WO2011094888A1 - Método y dispositivo para determinar la viabilidad de una muestra vegetal - Google Patents

Método y dispositivo para determinar la viabilidad de una muestra vegetal Download PDF

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WO2011094888A1
WO2011094888A1 PCT/CL2011/000010 CL2011000010W WO2011094888A1 WO 2011094888 A1 WO2011094888 A1 WO 2011094888A1 CL 2011000010 W CL2011000010 W CL 2011000010W WO 2011094888 A1 WO2011094888 A1 WO 2011094888A1
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starch
culture medium
viability
detection device
plant
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PCT/CL2011/000010
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English (en)
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Rolando GARCÍA GONZALEZ
Karla Andrea Quiroz Bravo
Peter Douglas Savaria Caligari
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Universidad De Talca
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01C—PLANTING; SOWING; FERTILISING
    • A01C1/00—Apparatus, or methods of use thereof, for testing or treating seed, roots, or the like, prior to sowing or planting
    • A01C1/02—Germinating apparatus; Determining germination capacity of seeds or the like
    • A01C1/025—Testing seeds for determining their viability or germination capacity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5097—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving plant cells

Definitions

  • the invention relates to a method of detection of viability of cells, plant tissues and plants that does not cause damage to the plant sample under study, allowing its normal growth once subjected to evaluation.
  • the method presented is based on the determination of the activity of the alpha amylase enzyme present in plant tissues.
  • the invention also relates to a viability detection device and the appropriate developing system.
  • the methods used to evaluate the viability of plant cells or tissue are mostly invasive and destructive, based on the irreversible staining of plant cells or tissues, without the possibility of recovering them and reintroducing them into the productive system. On the other hand, these methods are usually complex and expensive for the plant producing industry. In general terms, the methods used to measure viability can be classified into two groups: those that stain only dead cells and those that color only living cells, in the latter case, color is normally a product of metabolic activity
  • Another method for evaluation of viability includes the determination of enzymes such as reductases and esterases.
  • the reductase activity is determined spectrometrically by measuring the absorbance of formazan, which is a product of the reduction of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (Towill and Mazur, 1974).
  • esterase activity uses its ability to hydrolyze the fluorescein fluorescein diacetate (FDA), which is widely used for the detection of viability of both animal and plant cells, this compound passes through the cell membrane and is converted into a fluorescent substrate, called fluorescein by the endogenous enzyme esterase.
  • FDA fluorescein fluorescein diacetate
  • the use of FDA makes it possible to distinguish living cells from dead cells by fluorescence detection equipment (Yamori et al. 2006).
  • a colorimetric technology For the detection of viability of complete plants, a colorimetric technology has been developed aimed at determining the damage caused by stress in fruit, vegetable, plant or flower, which is based on the difference in the production of volatile compounds such as ethanol and aldehyde by part of the vegetables to suffer damage.
  • the method consists of covering the vegetable with an insulating cover and determining the change in the gases inside, the method of detecting the gases is of a colorimetric type, with reagents of the potassium dichromate type to determine volatile ethanol (US 6306620) .
  • the present invention has advantages over the materials described in the state of the art, since it allows to detect in a simple way the viability of cells, plant tissues and plants without damaging the analyzed samples, allowing their subsequent growth and use in a normal way. On the other hand, the present invention delivers reliable results without requiring sophisticated equipment for its implementation or the interpretation of results.
  • the present invention relates to a method of detection of viability of cells, plant tissues and / or whole plants based on the determination of the activity of alpha-amylase released to the medium, the enzyme is detected indirectly by determining degraded starch in the culture medium supplemented with said carbohydrate.
  • the method for determining viability of a plant sample of the present invention comprises the following steps:
  • a) Provide a viability detection device containing a solid or semi-solid culture medium suitable for the nutritional requirements of a plant sample, where the culture medium has a starch supplement; b) Grow the plant tissue in the viability detection device of the previous stage;
  • the present invention comprises a kit for the detection of viability of a plant sample which comprises: a support, a culture medium, a starch supplement, and a development composition based on iodine.
  • a starch supplement is to be added the culture medium in a concentration sufficient to achieve a concentration of starch in the culture medium between 0.5 and 5.0 gLT 1 .
  • the culture medium and the starch supplement are mixed to form a culture medium supplemented with starch.
  • the support contains the culture medium supplemented with starch.
  • the culture medium supplemented with starch has a concentration of starch between 0.5 and 5.0 gL -1 .
  • the present invention comprises a viability detection device of a plant sample comprising a support containing a culture medium supplemented with starch in which the plant tissue is grown.
  • the viability detection device comprises a support comprising a plate, a bottle, a petri dish or an eppendorf tube, with or without a lid.
  • the present method of viability detection does not destroy or damage plant tissues, allowing the normal growth of the plant after being subjected to viability detection analysis.
  • the proposed method is based on the detection of the activity of the alpha-amylase enzyme released into the culture medium, as a way to determine the viability of any plant tissue.
  • the method is based on the ability of the alpha-amylase enzyme to degrade the starch present in the culture medium of the detection device where the plant sample is grown, said degradation is evidenced by the lack of surface color of the culture medium of the device, when revealed with a solution based on iodine.
  • the enzyme alpha-amylase is mainly present in plant tissues, so the method has a level of selection against the growth of other organisms, notwithstanding the foregoing, in its preferred modality the method is developed under conventional aseptic conditions of the state of the art
  • the enzyme alpha-amylase is present in all plant tissues and cells, and although it has a different degree of presence and activity in the different tissues and stages of development of a plant, they are perfectly detectable by the proposed method.
  • the presented method allows to determine viability in plant samples from different plant species of gynemosperm or angiosperm, monocot or dicot plants, from plants grown in vivo or grown in vitro.
  • the present method allows to determine the viability in different stages of development of the plant, for example and not limiting to organogenesis, callogenesis, somatic embryogenesis, differentiated tissues and sexual tissues.
  • the method for determining the viability described in the present invention allows determining viability in plant tissues from different parts of the plant, not limiting leaves, stems, petioles, calluses, embryos, protoorms, rhizomes or roots, in addition to pollen and seeds.
  • the method for determining the designed viability can be applied to any plant cultivation process that requires a stage of viability detection for commercial, scientific research or other purposes, for example, and not limited to, micropropagation technology, viability in Pollen grains, viability of in vitro and ex vitro tissues subjected to biotic and abiotic stress, viability of genetically modified plant tissues, viability of ovaries, viability detection of any plant tissue and culture in bioreactors.
  • the culture medium is chosen within the state of the art according to the nutritional requirements of the plant tissue to be analyzed.
  • Said culture medium can be supplemented with compounds normally used in processes such as: growing plant tissues; select transformed tissues; avoid contamination of the environment with other prokaryotic or eukaryotic organisms; stimulate the morphogenic response of tissues; guarantee the development and growth of cells or tissues in the physiological state where the present method of detection of viability is developed, among others.
  • the compounds with which the culture medium can be supplemented comprise for example: inorganic salts, organic salts, minerals, vitamins, amino acids, natural or synthetic growth regulators, agar or any other polymer used to solidify culture media, bactericides, fungicides. ; organic acids and inorganic acids and water.
  • the culture medium of the present invention is further supplemented with starch, in its preferred embodiment, the starch concentration of the culture medium is between 0.5 and 5.0 gL -1 , preferably between 1.0 and 3.0 gL -1 , more preferably between 1.0 and 2.0 gL -1 .
  • the developing composition of the present invention is based on iodine with a 10% iodine solution, said developing composition may also contain preservatives, such as organic acids, antibiotics and fungicides.
  • the device of the present invention is developed under conditions of common sterility and asepsis described in the state of the art.
  • the plant sample is treated considering the normal aseptic conditions described in the state of the art.
  • the plant samples are placed on the surface of the device's culture medium and incubated for a period of time and temperature conditions suitable for each plant species.
  • the cultivation of plant tissues is carried out in dark conditions since a higher consumption of starch is obtained by the plant tissue.
  • step c) the tissue sample is removed from the culture medium.
  • the analyzed plant sample can be subsequently subcultured in starchy culture medium or used according to the purposes that the user deems convenient.
  • step d) of developing the viability detection device a solution of iodine is poured onto the surface of the culture medium and incubated for a period of time at room temperature, in its preferred embodiment, this incubation lasts between 3 and 5 minutes and is performed between 20 and 25 ° C. Subsequently, the iodine solution is removed from the surface and as a positive result of viability, a colorless halo is seen at the place where the plant sample was grown. This halo reflects the degradation of the starch present in the culture medium. Starch degradation by plant enzymes is evidenced visually, thereby detecting the viability of the sample evaluated. If the tissue is alive, a colorless halo is observed below the place where the tissue was.
  • the halo can have a variable size, depending on the type of tissue and the plant species, however, clear differences are observed between the color of the culture medium and the halo formed in the culture zone of the explant when the tissue is viable. If the tissue is dead, the surface under the evaluated explant is stained blue similar to the rest of the culture medium.
  • FIGURE 1 Standardization of the concentration of starch in the culture medium for the detection of viability of vegetables.
  • the picture shows 4 plates of culture medium (basal medium MS + 7 gL -1 agar-agar + 30 gL -1 sucrose) supplemented with different concentrations of Starch, Plate A: 1.0 gL " l; B: 1.0 gL -1 , Plate C: 1.5 gL -1 , Plate D: 2.0 gL -1 .
  • Explants of nodal tobacco segments were grown in the 4 plates for 72 hours at 25 ° C. in the dark Subsequently, the explants were removed from the plates B, C and D, and said B, C and D plates were revealed with a 10% iodine solution.
  • FIGURE 2 Feasibility detection in live (A) and dead (B) rhizomes of the Chloraea crispa terrestrial orchid.
  • the viability signal in living tissues (Plate A) is expressed in the formation of a colorless halo in the explant culture zone, an effect that does not occur in dead tissues (Plate B).
  • the living and dead tissues were incubated on plates A and B for 72 hours in the dark, resting and 25 ° C temperature. After that time the rhizomes were removed and the plates were treated with developer solution. The arrows mark the places where the explants were sown.
  • FIGURE 3 Viability detection in different Papaya tissues.
  • Figure A corresponds to the feasibility detection of the nodal segment of Papaya ⁇ Carica vasconcellea) grown in basal medium MS + Sucrose (30 gL -1 ) + GA 3 (1.0 mgL -1 ) + Starch (1.0 gL -1 ) in triplicate.
  • Figure B corresponds to the viability detection of Papaya leaves ⁇ Carica vasconcellea) grown in basal medium MS + Sucrose (30 gL -1 ) + GA 3 (1.0 mgL -1 ) + Starch (1.0 gL -1 ) in triplicate. All or tej gone plates were incubated for 72 hours in the dark, resting and 25 ° C temperature. After that time the nodal segments and the Papaya leaves were removed from the plates, and the plates were treated with revealing solution. The arrows mark some of the places where the explants were planted.
  • FIGURE 4 Feasibility detection in orchid meristems. Tissues were cultured in medium Medium Van aes + Sucrose (30 gL -1 ) + TDZ (1.5 mgL "1 ) + IBA (1.5 mgL " 1 ) + starch (1.0 gL -1 ) in triplicate . All tissues were incubated on the plates for 72 hours in the dark, resting and 25 ° C temperature. After that time the meristems were removed, and the plates were treated with the developer solution. The arrow marks one of the places where the explants were sown.
  • FIGURE 5 Viability detection of nodal tobacco segments ⁇ Nicotiana tabacum).
  • the tissues were grown in MS + Sucrose (30 gL -1 ) + 6- Benzylaminopurine (BAP) (0.1 mgL "1 ) + starch (1.0 gL -1 ) in triplicate. All tissues were incubated on plates for 72 hours in the dark, resting and a temperature of 25 ° C. After this time the nodal segments were removed and the plates were treated with a developer solution, the arrow marks one of the places where the explants were sown.
  • BAP 6- Benzylaminopurine
  • Example 1 Standardization of the culture medium for the viability detection device.
  • the culture medium is. prepared with basal medium MS
  • the culture media were dispensed in viability detection devices such as Petri dishes under aseptic conditions.
  • the explants were prepared in segments 0.5 cm long and 0.5 cm long. Once prepared, the explants were placed in the viability detection devices, trying to maintain a sufficient distance between them to avoid interference in the viability signals, preferably 5 explants per device. The explants were grown for 1, 2, 3 and 5 days, at 25 ° C and in dark conditions. After this incubation period the explants were removed from the plates and these were revealed with an iodine solution as indicated in the following paragraph. The development of the plates was performed using a 10% diluted iodine solution. The 10% diluted iodine solution was prepared in two stages: First, a colorless solution of Potassium Iodide (KI) 300 gLT 1 was prepared.
  • KI Potassium Iodide
  • the KI solution was used to prepare the Yodada solution by adding 233.1 mL of KI solution and 56 g of iodine crystals to 500 ml of distilled water. The solution was stirred for 1 hour or until the crystals were completely dissolved and the solution homogenized and allowed to stand for 24 hours. Finally, the volume of the solution was adjusted by adding 3.5 liters of distilled water.
  • a film of 10% diluted iodine solution was applied for 3 minutes on the surface of the plates until staining was observed in the culture medium. Subsequently, the iodine solution was removed from the surface of the plates by draining.
  • Figure 1 shows the results of the standardization of the culture medium in experiments for the detection of viability in the nodal tobacco segment, in plates B, C and D a colorless halo is observed on the surface where the implants were grown, demonstrating the viability of the tissues grown. It was determined to use 1.5 gL "1 of starch in the culture medium as the preferred concentration for the detection of cell viability in this experimental model.
  • EXAMPLE 2 Feasibility detection in different strawberry explants (Fragaria chiloensis), Tobacco (Nicotiana tabacum), blueberries [Vaccinum corymbosun) and Andean papaya ⁇ Carica vasconcellea).
  • the basal medium MS (Murashige and Skoog, 1962) supplemented with 1.5 gL -1 of starch, 30 gL -1 of Sucrose, 7 gL " 1 of agar-agar and growth regulators was used according to the type of explant and the species, as indicated in Table 1. This concentration of work was chosen according to the type of explant, the plant species and the morphogenic process in which the viability detection is performed.
  • Basal salts and vitamins of the MS medium were added according to the concentrations suggested for the preparation of this culture medium, without any modification (Murashige and Skoog, 1962).
  • the pH of the culture medium was adjusted to 5.6-5.7, before sterilization.
  • the sterilization of the culture medium was carried out by pressure steam in an autoclave at a temperature of 121 ° C, a pressure of 1 kgcrrf 2 and for 30 minutes. Once sterile, the culture media were dispensed in Petri dishes under aseptic conditions.
  • the plates can be sealed and kept in the dark and room temperature up to 30 days, before being used.
  • Table 1 Composition of the culture media used in the viability tests of different explants and species.
  • explants were taken from plants grown under in vitro conditions. The explants were prepared in segments 0.5 cm long and 0.5 cm long for the leaves; 0.5 cm in diameter for calluses; 0.5 cm in length for the nodal segments and petioles. c) Cultivation of explants in culture plates and viability test.
  • the explants were placed on the viability detection plate, trying to maintain a sufficient distance between them to avoid interference in the viability signals. In this case, no more than 6 explants were placed in 10 cm diameter plates, notwithstanding other densities in the species and tissues allow. All explants were placed on the culture medium as if they were to be manipulated to generate morphogenic responses according to the indications of the protocols for each species.
  • the explants were grown on the viability detection plates from 24 hours to 5 days and were grown at 25 ° C and in dark conditions.
  • the explants were removed from the viability detection medium for subsequent plate development.
  • the explants were subcultured in culture medium recommended for each species to induce the desired morphogenic response.
  • the basal culture medium described in Table 1 was used, but without the addition of starch.
  • Figure 6 shows that the culture period in the viability detection medium did not affect the morphogenic response.
  • a film of 10% diluted iodine solution was applied for 3 minutes on the surface of the plates until staining was observed in the culture medium. Subsequently, the iodine solution was removed from the surface of the plates by draining.
  • Figures 3, 4 and 5 show the results of the feasibility tests performed for some of the types of tissues described in Table 1. In these photographs it can be verified that the proposed system allows detecting the activity of living tissues of different origins, both at the species level and the type of tissue, regardless of the basal culture medium used.
  • tissues used in these tests are those commonly used in the in vitro multiplication protocols of most plant species.
  • Example 3 Effect of starch on the growth of plant tissues.

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Abstract

Método y dispositivo para determinar viabilidad de una muestra vegetal que comprende las siguientes etapas: Proveer un dispositivo de detección de viabilidad que contenga medio de cultivo sólido o semisólido adecuado para los requerimientos nutricionales de una muestra vegetal, donde el medio de cultivo posee un suplemento de almidón; Crecer el tejido vegetal en el dispositivo de detección de viabilidad de la etapa anterior; Retirar la muestra de tejido vegetal del dispositivo de detección de viabilidad; y Revelar el dispositivo de detección de viabilidad.

Description

METODO Y DISPOSITIVO PARA DETERMINAR LA VIABILIDAD
DE UNA MUESTRA VEGETAL
La invención se refiere a un método de detección de viabilidad de células, tejidos vegetales y plantas que no provoca daño en la muestra vegetal en estudio, permitiendo su normal crecimiento una vez sometida a evaluación. El método presentado se basa en la determinación de la actividad de la enzima alfa amílasa presente en tejidos vegetales.
La invención se refiere también a un dispositivo de detección de viabilidad y el sistema de revelado adecuado.
DESCRIPCION DE LO CONOCIDO
El desarrollo de las técnicas de cultivo de plantas in vitro, permitió la creación de una industria biotecnológica orientada a la producción y comercialización de plantas a nivel mundial. Uno de los puntos críticos del desarrollo de esta industria es la determinación de la viabilidad de los tejidos con los que se trabaja, factor determinante de las eficiencias metodológicas y la rentabilidad de la producción. Por otro lado, a nivel de estudios de investigación, estudios fisiológicos y biotecnológicos , la viabilidad celular representa un importante parámetro asociado a la respuesta a estrés biótico o abiótico, la generación de plantas genéticamente modificadas entre otros usos. La viabilidad ha i
sido un parámetro esencial en la evaluación de adaptación a distintos tipos de estrés, tales como la tolerancia al frió
(Leborgne y cois. 1995) y en respuestas a congelamiento, calor o alta salinidad (Ishikawa y cois. 1995).
Los métodos usados para evaluar viabilidad de células o tejido vegetal son, en su mayoría invasivos y destructivos, basados en la tinción irreversible de células o tejidos vegetales, sin la posibilidad de recuperarlos y reintroducirlos en el sistema productivo. Por otro lado, estos métodos suelen ser complejos y costosos para la industria productora de plantas. En términos generales, los métodos utilizados para medir viabilidad pueden ser clasificados en dos grupos : aquellos que tiñen sólo células muertas y aquellos que colorean sólo las células vivas, en este último caso, normalmente el color es un producto de la actividad metabólica
( idholm, 1972). Las tinciones más usadas para células muertas son azul de Evans, azul de bromofenol, azul de metileno y fenosafranin, mientras que diacetato de fluoresceína (FDA) es usado para células vivas.
Otro método para evaluación de viabilidad incluye la determinación de enzimas tales como reductasas y esterasas. La actividad de la reductasa es determinada de manera espectrométrica midiendo la absorbancia del formazan, que es producto de la reducción de cloruro de 2,3,5- trifeniltetrazolio (Towill y Mazur, 1974). Para la determinación de la actividad de esterasa se utiliza su capacidad de hidrolizar el sustrato fluorogénico diacetato de fluoresceina (FDA) , el cual es ampliamente usado para la detección de viabilidad de células tanto animales como vegetales, este compuesto pasa a través de la membrana celular y es convertido en un sustrato fluorescente, llamado fluoresceina por la enzima endógena esterasa. En general, el uso de FDA posibilita distinguir células vivas de células muertas mediante equipos de detección de fluorescencia (Yamori y cois. 2006) .
Para la detección de viabilidad de plantas completas, se ha desarrollado una tecnología colorimétrica orientada a determinar el daño producido por el estrés en fruta, vegetal, planta o flor, el cual se basa en la diferencia de producción de compuestos volátiles como etanol y aldehido por parte de los vegetales al sufrir daño. El método consiste en cubrir el vegetal con una cubierta aislante y determinar el cambio en los gases en su interior, el método de detección de los gases es de tipo colorimétrico, con reactivos del tipo dicromato de potasio para determinar el etanol volátil (US 6306620).
En los últimos años y gracias al aumento de la capacidad de medir señales de luz débiles (Ntziachristos y cois. 2005, Fujimoto y cois. 2000, Watanabe y cois. 2007) se ha desarrollado una tecnología para la determinación de viabilidad en semillas por luminiscencia retardada. Se considera que los fotones pueden ser considerados como portadores de información debido a su interacción a nivel atómico y molecular, entregando información acerca de los componentes químicos y la estructura compleja de dichos sistemas (Costanzo y cois. 2008). Si bien dicho sistema permite determinar la viabilidad de muestras vegetales de manera no invasiva y con resultados bastante acertados, se requiere una serie de sofisticados equipos para realizar las mediciones y el análisis de las mismas.
Por otro lado, para la detección de viabilidad de semillas existen algunas tecnologías no destructivas basadas en la corriente bioeléctrica . Cada organismo contiene niveles de actividad Redox, y en plantas se ha establecido que las corrientes bioeléctricas están asociadas con la movilidad de iones. La actividad Redox puede ser usada para monitorear los niveles de actividad enzimática y consecuentemente la viabilidad de la semilla. En el método diseñado, se humedecen las semillas con el fin de que comience la primera fase de su ciclo de pregerminación, y se hace pasar corriente eléctrica por ellas. Se ha calibrado la viabilidad de las semillas correlacionando la longitud radicular con¡ los valores de corriente eléctrica medidos en las correspondientes semillas (US 3852914) . Este método si bien no es invasivo, requiere de equipamiento especial que permita realizar las mediciones y el análisis de las mismas. La presente invención posee ventajas sobre las materias descritas en el estado del arte, dado que permite detectar de manera simple la viabilidad de células, tejidos vegetales y plantas sin dañar las muestras analizadas, permitiendo su posterior crecimiento y utilización de manera normal. Por otro lado, la presente invención entrega resultados fidedignos sin requerir de equipos sofisticados para su implementación o de la interpretación de resultados.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION
La presente invención se refiere a un método de detección de viabilidad de células, tejidos vegetales y/o plantas completas en base a la determinación de la actividad de la alfa-amilasa liberada al medio, la enzima es detectada indirectamente determinando almidón degradado en el un medio de cultivo suplementado con dicho carbohidrato.
El método para determinar viabilidad de una muestra vegetal de la presente invención comprende las siguientes etapas:
a) Proveer un dispositivo de detección de viabilidad que contenga un medio de cultivo sólido o semisólido adecuado para los requerimientos nutricionales de una muestra vegetal, donde el medio de cultivo posee un suplemento de almidón; b) Crecer el tejido vegetal en el dispositivo de detección de viabilidad de la etapa anterior;
c) Retirar la muestra de tejido vegetal del dispositivo de detección de viabilidad;
d) Revelar el dispositivo de detección de viabilidad.
La presente invención comprende un kit para la detección de viabilidad de una muestra vegetal el cual comprende: un soporte, un medio de cultivo, un suplemento de almidón, y una composición de revelado en base a yodo. Donde el suplemento de almidón es para ser agregado el medio de cultivo en una concentración suficiente para lograr una concentración de almidón en el medio de cultivo de entre 0,5 y 5,0 gLT1. Donde el medio de cultivo y el suplemento de almidón se mezclan para formar un medio de cultivo suplementado con almidón. El soporte contiene el medio de cultivo suplementado con almidón. El medio de cultivo suplementado con almidón tiene una concentración de almidón de entre 0,5 y 5,0 gL-1.
La presente invención comprende un dispositivo de detección de viabilidad de una muestra vegetal que comprende un soporte que contiene un medio de cultivo suplementado con almidón en el cual se crece el tejido vegetal.
El dispositivo de detección de viabilidad comprende un soporte que comprende una placa, un frasco, una placa petri o un tubo eppendorf, con o sin tapa. El presente método de detección de viabilidad no destruye o daña los tejidos vegetales, permitiendo el normal crecimiento del vegetal luego de ser sometido a análisis de detección de viabilidad.
DESCRIPCION DE LA INVENCION
El método propuesto se basa en la detección de la actividad de la enzima alfa-amilasa liberada al medio de cultivo, como una manera de determinar la viabilidad de cualquier tejido vegetal. En términos generales, el método se basa en la capacidad de la enzima alfa-amilasa de degradar el almidón presente en el medio de cultivo del dispositivo de detección donde se crece la muestra vegetal, dicha degradación es evidenciada por la falta de color de la superficie del medio de cultivo del dispositivo, al ser revelado con una solución en base a yodo. La enzima alfa-amilasa está principalmente presente en los tejidos vegetales, por lo cual el método tiene un nivel de selección frente al crecimiento de otros organismos, sin perjuicio de lo anterior, en su modalidad preferida el método se desarrolla en condiciones de asepsia convencionales del estado del arte.
La enzima alfa-amilasa está presente en todos los tejidos y células vegetales, y si bien presenta distinto grado de presencia y actividad en los diferentes tejidos y estados de desarrollo de una planta, ellos son perfectamente detectables por el método propuesto.
El método presentado permite determinar viabilidad en muestras vegetales provenientes de diferentes especies vegetales de plantas ginmospermas o angiospermas, monocotiledóneas o dicotiledóneas, a partir de plantas crecidas in vivo o cultivadas in vitro. Por otro lado, el presente método permite determinar la viabilidad en diferentes estadios de desarrollo de la planta, por ejemplo y no limitantes a organogénesis, callogénesis , embriogénesis somática, tejidos diferenciados y tejidos sexuales. El método para determinar la viabilidad descrito en la presente invención permite determinar viabilidad en tejidos vegetales provenientes de diferentes partes de la planta, no limitantes a hojas, tallos, peciolos, callos, embriones, protocormos, rizomas o raices, además de polen y semillas.
El método para determinar la viabilidad diseñado puede ser aplicado a cualquier proceso de cultivo vegetal que requiera una etapa de detección de viabilidad ya sea con fines comerciales, de investigación científica u otro, por ejemplo, y sin limitarse a, tecnología de micropropagación, viabilidad en granos de polen, viabilidad de tejidos in vitro y ex vitro sometidos a estrés biótico y abiótico, viabilidad de tejidos de plantas modificadas genéticamente, viabilidad de ovarios, detección de viabilidad de cualquier tejido vegetal y cultivo en bioreactores .
El medio de cultivo es elegido dentro del estado del arte de acuerdo a los requerimientos nutricionales propios del tejido vegetal a analizar. Dicho medio de cultivo puede ser suplementado con compuestos normalmente utilizados en procesos tales como: cultivar tejidos vegetales; seleccionar tejidos transformados; evitar contaminación del medio con otros organismos procariontes o eucariontes; estimular la respuesta morfogénica de los tejidos; garantizar el desarrollo y el crecimiento de las células o tejidos en el estado fisiológico donde se desarrolle el presente método de detección de viabilidad, entre otros. Los compuestos con los cuales se puede suplementar el medio de cultivo comprenden por ejemplo: sales inorgánicas, sales orgánicas, minerales, vitaminas, aminoácidos, reguladores del crecimiento natural o sintético, agar o cualquier otro polímero utilizado para solidificar medios de cultivo, bactericidas, fungicidas; ácidos orgánicos y ácidos inorgánicos y agua.
El medio de cultivo de la presente invención es suplementado además con almidón, en su modalidad preferida, la concentración de almidón del medio de cultivo está entre 0,5 y 5,0 gL-1, de preferencia entre 1,0 y 3,0 gL-1, más preferentemente entre 1,0 y 2,0 gL-1. La composición de revelado de la presente invención es en base a yodo con una solución de yodo al 10%, dicha composición de revelado puede contener además conservantes, tales como ácidos orgánicos, antibióticos y fungicidas.
El dispositivo de la presente invención es elaborado en condiciones de esterilidad y asepsia comunes descritas en el estado del arte. La muestra vegetal es tratada considerando las condiciones de asepsia normales descritas en el estado del arte.
En el método para determinar la viabilidad de la presente invención las muestras vegetales se sitúan en la superficie del medio de cultivo del dispositivo y se incuban por un periodo de tiempo y condiciones de temperatura adecuadas para cada especie vegetal. En su modalidad preferida, el cultivo de los tejidos vegetales se realiza en condiciones de oscuridad dado que se obtiene un mayor consumo de almidón por parte del tejido vegetal.
En la etapa c) se retira la muestra de tejido del medio de cultivo. La muestra vegetal analizada puede ser posteriormente subcultivada en medio de cultivo sin almidón o utilizada de acuerdo a los fines que el usuario estime conveniente.
En la etapa d) de revelado del dispositivo de detección de viabilidad, se vierte una solución de yodo sobre la superficie del medio de cultivo y se incuba por un periodo de tiempo a temperatura ambiente, en su modalidad preferida, esta incubación dura entre 3 y 5 minutos y se realiza entre 20 y 25°C. Posteriormente, se retira la solución de yodo de la superficie y como resultado positivo de viabilidad, se aprecia un halo incoloro en el lugar donde se creció la muestra vegetal. Este halo refleja la degradación del almidón presente en el medio de cultivo. La degradación del almidón por parte de las enzimas del vegetal queda en evidencia de manera visual, detectando de esta forma la viabilidad de la muestra evaluada. Si el tejido está vivo se observa un halo incoloro debajo del lugar donde este se encontraba el tejido. El halo puede tener un tamaño variable, en dependencia del tipo de tejido y la especie vegetal, sin embargo, se observan diferencias claras entre el color del medio de cultivo y el halo formado en la zona de cultivo del explante cuando el tejido es viable. Si el tejido está muerto la superficie debajo del explante evaluado se tiñe de azul de manera similar al resto del medio de cultivo.
DESCRIPCIÓN DETALLA DE LAS FIGURAS
FIGURA 1. Estandarización de la concentración de almidón en el medio de cultivo para la de detección de viabilidad de los vegetales. En la fotografía se muestran 4 placas de medio de cultivo (medio basal MS + 7 gL-1 de agar-agar + 30 gL-1 de sacarosa) suplementado con diferentes concentraciones de almidón, Placa A: 1,0 gL"l; B: 1,0 gL-1, Placa C: 1,5 gL-1, Placa D: 2,0 gL-1. Explantes de segmentos nodales de tabaco fueron cultivados en las 4 placas por 72 horas a 25°C en oscuridad. Posteriormente, se retiraron los explantes de las placas B, C y D, y dichas B, C y D placas fueron reveladas con una solución de yodo al 10%. La placa A corresponde a controles de explantes vivos que corresponden a segmentos nodales de tabaco creciendo en S + 7 gL-1 de agar-agar + 30 gL-1 de sacarosa + almidón 1,0 gL-1 cuya placa no fue revelada. Las flechas en las placas B, C y D marcan algunos de los lugares donde se sembraron los explantes.
FIGURA 2. Detección de viabilidad en rizomas vivos (A) y muertos (B) de la orquídea terrestre Chloraea crispa. La señal de viabilidad en los tejidos vivos (Placa A) se expresa en la formación de un halo incoloro en la zona de cultivo de los explantes, efecto que no se produce en los tejidos muertos (Placa B) . Los tejidos vivos y muertos se incubaron en las placas A y B durante 72 horas a la oscuridad, reposo y 25°C de temperatura. Transcurrido ese tiempo se retiraron los rizomas y las placas fueron tratadas con solución reveladora. Las flechas marcan los lugares donde se sembraron los explantes.
FIGURA 3. Detección de viabilidad en diferentes tejidos de Papaya. La Figura A corresponde a la detección de viabilidad del segmento nodal de Papaya {Carica vasconcellea) cultivadas en medio basal MS + Sacarosa (30 gL-1) + GA3 (1,0 mgL-1) + Almidón (1,0 gL-1) en triplicado. La figura B corresponde a la detección de viabilidad de hojas de Papaya {Carica vasconcellea) cultivadas en medio basal MS + Sacarosa (30 gL-1) + GA3 (1,0 mgL-1) + Almidón (1,0 gL-1) en triplicado. Todos losótej idos se incubaron en placas durante 72 horas a la oscuridad, reposo y 25°C de temperatura. Transcurrido ese tiempo se retiraron los segmentos nodales y las hojas de Papaya de las placas, y las placas fueron tratadas con solución reveladora. Las flechas marcan algunos de los lugares donde se sembraron los explantes.
FIGURA 4. Detección de viabilidad en meristemos de orquídeas. Los tejidos fueron cultivados en medio Sales Medio Van aes + Sacarosa (30 gL-1) + TDZ (1,5 mgL"1) + IBA (1,5 mgL"1) + almidón (1,0 gL-1) en triplicado. Todos los tejidos se incubaron en las placa durante 72 horas a la oscuridad, reposo y 25°C de temperatura. Transcurrido ese tiempo se retiraron los meristemos, y las placas fueron tratadas con la solución reveladora. La flecha marca uno de los lugares donde se sembraron los explantes.
FIGURA 5. Detección de viabilidad segmentos nodales de tabaco {Nicotiana tabacum) . Los tejidos fueron cultivados en MS + Sacarosa (30 gL-1) + 6- Bencilaminopurina (BAP) (0,1 mgL"1) + almidón (1,0 gL-1) en triplicado. Todos los tejidos se incubaron en placas durante 72 horas a la oscuridad, reposo y 25°C de temperatura. Transcurrido ese tiempo se retiraron los segmento nodales y las placas fueron tratadas con solución reveladora. La flecha marca uno de los lugares donde se sembraron los explantes .
Figura 6. Efecto del almidón sobre la respuesta morfogénica de segmentos nodales cultivados sobre medio basal de propagación durante 15 días. En (A) se muestran segmentos nodales de tabaco cultivados en medio de cultivo sin fuente de carbono.
En (B) se muestran segmentos nodales de tabaco cultivados en medio de cultivo suplementado con Sacarosa 30 gL"1, como fuente de energía, y almidón a 1,5 gL-1. En (C) se muestran segmentos nodales de tabaco cultivados en medio de cultivo suplementado solo con almidón a 1,5 gL"1.
EJEMPLOS DE APLICACIÓN
Ejemplo 1: Estandarización del medio de cultivo para el dispositivo de detección de viabilidad.
Con el fin de definir la composición de almidón del medio de cultivo de prueba a utilizar en los experimentos siguientes, se realizaron pruebas con medio de cultivo básico suplementado con diferentes concentraciones de almidón. En este experimento (Figura 1) se utilizó como modelo segmentos nodales de tabaco (Nicotiana tabacum) .
El medio de cultivo se . preparó con medio basal MS
(Murashige y Skoog, 1962) y agar-agar (7 gL"1) , suplementado con sacarosa (30 gL"1) y diferentes cantidades de almidón (0,5 gL"1, 1,0 gL"1, 1,5 gL"1, 2,0 g"1) . El pH del medio de cultivo se ajustó a 5,6-5,7, antes de esterilizar. La esterilización del medio de cultivo se realizó mediante vapor a presión en autoclave a temperatura de 121 °C, presión de 1 kgcm"2 y durante
30 minutos. Una vez estériles los medios de cultivo fueron dispensados en dispositivos de detección de viabilidad tales como placas de Petri en condiciones de asepsia.
Los explantes fueron tomados a partir de segmentos nodales f
de tabaco asépticos crecidos in vitro. Los explantes se prepararon en segmentos de 0,5 cm de largo y 0,5 cm de longitud. Una vez preparados, los explantes se colocaron en los dispositivos de detección de viabilidad, tratando de mantener una distancia suficiente entre ellos para evitar interferencias en las señales de viabilidad, preferentemente 5 explantes por dispositivo. Los explantes se cultivaron por 1, 2, 3 y 5 días , a 25°C y en condiciones de oscuridad. Luego de este periodo de incubación se retiraron los explantes de las placas y estas fueron reveladas con una solución de yodo como se indica en el siguiente párrafo. El revelado de las placas se realizó utilizando una solución de yodo diluido al 10%. La solución de yodo diluido al 10% se preparó en dos etapas: En primer lugar, se preparó una solución incolora de Yoduro de Potasio (KI) 300 gLT1. Posteriormente, la solución KI fue utilizada para preparar la solución Yodada agregando 233,1 mL de solución KI y 56 g de cristales de Yodo a 500 mi de agua destilada. La solución se agitó por 1 hora o hasta disolver completamente los cristales y homogenizar la disolución y se dejó reposar por 24 horas. Finalmente, el volumen de la solución fue ajustado añadiendo 3,5 litros de agua destilada.
Para visualizar las señales de viabilidad en las placas de detección, se aplicó una película de solución de yodo diluida al 10% por 3 minutos sobre la superficie de las placas hasta que se observó tinción en el medio de cultivo. Posteriormente, se retiró la solución de yodo de la superficie de las placas mediante escurrimiento .
En la Figura 1 se muestra los resultados de la estandarización del medio de cultivo en experimentos de detección de viabilidad en segmento nodales de tabaco, en las placas B, C y D se observa un halo incoloro en la superficie donde se cultivaron los implantes, demostrando la viabilidad de los tejidos crecidos. Se determinó utilizar 1,5 gL"1 de almidón en el medio de cultivo como concentración preferida para la detección de viabilidad celular en este modelo experimental .
EJEMPLO 2: Detección de viabilidad en diferentes explantes de frutilla (Fragaria chiloensis) , Tabaco (Nicotiana tabacum) , arándanos [Vaccinum corymbosun) y papaya andina {Carica vasconcellea) .
Se realizaron pruebas de viabilidad de explantes obtenidos de diferentes especies vegetales y distintos tejidos de las mismas, utilizando el dispositivo de detección de viabilidad de la presente invención.
Los pasos experimentales para detectar la viabilidad de los diferentes tejidos son descritos a continuación: a) Preparación de las placas de detección de viabilidad:
Se utilizó el medio basal MS (Murashige y Skoog, 1962) suplementado con 1,5 gL-1 de almidón, 30 gL-1 de Sacarosa, 7 gL" 1 de agar-agar y reguladores del crecimiento de acuerdo al tipo de explante y la especie, como se indica en la Tabla 1. Esta concentración de trabajo se eligió de acuerdo al tipo de explante, la especie vegetal y el proceso morfogénico en el cual se realiza la detección de la viabilidad.
Las sales básales y las vitaminas del medio MS se añadieron de acuerdo a las concentraciones sugeridas para la preparación de este medio de cultivo, sin ninguna modificación (Murashige y Skoog, 1962) . El pH del medio de cultivo se ajustó a 5,6-5,7, antes de esterilizar. La esterilización del medio de cultivo se realizó mediante vapor a presión en autoclave a temperatura de 121 °C, presión de 1 kgcrrf2 y durante 30 minutos. Una vez estériles los medios de cultivo fueron dispensados en placas de Petri en condiciones de asepsia.
Las placas pueden ser selladas y mantenidas a la oscuridad y temperatura ambiente hasta 30 días, antes de ser utilizadas. Tabla 1. Composición de los medios de cultivo utilizados en las pruebas de viabilidad de diferentes explantes y especies.
Figure imgf000020_0001
Especie Explante Medio de Cultivo
Frutilla Hoj as, Sales MS + Sacarosa (30 gL"1) + Ácido tallos , Indolbutírico (IBA) (1,0 mgL"1) .
peciolos
Callos Sales MS + Sacarosa (30 gL"1) + IBA
(0,01 mgL_1) + TDZ (0,25 mgL"1)
Arándanos Hoj as , Sales Woody Plant Médium (McCown y tallos , Lloyd, 1991)+ Sacarosa (30 gL"1) + 2- peciolos , iP (4,0 mgL"1) .
callos .
Orquídeas Hojas, Sales Medio Van Waes (van aes and rizomas . Debergh, 1986) + Sacarosa (30 gL"1) +
TDZ (1,5 mgL"1) + IBA (1,5 mgL"1).
Callos, Sales Medio Van Waes (van Waes and embriones Debergh, 1986) + Sacarosa (30 gL"1) + somáticos BAP (0,2 mgL"1) .
b) Preparación de los explantes :
Todos los explantes se tomaron a partir de plantas crecidas en condiciones in vitro. Los explantes se prepararon en segmentos de 0,5 cm de largo y 0,5 cm de longitud para el caso de las hojas; 0,5 cm de diámetro para los callos; 0,5 cm de longitud para los segmentos nodales y peciolos. c) Cultivo de los explantes en las placas de cultivo y ensayo de viabilidad.
Una vez preparados, los explantes se colocaron en la placa de detección de viabilidad, tratando de mantener una distancia suficiente entre ellos para evitar interferencias en las señales de viabilidad. En este caso no se colocaron más de 6 explantes en placas de 10 cm de diámetro, sin perjuicio de otras densidades en las especies y tejidos lo permitan. Todos los explantes se colocaron sobre el medio de cultivo tal como si fueran a ser manipulados para generar respuestas morfogénicas de acuerdo a las indicaciones de los protocolos para cada especie.
Los explantes se cultivaron en las placas de detección de viabilidad desde 24 horas a 5 días y fueron cultivados a 25°C y en condiciones de oscuridad.
Los explantes se retiraron del medio de detección de viabilidad para el posterior revelado de las placas. Los explantes se subcultivaron en medio de cultivo recomendado para cada especie para inducir la respuesta morfogénica deseada. En este caso, se utilizó el medio de cultivo basal descrito en la Tabla 1, pero sin la adición de almidón. La Figura 6 muestra que el periodo de cultivo en el medio de detección de viabilidad no afectó la respuesta morfogénica.
El revelado de las placas de detección de viabilidad se realizó utilizando una solución de yodo diluido al 10%, esta solución se preparó de acuerdo al protocolo para la preparación de la solución de yodo descrito en el Ejemplo 1.
Para visualizar las señales de viabilidad en las placas de detección, se aplicó una película de solución de yodo diluida al 10% por 3 minutos sobre la superficie de las placas hasta que se observó tinción en el medio de cultivo. Posteriormente, se retiró la solución de yodo de la superficie de las placas mediante escurrimiento .
A modo de control, se realizaron pruebas de viabilidad con muestras de tejido vivo y muerto. Con este fin, se utilizaron rizomas de la orquídea terrestre Chloraea crispa cultivada in vitro. Las muestras de tejido muerto se obtuvieron esterilizándolas en una autoclave a 121°C y 1 kgcnf2 por 40 minutos. En la Figura 2 se muestra los resultados de dicho experimento, demostrando que el sistema de detección permite determinar de manera clara la viabilidad del tejido en estudio, dado que se aprecia claramente un halo incoloro en la superficie de la placa donde se cultivaron los tejidos vivos (Figura 2A) , debido a la degradación del almidón en este sector de la placa. Dichos halos no se observan en las placas con tejidos muertos (Figura 2B) .
En las Figuras 3, 4 y 5 se muestran los resultados de las pruebas de viabilidad realizadas para algunos de los tipos de tejidos descritos en la Tabla 1. En estas fotografías se puede comprobar que el sistema propuesto permite detectar la actividad de los tejidos vivos de diferentes orígenes, tanto a nivel de especie como de tipo de tejido, con independencia del medio de cultivo basal utilizado.
Cabe mencionar que los tejidos utilizados en estas pruebas son los comúnmente utilizados en los protocolos de multiplicación in vitro de la mayoría de las especies vegetales.
Ejemplo 3. Efecto del almidón en el crecimiento de los tejidos vegetales.
Con el fin de determinar el posible efecto del almidón en el crecimiento normal y respuesta morfogénica de los tejidos sometidos a la prueba de detección de viabilidad, se cultivaron segmentos nodales de tabaco durante 15 días en medio basal de propagación (medio MS) suplementado con diferentes fuentes de carbono. Los medios de cultivo fueron preparados según protocolo descrito en los ejemplos anteriores. Se prepararon 3 medios de cultivo diferentes, ellos fueron: sin fuente de carbono (Figura 6 A), medio de cultivo suplementado con Sacarosa 30 gL-1, como fuente de energía, y almidón a 1,5 gL-1 (Figura 6 B) y medio de cultivo suplementado solo con almidón a 1,5 gL-1 (Figura 6 C) .
En la Figura 6 se muestra el efecto de los diferentes tipos de medio de cultivo sobre los segmentos nodales de tabaco. En las fotografías de la Figura 6 A y 6 C se aprecia un escaso crecimiento de las plantas, mostrando que el almidón no reemplaza la fuente de carbono para estos cultivos. Por otro lado, en la Figura 6B se aprecia que el almidón no afectó el crecimiento de la planta cultivada, produciéndose un crecimiento y respuesta morfogénica normales para la planta.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un método para determinar viabilidad de una muestra vegetal CARACTERIZADO comprende las siguientes etapas:
a) Proveer un dispositivo de detección de viabilidad que contenga medio de cultivo sólido o semisólido adecuado para los requerimientos nutricionales de una muestra vegetal, donde el medio de cultivo posee un suplemento de almidón;
b) Crecer el tejido vegetal en el dispositivo de detección de viabilidad de la etapa anterior;
c) Retirar la muestra de tejido vegetal del dispositivo de detección de viabilidad; y
d) Revelar el dispositivo de detección de viabilidad.
2. El método de la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque la etapa a) comprende proveer un dispositivo de viabilidad que comprende un medio de cultivo suplementado con almidón en una concentración de almidón de entre 0,5 y 5,0 gL-1, de preferencia entre 1,0 y 3,0 gL-1.
3. El método de la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque la etapa a) comprende proveer un dispositivo de viabilidad que comprende un medio de cultivo suplementado con almidón en una concentración de almidón de entre 1,0 y 2,0 gL-1, de preferencia 1,5 gL"1.
4. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, CARACTERIZADO porque la etapa b) se realiza en condiciones de oscuridad, a 25°C, durante 72 horas.
5. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, CARACTERIZADO porque la muestra que se retira en la etapa c) puede ser posteriormente subcultivada en un medio de cultivo sin almidón.
6. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, CARACTERIZADO porque la etapa de revelado se realiza con una solución de revelado que es una solución de yodo al 10%, y que opcionalmente puede contener conservantes tales, como ácidos orgánicos, antibióticos y fungicidas .
7. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, CARACTERIZADO porque en la etapa de revelado se vierte sobre el dispositivo de detección una solución de yodo al 10% y se incuba por 3 a 5 minutos a una temperatura de entre 20 y 25°C.
8. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, CARACTERIZADO porque la etapa de revelado además comprende retirar la solución de yodo y observar la presencia de un halo incoloro que indica que la muestra vegetal es viable.
9. Un dispositivo de detección de viabilidad CARACTERIZADO porque comprende: un soporte que posee un medio de cultivo suplementado con almidón.
10 El dispositivo de detección de viabilidad de acuerdo a la reivindicación 9, CARACTERIZADO porque el medio de cultivo tiene una concentración de almidón de entre 0,5 y 5,0 gL-1, de preferencia entre 1,0 y 3,0 gL-1.
11 El dispositivo de detección de viabilidad de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, CARACTERIZADO porque el medio de tiene una concentración de almidón de entre 1,0 y 2,0 gL-1, de preferencia 1,5 gL-1.
12 El dispositivo de detección de viabilidad de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, CARACTERIZADO porque el soporte que comprende una placa, un frasco, una placa petri o un tubo eppendorf, con o sin tapa.
13. Un Kit de detección de viabilidad CARACTERIZADO porque comprende: un soporte, un medio de cultivo, un suplemento de almidón y una composición de revelado.
14. El Kit de acuerdo a la reivindicación 13,
CARACTERIZADO porque el suplemento de almidón es para ser agregado el medio de cultivo en una concentración suficiente para lograr una concentración de almidón en el medio de cultivo de entre 0,5 y 5,0 gL-1.
15. El Kit de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14, CARACTERIZADO porque el medio de cultivo y el suplemento de almidón se mezclan para formar un medio de cultivo suplementado con almidón.
16. El Kit de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, CARACTERIZADO porque el soporte contiene un medio de cultivo suplementado con almidón.
17. El Kit de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, CARACTERIZADO porque el medio de cultivo suplementado con almidón tiene una concentración de almidón de entre 1,0 y 3,0 gL-1.
18. El Kit de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, CARACTERIZADO porque la concentración de almidón en el medio de cultivo es de entre 1,0 y 2,0 gL"1, de preferencia 1,5 gL"1.
19. El Kit de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, CARACTERIZADO porque la solución de revelado es una solución de yodo al 10%, y opcionalmente puede contener conservantes tales como ácidos orgánicos, antibióticos y fungicidas .
20. El Kit de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19, CARACTERIZADO porque el soporte comprende una placa, un frasco, una placa petri o un tubo eppendorf, con o sin tapa
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