WO2011089951A1 - 糖尿病網膜症の予防又は治療剤及び糖尿病網膜症の予防又は治療を目的とした食品、糖尿病網膜症の各種兆候の改善剤及び糖尿病網膜症の各種兆候の改善を目的とした食品並びに糖尿病網膜症の予防又は改善剤の投与時期を決定する方法 - Google Patents

糖尿病網膜症の予防又は治療剤及び糖尿病網膜症の予防又は治療を目的とした食品、糖尿病網膜症の各種兆候の改善剤及び糖尿病網膜症の各種兆候の改善を目的とした食品並びに糖尿病網膜症の予防又は改善剤の投与時期を決定する方法 Download PDF

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agent
lutein
diabetic
prevention
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一男 坪田
洋子 小澤
真理子 佐々木
沙織 小林
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学校法人 慶應義塾
株式会社わかさホールディングス
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Definitions

  • the present invention relates to a preventive or therapeutic agent for diabetic retinopathy and a food intended for the prevention or treatment of diabetic retinopathy, an agent for improving various signs of diabetic retinopathy and a food intended to improve various signs of diabetic retinopathy,
  • the present invention also relates to a method for determining the timing of administration of a preventive or ameliorating agent for diabetic retinopathy.
  • Diabetic retinopathy is one of the complications caused by retinal damage caused by diabetes. In recent years, diabetic retinopathy has become the second leading cause of blindness following glaucoma. Diabetic retinopathy is also one of the causes of blindness in young people, and the development of a prevention or treatment method is urgently needed.
  • Diabetic retinopathy is classified into (1) simple diabetic retinopathy, (2) preproliferative diabetic retinopathy, and (3) proliferative diabetic retinopathy, depending on the degree of progression.
  • the Ophthalmological Society of Japan defines simple diabetic retinopathy as an early stage diabetic retinopathy, pre-proliferative diabetic retinopathy as a step more advanced than simple diabetic retinopathy, and proliferative diabetic retinopathy as a severe stage in diabetic retinopathy. Yes.
  • In the stage of simple diabetic retinopathy and preproliferative diabetic retinopathy there is often no subjective symptoms, and when symptoms appear, the stage has progressed considerably (proliferative diabetic retinopathy) in many cases. It is important to prevent and treat diabetic retinopathy as early as possible, but it is difficult to accurately grasp the symptoms at the initial stage where subjective symptoms are not so common. Has not reached.
  • Precise fundus examination is an examination to examine bleeding and damage of retinal capillaries using an ophthalmoscope, fundus camera, etc. after mydriasis, but there should be no bleeding or damage of capillaries in the early stages of diabetic retinopathy In many cases, it is not necessarily sufficient for early detection of diabetic retinopathy.
  • Non-Patent Document 1 it has been reported that carotenoids decrease in patients with diabetic retinopathy.
  • Non-patent Document 2 describes that the decrease rate of MnSOD (manganese superoxide dismutase), which is known to decrease in diabetic retinopathy patients, was reduced by zeaxanthin administration.
  • MnSOD manganese superoxide dismutase
  • Patent Documents 1 to 3 attempts to treat diseases in the ophthalmic field by using a combination of a plurality of carotenoids have also been proposed (see, for example, Patent Documents 1 to 3).
  • lycopene, zeaxanthin, lutein and the like are mentioned as carotenoids, and diabetic retinopathy is exemplified as one of the target diseases.
  • Patent Documents 1 to 3 only describe that carotenoids generally have an antioxidative action and so on, and thus expect an effect in diseases in the ophthalmic field. Moreover, although the kind of disease in the ophthalmic field used as a treatment object, the composition and dosage of a therapeutic agent are illustrated, the data which demonstrate the effect are not described.
  • the problem to be solved by the present invention is a preventive or therapeutic agent for diabetic retinopathy, which can be appropriately prevented or treated at an early stage of diabetic retinopathy, particularly before the subjective symptoms of diabetic retinopathy appear.
  • food for the purpose of improving diabetic retinopathy an agent for improving various signs of diabetic retinopathy
  • a food for the purpose of improving various signs of diabetic retinopathy and a method for determining the timing of administration of an agent for preventing or improving diabetic retinopathy Is to provide.
  • the present invention reports that the electroretinogram measurement value is affected from the initial stage without diabetic retinopathy (Kawasaki, K. and Shirao, Y. “Electrical response” from “diabetic” retina. “Progress”, “Retinal” and “Eye” Research, “vol.” 17, “1998”, “pp.” 59-76.) It is a thing.
  • the present inventor conducted an experiment in which lutein was administered to a subject mouse in the very early stage of diabetic retinopathy, and found that the measured value of electroretinogram was improved.
  • the preventive or therapeutic agent for diabetic retinopathy according to the present invention is characterized by containing lutein.
  • the present invention is a prophylactic or therapeutic agent for diabetic retinopathy including lutein, which is administered at an early stage of diabetic retinopathy including simple diabetic retinopathy or preproliferative diabetic retinopathy.
  • the present invention is a food containing the aforementioned preventive or therapeutic agent for diabetic retinopathy. Moreover, this invention is a foodstuff ingested in the early stage of diabetic retinopathy including simple diabetic retinopathy or preproliferative diabetic retinopathy characterized by including lutein.
  • the present invention is an agent for improving various signs of diabetic retinopathy, specifically, an oxidative stress inhibitor, comprising lutein, and an agent for improving electroretinogram, comprising lutein It is.
  • the present invention is also an ERK activation inhibitor characterized by containing lutein.
  • suppression of ERK activation refers to suppression of phosphorylation of ERK (extracellular signal-regulated kinase).
  • the present invention is a decrease inhibitor of a neurotransmission-related molecule characterized by containing lutein, and a decrease inhibitor of brain-derived neurotrophic factor characterized by containing lutein.
  • the present invention is an apoptosis inhibitor for retinal ganglion cells, characterized by containing lutein.
  • the present invention is a food containing an agent for improving various signs of diabetic retinopathy as described above.
  • the present invention is a method for determining the timing of administration of a preventive or ameliorating agent for diabetic retinopathy containing lutein by comparing electroretinogram measurement values with normal electroretinogram measurement values.
  • the present invention provides a method for diagnosing diabetic retinopathy containing lutein by observing changes in the thickness of the inner reticulate layer, inner granule layer, and ganglion cell layer of the retina by optical coherence tomography (Optical Coherent Tomography, OCT). This is a method for determining the timing of administration of a prophylactic or improving agent.
  • OCT optical Coherent Tomography
  • Lutein is a structural isomer of zeaxanthin and, like zeaxanthin, is a substance present in the retina.
  • zeaxanthin is a substance present in the retina.
  • lutein it was thought that its function was also shared with zeaxanthin, but in recent years, lutein is in the periphery of the macula and zeaxanthin is in the center of the macula, even within the same retina. It has been found that the distribution ratio is high, and it is considered that there are also differences in the functions of lutein and zeaxanthin. There have been no reports of any substance other than lutein confirming the electroretinogram improvement effect in diabetic retinopathy.
  • the Japanese Ophthalmological Society defines simple diabetic retinopathy as early diabetic retinopathy.
  • the initial stage of diabetic retinopathy includes not only simple diabetic retinopathy but also pre-proliferative diabetic retinopathy. Shall be included.
  • an early stage of diabetic retinopathy including simple diabetic retinopathy or preproliferative diabetic retinopathy includes not only the stage diagnosed as simple diabetic retinopathy or preproliferative diabetic retinopathy
  • Retinopathy includes stages that are undeveloped or cannot be diagnosed with diabetic retinopathy. That is, the application target of the prophylactic or therapeutic agent and food of the present invention includes all diabetic patients who may develop diabetic retinopathy in the future.
  • the experiment performed using the mouse is described in the examples described later, in experimental animals such as a mouse, the blood glucose level is generally used as an index, and about one month after the onset of diabetes is referred to as the initial stage. .
  • the symptoms seen in the early stage of human diabetic retinopathy are shown.
  • the time when any one or more of the above initial symptoms are observed can be set as the administration time of the preventive or therapeutic agent for diabetic retinopathy including lutein.
  • the initial symptoms may not appear depending on the patient. It may also be felt as a subjective symptom only after diabetes has progressed considerably.
  • the timing of administration of the preventive or ameliorating agent for diabetic retinopathy including lutein is determined by comparing the change in electroretinogram waveform with the measured value of electroretinogram at normal time.
  • the method for determining the administration timing of the preventive or ameliorating agent for diabetic retinopathy containing these luteins is not limited to the administration timing of the prophylactic or ameliorating agent for diabetic retinopathy containing lutein to not only diabetic patients but also experimental animals such as diabetic mice. It can be used as a method of determining.
  • the prophylactic or therapeutic agent of the present invention can prevent or treat diabetic retinopathy more reliably by administering it at an early stage of diabetic retinopathy.
  • various improving agents of the present invention oxidative stress inhibitor, electroretinogram improving agent, ERK activation inhibitor, neurotransmission-related molecule decrease inhibitor, brain-derived neurotrophic factor decrease inhibitor, retinal ganglion cell
  • oxidative stress inhibitor electroretinogram improving agent
  • ERK activation inhibitor oxidative stress inhibitor
  • neurotransmission-related molecule decrease inhibitor oxidative stress inhibitor
  • ERK activation inhibitor oxidative stress inhibitor
  • neurotransmission-related molecule decrease inhibitor oxidative stress inhibitor
  • brain-derived neurotrophic factor decrease inhibitor e.g., retinopathy inhibitor of the present invention
  • retinal ganglion cell e.g., retinal ganglion cell
  • the food of the present invention contains the above-mentioned preventive or therapeutic agent for diabetic retinopathy or various improving agents, it can be taken at an early stage of diabetic retinopathy, thereby preventing or treating the above-mentioned diabetic retinopathy. Alternatively, it is possible to obtain actions and effects equivalent to those of various improvers.
  • the present invention can also be used for diabetes by a method using electroretinogram measurement values or by observing changes in the thickness of the inner reticulate layer, inner granule layer, and ganglion cell layer of the retina by optical coherence tomography.
  • the timing of administration of the preventive or ameliorating agent for retinopathy can be accurately determined.
  • it is useful for early detection and early prevention of diabetic retinopathy.
  • each OP wave (OP2, OP3, OP4) and total OP wave (OPs) of non-diabetic mice fed control diet and 1 month diabetic mice fed lutein supplemented diet or control diet The figure (B) which compared the integrated value ( ⁇ OPs) of the amplitude.
  • feed We compared the number of cells in which activated caspase-3 was detected in the ganglion cell layer (GCL) of non-diabetic mice fed control diet and diabetic mice fed lutein-supplemented diet or control diet Graph. The graph which compared the number of the TUNEL positive cells in the ganglion cell layer (GCL) of the non-diabetic mouse
  • the preventive or therapeutic agent for diabetic retinopathy of the present invention is characterized by containing lutein.
  • Administration Form As the administration form of the preventive or therapeutic agent for diabetic retinopathy of the present invention, there are systemic administration and local administration, and any of them may be used. Specifically, in addition to oral administration, intravenous administration such as ophthalmic administration, intravenous injection, etc. , Intramuscular administration, transdermal administration, nasal administration, intradermal administration, subcutaneous administration, intraperitoneal administration, rectal administration, mucosal administration, inhalation, intraarticular administration, etc. Oral administration, eye drop administration and the like are preferable.
  • intravenous administration such as ophthalmic administration, intravenous injection, etc.
  • Oral administration, eye drop administration and the like are preferable.
  • the dosage form of the preventive or therapeutic agent for diabetic retinopathy of the present invention includes a solid preparation, a semisolid preparation, a liquid preparation and the like, and is not particularly limited.
  • a solid preparation a semisolid preparation, a liquid preparation and the like
  • granules, powders, pills, troches, syrups, etc. in the case of eye drops, they are administered in the form of eye drops.
  • the content of lutein in the preventive or therapeutic agent for diabetic retinopathy of the present invention varies depending on the dosage form, and cannot be generally limited, and can be formulated into various dosage forms in relation to the dosage. What is necessary is just to select suitably.
  • a liquid preparation it can be adjusted to preferably 0.001 to 50 (w / v%), more preferably 0.01 to 20 (w / v%), and still more preferably 0.1 to 10 (w / v%).
  • w / v%) preferably 0.0002 to 0.2 (w / v%), more preferably 0.001 to 0.1 (w / v%), and in the case of solid preparations, preferably 0.01 to 50 (w / w%), More preferably, it can be prepared as 0.02 to 20 (w / w%), but is not necessarily limited to this range.
  • the dosage of the prophylactic or therapeutic agent for diabetic retinopathy of the present invention varies depending on the administration route, symptoms, age, weight, form of the prophylactic or therapeutic agent, and the like.
  • the amount of the active ingredient in the prophylactic or therapeutic agent for diabetic retinopathy is preferably 0.005 to 500 mg, more preferably 0.1 to 100 mg per kg of body weight of the subject in need of treatment, provided that for adults
  • the lower limit is preferably 0.01 mg (more preferably 0.1 mg) and the upper limit is preferably 20 g (more preferably 2000 mg, more preferably 500 mg, particularly preferably 100 mg). It is desirable to divide it into several times according to the symptoms.
  • the preventive or therapeutic agent for diabetic retinopathy of the present invention contains lutein as an essential component, but the preventive or therapeutic agent does not impair the purpose of the present invention.
  • Ingredients such as agents, physiologically active ingredients, salts, solvents, antioxidants, chelating agents, pearling agents, neutralizing agents, pH adjusting agents, emulsifiers and enzymes can be appropriately blended.
  • the preventive or therapeutic agent for diabetic retinopathy of the present invention may be a combination with conventionally known preventive or therapeutic components for diabetic retinopathy.
  • the preventive or therapeutic component includes carotenoids other than lutein, vitamins, minerals and the like.
  • the preventive or therapeutic agent for diabetic retinopathy of the present invention is an early stage of diabetic retinopathy, in particular, a time when diabetic retinopathy has not occurred, an early diabetic retinopathy, simple diabetic retinopathy or preproliferative diabetic retinopathy. It is preferable to administer at the timing.
  • “the time when diabetic retinopathy has not developed” refers to all the times when diabetes is not diagnosed. For example, there are times when various symptoms of diabetic retinopathy are not observed, but signs of diabetic retinopathy are observed.
  • the prophylactic or therapeutic agent for diabetic retinopathy of the present invention can prevent or treat diabetic retinopathy more reliably by appropriately using it in the initial stage of diabetic retinopathy.
  • Various improvers of the present invention are characterized by containing lutein.
  • the various ameliorating agents of the present invention include those that reduce various symptoms seen in diabetic retinopathy, such as an oxidative stress inhibitor, an electroretinogram ameliorating agent, an ERK activation inhibitor (ERK phosphorylation inhibitor). , Neurotransmitter-related molecule decrease inhibitor, brain-derived neurotrophic factor decrease inhibitor, retinal ganglion cell apoptosis inhibitor, and the like.
  • An oxidative stress inhibitor is one that suppresses oxidative stress in the retina induced by diabetes.
  • the electroretinogram improving agent is for preventing or improving attenuation of the electroretinogram waveform in diabetic retinopathy.
  • An ERK activation inhibitor increases the amount of pERK (phosphorylated extracellular signal-regulated kinase) in diabetic patients, etc., thereby suppressing the deterioration of synaptic transmission. The signal transmission function is maintained.
  • the neurotransmission-related molecule decrease inhibitor is a preventive or suppressive agent for the decrease in neurotransmission-related molecules in diabetic patients and the like.
  • the neurotransmission-related molecule means a protein that makes synaptic vesicles necessary for nerve transmission (synaptophysin) and the like.
  • the brain-derived neurotrophic factor decrease inhibitor is a compound that suppresses the decrease in brain-derived neurotrophic factor in diabetic patients and the like.
  • Brain-derived neurotrophic factor is a humoral protein of the nervous system that is indispensable for the survival of brain cells, and is also called BDNF (Brain-derived neurotrophic factor). This BDNF binds to a receptor (TrkB) specific for BDNF on the surface of the target cell and regulates the growth of neurons (survival, growth, hypersynaptic function, etc.), thereby allowing the brain cells to survive.
  • TrkB receptor
  • a retinal ganglion cell apoptosis inhibitor is one that prevents or inhibits retinal ganglion cells from causing cell death in diabetic patients and the like.
  • the dosage form, dosage form, lutein content, dosage, third component, combination, administration time, etc. of the various improving agents of the present invention are the same as those of the above-mentioned preventive or therapeutic agent for diabetic retinopathy of the present invention. is there.
  • various ameliorating agents of the present invention By using these various ameliorating agents of the present invention, various pathological conditions in diabetic retinopathy, particularly in early, simple retinopathy and preproliferative retinopathy, can be corrected and can be useful for early treatment of diabetic retinopathy. High nature.
  • the various improvers of the present invention can be used as experimental reagents in tests and research.
  • the content of lutein is preferably 0.0001 to 10 (w / v%), more preferably 0.001 to 5 (w / v%), particularly in the case of a liquid agent.
  • the content of lutein is preferably 0.0002 to 0.2 (w / v%), more preferably 0.001 to 0.1 (w / v%), and in the case of a solid agent, preferably 0.01 to 50 (w / w%), more preferably 0.02.
  • it can be prepared as -20 (w / w%), more preferably 0.05-10 (w / w%), etc., it is not necessarily limited to this range.
  • the method for determining the administration time of the agent for preventing or improving diabetic retinopathy of the present invention is to prevent or improve diabetic retinopathy by comparing electroretinogram measurement values with normal electroretinogram measurement values. This is a method for determining the timing of administration of a drug.
  • the electroretinogram is a recording of the retinal reaction that occurs when a light stimulus is applied to the eye, and serves as an index for confirming that the photoreceptor cells are functioning normally.
  • Ganzfeld System SG-2002 (LKC Technologies, Inc., Gaithersburg, Maryland, USA) is an example of a device that applies light stimulation to the eye
  • PowerLab System 2/25 (AD) is an example of an electroretinogram recording device. Instruments, New South Wales, Australia). The electroretinogram measurement method is described in detail in “Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, pp. 1433-1439. (2009)”.
  • Another method of determining the administration time of the preventive or ameliorating agent for diabetic retinopathy of the present invention is to observe changes in the thickness of the inner reticulated layer, inner granule layer, and ganglion cell layer of the retina by optical coherence tomography.
  • optical coherence tomography the structure of the retina can be observed without removing the eyes.
  • the blood glucose concentration (blood glucose level) in the tail vein of the mouse was measured using Medisafe Mini GR-102 (manufactured by Terumo Corporation). Then, 7 days after the first administration of STZ, a mouse whose blood glucose concentration was 250 mg / dl or more was considered to have developed diabetes. Mice that developed diabetes were divided into two groups. One was given a diet containing 0.1% lutein, and the other was given a diet without lutein (hereinafter also referred to as “control diet”). In addition, as a control group, a diabetic mouse and a non-diabetic mouse whose age was matched were prepared, and this non-diabetic mouse was also divided into two groups and fed with lutein-added food and control food.
  • Lutein-supplemented feed for mice, rats, and hamsters (cobalt 60-irradiated feed, CE-2 powder, Nippon Claire Co., Ltd.) with 0.1 lutein powder (95% contained, provided by Wakasa Life Co., Ltd.) w / w%) was used.
  • a mouse that has developed diabetes is referred to as a “diabetic mouse”
  • a mouse that has passed 1 month and 4 months from the onset of diabetes that is, from the start of administration of lutein-added diet or control diet
  • a 1-month and 4-month diabetic mouse is referred to as a 1-month and 4-month diabetic mouse, respectively.
  • FIG. 1 is a table showing the body weight and blood glucose concentration of diabetic and non-diabetic mice after 1 month and 4 months from the start of administration of lutein-added diet and control diet.
  • FIG. 1 there was no significant difference in body weight and blood glucose concentration between diabetic mice given lutein-added diet for 1 month and diabetic mice given 4 months.
  • FIG. 1 there was no difference in body weight and blood glucose concentration between non-diabetic mice fed with lutein-added diet and non-diabetic mice fed with control diet. For this reason, hereinafter, non-diabetic mice fed with a control diet are referred to as a control group.
  • ROS reactive oxygen species
  • FIG. 2 shows a fluorescence observation image of a frozen section one month after the start of ingestion of lutein-added food and control food.
  • the presence of ROS in each layer of the retina was observed as red fluorescence in the 1-month diabetic mice fed the control diet, whereas no fluorescence was observed throughout the retina in the diabetic mice fed the lutein supplemented diet (FIG. 2A).
  • the intensity in the diabetic mice fed with the lutein-added diet was significantly weaker than that in the diabetic mice fed the control diet (FIG. 2B). Accordingly, it was found that oxidative stress in the retina induced by diabetes is reduced by ingestion of lutein supplemented food.
  • an exploratory contact lens electrode is placed in the center of the cornea, a reference electrode is placed under the skin between the eyes, and a ground electrode is placed under the mouse tail. ). And it stimulated with the light pulse of 800 cd-s / m ⁇ 2 > and 4 milliseconds using Ganzfeld System SG-2002 (LKC Technologies, Inc., Gaithersburg, MD).
  • OP1 Oscillatory potential
  • OP2, OP3, OP4 were analyzed. Further, the sum of the amplitudes of OP2, OP3, and OP4 is taken as ⁇ OPs.
  • FIG. 3A shows ERG measurement data
  • FIG. 3B shows the amplitudes of OP2, OP3, and OP4 and their integrated values ( ⁇ OPs).
  • OP2 and OP3 and ⁇ OPs the amplitude of OP waves
  • ⁇ OPs their integrated values
  • FIG. 4 shows the expression of various proteins in the retina of 1-month diabetic mice (Diabetes + Lutein, Diabetes) fed with lutein-added diet or control diet and non-diabetic mice (Non-Diabetes) fed control diet. investigated.
  • FIG. 4A shows the result of immunoblot analysis of activated ERK (ie, phosphorylated ERK, pERK) in the retina
  • FIG. 4D shows the signal intensity in non-diabetic mice fed the control diet of FIG. Indicates the relative value of the hour. From these facts, the amount of activated ERK (pERK) in the retina of 1-month diabetic mice was significantly suppressed by ingestion of lutein-added food.
  • FIG. 4B shows the result of immunoblot of synaptophysin in the retina
  • FIG. 4E shows the relative value when the signal intensity in the non-diabetic mouse of FIG. 4B is 1.
  • Synaptophysin is a synaptic vesicle protein, and plays an important role in the generation of OP waves, ie, signal transduction, in photoreceptor cells.
  • OP waves ie, signal transduction
  • the levels of activated ERK (pERK) and synaptophysin did not change in the retina of non-diabetic mice fed with lutein supplemented diet. From the above, it was shown that in the retina of diabetic mice, the decrease in activated ERK (pERK) and the resulting synaptophysin was suppressed by continuous intake of lutein-added food.
  • FIG. 4C shows the result of immunoblot analysis of BDNF in the retina
  • FIG. 4F shows the relative value when the signal intensity in the non-diabetic mouse (Non-Diabetes) in FIG.
  • BDNF is one of the major trophic factors of retinal neurons, and it is known that BDNF decreases with diabetes.
  • FIG. 4F the decrease in BDNF was suppressed by continuous intake of the lutein-added diet.
  • the retina was fixed with 4% paraformaldehyde, and paraffin sections (6 ⁇ m) were prepared.
  • a section cut through the center of the lens and the center of the optic disc was used.
  • the sections were stained with hematoxylin and eosin, and the thickness of the inner reticulated layer (IPL), inner granular layer (INL), and outer granular layer (ONL) was measured.
  • the number of neurons in the ganglion cell layer (GCL) was counted.
  • FIG. 5A shows the thickness of the outer granular layer (ONL) of 4 month diabetic mice (Diabetes + Lutein, Diabetes) fed with lutein-added or control diet and non-diabetic mice (Non-Diabetes) fed with control diet.
  • the ratio of the thickness of the network layer (IPL) or the inner granular layer (INL) is shown.
  • FIG. 5A shows the relative thicknesses of the inner mesh layer (IPL) and the inner granule layer (INL) when the thickness of the outer granule layer (ONL) is 1. Their ratio was significantly decreased in the retina of diabetic mice, but the decrease was clearly suppressed by long-term administration of lutein.
  • FIG. 5A shows the reduction
  • FIG. 5B shows the number of neurons in the ganglion cell layer (GCL) of 4-month diabetic mice fed lutein-added diet or control diet and non-diabetic mice fed control diet.
  • the disappearance of nerve cells in the ganglion cell layer (GCL) was suppressed by long-term administration of lutein.
  • FIG. 6A shows the localization of activated caspase-3. Localization is indicated by arrows.
  • FIG. 6C shows the number of cells from which an activated caspase 3 signal was obtained.
  • FIG. 6B shows the result of TUNEL staining. Positive cells (cells causing cell death) are indicated by arrows. TUNEL positive cells were also observed in the ganglion cell layer (GCL). However, the number of positive cells was significantly reduced by ingesting lutein (FIG. 6D). These two points indicate that apoptosis induced by diabetic retinopathy and its related factors are suppressed or decreased by continuous intake of lutein-supplemented diet.

Abstract

本発明は、ルテインを含むことを特徴とする、糖尿病網膜症の予防又は治療剤，単純網膜症又は前増殖網膜症を含む糖尿病網膜症の初期段階において投与するための、当該予防又は治療剤，網膜電図の改善剤，網膜神経節細胞のアポトーシス抑制剤，神経伝達関連分子の減少抑制剤，ERK活性化抑制剤，脳由来神経栄養因子の減少抑制剤，網膜電図の測定値を正常時の網膜電図の測定値と比較することによって、或いは網膜の内網状層、内顆粒層、神経節細胞層の厚みの変化を光干渉断層法で観察することによって、糖尿病網膜症の予防又は改善剤の投与時期を決定する方法である。

Description

糖尿病網膜症の予防又は治療剤及び糖尿病網膜症の予防又は治療を目的とした食品、糖尿病網膜症の各種兆候の改善剤及び糖尿病網膜症の各種兆候の改善を目的とした食品並びに糖尿病網膜症の予防又は改善剤の投与時期を決定する方法
　本発明は、糖尿病網膜症の予防又は治療剤及び糖尿病網膜症の予防又は治療を目的とした食品、糖尿病網膜症の各種兆候の改善剤及び糖尿病網膜症の各種兆候の改善を目的とした食品、並びに糖尿病網膜症の予防又は改善剤の投与時期を決定する方法に関する。
　糖尿病網膜症は、糖尿病によって網膜が損傷して起こる合併症の１つである。近年では、糖尿病網膜症は緑内障についで中途失明の原因の第２位となっている。また、糖尿病網膜症は若年層における失明の原因の一つでもあり、その予防又は治療方法の開発が急務となっている。
　糖尿病網膜症は、その進行の程度によって、（１）単純糖尿病網膜症、（２）前増殖糖尿病網膜症、（３）増殖糖尿病網膜症に分類される。
　日本眼科学会では、単純糖尿病網膜症を初期の糖尿病網膜症、前増殖糖尿病網膜症を単純糖尿病網膜症より一歩進行した状態、増殖糖尿病網膜症を進行した糖尿病網膜症で重症な段階と定義している。単純糖尿病網膜症及び前増殖糖尿病網膜症の段階では、しばしば自覚症状がなく、症状が現れた時にはかなり進行した段階（増殖糖尿病網膜症）に至っている場合が多い。
　糖尿病網膜症はできるだけ初期の段階で予防、治療することが重要となるが、自覚症状があまり見られない初期段階ではその症状を的確に捉えることが難しく、実用的な予防、治療方法の発見には至っていない。
　現在、糖尿病網膜症の検査に最も良く用いられている方法は精密眼底検査である。精密眼底検査は、散瞳後に検眼鏡や眼底カメラ等を用いて網膜の毛細血管の出血や破損を調べる検査であるが、糖尿病網膜症の初期段階では毛細血管の出血や破損が見られないことも多く、糖尿病網膜症の早期発見に必ずしも十分とはいえない。
　一方、近年、糖尿病網膜症の患者においてカロチノイド類が減少すること等が報告されている（非特許文献１参照）。
　また、カロチノイド類の一種であるゼアキサンチンが糖尿病網膜症の改善に寄与することを示唆する報告もある（非特許文献２）。非特許文献２には、糖尿病網膜症の患者で低下することが知られているMnSOD（マンガンスーパーオキサイドディスムターゼ）の低下率が、ゼアキサンチン投与によって軽減されたことが記載されている。
　更に、複数のカロチノイド類を組み合わせて用いることにより、眼科領域における疾患を治療しようとする試みも提案されている（例えば特許文献１～３参照）。これら特許文献１～３には、カロチノイド類としてリコピンやゼアキサンチン、ルテイン等が挙げられており、対象疾患の一つとして糖尿病網膜症が例示されている。
　しかし、これら特許文献１～３には、カロチノイド類が一般に抗酸化作用を有すること等を根拠に眼科領域における疾患での効果を期待することが記載されているに過ぎない。また、治療対象となる眼科領域における疾患の種類や、治療剤の組成や投与量が例示されているものの、その効果を実証するデータは記載されていない。
特表2009-515821号公報 特表2008-520576号公報 特表2005-526719号公報
Brazionis, L., Rowley, K., Itsiopoulos, C. and O'Dea, K. "Plasma carotenoids and diabetic retinopathy." British Journal of Nutrition, volume 101, 2009, pp. 270-277 Kowluru, R.A., Menon, B. and Gierhart, D.L. "Beneficial effect of zeaxanthin on retinal metabolic abnormalities in diabetic rats." Investigative Ophthalmology of Visual Science, vol.49, 2008, pp. 1645-1651
　本発明が解決しようとする課題は、糖尿病網膜症の初期段階に、特には糖尿病網膜症の自覚症状等が現れる前に的確な予防又は治療を施すことのできる、糖尿病網膜症の予防又は治療剤及び糖尿病網膜症の改善を目的とした食品、糖尿病網膜症の各種兆候の改善剤及び糖尿病網膜症の各種兆候の改善を目的とした食品、糖尿病網膜症の予防又は改善剤の投与時期の決定方法を提供することにある。
　本発明は、糖尿病網膜症の早期発見手法を研究する過程で、糖尿病網膜症において自覚症状のない初期段階から網膜電図の測定値に影響が見られるとの報告（Kawasaki, K. and Shirao, Y.　"Electrical response from diabetic retina." Progress in Retinal and Eye Research, vol. 17, 1998, pp. 59-76.）に着目し、網膜電図の改善効果を有する物質を探索した結果、成されたものである。
　具体的には、本発明者は、糖尿病網膜症のごく初期段階において、被検体であるマウスにルテインを投与する実験を行い、網膜電図の測定値が改善されることを見出した。この結果成されたものが本発明に係る糖尿病網膜症の予防又は治療剤であり、ルテインを含むことを特徴とするものである。
　また、本発明は、ルテインを含む糖尿病網膜症の予防又は治療剤であって、単純糖尿病網膜症又は前増殖糖尿病網膜症を含む糖尿病網膜症の初期段階において投与するためのものである。
　さらに本発明は、上記した糖尿病網膜症の予防又は治療剤を含む食品である。
　また、本発明は、ルテインを含むことを特徴とする、単純糖尿病網膜症又は前増殖糖尿病網膜症を含む糖尿病網膜症の初期段階で摂取する食品である。
　本発明は、糖尿病網膜症の各種兆候の改善剤であり、具体的には、ルテインを含むことを特徴とする、酸化ストレス抑制剤、ルテインを含むことを特徴とする、網膜電図の改善剤である。
　また、本発明は、ルテインを含むことを特徴とする、ERK活性化抑制剤である。ここで、ERK活性化の抑制とはERK （extracellular signal-regulated kinase）がリン酸化されることを抑制することをいう。
　また、本発明は、ルテインを含むことを特徴とする、神経伝達関連分子の減少抑制剤であり、ルテインを含むことを特徴とする、脳由来神経栄養因子の減少抑制剤である。
　さらに、本発明は、ルテインを含むことを特徴とする、網膜神経節細胞のアポトーシス抑制剤である。
　本発明は、上記した糖尿病網膜症の各種兆候の改善剤を含む食品である。
　また、本発明は、網膜電図の測定値を正常時の網膜電図の測定値と比較することによって、ルテインを含んだ糖尿病網膜症の予防又は改善剤の投与時期を決定する方法である。
　さらに、本発明は、網膜の内網状層、内顆粒層、神経節細胞層の厚みの変化を光干渉断層法（Optical Coherent Tomography、OCT）で観察することによって、ルテインを含んだ糖尿病網膜症の予防又は改善剤の投与時期を決定する方法である。
　ルテインはゼアキサンチンの構造異性体であり、ゼアキサンチンと同様、網膜に存在する物質である。ルテインの発見当初は、その機能もゼアキサンチンと共通しているのではないかと考えられていたが、近年では、同じ網膜内であってもルテインは黄斑の周辺部において、ゼアキサンチンは黄斑の中心部において分布割合が高いことが分かってきており、ルテインとゼアキサンチンの機能においても異なる点があると考えられるようになってきている。ルテイン以外の物質について、糖尿病網膜症の網膜電図の改善効果が確認された例は報告されていない。
　なお、日本眼科学会では、単純糖尿病網膜症を初期の糖尿病網膜症と定義するが、本発明では、糖尿病網膜症の初期段階には単純糖尿病網膜症だけでなく前増殖糖尿病網膜症の段階をも含むものとする。さらに、「単純糖尿病網膜症又は前増殖糖尿病網膜症を含む糖尿病網膜症の初期段階」には、単純糖尿病網膜症又は前増殖糖尿病網膜症と診断された段階だけでなく、糖尿病を発症したが糖尿病網膜症は未発症或いは糖尿病網膜症の診断がつかない段階をも含むものとする。即ち、本発明の予防又は治療剤、食品の適用対象には、将来的に糖尿病網膜症を発症する可能性がある糖尿病患者の全てが含まれる。
　また、後述の実施例においてマウスを用いて行った実験について説明しているが、マウス等の実験動物では、一般的に血糖値を指標とし、糖尿病を発症させてから１ヶ月位を初期段階という。
　ここで、ヒトの糖尿病網膜症の初期段階で見られる症状を示す。特に次の（１）～（６）等がある。
（１）糖尿が出る
　血糖値が160mg/dl程度を超え、尿中に糖分が含まれる。
（２）尿の回数が多くなる（多尿症）
 　尿の糖分を薄めるために多量の水を排泄する結果、尿の回数や量が多くなる。
（３）のどが渇き水を大量に飲む（多渇症）
 　多尿のため、身体が水分を大量に欲しくなり、大量に水を飲むようになる。
（４）身体がだるく、疲れやすくなる
　糖尿病でインスリンが機能しなくなると食べた糖分や脂肪分を身体の細胞に吸収することができないため、エネルギー不足となり、疲れやすくなる。
（５）やせてくる
　摂取した食物のエネルギーが利用できないため、身体は筋肉を分解してエネルギーを得ようとし、その結果、やせてしまう、ミネラル分が尿に溶け出て、疲労感が加速される。
（６）食欲が異常に強くなる
　身体がエネルギー不足となるとなるため、強い空腹感を感じ、食欲が旺盛になる。
　従って、上記初期症状のいずれか１つ或いは複数の症状が見られる時期を、ルテインを含む糖尿病網膜症の予防又は治療剤の投与時期とすることができる。
　ただし、以上の初期症状は、糖尿病患者において一般的に見られると言われているが、患者によっては初期症状が現れない場合もある。また、糖尿病がかなり進行して初めて自覚症状として感じられる場合もある。
　そこで、網膜電図の波形の変化を正常時の網膜電図の測定値と比較することによって、ルテインを含む糖尿病網膜症の予防又は改善剤の投与時期を決定する。
　また、網膜の内網状層、内顆粒層、神経節細胞層の厚みの変化を光干渉断層法で観察することによって、ルテインを含む糖尿病網膜症の予防又は改善剤の投与時期を決定することもできる。
　これらのルテインを含む糖尿病網膜症の予防又は改善剤の投与時期を決定する方法は、糖尿病患者だけでなく糖尿病マウス等の実験動物に対する、ルテインを含む糖尿病網膜症の予防又は改善剤の投与時期の決定する方法として用いることができる。
　本発明の予防剤又は治療剤は、糖尿病網膜症の初期段階で投与することによって、より確実に、糖尿病網膜症を予防又は治療することができる。
　また、本発明の各種改善剤（酸化ストレス抑制剤，網膜電図の改善剤， ERK活性化抑制剤，神経伝達関連分子の減少抑制剤，脳由来神経栄養因子の減少抑制剤，網膜神経節細胞のアポトーシス抑制剤等）は、糖尿病網膜症の兆候の一部をそれぞれ改善できるため、糖尿病網膜症の予防又は治療剤としての効果も有するほか、試験・研究における、実験試薬等としても有用である。
　さらに、本発明の食品は、上述の糖尿病網膜症の予防又は治療剤、あるいは、各種改善剤を含むため、糖尿病網膜症の初期段階で摂取することによって、上述の糖尿病網膜症の予防又は治療剤、あるいは、各種改善剤と同等の作用、効果を得ることができる。
　さらにまた、本発明は、網膜電図の測定値を利用する方法によって、あるいは、網膜の内網状層、内顆粒層、神経節細胞層の厚みの変化を光干渉断層法で観察することでも糖尿病網膜症の予防又は改善剤の投与時期を的確に決定することができる。また、これらの方法を用いることにより、糖尿病網膜症の早期発見、早期予防にも役立つ。
ルテイン添加餌及び対照餌の摂取開始から１ヶ月及び４ヶ月経過後の糖尿病マウス及び非糖尿病マウスの代謝パラメータ（体重及び血中グルコース濃度）を示す表。 糖尿病マウスにルテイン添加餌及び対照餌を摂取させた場合の餌摂取開始から１ヶ月経過後の網膜中に存在する活性酸素の蛍光（赤色）観察像（Ａ）及び内顆粒層（INL）における蛍光強度（Ｂ）を示す図。 対照餌を摂取させた非糖尿病マウスとルテイン添加餌または対照餌を摂取させた１ヶ月糖尿病マウスの網膜電図（Ａ）、各OP波（OP2,OP3,OP4）及び全OP波（OPs）の振幅の積算値（ΣOPs）を比較した図（Ｂ）。 対照餌を摂取させた非糖尿病マウスとルテイン添加餌または対照餌を摂取させた糖尿病マウスの網膜におけるリン酸化（活性化）ERK、シナプトフィジン、及びBDNFの発現量をイムノブロットで分析した結果（Ａ～Ｃ）、及びそれらのシグナル強度を数値化して比較したグラフ（Ｄ～Ｆ）。 対照餌を摂取させた非糖尿病マウスとルテイン添加餌または対照餌を摂取させた糖尿病マウスの外顆粒層（ONL）の厚みに対する内網状層（IPL）、内顆粒層（INL）の厚さを比較したグラフ（Ａ）及び神経節細胞層（GCL）中の神経細胞（neuronal cell）の数を比較したグラフ（Ｂ）。 対照餌を摂取させた非糖尿病マウスとルテイン添加餌または対照餌を摂取させた糖尿病マウスの網膜におけるアポトーシス・マーカーである活性化カスパーゼ３（cleaved caspase3）の局在を示す写真。 対照餌を摂取させた非糖尿病マウスとルテイン添加餌または対照餌を摂取させた糖尿病マウスの網膜中でのTUNEL陽性細胞の存否を示す写真。 対照餌を摂取させた非糖尿病マウスとルテイン添加餌または対照餌を摂取させた糖尿病マウスの神経節細胞層（GCL）中における活性化カスパーゼ３（cleaved caspase3）が検出された細胞の数を比較したグラフ。 対照餌を摂取させた非糖尿病マウスとルテイン添加餌または対照餌を摂取させた糖尿病マウスの神経節細胞層（GCL）中におけるTUNEL陽性細胞の数を比較したグラフ。
　［本発明の糖尿病網膜症の予防又は治療剤］
本発明の糖尿病網膜症の予防又は治療剤は、ルテインを含むことを特徴とするものである。
　１．投与形態
　本発明の糖尿病網膜症の予防又は治療剤の投与形態としては、全身投与と局所投与があり、いずれでも良く、具体的には、経口投与のほか、点眼投与，静注等の静脈投与，筋肉内投与,  経皮投与，経鼻投与，皮内投与，皮下投与，腹腔内投与，直腸内投与，粘膜投与,  吸入，関節腔内投与，等が挙げられるが、適用が容易という点では、経口投与や点眼投与等が好ましい。
　２．剤形
　本発明の糖尿病網膜症の予防又は治療剤の剤形は、固形剤，半固形剤，液剤等が挙げられ、特に制限されるものでは無いが、経口投与の場合には、例えば錠剤，カプセル剤，顆粒剤，散剤，丸剤，トローチ，もしくはシロップ剤等の形態で、点眼投与の場合には、点眼剤の形態で投与される。
　３．含有量
　本発明の糖尿病網膜症の予防又は治療剤中のルテインの含有量は、剤形によって様々であり、一概に限定できず、各種剤形化が可能な範囲で、投与量との関係で適宜選択すれば良い。例えば液剤の場合、好ましくは0.001～50（w/v%）、より好ましくは0.01～20（w/v%）、さらに好ましくは0.1～10（w/v%）として調整できる。また、特に注射剤の場合、好ましくは0.0002～0.2（w/v%）、より好ましくは0.001～0.1（w/v%）、固形剤の場合、好ましくは0.01～50（w/w%）、より好ましくは0.02～20（w/w%）等として調製できるが、必ずしもこの範囲に限定されるものでは無い。
　４．投与量
　本発明の糖尿病網膜症の予防又は治療剤の投与量は、投与経路，症状，年齢，体重，予防又は治療剤の形態等によって異なる。例えば、経口投与の場合、糖尿病網膜症の予防又は治療剤中の有効成分の量が、処置を必要としている対象体重1kg当たり好ましくは0.005～500mg，より好ましくは、0.1～100mg、但し、成人に対して１日あたり、下限として好ましくは0.01mg（より好ましくは0.1mg）、上限として、好ましくは20g（より好ましくは2000mg、更に好ましくは500mg、特に好ましくは100mg）となるように、１回又は数回に分けて、症状に応じて投与することが望ましい。
　５．その他の成分
　本発明の糖尿病網膜症の予防又は治療剤は、ルテインを必須の構成成分とするが、当該予防又は治療剤には本発明の目的を損なわない範囲で、他の成分、例えば、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、増粘剤、油剤（カロテノイド、天然色素）、粉体（色素、天然色素、樹脂、顔料、）、防腐剤、香料、保湿剤、生理活性成分、塩類、溶媒、酸化防止剤、キレート剤、パール化剤、中和剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、酵素等の成分を適宜配合することができる。
　６．合剤
　本発明の糖尿病網膜症の予防又は治療剤は、従来知られている糖尿病網膜症の予防又は治療成分との合剤としても良い。その予防又は治療成分としては、ルテイン以外のカルテノイド、ビタミン類、ミネラル類等が挙げられる。
　７．投与時期
　本発明の糖尿病網膜症の予防又は治療剤は、糖尿病網膜症の初期段階、特に、糖尿病網膜症未発症の時期、初期の糖尿病網膜症である単純糖尿病網膜症又は前増殖糖尿病網膜症の時期に投与することが好ましい。ここで、「糖尿病網膜症未発症の時期」とは、糖尿病であるが網膜症の診断がついていない時期全てをいう。例えば、糖尿病網膜症の各種の症状は観察されないものの糖尿病網膜症の兆候が観察される時期が挙げられる。糖尿病網膜症の兆候は、例えば網膜電図の測定値の変化や、網膜の内網状層、内顆粒層、神経節細胞層の厚みの変化によって観察される。
　本発明の糖尿病網膜症の予防又は治療剤は、糖尿病網膜症の初期段階に適切に用いることによって、より確実に糖尿病網膜症を予防又は治療することができる。
　［本発明の各種改善剤］
　本発明の各種改善剤は、ルテインを含むことを特徴とするものである。本発明の各種改善剤としては、糖尿病網膜症において見られる各種の症状を軽減するものがあり、酸化ストレス抑制剤、網膜電図の改善剤、ERK活性化抑制剤（ERKのリン酸化抑制剤）、神経伝達関連分子の減少抑制剤、脳由来神経栄養因子の減少抑制剤、網膜神経節細胞のアポトーシス抑制剤等が挙げられる。
　酸化ストレス抑制剤とは、糖尿病に誘発される網膜中の酸化ストレスを抑制するものである。
　網膜電図の改善剤とは、糖尿病網膜症において、網膜電図の波形の減衰を、予防又は改善するものである。
　ERK活性化抑制剤とは、糖尿病患者等においてpERK（リン酸化細胞外シグナル制御キナーゼ：phosphorylated extracellular signal-regulated kinase）の量が増加し、そのことによってシナプスの伝達が悪くなるのを抑制し、シナプスにおける信号伝達機能を維持させるものである。
　神経伝達関連分子の減少抑制剤とは、糖尿病患者等において、神経伝達関連分子が減少するのを、予防又は抑制するものである。神経伝達関連分子とは、神経の伝達に必要なシナプス小胞を作る蛋白質（シナプス小胞タンパク質：synaptophysin）等を意味する。
　脳由来神経栄養因子の減少抑制剤とは、糖尿病患者等において、脳由来神経栄養因子の減少を抑制するものである。
　脳由来神経栄養因子とは、脳細胞の生存には不可欠な神経系の液性蛋白質であり、BDNF（Brain-derived neurotrophic factor）とも呼ばれるものである。
　このBDNFは標的細胞の表面にあるBDNFに特異的なレセプター（TrkB）に結合して、神経細胞の成長（生存，成長，シナプス機能亢進等）を調節することによって、脳細胞を生存させる。
　網膜神経節細胞のアポトーシス抑制剤とは、糖尿病患者等において、網膜神経節細胞が細胞死を起こすのを、予防又は抑制するものである。
　本発明の各種改善剤の、投与形態，剤形，ルテイン含有量，投与量，第三成分，合剤，投与時期等については、上述の本発明の糖尿病網膜症の予防又は治療剤と同様である。
　これらの本発明の各種改善剤を用いることによって、糖尿病網膜症，特に初期の、単純網膜症や前増殖網膜症における、各種の病態を是正することができ、糖尿病網膜症の早期治療に役立つ可能性が高い。
　本発明の各種改善剤は、試験・研究における実験試薬として用いることができる。本発明の各種改善剤を実験試薬として用いる場合のルテインの含有量は、例えば液剤の場合、好ましくは0.0001～10（w/v%），より好ましくは0.001～5（w/v%）特に注射剤の場合、好ましくは0.0002～0.2（w/v%），より好ましくは0.001～0.1（w/v%），固形剤の場合、好ましくは0.01～50（w/w%），より好ましくは0.02～20（w/w%）、さらに好ましくは0.05～10（w/w%）等として調製できるが、必ずしもこの範囲に限定されるものでは無い。
　［本発明の糖尿病網膜症の予防又は改善剤の投与時期を決定する方法］
　本発明の糖尿病網膜症の予防又は改善剤の投与時期を決定する方法は、網膜電図の測定値を、正常時の網膜電図の測定値と比較することによって、糖尿病網膜症の予防又は改善剤の投与時期を決定する方法である。
　網膜電図とは、目に光刺激を与えたときに生じる網膜の反応を記録したもので、視細胞が正常に機能していることを確認するための指標となる。目に光刺激を与える装置の例としては、Ganzfeld System SG-2002（LKC Technologies,Inc., Gaithersburg, Maryland, USA）が、網膜電図の記録装置の例としては、PowerLab System 2/25（AD Instruments, New South Wales, Australia）がそれぞれ挙げられる。網膜電図の測定方法は、「Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.　50,pp. 1433-1439.（2009）」に詳しく記載されている。
　また、本発明の別の糖尿病網膜症の予防又は改善剤の投与時期を決定する方法は、網膜の内網状層、内顆粒層、神経節細胞層の厚みの変化を光干渉断層法によって観察することによって、糖尿病網膜症の予防又は改善剤の投与時期を決定する方法である。
　光干渉断層法では、目を摘出することなく網膜の構造を観察できる。
　網膜電図の測定値の比較によって、あるいは、光干渉断層法による網膜の内網状層、内顆粒層、神経節細胞層の観察によって、従来では発見が困難であった、糖尿病網膜症の早期発見が可能となる。
　以下、マウスを用いて行った実験について説明する。
[実験手順]
　実験には、8週齢のC57BL/6マウス（日本クレア株式会社）を用いた。まず、このマウスに体重1kg当たり60mgのストレプトゾトシン（streptozotosin（STZ）,シグマ社）を、腹腔内に投与することで糖尿病を誘発させた。投与は１日１回、３日間行った。
　次に、メディセーフミニGR-102（テルモ株式会社製）を用いてマウスの尾静脈の血中グルコース濃度（血糖値）を測定した。そして、STZの最初の投与から7日後に血中グルコース濃度が250mg/dl以上であったマウスを糖尿病が発症したものとした。糖尿病が発症したマウスを２群に分け、一方に0.1%ルテイン添加餌を、他方にルテイン無添加餌（以下では「対照餌」ともいう）を、それぞれ自由に与えた。また、対照群として、糖尿病マウスと年齢を適合させた非糖尿病マウスを用意し、この非糖尿病マウスも２群に分けてルテイン添加餌及び対照餌を与えた。ルテイン添加餌として、マウス・ラット・ハムスター用の粉末飼料（コバルト60照射飼料、CE-2粉、日本クレア株式会社）にルテイン粉末（95%含有、株式会社わかさ生活より供与された）を0.1（w/w%）となるように加えたものを使用した。
　以下、糖尿病が発症したマウスを「糖尿病マウス」とし、糖尿病発症から（即ちルテイン添加餌或いは対照餌の投与開始から）１ヶ月および４ヶ月経過した糖尿病マウスをそれぞれ１ヶ月および４ヶ月糖尿病マウスと表記する。
　図１は、ルテイン添加餌及び対照餌の投与開始から１ヶ月及び４ヶ月経過後における糖尿病マウス及び非糖尿病マウスの体重及び血中グルコース濃度を示す表である。図１に示すように、ルテイン添加餌を１ヶ月間与えた糖尿病マウス、及び４ヶ月間与えた糖尿病マウスの間では、体重及び血中グルコース濃度に有意な差はなかった。
　なお、表には示していないが、ルテイン添加餌を与えた非糖尿病マウスと、対照餌を与えた非糖尿病マウスの間では、体重及び血中グルコース濃度に差が無かった。このため、以下では、対照餌を与えた非糖尿病マウスを対照群とする。
［活性酸素種（Reactive oxygen species;ROS）の測定］
　マウスから眼球を摘出し、OCTコンパウンド（サクラファインテックジャパン株式会社）中で凍結させた。非固定化凍結切片（10μm）を作成した後、この非固定化凍結切片をジヒドロエチヂウム（DHE、5μM）と共に37℃で20分間インキュベートし、この後、蛍光顕微鏡によって後極部網膜（posterior retina）の４箇所の内顆粒層（INL）における発光強度を測定した。DHEは細胞内のスーパーオキサイドアニオン（ROS）を特異的に検出することができる蛍光プローブである。
　図２は、ルテイン添加餌及び対照餌の摂取開始から１ヶ月経過後における凍結切片の蛍光観察像を示す。対照餌を与えた１ヶ月糖尿病マウスでは、網膜の各層のROSの存在が赤色の蛍光として観察されたが、ルテイン添加餌を与えた糖尿病マウスでは網膜全体にわたって蛍光が観察されなかった（図２Ａ）。さらに、各切片での蛍光強度を数値化し比較しても、ルテイン添加餌を与えた糖尿病マウスでの強度は対照餌を摂食させた糖尿病マウスに比べ有意に弱くなった（図２Ｂ）。従って、糖尿病によって誘発される網膜中の酸化ストレスが、ルテイン添加餌の摂取により減少することが分かった。
［網膜電図（ERG）分析］
　マウスを少なくとも12時間連続で暗所においた（完全暗順応）後、ペントバルビタールナトリウムを腹腔内注射（70 mg/Kg）することでマウスに麻酔をかけた。さらに散瞳させるために0.5%のトロピカミド（tropicamide）と0.5%のフェニレフリン（phenylephrine）の溶液（Mydrin-P;参天製薬株式会社製）を点眼した。
　次に、角膜中央部に探査用のコンタクトレンズ電極（active contact lens electrodes）を設置し、両目の間の皮下に対照電極（reference electrode）を設置し、マウス尾部の皮下にアース用電極（ground electrode）を針入した。そして、Ganzfeld System SG-2002（LKC Technologies,Inc., Gaithersburg, MD）を用いて800 cd-s/m2、4ミリ秒の光パルスで刺激した。この装置では、OP1（OP:Oscillatory potential）はa波の反応と区別されない。従って、OP2,OP3,OP4の大きさ及び潜時（implicit times）を分析した。また、OP2,OP3,OP4の振幅を加算したものをΣOPsとした。
　なお、記録の際の電極の設置など、全ての操作を赤色灯下で行った。また、a波、b波の振幅が温度に依存して変化しうることから、安定した網膜電図を得るために測定中はマウスをヒーティングパッド上に置き、体温を37度に保温した。
　ERGの測定データを図３Ａに、OP2,OP3,OP4の振幅とそれらの積算値（ΣOPs）を図３Ｂに示す。これら図３Ａ及び３Ｂから明らかなように、対照餌を与えた1ヶ月糖尿病マウスではOP波（OP3及びΣOPs）の振幅が減少するが、糖尿病の発症初期からの継続的なルテイン摂取により、OP波の振幅の減少が抑えられた。各OP波の振幅の大きさは、網膜内層の機能状態を反映している。なお、データには示さないが、ルテイン添加餌を摂取させた非糖尿病マウス及び糖尿病マウスのいずれにおいても、OPsの潜時、及び、a波、b波については変化がなかった。
　以上より、ルテイン添加餌の継続的な摂取が、糖尿病に起因する機能障害から網膜内層を保護することが分かった。
　［イムノブロット分析］
　マウスの網膜を取り出し、溶解緩衝液（10mM Tris-HCl（pH7.6）, 100mM NaCl, 1mM EDTA, 1% Triton X-100, プロテアーゼインヒビター）中で組織を可溶化させた後、試料をSDS-PAGEで分離し、PVDF膜に転写した。このPVDF膜を4%のスキムミルクでブロッキングした後、抗リン酸化ERK抗体、または抗シナプトフィジン抗体、または抗BDNF抗体と共に4℃で一晩インキュベートした。また、比較したいサンプル間のタンパク質量を補正するための内部標準タンパク質としてチューブリンを用いた。それらの抗体を化学発光法により検出した。
　図４ではルテイン添加餌または対照餌を与えた１ヶ月糖尿病マウス（Diabetes+Lutein, Diabetes）及び対照餌を与えた非糖尿病マウス（Non-Diabetes）の網膜における各種タンパク質の発現量をイムノブロット分析で調査した。
　図４Ａは、網膜中の活性化ERK（つまりリン酸化ERK、pERK）のイムノブロット分析の結果を、図４Ｄは、図４Ａの対照餌を食べさせた非糖尿病マウスでのシグナル強度を１とした時の相対値を示す。これらのことから１ヶ月糖尿病マウスの網膜における活性化ERK（pERK）の量はルテイン添加餌の摂取により有意に抑制された。
　図４Ｂは、網膜中のシナプトフィジンのイムノブロットの結果を、図４Ｅは図４Ｂの非糖尿病マウスでのシグナル強度を１とした時の相対値を示す。シナプトフィジンはシナプス小胞タンパク質であり、視細胞においてOP波の発生、つまりシグナル伝達に重要な役割を果たす。イムノブロット分析の結果、１ヶ月糖尿病マウスでは、シナプトフィジンの発現量は減少するが、糖尿病発症からのルテイン添加餌の継続的な摂取により、その発現レベルが維持された。
　また、図には示していないが、ルテイン添加餌を摂取した非糖尿病マウスの網膜では、活性化ERK（pERK）及びシナプトフィジンのレベルは変化しなかった。
　以上より、糖尿病マウスの網膜では、活性化ERK（pERK）及びその結果生じるシナプトフィジンの減少が継続的なルテイン添加餌の摂取により抑制されることが示された。
　図４Ｃは、網膜中のBDNFのイムノブロットの分析結果を、図４Ｆは図４Ｃの非糖尿病マウス（Non-Diabetes）でのシグナル強度を１とした時の相対値を示す。BDNFは網膜ニューロンの主要な栄養因子のひとつであり、糖尿病によってBDNFが減少することが知られている。しかし、図４Ｆから明らかなように、ルテイン添加餌の継続的な摂取によりBDNFの減少が抑えられた。
　［構造解析及び免疫組織化学］
　網膜を4%のパラフォルムアルデヒドで固定し、パラフィン切片（6μm）を作成した。実験には水晶体の中心と視神経乳頭の中心を通るようにカットできた切片を用いた。切片にヘマトキシリン・エオシン染色を施し、内網状層（IPL）、内顆粒層（INL）、外顆粒層（ONL）の厚さを測定した。また、神経節細胞層（GCL）の神経細胞数を計測した。
　図５Ａに、ルテイン添加餌または対照餌を与えた４ヶ月糖尿病マウス（Diabetes+Lutein, Diabetes）及び対照餌を与えた非糖尿病マウス（Non-Diabetes）の外顆粒層（ONL）の厚さに対する内網状層（IPL）または内顆粒層（INL）の厚さの比率を示す。図５Ａでは、外顆粒層（ONL）の厚さを１とした場合の内網状層（IPL）、内顆粒層（INL）の相対的な厚さを示している。それらの比率は、糖尿病マウスの網膜において有意に減少したが、長期間のルテイン投与によりその減少が明らかに抑制された。また、内顆粒層（INL）の厚みの減少も同様に抑制された（図５Ａ参照）。
　また、図５Ｂに、ルテイン添加餌または対照餌を与えた４ヶ月糖尿病マウス及び対照餌を与えた非糖尿病マウスの神経節細胞層（GCL）の神経細胞数を示す。図５Ｂに示すように、神経節細胞層（GCL）の神経細胞の消失が長期間のルテイン投与により抑えられた。
　上述の結果より、糖尿病によって引き起こされる網膜内層細胞、神経突起及び神経節細胞の減少が、ルテインを継続的に摂取することにより抑制されることが分かった。
　[アポトーシス・マーカーの発現分析]
　アポトーシス・マーカーである活性化カスパーゼ３（cleaved caspase3）の局在及びTUNEL陽性細胞の存否をルテイン添加餌または対照餌を与えた４ヶ月糖尿病マウス及び対照餌を与えた非糖尿病マウスの網膜において観察した。
　図６Ａは活性化カスパーゼ３の局在を示す。局在を矢じりで示した。さらに、図６Ｃでは活性化カスパーゼ３のシグナルが得られた細胞の数を示した。その結果、対照餌を摂取させた糖尿病マウスでは活性化カスパーゼ３は神経節細胞層（GCL）に多く存在し、切片あたりの数も多かった。しかし、糖尿病マウスにルテインを摂取させることでその数が有意に減少しただけではなく、非糖尿病マウスとほぼ同程度となった。
　図６ＢではTUNEL染色の結果を示す。陽性細胞（細胞死を起こしている細胞）を矢じりで示している。TUNEL陽性細胞もまた神経節細胞層（GCL）において観察された。しかし、陽性細胞の数は、ルテインを摂取させることで有意に減少した（図６Ｄ）。
以上の二点から、糖尿病網膜症で誘発されるアポトーシスとその関連因子がルテイン添加餌の継続的な摂取によって抑制されるまたは減少することを示している。
　本発明の予防又は治療剤や各種改善剤、食品を、網膜電図による測定結果をもとに、適切な時期に適用することによって、自覚症状等が現れるよりも早く、的確な予防又は治療を施すことができる。

Claims (13)

  1. 　ルテインを含むことを特徴とする、糖尿病網膜症の予防又は治療剤。
  2. 　単純糖尿病網膜症又は前増殖糖尿病網膜症を含む糖尿病網膜症の初期段階において投与するための、請求項１記載の糖尿病網膜症の予防又は治療剤。
  3. 　請求項１又は請求項２に記載の糖尿病網膜症の予防又は治療剤を含むことを特徴とする食品。
  4. 　ルテインを含むことを特徴とする、単純糖尿病網膜症又は前増殖糖尿病網膜症を含む糖尿病網膜症の初期段階で摂取する食品。
  5. 　ルテインを含むことを特徴とする、酸化ストレス抑制剤。
  6. 　ルテインを含むことを特徴とする、網膜電図の改善剤。
  7. 　ルテインを含むことを特徴とする、ERK活性化抑制剤。
  8. 　ルテインを含むことを特徴とする、神経伝達関連分子の減少抑制剤。
  9. 　ルテインを含むことを特徴とする、脳由来神経栄養因子の減少抑制剤。
  10. 　ルテインを含むことを特徴とする、網膜神経節細胞のアポトーシス抑制剤。
  11. 　請求項５～請求項１０のいずれかに記載の糖尿病網膜症の各種兆候の抑制剤又は改善剤を含むことを特徴とする食品。
  12. 　網膜電図の測定値を正常時の網膜電図の測定値と比較することによって、ルテインを含んだ糖尿病網膜症の予防又は改善剤の投与時期を決定する方法。
  13. 　網膜の内網状層、内顆粒層、神経節細胞層の厚みの変化を光干渉断層法で観察することによって、ルテインを含んだ糖尿病網膜症の予防又は改善剤の投与時期を決定する方法。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6148780B1 (ja) * 2016-02-05 2017-06-14 参天製薬株式会社 キサントフィルとヒシ属植物の加工物を含有する組成物
WO2017135466A1 (ja) * 2016-02-05 2017-08-10 参天製薬株式会社 キサントフィルとヒシ属植物の加工物を含有する組成物

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060205826A1 (en) * 2005-03-09 2006-09-14 Romero Francisco J Method of using carotenoids in the prevention of cognitive decline and for other neuroprotection functions
JP2008127505A (ja) * 2006-11-22 2008-06-05 Q P Corp 粉末状組成物およびその製造方法、ならびにこれを含有する食品組成物

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101778593B (zh) * 2007-06-15 2013-03-20 南加州大学 用于分析光学相干断层照相图像的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060205826A1 (en) * 2005-03-09 2006-09-14 Romero Francisco J Method of using carotenoids in the prevention of cognitive decline and for other neuroprotection functions
JP2008127505A (ja) * 2006-11-22 2008-06-05 Q P Corp 粉末状組成物およびその製造方法、ならびにこれを含有する食品組成物

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AKIHIRO KAKEHASHI: "Tonyobyo Momakusho no Rikai no Shinpo -Gankai kara Naikai e", MEDICAL PRACTICE, vol. 20, no. 5, 2003, pages 781 - 786 *
ARNAL, E. ET AL.: "Beneficial effect of docosahexanoic acid and lutein on retinal structural, metabolic, and functional abnormalities in diabetic rats", CURR EYE RES, vol. 34, no. LL, 2009, pages 928 - 38 *
LI, S.Y. ET AL.: "Effect of lutein on retinal neurons and oxidative stress in a model of acute retinal ischemia/reperfusion", INVEST OPHTHALMOL VIS SCI, vol. 50, no. 2, 2009, pages 836 - 43 *
MIRANDA, M. ET AL.: "Oxidative stress in a model for experimental diabetic retinopathy: treatment with antioxidants", ARCH SOC ESP OFTALMOL, vol. 79, no. 6, 2004, pages 289 - 94 *
MIRANDA, M. ET AL.: "Oxidative stress in a model of experimental diabetic retinopathy: the utility of peroxinytrite scavengers", ARCH SOC ESP OFTALMOL, vol. 81, no. 1, 2006, pages 27 - 32 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6148780B1 (ja) * 2016-02-05 2017-06-14 参天製薬株式会社 キサントフィルとヒシ属植物の加工物を含有する組成物
WO2017135466A1 (ja) * 2016-02-05 2017-08-10 参天製薬株式会社 キサントフィルとヒシ属植物の加工物を含有する組成物
JP2017141217A (ja) * 2016-02-05 2017-08-17 参天製薬株式会社 キサントフィルとヒシ属植物の加工物を含有する組成物
JP2021080270A (ja) * 2016-02-05 2021-05-27 参天製薬株式会社 キサントフィルとヒシ属植物の加工物を含有する組成物

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