WO2011136233A1 - 神経幹細胞の自己複製促進剤およびその使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2010年4月26日付で出願した日本国特許出願2010-101415に基づく優先権を主張するものであり、当該基礎出願を引用することにより、本明細書に含めるものとする。
本明細書においてECF-Lとは、配列番号1に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、配列番号1に示すアミノ酸配列を有するタンパク質のホモログ、または配列番号1に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子のオーソログがコードするアミノ酸配列を有するタンパク質である。ここで、ホモログは、配列番号1に示すアミノ酸配列と、60%以上相同であることが好ましく、70%以上相同であることがより好ましく、80%以上相同であることがさらに好ましく、90%以上相同であることがさらに好ましく、95%以上相同であることがさらに好ましい、というように、相同性が高いほど好ましい。ECF-Lのアミノ酸配列は、いずれの動物種のECF-Lに由来するものであってもよく、神経幹細胞の自己複製促進機能を有する範囲で制限されないが、自己複製を促進させる対象となる神経幹細胞が由来する動物種と同じであることが好ましく、例えば、ヒト由来の神経幹細胞の自己複製を促進する場合には、ヒト由来のアミノ酸配列を有するECF-Lを用いることが好ましい。ここで、ヒト由来のアミノ酸配列を有するECF-L、すなわち、ECF-Lのヒトホモログとして、例えば、acidic chitinase (isoform a (NCBIアクセッション番号: NP_068569.2)及びisoform c (NCBIアクセッション番号: NP_970615.2))、chitotriosidase (NCBIアクセッション番号: NP_003456.1)、oviductal glycoprotein 1 precursor (NCBIアクセッション番号: NP_002548.3)、chitinase 3-like 2 (isoform a (NCBIアクセッション番号: NP_003391.2)、isoform b (NCBIアクセッション番号: NP_001020368.1)、及びisoform c (NCBIアクセッション番号: NP_001020370.1))chitinase 3-like 1 (NCBIアクセッション番号: NP_001267.2)が挙げられる。
ECF-L存在下で神経幹細胞を培養すると、神経幹細胞の自己複製を促進することができる。従って、ECF―Lを有効成分として含有する薬剤は、神経幹細胞の自己複製促進剤として有効である。
神経幹細胞とは、自己複製能及び神経細胞とグリア細胞への多分化能を有する細胞である。神経幹細胞を、ECF-L存在下で培養することにより、神経幹細胞の非対称分裂およびそれに伴うグリア前駆体への分化を抑制し、神経幹細胞のみを効率よく自己複製させることができる。
本発明に係る培養方法によって自己複製した神経幹細胞は、再生医療分野において高い利用価値を有する。例えば、自己複製した神経幹細胞を、神経の機能不全が生じた神経組織に必要量移植することにより、移植部位において新たな神経細胞が分化し、組織再生することができる。この場合、移植細胞である神経幹細胞の由来動物種(ドナー)と、移植を受ける動物種(レシピエント)は同一であることが好ましく、同一個体であることがさらに好ましいが、これに制限されない。また、自己複製された神経幹細胞の移植前調製法は特に制限されず、当業者が適宜決定できるが、例えば、培地やバッファーに懸濁して調製しても、あるいは、細胞塊や細胞シートに調製してもよい。ここで、上記レシピエントの疾患は、神経幹細胞の移植によって病状の改善が期待される疾患であれば特に制限されないが、神経の機能不全をもたらす疾患であることが好ましく、例えば、脊髄損傷などの外傷性疾患、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、進行性核上性麻痺、ハンチントン病、多系統萎縮症、脊髄小脳変性症等の神経変性疾患、脳出血、くも膜下出血、脳梗塞等による神経細胞の壊死等が挙げられる。また、神経の機能不全が加齢に起因する場合も、自己複製された神経幹細胞の移植によって治療することができる。
本発明に係る、神経幹細胞を増殖するための医薬組成物は、ECF-LまたはECF-Lを発現する発現ベクターを含有することを特徴とする。
==生細胞計数法==
10μlのトリパンブルーと10μlの骨髄由来血管内皮前駆細胞懸濁液を混合し、これを血球計算盤に滴下し、16エリア(1エリアは250×250μm)における非染色細胞を計数した。なお、トリパンブルーは死細胞を染色するため、非染色細胞は生細胞である。
マウスをジエチルエーテルで麻酔し、その左心室に50mlPBSで満たした灌流ポンプに接続した23Gニードルを用いてPBSを緩やかに注入し、灌流を行った。肝臓の色が赤から灰色に変色した後、PBSに代えて50~75mlの4%パラホルムアルヒド(pH7.4)を還流し、組織を固定した。
上記のように固定した脳組織を単離し、4℃で一晩4%パラホルムアルデヒドで後固定し、30%ショ糖-PBS液中で一晩インキュベートした。なお、増殖細胞の陽性対照として、胸腺組織を同様に処理した。
切片をPBSで10分間洗浄し、0.3%Triton X-100-PBSを150μl滴下して3分間インキュベートした。この切片を、ブロッキングバッファーで希釈した一次抗体を用いて4℃で一晩、あるいは37℃で3時間インキュベートした。免疫染色の対照として、対照切片は、ブロッキングバッファーのみでインキュベートした。PBSで10分間ずつ3回洗浄し、二次抗体を用いて室温で1時間インキュベートした。PBSで10分間ずつ3回洗浄した後、PBSで1000倍に希釈したHoechest 33258(Sigma 社)で10分間インキュベートすることにより核を対比染色した。この切片をPBSで10分間ずつ2回洗浄し、さらに滅菌蒸留水で5分間洗浄した。切片を封入剤を用いて封入し、蛍光顕微鏡、もしくは、共焦点レーザースキャン顕微鏡下で観察した。
本実施例では、マウス骨髄由来血管内皮前駆細胞の培養上清(Endotherial progenitor cell-conditioned medium、EPC-CM)が、in vivoにおいて神経幹細胞の自己複製を促進する効果、およびその子孫細胞の数を増加させる効果を有することを示す。
成体マウス(C57BL/6J、オス、8~10週齢、n=10)を、ジエチルエーテルを用いて麻酔した後、断頭、もしくは、頚椎脱臼することにより屠殺した。このマウスをアルコール消毒した後、腿骨および脛骨を単離し、氷上で冷却した6cmディッシュのPBS中で維持した。これらの骨から、70%エタノールを含んだキムワイプ(日本製紙クレシア株式会社)を用いて、筋肉組織および腱を除去した後、10個体分の骨を6mlのαMEM/FBS(10%FBS、100ユニット/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン添加αMEM)で満たした乳鉢に入れ、すりつぶした。この粉砕骨溶液を70μmフィルター(cell strainer 2350、ファルコン社)を用いて遠心分離によりろ過し、ろ過された細胞懸濁液を回収した。回収した細胞懸濁液を280×gで8分間遠心し、得られた細胞ペレットを、ピペッティングにより、5mlαMEM/FBSに再懸濁した。
冷却したフィコール(Ficoll-Paqie Plus(1077g/ml)、GEヘルスケア・バイオサイエンス社)を5ml加え、ここに5mlの細胞懸濁液を重層した。これを、4℃、780×gで15分間遠心した。上層を2ml残して吸引により除去した。さらに、8mlのαMEM/FBSを満たしたピペットを、残留した上層表面の下部に挿入して、約2mlの中間層(単核細胞層)を回収した。この中間層を280×gで8分間遠心した後、上層を除去して細胞ペレットを2mlのEGM-2 BulletKit 培地(Lonza社)にピペッティングにより再懸濁し、これを骨髄単核細胞懸濁液とした。
まず、6ウェルプレートの各ウェルに、3mlずつフィブロネクチン溶液(1mg/mlのフィブロネクチンストック溶液50μlを25mlPBSで希釈)を加えた。これを、37℃で一晩インキュベートし、PBSで洗浄してフィブロネクチンコーティングプレートとした。
播種後21日目に、骨髄由来血管内皮前駆細胞の培養液を吸引し、細胞を1mlのMHM培地(DMEM-F12 (1:1)、 glucose (0.6 %)、 glutamine (2 mM)、 sodium biocarbonate (13.4 mM)、 HEPES (5 mM)、 insulin (25 μg/ml)、 transferrin (100 μg/ml)、 progesterone (20 nM)、 sodium selenate (30 nM)、 purescine (60 μM)、Murayama et al., Journal of Neuroscience Research, 69: 837-847, 2002)で洗浄した後、1mlのMHMを加え、さらに24時間培養を続けた。その後、この培地を回収し、これを0.45μmのフィルターでろ過し、血管内皮前駆細胞培養上清(EPC-CM)とした。必要に応じ、使用時まで-20℃で保存した。
上記回収されたEPC-CMを、Amicon Ultra 15 centrifuge filter devices(10K NMWL、UFC9010、Millipore 社)を用いて、2380×g、30分間遠心してろ過し、フィルター上に残留した培養上清をピペットで回収した。これによりEPC-CMは約45倍濃縮された。これを濃縮EPC-CMとし、必要に応じて使用まで-20℃で保存した。
マウス脳室への濃縮EPC-CMの注入は、Alzet Brain Infusion Kit3 (0008851、Alzet 社)、およびAlzet osmotic pump(1007D、Alzet 社)を用いて行った。まず、この注入装置のカテーテルチューブを2cmの長さに切り、一端を脳注入用カニューレに、もう一端をAlzet pump flow modulatorに接続し、これらの接続点をシアノアクチレート接着剤でそれぞれ接着した。さらに、脳注入用カニューレに、0.5mm厚の深度調節用スペーサーを取り付け、シアノアクチレート接着剤で接着した。これにより、3mmであったカニューレチューブの深度が2.5mmに調節された。Alzet osmotic pumpに濃縮EPC-CM、あるいは、αMEM(担体、対照)を満たした。適当な長さに切った残りのカテーテルチューブを用い、このニードルの先をAlzet pump flow modulator の開放側に接続して、注入装置にシリンジ内の濃縮EPC-CM、あるいは同様に濃縮したαMEM(対照)を注入した。その後、シリンジと、シリンジに接続されたカテーテルチューブを取り外し、Alzet flow modulatorの開放側にAlzet osmotic pump を接続した。
これらのマウスに対し、以下に詳細に説明するように、BrdUを投与して、神経幹細胞及びその子孫細胞を検出した。
本実施例では実施例1で回収されたEPC-CMが、in vitroで神経幹細胞の自己複製を促進することを示す。
骨髄由来血管内皮前駆細胞の培養上清(EPC-CM)の比較対照として、骨髄由来血内皮前駆細胞と同様に骨髄由来で増殖因子を分泌する骨髄間質細胞の上清(MSC-CM)を調製した。まず、以下のように、骨髄間質細胞を培養した。実施例1と同様に、成体マウス(C57BL/6J、オス、8~10週齢、n=2)の粉砕骨溶液を遠心分離して得られた細胞ペレットをαMEM/FBSに再懸濁した。
大脳半球の線条体から単離した細胞をin vitroで浮遊培養することにより、神経幹細胞および神経前駆細胞からなる浮遊細胞塊(ニューロスフェア)を形成させることができる。以下に、EPC-CMで培養することにより継代培養後のニューロスフェアの形成率を増加させることができることから、神経幹細胞の自己複製を促進させる物質がEPC-CMに含まれていることを示す。
と20ng/ml EGF(共に最終濃度)を添加したMHMを含む75cm2フラスコに2×105細胞/mlの密度で播種し、5%CO2、37℃で培養した。
フラスコ内の初代ニューロスフェアを遠心管に移し、400rpmで5分間遠心した。上清を除去し、細胞ペレットに2mlMHMを加えてニューロスフェアを再懸濁した。ピペッティングにより、ニューロスフェアを粉砕し、細胞懸濁液を調製した。数分間、この懸濁液を静置することにより、残った細胞塊を沈下させ、単細胞のみを含む上澄み部分(1.5ml)を新しい遠心管に移した。さらに、細胞塊を含む下層に1.5mlのMHMを加え、再びピペッティングにより細胞塊を粉砕した。これを2分間静置し、この上澄み1.5mlを1回目に回収した上澄みに混合した。ここに2mlMHMを加え、800rpmで5分間遠心した。上清を吸引除去し、細胞ペレットに1mlMHMを加えて細胞を再懸濁した。
さらに、6ウェルプレートに播種した二次ニューロスフェアを、継代1回目と同様に継代した。細胞数を計数した後に得られた細胞ペレットを、20ng/ml bFGFと20ng/ml EGF(共に最終濃度)を添加したMHM/初代培養ニューロスフェアの培養上清(1:1)に再懸濁し2000細胞/200μlの細胞密度に調製した。これを96ウェルプレートに播種し、5%CO2、37℃で10日間培養した。
上記1回目あるいは2回目の継代後の培養で得られた、各ウェルにおける直径が50μmより大きなニューロスフェアを計数した。計数した三次ニューロスフェア数の、播種した細胞数に対する百分率をニューロスフェア形成率とした。
本実施例では、EPC-CMに含まれる神経幹細胞の自己複製促進物質が、既知の増殖因子以外の物質であることを示す。
本実施例では、EPC-CMに含まれる神経幹細胞自己複製促進タンパク質であるECF-Lを単離する。
蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動(財団法人化学物質評価研究機構 安全性評価技術研究所に委託、試験番号937-07-P-1022)によって、EPC-CMには含まれるが、MSC-CMには含まれない物質を検索した。以下に具体的な実験法を説明する。
尿素、ジチオスレイトール(DTT)、ファーマライト、グリセロール、ラウリル硫酸ナトリウム(SDS)、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩(Tris)、Cy-DyeはGEヘルスケア・バイオサイエンス社、{3-〔(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio〕-1- propanesulfonate}CHAPS、ヨードアセトアミドは同仁化学、リジンはシグマ社、酢酸、蟻酸(精密分析用)は和光純薬、メタノール(HPLCグレード)は和光純薬工業、トリプシンはプロメガ社、マルチプルアフィニティーリムーバルスピンカートリッジ、Ms-3 (0.45 ml pack)はアジレント・テクノロジー社、Sypro RubyはMolecular Probes 社より、それぞれ購入した。
マルチプルアフィニティーリムーバルスピンカートリッジを用いて、サンプル(EPC-CM、および、MSC-CM)中のアルブミン、IgG、トランスフェリンをアジレント社の提供しているプロトコールに従って除去した。除去処理後のタンパク質溶液に対して2倍量の冷アセトンを添加した後にディープフリーザー(-80℃)で1時間保持し、析出したタンパク質を20000×gで20分間遠心した。沈降物をプロテアーゼインヒビターを添加したLysis Buffer (LB) (4%(w/v)CHAPS、2M thiourea, 8M ウレア、 10mM Tris-HCl、pH 8.8)で溶解したものを解析用サンプルとした。タンパク質濃度については、濃縮処理後LBに再溶解したサンプルのタンパク質濃度をブラッドフォード法に従って定量した。処理後のEPC-CMとMSC-CMの両サンプルをタンパク質量として等量ずつ混合したものをプールサンプルとした。
二次元電気泳動を、以下の条件に従って、3枚のゲルにおいて行った(トリプリケート)。各200μgのサンプルを展開した。
上記二次元ディファレンスゲルの方法に従い、同条件下で600μgのタンパク質を含むサンプルを泳動した。泳動後、固定化液(メタノール10%、酢酸7%)に室温で30分浸漬してタンパク質を固定化した。固定化後、200mlのSypro Ruby液(モレキュラープローブ社)中に室温で3時間浸漬した。染色が終了したら、脱色液(メタノール10%、酢酸7%)で余分な染色液を洗った。
LC条件:
カラム:PepMap100(75μmID×15cm、3μm、100Å、S/N 31817)
カラム温度:室温
移動相:A液 95/5 水/アセトニトリル 0.1%蟻酸
B液 5/95 水/アセトニトリル 0.1%蟻酸
流速:2.5μL/分
グラジェント条件:表2
MS測定はMasslynx ソフトウェア(マイクロマス社)のサーベイモードで行った。
キャピラリー電圧:3300 V
コーン電圧:45 V
Collision-induced dissociation (CID)ガス:アルゴン
コリジョンエネルギー:25-35 eV
MS/MS解析により得られたデータは、MassLynx(マイクロマス社)によりデコンボリューション処理を行った。得られたピークリストファイル(pklファイル)をMascot(マトリックスサイエンス社)を用いてNCBInr(20070727: 5325920 sequences; 1842455067 residues)およびSwiss-Prot(50.8: 234112 sequences; 85963701 residues)のデータベースに対して検索を行った。修飾に関する検索条件は、カルバミドメチル化とメチオニンの酸化を標準とした。
本実施例では、実施例4で同定されたECF-Lが、神経幹細胞自己複製促進物質であることを示す。
マウスChitanase 3-like 3(ECF-L)をコードするcDNAが挿入されたpDNR-LIB ベクターを有する大腸菌 DH10B TonA(30298306、imaGenes 社)をクロラムフェニコール(30mg/mlで100%エタノールに希釈)選択LB培地に播種し、37℃で培養した。翌日、コロニーをピックアップし、さらにクロラムフェニコール選択LB液体培地で一晩振盪培養した後、QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen 社)を用いてプラスミドを回収した。
CMV-F:GCTCACCGTCTTTCATTGCC(配列番号2)
CMV-R:TGTATCTTATCATGTCTGGATC(配列番号3)
得られたECF-L遺伝子導入HEK293T細胞の培養上清にECF-Lが分泌されていることを確認するため、ウエスタンブロット法によりECF-L遺伝子導入HEK293T細胞の培養上清に含まれるECF-Lを検出した。まず、ECF-L遺伝子導入HEK293T細胞の培養上清1mlを回収し、AmiconUltra-4 Centrifugal Filter Devices (10k NMWL、UFC801008、Millipore 社)を用いてろ過することにより濃縮した。
以下、組換えECF-Lが、神経幹細胞の自己複製に対する促進効果があることを検証した。
Sense strand: 5’-GAUCAAGUUCAACGGUUUUUC(配列番号4)
Anti sense strand: 5’-AAAACCGUUGAACUUGAUCUU(配列番号5)
ここでは、組換えECF-Lが、成体の線条体から得られた神経幹細胞の自己複製促進効果を有することを検証する。
本実施例では、神経幹細胞が存在する海馬および脳室下帯においてECF-Lが局在しており、ECF-Lが生理的に神経幹細胞に作用している可能性があることを示す。
CAG-EGFPマウスから、前述の骨髄由来細胞の単離法に基づいて骨髄細胞を取得した。この骨髄細胞を、レシピエント個体(C57BL/6J、オス、8~10週齢)あたり2×106細胞ずつ移植した後、レシピエント個体を10.5Gyの放射線に曝露した。その後、4週間以上飼育した。
本実施例では、ECF-Lをin vitroで作用させて調製したニューロスフェアが、高効率で神経細胞に分化することを示す。
本実施例では、ECF-Lがin vivoでも、神経幹細胞の自己複製を促進する効果を有すること、並びに、脳室にECF-Lが注入されたマウスの線条体から得られた神経幹細胞は、高効率で神経細胞に分化することを示す。
Claims (10)
- 神経幹細胞の自己複製を促進するための促進剤であって、
ECF-LまたはECF-Lを発現する発現ベクターを有効成分として含むことを特徴とする、促進剤。 - 前記ECF-Lがヒトacidic chitinase、ヒトchitotriosidase、ヒトoviductal glycoprotein 1 precursor、ヒトchitinase 3-like 2 またはヒトchitinase 3-like 1であることを特徴とする、請求項1に記載の促進剤。
- 神経幹細胞を培養する方法であって、
ECF-L存在下で神経幹細胞を培養することを特徴とする、方法。 - 前記ECF-Lがヒトacidic chitinase、ヒトchitotriosidase、ヒトoviductal glycoprotein 1 precursor、ヒトchitinase 3-like 2 またはヒトchitinase 3-like 1であることを特徴とする、請求項3に記載の方法。
- 神経幹細胞の自己複製を促進するための医薬組成物であって、
ECF-LまたはECF-Lを発現する発現ベクターを含有することを特徴とする医薬組成物。 - 前記ECF-Lがヒトacidic chitinase、ヒトchitotriosidase、ヒトoviductal glycoprotein 1 precursor、ヒトchitinase 3-like 2 またはヒトchitinase 3-like 1であることを特徴とする、請求項5に記載の医薬組成物。
- 神経の機能不全をもたらす疾患の治療用医薬組成物であることを特徴とする、請求項5または6に記載の医薬組成物。
- 前記疾患が、脳梗塞、脊髄損傷、筋委縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、進行性核上性麻痺、ハンチントン病、多系統萎縮症、脊髄小脳変性症、脳出血、または、くも膜下出血であることを特徴とする、請求項7に記載の医薬組成物。
- 前記神経の機能不全が、加齢に起因することを特徴とする、請求項7に記載の医薬組成物。
- 請求項5~9のいずれかに記載の医薬組成物を含有することを特徴とする、医薬剤。
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