WO2011086973A1 - 活性型egfr特異抗体 - Google Patents

活性型egfr特異抗体 Download PDF

Info

Publication number
WO2011086973A1
WO2011086973A1 PCT/JP2011/050145 JP2011050145W WO2011086973A1 WO 2011086973 A1 WO2011086973 A1 WO 2011086973A1 JP 2011050145 W JP2011050145 W JP 2011050145W WO 2011086973 A1 WO2011086973 A1 WO 2011086973A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
egfr
antibody
antigen
binding fragment
active
Prior art date
Application number
PCT/JP2011/050145
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
伸之 伊勢
和也 小見
Original Assignee
富士レビオ株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 富士レビオ株式会社 filed Critical 富士レビオ株式会社
Priority to EP11732843.5A priority Critical patent/EP2524964A4/en
Priority to US13/521,942 priority patent/US20120282633A1/en
Publication of WO2011086973A1 publication Critical patent/WO2011086973A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators

Definitions

  • the present invention relates to an antibody that specifically binds to active EGFR, and a method for measuring active EGFR and a method for detecting cancer using the antibody.
  • Epidermal growth factor receptor (Epidermal Factor Receptor; EGFR) is a transmembrane receptor consisting of an intracellular tyrosine kinase domain and an autophosphorylation site, a transmembrane domain, and an extracellular EGF ligand binding domain. Abnormal activation of EGFR is known to cause carcinogenesis and is a therapeutic target. Therefore, the provision of a method that can easily and reliably detect the activation of EGFR is very useful in the mechanism of canceration, the development of cancer therapy, and the diagnosis of cancer.
  • EGFR Epidermal growth factor receptor
  • a method for detecting activated EGFR kinase in a sample such as a cell or tissue extract
  • a method phosphorylated EGFR measurement method
  • phosphorylation of EGFR is interpreted synonymously with activation.
  • a method for measuring phosphorylation activity on a synthetic peptide substrate a method for measuring enzyme activity
  • Non-Patent Documents 1 and 2 antibodies that recognize EGFR structural change sites are also known (Non-Patent Documents 1 and 2).
  • the antibody described in Non-Patent Document 1 recognizes the same domain whose structure has been changed by highmannose modification of the extracellular domain.
  • the antibody described in Non-Patent Document 2 recognizes a site whose structure has been changed by phosphorylation.
  • the activation of EGFR is usually evaluated using the phosphorylation level of EGFR as an index.
  • the inventors of the present application focused on the point that phosphorylation does not necessarily reflect the activation of EGFR. That is, EGFR phosphorylation occurs secondarily as a result of EGFR activation and does not necessarily reflect EGFR activation.
  • EGFR may be phosphorylated crosswise by other activated kinases in the biological sample. Depending on the phosphorylation site to be measured, there is a case where EGFR is activated but not phosphorylated.
  • the measurement value varies greatly depending on the conditions at the time of measurement due to the influence of phosphatase phosphatase.
  • the influence of phosphatase is also strongly influenced during the preparation of biological samples. Experiments at low temperatures and the use of phosphatase inhibitors are indispensable, and there is also a risk that the measured value may fluctuate if the control by them is insufficient. Therefore, the measurement method using phosphorylation as an index cannot appropriately measure the activation of EGFR.
  • Non-Patent Document 2 is an antibody that recognizes a site whose structure has been changed by phosphorylation. Have the same problems. Moreover, the structural change recognized by the antibody described in Non-Patent Document 1 is not necessarily an index for EGFR activation.
  • an object of the present invention is to provide means for accurately measuring activated EGFR regardless of the presence or absence of phosphorylation.
  • the inventors of the present application acquired an antibody that specifically recognizes and binds to activated EGFR, regardless of phosphorylation, from an antibody produced using the intracellular domain of EGFR as an immunogen. Successfully completed the present invention.
  • the present invention provides an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to non-denatured active EGFR.
  • the present invention comprises contacting a non-denaturing sample with the antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof, and performing an antigen-antibody reaction between the active EGFR in the sample and the antibody or the antigen-binding fragment thereof.
  • a method for measuring active EGFR which comprises measuring active EGFR in the sample by immunoassay.
  • the present invention provides a method for detecting cancer, which comprises measuring active EGFR in a sample separated from a living body by the method of the present invention.
  • the present invention provides an assay kit for active EGFR comprising the antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention provides a cancer detection kit comprising the antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention provides for the first time an antibody that can directly measure active EGFR itself without phosphorylation.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention specifically binds to non-denatured active EGFR, and can bind whether the active EGFR is in a phosphorylated form or a non-phosphorylated form. Therefore, according to the present invention, it is possible to measure active EGFR more accurately than conventional measurement methods.
  • abnormal activation of EGFR causes carcinogenesis and is a therapeutic target.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention is also useful for detection of cancer, particularly for detection of cancer to be administered with a molecular target therapeutic agent that targets EGFR.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention can contribute to elucidation of canceration mechanism and development of a novel treatment method for cancer, and can contribute widely to diagnosis and treatment of cancer.
  • the left side shows the antibody used for detection by Western blot.
  • Antibody 19-1 was used for detection of Western blot.
  • Cell extracts for human lung cancer-derived wild-type EGFR-expressing cell lines (A549, H460), human lung cancer-derived activated mutant EGFR-expressing cell lines (PC-9, HCC4006), and human lung cancer-derived EGFR overexpressing cell lines (HCC827) The results of immunoprecipitation of EGFR inside with an activated EGFR specific antibody are shown.
  • the left side (WB) shows the antibody used for detection by Western blot.
  • the antibody of the present invention specifically binds to unmodified active EGFR. That is, it binds only to active EGFR and does not substantially bind to non-activated (non-active) EGFR under protein non-denaturing conditions. “Substantially does not bind” means that it does not bind to non-active EGFR at a detectable level, or even if it binds to non-active EGFR at a detectable level, the degree of binding with active EGFR It means that it binds only to a degree that is clearly apparent to those skilled in the art that it is clearly less than the binding of and not bound to active EGFR.
  • Activating EGFR refers to EGFR whose structure has been changed to a state where information can be transmitted to downstream factors.
  • EGFR exists in an inactive form in normal living cells.
  • EGF binds to the extracellular ligand binding domain of EGFR
  • this ligand stimulates EGFR to become active, ATP binds to the ATP binding site in the intracellular domain, autophosphorylation occurs, and signals to downstream factors To communicate.
  • natural ligands such as TGF- ⁇ , amphiregulin, heparin-binding EGF-like growth factor (Heparin-binding EGF-like Growth actFactor; HB-EGF) can be used as ligands that activate EGFR.
  • TGF- ⁇ amphiregulin
  • heparin-binding EGF-like Growth actFactor Heparin-binding EGF-like Growth actFactor; HB-EGF
  • activating mutants of EGFR that show an activated state regardless of ligand stimulation are activated.
  • Human lung cancer-derived cell lines for example, PC-9, HCC4006, etc.
  • EGFR overexpression cell lines for example, HCC827 etc.
  • the active EGFR recognized by the antibody of the present invention includes various EGFR in an activated form recognized by those skilled in the art as active EGFR.
  • the antibody of the present invention is an antibody that specifically binds to non-denatured (non-denatured) active EGFR. Under denaturing conditions, this specificity of the invention is lost. In other words, the conditions in which the original three-dimensional structure of the protein was lost due to the protein in the sample being denatured by physical treatment such as heating, freezing, ultraviolet light, or chemical treatment such as acid, base, guanidine, or surfactant. Below, the specificity of the antibody of the present invention to active EGFR is lost, and it binds not only to active EGFR but also to non-active EGFR (see Examples below). This suggests that the antibody of the present invention recognizes the EGFR conformation change associated with activation.
  • the antibody of the present invention can detect active EGFR with or without phosphorylation. That is, it can bind to both non-phosphorylated active EGFR and phosphorylated active EGFR. As described above, the change to the active form of EGFR occurs prior to phosphorylation, but in the conventional active EGFR measurement method, activation of EGFR is evaluated using phosphorylation as an index. According to the antibody of the present invention, since activated EGFR itself can be directly detected, it becomes possible to evaluate the activation of EGFR more accurately than the conventional method.
  • the base sequence and amino acid sequence of the EGFR gene are known, and are registered in the NCBI database as accession numbers NM_005228 (mRNA) and NP_005219 (protein), for example. These sequences are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 in the sequence listing.
  • 24 residues at the N-terminus region aa1-24 in SEQ ID NO: 2 are signal sequences, and these 24 residues are removed after being expressed as a protein in the cell.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is the amino acid sequence of the EGFR protein from which this signal sequence has been removed.
  • the antibody of the present invention is not particularly limited, but binds to a region within aa956-998 (meaning “amino acids 956 to 998”) or a region within aa1023-1115 in the EGFR protein (SEQ ID NO: 3). To do.
  • the binding properties of the three established antibodies are analyzed using various fragments of the EGFR intracellular domain.
  • Antibodies 4-2 and 25-1 are the regions within aa956-998, and antibody 30 -2 has been confirmed to bind to the region within aa1023-1115. Therefore, the epitope of each antibody is considered to exist in each region.
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but a monoclonal antibody with high reproducibility is preferred for immunoassay and the like.
  • the anti-active EGFR antibody of the present invention can be obtained, for example, by a known hybridoma method using the intracellular domain of wild-type EGFR (aa669-1210 in SEQ ID NO: 2 and aa645-1186 in SEQ ID NO: 3) as an immunogen.
  • a hybridoma is produced by fusing with an immortalized cell, and a hybridoma producing an antibody having a desired binding property is screened from the hybridoma, and the antibody is recovered from the screened hybridoma, whereby the monoclonal antibody of the present invention is recovered.
  • Active and non-active EGFR is, for example, a known cell line expressing wild-type EGFR (for example, A549, H460, etc.) treated with EGF (eg, adding EGF to the culture medium) and not treated with EGF Protein can be extracted from When cells are treated with a ligand in this way, autophosphorylation of EGFR also occurs, and thus a phosphorylated form of active EGFR is obtained.
  • the activated EGFR that is not phosphorylated may be treated with a ligand in the presence of a phosphorylation inhibitor such as gefitinib.
  • a phosphorylation inhibitor such as gefitinib.
  • the antibody of the present invention is appropriately screened by screening an antibody produced by a conventional method using specific binding to an active form as an index, and screening the obtained antibody for binding regardless of the presence or absence of phosphorylation. Can be acquired.
  • “specific binding” is also as defined above.
  • Antigen-binding fragment means an antibody fragment that maintains the binding ability (antigen-antibody reactivity) of the antibody to the corresponding antigen, such as an Fab fragment or F (ab ′) 2 fragment of an immunoglobulin, for example. To do. It is well known that such antigen-binding fragments can also be used for immunoassays, and are useful in the same manner as the original antibody. Fab fragments and F (ab ′) 2 fragments can be obtained by treating monoclonal antibodies with proteolytic enzymes such as papain and pepsin, as is well known.
  • the antigen-binding fragment is not limited to the Fab fragment or the F (ab ′) 2 fragment, and may be any fragment that maintains the binding property with the corresponding antigen. It may be prepared.
  • an antibody in which a single chain fragment of variable region (scFv: single chain fragment of variable region) is expressed in E. coli can be used by a genetic engineering technique.
  • the method for producing scFv is also well known.
  • the hybridoma mRNA produced as described above is extracted, single-stranded cDNA is prepared, and PCR is performed using primers specific to immunoglobulin H chain and L chain for immunization.
  • ScFv by amplifying globulin H chain gene and L chain gene, linking them with a linker, adding an appropriate restriction enzyme site and introducing it into a plasmid vector, transforming E. coli, and recovering scFv from E. coli Can be produced.
  • Such scFv is also included in the scope of the present invention as an “antigen-binding fragment”.
  • an antibody capable of exhibiting specificity for active EGFR without being affected by the presence or absence of phosphorylation and an antigen-binding fragment thereof are provided. Therefore, by immunoassay using the antibody or the antigen-binding fragment thereof It becomes possible to measure the active EGFR in the sample more accurately than in the past. That is, the present invention is to measure active EGFR in a sample by immunoassay using an antigen-antibody reaction between the above-described antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof and active EGFR in the sample. A method for measuring active EGFR is also provided.
  • the term “measurement” includes detection, quantification, and semi-quantification.
  • the specificity of the antibody of the present invention for active EGFR is exhibited under conditions where the active EGFR has not undergone denaturation. Therefore, when measuring active EGFR using the antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof, contact with an anti-active EGFR antibody or an antigen-binding fragment thereof under conditions that do not denature the protein in the sample. It is necessary to let
  • the immunoassay method itself is well known in this field. Any well-known immunoassay method can be employed as long as the above-mentioned condition that the non-denaturing sample is brought into contact with the antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof can be satisfied. That is, when classified based on the reaction format, there are a sandwich method, a competitive method, an agglutination method, and the like, and when classified based on a label, there are an enzyme immunoassay, a radioimmunoassay, a fluorescence immunoassay, etc. And can be employed in the measurement method of the present invention. Although not particularly limited, techniques such as immunoprecipitation, ELISA, and immunostaining can be preferably employed as specific examples.
  • Reagents necessary for each immunoassay are well known, and an immunoassay can be performed using a normal immunoassay kit except that the antibody used is the antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof. That is, the present invention also provides a measurement kit for carrying out the measurement method of the present invention, comprising the above-described antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof. Reagents contained in the kit other than the antibody or antigen-binding fragment thereof may be the same as those in known ordinary immunoassay kits.
  • the sample is not limited at all, and any sample may be used as long as it can contain active EGFR.
  • a sample derived from a living body separated from a living body or a sample not derived from a living body may be used.
  • biological samples include, but are not limited to, blood samples (whole blood, plasma, serum, etc.), cell extracts, tissue samples, and the like.
  • the living body is not particularly limited, but is a mammal such as a human, a dog, a cat, a rabbit, a mouse, or a hamster.
  • abnormal activation of EGFR causes carcinogenesis and is a therapeutic target.
  • active EGFR in various cancer-derived cell lines can be detected.
  • Certain types of cancer, such as lung cancer, are known to have more active EFGR than healthy individuals, and EGFR such as gefitinib, etc., for those types of cancer that activate EGFR abnormally A molecular targeted therapeutic drug that targets is effective.
  • the active EGFR measurement method of the present invention is performed on a sample separated from a living body to be detected whether it is cancer or not, cancer of the living body can be detected, and in particular, a molecular target therapeutic drug targeting EGFR It is useful for examining whether or not to be administered. Therefore, the active EGFR measurement method of the present invention is also useful as a cancer detection method, particularly as a cancer detection method to be administered with a molecular target therapeutic agent targeting EGFR.
  • the active EGFR measurement kit described above is also useful as a cancer detection kit, in particular, as a cancer detection kit to be administered with a molecular target therapeutic agent targeting EGFR.
  • the measurement method of the present invention is performed on a sample separated from the organism, and if active EGFR in the sample is measured, is it cancer? You can determine whether or not. If the measured value is significantly higher than the amount of active EGFR in a sample derived from a healthy living body, the living body is likely to suffer from cancer. When such a living body is actually diagnosed as cancer, a molecular targeted therapeutic drug targeting EGFR can be effective in the treatment of cancer in the living body. Can effectively treat cancer. That is, the detection method of the present invention can be carried out on a living body that has already been diagnosed with cancer for the purpose of examining the use of a molecular target therapeutic agent.
  • lung cancer, colon cancer, breast cancer and the like are known as cancers in which EFGR activation is seen, but not limited to such known examples, EGFR activation is actually confirmed by the method of the present invention. Since a molecular targeted therapeutic drug that targets EGFR can be effective as long as it is a cancer, the scope of the present invention is not limited by the type of cancer.
  • Molecular target therapeutic drug is a general term in the field of medical treatment, and usually refers to a drug that acts specifically by targeting a gene or gene product involved in a disease.
  • “molecular target therapeutic drug targeting EGFR” refers to a drug that targets EGFR, and binds to non-active EGFR to change to active form or to signal downstream. Those that inhibit or those that bind to the active form of EGFR and inhibit downstream signaling are included.
  • molecular targeted therapeutic agents targeting EGFR, gefitinib, erlotinib and the like are known, and various new substances are under development.
  • active EGFR can be measured more accurately than conventional methods, so that it is possible to preferably detect cancer patients of the type in which EGFR is excessively activated. Can greatly contribute to the selection.
  • the amount of active EGFR is measured for multiple healthy subjects to determine the healthy reference value, and this is compared with the amount of active EGFR in the target sample. It is preferable to check whether there is any. Furthermore, for multiple known cancer patients with excessive activation of EGFR, the amount of active EGFR is measured to determine the cancer reference value, and whether or not there is a significant difference with this is further improved detection accuracy. Since it can raise, it is more preferable.
  • a plurality of cancer reference values may be provided in stages such as false positive and positive. Such a reference value does not need to be determined every time it is implemented, and a predetermined reference value can be used.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention can also be used for screening for novel compounds useful for cancer treatment, for example.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention can contribute to the diagnosis of cancer and the selection of therapeutic means, as well as the elucidation of canceration mechanisms and the development of new therapeutic methods for cancer.
  • the EGFR intracellular domain (aa669-1210 in SEQ ID NO: 2 and aa645-1186 in SEQ ID NO: 3) expressed in insect cells by a conventional method is immunized to mice with Freund's adjuvant, and the conventional hybridoma method
  • a hybridoma producing an antibody against the EGFR intracellular domain was prepared.
  • the reactivity of the antibody to the immunogen was analyzed by ELISA, a hybridoma producing an antibody that binds to the immunogen was selected, and the antibody was recovered (antibodies 4-2, 5-1, 19-1, 25-1, 30-2).
  • 5-1 and 19-1 are antibodies that bind to all states of EGFR (no specificity for active EGFR), as shown in the following experiment, and 4-2, 25 -1 and 30-2 were specifically bound to active EGFR.
  • FIG. 1 (b) SDS-PAGE of untreated and EGF-treated A549 cell extract denatured with SDS sample buffer, transferred to a PVDF membrane, and detected by Western blot using established antibodies.
  • the antibody ⁇ -pY1148 in the figure is an antibody established using as an immunogen a peptide synthesized based on the peripheral sequence of one of the phosphorylation domains of EGFR, pY1148.
  • the established antibodies 4-2, 25-1, and 30-2 do not adhere to the PVDF membrane regardless of EGF stimulation. Reacted with transcribed denatured EGFR.
  • Established antibody 4-2 showed EGF stimulation-dependent reactivity against EGFR in wild-type EGFR-expressing cell lines (A549, H460), but mutant EGFR-expressing cell lines (PC-9, HCC4006) ) And EGFR overexpressing cell line (HCC827) reacted with EGFR even under non-stimulated EGF conditions.
  • mutants and overexpression strains are known as human cancer-derived cell lines that cause activation of EGFR, and against various types of activated EGFR including those expressed in such cancers It was also shown that the established antibody can react specifically.
  • Activating mutant EGFR that specifically reacts with established antibodies has become a therapeutic target for molecular target therapeutics for cancers such as gefitinib, and is also useful for cancer diagnosis such as diagnosing cancers targeted by molecular target therapeutics It was shown that.
  • the reacted antibody 30-2 is the AlexaFluor488 fluorescently labeled secondary antibody
  • the reacted anti-EEA1 rabbit antibody is the AlexaFluor555 fluorescently labeled secondary antibody (FIG. 4 (b)).
  • antibody 5-1 reacted with the plasma membrane localized EGFR of EGF-untreated A549 cells.
  • antibody 30-2 did not react with EGFR of E549-untreated A549 cells, but specifically reacted with EGFR of E549-stimulated A549 cells localized in early endosomes together with EEA1.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

要約　活性化されたEGFRをリン酸化の有無にかかわらず正確に測定できる手段が開示されている。本発明の抗体又はその抗原結合性断片は、活性型EGFRがリン酸化形態と非リン酸化形態のいずれであっても結合できる。該抗体又はその抗原結合性断片を利用して免疫測定を行えば、試料中の活性型EGFRを従来法よりも正確に測定できる。EGFRの異常な活性化は発癌の原因となり、治療標的となっているため、本発明の抗体又はその抗原結合性断片は、癌の検出、とりわけEGFRを標的とする分子標的治療薬の投与対象となる癌の検出にも有用である。

Description

活性型EGFR特異抗体
　本発明は、活性型EGFRと特異的に結合する抗体、並びに該抗体を用いた活性型EGFRの測定方法及び癌の検出方法に関する。
　上皮成長因子受容体（Epidermal Growth Factor Receptor; EGFR）は、細胞内のチロシンキナーゼドメイン及び自己リン酸化部位、膜貫通ドメイン、並びに細胞外のEGFリガンド結合ドメインとから成る膜貫通型レセプターである。EGFRの異常な活性化は発癌の原因となることが知られており、治療標的となっている。それ故に、EGFRの活性化を簡便且つ確実に検出可能な方法の提供は、癌化メカニズム、癌の治療法の開発及び癌の診断において非常に有用である。
　細胞あるいは組織抽出液等試料中の活性化EGFRキナーゼの検出方法としては、活性化に伴って変化するEGFRのリン酸化状態を活性化のマーカーとして測定する方法（リン酸化EGFR測定法）が一般的に用いられている。一般には、EGFRのリン酸化が活性化と同義に解釈されている。感度の問題から一般的な手法は確立されていないが、合成ペプチド基質に対するリン酸化活性を測定する方法（酵素活性測定法）も考えられている。
　その他、EGFRの構造変化部位を認識する抗体も知られている（非特許文献１、２）。非特許文献１に記載の抗体は、細胞外ドメインのhighmannose修飾により構造変化した同ドメインを認識する。非特許文献２に記載の抗体は、リン酸化により構造変化した部位を認識する。
FASEB J 2005;19(7):780. J Biol Chem 1995;270(14):7975-7979.
　上記の通り、EGFRの活性化は通常EGFRのリン酸化レベルを指標として評価されている。しかしながら、本願発明者らは、リン酸化が必ずしもEGFRの活性化を反映していないという点に着目した。すなわち、EGFRのリン酸化とは、EGFRの活性化の結果二次的に起こるものであり、必ずしもEGFRの活性化を反映していない。また、EGFRが活性化されていなくても、生体試料中の他の活性化されたキナーゼにより交差的にEGFRがリン酸化される場合がある。測定対象とするリン酸化部位によっては、EGFRが活性化されているにも関わらずリン酸化されていない場合もある。さらに、生体中においては脱リン酸化酵素フォスファターゼの影響を受け、測定する時点における条件により測定値が大きく異なるケースがある。フォスファターゼの影響は生体試料調製時にも強く受け、低温下での実験、フォスファターゼ阻害剤の使用が不可欠であり、それらによる制御が不十分な場合は測定値が変動するリスクもある。従って、リン酸化を指標とした測定方法では、EGFRの活性化を適切に測定することができていない。
　上記したEGFRの構造変化を認識する公知の抗体のうち、非特許文献２に記載の抗体は、リン酸化により構造変化した部位を認識する抗体であるため、リン酸化を指標とする一般的な手法と同じ問題点を有する。また、非特許文献１に記載の抗体が認識する構造変化は、必ずしもEGFRの活性化の指標とはならない。
　従って、本願発明の目的は、活性化されたEGFRをリン酸化の有無にかかわらず正確に測定できる手段を提供することにある。
　本願発明者らは、鋭意研究の結果、EGFRの細胞内ドメインを免疫原として作製した抗体から、リン酸化の有無にかかわらず、活性化されたEGFRを特異的に認識して結合する抗体を獲得することに成功し、本願発明を完成した。
　すなわち、本発明は、非変性の活性型EGFRと特異的に結合する抗体又はその抗原結合性断片を提供する。また、本発明は、非変性の試料と上記本発明の抗体又はその抗原結合性断片とを接触させ、試料中の活性型EGFRと前記抗体又はその抗原結合性断片との間の抗原抗体反応を利用した免疫測定により前記試料中の活性型EGFRを測定することを含む、活性型EGFRの測定方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の方法により、生体から分離した試料中の活性型EGFRを測定することを含む、癌の検出方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の抗体又はその抗原結合性断片を含む、活性型EGFRの測定キットを提供する。さらに、本発明は、上記本発明の抗体又はその抗原結合性断片を含む、癌の検出キットを提供する。
　本発明により、活性型EGFR自体をリン酸化によらずに直接的に測定可能な抗体が初めて提供された。本発明の抗体又はその抗原結合性断片は、非変性の活性型EGFRと特異的に結合し、活性型EGFRがリン酸化形態と非リン酸化形態のいずれであっても結合できる。従って、本発明によれば、従来の測定法よりも正確に活性型EGFRを測定可能になる。当業者に周知の通り、EGFRの異常な活性化は発癌の原因となり、治療標的となっている。本発明の抗体又はその抗原結合性断片は、癌の検出、とりわけEGFRを標的とする分子標的治療薬の投与対象となる癌の検出にも有用である。また、本発明の抗体又はその抗原結合性断片は、癌化メカニズムの解明や癌の新規治療法の開発にも貢献でき、癌の診断及び治療に広く貢献できる。
(a)　実施例で作製された各抗体で細胞抽出液中のEGFRを免疫沈降し、沈降されたEGFRをウエスタンブロットにより検出した結果を示す。写真の上部（IP mAb）には免疫沈降に用いた抗体を、左側（WB）にはウエスタンブロットで検出に用いた抗体を示す。(b)　実施例で作製された各抗体を用いたウエスタンブロットにより、変性させた細胞抽出液中のEGFRを検出した結果を示す。 ゲフィチニブ処理によりリン酸化を阻害した条件下でリガンド刺激した細胞からの抽出液について、各抗体を用いたEGFRの免疫沈降実験を行なった結果を示す。(a)　免疫沈降に抗体5-1を用いた場合の結果である。左側（WB）にはウエスタンブロットで検出に用いた抗体を示す。(b)　左側（IP）に示した各抗体で免疫沈降を行なった結果である。ウエスタンブロットの検出には抗体19-1を用いた。 ヒト肺癌由来野生型EGFR発現細胞株（A549、H460）、ヒト肺癌由来活性化変異EGFR発現細胞株（PC-9、HCC4006）、及びヒト肺癌由来EGFR過剰発現細胞株（HCC827）について、細胞抽出液中のEGFRを活性化EGFR特異抗体により免疫沈降した結果を示す。(a)全抽出物をウエスタンブロットで検出した結果である。左側（WB）にはウエスタンブロットで検出に用いた抗体を示す。(b)抗体4-2で免疫沈降したEGFRをウエスタンブロットで検出した結果である。ウエスタンブロットの検出には抗体19-1を用いた。 活性化EGFR特異抗体を用いてリガンド刺激した細胞を免疫染色した結果を示す。(a)抗体5-1で免疫染色した結果である。(b)抗体30-2で免疫染色した結果である。Mergedとして、抗体30-2による染色像及びα-EEA1による染色像を重ねた像を示す。
　本発明の抗体は、変性されていない活性型EGFRと特異的に結合する。すなわち、タンパク質非変性の条件下において、活性型EGFRとのみ結合し、活性化されていない（非活性型の）EGFRとは実質的に結合しない。「実質的に結合しない」とは、非活性型EGFRとは検出可能なレベルで結合しないか、又は検出し得るレベルで非活性型EGFRと結合しても、その結合の程度が活性型EGFRとの結合よりも明らかに少なく、活性型EGFRと結合しているわけではないことが当業者にとって明瞭な程度にしか結合しないことを意味する。
　活性型EGFRとは、下流の因子に情報を伝達し得る状態に構造変化したEGFRを指す。EGFRは、通常の生体細胞内では非活性型で存在する。EGFRの細胞外リガンド結合ドメインにEGFが結合すると、このリガンド刺激を受けてEGFRが活性型となり、細胞内ドメイン中のATP結合部位にATPが結合して自己リン酸化が生じ、下流の因子にシグナルを伝達する。EGFRを活性化するリガンドとしては、EGFの他、TGF-α、アンフィレギュリン (amphiregulin)、ヘパリン結合EGF様増殖因子 (Heparin-binding EGF-like Growth Factor; HB-EGF)等の天然のリガンドが知られている。その他、リガンド刺激によらず活性化状態を呈するEGFRの活性化変異体（例えば配列番号２のEGFR配列中の746番Gluから750番Alaの領域の欠失など）が知られており、活性化変異EGFRを発現するヒト肺癌由来細胞株（例えばPC-9、HCC4006等）が公知である。また、EGFRの過剰発現によりEGFRが活性化され下流のシグナル経路が動いているEGFR過剰発現細胞株（例えばHCC827等）も知られている。本発明の抗体が認識する活性型EGFRには、このような、当業者の間で活性型EGFRと認識される、活性化形態にある種々のEGFRが包含される。
　本発明の抗体は、非変性の（変性されていない）活性型EGFRと特異的に結合する抗体である。変性条件下では、本発明のこの特異性は失われる。すなわち、加熱、凍結、紫外線等の物理的な処理、又は酸、塩基、グアニジン、界面活性剤等の化学的な処理により試料中のタンパク質が変性され、タンパク質の本来の立体構造が失われた条件下では、本発明の抗体の活性型EGFRへの特異性は失われ、活性型EGFRのみならず非活性型のEGFRとも結合する（下記実施例参照）。このことは、本発明の抗体が、活性化に関連するEGFRの立体構造の変化を認識していることを示唆している。
　本発明の抗体は、活性型のEGFRをリン酸化の有無にかかわらず検出可能である。すなわち、リン酸化されていない活性型EGFR及びリン酸化されている活性型EGFRの両者に結合できる。上記の通り、EGFRの活性型への変化はリン酸化に先行して生じるものであるが、従来の活性型EGFR測定法ではリン酸化を指標としてEGFRの活性化が評価されている。本発明の抗体によれば、活性型EGFRそのものを直接的に検出できるので、従来法よりもより正確にEGFRの活性化を評価することが可能になる。
　EGFR遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列は公知であり、例えばNCBIのデータベースにアクセッション番号NM_005228（mRNA）及びNP_005219（タンパク質）として登録されている。これらの配列を配列表の配列番号１及び２に示す。なお、EGFRのアミノ酸配列中、N末端の２４残基（配列番号２中のaa1-24の領域）はシグナル配列であり、細胞内でタンパク質として発現された後この２４残基は除去される。配列番号３に示すアミノ酸配列は、このシグナル配列が除去されたEGFRタンパク質のアミノ酸配列である。
　本発明の抗体としては、特に限定されないが、EGFRタンパク質（配列番号３）中のaa956-998（「第956番～第998番アミノ酸」の意）内の領域又はaa1023-1115内の領域に結合するものが挙げられる。下記実施例では、確立された3つの抗体について、EGFR細胞内ドメインの各種断片を用いて結合性を解析しており、抗体4-2及び25-1がaa956-998内の領域と、抗体30-2がaa1023-1115内の領域と結合することが確認されている。従って、それぞれの抗体のエピトープはそれぞれの領域内に存在すると考えられる。
　EGFRの活性化と構造変化に関しては、EGFRキナーゼドメインの結晶構造解析の報告があり、キナーゼドメインの構造変化と活性化とが密接に関連していることが示されている（Cancer Research 2004;64:6652-6659）。抗体4-2及び25-1のエピトープが存在するaa956-998の領域は、同報告において活性化により構造変化することが示されている領域と一致しているが、この点もまた、本発明の抗体が活性化による構造変化を認識していることを示唆している。
　抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、免疫測定等のためには再現性の高いモノクローナル抗体が好ましい。
　本発明の抗活性型EGFR抗体は、例えば、野生型EGFRの細胞内ドメイン（配列番号２ではaa669-1210、配列番号３ではaa645-1186の領域）を免疫原として用いて、周知のハイブリドーマ法により調製することができる。すなわち、野生型EGFRの細胞内ドメイン断片を周知の遺伝子工学的手法により調製し、これを免疫原として用いて動物（ヒトを除く）を免疫し、該動物から抗体産生細胞を得てミエローマ細胞等の不死化細胞と融合させることによりハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマから、所望の結合性を有する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングし、スクリーニングしたハイブリドーマから抗体を回収することにより、本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。
　スクリーニングは、(1)　EGFRの活性型と非活性型とを用いて、活性型への特異的な結合を確認する、(2)　リン酸化されていない活性型EGFRとリン酸化されている活性型EGFRの両者への結合を確認する、の2つの観点から行なえばよい。活性型及び非活性型のEGFRは、例えば、野生型のEGFRを発現する公知の細胞株（例えばA549、H460等）をEGF処理（培養液にEGFを添加する等）したもの及びEGF処理しないものからタンパク質を抽出して調製することができる。このように細胞をリガンド処理すると、EGFRの自己リン酸化も生じるため、リン酸化形態の活性型EGFRが得られる。リン酸化されていない形態の活性型EGFRについては、例えばゲフィチニブ等のリン酸化阻害剤の共存下でリガンド処理すればよい。通常、常法により作製した抗体を活性型への特異的結合を指標にスクリーニングし、得られた抗体について、リン酸化の有無にかかわらず結合するものをスクリーニングすることで、本発明の抗体を適宜取得することができる。なお、ここでいう「特異的結合」も上記の定義の通りである。
　本発明の抗体から抗原結合性断片を調製することも可能である。「抗原結合性断片」とは、例えば免疫グロブリンのFab断片やF(ab')2断片のような、当該抗体の対応抗原に対する結合性（抗原抗体反応性）を維持している抗体断片を意味する。このような抗原結合性断片も免疫測定に利用可能であることは周知であり、もとの抗体と同様に有用である。Fab断片やF(ab')2断片は、周知の通り、モノクローナル抗体をパパインやペプシンのようなタンパク分解酵素で処理することにより得ることができる。なお、抗原結合性断片は、Fab断片やF(ab')2断片に限定されるものではなく、対応抗原との結合性を維持しているいかなる断片であってもよく、遺伝子工学的手法により調製されたものであってもよい。また、例えば、遺伝子工学的手法により、一本鎖可変領域 (scFv: single chain fragment of variable region) を大腸菌内で発現させた抗体を用いることもできる。scFvの作製方法も周知であり、上記の通りに作製したハイブリドーマのmRNAを抽出し、一本鎖cDNAを調製し、免疫グロブリンＨ鎖及びＬ鎖に特異的なプライマーを用いてPCRを行なって免疫グロブリンＨ鎖遺伝子及びＬ鎖遺伝子を増幅し、これらをリンカーで連結し、適切な制限酵素部位を付与してプラスミドベクターに導入し、それで大腸菌を形質転換し、大腸菌からscFvを回収することによりscFvを作製することができる。このようなscFvも「抗原結合性断片」として本発明の範囲に包含される。
　本発明により、リン酸化の有無に影響されずに活性型EGFRへの特異性を発揮できる抗体及びその抗原結合性断片が提供されるため、該抗体又はその抗原結合性断片を用いた免疫測定により、試料中の活性型EGFRを従来よりも正確に測定することが可能になる。すなわち、本発明は、上記した本発明の抗体又はその抗原結合性断片と試料中の活性型EGFRとの間の抗原抗体反応を利用した免疫測定により、試料中の活性型EGFRを測定することを含む、活性型EGFRの測定方法も提供する。なお、本発明において、「測定」という語には、検出、定量、半定量が包含されるものとする。
　上記したように、本発明の抗体が有する活性型EGFRへの特異性は、活性型EGFRが変性を受けていない条件下で発揮される。従って、本発明の抗体又はその抗原結合性断片を用いて活性型EGFRの測定を実施する場合には、試料中のタンパク質を変性させない条件下で抗活性型EGFR抗体又はその抗原結合性断片と接触させる必要がある。
　免疫測定方法自体はこの分野において周知である。非変性の試料を本発明の抗体又はその抗原結合性断片と接触させるという上記条件を満足できる限り、周知のいずれの免疫測定方法でも採用することができる。すなわち、反応形式に基づき分類すると、サンドイッチ法、競合法、凝集法等があり、標識に基づき分類すると、酵素免疫分析、放射免疫分析、蛍光免疫分析等があるが、これらのいずれもが本発明で言う「免疫測定」に包含され、本発明の測定方法に採用することができる。特に限定されないが、具体例を挙げると、免疫沈降、ELISA、免疫染色等の手法を好ましく採用することができる。
　各免疫測定に必要な試薬類も周知であり、用いる抗体が本発明の抗体又はその抗原結合性断片であること以外は、通常の免疫測定用キットを用いて免疫測定を行なうことができる。すなわち、本発明は、上記した本発明の抗体又はその抗原結合性断片を含む、本発明の測定方法を実施するための測定キットも提供する。抗体又はその抗原結合性断片以外でキットに含まれる試薬類は、公知の通常の免疫測定用キットと同様で良い。
　試料については何ら限定されず、活性型EGFRを含有し得る試料であればいかなるものであってもよい。生体から分離した生体由来試料でもよいし、生体に由来しない試料（例えば実験室で遺伝子工学的手法により調製した活性型EGFR試料など）であってもよい。例えば、生体由来の試料としては、血液試料（全血、血漿、血清等）、細胞抽出液、組織試料等が挙げられるが、これらに限定されない。生体は、特に限定されないが、ヒト、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ハムスター等の哺乳動物である。
　当業者に周知の通り、EGFRの異常な活性化は発癌の原因となり、治療標的となっている。下記実施例にも具体的に示される通り、本発明の抗体を用いれば、各種の癌由来細胞株における活性型EGFRを検出することができる。肺癌等のある種の癌では健常者よりも多く活性型EFGRが存在することが知られており、そのようなEGFRが異常に活性化するタイプの癌に対しては、ゲフィチニブ等のようなEGFRを標的とする分子標的治療薬が有効である。癌か否かを検出すべき生体から分離した試料に対して本発明の活性型EGFR測定方法を実施すれば、該生体の癌を検出可能であり、とりわけEGFRを標的とする分子標的治療薬の投与対象となるかどうかを調べるのに有用である。従って、本発明の活性型EGFR測定方法は、癌の検出方法、とりわけEGFRを標的とする分子標的治療薬の投与対象となる癌の検出方法としても有用である。また、上記した活性型EGFR測定キットも、方法の場合と同様、癌の検出キット、特にEGFRを標的とする分子標的治療薬の投与対象となる癌の検出キットとしても有用である。
　対象となる生体が癌であるか否かが未確定である場合、該生体から分離した試料に対して本発明の測定方法を行ない、試料中の活性型EGFRを測定すれば、癌であるか否かを判断できる。健常生体由来の試料における活性型EGFR量と比較して測定値が有意に高ければ、該生体は癌を罹患している恐れが高い。このような生体が実際に癌と確定診断された場合、EGFRを標的とする分子標的治療薬が該生体の癌の治療に有効であり得るので、そのような分子標的治療薬の利用を積極的に取り入れることで癌を効果的に治療し得る。つまり、本発明の検出方法は、分子標的治療薬の利用を検討する目的で、既に癌であると診断された生体に対しても実施することができる。なお、EFGRの活性化が見られる癌としては、肺癌、大腸癌、乳癌等が知られているが、このような公知の例に限らず、EGFRの活性化が本発明の方法により実際に確認できた癌であればEGFRを標的とする分子標的治療薬は有効であり得るため、本発明の範囲は癌の種類で限定されるものではない。
　分子標的治療薬とは、医学治療の分野では一般的な語であり、通常、疾患に関与する遺伝子又は遺伝子産物を標的として特異的に作用する薬剤を指す。本発明では、「EGFRを標的とする分子標的治療薬」とは、EGFRを作用の標的とする薬剤を指し、非活性型のEGFRに結合して活性型への変化若しくは下流へのシグナル伝達を阻害するもの、又は活性型のEGFRに結合して下流へのシグナル伝達を阻害するものが包含される。そのようなEGFRを標的とする分子標的治療薬としては、ゲフィチニブ、エルロチニブ等が知られており、また各種の新規物質が開発中である。本発明の抗体又はその抗原結合性断片を用いれば、活性型EGFRを従来法よりも正確に測定できるので、EGFRが過剰に活性化しているタイプの癌患者を好ましく検出することができ、治療手段の選択に大いに貢献できる。
　癌の検出を行なう場合、検出精度を高める観点から、複数の健常者について活性型EGFR量を測定して健常基準値を定め、これと対象試料中の活性型EGFR量とを対比して有意差があるかどうかを調べることが好ましい。さらに、EGFRが過剰に活性化している複数の既知の癌患者についても活性型EGFR量を測定して癌基準値を定め、これとの有意差があるかどうかを調べることにより、さらに検出精度を高めることができるので、より好ましい。癌基準値は、疑陽性、陽性等の段階分けをして複数設けてもよい。このような基準値は、実施の都度定める必要はなく、予め決定された基準値を用いることができる。
　また、本発明の抗体又はその抗原結合性断片は、例えば癌の治療等に有用な新規化合物のスクリーニングに用いることもできる。本発明の抗体又はその抗原結合性断片は、癌の診断及び治療手段の選択に貢献できるほか、癌化メカニズムの解明や癌の新規治療法の開発にも貢献できる。
　以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
１．抗体作製
　常法により昆虫細胞にて発現させたEGFR細胞内ドメイン（配列番号２ではaa669-1210、配列番号３ではaa645-1186の領域）を、フロイントアジュバントと共にマウスに免疫し、常法のハイブリドーマ法によりEGFR細胞内ドメインに対する抗体を産生するハイブリドーマを作製した。免疫原に対する抗体の反応性をELISAにて分析し、免疫原と結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択し、抗体を回収した（抗体4-2、5-1、19-1、25-1、30-2）。以下の実験で示される通り、これらの抗体のうち、5-1及び19-1は全ての状態のEGFRに結合する（活性型EGFRへの特異性がない）抗体であり、4-2、25-1及び30-2は活性型EGFRに特異的に結合するものであった。
２．エピトープ解析
　下記表１に示すEGFR細胞内ドメインの各種フラグメントを常法により大腸菌でGST融合タンパク質として発現させ、これらをSDS-PAGEした後PVDF膜に転写した。確立した抗体によるウエスタンブロットを行ない、反応した全フラグメントのオーバーラップ領域を各抗体のエピトープとして決定した。確立した各抗体の各フラグメントとの反応性を表１に示す。確立した抗体4-2及び25-1はEGFRのキナーゼドメインC末端に隣接する部位（aa956-998）を、抗体30-2はaa1023-1115の領域を認識することが確認された。aa956-998の領域は、結晶構造解析により構造変化することが示されている領域（Cancer Research 2004; 64: 6652-6659）と一致する領域である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
３．活性化EGFR特異性の解析
　未処理及びEGF処理したA549の細胞抽出液に対して、確立した各抗体及び全ての状態のEGFRを認識する抗体5-1でEGFRを免疫沈降した。免疫沈降されたEGFRをSDS-PAGEし、PVDFに転写後、全ての状態のEGFRを認識する抗EGFR抗体19-1によるウエスタンブロットにて免疫沈降されたEGFRを検出した（図１(a)）。確立した抗体4-2、25-1、30-2はいずれも、EGF処理した細胞抽出液のみでEGFRが検出され、EGFリガンド刺激により活性化されたEGFRを特異的に免疫沈降することが確認された。
４．リン酸化非依存性の解析
　未処理及びEGF処理したA549の細胞抽出液をSDSサンプルバッファーで変性したものをSDS-PAGEし、PVDF膜に転写後、確立した抗体によるウエスタンブロットにて検出した（図１(b)）。図中の抗体α-pY1148とは、EGFRのリン酸化ドメインの一つpY1148の周辺配列をもとに合成したペプチドを免疫原として確立された抗体である。図１(b)に示される通り、リン酸化EGFR特異抗体α-pY1148（右端）とは異なり、確立した抗体4-2、25-1、30-2は、EGF刺激に関わらず、PVDF膜に転写された変性後のEGFRと反応した。
　EGFR特異的阻害剤ゲフィチニブ存在下で上記３と同様の免疫沈降実験を行なった（図２(b)）。リン酸化が阻害された条件下（ゲフィチニブ＋）においても、確立した抗体4-2、25-1、30-2は、EGFリガンド刺激により活性化されたEGFRを特異的に免疫沈降した。これにより、確立した抗体4-2、25-1、30-2が、EGFリガンド刺激により活性化された非変性のEGFRをリン酸化の有無にかかわらず認識できることが確認された。
５．活性化変異あるいは過剰発現により活性化されたEGFRに対する反応性の解析
　野生型EGFR、活性化変異EGFRを発現するあるいはEGFRを過剰発現する各種肺癌由来細胞株の細胞抽出液に対して、確立した抗体で免疫沈降した。免疫沈降されたEGFRをSDS-PAGEし、PVDF膜に転写後、全ての状態のEGFRを認識するEGFR抗体19-1によるウエスタンブロットにて検出した（図３）。確立した抗体4-2は、野生型EGFRを発現する細胞株（A549、H460）のEGFRに対してはEGF刺激依存的な反応性を示したが、変異EGFR発現細胞株（PC-9、HCC4006）及びEGFR過剰発現細胞株（HCC827）に対してはEGF未刺激の条件でもEGFRと反応した。これらの変異株及び過剰発現株は、EGFRの活性化を生じるヒト癌由来細胞株として知られているものであり、このような癌において発現するものを含めた各種態様の活性化EGFRに対しても確立した抗体が特異的に反応できることが示された。確立した抗体が特異的に反応した活性化変異EGFRはゲフィチニブ等の癌の分子標的治療薬の治療標的となっており、分子標的治療薬の治療対象癌を診断する等の癌の診断にも有用であることが示された。
６．細胞免疫染色系における活性化EGFRの検出
　未処理及びEGF処理したA549細胞をPFAで固定し、TritonX100含有緩衝液で細胞を透過処理した。全ての状態のEGFRを認識する抗EGFR抗体5-1を反応させた後、反応した抗体を抗マウスAlexaFluor488蛍光標識二次抗体（図４(a)）で検出した。あるいは、活性化EGFR特異抗体30-2及び抗EEA1ウサギ抗体で反応させた後、反応した抗体30-2をAlexaFluor488蛍光標識二次抗体で、反応したanti-EEA1ウサギ抗体をAlexaFluor555蛍光標識二次抗体で検出した（図４(b)）。その結果、抗体5-1はEGF未処理A549細胞の細胞膜局在EGFRと反応した。一方、抗体30-2は、EGF未処理A549細胞のEGFRとは反応しなかったが、EGF刺激したA549細胞の、EEA1と共に初期エンドソームに局在するEGFRと特異的に反応した。

Claims (11)

  1. 　非変性の活性型EGFRと特異的に結合する抗体又はその抗原結合性断片。
  2. 　リン酸化された活性型EGFRとリン酸化されていない活性型EGFRの両者に結合する請求項１記載の抗体又はその抗原結合性断片。
  3. 　非変性の非活性型EGFRとは実質的に結合しない請求項1又は２記載の抗体又はその抗原結合性断片。
  4. 　配列番号３に示すEGFRタンパク質のアミノ酸配列中のaa956-998内の領域又はaa1023-1115内の領域に結合する請求項１ないし３のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
  5. 　前記抗体がモノクローナル抗体である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
  6. 　非変性の試料と請求項１ないし５のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性断片とを接触させ、試料中の活性型EGFRと前記抗体又はその抗原結合性断片との間の抗原抗体反応を利用した免疫測定により前記試料中の活性型EGFRを測定することを含む、活性型EGFRの測定方法。
  7. 　請求項６記載の方法により、生体から分離した試料中の活性型EGFRを測定することを含む、癌の検出方法。
  8. 　EGFRを標的とする分子標的治療薬の投与対象となる癌を検出する方法である請求項７記載の方法。
  9. 　請求項１ないし５のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性断片を含む、活性型EGFRの測定キット。
  10. 　請求項１ないし５のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性断片を含む、癌の検出キット。
  11. 　EGFRを標的とする分子標的治療薬の投与対象となる癌を検出するキットである請求項１０記載の検出キット。
PCT/JP2011/050145 2010-01-13 2011-01-07 活性型egfr特異抗体 WO2011086973A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP11732843.5A EP2524964A4 (en) 2010-01-13 2011-01-07 FOR THE ACTIVATED EGFR SPECIFIC ANTIBODY
US13/521,942 US20120282633A1 (en) 2010-01-13 2011-01-07 Antibody specific to activated egfr

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010-005115 2010-01-13
JP2010005115A JP2011144124A (ja) 2010-01-13 2010-01-13 活性型ｅｇｆｒ特異抗体

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2011086973A1 true WO2011086973A1 (ja) 2011-07-21

Family

ID=44304246

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2011/050145 WO2011086973A1 (ja) 2010-01-13 2011-01-07 活性型egfr特異抗体

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20120282633A1 (ja)
EP (1) EP2524964A4 (ja)
JP (1) JP2011144124A (ja)
WO (1) WO2011086973A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2668861T3 (es) 2012-07-31 2018-05-22 Crown Bioscience, Inc. (Taicang) Marcadores histológicos para identificar pacientes con carcinoma de pulmón de células no pequeñas para el tratamiento con un fármaco anti EGFR

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AUPQ841800A0 (en) * 2000-06-28 2000-07-20 Biomolecular Research Institute Limited Truncated egf receptor
ATE446317T1 (de) * 2001-05-11 2009-11-15 Ludwig Inst For Cancer Res Ltd Spezifische bindungsproteine und ihre verwendung

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ISE, N. ET AL.: "Novel monoclonal antibodies recognizing the active conformation of epidermal growth factor receptor.", BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., vol. 394, no. 3, 9 April 2010 (2010-04-09), pages 685 - 690, XP055072596 *
ISE, N. ET AL.: "Novel Monoclonal Antibodies Recognizing the Active State and Conformation of Epidermal Growth Factor Receptor", PROCEEDINGS OF THE JAPANESE CANCER ASSOCIATION, vol. 68TH, 31 August 2009 (2009-08-31), pages 444, XP008164251 *
JOHNS, T.G. ET AL.: "The antitumor monoclonal antibody 806 recognizes a high-mannose form of the EGF receptor that reaches the cell surface when cells over-express the receptor.", FASEB J., vol. 19, no. 7, May 2005 (2005-05-01), pages 780 - 782, XP008071641 *
MAKOTO KAWAISHI ET AL.: "Kasseigata EGFR Hen'itai (L858R) Tokuiteki Kotai no Kaihatsu", PROCEEDINGS OF THE JAPANESE CANCER ASSOCIATION, vol. 65TH, 28 August 2006 (2006-08-28), pages 455, XP008164250 *
PANNEERSELVAM, K. ET AL.: "A conformation- specific anti-peptide antibody to the beta-type platelet-derived growth factor receptor also recognizes the activated epidermal growth factor receptor.", J. BIOL. CHEM., vol. 270, no. 14, 7 April 1995 (1995-04-07), pages 7975 - 7979, XP055072701 *
See also references of EP2524964A4 *
STAMOS, J. ET AL.: "Structure of the epidermal growth factor receptor kinase domain alone and in complex with a 4-anilinoquinazoline inhibitor.", J. BIOL. CHEM., vol. 277, no. 48, 29 November 2002 (2002-11-29), pages 46265 - 46272, XP002348235 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2524964A4 (en) 2013-07-03
JP2011144124A (ja) 2011-07-28
EP2524964A1 (en) 2012-11-21
US20120282633A1 (en) 2012-11-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6715770B2 (ja) モノクローナル抗ｔｋ１抗体
EP2189526B1 (en) Antibody binding specifically to tdp-43 aggregate
CN105793439B (zh) 以生物样品进行的针对igfbp7的具有改进的性能的测定
DK3054298T3 (en) METHOD OF DETECTING TUMOR IN THE ARC
TW201207396A (en) Novel antibody for the diagnosis and/or prognosis of cancer
DK2743697T3 (en) METHODS OF IN VITRO DIAGNOSTICS OF INVASIVE CARCINOMS
JPWO2004081047A1 (ja) モノクローナル抗体及びこれを産生するハイブリドーマ
KR20110090985A (ko) 인간 ｃｘｃｌ１ 단백질의 면역학적 측정 방법
US10809263B2 (en) Antigenic composition for detecting auto-antibody with specific response to exosomal protein EIF3A, and method for diagnosing liver cancer using antigenic composition
US20220412976A1 (en) Clinical management of oropharyngeal squamous cell carcinoma
JP6977105B2 (ja) Ｉｇｆ−１ｒ抗体および癌の診断のためのその使用
CN110914685A (zh) Rep蛋白作为蛋白质抗原用于诊断试验
WO2014192974A1 (ja) 抗ｌｇｒ６抗体を含む癌の検出用又は診断用試薬
JP6677655B2 (ja) 胆道癌の検出方法及び胆道癌検出用キット
WO2012028958A2 (ja) 大腸がんマーカーに対する抗体
WO2011086973A1 (ja) 活性型egfr特異抗体
US11174310B2 (en) Disulfide-type HMGB1-specific antibody, method for measuring disulfide-type HMGB1 and kit for said measurement, and measurement method capable of quantitating all of HMGB1 molecules including reduced HMGB1, disulfide-type HMGB1 and thrombin-cleavable HMGB1 and kit for said measurement
CN107709362B (zh) Igf-1r抗体及其用于癌症诊断的用途
TW201840588A (zh) 抗ｇｐｒ２０抗體
WO2022202826A1 (ja) 悪性膵嚢胞性腫瘍の判定補助方法及び判定補助用キット
JP6729917B2 (ja) ＥｐｈＡ２ Ｎ末端フラグメント抗体
US7160989B2 (en) Antibodies that recognize and bind phosphorylated human androgen receptor and methods of using same
Marzouq et al. Production of Recombinant Human EGFR CR2 Domain and Generation of Monoclonal Antibodies Discriminating The R and K Variants.
KR20220157443A (ko) Xix형 콜라겐 분석
JP5626681B2 (ja) 癌の検出方法

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13521942

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011732843

Country of ref document: EP