JP2013501706A - 網膜色素上皮におけるａ２ｅの形成を軽減するための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

療法上有効量の黄斑カロテノイド配合物を投与することにより、対象における2-(2,6-ジメチル-8-(2,6,6-トリメチル-1-シクロヘキセン-1-イル)-1E,3E,5E,7E-オクタテトラエニル)-1-(2-ヒドロキシエチル)-4-(4-メチル-6-(2,6,6-トリメチル-1シクロヘキセン-1-イル)-1E,3E,5E-ヘキサトリエニル-ピリジニウム（Ａ２Ｅ）およびその異性体の含有量を減少させる方法。
【選択図】図１

Description

関連する出願への相互参照
[0001] この出願は２００８年６月１３日に出願された米国特許出願シリアル番号６１／１３１，８８５に対して優先権を主張し、それをそのまま本明細書に援用する。

[0002] 本発明は、概して網膜色素上皮における2,6-ジメチル-8-(2,6,6-トリメチル-1-シクロヘキセン-1-イル)-1E,3E,5E,7E-オクタテトラエニル)-1-1(2-ヒドロキシエチル)-4-4(4-メチル-6-(2,6,6-トリメチル-1-シクロヘキセン-1-イル)-1E,3E,5E-ヘキサトリエニル-ピリジニウム（Ａ２Ｅ）の形成を軽減するための組成物および方法に、ならびに、より具体的には、眼疾患の危険性がある人におけるＡ２Ｅのレベルを低減するための療法上有効量のキサントフィル類の投与に関し、それにはルテインおよびゼアキサンチンが含まれるがそれらに限定されない。

[0003] 加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は先進国における不可逆的失明の主な原因であるが、その分子的な病態生理はまだ十分に理解されていない（１）。高レベルの酸化的ストレスによる細胞の損傷は、ＡＭＤを含む加齢と関連する眼疾患に関する主な病理学的説明の１つであるようであり（２）、高度に蛍光性のレチノイドおよびリン脂質代謝産物の複合混合物であるリポフスチンの細胞蓄積は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）における老化の主な病原のバイオマーカーであると考えられている（３）。

[0004] Ａ２ＥはＲＰＥにおいて同定された主要な蛍光体である。化学的には、それは２個の全トランスレチナール分子および１個のエタノールアミン分子の組み合わせである（４）。Ａ２Ｅおよび他のリポフスチン構成要素のレベルは年齢と共に、光曝露と共に、およびＡＭＤの発現と共に上昇し、スターガルト病およびベスト病のような早発性黄斑障害はヒトにおける、および動物モデルにおける異常に高レベルのＡ２Ｅに関して注目に値する（５〜９）。Ａ２Ｅおよびそのシス異性体は、黄斑において損傷および細胞死を引き起こす可能性があり中心視覚の喪失につながる可能性がある活性酸素種の生成に関する、青色光に仲介される光感受性物質として働いている可能性があることが研究により示されている（１０〜１１）。

[0005] 一方、食品キサントフィルカロテノイド類であるルテインおよびゼアキサンチンは、ヒトの黄斑において非常に高レベルで、および周辺網膜においてより低い程度で濃縮され、そこでそれらは入射する青色光を吸収することにより、および／または活性酸素中間体を抑える（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）ことにより網膜の酸化的損傷を制限していると考えられている（１２〜１３）。インビトロでの研究は、その眼性カロテノイド類（ｏｃｕｌａｒ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ）はＡ２Ｅに仲介される酸化的損傷を、光毒性青色光を直接消光することまたはそれを遮ることのどちらかにより緩和している可能性があることを示唆したが（１４）、部分的にはヒトの眼組織を得ることの難しさならびにＡ２Ｅおよび眼性カロテノイド類の両方をかなりのレベルで蓄積する非霊長類の小動物モデルが稀であることにより、インビボでの証拠は明らかに不足している。ここで、我々は大量に収集したヒトの眼の黄斑および周辺網膜におけるＡ２Ｅおよびカロテノイド類の関係を報告し、我々は眼に相当なレベルのＡ２Ｅおよびカロテノイド類の両方を有する鳥類であるニホンウズラ（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｑｕａｉｌ Ｃｏｔｕｒｎｉｘ ｊａｐｏｎｉｃａ）において食品カロテノイド類によるＡ２Ｅの形成の抑制を試験する。

[0006] Ａ２Ｅおよびその異性体であるイソ−Ａ２Ｅは、ヒトの網膜色素上皮（ＲＰＥ）におけるリポフスチンの主要な蛍光体であり、それらは老化および他の眼の障害と関係する光に誘発される酸化的損傷の重要な媒介物質であると考えられている。黄斑カロテノイド類のこれらの損傷に対する保護作用の可能性を評価するため、上を覆っている網膜組織中の眼性カロテノイド類を、質量スペクトル検出と組み合わせたＨＰＬＣ（ＨＰＬＣ−ＭＳ）により測定し、それらはＡ２Ｅのレベルと相関していた。ヒトのＲＰＥ／脈絡膜において、年齢に伴う総Ａ２Ｅレベルの統計学的に有意な増大（Ｎ＝６６，Ｐ，０．０００１）が見出された。Ａ２Ｅのモノフラノイドおよびモノペルオキシドと推定されるｍ／ｚ ６０８および６２４における質量スペクトルのピークは、専ら老齢の提供者において検出された。加えて、黄斑領域におけるＡ２Ｅのレベル（２．７±１．１ｎｇ／８−ｍｍパンチ、ｎ＝３１）は、同じ大きさの周辺網膜の領域における（９．１±４．６ｎｇ／８−ｍｍパンチ、ｎ＝３１）よりもおおよそ３分の１の低さであることが分かった。周辺網膜のカロテノイド類ならびに周辺ＲＰＥ／脈絡膜のＡ２Ｅおよびイソ−Ａ２Ｅの間には統計学的に有意な逆相関があった。ニホンウズラ（Ｃｏｔｕｒｎｉｘ ｊａｐｏｎｉｃａ）における前向き（Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ）カロテノイド補充の試験は、Ａ２Ｅ形成のほぼ完全な抑制を実証した。ＡＭＤによる視覚の喪失の危険性のある人は、黄斑カロテノイド類を含む栄養サプリメントを摂取することにより、その影響を低減することができる。

図１Ａ〜Ｆは、１４歳（Ａ、Ｃ、およびＥ）および７４歳（Ｂ、Ｄ、およびＦ）の提供者のＲＰＥ／脈絡膜からのＡ２Ｅおよびイソ−Ａ２ＥのピークのＨＰＬＣ ＰＤＡクロマトグラム（ＡおよびＢ）およびフルスキャン質量スペクトル（Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）である。 図２Ａ〜Ｃは、ヒトのＲＰＥ／脈絡膜全体（Ａ）；８ｍｍの黄斑のパンチ（Ｂ）；および８ｍｍの周辺網膜のパンチ（Ｃ）におけるＡ２Ｅのレベルの、年齢ごとの分布のグラフ表現である。全ての場合において、年齢に伴う有意な増大が観察された（Ｐ＜０．００１）。 図３Ａおよび３Ｂは、８ｍｍの黄斑のパンチ（Ａ）および８ｍｍの周辺網膜のパンチ（Ｂ）における、上を覆っている網膜のカロテノイドのレベルに関するＲＰＥ／脈絡膜のＡ２Ｅのレベルの分布のグラフ表現である。周辺網膜におけるカロテノイド類および下にあるＲＰＥ−脈絡膜におけるＡ２Ｅのレベルの間には統計学的に有意な逆相関があった（Ｒ＝−０．３６、Ｎ＝４０、Ｐ＝０．０２）が、この逆相関は黄斑のカロテノイド類および黄斑のＡ２Ｅの間では統計学的に有意では無かった（Ｒ＝−０．２８；Ｎ＝３５；Ｐ＝０．１０）。 図４は、ニホンウズラにおける１６週間のルテインまたはゼアキサンチンの食餌での補充に応答する眼のカロテノイドおよびＡ２Ｅのレベルの操作のグラフ表現である（全てのグループに関してＮ＝４）。上のパネルにおいて、濃い灰色の棒はそれぞれのグループにおける総カロテノイド類の含有量を表し、薄い灰色の棒は総ルテインおよびゼアキサンチンの含有量を表す。対照の動物は、低カロテノイドの餌を１６週間与えた。ＲＰＥにおけるＡ２Ｅのレベルは、対象のグループに関して他の３つのグループと比較して有意に高かった（Ｐ＜０．００１）。他のグループのＡ２Ｅのレベルは、互いと有意に異なっていなかった。 図５Ａ〜Ｄは、実験のトリのＲＰＥから抽出したＡ２Ｅのフルスキャン質量スペクトルの図示である。対照の餌、第１週目（Ａ）；対照の餌、第１０週目（Ｂ）；ゼアキサンチンを補充した餌、第１２週目（Ｃ）、ルテインを補充した餌、第１２週目（Ｄ）。

定義
[0012] 本明細書で用いられる用語“眼疾患”は、ある場合において酸化的プロセスの結果である可能性がある急性または慢性のどちらかの病気を指し、それには黄斑変性、加齢黄斑変性；スターガルト病、ベスト病、色素性網膜炎、および白内障が含まれる。

[0013] “視覚性能”は対象の視覚的な性能を指す。視覚性能には、視力、低コントラスト視力（ｌｏｗ ｃｏｎｔｒａｃｔ ａｃｕｉｔｙ）、薄明視力、文字コントラスト感度（ｌｅｔｔｅｒ ｃｏｎｔｒａｃｔ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）、格子コントラスト感度、減能グレア、眼内迷光、および視野が含まれる。視覚性能の向上には、視覚の見え方（ａｓｐｅｃｔ）の向上、例えば視力、低コントラスト視力、薄明視力、文字コントラスト感度、格子コントラスト感度もしくは視野の向上または減能グレアもしくは眼内迷光の低減が含まれる。

[0014] “黄斑カロテノイド配合物”は、眼の黄斑において見つかるカロテノイド類、主にルテインおよびゼアキサンチンを含む組成物を指す。
[0015] 本明細書で用いられる用語“療法上有効量”は、対象に投与した際に有効な応答（すなわち、研究者、獣医師、医師または他の臨床家により求められる、組織、系、動物またはヒトの生物学的または医学的応答）をもたらすのに十分である化合物または医薬組成物の量／用量を指す。“療法上有効量”は、特に疾患およびその重篤さ、ならびに処置すべき対象の年齢、体重、体調および応答性に依存して異なるであろう。

[0016] 本明細書で用いられる用語“処置した”および“処置する”は、その疾患または病気で苦しむ可能性がある、またはそれにかかりやすい可能性があるがその疾患または病気の臨床または不顕性症状をまだ経験していない、または示していない対象において、疾患または病気の臨床症状の出現を予防する、または遅らせることを指す。“処置する”は、その疾患または病気を抑制すること、すなわちそれの発現またはその少なくとも１種類の臨床もしくは不顕性症状を止める、または低減することも指す。“処置する”はさらに、その疾患または病気を和らげる、すなわちその疾患もしくは病気またはその臨床もしくは不顕性症状の少なくとも１種類の後退を引き起すことも指す。処置される対象に対する利益は、統計学的に有意であるか、少なくともその対象および／またはその医師に認知され得るかのどちらかである。

配合物
[0017] 本発明は上記のような使用を提供し、ここでその組成物は単位用量としての投与のためのものである。本発明の別の態様において、その単位用量はその有効成分（単数または複数）を約１０μｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ体重まで、別の態様において約２５μｇ／日／ｋｇから１．０ｍｇ／日／ｋｇまで、さらに別の態様において約０．１ｍｇ／日／ｋｇから１．０ｍｇ／日／ｋｇ体重までの量で含む。別の態様において、その単位用量はその有効成分を０．１ｍｇ／日／ｋｇから１．０ｍｇ／日／ｋｇ体重までの量で含んでいる。

[0018] 本発明に従って、上記の化合物はあらゆる適切な方法で、例えば経口または非経口で投与されてよく、それはその投与に適したあらゆる形で、例えば錠剤、カプセル、粉末、シロップまたは注射のための溶液もしくは分散液の形で与えられてよい。別の態様において、および本発明の目的に従って、本発明の化合物は固体の医薬的単位の形で、適切には錠剤もしくはカプセルとして、または注射のための懸濁液、溶液もしくは分散液の形で投与される。本発明の化合物は、有効成分を約１０μｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ体重まで、例えば２５μｇ／日／ｋｇから１．０ｍｇ／日／ｋｇまでの量で含む単位剤形、例えば錠剤またはカプセルで経口投与されるのが最も好都合である。

[0019] 本発明の化合物は、経口投与形、例えば固体の経口投与形、典型的には錠剤もしくはカプセルとして、もしくは液体の経口投与形として投与されてよく、または即時放出剤形もしくは制御もしくは持続放出剤形で投与されてよい。その化合物は、有効成分を約０．１から約１５０ｍｇ／日まで、約０．２から約１００ｍｇ／日まで、約０．５から約５０ｍｇ／日まで、約０．１から約５０ｍｇ／日まで、約１から約１５ｍｇ／日まで、または約２から約５ｍｇ／日までの量で含む単位剤形、例えば錠剤またはカプセルで好都合に経口投与されてよい。典型的には、その医薬組成物は約０．５ｍｇから約２０ｍｇまで、例えば約０．５ｍｇ、約１ｍｇ、約１．５ｍｇ、約２ｍｇ、約２．５ｍｇ、約３ｍｇ、約３．５ｍｇ、約４ｍｇ、約４．５ｍｇ、約５ｍｇ、約５．５ｍｇ、約６ｍｇ、約６．５ｍｇ、約７ｍｇ、約７．５ｍｇ、約８ｍｇ、約８．５ｍｇ、約９ｍｇ、約９．５ｍｇ、約１０ｍｇ、約１０．５ｍｇ、約１１ｍｇ、約１１．５ｍｇ、約１２ｍｇ、約１２．５ｍｇ、約１３ｍｇ、約１３．５ｍｇ、約１４ｍｇ、約１４．５ｍｇ、約１５ｍｇ、約１５．５ｍｇ、約１６ｍｇ、約１６．５ｍｇ、約１７ｍｇ、約１７．５ｍｇ、約１８ｍｇ、約１８．５ｍｇ、約１９ｍｇ、約１９．５ｍｇまたは約２０ｍｇの１種類以上のその化合物を含む。

[0020] １態様において、本発明の化合物（単数または複数）は１日１回（例えば朝または午後に）、約２．５ｍｇ〜約２０ｍｇの用量を用いて投与される。別の態様において、その化合物（単数または複数）は、より延長された持続性の放出で、例えば低用量で１日２〜３回の投与で、または当技術で既知の一般に行われる方法を用いて調製された調節放出（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ）配合物で、対象に２４時間の期間あたり約５〜約５０ｍｇが投与されるように投与される。

[0021] 本発明に従って、本発明の化合物（単数または複数）またはその医薬的に許容できる塩は、あらゆる適切な方法で、例えば経口または非経口で投与されてよく、それはその投与に適したあらゆる形で、例えば錠剤、カプセル、粉末、シロップまたは注射のための溶液もしくは分散液の形で、または吸入剤として与えられてよい。別の態様において、および本発明の目的に従って、本発明の化合物（単数または複数）は固体の医薬的単位の形で、適切には錠剤もしくはカプセルとして、または注射のための懸濁液、溶液もしくは分散液の形で投与される。加えて、本発明の化合物（単数または複数）は、医薬的に許容できるキャリヤー、例えば補助剤および／または希釈剤と共に投与されてよい。

[0022] 固体または液体の医薬製剤の調製のための方法は、当技術で周知である。例えばRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 第２１版, Lippincott Williams & Wilkins (2005)を参照。このように、錠剤は有効成分を通常のキャリヤー、例えば補助剤および／または希釈剤と混合し、続いてその混合物を錠剤機で圧縮することにより調製することができる。補助剤および／または希釈剤の限定的では無い例には次のものが含まれる：コーンスターチ、ラクトース、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ゼラチン、ラクトース、ゴム類、および同様のもの。あらゆる他の補助剤または添加剤、例えば着色剤、アロマ、および保存剤も、それらが有効成分と共存可能であるならば、用いられてよい。従って、本発明の医薬組成物は、典型的には有効量の本発明の化合物（単数または複数）および医薬的に許容できるキャリヤーを含む。

[0023] その化合物は、次のものからなるグループから選択される形で全身投与されてよい：呼吸可能な粒子のエアロゾル懸濁液；点鼻剤または鼻内スプレーとしての投与のための液体または液体懸濁液；口または鼻咽頭気道への投与のための噴霧液；経口の形；注射可能な形；坐剤の形；および経皮パッチまたは経皮パッド。

[0024] １つのその手段には、有効化合物からなる呼吸可能な粒子のエアロゾル混合物が含まれ、対象はそれを吸入する。その療法化合物は医薬的に有効な量で肺を経由して血流中に吸収される。その呼吸可能な粒子は液体または固体であってよく、吸入の際に口および喉頭を通過するのに十分に小さい粒子の大きさを有する；通常、約１から１０ミクロンまで、より好ましくは１〜５ミクロンの範囲の大きさの粒子が呼吸可能であると考えられる。

[0025] Ａ２Ｅが眼のリポフスチンの主要な蛍光体として同定されて以来、Ａ２Ｅは老化および網膜変性に関わる病理（ｐａｔｈａｌｏｇｉｃａｌ）プロセスの重要な媒介物質であると考えられてきた（３〜６）。臨床的には、ヒトの網膜色素上皮中の自己蛍光化合物は自己蛍光イメージングにより測定した際に年齢と共に増加しており（１７〜１８）、早発性黄斑ジストロフィー、例えばスターガルトおよびベスト病も同様に高レベルのリポフスチンの沈着を示す（７、９）。乾燥型加齢黄斑変性では、さらなる萎縮の拡大が起こっていそうである領域における地図状萎縮の境界において、しばしば強い自己蛍光が見られる（１９）。Ａ２Ｅの増大したレベルは、高齢者の解剖用の眼において、および黄斑ジストロフィーを有する人からの提供者の眼において生化学的に確かめられている（４〜９）。Ａｂｃａ４ノックアウトマウス（ヘテロ接合性およびホモ接合性）およびＥｌｏｖ１４トランスジェニックマウスのような優性および劣性のスターガルト病の動物モデルが開発されており、それらはＡ２Ｅを蓄積する（７〜８）。インビトロの研究は、Ａ２ＥがそのＲＰＥに対する毒性作用を、青色光に仲介されるフリーラジカルの生成により、または界面活性剤様の、およびｐＨを変える作用を通したリソソームの機能不全の誘導により発揮している可能性があることを示している（１０〜１１、２０〜２１）。

[0026] Ａ２Ｅの形成を制限することはＡＭＤおよび関連する疾患に対する薬理学的介入のための価値のある目標であるという一般的合意があり、学会および産業における多くのグループがこの仕事に専念してきた。Ａ２Ｅの形成は強い光曝露と結びつけられており、それは視覚サイクルにおけるレチノイド類の高い度合いの処理量を引き起し、高い量の、Ａ２Ｅの前駆体である全トランスレチナールのホスファチジルエタノールアミンとの様々なシッフ塩基付加物の形成を促進する（２２〜２３）。動物モデルでは厳しい光制限はＡ２Ｅの形成を抑制するが（２２）、このアプローチはヒトではおそらく現実的では無い。従って、視覚サイクルの阻害剤が主な焦点であった。これらには、アルコールデヒドロゲナーゼおよび／またはイソメラーゼの阻害を通して暗順応を阻害する、ＦＤＡに認可されたニキビの医薬品である１３−ｃｉｓ−レチノイン酸（２４）、ビタミンＡの穏やかな計画的な欠乏を誘導するレチノイドアナログであるフェンレチニド（ｆｅｎｒｅｔｉｎｉｄｅ）（２５）、および全トランスレチノイド類を１１−ｃｉｓ−レチノイド類に異性化する脊椎動物の機構の重要な段階を阻害することを標的としたＲＰＥ−６５拮抗薬（２６）が含まれる。これらの薬剤の全てがある程度の夜盲を引き起すと考えられ、それは患者にとって不快である可能性があり、レチノイドに基づく化合物は長期にわたって用いられると重大な全身性の副作用および催奇形作用を引き起す可能性がある。非レチノイドＲＰＥ−６５拮抗薬は動物モデルにおいて十分に許容されるようであるが、これらの化合物を用いたヒトでの経験はたとえあったとしてもほとんど無い。

[0027] 黄斑カロテノイド類であるルテインおよびゼアキサンチンも、Ａ２Ｅの形成および毒性作用に対する拮抗薬である可能性のあるものと考えられてきた（１４）。多数の疫学的研究が、これらのキサントフィル類の高い食事での摂取、血中レベル、および黄斑でのレベルとＡＭＤの危険性の間の逆相関を実証しており（２７〜３０）、ＡＲＥＤＳ２試験は現在ＡＭＤに対するそれらの有効性を、大規模な、ランダム化された、プラセボ対照の、前向きの方式で評価している。黄斑カロテノイド類は、最もＡ２Ｅからフリーラジカルを生成しそうな可視スペクトルの領域である青色光を効率的に吸収し、インビトロでそれらはＡ２Ｅおよびその前駆体の光酸化を阻害することができる（１４）。

材料および方法
化学物質
[0028] 有機溶媒は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ニューハンプシャー州ハンプトン）からのＨＰＬＣグレードのものであった。Ａ２Ｅおよびイソ−Ａ２Ｅの標準物質は、ユタ州プロボ、ブリガムヤング大学化学生化学科のＤｒ．Ｈｅｉｄｉ Ｒ． Ｖｏｌｍｅｒ−Ｓｎａｒｒの研究室で調製されカラム精製された。それらはメタノール（ＭｅＯＨ）中で１μｇ／ｍｌの濃度で溶解し、−７０℃で保管し、使用前に室温に戻した。Ａ２Ｅのストック溶液の濃度は、公表された吸光係数（４）を用いて分光学的に[４３９ｎｍにおけるＥ（１Ｍ）＝３６９００]確認した。ルテイン(Ｋｅｍｉｎ Ｈｅａｌｔｈ，アイオワ州デモイン）およびゼアキサンチン（ＤＳＭ，スイス、カイゼルオーガスト）の同様の標準のストック溶液を調製し、公表された吸光係数（３３）を用いて濃度を確認した。

組織の調達および処理
[0029] ヒトの提供者の眼は、ユタ州ライオンズアイバンクから、死後２４時間以内に、角膜を移植のために採取した後に得た。眼疾患の既知の病歴を有していた提供者はいなかった。組織の調達および分配は、ヘルシンキ宣言の主義に従った。提供者の死と眼球摘出（ｅｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ）の間の時間は４時間を超えていなかった。解剖は提供者の死の６〜２４時間後に薄明環境で行われた。これらのデータは、死の前に高い用量のルテインサプリメントを定期的に消費していた４８歳以上の高齢の異常値（ｏｌｄｅｒ ｏｕｔｌｉｅｒｓ）を排除している（３４）。全てのアイカップ（ｅｙｅｃｕｐｓ）を、手持ち式拡大鏡を用いて視覚的に検査し、明らかな眼の病理、例えば中程度の、または大きなドルーゼン、出血、または傷跡の存在を排除した。付着した硝子体を注意深く除去した後、黄斑および中周辺の網膜組織を８ｍｍの円形穿孔器で切り取った。次いで下にあるＲＰＥ／脈絡膜層を、同じ穿孔器を用いて注意深く切り取った。様々な非ヒト哺乳類の眼を、近隣の研究室または地元の屠殺場から得た。非霊長類の動物の眼は黄斑を有していないため、小さい眼に関しては網膜およびＲＰＥ／脈絡膜全体を分離して処理し、大きい眼に関しては無作為な領域で８ｍｍ穿孔器を用いた。全ての集めた組織に関して、過剰な水分を吸い取った後に重量を記録した。それぞれブラッドフォードアッセイにより、および１次元ＳＤＳゲル電気泳動により決定された総タンパク質レベルおよびタンパク質の分離パターンは、ヒトからの黄斑および網膜のＲＰＥ／脈絡膜のパンチの両方において類似していた（約２５０μ／８ｍｍの組織）。

ＲＰＥ／脈絡膜からのＡ２Ｅの抽出
[0030] Ａ２Ｅおよびその異性体を、以前に記述した方法（８）を用いてＲＰＥ／脈絡膜から抽出および単離した。ＲＰＥの試料を、１：１ ＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ（２ｍｌ）および０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（１ｍｌ）中でホモジナイズした。ホモジナイザーを１：１ ＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ（２ｍｌ）、０．０１Ｍ ＰＢＳ（１ｍｌ）で洗浄し、次いでＣＨＣｌ_３（２ｍｌ）およびＣＨ_２Ｃｌ_２（２ｍｌ）を添加してあらゆる残留した物質を除去した。全ての溶液を合わせ、有機層を水層から抽出した。有機性抽出物を合わせ、室温において真空下で蒸発させて乾燥させた。残留物をＨＰＬＣのためにＭｅＯＨ中で溶解させた。分析の前に、バイアルをおおよそ２０００ｇで遠心分離して少量の不溶性の固体粒子を除去した。

網膜からのカロテノイド類の抽出
[0031] 組織を０．１％ブチル化ヒドロキシトルエンを含むテトラヒドロフランを用いて３回、各回５℃〜１０℃での３０分間の超音波処理によりホモジナイズおよび抽出した。有機性抽出物を合わせ、室温において真空下で蒸発させて乾燥させた。乾燥した残留物を１ｍｌのＨＰＬＣ移動相中で再溶解し、分析の前におおよそ２０００ｇで１０分間遠心分離して少量の不溶性の固体粒子を除去した。トリの網膜中のカロテノイド類の大部分はエステル化されており（３２）、従って最初の抽出の後、乾燥したカロテノイド残留物をヘキサン中で再溶解し、１．８％（ｗ／ｖ）メタノール性水酸化カリウム（ＫＯＨ）中で室温において２時間鹸化を施した。鹸化の後、試料が中性ｐＨを得るまで試料を水で洗浄した。バイアルをおおよそ２０００ｇで遠心分離して少量の不溶性の固体粒子を除去した。溶液をロータリーエバポレーター上で減圧下で室温において蒸発させて乾燥させ、適切なＨＰＬＣ溶媒中で再構成した。

ＨＰＬＣの条件
[0032] ＨＰＬＣ分析は、バイナリーグラジエントポンプ、冷却式オートサンプラー、ＵＶ６０００フォトダイオードアレイ検出器（ＰＤＡ）、およびＭＳＱシングル四重極質量分析器を備えたＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ（カリフォルニア州サンノゼ）ＨＰＬＣシステム上で行った。ピークの同一性は、ＰＤＡおよび質量スペクトルにより、ならびに必要に応じて信頼できる標準物質との共溶出により確認した。キャリブレーションは信頼できる標準物質を用いた外部標準曲線により行った。我々は内部標準を日常的には用いておらず、それはそれらが小さい生物学的試料における低レベルの分析物を妨害する可能性があるためである（３５）。我々の研究室における外部標準を用いた典型的な再現性は±５％である。

[0033] Ａ２ＥのＨＰＬＣ分析：乾燥したＡ２Ｅ試料を１００μｌのＭｅＯＨ中で再溶解した。８４〜１００％アセトニトリル（Ａ）およびＨ_２Ｏ中０．０５％トリフルオロ酢酸（Ｂ）の３５分間にわたる勾配を用いて、逆相Ｃ１８カラム（４．６×２５０ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、ジョージア州アトランタ）上で１．０ｍｌ分^−１の流速でＡ２Ｅを分離した。カラムは室温で維持し、ＨＰＬＣ ＰＤＡ検出器は４４０ｎｍで作動させた。

[0034] カロテノイドのＨＰＬＣ分析：乾燥した抽出物を１００μｌのＨＰＬＣ移動相[ヘキサン：ジクロロメタン：メタノール：Ｎ，Ｎ−ジ−イソプロピルエチルアミン（８０：１９．２：０．７：０．１ ｖ ｖ^−１）]中で再溶解した。ＨＰＬＣでの分離は、シアノカラム（Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ 長さ２５ｃｍ×４．６ｍｍ ｉｄ、粒子サイズ５μｍ、Ｒａｉｎｉｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．、マサチューセッツ州ウォーバーン）上で１．０ｍｌ分^−１の流速で行った。カラムは室温で維持し、ＨＰＬＣ ＰＤＡ検出器は４５０ｎｍで作動させた。

質量分析（ＭＳ）の設備および条件
[0035] ＭＳ分析は、電子スプレーイオン化（ＥＳＩ）源および大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）源を備えたＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ（カリフォルニア州サンノゼ）ＭＳＱシングル四重極質量分析器を用いて行った。Ａ２Ｅおよびカロテノイド類をそれぞれ陽イオンＥＳＩおよびＡＰＣＩモードでイオン化した。質量分析器における溶離した溶媒の分子のオーバーローディングを避けるため、およびイオン化条件を最適化するため、溶離物の５０％をＰＤＡ検出器の後のダイバーターバルブの助けにより廃棄（ｗａｓｔｅ）へ向かわせた。ＰＤＡからＭＳまでの遅延時間は０．１３分であった。プロトン化された前駆体分子イオンを最初にフルスキャンモードで３００から１０００Ｄａまで０．２ステップサイズで獲得し、構成要素の分子質量を明らかにした。それぞれのチャンネルに関して２００ｍｓの滞在時間（ｄｗｅｌｌ ｔｉｍｅ）を用いて選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）を行った。ＳＩＭモードでは、Ａ２Ｅおよびその酸化生成物に関してｍ／ｚチャンネル５９２±３、６０８±１．５、６２４±１．５、および６４０±１．５を用いた。Ａ２Ｅに関する典型的な検出条件は次のものであった：ＲＦレンズバイアス電圧０．１Ｖ、コーン電圧８０Ｖ、およびヒーター温度５５０℃。イオン源およびチューニングレンズのパラメーターは、Ａ２Ｅ試料をインジェクターを通して注入することにより自動的に最適化された。カロテノイド類に関して、ルテインに関して５５１±０．７および５６９±０．７、ならびにゼアキサンチンに関して５６９±０．８のｍ／ｚチャンネルを用いた。典型的な検出条件は次のものであった：コロナ放電電流５μＡ、コーン電圧８０Ｖ、およびプローブ温度５００℃。

ニホンウズラにおけるキサントフィルの補充の試験
[0036] 成体のニホンウズラ（Ｃｏｔｕｒｎｉｘ ｊａｐｏｎｉｃａ）はＢ＆Ｄ飼育場（オクラホマ州ハラー）から入手し、全ての実験はユタ大学の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により視察され、認可された。トリを周囲の室内灯の下で１２時間の明暗サイクルで維持し、それらを４羽のトリの３個のグループに分けた：ルテインを補充、ゼアキサンチンを補充、および補充無し。全てのトリに毎日標準的なシチメンチョウの餌を与え（約２０ｇ／日）（Ｐｕｒｉｎａ Ｍｉｌｌｓ、ミズーリ州セントルイス）、それはカロテノイド類が少ないものであった（１．１０ｎｇ／ｇ）。補充したトリは、１６週間毎日ルテインまたはゼアキサンチンに富む微生物抽出物０．５ｍｌを強制的に与えた（ｇａｖａｇｅｄ）（トリごとに１日あたり０．２ｍｇのカロテノイド）。ルテインは淡水性藻類クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）ＣＳ ４１（Ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ Ｓｕｐｐｌｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ， ＣＳＩＲＯ，オーストラリアホーバート）から、前に記述された条件の下で調製した（３６）。ゼアキサンチンは液体増殖培地で増殖させた非病原性細菌フラボバクテリウム・マルチボラム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ）ＡＴＣＣ ５５２３８から、前に詳細に記述されたようにして得た（３７）。実験の後、トリを屠殺し、上記のようにＲＰＥ／脈絡膜および網膜のＡ２Ｅおよびカロテノイドの含有量をそれぞれ測定した。

統計
[0037] 報告した値は平均値±標準偏差（ＳＤ）である。統計学的分析はＭｉｃｒｏｃａｌ Ｏｒｉｇｉｎバージョン６．０（マサチューセッツ州ノーサンプトン）を用いて行った。ほとんどの場合では、２母集団（独立）ｔ検定を、有意水準を０．０５に設定して行った。

結果
ヒトのＲＰＥ／脈絡膜および網膜におけるＡ２Ｅおよびカロテノイドのレベル
[0038] 我々はヒトのＲＰＥ／脈絡膜からのＡ２Ｅおよびその異性体の好都合なインラインＨＰＬＣ定量および同定のためにフォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）および質量スペクトル（ＭＳ）検出を用いた。より若いヒトの眼（＜５０歳；Ｎ＝２２）は常にｍ／ｚ ５９２．６におけるＡ２Ｅおよびイソ−Ａ２Ｅに関する単一の主要な分子イオンのピークを有していたが、５０歳より年上の眼（Ｎ＝３１）は検出可能なＡ２Ｅのより高い分子量のイオンを示す傾向がより大きく、その内の２つは以前に報告されたｍ／ｚ ６０８および６２４における酸化生成物と一致しており（Ｎ＝２４）（１５〜１６）、さらに７２４〜８０８に未同定のより高いｍ／ｚのイオンがある（図１）。これらのイオンの単一イオンモニタリング（ＳＩＭ）は、ｍ／ｚ ５９２±３、６０８±１．５、および６２４±１．５におけるこれらのピークのＡ２Ｅのピークと比較した定量を可能にした。５０歳より年上の提供者に存在するｍ／ｚ ６０８および６２４のピークの酸化されていないＡ２Ｅに対する比率は０．０２７±０．００８（Ｎ＝２４）であり、一方でこれらの酸化されたピークは５０歳以下の提供者には存在しなかった。

[0039] ２０〜８８歳のヒトの眼からのＲＰＥ／脈絡膜全体を用いた最初の実験は、Ａ２Ｅが年齢と共に線形に増加することを明らかにした（Ｎ＝６６，Ｐ＜０．０００１）（図ｓＡ）。この同じ年齢に伴う有意な増加は黄斑および周辺網膜の両方に存在したが、Ａ２Ｅのレベルは周辺において４倍高いのが典型的であった（図２Ｂおよび２Ｃ）。

[0040] 我々は、黄斑におけるＡ２Ｅのより低いレベルは、上を覆っている網膜中のカロテノイド類のより高いレベルと関係している可能性があると推測した。表１は、実際にこのようになったことを示している：若い眼および高齢の眼において、黄斑では周辺に対して総カロテノイド類のレベルが１０倍高く、周辺では黄斑に対してＡ２Ｅのレベルが３倍よりも高かった。

表１．ヒトの眼からの８ｍｍの黄斑および周辺のパンチにおける、ＲＰＥ／脈絡膜中のＡ２Ｅのレベルおよび上を覆っている網膜中のカロテノイド類のレベル（平均±ＳＤ） ^* 。

＊これらのデータは、死の前に高い用量のルテインサプリメントを定期的に消費していた４８歳以上の高齢の異常値を排除している（３４）。
[0041] 黄斑（Ｒ＝−０．２８；Ｎ＝３５；Ｐ＝０．１０）および周辺網膜（Ｒ＝−０．３６；Ｎ＝４０；Ｐ＝０．２０）の両方において、網膜のカロテノイドのレベルは下にあるＲＰＥ／脈絡膜中のＡ２Ｅのレベルと逆相関していたが、周辺網膜のみが統計学的有意に達していた（図３）。

動物のＲＰＥ／脈絡膜および網膜中のＡ２Ｅおよびカロテノイドのレベル
[0042] ヒトの眼は、食餌による操作に応答する黄斑カロテノイドのレベルの変化が遅いことおよびＡ２Ｅの分析測定の侵襲的性質により、容易にはカロテノイドおよびＡ２Ｅのレベルの実験的操作を受け入れられない。従って我々は様々な高等脊椎動物の眼を調査し、眼性カロテノイドおよびＡ２Ｅのレベルを湿重量に基づいて比較した（表２）。

表２：様々な高等脊椎動物におけるＲＰＥ／脈絡膜および上を覆っている網膜中のＡ２Ｅおよびカロテノイドのレベル。

＊ラットおよびマウスに関して、ｎ＝６およびｎ＝８の試料をまとめてカロテノイド類およびＡ２Ｅ両方の抽出および検出のために用いた。
[0043] 予想されたように、サルの眼はＡ２Ｅおよびカロテノイドの含有量に関してヒトの眼に最も近く似ていたが、これらの実験動物は調達するのに費用がかかり、管理および扱いが難しい。若いラットおよびマウスの目は辛うじて検出できるレベルのカロテノイド類を含んでおり、高い用量のカロテノイドの補充がこれらの非常に低いレベルを変えることができることを示す公開された文献は存在しない。さらに、それらの組織湿重量に対するＡ２Ｅのレベルは、リストした他の動物よりも数桁低い。一般に、齧歯類は、Ａｂｃａ４ノックアウトおよびＥｌｏｖ１４トランスジェニックマウス（７〜８）におけるように、適切に遺伝学的に改変された場合にのみ高レベルのＡ２Ｅを有する。ウシおよび、より低い程度で、ブタは、食餌での操作に適した適度なレベルのＡ２Ｅおよびカロテノイド類を有するが、これらの動物はかなり大きい。メスのニホンウズラは小さいサイズと適度なレベルの眼のＡ２Ｅおよびカロテノイド類の最高の組み合わせを有しており、従ってそれらをさらなる試験のために選択した。

[0044] 若い成体のメスのニホンウズラに(3R, 3’R, 6’R)-ルテインまたは(3R, 3’R)-ゼアキサンチンを１６週間の期間補充し、補充しなかったウズラと比較した。図４および表３において示されているように、総網膜カロテノイドレベルはルテインを補充したグループにおいて基底線と比較して１．６倍に、およびゼアキサンチンを補充したグループにおいて３．１倍に上昇しており、一方で対照の餌のトリでは１６％減少していた。総ルテインおよびゼアキサンチンレベルはルテインを補充したグループにおいて基底線と比較して２．８倍に、およびゼアキサンチンを補充したグループにおいて８．１倍に増加しており、一方で対照の餌のトリでは６．５％増加していた。補充したトリにおけるこれらの増加の全てが統計学的に有意であった（Ｐ＜０．０５）。ルテインおよびゼアキサンチンの補充は、ＲＰＥ中のルテイン、ゼアキサンチンおよびそれらのカロテノイド代謝産物のレベルの、基底および対照グループと比較した有意な増加にもつながった（Ｐ＜０．０５）（表３）。

表３：補充実験の開始および終了の時点でのニホンウズラのＲＰＥ／脈絡膜および網膜中のカロテノイド含有量。

[0045] １６週間の期間で、補充しなかった対照グループではＡ２Ｅのレベルが基底レベルと比較して６倍より高く上昇したが（Ｐ＜０．００１）、ルテインおよびゼアキサンチンを補充したトリは基底線レベルからの上昇をほとんど示さなかった（Ｐ＝０．１）。対照グループからのＡ２Ｅの質量スペクトルは、ルテインおよびゼアキサンチンを補充したグループからの質量スペクトルと比較してより高いレベルの酸化生成物を有していた（図５）。

考察
[0046] この試験で、我々はまずヒトの提供者の眼における網膜のカロテノイド類およびＡ２Ｅの間の関係を調べた。我々は、黄斑および周辺網膜の両方においてＡ２Ｅが年齢と共に上昇すること、ならびにそれが年齢と共により酸化された状態になることを確認した。興味深いことに、集中的な光曝露および高い代謝活性にも関わらず、これらの８ｍｍパンチにおける黄斑のＡ２Ｅレベルは、黄斑において周辺と比較して約３倍低かった。黄斑および周辺の両方において、Ａ２Ｅのレベルおよび総カロテノイド類の間に逆相関があったが、統計学的有意に達したのは周辺においてのみであった。まとめると、これらのヒトの死体の眼のデータは網膜のカロテノイド類が下にあるＲＰＥにおけるＡ２Ｅの形成および酸化を抑制するという仮説と一致するが、この仮説の証明は前向き臨床試験または適切な動物実験のどちらかを必要とする。ヒトの試験は、非侵襲的な定量的Ａ２Ｅ測定を十分な信頼性で行うのが難しいため、および生きているヒトにおいて周辺のカロテノイド類を測定するのが不可能であるため困難であろう。従って、我々はさらなる研究のために動物モデルへと方向を向けた。

[0047] 齧歯類はＡ２Ｅ形成の阻害剤を研究するために最も頻繁に用いられてきたが、それらにおいて眼における内在性のＡ２Ｅおよびカロテノイド類レベルが低いこと、ならびにそれらが補充に応答してカロテノイド類を網膜中に取り込めないことのために、さらなる研究が不可能になっている。我々は様々な他の可能性のある実験動物を調査し、ニホンウズラは、湿重量を基準としてヒトに匹敵するカロテノイド類およびＡ２Ｅの基底線レベルを有しており、眼におけるカロテノイドレベルを食餌によって操作することを受け入れられる（ａｍｅｎｄａｂｌｅ）（３１〜３２）ため、さらに研究するためには最高の小さい非霊長類の動物モデルであることを見いだした。我々の実験は、高い用量のルテインまたはゼアキサンチンを補充したトリにおいては、カロテノイド類が少ない対照の餌を与えられたトリと比較して、著しくＡ２Ｅ形成が抑制されることを示した。ウズラの網膜中のカロテノイド類の大部分は脂肪酸エステルとして油滴中に隔離されるため、摂取されたカロテノイド類によるＡ２Ｅ形成の抑制は、直接的な抗酸化機構によるよりもむしろ光フィルター作用により仲介されている可能性がより高い。これは補充に応答したＲＰＥのカロテノイド類の有意な増加はあったものの、そのレベルは上を覆っている網膜よりもなお約１０倍低いままであったためである。

[0048] 我々の発見は、変性性の眼の障害におけるルテインおよびゼアキサンチンの可能性のある前向き作用−すなわちＡ２Ｅの形成および酸化の抑制に関する新規の機構に関する証拠を提供する。リポフスチンの非侵襲的定量が向上すれば、生きているヒトにおいてこの仮説を直接試験することができる。ルテインおよびゼアキサンチンは、現在調査されている他の阻害剤とは異なり、それらは既にヒトにおいて食事用サプリメントとして広く用いられており、今までに毒性が報告されていないため、Ａ２Ｅ形成阻害剤としての臨床的用途に関して特に魅力的な薬剤である。さらに、我々の調査はＡ２Ｅ形成の阻害剤の試験に関する非齧歯類の小動物モデルの価値を指摘する。１５０〜２００ｇで、成体のニホンウズラはラットの大きさであり、世話しやすく、カロテノイド類が少ない対照の餌を与えられると数ヶ月間の期間にわたって数倍に増加したＡ２Ｅのレベルを形成する。従って、Ａ２Ｅ形成の新規の薬理学的阻害剤の迅速なスクリーニングがかなり実行可能になるはずである。

参考文献−下記の参考文献を本明細書にそのまま援用する：

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Claims (20)

1. それを必要とする対象において2-(2,6-ジメチル-8-(2,6,6-トリメチル-1-シクロヘキセン-1-イル)-1E,3E,5E,7E-オクタテトラエニル)-1-(2-ヒドロキシエチル)-4-(4-メチル-6-(2,6,6-トリメチル-1シクロヘキセン-1-イル)-1E,3E,5E-ヘキサトリエニル-ピリジニウム（Ａ２Ｅ）およびその異性体の含有量を減少させる方法であって、療法上有効量の黄斑カロテノイド配合物を投与し、それによりＡ２Ｅの含有量を減少させることを含む方法。
2. 該カロテノイドがルテインである、請求項１に記載の方法。
3. 該カロテノイドがゼアキサンチンである、請求項１に記載の方法。
4. 該対象が哺乳類である、請求項１に記載の方法。
5. 該対象がヒトである、請求項１に記載の方法。
6. 該組成物が経口で与えられる、請求項１に記載の方法。
7. 該Ａ２Ｅが網膜色素上皮／脈絡膜において減少する、請求項１に記載の方法。
8. 該Ａ２Ｅが黄斑において減少する、請求項１に記載の方法。
9. 該Ａ２Ｅが網膜において減少する、請求項１に記載の方法。
10. 該Ａ２Ｅが水晶体において減少する、請求項１に記載の方法。
11. ルテインが主要なカロテノイドである、請求項１に記載の方法。
12. ゼアキサンチンが主要なカロテノイドである、請求項１に記載の方法。
13. それを必要とする対象において眼組織の酸化を減少させる方法であって、療法上有効量の黄斑カロテノイド配合物を投与し、それにより眼組織における酸化を減少させることを含む方法。
14. 該眼組織が黄斑および網膜色素上皮からなるグループから選択される、請求項１３に記載の方法。
15. 該対象が加齢黄斑変性の危険性がある、または加齢黄斑変性に関して処置されている、請求項１３に記載の方法。
16. 該対象がスターガルト病の危険性がある、またはスターガルト病に関して処置されている、請求項１３に記載の方法。
17. 該対象が色素性網膜炎の危険性がある、または色素性網膜炎に関して処置されている、請求項１３に記載の方法。
18. 該対象が白内障の発現の危険性がある、または白内障の発現に関して処置されている、請求項１３に記載の方法。
19. それを必要とする対象において視覚性能を向上させる方法であって、療法上有効量の黄斑カロテノイド配合物を投与し、それにより対象における視覚性能を向上させることを含む方法。
20. 該視覚性能が視力、コントラスト感度および回復の低減（ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）からなるグループから選択される、請求項１９に記載の方法。