptidmultimeren oder Aggregation von Peptiden oder Proteinfehlfaltungen, die zu neurodegenerativen Erkrankungen führen.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ist dadurch gekennzeichnet, dass sie intravenös, subcutan, intraperitoneal, intrarektal, intravesikal, topisch oder als Aerosol eingesetzt wird.
Die erfindungsgemäßen Hybrid-Verbindungen zeigen synergetische Effekte, die den Einzelmolekülen A und B überlegen sind.
Synergetische Effekte im Sinne der vorliegenden Erfindung werden nachgewiesen durch die Reduktion toxischer A-beta-Oligomere im Überstand A-beta-Oligomer sezernierender Zel l en d u rch Zu gabe d er erfi n d u n gsgemä ßen H ybri d-Verbindungen. Im Falle synergetischer Effekte ist die Reduktion toxischer A-beta-Oligomere dosisabhängig, bevorzugt signifikant deutlicher als mit jeder der Einzelsubstanzen A und B und/oder einer Kombination aus beiden
Ferner inhibieren die erfindungsgemäßen Hybrid-Verbindungen die Aggregation von A- beta-Oligomeren in niedrigen Konzentrationen, in denen die einzelnen Verbindungen A und B noch keine Wirkung zeigen.
Toxische Amyloid-beta-peptidmultimere oder Aggregation von Peptiden oder Protei nfeh lfaltu ngen im Sine der vorl iegenden Erfindung liegen vor, wenn die Cytotoxizität in einem MTT Test (siehe van Groen et al. 2008) nachgewiesen werden kann.
I n einer weiteren Variante wird d ie Toxizität in einem Langzeit-Potenzierungs-Test nachgewiesen. Zusätzlicher und/oder alternativer Effekt der erfindungsgemäßen Hybrid-Verbindungen ist ein deutlicher Anti-Prion-Effekt. Dies ist ein Effekt auf Prionen, die infektiösen Erreger der oben genanten Prion-Erkrankungen, dergestalt, dass durch die Verhinderung der Multimerisierung beziehungsweise. Das Anlagern der infektiösen Erreger an die Edukte ihre Replikation verhindert wird.
Ferner bewirken die erfindungsgemäßen Hybrid-Verbindungen eine Aufhebung synaptischer Pathologien die durch A-beta-Oligomere verursacht werden.
Außerdem können die erfindungsgemäßen Hybrid-Verbindungen die durch A-beta- Oligomere verursachte Aufhebung der LTP (Langzeit-Potenzierung), eine Form der synaptischen Plastizität rückgängig machen.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand der Ausführungsbeispiele und der beiliegenden Abbildungen näher beschrieben.
BEISPIELE
Beispiel 1 :
Herstellung der Hybridverbindung:
Die Verbindung wurde in einem konvergenten halbautomatischen Verfahren synthetisiert. Zunächst wurde das mit PMB-Schutzgruppen versehende Aminopyrazol-Trimer-OH am C-Terminus mit einem Linker, GABA, TEG, TEG2, verlängert. Anschließend wurde die Trimer-Linker-OH-Einheit an das D3-Peptid gekoppelt, welches an ein Harz gebunden ist. Dieser Schritt stellt den letzten Schritt einer Peptid-Festphasensynthese dar. Anschließend wurde die Hybridverbindung unter milden Bedingungen bei Raumtemperatur von dem Harz gelöst, gefolgt von der Abspaltung der PMB- Schutzgruppen mit heißer Trifluoressigsäure (TFA).
Das D3-Peptid wurde mittels einer Fmoc-Festphasen-Peptidsynthese in einem automatischen Mikrowellenpeptidsynthesizer synthetisiert (CEM, Liberty, Kamp-Lintfort, Deutschland). Ein Wang-Harz wurde als Polymerträger verwendet, beladen mit Fmoc-D- Arg(Pbf) mit einer durchschnittlichen Beladung von 0,51 mmol/g. Jeder Kopplungsschritt wurde durchgeführt mit D-Aminosäuren (0,20 M in DM F) gesch ützt mit Fmoc (9- Fluoronyl-Metoxycarbonyl). Die Entfernung der Schutzgruppen der Aminosäureseidenkette erfolgte durch eine saure Mischung bestehend aus 93% TFA, 5 % Triisopropylsilan und 2 % Wasser bei Raumtemperatur über 3,5 Stunden. Nach der Filtration wurde die Lösung auf 0 Grad C gekühlt und die mit PMB-Schutzgruppen versehene Hybridverbindung unter Zugabe von kaltem Diethylether präzipitiert und mit kaltem Diethylether gewaschen. Anschließend wurde die feste, farblose Verbindung im Vakuum getrocknet.
Zum Ablösen der PMB-Schutzgruppen wurde die Verbindung unter Argon in TFA für 3 Stunden bei 70 Grad C erhitzt. Das Produkt wurde anschließend unter Zugabe von kaltem Diethylether präzipitiert. Das Präzipitat wurde gefiltert, mit Diethylether gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die so entstandene Hybridverbindung wurde analysiert mittels ESI-TOF und HPLC und als lyophilisiertes Pulver bei minus 18 Grad C gelagert.
Beispiel 2: Wirkung der erfindungsgemäßen Hybrid-Verbindungen auf die A-beta- Oligomerisation Die Experimente wurden gemäß dem Protokoll von Walsh et al. (J Neuro Sei., 25, pp. 2455 - 2462, 2005) durchgeführt. 7PA2-Zellen die APP751 Val717Phe überexprimieren, wurden in DMEM-Medium mit 10% FBS kultiviert. 0,3 x 105 -Zellen wurden in eine 10 cm-Zellkulturschale umgesetzt und kultiviert. Die Zellen wurden mit folgenden Substanzen behandelt: Zugabe der Hybridverbindung gemäß Formel 1 in Konzentrationen von 0, 1 ,5 und 10 μΜ über 3 Tage. Des Weiteren erfolgte die Zugabe von D3-Peptid, Aminopyrazol-Trimer, sowie D3-Peptid und Aminopyrazol-Trimer zusammen, alle in einer Konzentration von 10 μΜ.
Die einzelnen Verbindungen wie das Peptid, das Aminopyrazol oder beide zusammen zeigten bei dieser Konzentration keinen Effekt auf die Inhibierung der A-'Y-Oligo- Merisation. Lediglich die erfindungsgemäße Hybridverbindung der Formel 1 zeigte eine deutlich dosisabhängige Inhibierung der A-'Y-Oligo-Merisation.
Figur 1 zeigt den Vergleich von 5 unabhängigen Experimenten wie oben beschrieben mit 7PA2-Zellen , die mit den angegebenen Konzentrationen der erfindungsgemäßen Verbindung gemäß Formel 1 behandelt wurden. Die Signifikanz der Ergebnisse wurden mit einem Student t-test nachgewiesen. Bei einem Stern ist p = 0,012, 3 Sterne p = 0.0007. Diese Ergebnisse belegen deutlich den synergetischen Effekt der erfindungsgemäßen Hybridverbindung. A und B, also D3-Peptid oder Aminopyrazoltrimer sowohl einzeln als auch zusammen in dieser Konzentrationen haben keinen Effekt auf die A-Beta-Oligomer- Bildung. Die Hybridverbindung gemäß Formel 1 jedoch zeigt einen deutlich dosisabhängigen Effekt und belegt somit den synergistischen Effekt der Hybridverbindungen insbesondere im Vergleich zur gleichzeitigen Zugabe von D3-Peptid und Aminopyrazoltrimer.
Beispiel 3: Aufhebung synaptischer Pathologien verursacht durch A-beta- Oligomere mittels der Hybrid-Verbindung der Formel I Die Kultur von C57BL/6J Maus-Fötus-Zellen bis zu Tag 19 der embryonalen Entwicklung wird von Mohrmann et al. (Neuriscience, 17, 7-18, 2003) beschrieben. Die Neuronen wurden in Neurobal A Medium (GIBCO) mit 2% NS-21 , 100U/ml Penicilin, 100 g ml Streptomycin und GlutaMAX auf mit Poly-L-Ornithin (1 mg/ml) beschichteten Objekträgern kultiviert. Nach 8 Tagen wurde die Hälfte des Mediums gegen den Überstand der 7PA2 Zelkultur mit 27.7 nM A-beta-Peptid ausgetauscht und die Verbindung der Formel I in einer Konzentration von 10 μΜ zugesetzt. Als Kontrolle wurden Neuronen mit den Überstand der 7PA2 Zelkultur mit 27.7 nM A-beta-Peptid ohne die Hybrid-Verbindung verwendet.
Die mEPSC (miniatur exzitatorischer postsynaptischer Strom) -Aufnahmen erfolgten nach 3 Tagen mittels Ganz-Zellen Voltage-Clamp wie von Jungling et al. (J neurosci 26, 6968-6978, 2006) beschrieben. Um signifikante Ergebnisse zu erhalten wurden jeweils 20-36 Zellen vermessen. Die Ergebnisse wurden mit einem Student t Test überprüft (**p=0.001 )
Die Ergebnisse sind in Fig. 2 zusammengefasst.
Daraus geht hervor, dass die erfindungsgemäße Hybridverbindung der Formel I den von A-beta-Oligomeren induzierten Rückgang der mEPSC Frequenz aufhebt.
Beispiel 4: Hybrid-Verbindung der Formel I machen die durch A-beta-Oligomere verursachte Aufhebung der LTP (Langzeit-Potenzierung) rückgängig
Amyloid-Beta-Peptid wurde in DMSO in eine Konzentration von 100 μΜ aufgelöst und m it U ltraschall behandelt. Die O ligomere erh ielt man d u rch Verd ü n n en d ieser Stammlösung mit F12/DMEM (ohne Glutamin, von Biochrom) auf eine Konzentration von 20 μΜ und Inkubation bei 4 Grad für 24 Stunden. Die erfindungsgemäße Hybrid- Verbindung der Formel 1 wurde in einer Konzentration von 10 μΜ dieser Oligomerenpräparation zugesetzt. Die Überprüfung der Oligomergeneration erfolgte mittels SDS-PAGE und anschließend unter Coomassie-Färbu ng m it I nstant Blue Coomassie Stain Kit (Expedion).
Die Mäuse wurden unter konstanten Umgebungsbedingungen gehalten, d.h. bei einer Temperatur von 21 +/- 2 Grad C, einer Luftfeuchte von 40%, eines 12-Stunden Hell/Dunkel-Zyklus und freiem Zugang zu Futter und Wasser. Alle Tierexperimente stimmen mit der Richtlinie der Europäischen Gemeinschaft 86/609/EEC überein.
Hippocampusschnitte (400 μΜ dick) wurden von einer männlichen 4 Monate alten Maus C 57/BI6 gewonnen. Zunächst wurden beide Hippocampi isoliert in einer Kammer mit künstlicher Gehirnflüssigkeit transferiert. Die A-Beta-Oligomere wurden auf die Schnitte in eine Konzentration von 500 nM für 2 Stunden bei Raumtemperatur zugesetzt. Die Schnitte wurden in eine Aufnahmekammer überführt und für mindestens 30 Minuten vor dem Experiment stehen gelassen. Die Kammer wurde konstant von der künstlichen Gehirn-Rückenmarkflüssigkeit (ACSF) mit einem Durchfluss von 2,5 ml/Minute bei 33 +1- 1 Grad C durchströmt.
Die synaptische Antwort erhielt man durch Stimulation der Schafferschen Kollateralen in dem Stratum Radiatum der CA1 -Region mittels lackierten Edelstahlstimulierungselektroden. Glaselektroden (gefüllt mit der künstlichen Gehirn- Rückenmarkflüssigkeit, 1-4 M Omega) wurden in die apikal-dentritische Schicht gesetzt, um das fEPSP (Feld exzitatorische postsynaptische Potenzial) aufzunehmen. Die ursprüngliche Steigung des fEPSP wurde verwendet, um dieses Potenzial zu messen. Der Testpuls wurde auf 30 % des EPSP-Maximums gesetzt. Während der Aufnahme der Basislinie wurden einzelne Stimuli jede Minute von 0,0166 Hz gesetzt und wurden alle 5 Minuten gemittelt. Sobald eine stabile Basislinie erhalten wurde, erfolgte die Induktion der Langzeitpotenzierung durch Applikation starker Stimulierungen von 3 Zügen von 100 Pulsen bei einem Intervall von 10 Minuten zwischen den Zügen und einem Intervall von 10 ms zwischen den einzelnen Pulsen.
Es wurden 7 bis 8 Experimente durchgeführt. Die Ergebnisse sind Abb. 4 zu entnehmen. Verglichen mit der Kontroll-LCP (Langzeitpotenzierung, gefüllte Kreise) wurde die LCP durch die A-Beta-Oligomere signifikant herabgesetzt (leere Kreise). Diese Herabsetzung wurde überkompensiert durch Zusatz von 10 μΜ Hybridverbindung der Formel 1 (Dreiecke). Die Daten belegen einen signifikanten Effekt der erfindungsgemäßen Hybridverbindung (*p < 0,05).

Claims

Ansprüche
1 . Hybrid-Verbindung der Formel A-B wobei
A ein Aminopyrazol oder ein Derivat davon ist und
B ein Peptid und
A und B unmittelbar oder mittels eines Linkers kovalent miteinander verbunden sind.
2. Hybrid-Verbindung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass B ein D- Peptid ist.
3. Verbindung nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass
A ausgewählt ist aus der Gruppe der Verbindungen bestehend aus:
3-Aminopyrazol-5-carbonsäure, Derivate davon mit ersetzter heterocyclischer CH-
Gruppe gegen -CR- oder -N-, -O-, -S-, 3-Aminopyrazol-5-carbonsäure-Dimer sowie -Trimer oder -Tetramer.
B ausgewählt ist aus der Gruppe der Verbindungen bestehend aus:
D3-Peptid, SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ I D NO 6, SEQ I D NO 7, SEQ I D NO 8, SEQ I D NO 9, SEQ I D NO 1 1 ,
SEQ ID NO 12;
der Linker ausgewählt ist aus der Gruppe der Verbindungen bestehend aus: kein Linker, GABA, TEG, TEG-Dimer, PEG, alpha-Aminosäuren, a(alpha)-Amino- (ö(omega)-carbonsäure.
4. Verfahren zur Herstellung einer Hybrid-Verbindung gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass
ein mit Schutzgruppen versehenes Aminopyrazol mit einer freien Carboxylgruppe an eine N-terminale Aminogruppe eines mit Schutzgruppen versehenen Peptids gekoppelt wird, wobei das Peptid an eine feste Phase gebunden ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet, dass
z u r Ko p p l u n g z u s ä tz l i c h H C T U (2-(6-Chloro-1 H-benzotriazole-1-yl)-1 , 1 ,3,3- tetramethylaminium hexafluorophosphate) und Diisopropylethylamin eingesetzt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet, dass
bei Verbindung A Para-Metoxybenzyl als Schutzgruppe eingesetzt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet, dass
bei Verbindung B Fmoc als Schutzgruppen eingesetzt werden. Verfahren nach Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet, dass
Verbindung A mit der C-terminalen Carboxylgruppe zunächst an einen Linker gekoppelt wird und anschließend mit dem Peptid.
Verwendung der Hybrid-Verbindung nach Anspruch 1 zur Verhinderung von toxischen Amyloidbeta-Peptid-Oligomeren.
Verwendung der Hybrid-Verbindung nach Anspruch 1 bei der Vorbeugung und/oder Therapie von Krankheiten bei denen eine aberrante Proteinaggregation oder -multimerisierung oder Proteinfehlfaltungen toxisch wirken.
Verwendung der Hybrid-Verbindung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Mittels zur Vorbeugung oder Behandlung von Krankheiten, bei denen eine aberrrante Proteinaggregation oder -multimerisierung oder Proteinfehlfaltungen toxisch wirken.
Verwendung nach Anspruch 1 1 zur Herstellung eines Mittels zur Vorbeugung und/oder Therapie von Morbus Alzheimer.
Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend eine Hybridverbindung nach Anspruch 1 .
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 13 zur Auflösung oder Verhinderung von toxischen Amyloid-beta-peptidmultimeren oder Aggregation von Peptiden oder Proteinfehlfaltungen, die zu neurodegenerativen Erkrankungen führen.
Pharmazeutische Zusammensetzung dadurch gekennzeichnet, dass sie intravenös, subcutan, intraperitoneal, intrarektal, intravesikal, topisch oder als Aerosol eingesetzt wird.
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