WO2011126409A1 - Ингибиторы теломеразы и способ их получения - Google Patents
Ингибиторы теломеразы и способ их получения Download PDFInfo
- Publication number
- WO2011126409A1 WO2011126409A1 PCT/RU2011/000223 RU2011000223W WO2011126409A1 WO 2011126409 A1 WO2011126409 A1 WO 2011126409A1 RU 2011000223 W RU2011000223 W RU 2011000223W WO 2011126409 A1 WO2011126409 A1 WO 2011126409A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- substituents
- group
- substituent
- imidazol
- telomerase
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/28—Compounds containing heavy metals
- A61K31/30—Copper compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
- C07D401/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing three or more hetero rings
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F1/00—Compounds containing elements of Groups 1 or 11 of the Periodic System
- C07F1/005—Compounds containing elements of Groups 1 or 11 of the Periodic System without C-Metal linkages
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F1/00—Compounds containing elements of Groups 1 or 11 of the Periodic System
- C07F1/08—Copper compounds
Abstract
Изобретение относится к области органической и медицинской химии, молекулярной биологии и касается способа получения нового класса соединений, ингибирующих теломеразу, которые могут быть использованы для изучения теломераз и каталитических субъединиц теломераз, обратных транскриптаз, для изучения и лечения опухолевых и вирусных заболеваний. Координационные соединения производных имидазол-4-она, ингибирующие теломеразу, характеризуются общей формулой (I).
Description
ИНГИБИТОРЫ ТЕЛОМЕРАЗЫ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
Область техники
Изобретение относится к области органической и медицинской химии, молекулярной биологии и касается способа получения нового класса соединений, ингибирующих теломеразу, которые могут быть использованы для изучения теломераз и каталитических субъединиц теломераз, обратных транскриптаз, для изучения и лечения опухолевых и вирусных заболеваний.
Уровень техники
Теломераза - это фермент, необходимый для компенсации укорочения длины теломер в клетках эукариот. Теломеры состоят из характерных тандемных повторов (например TTAGGG у человека), найденных на концах большинства эукариотических хромосом (Blackburn, "Structure and Function of Telomeres, "Nature, 350:569-573, 1991). Количество повторов определяет длину теломер. Пролиферативный потенциал клетки связывают с длиной теломер, так как стабильность и целостность эукариотических хромосом зависят от динамической структурной организации теломер (Baird DM. "Mechanisms of telomeric instability", Cytogenet Genome Res. 2008; 122(3-4):308-14, 2009), при их укорочении меньше критической длины стабильность нарушается, затем клетка гибнет. Теломеры играют важную роль в контроле разделения хромосом и вовлечены в регулирование клеточного цикла. С каждым клеточным делением у соматической клетки теряются приблизительно 60-100 оснований с концов хромосом. Теломеры сокращаются, клетка, в конечном счете, достигает кризиса, и в клетке запускается апоптоз. В организме существуют клетки с неограниченным потенциалом деления. Именно в них (в половых, стволовых клетках, а так же в клетках опухоли), существует процесс компенсации укорочения теломер. За этот процесс отвечает фермент- теломераза. Теломераза активна в таких клетках и поддерживает длину теломер выше кризисного уровня. Теломераза - это специализированная обратная транскриптаза (для человека hTERT), работающая в комплексе с собственной рибонуклеиновой кислотой (РНК). Эта РНК называется теломеразной (для человека hTERC) и содержит участок для синтеза теломерных повторов ДНК (матричный участок). Другими словами, для приобретения способности к неограниченному делению клетка должна активировать механизм, поддерживающий длину теломер выше критического уровня, а именно теломеразу. Так, существенный уровень теломеразной активности был обнаружен в более чем 85% опухолей (Kim et al., "Specific Association of Human Telomerase Activity
with Immortal Cells and Cancer," Science, 266:201 1-2015, 1994). Теломеразная активность также присутствует в стволовых сумках нормальных тканей, но на более низком уровне (Morin, "Is Telomerase a Universal Cancer Target?", J. Natl. Cancer Inst., 87:859-861, 1995). Таким образом, присутствие активной теломеразы в опухоли обеспечивает наличие мишени, дающей потенциально хорошую селективность к опухолевым клеткам по отношению к здоровой ткани. Ингибирование теломеразы было предложено в качестве нового подхода к терапии рака (первые работы Morin, "Is Telomerase a Universal Cancer Target?", J. Natl. Cancer Inst., 87:859-861, 1995; Parkinson, "Do Telomerase Antagonists Represent a Novel Anti-Cancer Strategy?" Brit. J. Cancer, 73: 1-4, 1996; Raymond et al., "Agents that target telomerase and telomeres," Curr Opinion Biotech.,7:583-591, 1996, более современное состояние в обзоре Shay JW, Wright WE. Telomerase therapeutics for cancer: challenges and new directions. Nat Rev Drug Discov. 5(7):577-84, 2006).
Третичная структура белка каталитической субъединицы теломеразы человека остается на настоящий момент неразрешенной, но на основе анализа первичной структуры показано, что этот белок сходен с другими обратными транскриптазами (Lingner et al., "Reverse Transcriptase Motifs in the Catalytic Subunit of Telomerase," Sci., 276:561-567, 1997), поэтому ее активность подавляется при использовании ингибиторов обратных транскриптаз, например: AZT (Strahl and Blackburn, "Effects of Reverse Transcriptase Inhibitors on Telomere Length and Telomerase Activity in Two Immortalized Human Cell Lines,"Mol. Cell. Biol.,16;53-65, 1996) и других нуклеозидов (Fletcher et al., "Human Telomerase Inhibition by 7-Deaza 2'-deoxypurine Nucleoside Triphosphates," Biochem, 35:1561 1-15617, 1996). Также была показана возможность ингибирования любой теломеразной активности при использования антисмысловой последовательности к матричному участку теломеразной РНК, например нуклеиновых кислот, слитых с пептидом (Norton et al., "Inhibition of Human Telomerase Activity by Peptide Nucleic Acids," Nature Biotechnol., 14:615-619, 1996) и фосфотиоатных олигонуклеотидов (Mata et al., "A Hexameric Phosphorothioate Oligonucleotide Telomerase Inhibitor Arrests Growth of Burkitt's Lymphoma Cells in Vitro and in Vivo, "Toxicol Appl. Pharmacol., 144: 189-197, 1997). Антисмысловый дезоксирибонуклеотид, содержащий 185 нуклеотидов hTERC, был в состоянии сократить теломеры в клетках HeLa за 23-26 клеточных делений до критического уровня и вызвал апоптоз. Другой дезоксирибонуклеотид, содержащий 2'-5'-аденилат (2-5А) с тем, чтобы не только связать, но и расщепить hTERC, вызвал апоптоз в глиоме, раке простаты, раке шейки матки, мочевого пузыря и яичников в течение 4-5 дней. Чтобы увеличить сродство к hTERC-последовательности и стабильность олигонуклеотида были использованы 2'-0-
метил-РНК-олигонуклеотиды. Самым эффективным оказался олигонуклеотид GRN163 (Asai et al. A novel telomerase template antagonist (GRN163) as a potential anticancer agent. Cancer Research, 63:3931-3939, 2003). Клетки, культивируемые с этим соединением, гибли в течение 100 дней, GRN163 ингибировал теломеразную активность при очень низких, по сравнению с другими олигонуклеотидами, концентрациях, GRN163L является первым ингибитором теломеразы, который вошел в клиническую практику. Доклинические исследования показали безопасность и эффективность такого ингибирования. Безопасность и определение дозы для пациентов, невосприимчивых к другой терапии, находятся в стадии изучения. Эти исследования не закончены (США, ClinicalTrials.gov, NCT00310895), однако уже показанная эффективность. GRN163L - однозначное подтверждение того, что ингибирование теломеразы - это основа антираковой терапии.
Из WO99/01560 от 14.01.1999 (RU2000102361, дата приоритета 01.07.1998) также известны ингибиторы теломеразной активности олигонуклеотидной природы.
Известны примеры использования координационных соединений железа (III), цинка (II), никеля (II), марганца (III) и платины (И) (Monchaud et al., "A hitchhiker's guide to G-quadruplex ligands", Org. Biomol. Chem., 6, 627, 2008). Большинство координационных соединений содержит производные порфирина или конденсированные пиридиновые системы. Ингибирование теломеразы наблюдается при значениях IC5o-TRAP (IC50 - концентрация ингибитора, при которой активность фермента подавляется на 50%) от 0,12 до 30 мкМ.
Наиболее близким аналогом изобретения является ингибитор теломеразы, который представляет собой координационное соединение меди (II), содержащее лиганд на основе производного порфирина [S. Е. Evans, М. A. Mendez, К. В. Turner, L. R. Keating, R. Т. Grimes, S. Melchoir and V. A. Szalai, J. Biol. Inorg. Chem., 2007, 12(8), 1235-1249]. Это соединение селективно взаимодействует с квадруплексом ДНК, значение ICso-TRAP в экспериментах по ингибированию теломеразы составляет 26 мкМ. К недостаткам этого ингибитора теломеразы следует отнести сложность синтеза органического лиганда и координационного соединения, а также низкое значение IC50.
Указанные недостатки известных ингибиторов теломеразы могут быть преодолены при использовании координационных соединений производных имидазол- 4-она, более подробно описанных далее со ссылками на прилагаемые иллюстративные материалы.
Описание иллюстративных материалов
Фиг. 1. Структурные формулы заместителей А в заявленных производных имидазол-4-она.
Фиг. 2. Структурные формулы заместителей В в заявленных производных имидазол-4-она.
Фиг. 3. Структурные формулы заместителей С в заявленных производных имидазол-4-она.
Фиг. 4. Метод амплификации теломерных повторов (TRAP-анализ).
Фиг. 5. Тестирование теломеразной активности для различных концентраций комплекса (5Z, 5^)-2,2'-(этан-1,2-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2-пиридилметилен)-3- аллил-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-она) с хлоридом меди.
Раскрытие изобретения
В качестве ингибиторов теломеразы согласно изобретению могут быть использованы координационные соединения производных имидазол-4-она общей формулы
где заместитель А выбран из группы, включающей арильные заместители, конденсированные арильные заместители, циклопентил, циклогексил, алифатические заместители, алифатические заместители с двойной связью, алифатические заместители с тройной связью, метиламиновый заместитель CH3NH-, карбэтокси-группу C2HsO(0)C-, пятичленные гетероциклические заместители с одним атомом азота, пятичленные гетероциклические заместители с двумя атомами азота, шестичленные гетероциклические заместители, заместитель В отсутствует или является алифатическим заместителем, заместитель С представляет собой гетероарильный заместитель, присоединяемый к производному имидазол-4-она через атом углерода и выбран из группы, включающей 5-членные ненасыщенные моноциклические гетероарильные заместители с 1 , 2, 3 гетероатомами в цикле, выбранными из группы,
включающей N, О и S, 6-членные ненасыщенные моноциклические гетероарильные заместители с 1, 2, 3 гетероатомами в цикле, выбранными из группы, включающей N, О и S, 8-, 9- и 10-членные ненасыщенные бициклические гетероарильные заместители с 1 , 2, 3 гетероатомами в цикле, выбранными из группы, включающей N, О и S, X представляет собой хлорид С1 или нитрат N03.
В предпочтительном варианте выполнения изобретения заместитель А является незамещенным или монозамещенным, или дизамещенным арильным заместителем, при этом заместители R в арильной группе выбраны из группы, включающей галогены и алкильные заместители.
В предпочтительном варианте выполнения изобретения заместитель А является незамещенным или монозамещенным, или дизамещенным конденсированным арильным заместителем, при этом заместители R в конденсированной арильной группе выбраны из группы, включающей галогены и алкильные заместители.
В предпочтительном варианте выполнения заместитель А выбран из группы, включающей фенил C6Hs-, З-хлор-4-фторфенил 3-Cl-4-F-C6H3-, 4-карбэтоксифенил
4- С2Н50(0)СС6Н4-, метил СН3-, аллил СН2=СНСН2-, 2-антрил, пропил С3Н7- (фиг. 1).
В предпочтительном варианте выполнения заместитель В выбран из группы, включающей 1,2-этандиил -(СН2)2-, 1,3-пропандиил -(СН2)3-, 1 ,4-бутандиил -(СН2)4-, 1 ,6-гександиил -(СН2)б-, 1 , 10-декандиил -(СН2)ю- (фиг. 2).
В предпочтительном варианте выполнения заместитель С выбран из группы, включающей 2-хинолил, 2-пиридил, 1-метил-2-имидазолил, 4-метил-5-имидазолил,
5- имидазолил, 2-имидазолил, 1,5-диметил-З-пиразолинил, 1,5-дифенил-З-пиразолинил (фиг. 3).
В способе получения координационных соединений производных имидазол-4-она согласно изобретению осуществляют следующие стадии: смешивают раствор производного имидазол-4-она в дихлорметане с метонолом, медленно приливают к смеси раствор соли меди в метаноле или ацетонитриле, реакционную смесь выдерживают до выпадения осадка координационного соединения производного имидазол-4-она.
В качестве соли меди могут быть использованы хлорид меди и нитрат меди. В качестве производных имидазол-4-она могут быть использованы соединения общей формулы
где заместитель А выбран из группы, включающей арильные заместители, конденсированные арильные заместители, циклопентил, циклогексил, алифатические заместители, алифатические заместители с двойной связью, алифатические заместители с тройной связью, метиламиновый заместитель CH3NH-, карбэтокси-группу С2Н50(0)С-, пятичленные гетероциклические заместители с одним атомом азота, пятичленные гетероциклические заместители с двумя атомами азота, шестичленные гетероциклические заместители, заместитель В отсутствует или является алифатическим заместителем, заместитель С представляет собой гетероарильный заместитель, присоединяемый к производному имидазол-4-она через атом углерода и выбран из группы, включающей 5-членные ненасыщенные моноциклические гетероарильные заместители с 1 , 2, 3 гетероатомами в цикле, выбранными из группы, включающей N, О и S, 6-членные ненасыщенные моноциклические гетероарильные заместители с 1 , 2, 3 гетероатомами в цикле, выбранными из группы, включающей N, О и S, 8-, 9- и 10-членные ненасыщенные бициклические гетероарильные заместители с 1, 2, 3 гетероатомами в цикле, выбранными из группы, включающей N, О и S.
В предпочтительном варианте выполнения изобретения заместитель А является незамещенным или монозамещенным, или дизамещенным арильным заместителем, при этом заместители R в арильной группе выбраны из группы, включающей галогены и алкильные заместители.
В предпочтительном варианте выполнения изобретения заместитель А является незамещенным или монозамещенным, или дизамещенным конденсированным арильным заместителем, при этом заместители R в конденсированной арильной группе выбраны из группы, включающей галогены и алкильные заместители.
В предпочтительном варианте выполнения заместитель А выбран из группы, включающей фенил СбН5-, З-хлор-4-фторфенил 3-С1-4-Р-СбН3-, 4-карбэтоксифенил 4-С2Н50(0)СС6Н4-, метил СН3-, аллил СН2=СНСН2-, 2-антрил, пропил С3Н7- (фиг. 1).
В предпочтительном варианте выполнения заместитель В выбран из группы, включающей 1,2-этандиил -(СН2)2-, 1,3-пропандиил -(СН2)3-, 1 ,4-бутандиил -(СН2)4-, 1 ,6-гександиил -(СН2)6-, 1 , 10-декандиил -(СН2)ю- (фиг. 2).
В предпочтительном варианте выполнения заместитель С выбран из группы, включающей 2-хинолил, 2-пиридил, 1 -метил-2-имидазолил, 4-метил-5-имидазолил, 5-имидазолил, 2-имидазолил, 1,5-диметил-З-пиразолинил, 1 ,5-дифенил-З-пиразолинил (фиг. 3).
Заявленные производные имидазол-4-она могут быть получены алкилированием замещенных в 3-положении 2-тиогидантоинов α,ω-дибромалканами. Для этого к смеси производных 2-тиогидантоинов (2 эквивалента) и сухого К2С03 (3 эквивалента) в диметилформамиде при температуре 0°С при перемешивании добавляют α,ω-дибромалкан (1 эквивалент). Реакционную смесь перемешивают в течение двух часов при температуре 0°С, а затем 2 часа при комнатной температуре. После этого к смеси добавляют 50 мл воды. Образовавшийся осадок отфильтровывают и промывают водой, а затем диэтиловым эфиром.
Изобретение иллюстрируется примерами альтернативных вариантов его выполнения.
Пример 1. Синтез (5Z, 5'г)-2,2'-(этан-1,2-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2- пиридилметилен)-3-метил-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-она)
Из 0,5 г (0,0025 моль) 2-тиоксо-3-метил-5(( )-2-пиридилметилен)-тетрагидро- 4Н-имидазол-4-она и 0,21 г (0,0013 моль) 1,2-дибромэтана получено 0,40 г (76%) (5Z, 5^)-2,2'-(этан-1 ,2-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2-пиридилметилен)-3-метил-3,5- дигидро-4Н-имидазол-4-она). Тпл=215°С.
Спектр ЯМР Ή (400МГц, CDC13, δ, м.д.): 8,82(д, 1Н, Н„-Ру, .1=7,9Гц), 8,59(д, Ш, Нр-Ру, 1=4,0Гц), 7,71(тд, 1Н, Нр-Ру, 1,=7,ЗГц, ^=2,ЗГц), 7,23(с, 1Н, СН=), 7,13(дд, 1Н, H Py,
3,08(с, ЗН, N-CH3).
ИК-спектр (см 1): 1710(С=О), 1670(C=N), 1640(С=С).
Элементный анализ: C22H2oN602S2 вычислено С 56,88% Н 4,34% N 18,09%; найдено С 56,74% Н 4,27% N 17,82%.
Пример 2. Синтез (5Z, 5^)-2,2'-(этан-1,2-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2- пиридилметилен)-3-пропил-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-она)
Из 0,5 г (0,002 моль) 2-тиоксо-3-пропил-5((г)-2-пиридилметилен)-тетрагидро- 4Н-имидазол-4-она и 0,19 г (0,001 моль) 1,2-дибромэтана получено 0,43 г (82%) (5Z, 5'г)-2,2'-(этан-1,2-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2-пиридилметилен)-3-пропил-3,5- дигидро-4Н-имидазол-4-она).
Спектр ЯМР Ή (400МГц, CDC13, δ, м.д.): 8,69(д, J=8,0 Гц, 1Н, На-Ру,), 8,65 (д, J=4,7 Гц, Ш, Нр-Ру,), 7,63 (тд, 1,=7,4Гц, т2=2,0Гц, 1Н, Нр-Ру,), 7,19 (да, -Γι=7,5Γα,
12=0,9Гц, 1H, HY-Py,), 7,12 (c, 1H, CH=), 7,12 (c, 1H, CH=), 3,93 (c, 2H, S-CH2), 3,60 (τ, J=7,5 Гц, 2H, CH2N), 1,72 (м, 2H, CH2), 0,96 (т, J=7,5, 3H, CH3).
ИК-спектр (CM-1): 1705(C=O), 1675(C=N), 1640(C=C).
Элементный анализ: C26H2gN602S2 вычислено С 59,98% H 5,42% N 16,14%; найдено С 59,34% Н 5,17% N 15,88%.
Пример 3. Синтез (5Z, 5^)-2,2'-(этан-1,2-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2- пиридилметилен)-3-аллил-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-она)
Из 0,5 г (0,002 моль) 2-тиоксо-3-пропил-5((2)-2-пиридилметилен)-тетрагидро- 4Н-имидазол-4-она и 0,19 г (0,001 моль) 1 ,2-дибромэтана получено 0,46 г (92%) (5Z, 5' )-2,2'-(этан-1,2-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2-пиридилметилен)-3-аллил-3,5- дигидро-4Н-имидазол-4-она).
Спектр ЯМР Ή (400МГц, CDC13, δ, м.д.): 8,65(м, 2Н, На-Ру + Нр-Ру,), 7,62 (т, 1=7,5Гц, 1Н, Нр-Ру,), 7,19 (м, Ш, Ну-Ру,), 7,14 (с, 1Н, СН=), 7,12 (с, 1Н, СН=), 5,82 (м, 1Н, СН=), 5,23 (м., 2Н, СН2=), 4,23 (м, 2Н, CH2N) 3,89 (с, 2Н, S-CH2).
ИК-спектр (см 1): 1720(С=О), 1680(C=N), 1640(С=С).
Элементный анализ: C26H26N602S2 вычислено С 60,44% Н 4,68% N 16,27%; найдено С 60,14% Н 4,48% N 16,03%.
Пример 4. Синтез (5Z, 5' )-2,2'-(этан-1,2-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2- пиридилметилен)-3-фенил-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-она)
Из 0,3 г (0,001 моль) 2-тиоксо-3-фенил-5((г)-2-пиридилметилен)-тетрагидро-4Н- имидазол-4-она и 0,1 г (0,0005 моль) 1 ,2-дибромэтана получено 0,23 г (73%) (5Z, 5'Z)- 2,2'-(этан-1,2-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2-пиридилметилен)-3-фенил-3,5-дигидро- 4Н-имидазол-4-она). Тпл=2590С.
Спектр ЯМР Ή (400МГц, CDC13, δ, м.д.): 8,75(д, 2Н, На-Ру, 1=7,9Гц), 8,66(д, 2Н, Нр-Ру, 1=4,0Гц), 7,81(тд, 2Н, Нр-Ру, 1,=7,ЗГц, 12=2,ЗГц), 7,42(м, 6Н, H-Ph), 7,29(м, 4Н, H-Ph), 7,1 1(тд, 2Н, Ну-Ру, 1,=7,5Гц, 12=1,0Гц), 7,18(с, 2Н, СН=), 3,1 1(т, 4Н, S-CH2-, 1=7,5Гц).
ИК-спектр (см"1): 1710(С=О), 1670(C=N), 1640(С=С).
Элементный анализ: C32H24N6S202 вычислено С% 65,31, Н% 4,08, N% 14,29; найдено С% 65,28, Н% 4,10, N% 14,11.
Пример 5. Синтез (5Z, 5^)-2,2'-(этан-1,2-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2- пиридилметилен)-3-(1-нафтил)-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-она)
Из 0,3 г (0,001 моль) 2-тиоксо-3-(1-нафтил)-5((2)-2-пиридилметилен)- тетрагидро-4Н-имидазол-4-она и 0,1 г (0,0005 моль) 1 ,2-дибромэтана получено 0,19 г
(68%) (5Z, 5^)-2,2'-(этан-1,2-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2-пиридилметилен)-3-(1- нафтил)-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-она). ТПЛ =2670С.
Спектр ЯМР Ή (400МГц, CDC13, δ, м.д.): 9,12 (д, J=8,8 Гц, 1Н, HetAr), 8,30 (д, J=8,7 Гц, 1Н, HetAr), 8,20 (д, J=8,3 Гц, 1Н, HetAr), 8,15 (д, J=8,3 Гц, 1Н, Аг), 7,95 (м, 1Н, Аг), 7,78 (д, J=8,l Гц, Ш, HetAr), 7,69 (т, J=7,l Гц, Ш, HetAr), 7,61 (м, 1Н, Аг), 7,53(м, 6Н, HetAr + СН= + Аг), 6,91 (с, 2Н, СН=), 3,76 (с, 4Н, CH2-S).
ИК-спектр (см 1): 1710(С=О), 1670(C=N), 1640(С=С).
Пример 6. Синтез (5Z, 5^)-2,2'-(этан-1,2-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2- пиридилметилен)-3-(2-антрил)-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-она)
Из 0,4 г (0,001 моль) 2-тиоксо-3-(2-антрил)-5((г)-2-пиридилметилен)- тетрагидро-4Н-имидазол-4-она и 0,1 г (0,0005 моль) 1,2-дибромэтана получено 0,21 г (81%) (5Z, 5 'г)-2,2'-(этан- 1 ,2-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2-пиридилметилен)-3-(2- антрил)-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-она). Тпл=249°С.
Спектр ЯМР Ή (400МГц, CDC13, δ, м.д.): 8,73 (д, J=7,9 Гц, 2Н, Аг), 8,69 (д, J=5,l Гц, Ш, На-Ру), 8,45 (м, 4Н, Аг), 8,13 (д, J=8,8 Гц, 2Н, Нр-Ру), 8,01 (м, ЗН, Аг), 7,76 (т, J=7,6 Гц, 1Н, Нр -Ру), 7,51 (м, 4Н, Аг), 7,47 (дд, Л=6,8 Гц, J2=l,4 Гц, 2Н, HY-Py)), 7,25 (м, 2Н, Аг), 6,94 (с, 2Н, СН=), 3,83 (с, 4Н, CH2-S).
ИК-спектр (см 1): 1730(С=О), 1680(C=N), 1620(С=С).
Элементный анализ: C48H32N602S2 вычислено С 73,08% Н 4,09% N 10,65%; найдено С 73,35% Н 4,82% N 10,13%.
Пример 7. Синтез (5Z, 5^)-2,2'-(бутан-1,4-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2- пиридилметилен)-3-аллил-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-она)
Из 0,5 г (0,002 моль) 2-тиоксо-3-аллил-5((г)-2-пиридилметилен)-тетрагидро-4Н- имидазол-4-она и 0,22 г (0,001 моль) 1 ,4-дибромбутана получено 0,40 г (76%) (5Z, 5'Z)- 2,2'-(бутан-1 ,4-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2-пиридилметилен)-3-аллил-3,5-дигидро- 4Н-имидазол-4-она). ТПЛ=1980С.
Спектр ЯМР Ή (400МГц, CDC13, δ, м.д.): 8,72(д, 8,1Гц, 2Н, На-Ру), 8,65(д, 1=3,8Гц, 2Н, Нр-Ру), 7,63(тд, Л=8,ЗГц, 12=4,6Гц, 2Н, Н Ру), 7,05(дд, Л=4,7 Гц, J2=l,2 Гц, 2Н, Нр-Ру,), 7,12(с, 2Н, СН=), 5,80 (м, 2Н, =СН-) 5,25 (м, 4Н, СН2=), 4,22 (д, J=7,l Гц, 4Н, -CH2-N), 3,45(т, J=6,7 Гц, 4Н, -CH2-S), 2,07 (м, 4Н, -СН2-).
ИК-спектр (см-1): 1710(С=О), 1670(C=N), 1640(С=С).
Элементный анализ: C28H28N602S2 вычислено С 61,74% Н 5,18% N 15,43%; найдено С 61 ,74% Н 5,18% N 15,43%.
Пример 8. Синтез (5Z, 5'г)-2,2'-(бутан-1,4-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2- пиридилметилен)-3-фенил-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-она
Из 0,3 г (0,001 моль) 2-тиоксо-3-фенил-5((2)-2-пиридилметилен)-тетрагидро-4Н- имидазол-4-она и 0,12 г (0,0005 моль) 1 ,4-дибромбутана получено 0,18 г (78%) (5Z, 5'2)-2,2'-(бутан-1,4-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2-пиридилметилен)-3-фенил-3,5- дигидро-4Н-имидазол-4-она). ТПЛ=2490С.
Спектр ЯМР Ή (400МГц, CDC13, δ, м.д.): 8,75(д, J=7,9 Гц, 2Н, Н„-Ру), 8,66(д, J=4,0 Гц, 1Н, Нр-Ру), 7,81(тд, J,=7,3 Гц, J2=2,3 Гц, 2Н, Нр-Ру), 7,42(м, 6Н, H-Ph), 7,29(м, 4Н, H-Ph), 7,1 1(тд, J,=7,5 Гц, J2=1 ,0 Гц, 2Н, HrPy), 7,18(с, 2Н, СН=), 3,1 1(т, J=7,5 Гц, 4Н, S-CH2-,) 1,86(кв, 1=7,6Гц, 4Н, -СН2-).
ИК-спектр (см 1): 1720(С=О), 1670(C=N), 1640(С=С).
Элементный анализ: C34H28N602S2 вычислено С 66,21% Н 4,58% N 13,63%; найдено С 66,12% Н 4,76% N 13,20%.
Пример 9. Синтез (5Z, 5^)-2,2'-(гексан-1,6-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2- пиридилметилен)-3-аллил-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-она)
Из 0,5 г (0,002 моль) 2-тиоксо-3-аллил-5((г)-2-пиридилметилен)-тетрагидро-4Н- имидазол-4-она и 0,22 г (0,001 моль) 1 ,6-дибромгексана получено 0,40 г (81%) (5Z, 5^)-2,2'-(гексан-1,6-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2-пиридилметилен)-3-аллил-3,5- дигидро-4Н-имидазол-4-она). Тпл=171 °С.
Спектр ЯМР Ή (400МГц, CDC13, 5, м.д.): 8,75 (д, 1=8,2Гц, 2Н, Н„-Ру), 8,67(д, J=4,ir , 2Н, Нр-Ру), 7,68(т, J=7,8 Гц, 21Н, НгРу), 7,16(м, 2Н, Нр-Ру), 7,13(с, 2Н, СН=), 5,83(м, 2Н, -СН=), 5,25(м, 4Н, СН2=), 4,15(д, J=5,9, 4Н, -CH2-N), 3,38 (т, J=7,0 Гц, 4Н, CH2-S), 1,91 (м, 4Н, -СН2-), 1,60 (м, 4Н, -СН2-).
ИК-спектр (см 1): 1710(С=О), 1670(C=N), 1640(С=С).
Элементный анализ: C3oH32N602S2 вычислено С 62,91% Н 5,63% N 14,67%; найдено С 62,91% Н 5,63% N 14,67%.
Пример 10. Синтез (5Z, 5'г)-2,2'-(гексан-1,6-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2- пиридилметилен)-3-фенил-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-она)
Из 0,3 г (0,001 моль) 2-тиоксо-3-фенил-5((г)-2-пиридилметилен)-тетрагидро-4Н- имидазол-4-она и 0,13 г (0,0005 моль) 1 ,6-дибромгексана получают 0,19г (64%) (5Z, 5'г)-2,2'-(гексан-1,6-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2-пиридилметилен)-3-фенил-3,5- дигидро-4Н-имидазол-4-она). TM=240°C.
Спектр ЯМР Ή (400МГц, CDC13, δ, м.д.): 8,77(д, 1=7,9Гц, 2Н, На-Ру,), 8,66(д, 1=3,9Гц ,1Н, Нр-Ру), 7,75(тд, .ч=7,ЗГц, 12=2,ЗГц, 2Н, Нр-Ру), 7,45(м, 6Н, H-Ph), 7,30(м,
4H, H-Ph), 7,17(c, 2H, CH=), 7,13(дц, 1,=7,5Гц, 12=0,9Гц, 2H, НгРу), 3,32(τ-, 7,5Гц, 4Η, S-CH2), 1,86(м, 4Н, -СН2-), 1,54(м, 4Н, -СН2-).
ИК-спектр (см 1): 1700(С=О), 1670(C=N), 1630(С=С).
Элементный анализ: C36H32N6S202 вычислено С% 67,06, Н% 5,00, N% 13,03; найдено С% 66,71, Н% 5,04, N% 12,65.
Пример 11. Синтез (5Z, 5'г)-2,2'-(этан-1,2-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2- хинолилметилен)-3-пропил-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-она)
Из 0,5 г (0,0015 моль) 2-тиоксо-3-пропил-5(^)-2-хинолилметилен)-тетрагидро- 4Н-имидазол-4-она и 0,15 г (0,0008 моль) 1 ,2-дибромэтана получено 0,75 г (81%) (5Z, 5'г)-2,2'-(этан-1,2-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2-хинолилметилен)-3-пропил-3,5- дигидро-4Н-имидазол-4-она). Тпл= 140°С.
Спектр ЯМР Ή (400МГц, CDC13, δ, м.д.): 8,82 (д, J=9,l Гц, 2Н, HetAr), 8,05 (м, 4Н, HetAr), 7,72 (м, 4Н, HetAr), 7,53 (м, 2Н, HetAr), 7,29 (с, 2Н, СН=), 4,00(с, 4Н, -СН2- S), 3,64(т, J=7,4 Гц, 4Н, CH2-N), 1,75 (м, 4Н, СН2), 1,01 (т, J=7,3, СН3-).
ИК-спектр (см 1): 1715(С=0), 1670(C=N), 1640(С=С).
Элементный анализ: C38H38N202S2 вычислено С 73,75% Н 6,19% N 4,53%; найдено С 73,13% Н 6,53% N 4,88%.
Пример 12. Синтез (5Z, 5'г)-2,2'-(этан-1,2-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2- хинолилметилен)-3-аллил-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-она)
Из 0,5 г (0,0015 моль) 2-тиоксо-3-аллил-5(^)-2-хинолилметилен)-тетрагидро- 4Н-имидазол-4-она и 0,15 г (0,0008 моль) 1 ,2-дибромэтана получено 0,70 г (78%) (5Z, 5^)-2,2'-(этан-1,2-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2-хинолилметилен)-3-аллил-3,5- дигидро-4Н-имидазол-4-она). Тпл=180°С.
Спектр ЯМР Ή (400МГц, CDC13, δ, м.д.): 8,82 (д, J=9,0 Гц, 2Н, HetAr), 8,05 (м, 4Н, HetAr), 7,73 (м, 4Н, HetAr), 7,57 (м, 2Н, HetAr), 7,32 (с, 2Н, СН=), 5,88 (м, 2Н, СН=), 5,30 (м, 4Н, СН2=), 4,30 (д, 1=5,6Гц, 4Н, -CH2-N), 3,97(с, 4Н, CH2-S).
ИК-спектр (см 1): 1710(С=О), 1670(C=N), 1640(С=С).
Элементный анализ: C38H34N202S2 вычислено С 74,24% Н 5,57% N 4,56%; найдено С 74,42% Н 5,14% N 4,89%.
Пример 13. Синтез (5Z, 5'г)-2,2'-(этан-1,2-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2- хинолилметилен)-3-фенил-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-она)
Из 0,5 г (0,0015 моль) 2-тиоксо-3-фенил-5((г)-2-хинолилметилен)-тетрагидро- 4Н-имидазол-4-она и 0,14 г (0,0007 моль) 1 ,2-дибромэтана получено 0,41 г (81%) (5Z, 5^)-2,2'-(этан-1,2-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2-хинолилметилен)-3-фенил-3,5- дигидро-4Н-имидазол-4-она). ТПл=2390С.
Спектр ЯМР Ή (400МГц, CDC13, 5, м.д.): 8,84 (д, J=8,6 Гц, 2Н, HetAr), 8,05 (д, J=8,8 Гц, 2Н, HetAr), 7,97 (д, J=8,3 Гц, 2Н, HetAr), 7,73 (м, 4Н, HetAr), 7,45 (м, 14Н, Аг + СН= + HetAr), 3,93 (с, 4Н, -CH2-S).
И -спектр (см 1): 1710(С=О), 1670(C=N), 1640(С=С).
Элементный анализ: C44H34N202S2 вычислено С 76,94% Н 4,99% N 4,08%; найдено С 76,67% Н 4,13% N 3,98%.
Пример 14. Получение координационных соединений производных имидазол-4-она
К раствору 0,0001 моль алкилированных производных 2-тиогидантоина (производных имидазол-4-она) в 2-3 мл хлористого метилена добавляют 2 мл метанола для достижения расслоения. Затем медленно, по каплям, в течение не менее чем 2 минут приливают раствор 0,0002 моль соли меди в 2-3 мл метанола. Реакционную смесь плотно закрывают и оставляют до выпадения осадка.
В случае получения комплекса (5Z, 5'Z)-2,2'-(3TaH-l,2- диилдисульфанилдиил)бис(5-(2-пиридилметилен)-3-аллил-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4- она) с нитратом меди в качестве растворителя соли используют ацетонитрил, при этом реакционную смесь закрывают от света и оставляют до выпадения осадка.
Получение комплекса (5Z, 5 '2)-2,2 '-(этан-1,2-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2- пиридилметилен)-3-метш-3,5-дигидро-4Н-1шидазол-4-она) с СиС1г2Н20
Из 0,05 г (5Z, 5'2)-2,2'-(этан-1,2-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2- пиридилметилен)-3-метил-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-она) и 0,03 г СиС12-6Н20 получают 0,04 г (54%) комплекса коричневого цвета.
Элементный анализ: C22H20N6O2S2*CuCl2*CuCl С 37,86% Н 2,89% N 12,04%; найдено С 37,04% Н 2,57% N 12,22%.
Получение комплекса (5Z, 5 '2)-2,2 '-(этан-1,2-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2- пиридилметилен)-3-пропил-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-она) с СиС1 2Н20
Из 0,05 г (5Z, 5'г)-2,2'-(этан-1 ,2-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2- пиридилметилен)-3-пропил-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-она) и 0,03 г СиС12-6Н20 получают 0,03 г (45%) комплекса коричневого цвета.
Элементный анализ: C26H28N602S2 *CuCl2*CuCl вычислено С 41 ,41% Н 3,74% N 1 1,14%; найдено С 41,63% Н 3,87% N 1 1,86%.
Получение комплекса (5Z, 5 '2)-2,2 '-(этан-1,2-диилдисулъфанилдиил)бис(5-(2- пиридилметилен)-3-аллил-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-она) с СиС1 2Н20
Из 0,05 г (5Z, 5'2)-2,2'-(этан-1,2-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2- пиридилметилен)-3-аллил-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-она) и 0,03 г СиС12-6Н20 получают 0,03 г (40%) комплекса коричневого цвета.
Элементный анализ: C26H24N602S2* CuCl2*CuCl вычислено С 41 ,63% Н 3,23% N 1 1,15%; найдено С 41,36% Н 3,23% N 1 1,85%.
Получение комплекса (5Z, 5 ' )-2,2 '-(этан-1,2-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2- пиридилметилен)-3-фенил-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-она) с СиС1г2Н20
Из 0,05 г (5Z, 5'г)-2,2'-(этан-1,2-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2- пиридилметилен)-3-фенил-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-она) и 0,03 г СиС12-6Н20 получают 0,03 г (55%) комплекса коричневого цвета.
Элементный анализ: C32H24N602S2*CuCl2*CuCl вычислено С 46,75% Н 2,94% N 10,22%; найдено С 46,67% Н 2,14% N 10,77%.
Получение комплекса (5Z, 5 ' )-2,2 '-(бутан-1,4-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2- пиридилметилен)-3-аллил-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-она) с СиС1г2Н20
Из 0,05 г (5Z, 5^)-2,2'-(бутан-1,4-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2- пиридилметилен)-3-аллил-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-она) и 0,03 г СиС12 6Н20 получают 0,04 г (59%) комплекса коричневого цвета.
Элементный анализ: C28H28N602S2*CuCl2*CuCl вычислено С 43,22% Н 3,63% N 10,80%; найдено С 43,45% Н 3,33% N 10,30%.
Получение комплекса (5Z, 5 ' )-2,2 '-(бутан-1,4-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2- пиридилметипен)-3-фенил-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-она) с СиС1 2Н20
Из 0,05 г (5Z, 5'г)-2,2'-(бутан-1,4-диилдисульфанилдиил)бис(5-(2- пиридилметилен)-3-фенил-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-она) и 0,03 г СиС12-6Н20 получают 0,03 г (49%) комплекса коричневого цвета.
Элементный анализ: C34H28N602S2*CuCl2*CuCl вычислено С 48,03% Н 3,32% N 9,88% найдено С 48,49% Н 2,60% N 9,10%.
Для тестирования ингибирования теломеразы, полученными соединениями был использован метод амплификации добавленных теломерных повторов (TRAP-анализ). TRAP-анализ является стандартным методом определения активности теломеразы, благодаря некоторым модификациям получивший возможности полуколичественного метода. Выбор метода детекции теломеразной активности определялся его широкой
освещенностью в мировой литературе, практически чувствительностью, а так же доступностью оборудования и реагентов.
Протокол амплификации теломерных повторов можно подразделить на 3 основных шага: удлинение праймера, амплификация получившегося продукта (продуктов) и детекция. На шаге удлинения теломерные повторы прибавляются присутствующей в клеточном экстракте теломеразой к олигонуклеотиду, узнаваемому ею как субстрат (TS). При амплификации продуктов удлинения олигонуклеотида TS теломеразой могут появляться ложные сигналы с теломер хромосом, содержащихся в клеточном экстракте. Чтобы избежать этого, 5 '-конец олигонуклеотида TS имеет нетеломерную последовательность, мешающую ему связываться с теломерами, однако узнается теломеразой как субстрат. Поскольку человеческая теломераза добавляет серию повторов по шесть нуклеотидов, то в результате удлинения олигонуклеотида TS теломеразой получается набор фрагментов ДНК, различающихся по длине. Затем следует шаг увеличения количества продукта с помощью специфических праимеров методом ПЦР с нуклеотидами, содержащими радиоактивную или флуоресцентную метку для детекции. Далее осуществляется детекция (фиг. 4), как правило, с помощью электрофоретического разделения и последующего сканирования.
Праймеры TS и АСХ (таблица 1) были использованы в TRAP-анализе, АСХ имеет на 5'-конце нетеломерный довесок из 6 нуклеотидов, за счет этого не образует димеров с теломеразным субстратом. При использовании этих праймеров количество встроенной метки пропорционально числу добавленных теломеразой повторов.
Таблица 1. Последовательности олигонуклеотидов, используемых при измерении теломеразной активности
Количество ПЦР-продукта слабо зависит от того, сколько в реакции было исходной матрицы, поэтому нельзя оценить количество теломеразного продукта по интенсивности его сигнала на фотографии. При введении в ПЦР набора теломеразных продуктов они все амплифицируются. Поэтому мы можем использовать количество добавленных теломеразой повторов как критерий ее активности.
Первым этапом было культивирование раковых клеточных линий человека для выделения активных экстрактов, необходимых для проверки. Для этого перевиваемые
клетки карциномы шейки матки человека линий SiHa, СЗЗА, CaSki и HeLa выращивали на стандартной среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной сыворотки (FCS), 4мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, стрептомицин/пенициллин в концентрации 100 мкг/мл и 100 ед/мл, соответственно, при температуре 37°С в атмосфере 5% С02. Для пересева клеток клеточный монослой промывали PBS (10 мМ Na2HP04, 2 мМ КН2Р04, 137 мМ NaCl, 2 мМ КО), добавляли стандартный раствор трипсин:ЕОТА (Sigma) и помещали в С02-инкубатор на 3-5 минут, добавляли среду с FCS и суспендировали пипетированием, клетки рассевали в необходимое количество культуральных флаконов. После образования монослоя клетки линий смывали с подложки раствором трипсина и осаждали центрифугированием (10 мин., 2000g). Дважды промывали буфером PBS. Ресуспендировали в лизирующем буфере (10 мМ Tris-HCl или 10 мМ HEPES-KOH, рН 7,5, 1 ,0 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA, 5 мМ β-меркаптоэтанола, 5% глицерина, 0,5% CHAPS, 0,1 мМ PMSF), 1 мл на 0,3-10 млн. клеток, в зависимости от необходимой концентрации. Инкубировали 30 минут во льду. Центрифугировали 10 минут при 4°С на 15000 об/мин и отбирали надосадочный раствор. Экстракт делили на аликвоты по 10 мкл и замораживали в жидком азоте. После этого проводили анализ теломеразной активности методом TRAP-теста. На первом шаге готовили смесь N1 : 49 мкл смеси TRAP, содержащей 1х TRAP-буфер (1х TRAP-буфер: 20 мМ HEPES-KOH рН 8,3, 1 ,5 мМ MgCl2, 63 мМ КС1, 1мМ EGTA, 0, 1 мг/мл BSA, 0,005% v/v Tween-20), 20 мкМ dNTP, 1,6 мкМ олигонуклеотида TS, 1 мкл раствора тестируемого препарата в ДМСО и экстракт клеток клеточных линий или тканей. Реакционную смесь инкубировали 30 минут при 30°С. На втором шаге к смеси добавляли 2 ед. Taq-ДНК- полимеразы ("Хеликон"), 0, 1 мкг олигонуклеотида АСХ и проводили ПЦР по следующей схеме: 35 с 94°С, 35 с 50°С 90 с 72°С (30 циклов, амплификатор Mastercycler ("Eppendorf ', Германия)). 15 мкл раствора и 2,5 мкл буфера для нанесения 6xDNA loading dye ("Fermentas", 10 мМ Tris-HCl, рН 7,6, 0,03% бромфенолового голубого, 0,03% ксиленоцианола, 60% глицерина, 60 мМ ЭДТА) наносили на полиакриламидный 20% гель (акриламид: BIS-акриламид 1 : 19 10%, TBElx, TEMED 0, 1%, персульфат аммония 0, 1 %). В качестве электродного буфера использовали ТВЕ lx (0, 1М Tris, 0,1М Н3ВОз, 2 мМ Ыа2ЭДТА). Проводили электрофорез пока ксиленцианол не пройдет 10-20 см. Гель окрашивали раствором SYBR Green (ΙΟΟΟΟχ концентрат в ДМСО фирмы Sigma-Aldrich, разведенный в 10000 раз 0, 1М буфером Tris-HCl с рН 8,5). Окраску детектировали с помощью сканирования флуоресценции в геле.
В качестве контроля действия препарата именно на РНК-зависимую ДНК- полимеразу (обратную транскриптазу) теломеразы, а не на ДНК-полимеразу, которая
используется в данном анализе на втором шаге для амплификации сигнала 1 мкл раствора препарата приливали не к смеси для работы теломеразы, а вместе с олигонуклеотидом АСХ перед ПЦР на втором шаге. Такая контрольная реакция проводилась одновременно с тестом для каждого проверяемого соединения.
Для определения 1С50 (концентрация вещества при которой происходит ингибирование теломеразной активности на 50%) проводили реакции для различных концентраций препаратов. Значение 1С50 приведено в таблице 2.
Для более точного определения IC50 проводилось отдельное повторное измерение ингибирования веществами с использованием дополнительных разведений. Пример такого анализа для препарата с наибольшей ингибирующей активностью представлен на фиг. 5. Экспериментальное изображение анализировали с помощью программы Image Qvant, сравнивая интенсивность полос, соответствующих одинаковому удлинению теломер-подобного субстрата TS теломеразой, в дорожках Т и П для каждой концентрации препарата.
Таблица 2. Тестирование теломеразной активности методом TRAP для серии препаратов
* Для данных препаратов данное значение соответствует ингибирующему эффекту 15% для насыщенного раствора (1С50 неизмеримо в силу низкой растворимости исходных препаратов).
Claims
1. Координационные соединения производных имидазол-4-она, ингибирующие теломеразу, об ей ормулы
где заместитель А выбран из группы, включающей арильные заместители, конденсированные арильные заместители, циклопентил, циклогексил, алифатические заместители, алифатические заместители с двойной связью, алифатические заместители с тройной связью, метиламиновый заместитель CH3NH-, карбэтокси-группу C2HsO(0)C-, пятичленные гетероциклические заместители с одним атомом азота, пятичленные гетероциклические заместители с двумя атомами азота, шестичленные гетероциклические заместители, заместитель В отсутствует или является алифатическим заместителем, заместитель С представляет собой гетероарильный заместитель, присоединяемый к производному имидазол-4-она через атом углерода и выбран из группы, включающей 5-членные ненасыщенные моноциклические гетероарильные заместители с 1, 2, 3 гетероатомами в цикле, выбранными из группы, включающей N, О и S, 6-членные ненасыщенные моноциклические гетероарильные заместители с 1 , 2, 3 гетероатомами в цикле, выбранными из группы, включающей N, О и S, 8-, 9- и 10-членные ненасыщенные бициклические гетероарильные заместители с 1 , 2, 3 гетероатомами в цикле, выбранными из группы, включающей N, О и S, X представляет собой хлорид О или нитрат N03.
2. Координационные соединения по п. 1, отличающиеся тем, что заместитель А является незамещенным или монозамещенным, или дизамещенным арильным заместителем, при этом заместители в арильной группе выбраны из группы, включающей галогены и алкильные заместители.
3. Координационные соединения по п. 1 , отличающиеся тем, что заместитель А является незамещенным или монозамещенным, или дизамещенным конденсированным арильным заместителем, при этом заместители в конденсированной арильной группе выбраны из группы, включающей галогены и алкильные заместители.
4. Координационные соединения по п. 1, отличающиеся тем, что заместитель А выбран из группы, включающей фенил С6Н5-, З-хлор-4-фторфенил 3-С1-4-Р-С6Нз-, 4- карбэтоксифенил 4-С2Н50(0)ССбН4-, метил СН3-, аллил СН2=СНСН2-, 2-антрил, пропил С3Н7-.
5. Координационные соединения по п. 1, отличающиеся тем, что заместитель В выбран из группы, включающей 1,2-этандиил -(СН2)2-, 1,3-пропандиил -(СН2)з-, 1,4- бутандиил -(СН2)4-, 1 ,6-гександиил -(СН2)6-, 1,10-декандиил -(СН2)ю-.
6. Координационные соединения по п. 1, отличающиеся тем, что заместитель С выбран из группы, включающей 2-хинолил, 2-пиридил, 1-метил-2-имидазолил, 4-метил-5-имидазолил, 5-имидазолил, 2-имидазолил, 1,5-диметил-З-пиразолинил, 1 ,5-дифенил-З-пиразолинил.
7. Способ получения координационных соединений производных имидазол-4- она, ингибирующих теломеразу, по пунктам с 1 по 6, в котором выполняют следующие стадии: смешивают раствор производного имидазол-4-она в дихлорметане с метонолом, медленно приливают к смеси раствор соли меди в метаноле или ацетонитриле, реакционную смесь выдерживают до выпадения осадка координационного соединения производного имидазол-4-она.
8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что соль меди выбрана из группы, включающей хлорид меди и нитрат меди.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP11766224.7A EP2592086A4 (en) | 2010-04-09 | 2011-04-05 | TELOMERASE INHIBITORS AND PROCESS FOR THEIR PRODUCTION |
| US13/647,642 US20130109861A1 (en) | 2010-04-09 | 2012-10-09 | Telomerase inhibitors and a method for the preparation thereof |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010113946 | 2010-04-09 | ||
| RU2010113946/04A RU2468030C2 (ru) | 2010-04-09 | 2010-04-09 | Ингибиторы теломеразы и способ их получения |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| US13/647,642 Continuation US20130109861A1 (en) | 2010-04-09 | 2012-10-09 | Telomerase inhibitors and a method for the preparation thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2011126409A1 true WO2011126409A1 (ru) | 2011-10-13 |
Family
ID=44763147
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/RU2011/000223 WO2011126409A1 (ru) | 2010-04-09 | 2011-04-05 | Ингибиторы теломеразы и способ их получения |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20130109861A1 (ru) |
| EP (1) | EP2592086A4 (ru) |
| RU (1) | RU2468030C2 (ru) |
| WO (1) | WO2011126409A1 (ru) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2639819C2 (ru) * | 2014-12-30 | 2017-12-22 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Композиция, ингибирующая теломеразу |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1059870A1 (ru) * | 1981-09-04 | 1991-04-30 | Институт Неорганической Химии Со Ан Ссср | Комплексное соединение меди (П) с тиосемикарбазоновым производным стабильного нитроксильного радикала имидазолина, про вл ющие противоопухолевую активность |
| US5141097A (en) | 1990-09-04 | 1992-08-25 | La Poste | Control device for a flow of objects in continuous file |
| WO1999001560A1 (en) | 1997-07-01 | 1999-01-14 | Cambia Biosystems Llc | Vertebrate telomerase genes and proteins and uses thereof |
| WO2007128968A1 (en) * | 2006-04-07 | 2007-11-15 | Imperial Innovations Limited | Telomerase inhibitors |
| CN101270078A (zh) * | 2008-03-14 | 2008-09-24 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 抑制端粒酶活性的金属超分子化合物及用法和用途 |
-
2010
- 2010-04-09 RU RU2010113946/04A patent/RU2468030C2/ru active IP Right Revival
-
2011
- 2011-04-05 WO PCT/RU2011/000223 patent/WO2011126409A1/ru active Application Filing
- 2011-04-05 EP EP11766224.7A patent/EP2592086A4/en not_active Withdrawn
-
2012
- 2012-10-09 US US13/647,642 patent/US20130109861A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1059870A1 (ru) * | 1981-09-04 | 1991-04-30 | Институт Неорганической Химии Со Ан Ссср | Комплексное соединение меди (П) с тиосемикарбазоновым производным стабильного нитроксильного радикала имидазолина, про вл ющие противоопухолевую активность |
| US5141097A (en) | 1990-09-04 | 1992-08-25 | La Poste | Control device for a flow of objects in continuous file |
| WO1999001560A1 (en) | 1997-07-01 | 1999-01-14 | Cambia Biosystems Llc | Vertebrate telomerase genes and proteins and uses thereof |
| WO2007128968A1 (en) * | 2006-04-07 | 2007-11-15 | Imperial Innovations Limited | Telomerase inhibitors |
| CN101270078A (zh) * | 2008-03-14 | 2008-09-24 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 抑制端粒酶活性的金属超分子化合物及用法和用途 |
Non-Patent Citations (17)
| Title |
|---|
| ASAI ET AL.: "A novel telomerase template antagonist (GRN163) as a potential anticancer agent", CANCER RESEARCH, vol. 63, 2003, pages 3931 - 3939 |
| BAIRD DM.: "Mechanisms of telomeric instability", CYTOGENET GENOME RES., vol. 122, no. 3-4, 2009, pages 308 - 14 |
| BLACKBURN: "Structure and Function of Telomeres", NATURE, vol. 350, 1991, pages 569 - 573, XP002004674, DOI: doi:10.1038/350569a0 |
| EVANS, S.E. ET AL.: "End-stacking of copper cationic porphyrins on parallel-stranded guanine quardruplexes.", J. BIOL. INORG. CHEM., vol. 12, 2007, pages 1235 - 1249, XP019565673 * |
| FLETCHER ET AL.: "Human Telomerase Inhibition by 7-Deaza 2'-deoxypurine Nucleoside Triphosphates", BIOCHEM, vol. 35, 1996, pages 15611 - 15617, XP002913086, DOI: doi:10.1021/bi961228v |
| KIM ET AL.: "Specific Association of Human Telomerase Activity with Immortal Cells and Cancer", SCIENCE, vol. 266, 1994, pages 2011 - 2015, XP002138759, DOI: doi:10.1126/science.7605428 |
| LINGNER ET AL.: "Reverse Transcriptase Motifs in the Catalytic Subunit of Telomerase", SCI., vol. 276, 1997, pages 561 - 567, XP002928260, DOI: doi:10.1126/science.276.5312.561 |
| MATA ET AL.: "A Hexameric Phosphorothioate Oligonucleotide Telomerase Inhibitor Arrests Growth of Burkitt's Lymphoma Cells in Vitro and in Vivo", TOXICOL APPL. PHARMACOL., vol. 144, 1997, pages 189 - 197, XP002180133, DOI: doi:10.1006/taap.1997.8103 |
| MONCHAUD ET AL.: "A hitchhiker's guide to G-quadruplex ligands", ORG. BIOMOL. CHEM., vol. 6, 2008, pages 627 |
| MORIN: "Is Telomerase a Universal Cancer Target?", J. NATL. CANCER INST., vol. 87, 1995, pages 859 - 861 |
| NORTON ET AL.: "Inhibition of Human Telomerase Activity by Peptide Nucleic Acids", NATURE BIOTECHNOL., vol. 14, 1996, pages 615 - 619, XP001023086, DOI: doi:10.1038/nbt0596-615 |
| PARKINSON: "Do Telomerase Antagonists Represent a Novel Anti- Cancer Strategy?", BRIT. J. CANCER, vol. 73, 1996, pages 1 - 4 |
| RAYMOND ET AL.: "Agents that target telomerase and telomeres", CURR OPINION BIOTECH., vol. 7, pages 583 - 591, XP002917801, DOI: doi:10.1016/S0958-1669(96)80068-1 |
| S. E. EVANS; M. A. MENDEZ; K. B. TURNER; L. R. KEATING; R. T. GRIMES; S. MELCHOIR; V. A. SZALAI, J. BIOL. INORG. CHEM., vol. 12, no. 8, 2007, pages 1235 - 1249 |
| See also references of EP2592086A4 |
| SHAY JW; WRIGHT WE.: "Telomerase therapeutics for cancer: challenges and new directions", NAT REV DRUG DISCOV., vol. 5, no. 7, 2006, pages 577 - 84, XP002463668, DOI: doi:10.1038/nrd2081 |
| STRAHL; BLACKBURN: "Effects of Reverse Transcriptase Inhibitors on Telomere Length and Telomerase Activity in Two Immortalized Human Cell Lines", MOL. CELL. BIOL., vol. 16, 1996, pages 53 - 65 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2592086A4 (en) | 2014-10-22 |
| RU2468030C2 (ru) | 2012-11-27 |
| US20130109861A1 (en) | 2013-05-02 |
| RU2010113946A (ru) | 2011-10-20 |
| EP2592086A1 (en) | 2013-05-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2022043073A (ja) | 二価ブロモドメインインヒビターおよびそれらの使用 | |
| CA3070621A1 (en) | Tyk2 inhibitors and uses thereof | |
| EP3564239B1 (en) | Aryl hydrocarbon receptor modulator | |
| Mohamed et al. | DNA fragmentation, cell cycle arrest, and docking study of novel bis spiro-cyclic 2-oxindole of pyrimido [4, 5-b] quinoline-4, 6-dione derivatives against breast carcinoma | |
| CN109415361B (zh) | 丙烯酸类衍生物及其制备方法和其在医药上的用途 | |
| KR20160103986A (ko) | N-벤질 트립탄트린 유도체, 및 이의 제조 방법 및 적용 | |
| CA2936871A1 (en) | Dihydropteridinone derivatives and uses thereof | |
| Davari et al. | Synthesis and biological evaluation of novel pyridine derivatives as potential anticancer agents and phosphodiesterase-3 inhibitors | |
| Martínez-Urbina et al. | 6-Substituted 2-(N-trifluoroacetylamino) imidazopyridines induce cell cycle arrest and apoptosis in SK-LU-1 human cancer cell line | |
| Attia et al. | New 2-oxopyridine/2-thiopyridine derivatives tethered to a benzotriazole with cytotoxicity on MCF7 cell lines and with antiviral activities | |
| US6528517B1 (en) | Synthesis of quinobenzoxazine analogues with topoisomerase II and quadruplex interactions for use as antineoplastic agents | |
| Chen et al. | Disubstituted 1, 8-dipyrazolcarbazole derivatives as a new type of c-myc G-quadruplex binding ligands | |
| Alizadeh et al. | Synthesis of pyrimido [6, 1-a] isoquinolines via a one-pot, four-component reaction | |
| RU2468030C2 (ru) | Ингибиторы теломеразы и способ их получения | |
| Bobba et al. | Synthesis and biological evaluation of selective tubulin inhibitors as anti-trypanosomal agents | |
| Low et al. | Tri-substituted imidazole analogues of SB203580 as inducers for cardiomyogenesis of human embryonic stem cells | |
| Fedorova et al. | Multicomponent reactions in the synthesis of dihydropyrimidine-containing podands having tuberculostatic activity | |
| CN102746307B (zh) | 1-n-苄基别嘌醇衍生物及其制备方法和用途 | |
| CN111732584B (zh) | 二芳基取代稠杂环类化合物及其制备方法和在制药中的用途 | |
| Rostom et al. | Synthesis and in vitro anti-HIV screening of certain 2-(benzoxazol-2-ylamino)-3H-4-oxopyrimidines | |
| RU2639819C2 (ru) | Композиция, ингибирующая теломеразу | |
| Tomassi et al. | Synthesis and anti-HIV1 biological activity of novel 5 ″-ATSAO compounds | |
| CN104945414A (zh) | 苯并硫杂蒽类衍生物及其制备方法与应用 | |
| CN103450113B (zh) | 一种取代噻二嗪三酮类衍生物及其制备方法与应用 | |
| CN114380728B (en) | Novel diaryl-beta-lactam organic selenium compound, preparation method and application thereof in pharmacy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 11766224 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
| NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
| WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 2011766224 Country of ref document: EP |