WO2011117429A1 - Derivados quinona de cannabinoides - Google Patents

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WO2011117429A1
WO2011117429A1 PCT/ES2010/070156 ES2010070156W WO2011117429A1 WO 2011117429 A1 WO2011117429 A1 WO 2011117429A1 ES 2010070156 W ES2010070156 W ES 2010070156W WO 2011117429 A1 WO2011117429 A1 WO 2011117429A1
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compound
cbd
cbg
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PCT/ES2010/070156
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Eduardo Muñoz Blanco
Giovanni Appendino
María Luz BELLIDO CABELLO DE ALBA
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Vivacell Biotechnology España, S.L
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Definitions

  • the present invention refers to quinone derivatives of cannabinoids for use as medicaments, particularly as agonists of the Peroxisome Proliferator-activated gamma receptor (PPARg), to treat diseases whose etiology is based on an altered function of PPARg as a factor of transcription, that is, diseases related to PPARg.
  • PPARg Peroxisome Proliferator-activated gamma receptor
  • the present invention can be encompassed in the medical field, in general, and more specifically, in that field of medicine related to the treatment of diseases, which share the etiology mentioned above, carrying out an agonist effect on PPARg.
  • PPARg is a member of the PPAR subfamily of nuclear hormone receptors that are ligand inducible transcription factors. PPARs form heterodimers with their bound partner the retinoid X receptor (RXR). All PPAR isotypes have a similar domain organization: the N-terminal A / B domain contains an activation factor 1 of putative ligand independent transcription (AF1). The DNA-binding C domain, composed of two zinc fingers, binds to the peroxisome proliferating response element (PPRE) in the regulatory region of the PPAR target genes. Domain D is a hinge region that confers flexibility between domain C and domain E (ligand binding domain or LBD) that contains the activation factor 2 of ligand-dependent transcription (AF-2). The transcriptional activity of PPARs is regulated not only by their ligands, but also by post-translational modifications, such as phosphorylation.
  • PPARg is expressed in a range of tissues that includes skeletal muscle cells, osteoclasts, osteoblasts, various types of immune cells, and in the brain and peripheral nervous system. Adipose tissue exhibits the highest levels of PPARg expression in the human body. PPARg is of special interest because it is involved in the regulation of adipocyte formation, insulin sensitivity and inflammation (Fievet et al. 2006; Stienstra et al. 2007; Tontonoz and Spiegelman, 2008). It is clear that PPARg is the dominant or "master" regulator of adipogenesis, due to the fact that it is sufficient and necessary for the differentiation of lipid cells.
  • the regulatory regions of a large number of genes that perform important functions in lipogenesis and insulin sensitivity contain binding sites for PPARg, including aP2, LPL, adiponectin, and Glut4 (Rosen and MacDougald, 2006).
  • PPARs exerts an anti-inflammatory function in several cell types by inhibiting the expression of pro-inflammatory genes, thus reducing the production of cytokines, metalloproteases and acute phase proteins. It also acts by increasing anti-inflammatory cytokines, and inhibiting the expression of inducible nitric oxide synthase ( ⁇ NOS) (see Széles et al., 2007 for a recent review).
  • ⁇ NOS inducible nitric oxide synthase
  • PPARs negatively regulate the transcription of inflammatory response genes through an antagonistic function in the signaling pathways of AP-1, the nuclear factor kappaB (NF-KB), the signal transducer and activator of transcription (STAT) and the nuclear factor of activated T cells (NFAT) (Vanden Berghe et al. 2003). It is noteworthy that PPARs also stimulate the catabolism of pro-inflammatory eicosanoids (Delerive et al. 2001).
  • PPARg has been recognized for playing a fundamental role in the immune response through its ability to inhibit the expression of inflammatory cytokines and direct the differentiation of immune cells towards anti-inflammatory phenotypes (Tontonoz and Spiegelman, 2008).
  • PPARg activators such as thiazolidinediones (TZDs, for example, rosiglitazone, piaglitazone) are used clinically in the treatment of type 2 diabetes (Lehmann et al., 1995).
  • PPARg agonists have been shown to have positive cardiovascular effects, which include increased availability of nitric oxide, reduced blood pressure and attenuation of atherosclerosis (Bishop-Bailey, 2000; Hsueh and Bruemmer, 2004).
  • PPARg agonists are a suitable treatment for a group of metabolic abnormalities, generally called metabolic syndrome, which include elevated blood pressure, elevated triglyceride level, low level of high density lipoprotein (HDL cholesterol), abdominal obesity , inflammation, insulin resistance, and high blood glucose (Lottenberg et al., 2007; Murphy and Holder, 2000).
  • metabolic syndrome a group of metabolic abnormalities, generally called metabolic syndrome, which include elevated blood pressure, elevated triglyceride level, low level of high density lipoprotein (HDL cholesterol), abdominal obesity , inflammation, insulin resistance, and high blood glucose (Lottenberg et al., 2007; Murphy and Holder, 2000).
  • the main cause of metabolic syndrome is insulin resistance, which is secondary to abdominal or visceral excess of adipose tissue.
  • PPARg agonists have demonstrated anti-inflammatory and neuroprotective effects in several experimental models of Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, multiple sclerosis and stroke, as well as in some clinical studies (Bernardo and Minghetti, 2008).
  • PPARg should be formally considered a tumor suppressor gene in the genetic field. It is expressed in several tumor cells, and activation of PPARg by ligand is directed both to the inhibition of cell proliferation and to the induction of apoptosis (Tachibana et al., 2008; Tontonoz and Spiegelman, 2008).
  • PPARg activation can be used for the treatment of various diseases, as shown in Table 1.
  • Table 1 This table summarizes the activity of PPARs in inflammatory diseases.
  • IL-1j_ ? MCP-1, COX-2, ⁇ NOS, proliferation and ⁇ apoptosis of mesangial cells.
  • Psoriasis and healing Improves psoriasis lesions in mouse models and patient skin wounds.
  • astrocytes and microglia are astrocytes and microglia.
  • the present invention takes a new step towards solving the aforementioned problem, developing new compounds suitable for the treatment of PPARg-related diseases due to their high agonist effect of PPARg and low cytotoxicity.
  • the present invention focuses on the formulation of cannabinoid derivatives, particularly quinone (Q) derivatives of cannabinoids, synthesized from natural cannabinoids such as CBD (cannabidiol) and CBG (cannabigerol), by substituting some specific radicals.
  • Q quinone
  • the compounds of the present invention are quinone derivatives (Q) of cannabinoids of Formula (I):
  • R1 means a hydrogen, hydroxyl, methyl or aldehyde group
  • R2 means a cyclohexene derivative or an aliphatic compound, preferably an alkene
  • R3 means a hydroxyl or methyloxy group
  • the compounds of the invention are those of Formula (III), (IV), (V) and (VI):
  • the quinone group (Q) comprised in the general Formula (I) gives the compounds of the present invention the ability to bind directly to PPARg, said compounds being good candidates as agonists. of PPARg.
  • the present invention it also demonstrates that said direct binding capacity to PPARg is even more efficient when the compounds have a formula comprising said quinone group in combination with the radicals R1, R2 and R3 mentioned above, said compounds also demonstrating a valued low level of cytotoxicity in several cell lines compared to the compounds included in the state of the art.
  • the compounds of the invention bind directly to PPARg having an IC 50 value of 2.2 and, therefore, lower than the IC 50 value of the known compounds CBD-Q and CBN.
  • This conclusion shown in Figures 1 and 2 is further ratified by Figure 3, by showing that CBG-Q is capable of inducing PPARg activation more efficiently than CBG (Figure 3B) and also that CBD and CBD-Q ( Figure 3A).
  • CBG-Q Stimulation of fibroblast differentiation to adipocytes is a well known property of PPARg ligands and this function was clearly carried out by CBG-Q, which, as shown in Figure 4, was able to stimulate differentiation of fibroblasts to adipocytes in a stronger way than CBG.
  • the CBD-Q derivatives of the invention are capable of inducing PPARg activation with greater efficiency than CBD-Q, showing FM-CBD-Q the highest activation value of PPARg.
  • Figure 8B confirms that the chemical modifications introduced in CBD-Q (M-CBD-Q, H-CBD-Q and FM-CBD-Q) maintained or, in the case of FM-CBD-Q even increased, affinity for PPARg.
  • the compounds of the invention can be used as PPARg agonists for the treatment of diseases whose etiology is based on a deregulated function of PPARg as a transcription factor (PPARg related diseases) such as, for example, metabolic diseases (hypertension , hypertriglyceridemia, hypercholesterolemia (HDL-C), obesity), inflammatory diseases (see Table 1) (atherosclerosis, inflammatory bowel disease, rheumatoid arthritis, liver fibrosis, neuropathy, psoriasis, skin wound healing, skin regeneration, pancreatitis, gastritis, neurodegenerative disorders and cancer), type 2 diabetes (insulin resistance) or high blood glucose.
  • metabolic diseases hypertension , hypertriglyceridemia, hypercholesterolemia (HDL-C), obesity
  • inflammatory diseases see Table 1 (atherosclerosis, inflammatory bowel disease, rheumatoid arthritis, liver fibrosis, neuropathy, psoriasis, skin wound healing, skin
  • CBG and CBG-Q have positive effects as anti-inflammatory compounds in adipose tissue and, therefore, are suitable as PPARg agonists for the treatment of type 2 diabetes by lowering the insulin resistance
  • both CBG and CBG-Q compounds were able to increase glucose absorption both in the presence and absence of insulin, but CBG-Q showed a greater effect than CBG in the absence of insulin.
  • CBG-Q is particularly preferred because it can be used for the treatment of type diabetes.
  • the compounds of the invention are particularly suitable as PPARg agonists, particularly for the treatment of inflammatory diseases (see Table 1 of the prior art), metabolic diseases and type 2 diabetes.
  • CBG-Q and FM-CBD-Q are particularly preferred due to their increased activity PPARg both in vivo and in vitro, and also for its improved effect on insulin sensitivity, and also for its low cytotoxicity.
  • the compounds of the invention also comprise their derivatives, analogs, tautomeric forms, stereoisomers, polymorphs, metabolic analogs, pharmaceutically acceptable salts, pharmaceutically acceptable solvates, and compositions containing them.
  • the compounds of the invention can be used alone or formulated in compositions, particularly pharmaceutical compositions, together with other active ingredients (other cannabinoid derivatives) or excipients such as: solvents, surfactants, oils, humectants, emollients, preservatives, stabilizers , and antioxidants.
  • active ingredients other cannabinoid derivatives
  • excipients such as: solvents, surfactants, oils, humectants, emollients, preservatives, stabilizers , and antioxidants.
  • Any pharmaceutically acceptable buffer can be used, for example, Tris or phosphate buffers.
  • compositions include the compounds of the invention, or derivatives thereof, associated with pharmaceutically acceptable excipients that may be a carrier or diluent.
  • excipients may be a carrier or diluent.
  • Such compositions may be in capsule, envelope, paper or other wrapping form.
  • Conventional techniques for the preparation of pharmaceutical compositions can be used for the manufacture of the compositions.
  • the compound of interest will normally be mixed with an excipient or diluted by an excipient, or included in an excipient that may be in the form of a blister, capsule, envelope, paper, or other wrapping.
  • the excipient serves as a diluent, this may be a solid, semi-solid, or liquid material that acts as a vehicle, excipient or medium for the active compound.
  • the compound of interest can be absorbed in a solid granular wrap, for example, in an envelope.
  • suitable excipients are water, saline solutions, alcohols, polyethylene glycols, polyhydroxyethoxylated castor oil, peanut oil, olive oil, lactose, terra alba, sucrose, cyclodextrin, amylose, magnesium stearate, talc, gelatin, agar, pectin, Acacia, stearic acid or lower alkyl cellulose esters, silicic acid, fatty acids, fatty acid amines, monoglycerides and diglycerides of fatty acids, pentaerythritol, fatty acid esters, polyoxyethylene, hydroxymethylcellulose, and polyvinylpyrrolidone.
  • the excipient or diluent may include any release material known in the state of the art, such as glyceryl monostearate or glyceryl deacetate, alone or mixed with wax.
  • the formulations may also include wetting agents, emulsifiers and suspending agents, agents preservatives, sweetening agents or flavoring agents.
  • the formulations of the invention can be formulated to provide a rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to the patient by employing procedures well known in the state of the art.
  • compositions can be sterilized and mixed, if desired, with auxiliary agents, emulsifiers, salts influencing osmotic pressure, buffers and / or coloring substances and the like, which do not react deleteriously with the active compounds.
  • the route of administration may be any route that efficiently transports the compound of interest to the desired or appropriate site of action, such as oral, nasal, pulmonary, transdermal or parenteral, for example, rectal, subcutaneous, intravenous, intraurethral, intramuscular, intranasal, as an ophthalmic solution or as an ointment.
  • the preparation may contain the compound of interest dissolved or suspended in a liquid excipient, in particular an aqueous excipient, for application as an aerosol.
  • a liquid excipient in particular an aqueous excipient, for application as an aerosol.
  • the excipient may contain additives, such as solubilizing agents, for example, propylene glycol, surfactants, absorption enhancers such as lecithin (phosphatidylcholine) or cyclodextrin, or preservatives such as parebenos.
  • the compound of interest is placed in a dermatological vehicle.
  • the amount of the compound of interest to be administered and the concentration of the compound in the topical formulation depends on the vehicle, release system or instrument selected, the patient's clinical condition, the side effects and the stability of the compound in the formulation.
  • the specialist then uses the appropriate preparation that contains an appropriate concentration of the compound of interest and selects the amount of formulation administered, depending on the clinical experience of the patient in question or with similar patients.
  • the compound of interest is formulated in solutions, suspensions, and ointments appropriate for use in the eye.
  • concentrations are normally those explained above for local preparations.
  • single solid or fluid dose forms can be prepared.
  • solid compositions such as tablets
  • the Compound of interest is mixed in formulations with conventional ingredients, such as talc, magnesium stearate, bicalcium phosphate, magnesium aluminum silicate, calcium sulfate, starch, lactose, acacia, methyl cellulose, and similar materials that function as pharmaceutical diluents or excipients .
  • the capsules are prepared by mixing the compound of interest with an inert pharmaceutical diluent and filling with the mixture a hard gelatin capsule of appropriate size.
  • Soft gelatin capsules are prepared by encapsulating in a machine a mixture of the compound of interest with an acceptable vegetable oil, light liquid paraffin or other inert oil.
  • Fluid forms of a single dose can be prepared for oral administration, such as syrups, elixirs and suspensions. Water soluble forms can be dissolved in aqueous vehicles with sugar, aromatic flavoring agents and preservatives to form a syrup.
  • An elixir is prepared by using a hydro-alcoholic vehicle (eg, ethanol) with appropriate sweeteners such as sugar or saccharin, together with a flavoring aromatic agent.
  • the suspensions can be prepared with an aqueous vehicle, with the help of a suspending agent such as acacia, tragacanth, methyl cellulose, and the like.
  • Formulations suitable for parenteral use are known to those skilled in the art, such as the use of appropriate solutions or suspensions for injection.
  • the formulation which is sterile, is appropriate for several topical or parenteral routes of administration, including intradermal, intramuscular, intravascular, and subcutaneous.
  • compositions may include, depending on the desired formulation and route of administration, non-toxic, pharmaceutically acceptable diluents or excipients, which include vehicles commonly used to form pharmaceutical compositions for administration in animals or humans.
  • diluents or excipients include vehicles commonly used to form pharmaceutical compositions for administration in animals or humans.
  • the diluent is selected so as not to affect the biological activity of the combination in any way.
  • diluents examples include water, various saline solutions, organic or inorganic salts, Ringer's solution, dextrose solution, and Hank's solution.
  • the pharmaceutical composition or formulation may include additives such as other non-toxic, non-therapeutic and non-immunogenic excipients, adjuvants or stabilizers and the like.
  • excipients can be included in the formulation. Examples of excipients include cosolvents, surfactants, oils, humectants, emollients, preservatives, stabilizers and antioxidants.
  • Any pharmaceutically acceptable buffer can be used, for example, Tris or phosphate buffers.
  • the effective amount of diluents, additives, and excipients is that amount that is effective to obtain pharmaceutically acceptable formulations in terms of solubility, biological activity, etc.
  • the compound of interest can be incorporated into a microsphere.
  • the compound of interest can be loaded into albumin microspheres, so that it is possible to recover said microspheres in a dried powder for nasal administration.
  • Other materials suitable for the preparation of microspheres include agar, alginate, chitosan, starch, hydroxyetii starch, albumin, agarose, dextran, hiaiuronic acid, gelatin, collagen and casein.
  • Microspheres can be produced by various processes known to the person skilled in the art, such as the spray drying process or the emulsification process.
  • albumin microspheres can be prepared by adding rabbit serum albumin in phosphate buffer to olive oil by stirring to produce water in oil emulsion. A solution of glutaraldehyde is then added to the emulsion and the emulsion is stirred to bind the albumin. The microspheres can then be isolated by centrifugation, the oil being removed and the spheres washed, for example, with petroleum ether followed by ethanol. Finally, microspheres can be screened, collected and dried by filtration.
  • Starch microspheres can be prepared by adding a solution of starch in hot water, for example, of potato starch, to a hot solution of polyethylene glycol in water by stirring to form an emulsion.
  • a solution of starch in hot water for example, of potato starch
  • polyethylene glycol in water by stirring to form an emulsion.
  • the mixture is then cooled to room temperature under continuous stirring whereby the internal phase is converted into gel particles.
  • These particles are then filtered at room temperature and mixed in a solvent such as ethanol, after which the particles are filtered again and left in the air until they cool.
  • the microspheres can be hardened by well known agglutination methods, such as heat treatment, or by the use of agents chemical binders Suitable agents include dialdehydes, including glyoxal, malondialdehyde, succinicaldehyde, adipaldehyde, glutaraldehyde and phthalaldehyde, dyketones, such as butadione, epichlorohydrin, polyphosphate and borate. Dialdehydes are used to bind proteins such as albumin, through interaction with amino groups, and the dykestons form Schiff bases with amino groups. Epichlorohydrin activates compounds with nucleophiles such as amino or hydroxyl, to an epoxy derivative.
  • dialdehydes including glyoxal, malondialdehyde, succinicaldehyde, adipaldehyde, glutaraldehyde and phthalaldehyde, dyketones, such as buta
  • single dose form refers to physically differentiated units suitable as unit doses for subjects, for example, mammalian subjects, for example, humans, dogs, cats, and rodents, each unit containing a predetermined amount of a material. active calculated to produce the desired pharmaceutical effect in association with the diluent, excipient or pharmaceutical vehicle required.
  • the description for the single dose forms of the invention are dictated by and depend on (a) the characteristics of the active material and the particular effect to be achieved and (b) the limitations inherent in the state of the art for composing said material. active for use in humans and animals.
  • kits which may contain one or more forms of a single dose of the composition and instructions for use to treat one or more of the diseases described herein.
  • Slow and prolonged administration systems including any of a series of biopolymers (biologically based systems), systems employing liposomes, colloids, resins, and other administration systems with compartmentalized polymers or reservoirs can be used with the compositions described herein for provide a continuous or long-term source of the therapeutic compound.
  • Said slow release system is applied to formulations to be administered topically, intraocularly, orally and parenterally.
  • an effective amount of the compound of interest is used in the treatment.
  • the dose of the compounds used according to the invention varies depending on the compound and the condition to be treated, for example, according to age, weight and situation. clinic of the receiving patient. Other factors include: the route of administration, the patient, the patient's medical history, the severity of the disease, and the potency of the particular compound.
  • the dose should be sufficient to reduce the symptoms or signs of the treated disease without producing an unacceptable toxicity to the patient.
  • the effective amount of the compound is that which provides subjective relief of symptoms or an objectively identifiable improvement detected by the clinician or other qualified observer.
  • the compounds of the invention may also be administered orally in combination with natural or synthetic compounds that bind to or modify the activity of the vitamin D receptor, or in combination with compounds that bind to or modify the activity of the retinoid X receptor to provide an effect.
  • synergistic in the treatment or prevention of diseases include vitamin D analogs, various retinoic acid derivatives and other retinoid X receptor activators or retinoic acid receptors that include, but they are not limited to compounds such as LG100268, tazarotene, TTNPPB, AGN190121, adapalene, orLGD1069 (Targret ⁇ n).
  • R1 means a hydrogen, hydroxyl, methyl or aldehyde group
  • R2 means a cyclohexene derivative or an aliphatic compound, preferably an alkene
  • R3 means a hydroxyl or methyloxy group
  • the compounds of the invention are those of Formula (III), (IV), (V) and (VI):
  • the second aspect of the present invention refers to the use of the compounds of Formula (I) as medicaments, particularly as PPARg agonists in the treatment of PPARg-related diseases, selected from inflammatory diseases (for example: atherosclerosis, inflammatory bowel disease). , rheumatoid arthritis, liver fibrosis, neuropathy, psoriasis, healing of skin wounds, skin regeneration, pancreatitis, gastritis, neurodegenerative disorders or cancer), metabolic diseases (hypertension, hypertriglyceridemia, hypercholesterolemia (HDL-C), obesity), and type 2 diabetes.
  • inflammatory diseases for example: atherosclerosis, inflammatory bowel disease.
  • rheumatoid arthritis for example: atherosclerosis, inflammatory bowel disease.
  • liver fibrosis for example: atherosclerosis, inflammatory bowel disease
  • neuropathy for example: atherosclerosis, inflammatory bowel disease
  • psoriasis rheumatoid arthritis
  • the third aspect of the present invention refers to the use of the compounds of Formula (I) mentioned above for the preparation of a composition for the treatment of diseases related to PPARg selected from inflammatory diseases (for example: atherosclerosis, inflammatory disease of the colon, rheumatoid arthritis, liver fibrosis, neuropathy, psoriasis, healing of skin wounds, skin regeneration, pancreatitis, gastritis, neurodegenerative disorders or cancer), metabolic diseases (hypertension, hypertriglyceridemia, hypercholesterolemia (HDL-C), obesity), and type 2 diabetes.
  • inflammatory diseases for example: atherosclerosis, inflammatory disease of the colon, rheumatoid arthritis, liver fibrosis, neuropathy, psoriasis, healing of skin wounds, skin regeneration, pancreatitis, gastritis, neurodegenerative disorders or cancer
  • metabolic diseases hyperertension, hypertriglyceridemia, hypercholesterolemia (HDL-C), obesity
  • type 2 diabetes
  • the fourth aspect of the present invention refers to a composition comprising at least one of the above-mentioned compounds and any acceptable excipient.
  • the last aspect of the present invention refers to a method for the treatment of diseases related to PPARg selected from inflammatory diseases (for example: atherosclerosis, inflammatory bowel disease, rheumatoid arthritis, liver fibrosis, neuropathy, psoriasis, wound healing of the skin, skin regeneration, pancreatitis, gastritis, neurodegenerative disorders or cancer), metabolic diseases (hypertension, hypertriglyceridemia, hypercholesterolemia (HDL-C), obesity), and type 2 diabetes; which comprises administering to the patient an effective amount of the aforementioned composition.
  • inflammatory diseases for example: atherosclerosis, inflammatory bowel disease, rheumatoid arthritis, liver fibrosis, neuropathy, psoriasis, wound healing of the skin, skin regeneration, pancreatitis, gastritis, neurodegenerative disorders or cancer
  • metabolic diseases hypertension, hypertriglyceridemia, hypercholesterolemia (HDL-C), obesity
  • type 2 diabetes which comprises
  • the concentration of the compound tested ( ⁇ ) is shown on the x-axis and the percentage reduction in fluorescent polarization taken as a measure of PPARg binding is shown on the y-axis. This figure shows how some cannabinoids included in the prior art bind directly to PPARg, observing the best values with CBD-Q and CBN.
  • the concentration of the compound tested ( ⁇ ) is shown on the x-axis and the percentage reduction of fluorescent polarization taken as a measure of PPARg binding is shown on the y-axis.
  • This figure indicates that CBG-Q binds directly to PPARg, with the best IC 50 value, compared to CBG and even with the best known candidates shown in Figure 1 (CBD-Q and CBN).
  • the data are shown as average, indicating the standard deviation by bars, of the three replicas.
  • the concentration of the compound tested ( ⁇ ) is shown on the x-axis and the degree of activation of PPARg is shown on the y-axis.
  • This figure shows the effect of CBD and CBD-Q (Figure 3A) or CBG and CBG-Q ( Figure 3B) on PPARg activity, confirming that CBG-Q is capable of inducing PPARg activation more efficiently than CBG, CBD and CBD-Q.
  • This figure shows the effect of CBG and CBG-Q on the expression of several genes used as markers of adipocyte differentiation (aP2 and PPARg), as well as for several genes encoding adipokines (resistin, IL-6, adipoQ).
  • a reduction in the proinflammatory cytokine IL-6 gene expression was observed, as well as an increase in adipoQ gene expression, which is the main anti-inflammatory adipokine.
  • This result shows that CBG and CBG-Q have positive effects as anti-inflammatory compounds in adipose tissue.
  • CBG-Q can be used to treat insulin resistance through the reduction of pro-inflammatory adipose tissue and, in addition, through increased glucose absorption.
  • FIG. 7 CBG-Q as a PPARg agonist in mesenchymal cells derived from the spinal cord. CBG-Q does not inhibit osteoblast differentiation.
  • the figure shows the effect of CBG and CBG-Q on the gene expression of adipocytes (PPARg2 and LPL isoform) (Figure 7B) and the gene expression of osteoblasts (RUNX2 and ALP) ( Figure 7A).
  • the degree of gene expression is illustrated in the y-axis. It is known that an increase in PPARg activity due to treatment with the antidiabetic drug thiazolidinedione (TZD) rosiglitazone results in a decrease in the number of osteoblasts and an increase in the number of adipocytes.
  • ZTD antidiabetic drug
  • Figure 8A The concentration of the compound tested ( ⁇ ) is shown on the x-axis and the degree of activation of PPARg is shown on the y-axis.
  • CBD-Q showed the highest activation values of PPARg.
  • FIG. 8B The concentration of the compound tested ( ⁇ ) is shown on the x-axis and the percentage reduction in fluorescent polarization taken as a measure of PPARg activity in the presence of ligands is shown on the y-axis.
  • the IC50 is included in the legend. The data are shown as average, indicating the standard deviation by bars, of the three replicas. This figure indicates that the chemical modifications of CBD-Q maintained, or even increased (FM-CBD-Q), the affinity for PPARg.
  • FIG 8C Quantification of total triglycerides (mmol / L of 3T3-L1, y-axis) in completely differentiated adipocytes. The data are shown as average, indicating the standard deviation by bars, of the three replicas. At all concentrations tested, CBD-Q derivatives were found to stimulate differentiation of fibroblasts to adipocytes in a more potent way than CBD and CBD-Q, and without the cytotoxic effect observed for CBD-Q at a concentration greater than 1 ⁇ (note that the bar is absent). Again, FM-CBD-Q showed the highest efficiency.
  • Figure 9 Comparative effect of CBD, CBD-Q and FM-CBD-Q on glucose absorption in pre-adipocytes 3T3-L1.
  • Example 1 PPARg binding assay.
  • the ability of the compounds of the invention to bind the PPARg ligand binding domain was measured using the PolarScreen TM PPARg Competitor Assay Green (Invitrogen) assay kit. Briefly, the competing compounds were diluted in a reaction buffer in a black 384 shallow well piate (NUNC) multiwell plate. The purified PPARg ligand binding domains and the fluorescent PPARg ligand (Fluormone TM PPAR Green) were then added. Samples were incubated at room temperature for 2 hours and fluorescence polarization was obtained by reading the plate using a Tecan Genius Pro with an excitation wavelength of 485 nm and an emission wavelength of 535 nm.
  • NUNC black 384 shallow well piate
  • this PPARg binding assay was initially carried out with cannabinoids comprised in the prior art, also showing its IC 50 value: CBG (cannabigerol), CBD (cannabidiol), CBDV ( cannabidivarine), CBN (cannabinol), CBC (cannabichromene), THC ( ⁇ -tetrahydrocannabinol), THCV ( ⁇ -tetrahydrocannabinol-viridine) CBD-Q (CBD-Quinone) and CBD-abnormal.
  • CBG canbigerol
  • CBG-Q displaced the Fluormone TM PPAR Green fluorescent ligand from the PPAR-LBD / Fluormone TM PPAR Green complex with better IC50 than any of the other cannabinoids.
  • Example 2 Cell lines used in the invention.
  • AGS human gastric adenocarcinoma
  • HCT1 human colon carcinoma
  • HeLa human cervix carcinoma
  • MDA human breast cancer
  • T47D human breast adenocarcinoma
  • 293T human renal epithelial cell line
  • 3T3-L1 mouse embryocyte fibroblasts committed to differentiate into adipocytes.
  • DMEM Dulbecco-enriched Eagle medium
  • FBS heat-inactivated fetal bovine serum
  • MSC Mesenchymal cells
  • the 3T3-L1 pre-adipocyte cell line was plated at a concentration of 2x10 5 cells / well in 6-well plates for RNA isolation and triglyceride quantification.
  • 3T3-L1 fibroblasts were grown until confluence (3 days) in DMEM with 10% FBS and antibiotics. Then (day 0), the medium was supplemented with 1 ⁇ of dexamethasone, 0.5 mM of IBMX and 10 pM / ml of insulin, to induce differentiation for two days. On day 2, the medium is supplemented with only 5 ⁇ / ml of insulin for two more days.
  • CBG-Q stimulates the differentiation of fibroblasts to adipocytes in a more potent way than CBG. This is demonstrated by the accumulation of triglycerides in adipocytes. Taken together, these data show for the first time that CBG-Q is a PPARg ligand capable of binding to it and increasing its transcriptional activity.
  • Example 4 Effect of CBG and CBG-Q on gene expression in adipocytes (aP2 and PPARg), and gene expression of adipokines (resistin, IL-6, adipoQ).
  • CBG and CBG-Q have a positive effect as an anti-inflammatory compound in adipose tissue.
  • 3T3-L1 pre-adipocytes cultured in 12-well serum plates were deprived by incubation for 2 hours.
  • the cells were then incubated with 1.74 ⁇ of insulin for 20 minutes in 450 ⁇ ⁇ of KRH buffer (25 mM HEPES-NaOH [pH 7.4], 120 mM NaCI, 5 mM of KCI, 1.2 mM of MgS0 4 , 1.3 mM of CaCI 2 , and 1.3 mM of KH 2 P0 4 ).
  • Glucose transport was initiated by the addition of 50 [mu] KRH buffer containing 0.5 mM of 2-deoxy-D- [1, 2-3H] glucose (0.25 ⁇ ) in each well; After 5 minutes, the transport was completed by washing the cells 3 times with KRH buffer to freeze. The cells were solubilized and the incorporated radioactivity was measured by liquid scintillation counter. This test is illustrated in Figure 6 which shows the effect of CBG and CBG-Q on glucose uptake in 3T3-L1 pre-adipocytes. Two doses were tested in the presence and absence of insulin (1.74 ⁇ ). The data are shown as average, indicating the standard deviation by bars, of the three replicas.
  • FIG. 9 shows the effect of CBD, CBD-Q and FM-CBD-Q on glucose absorption in pre-adipocytes 3T3-L1. Two doses were tested in the presence of insulin (1.74 ⁇ ). The data are shown as average, indicating the standard deviation by bars, of the three replicas. To analyze the effect of FM-CBD-Q on glucose absorption in pre-adipocytes 3T3-L1, two doses were tested in the presence of insulin. The results show that the compound FM-CBD-Q is capable of increasing glucose absorption in the presence of insulin.
  • Example 6 CBG-Q as a PPAR agonist in mesenchymal cells of the spinal cord. CBG-Q does not inhibit osteoblast differentiation.
  • the cells were packed at 500 cells / cm 2 in P6 plates (TPP, Trasadingen, Switzerland) containing ⁇ - ⁇ medium with 10% FBS.
  • the medium was supplemented with 10 "8 M dexamethasone, 0.2 mM ascorbic acid and 10 mM? -Glycerol phosphate to induce differentiation to osteoblasts, and 5 x 10 " 7 M of dexamethasone, 0.5 mM isobutylmethylxanthine and 50 mM indomethacin to induce adipocyte differentiation. All inductors were from Sigma-Aldrich.
  • the MSCs (mesenchymal stem cells) were cultured in an osteogenic or adipogenic medium for 21 days, together with the corresponding control (in the absence of differentiation inducers). Cell samples were collected on day 13. As they were shown in Figure 7, the effect of CBG and CBG-Q on adipocyte gene expression (PPARg2 and LPL) ( Figure 7B) and osteoblast gene expression (RUNX2 and ALP) ( Figure 7A) were evaluated. Nuclear ribosomal DNA expression values were used to normalize the values obtained. Adipocytes and osteoblasts were obtained by differentiation of mesenchymal stem cells grown in specific differentiation culture media of adipogenesis or osteoblastogenesis.
  • Bone forming osteoblasts and fat forming adipocytes are derived from mesenchymal stem cells (MSCs).
  • MSCs mesenchymal stem cells
  • An increase in the activity of PPAEg due to treatment with the antidiabetic drug thiazolitinedione (TZD) rosiglitazone results in a reduced number of osteoblasts and a greater number of adipocytes.
  • TGD thiazolitinedione
  • Example 7 MTT cytotoxicity test (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide).
  • Table 2 shows the IC 50 values of the MTT cytotoxicity assay (3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) in several cell lines after 24 hours of treatment with CBD, CBD -Q, CBG and CBG-Q.
  • MTT 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) bromide - 2,5-diphenyltetrazolium, a tetrazole
  • CBG-Q showed a similar cytotoxic effect compared to CBG and reduced values compared to CBD and CBD-Q. The greatest cytotoxic effect was observed with CBD-Q.
  • Cell lines are derived from: AGS, human gastric adenocarcinoma; HCT116, human colon carcinoma; HeLa, human cervix carcinoma; MDA, human breast cancer; T47D, human breast adenocarcinoma; 3T3-L1, mouse embryocyte fibroblasts committed to differentiate into adipocytes.
  • Table 3 shows the IC 50 values of the MTT cytotoxicity assay (3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide, a tetrazole) in several cell lines after 24 hours of treatment with CBD-Q derivatives.
  • MTT 3- (4,5-Dimethyltiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide
  • all CBG-Q derivatives showed a reduced cytotoxic effect compared to CBD-Q.
  • Cell lines are derived from: AGS, human gastric adenocarcinoma; HCT1 16, human colon carcinoma; HeLa, human cervix carcinoma; MDA, human breast cancer; T47D, human breast adenocarcinoma; 3T3-L1, mouse embryocyte fibroblasts committed to differentiate into adipocytes.
  • AGS human gastric adenocarcinoma
  • HCT1 human colon carcinoma
  • HeLa human cervix carcinoma
  • MDA human breast cancer
  • T47D human breast adenocarcinoma
  • 3T3-L1 mouse embryocyte fibroblasts committed to differentiate into adipocytes.
  • Luciferase activity in cell lysate was measured using the TriStar LB 941 multimode microplate reader (Berthold) and following the instructions of the luciferase assay kit (Promega, Madison, Wl, USA). Protein concentration was measured by the Bradford assay (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Previous results obtained with the lysis buffer were subtracted from each experimental value and specific transactivation was expressed as the level of induction on untreated cells. All experiments were repeated at least three times.
  • the plasmids used were Gal4-hPPARgamma (name of the plasmid: pCMV-BD-hPPARg, manufactured at Sinal Laboratory, Dept.
  • FIG. 3 shows the effect of CBD and CBD-Q (Figure 3A) or CBG and CBG-Q ( Figure 3B), on the activity of PPARg, by means of a transactivation test led to out in 293T cells that transiently overexpress PPARg in combination with a luciferase reporter gene (PPARg-GAL4 / GAL4-LUC) and treated with cannabinoids for 6 hours.
  • the data are shown as average, indicating the standard deviation by bars, of the three replicas.
  • Figure 8A shows a transactivation assay performed on 293T cells that transiently overexpress PPARg in combination with a luciferase reporter gene (PPARg-GAL4 / GAL4-LUC) and treated with cannabinoids for 6 hours. The data are shown as average, indicating the standard deviation by bars, of the three replicas. Compared to untreated cells (indicated with the value 1 as a reference), a significant increase in luciferase activity was observed with CBD-Q derivatives compared to CBD-Q.
  • PPARg-GAL4 / GAL4-LUC luciferase reporter gene
  • FIG. 8B also illustrates a PPARg binding assay that demonstrates that CBD-Q derivatives displaced the Fluormone TM PPAR Green fluorescent ligand from the PPAR-LBD / Fluormone TM PPAR Green complex, resulting in a reduction of the polarization value. This result indicates that the chemical modifications of CBD-Q maintained, or even increased (FM-CBD-Q) affinity for PPARg.
  • Example 9 Total quantification of triglycerides.
  • CBD-Q derivatives were found to stimulate differentiation of fibroblasts to adipocytes in a more potent way than CBD and CBD-Q, and without the cytotoxic effect observed for CBD-Q at a concentration greater than 1 ⁇ (note that the bar is absent).
  • Example 10 Real-time quantitative PCR and PCR used in the invention (examples 4 and 6).
  • the PCR reaction consisted of 25 ⁇ of a mixture containing: 1 x PCR buffer, 1.5 mM MgCl 2 , 0.2 mM dNTPs, 0.2 ⁇ of each sequence specific primer, 1 ⁇ c of transcribed cDNA and 0.5 U of Taq polymerase (Biotools).
  • a Bio-Rad iCycler ⁇ Q Real Time PCR and ⁇ Q SYBR TM Green Supermix instrument Bio-Rad, Richmond, CA, USA
  • the amplification was carried out in a final volume of 50 pl with 1 pl of cDNA, 25 ⁇ of 2x SYBR Green Supermix (100 mM CI, 40 mM Tris-HCI at pH 8.4, 0.4 mM dNTP each, 50u / ml Taq polymerase, 6 mM MgCl 2 , SYBR Green I, and 20 nM fluorescein) and 2 ⁇ of 2 ⁇ primers.
  • the specific sequences of the primers are shown in Table 4.
  • the thermal cycling conditions were: 94 ° C for 2 min, followed by 35 cycles at 94 ° C for 15 s, 60 ° C for 30 s, and 72 ° C for 1 min.
  • a final extension step at 72 ° C for 5 years was also included.
  • a melt program [70 ° C, 10 s (+ 0.5 ° C x 60)] was included.
  • the amplified products were further analyzed by 1.8% agarose gel electrophoresis containing 0.5 ug / ml ethidium bromide. Relative expression values were calculated according to Pedersen (2001).
  • PPAR-gamma a nuclear receptor with af inity for cannabinoids.

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Abstract

Derivados quinona de cannabinoides. La presente invención hace referencia a derivados quinona de cannabinoides para ser usados como medicamentos, particularmente, como agonistas de PPARg para tratar enfermedades cuya etiología está basada en una función alterada del PPARg como factor de transcripción, es decir, enfermedades relacionadas con PPARg.

Description

DERIVADOS QUINONA DE CANNABINOIDES
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención hace referencia a derivados quinona de cannabinoides para ser usados como medicamentos, particularmente como agonistas del Receptor gamma activado por Proliferador de Peroxisoma (PPARg), para tratar enfermedades cuya etiología está basada en una función alterada del PPARg como factor de transcripción, es decir, enfermedades relacionadas con PPARg.
Debido a la expresión casi ubicua del PPARg en diferentes tejidos, la presente invención puede ser englobada en el campo médico, en general, y más específicamente, en aquel campo de la medicina relacionado con el tratamiento de enfermedades, que comparten la etiología arriba mencionada, llevando a cabo un efecto agonista sobre PPARg.
ESTADO DE LA TÉCNICA
PPARg es un miembro de la subfamilia PPAR de receptores hormonales nucleares que son factores de transcripción inducibles por ligando. Los PPAR forman heterodímeros con su obligada pareja el receptor X retinoide (RXR). Todos los isotipos PPAR tienen una organización de dominios similar: el dominio N-terminal A/B contiene un factor de activación 1 de la transcripción independiente de ligando putativo (AF1 ). El dominio C de unión a ADN, compuesto de dos dedos de zinc, se une al elemento de respuesta proliferador de peroxisoma (PPRE) en la región reguladora de los genes diana de PPAR. El dominio D es una región bisagra que confiere flexibilidad entre el dominio C y el dominio E (dominio de unión de ligando o LBD) que contiene el factor de activación 2 de la transcripción dependiente de ligando (AF-2). La actividad transcripcional de los PPAR es regulada no sólo por sus lígandos, sino también por modificaciones post-traduccionales, tales como la fosforilación.
PPARg se expresa en un rango de tejidos que incluye células del músculo esquelético, osteoclastos, osteoblastos, varios tipos de células inmunes, y en el cerebro y sistema nervioso periférico. El tejido adiposo exhibe los mayores niveles de expresión de PPARg en el cuerpo humano. PPARg es de especial interés porque está implicado en la regulación de la formación de adipocitos, en la sensibilidad a insulina y en la inflamación (Fievet et al. 2006; Stienstra et al. 2007; Tontonoz y Spiegelman, 2008). Está claro que PPARg es el regulador dominante o "master" de la adipogénesis, debido al hecho de que es suficiente y necesario para la diferenciación de las células lipídicas. Las regiones reguladoras de un gran número de genes que realizan importantes funciones en la lipogénesis y sensibilidad a insulina contienen lugares de unión para PPARg, incluyendo aP2, LPL, adiponectina, y Glut4 (Rosen and MacDougald, 2006).
Por otro lado, la activación de PPARs ejerce una función antiinflamatoria en varios tipos de células mediante la inhibición de la expresión de genes pro-inflamatorios, reduciendo así la producción de citoquinas, metaloproteasas y proteínas de fase aguda. También actúa aumentando las citoquinas anti-inflamatorias, e inhibiendo la expresión de la óxido nítrico sintasa inducible (¡NOS) (ver Széles et al., 2007 para una reciente revisión). Los PPARs regulan negativamente la transcripción de genes de respuesta inflamatoria mediante una función antagonista en las rutas de señalización de AP-1 , del factor nuclear kappaB (NF-KB), del transductor de señal y activador de transcripción (STAT) y del factor nuclear de células T activadas (NFAT) (Vanden Berghe et al. 2003). Es de destacar que los PPARs también estimulan el catabolismo de eicosanoides pro-inflamatorios (Delerive et al. 2001 ).
PPARg ha sido reconocido por jugar un papel fundamental en la respuesta inmune a través de su habilidad para inhibir la expresión de citoquinas inflamatorias y dirigir la diferenciación de células inmunes hacia fenotipos antiinflamatorios (Tontonoz y Spiegelman, 2008).
Los efectos antiinflamatorios de PPARg están íntimamente ligados a su efecto antidiabético. La activación por ligando de PPARg en adipocitos está asociada con la disminución de la producción de proteínas llamadas adipoquinas (TNFCT, IL-6, resistina, etc.) que se cree que causan resistencia a insulina. Por lo tanto, la activación de PPARg en tejido adiposo impacta sobre la sensibilidad a insulina en todo el cuerpo, mediante la alteración de la producción de adipoquinas. Esta es la razón por la cual activadores de PPARg tales como los tiazolidinediones (TZDs, por ejemplo, rosiglitazona, piaglitazona) son usados clínicamente en el tratamiento de la diabetes tipo 2 (Lehmann et al., 1995). Adicionalmente, los agonistas de PPARg se ha demostrado que tienen efectos cardiovasculares positivos, los cuales incluyen una disponibilidad aumentada de óxido nítrico, reducción en la presión sanguínea y atenuación de la aterosclerosis (Bishop-Bailey, 2000; Hsueh y Bruemmer, 2004).
Por lo tanto, los agonistas de PPARg son un tratamiento adecuado para un grupo de anormalidades metabólicas, llamadas en general síndrome metabólico, que incluyen presión sanguínea elevada, nivel de triglicéridos elevado, bajo nivel de lipoproteína de alta densidad (colesterol HDL), obesidad abdominal, inflamación, resistencia a insulina, y elevada glucosa en sangre (Lottenberg et al., 2007; Murphy y Holder, 2000). El síndrome metabólico tiene como causa principal la resistencia a insulina, que es secundaria al exceso abdominal o visceral de tejido adiposo.
Es interesante destacar que los agonistas de PPARg han demostrado efectos antiinflamatorios y neuroprotectores en varios modelos experimentales de la enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple y apoplejía, así como en algunos estudios clínicos (Bernardo y Minghetti, 2008).
Adicionalmente, PPARg debe considerarse formalmente un gen supresor de tumores en el ámbito genético. Se expresa en varias células tumorales, y la activación de PPARg mediante ligando se dirige tanto a la inhibición de la proliferación celular como a la inducción de apoptosis (Tachibana et al., 2008; Tontonoz y Spiegelman, 2008).
Los efectos beneficiosos de la activación de PPARg pueden ser usados para el tratamiento de varias enfermedades, tal y como se muestra en la Tabla 1. Esta tabla resume la actividad de los PPARs en enfermedades inflamatorias. Abreviaturas: J, inhibición, † estimulación, células hepáticas estrelladas (HSC), células de músculo liso vascular (VSMC), proteína 1 quimiotáctica de monocitos (MCP-1 ), T-helper (Th), factor de necrosis tumoral a (TNFa), ciclooxigenasa (COX), ¡nterferón-gamma (INFy), óxido nítrico sintasa ¡nducible (¡NOS), molécula de adhesión intracelular-1 (ICAM-1 ). Adaptado de Kostadinova et al., 2005. Tabla 1
Enfermedad Efecto de PPARg y sus ligandos
¿Recuento de células inmunes
Aterosclerosis
¿Migración y proliferación de VSMC.
¿IL-1 ?-inducida, IL-8 y MCP-1 en células epiteliales del colon.
Enfermedad inflamatoria
Modulación de la respuesta inflamatoria: ¿Th1 y†Th2. intestinal
Mejora de la colitis en modelos de ratones.
Mejora de la colitis en 4/15 pacientes.
† Apoptosis de sinoviocitos y condrocitos.
Artritis reumatoide ¿TNFa, IL-1/? y COX-2 en sinoviocitos reumatoides.
Mejora de la artritis en modelos de ratones.
¿activación de las HSC.
Fibrosis hepática
¿activación de las células de Kupffer.
¿IL-1j_?, MCP-1 , COX-2, ¡NOS, la proliferación y † apoptosis de las células mesangiales.
Nefropatía
Mejora la micro-albuminuria en pacientes con diabetes tipo 2 y ratas diabéticas.
Psoriasis y cicatrización Mejora las lesiones de psoriasis en modelos de ratón y de heridas de la piel pacientes.
¿COX-2, ICAM-1 y la producción de IL-6 en páncreas.
Pancreatitis ¿Activación de células inmunes.
¿Desarrollo de pancreatitis crónica en modelos de ratón.
¿TNFo, ¡NOS, IL-1/?, COX-2 y apoptosis en la mucosa
Gastritis gástrica.
Mejora de gastritis en ratones modelo.
¿¡NOS, TNFo, IL-1/?, IL-6, INFy, MCP-1 y COX-2 en
Desórdenes
astrocitos y microglía.
neurodegenerativos
¿Apoptosis neuronal.
†Apoptosis y ¿ proliferación de células cancerígenas.
Cáncer ¿Cáncer de colon asociado a colitis en modelos de ratones. Se reconoce de forma general que hay varios efectos secundarios asociados con los ligandos de PPARg, incluyendo ganancia de peso, edema y aumento de lipoproteínas del plasma (Gelman et al., 2007). Se están investigando actualmente nuevos agonistas de PPARg que no posean estos efectos secundarios, y se supone que los agonistas de afinidad parcial o baja pueden ser beneficiosos (Gelman et al., 2007).
La unión directa de cannabinoides a PPARs ha sido demostrada en varios estudios a través de ensayos de genes reporteros o ensayos de adipogénesis en células 3T3-L1. Estos incluyen oleiletanolamida (Fu et al., 2003), ácido ajulémico (Liu et al., 2003; Burstein, 2005), 2-araquidonoilglicerol (Burstein, 2005), anandamida (Bouaboula et al., 2005), WIN55212-2, noladín éter y virodamina (Sun et al., 2007), A9-THC (O'Sullivan et al., 2005), y CBD (O'Sullivan et al., 2009). Se ha descrito que alguno de ellos interaccionan con el dominio LBD de PPARg (Liu et al. 2003; O'Sullivan et al., 2009). Sin embargo, la activación de PPAR no es común a todos los cannabinoides (LoVerme et al., 2006; Bouaboula et al., 2005; Fu et al., 2003). La activación de PPAR mediante cannabinoides ha sido sugerida en algunas revisiones (O'Sullivan y Kendall, 2009; Burstein, 2005; O'Sullivan, 2007; Sun y Bennett, 2007). Sin embargo, los derivados quinona de cannabinoides no han sido nunca descritos por su actividad PPARg.
Como se muestra en los ejemplos comparativos llevados a cabo en la presente invención, desafortunadamente muchos de esos agonistas PPARg conocidos, particularmente algunos derivados de cannabinoides, exhiben una baja eficiencia de unión a PPARg y por lo tanto, un reducido efecto agonista sobre PPARg. Además, aún peor, algunos de ellos muestran una elevada toxicidad en varios tipos celulares (citotoxicidad).
Por lo tanto, teniendo en cuenta la disposición ubicua de PPARg en los tejidos, y consecuentemente la elevada cantidad de enfermedades con PPARg que existen, sería de gran importancia y ayuda el desarrollo de agonistas de PPARg sintéticos, con una mayor eficiencia de unión a PPARg en comparación con los agonistas de PPARg conocidos y consecuentemente, siendo capaces de llevar a cabo un mayor efecto agonista sobre PPARg, tanto in vitro como in vivo, para mejorar la condición de pacientes que sufren de enfermedades relacionadas con PPARg. Además, sería deseable que esos agonistas de PPARg exhibieran baja toxicidad en células (baja citotoxicidad). La presente invención da un nuevo paso adelante hacia la solución del problema anteriormente mencionado, desarrollando nuevos compuestos adecuados para el tratamiento de enfermedades relacionadas con PPARg debido a su elevado efecto agonista de PPARg y baja citotoxicidad.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se focaliza en la formulación de derivados de cannabinoides, particularmente derivados quinona (Q) de cannabinoides, sintetizados partiendo de cannabinoides naturales tales como CBD (cannabidiol) y CBG (cannabigerol), por medio de la sustitución de algunos radicales específicos.
Los compuestos de la presente invención son derivados quinona (Q) de cannabinoides de Fórmula (I):
Figure imgf000007_0001
(i)
donde
R1 significa un grupo hidrógeno, hidroxilo, metil o aldehido,
R2 significa un derivado ciclohexeno o un compuesto alifático, preferentemente un alqueno,
y R3 significa un grupo hidroxilo o metiloxi,
exceptuando el compuesto de Fórmul (II)
Figure imgf000007_0002
(II) En un aspecto preferido, los compuestos de la invención son aquellos de Fórmula (III), (IV), (V) y (VI):
Figure imgf000008_0001
(III)
H¡droxi-CBD-Q (H-CBD-Q)
Figure imgf000008_0002
(IV)
Metil-CBD-Q (M-CBD-Q)
Figure imgf000008_0003
(V)
Formil-Metoxi-CBD-Q (FM-CBD-Q)
Figure imgf000008_0004
(VI)
CBG-Q
Tal y como será inferido más abajo de los ejemplos y figuras, el grupo quinona (Q) comprendido en la Fórmula (I) general confiere a los compuestos de la presente invención la capacidad de unirse directamente a PPARg, siendo dichos compuestos buenos candidatos como agonistas de PPARg. Además, la presente invención también demuestra que dicha capacidad de unión directa a PPARg es aún más eficiente cuando los compuestos tienen una fórmula que comprende dicho grupo quinona en combinación con los radicales R1 , R2 y R3 arriba citados, demostrando además dichos compuestos un valorable bajo nivel de citotoxicidad en varias líneas celulares en comparación con los compuestos comprendidos en el estado de la técnica.
Tal y como se muestra en las Figuras 1 y 2, los compuestos de la invención, particularmente CBG-Q, se unen directamente a PPARg teniendo un valor IC50 de 2,2 y, por lo tanto, más bajo que el valor IC50 de los compuestos conocidos CBD-Q y CBN. Esta conclusión mostrada en las Figuras 1 y 2 es ratificada además por la Figura 3, al mostrar que CBG-Q es capaz de inducir la activación de PPARg con mayor eficiencia que CBG (Figura 3B) y además, que CBD y CBD-Q (Figura 3A). La estimulación de la diferenciación de fibroblastos a adipocitos es una propiedad bien conocida de los ligandos de PPARg y esta función se llevó claramente a cabo por CBG-Q, el cual, tal y como se muestra en la Figura 4, fue capaz de estimular la diferenciación de fibroblastos a adipocitos de una forma más fuerte que CBG.
Además, tal y como se muestra en la Figura 8A, los derivados de CBD-Q de la invención (M-CBD-Q, H-CBD-Q y FM-CBD-Q) son capaces de inducir la activación de PPARg con mayor eficiencia que CBD-Q, mostrando FM-CBD-Q el mayor valor de activación de PPARg. Adicionalmente, la Figura 8B confirma que las modificaciones químicas introducidas en CBD-Q (M-CBD-Q, H-CBD-Q y FM-CBD- Q) mantuvieron o, en el caso de FM-CBD-Q incluso aumentaron, la afinidad por PPARg. Estos resultados se confirmaron en cultivos celulares, examinando la habilidad para estimular la diferenciación a células lipídicas en fibroblastos 3T3-L1 , mostrando que los derivados CBD-Q (M-CBD-Q, H-CBD-Q y FM-CBD-Q), particularmente FM-CBD-Q, estimularon la diferenciación de fibroblastos a adipocitos de una forma más potente que CBD y CBD-Q, y sin el efecto citotóxico observado para CBD-Q (ver Ejemplo 7) a concentraciones mayores de 1 μΜ (Figura 8C).
Todos los datos inferidos de las Figuras 1 a 4 y 8 muestran que M-CBD-Q, H-CBD- Q y FM-CBD-Q y CBG-Q son ligandos de PPARg capaces de unirse a PPARg incrementando su actividad transcripcional de una forma más eficiente en comparación con compuestos conocidos (CBD-Q y CBN). Por lo tanto, los compuestos de la invención pueden ser usados como agonistas PPARg para el tratamiento de enfermedades cuya etiología se basa en una función desregulada del PPARg como factor de transcripción (enfermedades relacionadas con PPARg) tales como, por ejemplo, enfermedades metabólicas (hipertensión, hipertrigliceridemia, hipercolesterolemia (HDL-C), obesidad), enfermedades inflamatorias (ver Tabla 1 ) (aterosclerosis, enfermedad inflamatoria del colon, artritis reumatoide, fibrosis hepática, neuropatía, psoriasis, cicatrización de heridas de la piel, regeneración de la piel, pancreatitis, gastritis, desórdenes neurodegenerativos y cáncer), diabetes tipo 2 (resistencia a insulina) o elevada glucosa en sangre.
Tal y como se muestra en la Figura 5, CBG y CBG-Q tienen efectos positivos como compuestos antiinflamatorios en tejido adiposo y, por lo tanto, son adecuados como agonistas de PPARg para el tratamiento de la diabetes tipo 2 por medio del descenso de la resistencia a insulina. Además, tal y como se elucida en la Figura 6, ambos compuestos CBG y CBG-Q fueron capaces de incrementar la absorción de glucosa tanto en presencia como en ausencia de insulina, pero mostrando CBG-Q un mayor efecto que CBG en ausencia de insulina. Entonces, aunque ambos compuestos CBG y CBG-Q son adecuados como agonistas de PPARg para el tratamiento de la diabetes tipo 2 mediante el descenso de la resistencia a insulina, CBG-Q es particularmente preferido porque puede ser usado para el tratamiento de la diabetes tipo 2 por medio del descenso de la resistencia a insulina a través de la reducción de las condiciones pro-inflamatorias en tejido adiposo y, además, a través del incremento en la absorción de glucosa, incluso en ausencia de insulina, sin tener el efecto adicional observado en el desarrollo de osteoporosis cuando se emplean compuestos conocidos tales como TZD rosiglitazona (Figura 7). Además, se confirmó que FM-CBD-Q era capaz de incrementar la absorción de glucosa en presencia de insulina.
Por lo tanto, los compuestos de la invención son particularmente adecuados como agonistas de PPARg, particularmente para el tratamiento de enfermedades inflamatorias (ver la Tabla 1 del estado de la técnica), enfermedades metabólicas y diabetes tipo 2.
Aunque todos los compuestos de la invención mostraron buenas propiedades como agonistas PPARg, y por lo tanto, ninguno de ellos debería ser descartado, CBG-Q y FM-CBD-Q son particularmente preferidos debido a su incremento en la actividad PPARg tanto in vivo como in vitro, y también por su efecto mejorado en la sensibilidad a insulina, y también por su baja citotoxicidad.
Los compuestos de la invención también comprenden sus derivados, análogos, formas tautoméricas, esteroisómeros, polimorfos, análogos metabólicos, sales farmacéuticamente aceptables, solvatos farmacéuticamente aceptables, y composiciones que contengan a los mismos.
Así, los compuestos de la invención pueden ser usados solos o formulados en composiciones, particularmente composiciones farmacéuticas, junto con otros principios activos (otros derivados cannabinoides) o excipientes tales como: co- solventes, surfactantes, aceites, humectantes, emolientes, conservantes, estabilizantes, y antioxidantes. Cualquier tampón farmacéuticamente aceptable puede ser usado, por ejemplo, Tris o tampones fosfato.
Las composiciones típicas incluyen los compuestos de la invención, o derivados de los mismos, asociados con excipientes farmacéuticamente aceptables que pueden ser un transportador o un diluyente. Tales composiciones pueden estar en forma de cápsula, sobre, papel u otro envoltorio. Para la fabricación de las composiciones pueden usarse técnicas convencionales para la preparación de composiciones farmacéuticas. Por ejemplo, el compuesto de interés será normalmente mezclado con un excipiente o diluido por un excipiente, o incluido en un excipiente que puede estar en forma de ampolla, cápsula, sobre, papel, u otro envoltorio. Cuando el excipiente sirve como diluyente, éste puede ser un material sólido, semi-sólido, o líquido que actúa como vehículo, excipiente o medio para el compuesto activo. El compuesto de interés puede ser absorbido en un envoltorio granular sólido, por ejemplo, en un sobre. Algunos ejemplos de excipientes apropiados son agua, soluciones salinas, alcoholes, polietilenglicoles, aceite de ricino polihidroxietoxilado, aceite de cacahuete, aceite de oliva, lactosa, térra alba, sacarosa, ciclodextrina, amilosa, estearato magnésico, talco, gelatina, agar, pectina, acacia, ácido esteárico o ésteres de celulosa de alquil inferior, ácido silícico, ácidos grasos, aminas de ácidos grasos, monoglicéridos y diglicéridos de ácidos grasos, pentaeritritol, ésteres de ácidos grasos, polioxietileno, hidroximetilcelulosa, y polivinilpirrolidona. De forma similar, el excipiente o diluyente puede incluir cualquier material de liberación conocido en el estado de la técnica, tal como glicerilmonoestearato o glicerildiestearato, solo o mezclado con cera. Las formulaciones pueden además incluir agentes humectantes, emulsificantes y agentes de suspensión, agentes conservantes, agentes edulcorantes o agentes saborizantes. Las formulaciones de la invención pueden ser formuladas para proporcionar una liberación rápida, mantenida o retardada del ingrediente activo después de la administración al paciente mediante el empleo de procedimientos bien conocidos en el estado de la técnica.
Las composiciones farmacéuticas pueden ser esterilizadas y mezcladas, si se desea, con agentes auxiliares, emulsificantes, sales influyentes en la presión osmótica, tampones y/o sustancias colorantes y similares, que no reaccionen de forma deletérea con los compuestos activos
La vía de administración puede ser cualquier vía que transporte eficientemente el compuesto de interés al sitio de acción deseado o apropiado, tal como oral, nasal, pulmonar, transdérmica o parenteral, por ejemplo, rectal, subcutánea, intravenosa, intrauretral, intramuscular, intranasal, como solución oftálmica o como pomada.
Para la administración nasal, la preparación puede contener el compuesto de interés disuelto o suspendido en un excipiente líquido, en particular un excipiente acuoso, para la aplicación como aerosol. El excipiente puede contener aditivos, tales como agentes solubilizantes, por ejemplo, propilénglicol, surfactantes, potenciadores de la absorción tales como lecitina (fosfatidilcolina) o ciclodextrina, o conservantes tales como parebenos.
Como se conoce en el estado de la técnica, para la preparación de formulaciones tópicas, el compuesto de interés se sitúa en un vehículo dermatológico. La cantidad del compuesto de interés a ser administrada y la concentración del compuesto en la formulación tópica depende del vehículo, sistema de liberación o instrumento seleccionado, la condición clínica del paciente, los efectos secundarios y la estabilidad del compuesto en la formulación. Entonces, el especialista emplea la preparación apropiada que contiene una concentración adecuada del compuesto de interés y selecciona la cantidad de formulación administrada, dependiendo de la experiencia clínica del paciente en cuestión o con pacientes similares.
Para la aplicación oftálmica, el compuesto de interés es formulado en soluciones, suspensiones, y pomadas apropiadas para su uso en el ojo. Las concentraciones son normalmente las explicadas más arriba para preparaciones locales.
Para la administración oral, pueden prepararse formas de una única dosis sólidas o fluidas. Para la preparación de composiciones sólidas, tales como pastillas, el compuesto de interés se mezcla en formulaciones con ingredientes convencionales, tales como talco, estearato magnésico, fosfato bicálcico, silicato de aluminio- magnesio, sulfato cálcico, almidón, lactosa, acacia, metil-celulosa, y materiales similares que funcionen como diluyentes o excipientes farmacéuticos.
Las cápsulas se preparan mezclando el compuesto de interés con un diluyente farmacéutico inerte y llenando con la mezcla una cápsula de gelatina dura de tamaño apropiado. Las cápsulas de gelatina blanda se preparan mediante la encapsulación en una máquina de una mezcla del compuesto de interés con un aceite vegetal aceptable, parafina líquida ligera u otro aceite inerte. Pueden prepararse formas fluidas de una única dosis para la administración oral, tales como siropes, elixires y suspensiones. Las formas solubles en agua se pueden disolver en vehículos acuosos con azúcar, agentes aromáticos saborizantes y conservantes para formar un sirope. Un elixir se prepara mediante el uso de un vehículo hidro- alcohólico (por ejemplo, etanol) con edulcorantes apropiados tales como azúcar o sacarina, junto con un agente aromático saborizante. Las suspensiones se pueden preparar con un vehículo acuoso, con la ayuda de un agente para la suspensión tal como acacia, tragacanto, metil-celulosa, y similares.
Las formulaciones apropiadas para uso parenteral son conocidas para el experto medio en la materia, tales como el uso de soluciones o suspensiones apropiadas para su inyección. La formulación, que es estéril, es apropiada para varias vías de administración tópicas o parenterales, que incluyen la vía intradérmica, la intramuscular, la intravascular y la subcutánea.
Además del compuesto de interés, las composiciones pueden incluir, dependiendo de la formulación y la vía de administración deseada, diluyentes o excipientes no tóxicos, farmacéuticamente aceptables, que incluyen vehículos comúnmente usados para formar composiciones farmacéuticas para la administración en animales o humanos. El diluyente se selecciona de forma que no afecte en forma alguna a la actividad biológica de la combinación.
Ejemplos de dichos diluyentes que son especialmente útiles para formulaciones inyectables son el agua, varias soluciones salinas, de sales orgánicas o inorgánicas, solución de Ringer, solución de dextrosa, y solución de Hank. Adicionalmente, la composición o formulación farmacéutica puede incluir aditivos tales como otros excipientes, adyuvantes o estabilizantes no tóxicos, no terapéuticos y no inmunogénicos y similares. Además, se pueden incluir en la formulación los excipientes. Los ejemplos de excipientes incluyen cosolventes, surfactantes, aceites, humectantes, emolientes, conservantes, estabilizantes y antioxidantes. Se puede usar cualquier tampón farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, Tris o tampones fosfato. La cantidad efectiva de diluyentes, aditivos, y excipientes es aquella cantidad que es efectiva para obtener formulaciones farmacéuticamente aceptables en términos de solubilidad, actividad biológica, etc.
El compuesto de interés puede incorporarse en una microsfera. El compuesto de interés puede cargarse en microsferas de albúmina, de forma que es posible recuperar dichas microsferas en un polvo desecado para su administración nasal. Otros materiales adecuados para la preparación de microsferas incluyen agar, alginato, quitosano, almidón, almidón hidroxietii, albúmina, agarosa, dextrano, ácido hiaiurónico, gelatina, colágeno y caseína. Las microsferas se pueden producir mediante varios procesos conocidos para el experto medio en la materia, tales como el proceso de secado por spray o el proceso de emulsificación.
Por ejemplo, las microsferas de albúmina se pueden preparar mediante la adición de albúmina sérica de conejo en tampón fosfato a aceite de oliva mediante agitación para producir agua en emulsión de aceite. Una solución de glutaraldehído se añade entonces a la emulsión y la emulsión se agita para aglutinar la albúmina. Las microsferas se pueden entonces aislar mediante centrifugación, siendo el aceite eliminado y las esferas lavadas, por ejemplo, con éter de petróleo seguido de etanol. Finalmente, las microsferas pueden cribarse, recogerse y secarse mediante filtración.
Las microsferas de almidón se pueden preparar mediante la adición de una solución de almidón en agua caliente, por ejemplo, de almidón de patata, a una solución caliente de polietilénglicol en agua mediante agitación para formar una emulsión. Cuando el sistema de dos fases se ha formado (con la solución de almidón en la fase interna), la mezcla se enfría entonces a temperatura ambiente bajo agitación continua con lo cual la fase interna se convierte en partículas de gel. Estas partículas se filtran entonces a temperatura ambiente y se mezclan en un solvente como el etanol, después del cual las partículas se filtran de nuevo y se dejan al aire hasta que se enfrían.
Las microsferas pueden ser endurecidas mediante procedimientos de aglutinación bien conocidos, tales como el tratamiento por calor, o mediante el uso de agentes aglutinantes químicos. Agentes adecuados incluyen dialdehídos, incluyendo glioxal, malondialdehído, succinicaldehído, adipaldehído, glutaraldehído y ftalaldehído, diquetonas, tales como butadiona, epiclorohidrín, polifosfato y borato. Los dialdehídos se usan para aglutinar proteínas tales como la albúmina, mediante la interacción con grupos amino, y las diquetonas forman bases de Schiff con grupos amino. El epiclorohidrín activa compuestos con nucleófilos tales como amino o hidroxilo, a un derivado epoxi.
El término "forma de una única dosis" hace referencia a unidades físicamente diferenciadas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos, por ejemplo, sujetos mamíferos, por ejemplo, humanos, perros, gatos, y roedores, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de un material activo calculado para producir el efecto farmacéutico deseado en asociación con el diluyente, excipiente o vehículo farmacéutico requerido. La descripción para las formas de una única dosis de la invención se dictan por y dependen de (a) las características propias del material activo y el efecto particular a conseguir y (b) las limitaciones inherentes en el estado de la técnica para componer dicho material activo para su uso en humanos y animales. Ejemplos de formas de una única dosis son pastillas, cápsulas, pildoras, sobres de polvos, obleas, supositorios, granulados, pildoras recubiertas, cucharaditas, cucharadas, cuentagotas, ampollas, viales, aerosoles con descarga controlada, y otros provenientes de cualquiera de los anteriores, y otras formas como las aquí descritas. Las composiciones se pueden incluir en kits, que pueden contener una o más formas de una única dosis de la composición e instrucciones para su uso para tratar una o más de las enfermedades aquí descritas.
Los sistemas de administración lenta y prolongada, incluyendo cualquiera de una serie de biopolímeros (sistemas de base biológica), sistemas que emplean liposomas, coloides, resinas, y otros sistemas de administración con polímeros o reservónos compartimentalizados se pueden usar con las composiciones aquí descritas para proporcionar una fuente continua o a largo plazo del compuesto terapéutico. Dicho sistema de liberación lenta se aplica a formulaciones para ser administradas por vía tópica, intraocular, oral y parenteral.
En el tratamiento se emplea una cantidad efectiva del compuesto de interés. La dosis de los compuestos utilizados de acuerdo con la invención varía en función del compuesto y de la afección a tratar, por ejemplo, según la edad, peso y la situación clínica del paciente receptor. Otros factores incluyen: la vía de administración, el paciente, el historial médico del paciente, la gravedad de la enfermedad, y la potencia del compuesto en particular. La dosis debe ser suficiente para disminuir los síntomas o signos de la enfermedad tratada sin producir una toxicidad inaceptable al paciente. En general, la cantidad efectiva del compuesto es aquella que proporciona un alivio subjetivo de los síntomas o una mejora objetivamente identificable detectada por el clínico u otro observador cualificado.
Los compuestos de la invención pueden además administrarse oralmente en combinación con compuestos naturales o sintéticos que se unen a o modifican la actividad del receptor de la vitamina D, o en combinación con compuestos que se unen a o modifican la actividad del receptor X retinoide para proporcionar un efecto sinérgico en el tratamiento o prevención de las enfermedades. Ejemplos de estos compuestos que proporcionan un efecto sinérgico cuando se administran en combinación con los fármacos comprendidos en la presente invención, incluyen análogos de la vitamina D, varios derivados del ácido retinoico y otros activadores del receptor X retinoide o receptores del ácido retinoico que incluyen, pero no se limitan, a compuestos tales como LG100268, tazaroteno, TTNPPB, AGN190121 , adapaleno, orLGD1069 (Targretín).
Por lo tanto, la presente invención hace referencia a compuestos de Fórmula (I) o derivados de la misma:
Figure imgf000016_0001
donde
R1 significa un grupo hidrógeno, hidroxilo, metil o aldehido,
R2 significa un derivado ciclohexeno o un compuesto alifático, preferentemente un alqueno,
y R3 significa un grupo hidroxilo o metiloxi,
exceptuando el compuesto de Fórmula (II)
Figure imgf000017_0001
(II)
En un aspecto preferido, los compuestos de la invención son aquellos de Fórmula (III), (IV), (V) y (VI):
Figure imgf000017_0002
(III)
H¡drox¡-CBD-Q H-CBD-Q)
Figure imgf000017_0003
(VI)
CBG-Q El segundo aspecto de la presente invención hace referencia al uso de los compuestos de Fórmula (I) como medicamentos, particularmente como agonistas de PPARg en el tratamiento de enfermedades relacionadas con PPARg, seleccionadas entre enfermedades inflamatorias (por ejemplo: aterosclerosis, enfermedad inflamatoria del colon, artritis reumatoide, fibrosis hepática, neuropatía, psoriasis, cicatrización de heridas de la piel, regeneración de la piel, pancreatitis, gastritis, desórdenes neurodegenerativos o cáncer), enfermedades metabólicas (hipertensión, hipertrigliceridemia, hipercolesterolemia (HDL-C), obesidad), y diabetes tipo 2.
El tercer aspecto de la presente invención hace referencia al uso de los compuestos de Fórmula (I) arriba mencionados para la elaboración de una composición destinada al tratamiento de enfermedades relacionadas con PPARg seleccionadas entre enfermedades inflamatorias (por ejemplo: aterosclerosis, enfermedad inflamatoria del colon, artritis reumatoide, fibrosis hepática, neuropatía, psoriasis, cicatrización de heridas de la piel, regeneración de la piel, pancreatitis, gastritis, desórdenes neurodegenerativos o cáncer), enfermedades metabólicas (hipertensión, hipertrigliceridemia, hipercolesterolemia (HDL-C), obesidad), y diabetes tipo 2.
El cuarto aspecto de la presente invención hace referencia a una composición que comprende al menos uno de los compuestos arriba mencionados y cualquier excipiente aceptable.
El último aspecto de la presente invención hace referencia a un método para el tratamiento de enfermedades relacionadas con PPARg seleccionadas entre enfermedades inflamatorias (por ejemplo: aterosclerosis, enfermedad inflamatoria del colon, artritis reumatoide, fibrosis hepática, neuropatía, psoriasis, cicatrización de heridas de la piel, regeneración de la piel, pancreatitis, gastritis, desórdenes neurodegenerativos o cáncer), enfermedades metabólicas (hipertensión, hipertrigliceridemia, hipercolesterolemia (HDL-C), obesidad), y diabetes tipo 2; que comprende la administración al paciente de una cantidad efectiva de la composición arriba mencionada. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
A continuación se describen brevemente las figuras de la invención. Se incluye una explicación en profundidad de cada figura en cada ejemplo pertinente. Figura 1. Ensayo de unión a PPARg de algunos cannabinoides conocidos.
La concentración del compuesto testado (μΜ) se muestra en el eje de las x y el porcentaje de reducción de la polarización fluorescente tomado como medida de la unión a PPARg se muestra en el eje de las y. Esta figura muestra como algunos cannabinoides comprendidos en el estado de la técnica se unen directamente a PPARg, observándose los mejores valores con CBD-Q y CBN.
Figura 2. Ensayo comparativo de unión a PPARg de CBG vs. CBG-Q.
La concentración del compuesto testado (μΜ) se muestra en el eje de las x y el porcentaje de reducción de la polarización fluorescente tomado como medida de la unión a PPARg se muestra en el eje de las y. Esta figura indica que CBG-Q se une directamente a PPARg, con el mejor valor de IC50, en comparación con CBG e incluso con los mejores candidatos conocidos mostrados en la Figura 1 (CBD-Q y CBN). Los datos se muestran como media, señalando la desviación estándar mediante barras, de las tres réplicas.
Figura 3. Ensayo de transactivación.
La concentración del compuesto testado (μΜ) se muestra en el eje de las x y el grado de activación de PPARg se muestra en el eje de las y. Esta figura muestra el efecto de CBD y CBD-Q (Figura 3A) o CBG y CBG-Q (Figura 3B) en la actividad de PPARg, ratificando que CBG-Q es capaz de inducir la activación de PPARg con mayor eficiencia que CBG, CBD y CBD-Q.
Figura 4. Ensayo de diferenciación de adipocitos.
Cuantificación de triglicéridos totales (mmol/L de 3T3-L1 , eje y) en adipocitos completamente diferenciados. Los datos se muestran como media, señalando la desviación estándar mediante barras, de las tres réplicas. A todas las concentraciones testadas, se encontró que el derivado CBD-Q estimula la diferenciación de fibroblastos a adipocitos. Esta figura muestra la habilidad para estimular la diferenciación de las células lipídicas en fibroblastos 3T3-L1 como confirmación adicional de que CBG-Q es un ligando de PPARg. Se encontró que CBG-Q estimula la diferenciación de fibroblastos a adipocitos de una forma más fuerte que CBG. Tomados de forma conjunta, estos datos muestran por primera vez que CBG-Q es un ligando de PPARg capaz de unirse al mismo e incrementar su actividad transcripcional.
Figura 5. Efecto comparativo de CBG y CBG-Q como compuestos antiinflamatorios en tejido adiposo.
Esta figura muestra el efecto de CBG y CBG-Q en la expresión de varios genes usados como marcadores de la diferenciación de adipocitos (aP2 y PPARg), así como para varios genes que codifican adipoquinas (resistina, IL-6, adipoQ). Se observó una reducción de la expresión génica de la citoquina IL-6 proinflamatoria, así como un incremento en la expresión génica de adipoQ, que es la principal adipoquina antiinflamatoria. Este resultado muestra que CBG y CBG-Q tienen efectos positivos como compuestos antiinflamatorios en tejido adiposo.
Figura 6. Efecto comparativo de CBG y CBG-Q en la absorción de glucosa en pre-adipocitos 3T3-L1.
Esta figura muestra que los dos compuestos CBG y CBG-Q son capaces de incrementar la absorción de glucosa tanto en presencia (+) y en ausencia (-) de insulina, mostrando CBG-Q mayor efecto que CBG en ausencia de insulina. El eje de la y representa el DPM de proteína (μΜ). Por lo tanto CBG-Q se puede usar para tratar la resistencia a insulina a través de la reducción del tejido adiposo pro- inflamatorio y, además, a través del incremento de la absorción de glucosa.
Figura 7. CBG-Q como agonista de PPARg en células mesenquimales derivadas de la médula espinal. CBG-Q no inhibe la diferenciación de osteoblastos.
La figura muestra el efecto de CBG y CBG-Q en la expresión génica de los adipocitos (isoforma PPARg2 y LPL) (Figura 7B) y la expresión génica de los osteoblastos (RUNX2 y ALP) (Figura 7A). El grado de expresión génica se ilustra en el eje de las y. Se sabe que un aumento en la actividad PPARg debido al tratamiento con el fármaco antidiabético tiazolidinediona (TZD) rosiglitazona resulta en un descenso del número de osteoblastos y un aumento del número de adipocitos. Sin embargo, esta figura muestra que ninguna alteración significativa en la expresión de genes marcadores, tanto en adipocitos (PPAR y LPL) como en osteoblastos (RUNX2 y LPL), se produjo como consecuencia del uso de CBG-Q. Este resultado indica que CBG-Q se podría usar como agonista de PPARg sin efectos adicionales en el desarrollo de osteoporosis.
Figura 8. Efecto de varios derivados de CBD-Q en la actividad de PPARg.
Figura 8A. La concentración del compuesto testado (μΜ) se muestra en el eje de las x y el grado de activación de PPARg se muestra en el eje de las y.
Los datos se muestran como media, señalando la desviación estándar mediante barras, de las tres réplicas. Se observó un aumento significativo en la actividad de la luciferasa con los derivados de CBD-Q en comparación con CBD-Q. Este resultado indica que los derivados de CBD-Q son capaces de inducir la activación de PPARg con mayor eficiencia que CBD-Q. FM-
CBD-Q mostró los mayores valores de activación de PPARg.
Figura 8B. La concentración del compuesto testado (μΜ) se muestra en el eje de las x y el porcentaje de reducción de la polarización fluorescente tomado como medida de la actividad de PPARg en presencia de ligandos se muestra en el eje de las y. El IC50 se incluye en la leyenda. Los datos se muestran como media, señalando la desviación estándar mediante barras, de las tres réplicas. Esta figura indica que las modificaciones químicas de CBD-Q mantuvieron, o incluso aumentaron (FM-CBD-Q), la afinidad por PPARg.
Figura 8C. Cuantificación de triglicéridos totales (mmol/L de 3T3-L1 , eje y) en adipocitos completamente diferenciados. Los datos se muestran como media, señalando la desviación estándar mediante barras, de las tres réplicas. A todas las concentraciones testadas, se encontró que los derivados CBD-Q estimulan la diferenciación de fibroblastos a adipocitos de una forma más potente que CBD y CBD-Q, y sin el efecto citotóxico observado para CBD-Q a una concentración mayor de 1 μΜ (observar que la barra está ausente). Otra vez, FM-CBD-Q mostró la mayor eficiencia. Figura 9. Efecto comparativo de CBD, CBD-Q y FM-CBD-Q en la absorción de glucosa en pre-adipocitos 3T3-L1.
Se testaron dos dosis (1 y 10 μΜ) en presencia de insulina (1.74 μΜ). Los datos se muestran como media, señalando la desviación estándar mediante barras, de las tres réplicas. El eje de las y representa el DPM de proteína (μΜ). Los resultados muestran que el compuesto FM-CBD-Q es capaz de aumentar la absorción de glucosa incluso en presencia de insulina.
EJEMPLOS
Los ejemplos de la presente invención descritos a continuación pretenden ilustrar sus aspectos preferidos sin limitar su grado de protección.
Ejemplo 1. Ensayo de unión a PPARg.
La capacidad de los compuestos de la invención para unirse al dominio de unión de ligando de PPARg se midió usando el kit de ensayo PolarScreen™ PPARg Competitor Assay Green (Invitrogen). Brevemente, los compuestos competidores se diluyeron en un tampón de reacción en una placa multipocillo tipo black 384 shallow well píate (NUNC). Se añadieron entonces los dominios de unión de ligando a PPARg purificados y el ligando de PPARg fluorescente (Fluormone™ PPAR Green). Las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas y la polarización de fluorescencia se obtuvo mediante la lectura de la placa usando un Tecan Genius Pro con una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 535 nm. Tal y como se muestra en la Figura 1 , este ensayo de unión a PPARg se llevó a cabo inicialmente con cannabinoides comprendidos en el estado de la técnica, mostrando también su valor IC50: CBG (cannabigerol), CBD (cannabidiol), CBDV (cannabidivarina), CBN (cannabinol), CBC (cannabicromeno), THC (Δδ-tetrahidrocannabinol), THCV (Δδ-tetrahidrocannabinol-viridina) CBD-Q (CBD-Quinona) y CBD-anormal. Los datos se muestran como media, señalando la desviación estándar mediante barras, de las tres réplicas. Esos cannabinoides desplazaron el ligando fluorescente Fluormone™ PPAR Green del complejo PPAR- LBD/Fluormone™ PPAR Green, resultando en la reducción del valor de polarización. Este resultado indica que dichos cannabinoides se unen directamente a PPARg presentando los mejores valores observados CBD-Q y CBN. Además, la Figura 2 ilustra el mismo ensayo de unión a PPARg, pero llevado a cabo con el cannabinoide CBG comprendido en el estado de la técnica, y el cannabinoide CBD- Q de la invención, mostrándose también sus valores IC50. Los datos se muestran como media, señalando la desviación estándar mediante barras, de las tres réplicas. CBG-Q desplazó el ligando fluorescente Fluormone™ PPAR Green del complejo PPAR-LBD/Fluormone™ PPAR Green con mejor IC50 que cualquiera de los otros cannabinoides. Estos resultados indican que CBG-Q se une directamente a PPARg, con el mejor valor IC50 en comparación con CBG (Figura 2) e incluso con CBD-Q y CBN (Figura 1 ).
Ejemplo 2. Líneas celulares utilizadas en la invención.
Se usaron varias líneas celulares en la presente invención: AGS, adenocarcinoma gástrico humano; HCT1 16, carcinoma de colon humano; HeLa, carcinoma de cérvix humano; MDA, cáncer de mama humano; T47D, adenocarcinoma de mama humano; 293T, línea de células epiteliales renales humanes; y 3T3-L1 , fibroblastos de embriocitos de ratón comprometidos a diferenciarse a adipocitos. Todas las líneas celulares se cultivaron a 37 °C y 5% C02 en medio Eagle enriquecido por Dulbecco (DMEM) (Cambrex Co, Barcelona, España), conteniendo un 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS) (Cambrex Co, Barcelona, España), 2mM de glutamina, penicilina (50 U/ml) y estreptomicina (50 mg/ml). Las células mesenquimales (MSC) se obtuvieron a través del Servicio de Hematología. Servicio en el Hospital Universitario Reina Sofía (Córdoba, España). Las MSC se mantuvieron en σ-ΜΕΜ con un 15% de FBS. Ejemplo 3. Ensayo de diferenciación de adipocitos 3T3-L1.
La línea celular de pre-adipocitos 3T3-L1 se plaqueó a una concentración de 2x105 células/pocilio en placas de 6 pocilios para el aislamiento de ARN y cuantificación de triglicéridos. Los fibroblastos 3T3-L1 se cultivaron hasta su confluencia (3 días) en DMEM con un 10% de FBS y antibióticos. Entonces (día 0), el medio se suplemento con 1 μΜ de dexametasona, 0.5 mM de IBMX y 10 pM/ml de insulina, para inducir la diferenciación durante dos días. En el día 2, el medio se suplemento sólo con 5 μΜ/ml de insulina para dos días más. Todos los medios usados se suplementaron adicionalmente con cannabinoides, o rosiglitazona (1 μΜ) como control, desde el día 0. En caso de extracciones de ARN, las células fueron recogidas en el día 4. Para la cuantificación de triglicéridos las células se mantuvieron en medio suplementado con cannabinoides hasta el día 12 y se refrescaron cada 2 días. Este ejemplo se ilustra en la Figura 4, que muestra el efecto de CBG y CBG-Q en la adipogénesis de células 3T3-L1. Tal y como se mencionó anteriormente, se usó rosiglitazona (1 μ ) como control en la diferenciación de adipocitos. Se evaluó la capacidad para estimular la diferenciación de células lipídicas en fibroblastos 3T3-L1 con el objetivo de confirmar que CBG-Q es un ligando de PPARg. Se encontró que CBG-Q estimula la diferenciación de fibroblastos a adipocitos de una forma más potente que CBG. Esto se demuestra mediante la acumulación de triglicéridos en los adipocitos. Tomados de forma conjunta, estos datos muestran por primera vez que CBG-Q es un ligando de PPARg capaz de unirse al mismo e incrementar su actividad transcripcional.
Ejemplo 4. Efecto de CBG y CBG-Q en la expresión génica en adipocitos (aP2 y PPARg), y expresión génica de adipoquinas (resistina, IL-6, adipoQ).
Se examinó el efecto de CBG y CBG-Q en varios genes usados como marcadores de la diferenciación a adipocitos (aP2 y PPARg), así como en varios genes que codifican adipoquinas (resistina y adipoQ) mediante el uso de PCR. El gen GAPDH se usó como gen constitutivo. CBG y CBG-Q mostraron una respuesta de expresión génica aditiva en comparación con los adipocitos sin ningún compuesto añadido, confirmando su efecto estimulante en la diferenciación de adipocitos. Se observó una reducción de la citoquina IL-6 proinflamatoria, así como un incremento en adipoQ, que es la principal adipoquina antiinflamatoria. Estos resultados muestran que CBG y CBG-Q tienen un efecto positivo como compuesto antiinflamatorio en tejido adiposo. La producción de citoquinas proinflamatorias y la reducción de adipoQ en tejido adiposo predispone a un incremento de la resistencia a insulina, no sólo en tejido adiposo, sino también en músculo e hígado, lo que conduce a diabetes tipo 2 a corto plazo (Figura 5). Ejemplo 5. Absorción de glucosa.
Para ensayos del transporte de 2-deox¡-D-glucosa, se privó a pre-adipocitos 3T3-L1 cultivados en placas de 12 pocilios de suero mediante incubación durante 2 horas. Las células se incubaron entonces con 1.74 μΜ de insulina durante 20 minutos en 450 μ\ de tampón KRH (25 mM de HEPES-NaOH [pH 7.4], 120 mM de NaCI, 5 mM de KCI, 1.2 mM de MgS04, 1.3 mM de CaCI2, y 1.3 mM de KH2P04). El transporte de glucosa se inició mediante la adición de 50 μ\ de tampón KRH que contiene 0.5 mM de 2-deoxi-D-[1 ,2-3H]glucosa (0.25 μθ) en cada pocilio; tras 5 minutos, se finalizó el transporte lavando las células 3 veces con tampón KRH a punto de congelación. Las células se solubilizaron y se midió la radioactividad incorporada mediante contador de centelleo líquido. Este ensayo se ilustra en la Figura 6 que muestra el efecto de CBG y CBG-Q en la absorción de glucosa en pre-adipocitos 3T3-L1. Se testaron dos dosis en presencia y en ausencia de insulina (1.74 μΜ). Los datos se muestran como media, señalando la desviación estándar mediante barras, de las tres réplicas. Los resultados muestran que ambos compuestos son capaces de incrementar la absorción de glucosa tanto en presencia como en ausencia de insulina, mostrando CBG-Q un mayor efecto que CBG en ausencia de insulina. Por lo tanto, CBG-Q se podría usar para tratar la resistencia a insulina a través de la reducción del tejido adiposo proinflamatorio e incluso a través del incremento de la absorción de glucosa. También la Figura 9 muestra el efecto de CBD, CBD-Q y FM-CBD-Q sobre la absorción de glucosa en pre-adipocitos 3T3-L1. Se testaron dos dosis en presencia de insulina (1 .74 μΜ). Los datos se muestran como media, señalando la desviación estándar mediante barras, de las tres réplicas. Para analizar el efecto de FM-CBD-Q sobre la absorción de glucosa en pre-adipocitos 3T3-L1 , se testaron dos dosis en presencia de insulina. Los resultados muestran que el compuesto FM-CBD-Q es capaz de aumentar la absorción de glucosa en presencia de insulina.
Ejemplo 6. CBG-Q como agonista de PPAR en células mesenquimales de la médula espinal. CBG-Q no inhibe la diferenciación de osteoblastos.
Las células se paquearon a 500 células/cm2 en placas P6 (TPP, Trasadingen, Suiza) que contienen medio σ-ΜΕΜ con un 10% de FBS. Cuando los cultivos celulares confluyeron en un 80-90%, el medio se suplemento con 10"8 M de dexametasona, 0.2 mM de ácido ascórbico y 10 mM de ?-glicerolfosfato para inducir diferenciación a osteoblastos, y 5 x 10"7 M de dexametasona, 0.5 mM de isobutilmetílxantína y 50 mM de indometacina para inducir diferenciación a adipocitos. Todos los inductores eran de Sigma-Aldrich. Las MSC (células madre mesenquimales) se cultivaron en un medio osteogénico o adipogénico durante 21 días, junto con el control correspondiente (en ausencia de inductores de la diferenciación). Las muestras celulares se recogieron el día 13. Tal y como se muestra en la Figura 7, se evaluó el efecto de CBG y CBG-Q en la expresión génica de los adipocitos (PPARg2 y LPL) (Figura 7B) y la expresión génica de los osteoblastos (RUNX2 y ALP) (Figura 7A). Los valores de expresión del ADN ribosomal nuclear se usaron para normalizar los valores obtenidos. Los adipocitos y osteoblastos se obtuvieron mediante diferenciación de células madre mesenquimales crecidas en medios de cultivo de diferenciación específicos de adipogénesis u osteoblastogénesis. El análisis se llevó a cabo mediante QRT-PCR, y los resultados se muestran como media, señalando la desviación estándar mediante barras, de las tres réplicas. Los osteoblastos formadores de hueso y los adipocitos formadores de grasa se derivan de células madre mesenquimales (MSCs). Un aumento en la actividad de PPAEg debido al tratamiento con el fármaco antidiabético tiazolitinediona (TZD) rosiglitazona resulta en un reducido número de osteoblastos y en un mayor número de adipocitos. Para probar el efecto de CBG y CBG-Q en la diferenciación de MSC en osteoblastos o adipocitos, se añadieron los compuestos a un medio de diferenciación durante 21 días y la expresión génica se midió mediante PCR cuantitativa a tiempo real. No se observó ninguna alteración significativo en la expresión de genes marcadores en adipocitos (PPAR y LPL) y osteoblastos (RUNX2 y LPL), Este resultado indica que CBG-Q se podría usar como agonista PPARg sin efectos adicionales en el desarrollo de osteoporosis.
Ejemplo 7. Prueba de citotoxicidad MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)- 2,5- difeniltetrazolium).
Se dispensaron alícuotas de suspensiones de células en volúmenes de 100 μΙ en pocilios de placas de 96 pocilios para cultivo de tejidos a una densidad de 104 células/pocilio. Se añadieron varias concentraciones de cannabinoides, y se evaluó su eficacia tras 24 horas con el uso del ensayo MTT (Carmichael et al., 1987). En cada ensayo MTT, se evaluó cada concentración de la sustancia analizada en tres réplicas. El efecto inhibitorio de varios compuestos se calculó como el porcentaje de inhibición relativo a las células tratadas con el vehículo (0.5% DMSO).
La Tabla 2 muestra los valores de IC50 del ensayo de citotoxicidad MTT (bromuro de 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazolium) en varias líneas celulares tras 24 horas de tratamiento con CBD, CBD-Q, CBG y CBG-Q. En un ensayo de citotoxicidad (24 horas de tratamiento) MTT (bromuro de 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)- 2,5- difeniltetrazolium, un tetrazol) en varias líneas celulares, CBG-Q mostró un efecto citotóxico similar comparado con CBG y valores reducidos comparado con CBD y CBD-Q. El mayor efecto citotóxico se observó con CBD-Q. Las líneas celulares se derivan de: AGS, adenocarcinoma gástrico humano; HCT116, carcinoma de colon humano; HeLa, carcinoma de cérvix humano; MDA, cáncer de mama humano; T47D, adenocarcinoma de mama humano; 3T3-L1 , fibroblastos de embriocitos de ratón comprometidos a diferenciarse a adipocitos.
Tabla 2
Figure imgf000027_0001
La Tabla 3 muestra los valores de IC50 del ensayo de citotoxicidad MTT (bromuro de 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazolium, un tetrazol) en varias líneas celulares tras 24 horas de tratamiento con derivados de CBD-Q. En un ensayo de citotoxicidad (24 horas de tratamiento) MTT (bromuro de 3-(4,5-Dimet¡ltiazol-2-il)- 2,5- difeniltetrazolium) en varias líneas celulares, todos los derivados de CBG-Q mostraron un efecto citotóxico reducido comparado con CBD-Q. Las líneas celulares se derivan de: AGS, adenocarcinoma gástrico humano; HCT1 16, carcinoma de colon humano; HeLa, carcinoma de cérvix humano; MDA, cáncer de mama humano; T47D, adenocarcinoma de mama humano; 3T3-L1 , fibroblastos de embriocitos de ratón comprometidos a diferenciarse a adipocitos. Tabla 3
Figure imgf000028_0001
Ejemplo 8. Transfecciones transitorias y ensayo con luciferasa
7 x 103 células 293T se cultivaron en placas BD Falcon™ White de 96 pocilios Clear Bottom Microtest™ Optilux™ durante 24 horas. Posteriormente, las células se transfectaron con los plásmidos indicados usando reactivos Rottifect (ROTH, Karlsruhe, Alemania) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Después de 24 horas de post-transfección, las células se pre-trataron con dosis crecientes de cannabinoides durante 6 horas. Entonces, las células se lisaron en 25 mM de Tris- fosfato pH 7.8, 8 mM de MgCI2, 1 mM de DTT, 1 % de Tritón X-100, y 7% de glicerol. Se midió la actividad luciferasa en el lisado de células usando el lector de microplacas multimodo TriStar LB 941 (Berthold) y siguiendo las instrucciones del kit de ensayo de luciferasa (Promega, Madison, Wl, EE.UU.). Se midió la concentración de proteína mediante el ensayo Bradford (Bio-Rad, Richmond, CA, EE.UU.). Los resultados previos obtenidos con el tampón de lisis se restaron de cada valor experimental y se expresó la transactivación específica como el nivel de inducción sobre las células no tratadas. Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces. Los plásmidos usados fueron el Gal4-hPPARgamma (nombre del plásmido: pCMV-BD-hPPARg, fabricado en Sinal Laboratory, Dept. de Farmacología, Universidad de Dalhousie) y el plásmido reportero luc Gal4 que incluye cinco sitios de unión a ADN de Gal4 unidos al gen luciferasa. El anterior ensayo se ilustra en la Figura 3, que muestra el efecto de CBD y CBD-Q (Figura 3A) o CBG y CBG-Q (Figura 3B), en la actividad de PPARg, por medio de un ensayo de transactivación llevado a cabo en células 293T que sobreexpresan transitoriamente PPARg en combinación con un gen reportero de la luciferasa (PPARg-GAL4/GAL4-LUC) y tratadas con cannabinoides durante 6 horas. Los datos se muestran como media, señalando la desviación estándar mediante barras, de las tres réplicas. Este resultado confirma que el compuesto CBD-Q es capaz de inducir la activación de PPARg con mayor eficiencia que CBG. Además, la Figura 8A muestra un ensayo de transactivación realizado en células 293T que sobreexpresan de forma transitoria PPARg en combinación con un gen reportero de la luciferasa (PPARg-GAL4/GAL4-LUC) y tratadas con cannabinoides durante 6 horas. Los datos se muestran como media, señalando la desviación estándar mediante barras, de las tres réplicas. En comparación con las células sin tratar (indicadas con el valor 1 como referencia), se observó un incremento significativo en la actividad luciferasa con derivados de CBD-Q en comparación con CBD-Q. Este resultado indica que los derivados de CBD-Q son capaces de inducir la activación de PPARg con mayor eficiencia que CBD-Q. F -CBD-Q mostró los mayores valores de activación de PPARg. La Figura 8B también ilustra un ensayo de unión a PPARg que demuestra que los derivados de CBD-Q desplazaron el ligando fluorescente Fluormone™ PPAR Green del complejo PPAR- LBD/Fluormone™ PPAR Green, resultando en una reducción del valor de polarización. Este resultado indica que las modificaciones químicas de CBD-Q mantuvieron, o incluso incrementaron (FM-CBD-Q) la afinidad por PPARg.
Ejemplo 9. Cuantificación total de triglicéridos.
Se lavaron adipocitos 3T3-L1 totalmente diferenciados en PBS y se sonicaron tres veces durante 5 segundos en un tampón que contiene 2 M de NaCI, 2 mM de EDTA y 50 mM de fosfato sódico a pH 7.4 para liberar el contenido celular. Se cuantificó el contenido total de triglicéridos liberado usando el kit comercial Triglyceride Assay (Applied BioSystem, España) basado en una reacción colorimétrica y medido mediante absorbancia a 500 nm en un espectrofotómetro. La Figura 8C confirma que los derivados de CBD-Q son ligandos de PPARg en cultivos celulares, mediante la comprobación de la capacidad para estimular la diferenciación de células lipídicas en fibroblastos 3T3-L1. A todas las concentraciones testadas, se encontró que los derivados de CBD-Q estimulan la diferenciación de fibroblastos a adipocitos de una forma más potente que CBD y CBD-Q, y sin el efecto citotoxico observado para CBD-Q a una concentración mayor de 1 μΜ (observar que la barra está ausente). Ejemplo 10. PCR y PCR cuantitativa a tiempo real utilizadas en la invención (ejemplos 4 y 6).
La reacción de PCR consistió en 25 μΙ de una mezcla que contiene: 1 x tampón de PCR, 1.5 mM de MgCI2, 0.2 mM de dNTPs, 0.2 μΜ de cada cebador específico de secuencia, 1 μ\ de ADNc transcrito y 0.5 U de Taq polimerasa (Biotools). Para la QRT-PCR se utilizó un instrumento Bio-Rad iCycler ¡Q Real Time PCR y ¡Q SYBR™ Green Supermix (Bio-Rad, Richmond, CA, EE.UU.). La amplificación se llevó a cabo en un volumen final de 50 pl con 1 pl de ADNc, 25 μΙ de 2x SYBR Green Supermix (100 mM CI, 40 mM de Tris-HCI a pH 8.4, dNTP 0.4 mM cada uno, 50u/ml ¡Taq polimerasa, 6 mM de MgCI2, SYBR Green I, y 20 nM fluoresceína) y 2 μΙ de cebadores 2 μΜ. Las secuencias específicas de los cebadores se muestran en la Tabla 4. Las condiciones térmicas de ciclación fueron: 94 °C durante 2 min, seguido de 35 ciclos a 94 °C durante 15 s, 60 °C durante 30 s, y 72 °C durante 1 min. Se incluyó también un paso final de extensión a 72 °C durante 5. Para valorar la correcta amplificación se incluyó un programa de fundido [70 °C, 10 s (+0.5°C x 60)]. Los productos amplificados se analizaron adicionalmente mediante electroforesis en gel de agarosa 1.8% que contiene 0.5 ug/ml de bromuro de etidio. Los valores de expresión relativa se calcularon de acuerdo a Pedersen (2001 ).
Tabla 4. Secuencias de los cebadores oligonucleótidos para la PCR.
Figure imgf000031_0001
Ejemplo 11. Oxidación de CBG a CBG hidroxiquinona (CBG-Q).
A una solución sometida a frío (baño de hielo) de CBG (200 mg, 0.64 mmol) en HMPA (5 ml_), se añadió nBuLi en hexano (0.66 ml_, 2.5 M, 1.65 mmol, 2.5 mol. equiv.) gota a gota. La adición se hizo bajo condiciones aeróbicas normales. Entonces, se retiró el baño frío y la solución se calentó a 50 °C (baño de aceite). La reacción se monitorizó mediante TLC (éter de petróleo-EtOAc 9:1 , Rf. CBG = 0.32; Rf CBGquinona = 0.46) y, después de dos horas, se activó mediante la adición de 2N H2S04 y se extrajo con EtOAc. Se secó (Na2S04), se evaporó y purificó la fase orgánica mediante cromatografía gravitacional en columna (éter de petróleo-EtOAc 95:5 como eluyente), proporcionando 130 mg (62%) de CBG- hidroxiquinona. Referencias
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Claims

REIVINDICACIONES
1. Compuestos de Fórmula (I), o derivados de los mismos:
Figure imgf000035_0001
(I)
donde R1 significa un grupo hidrógeno, hidroxilo, metil o aldehido, R2 significa un derivado ciclohexeno o un compuesto alifático, preferentemente un alqueno, y R3 significa un grupo hidroxilo o metiloxi, exceptuando al compuesto de fórmula
Figure imgf000035_0002
(li)
Compuesto, según la reivindicación 1 , caracterizado por tener una fórmula seleccionada entre:
Figure imgf000035_0003
(lii)
Figure imgf000035_0004
(IV)
Figure imgf000036_0001
(V)
Figure imgf000036_0002
(VI)
Compuesto, según las reivindicaciones 1 ó 2, para ser usado como medicamento.
Compuesto para ser usado como medicamento, según la reivindicación 3, caracterizado por tener una fórmula seleccionada entre:
Figure imgf000036_0003
(III)
Figure imgf000036_0004
(IV)
Figure imgf000036_0005
(V)
Figure imgf000037_0001
(VI)
Compuesto de Fórmula (I), o derivados del
Figure imgf000037_0002
donde R1 significa un grupo hidrógeno, hidroxilo, metil o aldehido, R2 significa un derivado ciciohexeno o un compuesto alifático, preferentemente un alqueno, y R3 significa grupo hidroxilo o metiloxi; para ser usado como agonista de PPARg en el tratamiento de enfermedades relacionadas con PPARg.
6. Compuesto, según la reivindicación 5, para ser usado como agonista de PPARg en el tratamiento de enfermedades inflamatorias, enfermedades metabólicas y diabetes tipo 2.
7. Compuesto, según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, para ser usado como agonista de PPARg en el tratamiento de enfermedades metabólicas seleccionadas entre: hipertensión, hipertrigliceridemia, hipercolesterolemia (HDL-C), obesidad; o enfermedades inflamatorias seleccionadas entre: aterosclerosis, enfermedad inflamatoria del colon, artritis reumatoide, fibrosis hepática, nefropatía, psoriasis, cicatrización de heridas de la piel, regeneración de la piel, pancreatitis, gastritis, desórdenes neurodegenerativos y cáncer.
8. Uso de un compuesto de Fórmula (I) o derivados de los mismos:
Figure imgf000037_0003
(l) donde R1 significa un grupo hidrógeno, hidroxilo, metil o aldehido, R2 significa un derivado ciclohexeno o un compuesto alifático, preferentemente un alqueno, y R3 significa un grupo hidroxilo o metiloxi; para la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades relacionadas con PPARg.
9. Uso, según la reivindicación 8, para la elaboración de una composición para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, enfermedades metabólicas y diabetes tipo 2.
10. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9, para la elaboración de una composición para el tratamiento de enfermedades metabólicas seleccionadas entre: hipertensión, hipertrigliceridemia, hipercolesterolemia
(HDL-C), obesidad; o enfermedades inflamatorias seleccionadas entre: aterosclerosis, enfermedad inflamatoria del colon, artritis reumatoide, fibrosis hepática, nefropatía, psoriasis, cicatrización de heridas de la piel, regeneración de la piel, pancreatitis, gastritis, desórdenes neurodegenerativos y cáncer.
11. Composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de las reivindicaciones 1 ó 2 y cualquier excipiente o transportador adecuado.
12. Método para el tratamiento de enfermedades relacionadas con PPARg que comprende la administración al paciente de una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende un compuesto de Fórmula (I) o derivados del mismo:
Figure imgf000038_0001
(")
donde R1 significa un grupo hidrógeno, hidroxilo, metil o aldehido, R2 significa un derivado ciclohexeno o un compuesto alifático, preferentemente un alqueno y R3 significa un grupo hidroxilo o metiloxi.
13. Método, según la reivindicación 12, donde la enfermedad relacionada con PPARg se selecciona entre: enfermedades inflamatorias, enfermedades metabólicas y diabetes tipo 2.
14. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13, donde la enfermedad relacionada con PPARg es una enfermedad metabólica seleccionada entre: hipertensión, hipertrigliceridemia, hipercolesterolemia (HDL-C), obesidad; o una enfermedad inflamatoria seleccionada entre: aterosclerosis, enfermedad inflamatoria del colon, artritis reumatoide, fibrosis hepática, nefropatía, psoriasis, cicatrización de heridas de la piel, regeneración de la piel, pancreatitis, gastritis, desórdenes neurodegenerativos o cáncer.
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