WO2011111501A1 - ヌクレオシド化合物を含んでいるｒｎａ、当該ｒｎａからのタンパク質の産生量を制御する方法、およびヌクレオシド化合物 - Google Patents

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    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical

Definitions

  • the present invention relates to RNA containing a nucleoside compound, a method for controlling the amount of protein produced from the RNA, and a nucleoside compound.
  • the translation of the RNA can be controlled by photoisomerization of the nucleoside compound.
  • Non-patent Document 1 There is a technique for stopping the translation of mRNA injected into cells until the mRNA is irradiated with light having a predetermined wavelength (Non-patent Document 1).
  • a cage compound is bound in advance to the mRNA to be injected, and movement of the liposome on the mRNA is prevented by the cage compound.
  • the cage compound dissociates from mRNA when irradiated with light having a predetermined wavelength. Therefore, if this technique is utilized, translation of mRNA can be started at a desired timing.
  • JP 2009-114171 A Japanese Patent Publication “JP 2009-114171 A” (published May 28, 2009)
  • the started translation does not stop until the mRNA is degraded. This is because the dissociated cage compound does not bind to mRNA. For this reason, the amount of protein production cannot be controlled. Moreover, after irradiating light which dissociates a cage compound from mRNA, the said mRNA diffuses from the range irradiated with light. Since the translation of mRNA after diffusion into protein does not stop, the desired protein cannot be expressed locally. That is, local protein expression in cells cannot be reversibly controlled by the conventional technique.
  • a specific mRNA is localized in a specific region, and translation into a protein can be performed at a specific time in the region.
  • the transient expression of the protein in this particular region can determine the type of cell that differentiates.
  • an object of the present invention is to provide an RNA that can freely control the amount of protein produced by irradiation with light having a specific wavelength.
  • the RNA of the present invention comprises a 5 ′ cap structure and a translation region having a 5 ′ start codon and a 3 ′ stop codon at both ends,
  • the carbon atom at the 8th position of the purine nucleus or the 5th or 6th position of the pyrimidine nucleus has the formula (I):
  • a nucleoside compound to which a group represented by is bonded is introduced at a position selected from the 5 ′ cap structure of the RNA and the base from the 5 ′ end to 10 bases.
  • the method for controlling the amount of protein produced from the RNA of the present invention has a wavelength that changes the structure of the nucleoside compound from trans to cis by irradiation. 1) and / or irradiating the RNA with a second light having a wavelength that changes the structure of the nucleoside compound from a cis form to a trans form by irradiation.
  • nucleoside compound of the present invention has the formula (I ′): at the carbon atom at the 8th position of the purine nucleus or the 5th or 6th position of the pyrimidine nucleus.
  • A represents an aryl group or a heteroaryl group
  • # represents the bonding position with the carbon atom at the 8th position of the purine nucleus or the 5th or 6th position of the pyrimidine nucleus, and two X's are the same; Represents a nitrogen atom
  • the group represented by is attached.
  • the present invention has the effect of providing RNA capable of reversibly selecting the space and time and controlling the amount of protein produced by the translation.
  • FIG. 4 is a diagram demonstrating in vitro control of translation of RNA according to the present invention encoding GFP by irradiation with light of different wavelengths and fluorescence intensity of GFP. It is the figure which proves the local control in the cell of the translation of RNA based on this invention which codes GFP by the fluorescence of GFP. It is a figure which shows a time-dependent change of the absorption spectrum of the compound obtained in Example 3 when the light of 420 nm (upper stage) and 550 nm (lower stage) is irradiated.
  • RNA according to the present invention (RNA structure)
  • the RNA according to the present invention includes a 5 ′ cap structure and a translation region having a 5 ′ start codon and a 3 ′ stop codon at both ends.
  • the RNA according to the present invention further comprises a compound of formula (I):
  • a nucleoside compound to which a group represented by is bonded is introduced at a position selected from the 5 ′ cap structure of the RNA and the base from the 5 ′ end to 10 bases.
  • the group represented by the formula (I) can reversibly undergo cis-trans isomerization of the double bond moiety when receiving light of two different wavelengths. Therefore, by introducing the group into the base portion of the nucleoside, a nucleoside compound that can undergo a reversible structural change upon irradiation with light can be obtained. By introducing the nucleoside compound thus obtained at the above-mentioned position of the RNA, it is possible to obtain RNA that can determine whether or not it can bind to a factor involved in the initiation of translation according to the structural change of the nucleoside compound. it can.
  • the RNA when the RNA is in cis form, the RNA may cause binding to factors involved in translation initiation, while when the RNA is in trans form, the RNA is responsible for initiation of translation. It cannot produce binding with the factors involved. That is, the RNA of the present invention undergoes a reversible structural change from a structure capable of initiating translation to a structure incapable of initiating depending on the wavelength of irradiated light, and vice versa. The amount of protein produced can be controlled.
  • the nucleoside compound is preferably introduced into a 5 'cap structure in the RNA according to the present invention.
  • the RNA according to the present invention when it is in a trans form, it does not cause a binding with a translation initiation factor, and thus can more reliably inhibit the initiation of translation.
  • both Xs are nitrogen atoms.
  • the RNA according to the present invention can be reversibly isomerized by irradiation with visible light.
  • the advantage of this configuration is that when the RNA according to the present invention is introduced into a living body and the amount of protein produced by translation of the RNA is controlled, it is not necessary to use ultraviolet light that has a harmful effect on the living body. That is.
  • H when X is CH, H may be substituted with alkyl.
  • the substituent alkyl is an alkyl having a size that does not interfere with the cis-trans isomerization of the nucleoside compound, such as C 1-5 alkyl, preferably C 1-3 alkyl.
  • the type, number and substitution position of the substituent are not particularly limited.
  • the substituent include a halogen atom (for example, a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom), an aryl group (preferably a substituted or unsubstituted aryl group having 5 to 30 carbon atoms, such as a phenyl group and a tolyl group.
  • Xylyl group mesityl group, biphenylyl group, naphthyl group, anthryl group, phenanthryl group, fluorenyl group, pyrenyl group), heteroaryl group (preferably 5- to 10-membered heteroaryl group such as pyrrolyl group, imidazolyl group, An indolyl group, a phenanthrolinyl group, a phenazinyl group, a thebenidinyl group, a 10H-kindolinyl group), an alkyl group (preferably a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, such as a methyl group, an ethyl group, a propyl group, Isopropyl group, n-butyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, -Pentyl group, neopentyl group, hexyl group, heptyl group,
  • nucleoside compound includes “purine nucleoside compound” and “pyrimidine nucleoside compound”.
  • the “purine nucleoside compound” is a glycoside compound containing a purine nucleus in which a purine base and a sugar reducing group are bonded by a glycosidic bond.
  • the carbon atom at the 8-position of the purine nucleus is substituted with the group represented by the formula (I). The isomerization of the double bond moiety results in either the trans isomer (left) or cis isomer (right) described below.
  • Z 1 does not exist or represents a hydrogen atom or a substituent
  • Z 2 represents a hydrogen atom or a substituent
  • n represents an integer in the range of 1 to 4, and is a double line consisting of a solid line and a broken line Represents a single bond or a double bond
  • # 1 represents a bonding position with a sugar, and when n is 2 or more, a plurality of Z 2 are the same or different).
  • the substituent at the 7-position of the purine nucleus is, for example, an aryl group, a heteroaryl group, an alkyl group, or an aryl group via an alkyl group.
  • bonded is mentioned.
  • the aryl group is an aryl group having 6 to 30 carbon atoms, more preferably an aryl group having 6 to 10 carbon atoms.
  • the heteroaryl group is a 5- or 6-membered heteroaryl group, and the alkyl group includes a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • the substituent is more preferably a methyl group, but there may be an embodiment in which the substituent is not present.
  • A represents an aryl group or a heteroaryl group.
  • the aryl group has, for example, 5 to 30 carbon atoms and can be either monocyclic or polycyclic.
  • the aryl group may have a substituent. Examples of the aryl group include a substituted or unsubstituted phenyl group and a naphthyl group.
  • aryl group a phenyl group; a naphthyl group, an as-indacenyl group, an s-indacenyl group, an acenaphthylenyl group, a 9H-fluorenyl group, a phenanthryl group, an anthryl group, a fluoranthenyl group, an acephenanthrenylenyl group, an ASEAN
  • An aryl group having 10 to 20 atoms constituting a ring such as a trirenyl group, triphenylenyl group, pyrenyl group, chrycenyl group, tetraphenyl group, naphthacenyl group and perylenyl group; a ring such as a picenyl group, a pentaphenyl group and a pentacenyl group Examples thereof include, but are not limited to, an aryl group having 21 to 30 atoms.
  • RNA according to the present invention when synthesized by a transcription reaction as described later, (1) the yield of the transcription product (RNA according to the present invention) is large, and (2 ) The initiation and inhibition of initiation of RNA-to-protein translation according to the present invention can be more appropriately controlled according to light irradiation.
  • A can be appropriately selected according to the ease of controlling the yield of RNA to be produced and the amount of protein produced.
  • heteroaryl group represented by A examples include a 5- to 10-membered heteroaryl group containing, as a ring-constituting atom, one or more heteroatoms selected from the group consisting of a nitrogen atom, an oxygen atom, and a sulfur atom. And can be either monocyclic or polycyclic. More preferably, a 5-membered or 6-membered heteroaryl group containing 1 or 2 nitrogen atoms as a ring-constituting atom is included, and more preferably a 5-membered ring or 6 containing 1 nitrogen atom as a ring-constituting atom. Examples include membered heteroaryl groups. The heteroaryl group may have a substituent.
  • heteroaryl group examples include a monocyclic heteroaryl group having 5 or 6 atoms constituting a ring containing a nitrogen atom as a heteroatom such as a substituted or unsubstituted pyrrolyl group or imidazolyl group; A condensed cyclic heteroaryl group having 7 to 9 atoms constituting a ring containing a nitrogen atom; quinolinyl group, 2,7-naphthyridinyl group, 2,6-naphthyridinyl group, 1,6-naphthyridinyl group, 1,5- Naphthyridinyl group, quinoxalinyl group, quinazolinyl group, cinnolinyl group, 9H-carbazolyl group, 9H- ⁇ -carbolinyl group, phenanthridinyl group, 1H-perimidinyl group, 4,7-phenanthrolinyl group, 3,8-fephen Phen
  • guanosine derivative and an adenosine derivative represented by the following formula, wherein a group represented by the above formula (I) is bonded to the carbon atom at the 8-position of the purine nucleus, Can be mentioned.
  • Y 1 is a hydroxyl group or —HPO 3 —
  • Y 2 is —HPO 3 —
  • Y 3 is a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted amino group or a protecting group thereof.
  • the protecting group include an isobutyl group and a dimethylformamidine (DMF) group.
  • the method for synthesizing a purine nucleoside compound having an azo skeleton of the present invention may be referred to the section of (Purine nucleoside compound) described later.
  • a method for synthesizing a purine nucleoside having an olefin skeleton is described in S. Ogasawara, M. Maeda “Straightforward and Reversible Photoregulation of Hybridization using Photochromic Nucleoside” Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 8839-8842.
  • halogenated nucleoside derivative a purine nucleoside derivative halogenated at the 8-position
  • a group represented by the formula (I) the compound represented by the formula (I)
  • the purine nucleoside compound represented by this can be obtained.
  • a Suzuki-Miyaura coupling can be used for the synthesis of the E form.
  • the purine nucleus halogenated at the 8-position and the (E) -alkenylboron compound are heated to reflux for several hours in the presence of a catalyst such as palladium.
  • the solvent is removed by an evaporator, and the column is purified and re-purified.
  • the target product can be obtained by purification using methods such as crystallization and washing.
  • the Z form can be obtained, for example, by catalytic hydrogen reduction of 8-arylethynylpurine. The catalytic hydrogen reduction will be described more specifically.
  • an atomic group having a purine nucleus halogenated at position 8 and a terminal alkyne is added to a catalyst such as palladium, and copper iodide, an amine base, etc. are added simultaneously and heated to reflux for several hours.
  • the solvent is removed with an evaporator, and purification is performed by a method such as column purification, recrystallization, or washing.
  • the obtained 8-arylethynylpurine is dissolved in a suitable solvent such as ethanol or methanol, and the inside of the system is replaced with hydrogen under a catalyst such as palladium, and catalytic hydrogen reduction is performed at normal pressure or under pressure.
  • the purine nucleoside compound of the present invention Details of the synthesis reaction of the purine nucleoside compound of the present invention are described in Examples described later. Moreover, the raw materials and reagents used in the reaction can be synthesized by known methods, or commercially available products can be used. After the synthesis reaction, the target substance can be obtained by purification using a known method as necessary. Whether the target substance has been obtained can be confirmed by an identification method such as NMR or mass spectrometry.
  • the purine nucleoside compound represented by the formula (I) may form a salt depending on the type of functional group or substituent, and forms a hydrate or a solvate in a free state or a salt state. However, these states are also included in the scope of the present invention.
  • the RNA according to the present invention includes a 5 'cap structure and a translation region having a 5' start codon and a 3 'stop codon at both ends. That is, the RNA according to the present invention contains structures and regions necessary for translation in vitro or in vivo.
  • RNA according to the present invention in which the nucleoside compound is introduced as a 5 ′ cap structure for example, binds an arbitrary nucleoside to the 5 ′ carbon of the nucleoside compound via a triphosphate bridge, and this product is used as a transcription primer.
  • this product is not limited to this method.
  • the RNA according to the present invention in which the nucleoside compound is introduced from the 5 ′ end to 10 bases for example, binds a 5 ′ cap structure to the 5 ′ end of the artificial oligonucleotide containing the nucleoside compound
  • the product can be synthesized through a transcription reaction using the transcription primer.
  • the 5 'cap structure can be imparted to the nucleoside compound or any oligonucleotide using a known enzyme (for example, RNA polyphosphatase, RNA guanyltransferase, guanine-7-methyltransferase, etc.).
  • a known enzyme for example, RNA polyphosphatase, RNA guanyltransferase, guanine-7-methyltransferase, etc.
  • the transcription reaction can be performed using a known RNA polymerase with a DNA encoding a desired translation region as a template.
  • the initiation codon on the 5 ′ side of the RNA according to the present invention is a codon for initiating transcription from RNA to protein, and preferably AUG.
  • the RNA according to the present invention is translated in eubacteria. Thus, it can be exceptionally CUG, AUA or UUG.
  • the 3'-end stop codon of RNA according to the present invention is a codon for terminating transcription from RNA to protein, and can be appropriately selected from UAA, UAG and UGA.
  • the translation region of RNA according to the present invention can encode any protein for which it is desired to control the amount produced by translation.
  • the RNA according to the present invention may further include a 5 'untranslated region and / or a 3' untranslated region.
  • the 5 'untranslated region is not particularly limited as long as it is inserted for the purpose of providing an appropriate distance between the 5' cap structure and the translation initiation codon and has a length of 10 bases or more.
  • the 5 'untranslated region is preferably 1000 bases or less, more preferably 900 bases or less, more preferably 800 bases or less, more preferably 700 bases or less, more preferably 600 bases or less, more preferably 500 bases or less.
  • the nucleoside compound when a 5 'cap structure-independent translation initiation signal sequence such as a Kozak sequence exists, translation begins regardless of the presence or absence of the 5' cap structure, and thus the nucleoside compound is introduced into the 5 'cap structure. Such sequences are excluded.
  • the nucleoside compound is introduced at a position selected from the bases from the 5 'end to 10 bases, such a sequence can be included only in a range that does not hinder the control of translation initiation by light irradiation.
  • the 5 'untranslated region contains at least one of a sequence essential for binding of RNA to an initiation factor or a ribosome complex, or a sequence that increases translation efficiency.
  • the 3 'untranslated region is not particularly limited as long as it has a length of 10 bases or more.
  • the 3 'untranslated region preferably further contains a sequence (poly A addition signal) for adding a poly A sequence to the 3' end.
  • the poly A addition signal include a base sequence consisting of AAUAAAA, SV40 early polyA signal containing two AAUAAAA sequences, or a sequence in which SV40 early polyA signal is arranged in tandem. Absent.
  • RNA according to the present invention may contain a poly A sequence at the 3 'end.
  • RNA containing a poly A sequence at the 3 'end is excellent in the translation efficiency of the translation region and the stability of the RNA itself.
  • nucleoside compound includes “pyrimidine nucleoside compound” as described above.
  • the “pyrimidine nucleoside compound” is a pyrimidine nucleoside compound in which the carbon atom at the 5th or 6th position of the pyrimidine nucleus is substituted with the group represented by the formula (I) of the above “Chemical Formula 1”.
  • the group represented by the formula (I) can reversibly undergo cis-trans isomerization of the double bond moiety in response to light having two different wavelengths, the group is added to the base part of the nucleotide. By introducing, a nucleoside capable of reversibly changing the structure upon receiving light irradiation can be obtained.
  • a pyrimidine nucleoside compound is a glycoside compound containing a pyrimidine nucleus in which a pyrimidine base and a sugar ring base group are bonded by a glycosidic bond.
  • the “pyrimidine nucleus” is, for example, a thymine nucleus, cytosine nucleus or uracil nucleus. The pyrimidine nucleus is linked to the sugar at the 1st nitrogen atom.
  • the group of the above formula (I) is bonded to the 6-position carbon atom of the pyrimidine nucleus.
  • the group of the above formula (I) is preferably bonded to the carbon atom at the 5-position of the pyrimidine nucleus.
  • the pyrimidine nucleoside compound has the same configuration as the above-described purine nucleoside compound except for only the base portion. Therefore, for the definition of the symbol A in the above formula (I), the structure of the sugar moiety to which the pyrimidine nucleus can bind, the definition of terms, the synthesis method, its use and advantages, etc., the description in the purine nucleoside compound may be referred to as appropriate.
  • the present invention also relates to a method for controlling the amount of protein produced from the RNA described in the section [RNA according to the present invention].
  • the method includes the first light having a wavelength that changes the structure of the nucleoside compound from a trans form to a cis form by irradiation, and / or the structure of the nucleoside compound, from the cis form to the trans form by irradiation.
  • transcription of RNA can be started and / or stopped by irradiation with the first and / or second light in vivo or in vitro. That is, the first light is light having a wavelength that isomerizes from the trans form to the cis form and initiates translation of RNA, and the second light isomerizes from the cis form to the trans form and converts RNA. It is light having a wavelength that inhibits the start of translation.
  • the method further includes the step of introducing the RNA into a cell, and the step of irradiating the first light and / or the second light to the cell into which the RNA has been introduced. It is preferable that it is an irradiation process. Thereby, the amount of protein produced from RNA in the cell can be controlled.
  • the method irradiates in the order of the first light and the second light, or irradiates in the order of the second light and the first light. This allows reversible control of translation initiation and initiation inhibition.
  • the step of irradiating is a step of irradiating the first light to a local part of the cell into which the RNA has been introduced.
  • the step of irradiating light is a step of irradiating the region other than the local region with the second light simultaneously with the irradiation of the first light.
  • Local means a part of a cell (for example, about 5 to 10% of the area when the adsorbed cell is viewed from above), and more specifically indicates a region having a diameter of about 1 to 5 ⁇ m.
  • the method further includes a step of irradiating the region including the local area with the second light after the irradiation with the first light. According to this, reversible translation control can be performed locally.
  • the first light and / or the second light is preferably visible light. Since ultraviolet rays are harmful to a living cell or a living body, when the method according to the present invention is carried out as a living cell or a living body, the irradiated light is preferably visible light. When the method according to the present invention is performed in vitro, the irradiated light can be visible light or ultraviolet light.
  • the wavelength of the first light when two Xs are nitrogen atoms, the wavelength of the first light is 400 nm to 500 nm, and the wavelength of the second light is 450 nm to 600 nm. . At this time, the first light is always light having a shorter wavelength than the second light.
  • the wavelength of the first light when two Xs in the above formula (I) are CH, the wavelength of the first light is 300 nm to 500 nm, and the wavelength of the second light is 240 nm to 400 nm. It is. At this time, contrary to the case where the two X are nitrogen atoms, the first light is always light having a longer wavelength than the second light.
  • the wavelength of the first light is 300 nm to 500 nm
  • the second light has The wavelength is 240 nm to 450 nm.
  • the first light is always light having a longer wavelength than the second light.
  • the above method can isomerize RNA using two-photon excitation. Since two-photon excitation occurs only in the material at the focal plane, it allows control of RNA isomerization in three dimensions, ie, initiation of translation and inhibition of initiation.
  • the purine nucleoside compound of the present invention is a purine nucleoside compound in which the carbon atom at the 8-position of the purine nucleus is substituted with a group represented by the following formula (I ′).
  • A represents an aryl group or a heteroaryl group
  • two Xs are nitrogen atoms
  • # represents the bonding position with the 8-position carbon atom of the purine nucleus
  • the group represented by the formula (I ′) can undergo reversible cis-trans isomerization of the diazo moiety in response to visible light of two different wavelengths, by introducing the group into the base part of the nucleotide A nucleoside capable of reversibly changing its structure upon receiving visible light irradiation can be obtained. Since the structure can be changed by visible light, there is no possibility of damaging biomolecules (for example, proteins and DNA) when the nucleoside is introduced into living cells. Since the base is relatively small, the nucleotide chain into which the nucleoside has been introduced can form a normal structure when the nucleoside is structurally changed to one isomer.
  • biomolecules for example, proteins and DNA
  • the type, number and substitution position of the substituent are not particularly limited.
  • the substituent include a halogen atom (for example, a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom), an aryl group (preferably a substituted or unsubstituted aryl group having 5 to 30 carbon atoms, such as a phenyl group and a tolyl group.
  • Xylyl group mesityl group, biphenylyl group, naphthyl group, anthryl group, phenanthryl group, fluorenyl group, pyrenyl group), heteroaryl group (preferably 5- to 10-membered heteroaryl group such as pyrrolyl group, imidazolyl group, An indolyl group, a phenanthrolinyl group, a phenazinyl group, a thebenidinyl group, a 10H-kindolinyl group), an alkyl group (preferably a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, such as a methyl group, an ethyl group, a propyl group, Isopropyl group, n-butyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, -Pentyl group, neopentyl group, hexyl group, heptyl group,
  • the “purine nucleoside compound” is a glycoside compound containing a purine nucleus in which a purine base and a sugar reducing group are bonded by a glycosidic bond.
  • the “purine nucleus” in the present invention has the following structure.
  • Z 1 and Z 2 each independently represent a hydrogen atom or a substituent
  • n 1 represents 1 or 2
  • n 2 represents an integer in the range of 1 to 4, and is a double line consisting of a solid line and a broken line Represents a single bond or a double bond
  • # 1 represents a bonding position with a sugar.
  • n1 and n2 are 2 or more, a plurality of Z 1 and Z 2 are the same or different).
  • the carbon atom at the 8-position of the purine nucleus is substituted with a group represented by the above formula (I ′).
  • the isomerization of the diazo moiety results in either the following trans isomer (E-isomer) or cis isomer (Z-isomer).
  • A represents an aryl group or a heteroaryl group.
  • the aryl group has, for example, 5 to 30 carbon atoms and can be either monocyclic or polycyclic.
  • the aryl group may have a substituent.
  • Examples of the aryl group include a substituted or unsubstituted phenyl group and a naphthyl group.
  • aryl group a phenyl group; a naphthyl group, an as-indacenyl group, an s-indacenyl group, an acenaphthylenyl group, a 9H-fluorenyl group, a phenanthryl group, an anthryl group, a fluoranthenyl group, an acephenanthrenylenyl group, an ASEAN
  • An aryl group having 10 to 20 atoms constituting a ring such as a trirenyl group, triphenylenyl group, pyrenyl group, chrycenyl group, tetraphenyl group, naphthacenyl group and perylenyl group; a ring such as a picenyl group, a pentaphenyl group and a pentacenyl group Examples thereof include, but are not limited to, an aryl group having 21 to 30 atoms.
  • the aryl group is preferably an aryl group having 6 to 10 atoms constituting the ring and a substituted or unsubstituted phenyl group.
  • the substituted phenyl group include a phenyl group having an electron donating group or an electron withdrawing group such as a nitro group, a diethylamino group, a dimethylamino group, a trifluoromethyl group, a methoxy group, a carbonyl group or a halogen as a substituent. .
  • an aryl group having 6 to 10 atoms constituting the ring and a substituted or unsubstituted phenyl group are preferable, and a substituted or unsubstituted aryl group formed by condensing two rings and a substituted or unsubstituted aryl group.
  • a phenyl group is more preferable, and a methyl-substituted or unsubstituted phenyl group is particularly preferable.
  • heteroaryl group represented by A examples include a 5- to 10-membered heteroaryl group containing, as a ring-constituting atom, one or more heteroatoms selected from the group consisting of a nitrogen atom, an oxygen atom, and a sulfur atom. And can be either monocyclic or polycyclic. More preferably, a 5-membered or 6-membered heteroaryl group containing 1 or 2 nitrogen atoms as a ring-constituting atom is included, and more preferably a 5-membered ring or 6 containing 1 nitrogen atom as a ring-constituting atom. Examples include membered heteroaryl groups. The heteroaryl group may have a substituent.
  • heteroaryl group examples include a monocyclic heteroaryl group having 5 or 6 atoms constituting a ring containing a nitrogen atom as a heteroatom such as a substituted or unsubstituted pyrrolyl group or imidazolyl group; A condensed cyclic heteroaryl group having 7 to 9 atoms constituting a ring containing a nitrogen atom; quinolinyl group, 2,7-naphthyridinyl group, 2,6-naphthyridinyl group, 1,6-naphthyridinyl group, 1,5- Naphthyridinyl group, quinoxalinyl group, quinazolinyl group, cinnolinyl group, 9H-carbazolyl group, 9H- ⁇ -carbolinyl group, phenanthridinyl group, 1H-perimidinyl group, 4,7-phenanthrolinyl group, 3,8-fe Phenan
  • the bonding position of the aryl group and heteroaryl group with the diazo bond moiety is not particularly limited, and may be appropriately selected according to the group used, the synthesis method, and the like.
  • the group represented by the formula (I ′) is bonded to the carbon atom at the 8-position of the purine nucleus at the position represented by # 1 in the formula (I ′).
  • the structure of the sugar moiety to which the purine nucleus substituted with the group represented by the formula (I ′) is glycosidically bonded is not particularly limited, and examples thereof include sugar moieties contained in known nucleoside compounds. Includes a sugar moiety contained in the formula (II) or (III) described later.
  • guanosine derivative represented by the following formula (II) in which the carbon atom at the 8-position of the purine nucleus is substituted with a group represented by the above formula (I ′), and Adenosine derivatives represented by the formula (III) are mentioned.
  • the purine nucleoside compound of the present invention can be not only the trans form but also the cis form.
  • R 1 and R 2 are independently of each other using a hydroxyl group or a protecting group thereof, a reactive group that can be introduced for the production of oligonucleotides, or self-assembly of nucleoside derivatives Represents an atomic group that can be introduced.
  • R 3 represents a hydrogen atom, a hydroxyl group or a protecting group thereof, a reactive group that can be introduced for the production of an oligonucleotide, or an atomic group that can be introduced when utilizing the self-assembly of a nucleoside derivative.
  • Examples of the protecting group include isobutyl, tert-butyldimethylsilyl (TBDMS), dimethoxytrityl (DMTr), and the reactive group includes 2-cyanoethyl-N, N, N ′, N′-tetraisopropyl.
  • Examples include phosphoramidites, monophosphates, diphosphates, and triphosphates. The details of the above atomic groups are described in Isao Yoshikawa, et al., Tetrahedron 63 (2007) 7474-7481, Jeffery T. Davis, et al Chem. Soc. Rev., 2007, 36, 296-313, Gian Piero Spada. , et al., SYNLETT 2004, No.
  • atomic group examples include —OR (where R is an alkylsilyl group (eg, Si (iPr) 2 C 8 H 17 and the like)) and an ester group, and R 1 to R 3 are Two or more can be linked to form a ring.
  • R 4 represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted amino group or a protecting group thereof.
  • the protecting group include an isobutyl group and a dimethylformamidine (DMF) group.
  • More specific embodiments of the guanosine derivative represented by the formula (II) include compounds represented by the following formula (II) -1 and formula (II) -2, which are represented by the formula (III) More specific embodiments of the adenosine derivative include compounds represented by the following formula (III) -1 and formula (III) -2.
  • the method for synthesizing the purine nucleoside compound of the present invention is not particularly limited, but azo coupling using aniline, a purine nucleoside derivative, and nitrite allows the purine nucleoside compound to have the formula (I ′ ), A purine nucleoside compound having a group represented by the formula (I ′) can be obtained.
  • a mixture of aniline, purine nucleus, and nitrite is heated to reflux for several hours, and after the reaction, the solvent is removed using an evaporator and purified using methods such as column purification, recrystallization, and washing. Can be obtained.
  • the purine nucleoside compound represented by the formula (I ′) may form a salt depending on the type of functional group or substituent, and forms a hydrate or a solvate in a free state or a salt state. However, these states are also included in the scope of the present invention.
  • the purine nucleoside compound of the present invention can reversibly control the structural change (isomerization).
  • the structure of the purine nucleoside compound of the present invention can be easily controlled because the structure is changed by a simple method of turning on / off the light source.
  • nucleic acid synthesis by using an appropriate polymerase.
  • nitrogen atom at the 7-position of the purine ring is involved in interactions in nucleic acids (such as hydrogen bonds and coordinate bonds to metal ions).
  • nucleic acid containing the purine nucleoside compound of the present invention inhibition of the above interaction can be controlled by trans ⁇ cis isomerization of the group represented by the formula (I ′) substituted at the carbon atom at the 8-position of the purine ring. It is considered that more accurate activity control is possible.
  • nucleic acid containing the purine nucleoside compound of the present invention has undergone a minimum modification, the formation of higher-order structures such as DNA and RNA double helix structures, ribozymes, deoxyribozymes and aptamers, It can be carried out satisfactorily without being affected by the above modification.
  • the purine nucleoside compound of the present invention can be easily introduced into a nucleic acid by a nucleic acid amplification technique such as a PCR method or an RCA method for the same reason.
  • the pyrimidine nucleoside compound of the present invention is a pyrimidine nucleoside compound in which the carbon atom at the 5-position or 6-position of the pyrimidine nucleus is substituted with a group represented by the formula (I ′) of the above “Chemical Formula 6”.
  • the group represented by the formula (I ′) can undergo reversible cis-trans isomerization of the diazo moiety in response to visible light of two different wavelengths, by introducing the group into the base part of the nucleotide A nucleoside capable of reversibly changing its structure upon receiving visible light irradiation can be obtained. Since the structure can be changed by visible light, there is no possibility of damaging biomolecules (for example, proteins and DNA) when the nucleoside is introduced into living cells. Since the base is relatively small, the nucleotide chain into which the nucleoside has been introduced can form a normal structure when the nucleoside is structurally changed to one isomer.
  • biomolecules for example, proteins and DNA
  • the pyrimidine nucleoside compound of the present invention is a glycoside compound containing a pyrimidine nucleus in which a pyrimidine base and a sugar ring base group are bonded by a glycosidic bond.
  • the “pyrimidine nucleus” of the present invention is, for example, a thymine nucleus, a cytosine nucleus or a uracil nucleus.
  • the pyrimidine nucleus of the present invention is linked to a sugar at the 1-position nitrogen atom.
  • the group of the above formula (I ′) is bonded to the 6-position carbon atom of the pyrimidine nucleus. Further, when the pyrimidine nucleus is a cytosine nucleus or a uracil nucleus, the group of the above formula (I ′) is preferably bonded to the 5-position carbon atom of the pyrimidine nucleus.
  • the pyrimidine nucleoside compound of the present invention has the same configuration as the above-described purine nucleoside compound except for only the base moiety. Therefore, for the definition of the symbol A in the above formula (I ′), the structure of the sugar moiety to which the pyrimidine nucleus can bind, the definition of terms, the synthesis method, its use and advantages, etc., refer to the description in (Purine nucleoside compound) as appropriate. That's fine.
  • the present invention provides a method for isomerizing the nucleoside compound by irradiating the nucleoside compound of the present invention with visible light, and the optical properties of the nucleoside compound by irradiating the nucleoside compound of the present invention with visible light. It relates to how to change.
  • the nucleoside compound of the present invention can reversibly cause cis-trans isomerization of the diazo moiety in the group represented by the general formula (I).
  • the nucleoside compound of the present invention has high stability in both trans and cis forms. Therefore, isomerization (trans ⁇ cis isomerization and cis ⁇ trans isomerization) can be controlled by irradiation with light in the nucleoside compound of the present invention unless it is irradiated with light.
  • Trans ⁇ cis isomerization can occur by irradiating the trans form with visible light having a medium wavelength (for example, a wavelength of 400 to 500 nm).
  • the cis ⁇ trans isomerization can be caused by irradiating the cis isomer with visible light having a wavelength longer than that used for the trans ⁇ cis isomerization (for example, a wavelength of 450 to 600 nm).
  • a wavelength longer than that used for the trans ⁇ cis isomerization for example, a wavelength of 450 to 600 nm.
  • a in the above general formula (I) is a phenyl group or a phenyl group having a substituent
  • trans ⁇ cis isomerization occurs by irradiation with visible light of 400 to 450 nm
  • cis ⁇ trans isomerization is 500 Occurs by irradiation with visible light of ⁇ 600 nm.
  • Both trans ⁇ cis photoisomerization and cis ⁇ trans photoisomerization can proceed easily at room temperature.
  • the isomerization conditions such as the light irradiation time for isomerization, the light source to be used and the intensity of the irradiation light may be set as appropriate.
  • the examples described later may also be referred to.
  • the nucleoside compound of the present invention differs in optical properties such as absorption spectrum and quantum yield between the trans isomer and the cis isomer. Therefore, the photophysical properties of the nucleoside compound of the present invention can be changed by isomerization by irradiation with visible light. Furthermore, since the photoisomerization can occur reversibly, the optical properties of the compound can be reversibly changed by repeatedly irradiating the nucleoside compound of the present invention with visible light having different wavelengths.
  • the light irradiation conditions for changing the light characteristics are as described above.
  • the present invention relates to a nucleic acid containing the nucleoside compound of the present invention, or an optical switching device material containing the nucleoside compound of the present invention.
  • the optical switching device material of the present invention may be composed of one or more of the above nucleoside compounds or nucleic acids, or may contain other components commonly used in electronic devices.
  • the “light switching type” refers to a property whose function and structure can be switched by irradiation with visible light.
  • the nucleoside compound of the present invention can be reversibly isomerized by irradiation with visible light to change the structure, and the optical properties can be changed accordingly.
  • an electronic device such as a switching element or a storage element can be formed.
  • the optical switching device material of the present invention is suitable as an optical switch of an optically driven nanodevice.
  • RNA interference can be reversibly photocontrolled by introducing the nucleoside compound of the present invention into an oligonucleotide of about 20 bases and controlling the formation of a double helix with the target RNA.
  • 8-styrylguanosine (6a of Chemical formula 11) was placed in a two-necked eggplant-type flask, and the system was sufficiently purged with nitrogen by repeating nitrogen substitution under reduced pressure three times. After adding 1 mL of trimethyl phosphate and 91 mg proton sponge, the system was cooled to 0 ° C. Next, 31 ⁇ L of phosphoryl chloride was added and stirred at 0 ° C. After 6 hours, 269 ⁇ L of tributylamine, 250 mg of tributylammonium pyrophosphate were added and stirred for an additional 1 minute.
  • the reaction was stopped by adding 37 mL of 1 M TEAB buffer, and then purified using DEAE Sephadex (0-1 M TEAB). After collecting the fraction containing the desired product and removing the solvent, the obtained 8-styrylguanosine triphosphate (TEA salt) was used with a weak anion exchange column (Strata-X-AW, SHIGMA Co.). Thus, it was converted into a free acid to obtain 7.2 mg of 8-styrylguanosine triphosphate (Chemical Formula 12) as the target compound.
  • TEA salt 8-styrylguanosine triphosphate
  • the precipitate was collected and washed with water, and then sufficiently dried in a desiccator.
  • the obtained monophosphate was put into a two-necked eggplant type flask, and nitrogen substitution under reduced pressure was repeated three times to sufficiently substitute the inside of the system with nitrogen.
  • An additional 25 mL DMSO and 2 mL methyl iodide were added and stirred overnight at room temperature.
  • 100 mL of cold water was added to the reaction solution, and the precipitate was collected and washed with methanol.
  • the resulting monophosphate methylated at the 7-position was placed in a two-necked eggplant-type flask, and nitrogen substitution under reduced pressure was repeated three times to sufficiently purge the system with nitrogen.
  • the resulting monophosphate methylated at the 7-position was placed in a two-necked eggplant-type flask, and nitrogen substitution under reduced pressure was repeated three times to sufficiently purge the system with nitrogen.
  • An additional 10 mL of N, N-dimethylformamide (DMF), 308 mg imidazole, 476 mg triphenylphosphine, 401 mg aldolthiol, and 0.501 mL triethylamine were added and stirred overnight at room temperature.
  • the reaction solution was poured into an acetone solution in which 401 mg of sodium perchlorate had been dissolved, and stirred at 4 ° C. for 2 hours. The precipitate was collected and washed with cooled acetone, and then sufficiently dried in a desiccator.
  • the obtained compound and 715 mg of GDP were placed in a two-necked eggplant type flask, and nitrogen substitution under reduced pressure was repeated three times to sufficiently purge the system with nitrogen.
  • An additional 25 mL DMF and 455 mg zinc chloride were added and stirred at room temperature for 60 hours.
  • the reaction solution was poured into an aqueous solution in which 2.19 g of EDTA was dissolved, and 1 M TEAB buffer was added to adjust the pH of the reaction solution to 5.5. Then, it was purified using DEAE Sephadex (0-1 M TAEB buffer).
  • the obtained 8NV-cap (TEA salt) was converted to the free acid using a weak anion exchange column (Strata-X-AW, SHIGMA Co.). Conversion was performed to obtain 92 mg of 8NV-cap (Chemical Formula 13 2b) as the target compound.
  • the resulting monophosphate methylated at the 7-position was placed in a two-necked eggplant type flask, and nitrogen substitution under reduced pressure was repeated three times to sufficiently purge the system with nitrogen.
  • An additional 5 mL DMF, 120 mg imidazole, 185 mg triphenylphosphine, 155 mg aldrithiol, and 0.196 mL triethylamine were added and stirred at room temperature overnight.
  • the reaction solution was poured into an acetone solution in which 150 mg of sodium perchlorate had been dissolved, and stirred at 4 ° C. for 2 hours. The precipitate was collected and washed with cooled acetone, and then sufficiently dried in a desiccator.
  • the obtained compound and 395 mg of GDP were placed in a two-neck eggplant type flask, and nitrogen substitution under reduced pressure was repeated three times to sufficiently purge the system with nitrogen.
  • An additional 15 mL of DMF and 250 mg of zinc chloride was added and stirred at room temperature for 60 hours.
  • the reaction solution was poured into an aqueous solution in which 1.23 g of EDTA was dissolved, and 1M TEAB buffer was added to adjust the pH of the reaction solution to 5.5. Then, it was purified using DEAE Sephadex (0-1 M TAEB buffer).
  • the obtained 8FV-cap (TEA salt) was converted into the free acid using a weak anion exchange column (Strata-X-AW, SHIGMA Co.). Conversion was performed to obtain 85 mg of 8FV-cap (2c of Chemical formula 13), which is the target compound.
  • the resulting monophosphate methylated at the 7-position was placed in a two-necked eggplant-type flask, and nitrogen substitution under reduced pressure was repeated three times to sufficiently purge the system with nitrogen.
  • An additional 20 mL DMF, 575 mg imidazole, 887 mg triphenylphosphine, 745 mg aldrithiol, and 0.936 mL triethylamine were added and stirred at room temperature overnight.
  • the reaction solution was poured into an acetone solution in which 750 mg of sodium perchlorate had been dissolved, and stirred at 4 ° C. for 2 hours. The precipitate was collected and washed with cooled acetone, and then sufficiently dried in a desiccator.
  • the obtained compound and 760 mg of GDP were placed in a two-neck eggplant type flask, and nitrogen substitution under reduced pressure was repeated three times to sufficiently purge the system with nitrogen.
  • An additional 45 mL of DMF and 876 mg of zinc chloride was added and stirred at room temperature for 60 hours.
  • the reaction solution was poured into an aqueous solution in which 4.21 g of EDTA was dissolved, and 1 M TEAB buffer was added to adjust the pH of the reaction solution to 5.5. Then, it was purified using DEAE Sephadex (0-1 M TAEB buffer).
  • the obtained 8PV-cap (TEA salt) was converted to the free acid using a weak anion exchange column (Strata-X-AW, SHIGMA Co.). Conversion was performed to obtain 87 mg of 8PT-cap (2d of Chemical formula 13), which is the target compound.
  • RNA containing photoresponsive 5'cap into protein RNA encoding GFP containing photoresponsive 5'cap synthesized in (1-2) Each of the four types was synthesized using a cell-free transcription kit (MEGAscript, Ambion Co.). GFP was synthesized from each of the above RNAs using a cell-free protein translation system (Transdirect direct cell, SIGMA Co.). As a comparative control, mRNA (with or without cap structure) encoding GFP in addition to the above RNA was further used. The expression level of GFP from each RNA was compared via the fluorescence intensity of GFP. For RNA containing a light-responsive 5′cap, the expression level between the cis type and the trans type (the upper part of FIG. 1) was also compared. The result is shown in FIG. In FIG. 1, no-cap is mRNA without a cap structure, and normal-cap is mRNA with a normal cap structure.
  • RNA containing photoresponsive 5'cap had a higher expression level in the cis type than in the trans type.
  • RNA containing 8NV-cap expressed almost no protein when in the trans form, and showed an expression level equivalent to that of normal-cap when in the cis form. Therefore, it can be said that 8NV-cap showed a good property as a photoresponsive 5'cap.
  • data regarding RNA containing 8PV-cap is not shown. 8PV-cap has high hydrophobicity, and therefore, it is highly likely that it has not been introduced into mRNA. Therefore, it could not be judged whether the result of the translation control test on RNA containing 8PV-cap was due to the action of the nucleoside compound according to the present invention.
  • FIG. 2 shows the transition of the fluorescence intensity of GFP (bottom) and the structure of RNA containing 8NV-cap (upper).
  • the fluorescence intensity of GFP was constant during the first 60 minutes, and no expression of GFP was observed from RNA containing 8NV-cap (lower graph). .
  • an increase in the fluorescence intensity of GFP was observed, and expression of GFP from RNA containing 8NV-cap was observed.
  • the increase in the fluorescence intensity of GFP gradually becomes gradual, staying at a certain intensity, and it is recognized that the expression of GFP from RNA containing 8NV-cap is stopped. It was.
  • the normal-cap always showed an increase in the fluorescence intensity of GFP, indicating the expression of GFP.
  • the conversion from RNA (8NV-cap) to protein according to the present example repeatedly stops and starts reversibly by alternating irradiation of two lights having different wavelengths. It was.
  • Solution 1 was prepared by adding 37 wt% hydrochloric acid (12 mL) and 1.48 g of p-anisidine to 60 mL of water with cooling. 3.0 g guanosine was dissolved in 1.5 wt% aqueous NaOH (600 mL) and cooled in an ice bath. To this was added NaNO 2 (828 mg) aqueous solution and Solution 1 and stirred at 0 ° C. for 30 minutes. After the reaction, acetic acid was added to precipitate the reaction product, which was allowed to stand for 2 hours. The deposited precipitate was collected by filtration to obtain 3.73 g of 8- (4-methoxyphenyl) azoguanine (Chemical Formula 14-2).
  • Solution 2 was prepared by adding 37 wt% hydrochloric acid (6 mL) and 1.00 g aminoquinoline to 30 mL water with cooling. 1.74 g guanosine was dissolved in 1.5 wt% aqueous NaOH (300 mL) and cooled in an ice bath. To this was added NaNO 2 (479 mg) aqueous solution and Solution 2 and stirred at 0 ° C. for 30 minutes. After the reaction, acetic acid was added to precipitate the reaction product, which was allowed to stand for 2 hours. The deposited precipitate was collected by filtration to obtain 2.23 g of 8- (6-aminoquinolyl) azoguanine (Chemical Formula 15-2).
  • Solution 3 was prepared by adding 37 wt% hydrochloric acid (12 mL) and 1.50 mL 4-ethylaniline to 60 mL water with cooling. 3.00 g guanosine was dissolved in 1.5 wt% aqueous NaOH (600 mL) and cooled in an ice bath. To this was added NaNO 2 (828 mg) aqueous solution and Solution 3 and stirred at 0 ° C. for 30 minutes. After the reaction, acetic acid was added to precipitate the reaction product, which was allowed to stand for 2 hours. The deposited precipitate was collected by filtration to obtain 3.84 g of 8- (4-ethylphenyl) azoguanine (Chemical Formula 16-2).
  • RNA encoding GFP was synthesized using a cell-free transcription kit (MEGAscript, Ambion Co.). After the synthesis reaction, RNA containing 5 ′ cap was purified using mRNA kit MEGAclear (Ambion Co.). RNA obtained using water containing no nuclease was diluted to 2 ⁇ M and injected into HeLa cells by microinjection. After the injection, simultaneously using a confocal laser microscope, only a specific region of the cell was irradiated with 458 nm light, and the other region was irradiated with 543 nm light for 30 minutes. The results of observation of fluorescence from GFP at this time (lower) and the structure of the RNA used (upper) are shown in FIG.
  • the RNA of this example can be isomerized from a cis form to a trans form by applying heat (for example, room temperature) without irradiation with light of 500 nm to 600 nm.
  • heat for example, room temperature
  • ⁇ in “500 to 600 nm or ⁇ ” shown in the upper part of FIG. 3 means RNA isomerization (from cis form to trans form) by heat. That is, the RNA of this example suppresses the start of translation by irradiating light of, for example, 458 nm to a cell region where translation is desired in the dark, and interrupting the light irradiation at room temperature. Subsequent protein expression can be stopped. In “Chemical 19” and “Chemical 21” described later, “ ⁇ ” means the same thing.
  • Solution A was prepared by adding 37 wt% hydrochloric acid (6 ml) and aniline (549 ml) to 42 ml water with cooling. 1.5 g of guanosine was dissolved in a 1.5 wt% aqueous NaOH solution (300 ml) and cooled in an ice bath. An aqueous NaNO 2 solution (414 mg) and Solution A were added to the ice bath and stirred at 0 ° C. for 30 minutes. After the reaction, acetic acid was added to precipitate the reaction product, which was allowed to stand for 2 hours. The precipitate was collected by filtration to obtain 1.61 g of 8-phenylazoguanine (Chemical Formula 18-2).
  • (3-2-1) Photoisomerization from trans-isomer to cis-isomer
  • concentration of trans-8-phenylazoguanosine obtained in (3-1) is 25 ⁇ M.
  • a stock solution was prepared by dissolving in methanol. 200 ⁇ l of the stock solution was transferred to a 1 cm square quartz cell, irradiated with visible light at a wavelength of 420 nm in the dark, and the photoisomerization of trans-8-phenylazoguanosine was measured by measuring the time course of the absorption spectrum. evaluated.
  • Asahi Spectroscopy's MAX-301 is used as the light source, and the company's M.I. C. 420/10 nm was used. The result is shown in FIG.
  • Solution B was prepared by adding 37 wt% hydrochloric acid (4 ml) and 428 mg p-toluidine to 28 ml water. It was dissolved in 1.0 g of guanosine 1.5 wt% NaOH aqueous solution (200 ml) and cooled in an ice bath. An aqueous NaNO 2 solution (275 mg) and Solution A were added to the ice bath and stirred at 0 ° C. for 30 minutes. After the reaction, acetic acid was added to precipitate the reaction product, which was allowed to stand for 2 hours. The precipitate was collected by filtration to obtain 1.17 g of 8- (p-toluylazo) guanine (Chemical 20-2).
  • Reaction 3 ⁇ 4 in Chemical Formula 20 777 mg of 2-N-acetyl-8- (p-toluylazo) guanine was placed in a two-necked eggplant type flask, and the system was sufficiently substituted with nitrogen by repeating nitrogen substitution three times under reduced pressure.
  • To this two-necked eggplant type flask 30 ml of dichloroethane and 4.38 ml of N, O-bis (trimethylsilyl) acetamide were added and heated to reflux at 80 ° C. for 1 hour. After the reaction, the solvent was removed using a rotary evaporator. The flask containing the reaction product was purged with nitrogen under reduced pressure three times to sufficiently replace the system with nitrogen.
  • Reaction 4 ⁇ 5 in Chemical Formula 20 1.07 g of 2 ′, 3 ′, 5′-O-acetyl-2-N-acetyl-8- (p-toluylazo) guanosine was placed in a two-necked eggplant type flask and repeated three times with nitrogen substitution under reduced pressure. The system was thoroughly replaced with nitrogen. To this two-necked eggplant type flask, 15 ml of methanol and 15 ml of a methanol solution of ammonia were added and stirred at 60 ° C. for 4 hours. After the reaction, the precipitate was collected by filtration and washed with methanol to obtain 572 mg of cis-8- (p-toluylazo) guanosine (Chemical Formula 20-5).
  • Reaction 3 ⁇ 4 in Chemical Formula 22 300 mg of 2-N-isobutyl-8-phenylazoguanine was placed in a two-necked eggplant type flask, and the system was sufficiently replaced with nitrogen by repeating the nitrogen replacement three times under reduced pressure.
  • 10 ml of dichloroethane and 1.62 ml of N, O-bis (trimethylsilyl) acetamide were added and heated to reflux at 80 ° C. for 1 hour. After the reaction, the solvent was removed using a rotary evaporator. The flask containing the reaction product was purged with nitrogen under reduced pressure three times to sufficiently replace the system with nitrogen.
  • Reaction 4 ⁇ 5 in Chemical Formula 22 164 mg of 3 ′, 5′-O-toluol-2-N-isobutyl-8-phenylazo-2′deoxyguanosine was placed in a two-necked eggplant type flask and repeated three times with nitrogen under reduced pressure until the inside of the system was fully Replaced with nitrogen. Add 3.5 ml of methanol, 6.5 ml of pyridine and 39.2 mg of sodium methoxide to the two-necked eggplant type flask, and stir for 2 hours while cooling using an ice bath, and then at room temperature for 30 minutes.
  • the present invention is expected to be applied to the biological and medical fields, particularly regenerative medical technology.

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Abstract

　本発明のＲＮＡは、５'キャップ構造、ならびに５'側の開始コドンおよび３'側の終止コドンを両端に有している翻訳領域を含んでいるＲＮＡであって、　プリン核の８位またはピリミジン核の５位もしくは６位の炭素原子に、式（Ｉ）：（ここで、Ａがアリール基またはヘテロアリール基を表し、＃がプリン核の８位またはピリミジン核の５位もしくは６位の炭素原子との結合位置を表し、同一であるか、または異なる２つのＸがＣＨまたは窒素原子を表し、ここでＣＨラジカルのＨがアルキルによって置換され得る） によって表される基が結合しているヌクレオシド化合物が、上記ＲＮＡの５'キャップ構造および５'末端から１０塩基までの塩基から選択される位置に導入されている。

Description

ヌクレオシド化合物を含んでいるＲＮＡ、当該ＲＮＡからのタンパク質の産生量を制御する方法、およびヌクレオシド化合物
　本発明は、ヌクレオシド化合物を含んでいるＲＮＡ、当該ＲＮＡからのタンパク質の産生量を制御する方法、およびヌクレオシド化合物に関する。上記ＲＮＡは、上記ヌクレオシド化合物の光異性化によってその翻訳が制御され得る。
　タンパク質の発現を短い期間において厳密に制御するには、ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳過程を制御する必要がある。ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写を制御した場合、転写を抑制しても、ｍＲＮＡが分解を受けるまで翻訳が継続し続けるからである。
　細胞内に注入したｍＲＮＡの翻訳を、所定の波長を有している光の照射を当該ｍＲＮＡが受けるまで、停止させる技術が存在する（非特許文献１）。この技術において、注入されるｍＲＮＡにあらかじめケージ化合物が結合しており、ケージ化合物によってリポソームのｍＲＮＡ上の移動が妨げられている。上記ケージ化合物は、所定の波長を有している光の照射を受けると、ｍＲＮＡから解離する。したがって、この技術を利用すれば、所望のタイミングにおいてｍＲＮＡの翻訳を開始させることができる。
日本国公開特許公報「特開２００９－１１４１７１号公報」（２００９年５月２８日公開）
H. Ando, T. Furuta, R. Y. Tsien, H. Okamoto "Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos" Nat. genetics. 2001, 28, 317-325. S. Ogasawara, I. Saito, M. Maeda "Synthesis and reversible photoisomerization of photoswitchable nucleoside, 8-styryl-2’-deoxyguanosine" Tetrahedron Lett. 2008, 49, 2479-2482. S. Ogasawara, M. Maeda "Straightforward and Reversible Photoregulation of Hybridization using Photochromic Nucleoside" Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 8839-8842. S. Ogasawara, M. Maeda "Reversible Photoswitching of a G-Quadruplex" Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 6671-6674.
　しかし、上述の従来技術において、開始させた翻訳はｍＲＮＡが分解されるまで停止しない。解離したケージ化合物がｍＲＮＡに結合しないからである。このため、タンパク質の産生量は制御され得ない。また、ケージ化合物をｍＲＮＡから解離させる光を照射した後に、当該ｍＲＮＡは、光照射された範囲から拡散する。拡散後のｍＲＮＡからのタンパク質への翻訳は停止しないため、所望のタンパク質を局所的に発現させることはできない。すなわち、当該従来技術によって細胞内における局所的なタンパク質発現を可逆的に制御することはできない。
　ここで、例えば、未分化の細胞では、特定の領域に特定のｍＲＮＡが局在し、当該領域においてタンパク質への翻訳が特定の時期に行われ得ることが知られている。この特定の領域におけるタンパク質の一時的な発現が、分化する細胞の種類を決定し得る。つまり、生命現象を精密に制御する必要がある再生医療技術などの開発、またはさらなる生命現象を解明する研究には、特定の領域において所望のタイミングから特定の期間にわたって、特定のｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を起こさせ、かつ特定の期間の経過後に当該翻訳を停止させてタンパク質の産生量を制御し得る技術が必要になってくる。
　上述のような背景から鑑みて、本発明の目的は、特定の波長を有している光の照射によってタンパク質の産生量を自在に制御し得るＲＮＡを提供することである。
　上記課題を解決するために、本発明のＲＮＡは、５’キャップ構造、ならびに５’側の開始コドンおよび３’側の終止コドンを両端に有している翻訳領域を含んでおり、
　プリン核の８位またはピリミジン核の５位もしくは６位の炭素原子に、式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　（ここで、Ａがアリール基またはヘテロアリール基を表し、＃がプリン核の８位またはピリミジン核の５位もしくは６位の炭素原子との結合位置を表し、同一であるか、または異なる２つのＸがＣＨまたは窒素原子を表し、ここでＣＨラジカルのＨがアルキルによって置換され得る）
によって表される基が結合しているヌクレオシド化合物が、上記ＲＮＡの５’キャップ構造および５’末端から１０塩基までの塩基から選択される位置に導入されている。
　また、上記課題を解決するために、本発明のＲＮＡからのタンパク質の産生量を制御する方法は、上記ヌクレオシド化合物の構造を、その照射によってトランス型からシス型にする波長を有している第１の光、および／または上記ヌクレオシド化合物の構造を、その照射によってシス型からトランス型にする波長を有している第２の光を、上記ＲＮＡに照射する工程を包含している。
　また、本発明のヌクレオシド化合物は、プリン核の８位またはピリミジン核の５位もしくは６位の炭素原子に、式（Ｉ’）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
（ここで、Ａがアリール基またはヘテロアリール基を表し、＃がプリン核の８位またはピリミジン核の５位もしくは６位の炭素原子との結合位置を表し、２つのＸが、同一であり、窒素原子を表す）
によって表される基が結合している。
　本発明は、空間および時期を選択して可逆的に、その翻訳によって産生されるタンパク質の量を制御可能なＲＮＡを提供するという効果を奏する。
本発明の実施例１に使用したＲＮＡの概略の構造、ならびに当該ＲＮＡの翻訳レベルおよび翻訳の光制御の比較を示す図である。 ＧＦＰをコードしている本発明に係るＲＮＡの翻訳のインビトロにおける制御を、異なる波長の光の照射およびＧＦＰの蛍光強度によって証明している図である。 ＧＦＰをコードしている本発明に係るＲＮＡの翻訳の細胞内における局所的な制御を、ＧＦＰの蛍光によって証明している図である。 ４２０ｎｍ（上段）および５５０ｎｍ（下段）の光を照射したときの、実施例３において得られた化合物の吸収スペクトルの経時変化を示す図である。 ４２０ｎｍの光および５５０ｎｍの光を交互に照射したときの、実施例４において得られた化合物の吸光度の変化を示す図である。 ４２０ｎｍ（上段）および５５０ｎｍ（下段）の光を照射したときの、実施例４において得られた化合物の吸収スペクトルの変化を示す。
　〔本発明に係るＲＮＡ〕
　（ＲＮＡの構造）
　本発明に係るＲＮＡは、５’キャップ構造、ならびに５’側の開始コドンおよび３’側の終止コドンを両端に有している翻訳領域を含んでいる。本発明に係るＲＮＡは、さらにプリン核の８位またはピリミジン核の５位もしくは６位の炭素原子に、式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
（ここで、Ａがアリール基またはヘテロアリール基を表し、＃がプリン核の８位またはピリミジン核の５位もしくは６位の炭素原子との結合位置を表し、同一であるか、または異なる２つのＸがＣＨまたは窒素原子を表し、ここでＣＨラジカルのＨがアルキルによって置換され得る）
によって表される基が結合しているヌクレオシド化合物が、上記ＲＮＡの５’キャップ構造および５’末端から１０塩基までの塩基から選択される位置に導入されている。
　式（Ｉ）によって表されている基は、異なる２つの波長の光を受けて二重結合部分のシス－トランス異性化を可逆的に起こし得る。したがって、ヌクレシオドの塩基部分に当該基を導入することによって、光照射を受けて可逆的に構造変化し得るヌクレオシド化合物を得ることができる。このようにして得られたヌクレオシド化合物を上記ＲＮＡの上述の位置に導入することによって、翻訳の開始に関与する因子との結合の可否をヌクレオシド化合物の構造変化にしたがって決定し得るＲＮＡを得ることができる。
　より詳細には、上記ＲＮＡがシス型であるとき、当該ＲＮＡは翻訳の開始に関与する因子との結合を生じ得、一方で、上記ＲＮＡがトランス型であるとき、当該ＲＮＡは翻訳の開始に関与する因子との結合を生じ得ない。つまり、本発明のＲＮＡは、照射される光の波長に応じて翻訳の開始可能な構造から開始不可能な構造へ、そしてその逆へと可逆的に構造変化を起こして、当該ＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質の量を制御し得る。
　上記ヌクレオシド化合物は、本発明に係るＲＮＡにおいて、５’キャップ構造に導入されていることが好ましい。このような場合、本発明に係るＲＮＡは、トランス型であるとき、翻訳の開始因子との結合を生じないため、より確実に翻訳の開始を阻害し得る。
　式（Ｉ）において、両方のＸが窒素原子であることが好ましい。両方のＸが窒素原子であれば、本発明に係るＲＮＡは、可視光の照射によって可逆的に異性化し得る。この構成の利点は、生体内に本発明に係るＲＮＡを導入して、当該ＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質の量を制御する場合に、生体に有害な作用を及ぼす紫外光を用いる必要がないことである。
　式（Ｉ）において、ＸがＣＨである場合に、Ｈはアルキルによって置換されいてもよい。置換基であるアルキルは、上記ヌクレオシド化合物のシス－トランス異性化を妨げない大きさのアルキル、例えばＣ１－５アルキル、好ましくはＣ１－３アルキルである。
　本明細書において、ある官能基または原子が置換基を有し得る場合、置換基の種類、その数および置換位置は、特に限定されない。当該置換基の具体例として、ハロゲン原子（例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子）、アリール基（好ましくは炭素数５～３０の置換または無置換のアリール基、例えばフェニル基、トリル基、キシリル基、メシチル基、ビフェニリル基、ナフチル基、アントリル基、フェナントリル基、フルオレニル基、ピレニル基）、ヘテロアリール基（好ましくは５～１０員環のヘテロアリール基、例えば、ピロリル基、イミダゾリル基、インドリル基、フェナントロリニル基、フェナジニル基、テベニジニル基、１０Ｈ－キンドリニル基）、アルキル基（好ましくは炭素数１～２０の置換または無置換のアルキル基、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ネオペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、ベンジル基、フェネチル基、ジフェニルメチル基、トリチル基）が挙げられる。また、ある基に関する「炭素数」とは、置換基を有する基において、当該置換基に含まれる炭素を除いた炭素の数を指す。
　本発明において「ヌクレオシド化合物」は、「プリンヌクレオシド化合物」および「ピリミジンヌクレオシド化合物」を含んでいる。このうち「プリンヌクレオシド化合物」は、プリン塩基と糖の還元基とがグリコシド結合によって結合した、プリン核を含む配糖体化合物である。本発明のプリンヌクレオシド化合物において、上記プリン核の８位の炭素原子が上記式（Ｉ）によって表される基に置換されている。二重結合部分の異性化によって下記のトランス異性体（左）またはシス異性体（右）のいずれかになる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　（上記において、Ｚ１は存在しないか、水素原子または置換基を表し、Ｚ２は水素原子または置換基を表し、ｎは１～４の範囲の整数を表し、実線および破線からなる二重線は単結合または二重結合を表し、＃１は糖との結合位置を表し、ｎが２以上の場合、複数存在するＺ２は同じであるか、または異なる）。
　ここで、上記ヌクレオシド化合物が５’キャップ構造に導入されている場合には、プリン核の７位の置換基としては、例えばアリール基、ヘテロアリール基、アルキル基、またはアルキル基を介してアリール基もしくはヘテロアリール基が結合した置換基が挙げられる。アリール基としては、炭素数６～３０のアリール基であり、より好ましくは炭素数６～１０のアリール基である。ヘテロアリール基としては５員又は６員のヘテロアリール基であり、アルキル基としては炭素数１～６の直鎖状または分岐鎖状のアルキル基が挙げられる。上記置換基は、より好ましくはメチル基であるが、上記置換基が存在しない態様があり得る。
　「化４」および式（Ｉ）において、Ａはアリール基またはヘテロアリール基を表す。アリール基は、例えば炭素数５～３０であり、単環または多環のいずれかであり得る。上記アリール基は置換基を有し得る。上記アリール基として、例えば、置換または無置換のフェニル基ならびにナフチル基が挙げられる。また、上記アリール基として、フェニル基；ナフチル基、ａｓ－インダセニル基、ｓ－インダセニル基、アセナフチレニル基、９Ｈ－フルオレニル基、フェナントリル基、アントリル基、フルオランテニル基、アセフェナントリレニル基、アセアントリレニル基、トリフェニレニル基、ピレニル基、クリセニル基、テトラフェニル基、ナフタセニル基およびペリレニル基など環を構成する原子数が１０～２０のアリール基；ピセニル基、ペンタフェニル基およびペンタセニル基など環を構成する原子数２１～３０のアリール基などが挙げられるが、これらに限定されない。
　これらの中でも、環を構成する原子数が６～１３のアリール基が好ましく、置換もしくは無置換のナフチル基が特に好ましい。例えば、Ａがこのような基であれば、後述のように本発明に係るＲＮＡを転写反応によって合成する場合に、（１）転写産物（本発明に係るＲＮＡ）の収量が多く、かつ（２）本発明に係るＲＮＡからタンパク質への翻訳の開始および開始の阻害が光照射にしたがってより適切に制御され得る。（１）の観点から単環式または二環式のアリール基が好ましく、（２）の観点から二環式のアリール基または３つ以上の環構造を有しているアリール基が好ましい。したがって、Ａは、生成されるＲＮＡの収量およびタンパク質の産生量の制御の容易さに合わせて、適宜選択され得る。
　Ａによって表されるヘテロアリール基としては、例えば、窒素原子、酸素原子および硫黄原子からなる群から選ばれる１または２以上のヘテロ原子を環構成原子として含む、５～１０員環のヘテロアリール基が挙げられ、単環または多環のいずれかであり得る。より好ましくは窒素原子を環構成原子として、１個または２個含む５員環または６員環のヘテロアリール基が挙げられ、さらに好ましくは窒素原子を環構成原子として１個含む５員環または６員環のヘテロアリール基が挙げられる。上記ヘテロアリール基は置換基を有し得る。ヘテロアリール基の具体例として、置換または無置換のピロリル基、イミダゾリル基などヘテロ原子として窒素原子を含む環を構成する原子数が５または６の単環式ヘテロアリール基；インドリル基などヘテロ原子として窒素原子を含む環を構成する原子数が７～９の縮合環式ヘテロアリール基；キノリニル基、２，７－ナフチリジニル基、２，６－ナフチリジニル基、１，６－ナフチリジニル基、１，５－ナフチリジニル基、キノキサリニル基、キナゾリニル基、シンノリニル基、９Ｈ－カルバゾリル基、９Ｈ－β－カルボリニル基、フェナントリジニル基、１Ｈ－ペリミジニル基、４，７－フェナントロリニル基、３，８－フェナントロリニル基および２，９－フェナントロリニル基などのフェナントロリニル基、フェナジニル基、テベニジニル基ならびに１０Ｈ－キンドリニル基などヘテロ原子として窒素原子を含む環構成原子１０～２０のヘテロアリール基などが挙げられる。中でも、環を構成する原子数が５～１０のヘテロアリール基が好ましい。
　本発明のプリンヌクレオシド化合物の好ましい態様としては、プリン核の８位の炭素原子に上記式（Ｉ）によって表される基が結合している、以下の式によって表されるグアノシン誘導体およびアデノシン誘導体が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　「化５」において、ＡおよびＺ１の定義およびその詳細は上述の通りである。また、「化５」おいて、Ｙ１は水酸基または－ＨＰＯ３－であり、Ｙ２は－ＨＰＯ３－であり、Ｙ３は、水素原子、または置換もしくは無置換のアミノ基もしくはその保護基を表す。上記保護基としては、イソブチル基およびジメチルホルムアミジン（ＤＭＦ）基などが挙げられる。
　本発明のアゾ骨格を有しているプリンヌクレオシド化合物の合成方法は、後述の（プリンヌクレオシド化合物）の項を参照すればよい。また、オレフィン骨格を有しているプリンヌクレオシドの合成方法は、S. Ogasawara, M. Maeda “Straightforward and Reversible Photoregulation of Hybridization using Photochromic Nucleoside" Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 8839-8842.およびS. Ogasawara, M. Maeda “Reversible Photoswitching of a G-Quadruplex" Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 6671-6674.を参照すればよい。
　また、例えば８位がハロゲン化されたプリンヌクレオシド誘導体（以下、「ハロゲン化ヌクレオシド誘導体」ともいう）の８位ハロゲン原子を、式（Ｉ）で表される基と置換することによって、式（Ｉ）によって表されるプリンヌクレオシド化合物を得ることができる。例えば、Ｅ体の合成には、鈴木‐宮浦カップリングを用いることができる。具体的には、８位をハロゲン化したプリン核および（Ｅ）－アルケニルホウ素化合物をパラジウム等の触媒存在下において数時間にわたって加熱還流し、反応後、エバポレーターによって溶媒を除去し、カラム精製、再結晶、洗浄などの方法を用いて精製を行なうことによって目的物を得ることができる。上記反応の詳細については、N. Miyaura et al., Chem. Rev., 1995, 95, 2457-2483; N. Amann et al., Synlett, 2002, 5, 687-691.を参照できる。一方、Ｚ体は、例えば８‐アリールエチニルプリンの接触水素還元により得ることができる。上記接触水素還元について、より具体的に説明する。まず薗頭カップリングを用い、８位をハロゲン化したプリン核と末端アルキンを有している原子団をパラジウム等の触媒に加えヨウ化銅、アミン塩基などを同時に加えて数時間にわたって加熱還流し、反応後、エバポレーターで溶媒を除去し、カラム精製、再結晶、洗浄などの方法で精製する。得られた８‐アリールエチニルプリンをエタノール、メタノールなど適当な溶媒に溶かし、パラジウム等の触媒下、系内を水素を用いて置換し常圧もしくは加圧下で接触水素還元する。
　本発明のプリンヌクレオシド化合物の合成反応の詳細は、後述の実施例に説明されている。また、反応に使用する原料および試薬は、公知の方法によって合成可能であるか、または市販品を用いることができる。合成反応後、必要に応じて公知の方法を用いて精製することによって、目的物質を得ることができる。目的物質が得られたことは、ＮＭＲまたは質量分析などの同定方法によって確認できる。なお、式（Ｉ）によって表されるプリンヌクレオシド化合物は、官能基や置換基の種類によっては塩を形成する場合があり、遊離の状態または塩の状態において水和物または溶媒和物を形成することもあるが、これらの状態も本発明の範囲に含まれる。
　本発明に係るＲＮＡは、上述のように５’キャップ構造、ならびに５’側の開始コドンおよび３’側の終止コドンを両端に有している翻訳領域を含んでいる。すなわち、本発明に係るＲＮＡは、インビトロまたはインビボにおける翻訳に必要な構造および領域を含んでいる。
　５’キャップ構造として上記ヌクレオシド化合物が導入されている本発明に係るＲＮＡは、例えば、上記ヌクレオシド化合物の５’炭素に三リン酸架橋を介して任意のヌクレオシドを結合させ、この生成物を転写プライマーとして転写反応を経ることによって合成され得るが、この方法に制限されない。また、５’末端から１０塩基までに上記ヌクレオシド化合物が導入されている本発明に係るＲＮＡは、例えば、上記ヌクレオシド化合物を含んでいる人工オリゴヌクレオチドの５’末端に５’キャップ構造を結合させ、この生成物を転写プライマーとして用いる転写反応を経ることによって合成され得る。
　５’キャップ構造は、公知の酵素（例えば、ＲＮＡポリホスファターゼ、ＲＮＡグアニルトランスフェラーゼ、およびグアニン－７－メチルトランスフェラーゼなど）を用いて上記ヌクレオシド化合物または任意のオリゴヌクレオチドに付与され得る。また、転写反応は、所望の翻訳領域をコードしているＤＮＡを鋳型として、公知のＲＮＡポリメラーゼを用いて実施され得る。
　本発明に係るＲＮＡの５’側の開始コドンは、ＲＮＡからタンパク質への転写を開始させるためのコドンであり、好ましくはＡＵＧであるが、本発明に係るＲＮＡを真正細菌において翻訳する場合を考慮して、例外的にＣＵＧ、ＡＵＡまたはＵＵＧなどであり得る。また、本発明に係るＲＮＡの３’側の終止コドンは、ＲＮＡからタンパク質への転写を終結させるためのコドンであり、ＵＡＡ、ＵＡＧおよびＵＧＡから適宜、選択され得る。
　本発明に係るＲＮＡの翻訳領域は、翻訳によって産生される量の制御を所望される任意のタンパク質をコードし得る。
　本発明に係るＲＮＡは、５’非翻訳領域および／または３’非翻訳領域をさらに含んでいてもよい。５’非翻訳領域は、５’キャップ構造と翻訳の開始コドンとの間に適切な距離を設けることを目的として挿入され、１０塩基以上の長さがある限りにおいて、特に制限されない。５’非翻訳領域は、好ましくは１０００塩基以下、より好ましくは９００塩基以下、より好ましくは８００塩基以下、より好ましくは７００塩基以下、より好ましくは６００塩基以下、より好ましくは５００塩基以下である。但し、コザック配列等の５’キャップ構造非依存型の翻訳開始シグナル配列が存在する場合、５’キャップ構造の有無に関わらず翻訳が始まるため、上記ヌクレオシド化合物が５’キャップ構造に導入された場合にはこのような配列は除かれる。上記ヌクレオシド化合物が５’末端から１０塩基までの塩基から選択される位置に導入された場合においては、光照射による翻訳開始の制御の妨げにならない範囲においてのみ、このような配列は含まれ得る。また、５’非翻訳領域には、ＲＮＡと開始因子またはリボソーム複合体との結合にとって必須の配列、または翻訳効率を上げる配列の少なくともどちらか一方が含まれていることが好ましい。
　３’非翻訳領域は、１０塩基以上の長さがある限りにおいて、特に制限されない。また、３’非翻訳領域には、そのさらに３’末端にポリＡ配列が付加され得るための配列（ポリＡ付加シグナル）が含まれていることが好ましい。ポリＡ付加シグナルとしては、ＡＡＵＡＡＡからなる塩基配列、２ つのＡＡＵＡＡＡ配列を含んでいるSV40 early polyA signal、またはSV40 early polyA signalがタンデムに並んでいる配列などが挙げられるがこれらに制限されることはない。
　また、本発明に係るＲＮＡは、３’末端にポリＡ配列が含まれ得る。３’末端にポリＡ配列が含んでいるＲＮＡは、翻訳領域の翻訳効率およびＲＮＡ自身の安定性に優れている。
　本発明において「ヌクレオシド化合物」は、上述のように「ピリミジンヌクレオシド化合物」を含んでいる。「ピリミジンヌクレオシド化合物」は、ピリミジン核の５位または６位の炭素原子が上記「化１」の式（Ｉ）によって表される基に置換されたピリミジンヌクレオシド化合物である。
　式（Ｉ）によって表される基は、異なる２つの波長を有している光を受けて二重結合部分のシス－トランス異性化を可逆的に起こし得るため、ヌクレシオドの塩基部分に当該基を導入することによって、光照射を受けて可逆的に構造変化し得るヌクレオシドを得ることができる。
　ピリミジンヌクレオシド化合物が上述のプリンヌクレオシド化合物と異なる点は、塩基部分がピリミジン塩基であることである。よって、ピリミジンヌクレオシド化合物は、ピリミジン塩基と糖の環元基とがグリコシド結合によって結合した、ピリミジン核を含んでいる配糖体化合物である。「ピリミジン核」は、例えば、チミン核、シトシン核またはウラシル核である。ピリミジン核は、１位の窒素原子において糖と結合している。
　ピリミジン核がチミン核である場合、上記式（Ｉ）の基は、ピリミジン核の６位の炭素原子と結合している。また、ピリミジン核がウラシル核である場合、上記式（Ｉ）の基は、ピリミジン核の５位の炭素原子と結合していることが好ましい。
　上述のように、ピリミジンヌクレオシド化合物は、塩基部分のみを除いて上述のプリンヌクレオシド化合物と同様の構成を有している。したがって、上記式（Ｉ）における記号Ａの定義、ピリミジン核が結合し得る糖部分の構造、用語の定義、合成方法、その用途および利点などは、プリンヌクレオシド化合物における記載を適宜参照すればよい。
　〔ＲＮＡからのタンパク質の産生量を制御する方法〕
　また、本発明は、〔本発明に係るＲＮＡ〕の項に記載のＲＮＡからのタンパク質の産生量を制御する方法に関する。当該方法は、上記ヌクレオシド化合物の構造を、その照射によってトランス型からシス型にする波長を有している第１の光、および／または上記ヌクレオシド化合物の構造を、その照射によってシス型からトランス型にする波長を有している、第１の光の波長と異なる第２の光を、上記ＲＮＡに照射する工程を包含している。
　この方法によれば、インビボまたはインビトロにおいて、第１および／または第２の光の照射によってＲＮＡの転写を開始させるか、および／または停止させ得る。つまり、第１の光は、トランス型からシス型に異性化してＲＮＡの翻訳を開始させる波長を有している光であり、第２の光は、シス型からトランス型に異性化してＲＮＡの翻訳の開始を阻害させる波長を有している光である。
　上記方法は、上記ＲＮＡを細胞に導入する工程をさらに包含しており、照射する上記工程が、上記第１の光および／または上記第２の光を、上記ＲＮＡが導入されている当該細胞に照射する工程であることが好ましい。これによって細胞内におけるＲＮＡからのタンパク質の産生量を制御し得る。
　また、上記方法は、照射する上記工程において、上記第１の光、上記第２の光の順に照射するか、または上記第２の光、上記第１の光の順に照射することが好ましい。これによって、翻訳の開始および開始の阻害を可逆的に制御し得る。
　また、上記方法において、照射する上記工程が、上記ＲＮＡが導入された当該細胞の局所に、上記第１の光を照射する工程であることが好ましい。さらに、上記方法において、光を照射する上記工程が、上記第１の光の照射と同時に、上記局所以外の領域に上記第２の光をさらに照射する工程であることが好ましい。これらによれば、第１の光の照射を受けた局所にあるＲＮＡは、時間の経過とともに局所の外側に拡散すると、第２の光の照射を受ける。つまり、局所の外側に拡散したＲＮＡは翻訳の開始を阻害される。したがって、局所に存在するＲＮＡのみからタンパク質に翻訳され得る。
　局所とは、細胞の一部分（例えば、吸着細胞を上面視したときの面積の約５～１０％）を意味しており、より詳細には、直径約１～５μｍの大きさの領域を指す。
　また、上記方法において、上記第１の光の照射後に、上記局所を含んでいる領域に上記第２の光を照射する工程をさらに包含していることが好ましい。これによれば、局所における可逆的な翻訳制御が可能である。
　また、上記方法において上記第１の光および／または上記第２の光が可視光であることが好ましい。生細胞または生体にとって紫外線は有害であるため、生細胞または生体として本発明に係る方法を実施する場合、照射される光は可視光であることが好ましい。インビトロにおいて本発明に係る方法を実施する場合には、照射される光は可視光または紫外光で有り得る。
　上記式（Ｉ）において２つのＸが窒素原子である場合に、第１の光が有している波長は４００ｎｍ～５００ｎｍであり、第２の光が有している波長は４５０ｎｍ～６００ｎｍである。このとき、第１の光は常に、第２の光よりも短い波長の光である。一方で、上記式（Ｉ）において２つのＸがＣＨである場合に、第１の光が有している波長は３００ｎｍ～５００ｎｍであり、第２の光が有している波長は２４０ｎｍ～４００ｎｍである。このとき、２つのＸが窒素原子である場合とは逆に、第１の光は常に、第２の光よりも長い波長の光である。また、上記式（Ｉ）において一方のＸがＮであり、他方のＸがＣＨである場合に、第１の光が有している波長は３００ｎｍ～５００ｎｍであり、第２の光が有している波長は２４０ｎｍ～４５０ｎｍである。このとき、２つのＸがＣＨである場合と同様に、第１の光は常に、第２の光よりも長い波長の光である。
　また、上記方法は、二光子励起を利用してＲＮＡを異性体化し得る。二光子励起は、焦点面における物質のみに生じるため、三次元的な局所におけるＲＮＡの異性体化、すなわち翻訳の開始および開始の阻害の制御を可能にする。
　〔本発明に係るヌクレオシド化合物〕
　（プリンヌクレオシド化合物）
　本発明のプリンヌクレオシド化合物は、プリン核の８位の炭素原子が下記式（Ｉ’）によって表される基に置換されたプリンヌクレオシド化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
（ここで、Ａはアリール基またはヘテロアリール基を表し、２つのＸは窒素原子であり、＃はプリン核の８位炭素原子との結合位置を表す）。
　式（Ｉ’）によって表される基は、異なる２つの波長の可視光を受けてジアゾ部分のシス－トランス異性化を可逆的に起こし得るため、ヌクレシオドの塩基部分に当該基を導入することによって、可視光照射を受けて可逆的に構造変化し得るヌクレオシドを得ることができる。可視光によって構造変化し得るために、当該ヌクレオシドを生細胞に導入した場合に、生体分子（例えば、タンパク質およびＤＮＡなど）を損傷するおそれがない。当該塩基が比較的に小さいため、当該ヌクレオシドを導入したヌクレオチド鎖は、当該ヌクレオシドが一方の異性体に構造変化しているときに正常な構造を形成し得る。
　以下に、本発明のプリンヌクレオシド化合物について、さらに詳細に説明する。
　本明細書において、ある官能基または原子が置換基を有し得る場合、置換基の種類、その数および置換位置は、特に限定されない。当該置換基の具体例として、ハロゲン原子（例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子）、アリール基（好ましくは炭素数５～３０の置換または無置換のアリール基、例えばフェニル基、トリル基、キシリル基、メシチル基、ビフェニリル基、ナフチル基、アントリル基、フェナントリル基、フルオレニル基、ピレニル基）、ヘテロアリール基（好ましくは５～１０員環のヘテロアリール基、例えば、ピロリル基、イミダゾリル基、インドリル基、フェナントロリニル基、フェナジニル基、テベニジニル基、１０Ｈ－キンドリニル基）、アルキル基（好ましくは炭素数１～２０の置換または無置換のアルキル基、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ネオペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、ベンジル基、フェネチル基、ジフェニルメチル基、トリチル基）が挙げられる。また、ある基に関する「炭素数」とは、置換基を有する基において、当該置換基に含まれる炭素を除いた炭素の数を指す。この点については、後述の（ピリミジンヌクレオシド化合物）にも該当する。
　本発明において「プリンヌクレオシド化合物」は、プリン塩基と糖の還元基とがグリコシド結合によって結合した、プリン核を含む配糖体化合物である。また、本発明における「プリン核」は、下記構造を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
（上記において、Ｚ１およびＺ２は、それぞれ独立に水素原子または置換基を表し、ｎ１は１または２を表し、ｎ２は１～４の範囲の整数を表し、実線および破線からなる二重線は単結合または二重結合を表し、＃１は糖との結合位置を表す。ｎ１およびｎ２が２以上の場合、複数存在するＺ１およびＺ２は同じか、または異なる）。
　本発明のプリンヌクレオシド化合物において、上記プリン核の８位の炭素原子が上記式（Ｉ’）によって表される基に置換されている。ジアゾ部分の異性化によって下記のトランス体（Ｅ－ｉｓｏｍｅｒ）またはシス体（Ｚ－ｉｓｏｍｅｒ）のいずれかになる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　（上記において、Ｚ１、Ｚ２、ｎ１、ｎ２、＃１、ならびに実線および破線からなる二重線は上述したものと同義である）。
　「化７」および式（Ｉ’）において、Ａはアリール基またはヘテロアリール基を表す。
　アリール基は、例えば炭素数５～３０であり、単環または多環のいずれかであり得る。上記アリール基は置換基を有し得る。上記アリール基として、例えば、置換または無置換のフェニル基ならびにナフチル基が挙げられる。また、上記アリール基として、フェニル基；ナフチル基、ａｓ－インダセニル基、ｓ－インダセニル基、アセナフチレニル基、９Ｈ－フルオレニル基、フェナントリル基、アントリル基、フルオランテニル基、アセフェナントリレニル基、アセアントリレニル基、トリフェニレニル基、ピレニル基、クリセニル基、テトラフェニル基、ナフタセニル基およびペリレニル基など環を構成する原子数が１０～２０のアリール基；ピセニル基、ペンタフェニル基およびペンタセニル基など環を構成する原子数２１～３０のアリール基などが挙げられるが、これらに限定されない。アリール基は、環を構成する原子数が６～１０のアリール基、および置換もしくは無置換のフェニル基であることが好ましい。置換のフェニル基として、ニトロ基、ジエチルアミノ基、ジメチルアミノ基、トリフルオロメチル基、メトキシ基、カルボニル基もしくはハロゲンなどの電子供与基または電子吸引基を置換基として有しているフェニル基が挙げられる。
　これらの中でも、環を構成する原子数が６～１０のアリール基ならびに置換または無置換のフェニル基が好ましく、２個の環が縮合してなる置換または無置換のアリール基ならびに置換または無置換のフェニル基がより好ましく、メチル置換または無置換のフェニル基が特に好ましい。
　Ａによって表されるヘテロアリール基としては、例えば、窒素原子、酸素原子および硫黄原子からなる群から選ばれる１または２以上のヘテロ原子を環構成原子として含む、５～１０員環のヘテロアリール基が挙げられ、単環または多環のいずれかであり得る。より好ましくは窒素原子を環構成原子として、１個または２個含む５員環または６員環のヘテロアリール基が挙げられ、さらに好ましくは窒素原子を環構成原子として１個含む５員環または６員環のヘテロアリール基が挙げられる。上記ヘテロアリール基は置換基を有し得る。ヘテロアリール基の具体例として、置換または無置換のピロリル基、イミダゾリル基などヘテロ原子として窒素原子を含む環を構成する原子数が５または６の単環式ヘテロアリール基；インドリル基などヘテロ原子として窒素原子を含む環を構成する原子数が７～９の縮合環式ヘテロアリール基；キノリニル基、２，７－ナフチリジニル基、２，６－ナフチリジニル基、１，６－ナフチリジニル基、１，５－ナフチリジニル基、キノキサリニル基、キナゾリニル基、シンノリニル基、９Ｈ－カルバゾリル基、９Ｈ－β－カルボリニル基、フェナントリジニル基、１Ｈ－ペリミジニル基、４，７－フェナントロリニル基、３，８－フェナントロリニル基および２，９－フェナントロリニル基などのフェナントロリニル基、フェナジニル基、テベニジニル基ならびに１０Ｈ－キンドリニル基などヘテロ原子として窒素原子を含む環構成原子１０～２０のヘテロアリール基などが挙げられる。中でも、環を構成する原子数が５～１０のヘテロアリール基が好ましい。ヘテロアリール基の好ましい例としては、ピロリル基およびキノリニル基が挙げられる。
　また、アリール基およびヘテロアリール基におけるジアゾ結合部分との結合位置は、特に限定されず、使用する基および合成方法などにしたがって適宜選択すればよい。
　式（Ｉ’）によって表される基は、式（Ｉ’）中の＃１によって表される位置においてプリン核の８位の炭素原子と結合している。式（Ｉ’）によって表される基に置換されたプリン核がグリコシド結合する糖部分の構造として、特に限定されるものではなく、公知のヌクレオシド化合物に含まれる糖部分が挙げられ、より詳細には、後述する式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）に含まれる糖部分が挙げられる。
　本発明のプリンヌクレオシド化合物の好ましい態様としては、プリン核の８位の炭素原子が上記式（Ｉ’）によって表される基に置換された、下記式（ＩＩ）によって表されるグアノシン誘導体および下記式（ＩＩＩ）によって表されるアデノシン誘導体が挙げられる。
　なお、下記式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）にトランス体を示しているが、本発明のプリンヌクレオシド化合物は、トランス体だけではなくシス体であり得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）におけるＡの定義およびその詳細は、上述の通りである。
　式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）中、Ｒ１およびＲ２は互いに独立して、水酸基もしくはその保護基、オリゴヌクレオチドの製造のために導入され得る反応性基、またはヌクレオシド誘導体の自己組織化を利用する際に導入され得る原子団を表す。
　Ｒ３は、水素原子、水酸基もしくはその保護基、オリゴヌクレオチドの製造のために導入され得る反応性基、またはヌクレオシド誘導体の自己組織化を利用する際に導入され得る原子団を表す。
　上記保護基としては、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）などが挙げられ、上記反応性基としては、２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロアミダイト、一リン酸、二リン酸および三リン酸などが挙げられる。また、上記原子団の詳細は、Isao Yoshikawa, et al., Tetrahedron 63 (2007) 7474-7481、Jeffery T. Davis, et al Chem. Soc. Rev., 2007, 36, 296-313、Gian Piero Spada, et al., SYNLETT 2004, No.4, pp 0596-0602に記載されている。上記原子団の具体例としては、－ＯＲ（Ｒはアルキルシリル基（例えばＳｉ（ｉＰｒ）２Ｃ８Ｈ１７など）およびエステル基が挙げられる。また、Ｒ１～Ｒ３は、これらのうちの２つ以上が連結して環を形成し得る。
　式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）中、Ｒ４は、水素原子、または置換もしくは無置換のアミノ基もしくはその保護基を表す。上記保護基としては、イソブチル基およびジメチルホルムアミジン（ＤＭＦ）基などが挙げられる。
　式（ＩＩ）によって表されるグアノシン誘導体のさらに具体的な態様としては、下記式（ＩＩ）－１および式（ＩＩ）－２によって表される化合物が挙げられ、式（ＩＩＩ）によって表されるアデノシン誘導体のさらに具体的な態様としては、下記式（ＩＩＩ）－１および式（ＩＩＩ）－２によって表される化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　（Ａは上述したものと同義である）。
　本発明のプリンヌクレオシド化合物の合成方法は、特に限定されるものではないが、アニリン、プリンヌクレオシド誘導体および亜硝酸塩を用いてアゾカップリングさせることによって、プリンヌクレオシドの８位の炭素に式（Ｉ’）によって表される基を導入して、式（Ｉ’）によって表される基を有するプリンヌクレオシド化合物を得ることができる。例えば、アニリン、プリン核および亜硝酸塩の混合液を数時間にわたって加熱還流し、反応後にエバポレーターを用いて溶媒を除去し、カラム精製、再結晶、洗浄などの方法を用いて精製することによって目的物を得ることができる。
　本発明のプリンヌクレオシド化合物の合成反応の詳細は、後述の実施例に説明されている。また、反応に使用する原料および試薬は、公知の方法によって合成可能でありか、または市販品を用いることができる。合成反応後、必要に応じて公知の方法を用いて精製することによって、目的物質を得ることができる。目的物質が得られたことは、ＮＭＲまたは質量分析などの同定方法によって確認できる。なお、式（Ｉ’）によって表されるプリンヌクレオシド化合物は、官能基や置換基の種類によっては塩を形成する場合があり、遊離の状態または塩の状態において水和物または溶媒和物を形成することもあるが、これらの状態も本発明の範囲に含まれる。
　本発明のプリンヌクレオシド化合物は、構造変化（異性化）を可逆的に制御することができる。また、本発明のプリンヌクレオシド化合物は、光源のＯＮ／ＯＦＦという簡便な方法によって構造が変化するので、構造制御が容易である。
　また、適当なポリメラーゼの使用により核酸合成にも利用可能と期待される。特に、プリン環の７位の窒素原子は、核酸における相互作用（水素結合および金属イオンへの配位結合など）に関与することが知られている。本発明のプリンヌクレオシド化合物を含有する核酸では、プリン環の８位の炭素原子に置換した式（Ｉ’）によって表される基のトランス→シス異性化によって、上記相互作用の阻害を制御可能と考えられ、より正確な活性制御が可能になるものと期待される。特に、塩基部分に光応答性基を導入することは、分子構造全体への影響が少ないため、核酸の機能を維持しつつ活性を制御することができると考えられる。また、本発明のプリンヌクレオシド化合物を含有する核酸は、必要最小限の修飾を受けているため、ＤＮＡおよびＲＮＡの二重螺らせん構造、リボザイム、デオキシリボザイムならびにアプタマーなどの高次構造の形成を、上記修飾の影響を受けることなく良好に行なうことができる。また、本発明のプリンヌクレオシド化合物は、同様の理由によりＰＣＲ法またはＲＣＡ法などの核酸増幅技術によって簡便に核酸に導入することができる。
　（ピリミジンヌクレオシド化合物）
　本発明のピリミジンヌクレオシド化合物は、ピリミジン核の５位または６位の炭素原子が上記「化６」の式（Ｉ’）によって表される基に置換されたピリミジンヌクレオシド化合物である。
　式（Ｉ’）によって表される基は、異なる２つの波長の可視光を受けてジアゾ部分のシス－トランス異性化を可逆的に起こし得るため、ヌクレシオドの塩基部分に当該基を導入することによって、可視光照射を受けて可逆的に構造変化し得るヌクレオシドを得ることができる。可視光によって構造変化し得るために、当該ヌクレオシドを生細胞に導入した場合に、生体分子（例えば、タンパク質およびＤＮＡなど）を損傷するおそれがない。当該塩基が比較的に小さいため、当該ヌクレオシドを導入したヌクレオチド鎖は、当該ヌクレオシドが一方の異性体に構造変化しているときに正常な構造を形成し得る。
　ピリミジンヌクレオシド化合物が上述のプリンヌクレオシド化合物と異なる点は、塩基部分がピリミジン塩基であることである。よって、本発明のピリミジンヌクレオシド化合物は、ピリミジン塩基と糖の環元基とがグリコシド結合によって結合した、ピリミジン核を含む配糖体化合物である。本発明の「ピリミジン核」は、例えば、チミン核、シトシン核またはウラシル核である。本発明のピリミジン核は、１位の窒素原子において糖と結合している。
　ピリミジン核がチミン核である場合、上記式（Ｉ’）の基は、ピリミジン核の６位の炭素原子と結合している。また、ピリミジン核がシトシン核またはウラシル核である場合、上記式（Ｉ’）の基は、ピリミジン核の５位の炭素原子と結合していることが好ましい。
　上述のように、本発明のピリミジンヌクレオシド化合物は、塩基部分のみを除いて上述のプリンヌクレオシド化合物と同様の構成を有している。したがって、上記式（Ｉ’）における記号Ａの定義、ピリミジン核が結合し得る糖部分の構造、用語の定義、合成方法、その用途および利点などは、（プリンヌクレオシド化合物）における記載を適宜参照すればよい。
　〔異性化方法および光特性を変化させる方法〕
　さらに本発明は、本発明のヌクレオシド化合物に可視光を照射することによって、当該ヌクレオシド化合物を異性化する方法、および本発明のヌクレオシド化合物に可視光を照射することによって、当該ヌクレオシド化合物の光特性を変化させる方法に関する。
　上述したように、本発明のヌクレオシド化合物は、一般式（Ｉ）によって表される基におけるジアゾ部分のシス－トランス異性化を可逆的に起こすことができる。本発明のヌクレオシド化合物は、トランス体およびシス体いずれも高い安定性を有している。このため、本発明のヌクレオシド化合物は、光照射しない限り異性化が進行せず、光照射によって異性化（トランス→シス異性化およびシス→トランス異性化）を制御することができる。トランス→シス異性化は、トランス体に対して中程度の波長の可視光（例えば４００～５００ｎｍの波長）を照射することによって起こすことができる。シス→トランス異性化は、シス体に対して、トランス→シス異性化に使用する光より長波長の可視光（例えば４５０～６００ｎｍの波長）を照射することにより起こすことができる。また、例えば、上記一般式（Ｉ）におけるＡがフェニル基または置換基を有するフェニル基である場合、トランス→シス異性化は４００～４５０ｎｍの可視光の照射によって起こり、シス→トランス異性化は５００～６００ｎｍの可視光の照射によって起こる。トランス→シス光異性化およびシス→トランス光異性化とも、室温において容易に進行し得る。また、異性化のための光照射時間、使用する光源および照射光の強度などの異性化条件は、適宜設定すればよい。異性化条件については、後述の実施例もあわせて参照すればよい。
　本発明のヌクレオシド化合物は、トランス体とシス体との間において吸収スペクトルおよび量子収率などの光特性が異なる。したがって、可視光照射による異性化によって、本発明のヌクレオシド化合物の光物性を変化させることができる。さらに、上記光異性化を可逆的に起こすことができるため、本発明のヌクレオシド化合物に異なる波長の可視光を繰り返し照射することによって、化合物の光特性を可逆的に変化させることができる。光特性を変化させるための光照射条件については、上述の通りである。
　〔光スイッチング型デバイス材料〕
　さらに本発明は、本発明のヌクレオシド化合物を含有する核酸、または本発明のヌクレオシド化合物を含む光スイッチング型デバイス材料に関する。本発明の光スイッチング型デバイス材料は、上記ヌクレオシド化合物または上記核酸の１種またはそれ以上から構成され得るか、またはエレクトロニックデバイスに通常に使用される他の成分を含み得る。
　本発明において「光スイッチング型」とは、可視光照射によって機能および構造をスイッチングされ得る性質をいう。上述のように、本発明のヌクレオシド化合物は、可視光照射によって可逆的に異性化して構造を変化させることができ、それに伴い光特性を変えることができる。この性質を利用して、例えばトランス体の状態をオンまたはデジタル信号におけるビットの１とし、シス体の状態をオフまたはデジタル信号におけるビットの０とすることによって、スイッチング素子または記憶素子などのエレクトロニックデバイスを形成可能である。特に、本発明の光スイッチング型デバイス材料は、光駆動型ナノデバイスの光スイッチとして好適である。
　〔機能性核酸の機能を可逆的に光制御する方法〕
　ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機またはポリメラーゼなどの酵素を用いて、本発明のヌクレオシド化合物を任意のＤＮＡまたはＲＮＡに導入することによって、アンチセンス、アプタマー、およびリボザイムなどの機能性核酸の機能を可逆的に光制御し得る。例えば、２０塩基程度のオリゴヌクレオチドに本発明のヌクレオシド化合物を導入し、標的ＲＮＡとの二重螺旋の形成を制御することによって、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を可逆的に光制御することができる。
　〔実施例１〕
　（１－１）オレフィン骨格を有しているヌクレオシド化合物の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　（１－１－１）８－スチリルグアノシン（化１１の６ａ）の合成
　１０ｇのグアノシン（化１１の１）、７．５４ｇのＮ－ブロモスクシンイミド、５００ｍＬの水をナス型フラスコに入れ室温で２時間撹拌した。反応後、析出物をろ過し９．０３ｇの８－ブロモグアノシン（化１１の２）を得た。
　９．０３ｇの８－ブロモグアノシン（化１１の２）を２口ナス口型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。１００ｍＬのアセトニトリル、７６ｍｇのジメチルアミノピリジン、９．４６ｍＬの無水酢酸、および１３．９ｍＬのトリエチルアミンを加えて室温において１．５時間にわたって攪拌した。ロータリーエバポレーターで溶媒を除去した後、水で再結晶させ１０．３ｇの８－ブロモ－２’，３’，５’－トリ－Ｏ－アセチルグアノシン（化１１の３）を得た。
　２．５ｇの８－ブロモ－２’，３’，５’－トリ－Ｏ－アセチルグアノシン（化１１の３）１０ｍＬのＮ－メチルピロリドンを２口ナス口型フラスコに入れ、溶液をアルゴンガスによって１０分間にわたってバブリングした。次いで、５９３ｍｇのテトラキス（トリフェニルフォスフィン）パラジウム、２．９９ｍLのトリブチルビニルすずを加え、系内をアルゴン置換した後に１１０℃において１時間にわたって加熱還流した。反応後に、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去し、それからシリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール＝９５：５）によって精製した。目的物を含んでいるフラクションを回収し、展開溶媒を除去し、１．７１ｇの８－ビニル－２’，３’，５’－トリ－Ｏ－アセチルグアノシン（化１１の４）を得た。
　２５７ｍｇのトリフェニルフォスフィンを２口ナス型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。２０ｍＬのジオキサン、８８ｍｇのパラジウム（ＩＩ）アセテート、０．８１２ｍＬのトリエチルアミンを加え６０℃において１０分間にわたって攪拌した。反応溶液がワインレッドに変色するのを確認した後、０．６１４ｍＬのブロモベンゼン、２０ｍＬのＤＭＦに溶解させた１．７ｇの８－ビニル－２’，３’，５’－トリ－Ｏ－アセチルグアノシン（化１１の４）を順に加え、１１５℃において１時間にわたって加熱還流した。触媒をろ過によって除去し、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去してからシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９５：５）によって精製した。目的物を含んでいるフラクションを回収し、展開溶媒を除去し、１．５１ｇの８－スチリル－２’，３’，５’－トリ－Ｏ－アセチルグアノシン（化１１の５a）を得た。
　１．５１ｇの８－スチリル－２’，３’，５’－トリ－Ｏ－アセチルグアノシン（化１１の５a）を２口ナス型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。２５ｍＬのメタノール、２５ｍＬの２Ｍアンモニア（メタノール溶液）を加え６０℃において４時間にわたって攪拌した。析出物を回収し、８３０ｍｇの８－スチリルグアノシン（化１１の６a）を得た。
　（１－１－２）８－ナフチルビニルグアノシン（化１１の６ｂ）の合成
　２５７ｍｇのトリフェニルフォスフィンを２口ナス型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。２０ｍＬのジオキサン、８８ｍｇのパラジウム（ＩＩ）アセテート、および０．８１２ｍＬのトリエチルアミンを加え、６０℃において１０分間にわたって攪拌した。反応溶液がワインレッドに変色するのを確認した後、１０ｍＬのＤＭＦに溶解させた１．２１ｇのブロモナフタレン、１０ｍＬのＤＭＦに溶解させた１．７ｇの８－ビニル－２’，３’，５’－トリ－Ｏ－アセチルグアノシン（化１１の４）を順に加え、１１５℃において１時間にわたって加熱還流した。触媒をろ過によって除去し、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去してからシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９５：５）によって精製した。目的物を含んでいるフラクションを回収し、展開溶媒を除去し、１．３７ｇの８－ナフチルビニル－２’，３’，５’－トリ－Ｏ－アセチルグアノシン（化１１の５ｂ）を得た。
　１．３６ｇの８－ナフチルビニル－２’，３’，５’－トリ－Ｏ－アセチルグアノシン（化１１の５ｂ）を２口ナス型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。２０ｍＬのメタノール、２０ｍＬの２Ｍのアンモニア（メタノール溶液）を加え、６０℃において４時間にわたって攪拌した。析出物を回収し、７１０ｍｇの８－ナフチルビニルグアノシン（化１１の６ｂ）を得た。
　（１－１－３）８－フルオレニルビニルグアノシン（化１１の６ｃ）の合成
　２５７ｍｇのトリフェニルフォスフィンを２口ナス型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。２０ｍＬのジオキサン、８８ｍｇのパラジウム（ＩＩ）アセテート、および０．８１２ｍＬのトリエチルアミンを加え、６０℃において１０分間にわたって攪拌した。反応溶液がワインレッドに変色するのを確認した後、１０ｍＬのＤＭＦに溶解させた１．４４ｇのブロモフルオレン、１０ｍＬのＤＭＦに溶解させた１．７ｇの８－ビニル－２’，３’，５’－トリ－Ｏ－アセチルグアノシン（化１１の４）を順に加え、１１５℃において１時間にわたって加熱還流した。触媒をろ過によって除去し、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去してからシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９５：５）によって精製した。目的物を含んでいるフラクションを回収し、展開溶媒を除去し、１．２３ｇの８－フルオレニルビニル－２’，３’，５’－トリ－Ｏ－アセチルグアノシン（化１１の５ｃ）を得た。
　１．２２ｇの８－フルオレニルビニル－２’，３’，５’－トリ－Ｏ－アセチルグアノシン（化１１の５ｃ）を２口ナス型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。２０ｍＬのメタノール、２０ｍＬの２Ｍのアンモニア（メタノール溶液）を加え６０℃において４時間にわたって攪拌した。析出物を回収し、５９０ｍｇの８－フルオレニルビニルグアノシン（化１１の６ｃ）を得た。
　（１－１－４）８－ピレニルビニルグアノシン（化１１の６ｄ）の合成
　２５７ｍｇのトリフェニルフォスフィンを２口ナス型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。２０ｍＬのジオキサン、８８ｍｇのパラジウム（ＩＩ）アセテート、０．８１２ｍＬのトリエチルアミンを加え、６０℃において１０分間にわたって攪拌した。反応溶液がワインレッドに変色するのを確認した後、１５ｍＬのＤＭＦに溶解させた１．６５ｇのブロモピレン、１０ｍＬのＤＭＦに溶解させた１．７ｇの８－ビニル－２’，３’，５’－トリ－Ｏ－アセチルグアノシン（化１１の４）を順に加え、１１５℃において１時間にわたって加熱還流した。触媒をろ過によって除去し、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去してからシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９５：５）によって精製した。目的物を含んでいるフラクションを回収し、展開溶媒を除去し、１．７６ｇの８－ピレニルビニル－２’，３’，５’－トリ－Ｏ－アセチルグアノシン（化１１の５ｄ）を得た。
　１．７６ｇの８－ピレニルビニル－２’，３’，５’－トリ－Ｏ－アセチルグアノシン（化１１の５ｄ）を２口ナス型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。２５ｍＬのメタノール、２５ｍＬの２Ｍアンモニア（メタノール溶液）を加え６０℃において４時間にわたって攪拌した。析出物を回収し、９６２ｍｇの８－ピレニルビニルグアノシン（化１１の６ｄ）を得た。
　（１－１－５）８－スチリルグアノシン三リン酸の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
１０９ｍｇの８－スチリルグアノシン（化１１の６a）を２口ナス口型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。１ｍＬのリン酸トリメチル、９１ｍｇのプロトンスポンジを加えた後、系を０℃に冷却した。次いで、３１μＬの塩化ホスホリルを加え、０℃において攪拌した。６時間後、２６９μＬのトリブチルアミン、２５０ｍｇのピロリン酸トリブチルアンモニウムを加え、さらに１分間にわたって撹拌した。３７ｍＬの１ＭのＴＥＡＢ緩衝液を加えて反応を停止させた後、ＤＥＡＥセファデックス（０～１ＭのＴＥＡＢ）を用いて精製した。目的物を含んでいるフラクションを回収し、溶媒を除去した後に、得られた８－スチリルグアノシン三リン酸（ＴＥＡ塩）を弱陰イオン交換カラム（Ｓｔｒａｔａ－Ｘ－ＡＷ、ＳＨＩＧＭＡ　Ｃｏ．）を用いて遊離酸に変換し、目的の化合物である７．２ｍｇの８－スチリルグアノシン三リン酸（化１２）を得た。
1H NMR (D2O, 400 MHz) δ:7.31-7.22 (m, 6H), 6.83 (d, J = 16.1, 1H), 5.93 (d, J = 6.4, 1H), 5.17 (t, J = 5.8, 1H), 4.51 (s, 1H), 4.24-4.14 (m, 3H); 31P NMR (D2O, 400 MHz) δ: -16.5 (2P), -28.4 (1P); ESI-TOF MS (M-H)- for C18H22N5O14P3, Calculated: 624.0298; Found: 624.0070。
　（１－２）オレフィン骨格を有している５’キャップ構造を備えている５’ヌクレオシドの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　（２－１）８－スチリルビニルグアノシンを５’キャップ構造として備えている５’ヌクレオシド（８ＳＴ－ｃａｐ、化１３の２ａ）の合成
　８７０ｍｇの８－スチリルビニルグアノシン（化１３の１ａ）を２口ナス口型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。１３ｍＬのリン酸トリメチルおよび０．４１２ｍＬの塩化ホスホリルを２口ナス口型フラスコへさらに加え、２０時間にわたって２℃において攪拌した。その後、２０ｍＬの水をさらに加え、１ＭのＴＥＡＢ緩衝液を加えて反応溶液のｐＨを５．５に調整した。析出物を回収して水を用いて洗浄した後に、デシケーター内において十分に乾燥させた。得られたモノホスフェートを２口ナス口型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。２５ｍＬのＤＭＳＯおよび２ｍＬのヨウ化メチルをさらに加え、一晩にわたって室温において攪拌した。１００ｍＬの冷水を反応溶液に加え、析出物を回収し、メタノールを用いて洗浄した。７位がメチル化されている得られたモノホスフェートを２口ナス口型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。１０ｍＬのＤＭＦ、３４０ｍｇのイミダゾール、５２４ｍｇのトリフェニルホスフィン、４４０ｍｇのアルドリチオール、および０．５５４ｍＬのトリエチルアミンをさらに加えて、一晩にわたって室温において攪拌した。４５０ｍｇの過塩素酸ナトリウムが溶解しているアセトン溶液に反応溶液を注ぎ、２時間にわたって４℃において攪拌した。析出物を回収し、冷却したアセトンを用いて洗浄した後に、デシケーター内において十分に乾燥させた。得られた化合物、および２６８ｍｇのＧＤＰを２口ナス口型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。２０ｍＬのＤＭＦおよび３０８ｍｇの塩化亜鉛をさらに加え、６０時間にわたって室温において攪拌した。１．４８ｇのＥＤＴＡが溶解している水溶液に反応溶液を注ぎ、１ＭのＴＥＡＢ緩衝液を加えて反応溶液のｐＨを５．５に調整した。そして、ＤＥＡＥセファデックス（０～１ＭのＴＡＥＢ緩衝液）を用いて精製した。目的物を含んでいるフラクションを回収し、溶媒を除去した後に、得られた８ＳＴ－ｃａｐ（ＴＥＡ塩）を弱陰イオン交換カラム（Ｓｔｒａｔａ－Ｘ－ＡＷ、ＳＨＩＧＭＡ　Ｃｏ．）を用いて遊離酸に変換し、目的の化合物である１０３ｍｇの８ＳＴ－ｃａｐ（化１３の２ａ）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　（１－２－２）８－ナフチルビニルグアノシンを５’キャップ構造として備えている５’ヌクレオシド（８ＮＶ－ｃａｐ、化１３の２ｂ）の合成
　７００ｍｇの８－スチリルビニルグアノシン（化１３の１ｂ）を２口ナス口型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。９ｍＬのリン酸トリメチルおよび０．２９４ｍＬの塩化ホスホリルを２口ナス口型フラスコへさらに加え、２０時間にわたって２℃において攪拌した。その後、２０ｍＬの水をさらに加え、１ＭのＴＥＡＢ緩衝液を加えて反応溶液のｐＨを５．５に調整した。析出物を回収して水を用いて洗浄した後に、デシケーター内において十分に乾燥させた。得られたモノホスフェートを２口ナス口型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。２５ｍＬのジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）および１．７４ｍＬのヨウ化メチルをさらに加え、一晩にわたって室温において攪拌した。１００ｍＬの冷水を反応溶液に加え、析出物を回収し、メタノールを用いて洗浄した。７位がメチル化されている得られたモノホスフェートを２口ナス口型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。１０ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、３０８ｍｇのイミダゾール、４７６ｍｇのトリフェニルホスフィン、４０１ｍｇのアルドリチオール、および０．５０１ｍＬのトリエチルアミンをさらに加えて、一晩にわたって室温において攪拌した。４０１ｍｇの過塩素酸ナトリウムが溶解しているアセトン溶液に反応溶液を注ぎ、２時間にわたって４℃において攪拌した。析出物を回収し、冷却したアセトンを用いて洗浄した後に、デシケーター内において十分に乾燥させた。得られた化合物、および７１５ｍｇのＧＤＰを２口ナス口型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。２５ｍＬのＤＭＦおよび４５５ｍｇの塩化亜鉛をさらに加え、６０時間にわたって室温において攪拌した。２．１９ｇのＥＤＴＡが溶解している水溶液に反応溶液を注ぎ、１ＭのＴＥＡＢ緩衝液を加えて反応溶液のｐＨを５．５に調整した。そして、ＤＥＡＥセファデックス（０～１ＭのＴＡＥＢ緩衝液）を用いて精製した。目的物を含んでいるフラクションを回収し、溶媒を除去した後に、得られた８ＮＶ－ｃａｐ（ＴＥＡ塩）を弱陰イオン交換カラム（Ｓｔｒａｔａ－Ｘ－ＡＷ、ＳＨＩＧＭＡ　Ｃｏ．）を用いて遊離酸に変換し、目的の化合物である９２ｍｇの８ＮＶ－ｃａｐ（化１３の２ｂ）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　（１－２－３）８－フルオレニルビニルグアノシンを５’キャップ構造として備えている５’ヌクレオシド（８ＦＶ－ｃａｐ、化１３の２ｃ）の合成
　５８０ｍｇの８－フルオレニルビニルグアノシン（化１３の１ｂ）を２口ナス口型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。１３ｍＬのリン酸トリメチルおよび０．２２４ｍＬの塩化ホスホリルを２口ナス口型フラスコへさらに加え、２０時間にわたって２℃において攪拌した。その後、１０ｍＬの水をさらに加え、１ＭのＴＥＡＢ緩衝液を加えて反応溶液のｐＨを５．５に調整した。析出物を回収して水を用いて洗浄した後に、デシケーター内において十分に乾燥させた。得られたモノホスフェートを２口ナス口型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。２０ｍＬのＤＭＳＯおよび０．９ｍＬのヨウ化メチルをさらに加え、一晩にわたって室温において攪拌した。１００ｍＬの冷水を反応溶液に加え、析出物を回収し、メタノールを用いて洗浄した。７位がメチル化されている得られたモノホスフェートを２口ナス口型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。５ｍＬのＤＭＦ、１２０ｍｇのイミダゾール、１８５ｍｇのトリフェニルホスフィン、１５５ｍｇのアルドリチオール、および０．１９６ｍＬのトリエチルアミンをさらに加えて、一晩にわたって室温において攪拌した。１５０ｍｇの過塩素酸ナトリウムが溶解しているアセトン溶液に反応溶液を注ぎ、２時間にわたって４℃において攪拌した。析出物を回収し、冷却したアセトンを用いて洗浄した後に、デシケーター内において十分に乾燥させた。得られた化合物、および３９５ｍｇのＧＤＰを２口ナス口型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。１５ｍＬのＤＭＦおよび２５０ｍｇの塩化亜鉛をさらに加え、６０時間にわたって室温において攪拌した。１．２３ｇのＥＤＴＡが溶解している水溶液に反応溶液を注ぎ、１ＭのＴＥＡＢ緩衝液を加えて反応溶液のｐＨを５．５に調整した。そして、ＤＥＡＥセファデックス（０～１ＭのＴＡＥＢ緩衝液）を用いて精製した。目的物を含んでいるフラクションを回収し、溶媒を除去した後に、得られた８ＦＶ－ｃａｐ（ＴＥＡ塩）を弱陰イオン交換カラム（Ｓｔｒａｔａ－Ｘ－ＡＷ、ＳＨＩＧＭＡ　Ｃｏ．）を用いて遊離酸に変換し、目的の化合物である８５ｍｇの８ＦＶ－ｃａｐ（化１３の２ｃ）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　（１－２－４）８－フルオレビニルグアノシンを５’キャップ構造として備えている５’ヌクレオシド（８ＰＶ－ｃａｐ、化１３の２ｄ）の合成
　９００ｍｇの８－ピレニルビニルグアノシン（化１３の１ｂ）を２口ナス口型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。１０ｍＬのリン酸トリメチルおよび０．１９４ｍＬの塩化ホスホリルを２口ナス口型フラスコへさらに加え、２０時間にわたって２℃において攪拌した。その後、２０ｍＬの水をさらに加え、１ＭのＴＥＡＢ緩衝液を加えて反応溶液のｐＨを５．５に調整した。析出物を回収して水を用いて洗浄した後に、デシケーター内において十分に乾燥させた。得られたモノホスフェートを２口ナス口型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。４０ｍＬのＤＭＳＯおよび２．９６ｍＬのヨウ化メチルをさらに加え、一晩にわたって室温において攪拌した。１００ｍＬの冷水を反応溶液に加え、析出物を回収し、メタノールを用いて洗浄した。７位がメチル化されている得られたモノホスフェートを２口ナス口型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。２０ｍＬのＤＭＦ、５７５ｍｇのイミダゾール、８８７ｍｇのトリフェニルホスフィン、７４５ｍｇのアルドリチオール、および０．９３６ｍＬのトリエチルアミンをさらに加えて、一晩にわたって室温において攪拌した。７５０ｍｇの過塩素酸ナトリウムが溶解しているアセトン溶液に反応溶液を注ぎ、２時間にわたって４℃において攪拌した。析出物を回収し、冷却したアセトンを用いて洗浄した後に、デシケーター内において十分に乾燥させた。得られた化合物、および７６０ｍｇのＧＤＰを２口ナス口型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。４５ｍＬのＤＭＦおよび８７６ｍｇの塩化亜鉛をさらに加え、６０時間にわたって室温において攪拌した。４．２１ｇのＥＤＴＡが溶解している水溶液に反応溶液を注ぎ、１ＭのＴＥＡＢ緩衝液を加えて反応溶液のｐＨを５．５に調整した。そして、ＤＥＡＥセファデックス（０～１ＭのＴＡＥＢ緩衝液）を用いて精製した。目的物を含んでいるフラクションを回収し、溶媒を除去した後に、得られた８ＰＶ－ｃａｐ（ＴＥＡ塩）を弱陰イオン交換カラム（Ｓｔｒａｔａ－Ｘ－ＡＷ、ＳＨＩＧＭＡ　Ｃｏ．）を用いて遊離酸に変換し、目的の化合物である８７ｍｇの８ＰＴ－ｃａｐ（化１３の２ｄ）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　（１－３）光応答性の５’ｃａｐを含んでいるＲＮＡのタンパク質への翻訳
　（１－２）において合成した光応答性の５’ｃａｐを含んでいる、ＧＦＰをコードしているＲＮＡ（４種類）のそれぞれを無細胞転写キット（ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ、Ａｍｂｉｏｎ　Ｃｏ．）を用いて合成した。無細胞タンパク質翻訳系（Ｔｒａｎｓｄｉｒｅｃｔ　ｄｉｎｓｅｃｔ　ｃｅｌｌ、ＳＩＧＭＡ　Ｃｏ．）を用いて、上記ＲＮＡのそれぞれからＧＦＰを合成した。比較対照として、上記ＲＮＡ以外にＧＦＰをコードしているｍＲＮＡ（キャップ構造のあり、またはなし）をさらに使用した。各ＲＮＡからのＧＦＰの発現量を、ＧＦＰの蛍光強度を介して比較した。光応答性の５’ｃａｐを含んでいるＲＮＡについては、シス型とトランス型と（図１の上段）の間における発現量も比較した。この結果を図１に示す。図１において、ｎｏ－ｃａｐはキャップ構造なしのｍＲＮＡであり、ｎｏｒｍａｌ－ｃａｐは通常のキャップ構造ありのｍＲＮＡである。
　図１（下段）に示されるように、光応答性の５’ｃａｐを含んでいるＲＮＡは、シス型のときにトランス型と比べて発現量が高かった。なかでも８ＮＶ－ｃａｐを含んでいるＲＮＡは、トランス型のときにほとんどタンパク質を発現せず、シス型のときにｎｏｒｍａｌ－ｃａｐと同等の発現量を示した。よって、光応答性の５’ｃａｐとしては８ＮＶ－ｃａｐが良好な性質を示したと言える。なお、８ＰＶ－ｃａｐを含んでいるＲＮＡに関するデータを図示していない。８ＰＶ－ｃａｐは、高い疎水性を有しており、このためｍＲＮＡに導入されていない可能性が高い。よって、８ＰＶ－ｃａｐを含んでいるＲＮＡに関する翻訳制御試験の結果が、本発明に係るヌクレオシド化合物の作用によるものか判断し得なかった。
　（１－４）光応答性の５’ｃａｐを含んでいるＲＮＡのタンパク質への翻訳の可逆的な光制御
　無細胞タンパク質翻訳系（Ｔｒａｎｓｄｉｒｅｃｔ　ｄｉｎｓｅｃｔ　ｃｅｌｌ、ＳＩＧＭＡ　Ｃｏ．）を用いた８ＮＶ－ｃａｐを含んでいるＲＮＡからのタンパク質への翻訳を、以下のように可逆的に光制御した。比較対照として、上記ｎｏｒｍａｌ－ｃａｐを使用した。まず反応溶液系のそれぞれに３１０ｎｍの光を２分間にわたって照射した（８ＮＶ－ｃａｐをトランス型にした）。その６０分後に、反応溶液系のそれぞれに４１０ｎｍの光を２分間にわたって照射した（８ＮＶ－ｃａｐをシス型にした）。さらにその６０分後に、反応溶液系のそれぞれに３１０ｎｍの光を２分間にわたって照射した（８ＮＶ－ｃａｐをトランス型にした）。このときのＧＦＰの蛍光強度の推移（下段）および８ＮＶ－ｃａｐを含んでいるＲＮＡの構造（上段）を図２に示す。
　図２（下段）に示されるように、最初の６０分間において、ＧＦＰの蛍光強度は一定であり、８ＮＶ－ｃａｐを含んでいるＲＮＡからのＧＦＰの発現は認められなかった（下側のグラフ）。次の期間において、ＧＦＰの蛍光強度の増強が認められ、８ＮＶ－ｃａｐを含んでいるＲＮＡからのＧＦＰの発現が認められた。さらに次の期間において、ＧＦＰの蛍光強度の増強が徐々に緩やかになり、やがて一定の強度に留まっており、８ＮＶ－ｃａｐを含んでいるＲＮＡからのＧＦＰの発現が停止させられていることが認められた。一方で、ｎｏｒｍａｌ－ｃａｐからは、ＧＦＰの発現を示す、ＧＦＰの蛍光強度の増加が常に認められた。以上のように、本実施例に係るＲＮＡ（８ＮＶ－ｃａｐ）からのタンパク質への翻は、異なる波長を有している２つの光の、交互の照射によって、可逆的に停止と開始とを繰り返した。
　〔実施例２〕
　（２－１）アゾ骨格を有しているヌクレオシド化合物の合成
　（２－１－１）８－（４－メトキシフェニル）アゾグアノシン（化１４の５）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　３７重量％の塩酸（１２ｍＬ）および１．４８ｇのｐ－アニシジンを、６０ｍＬの水に冷却しながら加えて溶液１を調製した。３．０ｇのグアノシンを、１．５重量％のＮａＯＨ水溶液（６００ｍＬ）に溶解させ、アイスバスにおいて冷却した。これにＮａＮＯ２（８２８ｍｇ）水溶液および溶液１を加え、３０分間にわたって０℃において攪拌した。反応後に、酢酸を加えて反応物を析出させ、２時間にわたって静置した。析出した沈殿物をろ過によって回収し、３．７３ｇの８－（４－メトキシフェニル）アゾグアニン（化１４の２）を得た。
　３．７３ｇの８－（４－メトキシフェニル）アゾグアニンを２口ナス型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。６０ｍＬのＤＭＡおよび２．４７ｍＬの無水酢酸を２口ナス型フラスコへさらに加え、２時間にわたって１６０℃において加熱還流した。反応後に、沈殿物をろ過によって回収し、メタノールを用いて洗浄し、２．８８ｇの２－Ｎ－アセチル－８－（４－メトキシフェニル）アゾグアニン（化１４の３）を得た。
　２．３０ｇの２－Ｎ－アセチル－８－（４－メトキシフェニル）アゾグアニンを２口ナス型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。７０ｍＬのジクロロエタンおよび１２．４ｍＬのＮ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）アセトアミドを２口ナス型フラスコへさらに加え、１時間にわたって８０℃において加熱還流した。反応後に、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去した。反応物が入っているフラスコを減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。７０ｍＬのトルエン、１．５３ｍＬのトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル、および２．６９ｇのβ－Ｄ－リボフラノース１，２，３，５－テトラアセテートをフラスコへさらに加え、２時間にわたって８０℃において加熱還流した。反応後に、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去し、それからシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９５：５）によって精製した。目的物を含んでいるフラクションを回収し、展開溶媒を除去し、８０４ｍｇの２’，３’，５’－Ｏ－アセチル－２－Ｎ－アセチル－８－（４－メトキシフェニル）アゾグアノシン（化１４の４）を得た。
　８００ｍｇの２’，３’，５’－Ｏ－アセチル－２－Ｎ－アセチル－８－（４－メトキシフェニル）アゾグアノシンを２口ナス型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。１２ｍＬのメタノールおよび１５ｍＬのアンモニア（メタノール溶液）を２口ナス型フラスコへさらに加え、６時間にわたって６０℃において攪拌した。反応後に、沈殿物をろ過によって回収し、メタノールを用いて洗浄し、４６２ｍｇの８－（４－メトキシフェニル）アゾグアノシン（化１４の５）を得た。
　（２－１－２）８－（４－アミノキノリル）アゾグアノシン（化１５の５）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　３７重量％の塩酸（６ｍＬ）および１．００ｇのアミノキノリンを、３０ｍＬの水に冷却しながら加えて溶液２を調製した。１．７４ｇのグアノシンを、１．５重量％のＮａＯＨ水溶液（３００ｍＬ）に溶解させ、アイスバスにおいて冷却した。これにＮａＮＯ２（４７９ｍｇ）水溶液および溶液２を加え、３０分間にわたって０℃において攪拌した。反応後に、酢酸を加えて反応物を析出させ、２時間にわたって静置した。析出した沈殿物をろ過によって回収し、２．２３ｇの８－（６－アミノキノリル）アゾグアニン（化１５の２）を得た。
　２．１５ｇの８－（６－アミノキノリル）アゾグアニンを２口ナス型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。５０ｍＬのＤＭＡおよび１．７９ｍＬの無水酢酸を２口ナス型フラスコへさらに加え、２時間にわたって１６０℃において加熱還流した。反応後に、沈殿物をろ過によって回収し、メタノールを用いて洗浄し、１．８５ｇの２－Ｎ－アセチル－８－（６－アミノキノリル）アゾグアニン（化１５の３）を得た。
　１．８５ｇの２－Ｎ－アセチル－８－（６－アミノキノリル）アゾグアニンを２口ナス型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。７０ｍＬのジクロロエタンおよび９．６ｍＬのＮ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）アセトアミドを２口ナス型フラスコへさらに加え、１時間にわたって８０℃において加熱還流した。反応後に、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去した。反応物が入っているフラスコを減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。７０ｍＬのトルエン、１．１９ｍＬのトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル、および２．１０ｇのβ－Ｄ－リボフラノース１，２，３，５－テトラアセテートをフラスコへさらに加え、２時間にわたって８０℃において加熱還流した。反応後に、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去し、それからシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９５：５）によって精製した。目的物を含んでいるフラクションを回収し、展開溶媒を除去し、３００ｍｇの２’，３’，５’－Ｏ－アセチル－２－Ｎ－アセチル－８－（６－アミノキノリル）アゾグアノシン（化１５の４）を得た。
　３００ｍｇの２’，３’，５’－Ｏ－アセチル－２－Ｎ－アセチル－８－（６－アミノキノリル）アゾグアノシンを２口ナス型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。４ｍＬのメタノールおよび６ｍＬのアンモニア（メタノール溶液）を２口ナス型フラスコへさらに加え、６時間にわたって６０℃において攪拌した。反応後に、沈殿物をろ過によって回収し、メタノールを用いて洗浄し、１８６ｍｇの８－（６－アミノキノリル）アゾグアノシン（化１５の５）を得た。
　（２－１－３）８－（４－エチルフェニル）アゾグアノシン（化１６の５）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　３７重量％の塩酸（１２ｍＬ）および１．５０ｍＬの４－エチルアニリンを、６０ｍＬの水に冷却しながら加えて溶液３を調製した。３．００ｇのグアノシンを、１．５重量％のＮａＯＨ水溶液（６００ｍＬ）に溶解させ、アイスバスにおいて冷却した。これにＮａＮＯ２（８２８ｍｇ）水溶液および溶液３を加え、３０分間にわたって０℃において攪拌した。反応後に、酢酸を加えて反応物を析出させ、２時間にわたって静置した。析出した沈殿物をろ過によって回収し、３．８４ｇの８－（４－エチルフェニル）アゾグアニン（化１６の２）を得た。
　３．８４ｇの８－（４－エチルフェニル）アゾグアニンを２口ナス型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。６０ｍＬのＤＭＡおよび２．５６ｍＬの無水酢酸を２口ナス型フラスコへさらに加え、２時間にわたって１６０℃において加熱還流した。反応後に、沈殿物をろ過によって回収し、メタノールを用いて洗浄し、２．８２ｇの２－Ｎ－アセチル－８－（４－エチルフェニル）アゾグアニン（化１６の３）を得た。
　２．３８ｇの２－Ｎ－アセチル－８－（４－エチルフェニル）アゾグアニンを２口ナス型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。６５ｍＬのジクロロエタンおよび１３．１ｍＬのＮ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）アセトアミドを２口ナス型フラスコへさらに加え、３０分間にわたって８０℃において加熱還流した。反応後に、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去した。反応物が入っているフラスコを減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。６０ｍＬのトルエン、１．５９ｍＬのトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル、および２．７９ｇのβ－Ｄ－リボフラノース１，２，３，５－テトラアセテートをフラスコへさらに加え、２時間にわたって８０℃において加熱還流した。反応後に、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去し、それからシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９５：５）によって精製した。目的物を含んでいるフラクションを回収し、展開溶媒を除去し、２．７９ｇの２’，３’，５’－Ｏ－アセチル－２－Ｎ－アセチル－８－（４－エチルフェニル）アゾグアノシン（化１６の４）を得た。
　２．７９ｇの２’，３’，５’－Ｏ－アセチル－２－Ｎ－アセチル－８－（４－エチルフェニル）アゾグアノシンを２口ナス型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。３０ｍＬのメタノールおよび３０ｍＬのアンモニア（メタノール溶液）を２口ナス型フラスコへさらに加え、６時間にわたって６０℃において攪拌した。反応後に、沈殿物をろ過によって回収し、メタノールを用いて洗浄し、１．５７ｇの８－（４－エチルフェニル）アゾグアノシン（化１６の５）を得た。
　（２－２）アゾ骨格を有している５’キャップ構造を備えている５’ヌクレオシド（８ＥＰＡ－ｃａｐ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　３ｇの８－（４－エチルフェニル）アゾグアニン（化１７の１）を２口ナス口型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。１００ｍＬのリン酸トリメチルおよび１．１７ｍＬの塩化ホスホリルを２口ナス口型フラスコへさらに加え、２０時間にわたって４℃において攪拌した。その後、２０ｍＬの水をさらに加え、１ＭのＴＥＡＢ緩衝液を加えて反応溶液のｐＨを５．５に調整した。反応溶液をＤＥＡＥセファデックス（０～１ＭのＴＥＡＢ）を用いて精製し、目的物を含んでいるフラクションを回収し、溶媒を除去して、８－（４－エチルフェニル）アゾグアノシンモノホスフェート（化１７の２）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
　１．３７ｇの得られたモノホスフェートを２口ナス口型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。７０ｍＬのＤＭＳＯおよび４．７４ｍＬのヨウ化メチルをさらに加え、１時間にわたって室温において攪拌した。１００ｍＬの冷水を反応溶液に加え、３００ｍＬのジエチルエーテルを用いて３回にわたって洗浄した。１Ｍの炭酸水素ナトリウム水溶液を用いて水層をｐＨ５．５に調整し、ＤＥＡＥセファデックス（０～１ＭのＴＥＡＢ）を用いて精製した。目的物を含んでいるフラクションを回収し、溶媒を除去し、ＨＰＬＣ（０．１ＭのＴＥＡＢ／アセトニトリル）によってさらに精製した。これによって、７位がメチル化されている８－（４－エチルフェニル）グアノシンモノホスフェート（化１７の３）を得た。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 7.84 (d, J = 8.3, 2H), 7.47 (d, J = 8.3, 2H), 7.24 (s, 2H), 6.37 (d, J = 6.3, 1H), 7.43 (s, 2H), 5.10 (t, J = 5.8, 1H), 4.33-4.31 (m, 1H), 4.18-4.12 (m, 1H), 4.06-4.02 (m, 1H), 3.95-3.89 (m, 1H), 2.72 (dd, J = 15.1, 7.3, 2H), 2.11 (s, 3H), 1.24 (t, J = 7.3, 3H); 31P NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: -6.74 (m, 1P); FAB MS (M-H)- for C19H24N7O8P, Calculated: 508.13; Found: 507.77。
　１９３ｍｇの得られた化合物（化１７の３）を２口ナス口型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換を３回にわたって繰り返して系内を十分に窒素置換した。１４ＤＭＦおよび２５８ｍｇの塩化亜鉛を２口ナス口型フラスコへさらに加え、６０時間にわたって室温において攪拌した。１．２４ｇのＥＤＴＡが溶解している水溶液に反応溶液を注ぎ、ＴＥＡＢ緩衝液を加えて反応溶液のｐＨを５．５に調整した。その後に、ＤＥＡＥセファデックス（０～１ＭのＴＥＡＢ）を用いて精製した。目的物を含んでいるフラクションを回収し、溶媒を除去して、８ＥＰＡ－ｃａｐ（ＴＥＡ塩）を得た。得られた８ＥＰＡ－ｃａｐを弱陰イオン交換カラム（Ｓｔｒａｔａ－Ｘ－ＡＷ、ＳＨＩＧＭＡ　Ｃｏ．）によって遊離酸に変換し、目的の化合物である８５ｍｇの８ＥＰＡ－ｃａｐ（化１７の４）を得た。
　（２－３）光応答性の５’ｃａｐを含んでいるＲＮＡからタンパク質への、細胞内における翻訳の可逆的な光制御
　（２－２）において合成した光応答性の５’ｃａｐを含んでいる、ＧＦＰをコードしているＲＮＡを無細胞転写キット（ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ、Ａｍｂｉｏｎ　Ｃｏ．）を用いて合成した。合成反応後にｍＲＮＡキットＭＥＧＡｃｌｅａｒ（Ａｍｂｉｏｎ　Ｃｏ．）を用いて５’ｃａｐを含んでいるＲＮＡを精製した。ヌクレアーゼを含んでいない水を用いて得られたＲＮＡを２μＭに希釈し、マイクロインジェクションによってＨｅＬａ細胞に注入した。注入後に、共焦点レーザ顕微鏡を用いて同時に、細胞の特定の領域のみに対する４５８ｎｍの光の照射、それ以外の領域に対する５４３ｎｍの光の照射を３０分間にわたって行った。このときのＧＦＰからの蛍光を観察した結果（下段）および使用したＲＮＡの構造（上段）を図３に示す。
　図３（下段）に示すように、４５８ｎｍの光を照射した特定の領域（下段－左側の丸囲みに対応する左側の領域）に集中して、ＧＦＰの強い緑色蛍光が観察された。つまり、４５８ｎｍの光の照射を受けてシス型になっているＲＮＡのみからタンパク質が発現し、５４３ｎｍの光の照射を受けてトランス型になっているＲＮＡからタンパク質が発現していないことが明かであった。
　なお、本実施例のＲＮＡは、熱（例えば、室温）を与えることによって、５００ｎｍ～６００ｎｍの光を照射しなくともシス体からトランス体には異性体化し得る。図３の上段に示されている「５００～６００ｎｍ or Δ」のうち「Δ」は、熱によるＲＮＡの異性体化（シス体からトランス体への）を意味している。すなわち、本実施例のＲＮＡは、暗所において翻訳を開始させたい細胞の領域に対して例えば４５８ｎｍの光を照射し、室温において当該光の照射を中断すれば、翻訳の開始を抑制してそれ以降のタンパク質の発現を止めることができる。後ほど記載する「化１９」および「化２１」においても「Δ」は、同じことを意味している。
　〔実施例３〕
　（３－１）トランス－８－フェニルアゾグアノシンの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　化１８におけるａの反応：
３７重量％の塩酸（６ｍｌ）およびアニリン（５４９ｍｌ）を冷却しながら４２ｍｌの水に加えて、溶液Ａを調製した。１．５ｇのグアノシンを１．５重量％のＮａＯＨ水溶液（３００ｍｌ）に溶解させてアイスバスにおいて冷却した。このアイスバスにＮａＮＯ２水溶液（４１４ｍｇ）および溶液Ａを加えて、３０分にわたって０℃において攪拌した。反応後に、酢酸を加えて反応物を析出、沈殿させて、２時間にわたって静置した。沈殿物をろ過によって回収して、１．６１ｇの８－フェニルアゾグアニン（化１８の２）を得た。
　化１８におけるｂの反応：
５．０ｇの８－フェニルアゾグアニンを２口ナス型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換３回にわたって繰返して系内を十分に窒素に置換した。この２口ナス型フラスコに７５ｍｌのＤＭＡおよび８．２ｍｌのイソ酪酸無水物を加えて、１時間にわたって１５０℃において加熱還流した。反応後に沈殿物をろ過によって回収し、メタノール洗浄して４．１４ｇの２－Ｎ－イソブチル－８－フェニルアゾグアニン（化１８の３）を得た。
　化１８におけるｃの反応：
３．５８ｇの２－Ｎ－イソブチル－８－フェニルアゾグアニンを２口ナス型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換３回にわたって繰返して系内を十分に窒素に置換した。この２口ナス型フラスコに１００ｍｌのジクロロエタンおよび１９．３ｍｌのＮ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）アセトアミドを加えて、１時間にわたって８０℃において加熱還流した。反応後にロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去した。反応物の入ったフラスコを減圧下における窒素置換を３回にわたって繰返して系内を十分に窒素に置換した。１００ｍｌのトルエン、２．３９ｍｌのトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル、４．２０ｇのβ－Ｄ－リボフラノース１，２，３，５－テトラアセテートをこのフラスコに加えて、１．５時間にわたって８０℃において加熱還流した。反応後に、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９５：５）によって精製した。目的物を含むフラクションを回収し、展開溶媒を除去して、４．２１ｇの２’，３’，５’－Ｏ－アセチル－２－Ｎ－イソブチル－８－フェニルアゾグアノシン（化１８の４）を得た。
　化１８におけるｄの反応：
１．１４ｇの２’，３’，５’－Ｏ－アセチル－２－Ｎ－イソブチル－８－フェニルアゾグアノシンを２口ナス型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換３回にわたって繰返して系内を十分に窒素に置換した。この２口ナス型フラスコに２５ｍｌのメタノールおよび２５ｍｌのアンモニアのメタノール溶液を加えて、４時間にわたって６０℃において攪拌した。反応後に、沈殿物をろ過によって回収し、メタノール洗浄して６３４ｍｇのトランス－８－フェニルアゾグアノシン（化１８の５）を得た。
　（３－２）８－フェニルアゾグアノシンの可逆的な光異性化反応
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　（３－２－１）トランス体（ｔｒａｎｓ－ｉｓｏｍｅｒ）からシス体（ｃｉｓ－ｉｓｏｍｅｒ）への光異性化反応
　（３－１）において得られたトランス－８－フェニルアゾグアノシンの濃度が２５μＭになるようにメタノールに溶解させて、ストック溶液を調製した。ストック溶液のうち２００μｌを１ｃｍ角の石英セルに移し、暗所において４２０ｎｍの波長の可視光を照射して、吸収スペクトルの経時変化を測定することによってトランス－８－フェニルアゾグアノシンの光異性化を評価した。ここでは、光源として（株）朝日分光のＭＡＸ－３０１を使用し、フィルタとして同社のＭ．Ｃ．４２０／１０ｎｍを使用した。この結果を図１に示す。図４（上段）に示すように、トランス－８－フェニルアゾグアノシンのシス体への光異性化にともなって、４２０ｎｍの吸光度のピークが減少し、５００～６００ｎｍの吸光度が増加した。すなわち、可視光照射前にトランス体であったトランス－８－フェニルアゾグアノシンが、ほぼ完全にシス体に光異性化したことがわかった。
　（３－２－２）シス体からトランス体への光異性化反応
　（３－２－１）のストック溶液のうちの２００μｌを上述のようにシス体に異性化させてから、１ｃｍ角の石英セルに移し、暗所において５５０ｎｍの波長の可視光を照射して、吸収スペクトルの経時変化を測定することによってシス－８－フェニルアゾグアノシンの光異性化を評価した。ここでは、光源として（株）朝日分光のＭＡＸ－３０１を使用し、フィルタとして同社のＭ．Ｃ．５５０／１０ｎｍを使用した。この結果を図４（下段）に示す。図４（下段）に示すように、シス－８－フェニルアゾグアノシンのトランス体への光異性化にともなって、４２０ｎｍの吸光度のピークが増加し、５００～６００ｎｍの吸光度が減少した。すなわち、可視光照射前にシス体であったシス－８－フェニルアゾグアノシンが、ほぼ完全にトランス体に光異性化したことがわかった。
　（３－４）８－フェニルアゾグアノシンのシス－トランス光異性化の繰返し反応
　（３－１）において得られたトランス－８－フェニルアゾグアノシンの濃度が２５μＭになるようにメタノールに溶解させて、ストック溶液を調製した。ストック溶液のうち２００μｌを１ｃｍ角の石英セルに移し、暗所において４２０ｎｍおよび５５０ｎｍの波長の可視光を交互に２０秒間ずつ３０回繰り返し照射しながら、吸光度（４２０ｎｍ）を測定した。この測定結果から、可逆的な光異性化による化合物の耐久性を評価した。光源として（株）朝日分光のＭＡＸ－３０１を使用し、フィルタとして同社のＭ．Ｃ．４２０／１０ｎｍおよびＭ．Ｃ．５５０／１０ｎｍを使用した。この結果を図５に示す。図５に示すように、８－フェニルアゾグアノシンは、トランス体→シス体およびシス体→トランス体へと適切に繰り返し光異性化された。３０サイクルの繰返しの後においても化合物の分解および副反応は見られなかった。
　〔実施例４〕
　（４－１）トランス－８－（ｐ－トルイルアゾ）グアノシンの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　化２０における１→２の反応：
３７重量％の塩酸（４ｍｌ）および４２８ｍｇのｐ－トルイジンを２８ｍｌの水に加えて溶液Ｂを調製した。１．０ｇのグアノシン１．５重量％のＮａＯＨ水溶液（２００ｍｌ）に溶解させてアイスバスにおいて冷却した。このアイスバスにＮａＮＯ２水溶液（２７５ｍｇ）および溶液Ａを加えて、３０分にわたって０℃において攪拌した。反応後に、酢酸を加えて反応物を析出、沈殿させて、２時間にわたって静置した。沈殿物をろ過によって回収して、１．１７ｇの８－（ｐ－トルイルアゾ）グアニン（化２０の２）を得た。
　化２０における２→３の反応：
１．０ｇの８－（ｐ－トルイルアゾ）グアニンを２口ナス型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換３回にわたって繰返して系内を十分に窒素に置換した。この２口ナス型フラスコに１５ｍｌのＤＭＡおよび０．７ｍｌの無水酢酸を加えて、３．５時間にわたって１６０℃において加熱還流した。反応後に沈殿物をろ過によって回収し、メタノール洗浄して８４５ｍｇの２－Ｎ－アセチル－８－（ｐ－トルイルアゾ）グアニン（化２０の３）を得た。
　化２０おける３→４の反応：
７７７ｍｇの２－Ｎ－アセチル－８－（ｐ－トルイルアゾ）グアニンを２口ナス型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換３回にわたって繰返して系内を十分に窒素に置換した。この２口ナス型フラスコに３０ｍｌのジクロロエタンおよび４．３８ｍｌのＮ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）アセトアミドを加えて、１時間にわたって８０℃において加熱還流した。反応後にロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去した。反応物の入ったフラスコを減圧下における窒素置換を３回にわたって繰返して系内を十分に窒素に置換した。３０ｍｌのトルエン、０．５５ｍｌのトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル、９５４ｍｇのβ－Ｄ－リボフラノース１，２，３，５－テトラアセテートをこのフラスコに加えて、１．５時間にわたって８０℃において加熱還流した。反応後に、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９５：５）によって精製した。目的物を含むフラクションを回収し、展開溶媒を除去して、１．０７ｇの２’，３’，５’－Ｏ－アセチル－２－Ｎ－アセチル－８－（ｐ－トルイルアゾ）グアノシン（化２０の４）を得た。
　化２０における４→５の反応：
１．０７ｇの２’，３’，５’－Ｏ－アセチル－２－Ｎ－アセチル－８－（ｐ－トルイルアゾ）グアノシンを２口ナス型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換３回にわたって繰返して系内を十分に窒素に置換した。この２口ナス型フラスコに１５ｍｌのメタノールおよび１５ｍｌのアンモニアのメタノール溶液を加えて、４時間にわたって６０℃において攪拌した。反応後に、沈殿物をろ過によって回収し、メタノール洗浄して５７２ｍｇのシス－８－（ｐ－トルイルアゾ）グアノシン（化２０の５）を得た。
　（４－２）８－（ｐ－トルイルアゾ）グアノシンの可逆的な光異性化反応
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　（４－２－１）トランス体からシス体への光異性化反応
　（４－１）において得られたトランス－８－（ｐ－トルイルアゾ）グアノシンの濃度が２５μＭになるようにメタノールに溶解させて、ストック溶液を調製した。ストック溶液のうち２００μｌを１ｃｍ角の石英セルに移し、暗所において４２０ｎｍの波長の可視光を照射して、吸収スペクトルの経時変化を測定することによってトランス－８－（ｐ－トルイルアゾ）グアノシンの光異性化を評価した。ここでは、光源として（株）朝日分光のＭＡＸ－３０１を使用し、フィルタとして同社のＭ．Ｃ．４２０／１０ｎｍを使用した。この結果を図６（上段）に示す。図６（上段）に示すように、トランス－８－（ｐ－トルイルアゾ）ゾグアノシンのシス体への光異性化にともなって、４２０ｎｍの吸光度のピークが減少し、５００～６００ｎｍの吸光度が増加した。すなわち、可視光照射前にトランス体であったトランス－８－（ｐ－トルイルアゾ）グアノシンが、ほぼ完全にシス体に光異性化したことがわかった。
　（４－２－２）シス体からトランス体への光異性化反応
　（４－２－１）のストック溶液のうちの２００μｌを上述のようにシス体に異性化させてから、１ｃｍ角の石英セルに移し、暗所において５５０ｎｍの波長の可視光を照射して、吸収スペクトルの経時変化を測定することによってシス－８－（ｐ－トルイルアゾ）グアノシンの光異性化を評価した。ここでは、光源として（株）朝日分光のＭＡＸ－３０１を使用し、フィルタとして同社のＭ．Ｃ．５５０／１０ｎｍを使用した。この結果を図６（下段）に示す。図６（下段）に示すように、シス－８－（ｐ－トルイルアゾ）グアノシンのトランス体への光異性化にともなって、４２０ｎｍの吸光度のピークが増加し、５００～６００ｎｍの吸光度が減少した。すなわち、可視光照射前にシス体であったシス－８－（ｐ－トルイルアゾ）グアノシンが、ほぼ完全にトランス体に光異性化したことがわかった。
　〔実施例５〕
　（５－１）８－フェニルアゾ－２’－デオキシグアノシンの合成およびそのＤＮＡへの導入
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
　化２２における１→２までの反応を、（３－１）における「化１８におけるａの反応」に記載の通りに行って、１．６１ｇの８－フェニルアゾグアニン（化２２の２）を得た。
　化２２における２→３の反応：
５．０ｇの８－フェニルアゾグアニンを２口ナス型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換３回にわたって繰返して系内を十分に窒素に置換した。この２口ナス型フラスコに７５ｍｌのＤＭＡおよび８．２ｍｌのイソ酪酸無水物を加えて、１時間にわたって１５０℃において加熱還流した。反応後に沈殿物をろ過によって回収し、メタノール洗浄して４．１４ｇの２－Ｎ－イソブチル－８－フェニルアゾグアニン（化２２の３）を得た。
　化２２における３→４の反応：
３００ｍｇの２－Ｎ－イソブチル－８－フェニルアゾグアニンを２口ナス型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換３回にわたって繰返して系内を十分に窒素に置換した。この２口ナス型フラスコに１０ｍｌのジクロロエタンおよび１．６２ｍｌのＮ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）アセトアミドを加えて、１時間にわたって８０℃において加熱還流した。反応後にロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去した。反応物の入ったフラスコを減圧下における窒素置換を３回にわたって繰返して系内を十分に窒素に置換した。１０ｍｌのトルエン、０．２１ｍｌのトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル、３５８ｍｇの２５－デオキシ３，５－ジ－Ｏ－（ｐ－トルオール）－Ｄ－リボフラノシルクロライドをこのフラスコに加えて、１．５時間にわたって８０℃において加熱還流した。反応後に、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９７：３）によって精製した。目的物を含むフラクションを回収し、展開溶媒を除去して、３４２ｍｇの３’，５’－Ｏ－トルオール－２－Ｎ－イソブチル－８－フェニルアゾ－２’デオキシグアノシン（化２２の４）を得た。
　化２２における４→５の反応：
１６４ｍｇの３’，５’－Ｏ－トルオール－２－Ｎ－イソブチル－８－フェニルアゾ－２’デオキシグアノシンを２口ナス型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換３回にわたって繰返して系内を十分に窒素に置換した。この２口ナス型フラスコに３．５ｍｌのメタノール、６．５ｍｌのピリジンおよび３９．２ｍｇのナトリウムメトキシドを加えて、アイスバスを用いて冷却しながら２時間にわたって攪拌し、その後に３０分にわたって室温において攪拌した。反応後に、反応溶液を１Ｍの酢酸を用いて中和し、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９５：５）によって精製した。目的物を含むフラクションを回収し、展開溶媒を除去して、６１ｍｇの２－Ｎ－イソブチル－８－フェニルアゾ－２’－デオキシグアノシン（化２２の５）を得た。
　化２２における５→６の反応：
６１ｍｇの２－Ｎ－イソブチル－８－フェニルアゾ－２’－デオキシグアノシンを２口ナス型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換３回にわたって繰返して系内を十分に窒素に置換した。この２口ナス型フラスコに１．５ｍｌのピリジン、３．４ｍｇのジメチルピリミジンおよび４，４’－ジメトキシトリチルクロライド（４６．８ｍｇ）のピリジン溶液を加えて、２時間にわたって室温において攪拌した。反応後にロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９５：５）によって精製した。目的物を含むフラクションを回収し、展開溶媒を除去して、４４ｍｇの５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２－Ｎ－イソブチル－８－フェニルアゾ－２’－デオキシグアノシン（化２２の６）を得た。
　化２２の６→７の反応：
４４ｍｇの５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２－Ｎ－イソブチル－８－フェニルアゾ－２’－デオキシグアノシンを２口ナス型フラスコに入れ、減圧下における窒素置換３回にわたって繰返して系内を十分に窒素に置換した。この２口ナス型フラスコに０．５ｍｌのピリジン、１ｍｌのアセトニトリルおよび０．０２１ｍｌの２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルフォスフォロジアミダイトのピリジン溶液を加えて、１．５時間にわたって室温において攪拌した。反応後にロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９５：５）によって精製した。目的物を含むフラクションを回収し、展開溶媒を除去して、３７ｍｇの５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－３’－Ｏ－［２－シアノエチル（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノ）フォスフィノ］２－Ｎ－イソブチル－８－フェニルアゾ－２’－デオキシグアノシン（化２２の７）を得た。
　フォトクロミック塩基のＤＮＡへの導入：
５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－３’－Ｏ－［２－シアノエチル（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノ）フォスフィノ］２－Ｎ－イソブチル－８－フェニルアゾ－２’－デオキシグアノシンをＤＮＡ自動合成機にセットしてオリゴマーを合成した。当該オリゴマーは、５’－ＴＣＡＧＴＴＸＣＧＡＣＡ－３’の配列によって表され、当該配列のＸの部分に人工塩基が導入されている。
　本発明は、生物学的分野および医学分野、特に再生医療技術などへの応用が期待される。

Claims (17)

  1. 　５’キャップ構造、ならびに５’側の開始コドンおよび３’側の終止コドンを両端に有している翻訳領域を含んでいるＲＮＡであって、
    　プリン核の８位またはピリミジン核の５位もしくは６位の炭素原子に、式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （ここで、Ａがアリール基またはヘテロアリール基を表し、＃がプリン核の８位またはピリミジン核の５位もしくは６位の炭素原子との結合位置を表し、同一であるか、または異なる２つのＸがＣＨまたは窒素原子を表し、ここでＣＨラジカルのＨがアルキルによって置換され得る）
    によって表される基が結合しているヌクレオシド化合物が、上記ＲＮＡの５’キャップ構造および５’末端から１０塩基までの塩基から選択される位置に導入されている、ＲＮＡ。
  2. 　上記式（Ｉ）におけるＸが窒素原子である、請求項１に記載のＲＮＡ。
  3. 　上記式（Ｉ）におけるＡがアリール基またはヘテロアリール基であり、当該基に含まれている環が５～３０の原子数を有している、請求項１または２に記載のＲＮＡ。
  4. 　上記式（Ｉ）におけるＡが置換または非置換のナフチル基である、請求項１～３のいずれか１項に記載のＲＮＡ。
  5. 　上記ヌクレオシド化合物が、グアノシン誘導体、アデノシン誘導体、シトシン誘導体およびウラシル誘導体からなる群から選択される、請求項１～４のいずれか１項に記載のＲＮＡ。
  6. 　請求項１～５のいずれか１項に記載のＲＮＡからのタンパク質の産生量を制御する方法であって、
    　上記ヌクレオシド化合物の構造を、その照射によってトランス型からシス型にする波長を有している第１の光、および／または上記ヌクレオシド化合物の構造を、その照射によってシス型からトランス型にする、第１の光の波長と異なる波長を有している第２の光を、上記ＲＮＡに照射する工程を包含している、方法。
  7. 　上記ＲＮＡを細胞に導入する工程をさらに包含しており、
    　照射する上記工程が、上記第１の光および／または上記第２の光を、上記ＲＮＡが導入されている当該細胞に照射する工程である、請求項６に記載の方法。
  8. 　照射する上記工程において、上記第１の光、上記第２の光の順に照射するか、または上記第２の光、上記第１の光の順に照射する、請求項６または７に記載の方法。
  9. 　照射する上記工程が、上記ＲＮＡが導入された当該細胞の局所に、上記第１の光を照射する工程である、請求項７に記載の方法。
  10. 　光を照射する上記工程が、上記第１の光の照射と同時に、上記局所以外の領域に上記第２の光をさらに照射する工程である、請求項９に記載の方法。
  11. 　上記第１の光の照射後に、上記局所を含んでいる領域に上記第２の光を照射する工程をさらに包含している、請求項９または１０に記載の方法。
  12. 　上記第１の光および／または上記第２の光が可視光である、請求項６～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　上記局所の大きさが直径約１～５μｍである、請求項９～１１のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　プリン核の８位またはピリミジン核の５位もしくは６位の炭素原子に、式（Ｉ’）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （ここで、Ａがアリール基またはヘテロアリール基を表し、＃がプリン核の８位またはピリミジン核の５位もしくは６位の炭素原子との結合位置を表し、２つのＸが、同一であり、窒素原子を表す）
    によって表される基が結合している、ヌクレオシド化合物。
  15. 　グアノシン誘導体、アデノシン誘導体、シトシン誘導体およびウラシル誘導体からなる群から選択される、請求項１４に記載のヌクレオシド化合物。
  16. 　式（Ｉ’）におけるＡは、アリール基またはヘテロアリール基であり、当該基に含まれている環が５～３０の原子数を有している、請求項１４または１５に記載のヌクレオシド化合物。
  17. 　式（Ｉ’）におけるＡは、置換または無置換のフェニル基である、請求項１４～１６のいずれかに記載のヌクレオシド化合物。
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