WO2011101520A2 - Dendrimeros carbosilanos y su uso como antivirales - Google Patents

Dendrimeros carbosilanos y su uso como antivirales Download PDF

Info

Publication number
WO2011101520A2
WO2011101520A2 PCT/ES2011/070104 ES2011070104W WO2011101520A2 WO 2011101520 A2 WO2011101520 A2 WO 2011101520A2 ES 2011070104 W ES2011070104 W ES 2011070104W WO 2011101520 A2 WO2011101520 A2 WO 2011101520A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
dendrimer
sich
dendrimers
group
groups
Prior art date
Application number
PCT/ES2011/070104
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2011101520A3 (es
Inventor
Fco. Javier De La Mata De La Mata
Rafael GÓMEZ RAMÍREZ
Mª Ángeles MUÑOZ FERNÁNDEZ
Javier SÁNCHEZ-NIEVES FERNÁNDEZ
Paula ORTEGA LÓPEZ
Louis CHONCO JÍMENEZ
Beatriz Rasines Moreno
Eduardo Arnaiz Garrido
Mª Jesús SERRAMÍA LOBERA
Original Assignee
Universidad De Alcalá De Henares (Uah)
Hospital General Universitario Gregorio Marañon (Hgugm)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from ES201030233A external-priority patent/ES2364264B2/es
Priority claimed from ES201030450A external-priority patent/ES2365685B2/es
Application filed by Universidad De Alcalá De Henares (Uah), Hospital General Universitario Gregorio Marañon (Hgugm) filed Critical Universidad De Alcalá De Henares (Uah)
Priority to BR112012020870A priority Critical patent/BR112012020870A2/pt
Priority to EP11719842A priority patent/EP2537880A2/en
Priority to JP2012553360A priority patent/JP2013519711A/ja
Priority to US13/579,849 priority patent/US20130059818A1/en
Priority to AU2011217142A priority patent/AU2011217142A1/en
Priority to CN2011800101295A priority patent/CN102858851A/zh
Publication of WO2011101520A2 publication Critical patent/WO2011101520A2/es
Publication of WO2011101520A3 publication Critical patent/WO2011101520A3/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G83/00—Macromolecular compounds not provided for in groups C08G2/00 - C08G81/00
    • C08G83/002—Dendritic macromolecules
    • C08G83/003—Dendrimers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides

Definitions

  • the present invention relates to highly branched macromolecules synthesized from a polyfunctional nucleus, called dendrimers, of carbosilane structure and functionalized at its periphery with anionic groups that give the macromolecule a negative net charge. Furthermore, the invention relates to its method of obtaining and its uses in biomedicine.
  • dendrimers or dendronized polymers with a negative net surface charge since many types of viruses, such as HIV or HSV, bind polyanionic compounds. Thus, sulfated polysaccharides are typical effective inhibitors of viral inhibition.
  • polyanionic dendrimers for example polylysine dendrimers with carboxylate and sulphonate terminal groups have been described that are capable of effectively blocking HSV infection (cf. Gong, Y. et al. Antiviral Res, 2002, 55 ( 2), 319-329). The same authors conducted studies in mice in which they showed that these dendrimers protected the animals against vaginal infection and that the sulfonate derivatives were able to interfere in the final stages of virus replication in the infected cells.
  • SPL7013 is a lysine-based dendrimer with naphthalene disulfonic acid groups on its surface and is the active substance of a vaginal microbicidal gel called VivaGel®. Is a
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) potent in vitro inhibitor against numerous strains of HIV-1. It is being used in the prevention of vaginal transmission of HIV and genital herpes. Thus, a study developed by Dezutti and collaborators has shown that a formulation of this dendrimer (5%) has a very low toxicity in epithelial cells and is effective in preventing HIV-1 infection in peripheral blood mononuclear cells ( CMSP), macrophages and in the transfer of HIV-1 from epithelial cells to CMSP. Subsequent studies have shown that the daily application of the SPL7013 gel in proportions of 1-3% were well tolerated. In addition, similar results were obtained in the prevention of HIV-1 infection in the rectal application of the gel.
  • CMSP peripheral blood mononuclear cells
  • BRI2923 which is a polyamidoamine type dendrimer (PAMAM) grown from an ammonia nucleus and functionalized on the surface with 24 naphthalene disulfonic acid groups.
  • BRI6195 which is also a PAMAM type dendrimer, grown in this case from an ethylenediamine core and which is functionalized with 32 phenyldicarboxylate groups.
  • dendrimers based on a skeleton containing phosphorus atoms, functionalized on its surface with anionic phosphonate groups (cf. L. Griffe, et al., Anqew. Chem. Int. Ed., 2007, 46, 2523, has also been published. ). These dendrimers show great activity in the activation and multiplication of natural killer cells (NK). These data are promising as they open the door to the use of antiviral or anticancer immunotherapies, where a large number of NK cells may be necessary.
  • NK natural killer cells
  • the present invention provides highly branched macromolecules synthesized from a polyfunctional nucleus, called dendrimers, of carbosilane structure and functionalized at its periphery with carboxylic, phosphonic or sulfonic groups, preferably anionic that give the macromolecule a negative net charge.
  • the invention provides a method for obtaining it and its uses in biomedicine.
  • a first aspect of the present invention relates to a carbosilane dendrimer comprising: a polyfunctional core (Nu) and an outer layer, consisting, totally or partially, of equal or different units of the group of formula (I):
  • R is a (C-1-C4) alkyl group
  • p is an integer and varies between 1 and 3, preferably p is 1
  • X is the following group of formula (II):
  • E is a linking group located between the silicon of the general formula (I) and the amine group nitrogen, z is an integer and varies between 1 and 4, R 1 is selected from a group from the list comprising - COOR 2 , -SO3R 2 or -P0 3 (R 2 ) 2, and R 2 is hydrogen or an alkyl group (CC 4 ).
  • Carbosilane dendrimer refers in the present invention to a highly branched macromolecule with a spherical shape, where the dendrimer's growth core is polyfunctional, the growth units, branches or branches have carbosilane skeleton and the outer layer, surface or periphery of the dendrimer incorporates functional groups. This surface or periphery would correspond to the extremities of the branches.
  • polyfunctional core in the present invention a polyvalent element or compound covalently bonded with at least two branches, that is, at least it must be divalent.
  • the core is tetravalent and more preferably the core is silicon (i.e., a silyl group).
  • the core may be a polyphenol, and "polyphenol” is understood as a benzene molecule substituted by at least two hydroxyl groups in
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) Any of its positions, for example 1,4-dihydroxybenzene, 1,2-dihydroxybenzene or 1,3-dihydroxybenzene, more preferably is hydroquinone (1,4-dihydroxybenzene), but may have three, four, five or six hydroxyl groups. More preferably the polyphenol is trisubstituted, even more preferably 1,3,5-trihydroxybenzene.
  • linking group is meant in the present invention any group that joins the branches, which in turn are attached to the core, with the functional groups of the outer layer of the dendrimer.
  • the linking group E may preferably be selected from an alkyl (dC 10 ) or a group - (CH 2 ) X -R 3 , where R 3 can be a triazole or phenoxo group and x is an integer ranging from 1 to 6.
  • alkyl refers in the present invention to aliphatic, linear or branched chains.
  • R 'and R 2 these chains have 1 to 4 carbon atoms, for example, methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, tert-butyl or sec-butyl, preferably the alkyl group is a methyl.
  • a linking group (E) these chains have 1 to 10 carbon atoms, more preferably the alkyl group is a chain having 1 to 4 carbon atoms and more preferably the linking group (E) is a propyl group.
  • linking group (E) is the group - (CH 2) x R 3 and R 3 is triazole, ie, of formula:
  • x is described above and more preferably x is 4.
  • linking group (E) is the group - (CH 2 ) X -R 3 and R 3 is phenox, that is, of the formula:
  • x is described above and more preferably x is 1.
  • R 1 is the group -COOR 2 or the group -S0 3 R 2
  • R 2 is hydrogen or methyl and more preferably z is 2.
  • R is the group -P0 3 (R 2 ) 2
  • R 2 is hydrogen or methyl and more preferably z is 1.
  • the dendrimer of the present invention can also be anionic, forming the carboxylate, phosphonate or sulfonate groups.
  • the present invention not only includes dendrimers themselves, but any of their salts, for example, alkali metal or alkaline earth metal salts, which
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) they can be selected from sodium, potassium or calcium salts, preferably the salts are sodium.
  • the dendrimer may be zero generation and may be represented by the following formula (III):
  • Nu represents a polyfunctional core as defined above, R a is an alkyl group (Ci-Ce); and is an integer that varies between 2 and 6, preferably and is 4 when the core is silicon; and and R is the terminal group of general formula (I) as described above. If the core is made of silicon or polyphenol, the dendrimer of formula (III) can be of formula Illa or lllb.
  • R, R a , e and are defined above. In the case of lllb, and is preferably 3.
  • generation refers to the number of iterative branches that are necessary for the preparation of the dendrimer.
  • the dendrimer is at least first generation and can be represented by the following general formula (IV):
  • Nu represents a polyfunctional nucleus as defined above, R a R b and R ", are the same or different, and represent a (C1-C6) alkyl group; m is an integer that varies between 1 and 3 preferably m is 2; and is an integer that varies between 2 and 6; and R is the terminal group of general formula (I) as described above.
  • the dendrimer of formula (IV) may be of formula IVa or IVb, respectively:
  • R, R to Rb, R ", me and are defined above. In the case of IVb, and is preferably 3.
  • the dendrimer is at least second generation and can be represented by the following formula (V):
  • Nu represents a polyfunctional nucleus as defined above, R a , Rb, Re, R “and R 1 ", are the same or different, and represent an alkyl group (Ci-Ce); myn are the same or different and is an integer that varies between 1 and 3; preferably my / on is 2; and is an integer that varies between 2 and 6; and R is the terminal group of general formula (I) as described above. If the core is made of silicon or of formula Va or Vb, respectively:
  • R, R a , Rb, Re, R ", R 1 ", m, ney are defined above.
  • Vb is preferably 3.
  • the dendrimer is at least third generation and can be represented by the following formula (VI):
  • R a , Rb, R c , R ⁇ i, R ", R m and R IV are the same or different, and represent a (C1-C6) alkyl group; m, n and q are the same or different and is an integer which varies between 1 and 3; preferably it is m, n / oq is 2; and it is an integer that varies between 2 and 6; and R is the terminal group of general formula (I) as described above. it is silicon or polyphenol the dendrimer of formula (VI) can be of formula Via or Vlb, respectively:
  • Vb is preferably 3.
  • the radicals R a , Rb, R c or R d may be the same or different, and preferably represent a (C 2 -C 4) alkyl group ).
  • the radicals R ", R MI OR iv are independently from each other, and represent a (C1-C 4) group, more preferably are a methyl group.
  • carboxylate and sulfonate dendrimers are stable and water soluble dendrimers. Depending on the pH, dendrimers can be obtained as sodium salts, acids or amino acids, which provides greater versatility in their applications. Its synthesis is relatively simple, which facilitates its obtaining in large quantities. In addition, carbosilane dendrimers have great chemical inertia, which is very useful for the study of any biomedical application.
  • dendritic wedges or dendrons of carbosilane nature that have a functional group at the focal point, allow the coupling of several of these wedges on a core.
  • the adequate subsequent functionalization of the periphery of the dendrimers obtained allows obtaining anionic dendrimers with terminal groups such as carboxylate, sulphonate or phosphonate. That is, the preparation of these anionic derivatives can be done following a synthetic sequence of 3 steps that involve:
  • these dendritic wedges For the synthesis of these dendritic wedges, it is possible to start from a haloalkene, more preferably bromoalkene, such as allyl bromide or 4-bromobutene, and a divergent growth strategy can be used. Depending on the type of functionalization that is reached at the periphery of these dendrons, different dendritic wedges can be obtained that subsequently allow a great versatility of preparative procedures for obtaining anionic carbosilane dendrimers.
  • a haloalkene more preferably bromoalkene, such as allyl bromide or 4-bromobutene
  • a divergent growth strategy can be used.
  • different dendritic wedges can be obtained that subsequently allow a great versatility of preparative procedures for obtaining anionic carbosilane dendrimers.
  • dendritic wedges can be prepared which have an alkyl bromine group, BrCH 2 -Dendr, at their focal point, and have their functionalized surface with different groups such as: allyl groups, Si-H bonds or terminal Si-CI terminals, ester groups, etc.
  • a general scheme of these dendritic wedges is shown in FIG. 16.
  • the dendrons can present at their focal point a functionality -CH 2 Br, so they can be anchored on a core, to give rise to dendrimers with different
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) functional groups on the surface.
  • This coupling reaction of dendritic wedges with C-Br bonds at the focal point on different derivatives, such as polyphenolics can generally be carried out in a solvent, such as acetone, tetrahydrofuran (THF) or dimethylformamide (DMF), heated at temperatures between 60 and 100 ° C for several hours in the presence of a base such as potassium carbonate (K2CO3) or cesium carbonate (CS2CO3) and adding crown ether, for example 18-C-6, to favor the solubility of the inorganic salt in the organic solvent used.
  • a solvent such as acetone, tetrahydrofuran (THF) or dimethylformamide (DMF)
  • K2CO3 potassium carbonate
  • CS2CO3 cesium carbonate
  • dendrimers described above have been synthesized, obtaining dendrimers with carboxylic, phosphonic or sulfonic groups, and more preferably their anionic groups, on the surface it can be approached in various ways depending firstly on the functionalities present in the starting dendrimer and in second place of the nature of the anionic groups that are desired in the final dendrimer:
  • carboxylate derivatives two different methods can be used to obtain carboxylate derivatives, the first being the reaction of allylamine hydrosilylation on dendrimers terminated in Si-H bonds using a platinum catalyst, followed by the Michael-type addition of acrylate methyl on the amino groups, -NH 2 , terminals of the dendrimer and subsequent transformation of the resulting ester groups into carboxylate groups by treatment with a base, such as NaOH.
  • the second method consists in initially preparing an allylamine with terminal ester groups by Michael-type addition of methyl acrylate on allylamine and subsequent hydrosilylation of this functionalized allylamine on the dendrimer terminated in terminal Si-H groups. In this case, the final step would also be the transformation of the terminal ester groups into carboxylate groups by adding a base.
  • dendrimers with sulfonate groups can be prepared by initially carrying out allylamine hydrosilylation on dendrimers terminated in Si-H groups and subsequent Michael-type addition of sodium vinyl sulfonate on dendrimers ending in -NH 2 groups resulting in the first stage.
  • dendrimers finished in -NH 2 groups can be prepared initially and from them the groups are introduced by the addition of methyl phosphite, HPO (OMe) 2 . Also in this case obtaining
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) anionic derivatives with terminal phosphonate groups can be achieved by adding base, for example NaOH, on the above dendrimers.
  • another aspect of the present invention relates to a process for obtaining the dendrimers of the invention, which comprises the Michael type addition of a dendrimer containing a polyvalent core and terminal NH- 2 groups to an alkene containing carboxylic groups. or sulfonates, for example, methyl acrylate or vinyl sulphonate (for the functionalization of the dendrimer surface with carboxylate or sulphonate groups) or the two-stage reaction of these dendrimers with formaldehyde and dimethyl phosphonate (for the functionalization of the surface of the dend
  • n represents the number of generations (G) and x the number of terminal groups, which will depend on the number of generations.
  • alkene in the present invention refers to unsaturated hydrocarbons of linear or branched chains, and which contain at least one terminal double bond, are chains having 2 to 4 carbon atoms and also comprise a carboxylic or sulphonate group.
  • dendrimers with -Nhb terminations can be obtained by hydrosilylation of allylamine on carbosilane dendrimers of different generations with Si-H terminal bonds.
  • the dendrimer containing a -NH 2 group is obtained by:
  • step (b) coupling of the dendrons obtained in step (a) to a polyvalent core; and c) the functionalization of the dendrimer obtained in (b) with -NH 2 terminal groups.
  • Another aspect of the present invention relates to a process for obtaining the dendrimers of the invention, which comprises the hydrosilylation of a dendrimer
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) which contains a terminal -Si-H groups with an allylamine group functionalized with carboxylic, phosphonic or sulfonic groups.
  • the dendrimer containing polyvalent nuclei and terminal Si-H groups is obtained by:
  • step (a) coupling of the dendrons obtained in step (a) to a nucleus; or alternatively
  • haloalkene is meant in the present invention an alkene ( ⁇ - ⁇ - ⁇ ) substituted by a halogen, for example a bromine, iodine or chlorine atom, more preferably it is a bromoalkene (Ci-Ce), even more preferably it is a bromoalkene (C2-C4), such as 4-bromobutene.
  • a halogen for example a bromine, iodine or chlorine atom, more preferably it is a bromoalkene (Ci-Ce), even more preferably it is a bromoalkene (C2-C4), such as 4-bromobutene.
  • dendrimers with -NH 2 terminations can be obtained by the "click chemistry" methodology for the union of propargilamine in carbosilane dendrimers on carbosilane dendrimers of different generations functionalized with terminal azide groups. But, as described, the functionalization of the amine terminations with the carboxylic, sulfonic or phosphoric groups may also be prior to their attachment to the surfaces of the dendrimer skeletons.
  • another aspect of the present invention relates to a process for obtaining the dendrimers of the invention, which comprises the initial functionalization of organic amines with the carboxylic, sulfonic or phosphoric groups or their precursor groups, and their subsequent binding to dendrimers.
  • the present invention relates to a compound of formula (VII):
  • Et is an ethyl group and R is the terminal group of formula (I) as described above, a group -Si (R ') 3-p [(CH2) 4-N 3 ] p, or the group - If (R ') 3- p [E-NH2] p where R is
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) a (C1-C4) alkyl group, preferably R 'is methyl, p varies between 1 and 3, preferably p is 1 and E is a linking group as described above. Therefore, other reaction intermediates may be carbosilane dendrimers functionalized with terminal azide and amine groups comprising:
  • polyfunctional core defined above, preferably silicon tetraalyl or polyphenol
  • R ', p and E have been described above, preferably E is the group -
  • (CH 2 ) X -R 3 and R 3 is triazole, x is defined in claim 6, preferably x is 4.
  • the dendrimers of the invention may have application in different fields of biomedicine, among which its use as therapeutic, antiviral, antibacterial or antiprionic agents should be noted.
  • they also have anti-inflammatory activity, which improves their prophylactic properties since the likelihood of infection against HIV increases significantly in the presence of inflammatory processes.
  • a good vaginal topical microbicide should prevent HIV infection and keep the vaginal epithelial barrier intact. In this sense, a process of vaginal inflammation could increase HIV infection by activating dendritic cells and recruiting T cells (targets of HIV) to the site of inflammation, increasing the risk of HIV infection and activating the transcription process.
  • the transcription factor NF-kappaB is one of the major pharmacological targets for anti-inflammatory compounds.
  • the anti-inflammatory property of the dendrimers of the invention is an additional advantage over other dendrimers with antiviral, antibacterial or antiprionic activity known in the state of the art.
  • dendrimers as a medicament.
  • This medication being preferably for the prevention and / or treatment of diseases caused by viruses, bacteria or fungi. And more preferably when the disease is caused by strains of HIV. More preferably these dendrimers are anionic.
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26)
  • the dendrimer of the invention As an antiviral agent, the dendrimer of the invention, of nanoscopic size, prevents the correct adhesion process to the target cell, as well as the infection of this and its corresponding production of new viral particles.
  • the dendrimers of the invention have therapeutic effect, since in cells infected by HIV this nanoparticle reduces viral replication, but above all they have therapeutic effect for sexually transmitted diseases (STDs) (antiviral, antibacterial or antifungal).
  • STDs sexually transmitted diseases
  • the diseases are sexually transmitted diseases, the dendrimer of the invention acting as antiviral, antibacterial or antifungal.
  • “Sexually transmitted disease” means in the present invention infections that are acquired by having sex with someone who is infected, and said infection can be caused by bacteria, fungi, protozoa or viruses, for example the infection caused by the HIV The vast majority of HIV infections occur due to lack of protection when having sex with an HIV-positive person.
  • Another aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least one dendrimer as described above and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • this pharmaceutical composition may comprise another active ingredient.
  • compositions are the vehicles known to a person skilled in the art.
  • Examples of pharmaceutical preparations include any solid composition (tablets, pills, capsules, granules, etc.) or liquid (gels, solutions, suspensions or emulsions) for oral, nasal, topical or parenteral administration, preferably the administration will be topical and even more preferably in gel form.
  • the present invention relates to a method of treatment or prevention of diseases caused by viruses, bacteria or fungi in a mammal, preferably a human, comprising the administration of a therapeutically effective amount of a composition comprising at least one dendrimer
  • the administration of the composition can be performed orally, nasally, topically or parenterally.
  • the term "therapeutically effective amount” refers to the amount of the composition calculated to produce the desired effect and, in general, will be determined, among other causes, by the characteristics of the composition itself, the age, condition and history of the patient, the severity of the disease, and the route and frequency of administration.
  • dendrimers of the invention are vehicles for transporting molecules, preferably molecules with pharmacological activity (active ingredients), and more preferably molecules with positive charge when dendrimers have a negative charge.
  • FIG. 1 Shows the viability of the three generations of anionic dendrimers with carboxylate terminations (G1CO08, G2CO016 and G3C0032) and sulfonate (G1SF8,
  • FIG. 1A LDH test (Lactate Release
  • Tx-100 (triton x-100) at 1% represents 100% toxicity.
  • MTT assay 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazole bromide. 20% DMSO represents 100% toxicity.
  • Dx (Dextran) is used as a safe molecule control
  • DxS (Dextran Sulfonate)
  • Suramin are molecules with sulfonate groups used as a positive control of HIV inhibition.
  • FIG. 2 Shows the viability of CMSPs in the presence of different concentrations of G2C0016 and G2SF16.
  • FIG. 2A LDH assay
  • FIG. 2B MTT assay.
  • FIG. 3 Shows the toxicity of the G2SF16 dendrimer on human blood erythrocytes (hemoglobin release to the supernatant).
  • FIG. 4 Represents a 4-day lymphoproliferative trial in CMSP. CMSPs are stimulated with 2 g / mL PHA (purified phytohemagglutinin). In FIG. 4A is shown
  • FIG. 5 Represents an adsorption test of viral particles to the epithelial cell monolayer in the presence of a pretreatment with dendrimers, G2SF16 and G2C0016, at different times.
  • the amount of HIV is evaluated by performing an enzyme immunoassay for the quantification of Agp24 in the culture supernatant (ELISA p24). After 24 hours of infection (FIG. 5A) and after 72 hours of infection (FIG. 5B).
  • FIG. 6. It shows an assay of internalization of viral particles by the HEC-1A cell line.
  • the cells were pretreated for 1h with the dendrimers before infecting them with the X4 HIV NL4.3 isolate for 3h. After infection, HEC-1A was lysed with 0.2% TX-100 to quantify viral particles inside the cell.
  • FIG. 7. Shows the mechanism of interaction between dendrimers and viral particles. Strains X4 HIV NL4.3 and R5 HIV Bal were pretreated with dendrimers before being exposed to CMSP. The viral supernatant was collected at 4 days.
  • FIG. 8 Shows the inhibition of transcytosis in HEC-1A.
  • the amount of Agp24 in the basolateral supernatant of the transweil devices used to simulate a monolayer of the vaginal mucosa was evaluated.
  • FIG. 9 Shows the evaluation of the prophylactic and therapeutic effect of the G2SF16 dendrimer in CMSP.
  • CMSPs were treated at different times before and after being infected with HIV to analyze the activity of the G2SF16 dendrimer.
  • T-20 is a fusion inhibitor of the viral membrane with the cell membrane through the gp41 protein, inhibits the entry of the virus into the cell and
  • AZT is a reverse transcriptase inhibitor.
  • both viral replication inhibitors are used as controls to see that they inhibit virus replication.
  • FIG. 9A is pretreatment, that is, the dendrimer is first added and then infected
  • FIG. 9B is post-treatment, that is, it is first infected and then the virus is added.
  • FIG. 10 Shows inhibition of HIV entry in dendritic cells and macrophages.
  • the cells were pretreated for 1h with the G2SF16 dendrimer. They were infected with strains X4 HIV NL4.3 (black columns) and R5 HIV Bal (gray columns)
  • FIG. 11 It shows the bactericidal effect of anionic dendrimers of carbosilane structure. Representation of the effect dependent on the concentration of ampicillin and
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) the G2C0016 and G2SF16 dendrimers at 24 hours post-treatment of S.aureus.
  • the slope of the triangle represents the decrease in the antibiotic concentration (2; 1; 0.5; 0.25; 1.12; 0.6; 0.3; 0.15 yg / mL) or dendrimer (160; 80; 40; 20; 10; 5; 2.5; 1.25 ⁇ ).
  • the gray bar represents the dendrimer at 10 ⁇ .
  • FIG. 12 Shows the bacteriostatic effect of anionic dendrimers of carbosilane structure. Representation of the effect dependent on the concentration of ampicillin and the G2C0016 and G2SF16 dendrimers at 24 hours post-treatment of S. aureus.
  • the slope of the triangle represents the decrease in the antibiotic concentration (2; 1; 0.5; 0.25; 1.12; 0.6; 0.3; 0.15 g / mL) or dendrimer (160; 80; 40; 20; 10; 5; 2.5; 1.25 ⁇ ).
  • the gray bar represents the dendrimer at 10 ⁇ .
  • FIG. 13 Shows the biocompatibility studies and inhibitory effect of the entry of HIV from dendrimers click.
  • FIG. 13A represents a toxicity curve of dendrimers in HEC-1A.
  • FIG. 13B shows the inhibition of HIV entry into HEC-1A cells after pretreatment with the G2CKC0016 and G2CKP32 dendrimers 1h before infection.
  • FIG. 14 Shows the study of TNF-alpha (TNF) inhibition in T lymphocytes. Transfection of Jurkat cells with the plasmid pTNF-luc, in the presence of G2SF16. aTNF is anti-TNF-alpha.
  • FIG. 15 Shows the transfection of Jurkat cells with the plasmid pNF-kB-luc, in the presence of G2SF16.
  • FIG. 16 Schematically represents a dendritic wedge of carbosilane nature with double functionality, at the focal point (F.p.f) and the periphery (F.P.),
  • FIG. 17.- It shows a study of the release of LDH after 24 hours of contact between the three generations of dendrimer and MT-2 cells.
  • FIG. 18.- Shows a study of the release of LDH after 24 hours of contact between the three generations of dendrimer and the CMSP.
  • FIG. 19.- Shows a study of the mitochondrial activity of CMSPs in contact with different concentrations of dendrimer at 24h.
  • FIG. 20 Represents the inhibition of HIV transcytosis in monolayer of HEC-1A. It was treated with 70 ng of Bal virus in the apical part after 1h of pretreatment with the dendrimer and basolateral supernatant was collected at 48h.
  • FIG. 21 Represents the inhibition of CMSP infection pretreated 1h with G203SF24. All reagents were added to a final concentration in the well of 10 ⁇ .
  • FIG. 22.- Shows an infection inhibition assay in macrophages (M), immature dendritic cells (Di) and mature dendritic cells (Dm) at 4 days. They were pretreated 1h before infecting with NL4.3 (3ng)
  • FIG. 23 Representation of the bactericidal effect dependent on the concentration of ampicillin (commercial antibiotic) and G203SF24 at 24 hours post-treatment of S. aureus.
  • the slope of the triangle represents the decrease in the concentration of Antibiotic (2; 1; 0.5; 0.25; 1.12; 0.6; 0.3; 0.15 g / mL) or dendrimer (160; 80; 40; 20; 10; 5; 2.5; 1.25 ⁇ ).
  • the gray bar represents the dendrimer at 10 ⁇ .
  • FIG. 24 Representation of the bacteriostatic effect dependent on the concentration of ampicillin (commercial antibiotic) and G203SF24 at 24 hours post-treatment of S. aureus.
  • the slope of the triangle represents the decrease in the concentration of Antibiotic (2; 1; 0.5; 0.25; 1.12; 0.6; 0.3; 0.15 pg / mL) or dendrimer (160; 80; 40; 20; 10; 5; 2.5; 1.25 ⁇ ).
  • the gray bar represents the dendrimer at 10 ⁇ .
  • FIG. 25 Representation of the fungicidal effect dependent on the concentration of amphotericin B (commercial fungicide) and G203SF24 at 24 hours post-treatment of C. albicans.
  • the slope of the triangle represents the decrease in the concentration of Amphotericin B (2; 1; 0.5; 0.25; 1.12; 0.6; 0.3; 0.15 pg / mL) or dendrimer (160; 80; 40; 20; 10; 5; 2.5; 1.25 ⁇ ).
  • the gray bar represents the dendrimer at 10 ⁇ .
  • FIG. 26 - Representation of the fungistatic effect dependent on the concentration of amphotericin B (commercial fungicide) and G203SF24 at 24 hours post-treatment of C. albicans.
  • the slope of the triangle represents the decrease in the concentration of Amphotericin B (2; 1; 0.5; 0.25; 1.12; 0.6; 0.3; 0.15 pg / mL) or dendrimer (160; 80; 40; 20; 10; 5; 2.5; 1.25 ⁇ ).
  • the gray bar represents the dendrimer at 10 ⁇ .
  • EXAMPLE 1 Obtaining the dendrimers of the invention grown from a silicon core.
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) METHOD 1: Synthesis of carbosilane dendrimers from a tretraalyl silicon core with amino terminal groups.
  • METHOD 1 (a): Synthesis of anionic dendrimers from dendrimers with amino terminal groups obtained by allylamine hydrosilylation.
  • dendrimers In general, to simplify the way of naming dendrimers described in these examples, they can be represented as Gn- (Fp) x, where:
  • n indicates the number of generation G.
  • F indicates the nature of the functional groups located on the periphery of the dendrimer.
  • p indicates the number of functional groups in each branch.
  • x denotes the number of terminal units present in the dendrimer.
  • Anionic dendrimers were prepared following this synthetic route starting from carbosilane dendrimers with amino terminal groups or their triethyl silyl intermediate
  • These dendrimers of different generations can be prepared following reactions described in the bibliography a through divergent procedures (M. Angeles Mu ⁇ oz-Fernández et al.
  • Derivatives 13-16 are also converted through a reversible process in anionic dendrimers 9-12 by treatment with a NaOH solution, who revert to the former if they are treated again with an aqueous solution of 1M HCI (scheme 2).
  • METHOD 1 (b): Synthesis of anionic dendrimers from dendrimers with amino terminal groups obtained by coupling propargyl amine on dendrimers terminated in azide groups via click chemistry.
  • This synthetic route initially involves the preparation of carbosilane dendrimers, grown from a tetraalyl silicon core, with terminal azide groups. The preparation of these azide derivatives has been carried out from dendrimers
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) containing terminal links Si-H, of the type Gn- [Si-H] x in two stages (scheme 4).
  • Compounds 25 to 32 are oily solids stable to air and moisture, soluble in most organic solvents in common use and can be stored without decomposition for long periods of time.
  • dendrimers can be simplified by representing them as c / c-Gn- (Fp) x, where: ck indicates that they are dendrimers obtained by click coupling between an azide group and a triple carbon carbon bond and n, G, F, P and x are those described above and their structures are like the previous ones.
  • anionic dendrimers following this synthetic route starts from carbosilane dendrimers with amino terminal groups c -Gn- [Si (CH 2 ) 4 (N 3 C 2 H) CH 2 NH 2 ] x, (33) to (36) . From these compounds, obtaining anionic dendrimers with groups such as carboxylate, sulphonate or phosphonate is finally produced following procedures analogous to those described in the previous section for dendrimers with 2- NH-groups obtained from allylamine hydrosilylation. . Thus we have obtained the families of compounds described below.
  • Derivatives 37-40 can be transformed into the corresponding anionic carboxylate derivatives by treatment with NaOH, giving rise to the compounds ck-Gn- [Si (CH 2 ) 4 (N3C2H) CH2N (CH2CH 2 COONa) 2] x (triethyl silane Et 3 -
  • Derivatives 49-52 can be transformed into anionic carbosilane dendrimers with terminal phosphonate groups ck- Gn- [Si (CH 2 ) 4 (N 3 C 2 H) CH 2 N (CH 2 PO (ONa) 2 ) 2 ] x (triethyl silane Et 3 -
  • dendrimers are isolated as white water-soluble solids and can be stored for long periods of time without showing signs of decomposition.
  • METHOD Functionalization of organic amines with anionic groups and subsequent anchoring of them to a carbosilane dendrimer.
  • Another family of synthesized compounds derives from the functionalization of propargyl amine with carboxylate (D), sulfonate (E) or phosphonate (F) groups.
  • D carboxylate
  • E sulfonate
  • F phosphonate
  • the presence of the carbon-carbon triple bond present in these derivatives allows their binding to carbosilane dendrimers with terminal azide groups, of the type Gn- [Si-CH 2 CH2CH2CH2N 3 ] X , through a coupling reaction click between the propargyl derivative and the azide group of the dendrimer.
  • a third type of compounds prepared are those obtained from the functionalization of the -NH 2 group of 4-amino phenol with carboxylate derivatives (G), or phosphonate (H).
  • G carboxylate derivatives
  • H phosphonate
  • the binding of these compounds to carbosilane dendrimers is carried out through a phenolysis reaction of dendrimers containing Si-CI or S ⁇ CH 2 -CI terminal bonds (scheme 11).
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) The synthesis of the AB compounds has been carried out through a Michael-type addition reaction of allylamine with methyl acrylate, and sodium vinyl sulphonate respectively.
  • the Michael type addition is completed in THF at room temperature and in just 3 hours.
  • Derivative B is prepared through a Michael type addition of sodium vinyl sulphonate on allylamine. In this case the reaction is carried out in H 2 0 as solvent, at 120 ° C and for 48 hours.
  • derivative C its preparation is carried out in a two-step reaction, from allylamine.
  • allylamine is reacted with formaldehyde in THF for 1 hour at room temperature and then "in situ" dimethyl phosphite is added and the mixture is heated at 40 ° C for 3 hours, giving derivative C as a colorless oil.
  • Derivatives 5-8 can be transformed into the corresponding anionic dendrimers, with carboxylate groups, 9-12, by treatment with a NaOH solution (see scheme 2).
  • Derivative H is prepared from a two-step reaction, from 4-aminophenol. Initially 4-aminophenol is reacted with formaldehyde in THF for 1 hour at room temperature and then "in situ" dimethyl phosphonate is added and the mixture is heated at 40 ° C for 3 hours, giving derivative H as a colorless oil .
  • the dendrimers described in the previous section were characterized by elemental analysis of carbon, hydrogen and nitrogen, nuclear magnetic resonance of 1 H, 13 C, 29 Si and 31 P, and mass spectrometry.
  • the analytical and spectroscopic data obtained are in accordance with the proposed structures for these derivatives.
  • NMR- 13 C ⁇ 1 H ⁇ (CDCI 3 ): ⁇ 173.0 (COOMe), 57.5 (SiCH 2 CH 2 CH 2 N-), 51.5 (-OMe), 49.3 (-NCH 2 CH 2 COOMe), 32.4 (- NCH 2 CH 2 COOMe), 21.6 (-SiCH 2 CH 2 CH 2 N-), 20.3, 18.5, 18.0 (Si (CH 2 ) 3 Si-), 13.0 (- SiCH 2 CH 2 CH 2 N-), - 3.3 (-SiMe 2 ).
  • NMR- 29 Si ⁇ 1 H ⁇ (CDCI 3 ): ⁇ 0.8 (G 0 -Si), 1.9 (G Si).
  • NMR- 13 C ⁇ 1 H ⁇ (CDCI 3 ): ⁇ 173.0 (-COOMe), 57.5 ((-S ⁇ CH 2 CH 2 CH 2 N ⁇ ), 51.5OMe), 49.2 (-NCH 2 CH 2 COOMe), 32.5 (-NCH 2 CH 2 COOMe), 21.5 (-SiCH 2 CH 2 CH 2 N-), 20.1 - 17.7 (Si (CH 2 ) 3 Si-), 12.8 (- SiCH 2 CH 2 CH 2 N-), -3.3 (-SiMe 2 ) -5.0 (-SiMe).
  • NMR- 29 Si ⁇ 1 H ⁇ (CDCI 3 ): ⁇ (G 0 -If not observed), 0.78 (G Si), 1.88 (G 2 -Si).
  • the second generation dendrimer is prepared by following a procedure similar to that described for compound 10. Starting from a solution of the second generation dendrimer 7 (1.05 g, 0.35 mmol) in ethanol, an excess of one
  • the first generation dendrimer is prepared starting from a MeOH solution of dendrimer 10 (1.36 g, 1.01 mmol), and an excess of 37% HCI (2.36 mmol). The reaction mixture is maintained at room temperature and with constant stirring.
  • the second generation dendrimer is prepared following a procedure similar to that described for compound 14, starting from a solution of the second generation dendrimer 11 (1.0 g, 0.33 mmol) in MeOH and an excess of 37% HCI (2.65 mmol ). In this way, compound 15 is obtained as a white water-soluble solid (0.98 g, 96%).
  • the third generation dendrimer is prepared following a procedure similar to that described for dendrimers of 1 to 2 to generation 14 and 15, starting from a solution of dendrimer 12 (1.0, 0.17 mmol) in MeOH, to which a
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) Sephadex with water as eluent. In this way compound 22 is isolated as a white solid (0.04 g, 80%), soluble in water.
  • the second generation dendrimer is prepared in a manner similar to that described for compound 22, starting from a water solution of dendrimer 19 (0.07 g, 0.02 mmol) and an excess of a 1M solution in HCI diethyl ether (0.5 ml). , 0.3 mmol). In this way, compound 23 is obtained as a white solid (0.04 g, 60%), soluble in water.
  • the third generation dendrimer is prepared in a manner similar to that described for compounds 22 and 23, starting from a water solution of dendrimer 20 (0.06 g, 0.008 mmol) and an excess of a 1M solution in diethyl ether of HCI ( 0.5 mi, 0.3
  • the second generation dendrimer 27 is prepared following a synthesis procedure similar to 26. In this way, 0.38 g of the G 2 - [Si-H] 8 dendrimer is dissolved in hexane (10 mL) in a glass vial and add 0.28 mL of 4-bromobutene (2.7 mmol). Then 2 drops of the Karstedt catalyst are added and stirred vigorously for 16 hours at 60 ° C. After the reaction time has elapsed, the mixture is concentrated to dryness and redissolved in dichloromethane. It is then filtered by
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) activated carbon and celite and taken to dryness to give compound 27 as a yellowish oil (0.61 g, 83%).
  • the third generation dendrimer 28 is prepared following a synthesis procedure similar to 26. 0.81 g of the G3- [Si-H] and 6 (0.31 mmol) dendrimer are dissolved in hexane (20 mL) in a glass vial and add 0.51 mL of 4-bromobutene (5.04 mmol). Then, 2 drops of the Karstedt catalyst are added and stirred vigorously for 16 hours at 60 ° C. After the reaction time has elapsed, the mixture is concentrated to dryness and redissolved in dichloromethane. It is then filtered by active carbon and celite and taken to dryness to give compound 28 as a yellowish oil (0.1 .27 g, 86%).
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) 1 H-NMR (CDCI 3 ): ⁇ 3.24 (8H, t, CH 2 N 3 ), 1.60 (8H, m, SiCH 2 CH 2 CH 2 CH 2 N 3 ), 1.35 (16H, m, S ⁇ CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 N 3 and SiCH 2 CH 2 CH 2 S ⁇ ), 0.52 (24H, m, CH 2 linked to Si), -0.06 (24H, s, Si (CH 3 ) 2 ).
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) (S ⁇ CH 2 ) 15.0 (SiCH 2 ), -3.3 (Si (CH 3 ) 2 ), -4.9 (SiCH 3 ).
  • ELEMENTAL ANALYSIS Ci 92 H428N48S ⁇ 29 Cale. %: C, 54.59; H, 10.21; N, 15.92; Exp.%: C, 56.08; H, 9.58; N, 11.08.
  • NMR-H (CDCI 3 ): ⁇ 7.41 (4H, s, NCHCN), 4.30 (8H, t, CH 2 CH 2 N), 3.97 (8H, sa, NH 2 ), 1.88 ((8H, m, CH 2 CH 2 N), 1.27 (16H, m, S ⁇ CH 2 CH 2 ), 0.54 (24H, m, SiCH 2 ), 0.08 (24H, s, SiCH 3 ).
  • the first generation dendrimer 38 is obtained as a yellow oil (0.43 g, 68%).
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) (8H, m, Cry 2 CH 2 N), 1.27 (16H, m, SiCH 2 CH 2 ), 0.52 (24H, m, SiCH 2 ), -0.08 (24H, s, SiCH 3 ).
  • NMR- 13 C ⁇ 1 H ⁇ (CDCI 3 ): ⁇ 143.1 (NCCCH 2 ), 123.0 (NCCCH 2 ), 52.7 (d, OCH 3 ), 51.2 (t, CCH 2 N), 50.0, 49.0 (dd, NCH 2 P), 34.1 (CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 N), 21.0 (CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 N), 20.1 (CH 2 CH 2 CH 2 Si), 18.5 (SiCH 2 ), 17.5 (SiCH 2 ), 14.9 (S ⁇ CH 2 ), -3.4 (SiCH 3 ).
  • EXAMPLE 2 Obtaining the dendrimers of the invention grown from a polyphenolic core.
  • the functionalization of the anterior dendritic wedges with Si-H terminal bonds is carried out through a two-step reaction that involves first, the hydrosilylation of chlorodimethyl silane, SiMe 2 CIH, on dendrons terminated in allyl groups and then the transformation of the resulting Si-CI bonds to terminal Si-H bonds with lithium aluminum tetrahydride, LiAIH 4 , as described in scheme 13. Operating in this way, from the first generation dendron BrGiA 2 (66 ), we would obtain the dendritic wedge BrGiH 2 (71).
  • a third type of dendritic wedges that are collected in this invention are those that present at their focal point a functional group -CH 2 Br, and its periphery is functionalized with ester groups, which are precursor groups of anionic ligands, such as We have described in the first part of this Report.
  • These dendritic wedges have been prepared up to a third generation following the synthetic route described in scheme 14.
  • the reaction described in this scheme is a hydrosilylation reaction of dendritic wedges of carbosilane nature containing Si-H terminal bonds with a functionalized allylamine with methyl acrylate groups, using the Karstedt catalyst.
  • the allylamine used in this synthesis is what we have described as compound A
  • dendrons or dendritic wedges described in this section, 65-76 have been characterized by elemental analysis of carbon, hydrogen and nitrogen, nuclear magnetic resonance of 1 H, 13 C and 29 Si, and mass spectrometry, which are detailed below. :
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) (CDCI 3 ): ⁇ 5.1 (MeS ⁇ CI 2 ), 20.6 (CH 2 CH 2 Si), 21.1 (CH 2 CH 2 Si), 32.8 (BrCH 2 CH 2 ), 34.9 (BrCH 2 CH 2 ); 29 Si-NMR (CDCI 3 ): ⁇ 32.3 (MeS / CI 2 ).
  • This compound is prepared from BrG ⁇ (4.30 g, 0.016 mol), HSiMeCI 2 (3.41 g, 0.03 mol) and Kardsted catalyst (3% mol) following the procedure described for the synthesis of BrGiCI 2 , obtaining BrG 2 CI 4 as a colorless oil (7.60 g, 94%).
  • the derivative 67 is sensitive to moisture and must be stored under an inert atmosphere.
  • This compound is prepared from BrG 2 CI 4 (6.25 g, 0.013 mol) and BrMg (C 3 H 5 ) (0.055 mol) following the procedure described for the synthesis of BrG 1 A 2 , obtaining BrG 2 A4 as an oil colorless (5.10 g, 78%).
  • This compound is prepared from BrG 2 A4 (2.50 g, 4.86 mmol), HSiMeCI 2 (3.80 g, 0.033 mol) and Kardsted catalyst (3% mol) following the procedure described for the synthesis of BrGiCI 2 , obtaining BrGsCle as a colorless oil (4.45 g, 94%).
  • the derivative 69 is sensitive to moisture and must be stored under an inert atmosphere.
  • This compound is prepared from BrG 3 CI 8 (3.30 g, 3.39 mmol) and BrMg (C 3 H 5 ) (0.031 mol) following the procedure described for the synthesis of BrGiA 2 , obtaining BrGsA 8 as a colorless oil (2.62 g, 76%).
  • This compound is prepared from BrG 2 (SiCI) 4 (3.15 g, 3.53 mmol) and LiAIH 4 (10.60 mmol) following the procedure described for the synthesis of BrGiH 2 , obtaining BrG 2 H 4 , 72, as a colorless oil (1.76 g, 66%).
  • This compound is prepared from BrG3 (SiCI) s (2.00 g, 1.13 mmol) and LiAIH 4 (6.75 mmol) following the procedure described for the synthesis of BrGiH 2 , obtaining
  • This compound is prepared from BrG 2 H 4 (0.30 g, 0.40 mmol) and C3H 5 N (C 2 H 4 C0 2 Me) 2 (0.40 g, 1.75 mmol), following the procedure described for BrG-i (C0 2 Me) 4 , obtaining BrG 2 (C0 2 Me) and as a colorless oil (0.53 g, 80%) after performing a gel permeation chromatography in toluene.
  • Gn Indicates the generation of the dendrimer obtained by coupling dendritic wedges on polyphenolic nuclei.
  • Ox indicates that the dendritic wedges have been coupled to the dendrimer core through an oxygen atom of the phenolic groups initially present in said core.
  • the number x indicates the number of phenolic groups present in the initial polyphenolic derivative.
  • 02 indicates coupling to a hydroquinone core that has two phenol groups
  • 03 indicates coupling to a 1,3,5-trihydroxybenzene core, which has three phenol groups.
  • F represents one or several letters indicating the nature of the functional groups present on the surface of the dendrimer, thus A represents an allyl group, Cl, terminal groups with Si-CI bonds, H terminal groups with Si-H bonds, N groups amino terminals, etc.
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) (2) leads to the formation of the dendrimer Gi03A 6 (13) containing 6 allyl groups on the surface. If the second generation dendritic wedge BrG2A 4 (4) is used in the coupling reaction, the second generation dendrimer G203A 2 (14) is obtained and if what is used is the third generation wedge BrG 3 A 8 (6) , you get the
  • these compounds can be prepared by hydrosilylation on dendrimers with terminal Si-H groups (80-82) with allylamine A, described above (method B) or, by Michael type addition of methyl acrylate on dendrimers functionalized with groups - NH 2 terminals (86-88) (method C).
  • Scheme 19 collects the synthesis of these dendrimers with terminal ester groups prepared by methods B and C.
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) The 77-85 dendrimers have been characterized by elemental analysis of carbon, hydrogen and nitrogen, 1 H, 13 C and 29 Si nuclear magnetic resonance, and mass spectrometry, which are detailed below:
  • This compound can be prepared in a two-stage process from G1 O3A 6 , 77.
  • the first stage consists of the hydrosilylation of 77 (1.01 g, 1.51 mmol) with HSiMe 2 CI (1.46 g, 0.015 mol) and catalyst of Kardsted (3% mol), obtaining the dendrimer with terminal Si-CI links GiO3 (SiCI) 6 as a pale yellow oil (1.77 g, 95%).
  • G1 O3 (SiCI) 6 is sensitive to moisture and should be stored under an inert atmosphere.
  • This compound can be prepared in a two-stage process from G2O3A 12 , 78.
  • the first stage consists of the hydrosilylation of 78 (2.00 g, 1.40 mmol) with HSiMe 2 CI (2.71 g, 0.029 mol) and Kardsted catalyst (3% mol), obtaining the dendrimer with terminal Si-CI bonds G 2 03 (SiCI) and 2 as a pale yellow oil (3.41 g, 95%).
  • G 2 O3 (SiCI) 12 is sensitive to moisture and should be stored under an inert atmosphere.
  • This compound can be prepared in a two-stage process from G 3 O3A 2 4, 82.
  • the first stage consists of the hydrosilylation of 79 (2.50 g, 0.85 mmol) with HSiMe 2 CI (3.28 g, 0.034 mol) and Kardsted catalyst (3% mol), obtaining the dendrimer with terminal Si-CI bonds G 3 O3 (SiCI) 24 as a pale yellow oil (4.21 g, 95%).
  • G 3 O3 (SiCf) 24 is sensitive to moisture and should be stored under an inert atmosphere.
  • Dendrimers with terminal ester groups prepared by methods A, B and C described above can be transformed into anionic dendrimers with terminal carboxylate groups 89-91 by treatment with NaOH in a mixture of MeOH and water (Scheme 20).
  • the first generation dendrimer Gi03 (COONa) i2 (89) having 12 terminal anionic groups, the dendrimer G 2 03 (COONa) 24 (90) with 24 anionic groups and the dendrimer G 3 03 (COONa) are obtained ) 4 8 (91) presenting 48 terminal carboxylate groups.
  • Scheme 9 describes the synthesis of the first generation dendrimer.
  • anionic dendrimers with terminal sulfonate groups is mainly carried out using as starting products dendrimers containing -Nhfe groups on their surface, 86-88, described in the previous section and from them carrying out a Michael type addition of sodium vinyl sulphonate to give rise to the synthesis of anionic dendrimers with peripheral sulfonate groups.
  • Obtaining anionic dendrimers with terminal phosphonate groups is also carried out using dendrimers containing -NH 2 groups on their surface, 86-88, and from them a two-step reaction is carried out, first with THF formaldehyde for 1 hour at room temperature and then "in situ" dimethyl phosphite is added and the mixture is heated at 40 ° C for 3 hours, giving rise to dendrimers with terminal groups having units -PO (OMe) 2. Finally, the reaction of the above dendrimers with NaOH transforms the peripheral groups -PO (OMe) 2 into anionic groups -PO (ONa) 2 .
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) G, 0 3 (NH 2 ) and G, 0 3 (P (0) (OMe) (ONa)) 12
  • the dendrimers described, 86-97 have been characterized by elemental analysis of carbon, hydrogen and nitrogen, 1 H, 13 C, 29 Si and 31 P nuclear magnetic resonance, and mass spectrometry, as detailed below:
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) S ⁇ nntteessiiss ddee GG ?? QQ33 ((NNHH ?? )) 11 ?? ((8877)) ..
  • the third generation dendrimer with 24 groups -NH 2 terminals, 88 is prepared by a procedure similar to that described for compound 86, starting with G 3 O 3 H 2 4 (1.00 g, 0.23 mmol), C 3 H 5 NH 2 ( 0.62 g, 0.011 mol) and Kardsted catalyst (3% mol). In this way, G 3 03 (NH 2 ) 2 4 is obtained as a yellowish oil (0.48 g, 36%).
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) it obtains G 1 03 (C0 2 Me) and 2 as a yellowish oil after washing with hexane (2 x 10 ml_) (0.42 g, 89%).
  • the synthesis of compound 84 can be carried out by procedures similar to those described for derivative 83. For example, from G 2 O 3 H 12 (0.35 g, 0.16 mmol) and C 3 H 5 N (C 2 H 4 CO2 Me) 2 (0.46 g, 2.00 mmol), following the procedure described for the synthesis of BrGi (CO 2 Me) 4 , G 2 O3 (CO 2 Me) 2 4 is obtained as a yellowish oil (0.70 g, 88%).
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) C3H 5 N (C 2 H 4 C0 2 Me) 2 (0.41 g, 1.80 mmol), following the procedure described for the synthesis of BrGi (CO 2 Me) 4 , G 3 03 (C0 2 Me) 4 8 is obtained as a yellowish oil (0.63 g, 88%).
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) (CH 2 ), 32.9 (OCH 2 CH 2 ), 34.3 (NCH 2 ), 49.6 (CH 2 CO), 57.2 (NCH 2 ), 67.2 (OCH 2 ), 93.8 (C 6 H 3 (CH), 168.4 ( iC 6 H 3 ), 181.2 (CO); 29 Si-NMR (D 2 0): ⁇ 1.7 (MeS / and Me 2 S /).
  • EXAMPLE 3 BIOLOGICAL ACTIVITY OF THE DENDRIMEROS OF THE INVENTION Below is an evaluation of the cytotoxicity, mitogenicity and microbicidal / microstatic effect of the new anionic dendrimers synthesized according to the present invention in different cell lines (vaginal and lymphoid), in different populations physiological (peripheral blood mononuclear cells, red blood cells, macrophages and dendritic cells) and in bacterial cultures.
  • HEC-1A Human Endometrial Carcinoma cells
  • human endometrial cell line derived from a human adenocarcinoma of the endometrium. They were obtained from the American Type Culture Collection (ATCC).
  • the HEC-1A were grown in complete medium [RPMI 1640 (Gibco) supplemented with 10% Fetal Calf Serum (SFT), 2mM L-glutamine and antibiotics (1% chloxacycline, 1% ampicillin and 0.32% gentamicin)] in plates 24 or 96 wells or 12-well transweil plates with permeable polycarbonate support of 0.4 pore pore (Costar, Cambridge, MA), under culture conditions (37 ° C in an atmosphere of 5% C0 2 and 95% humidity relative).
  • CMSP Peripheral Blood Mononuclear Cells
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) MT-2: T-cell leukemia cell line with integrated HTLV-1 DNA. They were obtained from the American Type Culture Collection (ATCC). They were grown in complete medium in different plate formats (6, 24 or 96 wells) and under culture conditions.
  • ATCC American Type Culture Collection
  • Dendritic Cells A separation of CMSP by density gradient was performed as described above. Monocytes were obtained by immunomagnetic separation with anti-human CD14 monoclonal antibodies (MicroBeads) by column separation (MACS®, Miltenyi Biotec, Germany). The purified monocytes were resuspended in complete medium on a 6-well flat bottom plate at a concentration of 2 * 10 6 cells / well in a final volume of
  • Macrophages A separation of CMSP was performed by density gradient and an immunomagnetic separation with anti-human CD14 monoclonal antibodies (MicroBeads) as described above.
  • the purified monocytes were resuspended in RPMI 1640 medium (Gibco) supplemented with 10% human AB serum, 2mM L-glutamine and antibiotics (1% chloxacycline, 1% ampicillin and 0.32% gentamicin) in a 6-well flat bottom plate concentration of 2 * 10 6 cells / well in a final volume of 3 mL. They were grown with 50 ng / ml rh M-CSF and fresh medium was added with 50 ng / ml rh M-CSF at 3 days. At 7 days, macrophage markers were analyzed by a 4-color Beckman-Coulter® cytometer and the Beckman-Coulter® EPICs® software was used.
  • Jurkat clone E6 T cell line (ATCC; T lymphocyte cell line) was routinely grown in RPMI 1640 (Biochrom KG Seromed, Berlin, Germany) supplemented with 5% heat-inactivated fetal calf serum (FCS), 1% penicillin / streptomycin, and 2mM L-glutamine (ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA-USA) at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO2.
  • FCS heat-inactivated fetal calf serum
  • penicillin / streptomycin 1% penicillin / streptomycin
  • 2mM L-glutamine ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA-USA
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) The synthesis of carbosilane dendrimers with sulphonate (G1SF8, G2SF16 and G3SF32) and carboxylate (G1C008, G2C0016, G3C0032) terminations was as described in the previous section (see pages 15 to 19). In addition to the G2CKCO016 and G2CKP32 dendrimers (see pages 21 to 23).
  • the G2CKCOO16 and G2CKP32 dendrimers correspond to the compounds c / -G1- [Si (CH 2 ) 4 (N3C2H) CH2N (CH 2 CH 2 COONa) 2] 8 (43) and c / -G1-
  • G103SF12, G2O3SF24 and G203SF48 carbosilane dendrimers with sulphonate terminations
  • G103SF12, G2O3SF24 and G203SF48 dendrimers correspond to GiO3 (S0 3 Na) 12 (92), G 2 03 (S0 3 Na) 2 4 (93) and G 3 03 (S0 3 Na) 4 8 (94) that have 12 , 24 and 48 terminal sulfonate groups.
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) A solution with 0.8% trypan blue (Sigma®) was prepared. The cells treated with the dendimer were centrifuged and the supernatant was decanted; After resuspending the cell pellet, it was treated with the trypan blue solution for 30 seconds, then centrifuging-washing with PBS twice. The cells were observed under optical microscopy and the positive ones were counted for the presence of trypan blue (blue, dead cells) in relation to the percentage of negative cells (living cells). For this, a broad field was selected with at least 100 cells at a time.
  • Opti-MEM® 20 ⁇ of previously filtered MTT was added to achieve sterility (Tiazolyl Blue, Sigma®) in PBS at a concentration of 5 mg / mL (final well concentration of 0.5 mg MTT / mL). After 4 hours of incubation under culture conditions, the plate was centrifuged at 2000 rpm. 10 minutes and after removal of the supernatant with the excess MTT that did not react. Formazan crystals were observed under the phase contrast microscope and subsequently dissolved with 200 ⁇ of DMSO. The plate was stirred at 700 rpm. in an Eppendorf ® stirrer to ensure the correct dissolution of said crystals.
  • Formazan concentration was determined by spectrophotometry using a plate reader at a wavelength of 570 nm with a reference of 690 nm.
  • the spectrophotometer was calibrated to 0 using Opti-MEM® without cells.
  • the relative cell viability (%) with respect to the control (untreated cells) was calculated based on the formula: [A] test / [A] control x 100.
  • Each dendrimer concentration was tested in triplicate, following the guidelines of the ATCC.
  • the red blood cells were obtained after being separated from the CMSP by the same Ficoll gradient detailed above. They were properly diluted in PBS until they can be visualized individually. They were then resuspended in 500 pL of PBS and grown in a 24-well plate (300,000 / well). As a positive control, cells treated with 0.2% Triton X-100 were used. Negative control: cells treated only with PBS. The red blood cells were incubated with different concentrations of dendrimer. Hemagglutination presence, cell number and hemoglobin release were evaluated at the time by collecting 100 pL of supernatant and measuring absorbances by spectrophotometry using a plate reader at a wavelength of 550 nm and 690 nm as a reference.
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) it includes a negative proliferation control (untreated cells), wells treated with different concentrations of dendrimer and another positive proliferation control treated with 2 pg / mL phytohemagglutinin (PHA). After 4 days of incubation under culture conditions, the supernatant was removed and the samples were prepared for the BrdU Cell Proliferation Kit (Bromodeoxyuridine Cell Proliferation Assay, Chemicon International). The protocol indicated by the kit was performed and the incorporation of BrdU into newly synthesized DNA was obtained. The greater the incorporation of BrdU, the greater the cell proliferation.
  • BrdU Cell Proliferation Kit Bromodeoxyuridine Cell Proliferation Assay, Chemicon International
  • the viral isolate X4 HIV-1 NL-3 is an established laboratory viral strain and MT-2 cells were used for virus expansion. 2x10 6 MT-2 was washed twice with complete medium and transferred to a 15 mL conical tube at a concentration of 2x10 6 cells / mL in complete medium. Subsequently, HIV-1NL4-3 was added at a concentration of 1 particle per cell or what is the same, 1 MOI (Multiplicity Of Infection). The MT-2 were cultured with the virus for 2 hours under culture conditions, shaking the culture every 15-30 minutes. Finally, cultures (virus-cells) were washed twice to remove the virus not integrated into the cell genome. The cells were transferred to a well of p6 in a volume of 3-4 mL.
  • the viral isolate R5 HIV-l ea-L is an established laboratory strain and the virus expansion process was performed similarly to HIV-1 N L4-3, but stimulated CMSP was used in this case as indicated below. in section 3. 8. 5. The supernatant was aliquoted and stored in a liquid nitrogen tank, for later titration.
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) The viral HIV-1 NL4 isolated - 3 and HIV-2 C BL2 3 was titrated in MT-2 cell line. 2x10 4 MT-2 cells were cultured with complete medium in 96-well plates and 40 were requested for viral preparation at different concentrations, for which the corresponding dilutions were made. The dilutions were placed in octuplicate and kept under culture conditions for one week. After this time, the titration was read by visualization of the cytopathic effect. The title was calculated applying the Spearman-Karber formula. It was also titrated by quantification of p24 protein by an enzymatic immunoassay (ELISA p24.
  • ELISA p24 enzymatic immunoassay
  • HIV-1 BA -L viral isolated isolate it was titrated by quantification of p24 protein by ELISA. To ensure virus purity, thawed aliquots were filtered through 0.22 pm filters before quantification.
  • CMSPs were stimulated for 48 hours with 2 pg / mL of PHA and 50 Ul of IL-2, to cause polyclonal activation; at 48 hours the cells are washed with PBS.
  • the desired cell concentration was incubated with the desired number of HIV particles in complete medium for 2 hours under culture conditions. After this time the cells of the culture were collected and washed three times with PBS to eliminate the virus not integrated in the cell genome, after which they were deposited in 24-well or 96-well plate (depending on the assay) in complete medium with 50 IU / mL of IL-2.
  • MT-2, HEC-1A, CDi, CDm and macrophages were collected on the day of the experiment and washed twice with PBS before being infected with HIV for 2 or 3 hours, depending on the experiment.
  • HEC-1A confluents in 24-well plates were used. 3 * 10 5 cells were cultured in 500 pL of complete medium per well and cultured for 3 days. In the adhesion tests, the cells were pre-treated with the dendrimers 2h, 1h and 30 minutes before infection with HIV-1N -3- Once the estimated time had elapsed, they proceeded to become infected with HIV-1NL. 4- 3 each well for 3 hours. After this time, the monolayer was washed 3 times with PBS and left under culture conditions. At 24h and 72h, supernatant was collected to quantify p24 antigen by ELISA. For the internalization test, the procedure
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) Initial was as indicated above. After 3 hours of infection, the monolayer was washed 3 times with PBS and cell lysis was carried out by the addition of Triton x-100 . 0.2% for 45 minutes at 37 ° C. The supernatant was collected to quantify p24 antigen by ELISA.
  • a flat-bottom 96-well plate with Poly-L-Lysine (PLL, Sigma®) covering the bottom of the well was used for this experiment.
  • 50 uL of PLL was incubated at 37 ° C for one hour.
  • 4 ng of HIV was incubated overnight at 4 ° C, to ensure that the viral particles adhered to the bottom of the well.
  • Each well was washed 3 times with PBS to remove HIV not adhered to the plaque and each well was treated with different dendrimer concentrations for one hour. After this time, it was washed 3 times with PBS and previously stimulated CMSP was added.
  • the supernatant of this culture was collected at 4 days and p24 antigen was quantified by ELISA to assess the amount of HIV produced by the CMSP in the different treatments. It was used as a positive lysis control of 1% Triton x-100 viral particles.
  • the HEC-1A were grown in complete medium on a permeable polycarbonate support of 0.4 ⁇ pore (Costar, Cambridge, MA). 2 * 10 5 cells per well were cultured and cultured for 7 days, with medium changes every 2-3 days. The dendrimer was added one hour before infection. After adding the viral particles to the apical zone of the monolayer (100ng), the supernatant was collected from the chamber of the basolateral area at 24/48 hours. The viral concentration was quantified by ELISA.
  • Stimulated CMSP dispensed in 2 * 10 5 cells in 200 pL of complete medium were used in wells of round bottom p96 plate.
  • the dendrimer was treated 1 hour before infection at 50 ng of HIV-1NL4-3 and infected for 3 hours under culture conditions. After this time, it was washed twice with PBS and incubated under culture conditions. Viral concentration at 3 days was quantified by p24 ELISA.
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) Once the cells were differentiated, they were washed with PBS twice and 2 * 10 5 CDi, 2 * 10 5 CDm and 10 5 macrophages were dispensed in 200 ⁇ _ of complete medium in wells of bottom p96. The dendrimer was added one hour before infection. After adding the viral particles (50 ng), it was incubated under culture conditions and at 3 hours, the supernatant was removed and washed 4 times with PBS. Supernatant was collected at 4 days. The viral concentration was quantified by ELISA.
  • Strain FDA209 (ATCC 6538) was used to study the ability of dendrimers as bactericides. Bacteria were grown on Mueller Hinton agar plates (Sigma TM) overnight at 37 ° C before each experiment.
  • the clinical isolate SC5314 (ATCC MYA-2876) was used to study the ability of dendrimers as fungicides. Yeasts were grown on YED agar plates (1% D-glucose, 1% Difco yeast extract (BD Diagnostic Systems, USA) and 2% agar) overnight at 30 ° C before each experiment.
  • the transfected cells were stimulated for 16 hours with the different stimuli that appear in the graphs (TNF-alpha, anti-TNF-alpha monoclonal antibody and different concentrations (5 and 10 micromolar) of the anionic dendimer debris.
  • the transfected cells were collected by centrifugation and lysed with commercial lysis buffer " Dual-luciferase Assay System Kit “(Promega), according to the manufacturer's recommendations.
  • the amount of protein in 5 microliters of cell lysate was measured by the BSA-BCA method (Pierce, Rockford, USA). Once quantified, they were normalized Protein values of all samples at 20 micrograms to measure luciferase activity for 10 seconds on a 1450 Microbeta Luminisc luminometer ence Counter (Walax, Trilux). The values of
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) Firefly luciferase activity is expressed as induction relative to control cells.
  • TNF-alpha proinflammatory cytokine
  • Jurkat clone E6 cells transfected with pTNF-alpha were treated with an anti-TNF monoclonal antibody as a positive control of TNF transcriptional activity inhibition.
  • the sulfonate dendrimer was able to decrease the promoter activity of the plasmid pTNF-luc at doses of 5 and 10 micromolar (to a measure two and three times lower with respect to the control of unstimulated cells in a series of three experiments independent).
  • the anionic dendrimer decreases the transcriptional activity of TNF-alpha.
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) The cells showed blue staining superior to the control from 20 ⁇ dendrimer, so it was decided to focus the feasibility studies on a given concentration, 10 ⁇ .
  • lactate dehydrogenase release tests were performed on the supernatant. These studies were complemented with mitochondrial cell activity assays, where the reduction of tetrazolium salts to formazan crystals is an indirect reflection of the correct metabolism of the cells. See FIG.
  • the dendrimers that were to be exposed on the epithelial cell monolayer had been shown not to be toxic or mitogenic at the concentration of 10 ⁇ .
  • the dendrimer molecule would thus act as a physical barrier in the prevention of HIV infection of the endometrial cells and their passage into the internal cavity of the uterus.
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) evaluate whether the treatment times prior to infection (pretreatment) are limiting when it comes to checking efficacy.
  • the graph below shows how the pre-treatment of HEC-1A at different times does not significantly modify the efficacy of 60% inhibition of HIV-1 NL4.3 adhesion.
  • This data could be verified by collecting the culture supernatants at two different times after infection, the pretreatment is for 30 min, 1 hour and 2 hours, then infected with HIV and the culture is maintained 24 hours (FIG. 5A). The supernatant is collected and the Agp24 is measured and infected it is maintained 72 hours (FIG. 5B) the supernatant is collected and the Agp24 is quantified.
  • Suramin was selected as a positive control of adhesion inhibition since its electrostatic binding to the gp120 of the HIV V3 region has been demonstrated, which prevents its infection machinery from functioning properly.
  • p24 represents the p24 antigen (virus genetic material) that is detected in the cell culture supernatant by an ELISA kit (INNOTEST TM HIV antigen mAB -Innogenetics®). See FIG. 5.
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) dendrimer with the normal functioning of HIV to infect CMSP. See FIG. 7.
  • transwell devices were used to recreate the phenomenon of transcytosis (transport of macromolecules from one extracellular space to another through the cytoplasm of a cell through an endocytic vesicle) due to the possibility of forming a perfect monolayer of adherent cells inside and collecting information from the supernatants of the apical and basolateral face of The monolayer.
  • the following graph shows the effect of the dendrimer on the passage of viral particles through the monolayer.
  • the second generation of sulphonates was evaluated for their possible prophylactic and therapeutic effect in CMSP showing 80% inhibition in pretreatment trials of cells with dendrimer and 60% in post-treatment trials, confirming both applications of this dendrimer in a more physiological system such as a primary lymphoid line.
  • T-20 (Fuzeon) and AZT were used as controls for inhibition of viral fusion and reverse retrotranscriptase. See FIG. 9.
  • G2SF16 showed 80% inhibition in pretreatment trials of cells with the dendrimer before HIV-1 NL4.3 infection and 60% in post-treatment trials, confirming The two applications of this dendrimer in a more physiological system such as a primary lymphoid line. In this way, the prevention of HIV infection is enhanced, as well as the inhibition of viral replication in cells already infected with HIV.
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) The ability to release viral particles by dendritic and macrophage cells was evaluated. Controls such as dextran, suramin and mannan were tested on dendritic. NL4.3 and Bal were used for a virus internalization assay in the presence of inhibitory nanoparticles. A clear decrease in p24 antigen was observed in the macrophage supernatant in the presence of G2SF16. In immature dendritic, the decrease in p24 antigen was significant for suramin, mannan and G2SF16. See FIG. 10, where, as previously reported, the ability to release viral particles by the cells was evaluated and infected at 50ng to ensure good quantification.
  • Controls such as dextran, suramin and mannan were tested on dendritic. NL4.3 (black columns) and Bal (white columns) were used for a virus internalization test in the presence of inhibitory nanoparticles. A clear decrease in p24 antigen was observed in the macrophage supernatant in the presence of G2SF16. In immature dendritic, the decrease in p24 antigen was significant for suramin, mannan and G2SF16.
  • the new click dendrimers with carboxylate and phosphonate terminations were also evaluated to obtain the biocomatibility ranges in the cell population most exposed to its action, endometrial epithelial cells.
  • the good cell viability can be seen up to 10 ⁇ , while in the
  • FIG. 13B the inhibition of entry into the same cell line can be seen by pretreating these with dendrimer one hour before infection with HIVNI_ 4 - 3 - This inhibition is dependent on dendrimer concentration and is obtained up to 50% in the case of 10 ⁇ concentration.
  • the dendrimers previously described in the present invention have been shown to be able to inhibit infection caused by different viruses, interfering with both the entry of the virus into the cells and subsequent viral replication steps. This is the case, for example, of Herpes Simplex, whose infection is inhibited in vitro by the effect of modified polylysine dendrimers. It has also been possible to inhibit HIV replication, both at the level of cell entry and in subsequent steps, in this case through the use of covalently modified PAMAM dendrimers, which proved to be able to interfere with the retrotranscriptase and virus integrase.
  • vaginal gels have been developed for the prevention of sexually transmitted diseases with dendrimer-based formulations, such as VivaGel TM (Starpharma), whose active ingredient is a functionalized polylysine dendrimer with naphthalenedisulfonate residues that appears to be effective in the prevention of HIV infection thanks to its ability to bind to the gp120 glycoprotein of the virus surface.
  • dendrimer-based formulations such as VivaGel TM (Starpharma)
  • active ingredient is a functionalized polylysine dendrimer with naphthalenedisulfonate residues that appears to be effective in the prevention of HIV infection thanks to its ability to bind to the gp120 glycoprotein of the virus surface.
  • dendrimers have been used as antibacterials or to deconstruct the cell membranes of some fungi.
  • the dendrimers of the present invention functionalized with residues containing carboxylate and sulfonate anionic groups, represent an option to be used as microstatics.
  • the dendrimers of the present invention involve interesting alternatives for these areas of biomedicine and the chemical nature of dendrimers, the studies concerning their biocompatibility (performed on cell lines, on peripheral blood mononuclear cells (CMSP) and on red blood cells are described here. ), antigenicity studies, studies of impaired adherence and internalization of HIV particles to the cell surface and studies of inhibition of transcytosis through monolayers of vaginal epithelium. In addition to this prophylactic application, its therapeutic effect is also evaluated, since in infected patients the dendrimer could prevent the progression of infection to healthy cells.
  • CMSP peripheral blood mononuclear cells
  • lactate dehydrogenase release tests were performed on the supernatant. It was obtained that at values below 10 ⁇ , the dendrimers were not toxic either in a lymphoid cell line (FIG. 17) or in CMSP (FIG. 18).
  • the dendrimer that was to be exposed on the epithelial cell monolayer had proved to be nontogenic nj mitogenic at the concentration of 10 ⁇ .
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) the process of adhesion of the latter to the surface of the cell membrane.
  • the dendrimer molecule would thus act as a physical barrier in the prevention of HIV infection of the endometrial cells and their passage into the internal cavity of the uterus.
  • transwell devices were used to recreate the phenomenon of transcytosis (transport of macromolecules from one extracellular space to another through the cytoplasm of a cell through an endocytic vesicle) due to the possibility of forming a perfect monolayer of adherent cells inside and collecting information from the supernatants of the apical and basolateral face of The monolayer
  • the effect of the dendrimer on the passage of viral particles through the monolayer is shown. This effect is reduced by 40%, while our positive control lacks the inhibitory effect. Therefore, the internal structure of the dendrimer is involved in the antiviral capacity of the molecule.
  • the second generation of sulphonates was evaluated for their possible prophylactic and therapeutic effect on PBMCs, showing 60% inhibition in pretreatment tests of cells with the dendrimer, confirming the application of this dendrimer in a more physiological system as is a primary lymphoid line, FIG. 21. Its action is currently being evaluated in dendritic cells and macrophages. Because these cell lines become less noticeably infected than in the

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Low-Molecular Organic Synthesis Reactions Using Catalysts (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
  • Silicon Polymers (AREA)

Abstract

Macromoléculas altamente ramificadas sintetizadas a partir de un núcleo polifuncional, preferiblemente silicio o polifenólico, de estructura carbosilano y funcionalizados en su periferia con grupos, prefereiblemente aniónicos que dan a la macromolécula una carga neta negativa. Además, la invención se refiere a su procedimiento de obtención y sus usos como agentes antivirales, antibacterianos y antifúngicos.

Description

DENDRI EROS CARBOSILANOS Y SU USO COMO ANTIVIRALES
La presente invención se refiere a macromoléculas altamente ramificadas sintetizadas a partir de un núcleo polifuncional, denominadas dendrímeros, de estructura carbosilano y funcionalizados en su periferia con grupos aniónicos que dan a la macromolécula una carga neta negativa. Además la invención se refiere a su procedimiento de obtención y sus usos en biomedicina.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
Existen varios tipos de dendrímeros o polímeros dendronizados con carga neta negativa en la superficie, ya que muchos tipos de virus, como por ejemplo el VIH o VHS, se unen a compuestos polianiónicos. Así, polisacáridos sulfatados son inhibidores efectivos típicos de la inhibición viral. Dentro de este tipo de dendrímeros polianiónicos, se han descrito por ejemplo dendrímeros polilisina con grupos terminales carboxilato y sulfonato que son capaces de bloquear de forma efectiva la infección por VHS (cfr. Gong, Y. et al. Antiviral Res, 2002, 55(2), 319-329). Los mismos autores realizaron estudios en ratones en los que mostraron que estos dendrímeros protegían a los animales frente a la infección vaginal y que los derivados sulfonato eran capaces de interferir en las etapas finales de replicación del virus en las células infectadas.
Dendrímeros similares con un esqueleto polilisina y grupos terminales carboxilato o sulfonato, también han mostrado ser eficaces en la inhibición del VIH en modelos celulares in vitro (cfr. McCarthy, TD et al. Mol Pharm. 2005 Jul-Aug;2(4):312-8) y los dendrímeros polianiónicos inhiben la entrada del virus en la célula, e inhiben la actividad de dos enzimas virales, la transcriptasa reversa y la integrasa, lo que indica que estos derivados polianiónicos pueden actuar en diferentes ciclos replicativos del VIH dependiendo de cómo se integren y se sitúan en la célula. Otros estudios más recientes, muestran que dendrímeros con grupos sulfonato protegen a macacos hembra frente a la infección vaginal del virus de la inmunodeficiencia en simios (VIS). En este apartado, hay que destacar el dendrimero cargado negativamente, formulado como un gel y denominado SPL7013. Este dendrimero ha sido desarrollado por una compañía farmacéutica australiana y los estudios realizados in vitro e in vivo han mostrado que es el mejor candidato para acceder al mercado, convirtiéndose en el primer dendrimero comercial con una aplicación biomédica definida. El SPL7013 es un dendrimero basado en lisina con grupos ácido naftaleno disulfónico en su superficie y es el principio activo de un gel microbicida vaginal denominado VivaGel®. Es un
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) potente inhibidor in vitro frente a numerosas cepas del VIH-1. Se está utilizando en la prevención de la transmisión vaginal del VIH y del herpes genital. Así, un estudio desarrollado por Dezutti y colaboradores ha mostrado que una formulación de este dendrímero (5%) tiene una toxicidad muy baja en células epiteliales y es efectivo en la prevención de la infección por el VIH-1 en células mononucleares de sangre periférica (CMSP), macrófagos y en la transferencia del VIH-1 desde las células epiteliales a las CMSP. Estudios posteriores han mostrado que la aplicación diaria del gel SPL7013 en proporciones de 1-3% eran bien toleradas. Además se obtuvieron resultados similares en la prevención de la infección por el VIH-1 en la aplicación rectal del gel. También se han realizado estudios aplicando a nivel vaginal el gel SPL7013 en macacos y han mostrado que no produce ningún signo de irritación de la mucosa vaginal y que es capaz de proteger de la infección por el VIS al 100% de los macacos si se aplica en un 5%. También se han preparado otros dendrímeros similares al SPL7013 utilizando esqueletos tipo PAMAM y PPI, que presentaban actividades biológicas similares, pero se han descartado para su utilización comercial debido a las dificultades en el proceso de síntesis.
Otros dendrímeros aniónicos descritos como agentes antivirales son: el BRI2923 que es un dendrímero de tipo poliamidoamina (PAMAM) crecido a partir de un núcleo de amoniaco y funcionalizado en la superficie con 24 grupos acido naftaleno disulfónico. El BRI6195, que también es un dendrímero tipo PAMAM, crecido en este caso a partir de un núcleo de etilendiamina y que está funcionalizado con 32 grupos fenildicarboxilato. Estos dendrímeros son capaces de inhibir la replicación de diferentes cepas del VIH en la línea célular MT-4 (cfr. Y. H. Jiang, et al., AIDS Res. Hum. Retriviruses, 2005, 21 , 207).
También se ha publicado la síntesis de dendrímeros basados en un esqueleto conteniendo átomos de fósforo, funcionalizados en su superficie con grupos aniónicos fosfonato (cfr. L. Griffe, et al., Anqew. Chem. Int. Ed., 2007, 46, 2523). Estos dendrímeros muestran una gran actividad en la activación y multiplicación de células natural killers (NK). Estos datos son prometedores ya que abren la puerta a la utilización de inmunoterapias antivirales o anticancerígenas, donde un gran número de células NK podrían ser necesarias.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) La presente invención proporciona macromoléculas altamente ramificadas sintetizadas a partir de un núcleo polifuncional, denominadas dendrímeros, de estructura carbosilano y funcionalizados en su periferia con grupos carboxilicos, fosfónicos o sulfónicos, preferiblemente aniónicos que dotan a la macromolécula de una carga neta negativa. Además, la invención proporciona un procedimiento para su obtención y sus usos en biomedicina.
Un primer aspecto de la presente invención se refiere a un dendrímero carbosilano que comprende: un núcleo polifuncional (Nu) y una capa externa, que consiste, total o parcialmente, en unidades iguales o diferentes del grupo de fórmula (I):
Figure imgf000004_0001
(i)
donde: R es un grupo alquilo (C-1-C4), p es un número entero y varía entre 1 y 3, preferiblemente p es 1 , y X es el siguiente grupo de fórmula (II):
-E-N[(CH2)Z-R ]2 (II)
donde: E es un grupo enlazante situado entre el silicio de la fórmula general (I) y el nitrógeno del grupo amina, z es un número entero y varía entre 1 y 4, R1 se selecciona de un grupo de la lista que comprende -COOR2, -SO3R2 o -P03(R2)2, y R2 es hidrógeno o un grupo alquilo (C C4).
Por "dendrímero carbosilano" se refiere en la presente invención a una macromolécula muy ramificada con forma esférica, donde el núcleo de crecimiento del dendrímero es polifuncional, las unidades, ramas o ramificaciones de crecimiento tienen esqueleto carbosilano y la capa externa, superficie o periferia del dendrímero incorpora grupos funcionales. Esta superficie o periferia sería la correspondiente a las extremidades de las ramificaciones.
Por "núcleo polifuncional" se entiende en la presente invención a un elemento o compuesto polivalente enlazado de la manera covalente con al menos dos ramificaciones, es decir, al menos deberá ser divalente. En una realización preferida el núcleo es tetravalente y más preferiblemente el núcleo es de silicio (es decir, un grupo sililo). En otra realización preferida el núcleo puede ser un polifenol, y se entiende por "polifenol" a una molécula de benceno sustituido por al menos dos grupos hidroxilo en
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) cualquiera de sus posiciones, por ejemplo 1 ,4-dihidroxibenceno, 1 ,2-dihidroxibenceno o 1 ,3-dihidroxibenceno, más preferiblemente es hidroquinona (1 ,4-dihidroxibenceno), pero puede tener tres, cuatro, cinco o seis grupos hidroxilo. Más preferiblemente el polifenol es trisustituido, aún más preferiblemente 1 ,3,5-trihidroxibenceno.
Por "grupo enlazante" se entiende en la presente invención cualquier grupo que une lasramificaciones, que su vez se encuentran unidas al núcleo, con los grupos funcionales de la capa externa del dendrímero. El grupo enlazante E se puede seleccionar preferiblemente entre un alquilo (d-C10) o un grupo -(CH2)X-R3, donde R3 puede ser un grupo triazol o fenoxo y x es un número entero que varia entre 1 y 6.
El término "alquilo" se refiere en la presente invención a cadenas alifáticas, lineales o ramificadas. En el caso de R' y R2, estas cadenas tienen de 1 a 4 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, tert-butilo o sec-butilo, preferiblemente el grupo alquilo es un metilo. En el caso de un grupo enlazante (E), estas cadenas tienen de 1 a 10 átomos de carbono, más preferiblemente el grupo alquilo es una cadena que tiene de 1 a 4 átomos de carbono y más preferiblemente el grupo enlazante (E) es un grupo propilo.
En otra realización preferida el grupo enlazante (E) es el grupo -(CH2)x-R3 y R3 es triazol, es decir, de fórmula:
Figure imgf000005_0001
donde x está descrito anteriormente y más preferiblemente x es 4.
En otra realización preferida el grupo enlazante (E) es el grupo -(CH2)X-R3 y R3 es fenoxo, es decir, de fórmula:
Figure imgf000005_0002
donde x está descrito anteriormente y más preferiblemente x es 1.
Cuando R1 es el grupo -COOR2 o el grupo -S03R2, preferiblemente R2 es hidrógeno o metilo y más preferiblemente z es 2. Cuando R es el grupo -P03(R2)2, preferiblemente R2 es hidrógeno o metilo y más preferiblemente z es 1.
El dendrímero de la presente invención además puede ser aniónico, formando los grupos carboxilato, fosfonato o sulfonato.
Por lo tanto, la presente invención no solo incluye los dendrímeros por si mismos, sino cualquiera de sus sales, por ejemplo, sales de metal alcalino ó metal alcalinotérreo, que
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) se pueden seleccionar entre sales de sodio, potasio ó calcio, preferiblemente las sales son de sodio.
En otra realización preferida el dendrímero puede ser de generación cero y se puede representar con la siguiente fórmula (III):
Nu-(-Ra— R)
(III)
donde: Nu representa un núcleo polifuncional como se define anteriormente, Ra es un grupo alquilo (C-i-Ce); y es un número entero que varía entre 2 y 6, preferiblemente y es 4 cuando el núcleo es de silicio; y y R es el grupo terminal de fórmula general (I) según se ha descrito anteriormente. Si el núcleo es de silicio o polifenol el dendrímero de fórmula (III) puede ser de fórmula Illa o lllb res ectivamente:
Figure imgf000006_0001
(Illa) (lllb)
donde: R, Ra, e y están definidos anteriormente. En el caso de lllb, y es preferiblemente 3.
El término "generación" se refiere al número de ramificaciones iterativas que son necesarias para la preparación del dendrímero.
En otra realización preferida, el dendrímero es al menos de primera generación y se puede representar con la siguiente fórmula general (IV):
Figure imgf000006_0002
(IV)
donde: Nu representa un núcleo polifuncional como se define anteriormente, Ra Rb y R", son iguales o diferentes, y representan un grupo alquilo (C1-C6); m es un número entero que varía entre 1 y 3 preferiblemente m es 2; y es un número entero que varía entre 2 y 6; y R es el grupo terminal de fórmula general (I) según se ha descrito anteriormente. Si el núcleo es de silicio o polifenol el dendrímero de fórmula (IV) puede ser de fórmula IVa o IVb, respectivamente:
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26)
Figure imgf000007_0001
(IVa) (IVb)
donde: R, Ra Rb,R", m e y están definidos anteriormente. En el caso de IVb, y es preferiblemente 3.
En otra realización preferida, el dendrímero es al menos de segunda generación y se puede representar con la siguiente fórmula (V):
Figure imgf000007_0002
(V)
donde: Nu representa un núcleo polifuncional como se define anteriormente, Ra, Rb, Re, R" y R1", son iguales o diferentes, y representan un grupo alquilo (C-i-Ce); m y n son iguales o diferentes y es un número entero que varia entre de 1 y 3; preferiblemente m y/o n es 2; y es un número entero que varia entre 2 y 6; y R es el grupo terminal de fórmula general (I) según se ha descrito anteriomente. Si el núcleo es de silicio o de fórmula Va o Vb, respectivamente:
Figure imgf000007_0003
(Va) (Vb)
donde: R, Ra, Rb, Re, R", R1", m, n e y están definidos anteriormente. En el caso de Vb, y es preferiblemente 3.
En otra realización preferida, el dendrímero es al menos de tercera generación y se puede representar con la siguiente fórmula (VI):
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26)
Figure imgf000008_0001
(VI)
donde: Ra, Rb, Rc, R<i, R" , Rm y RIV son iguales o diferentes, y representan un grupo alquilo (C1-C6); m, n y q son iguales o diferentes y es un número entero que varía entre 1 y 3; preferiblemente es m, n y/o q es 2; y es un número entero que varía entre 2 y 6; y R es el grupo terminal de fórmula general (I) según se ha descrito anteriomente. Si el núcleo es de silicio o polifenol el dendrímero de fórmula (VI) puede ser de fórmula Vía o Vlb, respectivamente:
Figure imgf000008_0002
(Vlb)
donde: R, Ra, Rb, Re, Ra, R" , RIM, RIV, m, n, q e y se ha descrito anteriomente. En el caso de Vb, y es preferiblemente 3.
En estos dendrímeros de fórmula (III), (IV), (V) o (VI) los radicales Ra, Rb, Rc o Rd pueden ser iguales o diferentes, y preferiblemente representan un grupo alquilo (C2- C4). En otra realización preferida, los radicales R", RMI O Riv son, independiente unos de otros, y representar un grupo alquilo (C1-C4), más preferiblemente son un grupo metilo. Estos dendrímeros organosilano de la invención se pueden preparar de diferentes generaciones con rendimientos elevados usando reacciones bien conocidas, a través de métodos divergentes (crecimiento desde dentro hacia fuera) a partir de un núcleo polivalente, preferiblemente de silicio tetraalilo y posterior funcionalización de la superficie con diferentes grupos funcionales, preferiblemente aniónicos. Los
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) dendrímeros carboxilato y sulfonato son dendrímeros estables y solubles en agua. En función del pH se pueden obtener los dendrímeros como sales sódicas, ácidos o aminoácidos, lo que proporciona mayor versatilidad en sus aplicaciones. Su síntesis es relativamente sencilla, lo que facilita su obtención en grandes cantidades. Además, los dendrímeros carbosilano presentan una gran inercia química, lo que es muy útil para el estudio de cualquier aplicación biomédica.
La síntesis de cuñas dendríticas o dendrones de naturaleza carbosilano que tienen un grupo funcional en el punto focal, permiten el acoplamiento de varias de estas cuñas sobre un núcleo. La adecuada funcionalización posterior de la periferia de los dendrímeros obtenidos permite la obtención de dendrímeros aniónicos con grupos terminales como por ejemplo carboxilato, sulfonato o fosfonato. Es decir, la preparación de estos derivados aniónicos se puede hacer siguiendo una secuencia sintética de 3 pasos que implican:
• Síntesis de dendrones o cuñas dendríticas con un punto focal y una periferia adecuadamente funcionalizados.
•Acoplamiento de dendrones o cuñas dendríticas de los sintetizados en el apartado anterior sobre un núcleo
• Funcionalización de la periferia de los dendrímeros obtenidos en el apartado anterior con grupos aniónicos de diferente naturaleza, como por ejemplo, carboxilato, sulfonato o fosfonato.
Para la síntesis de estas cuñas dendríticas se puede partir de un haloalqueno, más preferiblemente bromoalqueno, como por ejemplo bromuro de alilo o 4-bromobuteno y se puede utilizar una estrategia de crecimiento divergente. Dependiendo del tipo de funcionalización que se alcance en la periferia de estos dendrones, se pueden obtener cuñas dendríticas diferentes que permiten posteriormente, una gran versatilidad de procedimientos preparativos para la obtención de dendrímeros carbosilano aniónicos. De esta forma se pueden preparar cuñas dendríticas que tienen en su punto focal un grupo bromo alquilo, BrCH2-Dendr, y que presentan su superficie funcionalizada con diferentes grupos como por ejemplo: grupos alilo, enlaces Si-H o Si-CI terminales, grupos ester, etc. Un esquema general de estas cuñas dendríticas se muestra en la FIG. 16.
Los dendrones pueden presentan en su punto focal una funcionalidad -CH2Br, por lo que pueden ser anclados sobre un núcleo, para dar lugar a dendrímeros con diferentes
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) grupos funcionales en la superficie. Esta reacción de acoplamiento de cuñas dendríticas con enlaces C-Br en el punto focal sobre distintos derivados, como por ejemplo polifenólicos, se puede realizar de forma general en un disolvente, como por ejemplo acetona, tetrahidrofurano (THF) o dimetilformamida (DMF), calentado a temperaturas entre 60 y 100 °C durante varias horas en presencia de una base como por ejemplo carbonato potásico (K2CO3) o carbonato de cesio (CS2CO3) y añadiendo éter corona, por ejemplo 18-C-6, para favorecer la solubilidad de la sal inorgánica en el disolvente orgánico utilizado.
Una vez sintetizados los dendrímeros descritos anteriormente, la obtención de dendrímeros con grupos carboxílicos, fosfónicos o sulfónicos, y más preferiblemente sus grupos aniónicos, en la superficie puede abordarse de formas diversas dependiendo en primer lugar de las funcionalidades presentes en el dendrímero de partida y en segundo lugar de la naturaleza de los grupos aniónicos que se deseen en el dendrímero final:
Así, para la obtención de derivados carboxilato se pueden utilizar dos métodos diferentes, el primero consiste en la reacción de hidrosililación de alilamina sobre dendrímeros acabados en enlaces Si-H utilizando para ello un catalizador de platino, seguido de la adición tipo Michael de acrilato de metilo sobre los grupos amino, -NH2, terminales del dendrímero y posterior transformación de los grupos éster resultantes en grupos carboxilato por tratamiento con una base, como por ejemplo NaOH. El segundo método consiste en preparar inicialmente una alil amina con grupos éster terminales mediante adición tipo Michael de acrilato de metilo sobre alilamina y posterior hidrosililación de esta alilamina funcionalizada sobre el dendrímero acabado en grupos Si-H terminales. En este caso también el paso final consistiría en la transformación de los grupos éster terminales en grupos carboxilato por adición de una base.
Por otro lado, los dendrímeros con grupos sulfonato se pueden preparan llevando a cabo inicialmente la hidrosililación de alilamina sobre dendrímeros terminados en grupos Si-H y posterior adición tipo Michael de vinil sulfonato de sodio sobre los dendrímeros acabados en grupos -NH2 resultantes en la primera etapa.
En el caso de los derivados fosfonato se pueden preparar inicialmente los dendrímeros acabados en grupos -NH2 y a partir de ellos se introducen los grupos mediante la adición de fosfito de metilo, HPO(OMe)2. También en este caso la obtención de
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) derivados aniónicos con grupos fosfonato terminales se puede conseguir por adición de base, por ejemplo NaOH, sobre los dendrímeros anteriores.
Por tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de los dendrímeros de la invención, que comprende la adición tipo Michael de un dendrímero que contiene un núcleo polivalente y grupos -NH2 terminales a un alqueno que contiene grupos carboxílicos o sulfonatos, por ejemplo, acrilato de metilo o vinil sulfonato (para la funcionalización de la superficie del dendrímero con grupos carboxilato o sulfonato) o la reacción en dos etapas de estos dendrímeros con formaldehido y fosfonato de dimetilo (para la funcionalización de la superficie del dend
Figure imgf000011_0001
Esquema 1
Donde: E, z y R1 se han descrito anteriormente, n representa el número de generaciones (G) y x el número de grupos terminales, que va a depender del número de generaciones.
Por "alqueno" se refiere en la presente invención a hidrocarburos insaturados de cadenas lineales o ramificadas, y que contienen al menos un doble enlace terminal, son cadenas que tienen de 2 a 4 átomos de carbono y además comprenden un grupo carboxilico o sulfonato.
En una realización preferida del procedimiento de obtención de los dendrímeros de la invención, los dendrímeros con terminaciones -Nhb se pueden obtener mediante la hidrosililación de alilamina sobre dendrímeros carbosilano de diferentes generaciones con enlaces terminales Si-H.
En otra realización preferida, el dendrímero que contiene un grupo -NH2 se obtiene mediante:
a) la síntesis de dendrones con un punto focal haloalquilo y funcionalizada por grupos alilo a partir de un haloalqueno;
b) acoplamiento de los dendrones obtenidos en el paso (a) a un núcleo polivalente; y c) la funcionalización del dendrímero obtenido en (b) con grupos -NH2 terminales.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de los dendrímeros de la invención, que comprende la hidrosililación de un dendrímero
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) que contiene un grupos -Si-H terminales con un grupo alilamina funcionalizado con grupos carboxilícos, fosfónicos o sulfónicos.
En otra realización preferida, el dendrímero que contienen núcleos polivalentes y grupos -Si-H terminales se obtiene mediante:
a) la síntesis de dendrones con un punto focal haloalquilo y funcionalizada por grupos
-Si-H a partir de un haloalqueno; y
b) acoplamiento de los dendrones obtenidos en el paso (a) a un núcleo; o de manera alternativa
a')la síntesis de dendrones con un punto focal haloalquilo y funcionalizada por grupos alilo a partir de un haloalqueno;
b')acoplamiento de los dendrones obtenidos en el paso (a') a un núcleo; y
c')la funcionalización del dendrímero obtenido en (b') con grupos -Si-H terminales.
Por "haloalqueno" se entiende en la presente invención a un alqueno (Ο-ι-Οβ) sustituido por un halógeno, por ejemplo un átomo de bromo, yodo o cloro, más preferiblemente es un bromoalqueno (C-i-Ce), aún más preferiblemente es un bromoalqueno (C2-C4), como por ejemplo el 4-bromobuteno.
En el procedimiento de obtención de los dendrímeros de la invención, los dendrímeros con terminaciones -NH2 se pueden obtener mediante la metodología "click chemistry" para la unión de propargilamina en dendrímeros carbosilanos sobre dendrímeros carbosilanos de diferentes generaciones funcionalizados con grupos azida terminales. Pero, como se ha descrito, la funcionalización de las terminaciones aminas con los grupos carboxilícos, sulfónicos o fosfóricos puede ser también anterior a su unión a las superficies de los esqueletos de los dendrímeros.
Por tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de los dendrímeros de la invención, que comprende la funcionalización inicial de aminas orgánicas con los grupos carboxilícos, sulfónicos o fosfóricos o sus grupos precursores, y su posterior unión a dendrímeros carbosilano de diferentes generaciones con enlaces terminales Si-H o funcionalizados con grupos azida terminales.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (VII):
Et3-R (VII)
donde: Et es un grupo etilo y R es el grupo terminal de fórmula (I) según se ha descrito anteriormente, un grupo -Si(R')3-p[(CH2)4-N3]p, o el grupo -Si(R')3-p[E-NH2]p donde R es
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) un grupo alquilo (C1-C4), preferiblemente R' es metilo, p varía entre 1 y 3, preferiblemente p es 1 y E es un grupo enlazante como se ha descrito anteriormente. Por tanto, otros intermedios de reacción pueden ser los dendrímeros carbosilano funcionalizados con grupos azida y amina terminales que comprende:
- un núcleo polifuncional definido anteriormente, preferiblemente de silicio tetraalilo o polifenol, y
- una capa externa, que consiste, total o parcialmente, en unidades iguales o diferentes del grupo -Si(R')3-p[(CH2)4-N3]p o el grupo o el grupo -Si(R')3-p[E- NH2]P
donde: R', p y E se han descrito anteriormente, preferiblemente E es el grupo -
(CH2)X-R3 y R3 es triazol, x está definido en la reivindicación 6, preferiblemente x es 4.
Los dendrímeros de la invención pueden tener aplicación en diferentes campos de la biomedicina, entre los que cabe destacar su utilización como agentes terapéuticos, antivirales, antibacterianos o antipriónicos. Además de su actividad microbicida, también tienen actividad antiinflamatoria, haciendo que mejore sus propiedades profilácticas puesto que la probabilidad de infección frente al VIH aumentan significativamente en presencia de procesos inflamatorios. Está claro que un buen microbicida tópico vaginal debe prevenir de la infección por el VIH y mantener íntegra la barrera vaginal epitelial. En este sentido un proceso de inflamación vaginal podría aumentar la infección por el VIH al activar a las células dendríticas y reclutar células T (dianas del VIH) al sitio de la inflamación incrementando el riesgo de la infección por el VIH y activando el proceso de transcripción vía citoquinas, regulando el factor de transcripción NF-kappaB que a su vez une y activa el promotor del VIH. El factor de transcripción NF-kappaB es una de las mayores dianas farmacológicas para los compuestos antiinflamatorios. La propiedad antiinflamatoria de los dendrímeros de la invención es una ventaja adicional con respecto a otros dendrímeros con actividad antivirales, antibacterianos o antipriónicos conocidos en el estado de técnica.
Por tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a los dendrímeros como medicamento. Siendo este medicamento preferiblemente para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades causadas por virus, bacterias u hongos. Y más preferiblemente cuando la enfermedad es causada por cepas del VIH. Más preferiblemente estos dendrímeros son aniónicos.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) Como antiviral, el dendrímero de la invención, de tamaño nanoscópico, impide el correcto proceso de adhesión a la célula diana, así como la infección de esta y su correspondiente producción de partículas virales nuevas.
Además de esta aplicación profiláctica, puesto que en pacientes infectados por el VIH esta nanopartícula podría impedir la infección de células aún no infectadas debido a los resultados obtenidos en los experimentos, también los dendrímeros de la invención tienen efecto terapéutico, ya que en células infectadas por el VIH ésta nanopartícula reduce la replicación viral, pero sobre todo tienen efecto terapéutico para las enfermedades de transmisión sexual (ETS) (antiviral, antibacteriano o antifúngico). Por tanto, en una realización preferida las enfermedades son enfermedades de transmisión sexual actuando los dendrimeros de la invención como antivirales, antibacterinas o antifúngicas.
Por "enfermedad de transmisión sexual" se entiende en la presente invención a infecciones que se adquieren por tener relaciones sexuales con alguien que esté infectado, y dicha infección puede ser causada por bacterias, hongos, protozoos o virus, por ejemplo la infección causada por el VIH. La gran mayoría de las infecciones por el VIH ocurren debido a la carencia de protección cuando se mantienen relaciones sexuales con una persona seropositiva.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un dendrímero según se ha descrito anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Además, esta composición farmacéutica puede comprende otro principio activo.
Los "vehículos farmacéuticamente aceptables" que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los vehículos conocidos por un experto en la materia.
Como ejemplos de preparaciones farmacéuticas se incluye cualquier composición sólida (comprimidos, pildoras, cápsulas, gránulos, etc.) o líquida (geles, soluciones, suspensiones o emulsiones) para administración oral, nasal, tópica o parenteral, preferiblemente la administración será tópica y aún más preferiblemente en forma de gel.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método de tratamiento o prevención de enfermedades causadas por virus, bacterias u hongos en un mamífero, preferiblemente un humano, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende al menos un dendrímero
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) de la invención. Preferiblemente la administración de la composición se puede realizar por vía oral, nasal, tópica o parenteral.
En el sentido utilizado en esta descripción, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de la composición calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de la composición, la edad, estado y antecedentes del paciente, la severidad de la enfermedad, y de la ruta y frecuencia de administración.
También es posible el uso de los dendrímeros de la invención como vehículos de transporte de moléculas, preferiblemente moléculas con actividad farmacológica (principios activos), y más preferiblemente moléculas con carga positiva cuando los dendrímeros tienen carga negativa.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG. 1. Muestra la viabilidad de las tres generaciones de dendrímeros aniónicos con terminaciones carboxilato (G1CO08, G2CO016 y G3C0032) y sulfonato (G1SF8,
G2SF16 y G3SF32) a una concentración de 10 μΜ en HEC-1A (células epiteliales de endometrio humano). FIG. 1A, ensayo de LDH (Liberación de Lactato
DesHidrogenasa). El Tx-100 (tritón x-100) al 1% representa el 100% de toxicidad. FIG.
1B, ensayo de MTT Bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol. El DMSO al 20% representa el 100% de toxicidad. Dx (Dextrano) se utiliza como control de molécula inocua, DxS (Dextrano Sulfonato) y Suramin son moléculas con grupos sulfonato utilizadas como control positivo de inhibición del VIH.
FIG. 2. Muestra la viabilidad de las CMSP en presencia de distintas concentraciones de G2C0016 y G2SF16. FIG. 2A, ensayo de LDH y FIG. 2B, ensayo de MTT.
FIG. 3. Muestra la toxicidad del dendrímero G2SF16 sobre eritrocitos de sangre humana (liberación de hemoglobina al sobrenadante).
FIG. 4. Representa un ensayo linfoproliferativo de 4 días en CMSP. Se estimulan las CMSP con 2 g/mL de PHA (fitohemaglutinina purificada). En la FIG. 4A se muestra
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) que el dendrímero G2SF16 no tiene efecto mitogénico. En la FIG. 4B, se muestra que el dendrímero G2SF16 inhibe el efecto mitogénico de la PHA en las CMSP.
FIG. 5. Representa un ensayo de adsorción de las partículas virales a la monocapa de células epiteliales en presencia de un pretratamiento con los dendrímeros, G2SF16 y G2C0016, a distintos tiempos. Se evalúa la cantidad de VIH realizando un inmunoensayo enzimático para la cuantificación del Agp24 en el sobrenadante del cultivo (ELISA p24). Tras 24 horas de infección (FIG. 5A) y tras 72 horas de infección (FIG. 5B).
FIG. 6. Muestra un ensayo de internalización de las partículas virales por la línea celular HEC-1A. Se pretrataron las células durante 1h con los dendrímeros antes de infectarlas con el aislado X4 VIH NL4.3 durante 3h. Tras la infección se lisaron las HEC-1A con TX-100 al 0.2% para cuantificar las partículas virales en el interior celular. FIG. 7. Muestra el mecanismo de interacción entre los dendrímeros y las partículas virales. Las cepas X4 VIH NL4.3 y R5 VIH Bal fueron pretratadas con los dendrímeros antes de exponerse a las CMSP. El sobrenadante viral se recogió a los 4 días.
FIG. 8. Muestra la inhibición de la transcitosis en HEC-1A. Se evaluó la cantidad de Agp24 en el sobrenadante basolateral de los dispositivos de transweil utilizados para simular una monocapa de la mucosa vaginal.
FIG. 9. Muestra la evaluación del efecto profiláctico y terapéutico del dendrímero G2SF16 en CMSP. Se trataron las CMSP a distintos tiempos antes y después de ser infectadas por el VIH para analizar la actividad del dendrímero G2SF16. T-20 es un inhibidor de fusión de la membrana viral con la membrana celular a través de la proteína gp41 , inhibe la entrada del virus en la célula y el AZT es un inhibidor de la transcriptasa inversa. En resumen ambos inhibidores de la replicación viral y se utilizan como controles para ver que inhiben la replicación del virus. La FIG. 9A es pretratamiento, es decir, primero se añade el dendrímero y después se infecta; la FIG. 9B es posttratamiento, es decir primero se infecta y luego se añade el virus.
FIG. 10. Muestra la inhibición de la entrada del VIH en células dendríticas y macrófagos. Se pretrataron las células durante 1h con el dendrímero G2SF16. Se infectaron con las cepas X4 VIH NL4.3(columnas negras) y R5 VIH Bal (columnas grises)
FIG. 11. Muestra el efecto bactericida de los dendrímeros aniónicos de estructura carbosilano. Representación del efecto dependiente de la concentración de ampicilina y
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) los dendrímeros G2C0016 y G2SF16 a las 24h post-tratamiento de S.aureus. La pendiente del triángulo representa la disminución de la concentración de antibiótico (2; 1; 0.5; 0.25; 1.12; 0.6; 0.3; 0.15 yg/mL) o dendrímero (160; 80; 40; 20; 10; 5; 2.5; 1.25 μΜ). La barra gris representa el dendrímero a 10 μΜ.
FIG. 12. Muestra el efecto bacterioestático de los dendrímeros aniónicos de estructura carbosilano. Representación del efecto dependiente de la concentración de ampicilina y los dendrímeros G2C0016 y G2SF16 a las 24h post-tratamiento de S.aureus. La pendiente del triángulo representa la disminución de la concentración de antibiótico (2; 1; 0.5; 0.25; 1.12; 0.6; 0.3; 0.15 g/mL) o dendrímero (160; 80; 40; 20; 10; 5; 2.5; 1.25 μΜ). La barra gris representa el dendrímero a 10 μΜ.
FIG. 13. Muestra los estudio de biocompatibilidad y efecto inhibidor de la entrada de VIH de dendrímeros click. La FIG. 13A representa una curva de toxicidad de los dendrímeros en HEC-1A. La FIG. 13B muestra la inhibición de la entrada del VIH en células HEC-1A tras pretratarlas con los dendrímeros G2CKC0016 y G2CKP32 1h antes de la infección.
FIG. 14. Muestra el estudio de la inhibición del TNF-alpha (TNF) en linfocitos T. Transfección de células Jurkat con el plámido pTNF-luc, en presencia de G2SF16. aTNF es anti-TNF-alpha.
FIG. 15. Muestra la transfección de células Jurkat con el plásmido pNF-kB-luc, en presencia de G2SF16.
FIG. 16.- Representa esquemáticamente una cuña dendrítica de naturaleza carbosilano con doble funcionalidad, en el punto focal (F.p.f) y el la periferia (F.P.),
FIG. 17.- Muestra un estudio de la liberación de LDH tras 24h de contacto entre las tres generaciones de dendrímero y las células MT-2.
FIG. 18.- Muestra un estudio de la liberación de LDH tras 24h de contacto entre las tres generaciones de dendrímero y las CMSP.
FIG. 19.- Muestra un estudio de la actividad mitocondrial de las CMSP en contacto con distintas concentraciones de dendrímero a las 24h.
FIG. 20.- Representa la inhibición de la transcitosis de VIH en monocapa de HEC-1A. Se trató con 70 ng de virus Bal en la parte apical tras 1h de pretratamiento con el dendrímero y se recogió sobrenadante basolateral a las 48h.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) FIG. 21.- Representa la inhibición de la infección de CMSP pretratadas 1h con G203SF24. Todos los reactivos se añadieron a una concentración final en el pocilio de 10 μΜ.
FIG. 22.- Muestra un ensayo de inhibición de la infección en macrófagos (M), células dendríticas inmaduras (Di) y células dendríticas maduras (Dm) a los 4 días. Se pretrataron 1h antes de infectar con NL4.3 (3ng)
FIG. 23.- Representación del efecto bactericida dependiente de la concentración de ampicilina (antibiótico comercial) y G203SF24 a las 24h post-tratamiento de S.aureus. La pendiente del triángulo representa el decremento de la concentración de Antibiótico (2; 1; 0.5; 0.25; 1.12; 0.6; 0.3; 0.15 g/mL) o dendrímero (160; 80; 40; 20; 10; 5; 2.5; 1.25 μΜ). La barra gris representa el dendrímero a 10 μΜ.
FIG. 24.- Representación del efecto bacterioestático dependiente de la concentración de ampicilina (antibiótico comercial) y G203SF24 a las 24h post-tratamiento de S.aureus. La pendiente del triángulo representa el decremento de la concentración de Antibiótico (2; 1; 0.5; 0.25; 1.12; 0.6; 0.3; 0.15 pg/mL) o dendrímero (160; 80; 40; 20; 10; 5; 2.5; 1.25 μΜ). La barra gris representa el dendrímero a 10 μΜ.
FIG. 25.- Representación del efecto fungicida dependiente de la concentración de anfotericina B (fungicida comercial) y G203SF24 a las 24h post-tratamiento de C.albicans. La pendiente del triángulo representa el decremento de la concentración de Anfotericina B (2; 1; 0.5; 0.25; 1.12; 0.6; 0.3; 0.15 pg/mL) o dendrímero (160; 80; 40; 20; 10; 5; 2.5; 1.25 μΜ). La barra gris representa el dendrímero a 10 μΜ.
FIG. 26.- Representación del efecto fungiestático dependiente de la concentración de anfotericina B (fungicida comercial) y G203SF24 a las 24h post-tratamiento de C.albicans. La pendiente del triángulo representa el decremento de la concentración de Anfotericina B (2; 1; 0.5; 0.25; 1.12; 0.6; 0.3; 0.15 pg/mL) o dendrímero (160; 80; 40; 20; 10; 5; 2.5; 1.25 μΜ). La barra gris representa el dendrímero a 10 μΜ.
EJEMPLOS
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad de los dendrímeros carbosilano y sus procedimientos de síntesis.
EJEMPLO 1: Obtención de los dendrímeros de la invención crecidos a partir de un núcleo de silicio.
Se llevaron a cabo mediante dos métodos que a continuación se detallan:
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) METODO 1 : Síntesis de los dendrímeros carbosilanos a partir de un núcleo de silicio tretraalilo con grupos amino terminales.
La síntesis de dendrímeros de estructura carbosilano con grupos amina terminales se llevó a cabo de dos maneras diferentes: a) hidrosililación de alilamina sobre dendrímeros carbosilano de diferentes generaciones con enlaces terminales Si-H, o b) utilización de la metodología click chemistry para la unión de propargilamina sobre dendrímeros carbosilano de diferentes generaciones con funcionalidades azida terminales.
METODO 1 (a): Síntesis de dendrímeros aniónicos a partir de dendrímeros con grupos amino terminales obtenidos por hidrosililación de alilamina.
En general, para simplificar la forma de nombrar los dendrímeros que se describen en estos ejemplos se pueden representar como Gn-(Fp)x, donde:
n indica el número de la generación G.
F, indica la naturaleza de los grupos funcionales situados en la periferia del dendrimero.
p indica el número de grupos funcionales en cada rama.
x denota el número de unidades terminales presentes en el dendrimero.
Cuando el dendrimero es de generación cero, G0, es decir, n=0, o cuando es de primera generación, G1 , es decir, n=1 o de segunda generación, G2, es decir, n=2, las estructuras generales serían las siguientes:
Figure imgf000019_0001
G0-[Fp]4 G1-[Fp]8 G2-[Fp]16
Los intermedios correspondientes serían: Et3-[Fp], donde Et es el grupo etilo.
Se prepararon dendrímeros aniónicos siguiendo esta ruta sintética que parte de dendrímeros carbosilano con grupos amino terminales o su intermedio trietil sililo
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) sustiuido (Et3-[Si(CH2)3NH2] (1), donde F es el grupo Si(CH2)3NH2 por tanto la fórmula sería Gn-[Si(CH2)3NH2]x,(n = 0, x = 4 (2); n = 1 , x = 8 (3); n = 2, x = 16 (4)). Estos dendrímeros de diferentes generaciones se pueden preparar siguiendo reacciones descritas en la bibliografía a través de procedimientos divergentes (M. Angeles Muñoz- Fernández et al. "Water-Soluble Carbosilane Dendrimers: Synthesis, Biocompatibility and Complexation with Oligonucleotides; evaluation for Medical Applications" Chem. Eur. J.. 2007, 13, 483-495). A partir de estos compuestos, la obtención de dendrímeros aniónicos con grupos carboxilato, sulfonato o fosfonato se produce finalmente siguiendo los procedimientos que se describen a continuación.
METODO Ka) para dendrímeros carboxilato.
La síntesis de dendrímeros carboxilato aniónicos de diferentes generaciones se realizó a través de una reacción de adición tipo Michael de acrilato de metilo sobre los dendrímeros terminados en grupos -NH2, 1-4, descritos anteriormente. Las condiciones de reacción se describen en el esquema 1 y de esta forma se obtienen los dendrímeros Gn-[Si(CH2)3N(CH2CH2COOMe)2]x: (trietil sililo: Et3-[Si(CH2)3N(CH2CH2COOMe)2] (5); G0-[Si(CH2)3N(CH2CH2COOMe)2]4 n = 0 y x = 4 (6); G1-[Si(CH2)3N(CH2CH2COOMe)2]8, n = 1 y x = 8 (7); G2-[Si(CH2)3N(CH2CH2COOMe)2]i6 n = 2 y x = 16 (8)) como aceites incoloros solubles en disolventes orgánicos de uso común, pero insolubles en agua. A modo ilustrativo para los demás ejemplos se representan las estructuras del intermedio tetraetil sililo (5) y de los dendrímeros (6), (7) y(8):
Figure imgf000020_0001
(5) (6)
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26)
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000021_0002
(8)
Los derivados 5-8, se pueden transformar en los correspondientes derivados carboxilato aniónicos por tratamiento con NaOH, dando lugar a los compuestos Gn- [Si(CH2)3N(CH2 CH2COONa)2]x: trietil sililo Et3-[Si(CH2)3N(CH2CH2COONa)2] (9); G0- [Si(CH2)3N(CH2 CH2COONa)2]4 n = 0 y x = 4 (10); G1-[Si(CH2)3N(CH2 CH2COONa)2]8 n = 1 y x = 8 (11); G2-[Si(CH2)3N(CH2 CH2COONa)2]x n = 2 y x=16 (12), que se aislan
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) como sólidos blancos solubles en agua con rendimiento elevado (esquema 1). Adicionalmente, el tratamiento de los compuestos 9-12 con una disolución acuosa de HCI 1M conduce a los derivados catiónicos Gn-[Si(CH2)3N+H(CH2CH2COOH)2]x: trietil sililo Et3-[Si(CH2)3N+H(CH2CH2COOH)2] (13); G0-[Si(CH2)3N+H(CH2CH2COOH)2]4, n = 0 y x = 4 (14); G1-[Si(CH2)3N+H(CH2CH2COOH)2]8 n = 2 y x = 8 (15); G2- [Si(CH2)3N+H(CH2CH2COOH)2]i6 n = 3 y x = 16 (16)) (esquema 2).
Figure imgf000022_0001
χ= ι (5)
n= 0 x = 4 (6) n= 1 x= 8 (7)
2xNaOH n= 2 x= 16 (8)
MeOH pH= 10
Figure imgf000022_0002
x= l (9)
n= 0 x= 4 (10)
x= l (13) n= l x= 8 (11)
n= 0 x= 4 (14) n= 2 x= 16 (12)
n= 1 x= 8 (15)
n= 2 x= 16 (16)
Esquema 2
Los derivados 13-16 también se convierten a través de un proceso reversible en los dendrímeros aniónicos 9-12 por tratamiento con una disolución de NaOH, quienes revierten a los primeros si se tratan nuevamente con una disolución acuosa de HCI 1M (esquema 2).
Obteniéndose también los siguientes compuestos de estructuras Gn- [Si(CH2)3N+H(CH2CH2COOH)2]x (trietil silano Et3-[Si(CH2)3N+H(CH2CH2COOH)2] (13); G0-[Si(CH2)3N+H(CH2CH2COOH)2]4 n = 0 y x = 4 (14); G1- [Si(CH2)3N+H(CH2CH2COOH)2]8 n = 1 y x = 8 (15); G2-[Si(CH2)3N+H(CH2CH2COOH)2]i6 n = 3 y x = 16 (16)), así por ejemplo el compuesto (13) y el dendrímero (14) serían:
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26)
Figure imgf000023_0001
METODO Ka) para dendrímeros sulfonato.
La síntesis de dendrímeros aniónicos de diferentes generaciones con grupos terminales de naturaleza sulfonato, se ha realizado a través de una reacción de adición tipo Michael de viníl sulfonato de sodio sobre los dendrímeros terminados en grupos - NH2, 1- 4. La reacción se lleva a cabo en una mezcla de etanol-agua, calentando a 120 °C, obteniéndose los derivados aniónicos Gn-[S¡(CH2)3N(CH2CH2SO3Na)2]x (trietil sililo Et3-[Si(CH2)3N(CH2CH2SO3Na)2] (17); G0-[Si(CH2)3N(CH2CH2SO3Na)2]4 n = 0, x = 4 (18); G1-[Si(CH2)3N(CH2CH2SO3Na)2]8 n = 1 y x=8 (19); G2- [Si(CH2)3N(CH2CH2SO3Na)2]i6 n = 3 y x = 16 (20)), como sólidos blancos solubles en agua con un rendimiento elevado y se pueden almacenar durante largos periodos de tiempo sin mostrar signos de descomposición. (Esquema 3).
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26)
Figure imgf000024_0001
x= l (21)
n= 0 x= 4 (22)
n= 1 x= 8 (23)
n= 2 x= 16 (24)
Esquema 3
Al igual que en los derivados carboxilato, los dendrímeros aniónicos 17-20, se pueden protonar por tratamiento con un exceso de una disolución de HCI 1 M en agua, obteniéndose los dendrímeros catiónicos Gn-[Si(CH2)3N+H(CH2CH2S03" a+)2]x (trietil sililo Et3-[Si(CH2)3N+H(CH2CH2S03"Na+)2] (21); G0-[Si(CH2)3N+H(CH2CH2SO3"Na+)2]4 n = 0 y x = 4 (22); G1-[S¡(CH2)3N+H(CH2CH2S03"Na+)2]8 n = 2 y x = 8 (23); G2- [Si(CH2)3N+H(CH2CH2SO3"Na+)2]i6 n=3 y x = 16 (24)), quienes de nuevo pueden revertir a los primeros por tratamiento con una disolución de NaOH (esquema 3).
METODO 1(a) para dendrímeros fosfonato.
La síntesis de dendrímeros aniónicos con grupos fosfonato en la periferia no se puede obtener a partir de dendrímeros carbosilano con grupos -NH2 terminales preparados por hidrosililación con alilamina, ya que la reacción de estos derivados con formaldehido y fosfito de dimetilo, HPO(OMe)2, no conduce a la funcionalización de los sistemas dendríticos con grupos fosfonato.
METODO 1 (b): Síntesis de dendrímeros aniónicos a partir de dendrímeros con grupos amino terminales obtenidos por acoplamiento de propargil amina sobre dendrímeros terminados en grupos azida via click chemistry.
Esta ruta sintética conlleva inicialmente la preparación de dendrímeros carbosilano, crecidos a partir de un núcleo de silicio tetraalilo, con grupos azida terminales. La preparación de estos derivados azida se ha llevado a cabo a partir de dendrímeros
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) conteniendo enlaces terminales Si-H, del tipo Gn-[Si-H]x en dos etapas (esquema 4). Primero la reacción de hidrosililación de nG-[Si-H]x con 4-bromobuteno conduce a dendrímeros carbosilano de diferentes generaciones con grupos -CH2Br terminales, Gn-[Si-CH2CH2CH2CH2Br]x (trietil silano Et3-[Si-CH2CH2CH2CH2Br] (25); G0-[Si- CH2CH2CH2CH2Br]4 n = 0 y x = 4 (26); G1-[Si-CH2CH2CH2CH2Br]8 n = 1 y x = 8 (27); G2-[Si-CH2CH2CH2CH2Br]16 n = 2 y x = 16 (28)). La posterior reacción de los derivados 25-28 con azida de sodio da lugar a los dendrímeros de estructura carbosilano con grupos azida terminales Gn-[Si-CH2CH2CH2CH2N3]x (trietil silano Et3-[S¡- CH2CH2CH2CH2N3] (29); G0-[Si-CH2CH2CH2CH2N3]4 n=0 y x=4 (30); G1-[Si- CH2CH2CH2CH2N3]8 n =1 y x =8 (31); G2-[Si-CH2CH2CH2CH2N3]16 n=2 y x = 16 (32))
Figure imgf000025_0001
x= 1 (29)
n= 0 x=4 (30)
n= l x= 8 (31 )
n= 2 x= 16 (32)
Esquema 4
Los compuestos 25 a 32 son sólidos aceitosos estables al aire y a la humedad, solubles en la mayoría de los disolventes orgánicos de uso común y pueden ser almacenados sin descomposición durante largos periodos de tiempo.
Una vez preparados los dendrímeros con grupos azida terminales, la síntesis de dendrímeros con grupos amino (-NH2) en la superficie se produce por una reacción de tipo "click chemistry", entre los compuestos 29-32 y propargil amina, dando lugar a los derivados c/f-Gn-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2NH2]x (trietil sililo Et3-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2NH2] (33); c/ -G0-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2NH2]4 n = 0 y x = 4 (34); c/c-G1- [Si(CH2)4(N3C2H)CH2NH2]8 n = 2 y x = 8 (35); c/ -G3-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2NH2]16 n = 3 y x = 16 (36)) (ver esquema 5).
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26)
Figure imgf000026_0001
x= 1 (29) x= 1 (33)
n= 0 x= 4 (30) n= 0 x= 4 (34)
n= l x= 8 (31) n= 1 x= 8 (35)
n= 2 x= 16 (32) n= 2 x= 16 (36)
Esquema 5
Estos dendrímeros que se describen se pueden simplificar representándolos como c/c-Gn-(Fp)x, donde: ck indica que se trata de dendrímeros obtenidos por acoplamiento click entre un grupo azida y un triple enlace carbono carbono y n, G, F, P y x son los descritos anteriormente y sus estructuras son como las anteriores.
La preparación de dendrímeros aniónicos siguiendo esta ruta sintética parte de los dendrímeros carbosilano con grupos amino terminales c -Gn- [Si(CH2)4(N3C2H)CH2NH2]x, (33) a (36). A partir de estos compuestos, la obtención de dendrímeros aniónicos con grupos por ejemplo carboxilato, sulfonato o fosfonato se produce finalmente siguiendo procedimientos análogos a los descritos en la sección anterior para los dendrímeros con grupos -NH2 terminales obtenidos a partir de la hidrosililación de alilamina. Así hemos obtenido las familias de compuestos que se describen a continuación
Método 1 (b) para dendrímeros aniónicos con grupos carboxilato.
La reacción de adición tipo Michael de acrilato de metilo sobre los dendrímeros terminados en grupos -NH2, 33-36, utilizando las condiciones de reacción descritas en el esquema 5 permiten obtener los dendrímeros c -Gn-
[Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2CH2COOMe)2]x (trietil sililo Et3- [Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2CH2COOMe)2](37);c f-G0-
Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2CH2COOMe)2]4 n=0 y x=4(38); c/ -G 1 - [Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2CH2COOMe)2]8 n= 1 y x = 8 (39); ck-G2- [Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2CH2COOMe)2]i6 n = 2 y x = 16 (40)) como aceites incoloros solubles en disolventes orgánicos de uso común, pero insolubles en agua.
Los derivados 37-40, se pueden transformar en los correspondientes derivados aniónicos carboxilato por tratamiento con NaOH, dando lugar a los compuestos ck-Gn- [Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2CH2COONa)2]x (trietil silano Et3-
[Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2CH2COONa)2](41);c/ -G0-
[Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2CH2COONa)2]4 n=0 y x = 4 (42); C/Í-G 1 -
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) [Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2CH2COONa)2]8 n =1 y x = 8 (43); ck-G2- [Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2CH2COONa)2]i6 n =2 y x = 16 (44)), que se aislan como sólidos blancos solubles en agua con rendimiento elevado (esquema 6).
Figure imgf000027_0001
x= 1 (41)
n= 0 x= 4 (42)
n= 1 x= 8 (43)
n= 2 x= 16 (44)
Esquema 6
Método 1(b) para dendrímeros aniónicos con grupos sulfonato.
La adición tipo Michael de vinil sulfonato de sodio sobre los dendrímeros terminados en grupos -NH2, 33-36, en una mezcla de etanol-agua a 120 °C, da lugar a los derivados aniónicos c/ -Gn-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2CH2S03Na)2]x (trietil sililo , x = 1 (45); n = 1 , x = 4 (46); n = 2, x = 8 (47); n = 3, x = 16 (48)), como sólidos blancos solubles en agua con un rendimiento elevado y se pueden almacenar durante largos periodos de tiempo sin mostrar signos de descomposición, (esquema 7).
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26)
Figure imgf000028_0001
χ= 1 (33) x= 1 (45) n= 0 x= 4 (34) n= 0 x= 4 (46)
n= 1 x= 8 (35) n= 1 x= 8 (47)
n= 2 x= 16 (36) n= 2 x= 16 (48)
Esquema 7
Método 1 (b) para dendrímeros aniónicos con grupos fosfonato.
Los dendrímeros terminados en grupos -NH2, 33-36, reaccionan con formaldehido en THF durante 1 hora a temperatura ambiente, a continuación "in situ" se añade fosfito de metilo, HPO(OMe)2, y se calienta la mezcla a 40 °C durante 3 horas, dando lugar a los derivados aniónicos c/f-Gn-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2PO(OMe)2)2]x (trietil sililo Et3- [Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2PO(OMe)2)2] (49); dc-GO-
[Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2PO(OMe)2)2]4 n =0 y x = 4 (50); c/ -G1- [Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2PO(OMe)2)2]8 n =1 y x = 8 (51); c/ -G2- [Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2PO(OMe)2)2]i6 n =2 y x = 16 (52)), como aceites incoloros con un rendimiento elevado y se pueden almacenar durante largos periodos de tiempo sin mostrar signos de descomposición (esquema 7). Los derivados 49-52, se pueden transformar en dendrímeros carbosilano aniónicos con grupos fosfonato terminales ck- Gn-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2PO(ONa)2)2]x (trietil silano Et3-
[Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2PO(ONa)2)2] (53); c/ -G0-
[Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2PO(ONa)2)2]4 n=0 y x=4 (54); c/ -G1- [Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2PO(ONa)2)2]8 n=1 y x = 8 (55); ck-G2- [Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2PO(ONa)2)2]i6 n =2 y x = 16 (56)) (Esquema 8), por tratamiento con NaOH.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26)
Figure imgf000029_0001
x= 1 (53)
n= 0 x=4 (54)
n= 1 x= 8 (55)
n= 2 x= 16 (56)
Esquema 8
Estos dendrímeros se aislan como sólidos blancos solubles en agua y se pueden almacenar durante largos periodos de tiempo sin mostrar signos de descomposición.
METODO 2.- Funcionalización de aminas orgánicas con grupos aniónicos y posterior anclaje de las mismas a un dendrímero de naturaleza carbosilano.
Para llevar a cabo la síntesis de estos compuestos, se ha llevado a cabo inicialmente la funcionalización de una serie de aminas orgánicas, alifáticas y aromáticas, con grupos aniónicos o precursores de grupos aniónicos. Estas aminas, disponen además de otro grupo funcional que va a permitir su anclaje a un dendrímero de estructura carbosilano a través de los grupos terminales de este:
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26)
Figure imgf000030_0001
B
Figure imgf000030_0002
D E F
Figure imgf000030_0003
G H
Se sintetizaron derivados alilo que contienen grupos carboxilato (A), sulfonato (B) o fosfonato (C) que se podrían utilizar para su anclaje a un dendrímero carbosilano a través de una reacción de hidrosililación con dendrímeros que contengan enlaces Si-H terminales, del tipo Gn-(SiH)x (trietil silano, G0, G1 , G2; con x = 1 , 4, 8 y 16, respectivamente).
Otra familia de compuestos sintetizada, deriva de la funcionalización de propargil amina con grupos carboxilato (D), sulfonato (E) o fosfonato (F). En este caso, la presencia del triple enlace carbono-carbono presente en estos derivados permite su unión a dendrímeros carbosilano con grupos azida terminales, del tipo Gn-[Si- CH2CH2CH2CH2N3]X, a través de una reacción de acoplamiento click entre el derivado propargilo y el grupo azida del dendrímero.
Un tercer tipo de compuestos preparados son aquellos obtenidos a partir de la funcionalización del grupo -NH2 de 4-amino fenol con derivados carboxilato (G), o fosfonato (H). En este caso, la unión de estos compuestos a dendrímeros carbosilano se realiza a través de una reacción de fenólisis de dendrímeros que contienen enlaces terminales Si-CI ó SÍCH2-CI (esquema 11).
Método 2(a). Funcionalización de alilamina.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) La síntesis de los compuestos A-B, se ha realizado a través de una reacción de adición de tipo Michael de alilamina con acrilato de metilo, y vinil sulfonato de sodio respectivamente. En la síntesis del derivado A, la adición tipo Michael se completa en THF a temperatura ambiente y en tan sólo 3 horas. El derivado B se prepara a través de una adición tipo Michael de vinil sulfonato de sodio sobre alilamina. En este caso la reacción se lleva a cabo en H20 como disolvente, a 120 °C y durante 48 horas. En el caso del derivado C, su preparación se lleva a cabo en una reacción en dos pasos, a partir de alilamina. Inicialmente se hace reaccionar alilamina con formaldehido en THF durante 1 hora a temperatura ambiente y a continuación "in situ" se añade fosfito de dimetilo y se calienta la mezcla a 40 °C durante 3 horas, dando lugar al derivado C como un aceite incoloro.
Una vez obtenidos los derivados alilo A-C, la reacción de hidrosililación de estos derivados con dendrímeros carbosilano crecidos a partir de un núcleo de silicio tetraalilo con enlaces terminales Si-H, de generaciones 0 a 2, del tipo Gn-(SiH)x (trietil silano, G0, G1 , G2; x = 1 , 4, 8 y 16, respectivamente) da lugar a la síntesis de los dendrímeros carbosilano funcionalizados con grupos acrilato de metilo, 5-8, o sulfonato de sodio, 17-20, que ya han sido descritos en el apartado anterior (ver esquema 9).
Figure imgf000031_0001
x= l (5)
n= 0 x= 4 (6)
n= 1 x= 8 (7)
n= 2 x= 16 (8)
Figure imgf000031_0002
x= l (17)
n= 0 x= 4 (18)
n= 1 x= 8 (19)
n= 2 x= 16 (20)
Esquema 9
Los derivados 5-8 se pueden transformar en los dendrímeros aniónicos correspondientes, con grupos carboxilato, 9-12, por tratamiento con una disolución de NaOH (ver esquema 2).
Método 2(b). Funcionalización de propar il amina.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) La síntesis de los compuestos D y E, se ha realizado a través de una reacción de adición tipo Michael de propargilamina con acrilato de metilo, y vinil sulfonato de sodio respectivamente. En la síntesis del derivado D, la adición tipo Michael se completa en THF a temperatura ambiente y en tan sólo 3 horas. El derivado E se prepara a través de una adición tipo Michael de vinil sulfonato de sodio sobre propargilamina. En este caso la reacción se lleva a cabo en H2O como disolvente, a 120 °C y durante 48 horas. En el caso del derivado F, su preparación se lleva a cabo en una reacción en dos pasos, a partir de propargilamina. Inicialmente se hace reaccionar propargilamina con formaldehido en THF durante 1 hora a temperatura ambiente y a continuación "¡n situ" se añade fosfito de dimetilo y se calienta la mezcla a 40 °C durante 3 horas, dando lugar al derivado F como un aceite incoloro.
Una vez obtenidos los derivados D-F, la reacción de acoplamiento click de estos derivados con dendrímeros carbosilano crecidos a partir de un núcleo de silicio tetraalilo con grupos terminales azida, de generaciones 0 a 2, del tipo Gn-[Si- CH2CH2CH2CH2N3]x (trietil silano
Figure imgf000032_0001
(29); G0-[Si- CH2CH2CH2CH2N3]4 n =0 y x = 4 (30); GI-fSi-C^CHsCHzCHsNsls n =1 y x = 8 (31); G2-[Si-CH2CH2CH2CH2N3]i6 n = 2, x = 16 (32)) da lugar a la síntesis de los dendrímeros carbosilano funcíonalizados con grupos ester, 37-40, sulfonato de sodio, 45-48 o grupos fosfonato de metilo c/ -Gn-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2PO(OMe)2)2]x (trietil silano Et3-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2PO(OMe)2)2] (49); c/ -G0- [Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2PO(OMe)2)2]4 n=0 y x=4 (50); dc-G1- [Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2PO(OMe)2)2]8 n=1 y x=8 (51); ck-G2- [Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2PO(OMe)2)2]i6 n =2 y x = 16 (52)). (Esquema 10)
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26)
Figure imgf000033_0001
x= 1 (29)
n= 0 x= 4 (30) χ= 1 (45)
n= l x=8 (31) n= 0 x= 4 (46)
n= 2 x= 16 (32) n= 1 x= 8 (47)
n=2 x= 16 (48)
Figure imgf000033_0002
Esquema 10
Estos dendrímeros con grupos carboxilato, sulfonato o fosfonato ya han sido descritos anteriormente en la presente invención.
Método 2(c), Funcionalización de 4-aminofenol.
La síntesis del compuesto G se ha realizado a través de una reacción de adición tipo Michael de acrilato de metilo sobre 4-amino fenol. Este derivado se encuentra descrito en la bibliografía. El derivado H se prepara a partir de una reacción en dos pasos, a partir de 4-aminofenol. Inicialmente se hace reaccionar 4-aminofenol con formaldehido en THF durante 1 hora a temperatura ambiente y a continuación "in situ" se añade fosfonato de dimetilo y se calienta la mezcla a 40 °C durante 3 horas, dando lugar al derivado H como un aceite incoloro.
Una vez obtenidos los derivados G y H, la reacción de fenolisis de estos derivados con dendrímeros carbosilano crecidos a partir de un núcleo de silicio tetraalilo con grupos terminales Si-CI o Si-CH2CI, de generaciones 0 a 2, da lugar a la síntesis de los dendrímeros carbosilano funcionalizados con grupos acrilato de metilo, Gn-[SiCH2-
HO JA DE REEMPLAZO (Regla 26) OC6H4-N(CH2CH2COOMe)2]x (trietil sililo Et3-[SiCH2-OC6H4-N(CH2CH2COOMe)2] (57); G0-[S¡CH2-OC6H4-N(CH2CH2COOMe)2]4 n =0 y x = 4 (58); G1-[SiCH2-OC6H4- N(CH2CH2COOMe)2]8 n =1 y x = 8 (59); G2-[SiCH2-OC6H4-N(CH2CH2COOMe)2]i6 n=2 y x = 16 (60)), o grupos fosfonato de metilo Gn-[SiCH2-OC6H4-N(CH2PO(OMe)2)2]x (trietil sililo Et3-[SiCH2-OC6H4-N(CH2PO(OMe)2)2] (61); G0-[SiCH2-OC6H4-N(CH2PO(OMe)2)2]4 n =0 y x = 4 (62); G1-[SiCH2-OC6H4-N(CH2PO(OMe)2)2]8 n =1 y x = 8 (63); G2-[SiCH2- OC6H4-N(CH2PO(OMe)2)2]16 n =2 y x = 16 (64)), esquema 11. Los compuestos 57-64 se obtienen como aceites incoloros solubles en la mayoría de los disolventes orgánicos d
Figure imgf000034_0001
x= 1 (57)
n= 0 x= 4 (58)
n= 1 x= 8 (59)
n= 2 x= 16 (60)
Figure imgf000034_0002
x = 1 (61)
n= 0 x= 4 (62)
n= 1 x= 8 (63)
n= 2 x= 16 (64)
Esquema 11
SÍNTESIS Y CARACTERIZACION DE DENDRÍMEROS CARBOSILANO.
Los dendrímeros descritos en el apartado anterior fueron caracterizados por análisis elemental de carbono, hidrógeno y nitrógeno, resonancia magnética nuclear de 1H, 13C, 29Si y 31 P, y espectrometría de masas. Los datos analíticos y espectroscópicos obtenidos están de acuerdo con las estructuras propuestas para estos derivados.
Figure imgf000034_0003
Método 1.
Sobre una disolución en MeOH del compuesto Gi-[(CH2)3NH2]4 (0.88 g, 1.34 mmol), preparado como se describe en la bibliografía (S.W. Krska, D. Seyferth, J. Am. Chem. Soc, 1998, 120, 3604-3612), se añade el reactivo comercial CH2=CHCOOMe (1.0 mi, 11.1 mmol). La mezcla así preparada se mantiene a temperatura ambiente y con agitación constante durante 12 h, tras las cuales se elimina el disolvente a vacío. De
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) este modo se obtiene el compuesto 6 como un aceite incoloro (1.79 g, 99%).
Método 2.
Sobre una disolución en tolueno del dendrímero Gr[Si-H]4 (0.24 g, 0.05 mmol), se añade el derivado CH2=CHCH2N(CH2CH2COOMe)2 (0.5 g, 2.18 mmol) y una gota de una disolución de catalizador de Karsted [(3-3.5% en Pt) en poli(dimetilsiloxano)]. La mezcla así preparada se mantiene con agitación constante a temperatura ambiente durante 12h, tras las cuales se elimina el disolvente por evaporación a vacío. De este modo se obtiene el compuesto 6 (0.58 g, 80%).
RMN-1H (CDCI3): δ 3.64 (s, 24H, -OMe), 2.75 (t, 16H, -NCH2CH2COOMe), 2.42 (m, 16H, -NCH2CH2COOMe y -SiCH2CH2CH2N-), 1.32 (m, 16H, SiCH2CH2CH2Si- y - SiCH2CH2CH2N-), 0.54 (m, 24H, SiCH2CH2CH2Si- y -SiCH2CH2CH2N-), 0.37 (m, 8H, SiCH2CH2CH2Si-), -0.06 (s, 24H, -SiMe2). RMN-13C {1H} (CDCI3): δ 173.0 (COOMe), 57.5 (SiCH2CH2CH2N-), 51.5 (-OMe), 49.3 (-NCH2CH2COOMe), 32.4 (- NCH2CH2COOMe), 21.6 (-SiCH2CH2CH2N-), 20.3, 18.5, 18.0 (Si(CH2)3Si-), 13.0 (- SiCH2CH2CH2N-), -3.3 (-SiMe2). RMN-29Si{1H} (CDCI3): δ 0.8 (G0-Si), 1.9 (G Si). ANÁLISIS ELEMENTAL C64Hi28 4O16S¡5: Cale. %: C, 56.93; H, 9.56; N, 4.15; Exp. %: C 57.09; H, 10.06; N, 4.34. GPC: PDI exp = 1.04.
Ejemplo 1.2: Síntesis de G?-rSi(CH? N(CH?CH?COOMe)?lK (7)
El dendrímero de segunda generación se sintetiza siguiendo un procedimiento similar al descrito para el compuesto 6 partiendo del dendrímero G2-[(CH2)3NH2]e en MeOH (0.65 g, 0.39 mmol) y de un exceso de acrilato de metilo, CH2=CHCOOMe (1 mi. 11.1 mmol). De este modo se obtiene el compuesto 7 como un aceite incoloro (1.09 g, 92%). RMN-1H (CDCI3): δ 3.64 (s, 48H, -OMe), 2.75 (m, 32H, -NCH2CH2COOMe), 2.42 (m, 48H, -NCH2CH2COOMe y -SiCH2CH2CH2N-), 1.31 (m, 40H, SiCH2CH2CH2Si- y - SiCH2CH2CH2N-), 0.53 (m, 48H, SiCH2CH2CH2Si- y -SiCH2CH2CH2Si-), 0.38 (m, 16H, SiCH2CH2CH2N-), -0.06 (s, 48H, -SiMe2), -0.1 (s, 12H, -SiMe). RMN-13C {1H} (CDCI3): δ 173.0 (-COOMe), 57.5 ((-S¡CH2CH2CH2N~), 51.5OMe), 49.2 (-NCH2CH2COOMe), 32.5 (-NCH2CH2COOMe), 21.5 (-SiCH2CH2CH2N-), 20.1 - 17.7 (Si(CH2)3Si-), 12.8 (- SiCH2CH2CH2N-), -3.3 (-SiMe2) -5.0 (-SiMe). RMN-29Si{1H} (CDCI3): δ (G0-Si no se observa), 0.78 (G Si), 1.88 (G2-Si). ANÁLISIS ELEMENTAL C144H292N8O32Sii3: Cale. %: C, 57.40; H, 9.77; N, 3.72; Exp. %: C 56.76; H, 9.78; N, 3.88. GPC: PDI exp = 1.3 Ejemplo 1.3: Síntesis de G3-rSi(CH?)aN(CH2CH?COOMe)211B (8)
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) El dendrímero de tercera generación se prepara del mismo modo que los dendrímeros de 1a y 2a generación, partiendo del dendrímero G3-[(CH2)3NH2]i6 disuelto en MeOH (0.25 g, 0.06 mmol), y de un exceso de acrilato de metilo, CH2=CHCOOMe (1 mi. 11.1 mmol). De este modo se obtiene el compuesto 8 como un aceite incoloro (0.39 g, 99%). RMN- H (CDCI3): δ 3.63 (s, 96H, -OMe), 2.74 (m, 64H, -NCH2CH2COOMe), 2.41 (m, 96H, -NCH2CH2COOMe y -SiCH2CH2CH2N-), 1.31 (m, 88H, SiCH2CH2CH2Si- y - S¡CH2CH2CH2N-), 0.53 (m, 112H, S¡CH2CH2CH2S¡- y -SiCH2CH2CH2Si-), 0.37 (m, 32H, SiCH2CH2CH2N-), -0.07 (s, 96H, -SiMe2), -0.1 (s, 36H, -SiMe). RMN-13C {1H} (CDCI3): δ 173.0 (-COOMe), 57.5 (-SiCH2CH2CH2N-), 51.5 (-OMe), 49.2 (-NCH2CH2COOMe), 32.5 (-NCH2CH2COOMe), 21.5 (-SiCH2CH2CH2N-), 20.1 - 17.9 (Si(CH2)3Si-), 12.8 (- SiCH2CH2CH2N-), -3.3 (-SiMe2) -5.0 (-SiMe). RMN-29Si{1H} (CDCI3): δ (G0-Si y G Si no se observan), 0.8 (G2-Si), 1.9 (G3-Si). ANÁLISIS ELEMENTAL C3o4H62oNi6O64Si29: Cale. %: C, 57.60; H, 9.86; N, 3.54; Exp. %: C 58.38; H, 9.86; N, 3.08. GPC: PDI exp = 1.3
Ejemplo 1.4: Síntesis de Gi-rSi(CH? N(CH?CH?COONa)7L (10)
Sobre una disolución del dendrímero 6 (1.80 g, 1.34 mmol) en etanol, se añade un exceso de una disolución de hidróxido sódico de pH= 10. Esta mezcla se mantiene con agitación constante durante 2h a temperatura ambiente. Tras evaporar el disolvente y lavar con éter dietílico se obtiene el compuesto 10 como un sólido blanco (1 ,86 g, 98%), soluble en agua.
RMN-1H (D2O): δ 2.57 (m, 8H, -NCH2CH2COO-Na+), 2.72 (m, 8H, -SiCH2CH2CH2N-), 2.16 (m, 16H, -NCH2CH2COO Na+), 1.25 (m, 16H, -SiCH2CH2CH2N-, SiCH2CH2CH2Si-), 0.43 (m, 8H, SiCH2CH2CH2Si-), 0.27 (t, 8H, SiCH2CH2CH2N), -0.20 (s, 24H, -SiMe2). RMN-13C {1H} (D2O): δ 179.9 (-NCH2CH2COO-Na+), 55.3 (-SiCH2CH2CH2N-), 48.6 (- NCH2CH2COO-Na+), 32.7 (-NCH2CH2COO Na+), 19.0 (-SiCH2CH2CH2N-), 18.4, 17.5 y 15.9 (Si(CH2)3Si), 11.4 (-SiCH2CH2CH2N-), -4.8 ( -SiMe2). RMN-29Si{1H} (D2O): δ 1.1 (Go-Si), 1.8 (G1-S1). RMN-15N{1H} (D2O): δ -322.6. ANÁLISIS ELEMENTAL C56Hio4N4Na8Oi6SÍ5: Cale. %: C, 47.57; H, 7.41 ; N, 3.96; Exp. %: C 46,15; H, 7.53; N, 3.62.
Ejemplo 1.5: Síntesis de G?-rSi(CH? N(CH?CH?COONa)?lg (11)
El dendrímero de segunda generación se prepara de siguiendo un procedimiento similar al descrito para el compuesto 10. Partiendo de una disolución del dendrímero de segunda generación 7 (1.05 g, 0.35 mmol) en etanol, se añade un exceso de una
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) disolución de hidróxido sódico de pH= 10. Esta mezcla se deja agitando durante 2h a temperatura ambiente. Tras evaporar el disolvente y lavar con éter dietílico se obtiene el compuesto 11 como un sólido blanco (1.06 g, 97%), soluble en agua.
RMN-1H (D20): δ 2.61 (m, 32H, -NCH2CH2COO Na+), 2.31 (m, 16H, -S¡CH2CH2CH2N-), 2.17 (m, 32H, -NCH2CH2COO-Na+), 1.31 (m, 16H, -SiCH2CH2CH2N-), 1.20 (m, 24H, S¡CH2CH2CH2Si-), 0.42 (m, 48H, SiCH2CH2CH2Si-), 0.26 (m, 16H, -SiCH2CH2CH2N-), - 0.17 (s ancho, 48H, -SiMe2), -0,21 (s ancho, 12H, -SiMe). RMN-13C {1H} (D20): δ 180.5 (-NCH2CH2COO Na+), 56.8 (-SiCH2CH2CH2N-), 49.7 (-NCH2CH2COO"Na+), 33.7 (- NCH2CH2COO Na+), 19.9 (-SiCH2CH2CH2N-), 19.3 - 17.9 (Si(CH2)3Si), 12.7 (- SiCH2CH2CH2N-), -3.4 ( -SiMe2), -4.4 ( -SiMe). RMN-29Si{ H} (D2O): δ (G0-Si no se observa), 1.2 (G Si), 1.9 (G2-Si). RMN-15N{1H} (D20): δ -329. ANÁLISIS ELEMENTAL Ci28H244N8Na 6032Sii3: Cale. %: C, 48.96; H, 7.83; N, 3.57; Exp. %: C, 49.03; H, 7.79; N, 3.31.
Figure imgf000037_0001
El dendrímero de tercera generación se prepara de siguiendo un procedimiento similar al descrito para los dendrímeros de 1a y 2a generación 10 y 11 , partiendo de una disolución del dendrímero 8 (0.39 g, 0.07 mmol) en etanol, sobre el que se añade un exceso de una disolución de hidróxido sódico de pH= 10. Esta mezcla mantiene agitando durante 2h a temperatura ambiente. Tras evaporar el disolvente y lavar con éter dietílico se obtiene el compuesto 12 como un sólido blanco (1.07 g, 95%) soluble en agua.
RMN-1H (D20): δ 2.54 (m, 64H, -NCH2CH2COO Na+), 2.22 (m, 32H, -SiCH2CH2CH2N-), 2.14 (m, 64H, -NCH2CH2COO Na+), 1.20 (m, 88H, -SiCH2CH2CH2N-, SiCH2CH2CH2Si-), 0.42 (m, 112H, SiCH2CH2CH2Si-), 0.25 (m, 32H, -S¡CH2CH2CH2N-), -0.17 (s ancho, 96H, -SiMe2), -0,25 (s ancho, 36H, -SiMe). RMN-13C {1H} (D20): δ 181.2 (- NCH2CH2COO"Na+), 57.1 (-SiCH2CH2CH2N-), 49.6 (-NCH2CH2COO-Na+), 34.3 (- NCH2CH2COO-Na+), 20.3 (-SiCH2CH2CH2N-), 19.5 - 18.0 (Si(CH2)3Si), 13.0 (- SiCH2CH2CH2N), -3.4(-SiMe2), -4.5 (-SiMe). RMN-29Si{1H} (D20): δ (G0-Si y G Si no se observan), 1.1 (G2-Si), 2.0 (G3-Si).
Ejemplo 1.7 Síntesis de Gi-rSifCH?)3N÷H CH?CH7COOH)?1 4 Cl (14)
El dendrímero de primera generación se prepara partiendo de una disolución en MeOH del dendrímero 10 (1.36 g, 1.01 mmol), y de un exceso de HCI al 37% (2.36 mmol). La mezcla de reacción se mantiene temperatura ambiente y con agitación constante
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) durante 3h, tras las cuales se elimina el disolvente por evaporación a vacío calentando con un baño de agua a 50 °C. El residuo resultante se lava con dietil éter frío (2 x 25ml), así se obtiene el compuesto 14 como un sólido blanco (1.17 g, 84%).
RMN-1H (D20): δ 3.30 (m, 16H, -N+HCH2CH2COOH), 2.99 (m, 8H, -SiCH2CH2CH2N+H- ), 2.70 (m, 16H, -N+HCH2CH2COOH), 1.57 (m, 8H, -SiCH2CH2CH2N+H-), 1 ,21 (m, 8H, SiCH2CH2CH2Si-), 0.44 (m, 24H, S¡CH2CH2CH2S¡- y -SiCH2CH2CH2N+H-), -0.15 (s ancho, 6H, -SiMe2). RMN-13C {1H} (D20): δ 174.0 (-COOH), 55.2 (-SiCH2CH2CH2N+H-),
49.1 (-N+HCH2CH2COOH), 28.4 (-N+HCH2CH2COOH), 19.6, 18.5, 18.2 (Si(CH2)3Si),
17.2 (-SiCH2CH2CH2N+H-), 11.5 (-SiCH2CH2CH2N+H-), -3.6 (-SiMe2). RMN-15N {1H} (D20): δ -325 (-N+H(CH2CH2COOH)2). RMN-29Si {1H} (D2O): δ (G0-Si) no se observa,
2.2 (G Si). ANÁLISIS ELEMENTAL
Figure imgf000038_0001
Cale. %: C, 48.61 ; H, 8.45; N, 4.05; Exp. C, 48.78; H, 8.41 ; N, 4.00.
Ejemplo 1.8 Síntesis de G?-rSi(CH? N+H(CH?CH?COOH)?lR 8 Cl (15)
El dendrímero de segunda generación se prepara de siguiendo un procedimiento similar al descrito para el compuesto 14, partiendo de una disolución del dendrímero de segunda generación 11 (1.0 g, 0.33 mmol) en MeOH y de un exceso de HCI al 37% (2.65 mmol). De este modo se obtiene el compuesto 15 como un sólido blanco soluble en agua (0.98 g, 96%).
RMN-1H (D2O): δ 3.30 (m, 32H, -N+HCH2CH2COOH), 3.01 (m, 16H, - SiCH2CH2CH2N+H-), 2.74 (m, 32H, -N+HCH2CH2COOH), 1.57 (m, 16H, - SiCH2CH2CH2N+H-), 1.20 (m, 24H, SiCH2CH2CH2Si- y -SiCH2CH2CH2Si-), 0.42 (m, 64H, S¡CH2CH2CH2Si- y -SiCH2CH2CH2N+H-), -0.14 (s ancho, 60H, -SiMe2 y -SiMe). RMN-13C {1H} (D2O): δ 173.8 (-COOH), 55.3 (-SiCH2CH2CH2N+H-), 49.1 (- N+HCH2CH2COOH), 28.4 (-N+HCH2CH2COOH), 19.6 - 17.0 (Si(CH2)3Si- y - SiCH2CH2CH2N+H-), 11.6 (-SiCH2CH2CH2N+H-), -3.5 (-SiMe2 y -SiMe). RMN-29Si {1H} (D2O): δ (Go-Si no se observan), 1.1 (G Si). 2.2 (G2-Si). ANÁLISIS ELEMENTAL Ci28H268Cl8N8O32Si13: Cale. %: C, 49.91 ; H, 8.77; N, 3.64; Exp. %: C, 50.64; H, 8.61 ; N, 3.45.
Ejemplo 1.9 Síntesis de G, Si(CH,hN+H(CHgCH?COOH)2liB 16 Cl (16)
El dendrímero de tercera generación se prepara de siguiendo un procedimiento similar al descrito para los dendrímeros de 1a y 2a generación 14 y 15, partiendo de una disolución del dendrímero 12 (1.0, 0.17 mmol) en MeOH, sobre la que se añade un
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) exceso HCI al 37% (2.52 mmol). De este modo se obtiene el compuesto 16 (0.8 g, 86%) como un sólido blanco soluble en agua.
RMN-1H (D20): δ 3.29 (m, 64H, -N+HCH2CH2COOH), 3.0 (m, 32H, -SiCH2CH2CH2N+H- ), 2.71 (m, 32H, -N+HCH2CH2COOH), 1.57 (m, 32H, -S¡CH2CH2CH2N+H-), 1.19 (m, 56H, SiCH2CH2CH2Si- y -SiCH2CH2CH2Si-), 0.40 (m, 144H, S¡CH2CH2CH2S¡- y - SiCH2CH2CH2N+H-), -0.14 (s ancho, 132H, -SiMe2 y -SiMe). RMN-13C {1H} (D2O): δ174.6 (-COOH), 55.8 (-SiCH2CH2CH2N+H-), 49.4 (-N+HCH2CH2COOH), 28.9 (- N+HCH2CH2COOH), 19.8-17.2 (Si(CH2)3Si- y -SiCH2CH2CH2N+H-), 11.6 (- SiCH2CH2CH2N+H-), -3.5 (-SiMe2 ), -4.4 (-SiMe). RMN-29Si {1H} (D20): δ (G0-Si, G Si y G2-Si no se observan), 2.5 (G3-Si). ANÁLISIS ELEMENTAL C272H572Cli6N16O6 Si29: Cale. %: C, 50.47; H, 8.91 ; N, 3.46; Exp. %: C, 50.99; H, 8.61 ; N, 2.99.
Ejemplo 1.10 Síntesis de Gi-íSi(CH?),N(CH?CH?SO.Na)?L (18)
Sobre una disolución del dendrímero Gr[CH2CH2CH2NH2]4 (1.16 g, 1.75 mmol) en etanol, se añade el reactivo comercial CH2=CHS03Na 30% en peso, en H20 (5.16 mi, 14.0 mmol). Esta mezcla se deja agitando durante 3 días a 120°C. Transcurrido este tiempo se elimina la disolución sobrenadante por filtración y el residuo sólido se lava con MeOH. . De este modo se obtiene el dendrímero 18 como un sólido blanco (2.25 g, 73%).
RMN-1H (D20): δ 2.86 (m, 16H, -NCH2CH2SO3 "Na+), 2.77 (m, 16H, -NCH2CH2S03 "Na+), 2.27 (m, 8H, -SiCH2CH2CH2N-), 1.39 (m, 8H, -SiCH2CH2CH2N-), 1.21 (m, 8H, SiCH2CH2CH2S¡-) 0.42 (m, 9H, SiCH2CH2CH2Si- y -SiCH2CH2CH2N-), -0.20 (s, 24H, - SiMe2). RMN-13C {1H} (D20): δ 56.5 (-SiCH2CH2CH2N-), 47.8 (-NCH2CH2SO3 Na+), 47.0 (-NCH2CH2SO3 Na+), 20.4 (SiCH2CH2CH2Si-), 19.4, 16.9 (-SiCH2CH2CH2N- y SiCH2CH2CH2Si-), 18.5 (-SiCH2CH2CH2N-), 12.3 (SiCH2CH2CH2Si-), -3.8 (-SiMe2). RMN-15N{1H} (D20): δ -339.1 (-NCH2CH2SO3-Na+). RMN-29Si{1H} (D20): δ (G0-Si no se observa), 1.8 (G Si). ANÁLISIS ELEMENTAL C52Hi16N4Na8024S8SÍ5: Cale. %: C, 35.44; H, 6.63; N, 3.18; S, 14.56; Exp. %: C, 34.54; H, 6.56; N, 3.02; S, 15.28.
Ejemplo 1.11 Síntesis de G?-rSi(CH2)aN(CH,CH2S03Na)21B (19)
Sobre una disolución del dendrímero G2-[CH2CH2CH2NH2]8 (0.5 g, 0.31 mmol) en etanol, se añaden el reactivo comercial CH2=CHS03Na 30% en peso en H2O (1.8 mi, 4.91 mmol). Esta mezcla se deja agitando durante 3 días a 120°C. Transcurrido este tiempo se elimina la disolución sobrenadante por filtración y el residuo sólido se lava con MeOH. De este modo se obtiene 19 como un sólido blanco (0.91 g, 80%)
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) RMN- H (D20): δ 2.86 (m, 32H, -NCH2CH2S03 Na+), 2.76 (m, 32H, -NCH2CH2S03 Na+), 2.28 (m, 16H, -SiCH2CH2CH2N-), 1.21 (m, 40H, -S¡CH2CH2CH2N-, -S¡CH2CH2CH2S¡- y SiCH2CH2CH2Si-), 0.43 (m, 48H, SiCH2CH2CH2S¡- y -SiCH2CH2CH2Si-), 0.28 (m, 16H, - SiCH2CH2CH2N-), -0.16 (s ancho, 48H, -SiMe2), -0.21 (s ancho, 12H, -SiMe). RMN-13C { H} (D20): δ 56.9 (-SiCH2CH2CH2N-), 48.0 (-NCH2CH2S03 "Na+), 46.7 (-NCH2CH2S03 " Na+), 20.1 (-SiCH2CH2CH2N-), 18.5-17.7 (Si(CH2)3Si), 12.4 (-SiCH2CH2CH2N-), -3.5 (SiMe2), -4.4 (SiMe). RMN-15N{1H} (D20): δ -348.5 (-NCH2CH2SO3 Na+). RMN-29Si{ H} (D20): δ (Go-S¡ no se observa), 1.1 (G Si), 2.1 (G2-Si). ANÁLISIS ELEMENTAL Cii2H244 8Na16048Si6Sii3: Cale. %: C, 36.19; H, 6.62; N, 3.01 ; S, 13.80; Exp. %: C, 36.06; H, 7.04; N, 2.63; S, 13.91.
Ejemplo 1.12 Síntesis de G.-rSi(CH? N(CH?CH?SC Na)?1ifi (20)
Sobre una disolución del dendrímero G3-[CH2CH2CH2NH2] 6 (0.52 g, 0.14 mmol) en etanol, se añade el reactivo comercial CH2=CHS03Na 30% en peso en H20 (1.70 mi, 4.64 mmol). Esta mezcla se deja agitando durante 3 días a 120°C. Transcurrido este tiempo se elimina la disolución sobrenadante por filtración y el residuo sólido se lava con MeOH. De este modo se obtiene el dendrímero 20 como un sólido blanco (0.79 g, 73%).
RMN- H (D20): δ 2.85 (m, 64H, -NCH2CH2S03 "Na+), 2.78 (m, 64H, -NCH2CH2S03 Na+), 2.27 (m, 32H, -S¡CH2CH2CH2N-), 1.24 (m, 88H, -SiCH2CH2CH2N-, -SiCH2CH2CH2Si- y SiCH2CH2CH2Si-), 0.44 (m, 144H, SiCH2CH2CH2Si-, -SiCH2CH2CH2Si- y - SiCH2CH2CH2N-), -0.15 (s ancho, 132H, -SiMe2 y -SiMe). RMN-13C {1H} (D20): δ 57.1 (- SiCH2CH2CH2N-), 47.9 (-NCH2CH2S03-Na+), 47.1 (-NCH2CH2S03-Na+), 20.6 (- SiCH2CH2CH2N-), 20.0-18.0 (Si(CH2)3Si), 12.7 (-SiCH2CH2CH2Si-), -3.4 (-SiMe2), -4.4 (- SiMe). RMN-15N {1H} (D20): δ -349.7. RMN-29Si{1H} (D20): δ (G0-Si y G Si no se observan), 1.2 (G2-Si), 2.0 (G3-Si). ANÁLISIS ELEMENTAL
Figure imgf000040_0001
Cale. %: C, 35.76; H, 6.59; N, 2.98; S, 13.64; Exp. %: C, 36.93; H, 7.19; N, 2.58; S, 12.86.
Ejemplo 1.13 Síntesis de Gi-rSi(CH2 N÷H(CH?CH?SQ3 Na*)?!* 4 Cl (22)
Sobre una disolución de un equivalente del dendrímero 18 (0.05 g, 0.03 mmol), en agua, se añade un exceso de una disolución de una disolución de HCI 1 M en dietil éter (0.5 mi, 0.23 mmol). La mezcla así preparada se mantiene con agitación constante durante 2h, tras las cuales se elimina el disolvente por evaporación a vacío. El residuo resultante se lava con éter dietílico (2 x 25 mi) y se cromatografía en columna de
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) sephadex con agua como eluyente. De este modo se aisla el compuesto 22 como un sólido blanco (0.04 g, 80%), soluble en agua.
RMN- H (D20): δ 3.44 (m, 16H, -N+HCH2CH2SO3 Na+), 3.16 (m, 24H, -N+HCH2CH2S03- Na+ y -S¡CH2CH2CH2N+H-), 1.56 (m, 16H, -S¡CH2CH2CH2N+H- y - S03 "Na+), 1.21 (m, 8H, SiCH2CH2CH2Si-) 0.42 (m, 9H, SiCH2CH2CH2Si- y -SiCH2CH2CH2N+H-), -0.16 (s ancho, 24H, -SiMe2). RMN-13C {1H} (D20): δ 56.5 (-SiCH2CH2CH2N+H-), 49.4 (- N+HCH2CH2S03 Na+), 44.8 (-N+HCH2CH2S03 Na+), 19.6 (SiCH2CH2CH2Si-), 18.5, 18.2 (-SiCH2CH2CH2N+H- y SiCH2CH2CH2Si-), 17.2 (-SiCH2CH2CH2N+H-), 11.4 (SiCH2CH2CH2Si-), -3.5 (-SiMe2). RMN-15N{1H} (D20): δ -338.5 (N+HCtf2CH2S03 Na+). RMN-29Si{1H} (D20): δ (G0-Si no se observa), 2.3 (G Si).ANÁLISIS ELEMENTAL C46Hi i2Cl4N4024S8SÍ5: Cale. %: C, 33.60; H, 6.87; N, 3.41 ; S, 15.60; Exp. %: C, 32.52; H, 5.87; N, 3.72; S, 14.58.
Figure imgf000041_0001
El dendrímero de segunda generación se prepara de un modo similar al descrito para el compuesto 22, partiendo de una disolución en agua del dendrímero 19 (0.07 g, 0.02 mmol) y de un exceso de una disolución 1M en dietil éter de HCI (0.5 mi, 0.3 mmol). De este modo se obtiene el compuesto 23 como un sólido blanco (0.04 g, 60%), soluble en agua.
RMN-1H (D20): δ 3.47 (m, 32H, -N+HCH2CH2S03 "Na+), 3.17 (m, 48H, -N+HCH2CH2S03- Na+ y -SiCH2CH2CH2N+H-), 1.58 (m, 32H, -SiCH2CH2CH2N+H- y - S03-Na+), 1.23 (m, 24H, -SiCH2CH2CH2Si- y SiCH2CH2CH2Si-), 0.46 (m, 64H, SiCH2CH2CH2Si-, - SiCH2CH2CH2Si- y -SiCH2CH2CH2N+H-), -0.11 (s ancho, 60H, -SiMe2 y -SiMe). RMN- 13C {1H} (D20): δ 55.6 (-SiCH2CH2CH2N+H-), 48.4 (-N+HCH2CH2S03 Na+), 43.9 (- N+HCH2CH2S03 Na+), 20.5 - 17.1 (-SiCH2CH2CH2N+H-, y Si(CH2)3Si), 10.6 (- SiCH2CH2CH2N+H-), -3.3 (-SiMe2 y -SiMe). RMN-29Si{1H} (D2O): δ (G0-Si no se observa), 0.7 (G Si), 2.2 (G2-Si). ANÁLISIS ELEMENTAL
Figure imgf000041_0002
Cale. %: C, 36.78; H, 7.39; N, 3.06; S, 14.03; Exp. %: C, 35.93; H, 7.46; N, 3.43; S, 13.97.
Ejemplo 1.15 Síntesis de G¾-rSifCH2)3N+HfCH?CH?SO. Na+)2lig 16 CI' (24)
El dendrímero de tercera generación se prepara de un modo similar al descrito para los compuestos 22 y 23, partiendo de una disolución en agua del dendrímero 20 (0.06 g, 0.008 mmol) y de un exceso de una disolución 1M en dietil éter de HCI (0.5 mi, 0.3
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) mmol). De este modo se obtiene el compuesto 24 como un sólido blanco (0.04 g, 60%), soluble en agua.
RMN-1H (D20): δ 3.47 (m, 64H, -N+HCH2CH2S03 Na+), 3.16 (m, 96H, -N+HCH2CH2S03 " Na+ y -SiCH2CH2CH2N+H-), 1.57 (m, 64H, -SiCH2CH2CH2N+H- y -S03 "Na+), 1.21(m, 56H, -S¡CH2CH2CH2Si- y S¡CH2CH2CH2S¡-), 0.44 (m, 144H, SiCH2CH2CH2Si-, - SiCH2CH2CH2Si- y -S¡CH2CH2CH2N+H-), -0.11 (s ancho, 132H, -SiMe2 y -SiMe). RMN- 13C {1H} (D2O): δ 56.5 (-SiCH2CH2CH2N+H-), 45.1 y 44.9 (N+HCH2CH2S03 Na+ y - N+HCH2CH2SO3-Na+), 20.0-17.8 (-SiCH2CH2CH2N+H y Si(CH2)3Si), 11.6 (SiCH2CH2CH2Si), -3.3 (-SiMe2), -4.4 (-SiMe). ANÁLISIS ELEMENTAL C224H54oCli6Ni6096S32S¡29: Cale. %: C, 36.34; H, 7.35; N, 3.03; S, 13.86; Exp. %: C, 35.87; H, 7.84; N, 3.34; S, 12.96.
Ejemplo 1.16 Síntesis de Gi-rSiCH?CH?CH?CH?BrL (26)
En una ampolla de vidrio se disuelven 1.52 g del dendrímero Gr[Si-H]4 (3.52 mmol) en hexano (5 mL) y se le añaden 1.61 mL de 4-bromobuteno (15.85 mmol). A continuación se añaden 5 gotas del catalizador de Karstedt y se agita vigorosamente durante 5 días a 60° C. Transcurrido este tiempo la reacción se concentra a sequedad y se redisuelve en diclorometano. La mezcla se filtra por carbón activo y celite y se lleva a sequedad para dar un aceite amarillento que se identifica como el dendrímero de primera generación 26 (2.32 g, 68%).
RMN-1H (CDCI3): δ 3.40 (8H, t, CW2Br), 1.85 (8H, m, SiCH2CH2CH2CH2Br), 1.37 (16H, m, SiCH2CH2CH2CH2Br y SiCH2CH2CH2Si), 0.51 (24H, m, CH2 unidos a Si), -0.05 (24H, s, SiCH3). RMN-13C {1H} (CDCI3): δ 36.4 (CH2Br), 33.7 (SiCH2CH2CH2CH2Br), 22.5(SiCH2CH2CH2CH2Br), 20.2 (S¡CH2), 18.6 (SiCH2), 17.6 (S¡CH2), 14.5 (SiCH2), - 3.281 (SiCH3). ANÁLISIS ELEMENTAL C36H8oBr4S¡5: Cale. %: C, 44.44; H, 8.29; Exp. %: C, 44.24; H, 8.18.
Ejemplo 1.17 Síntesis de G?-rSiCH?CH?CH?CH?Br1» (27)
El dendrímero de segunda generación 27, se prepara siguiendo un procedimiento de síntesis similar a 26. De este modo, se disuelven 0.38 g del dendrímero G2-[Si-H]8 en hexano (10 mL) en una ampolla de vidrio y se añaden 0.28 mL de 4-bromobuteno (2.7 mmol). A continuación se añaden 2 gotas del catalizador de Karstedt y se agita vigorosamente durante 16 horas 60° C. Transcurrido el tiempo de reacción la mezcla se concentra a sequedad y se redisuelve en diclorometano. A continuación se filtra por
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) carbón activo y celite y se lleva a sequedad para dar el compuesto 27 como un aceite amarillento (0.61 g, 83%).
RMN-1H (CDCI3): δ 3.40 (16H, t, CH2Br), 1 .85 (16H, m, SiCH2CH2CH2CH2Br), 1 .31 (40H, m, SiCH2CH2CH2CH2Br y SiCH2CH2CH2S¡), 0.53 (64H, m, CH2 unidos a Si), -0.05 (48H, s, Si(CH3)2), -0.09 (12H, s, SiCH3). RMN-13C {1 H} (CDCI3): δ 36.8 (CH2Br), 34.0 (SiCH2CH2CH2CH2Br), 22.93 (SiCH2CH2), 20.5(SiCH2CH2), 19.6(SiCH2CH2), 19.3 (S¡CH2), 19.1 (SiCH2), 18.9 (SiCH2), 18.2 (SiCH2), 14.9 (SiCH2), -2.8 (S¡CH3), -4.5 (SiCH3). ANÁLISIS ELEMENTAL CeeH^BrsS s: Cale. %: C, 46.79; H, 8.75; Exp. %: C, 46.51 ; H, 8.75.
Ejemplo 1.18 Síntesis de Ga-rSiCH2CH2CH2CH2Br1ifi (28)
El dendrímero de tercera generación 28, se prepara siguiendo un procedimiento de síntesis similar a 26. Se disuelven 0.81 g del dendrímero G3-[Si-H]i6 (0.31 mmol) en hexano (20 mL) en una ampolla de vidrio y se añaden 0.51 mL de 4-bromobuteno (5.04 mmol). A continuación, se añaden 2 gotas del catalizador de Karstedt y se agita vigorosamente durante 16 horas a 60° C. Transcurrido el tiempo de reacción la mezcla se concentra a sequedad y se redisuelve en diclorometano. A continuación, se filtra por carbón activo y celite y se lleva a sequedad para dar el compuesto 28 como un aceite amarillento (0.1 .27 g, 86%).
RMN-1 H (CDCI3): δ 3.40 (32H, t, CH2Br), 1 .85 (32H, m, SiCH2CH2CH2CH2Br), 1 .30 (88H, m, S¡CH2CH2CH2CH2Br y SiCH2CH2CH2Si), 0.53 (144H, m, CH2 unidos a Si), - 0.05 (120H, s, Si(CH3)2 y SiCH3), -0.09 (12H, s, SiCH3). RMN-13C {1 H} (CDCI3): δ 36.4 (CH2Br), 33.6 (SiCH2CH2CH2CH2Br), 22.5 (SiCH2CH2), 20.1 (SiCH2CH2), 19.0-14.5 (SiCH2), -3.3 (SiCH3), -4.8 (SiCH3, ambas señales). ANÁLISIS ELEMENTAL Ci92H428Br16Si29: Cale. %: C, 47.74; H, 8.93; Exp. %: C, 48.62; H, 9.00.
Ejemplo 1.19 Síntesis de Gi-rSiCH2CH2CH2CH2N3 (30)
En una ampolla de vidrio se disuelve 0.5 g del dendrímero 26 (0.52 mmol) en DMF (20 mL), a continuación se añaden 0.34 g de azida sódica (5.16 mmol) y una punta de espátula de ioduro sódico. La mezcla se calienta a 90° C durante 16 horas. A continuación se deja enfriar a temperatura ambiente y la mezcla se concentra a sequedad. El residuo resultante se disuelve en diclorometano (20 mL) y se lava con agua destilada (10 mL). La fase orgánica se seca sobre MgS04, y se concentra a vacío obteniéndose el producto 30 como un aceite amarillento (0.35 g, 81 %).
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) RMN-1H (CDCI3): δ 3.24 (8H, t, CH2N3), 1.60 (8H, m, SiCH2CH2CH2CH2N3), 1.35 (16H, m, S¡CH2CH2CH2CH2N3 y SiCH2CH2CH2S¡), 0.52 (24H, m, CH2 unidos a Si), -0.06 (24H, s, Si(CH3)2). RMN-13C {1H} (CDCI3): δ 51.1 (CH2N3), 32.6 (SiCH2CH2CH2CH2N3), 21.1 (SiCH2CH2), 20.2 (SiCH2CH2), 18.6 (SiCH2), 17.5 (SiCH2), 15.0 (SiCH2), -3.3 (SiCH3).
Figure imgf000044_0001
(31)
En una ampolla de vidrio se disuelve 1.00 g del dendrímero de segunda genración 27 (0.44 mmol) en DMF (30 mL), a continuación se añaden 0.43 g de azida sódica (6.64 mmol) y una punta de espátula de ioduro sódico. La mezcla se calienta a 90° C durante 16 horas y posteriormente se deja enfriar a temperatura ambiente. La mezcla se concentra a sequedad y el residuo resultante se disuelve en diclorometano (30mL) y se lava con agua destilada (15mL). La fase orgánica se seca sobre MgS04, y se concentra a vacío obteniéndose el compuesto 31 como un aceite amarillento (067 g, 78%).
RMN-1H (CDCI3): δ 3.24 (16H, t, CH2N3), 1.60 (16H, m, SiCH2CH2CH2CH2N3), 1.29 (40H, m, SiCH2Ctf2CH2CH2N3 y S¡CH2CH2CH2Si), 0.51 (64H, m, CH2 unidos a Si), - 0.06 (48H, s, Si(CH3)2), -0.10 (24H, s, SiCH3). RMN-13C {1H} (CDCI3): δ 51.1 (CH2N3), 32.6 (SiCH2CH2CH2CH2N3), 21.2 (SiCH2CH2), 20.5 (SiCH2CH2), 19.2 (SiCH2CH2), 18.8 (SiCH2), 18.6 (SiCH2), 18.5 (SiCH2), 17.7 (SiCH2), 15.0 (SiCH2), -3.3 (S¡(CH3)2), -4.9 (SiCH3). ANÁLISIS ELEMENTAL C88Hi96N24Sii3: Cale. %: C, 54.04; H, 10.10; N, 17.19; Exp. %: C, 54.81 ; H, 9.72; N, 12.94.
Ejemplo 1.21 Síntesis de G SiCH7CH2CH?CH7N,1ifi (32)
En una ampolla de vidrio se disuelven 1.82 g del dendrímero de tercera generación 28 (0.38 mmol) en una mezcla de DMF (30 mL) y THF ( 10 mL). A continuación, se añaden 0.50 g de azida sódica (7.70 mmol) y una punta de espátula de ioduro sódico. La mezcla se calienta a 90° C durante 16 horas, posteriormente se deja enfriar a temperatura ambiente. La mezcla se concentra a sequedad y el residuo resultante se disuelve en diclorometano (30mL) y se lava con agua destilada (15mL). La fase orgánica se seca sobre MgS04, y se concentra a vacío obteniéndose el compuesto 32 como un aceite amarillento (1.33 g, 82%).
RMN-1H (CDCI3): δ 3.24 (32H, t, CH2N3), 1.60 (32H, m, SiCH2CH2CH2CH2N3), 1.32 (88H, m, SiCH2CH2CH2CH2N3 y SiCH2CH2CH2Si), 0.54 (144H, m, CH2 unidos a Si), - 0.05 (120H, s, Si(CH3)2 y SiCH3), -0.09 (12H, s, SiCH3). RMN-13C {1H} (CDCI3): δ 51.1 (CH2N3), 32.6 (SiCH2CH2CH2CH2N3), 21.2 (SiCH2CH2), 20.0 (SiCH2CH2), 19.0-17.5
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) (S¡CH2) 15.0 (SiCH2), -3.3 (Si(CH3)2), -4.9 (SiCH3). ANÁLISIS ELEMENTAL Ci92H428N48S¡29: Cale. %: C, 54.59; H, 10.21 ; N, 15.92; Exp. %: C, 56.08; H, 9.58; N, 11.08.
Ejemplo 1.22 Síntesis de c -G^-rSi(CH?)4(N.C7H)CH?NH?l4 (34)
Se disuelven 0.31 g (0.38 mmol) de Gi-[SiCH2CH2CH2CH2N3]4 en 10mL de THF, sobre éste, se añaden 0.11 mL (1.66 mmol) de propargilamina. A continuación se añade una disolución recién preparada de ascorbato sódico (0.04 g, 0.11 mmol) en 1.25 mL de agua destilada y seguidamente otra disolución recién preparada de CuSO4 (0.02 mg, 0.07 mmol) en 1.25 mL de agua destilada. La mezcla se agita vigorosamente durante 16 horas. Transcurrido ese tiempo la reacción se interrumpe añadiendo 2 mL de una disolución de amoniaco al 15%, y la mezcla se agita 10 minutos. A continuación, se extrae con acetato de etilo (3x10 mL), y las fases orgánicas se juntan y se lavan con una disolución de cloruro sódico saturada. Las fases orgánicas se secan sobre MgS04 se filtran y se elimina el disolvente a vacio, para obtener el dendrímero de primera generación 34 un aceite amarillo.
RMN- H (CDCI3): δ 7.41 (4H, s, NCHCN), 4.30 (8H, t, CH2CH2N), 3.97 (8H, sa, NH2), 1.88 ((8H, m, CH2CH2N), 1.27 (16H, m, S¡CH2CH2), 0.54 (24H, m, SiCH2), 0.08 (24H, s, SiCH3).
Ejemplo 1.23 Síntesis de c c-Gi-rSi(CH? N ?H)CH?N(CH?CH?COOMe)?L (38)
Se disuelven 0.30 g del derivado G1-[SiCH2CH2CH2CH2N3]4 en 5 mL de THF (0.37 mmol) y se añade sobre esta mezcla 0.33 g (1.46 mmol) de la propargilamina funcionalizada con grupos ester (D). A continuación se añade una disolución recién preparada de ascorbato sódico (35 mg, 0.18 mmol) en 0.75 mL de agua destilada y seguidamente otra disolución recién preparada de CuS04 (18 mg, 0.073 mmol) en 0.75 mL de agua destilada. La mezcla se agita vigorosamente durante 16 horas. Transcurrido ese tiempo la reacción se interrumpe añadiendo 4 mL de una disolución de amoniaco al 15%, y la mezcla se agita 10 minutos. A continuación, se extrae con acetato de etilo (3x10 mL), y las fases orgánicas se juntan y se lavan con una disolución de cloruro sódico saturada. Las fases orgánicas se secan sobre MgSO4 se filtran y se elimina el disolvente a vacio. Tras cromatografía de exclusión de tamaños se obtiene el dendrímero de primera generación 38 como un aceite amarillo (0.43 g, 68%). RMN-1H (CDCI3): δ 7.43 (4H, s, NCHCN), 4.3 (8H, t, CH2CH2N), 3.78 (8H, s, CCH2N), 3.64 (24H, s, OCH3), 2.78 (16H, t, NCH2CH2C(0)), 2.47 (16H, t, NCH2CH2C(0)), 1.90
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) (8H, m, Cry2CH2N), 1.27 (16H, m, SiCH2CH2), 0.52 (24H, m, SiCH2), -0.08 (24H, s, SiCH3). RMN-13C {1H} (CDCI3): δ 172.8 (C02CH3), 144.6 (NCCCH2), 122.2 (NCCCH2), 51.5 (OCH3), 49.9 (CH2N), 48.9 (CH2N), 48.7 (CH2N), 34.0 (CH2CH2CH2CH2N), 32.6 (CH2CO), 21.0 (CH2CH2CH2Si), 20.1 (CH2CH2CH2), 18.5 (SiCH2), 17.5 (SiCH2), 14.9 (SiCH2), -3.4 (SiCH3).
Ejemplo 1. 24 Síntesis de cfc-Gi-rSifCH2UNaC2H)CH2N(CH2PO(OMe)2)21d (50)
Se disuelven 0.30 g (0.37 mmol) del derivado Gr[SiCH2CH2CH2CH2N3]4 en 10 mL de THF y se añade sobre esta mezcla la propargil amina funcionalizada con grupos fosfito (F), (0.44 g, 1.46 mmol). A continuación se añade una disolución recién preparada de ascorbato sódico (35 mg, 0.18 mmol) en 1.25 mL de agua destilada y seguidamente otra disolución recién preparada de CuS04 (18 mg, 0.073 mmol) en 1.25 mL de agua destilada. La mezcla se agita vigorosamente durante 16 horas. Transcurrido ese tiempo la reacción se interrumpe añadiendo 2 mL de una disolución de amoniaco al 15%, y la mezcla se agita 10 minutos. A continuación, se extrae con acetato de etilo (3x10 mL), y las fases orgánicas se juntan y se lavan con una disolución de cloruro sódico saturada. Las fases orgánicas se secan sobre MgS04 se filtran y se elimina el disolvente a vacio, para obtener el dendrímero de primera generación 50 como un aceite amarillo (0.16 g, 65%).
RMN-1H (CDCI3): δ 7.6 (4H, s, NCHCN), 4.32 (8H, t, CH2CH2N), 4.13 (8H, s, CCH2N), 3.76 (48H, d, OCH3), 3.15 (4H, d, NCH2P), 1.89 (8H, m, CH2CH2N), 1.27 (16H, m, SiCH2CH2), 0.54 (24H, m, SiCH2), -0.08 (24H, s, SiCH3). RMN-13C {1H} (CDCI3): δ 143.1 (NCCCH2), 123.0 (NCCCH2), 52.7 (d, OCH3), 51.2 (t, CCH2N), 50.0, 49.0 (dd, NCH2P), 34.1 (CH2CH2CH2CH2N), 21.0 (CH2CH2CH2CH2N), 20.1 (CH2CH2CH2Si), 18.5 (SiCH2), 17.5 (SiCH2), 14.9 (S¡CH2), -3.4 (SiCH3).
EJEMPLO 2: Obtención de los dendrimeros de la invención crecidos a partir de un núcleo polifenólico.
A.-Síntesis de dendrones o cuñas dendríticas con un punto focal y una periferia adecuadamente funcionalizados.
En el esquema 12 se describe el procedimiento de síntesis de cuñas dendríticas de 1a, 2a y 3a generación con grupos alilo terminales a partir de un bromo alqueno como el 4- bromo buteno. En un primer paso, la hidrosililación del doble enlace del alqueno con HSiMeCI2 conduce a la cuña dendrítica de 1a generación con enlaces Si-CI terminales, BrGiCI2 (65), la cual se puede transformar en una cuña dendrítica de 1a generación con
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) grupos alilo terminales por reacción con bromuro de alil magnesio, BrMg(C3H5), y que denominamos BrG-|A2 (66). La repetición de las dos reacciones anteriores sobre BrGiA2, conduce a los dendrones de 2a generación, BrG2CI4 (67) y BrG2A4 (68) y si se repiten nuevamente, ahora sobre la cuña BrG2A4, se obtienen los dendrones de 3a
Figure imgf000047_0001
Esquema 12
donde: i) HSiMeCI2, catalizador de platino; ii) BrMg(C3H5)
La funcionalización de las cuñas dendríticas anteriores con enlaces terminales Si-H, se lleva a cabo a través de una reacción en dos pasos que conlleva primero, la hidrosililación de clorodimetil silano, SiMe2CIH, sobre los dendrones terminados en grupos alilo y posteriormente la transformación de los enlaces Si-CI resultantes a enlaces Si-H terminales con tetrahidruro de litio y aluminio, LiAIH4, tal y como se describe en el esquema 13. Operando de esta forma, a partir del dendrón de primera generación BrGiA2 (66), obtendríamos la cuña dendrítica BrGiH2 (71). Si partimos del derivado de segunda generación 68, obtendríamos BrG2H4 (72), y si llevamos a cabo la funcionalización a partir del dendron de tercera generación 6, llegaríamos a la cuña dendrítica con 8 enlaces terminales Si-H, BrG3H8 (73).
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26)
Figure imgf000048_0001
Figure imgf000048_0002
Esquema 13
donde: i) HSiMe2CI, catalizador de platino; ii) UAIH4.
Un tercer tipo de cuñas dendríticas que se recogen en esta invención, son aquellas que presentan en su punto focal un grupo funcional -CH2Br, y su periferia se encuentra funcionalizada con grupos éster, que son grupos precursores de ligandos aniónicos, tal y como hemos descrito en la primera parte de esta Memoria. Se han preparado estas cuñas dendríticas hasta una tercera generación siguiendo la ruta sintética que se describe en el esquema 14. La reacción que se describe en este esquema es una reacción de hidrosililación de cuñas dendríticas de naturaleza carbosilano que contienen enlaces terminales Si-H con una alilamina funcionalizada con grupos acrilato de metilo, utilizando el catalizador de Karstedt. La alilamina utilizada en esta síntesis, es la que hemos descrito como compuesto A
Figure imgf000048_0003
A
Así pues, si la reacción parte de la cuña dendrítica de primera generación 71, su reacción de hidrosililación con A, conduce a la cuña dendrítica de primera generación con grupos acrilato de metilo terminales BrG1(COOMe)4 (74). Si se parte de la cuña de segunda generación 8, se obtiene la cuña de segunda generación BrG2(COOMe)8 (75), que tiene 8 grupos acrilato en la superficie, y si se lleva a cabo la reacción de
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) hidrosililación empezando con la cuña de tercera generación 9 y la alilamina A, se obtiene el dendrón de tercera generación BrG3(COOMe)i6 (76), que cuenta con 16 grup
Figure imgf000049_0001
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26)
Figure imgf000050_0001
BrG3(COOMe)
Esquema 14
donde: i) C3H5N(C2H4COOMe)2) catalizador de platino.
Los dendrones o cuñas dendríticas descritas en este apartado, 65-76, han sido caracterizados por análisis elemental de carbono, hidrógeno y nitrógeno, resonancia magnética nuclear de 1H, 13C y 29Si, y espectrometría de masas, que se detallan a continuación:
Síntesis de BrGiC (65).
A una disolución de 4-Bromo-1-buteno (4.00 g, 0.030 mol) en hexano (4 mL) enfriada a 0°C se adiciona HSiMeCI2 (5.10 g, 0.045 mol) y catalizador de Kardsted (3% mol). La reacción se agita a temperatura ambiente durante una noche y a continuación se lleva a sequedad. Se adiciona hexano (15 mL) y se filtra la disolución a través de carbono activo. Se evapora el disolvente y se obtiene el compuesto BrGiCI2 como un líquido incoloro (7.03 g, 95 %). El derivado 65 es sensible a la humedad y debe almacenarse bajo atmósfera inerte.
1H-RMN (CDCI3): δ 0.77 (s, 3 H, MeS¡CI2), 1.11 (m, 2 H, CH2Si), 1.65 (m, 2 H, CH2CH2SÍ), 1.93 (m, 2 H, BrCH2CH2), 3.41 (t, J = 6.6 Hz, 2 H, BrCH2); 13C-RMN{1H}
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) (CDCI3): δ 5.1 (MeS¡CI2), 20.6 (CH2CH2Si), 21.1 (CH2CH2Si), 32.8 (BrCH2CH2), 34.9 (BrCH2CH2); 29Si-RMN (CDCI3): δ 32.3 (MeS/CI2).
Síntesis de BrGiA2 (66).
Sobre una disolución de BrGi(SiCI2) (10.00 g, 0.040 mol) en Et20 (25 ml_) enfriada a 0°C se adiciona lentamente BrMg(C3H5) (0.085 mol) y se agita a temperatura ambiente durante una noche. Transcurrido este tiempo se adiciona en frío una disolución de NH4CI en agua (12%, 50 ml_). A continuación, se realiza una extracción agua/éter (3 veces), la fase orgánica se seca con MgS04 y finalmente se lleva a sequedad, obteniéndose el compuesto BrGiA2 como un líquido incoloro (8.35 g, 80 %).
1H-RMN (CDCI3): δ -0.02 (s, 3 H, MeSi(CH2CHCH2)2), 0.53 (m, 2 H, CH2Si), 1.44 (m, 2
H, CH2CH2Si), 1.54 (d, J = 8.5 Hz, 4 H, S¡CH2CH), 1.85 (m, 2 H, BrCH2CH2), 3.40 (t, J = 6.6 Hz, 2 H, BrCH2), 4.84 (m, 4 H, CH=CH2), 5.74 (m, 2 H, CH=CH2); 13C-RMN{1H} (CDCI3): δ -5.9 (e), 12.0 (d), 21.2 (f), 22.1 (c), 33.5 (a), 36.2 (b), 113.3 (h), 134.5 (g); 29Si-RMN (CDCI3): δ 0.99 (MeSi). Anal. Cale. CnH21BrSi (261 ,27 g/mol): C, 50.57; H, 8.10; Exp.: C, 51.03; H, 8.17.
Síntesis de BrG7CI4 (67).
Este compuesto se prepara a partir de BrG^ (4.30 g, 0.016 mol), HSiMeCI2 (3.41 g, 0.03 mol) y catalizador de Kardsted (3% mol) siguiendo el procedimiento descrito para la síntesis de BrGiCI2, obteniéndose BrG2CI4 como un aceite incoloro (7.60 g, 94 %). El derivado 67 es sensible a la humedad y debe almacenarse bajo atmósfera inerte.
1H-RMN (CDCI3): δ -0.03 (s, 3 H, MeSi), 0.53 (m, 2 H, SiCH2), 0.66 (m, 4 H, S¡CH2), 0.75 (s, 6 H, MeS¡CI2), 1.19 (m, 4 H, CH2SiCI2), 1.50 (m, 6 H, CH2), 1.85 (m, 2 H, BrCH2CH2), 3.40 (t, J = 6.6 Hz, 2 H, BrCH2); 13C-RMN{1H} (CDCI3): δ -5.1 (MeSi), 5.1 (MeSiCI2), 12.5 (SiCH2), 17.3 (CH2), 17.9 (CH2), 22.3 (BrCH2CH2CH2), 25.9 (CH2SiCI2), 33.7 (BrCH2), 36.4 (BrCH2CH2); 29Si-RMN (CDCI3): δ 2.3 (MeSi), 32.1 (MeS/CI2).
Síntesis de BrG?Aa (68).
Este compuesto se prepara a partir de BrG2CI4 (6.25 g, 0.013 mol) y BrMg(C3H5) (0.055 mol) siguiendo el procedimiento descrito para la síntesis de BrG1A2, obteniéndose BrG2A4 como un aceite incoloro (5.10 g, 78 %).
H-RMN (CDCI3): δ -0.08 (s, 3 H, MeSi), -0.04 (s, 6 H, MeSi), 0.56 (m, 10 H, SiCH2),
I .25 (m, 6 H, CH2), 1.52 (d, J = 8.4 Hz, 8 H, CH2CH=CH2), 1.84 (m, 2 H, BrCH2CH2), 3.40 (t, J = 6.6 Hz, 2 H, BrCH2), 4.84 (m, 8 H, CH=CH2), 5.74 (m, 4 H, CH=CH2); 13C- RMN{1H} (CDCI3): δ -5.7 (MeSi), -5.1 (MeSi), 12.9 (SiCH2), 17.9, 18.2 y 18.6 (CH2), 21.4
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) (CH2CH=CH2), 22.5 (BrCH2CH2CH2), 33.6 (BrCH2), 36.3 (BrCH2CH2), 1 13.0 (CH=CH2), 134.8 (CH=CH2); 29Si-RMN (CDCI3): § 0.1 (MeSi), 1.8 (MeSi). Anal. Cale. C25H49BrS¡3 (513.82 g/mol): C, 58.44; H, 9.61 ; Exp.: C, 58.01 ; H, 9.53.
Síntesis de BrG3CI» (69).
Este compuesto se prepara a partir de BrG2A4 (2.50 g, 4.86 mmol), HSiMeCI2 (3.80 g, 0.033 mol) y catalizador de Kardsted (3% mol) siguiendo el procedimiento descrito para la síntesis de BrGiCI2, obteniéndose BrGsCle como un aceite incoloro (4.45 g, 94 %). El derivado 69 es sensible a la humedad y debe almacenarse bajo atmósfera inerte.
1H-RMN (CDCI3): δ -0.07 (s, 3 H, MeSi), -0.04 (s, 6 H, MeSi), 0.58 (m, 18 H, S¡CH2), 0.75 (s, 12 H, MeSiCI2), 0.87 (m, 8 H, CH2), 1.16 (m, 8 H, CH2S¡CI2), 1.52 (m, 6 H, CH2), 1.85 (m, 2 H, BrCH2CH2), 3.40 (t, J = 6.6 Hz, 2 H, BrCH ); 13C-RMN{1H} (CDCI3): δ -5.2 (MeSi), 5.5 (MeSiCI2), 12.9 (SiCH2), 17.3 y 17.5 (CH2), 18.4, 18.6 y 18.7 (CH2), 22.6 (BrCH2CH2CH2), 25.9 (CH2SiCI2), 33.6 BrCH2), 36.3 (BrCH2CH2); 29Si-RMN (CDCI3): δ 1.4 {MeSi), 1.8 (MeSi), 32.1 (MeS/'CI2).
Síntesis de BrGaA» (70).
Este compuesto se prepara a partir de BrG3CI8 (3.30 g, 3.39 mmol) y BrMg(C3H5) (0.031 mol) siguiendo el procedimiento descrito para la síntesis de BrGiA2, obteniéndose BrGsA8 como un aceite incoloro (2.62 g, 76 %).
1H-RMN (CDCI3): .5 -0.10 (s, 3 H, MeSi), -0.08 (s, 6 H, MeSi), -0.04 (s, 12 H, MeSi), 055 (m, 26 H, SiCH2), 1.31 (m, 16 H, CH2), 1.52 (d, J = 8.4 Hz, 16 H, CH2CH=CH2), 1.84 (m, 2 H, BrCH2CH2), 3.40 (t, J = 6.6 Hz, 2 H, BrCH2), 4.84 (m, 16 H, CH=CH2), 5.73 (m, 8 H, CH=CH2); 13C-RMN{1H} (CDCI3): δ -5.7 (MeSi), -5.1 (MeSi), -4.9 (MeSi), 13.0 (SiCH2), 17.9, 18.3, 18.5, 18.8 y 18.9 (CH2), 21.5 (CH2CH=CH2), 22.6 (BrCH2CH2CH2), 33.6 (BrCH2), 36.4 (BrCH2CH2), 1 13.1 (CH=CH2), 134.9 (CH=CH2); 29Si-RMN (CDCI3): δ 0.1 (MeSi), 0.9 (MeSi), 1.8(MeS/). Anal. Cale. C53Hio5BrSi7 (1018.90 g/mol): C, 62.48; H, 10.39; Exp.: C, 61.92; H, 10.33.
Síntesis de BrGiH? (71).
Una disolución de BrG^SiCI):? (2.00 g, 4.44 mmol) en Et20 (25 mL) se adiciona lentamente sobre una disolución de LiAIH4 (7.76 mmol) en Et2O (25 mL) a 0°C. Una vez completada la adición se agita a temperatura ambiente durante una noche. A continuación se añade en frío una disolución acuosa de NH4CI/NaCI (12%, 50 mL) y se realiza una extracción agua/éter (3 veces). La fase orgánica se seca con MgS04 y
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) finalmente se lleva a sequedad, obteniéndose el compuesto 71 como un líquido incoloro (1.20 g, 71 %).
H-RMN (CDCI3): δ -0.08 (s, 3 H, MeSi), 0.04 (d, J = 4.2 Hz, 12 H, Me2S¡H), 0.52 (m, 2 H, SiCH2), 0.58 (m, 8 H, S¡CH2), 1.38 (m, 6 H, CH2), 1.85 (m, 2 H, BrCH2CH2), 3.40 (t, J = 6.6 Hz, 2 H, BrCH2), 3.82 (m, 2 H, SiH); 13C-RMN{1H} (CDCI3): 6 -5.1 (MeSi), -4.3 (Me2SiH), 12.9 (SiCH2), 17.9 (CH2), 18.8 y 19.0 (CH2), 22.5 (BrCH2CH2CH2), 33.7 (BrCH2), 36.4 (BrCH2CH2); 29Si-RMN (CDCI3): δ -14.6 (Me2S/H), 2.1 (MeS/). Anal. Cale. Ci5H37BrSi3 (381.61 g/mol): C, 47.21 ; H, 9.77; Obt.: C, 47.89; H, 9.53.
Síntesis de BrG?H¿ (72).
Este compuesto se prepara a partir de BrG2(SiCI)4 (3.15 g, 3.53 mmol) y LiAIH4 (10.60 mmol) siguiendo el procedimiento descrito para la síntesis de BrGiH2, obteniéndose BrG2H4, 72, como un aceite incoloro (1.76 g, 66 %).
1H-RMN (CDCI3): δ -0.10 (s, 6 H, MeSi), -0.08 (s, 3 H, MeSi), 0.04 (d, J = 4.2 Hz, 12 H,
Me2SiH), 0.54 (m, 26 H, SiCH2), 1.35 (m, 14 H, CH2), 1.85 (m, 2 H, BrCH2CH2), 3.40 (t, J = 6.6 Hz, 2 H, BrCH2), 3.82 (m, 4 H, SiH); 13C-RMN{1H} (CDCI3): δ -5.0 (MeSi), -4.38
(Me2SiH), 13.0 (SiCH2), 18.2, 18.5, 18.7, 18.8, 19.0 (CH2), 22.5 (BrCH2CH2CH2), 33.6
(BrCH2), 36.4 (BrCH2CH2); 29Si-RMN (CDCI3): δ -14.1 (Me2S/H), 1.0 (MeS/), 1.8 (MeS/).
Anal. Cale. C33H8iBrSÍ7 (754.50 g/mol): C, 52.53; H, 10.82; Obt.: C, 53.00; H, 10.25.
Síntesis de BrG¾H« (73).
Este compuesto se prepara a partir de BrG3(SiCI)s (2.00 g, 1.13 mmol) y LiAIH4 (6.75 mmol) siguiendo el procedimiento descrito para la síntesis de BrGiH2, obteniéndose
BrG3He, 73, como un aceite incoloro (1.11 g, 66 %).
1H-RMN (CDCI3): δ -0.10 (s, 21 H, MeSi), 0.04 (d, J = 4.2 Hz, 48 H, Me2S¡H), 0.58 (m, 58 H, SiCH2), 1.31 (m, 30 H, CH2), 1.82 (m, 2 H, BrCH2CH2), 3.40 (t, J = 6.6 Hz, 2 H, BrCH2), 3.83 (m, 8 H, SiH); 13C-RMN{1H} (CDCI3): -5.0 (MeSi), -4.3 (Me2S¡H), 13.0 (SiCH2), 18.2-19.0 (CH2), 22.6 (BrCH2CH2CH2), 33.5 (BrCH2), 36.5 (BrCH2CH2); 29Si- RMN (CDCI3): δ -14.6 (Me2S/H), 1.4 (MeS/). Anal. Cale.
Figure imgf000053_0001
(1500.27 g/mol): C, 55.24; H, 1 1.35; Obt.: C, 54.88; H, 10.73.
Síntesis de BrGifCOOMe d (74).
A una disolución de BrG H2 (1.00 g, 2.62 mmol) en hexano (2 ml_) se adiciona C3H5N(C2H4COOMe)2 (1.21 g, 5.24 mmol) en presencia de catalizador de Kardsted (3% mol) y la reacción se agita durante una noche. A continuación se añade hexano
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) (15 mi) y la disolución se filtra a través de carbono activo. Se evapora el disolvente y se obtiene el derivado BrGi(COOMe)4, 74, como un aceite incoloro (2.04 g, 92 %).
1H-RMN (CDCI3): δ -0.10 (s, 3 H, MeSi), -0.08 (s, 12 H, Me2Si), 0.33 (m, 4 H, S¡CH2), 0.52 (m, 10 H, SiCH2), 1.27 (m, 4 H, CH2), 1.35 (m, 6 H, CH2), 1.83 (m, 2 H, BrCH2CH2), 2.33 (m, 4 H, CH2N), 2.41 (t, J = 7.3 Hz, 8 H, CH2N), 2.74 (t, J = 7.3 Hz, 8 H, CH2CO), 3.39 (t, J = 6.6 Hz, 2 H, BrCH2), 3.61 (s, 12 H, OMe). 13C-RMN{1H} (CDCI3): δ -5.1 (MeSi), -3.3 (Me2S¡), 12.8 (SiCH2), 12.9 (SiCH2), 18.4 (CH2), 18.6 y 20.1 (CH2), 21.5 (CH2CH2N), 22.5 (BrCH2CH2CH2), 32.5 (CH2CO), 33.7 (BrCH2), 36.4 (BrCH2CH2), 49.2 (CH2N), 51.6 (OMe), 57.5 (CH2N), 173.1 (CO). Anal. Cale. CsrHysBrNbOsSia (840.16 g/mol): C, 52.89; H, 9.00; Obt.: C, 52.29; H, 8.63.
Síntesis de BrG?(COO e)« (75).
Este compuesto se prepara a partir de BrG2H4 (0.30 g, 0.40 mmol) y C3H5N(C2H4C02Me)2 (0.40 g, 1.75 mmol), siguiendo el procedimiento descrito para BrG-i(C02Me)4, obteniéndose BrG2(C02Me)e como un aceite incoloro (0.53 g, 80 %) tras realizar una cromatografía de permeación de gel en tolueno.
1H-RMN (CDCI3): δ -0.10 (s, 6 H, MeSi), -0.08 (s, 3 H, MeSi), -0.07 (s, 24 H, Me2S¡), 0.37 (m, 8 H, SiCH2), 0.52 (m, 26 H, SiCH2), 1.33 (m, 22 H, CH2), 1.83 (m, 2 H, BrCH2CH2), 2.33 (m, 8 H, CH2N), 2.41 (t, J = 7.3 Hz, 16 H, CH2N), 2.74 (t, J = 7.3 Hz, 16 H, CH2CO), 3.39 (t, J = 6,6 Hz, 2 H, BrC/-/2), 3.61 (s, 24 H, OMe).
B.-Acoplamiento de dendrones o cuñas dendríticas de los sintetizados en el apartado anterior sobre un núcleo polifenólico.
Todos los dendrones descritos en el apartado anterior presentan en su punto focal una funcionalidad -CH2Br, por lo que pueden ser anclados sobre un núcleo polifenólicos, como hidroquinona o 1 ,3,5-trihidroxibenceno, para dar lugar a dendrímeros con diferentes grupos funcionales en la superficie. Esta reacción de acoplamiento de cuñas dendríticas con enlaces C-Br en el punto focal sobre derivados polifenólicos, se realiza de forma general en acetona a 80 °C durante 3 días y con la presencia de carbonato potásico (Κ2ΟΟβ) y el éter corona 18-C-6, tal y como se describe en el esquema 15:
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26)
Figure imgf000055_0001
Esquema 15
Donde: i) K2CO3, C18H32O6, Acetona, 80°C; F son los grupos funcionales e y el número de grupos funcionales.
En estos dendrímeros que se describen a continuación se ha utilizado una nomenclatura del tipo GnOxFy, donde:
Gn: Indica la generación del dendrímero obtenido por acoplamiento de cuñas dendríticas sobre núcleos polifenólicos.
Ox: O indica que las cuñas dendríticas han sido acopladas al núcleo del dendrímero a través de un átomo de oxígeno de los grupos fenólicos presentes inicialmente en dicho núcleo. El número x indica el número de grupos fenólicos presentes en el derivado polifenólico inicial. Así 02, indica acoplamiento a un núcleo de hidroquinona que posee dos grupos fenol y 03 indica acoplamiento a un núcleo de 1 ,3,5-trihidroxibenceno, que presenta tres grupos fenol.
F: representa una o varias letras que indican la naturaleza de los grupos funcionales presentes en la superficie del dendrímero, así A representa un grupo alilo, Cl, grupos terminales con enlaces Si-CI, H grupos terminales con enlaces Si-H, N grupos amino terminales, etc.
y: representa el número de grupos funcionales presentes en la superficie del dendrímero.
Preparación de dendrímeros con grupos alilo terminales
La reacción de acoplamiento de cuñas dendríticas que poseen un enlace C-Br en el punto focal y funcionalidades alilo en la superficie, sobre un núcleo polifenólico, conduce a la formación de dendrímeros esféricos con grupos alilo terminales, tal y como se esquematiza en el esquema 16 para un dendrímero de primera generación. Así por ejemplo, la reacción de 1,3,5-trihidroxibenceno con la cuña dendrítica BrG-|A2
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) (2) conduce a la formación del dendrímero Gi03A6 (13) que contiene 6 grupos alilo en la superficie. Si se utiliza la cuña dendrítica de segunda generación BrG2A4 (4) en la reacción de acoplamiento se obtiene el dendrímero de segunda generación G203A 2 (14) y si lo que se utiliza es la cuña de tercera generación BrG3A8 (6), se obtiene el
Figure imgf000056_0001
Esquema 16 donde: i) K2C03l 18C6 (10%), Acetona, 80°C
Preparación de dendrímeros con enlaces Si-H terminales
La reacción de acoplamiento de cuñas dendríticas que poseen un enlace C-Br en el punto focal y enlaces Si-H en la superficie, sobre un núcleo polifenólico, conduce a la formación de dendrímeros esféricos funcionalizados con enlaces Si-H terminales, que se esquematiza en el esquema 17 para el derivado de primera generación. De esta forma a partir de BrGih (71), se obtiene el dendrímero de primera generación Gi03H6 (80), si partimos de BrG2H4 llegamos al dendrímero de segunda generación G2O3H12 (81) y si lo hacemos de BrG3H8 (73) obtenemos el dendrímero G3O3H24 (82) que contiene 24 ramas con enlaces Si-H terminales.
Estos derivados se pueden obtener también a partir de los dendrímeros con grupos alilo terminales 77-79, a través de un proceso de dos etapas: primero hidrosililación de los dendrímeros alilo con HSiMe2CI y posterior reducción de los enlaces Si-CI terminales con L1AIH4 para obtener los dendrímeros con enlaces Si-H en la superficie, 80-82, descritos anteriormente.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26)
Figure imgf000057_0001
Esquema 17 donde: i) K2CO3, 18C6(10%), Acetona, 80°C
, Preparación de dendrímeros con grupos acrilato de metilo terminales
De forma similar a lo descrito en los dos apartados anteriores, si se realiza la reacción de acoplamiento de cuñas dendríticas que poseen un enlace C-Br en el punto focal y grupos acrilato de metilo en la superficie, sobre un núcleo polifenólico, conduce a la formación de dendrímeros esféricos funcionalizados con grupos éster terminales (método A). El esquema 18 muestra la preparación de un dendrímero de esta familia de primera generación. De esta forma a partir de BrG1(COOMe)4 (74), se obtiene el dendrímero de primera generación Gi03(COOMe)i2 (83), si partimos de BrG2(COOMe)8 (75) llegamos al dendrímero de segunda generación G203(COOMe)24 (84) y si lo hacemos de BrG3(COOMe)i6 (76), obtenemos el dendrímero G303(COOMe)48 (85) que contiene 48 grupos éster terminales. También, se pueden preparar estos compuestos por hidrosililación sobre dendrímeros con grupos Si-H terminales (80-82) con la alilamina A, descrita anteriormente (método B) o bien, por adición tipo Michael de acrilato de metilo sobre dendrímeros funcionalizados con grupos -NH2 terminales (86-88) (método C). El esquema 19 recoge la síntesis de estos dendrímeros con grupos éster terminales preparados por los métodos B y C.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) BrG,(COOMe)4+
Figure imgf000058_0001
G.,03(COO e) 2
Esquema 18
donde: i) K2C03, 18C6(10%), Acetona, 80°C
GiOSAe—— 0,03(01)6
Figure imgf000058_0002
Gi03(NH2)6
G103(C02Me)12
Esquema 19
donde: i) HSiMe2CI, catalizador de Pt; ii) LiAIH4; iü) C3H5NH2, catalizador; C2H3CO2Me; v) C3H5N(C2H4CO2Me)2, cat.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) Los dendrímeros 77-85, han sido caracterizados por análisis elemental de carbono, hidrógeno y nitrógeno, resonancia magnética nuclear de 1H, 13C y 29Si, y espectrometría de masas, que se detallan a continuación:
Síntesis de GiQ3Afi (77)
Una ampolla de llave de teflón que contiene BrG1A2 (1.50 g, 5.74 mmol), 1 ,3,5- (HO)3C6H3 (0.24 g, 1.91 mmol), K2C03 (1.59 g, 1 1.48 mmol) y éter corona 18-C-6 (0.15 g, 0.57 mmol) en acetona (50 mL) se calienta a 80°C durante 56 h. A continuación se evaporan los volátiles y se realiza una extracción Et20/H2O (NH4CI, 12%). La fase orgánica se seca con MgS04 (aprox. 2 h) y a continuación se añade SiO2 y se agita durante 30 min. La disolución se filtra a través de carbono activo, se evapora el disolvente y se obtiene Gi03A6 como un aceite amarillo pálido (1.01 g, 79 %).
1H-RMN (CDCI3): δ -0.02 (s, 9 H, MeSi), 0.58 (m, 6 H, CH2Si), 1.44 (m, 6 H, OCH2CH2CH2), 1.54 (d, J = 8.5 Hz, 12 H, CH2CH=CH2), 1.76 (m, 6 H, OCH2CH2), 3.89 (t, J = 6.4 Hz, 6 H, OCH2), 4.84 (m, 12 H, CH=CH2), 5.78 (m, 6 H, CH=CH2), 6.04 (s, 3 H, C6H3); 13C-RMN{1H} (CDCI3): 6 -5.9 (MeSi), 12.7 (SiCH2), 20.1 (OCH2CH2CH2), 21.3 (CH2CH=CH2), 32.9 (OCH2CH2), 67.4 (OCH2), 93.7 (C6H3 (CH), 1 13.1 (CH=CH2), 134.7 (CH=CH2), 160.9 (/-C6H3); 29Si-RMN (CDCI3): 6 0.8 (MeSi). Anal. Cale. C39H6603Si3 (667.20 g/mol): C 70.21 ; H 9.97; Obt.: C 69.83; H 9.22.
Síntesis de G?Q3Ai7 (78)
Método A) Este compuesto se prepara a partir de BrG2A4 (1.50 g, 2.92 mmol), 1 ,3,5- (HO)3C6H3 (0.12 g, 0.97 mmol), K2C03 (0.81 g, 5.84 mmol) y éter corona 18-C-6 (0.077 g, 0.29 mmol) siguiendo el procedimiento descrito para la síntesis de Gi03A6, obteniéndose el derivado G203Ai2, 78, como un aceite amarillento (0.98 g, 71 %).
Método B) A partir de G203(SiCI2)6 (4.20 g, 3.09 mmol) y BrMg(C3H5) (0.044 mol), siguiendo el procedimiento descrito para la síntesis de BrGiA2, se obtiene G2O3Ai2 como un aceite amarillento (3.35 g, 76 %).
1H-RMN (CDCI3): δ -0.08 (s, 9 H, MeSi), -0.04 (s, 18 H, MeSi), 0.57 (m, 30 H, SiCH2), 1.30 (m, 12 H, CH2), 1.41 (m, 6 H, OCH2CH2CH2), 1.52 (d, J = 7.9 Hz, 24 H, CH2CH=CH2), 1.75 (m, 6 H, OCH2CH2), 3.88 (t, J = 6.3 Hz, 6 H, OCH2), 4.84 (m, 24 H, CH=CH2), 5.74 (m, 12 H, CH=CH2), 6.04 (s, 3 H, C6H3); 13C-RMN{1H} (CDCI3): δ -5.7 (MeSi), -5.1 (MeSi), 13.8 (SiCH2), 17.9, 18.2 y 18.6 (CH2), 20.6 (OCH2CH2CH2), 21.5 (CH2CH=CH2), 33.3 (OCH2CH2), 67.6 (OCH2), 93.7 (C6H3 (CH), 113.1 (CH=CH2), 134.9
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) (CH=CH2), 160.9 (/-C6H3); 29Si-RMN (CDCI3): δ 0.1 (MeS/), 1.5 (MeS/). Anal. Cale. CsiHisoOsSig (1424.83 g/mol): C 68.28; H 10.61 ; Obt.: C 68.01 ; H 10.31.
Síntesis de G¾Q3A?.i (79)
Método A) Este compuesto se prepara a partir de BrG3A8 (1.50 g, 1.47 mmol), 1 ,3,5- (HO)3C6H3 (0.061 g, 0.49 mmol), K2C03 (0.41 g, 2.94 mmol) y éter corona 18-C-6 (0.039 g, 0.14 mmol) siguiendo el procedimiento descrito para la síntesis de GiO3A6, obteniéndose el derivado G303A24, 79, como un aceite amarillento (0.92 g, 62 %).
Método B) A partir de G303(SiCI2)i2 (3.10 g, 1.10 mmol) y BrMg(C3H5) (0.027 mol), siguiendo el procedimiento descrito para la síntesis de BrGiA2) se obtiene G303A24 como un aceite amarillento (2.50 g, 77 %).
H-RMN (CDCI3): δ -0.10 (s, 18 H, MeSi), -0.07 (s, 9 H, MeSi), -0.04 (s, 36 H, MeSi), 0.55 (m, 78 H, S¡CH2), 1.31 (m, 42 H, CH2), 1.52 (d, J = 7.9 Hz, 48 H, CH2CHCH2), 1.75 (m, 6 H, OCH2CH2), 3.88 (t, J = 6.3 Hz, 6 H, OCH2), 4.84 (m, 48 H, CH=CH2), 5.74 (m, 24 H, CH=CH2), 6.04 (s, 3 H, C6H3); 13C-RMN{1H} (CDCI3): δ -5.7 (MeSi), -5.0 (MeSi), 13.9 (CH2Si), 17.9, 18.2, 18.5, 18.8, 18.9 (CH2), 20.6 (OCH2CH2CH2), 21.5 (CH2CH=CH2), 33.3 (OCH2CH2), 67.7 (OCH2), 93.6 (C6H3 (CH), 1 13.0 (CH=CH2), 134.9 (CH=CH2), 160.9 (i-C6H3); 29Si-RMN (CDCI3): δ 0.1 (MeS/), 0.9 (MeS/), 1 .7 (MeS/). Anal. Cale. C165H31803S¡21 (2940.08 g/mol): C 67.41 ; H 10.90; Obt.: C 66.56; H 10.87.
Síntesis de GiQ3HR (80)
Este compuesto se puede preparar en un proceso en dos etapas a partir de G1 O3A6, 77. La primera etapa consiste en la hidrosililación de 77 (1.01 g, 1.51 mmol) con HSiMe2CI (1.46 g, 0.015 mol) y catalizador de Kardsted (3% mol), obteniéndose el dendrímero con enlaces Si-CI terminales GiO3(SiCI)6 como un aceite amarillo pálido (1.77 g, 95 %). G1 O3(SiCI)6 es sensible a la humedad y debe almacenarse bajo atmósfera inerte. La reacción de G^ÍSiC e (1.77 g, 1.43 mmol) con LiAIH4 (6.45 mmol) siguiendo el procedimiento descrito para la síntesis de BrGiH2, da lugar al compuesto GiO3H6, 80, como un aceite incoloro (1.00 g, 68 %).
1H-RMN (CDCI3): δ -0.08 (s, 9 H, MeSi), 0.04 (d, J = 4.2 Hz, 36 H, Me2SiH), 0.55 (m, 18 H, SiCH2), 0.63 (m, 12 H, CH2SiH), 1.25 (m, 18 H, CH2), 1.77 (m, 6 H, OCH2CH2), 3.82 (m, 6 H, SiH), 3.88 (t, J = 6.6 Hz, 6 H, OCH2), 6.04 (s, 3 H, C6H3); 13C-RMN{1H} (CDCI3): δ -5.1 (MeSi), -4.4 (Me2SiH), 13.7 (SiCH2), 18.0, 18.8 y 18.9 (CH2), 20.5 (OCH2CH2CH2), 33.2 (OCH2CH2), 67.6 (OCH2), 93.8 (C6H3 (CH), 161.0 (/-C6H3); 29Si-
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) RMN (CDCI3):5 -14.0 (Me2S/H), 1.9 (MeSi). Anal. Cale. C51HH4O3SÍ9 (1028.22 g/mol): C 59.57; H 1 1.18; Obt.: C 59.89; H 1 1.53.
Síntesis de G?Q3H12 (81)
Este compuesto se puede preparar en un proceso en dos etapas a partir de G2O3A12, 78. La primera etapa consiste en la hidrosililación de 78 (2.00 g, 1.40 mmol) con HSiMe2CI (2.71 g, 0.029 mol)y catalizador de Kardsted (3% mol), obteniéndose el dendrímero con enlaces Si-CI terminales G203(SiCI)i2 como un aceite amarillo pálido (3.41 g, 95 %). G2O3(SiCI)12 es sensible a la humedad y debe almacenarse bajo atmósfera inerte. La reacción de G203(SiCI)i2 (1.45 g, 0.57 mmol) con LiAIH4 (5.10 mmol) siguiendo el procedimiento descrito para la síntesis de BrGiH2, da lugar al compuesto G203Hi2, 81 , como un aceite incoloro (0.80 g, 66 %).
1H-RMN (CDCI3): δ -0.10 (s, 18 H, MeSi), -0.08 (s, 9 H, MeSi), 0.03 (d, J = 4.2 Hz, 72 H, Me2SiH), 0.55 (m, 54 H, SiCH2), 0.63 (m, 24 H, CH2SiH), 1.35 (m, 42 H, CH2), 1.77 (m, 6 H, OCH2CH2), 3.82 (m, 12 H, Sítf), 3.88 (t, J = 6.6 Hz, 6 H, OCH2), 6.04 (s, 3 H, C6H3)\ 13C-RMN{1H} (CDCI3): δ -5.1 (MeSi), -5.0 (MeSi), -4.4 (Me2SiH), 13.9 (SiCH2), 18.2, 18.5, 18.8 y 19.0 (CH2), 20.5 (OCH2CH2CH2), 33.3 (OCH2CH2), 67.7 (OCH2), 93.7 (C6H3 (CH), 160.9 (/-C6H3); 29Si-RMN (CDCI3): δ -14.2 (Me2S/H), 0.8 (MeSi), 1.9 (MeSi). Anal. Cale. Cio5H24603Si2i (2146.87 g/mol): C 58.74; H 1 1.55; Obt.: C 57.89; H 11.53.
Síntesis de G^Q3H?4 (82)
Este compuesto se puede preparar en un proceso en dos etapas a partir de G3O3A24, 82. La primera etapa consiste en la hidrosililación de 79 (2.50 g, 0.85 mmol) con HSiMe2CI (3.28 g, 0.034 mol) y catalizador de Kardsted (3% mol), obteniéndose el dendrímero con enlaces Si-CI terminales G3O3(SiCI)24 como un aceite amarillo pálido (4.21 g, 95 %). G3O3(SiCf)24 es sensible a la humedad y debe almacenarse bajo atmósfera inerte. La reacción de G3O3(SiCI)24 (3.00 g, 0.58 mmol) con LiAIH4 (0.010 mmol) siguiendo el procedimiento descrito para la síntesis de BrGiH2, da lugar al compuesto G3O3H24, 82, como un aceite incoloro (1.64 g, 65 %).
1H-RMN (CDCI3): δ -0.10 (s. a., 54 H, MeSi), 0.03 (d, J = 4.2 Hz, 144 H, Me2S¡H), 0.58 (m, 174 H, SiCH2), 1.35 (m, 90 H, CH2), 1.77 (m, 6 H, OCH2CH2), 3.82 (m, 30 H, SiH y OCH2), 6.03 (s, 3 H, C6H3); 13C-RMN{1H} (CDCI3): δ -5.0 (MeSi), -4.3 (Me2SiH), 13.9 (CH2Si), 18.2, 18.5, 18.8, 18.9 (CH2), 20.6 (OCH2CH2CH2), 33.2 (OCH2CH2), 67.7 (OCH2), 94.5 (C6H3 (CH), 160.9 (i-C6H3); 29Si-RMN (CDCI3): δ -14.2 (Me2S/H), 1.0, 1.2
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) (MeSi). Anal. Cale. C213H510O3SÍ45 (4384.17 g/mol): C 58.35; H 11.73; Obt.: C 58.85; H 10.97.
C. Funcionalización de la periferia de los dendrímeros obtenidos en el apartado anterior con grupos aniónicos de diferente naturaleza, como por ejemplo, carboxilato, sulfonato o fosfonato.
Una vez sintetizados los dendrímeros descritos en el apartado anterior, la obtención de dendrímeros con grupos aniónicos en la superficie puede abordarse de formas diversas dependiendo en primer lugar de las funcionalidades presentes en el dendrímero de partida y en segundo lugar de la naturaleza de los grupos aniónicos que se deseen en el dendrímero final.
Preparación de dendrímeros aniónicos con grupos carboxilato terminales.
Los dendrímeros con grupos éster terminales preparados por los métodos A, B y C descritos anteriormente se pueden transformar en los dendrímeros aniónicos con grupos carboxilato terminales 89-91 por tratamiento con NaOH en una mezcla de MeOH y agua (Esquema 20).
Siguiendo los pasos anteriores se obtiene el dendrímero de primera generación Gi03(COONa)i2 (89) que poseen 12 grupos aniónicos terminales, el dendrímero G203(COONa)24 (90) con 24 grupos aniónicos y el dendrímero G303(COONa)48 (91) que presenta 48 grupos carboxilato terminales. El esquema 9 describe la síntesis del dendrímero de primera generación.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) Na
G,03(COOMe)12
Figure imgf000063_0001
Na Na
G^COz a)^
Esquema 20
donde: i) NaOH
Preparación de dendrímeros aniónicos con grupos sulfonato terminales.
La obtención de dendrímeros aniónicos con grupos sulfonato terminales se lleva a cabo fundamentalmente utilizando como productos de partida los dendrímeros que contienen grupos -Nhfe en su superficie, 86-88, descritos en el apartado anterior y a partir de ellos llevar a cabo una adición tipo Michael de vinil sulfonato de sodio para dar lugar a la síntesis de dendrímeros aniónicos con grupos sulfonato periféricos.
De esta forma se han preparado los dendrímeros aniónicos Gi03(S03Na)i2 (92), G203(S03Na)24 (93) y G303(S03Na)48 (94) que poseen 12, 24 y 48 grupos sulfonato terminales respectivamente. El esquema 20 describe la síntesis del dendrímero de primera generación.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26)
Figure imgf000064_0001
G^SOsNa)^
Esquema 21
donde: i) C2H3SO3Na
Preparación de dendrímeros aniónicos con grupos fosfonato terminales.
La obtención de dendrímeros aniónicos con grupos fosfonato terminales se lleva a cabo también utilizando como productos de partida dendrímeros que contienen grupos -NH2 en su superficie, 86-88, y a partir de ellos se lleva a cabo una reacción en dos pasos, primero con formaldehido en THF durante 1 hora a temperatura ambiente y a continuación "in situ" se añade fosfito de dimetilo y se calienta la mezcla a 40 °C durante 3 horas, dando lugar a dendrímeros con grupos terminales que presentan unidades -PO(OMe)2. Por último, la reacción de los dendrímeros anteriores con NaOH transforma los grupos periféricos -PO(OMe)2 en grupos aniónicos -PO(ONa)2.
De esta forma hemos preparado los dendrímeros aniónicos GiO3(PO(ONa)2)i2 (95), G2O3(PO(ONa)2)24 (96) y G303(PO(ONa)2)48 (97) que poseen 12, 24 y 48 grupos fosfonato terminales respectivamente. El esquema 22 describe la síntesis del dendrímero de primera generación.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) G,03(NH2)e G,03(P(0)(OMe)(ONa))12
Figure imgf000065_0001
G,03[P(0)(OMe)2l12
Esquema 22
donde: i) CH20, HP(0)(OMe)2; ii) NaOH
Los dendrímeros descritos, 86-97, han sido caracterizados por análisis elemental de carbono, hidrógeno y nitrógeno, resonancia magnética nuclear de 1 H, 13C, 29Si y 31 P, y espectrometría de masas, según se detalla a continuación:
Síntesis de Gi03(NH2)6 (86).
Una ampolla con llave de teflón que contiene Gi03H6 (0.50 g, 0.49 mmol), alilamina, C3H5NH2 (0.37 g, 6.42 mmol) y catalizador de Kardsted (3% mol) en THF (3 mL) se calienta a 120°C durante 48 h. A continuación la disolución se lleva a sequedad, se añade CH2CI2 (10 mL) y la disolución se filtra a través de carbono activo. Se evapora el disolvente y se obtiene Gi03(NH2)6, 86, como un aceite amarillo pálido (0.59 g, 89 %). H-RMN (CDCI3): δ -0.09 (s, 9 H, MeSi), -0.06 (s, 36 H, Me2S¡H), 0.48 (m, 18 H, SiCH2), 0.54 (m, 36 H, SiCH2), 1 .29 (m, 18 H, CH2), 1 .40 (m, 24 H, CH2), 1 .74 (m, 6 H, OCH2CH2), 2.63 (t, J = 7.1 Hz, 12 H, CH2N), 3.87 (t, J = 6.3 Hz, 6 H, OCH2), 6.04 (s, 3 H, C6H3); 13C-RMN{1 H} (CDCI3): δ -5.1 (MeSi), -3.3 (Me2Si), 12.3 (NCH2CH2CH2), 13.8 (SiCH2), 18.4, 18.6 y 20.0 (CH2), 20.5 (OCH2CH2CH2), 33.2 (OCH2CH2), 45.6 (NCH2), 67.6 (OCH2), 93.7 (C6H3 (CH), 160.9 (i-C6H3); 29Si-RMN (CDCI3): δ 1 .8 (MeS/), 2.1 (Me2S/). Anal. Cale. CegHiseNeOsSig (1370.78 g/mol): C 60.46, H 1 1.47, N 6.13; Obt.: C 61 .1 1 , H 1 1 .26, N 5.86.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) SSíínntteessiiss ddee GG??QQ33((NNHH??))11?? ((8877))..
EEll ddeennddrríímmeerroo ddee sseegguunnddaa ggeenneerraacciióónn ccoonn 1122 ggrruuppooss --NNHH22 tteerrmmiinnaalleess,, 8877,, ssee pprreeppaarraa ppoorr uunn pprroocceeddiimmiieennttoo ssiimmiillaarr aall ddeessccrriittoo ppaarraa eell ccoommppuueessttoo 8866,, ppaarrttiieennddoo ddee GG22OO33HH1122 ((00..5500 gg,, 00..2233 mmmmooll)),, CC33HH55NNHH22 ((00..3322 gg,, 55..5599 mmmmooll)) yy ccaattaalliizzaaddoorr ddee KKaarrddsstteedd ((33%% mmooll)).. 55 DDee eessttaa ffoorrmmaa ssee oobbttiieennee GG22OO33((NNHH22))ii22 ccoommoo uunn aacceeiittee aammaarriilllleennttoo ((00..4477 gg,, 7722 %%))..
1 1HH--RRMMNN ((CCDDCCII33)):: δδ --00..11 11 ((ss,, 1188 HH,, MMeeSSii)),, --00..0099 ((ss,, 99 HH,, MMeeSSii)),, --00..0077 ((ss,, 7722 HH,, MMee22SS¡iHH)),, 00..4433 ((mm,, 2266 HH,, CCHH22)),, 00..5544 ((mm,, 7722 HH,, CCHH22)),, 11..2211 ((ss,, 2244 HH,, NNHH22)),, 11..2288 ((mm,, 3366 HH,, CCHH22)),, 11..3388 ((mm,, 3300 HH)),, 11..7744 ((mm,, 66 HH,, OOCCHH22CCHH22)),, 22..6633 ((tt,, JJ == 77..11 HHzz,, 2244 HH,, CCHH22NN)),, 33..8855 ((tt,, JJ == 66..33 HHzz,, 66 HH,, OOCCHH22)),, 66..0044 ((ss,, 33 HH,, CC66HH33));; 1133CC--RRMMNN{{11HH}} ((CCDDCCII33)):: 55 --44..99((MMeeSSii)),, --44..77 ((MMeeSSii)),, --33..33 1100 ((MMee22SS¡i)),, 1122..33 ((SSiiCCHH22)),, 1133..88 ((SSiiCCHH22)),, 1188..44,, 1188..66,, 1188..88,, 2200..00,, 2200..11 ((CCHH22)),, 2200..66 ((OOCCHH22CCHH22CCHH22)),, 2288..33 ((CCHH22CCHH22NN)),, 3333..33 ((OOCCHH22CCHH22)),, 4455..77 ((CCHH22NN)),, 6677..66 ((OOCCHH22)),, 9933..77 ((CC66HH33 ((CCHH)),, 116600..99 ((ii--CC66HH33));; 2299SSii--RRMMNN ((CCDDCCII33)):: 88 00..99 ((MMeeSSii)),, 11..77 ((MMeeSSii)),, 11..99 ((MMee22SS//)).. AAnnaall.. CCaallee.. CC114411HH333300NN1122OO33SSÍÍ2211 ((22883322..0000 gg//mmooll)):: CC 5599..8800;; HH 1111..7755;; NN 55..9944;; OObbtt..:: CC 6600..9922;; HH 1100..0033;; NN 55..4444..
Figure imgf000066_0001
El dendrímero de tercera generación con 24 grupos -NH2 terminales, 88, se prepara por un procedimiento similar al descrito para el compuesto 86, partiendo de G3O3H24 (1.00 g, 0.23 mmol), C3H5NH2 (0.62 g, 0.011 mol) y catalizador de Kardsted (3% mol). De esta forma se obtiene G303(NH2)24 como un aceite amarillento (0.48 g, 36 %).
20 H-RMN (CDCI3): .5 -0.11 (¡ s.a., 54 H, MeSi), -0.07 (s, 144 H, Me2Si), 0.52 (m, 222
H, S¡CH2), 1.21-1.50 (m, 186 H, NH2, CH2), 1.74 (m, 6 H, OCH2CH2), 2.63 (t, J = 7.1 Hz, 48 H, CH2N), 3.85 (t, J = 6.3 Hz, 6 H, OCH2), 6.04 (s, 3 H, C6H3); 13C-RMN{1H} (CDCI3): δ -4.9 (MeSi), -3.3 (Me2S¡), 12.8 (CH2CH2CH2N), 14.1 (SiCH2), 17.9-20.6 (CH2), 27.1 (CH2CH2N), 33.4 (OCH2CH2), 45.1 (CH2N), 67.8 (OCH2), 93.7 (C6H3 (CH), 161.0 (i-
25 C6H3). Anal. Cale. C285H678N24O3SÍ45 (5754.44 g/mol): C 59.49; H 11.88; N 5.84; Obt.: C 58.50; H 11.67; N 5.34.
Síntesis de Gi03(COOMe)i? (83).
Método A) Este compuesto se prepara a partir de BrGi(CO2Me)4 (0.55 g, 0.65 mmol),
I , 3,5-(HO)3C6H3 (0.027 g, 0.21 mmol), K2CO3 (0.18 g, 1.30 mmol) y éter corona 18-C-6 30 (0.017 g, 0.06 mmol) siguiendo el procedimiento descrito para la síntesis de GiO3A6, obteniéndose GiO3(CO2Me)i2 como un aceite amarillento (0.36 g, 68 %).
Método B) A partir de GiO3H6 (0.20 g, 0.19 mmol) y CsHsN^^^Me^ (0.28 g, 1.18 mmol), siguiendo el procedimiento descrito para la síntesis de BrGi(CO2Me)4, se
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) obtiene G103(C02Me)i2 como un aceite amarillento después de lavar con hexano (2 x 10 ml_) (0.42 g, 89 %).
Método C) Una disolución de Gi03(NH2)6 (0.25 g, 0.18 mmol) y acrilato de metilo C2H3CO2Me (0.28 g, 3.28 mmol) en CH3OH (5 ml_) se agita a temperatura ambiente durante 16 h. A continuación, la disolución se filtra y se evaporan los volátiles y el aceite restante se lava con hexano (2 x 10 mL) para obtener G-|O3(C02Me)i2, 83, como un aceite amarillento (0.39 g, 90 %).
1H-RMN (CDCI3): δ -0.09 (s, 9 H, MeSi), -0.07 (s, 36 H, Me2Si), 0.40 (m, 12 H, SiCH2), 0.53 (m, 30 H, SiCH2), 1.27 (m, 12 H, CH2), 1.36 (m, 18 H, CH2), 1.75 (m, 6 H, OCH2CH2), 2.39 (m, 12 H, CH2N), 2.41 (t, J = 7.3 Hz, 24 H, CH2N), 2.74 (t, J = 7.3 Hz, 24 H, CH2CO), 3.64 (s, 36 H, OMe), 3.87 (t, J = 6.6 Hz, 6 H, OCH2), 6.03 (s, 3 H, C6H3); 13C-RMN{ H} (CDCI3): 6 -5.1 (MeSi), -3.3 (Me2S¡), 12.8 (SiCH2), 13.9 (SiCH2), 18.4, 18.6 y 20.1 (CH2), 20.5 (OCH2CH2CH2), 21.5 (CH2CH2N, 32.5 (CH2CO), 33.7 (OCH2CH2), 49.2 (CH2N), 51.6 (OMe), 57.5 (CH2N), 67.7 (OCH2), 93.6 (C6H3 (CH), 160.9 (/-C6H3), 173.1 (CO); 29Si-RMN (CDCI3): δ 1.6 (MeS/), 1.9 (Me2S ). Anal. Cale. Ci 7H228 6O27SÍ9 (2403.86 g/mol): C 58.46, H 9.56, N 3.50; Obt.: C 58.09, H 9.13, N 3.02.
Síntesis de G?Q3(COOMe)?4 (84).
La síntesis del compuesto 84, se puede llevar a cabo por procedimientos similares a los descritos para el derivado 83. Por ejemplo, a partir de G2O3H12 (0.35 g, 0.16 mmol) y C3H5N(C2H4CO2Me)2 (0.46 g, 2.00 mmol), siguiendo el procedimiento descrito para la síntesis de BrGi(CO2Me)4, se obtiene G2O3(CO2Me)24 como un aceite amarillento (0.70 g, 88 %).
1H-RMN (CDCI3): δ -0.10 (s, 27 H, MeSi), -0.07 (s, 72 H, Me2S¡), 0.39 (m, 24 H, SiCH2), 0.53 (m, 78 H, SiCH2), 1.30 (m, 66 H, CH2), 1.75 (m, 6 H, OCH2CH2), 2.39 (m, 24 H, CH2N), 2.41 (t, J = 7.3 Hz, 48 H, CH2N), 2.74 (t, J = 7.3 Hz, 48 H, CH2CO), 3.64 (s, 72 H, OMe), 3.87 (t, J = 6.6 Hz, 6 H, OCH2), 6.03 (s, 3 H, C6H3); 13C-RMN{1H} (CDCI3): δ - 5.1 (MeSi), -3.3 (Me2Si), 12.8 (SiCH2), 13.9 (SiCH2), 18.4, 18.8, 19.0 y 20.1 , 20.5, 21.5 (CH2), 32.5 (NCH2), 33.7 (OCH2CH2), 49.2 (CH2CO), 51.2 (OMe), 57.5 (CH2N), 67.7 (OCH2), 93.6 (C6H3 (CH), 160.9 (i-C6H3), 173.1 (CO); 29Si-RMN (CDCI3): § 0.9 (MeS/), 1.7 (MeS/), 1.9 (Me2S/).
Síntesis de GaQ3(COOMek» (85).
La síntesis del compuesto 85, se puede llevar a cabo por procedimientos similares a los descritos para el derivado 83. Por ejemplo, a partir de G3O3H24 (0.32 g, 0.075 mmol) y
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) C3H5N(C2H4C02Me)2 (0.41 g, 1.80 mmol), siguiendo el procedimiento descrito para la síntesis de BrGi(CO2Me)4, se obtiene G303(C02Me)48 como un aceite amarillento (0.63 g, 88 %).
1H-RMN (CDCI3): δ -0.12 (s.a., 54 H, MeSi), -0.07 (s, 144 H, Me2S¡), 0.38 (m, 48 H, SiCH2), 0.52 (m, 174 H, S¡CH2), 1.26 (m, 84 H, CH2), 1.38 (m, 54 H, CH2), 1.75 (m, 6 H, OCH2CH2), 2.45 (m, 144 H, CH2N), 2.74 (s.a., 98 H, CH2CO), 3.63 (s, 144 H, OMe), 3.87 (s.a., 6 H, OCH2), 6.00 (s, 3 H, C6H3); 13C-RMN{1H} (CDCI3): δ -4.8 (MeSi), -3.3 (Me2Si), 12.8 (SiCH2), 14.1 (SiCH2), 18.4-20.5 (CH2), 32.3 (NCH2), 33.6 (OCH2CH2), 49.2 (CH2CO), 51.6 (OMe), 57.4 (CH2N), 67.8 (OCH2), 93.6 (C6H3 (CH), 160.9 (i-C6H3), 172.8 (CO); 29Si-RMN (CDCI3): δ -0.9, 1.8 (MeS/), 1.9 (Me2S/). Anal. Cale. C477H966N24O99Si45 (9886.72 g/mol): C 57.95; H 9.85; N 3.40; Obt.: C 57.09; H 10.10; N 3.63.
Síntesis de G 03(COONa)1? (89).
Una disolución de NaOH (0.048 g, 1.19 mmol) en H2O (1 ml_) se añade a una disolución de GiO3(COOMe)i2 (0.20 g, 0.083 mmol) en MeOH (3 ml_) y se agita la reacción durante 24 h. A continuación se evaporan los disolventes, se extrae con MeOH (5 ml_) y se lleva a sequedad. El residuo se lava con Et2O (2 x 10 ml_) obteniéndose GiO3(COONa)i2, 89, como un sólido blanco (0.17 g, 82 %).
1H-RMN (D2O): δ -0.26 (s, 45 H, MeSi), 0.19 (m, 18 H, SiCH2), 0.32 (m, 24 H, SiCH2), 1.19 (m, 30 H, CH2), 1.45 (m, 6 H, OCH2CH2), 2.07 (m, 36 H, CH2N), 2.47 (m, 24 H, CH2CO), 3.50 (s, 6 H, OCH2), 5.70 (s, 3 H, C6H3); 13C-RMN{1H} (D2O): δ -4.8 (MeSi), - 3.5 (Me2Si), 12.8 (SiCH2), 13.7 (SiCH2), 18.4-20.2 (CH2), 32.9 (OCH2CH2), 34.2 (CH2N), 49.4 (CH2CO), 57.0 (CH2N), 67.1 (OCH2), 93.7 (C6H3 (CH), 160.5 (/-C6H3), 181.1 (CO); 29Si-RMN (D2O): δ 1.6 (MeS/).
Síntesis de G?Q3(COONa)?.i (90).
A partir de G2O3(COOMe)24 (0.35 g, 0.071 mmol) y NaOH (0.046 g, 1.16 mmol), siguiendo el procedimiento descrito para la síntesis de 89, se obtiene G2O3(COONa)24, 90, como un sólido blanco (0.29 g, 82 %).
1H-RMN (D2O): δ -0.21 (s, 99 H, MeSi y Me2Si), 0.22 (m, 30 H, SiCH2), 0.38 (m, 72 H, SiCH2), 1.17 (m, 66 H, CH2), 1.58 (m, 6 H, OCH2CH2), 2.10 (m, 48 H, CH2N), 2.19 (m, 24 H, CH2N), 2.51 (m, 48 H, CH2CO), 3.42 (s, 6 H, OCH2), 5.64 (s, 3 H, C6H3); 13C- RMN{1H} (D2O): δ -4.5 (MeSi), -3.4 (Me Si), 13.0 (SiCH2), 13.7 (SiCH2), 18.4-20.3
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) (CH2), 32.9 (OCH2CH2), 34.3 (NCH2), 49.6 (CH2CO), 57.2 (NCH2), 67.2 (OCH2), 93.8 (C6H3 (CH), 168.4 (i-C6H3), 181.2 (CO); 29Si-RMN (D20): § 1.7 (MeS/ y Me2S/).
Síntesis de G^03(COONa (91).
A partir de G3O3(COOMe)48 (0.30 g, 0.030 mmol) y NaOH (0.069 g, 1.74 mmol), siguiendo el procedimiento descrito para la síntesis de 89, se obtiene G303(COONa)48, 91 , como un sólido blanco (0.24 g, 79 %).
1H-RMN (D20): δ -0.21 (s. a., 207 H, MeSi y Me2Si), 0.20-0.40 (m, 222 H, SiCH2), 1.16 (m, 138 H, CH2), 1.58 (m, 6 H, OCH2Ctf2), 2.09 (m, 144 H, CH2N), 2.49 (m, 96 H, CH2CO), 3.42 (s, 6 H, OCH2), 5.64 (s, 3 H, C6H3); 13C-RMN{1H} (D20): δ -4.5 (MeSi), - 3.4 (Me2S¡), 12.9 (SiCH2), 18.0-21.0 (CH2), 34.2 (NCH2), 49.4 (CH2CO), 57.2 (NCH2), 181.1 (CO), no se observan los átomos de Carbono OCH2CH2CH2CH2 ni C6H3.
Síntesis de GiQ3(SOaNa)i2 (92).
Una ampolla con llave de teflón que contiene GiO3(NH2)6 (0.25 g, 0.18 mmol) y C2H3SO3Na (0.28 g, 2.18 mmol) en una mezcla EtOH/H2O (5 mL/10 mL) se calienta a 120°C durante 72 h. A continuación, se evaporan los volátiles y el residuo se lava primero con MeOH (2 x 10 mL) y Et2O (2 x 15 mL), obteniéndose GiO3(SO3Na)i2, 92, como un sólido blanco (0.30 g, 57%).
1H-RMN (D2O): δ -0.18 (s, 45 H, MeSi), 0.26 (m, 18 H, SiCH2), 0.39 (m, 24 H, SiCH2), 1.19 (m, 18 H, CH2), 1.29 (m, 12 H, CH2), 1.47 (m, 6 H, OCH2CH2), 2.26 (m, 12 H, CH2N), 2.77 (m, 24 H, CH2N), 2.86 (m, 24 H, CH2S), 3.59 (s, 6 H, OCH2), 5.78 (s, 3 H, C6H3); 13C-RMN{1H} (D2O): δ -4.8 (MeSi), -3.5 (Me2Si), 12.7 (SiCH2), 13.7 (SiCH2), 18.4, 19.9 y 20.2 (CH2), 32.7 (OCH2CH2), 47.1 (CH2S), 47.8 (CH2N), 57.1 (CH2N), 67.2 (OCH2), 93.7 (C6H3 (CH), 160.6 (/-C6H3); 29Si-RMN (D2O): δ 1.9 (MeSi).
Síntesis de G?03(SO^Na)?¿ (93).
A partir de G2O3(NH2)12 (0.20 g, 0.071 mmol) y C2H3SO3Na (0.13 g, 0.97 mmol), siguiendo el procedimiento descrito para la síntesis de 92, se obtiene G2O3(SO3Na)24, 93, como un sólido blanco (0.25 g, 60 %).
1H-RMN (D2O): δ -0.18 (s, 99 H, MeSi y Me2Si), 0.26 (m, 30 H, SiCH2), 0.41 (m, 72 H, S¡CH2), 1.25 (m, 66 H, CH2), 1.60 (m, 6 H, OCH2CH2), 2.27 (m, 24 H, CH2N), 2.75 (m, 48 H, CH2N), 2.86 (m, 48 ,H, CH2S), 3.45 (s, 6 H, OCH2), 5.78 (s, 3 H, C6H3); 13C- RMN{1H} (D2O): δ -4.6 (MeSi), -3.4 (Me2Si), 12.7 (SiCH2), 13.7 (SiCH2), 18.5-20.5 (CH2), 33.0 (OCH2CH2), 47.0 (NCH2), 47.9 (CH2S), 57.2 (NCH2), 66.8 (OCH2), 93.6 (C6H3 (CH), 160.6 (i-C6H3); 29Si-RMN (D2O): δ 1.9 (MeS/ y Me2S/).
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) Síntesis de G,03(SO,Na (94).
Á partir de G303(NH2)24 (0.20 g, 0.035 mmol) y C2H3SO3Na (0.12 g, 0.92 mmol), siguiendo el procedimiento descrito para la síntesis de 92, se obtiene G303(S03Na)48, 94, como un sólido blanco (0.26 g, 63 %).
1H-RMN (D20): δ -0.13 (s. a., 207 H, MeSi y Me2Si), 0.41 (s. a., 222 H, SiCH2), 1.15- 1.60 (s. a., 144 H, CH2), 2.40 (s. a., 48 H, CH2N), 2.90 (s. a., 192 H, CH2N y CH2S), no se observan las señales correspondientes a OCH2 y CeH3); 3C-RMN{1H} (D2O): δ -4.4 (MeSi), -3.3 (Me2S¡), 12.5 (SiCH2), 18.0-21.0 (CH2), 46.7 (NCH2), 48.5 (CH2S), 57.2 (NCH2), no se observan los átomos de Carbono OCH2CH2CH2CH2 ni C6H3.
EJEMPLO 3: ACTIVIDAD BIOLOGICA DE LOS DENDRIMEROS DE LA INVENCION A continuación se muestra una evaluación de la citotoxicidad, mitogenicidad y efecto microbicida/microestático de los nuevos dendrímeros aniónicos sintetizados según la presente invención en distintas líneas celulares (vaginales y linfoides), en diferentes poblaciones fisiológicas (células mononucleares de sangre periférica, hematíes. macrófagos y células dendríticas) y en cultivos bacterianos.
Materiales y métodos
1. CÉLULAS
Human Endometrial Carcinoma cells (HEC-1A): línea celular endometrial humana, derivada de un adenocarcinoma humano de endometrio. Se obtuvieron del American Type Culture Collection (ATCC). Las HEC-1A se cultivaron en medio completo [RPMI 1640 (Gibco) suplementado con 10% de Suero Fetal de Ternera (SFT), 2mM L- glutamina y antibióticos (1 % cloxaciclina, 1 % ampicilina y 0.32% gentamicina)] en placas de 24 o 96 pocilios o placas transweil de 12 pocilios con soporte permeable de policarbonato de 0.4 pm de poro (Costar, Cambridge, MA), en condiciones de cultivo (37°C en una atmósfera de 5% C02 y 95% de humedad relativa).
Células Mononucleares de Sangre Periférica (CMSP): La sangre se obtuvo de buffy coats procedentes de donantes sanos del Centro de Transfusiones de Madrid. Dicha sangre se diluye ½ con solución salina tamponada con fosfato 6.7 mM (PBS, Bio- Whittaker®) y se procede a su centrifugación en gradiente de densidad (Ficoll- Isopaque®). Tras dicha centrifugación se recupera el halo que contiene las CMSP y se procede a dos ciclos de lavado-centrifugado posteriores con PBS (10 minutos a 1500 r.p.m.). Las CMSP resultantes se resuspenden en medio de completo y en condiciones de cultivo.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) MT-2: Línea celular de leucemia de células T con ADN de HTLV-1 integrado. Se obtuvieron del American Type Culture Collection (ATCC). Se cultivaron en medio completo en diferentes formatos de placa (6, 24 o 96 pocilios) y en condiciones de cultivo.
Células Dendríticas (CD): Se realizó una separación de CMSP por gradiente de densidad como se ha descrito anteriormente. Los monocitos se obtuvieron por separación inmunomagnética con anticuerpos monoclonales anti-humano CD14 (MicroBeads) mediante separación en columnas (MACS®, Miltenyi Biotec, Alemania). Los monocitos purificados se resuspendieron en medio completo en placa de fondo plano de 6 pocilios a una concentración de 2*106 células/pocilio en un volumen final de
3 mL. Se cultivaron con 50 ng/ml rh GM-CSF y 20 ng/ml rh IL-4 (ImmunoTools, Alemania), en condiciones de cultivo. Se añadió medio fresco completo con 50 ng/ml rh GM-CSF y 20 ng/ml rh IL-4 a los 3 días a las células inmaduras (CDi). Se maduraron las células a los 6 días con 20 ng/ml LPS (Sigma) durante 2 días (CDm). Los marcadores de CDi y CDm se analizaron mediante un citómetro Beckman-Coulter® de
4 colores y se utilizó el software EPICs® de Beckman-Coulter®.
Macrófagos: Se realizó una separación de CMSP por gradiente de densidad y una separación inmunomagnética con anticuerpos monoclonales anti-humano CD14 (MicroBeads) como se describe anteriormente. Los monocitos purificados se resuspendieron en medio RPMI 1640 (Gibco) suplementado con 10% de suero humano AB, 2mM L-glutamina y antibióticos (1% cloxaciclina, 1% ampicilina y 0.32% gentamicina) en placa de fondo plano de 6 pocilios a una concentración de 2*106 células/pocilio en un volumen final de 3 mL. Se cultivaron con 50 ng/ml rh M-CSF y se añadió medio fresco con 50 ng/ml rh M-CSF a los 3 días. A los 7 días, los marcadores de macrófagos se analizaron mediante un citómetro Beckman-Coulter® de 4 colores y se utilizó el software EPICs® de Beckman-Coulter®.
Línea celular T Jurkat clon E6 (ATCC; línea celular de línfocitos T) se creció de forma rutinaria en RPMI 1640 (Biochrom KG Seromed, Berlín, Alemania) suplementado con 5% suero fetal de ternera (FCS) inactivado por calor, 1% penicilina/streptomicina, y 2mM L-glutamina (ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA-U.S.A.) a 37°C en una atmósfera de 5% CO2.
2. DENDRÍMEROS
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) La síntesis de los dendrímeros carbosilano con terminaciones sulfonato (G1SF8, G2SF16 y G3SF32) y carboxilato (G1C008, G2C0016, G3C0032) fué la descrita en el apartado anterior (ver páginas 15 a 19). Además de los dendrímeros G2CKCO016 y G2CKP32 (ver páginas 21 a 23).
Los dendrímeros G1SF8, G2SF16, G3SF32 se corresponden con los dendrímeros G0- [Si(CH2)3N(CH2CH2S03Na)2]4 n = 0 y x = 4 (18); G1-[S¡(CH2)3N(CH2CH2S03Na)2]8 n =1 y x = 8 (19); G2-[Si(CH2)3N(CH2CH2S03Na)2]i6 n =2 y x = 16 (20), respectivamente, cuya síntesis y caracterización ha sido descrito en los apartados anteriores. De la misma forma, los dendrímeros G1C008, G2C0016 y G3CO032 se corresponden con los dendrímeros G0-[Si(CH2)3N(CH2CH2COONa)2]4 n =0 y x = 4 (10); G1- [S¡(CH2)3N(CH2CH2COONa)2]8 n =1 y x = 8 (11); G2-[Si(CH2)3N(CH2CH2COONa)2]i6 n =2 y x = 16 (12), respectivamente. Del mismo modo los dendrímeros G2CKCOO16 y G2CKP32, se corresponden con los compuestos c/ -G1- [Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2CH2COONa)2]8 (43) y c/ -G1-
[Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2PO(OMe)2)2]8 (51), respectivamente.
La síntesis de los dendrímeros carbosilano con terminaciones sulfonato (G103SF12, G2O3SF24 y G203SF48) fué la descrita en el apartado anterior. Estos dendrímeros G103SF12, G2O3SF24 y G203SF48 corresponden a GiO3(S03Na)12 (92), G203(S03Na)24 (93) y G303(S03Na)48 (94) que poseen 12, 24 y 48 grupos sulfonato terminales.
Esta nueva nomenclatura para esta parte de la presente invención se ha adoptado para simplificar la representación de estos dendrímeros en su estudio biomédico y así facilitar el seguimiento de esta discusión de resultados.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26)
Figure imgf000073_0001
G1O3SF12
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26)
Figure imgf000074_0001
G203SF24
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26)
Figure imgf000075_0001
G203SF48
3. EVALUACIÓN DE LA TOXICIDAD
Se utilizaron distintas técnicas con el fin de evaluar la viabilidad en diferentes aspectos: integridad de membrana (tinciones con azul tripán y ensayo de LDH), actividad mitocondrial (reactivo MTT) y proliferación celular (incorporación de BrdU). Estas técnicas se aplicaron para el estudio de la toxicidad ie las generaciones de dendrímeros en HEC-1A y en CMSP humanas. Adicionalmente, se ha estudiado la toxicidad de los dendrímeros en hematíes humanos mediante un ensayo para evaluar la presencia de hemaglutinación y hemolisis.
3.1 Tinciones con azul tripán
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) Se preparó una solución con azul tripán (Sigma®) al 0,8%. Las células tratadas con los dend rimeros se centrifugaron y se decantó el sobrenadante; tras resuspender el sedimento celular, se trató con la solución de azul tripán durante 30 segundos, procediéndose a centrifugación-lavado posteriormente con PBS dos veces. Las células se observaron bajo microscopía óptica y se contaron las positivas para la presencia de azul tripán (células azules, muertas) en relación con el porcentaje de células negativas (células vivas). Para ello se seleccionó un campo amplio con al menos 100 células cada vez.
3.2 Ensayo MTT
Esta técnica se utilizó para evidenciar efectos deletéreos sobre el metabolismo celular. Se trata de un ensayo colorimétrico basado en la capacidad selectiva de las células viables para reducir el bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio (MTT, Sigma®) en cristales insolubles de formazán. Tras el tiempo deseado de incubación de las distintas poblaciones celulares con diferentes concentraciones de dendrímeros en placa de 96 pocilios (100.000 células/pocilio respectivamente), y con 3 pocilios como control positivo de inactividad celular [20% de dimetil sulfóxido (DMSO, Sigma®)], el sobrenadante que contenía dendrímero se retiró y se sustituyó por 200 μί de un medio de cultivo sin suero ni rojo fenol (Opti-MEM®). Además de los 200 μί de Opti-MEM®, se añadieron 20 μί de MTT filtrado previamente para conseguir su esterilidad (Azul de Tiazolil, Sigma®) en PBS a una concentración de 5 mg/mL (concentración final en pocilio de 0,5 mg MTT/mL). Después de 4 horas de incubación en condiciones de cultivo, se procedió a la centrifugación de la placa a 2000 r.p.m. 10 minutos y a la posterior retirada del sobrenadante con el exceso MTT que no reaccionó. Los cristales de formazán se observaron al microscopio de contraste de fase y se disolvieron posteriormente con 200 μί de DMSO. La placa se agitó a 700 r.p.m. en un agitador Eppendorf ® para asegurar la correcta disolución de dichos cristales. La concentración de formazán se determinó por espectrofotometría utilizando un lector de placas a una longitud de onda de 570 nm con una referencia de 690 nm. El espectrofotómetro se calibró a 0 utilizando Opti-MEM® sin células. La viabilidad celular relativa (%) respecto del control (células sin tratar) se calculó en base a la fórmula: [A] test / [A] control x 100. Cada concentración de dendrímero se ensayó por triplicado, siguiendo las directivas del ATCC.
3.3. Ensayo de LDH ,
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) Esta técnica (CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay) se utilizó para evaluar el daño en la superficie de la membrana celular debido a la presencia de los distintos grupos periféricos aniónicos de los dendrímeros. La lactato deshidrogenasa (LDH) es una enzima que se libera en el citoplasma debido a la lisis celular. El ensayo de LDH, por lo tanto, es una medida de la integridad de la membrana, que se basa en la oxidación de LDH a piruvato y la reducción de sales de tetrazolio a cristales de formazán por el piruvato. Se dispensaron en placa de 96 pocilios de fondo redondo 1*105 células/pocilio en un volumen de 100 μί de medio completo y se añadió el dendrímero en un volumen de 100 μί, para obtener un volumen final en el pocilio de 200 μL· Controles: 1. 200 μί de medio completo sin células (background control); 2. 100 μ- de células + 100 μί de medio completo; 3. 100 μί de células + 100 μί de tritón X-100 al 0,2%; 4. 100 μΙ_ de células + 100 μΐ_ con el dendrímero a la concentración deseada. Se incubaron en condiciones de cultivo durante las primeras 24hs. Se centrifugó la placa a 1500 r.p.m. 10 minutos y se retiraron 100 μΐ_ de sobrenadante, con cuidado de no llevarse las células. Se añadió 100 μί de mezcla de reacción preparada en el momento sobre los 100 μΙ_ de sobrenadante y se incubó a temperatura ambiente 30 minutos y en oscuridad. Finalmente, se midió a 490 nm y 690 nm de referencia. La citotoxicidad se obtuvo de la siguiente fórmula: Citotoxicidad(%) = (4 - 2)/(3-2) * 100 3.4 Ensayo de hemolisis
Los hematíes se obtuvieron tras ser separados de las CMSP mediante el mismo gradiente de Ficoll detallado anteriormente. Los mismos se diluyeron adecuadamente en PBS hasta poder ser visualizados de forma individualizada. Después se resuspendieron en 500 pL de PBS y se cultivaron en placa de 24 pocilios (300.000/ pocilio). Como control positivo se utilizaron células tratadas con Tritón X-100 al 0,2%. Control negativo: células tratadas solo con PBS. Los hematíes se incubaron con distintas concentraciones de dendrímero. Se evaluó la presencia de hemaglutinación, número de células y liberación de hemoglobina a la hora mediante la recogida de 100 pL de sobrenadante y medición de absorbancias por espectrofotometría utilizando un lector de placas a una longitud de onda de 550 nm y 690 nm como referencia.
4. ENSAYO LINFOPROLIFERATIVO
Para evaluar la capacidad antigénica de los dendrímeros, se realizó un ensayo de proliferación celular. Se preparó el experimento por triplicado en placa de 96 pocilios de fondo plano (100.000 células por pocilio en 200 pL de medio completo). El experimento
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) incluye un control negativo de proliferación (células sin tratar), pocilios tratados con distintas concentraciones de dendrímero y otro control positivo de proliferación tratado con 2 pg/mL de fitohemaglutinina (PHA). Tras 4 días de incubación en condiciones de cultivo, se procedió a la retirada del sobrenadante y a la preparación de las muestras para el Kit de proliferación celular de BrdU (Bromodeoxyuridine Cell Proliferation Assay, Chemicon International). Se realizó el protocolo indicado por el kit y se obtuvo la incorporación de BrdU en ADN de nueva síntesis. A mayor incorporación de BrdU, mayor proliferación celular.
5. ENSAYOS DE INHIBICIÓN DEL VIH
5.1 Preparación de la cepa X4 VI H-1 NL4-3
El aislado viral X4 VIH-l NL -3 es una cepa viral de laboratorio establecida y se utilizaron células MT-2 para la expansión del virus. Se lavaron 2x106 MT-2 dos veces con medio completo y se transfirieron a un tubo cónico de 15 mL a una concentración de 2x106 células/mL en medio completo. Posteriormente, se añadió VIH-1NL4-3 a una concentración de 1 partículá por célula o lo que es lo mismo, 1 M.O.I. (Multiplicity Of Infection). Se cultivaron las MT-2 con el virus durante 2 horas en condiciones de cultivo, agitando el cultivo cada 15-30 minutos. Finalmente se lavaron los cultivos (células- virus) dos veces para retirar el virus no integrado en el genoma celular. Las células se transfirieron a un pocilio de p6 en un volumen de 3-4 mL. Se dejó en cultivo durante 2-3 días y se observó la presencia de sincitios en el pocilio. Cuando la presencia de sincitios alcanzó un 80-90% de producción, se añadieron 12 mL de medio completo con 20*106 MT-2 y se dispensaron en placa petri. A los 2-3 días, se centrifugó todo el volumen y se recogió el sobrenadante. Se añadieron 12 mL de medio completo con 20*106 MT-2 a las células anteriores (MT-2 infectadas) y se dispensaron en placa petri. Se repitió este proceso hasta 3 veces. El sobrenadante se alicuotó y se almacenó en un tanque de nitrógeno líquido, para posteriormente ser titulado.
5.2. Preparación de la cepa R5 VIH-1 Ba-L
El aislado viral R5 VIH-l ea-L es una cepa de laboratorio establecida y el proceso de expansión del virus se realizó de forma similar al VIH-1NL4-3, pero se utilizó en este caso CMSP estimuladas como se indica más adelante en el apartado 3. 8. 5. El sobrenadante se alicuotó y se almacenó en un tanque de nitrógeno líquido, para posteriormente ser titulado.
5.3. Titulación de los virus
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) El aislado viral VIH-1NL4-3 y VIH-2CBL23 se tituló en la línea celular MT-2. Se cultivaron 2x104 células MT-2 con medio completo en placas de 96 pocilios y se añadieron 40 pide la preparación viral a distintas concentraciones, para lo que se realizaron las correspondientes diluciones. Se dispusieron las diluciones por octuplicado y se mantuvieron en condiciones de cultivo durante una semana. Transcurrido este tiempo se procedió a la lectura de la titulación por visualización del efecto citopático. El título se calculó aplicando la fórmula de Spearman-Karber. También se tituló mediante cuantificación de proteína p24 por un inmunoensayo enzimático (ELISA p24. INNOTEST™ HIV antigen mAB, Innogenetics®) y se establece la relación partículas infectivas por ml_ y pg de virus por mL.EI aislado viral VIH-1BA-L se tituló mediante cuantificación de proteína p24 por ELISA. Para asegurar la pureza del virus, las alícuotas descongeladas se filtraron a través de filtros de 0.22 pm antes de la cuantificación.
5.4. Infección in vitro de las diferentes poblaciones celulares
Las CMSP se estimularon durante 48 horas con 2 pg/mL de PHA y 50 Ul de IL-2, para provocar una activación policlonal; a las 48 horas se lavan las células con PBS. La concentración deseada de células se incubó con el número de partículas de VIH deseado en medio completo durante 2 horas en condiciones de cultivo. Tras este tiempo se recogieron las células del cultivo y se lavaron tres veces con PBS para eliminar el virus no integrado en el genoma celular, tras lo cual se depositaron en placa de 24 pocilios o 96 pocilios (dependiendo del ensayo) en medio completo con 50 UI/mL de IL-2. MT-2, HEC-1A, CDi, CDm y macrófagos se recogieron el día del experimento y se lavaron 2 veces con PBS antes de ser infectadas con el VIH durante 2 o 3 horas, según el experimento.
5.5. Ensayos de adhesión/internalización
Para estos ensayos se utilizaron HEC-1A confluyentes en placas de 24 pocilios. Se procedió al cultivo de 3*105 células en 500 pL de medio completo por pocilio y se cultivaron durante 3 días. En los ensayos de adhesión, se pre-trataron las células con los dendrímeros 2h, 1h y 30 minutos antes de la infección con el VIH-1N -3- Una vez cumplido el tiempo estimado, se procedió a infectar con el VIH-1NL.4-3 cada pocilio durante 3 horas. Tras este tiempo, se procedió a lavar 3 veces la monocapa con PBS y se dejó en condiciones de, cultivo. A las 24h y 72h, se recogió sobrenadante para cuantificar antígeno p24 por ELISA. Para el ensayo de internalización, el procedimiento
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) inicial fue el indicado anteriormente. Tras las 3 horas de infección, se lavó 3 veces la monocapa con PBS y se procedió a la lisis celular mediante la adición de Tritón x-100 .0,2% durante 45 minutes a 37°C. El sobrenadante se recogió para cuantificar antígeno p24 por ELISA.
5.6. Estudio del mecanismo de acción del DEC-
Se utilizó para este experimento una placa de 96 pocilios de fondo plano con Poli-L- Lisina (PLL, Sigma®) recubriendo el fondo del pocilio. Para ello, 50 uL de PLL se incubaron a 37°C durante una hora. Tras lavar los pocilios 3 veces con PBS, se incubaron 4 ng de VIH toda la noche a 4°C, para asegurar que las partículas virales se adhirieron al fondo del pocilio. Se lavó cada pocilio 3 veces con PBS para retirar el VIH no adherido a la placa y se procedió al tratamiento de cada pocilio con distintas concentraciones de dendrímero durante una hora. Tras este tiempo, se lavó 3 veces con PBS y se añadieron CMSP previamente estimuladas. El sobrenadante de este cultivo se recogió a los 4 días y se cuantificó antígeno p24 por ELISA para evaluar la cantidad de VIH producida por las CMSP en los distintos tratamientos. Se utilizó como control positivo de lisis de las partículas virales Tritón x-100 al 1%.
5.7. Monocapa de HEC-1A
Para obtener un perfecta monocapa de células epiteliales polarizadas, las HEC-1A se crecieron en medio completo sobre un soporte de policarbonato permeable de 0.4 μητι de poro (Costar, Cambridge, MA). Se procedió al cultivo de 2*105 células por pocilio y se cultivaron durante 7 días, con cambios de medio cada 2-3 días. El dendrímero se añadió una hora antes de la infección. Después de añadir las partículas virales a la zona apical de la monocapa (100ng), se recogió el sobrenadante de la cámara de la zona basolateral a las 24/48 horas. La concentración viral se cuantificó por ELISA.
5.8. Pre- tratamiento de CMSP
Se utilizaron CMSP estimuladas dispensadas en 2*105 células en 200 pL de medio completo en pocilios de placa p96 de fondo redondo. Para el experimento de pretratamiento, se trató con el dendrímero 1 hora antes de la infección a 50 ng de VIH- 1NL4-3 y se infectó durante 3 horas en condiciones de cultivo. Tras este tiempo, se lavó dos veces con PBS y se incubó en condiciones de cultivo. La concentración viral a los 3 días se cuantificó por ELISA de p24.
5.9. Pre-tratamiento en CDi, CDm y macrófagos
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) Una vez diferenciadas las células, se lavaron con PBS dos veces y se dispensaron 2*105 CDi, 2*105 CDm y 105 macrófagos en 200 μΐ_ de medio completo en pocilios de p96 de fondo. El dendrímero se añadió una hora antes de la infección. Después de añadir las partículas virales (50 ng), se incubó en condiciones de cultivo y a las 3 horas, se retiró el sobrenadante y se lavó 4 veces con PBS. Se recogió sobrenadante a los 4 días. La concentración viral se cuantificó por ELISA.
6. EFECTO BACTERICIDA/BACTERIOSTÁTICO DE LOS DENDRÍMEROS CARBOSILANO
Staphylococcus aureus. Cepa y condiciones de cultivo
Se utilizó la cepa FDA209 (ATCC 6538) para estudiar la capacidad de los dendrímeros como bactericidas. Las bacterias se crecieron en placas de Mueller Hinton agar (Sigma™) durante toda la noche a 37°C antes de cada experimento.
Experimento de biomasa: El día del ensayo, una colonia de S. aureus se crecía en 15 mL de medio Mueller Hinton durante 5h. Tras este tiempo, se contaba el número de S. aureus y se dispensaban 105 S. aureus por punto (100 pL de medio Mueller Hinton en placa de 96 pocilios de fondo en U). Se añadieron diluciones seriadas de los dendrímeros evaluados hasta completar un volumen de 200 pL por punto. Se utiliza ampicilina (Gobemicina®, Laboratorios Normon) como control positivo de bactericida. La cantidad de biomasa formada 24h después del tratamiento con el dendrímero, se cuantificó espectrofotométricamente con un lector de placas (Biowhittakermicroplate reader 2001 , Innogenetics®. A=550nm).
Experimento de proliferación: Para evaluar la proliferación de S. aureus en presencia del dendrímero, se utilizó el kit de proliferación celular 24h después del tratamiento (Bromodeoxyuridine Cell Proliferation Assay, Chemicon International. Lectura en Biowhittakermicroplate reader 2001 , Innogenetics®. λ=450 y referencia A=550nm). El número de células, tratamiento con los dendrímeros y tiempo de exposición se describen en el experimento de biomasa.
Candida albicans. Cepa y condiciones de cultivo
Se utilizó el aislado clínico SC5314 (ATCC MYA-2876) para estudiar la capacidad de los dendrímeros como fungicidas. Las levaduras se crecieron en placas de YED agar (1 % D-glucosa, 1 % Difco extracto de levadura (BD Diagnostic Systems, USA) y 2% agar) durante toda la noche a 30° C antes de cada experimento.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) Experimento de biomasa: El día del ensayo, una colonia aislada de levadura se creció en 15ml_ de medio YED agar durante 5h. Tras este tiempo, se contó el número de C.albicans y se dispensó 105 Cándidas por punto (100 uL de medio YED agar en placa de 96 pocilios de fondo en U). Se añadieron diluciones seriadas de los dendrímeros evaluados hasta completar un volumen de 200 uL por punto. Se utilizó anfotericina B (Duchefa Biochemie) como control positivo de fungicida. La cantidad de biomasa formada 24h después del tratamiento con el dendrímero, se cuantificó espectrofotométricamente con un lector de placas (Biowhittakermicroplate reader 2001 , Innogenetics ®. A=550nm).
Experimento de proliferación: Para evaluar la proliferación de C.albicans en presencia del dendrímero, se utilizó el kit de proliferación celular 3h antes de cumplir las 24h de tratamiento (Bromodeoxyuridine Cell Proliferation Assay, Chemicon International. Lectura en Biowhittakermicroplate reader 2001 , Innogenetics®. λ=450 y referencia A=550nm), evaluándose de esta forma la incorporación de BrdU al ADN de nueva síntesis. El número de células, tratamiento con los dendrímeros y tiempo de exposición se describen en el experimento de biomasa.
7. EFECTO ANTIINFLAMATORIO DE LOS DENDRÍMEROS CARBOSILANO Experimentos de inflamación: Para los experimentos se realizaron transfección transitoria utilizando los plásmidos indicadores pTNF-luc y pNF-KB-luc que contiene 3 copias en tándem del sitio NF-κΒ del promotor de la conalbúmina. La línea celular Jurkat fue nucleofectadas con el nucleofector de AMAXA siguiendo el protocolo de la casa comercial "cell line nucleofector kit V" y el programa específico utilizado en el X- 005. Las células transfectadas se estimularon durante 16 horas con los diferentes estímulos que aparecen en las gráficas (TNF-alpha, anticuerpo monoclonal anti-TNF- alpha y diferentes concentraciones (5 y 10 micromolar) del dendrímero aniónico sufonato. Tras los diferentes tratamientos, las células transfectadas se recogieron por centrifugación y se lisaron con tampón de lisis comercial "Dual-luciferase Assay System Kit" (Promega), según las recomendaciones del fabricante. Se midió la cantidad de proteína en 5 microlitros de lisado celular por el método de BSA-BCA (Pierce, Rockford, USA). Una vez cuantificadb, se normalizaron los valores de proteína de todas las muestras a 20 microgramos para medir durante 10 segundos la actividad luciferasa en un luminómetro 1450 Microbeta Luminiscence Counter (Walax, Trilux). Los valores de
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) actividad de luciferasa de luciérnaga se expresan como inducción respecto a las células control.
7.1 Experimento de transfección con TNF-alpha (citocina proinflamatoria) Las céulas Jurkat clon E6 transfectadas con el pTNF-alpha fueron tratadas con un anticuerpo monoclonal anti-TNF como control positivo de la inhibición de la actividad transcripcional del TNF. Como se puede observar el dendrímero sulfonato fue capaz de disminuir la actividad promotora del plásmido pTNF-luc a las dosis de 5 y 10 micromolar (en una medida dos y tres veces inferior con respecto al control de células sin estimular en una serie de tres experimentos independientes). El dendrímero aniónico disminuye la actividad transcripcional del TNF-alpha.
7.2 Experimento de transfección con el plámido pNF-kB-luc. Las células Jurkat se transfectaron con el plámido pNF-kB-luc, se cultivaron en presencia de sulfonato (10 micromolar) durante 16 horas y se midió la actividad luciferasa. Se utilizó TNF (20 ng/ml) como control positivo. En el experimento claramente se observa una disminución de la actividad del plásmido pNF-kB-luc en presencia del sulfonato, similar a la obtenida cuando las células se tratan con 10 microgramos mililitro de un aniticuerpo anti-TNF- alpha. Además, cuando se tratan las células con sulfonato+TNF-alpha se observa una reversión de la inducción de NF-kB-luc. Los resultados presentados están expresados como índice de inducción normalizado con los valores control de células sin tratamiento y es un experimento representativo de tres experimentos independientes
Resultados con los dendrímeros de núcleo de silicio
Evaluación de la citotoxicidad de los dendrímeros
Para realizar una completa caracterización de las tres generaciones de cada nuevo dendrímero sintetizado, se elaboró un sistema de screening para determinar las concentraciones biocompatibles que requerían un estudio más detallado. Antes de nada, se establecieron los límites de solubilidad de los dendrímeros de cada generación en agua. Se disolvieron los dendrímeros a concentraciones de 3mM, 2mM y 1mM, siendo esta última la que mejor solubilidad presentaba sin la ayuda de factores físicos adicionales para su perfecta solubilización (vortex, calor, etc). Una vez asentada la concentración de partida en todos los dendrímeros testados, se procedió a evaluar su citotoxicidad en las células diana de nuestro estudio, las células epiteliales vaginales (HEC-1A) y las CMSP. A concentraciones crecientes de dendrímero y se contó el porcentaje de células muertas a las 24 hs mediante la técnica de azul tripán.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) Las células mostraron tinción azul superior al control a partir de 20 μΜ de dendrímero, por lo que se decidió centrar los estudios de viabilidad en una concentración determinada, 10 μΜ. Para evaluar el daño a la membrana celular que pueden causar las cargas aniónicas de la periferia (formando poros debido a interacción con diversos receptores celulares o por interacción electrostática con zonas positivas de la membrana), se realizó ensayos de liberación de lactato deshidrogenasa al sobrenadante. Estos estudios se complementaron con ensayos de actividad celular de la mitocondria, donde la reducción de sales de tetrazolio a cristales de formazan es un reflejo indirecto del correcto metabolismo de las células. Véase la FIG. 1 , donde se evaluaron inicialmente las 3 generaciones de los dos tipos de dendrímeros con núcleo de silicio, obteniendo unos niveles aceptables de biocompatibilidad y siempre dentro de los márgenes de aceptabilidad indicados para ambos ensayos (no más del 10% de LDH en sobrenadante y no más de una disminución del 20% en la actividad celular). Este experimento se llevó a cabo en las células donde los dendrímeros se expondrán más tiempo, en las células epiteliales del endometrio de la vagina (HEC-1A). Se puede establecer una buena viabilidad de la membrana celular a tiempos cortos por el ensayo de LDH, ya que ningún dendrímero produce una liberación de LDH superior al 10% tras una hora de contacto con las células. El suramin, una molécula formada por 6 grupos acido naftaleno disulfónico y un grupo central de urea, no muestra toxicidad pese a su alta concentración. A las 24 horas de tratamiento, el control de células tratadas con una molécula inerte como el dextrano (Dx), mostró cerca de un 10% de concentración de LDH en el sobrenadante respecto al control. El dextrano con grupos sulfonato en la periferia (DxS) mostró similar toxicidad. De esta manera, un 10% de LDH se consideró aceptable a las 24 horas debido a que la presencia de una molécula externa per se, parece estar ocasionando una ligera perturbación en las células con una membrana celular menos íntegra. Se obtuvo similar resultado con los dendrímeros carboxilato y sulfonato, aunque se observó que la segunda y tercera generación de carboxilato no mostró valores significativos de LDH.
La viabilidad celular se estableció paralelamente cuantificando la reducción de sales de tetrazolio (MTT) por la mitocondria de las HEC-1A tratadas 24h con los dendrímeros. Se obtuvieron niveles de producción de cristales de formazán por encima de un 80% y se determinó que la concentración de dendrímero de 10 μΜ es biocompatible con el metabolismo celular de las HEC-1A.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) Para ampliar este estudio, se diseñó un experimento para evaluar el daño celular que estos dendrímeros pudieran ocasionar en un modelo terapéutico de tratamiento de la infección, además de la posibilidad de impedir la infección de las CMSP (linfocitos TCD4+) que se encuentran entre la monocapa múltiple estratifica del epitelio vaginal y bajo la misma.
Para reproducir la toxicidad en una línea más fisiológica, se evaluó la toxicidad en CMSP. La viabilidad en este caso se reduce en todos los casos y se hace más visible el punto de inflexión a partir de 10 μΜ. Véase la FIG. 2.
Se observó una buena integridad de la membrana a las 24 horas con respecto al control. Otros factores pueden modificar ia lectura por espectrofotometría, y se aceptó ese ligero aumento de la viabilidad debido a la presencia del dendrímero. El control positivo de liberación de LDH, el Tx-100 al 0.2%, funcionó en ambos experimentos y representó el 0% de viabilidad frente al control. La toxicidad se presentó a partir de 10 μΜ, excepto para el dendrímero con terminación carboxilato. La actividad mitocondrial se mostró estable a la cohcentración de 10 μΜ. El bajo daño que produce a la membrana de células fisiológicas como las CMSP, unido a la óptima actividad mitocondrial de las células en presencia de una concentración de 10 μΜ, determinó que el G2SF16 se seleccionara para poner a punto los ensayos de inhibición de la adherencia virus-célula, internalización e infección del VIH en células epiteliales y CMSP. Para ver el daño que este dendrímero produce en los eritrocitos a la concentración de uso, se enfrentaron los eritrocitos a distintas concentraciones de dendrímero.
Se observó un 100% de hemolisis en el control de hematíes tratados con Tritón X-100 0.2% (las células estaban todas muertas y rotas) y un 5% de hemolisis en el control negativo de células tratadas sólo con PBS. Cada pocilio se expresa como el porcentaje respecto a la D.O (densidad óptica) del Tritón X-100 al 0.2%, que se considera el 100%; además a ese porcentaje se le resta el 5% de hemólisis del control negativo de células no tratadas, encontrándose una buena biocompatibilidad a 10 μΜ, además de una carencia de hemaglutinación al microscopio óptico. Véase la FIG. 3
Linfoproliferativo
Es muy importante cuando se quiere conocer el perfil de biocompatibilidad de una nueva molécula, el saber si la misma puede constituir un estímulo antigénico inespecífico. Esto sería un inconveniente, por cuanto las células del sistema inmune
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) podrían reconocer a dicha molécula como un elemento extraño contra el cual se desencadenaría una respuesta que muy probablemente resultaría deletérea para el organismo. Por ello, se realizó un estudio de proliferación linfocitaria en presencia de los distintos dendrímeros, con el fin de comparar la capacidad de estimulación linfocitaria que tendrían los« mismos en contraste con un estímulo mitogénico clásico como es la fitohematoglutinina (PHA). Las CMSP se cultivaron en p96, y se trataron con los diferentes estímulos durante 4 días. Se utilizó la concentración de dendrímero de 10 μΜ, seleccionada para todos los experimentos de infección con el VIH. Los resultados se expresan en porcentaje de BrdU incorporada en las células que han proliferado frente al control. En la FIG. 4A, se aprecia un aumento de la incorporación de BrdU en el nuevo ADN sintetizado por las células en división, debido a la presencia de PHA. El dendrímero solo a la concentración de 10 μΜ carece de efecto mitogénico en las CMSP. El tratamiento con dendrímero a la vez que PHA, disminuye ligeramente el efecto mitogénico. Para comprobar si el dendrímero G2SF16 retrasa la proliferación celular en presencia de un mitógeno, en la FIG. 4B se utilizaron CMSP estimuladas previamente 3 días con PHA. Al cuarto día se trataron las células con igual cantidad de PHA, PHA más G2SF16 y G2SF16 solo, encontrándose una disminución de la incorporación de BrdU tras ,4 días de tratamiento. Esto indica que el dendrímero está inhibiendo el estímulo mitogénico, un dato interesante en el estudio de la inflamación a nivel local en el momento de administrar este tipo de dendrímero ¡n vivo. Véase la FIG. 4.
Ensayos de adhesión/internalización
Los dendrímeros que iban a ser expuestos sobre la monocapa de células epiteliales habían demostrado no ser tóxicos ni mitogénicos a la concentración de 10 μΜ. Para su posible uso como microbicida, se decidió evaluar la capacidad de interaccionar con el virus en el proceso de adhesión de éste a la superficie de la membrana celular. La molécula de dendrímero actuaría así como una barrera física en la prevención de la infección por VIH de las células endometriales y de su paso a la cavidad interna del útero.
Para evaluar la eficacia de impedimento de adhesión a la superficie celular, así como la capacidad de frenar la ¡nternalización del virus en las HEC-1A, se diseñó un experimento con las segundas generaciones de dendrímeros con terminación carboxilato y sulfonato. La idea de un uso tópico de esta molécula hace necesario
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) evaluar si los tiempos de tratamiento previos a la infección (pretratamiento) son limitantes a la hora de comprobar la eficacia.
La gráfica expuesta a continuación muestra como el pre-tratamiento de las HEC-1A a distintos tiempos no modifica significativamente la eficacia del 60% de inhibición de la adhesión del VIH-1 NL4.3. Este dato se pudo verificar recogiendo los sobrenadantes de cultivo a dos tiempos diferentes tras la infección, el pretratamiento es durante 30 min, 1 hora y 2 horas, luego se infecta con el VIH y el cultivo se mantiene 24 horas (FIG. 5A) se recoge el sobrenadante y se mide el Agp24 y se infecta se mantiene 72 horas (FIG. 5B) se recoge el sobrenadante y se cuantifica el Agp24. El suramin se seleccionó como control positivo de la inhibición de la adhesión ya que se ha demostrado su unión electrostática a la gp120 de la región V3 de VIH, lo que impide que su maquinaria de infección funcione correctamente. p24 representa el antígeno p24 (material genético del virus) que es detectado en el sobrenadante de los cultivos celulares mediante un kit de ELISA (INNOTEST™ HIV antigen mAB -Innogenetics®). Véase FIG. 5.
El siguiente experimento se realizó para cuantificar el número de partículas virales que se encontraban en el interior de las células previamente tratadas con dendrímero. Se comprobó que durante las 3h de infección, la cantidad de virus detectada por ELISA era un 70% menor que en las células control, lo que confirma el dato anterior y refuerza la teoría de que el dendrímero polianiónico está ejerciendo de barrera sobre las células ante el ataque viral. Se utilizó una concentración de 10 μΜ de todos los reactivos. Véase la FIG. 6.
Mecanismos de acción
Una vez comprobada la eficacia del dendrímero en bloquear la adhesión e internalización de las partículas virales, se procedió a intentar comprender el mecanismo de acción. Para ello, se diseñó un experimento que consistía en exponer las partículas virales a la presencia del dendrímero, para posteriormente usar esta combinación en cultivos de CMSP estimuladas (preparadas para la infección viral). Se utilizó VIH-1 NL4.3 (tropismo X4) y VIH-1 BaL (tropismo R5), para analizar el efecto que pudiera tener el dendrímero polianiónico con la V3 de la gp120 de ambos tipos virales, y si el uso de un coreceptor distinto variaba la eficacia de inhibición. Los resultados del ELISA de cuantificación de antígeno p24 a los 4 días de cultivo, muestran una mínima presencia de VIH en el sobrenadante de las CMSP tratadas con 10 μΜ del dendrímero G2SF16. Esto se traduce en una capacidad encapsuladora o interferente del
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) dendrímero con el normal funcionamiento del VIH para infectar las CMSP. Véase la FIG. 7.
Ensayos de inhibición
Para reproducir de la mejor forma posible la función que el dendrímero aniónico desarrollaría en la superficie del endometrio y estudiar el paso de las viriones a través de la mucosa estratificada del epitelio vaginal, se utilizaron dispositivos de transwell que permiten recrear el fenómeno de transcitosis (transporte de macromoléculas desde un espacio extracelular a otro a través del citoplasma de una célula por medio de una vesícula endocítica) debido a la posibilidad de formar una monocapa perfecta de células adherentes en su interior y recolectar información de los sobrenadantes de la cara apical y basolateral de la monocapa. En la gráfica siguiente, se muestra el efecto del dendrímero sobre el paso de las partículas virales a través de la monocapa. Este efecto se reduce en un 40% en ambos casos, pero como dato destacable indicar que en el caso de virus con tropismo R5, nuestro control positivo (suramin) carece del efecto inhibidor. Por tanto, la estructura interna del dendrímero está implicada en la capacidad antiviral de la molécula Véase FIG. 8, sobre la monocapa de HEC-1A, se redujo la concentración de 10 μΜ a 5 μΜ de G2SF16 para evitar cualquier posible daño a la monocapa perfectamente formada en las membranas de transwell. En esta gráfica se muestra el efecto del dendrímero sobre el paso de las partículas del VIH a través de la monocapa. Se recogió sobrenadante de la zona basolateral a las 24 y a las 48 horas tras la infección.
La segunda generación de sulfonatos se evaluó por su posible efecto profiláctico y terapéutico en CMSP mostrando un 80% de inhibición en los ensayos de pre tratamiento de las células con el dendrímero y un 60% en los ensayos de pos tratamiento, lo que confirma las dos aplicaciones de este dendrímero en un sistema más fisiológico como es una línea primaria linfoide. Se utilizó T-20 (Fuzeon) y AZT como controles de inhibición de la fusión viral y de la retrotranscriptasa inversa. Véase la FIG. 9. El G2SF16 mostró un 80% de inhibición en los ensayos de pre-tratamiento de las células con el dendrímero antes de la infección por el VIH-1 NL4.3 y un 60% en los ensayos de post-tratamiento, lo que confirma las dos aplicaciones de este dendrímero en un sistema más fisiológico como es una línea primaria linfoide. Se potencia de esta forma la prevención de la infección por el VIH, así como la inhibición de la replicación viral en células ya infectadas por el VIH.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) Se evaluó la capacidad de liberación de partículas virales por las células dendríticas y macrófagos. Se probaron controles como dextrano, suramin y mannan en dendríticas. Se utilizó NL4.3 y Bal para un ensayo de internalización del virus en presencia de nanoparticulas inhibidoras. Se observó una clara disminución de antígeno p24 en el sobrenadante de macrófagos en presencia de G2SF16. En dendríticas inmaduras, la disminución de antígeno p24 fue significativa para suramin, mannan y G2SF16. Véase FIG. 10, donde, como se ha contado anteriormente, se evaluó la capacidad de liberación de partículas virales por las células y se infectó a 50ng para asegurar una buena cuantificación. Se probaron controles como dextrano, suramin y mannan en dendríticas. Se utilizó NL4.3(columnas negras) y Bal(columnas blancas) para un ensayo de internalización del virus en presencia de nanoparticulas inhibidoras. Se observó una clara disminución de antígeno p24 en el sobrenadante de macrófagos en presencia de G2SF16. En dendríticas inmaduras, la disminución de antígeno p24 fue significativa para suramin, mannan y G2SF16.
También se determinó el efecto antibactericida que tienen estos dendrímeros en presencia de bacterias. Para ello se ha elegido staphylococcus aureus como modelo de experimentación. En estos experimentos hemos observado que a la concentración utilizada de 10 μιη los dendrímeros presentan aproximadamente un 50% de efecto bactericida (FIG. 11) y un 85% de efecto bacteriostático (FIG. 12). Así mismo, hemos observado que los dendrímeros terminados en grupos sulfonato son bactericidas más potentes que los análogos terminados en grupos carboxilato.
Por otro lado, es importante destacar que en los experimentos preliminares realizados se observa que los dendrímeros descritos en la presente invención muestran un efecto antiinflamatorio. Los datos obtenidos en los experimentos de transfección de células Jurkat con los plásmidos pTNF-luc (FIG. 14) y pNF-kB-luc (FIG. 15) en presencia del dendrímero aniónico G2SF16 claramente indican que el dendrimero aniónico disminuye la actividad transcripcional de NF-kappa y por lo tanto el proceso de inflamación.
Biocompatibilidad y efecto inhibidor de la entrada de los dendrímeros aniónicos obtenidos por acoplamiento click.
Los nuevos dendrímeros click con terminaciones carboxilato y fosfonato (G2CKCOO16 y G2CKP32) también se evaluaron para obtener los rangos de biocomatibilidad en la población celular más expuesta a su acción, las células epiteliales de endometrio. En la FIG. 13A se puede apreciar la buena viabilidad celular hasta 10 μΜ, mientras que en la
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) FIG. 13B se aprecia la inhibición de la entrada en la misma línea celular pretratando estas con dendrímero una hora antes de la infección con VIHNI_4-3- Esta inhibición es dependiente de la concentración de dendrímero y se obtiene hasta un 50% en el caso de la concentración de 10 μΜ.
Estos resultados muestran que los dendrímeros carbosilano aniónicos obtenidos con rutas sintéticas basadas en la denominada "clik-chemistry", se comportan también como potentes microbicidas, de forma similar a los dendrímeros aniónicos con grupos sulfonato y carboxilato descritos anteriormente.
Los dendrímeros previamente descritos en la presente invención han demostrado ser capaces de inhibir la infección causada por distintos virus, interfiriendo tanto con la entrada del virus en las células como en pasos posteriores de replicación viral. Ese es el caso por ejemplo del Herpes Simplex, cuya infección se ve inhibida in vitro por efecto de dendrímeros de polilisina modificados. También se ha conseguido inhibir la replicación del VIH, tanto a nivel de la entrada celular como en pasos posteriores, en este caso mediante la utilización de dendrímeros PAMAM modificados covalentemente, que demostraron ser capaces de interferir con la retrotranscriptasa y la integrasa del virus. Aprovechando estas propiedades, se han desarrollado geles vaginales para la prevención de enfermedades de transmisión sexual con formulaciones basadas en dendrímeros, como es el caso de VivaGel™ (Starpharma), cuyo ingrediente activo es un dendrímero de polilisina funcionalizado con restos naftalendisulfonato que parece ser efectivo en la prevención de la infección del VIH gracias a su capacidad de unirse a la glicoproteína gp120 de lá superficie del virus. Aunque en el diseño de dendrímeros antivirales se tiene preferencia por aquellos que presentan en su superficie grupos que mimetizan los que se encuentran presentes en la superficie celular y que, por ello, son capaces de competir con las células por la unión al virus, se ha diseñado también un dendrímero con grupos amida de superficie que funciona como inhibidor del virus respiratorio sincitial, se cree que por la formación de puentes de hidrógeno entre los grupos periféricos del dendrímero con la proteína de fusión del virus, por lo que es de esperar que dendrímeros funcionalizados con otros grupos capaces de formar puentes de hidrógeno con proteínas virales implicadas en la interacción con la superficie celular sean capaces también de interferir con distintos virus, inhibiendo la infección provocada por ellos.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) En otros casos, los dendrímeros han sido utilizados como antibacterianos o para desestructurar las membranas celulares de algunos hongos. Cuando se diseñan para esta finalidad, se tiene preferencia por los dendrímeros con grupos catiónicos en su superficie, tales como aminas o grupos tetraalquilamonio, que facilitan la adherencia de los dendrímeros a la membrana bacteriana, causando la lisis de la bacteria. Tal es el caso de los dendrímeros de poli(propilenimina) (PPI) con grupos alquilamonio terciarios en su superficie, que han demostrado una amplia actividad bactericida tanto contra bacterias Gram positivas como contra bacterias Gram negativas [Chen, C.Z. y S.L. Cooper, Biomaterials, 2002, 23, 3359-68; Chen C.Z. et al, Biomacromolecules, 2000, 1 , 473-80]. Estos dendrímeros presentan una mayor capacidad bactericida que otros polímeros hiperramificados. En el caso de dendrímeros funcionalizados con grupos aniónicos, se está estudiando el efecto bacteriostático o fungistático que estructuras como los dendrímeros pueden producir a nivel celular. La capacidad de agregar distintos patógenos e impedir su crecimiento puede favorecer la eliminación de los microorganismos por medio de las células polimorfonucleares del sistema inmune.
Los dendrímeros de la presente invención, funcionalizados con restos que contienen grupos aniónicos carboxilato y sulfonato, representan una opción para ser utilizados como microestáticos.
Los dendrímeros de la presente invención suponen interesantes alternativas para estas áreas de la Biomedicina y se describe aquí la naturaleza química de los dendrímeros, los estudios referentes a su biocompatibilidad (realizados en líneas celulares, en células mononucleares de sangre periférica (CMSP) y en hematíes), los estudios de antigenicidad, los estudios de impedimento de adherencia e internalización de partículas de VIH a la superficie celular y estudios de inhibición de transcitosis a través de monocapas de epitelio vaginal. Además de esta aplicación profiláctica, también se evalúa su efecto terapéutico, ya que en pacientes infectados el dendrímero podría impedir la progresión de la infección a células sanas.
Resultados con los dendrímeros de núcleo polifenólico
Evaluación de la citotoxicidad de los dendrímeros
Para realizar una completa caracterización de las tres generaciones del nuevo dendrímero sintetizado, se elaboró un sistema de screening para determinar las concentraciones biocompatibles que requerían un estudio más detallado.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) Antes de nada, se establecieron los límites de solubilidad de los dendrímeros de cada generación en agua. Se disolvieron los dendrímeros a concentraciones de 3mM, 2mM y 1mM, siendo esta última la que mejor solubilidad presentaba sin la ayuda de factores físicos adicionales para su perfecta solubilización (vortex, calor, etc.). Una vez asentada la concentración de partida en todos los dendrímeros testados, se procedió a evaluar su citotoxicidad en las células diana de nuestro estudio, las células epiteliales vaginales (HEC-1A) y las CMSP. Se realizó un estudio de los dendrímeros a distintas concentraciones, evaluándose la biocompatibilidad de las 3 generaciones mediante tinción con azul tripan. Para evaluar el daño a la membrana celular que pueden causar las cargas aniónicas de la periferia (formando poros debido a interacción con diversos receptores celulares o por interacción electrostática con zonas positivas de la membrana), se realizó ensayos de liberación de lactato deshidrogenasa al sobrenadante. Se obtuvo que a valores por debajo de 10 μΜ, los dendrímeros no resultaban tóxicos ni en una línea celular linfoide (FIG.17) ni en CMSP (FIG. 18).
Estos estudios se complementaron con ensayos de actividad celular de la mitocondria, donde la reducción de sales de tetrazolio a cristales de formazan es un reflejo indirecto del correcto metabolismo de las células.
Se evaluaron las 3 generaciones de dendrímero con núcleo polifenólico, obteniendo unos niveles aceptables de biocompatibilidad y siempre dentro de los márgenes de aceptabilidad indicados para ambos ensayos (no más del 10% de LDH en sobrenadante y no más de una disminución del 20% en la actividad celular). Los resultados muestran que incluso a una concentración de 50 μΜ, no existe daño de membrana significativo en una línea celular como son las MT-2.
Se realizó un estudio más detallado para evaluar el efecto de un dendrímero en el metabolismo de las CMSP. Se probó el dendrímero de segunda generación y se observó que la actividad mitocondrial no se veía reducida de forma notoria. FIG. 19). Ante estos resultados, se determinó que el G203SF24 sería el elegido para poner a punto los ensayos de inhibición de la adherencia, internalización e infección del VIH a las células epiteliales y CMSP.
Ensayos de adhesión/internalización
El dendrímero que iba a ser expuesto sobre la monocapa de células epiteliales había demostrado no ser tóxico nj mitogénico a la concentración de 10 μΜ. Para su posible uso como microbicida, se decidió evaluar la capacidad de interaccionar con el virus en
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) el proceso de adhesión de éste a la superficie de la membrana celular. La molécula de dendrímero actuaría así como una barrera física en la prevención de la infección por VIH de las células endometriales y de su paso a la cavidad interna del útero.
Para evaluar la eficacia de impedimento de adhesión a la superficie celular, así como la capacidad de frenar la internalización del virus en las HEC-1A, se diseñó un experimento con el G203SF24. La idea de un uso tópico de esta molécula hace necesario evaluar si los tiempos de tratamiento previos a la infección (pretratamiento) son limitantes a la hora de comprobar la eficacia. Se realizaron ensayos a diferentes tiempos y se estableció un pretratamiento de 1h en todos los experimentos. El suramin, un polisulfonato de naftilurea, es una molécula con terminaciones sulfonato idénticas al G203SF24 pero con distinta estructura interna. Esta molécula fue elegida como control positivo de la inhibición de la adhesión ya que se ha demostrado su unión electrostática a la gp120 de la región V3 de VIH, lo que impide que su maquinaria de infección funcione correctamente in vitro.
Ensayos de inhibición
Para reproducir de la mejor forma posible la función que el dendrímero aniónico desarrollaría en la superficie del endometrio y estudiar el paso de las viriones a través de la mucosa estratificada del epitelio vaginal, se utilizaron dispositivos de transwell que permiten recrear el fenómeno de transcitosis (transporte de macromoléculas desde un espacio extracelular a otro a través del citoplasma de una célula por medio de una vesícula endocítica) debido a la posibilidad de formar una monocapa perfecta de células adherentes en su interior y recolectar información de los sobrenadantes de la cara apical y basolateral de la monocapa. En la gráfica de la FIG. 20, se muestra el efecto del dendrímero sobre el paso de las partículas virales a través de la monocapa. Este efecto se reduce en un 40%, mientras que nuestro control positivo carece del efecto inhibidor. Por tanto, la estructura interna del dendrímero está implicada en la capacidad antiviral de la molécula.
La segunda generación de sulfonatos se evaluó por su posible efecto profiláctico y terapéutico en PBMCs, mostrando un 60% de inhibición en los ensayos de pre- tratamiento de las células con el dendrímero, lo que confirma la aplicación de este dendrímero en un sistema más fisiológico como es una línea primaria linfoide, FIG. 21. Se está evaluando actualmente su acción en células dendríticas y macrófagos. Debido a que estas líneas celulares se infectan de forma menos notable que en los
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) experimentos con linfocitos, la disminución de un 50 a 70% en las diferentes poblaciones celulares esta' ligada a la disponibilidad de virus en contacto con las mismas. FIG. 22.
Ensayos de aplicación antibacteriana y antifúngica
También se ha determinado el efecto antibacteriano y antifúngico que tienen estos dendrímeros en presencia de bacterias. Para ello se ha elegido staphylococcus aureus y candida albicans como modelo de experimentación bacteriano y fúngico, respectivamente. En estos experimentos se observó que a la concentración utilizada de 10 μΜ el dendrímero presenta un 40% de efecto bactericida y un efecto bacterioestático del 90% FIG. 23-24. No se observaron efectos fungicidas ni fu ng ¡estáticos a las concentraciones utilizadas, FIG. 25-26.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26)

Claims

REIVINDICACIONES
1. Dendrímero carbosilano que comprende:
- un núcleo polifuncional y
- una capa externa, que consiste, total o parcialmente, en unidades iguales o diferentes del grupo de fórmula (I):
-Si-Xp
( ')3-p
(i)
donde: R es un grupo alquilo (C1-C4),
p varía entre 1 y 3, y
X es el siguiente grupo de fórmula (II):
-E-N[(CH2)Z-R ]2 (II)
donde: E es un grupo enlazante entre el silicio y el grupo amina,
z varía entre 1 y 4,
R1 se selecciona de un grupo de la lista que comprende -COOR2, -SO3R2 o -PO3(R2)2, y
R2 es hidrógeno o un grupo alquilo (C C4).
2. Dendrímero según la reivindicación 1 , donde el núcleo es de silicio o polifenólico.
3. Dendrímero según la reivindicación 2, donde el núcleo polifenólico es 1 ,3,5- trihidroxibenceno.
4. Dendrímero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde p es 1.
5. Dendrímero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde R es metilo.
6. Dendrímero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde E se selecciona de entre un alquilo (C-I-CKD) O un grupo -(CH2)X-R3, donde R3 es un grupo triazol o fenoxo y x varia entre 1 y 6.
7. Dendrímero según la reivindicación 6, donde el grupo alquilo de E es un propilo.
8. Dendrímero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde R2 es hidrógeno o metilo.
9. Dendrímero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde E es el grupo - (CH2)X-R3 y R3 es triazol, x está definido en la reivindicación 6.
10. Dendrímero según la reivindicación 9, donde x es 4.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) i L Dend rimero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde E es el grupo - (CH2)x-R3 y R3 es fenoxo, x está definido en la reivindicación 6.
12. Dendrímero según la reivindicación 11 , donde x es 1.
13. Dendrímero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde R es el grupo - COOR2.
14. Dendrímero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde R es el grupo - S03R2.
15. Dendrímero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde R1 es el grupo -P03(R2)2.
16. Dendrímero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, donde z es 2.
17. Dendrímero según la reivindicación 15, donde z es 1.
18. Dendrímero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, donde dicho dendrímero está en forma de sal aniónica.
19. Dendrímero según la reivindicación 18, donde la sal es de Na+.
20. Dendrímero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, donde dicho dendrímero es de fórmula (III):
Figure imgf000096_0001
(III)
donde: Nu representa un núcleo polifuncional, Ra es un grupo alquilo (Ο-ι-Οβ); y tiene un valor de entre 2 y 6; y R es el grupo terminal de fórmula general (I) según se ha descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.
21. Dendrímero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, donde dicho dendrímero es al meno siguiente fórmula (IV):
Figure imgf000096_0002
(IV)
donde: Nu representa un núcleo polifuncional, Ra Rb y R", son iguales o diferentes, y representan un grupo alquilo (CrC6); m tiene un valor de entre 1 y 3; y tiene un valor de entre 2 y 6; y R es el grupo terminal de fórmula general (I) según se ha descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26)
22. Dendrímero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, donde dendrímero es fórmula (V):
Figure imgf000097_0001
(V)
donde: Nu representa un núcleo polifuncional, Ra, Rt>, Re, R y R , son iguales o diferentes, y representan un grupo alquilo (C Ce); m y n son iguales o diferentes y tienen un valor de entre de 1 y 3; y tiene un valor de entre 2 y 6; y R es el grupo terminal de fórmula general (I) según se ha descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.
23. Dendrímero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, donde dicho dendrí :
Figure imgf000097_0002
(VI)
donde: Nu representa un núcleo polifuncional, Ra, Rt>, Re, Rd, R" , R"' y R son iguales o diferentes, y representan un grupo alquilo (C Ce); m, n y q son iguales o diferentes y tiene un valor de entre 1 y 3; y tiene un valor de entre 2 y 6; y R es el grupo terminal de fórmula general (I) según se ha descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19..
24. Dendrímero según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, donde Ra, Rt>, Re o Rd, son iguales o diferentes, y representan un grupo alquilo (C2-C4).
25. Dendrímero según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, donde R" , R'"o RIV, son un grupo metilo.
26. Compuesto de fórmula:
Et3-R
donde: Et es un grupo etilo y
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) R es el grupo terminal de fórmula (I) descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, un grupo -Si(R')3-p[(CH2)4-N3]p, o el grupo -Si(R')3-p[E-NH2]p donde R es un grupo alquilo (C1-C4), p tiene un valor de entre 1 y 3 y E es un grupo enlazante descrito en las reivindicaciones anteriores.
27. Dendrímero carbosilano que comprende:
un núcleo polifuncional y
una capa externa, que consiste, total o parcialmente, en unidades iguales o diferentes del grupo -Si(R')3-p[(CH2)4-N3]p, o del grupo -Si(R')3-p[E-NH2]p; donde R es un grupo alquilo (C1-C4), p varía entre 1 y 3 y E es un grupo enlazante descrito en las reivindicaciones anteriores.
28. Compuesto según la reivindicación 24 o dendrímero según la reivindicación 25, donde p es 1.
29. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 24 o 26 o dendrímero según cualquiera de las reivindicaciones 25 o 26, donde R' es un metilo.
30. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 24 o 26 a 27 o dendrímero según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, donde E es el grupo -(CH2)X-R3 y R3 es triazol, x está definido en la reivindicación 6, preferiblemente x es 4.
31. Procedimiento de obtención de los dendrímeros según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 25, que comprende:
la adición tipo Michael de un dendrímero que contiene un núcleo polivalente y grupos -NH2 terminales a un alqueno que contiene grupos carboxílicos o sulfonatos o la reacción en dos etapas de un dendrímero que contiene un núcleo polivalente y grupos -NH2 terminales con formaldehido y fosfonato de dimetilo.
32. Procedimiento de obtención de los dendrímeros según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 25, que comprende:
la hidrosililación de un dendrímero que contiene grupos -Si-H terminales con un grupo alilamina funcionalizadas con grupos carboxílicos, fosfónicos o sulfónicos.
33. Uso de los dendrímeros según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, para la elaboración de un medicamento.
34. Uso de los dendrímeros según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades causadas por virus, bacterias u hongos.
35. Uso según la reivindicación 32, donde la enfermedad es causado por el VIH.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26)
36. Composición farmacéutica que comprende al menos un dendrímero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
37. Composición según la reivindicación 34, que además comprende otro principio activo.
38. Uso de los dendrímeros según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 como vehículos de transporte de moléculas.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26)
PCT/ES2011/070104 2010-02-18 2011-02-17 Dendrimeros carbosilanos y su uso como antivirales WO2011101520A2 (es)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BR112012020870A BR112012020870A2 (pt) 2010-02-18 2011-02-17 dendrímeros carbosilanos e seu uso como antivarais.
EP11719842A EP2537880A2 (en) 2010-02-18 2011-02-17 Carbosilane dendrimers and the use thereof as antiviral agents
JP2012553360A JP2013519711A (ja) 2010-02-18 2011-02-17 カルボシランデンドリマー及び抗ウイルス剤としてのそれらの使用
US13/579,849 US20130059818A1 (en) 2010-02-18 2011-02-17 Carbosilane dendrimers and the use thereof as antiviral agents
AU2011217142A AU2011217142A1 (en) 2010-02-18 2011-02-17 Carbosilane dendrimers and the use thereof as antiviral agents
CN2011800101295A CN102858851A (zh) 2010-02-18 2011-02-17 碳硅烷树枝状化合物及其作为抗病毒剂的用途

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES201030233A ES2364264B2 (es) 2010-02-18 2010-02-18 Dendrimeros carbosilanos y su uso como antivirales.
ESP201030233 2010-02-18
ES201030450A ES2365685B2 (es) 2010-03-25 2010-03-25 Dendrímeros carbosilanos con un núcleo polifenólico y su uso como antivirales.
ESP201030450 2010-03-25

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2011101520A2 true WO2011101520A2 (es) 2011-08-25
WO2011101520A3 WO2011101520A3 (es) 2012-03-29

Family

ID=44063179

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2011/070104 WO2011101520A2 (es) 2010-02-18 2011-02-17 Dendrimeros carbosilanos y su uso como antivirales

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20130059818A1 (es)
EP (1) EP2537880A2 (es)
JP (1) JP2013519711A (es)
CN (1) CN102858851A (es)
AU (1) AU2011217142A1 (es)
BR (1) BR112012020870A2 (es)
WO (1) WO2011101520A2 (es)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2417254A1 (es) * 2012-02-01 2013-08-06 Universidad De Alcalá Uso de dendrímeros carbosilanos aniónicos para la separación de proteínas
JP2014527071A (ja) * 2011-08-31 2014-10-09 マリンクロッド エルエルシー Ｈ−ホスホネートによるナノ粒子ｐｅｇの改変

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19812881A1 (de) * 1998-03-24 1999-10-07 Bayer Ag Neue dendrimere Verbindungen, ein Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung als Katalysatoren
ES2265291B1 (es) * 2005-07-22 2008-03-01 Universidad De Alcala Nuevos dendrimeros carbosilanos, su preparacion y sus usos.
US20100173871A1 (en) * 2008-08-01 2010-07-08 Centre National De La Recherche Scientifique Phosphorylated dendrimers as antiinflammatory drugs

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN, CZ; SL COOPER, BIOMATERIALS, vol. 23, 2002, pages 3359 - 68
CZ CHEN ET AL., BIOMACROMOLECULES, vol. 1, 2000, pages 473 - 80
GONG, Y. ET AL., ANTIVIRAL RES, vol. 55, no. 2, 2002, pages 319 - 329
JIANG YH ET AL., AIDS RES HUM. RETRIVIRUSES, vol. 21, 2005, pages 207
L. GRIFFE ET AL., ANGEW. CHEM, vol. 46, 2007, pages 2523
M. ANGELES MUNOZ-FERNANDEZ ET AL.: "Water-Soluble Carbosilane Dendrimers: Synthesis, Biocompatibility and Complexation with Oligonucleotides; evaluation for Medical Applications", CHEM. EUR. J.., vol. 13, 2007, pages 483 - 495
MCCARTHY, TD ET AL., MOL PHARM., vol. 2, no. 4, July 2005 (2005-07-01), pages 312 - 8
S.W. KRSKA; D. SEYFERTH, J. AM. CHEM. SOC., vol. 120, 1998, pages 3604 - 3612

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014527071A (ja) * 2011-08-31 2014-10-09 マリンクロッド エルエルシー Ｈ−ホスホネートによるナノ粒子ｐｅｇの改変
ES2417254A1 (es) * 2012-02-01 2013-08-06 Universidad De Alcalá Uso de dendrímeros carbosilanos aniónicos para la separación de proteínas

Also Published As

Publication number Publication date
US20130059818A1 (en) 2013-03-07
CN102858851A (zh) 2013-01-02
WO2011101520A3 (es) 2012-03-29
JP2013519711A (ja) 2013-05-30
BR112012020870A2 (pt) 2017-02-07
EP2537880A2 (en) 2012-12-26
AU2011217142A1 (en) 2012-09-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2265291B1 (es) Nuevos dendrimeros carbosilanos, su preparacion y sus usos.
Kurtoglu et al. Poly (amidoamine) dendrimer–drug conjugates with disulfide linkages for intracellular drug delivery
Sepulveda-Crespo et al. Polyanionic carbosilane dendrimer-conjugated antiviral drugs as efficient microbicides: Recent trends and developments in HIV treatment/therapy
Arnaiz et al. Synthesis of cationic carbosilane dendrimers via click chemistry and their use as effective carriers for DNA transfection into cancerous cells
ES2236518T3 (es) Micelas polimericas unimoleculares provistas de un nucleo interior ionizable.
Wang et al. Amphiphilic diblock terpolymer PMAgala-b-P (MAA-co-MAChol) s with attached galactose and cholesterol grafts and their intracellular pH-responsive doxorubicin delivery
KR20040027506A (ko) 성전이 질병의 예방및 치료제-ｉ
Tian et al. pH-Responsive tumor-targetable theranostic nanovectors based on core crosslinked (CCL) micelles with fluorescence and magnetic resonance (MR) dual imaging modalities and drug delivery performance
WO2011101520A2 (es) Dendrimeros carbosilanos y su uso como antivirales
Mlynarczyk et al. Dendrimer structure diversity and tailorability as a way to fight infectious diseases
ES2365685B2 (es) Dendrímeros carbosilanos con un núcleo polifenólico y su uso como antivirales.
ES2444490A1 (es) Compuestos dendríticos carbosilanos homo y hetero-funcionalizados
ES2364264B2 (es) Dendrimeros carbosilanos y su uso como antivirales.
ES2774663T3 (es) Agente para inducir interferón endógeno
ES2374243B1 (es) Vectores no virales para terapia génica.
Spain Cationic carbosilane dendrimers as Non-viral vectors of nucleic acids (oligonucleotide or siRNA) for gene therapy purposes
ES2657282B1 (es) Dendrones carbosilano funcionalizados con ácidos grasos: formación de micelas y usos
Sk Nanosize dendrimers: potential use as carriers and antimicrobials
ES2609464B2 (es) Nanopartículas metálicas esetabilizadas con dendrones carbosilano y sus usos
KR20120108842A (ko) 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체 및 이를 이용한 유전자 치료
ES2374245B1 (es) Vectores no virales para terapia génica.
KR100860416B1 (ko) 폴리카프로락톤 다이아크릴레이트와 폴리에틸렌이민을기초로 한 생분해성 폴리에스텔아민을 이용한 새로운유전자 전달체
Sepúlveda-Crespo et al. Dendrimers as a Candidate for Microbicide in Prevention of HIV-1 Infection in Women: Steps toward Their Clinical Evaluation
WO2024102797A1 (en) Charge-altering nucleic acid transporters with beta-amido carbonate backbones
Narayan et al. Dendrimers-a novel drug delivery system

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201180010129.5

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11719842

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011217142

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2012553360

Country of ref document: JP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2011217142

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20110217

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011719842

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13579849

Country of ref document: US

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112012020870

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112012020870

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20120820