WO2011121097A2 - Verfahren und vorrichtung zur untersuchung von molekülbindungen - Google Patents

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Thorsten Hugel
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    • G01Q60/24—AFM [Atomic Force Microscopy] or apparatus therefor, e.g. AFM probes
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • G01Q60/24—AFM [Atomic Force Microscopy] or apparatus therefor, e.g. AFM probes
    • G01Q60/28—Adhesion force microscopy

Definitions

  • the invention concerns methods for the investigation of moles ⁇ külitatien, wherein:
  • a measuring head and an adsorption body with an adsorption surface are provided;
  • - is the distance between the measuring head which is provided with a Sondenmo ⁇ lekül, and the adsorption body, to the adsorbing the probe molecule is at least partially adsorbed changed;
  • the force is measured, which is mediated by the probe molecule between the measuring head and adsorbent body;
  • a force-displacement curve is determined which shows the dependence of the measured force on the change in the distance between the measuring head and the adsorption body
  • the invention further relates to an apparatus for carrying out the method.
  • Such a method and device are known from WO 2008/081044 AI.
  • the adhesion of single molecules to a substrate surface is investigated by the known method.
  • the individual molecules are bound to a carrier polymer.
  • the probe molecule formed in this way is attached to a measuring head whose distance to the substrate surface is variable.
  • a force measuring device is used to measure the force imparted by the probe molecule between the measuring head and the substrate surface.
  • a force-displacement curve can be determined, which determines the dependence of the measured force of the change in the distance between the measuring head and Adsorptions emotions shows.
  • the plateau levels of the power plateaus can be determined with great accuracy.
  • the Desorptionskraft Sondenmole- CRWT can determine on the adsorption in the quasi-stationary Equilibrium ⁇ weight. Since the Desorptionskraft between the probe molecule and the substrate surface is mediated by the Einzelmole ⁇ cules, can investigate the adhesion of the single molecules to the substrate surface with the known method.
  • Bindungsverhal- least smaller molecules from solution to a macromolecule is of great importance for many technical applications, which take place in solution: for example the production of molecular markers, medical diagnostics, example ⁇ , the diagnosis of blood sugar in case of diabetes Mellitus, the functionality of molecular Sensortechnolo ⁇ gies, such as "Lab on a chip” applications, and
  • Enzyme- or DNA-based field-effect transistors for biomedical engineering.
  • the specific ligand adsorption at isolated, well-defined binding sites can be determined by classical methods such as fluorescence [1, 2] or radioactive labeling. cation [3].
  • only a method for determining the number of bound ligand for ternary systems is for the unspezifi ⁇ specific binding, such as blood glucose, available.
  • Such ternary systems consist of macromolecule, solvents and cosolutes.
  • a strategy for the complete characterization within the technically important four-component system, which additionally contains an extensive surface, does not yet exist.
  • the binding characteristics in ternary systems can calorimetry [4], densitometry [5] or Gleichpersssedi ⁇ mentation [6] are determined.
  • dsDNA double-stranded DNA
  • probe molecules are repeatedly withdrawn from the adsorbent surface of the adsorbent body.
  • the activity of the individual molecules is varied in a region adjacent to the adsorption surface of the adsorption body and a desorption size is determined as a function of the activity of the individual molecules.
  • binding parameters can be determined which describe the binding of the individual molecules to the probe molecule in the adsorbed and desorbed state of the probe molecule. In this way it is possible to make the binding behavior smaller To study molecules on macromolecules in the adsorbed and desorbed state.
  • the desorption size is determined on at least one further adsorption surface of at least one further adsorption body as a function of the activity of the individual molecules.
  • the material properties of the different adsorption surfaces should differ.
  • binding parameters can then be determined which describe the binding of the individual molecules to the probe molecule in the desorbed state and to the states of the probe molecule adsorbed on the various adsorption surfaces. With this particular embodiment of the method, the accuracy with which the binding parameters can be determined can be increased considerably.
  • the desorption size is determined at different temperatures as a function of the activity of the individual molecules. Based on between desorption size and activity determined
  • the binding parameters can then be determined, which describe the binding of the single molecules to the Sondenmole- kül in the desorbed and adsorbed states of the Son ⁇ denmoleküls at the various temperatures.
  • the additional data can also increase the accuracy in determining the binding parameters.
  • the desorption force is determined in the evaluation of the power plateau. By determining the relationship between desorption power and activity telt, will bond parameters that are determined that describe the binding of single molecules to the probe molecule in adsorbing ⁇ th and desorbed state of the probe molecule. In this way it is possible to study the binding behavior of small molecules to polymers in the adsorbed and desorbed state.
  • binding parameters which can be determined by the method are in particular the binding constants for the binding of the
  • the binding constants and the binding site lengths can each be determined for the adsorbed state of the probe molecule and for the desorbed state of the probe molecule.
  • the Bindungskon ⁇ stante and the mean length of binding sites in the desorbed state is independent of the nature of the Adsorptionsflä ⁇ surface.
  • the binding parameters concerning the desorbed state of the probe molecule can therefore be equated in each case.
  • the relationship between Desorptionskraft and activity can be determined by adjusting an equalizing function of measured values of the Desorptionskraft, wherein the measured values are plotted against the change in the activity and the parameters of the equalizing function, the binding constants and the mittle ⁇ re binding sites length for the adsorbed and desorbed state of the probe molecule ,
  • the desorption length is determined in the evaluation of the power plateau. From the dependence of the desorption length on the activity of the
  • Single molecules can then be determined a number of the individual molecules bound to the probe molecule.
  • the individual molecules are dissolved in a solvent.
  • a gaseous or liquid solvent can be used.
  • FIG. 2 shows a representation of the measuring head of the force microscope from FIG. 1 in the adsorbed (A) and desorbed (B) state of a probe molecule attached to the measuring head;
  • Figure 3 is a diagram with force-displacement curves having a force plateau
  • FIG. 4 shows a diagram with measured detachment lengths
  • Figure 5 is a diagram with measured adhesive forces
  • Figure 6 is a representation showing the interaction between
  • Figure 8 is a diagram showing the relationship between
  • Figure 9 is a diagram with measured adhesive forces at
  • FIG. 10 shows a diagram with the number of bound single molecules per probe molecule length in the desorbed and adsorbed state for different adsorption surfaces
  • FIG 11 is a diagram in which the desorption in
  • Figure 12 is a chart showing the number of bound Einzelmo ⁇ leküle per probe molecule length in the adsorbed and desorbed state at various tempera ⁇ ren.
  • AFM Atomic Force Microscope
  • the force microscope 1 further has an adsorption ⁇ body 6, the one the measuring head 2 and the probe molecule. 5 having facing adsorption 7.
  • the Adsorptionskör ⁇ per 6 is located in a container 8, which is filled with a Lö ⁇ sungsstoff 9.
  • the container 8 is on a
  • Sample holder 10 is arranged, which can be moved so that the distance between the measuring head 2 and the adsorption ⁇ surface 7 is varied.
  • the solvent may in principle be both gaseous and liquid.
  • the force microscope 1 is further equipped with a laser 11 surestat ⁇ Tet, the light beam 12 to one of the adsorption
  • Light beam 12 is directed from there to a photodetector 14 with a sectored photodiode. That from the photodetector
  • the evaluation unit 15 evaluated, which may be, for example, a commercially available computer.
  • the evaluation unit 15 is also used to control the sample holder 10.
  • the desorption force can be measured, with which the probe molecule 5 at the adsorption
  • the sample holder 8 is actuated such that the distance between the measuring head 2 and the adsorption surface 7 increases. Since the Sondenmole ⁇ kül 5 adheres to the adsorptive surface 7, the measuring head 2 is moved slightly in the direction of the adsorption surface 7 down, which leads to a deflection of the light beam 12th This Auslen ⁇ effect can be detected using the detector 14th Since the spring constant of the leaf spring 3 is known, it can be concluded that the desorption force.
  • FIG. 2 shows the leaf spring 3 of the force microscope 1 above the adsorption surface 7.
  • the measuring head 2 is respectively provided with the probe molecule 5, which is shown in the adsorbed state (A) and in the desorbed state (B).
  • FIG. 3 shows a diagram with a superimposition of force-displacement curves 16, which has force plateaus 17 and a plateau stage 18.
  • the force-displacement curves were recorded in an experiment described in more detail below, in which a poly (allylamine) molecule (PAAm) was used as the probe molecule 5 and an oxidized diamond surface as Adsorptionsoberflä ⁇ surface 7.
  • FIG. 3 shows the superimposition of 20 typical force-displacement curves 16 recorded with one and the same PAAm molecule under equilibrium conditions, as shown by the velocity-independent force plateaus 17.
  • PAAm poly (allylamine) molecule
  • a plateau Desorptionskraft of F can be determined, which is equal to the force required to pull the probe molecule 5 while maintaining a quasi-steady state of equilibrium of the adsorption.
  • a desorption length L which is equal to the length of the adsorbed on the adsorption 7 portion of the special molecule 5.
  • the product of L and Desorptionsus Desorptionskraft F of which corresponds to a surface 20 is equal to the free desorption.
  • FIGS. 4 and 5 show typical measured value distributions for the desorption length L and the desorption force F des .
  • the measured value distributions of the desorption length L and the desorptive force F des include the results of 100 approximation and separation cycles of the leaf spring 3 in investigating the adsorption behavior of a PAAm molecule in glucose solution on an oxidized diamond surface.
  • thermodynamic relations are derived, with the aid of which various binding parameters can be determined from the measurement results shown in FIGS. 3 to 5.
  • the fully adsorbed to the adsorption surface 7 probe molecule 5 is shown in the presence of Einzelmo ⁇ lekülen 21 which are dissolved in the solvent.
  • the single molecules 21 attach themselves to binding sites 22 of the adsorbed probe molecule 5 and detach again from the binding sites 22.
  • the attachment process is described by the rate constant K a on and the detachment process by the rate constant K a off .
  • FIG. 7 shows the probe molecule 5 in a further state in which the probe molecule 5 is desorbed from the adsorption surface 7.
  • the individual molecules 21 attach themselves to the binding make ⁇ 22 of the desorbed probe molecule 5 and 22 from the binding sites
  • the 6.3rungsvor- dissolve again transition is described by the rate constant K d on and the release operation by the rate constant K d off.
  • B ⁇ L K ".cN 8a - (l-0 a , d ) (1)
  • the removal rate d9 a / d / dt is proportional to the proportion of occupied binding sites (Ng es x Q a / d ):
  • the occupancy rate ⁇ thus increases with increasing concentration c of the individual molecules 21. This relation applies only to ideal mixtures. For non-ideal mixtures, the
  • Equation (6) follows: d T a / d N ⁇ a, ld (7) ⁇ L d ald where d is the distance between the total binding sites along the probe molecule 5.
  • the distance d is hereinafter also referred to as binding site length d.
  • Adsorption surface 7 is adsorbed, is described by the binding ⁇ constant K a and the binding site length d a .
  • the state of the portion of the probe molecule 5 desorbed from the adsorption surface 7 is determined by a binding constant K d and a binding site length d d .
  • the change in the line voltage ⁇ between Adsor ⁇ bêtm and desorbed state of the probe 5 is therefore equal to: kT kT
  • the binding energy of a single binding site can also be calculated:
  • Single molecules 21 on the interaction between probe molecule 5 and adsorption surface 7 due to the different binding behavior of the single molecules 21 to the probe molecule 5 can be used to detect the presence of the individual molecules 21 in the solvent 23.
  • binding parameters such as the binding constants K, bond site lengths d, binding energies and the number of bound single molecules 21 per length. These binding parameters are determined not only for the state in solution of the probe molecule 5, but also for the case in which the probe molecule 5 adheres to the adsorption surface 7.
  • the probe molecule 5 used is a single poly (allylamine) molecule (PAAm) which is covalently bonded to the tip of the measuring head 2 of the leaf spring 3 (AFM cantilever).
  • PAAm poly (allylamine) molecule
  • AFM cantilever The covalent attachment ensures the necessary long-term stability ⁇ [7] with, and to measure the same probe molecule 5 for the period from several hours to different adsorption faces 7 in glucose solutions of different concentrations, the Desorptions instrument.
  • zelmolekülen 21 it is in particular Glukosemole ⁇ molecules.
  • the concentration in this case was varied between 0 and 1 M.
  • the tip with the probe molecule 5 was brought into contact with the adsorbing surface 7 for one second to be adsorbed thereon.
  • the subsequent desorption of the probe molecule 5 at a rate of 1 ⁇ / s was carried out under equilibrium conditions, as was apparent from the force plateau 17 [8].
  • the probe molecule 5 from FIGS. 6 and 7 is thus a PAAm molecule adsorbed on the adsorption surface 7 in FIG. 6 and stretched in solution in FIG.
  • the single molecules 21 are further gebil ⁇ det of D-glucose molecules.
  • FIG. 8 shows the relationship between glucose concentration and glucose activity. From Figure 8 is ersicht ⁇ Lich, that the properties of the solution are similar to those of an ideal solution for average concentrations weakly interacting glucose molecules.
  • FIG. 9 shows the measured values for the desorption power of PAAm at various glucose concentrations on stainless steel (open triangles) and on oxidized diamond (filled triangles) at 31 ° C.
  • the Desorptionskraft on oxi ⁇ diertem diamond increases with the concentration of glucose, while the values point to a stainless steel non-monotonic course.
  • the illustrated with solid lines power boost ⁇ ven 24 and 25 illustrate the result of a common off ⁇ same bill.
  • the force cures 24 and 25 the graphical representation of the in equation (9) are reproduced function ⁇ with those intended for the respective adsorption surface 7 bonding parameter K a / d and d a / d , which under the
  • FIG. 10 shows the number of occupied binding sites 22 per unit length.
  • a curve 26 shows the number of accumulated glucose molecules in the desorbed state, another curve 27 the number of accumulated glucose molecules adsorbed to the diamond surface and a third curve 28 the number of accumulated glucose molecules adsorbed to the steel surface.
  • the curves 26 to 28 arising in accordance with equation (7) from the derivative of the force curves obtained for the respective items to ⁇ by the compensating calculation.
  • FIG. 11 shows the temperature dependence of glucose binding to the adsorbed and dissolved PAAm molecule.
  • FIG. 11 shows in particular the measured values for the desorption power of PAAm on oxidized diamond in glucose solutions of different concentration at 31 ° C. (open triangles) and 46 ° C. (filled triangles).
  • the force curves 29 and 30 are the result of matching calculations with which the functions according sliding ⁇ chung (9) have been adapted to the plotted measured values.
  • Figure 12 shows the number of bound Glukosemo ⁇ leküle depending on the activity.
  • Curve 31 relates to the desorbed state at 46 ° C.
  • curve 32 to the adsorbed state at 46 ° C.
  • curve 33 to the desorbed state at 31 ° C.
  • curve 34 to the adsorbed state at 31 ° C.
  • the force curves 29 and 30 can also be determined to increase the accuracy together with the force curves 24 and 25 in a common compensation calculation.
  • Table 1 shows the results of the adjustment calculation.
  • a look at Table 1 shows that for the diamond substrate , the adsorption state binding constant K a is about 8% greater than the binding constant K d for the desorbed state at 31 ° C and even about 20% greater at 46 ° C.
  • K a binding constant for the diamond substrate
  • K d binding constant for the desorbed state
  • Glucose molecules in forced desorption of the PAAm molecule by the additional binding of glucose molecules from the surrounding glucose solution are more glucose binds to the surface adsorbed PAAm molecule compared to its extended state in solution. Consequently, glucose molecules must go into solution, and the PAAm molecule loses bound glucose molecules while the PAAm molecule is stripped from the metal surface. This is most likely due to the different affinity of glucose for the substrate material itself. At low concentrations, the sugar is rejected from the metal surface and shows a reduced tendency to bind to the PAAm molecule when the PAAm molecule is at the surface. As the amount of glucose on the adsorption layer 7 increases, so does the number of adsorbed glucose until a dense layer of glucose molecules has formed on the adsorption layer 7. Now the Bin ⁇ making behavior is similar to that on the oxidized diamond surface.
  • the change in the desorption length L as a function of the concentration or activity of the individual molecules 21 can also be measured. Due to the attachment or detachment of single molecules 21 to the probe molecule 5, there are changes in the desorption length. By measuring them as a function of activity or concentration, the exact number of bound molecules can be determined as long as the change in length per single molecule is known.

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Abstract

Ein Rasterkraftmikroskop (1) wird für ein Messverfahren verwendet, um die Molekülbindung von sich in Lösung befindenden Einzelmolekülen an ein Sondenmolekül (5) zu untersuchen. Die Bindungsparameter können dabei für den adsorbierten Zustand des Sondenmoleküls (5), in dem das Sondenmolekül (5) an einer Adsorptionsfläche (7) adsorbiert ist, oder für einen desorbierten Zustand des Sondenmoleküls (5) bestimmt werden.

Description

Beschreibung
Verfahren und Vorrichtung zur Untersuchung von Molekülbindun¬ gen
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Untersuchung von Mole¬ külbindungen, bei dem:
- ein Messkopf und ein Adsorptionskörper mit einer Adsorptionsfläche bereitgestellt wird;
- der Abstand zwischen dem Messkopf, der mit einem Sondenmo¬ lekül versehen ist, und dem Adsorptionskörper, an dessen Adsorptionsfläche das Sondenmolekül wenigstens teilweise adsorbiert ist, geändert wird;
- mit Hilfe einer Kraftmessvorrichtung die Kraft gemessen wird, die von dem Sondenmolekül zwischen Messkopf und Adsorptionskörper vermittelt wird;
- eine Kraft-Weg-Kurve bestimmt wird, die die Abhängigkeit der gemessenen Kraft von der Änderung des Abstandes zwischen Messkopf und Adsorptionskörper zeigt;
- durch Auswertung von Kraftplateaus der Kraft-Weg-Kurve eine Desorptionsgröße des Sondenmoleküls an der Adsorptionsfläche im quasistationären Gleichgewicht bestimmt wird.
Die Erfindung betrifft ferner eine Vorrichtung zur Ausführung des Verfahrens.
Ein derartiges Verfahren und eine derartige Vorrichtung sind aus der WO 2008/081044 AI bekannt. Mit dem bekannten Verfahren wird die Haftung von Einzelmolekülen an einer Substrat- Oberfläche untersucht. Zu diesem Zweck werden die Einzelmoleküle an ein Träger-Polymer gebunden. Das auf diese Weise gebildete Sondenmolekül wird an einem Messkopf angebracht, dessen Abstand zur Substratoberfläche variierbar ist. Mithilfe einer Kraftmessvorrichtung wird die Kraft gemessen, die vom Sondenmolekül zwischen Messkopf und Substratoberfläche vermittelt wird. Auf der Grundlage der Messwerte kann eine Kraft-Weg-Kurve bestimmt werden, die die Abhängigkeit der gemessenen Kraft von der Änderung des Abstandes zwischen Messkopf und Adsorptionskörper zeigt. Die Plateaustufen der Kraftplateaus können mit großer Genauigkeit bestimmt werden. Insofern ist es möglich, die Desorptionskraft des Sondenmole- küls an der Adsorptionsfläche im quasistationären Gleichge¬ wicht zu bestimmen. Da die Desorptionskraft zwischen dem Sondenmolekül und der Substratoberfläche von den Einzelmole¬ külen vermittelt wird, lässt sich mit dem bekannten Verfahren die Haftung der Einzelmoleküle an der Substratoberfläche untersuchen.
Die Anwesenheit von gelösten im Vergleich zu dem Sondenmole¬ kül kleinen Molekülen wie organischen Verbindungen oder chemischen Prozessrückständen sind oftmals aus gesundheitli- chen oder qualitätstechnischen Gründen unerwünscht. Ein
Nachweis ist aufgrund der schwachen Reaktivität vieler Sub¬ stanzen jedoch schwierig. Ferner können Lösemittelzusätze und Kosolute (z.B. Ionen, Liganden, Enzyme, andere kleine Biomo¬ leküle, unter anderem auch kleiner Proteine) die Faltung von Proteinen, die Assemblierung von Polymeren, die Haftung oder das Ablösen eines Makromoleküls von einer Grenzschicht verur¬ sachen. Gleichzeitig ist die Wechselwirkung von Kosoluten mit einem Makromolekül beeinflusst von der unmittelbaren Nähe zu einer Grenzfläche. Die Charakterisierung des Bindungsverhal- tens kleinerer Moleküle aus Lösung an ein Makromolekül ist aber von großer Bedeutung für viele technische Anwendungen, die in Lösung stattfinden: zum Beispiel die Herstellung molekularer Marker, die medizinische Diagnostik, beispiels¬ weise die Diagnostik von Blutzucker im Falle von Diabetes Mellitus, die Funktionalität von molekularer Sensortechnolo¬ gien, wie zum Beispiel "Lab on a chip" Anwendungen, und
Enzym- oder DNA-basierte Feldeffekttransistoren für die biomedizinische Technik. Die spezifische Ligandenadsorption an vereinzelten, wohl definierten Bindungsstellen kann durch klassische Methoden wie beispielsweise Fluoreszenz [1, 2] oder radioaktive Mar- kierung [3] untersucht werden. Dagegen ist für die unspezifi¬ sche Bindung, wie beispielsweise von Blutzucker, nur eine Methode zur Bestimmung der Anzahl der gebundenen Liganden für ternäre Systeme verfügbar. Derartige ternäre Systeme bestehen aus Makromolekül, Lösemittel und Kosoluten. Eine Strategie zur kompletten Charakterisierung innerhalb des technisch wichtigen Vierkomponentensystems, das zusätzlich noch eine ausgedehnte Oberfläche beinhaltet, existiert bisher noch nicht .
Die Bindungscharakteristik in ternären Systemen kann mittels Kalorimetrie [4], Densiometrie [5] oder Gleichgewichtssedi¬ mentation [6] bestimmt werden. Die am häufigsten angewandte Methode ist die Isotherme Titrationskalorimetrie (=ITC) .
Diese benötigt jedoch eine gewisse Mindestmenge an Molekülen, um verlässliche Informationen über Änderungen der freien Energie und Bindungskonstanten zu liefern. Dabei steigt die Messgenauigkeit mit der verwendeten Menge an Makromolekülen an. Zusätzlich begrenzen Selbstassemblierung und Aggregation die Anwendbarkeit der ITC auf hydrophile und amphiphile
Moleküle [4] .
Alternative Messmethoden zur Bestimmung der Molekül-Ligand- Wechselwirkung im thermodynamischen Gleichgewicht in der Nähe einer Oberfläche sind durch ihr räumliches und zeitliches
Auflösungsvermögen eingeschränkt. Sehr spezifische Bindungen können, wie bereits erwähnt, durch Fluoreszenz untersucht werden. Dazu ist jedoch eine sehr verdünnte Lösung sowohl von Makromolekülen als auch von Kosoluten notwendig, was häufig eine starke Vereinfachung gegenüber dem technisch relevanten System darstellt. Zusätzlich ist eine chemische Modifikation der Kosolute notwendig. Eine andere gebräuchliche Methode zur Bestimmung von physikalischen Bindungsparametern bedient sich radioaktiver Kontrastmittel. Hier wird die räumliche Auflö- sung bestimmt durch die Reichweite des Beta-Emitters, die weit oberhalb molekularer Ausdehnungen liegt. Ähnliche Prob- lerne mit dem Auflösungsvermögen sind für die Ellipsometrie, Röntgen- und Neutronenstreuung gegeben,
In ZHANG, H.Y. and MARKO J.F, Maxwell relations for single- DNA experiments: Monitoring protein binding and double-helix torque with force-extension measurements , Physical Review E 77 (3), 2008 wird die Nutzung von Kraftkurven, die beim
Überstrecken von doppelsträngiger DNA (= dsDNA) entstehen, zur Charakterisierung der Bindung zwischen dsDNA und weiteren Molekülen theoretisch analysiert. Die gewonnenen Ergebnisse setzen die Besonderheiten beim Überstrecken von dsDNAs voraus und sind daher für die Untersuchung der Bindung von Einzelmoleküle an beliebige Makromoleküle nicht verwendbar. Ausgehend von diesem Stand der Technik liegt der Erfindung daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren anzugeben, mit dem sich die Bindung von kleinen Einzelmolekülen an beliebige Makromoleküle, insbesondere auch einzelsträngigen DNAs, untersuchen lässt.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren und eine Vorrichtung mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche gelöst. In davon abhängigen Ansprüchen sind vorteilhafte Ausgestaltungen und Weiterbildungen angegeben.
Bei dem Verfahren werden Sondenmoleküle wiederholt von der Adsorptionsfläche des Adsorptionskörpers abgezogen. Dabei wird die Aktivität der Einzelmoleküle in einem an die Adsorptionsfläche des Adsorptionskörpers angrenzenden Bereich variiert und eine Desorptionsgröße in Abhängigkeit von der Aktivität der Einzelmoleküle bestimmt. Indem ferner ein
Zusammenhang zwischen Desorptionsgröße und Aktivität ermittelt wird, lassen sich Bindungsparameter bestimmen, die die Bindung der Einzelmoleküle an das Sondenmolekül im adsorbier- ten und desorbierten Zustand des Sondenmoleküls beschreiben. Auf diese Weise ist es möglich, das Bindungsverhalten kleiner Moleküle an Makromolekülen im adsorbierten und desorbierten Zustand zu untersuchen.
Es sei angemerkt dass der Begriff der Aktivität in diesem Zusammenhang als Verallgemeinerung der Konzentration verstanden werden soll und somit auch Konzentrationen einschließt.
Bei einer besonderen Ausführungsform des Verfahrens wird die Desorptionsgröße an wenigstens einer weiteren Adsorptionsflä- che von wenigstens einem weiteren Adsorptionskörper in Abhängigkeit von der Aktivität der Einzelmoleküle bestimmt. Die Materialbeschaffenheit der verschiedenen Adsorptionsflächen sollte sich dabei unterscheiden. Anhand der zwischen Desorptionsgröße und Aktivität für die verschiedenen Adsorptions- flächen ermittelten Zusammenhänge können dann Bindungsparameter bestimmt werden, die die Bindung der Einzelmoleküle an das Sondenmolekül im desorbierten Zustand und in den an die verschiedenen Adsorptionsflächen adsorbierten Zuständen des Sondenmoleküls beschreiben. Mit dieser besonderen Ausfüh- rungsform des Verfahrens kann die Genauigkeit, mit der sich die Bindungsparameter bestimmen lassen, erheblich gesteigert werden .
Bei einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens wird die Desorptionsgröße bei verschiedenen Temperaturen in Abhängigkeit von der Aktivität der Einzelmoleküle bestimmt. Anhand von zwischen Desorptionsgröße und Aktivität ermittelten
Zusammenhängen können dann die Bindungsparameter bestimmt werden, die die Bindung der Einzelmoleküle an das Sondenmole- kül in den desorbierten und adsorbierten Zuständen des Son¬ denmoleküls bei den verschiedenen Temperaturen beschreiben. Durch die zusätzlichen Daten kann die Genauigkeit bei der Bestimmung der Bindungsparameter ebenfalls erhöht werden. Bei einer weiteren Ausführungsform wird bei der Auswertung der Kraftplateaus die Desorptionskraft bestimmt. Indem der Zusammenhang zwischen Desorptionskraft und Aktivität ermit- telt wird, lassen sich Bindungsparameter bestimmen, die die Bindung der Einzelmoleküle an das Sondenmolekül im adsorbier¬ ten und desorbierten Zustand des Sondenmoleküls beschreiben. Auf diese Weise ist es möglich, das Bindungsverhalten kleiner Moleküle an Polymere im adsorbierten und desorbierten Zustand zu untersuchen.
Die mit dem Verfahren ermittelbaren Bindungsparameter sind insbesondere die Bindungskonstanten für die Bindung der
Einzelmoleküle an das Sondenmolekül im Gleichgewichtszustand und die mittlere Bindungsstellenlänge, die gleich der Länge des Sondenmoleküls geteilt durch die Anzahl der Bindungsstel¬ len ist. Die Bindungskonstanten und die Bindungsstellenlängen können jeweils für den adsorbierten Zustand des Sondenmole- küls und für den desorbierten Zustand des Sondenmoleküls bestimmt werden.
Dabei kann davon ausgegangen werden, dass die Bindungskon¬ stante und die mittlere Bindungsstellenlänge im desorbierten Zustand unabhängig von der Beschaffenheit der Adsorptionsflä¬ che ist. Für die Ermittlung des Zusammenhangs zwischen De- sorptionskraft und Aktivität können die den desorbierten Zustand des Sondenmoleküls betreffenden Bindungsparameter daher jeweils gleichgesetzt werden.
Der Zusammenhang zwischen Desorptionskraft und Aktivität kann durch Anpassen einer Ausgleichsfunktion an Messwerte der Desorptionskraft bestimmt werden, wobei die Messwerte gegen die Änderung der Aktivität aufgetragen sind und die Parameter der Ausgleichsfunktion die Bindungskonstanten und die mittle¬ re Bindungsstellenlänge für den adsorbierten und desorbierten Zustand des Sondenmoleküls sind. Insbesondere bei Anpassen verschiedener Ausgleichsfunktionen an Messwerte der Desorpti- onskraft, die bei der Untersuchung von unterschiedlichen Adsorptionsflächen verwendet worden sind, kann die Genauig¬ keit bei der Bestimmung der Bindungsparameter wesentlich gesteigert werden. Bei einer weiteren Ausführungsform wird bei der Auswertung der Kraftplateaus die Desorptionslänge bestimmt. Aus der Abhängigkeit der Desorptionslänge von der Aktivität der
Einzelmoleküle kann dann eine Anzahl der an das Sondenmolekül gebundenen Einzelmoleküle bestimmt werden.
Um die Aktivität der Einzelmoleküle in dem an die Adsorpti¬ onsfläche des Adsorptionskörpers angrenzenden Bereich variie- ren zu können, sind die Einzelmoleküle in einem Lösungsmittel gelöst. Dabei kann ein gasförmiges oder flüssiges Lösungsmittel verwendet werden.
Weitere Vorteile und Eigenschaften der Erfindung gehen aus der nachfolgenden Beschreibung hervor, in der Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung im Einzelnen erläutert werden. Es zeigen:
Figur 1 ein Rasterkraftmikroskop oder kurz Kraftmikro- skop(= Atomic Force Microscope = AFM) ;
Figur 2 eine Darstellung des Messkopfs des Kraftmikroskops aus Figur 1 im adsorbierten (A) und desor- bierten (B) Zustand eines an den Messkopf ange- brachten Sondenmoleküls;
Figur 3 ein Diagramm mit Kraft-Weg-Kurven, die ein Kraftplateau aufweisen;
Figur 4 ein Diagramm mit gemessenen Ablöselängen;
Figur 5 ein Diagramm mit gemessenen Haftkräften;
Figur 6 eine Darstellung, die die Wechselwirkung zwischen
Sondenmolekül, Einzelmolekülen und Adsorptions¬ fläche im adsorbierten Zustand veranschaulicht; Figur 7 eine Darstellung, die die Wechselwirkung zwischen
Sondenmolekül und Einzelmolekülen im desorbierten Zustand veranschaulicht;
Figur 8 ein Diagramm, das den Zusammenhang zwischen
Aktivität und Konzentration für eine Glukoselö¬ sung zeigt;
Figur 9 ein Diagramm mit gemessenen Haftkräften bei
verschiedenen Adsorptionsoberflächen einschlie߬ lich der ermittelten Kraftkurven;
Figur 10 ein Diagramm mit der Anzahl gebundener Einzelmo- leküle pro Sondenmoleküllänge im desorbierten und adsorbierten Zustand für verschiedene Adsorpti- onsflächen;
Figur 11 ein Diagramm, in dem die Desorptionskraft in
Abhängigkeit von der Aktivität bei verschiedenen Temperaturen dargestellt ist; und
Figur 12 ein Diagramm mit der Anzahl gebundener Einzelmo¬ leküle pro Sondenmoleküllänge im adsorbierten und desorbierten Zustand bei verschiedenen Temperatu¬ ren .
Figur 1 zeigt ein Rasterkraftmikroskop oder kurz Kraftmikro¬ skop (= Atomic Force Microscope = AFM) , das über einen Mess¬ kopf 2 verfügt, der an einer Blattfeder 3 angebracht ist. Die Blattfeder 3 ist an einem dem Messkopf 2 gegenüberliegenden Ende fest mit einer Halterung 4 verbunden. Der Messkopf 2 kann mit einem Sondenmolekül 5 versehen sein, bei dem es sich typischerweise um ein Makromolekül, insbesondere um ein
Polymer handelt.
Das Kraftmikroskop 1 verfügt ferner über einen Adsorptions¬ körper 6, der eine dem Messkopf 2 und dem Sondenmolekül 5 zugewandte Adsorptionsfläche 7 aufweist. Der Adsorptionskör¬ per 6 befindet sich in einem Behälter 8, der mit einem Lö¬ sungsmittel 9 gefüllt ist. Der Behälter 8 ist auf einem
Probenhalter 10 angeordnet, der so verfahren werden kann, dass der Abstand zwischen dem Messkopf 2 und der Adsorptions¬ fläche 7 variiert wird.
Es sei angemerkt, dass das Lösungsmittel grundsätzlich sowohl gasförmig als auch flüssig sein kann.
Das Kraftmikroskop 1 ist ferner mit einem Laser 11 ausgestat¬ tet, der einen Lichtstrahl 12 auf eine vom Adsorptionskörper
6 abgewandten Rückseite 13 der Blattfeder 3 sendet. Der
Lichtstrahl 12 wird von dort zu einem Photodetektor 14 mit einer sektorierten Photodiode gelenkt. Das vom Photodetektor
14 gelieferte Messsignal wird mithilfe einer Auswerteeinheit
15 ausgewertet, bei der es sich beispielsweise um einen handelsüblichen Rechner handeln kann. Die Auswerteeinheit 15 wird auch dazu verwendet, den Probenhalter 10 zu steuern.
Mit dem Kraftmikroskop 1 lässt sich die Desorptionskraft messen, mit der das Sondenmolekül 5 an der Adsorptionsfläche
7 gehalten wird. Zu diesem Zweck wird der Probenhalter 8 derart betätigt, dass sich der Abstand zwischen dem Messkopf 2 und der Adsorptionsfläche 7 vergrößert. Da das Sondenmole¬ kül 5 an der Adsorptionsfläche 7 haftet, wird der Messkopf 2 etwas in Richtung auf die Adsorptionsfläche 7 hin bewegt, was zu einer Auslenkung des Lichtstrahls 12 führt. Diese Auslen¬ kung kann mithilfe des Detektors 14 erfasst werden. Da die Federkonstante der Blattfeder 3 bekannt ist, kann auf die Desorptionskraft geschlossen werden.
In Figur 2 ist die Blattfeder 3 des Kraftmikroskops 1 über der Adsorptionsfläche 7 dargestellt. Der Messkopf 2 ist jeweils mit dem Sondenmolekül 5 versehen, das im adsorbierten Zustand (A) und im desorbierten Zustand (B) gezeigt ist. Figur 3 zeigt ein Diagramm mit einer Überlagerung von Kraft- Weg-Kurven 16, die Kraftplateaus 17 und eine Plateaustufe 18 aufweist. Die Kraft-Weg-Kurven wurden bei einem nachfolgend noch im Einzelnen beschriebenen Experiment aufgenommen, bei dem ein Poly (allylamin) -Molekül (PAAm) als Sondenmolekül 5 und eine oxidierte Diamantoberfläche als Adsorptionsoberflä¬ che 7 verwendet wurde. Figur 3 zeigt die Überlagerung von 20 typischen Kraft-Weg-Kurven 16, die mit ein und demselben PAAm-Molekül unter Gleichgewichtsbedingungen aufgenommen wurden, wie die geschwindigkeitsunabhängigen Kraftplateaus 17 belegen .
Durch Anpassen von Ausgleichsgeraden 19 an die Kraftplateaus 17 kann eine Desorptionskraft Fdes bestimmt werden, die gleich der Kraft ist, die benötigt wird, um das Sondenmolekül 5 unter Einhaltung eines quasistationären Gleichgewichtszustand von der Adsorptionsfläche 7 abzuziehen. Von Interesse ist ferner auch eine Desorptionslänge L, die gleich der Länge des an der Adsorptionsfläche 7 adsorbierten Abschnitts des Son- denmoleküls 5 ist. Das Produkt von Desorptionslänge L und Desorptionskraft Fdes, das einer Fläche 20 entspricht, ist gleich der freien Desorptionsenergie .
In Figur 4 und 5 sind typische Messwertverteilungen für die Desorptionslänge L und die Desorptionskraft Fdes dargestellt. Die Messwertverteilungen der Desorptionslänge L und Desorpti- onskraft Fdes umfassen die Ergebnisse von 100 Annäherungs- und Separationszyklen der Blattfeder 3 bei der Untersuchung des Adsorptionsverhalten eines PAAm-Moleküls in Glukoselösung auf einer oxidierten Diamantoberfläche .
Im Folgenden werden einige thermodynamischen Relationen abgeleitet, mit deren Hilfe sich aus den in den Figuren 3 bis 5 gezeigten Messergebnissen diverse Bindungsparameter bestim- men lassen. In Figur 6 ist das vollständig an die Adsorptionsfläche 7 adsorbierte Sondenmolekül 5 in der Anwesenheit von Einzelmo¬ lekülen 21 dargestellt, die in dem Lösungsmittel 9 gelöst sind. Die Einzelmoleküle 21 lagern sich an Bindungsstellen 22 des adsorbierten Sondenmoleküls 5 an und lösen sich wieder von den Bindungsstellen 22. Der Anlagerungsvorgang wird durch die Geschwindigkeitskonstante Ka on und der Ablösevorgang durch die Geschwindigkeitskonstante Ka off beschrieben. Figur 7 zeigt das Sondenmolekül 5 in einem weiteren Zustand, in dem das Sondenmolekül 5 von der Adsorptionsfläche 7 desor- biert ist. Die Einzelmoleküle 21 lagern sich an den Bindungs¬ stellen 22 des desorbierten Sondenmoleküls 5 an und lösen sich wieder von den Bindungsstellen 22. Der Anlagerungsvor- gang wird durch die Geschwindigkeitskonstante Kd on und der Ablösevorgang durch die Geschwindigkeitskonstante Kd off beschrieben .
Die Anlagerungsgeschwindigkeit dGa/d/dt im adsorbierten und desorbierten Zustand des Sondenmoleküls ist proportional zur Konzentration c der Einzelmoleküle 21 und der Anzahl der freien Bindungsstellen 22 (N = Nges x [1 - Θ]) entlang dem Sondenmolekül 5. B^L = K" .c-N8a-(l-0a,d) (1)
Die Ablösegeschwindigkeit d9a/d/dt ist proportional zum Anteil der besetzten Bindungsstellen (Nges x Qa/d) :
Figure imgf000013_0001
Das dynamische Gleichgewicht ist dann erreicht, wenn die Geschwindigkeit der Anlagerung neuer Einzelmoleküle 21 gleich der Geschwindigkeit der Ablösung bereits angelagerter Einzel- moleküle 21 ist. Durch Gleichsetzen der Anlagerungs- und
Ablösegeschwindigkeiten und Auflösen nach Θ erhält man mit der Geschwindigkeitskonstante ( Ka/d = a/d 0n / a/ci0 ) jeweils die Langmuirsche Isotherme:
K ald (3)
Der Belegungsgrad Θ nimmt somit mit steigender Konzentration c der Einzelmoleküle 21 zu. Diese Relation gilt nur für ideale Mischungen. Bei nicht-idealen Mischungen ist die
Konzentration c durch die Aktivität a der Einzelmoleküle 21 zu ersetzen. Für die Aktivität a und die Konzentration c gilt der Zusammenhang: α = γ - c ( 4 ) wobei γ der Aktivitätskoeffizient ist. Es gilt: a = exp( / kT) ( 5 ) dabei ist k die Boltzmannkonstante und T die Temperatur. Der Effekt der auf das Sondenmolekül wirkenden Desorptionskraft ist bislang noch nicht berücksichtigt worden. Das Verhalten des von Sondenmolekül 5 und angelagerten Einzelmolekülen 21 gebildeten Systems kann nun mithilfe eines thermodynamischen Potentials ähnlich dem großkanonischen Potential für offene Systeme beschrieben werden. Dieses Potential ergibt sich aus der Zustandsumme Z des Systems. Für das Differential dieses Potentials gilt: d(kT In Z)ald = L dFdes + ΝαΙάάμ + TalddL ( 6 ) wobei L die Desorptionslänge des Sondenmoleküls 5, Fdes die auf das Sondenmolekül 5 einwirkende Desorptionskraft, N die Zahl der besetzten Bindungsstellen 22 entlang dem Sondenmole¬ kül 5, μ das chemische Potential der Einzelmoleküle 21 und τ eine Linienspannung der Einzelmoleküle 21 entlang dem Sonden- molekül 5 ist, die gleich der freien Energie pro Längenein¬ heit ist. Im Gleichgewichtszustand folgt aus Gleichung (6) : dTa/d N Θ a,ld (7) άμ L d ald wobei d der Abstand zwischen den insgesamt vorhandenen Bindungsstellen entlang dem Sondenmolekül 5 ist. Der Abstand d wird nachfolgend auch als Bindungsstellenlänge d bezeichnet. Durch Kombination der Gleichung (7) mit Gleichung (3) erhält man für die Änderung der Linienspannung τ bei Änderung der Aktivität der Einzelmoleküle 21 den Zusammenhang: kT
d *a„/d
Bei der Desorption des Sondenmoleküls 5 von der Adsorptions¬ fläche 7 sind die an der Adsorptionsfläche 7 adsorbierten Abschnitte des Sondenmoleküls 5 und die desorbierten Abschnitte jeweils im thermischen Gleichgewicht. Das Gleichge wicht an dem Abschnitt des Sondenmoleküls 5, der an der
Adsorptionsfläche 7 adsorbiert ist, ist durch die Bindungs¬ konstante Ka und die Bindungsstellenlänge da beschrieben. Dei Zustand des Abschnitts des Sondenmoleküls 5, der von der Adsorptionsfläche 7 desorbiert ist, ist dagegen durch eine Bindungskonstante Kd und eine Bindungsstellenlänge dd bestimmt. Die Änderung der Linienspannung Δτ zwischen adsor¬ biertem und desorbiertem Zustand des Sondenmoleküls 5 ist daher gleich: kT kT
AT =—ln(l + aKa) ln(l + aKd) (9) d„ d,,
Dieser Unterschied der Linienspannung τ trägt hauptsächlich dazu bei, dass die Desorptionskraft von der Aktivität der Einzelmoleküle 21 abhängt: F(a) = F(a = 0) + Ar (10)
Es sei angemerkt, dass anhand der errechneten Bindungskon- stanten K auch die Bindungsenergie einer einzelnen Bindungsstelle berechnet werden kann:
AG = -RTIn K (11) Das im Folgenden anhand eines konkreten Experiments näher beschriebene Verfahren ermöglicht den Nachweis von kleinen, in Lösung befindlichen Einzelmolekülen 21 und die Charakterisierung deren Bindung an das als Sondenmolekül 5 verwendete Makromolekül oder Polymer sowohl im gelösten als auch im oberflächenadsorbierten Zustand. Der Einfluss der gelösten
Einzelmoleküle 21 auf die Wechselwirkung zwischen Sondenmolekül 5 und Adsorptionsfläche 7 aufgrund des unterschiedlichen Bindungsverhaltens der Einzelmoleküle 21 an das Sondenmolekül 5 kann dazu verwendet werden, die Anwesenheit der Einzelmole- küle 21 in dem Lösungsmittel 23 nachzuweisen.
Durch die Übersetzung von Bindungsgleichgewichten in messbare Desorptionskräfte lassen sich ferner Bindungsparameter wie die Bindungskonstanten K, Bindungsstellenlängen d, Bindungs- energien sowie die Anzahl der gebundenen Einzelmoleküle 21 pro Länge ermitteln. Diese Bindungsparameter werden dabei nicht nur für den in Lösung befindlichen Zustand des Sondenmoleküls 5 bestimmt, sondern auch für den Fall, dass das Sondenmolekül 5 an der Adsorptionsfläche 7 anhaftet.
Das Verfahren wurde am Beispiel von Poly ( allylamin) getestet, das sich in Kontakt mit chirurgischen Edelstahl 316L oder mit oxidiertem Diamant befindet. Durch Auswertung der erhaltenen Kraft-Weg-Kurven 16 und der Anwendung der in den Gleichungen (1) bis (9) enthaltenen grundlegenden thermodynamischen
Relationen kann dabei auf die oben genannten Bindungsparameter geschlossen werden. Als Sondenmolekül 5 wird ein einzelnes Poly ( allylamin) - Molekül (PAAm) verwendet, das an die Spitze des Messkopfs 2 der Blattfeder 3 (AFM Cantilever) kovalent angebunden ist. Die kovalente Anbindung gewährleistet die notwendige Lang¬ zeitstabilität [7] um mit ein und demselben Sondenmolekül 5 für den Zeitraum von mehreren Stunden auf unterschiedlichen Adsorptionsflächen 7 in Zuckerlösungen unterschiedlicher Konzentration die Desorptionskräfte zu messen. Bei den Ein- zelmolekülen 21 handelt es sich insbesondere um Glukosemole¬ küle. Die Konzentration wurde in diesem Fall zwischen 0 und 1 M variiert. Die Spitze mit dem Sondenmolekül 5 wurde für eine Sekunde in Kontakt mit der Adsorptionsfläche 7 gebracht, um darauf zu adsorbieren. Die darauffolgende Desorption des Sondenmoleküls 5 mit einer Geschwindigkeit von 1 μιη/s wurde unter Gleichgewichtsbedingungen durchgeführt, wie aus den Kraftplateaus 17 ersichtlich war [8].
Das Sondenmolekül 5 aus Figur 6 und 7 ist somit ein PAAm- Molekül, das in Figur 6 adsorbiert auf der Adsorptionsfläche 7 und in Figur 7 gestreckt in Lösung dargestellt ist. Die Einzelmoleküle 21 werden ferner von D-Glukosemolekülen gebil¬ det. Die Bindungskonstanten Ka = Ka on/Ka off für die Anlagerung der Glukosemoleküle an das PAAm-Molekül 5 im adsorbierten Zustand auf der Adsorptionsfläche 7 und die Bindungskonstan¬ ten Kd = Kd on/Kd off für das PAAm-Molekül in Lösung sowie die Anzahl der im jeweiligen Zustand gebundenen Glukosemoleküle können nun anhand der Desorptionskräft als Funktion der
Glukoseaktivität bestimmt werden.
Es sei nochmals darauf hingewiesen, dass eine präzise Bestim¬ mung der Bindungsparameter durch die Gibbs Adsorptionsiso¬ therme in nicht-idealen Lösungen die Messung der Kraft als Funktion der Glukoseaktivität anstelle der Glukosekonzentra- tion voraussetzt. In den hier beschriebenen Experimenten wurden deshalb die Werte für den Stoffmengenanteil x für Glukose in Aktivitäten a gemäß a = γχ umgerechnet und dabei der Aktivitätskoeffizient aus [9] und [10] benutzt.
In Figur 8 ist der Zusammenhang zwischen Glukosekonzentration und Glukoseaktivität aufgetragen. Aus Figur 8 ist ersicht¬ lich, dass für durchschnittliche Konzentrationen schwach miteinander wechselwirkender Glukosemoleküle die Eigenschaften der Lösung denen einer idealen Lösung ähnlich sind.
Insbesondere bei einer Konzentration mit einem Mol-Anteil unterhalb von 0,05 kann der Zusammenhang zwischen Konzentration und Aktivität durch eine linear ansteigende Kurve 23 angenähert werden. In diesem Bereich ist der Aktivitätskoeffizient konstant und nahe 1. Deshalb ergibt sich nur ein kleiner Fehler, wenn man Konzentrationen statt Aktivitäten verwendet. Allerdings kann es Systeme geben, die die Benutzung von Aktivitäten für eine genaue Bestimmung der Bindungsparameter unumgänglich machen.
In Figur 9 sind die Messwerte für die Desorptionskraft von PAAm bei verschiedenen Glukosekonzentrationen auf Edelstahl (offene Dreiecke) und auf oxidiertem Diamant (gefüllte Dreiecke) bei 31 °C aufgetragen. Die Desorptionskraft auf oxi¬ diertem Diamant steigt mit der Glukosekonzentration an, während die Werte auf Edelstahl einen nicht-monotonen Verlauf zeigen. Die mit durchgezogenen Linien dargestellten Kraftkur¬ ven 24 und 25 stellen das Ergebnis einer gemeinsamen Aus¬ gleichsrechnung dar. Die Kraftkuren 24 und 25 sind die graphische Darstellung der in Gleichung (9) wiedergegebenen Funktion Δτ mit den für die jeweilige Adsorptionsfläche 7 bestimmten Bindungsparameter Ka/d und da/d, die unter der
Annahme ermittelt wurden, dass die Werte Kd und dd für den desorbierten Zustand jeweils gleich sind.
Von Bedeutung ist, dass die Ausgleichsrechnung an beiden Datensätze, die mit unterschiedlichen Materialien erhalten wurden, durchgeführt wird. Dadurch kann die Genauigkeit des Verfahrens erheblich gesteigert werden. Die erhaltenen Werte für die Bindungsparameter, namentlich die Länge einer Gluko¬ sebindestelle d und die zugehörige Gleichgewichtskonstante K, sind daher für die beiden Zustände äußerst zuverlässig. In Figur 10 sind die Anzahl der besetzten Bindungsstellen 22 pro Längeneinheit dargestellte. Eine Kurve 26 gibt die Anzahl angelagerter Glukosemoleküle im desorbierten Zustand wieder, eine weitere Kurve 27 die Anzahl angelagerter Glukosemoleküle bei Adsorption an die Diamantoberfläche und eine dritte Kurve 28 die Anzahl angelagerter Glukosemoleküle bei Adsorption an die Stahloberfläche. Die Kurven 26 bis 28 ergeben sich gemäß Gleichung (7) aus der Ableitung der für die jeweiligen Zu¬ stände durch die Ausgleichsrechnung ermittelten Kraftkurven. Für Konzentrationen ab etwa 0,2 M übersteigt die Anzahl angelagerter Glukosemoleküle am PAAm-Molekül nahe der Stahl¬ oberfläche (Kurve 28) diejenige in Lösung (Kurve 26) . Dies hat den nicht-monotonen Verlauf der Kraftkurve 25 zur Folge. Mit dem hier beschriebenen Verfahren können auch die kleinen Unterschiede detektiert werden, die durch Variation der
Temperatur hervorgerufen werden.
Figur 11 zeigt die Temperaturabhängigkeit der Glukosebindung an das adsorbierte und gelöste PAAm-Molekül. Figur 11 zeigt insbesondere die Messwerte für die Desorptionskraft von PAAm auf oxidiertem Diamant in Glukoselösungen unterschiedlicher Konzentration bei 31 °C (offene Dreiecke) und 46 °C (gefüllte Dreiecke) . Die Kraftkurven 29 und 30 sind das Ergebnis von Ausgleichsrechnungen, mit denen die Funktionen gemäß Glei¬ chung (9) an die aufgetragenen Messwerte angepasst wurden.
Figur 12 zeigt wiederum die Anzahl der gebundenen Glukosemo¬ leküle in Abhängigkeit von der Aktivität. Kurve 31 betrifft den desorbierten Zustand bei 46 °C, Kurve 32 den adsorbierten Zustand bei 46 °C, Kurve 33 den desorbierten Zustand bei 31 °C und Kurve 34 den adsorbierten Zustand bei 31 °C. Die Kraftkurven 29 und 30 können zur Erhöhung der Genauigkeit auch zusammen mit den Kraftkurven 24 und 25 in einer gemeinsamen Ausgleichsrechnung bestimmt werden.
In Tabelle 1 sind die Ergebnisse der Ausgleichsrechnung eingetragen. Ein Blick auf Tabelle 1 zeigt, dass für das Diamantsubstrat die Bindungskonstante Ka für den adsorbierten Zustand etwa 8% größer ist als die Bindungskonstante Kd für den desorbierten Zustand bei 31 °C und sogar um ca. 20% größer bei 46 °C. Folglich sind mehr Glukosemoleküle an das PAAm-Molekül in seinem oberflächenhaftenden Zustand gebunden. Die zusätzlich gebunden Glukosemoleküle lösen sich beim
Desorbieren des PAAm-Polymers ab, was zu dem gemessenen
Anstieg der Desorptionskraft führt. Auch der Abstand zwischen zwei benachbarten Bindungsstellen erhöht sich beim Übergang vom adsorbierten zum desorbierten Zustand.
Für die Edelstahloberfläche kann der Verlauf der Kraftkurve 25 durch die Überlagerung unterschiedlicher Glukosebindungs¬ affinitäten erklärt werden. Bis zu einer Konzentration von ca. 0,2 M, entsprechend einer Aktivität a von ungefähr 5 x 10~3, bindet mehr Glukose an den gelösten Zustand im Ver¬ gleich zu dem an der Oberfläche adsorbierten Zustand des PAAm-Moleküls . Folglich steigt die Anzahl der gebundenen
Glukosemoleküle bei erzwungener Desorption des PAAm-Moleküls durch das zusätzliche Binden von Glukosemolekülen aus der umgebenden Glukoselösung. Bei höheren Konzentrationen bindet jedoch mehr Glukose an das an der Oberfläche adsorbierte PAAm-Molekül im Vergleich zu seinem gestreckten Zustand in Lösung. Folglich müssen Glukosemoleküle in Lösung gehen und das PAAm-Molekül verliert gebundene Glukosemoleküle, während das PAAm-Molekül von der Metalloberfläche abgezogen wird. Dies ist höchst wahrscheinlich durch die unterschiedliche Affinität von Glukose zu dem Substratmaterial selbst verursacht. Bei kleinen Konzentrationen wird der Zucker von der Metalloberfläche abgewiesen und zeigt eine reduzierte Tendenz an das PAAm-Molekül zu binden, wenn sich das PAAm-Molekül an der Oberfläche befindet. Mit steigender Glukosemenge an der Adsorptionsschicht 7, steigt auch die Zahl an adsorbierter Glukose, bis sich eine dichte Schicht aus Glukosemolekülen auf der Adsorptionsschicht 7 gebildet hat. Nun ist das Bin¬ dungsverhalten ähnlich dem auf der oxidierten Diamantoberfläche .
Anstelle der Desorptionskraft kann auch die Änderung der Desorptionslänge L als Funktion der Konzentration oder Aktivität der Einzelmoleküle 21 gemessen werden. Aufgrund der Anlagerung oder des Ablösens von Einzelmolekülen 21 an das Sondenmolekül 5 kommt es zu Änderungen in der Desorptionslänge. Durch deren Messung als Funktion der Aktivität oder der Konzentration kann die genaue Zahl der gebundenen Moleküle bestimmt werden, sofern die Längenänderung pro Einzelmoleküle bekannt ist.
Abschließend sei noch darauf hingewiesen, dass Merkmale und Eigenschaften, die im Zusammenhang mit einem bestimmten
Ausführungsbeispiel beschrieben worden sind, auch mit einem anderen Ausführungsbeispiel kombiniert werden können, außer wenn dies aus Gründen der Kompatibilität ausgeschlossen ist. Schließlich wird noch darauf hingewiesen, dass in den Ansprü¬ chen und in der Beschreibung der Singular den Plural ein¬ schließt, außer wenn sich aus dem Zusammenhang etwas anderes ergibt. Insbesondere wenn der unbestimmte Artikel verwendet wird, ist sowohl der Singular als auch der Plural gemeint. Tabelle 1:
Bindungsparameter von D-Glukose an PAAm auf Edelstahl 3161 und oxidiertem Diamant bei unterschiedlicher Temperatur.
Edelstahl 316L O-Diamant O-Diamant
Temperatur 31 °C 31 °C 46 °C
Kd 1300 1300 1400
dd[Ä] 2.40 2.40 2.68
AGd[kJ mol"1] 18.13 18.13 18.32
Ka 114 1404 1789
da[Ä] 0.99 2.15 2.55
AGa[kJ mol"1] 11.98 18.33 18.94
Literatur :
[1] M. Gavutis, S. Lata, J. Piehler, Nature Protocols 2006, 1, 2091
[2] S. D'Auria, A. Ausiii, A. Marabotti, A. Varriale, V. Scogna- miglio, M. Staiano, E. Bertoli, M. Rossi, F. Tanfani, Journal of Biochemistry 2006, 139, 213.
[3] M. S. Yang, H. C. M. Yau, H. L. Chan, Langmuir 1998, 14, 6121.
[4] A. Velazquez-Campoy, E. Freire, Nature Protocols 2006, 1, 186.
[5] S. N. Tinesheff, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2002, 99, 9721.
[6] C. Ebel, H. Eisenberg, R. Ghirlando, Biophysical Journal 2000, 78, 385.
[7] M. Geisler, T. Pirzer, C. Ackerschott, S. Lud, J. Garrido,
T. Scheibel, T. Hügel, Langmuir 2008, 24, 1350.
[8] M. Geisler, T. Hügel, Advanced Materials 2010, 22, 398-402.
[9] Y. F. Hu, Z. C. Wang, Journal of Chemical Thermodynamics 1997, 29, 879.
[10] K. Miyajima, M. Sawada, M. Nakagaki, Bulletin of the Chemical Society of Japan 1983, 56, 1620.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Untersuchung von Molekülbindungen, bei dem:
- ein Messkopf (2) und ein Adsorptionskörper (6) mit einer Adsorptionsfläche (7) bereitgestellt wird;
- der Abstand zwischen dem Messkopf (2), der mit einem
Sondenmolekül (5) versehen ist, und dem Adsorptionskörper
(4) , an dessen Adsorptionsfläche (7) das Sondenmolekül (5) wenigstens teilweise adsorbiert ist, geändert wird;
- mit Hilfe einer Kraftmessvorrichtung (11-14) die Kraft gemessen wird, die von dem Sondenmolekül (5) zwischen Mess¬ kopf (2) und Adsorptionskörper (6) vermittelt wird;
- eine Kraft-Weg-Kurve (16) bestimmt wird, die die Abhängig- keit der gemessenen Kraft von der Änderung des Abstandes zwischen Messkopf (2) und Adsorptionskörper (6) zeigt;
- durch Auswertung von Kraftplateaus (17) der Kraft-Weg- Kurve (16) eine Desorptionsgröße (Fdes, L) des Sondenmoleküls
(5) an der Adsorptionsfläche (7) im quasistationären Gleich- gewicht bestimmt wird,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s
- eine Aktivität von Einzelmolekülen (21) in einem an die Adsorptionsfläche (7) des Adsorptionskörpers (6) angrenzenden Bereich variiert wird,
- die Desorptionsgröße (Fdes, L) in Abhängigkeit von der Aktivität der Einzelmoleküle (21) bestimmt wird und dass
- anhand eines zwischen Desorptionsgröße (Fdes, L) und Akti¬ vität ermittelten Zusammenhangs (24, 25, 29, 30) Bindungsparameter bestimmt werden, die die Bindung der Einzelmoleküle (21) an das Sondenmolekül (5) im adsorbierten und desorbier- ten Zustand des Sondenmoleküls (5) beschreiben.
2. Verfahren nach Anspruch 1,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s die Desorptionsgröße (Fdes, L) an wenigstens einer weiteren
Adsorptionsfläche (7) von wenigstens einem weiteren Adsorptionskörper (6) in Abhängigkeit von der Aktivität der Einzelmo- leküle (21) bestimmt wird und dass anhand von zwischen De- sorptionsgröße (Fdes, L) und Aktivität ermittelten Zusammen¬ hängen (24, 25) die Bindungsparameter bestimmt werden, die die Bindung der Einzelmoleküle (21) an das Sondenmolekül (5) im desorbierten Zustand und in den an die verschiedenen
Adsorptionsflächen (7) adsorbierten Zuständen des Sondenmoleküls (5) beschreiben.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s die Desorptionsgröße (Fdes, L) bei verschiedenen Temperaturen in Abhängigkeit von der Aktivität der Einzelmoleküle (21) bestimmt wird und dass anhand von zwischen Desorptionsgröße (Fdes, L) und Aktivität ermittelten Zusammenhängen (24, 25) die Bindungsparameter bestimmt werden, die die Bindung der Einzelmoleküle (21) an das Sondenmolekül (5) in den desorbierten und adsorbierten Zuständen des Sondenmoleküls (5) bei den verschiedenen Temperaturen beschreiben.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s bei der Auswertung der Kraftplateaus (17) die Desorpti- onskraft (Fdes) bestimmt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s als zu ermittelnden Bindungsparameter die Bindungskonstanten (Ks, Kb) für die Bindung der Einzelmoleküle (21) an das
Sondenmolekül (5) im Gleichgewichtszustand und die mittlere Bindungstellenlänge (ds, db) bestimmt werden, wobei die
Bindungskonstanten (Ks, Kb) und die Bindungsstellenlänge (ds, db) jeweils für den an der jeweiligen Adsorptionsfläche (7) adsorbierten und den von der jeweiligen Adsorptionfläche (7) desorbierten Zustand des Sondenmoleküls (5) bestimmt werden.
6. Verfahren nach Anspruch 5,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s für die Ermittelung der Bindungsparameter (Kb, db) diejenigen Bindungsparameter, die dem von den Adsorptionsflächen (7) desorbierten Zustand des Sondenmoleküls (5) zugeordnet sind, gleich gesetzt werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s aus der Bindungskonstante eine Bindungsenergie (AG) pro
Einzelmolekül (21) bestimmt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s die Bindungsparameter durch Anpassen einer Ausgleichsfunktion (24, 25) an Messwerte der Desorptionskraft (FdeS) bestimmt werden, wobei die Messwerte gegen die Änderung der Aktivität aufgetragen sind und die Parameter der Ausgleichsfunktion die Bindungskonstanten (Ks, Kb) und die mittlere Bindungsstellen¬ länge (ds, db) für den adsorbierten und desorbierten Zustand des Sondenmoleküls (5) sind.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s bei der Auswertung der Kraftplateaus (17) die Desorptionslän- ge (L) bestimmt wird und aus der Abhängigkeit der Desorpti- onslänge (L) von der Aktivität der Einzelmoleküle (21) eine
Anzahl der an das Sondenmolekül (5) gebundener Einzelmoleküle (21) bestimmt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s die Einzelmoleküle (21) in einem Lösungsmittel (9) gelöst werden .
11. Verfahren nach Anspruch 10
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s ein gasfömiges oder flüssiges Lösungsmittel (9) verwendet wird .
12. Vorrichtung zur Untersuchung von Molekülbindungen mit:
- einem Adsorptionskörper (6), der mit einer Adsorptionsflä¬ che (7) versehen ist,
- einem Messkopf (2), dessen Abstand von der Absorptionsflä¬ che (7) veränderbar ist,
- einer Kraftmessvorrichtung (11-14), mit der eine zwischen Messkopf (2) und Adsorptionsfläche (7) wirkende Kraft messbai ist, und mit
- einer an die Kraftmessvorrichung (11-14) angeschlossene Auswerteeinheit (15),
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s die Auswerteeinheit (15) zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 11 eingerichtet ist.
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