WO2011078393A1 - アブシジン酸輸送タンパク質を過剰発現する植物及びその作出方法 - Google Patents

アブシジン酸輸送タンパク質を過剰発現する植物及びその作出方法 Download PDF

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WO2011078393A1
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plant
protein
atabcg25
dna
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黒森崇
篠崎一雄
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独立行政法人理化学研究所
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N15/8262—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development

Definitions

  • the present invention relates to an environmental stress-tolerant transformed plant characterized by containing (excessively) expressing DNA encoding an exogenous abscisic acid (ABA) transport protein, and a method for producing the same.
  • ABA abscisic acid
  • Non-Patent Document 1 The plant hormone abscisic acid (ABA) plays an important role in various aspects of plant growth and development, such as embryo and seed maturation or post-emergence growth, and stress response to adapt to environmental changes.
  • Non-Patent Document 1 Many signal-related molecules related to ABA signal transduction have been found so far (Non-Patent Documents 1 to 3).
  • Non-Patent Documents 2 and 3 the existence of a plurality of transmission pathways is shown, and a large number of factors influence each other directly or indirectly in these pathways.
  • Non-patent Documents 4 and 8 Recently, a plurality of receptors that accept ABA have been reported from analysis of various phenomena.
  • Non-Patent Documents 9 to 14 the transport mechanism between ABA cells and the transport factor underlying ABA transport are completely unknown.
  • ATP-binding cassette (ABC) transporters are a highly conserved protein family with ATP-binding cassettes from prokaryotes to eukaryotes (Non-patent Document 15).
  • the half-size type gene cluster within the AtABCG subfamily of Arabidopsis ABC transporters (formerly also called the WBC subfamily) is the largest subfamily of Arabidopsis ABC transporters and consists of 28 genes (Non-patent document 16). So far, functions have been reported for three of these genes, and CER5 / WBC12 / AtABCG12 and COF1 / WBC11 / AtABCG11 are required for transport of cuticular wax (Non-patent Documents 17 to 22). Although WBC19 / AtABCG19 has been reported as a factor conferring antibiotic resistance (Non-Patent Document 23), the functions of genes belonging to other AtABCG subfamily are not known at all.
  • Patent Document 1 describes that a DNA encoding a chloroplast migrating protein that transports ABA to a chloroplast is expressed in a plant and imparts environmental stress resistance such as drought stress to the plant. However, although similar in purpose, this protein is different from the protein that allows ABA to be excreted across the cell membrane.
  • Plant Physiol 145: 1345-1360 Ukitsu H, et al. (2007) Cytologic and biochemical analysis of COF1, an Arabidopsis mutant of an ABC transporter gene.
  • An ABC transporter gene of Arabidopsis thaliana, AtWBC11, is involved indevelopmental development. Plant Cell Physiol 48: 1790-1802 Samuels L, Kunststoff L, Jetter R (2008) Sealing plant surfaces: cuticular wax formation cells.
  • abscisic acid is one of the most important plant hormones involved in responding to stress that is dangerous to plant life, seed maturation and senescence.
  • ABA is mainly produced in vascular tissue and induces hormonal responses in various cells such as guard cells.
  • This ABA response requires ABA excretion from ABA-producing cells and an intercellular ABA signaling pathway, but the mechanism of ABA transport through the plasma membrane remains unknown.
  • AtABCG25 is one of ABC (ATP binding cassette) transporter genes of Arabidopsis by screening ABA sensitive mutants. AtABCG25 is mainly expressed in vascular tissue.
  • AtABCG25 protein fused with a fluorescent protein was localized at the plasma membrane in plant cells. Using membrane vesicles extracted from insect cells expressing AtABCG25, it was shown that AtABCG25 protein transports ABA in an ATP-dependent manner. Plants that overexpress AtABCG25 have been shown to have higher leaf temperatures and affect stomatal regulation. These results strongly indicate that the AtABCG25 protein is an ABA transporter and is involved in the intercellular ABA signaling pathway. The existence of the ABA transport mechanism reveals the existence of active control of the ABA response to environmental stress between plant tissues and throughout the plant.
  • the AtABCG25 protein derived from Arabidopsis thaliana and other plant-derived homologues (including orthologues) having equivalent functions are collectively referred to as abscisic acid (ABA) transporter protein.
  • ABA abscisic acid
  • the findings found in Arabidopsis thaliana this time can be applied to any plant having an ABA transport mechanism as a universal phenomenon. Therefore, in summary, the present invention includes the following features. (1) A DNA that encodes an exogenous abscisic acid (ABA) transporter protein so as to be expressible, wherein the ABA transporter protein is a biological agent that excretes ABA through a cell membrane. An environmental stress-tolerant transformed plant that is an active protein.
  • DNA encoding the ABA transport protein is a polynucleotide (DNA) of any one of the following (a) to (d).
  • C DNA comprising a base sequence encoding an amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 20 or the homologous amino acid sequence and having an ABA transport activity
  • D) The amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 20 or the amino acid sequence of the homolog has 1 or more, preferably 1 or several amino acid substitutions, deletions or additions, and has ABA transport activity DNA
  • a transformed plant according to 1. The transformed plant according to any one of (1) to (3) above, wherein the environmental stress tolerance is drought stress tolerance. (5) The transformed plant according to any one of (1) to (4) above, wherein the plant is a dicotyledonous or monocotyledonous plant. (6) A progeny of environmental stress resistance of the transformed plant according to any one of (1) to (5) above. (7) The transformed plant according to any one of (1) to (5) or the progeny cell, tissue or seed according to (6) above. (8) A method for producing an environmental stress-tolerant transformed plant characterized in that a DNA comprising a base sequence encoding an exogenous abscisic acid (ABA) transport protein can be expressed, wherein the DNA is converted into plant cells.
  • ABA abscisic acid
  • a transporter involved in an ABA transport mechanism in a plant is clarified, and a plant overexpressing a DNA containing a base sequence encoding this transporter, that is, an ABA transport protein, is resistant to environmental stress such as drought stress.
  • environmental stress such as drought stress.
  • This figure shows the identification of the AtABCG25 gene and the atabcg25 mutant allele.
  • A shows isolation of ABA sensitive mutants by 96 well multititer plate assay. Mutants (atabcg25-1, atabcg25-2) are more sensitive to 1.0 ⁇ M ABA solution compared to wild type (Nos, Ler). This titer plate was incubated for 7 days in a growth room under long-day conditions.
  • (B) shows the AtABCG25 gene structure and the insertion mutation sites of the two atabcg25 alleles. Square boxes represent exons and black bars represent introns. Transposon insertions within atabcg 25-1 and atabcg 25-2 are indicated by triangles.
  • FIG. 1 shows AtABCG25 transcripts in wild type plants and mutants by RT-PCR analysis.
  • RNA was prepared from wild type (WT) and two atabcg25 mutants (atabcg25), namely Nossen (Nos), Landsberg (Ler), atabcg25-1 (-1) and atabcg25-2 (-2).
  • Actin2 ACT2 was used as a control for a gene that was constantly expressed.
  • D) to (F) show the ABA-sensitive phenotype of atabcg25-1.
  • FIG. 1 shows an AtABCG25 expression pattern in plant organs by RT-PCR analysis.
  • RNA was prepared from wild-type plant seedlings (Se), roots (R), leaves (L), stems (S), flowers (F) and fruits (Fr).
  • ACT2 was used as a control.
  • B) to (G) are 12-day-old plants (BD) and 5-week-old leaves (EG), ABA untreated (B, E), after water treatment (C, F) and The result of GUS staining after 10 ⁇ M ABA treatment (D, G) is shown.
  • the scale bar is 2 mm in (B) to (G). This figure shows the intracellular localization of AtABCG25 protein.
  • (A) and (B) show the results of transient expression in the onion epidermis.
  • a yellow fluorescent signal was observed in YFP-AtABCG25 fusion protein (A) and YFP alone (B).
  • C) and (D) show intracellular localization in transformed Arabidopsis plants.
  • a yellow fluorescent signal from the YFP-AtABCG25 fusion protein is observed in the root tip cells (C) as well as in the root tip cells (D) after 10 minutes protoplast separation with 20% (w / v) sucrose. It was.
  • An image obtained by superimposing the fluorescent image (left) and the bright field image (center) is shown on the right.
  • the scale bar indicates 50 ⁇ m. This figure shows the uptake of radioisotope labeled ABA by the AtABCG25 gene product.
  • A) shows AtABCG25 protein expression in Sf9 cells.
  • GA gibberellic acid
  • IAA indoleacetic acid
  • JA jasmonic acid
  • PAH p-aminohippuric acid salt
  • SA salicylic acid
  • TEA tetraethylammonium.
  • A shows RT-PCR analysis of AtABCG25 expression in AtABCG25 overexpressing plants.
  • RNA was prepared from control plants (Cont-1,2) and three 35S :: AtABCG25 transgenic lines (OE-04, OE-14 and OE-41).
  • ACT2 was used as a control.
  • B and (C) show the ABA sensitivity of post-emergence growth of AtABCG25 overexpressing plants.
  • Control (Cont-1 and Cont-2) seedlings and three transgenic lines expressing the 35S :: AtABCG25 transgene (OE-04, OE-14 and OE-41), Grows for 7 days in the presence of different concentrations of ABA (B). Values are mean ⁇ s. Of 50 seeds (obtained from 3 independent experiments).
  • d. Represents. A photograph of the seedlings germinated in the presence of 1.0 ⁇ M ABA was taken. 50 seeds of each were sown and grown on a plate for 15 days (C).
  • D is a thermographic image of an AtABCG25 overexpressing plant.
  • Control plants (Cont-1-1 and Cont-1-2) and AtABCG25 overexpressing plants (OE-04-1, OE-04-2, OE-14-1, OE-14-2, OE-41-1) And OE-41-2) 4 week-old plants were imaged using an infrared thermography apparatus (at this time, the atmospheric temperature was 22 ° C. ⁇ 2 ° C .; the relative humidity was 60 to 70%).
  • This figure shows the atabcg25-3 and atabcg25-4 mutant alleles and phenotypes.
  • (A) shows the insertion mutation sites of two more atabcg25 alleles.
  • T-DNA inserts in atabcg25-3 (SALK — 098823) and atabcg25-4 (SALK — 128331) are indicated by black triangles.
  • B shows AtABCG25 transcripts in wild type plants and atabcg25-3, atabcg25-4 mutants by RT-PCR analysis. RNA was prepared from wild type (Col) and seedlings of two types of atabcg25 mutants (atabcg25-3 and atabcg25-4). Actin 2 (ACT2) was used as a control.
  • C) and (D) show the ABA-sensitive phenotypes of atabcg25-3 and atabcg25-4.
  • C The number of individuals grown after germination on day 11 in different concentrations of ABA was counted (C). Values are mean ⁇ sd of 50 seeds (obtained from 3 independent experiments). d. Is shown as Pictures of wild-type and atabcg25 mutants germinated in the presence of 0.5 ⁇ M ABA were taken (D). 50 seeds of each were sown and grown on a plate for 16 days. This figure shows GUS staining of the enhancer-trap line atabcg25-2.
  • the atabcg25-2 (CSHL_ET7134) mutant has a Ds insertion element containing a GUS reporter gene for detecting expression under the control of the original promoter or enhancer of AtABCG25.
  • (A) 2 week old plants were used for GUS staining.
  • (B) an enlarged view of the roots of a 3-week-old plant dyed is shown.
  • (C) shows stained rosette leaves of a 3-week-old plant. The sections were longitudinally sectioned using a Technonov 7100 Paltic Embedding Kit (Kulzer). Here, Xy represents a wood part.
  • the scale bar is (A) 1 mm and (B, C) 50 ⁇ m. This figure shows the intracellular localization of AtABCG25 protein. Shows transient expression in the onion epidermis. The yellow fluorescent signal is from the YFP-AtABCG25 fusion protein.
  • FIG. 1 An image obtained by superimposing the fluorescence image (left) and the bright field image (center) is shown on the right.
  • the lower panel is an enlargement of the enclosed area.
  • the scale bar is 50 ⁇ m.
  • This figure shows the water transpiration rate of AtABCG25 overexpressing plants.
  • Three types of 35S :: AtABCG25 transgenic lines (OE-04, OE-14 and OE-41) and 6-7 week-old leaves of wild type plants (Col) were used.
  • the amount of water transpiration in the AtABCG25 overexpressing plants was measured as a percentage of the initial weight of fresh leaves. Values are the mean ⁇ s. Of 5 leaves (cut from 3 independent plants). d.
  • This figure shows the drought tolerance of AtABCG25 overexpressing plants.
  • (A) is a thermographic image of an AtABCG25 overexpressing plant before drying treatment.
  • Control plants Cont-1 and Cont-1
  • AtABCG25 overexpressing plants OE-04 OE-14
  • 6-week-old plants were imaged using an infrared thermography apparatus. Compared to control plants, AtABCG25 overexpressing plants have higher leaf temperatures.
  • (B) is a photograph of the plant body after the drying treatment.
  • a 6-week-old plant is a plant body after draining for 14 days and re-absorbing water 5 days later.
  • the figure shows AtABCG9 (WBC9), AtABCG21 (WBC23), AtABCG25 (WBC26), AtABCG26 (WBC27), AtABCG27 (TBC27), AtABCG27 (WBC27), AtABCG27 (WBC27) Shows the phylogenetic tree.
  • Amino acid sequence alignment was performed using genetic information processing software Genetyx (Geneticx Corporation) and the command Multiple Sequence Analysis (multiple sequence analysis).
  • Genetyx Geneticx Corporation
  • This figure shows an alignment of the amino acid sequences of AtABCG25 (Arabidopsis; upper) and Os11g07600 (rice; lower) proteins.
  • the boxes indicate common (or identical) amino acid residues between the two sequences.
  • This figure shows the stomatal opening measured by the SUMP (Suzuki's Universal Method of Printing) method for rosette leaves of 35S :: AtABCG25 transgenic plant line OE-41 and control plant (Col.) (each 4 weeks old) It is a graph which shows (micrometer). N indicates the number of samples. The result of the figure shows that the stomatal opening is smaller in mature leaves of AtABCG25 overexpressing plants than in control plants. This figure shows that, in the AtABCG25 overexpressing plant (OE), the opening and closing of the stomata changes depending on the CO 2 concentration and the light / dark conditions, similar to the wild type plant (WT).
  • SUMP Sudzuki's Universal Method of Printing
  • (A) shows stomatal conductivity (mol H 2 O / m 2 s) of rosette leaves of a 5-week-old plant counted by a portable photosynthesis measuring device (LI-6400 type; LI-COR Biosciences). The CO 2 concentration was adjusted every 30 minutes as shown.
  • (B) shows the stomatal conductivity counted during the light (day) 2 hours, the dark (night) 8 hours, and the light (day) 2 hours as shown. This figure is genetically proven data that AtABCG25 is associated with the abscisic acid (ABA) signaling pathway.
  • ABA abscisic acid
  • AtABCG25 overexpressing plant OE
  • WT wild type plant
  • nced3 deficient mutant plant nced3-2
  • AtABCG25 overexpressing plant ⁇ nced3 deficient mutant plant Nced3-2 / OE
  • pot arrangement A
  • plant C
  • expression of AtABCG25, NCED3 and ACT2 (control) genes by RT-PCR B
  • infrared camera The thermographic image (D) of the plant body by Neo Thermo TVS-700) is shown respectively.
  • NCED represents 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase.
  • NCED3 is a key gene for ABA synthesis (a gene for an enzyme that catalyzes the biosynthesis of xanthoxin from 9-cis-violaxanthin), and the NCED3 deletion mutant (nced3-2) has a problem in closing the pores. Temperature does not rise (FIG. 15D). In this crossover of the deletion mutant type (nced3-2) and the AtABCG25 overexpression type (OE) (nced3-2 / OE), the temperature of the leaves does not increase (FIG. 15D). Proven to be downstream.
  • the present invention provides an environmental stress-tolerant transformed plant characterized by including a DNA encoding an exogenous abscisic acid (ABA) transport protein, and a method for producing the same.
  • ABA abscisic acid
  • ABA is a plant hormone that has various aspects of plant growth and development, such as embryo and seed maturation or post-emergence growth, and stress response to adapt to environmental changes.
  • ABA abscisic acid
  • the present inventors have found that the ABCG subfamily genes among the ABC transporters in which many genes exist are protein factors that are directly involved in ABA transport in plants. Has been identified.
  • ABA transport mechanism refers to the mechanism by which ABA in plant cells is excreted out of the cell through the cell membrane by ABA transport proteins. Involved in the ABA signaling pathway. Therefore, the chloroplast migration protein described in JP2007-222129A (Japan) is not the ABA transport protein of the present invention.
  • abscisic acid (ABA) transport protein refers to a protein that has a function (or function) to excrete ABA through a cell membrane in a plant cell.
  • ABA transport protein when a DNA encoding an ABA transport protein is expressed (or overexpressed) in a plant, it is possible to impart resistance to environmental stress, preferably drought stress.
  • environmental stress include salt stress, low temperature stress, and osmotic stress.
  • the stress is controlled by the ABA response through the ABA transport mechanism in the plant body.
  • the ABA transport protein used in the present invention is any protein derived from any plant and having ABA transport activity.
  • ABA transport activity refers to a biological activity that excretes ABA produced in plant cells through the cell membrane. This activity is measured by the vesicle transport assay described in the examples below. Briefly, after a DNA encoding an ABA transport protein candidate is incorporated into a baculovirus expression vector, the vector is introduced into Sf9 insect cells and the cell membrane is separated.
  • the ABA transport protein candidate is expressed in this cell membrane, but this membrane also includes inverted membrane vesicles that are inverted inside and outside, and after incorporating the radioisotope-labeled ABA into the vesicle, Filter and wash using a filtration technique, measure the radioactivity adsorbed on the filter, and measure the excretion activity as the uptake.
  • the ABA transport protein include a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 derived from Arabidopsis thaliana, homologs derived from other plants (including “ortholog” in the present specification), and the protein. Alternatively, a mutant of the homolog and having an ABA transport activity is included.
  • Variants contain one or more amino acid substitutions, deletions or additions (or insertions) in the amino acid sequence of the original (ie, before the mutation), but still retain ABA transport activity. Should.
  • Such a mutant can be prepared by genetic engineering techniques such as site-directed mutagenesis and PCR-based mutation introduction. Genetic engineering techniques are described in, for example, Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular 94, and the like. It can be used for the production of mutants. In order to actually overexpress the ABA transport protein in plants, it is necessary to introduce the DNA encoding the protein, the homologue or the mutant in a form that can be expressed in plant cells.
  • Any method known as a plant cell transformation technique can be used to introduce DNA into cells.
  • Such methods include, for example, the Agrobacterium method, particle gun (gene gun) method, virus vector, floral dip method, leaf disk method, protoplast method, electroporation method and the like.
  • a DNA encoding an ABA transport protein is a base sequence encoding an amino acid sequence represented by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 derived from Arabidopsis thaliana or SEQ ID NO: 20 derived from rice
  • a DNA comprising a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence that is derived from another plant and is homologous from other plants and having ABA transport activity, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 20 or the amino acid sequence of the homologue 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, 97% or more, 99% or more
  • a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence having ABA transport activity NA has one or more, preferably one or several amino acid substitutions, deletions or additions in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 20 or the homologue amino
  • substitution is preferably a conservative amino acid substitution.
  • a conservative amino acid substitution means a substitution between amino acids having similar properties such as structural, electrical, polar or hydrophobic properties. Such properties can be classified by, for example, similarity of amino acid side chains. Amino acids having basic side chains are composed of lysine, arginine, histidine, amino acids having acidic side chains are composed of aspartic acid, glutamic acid, and amino acids having uncharged polar side chains are glycine, asparagine, glutamine, serine, Amino acids containing threonine, tyrosine, cysteine, etc.
  • hydrophobic side chains include alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, etc., and amino acids having branched side chains are composed of threonine, valine, isoleucine,
  • amino acid having an aromatic side chain is composed of tyrosine, tryptophan, phenylalanine, and histidine.
  • DNA containing the base sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (Arabidopsis thaliana) or SEQ ID NO: 20 (rice) is ABA transport shown in SEQ ID NO: 1 (Arabidopsis thaliana) or SEQ ID NO: 19 (rice) DNA containing a protein coding sequence.
  • GenBank GenBank
  • accession number accession no.
  • AY050810 cDNA
  • AAK92745 protein
  • the protein encoded by the DNA is a putative ABC transporter protein, but at that time, it was not known to have a function as an ABA transporter.
  • a DNA capable of hybridizing under stringent conditions with a sequence complementary to the base sequence of DNA containing the ABA transport protein coding sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 19, and encoded by the DNA The aforementioned DNA having a protein having an ABA transport activity can also be used in the present invention.
  • Such homologous DNA is, for example, about 40% or more, about 50% or more, about 60% or more, about 70% or more, about 80% or more, about 90% with the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 19.
  • DNA encoding an ABA transport protein homolog from Arabidopsis thaliana would be included in such DNA.
  • stringent conditions means, for example, hybridization at about 42 to 55 ° C. and 2 to 6 ⁇ SSC, followed by 50 to 65 ° C., 0.1 to 1 ⁇ SSC, 0.1 to 0 Include conditions consisting of one or more washes with 2% SDS, but such conditions vary with the GC content, ionic strength, temperature, etc. of the template nucleic acid and are not limited to the specific conditions described above Shall.
  • 1 ⁇ SSC consists of 0.15 M NaCl, 0.015 M Na citrate, pH 7.0.
  • stringent conditions are set to be about 5 ° C. lower than the melting temperature (Tm) of the specific sequence at the defined ionic strength and pH.
  • Tm refers to the temperature at which 50% of the probe complementary to the template sequence hybridizes to the template sequence in an equilibrium state.
  • DNA refers to genomic DNA, gene or cDNA.
  • identity refers to, for example, when two amino acid sequences or base sequences are aligned with or without introducing gaps so that they have the highest match rate, It means the ratio (%) of the number (or position) of the same amino acid or base to the total number of amino acids or bases (or the total number of positions; including gaps). Determination of% identity between sequences, homologous sequence search or homology search can be performed by using a known algorithm such as BLAST (BLASTN, BLASTP, BLASTX, etc.), FASTA, etc. (Altschul, SF, W Gish, W Miller, EW Myers, and DJ Lipman.Basic local alignment search tool.J Mol Biol 215 (3): 403-10, 1990).
  • BLAST BLASTN, BLASTP, BLASTX, etc.
  • FASTA Altschul, SF, W Gish, W Miller, EW Myers, and DJ Lipman.Basic local alignment search tool.J Mol Biol 215 (3): 403-10, 1990).
  • the term “several” is used for amino acids or nucleotides and generally refers to an integer in the range of 2-10, preferably an integer in the range of 2-5.
  • the term “plurality” used for amino acids or nucleotides in this specification refers to an integer of 2 or more, for example, an integer of 2 to 70, an integer of 2 to 60, an integer of 2 to 50, 2 to 40 An integer of 2 to 30, an integer of 2 to 20, an integer of 2 to 10, and the like.
  • “Homolog” that can be used in the present invention includes all ABA transport polypeptides having ABA transport activity derived from plants other than Arabidopsis thaliana.
  • homologs disclose plant genomes, for example, NCBI (US), EBI (Europe), KAOS (Kazusa DNA Research Institute, Japan), IRGSP (International Rice Genome Sequence Analysis Project, Japan), GrainGenes (US) , PGDIC (USA), ForestGEN (Forestry Research Institute, Japan), RAP-DB (Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries, Japan), Rice Genome Annotation Project Database (NSF, USA), etc. it can.
  • the homologue is a natural polypeptide having ABA transport activity of a plant, and may be derived from any plant (having an ABA transport mechanism) such as a dicotyledonous plant or a monocotyledonous plant.
  • homologs of rice include gene number Os11g0177400, registration number NM_001072418 (partial cDNA) and NP_001065886 (the registration number of RAP-DB of the Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries of Japan), or gene number Os11g07600 (RiceG of US NSF) Annotation Project registration number), and the homologue of Lotus japonicus is gene number LjSGA — 1111595.1 and registration number BABK01078073 (genome shotgun sequence) (DNA Research (2006) 13, 205).
  • ABA transport protein AtABCG25 (SEQ ID NO: 2) from Arabidopsis thaliana and ABA transport protein Os11g07600 (SEQ ID NO: 20) from rice are also very close to the phylogenetic tree (FIG. 11) and alignment (FIG. 12) of ABCG (WBC) family members. It turns out that there is a relationship. Furthermore, ABA transport proteins have a common functional domain, that is, an ATP binding site, a membrane region, and the like.
  • the ATP binding site is located at amino acid 71 (proline) to 290 (glycine), and the membrane region is amino acid 408 (leucine) to 594 ( Tyrosine).
  • the DNA of interest is selected from a cDNA library or a genomic DNA library of plant tissues (eg, leaves, stems, roots, petals, pollen, seeds, callus, etc.) and suitable vectors (eg, Phage, plasmid, etc.). DNA and vectors can be produced, for example, by genetic recombination techniques.
  • the genetic recombination technique is described in, for example, Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Sci. it can. Further, in relation to the above, from the cDNA library or genomic DNA library, for example, a DNA containing the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 19, a partial sequence thereof, or a complementary sequence thereof (labeled) ) Homolog DNA can be obtained by using as a probe or primer.
  • the plant to be transformed is not particularly limited.
  • Brassicaceae Arabidopsis thaliana, Brassica rapa, Brassica napus, Cabbage (Brasica oleracea var. Capitata), Rapeseed (Brassica rapa, Brasica Pekinensis), Chingensai (Brassica rapa var. Chinensis), Turnip (Brassica rapa var. Rapa), Nozawana (Brassica rapa var.
  • Hakabura Mizuna (Brassica rapain). Tuna (Brassica rapa var. Peruviridis), Pakchoi (Brassica rapa var. Chinensis), Japanese radish (Brassica Raphanus sativus), Wasabi (Wasabia japonica) and the like.
  • Solanum Nicotiana tabacum, eggplant (Solanum melongena), potato (Solanum tuberosum), tomato (Lycopersicon lycopersicum), capsicum (Capsicum annuum), petunia (Petuna, etc.).
  • Legumes soybean (Glycine max), peas (Pisum sativum), broad bean (Vicia faba), wisteria floribunda, peanut (Arachis. (Vigna angularis), Acacia and the like.
  • Asteraceae Chrysanthemum morifolium, sunflower (Helianthus annuus) and the like.
  • Palms oil palm (Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), coconut (Cocos lucifera), date palm (Phoenix dactylifera), wax coconut (Copernicia) and the like.
  • Urushiceae Rhizos succedanea, Cashew nutocidentale, Toxicendron vernicifluum, Mangofera indica, Pistachia and others.
  • Cucurbitaceae pumpkin (Cucurbita maxima, Cucurbita moschata, Cucurbita pepo), cucumber (Cucumis sativus), crow cucumber (Trichosanthes cucumeroides), gourd (Lagenararia. Rosaceae: Almond (Amygdalus communis), Rose (Rosa), Strawberry (Fragaria), Sakura (Prunus), Apple (Malus pumila var. Domestica) and the like.
  • Nadesico Carnation (Dianthus caryophyllus) and the like.
  • Willow Poplar (Populus trichocarpa, Populus nigra, Populus tremula) and the like.
  • Myrtaceae Eucalyptus camaldulensis, Eucalyptus grandis, etc.
  • Gramineae corn (Zea mays), rice (Oryza sativa), barley (Hordeum vulgare), wheat (Triticumanesrumum), sugarcane (Pacylumenumum) ), Miscanthus virgatum, Sorghum, Panicum and the like.
  • Lily family Tulipa, Lilium, etc.
  • a known sequence for example, SEQ ID NO :
  • a cDNA library derived from a plant tissue (preferably a tissue containing a vascular bundle or a vein) (which can be prepared by a known technique using phage).
  • the DNA encoding the ABA transport protein can be amplified by PCR (polymerase chain reaction) using a primer prepared based on 1 or SEQ ID NO: 19).
  • the DNA is purified by, for example, agarose gel or polyacrylamide gel electrophoresis, and then inserted into a suitable expression vector in a form that allows overexpression.
  • vectors are binary vectors or other vectors.
  • the binary vector includes two approximately 25 bp border sequences of right border (RB) and left border (LB) of Agrobacterium T-DNA, and foreign DNA is inserted between the border sequences.
  • Examples of the binary vector include pBI systems (for example, pBI101, pBI101.2, pBI101.3, pBI121, pBI221 (hereinafter Clontech)), pGA482, pGAH, pBIG, and the like.
  • vectors include, for example, the intermediate plasmids pLGV23Neo, pNCAT, pMON200, etc., or pH35GS (Kubo et al., 2005, Genes & Dev. 19: 1855-1860) containing the GATEWAY cassette.
  • a promoter is linked to the 5 ′ end of the foreign DNA. Examples of promoters include cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter, nopaline synthase gene promoter, maize ubiquitin promoter, octopine synthase gene promoter, rice actin promoter and the like.
  • a terminator for example, nopaline synthase gene terminator is inserted into the 3 ′ end of the foreign DNA.
  • a selection marker necessary for selecting transformed cells is inserted into the vector.
  • selectable markers are drug resistance genes such as kanamycin resistance gene (NPTII), hygromycin resistance gene (http), bialaphos resistance gene (bar), and the like.
  • transformation methods for introducing a vector constructed as described above into plants include Agrobacterium, particle gun (gene gun), electroporation, viral vectors, floral dip method, leaf disk method and the like.
  • plant transformation technology and tissue culture technology for example, Isao Shimamoto, supervised by Kiyotaka Okada, plant cell engineering series 15, model plant experiment protocol, from genetic techniques to genome analysis, described in Shujunsha (2001) Has been.
  • a plant cell, callus or plant tissue fragment is prepared, and Agrobacterium is infected to the plant cell to introduce DNA encoding the protein of the present invention into the plant cell.
  • Agrobacterium is infected to the plant cell to introduce DNA encoding the protein of the present invention into the plant cell.
  • a phenolic compound acetosyringone
  • the cells can be transformed efficiently.
  • Agrobacterium Agrobacterium tumefaciens strains (for example, C58, LBA4404, EHA101, EHA105, C58C1RifR, etc.) can be used.
  • the transformation medium is a solid medium, for example, a plant culture medium such as MS medium, B5 medium, DKN medium, Linsmeier & Skog medium, etc., and 1 to 5% maltose, sucrose, glucose, sorbitol. And a polysaccharide solidifying agent such as agar, agarose, gellite, gellan gum and the like can be added. Auxins, cytokinins, antibiotics (for example, kanamycin, hygromycin, carbenicillin, etc.), acetosyringone, etc. can be added to the medium.
  • the pH of the medium can be appropriately selected and is, for example, pH 5-7.
  • a substance that induces transcriptional activation such as a steroid hormone
  • a substance that induces transcriptional activation such as a steroid hormone
  • plant callus or tissue eg, leaf pieces, roots, stem pieces, growth points, etc.
  • co-cultivate a plant cell mass, and can be induced from a plant tissue piece or a mature seed using a callus induction medium.
  • the transformed callus or tissue piece is selected based on a selection marker, and then the callus can be redifferentiated into a young plant body in a regeneration medium.
  • callus can be induced from plant pieces and re-differentiated into seedlings, or protoplasts can be prepared from plant pieces and re-differentiated into seedlings through callus culture.
  • the seedlings thus obtained are transferred to soil after rooting and regenerated into plants.
  • an Agrobacterium solution is prepared, Soak the flower buds of the plant host to be transformed grown until the immature flower buds develop in the liquid for a short time, cover and keep the humidity overnight. Uncover the next day, grow the plants as they are, and harvest the seeds.
  • Transformed individuals can be selected by sowing the harvested seeds on a solid medium supplemented with an appropriate selectable marker such as antibiotics.
  • the next-generation seed of a transformed plant (also referred to as “transgenic plant”) can be obtained by transferring the individual thus selected to the soil and growing it.
  • a progeny having a novel trait similar to that of the transformed plant can be produced by crossing the transformed plant with the wild type or by self-pollination.
  • the transformed plant or its progeny produced by the above method is characterized in that it contains DNA encoding an ABA transport protein so that it can be overexpressed and is resistant to environmental stress such as drought stress.
  • the term “expressively” means that the DNA can be expressed at a higher level compared to a control plant that does not contain DNA encoding an exogenous ABA transport protein. .
  • Expression may be any of constitutive expression, inducible expression and autonomous expression. It is preferred that the DNA of interest is constantly and forcibly expressed under environmental stress conditions.
  • the present invention also provides, in a second aspect, not only such transformed plants or their progeny, but also their cells or tissues or seeds.
  • a method for producing an environmental stress-tolerant transformed plant characterized in that a DNA encoding an exogenous ABA transport protein can be expressed.
  • the present invention provides a method comprising introducing into a callus such that it can be expressed and regenerating the plant from the plant cell or callus.
  • the ABA transport protein is a protein having a biological activity for discharging ABA through the cell membrane to the outside of the cell.
  • the technique for transformation by this method is as described above.
  • the present invention further includes, in the fourth aspect, introducing into a plant or cells thereof such that DNA encoding an exogenous ABA transport protein can be expressed, thereby imparting environmental stress tolerance to the plant.
  • a method for imparting environmental stress tolerance to a plant is provided.
  • the ABA transport protein is a protein having a biological activity for discharging ABA through the cell membrane to the outside of the cell.
  • the technique for transformation by this method is as described above.
  • the environmental stress include drought stress, salt stress, low temperature stress, and osmotic stress. This is because ABA is known to act when plants are subjected to such environmental stresses.
  • plants with drought stress tolerance can be provided by the present invention, it would be possible to plant such plants in dry zones such as desertified land.
  • the invention is further described in the following examples, which are merely illustrative and are not intended to limit the scope of the invention.
  • Plant material and growth conditions Plants were grown in MS medium or soil containing 1% (w / v) sucrose and 0.8% (w / v) agar in a cycle of 22 ° C., 16 hours light / 8 hours dark.
  • the atabcg25-1 (15-0195-1) mutant was isolated from the Nossen ecotype Ds transposon tagline (Kuromori T, et al. (2004) Plant J 37: 897-905).
  • the atabcg25-2 (CSHL_ET7134) allele is a Landsberg ecotype Ds transposon tagline, obtained from Cold Spring Harbor Laboratory (Sundaresan V, et al. (1995) Genes Dev 9: 1797-1810).
  • the genomic DNA of Arabidopsis plants was prepared using the automated DNA isolation system PI-50alpha (Kurabo). Further, genotyping by PCR was performed using ExTaq polymerase (Takara Bio). The following primers were used to determine the genotype of atabcg25-1: 15-0195_5 ′ (5′-TGTAATGGGTATAGCGCATAAA-3 ′ (SEQ ID NO: 3)), 15-0195 — 3 ′ (5′-ATCTTTGGTTATTGAAACATCATGC-3 ′ (SEQ ID NO: 4)), and Ds5-3 (5′-TACCTCGGGTTCGAAATCGAT-3 ′ (SEQ ID NO: 5)).
  • the presence of the wild type allele is detected by PCR using gene-specific primers (15-0195_5 ′ and 15-0195_3 ⁇ , or ET7134_3 ′ and ET7134_5 ′) to the sequence adjacent to the insertion site, and Mutant alleles were detected by a combination of Ds border zone primer and one of the gene specific primers (Ds5-3 and 15-0195_5 ′ or Ds5-3 and ET7134_5 ′).
  • Ds border zone primer one of the gene specific primers
  • Ds5-3 and 15-0195_5 ′ or Ds5-3 and ET7134_5 ′ 50 sterilized seeds were sown on 0.5xMS media plates containing 1% sucrose and various concentrations of ABA.
  • RT-PCR uses the following primers: AtABCG25_RT-PCR_5 ′ (5′-TTTGGTTCTTGATGAGCCTCACT-3 ′ (SEQ ID NO: 8)) and AtABCG25_RT-PCR_3 ′ (5′-AAGTACTCCCCAAAAGATGGAT-3 ′ (SEQ ID NO: 9)) It was performed using PrimeScript One Step RT-PCR kit (Takara Bio).
  • Actin2 transcript As the Actin2 transcript as a control, the following primers: Actin2RT-F (5′-GACCTGCCCTCATACTACTCG-3 ′ (SEQ ID NO: 10)) and Actin2RT-R (5′-TTCCTCCAATCTCATCTTTCT TCC-3 ′ (SEQ ID NO: 11)) were used.
  • GUS staining was performed according to a standard protocol (Sundarsan V, et al. (1995) Genes Dev 9: 1797-1810). Observation of GUS-stained plants was performed under an SZ61 stereo microscope (Olympus), and a digital image was taken using a DS-L1 CCD digital camera (Nikon). Finer images were photographed using a BX60 upright microscope (Olympus) and a VB-7010 CCD camera (Keyence).
  • the 2 kb AtABCG25 promoter region was replaced with the following promoters: 3 ′ (SEQ ID NO: 13)) and KOD plus polymerase (Toyobo), cloned into pENTR / D / TOPO vector (Invitrogen), and GUS fusion vector pBGGUS (Kubo M, et al. (2005) Genes Dev 19: 1855-186 ) Incorporated in was made in.
  • the leaves of a 5-week-old pAtABCG25 :: GUS transgenic plant were soaked in 10 ⁇ M ABA for 24 hours.
  • AtABCG25 (At1g71960) gene was obtained from RIKEN BioResource Center.
  • the 2006 bp AtABCG25 cDNA was amplified using KOD plus polymerase and the following primers: AtABCG25_Forward (5′-CACCCATGTCAGCTTTTGACGGC-3 ′ (SEQ ID NO: 14)) and AtABCG25_Reverse (5′-CCTCTCCCCTCTTTTTTAAT) (5′-CCTCTCCCCTCTTTTTATTAT) And cloned into the pENTR / D-TOPO vector.
  • the onion epidermis was stripped and examined for yellow fluorescence under an LSM 510 META confocal laser scanning microscope (Carl Zeiss).
  • the inventors further introduced a YFP fusion protein construction vector consisting of pH35YG into Arabidopsis using an Agrobacterium-mediated transformation system. Thereafter, the roots of the transgenic plants were treated with 0.5 M mannitol for 20 minutes to perform protoplast separation of the cells.
  • Preparation and immunoblotting of membrane vesicles from Sf9 insect cells expressing AtABCG25 BaculoGold TM Recombinant baculovirus was prepared using Baculovirus Expression Vector System (BD PharMingen).
  • Sf9 insect cells (Spodoptera frugiperda) were infected with the virus, and cultured in a shake-type incubator at 27 ° C. for 72 hours in SF900-SFM medium (Invitrogen). Cells were collected by centrifugation at 1,100 ⁇ g for 10 minutes, 150 mM NaCl, 3 mM CaCl 2 , 2 mM MgCl 2 , 0.1 mM EGTA and 10 mM Tris-HCl (pH 7.4). Unbroken cells, nuclear debris and mitochondria were pelleted by centrifugation at 2,600 ⁇ g for 10 minutes.
  • This synthetic peptide consists of three types of 12 to 14 amino acid residues of the Arabidopsis AtABCG25 protein, ie, those designed from positions 69 to 82 (QKPSDETRSTERT), positions 132 to 143 (GKITKQTLKRTG), and positions 328 to 340 (GVTEREKPNVRRQT) Made up of.
  • Membrane proteins were solubilized using 4% SDS and subjected to 10% SDS-PAGE. The protein was transferred to a polyvinylidene difluoride membrane and probed with rabbit anti-AtABCG25 antibody and horseradish peroxidase-conjugated donkey anti-rabbit IgG.
  • ⁇ g of membrane protein 4 mM adenosine triphosphate (ATP) and 1 ⁇ M ABA, in which 22 nM DL-cis, trans- [G- 3 H] 100 ⁇ L of transport medium (70 mM KCl, 7.5 mM MgCl) containing abscisic acid (GE Healthcare) 2 , 50 mM MOPS-Tris, pH 7.0) was incubated at 27 ° C. The transport medium was filtered through a 0.45 ⁇ m nitrocellulose filter (Millipore) and ice-cooled stop buffer (70 mM KCl, 7.5 mM MgCl). 2 , 50 mM MOPS-Tris, pH 7.0).
  • the 35S :: AtABCG25 plasmid was introduced into Agrobacterium GV3101 by electroporation, and a transgenic plant was produced by the floral dipping method.
  • T2 plants overexpressing lines were selected by examining with RT-PCR.
  • T3 seeds were used for the next experiment.
  • Thermographic images were obtained using a Neo Thermo TVS-700 infrared camera (Nippon Avionics). Thereafter, the images were analyzed by PE Professional software (Nippon Avionics). Plants were grown in soil under conditions of sufficient water supply (22 ° C., 60-70% relative humidity, 16 hours photoperiod).
  • the inventors have created approximately 12,000 transposon tagged lines of Arabidopsis using the Activator (Ac) / Dissociation (Ds) system and determined the sequence adjacent to the Ds element in all lines ( Kuromori T, et al. (2004) Plant J 37: 897-905).
  • the present inventors selected a homoinsertion line in which a Ds transposon was inserted into the gene coding region in order to perform a systematic phenotypic analysis (phenome analysis) (Kuromori T, et al. (2006) Plant J 47: 640-651).
  • Fig. 1A The genomic sequence of the Ds insertion part, this isolated strain (15-0195-1) had a Ds element inserted in the second intron of the gene coding region (ORF) of the At1g71960 gene (FIG. 1B). .
  • the At1g71960 gene encodes AtABCG25 (also reported as AtWBC26) and is a member of the ABCG subfamily of ABC (ATP binding cassette) transporters in the Arabidopsis genome (Verrier PJ, et al. (2008) Trends Sci13).
  • the first mutant obtained was designated atabcg25-1.
  • Mutant CSHL_ET7134, called atabcg25-2 had a Ds insert in the third exon of AtABCG25 and showed the same phenotype as atabcg25-1 in the multititer plate assay (FIG. 1A).
  • Two more alleles from the T-DNA insertion line also showed an ABA-sensitive phenotype (FIG. 6), indicating that mutations in AtABCG25 are responsible for the ABA-sensitive phenotype.
  • AtABCG25 gene expression pattern in plant organs For the purpose of examining the gene expression pattern of AtABCG25, RT-PCR was performed to determine the expression pattern in the wild type tissue. RNA was extracted from wild-type seedlings, roots, stems, leaves, flowers and fruits. AtABCG25 transcripts could be amplified from all the above tissues (FIG. 2A).
  • pAtABCG25 GUS transgenic plant was produced, and the GUS activity of the transformant was detected mainly in the hypocotyl, root, and leaf veins (FIGS. 2B-2G).
  • pAtABCG25 GUS transgenic plants were treated with ABA solution and stained with GUS. The expression level of the GUS reporter in the transformant was increased by ABA treatment (FIGS. 2B-2G).
  • the atabcg25-2 mutant containing the GUS reporter gene in the Ds element was stained as an enhancer-trap system (Sundarsan V, et al. (1995) Genes Dev 9: 1797-1810).
  • the GUS signal of atabcg25-2 was observed in vascular tissue (FIG. 7A) and detected along the vascular bundle at the center of the root (FIG. 7B). When cut so that the cross section of the stained leaf was visible, the signal was accumulated in a region close to the vein (FIG. 7C).
  • Intracellular localization of AtABCG25 protein In order to examine the intracellular localization of AtABCG25 protein, the present inventors constructed a fusion vector of AtABCG25 protein and yellow fluorescent protein (YFP) produced under the control of cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter.
  • the gene coding region (ORF) of AtABCG25 was placed downstream of 35S :: YFP.
  • the 35S :: YFP-AtABCG25 recombinant gene was transiently expressed in onion epidermal cells by the particle gun method. Intracellular localization of the fusion protein was visualized by confocal imaging of the yellow fluorescent signal in the onion cells.
  • the yellow fluorescence of the YFP-AtABCG25 recombinant protein was present around the cell surface in the onion epidermis cells (FIGS. 3A and 8), but the YFP-only signal as an experimental control spread throughout the cell. (FIG. 3B).
  • the 35S :: YFP-AtABCG25 recombinant vector was transformed into an Arabidopsis wild type plant. Similar to the results of the transient expression experiment, a signal was observed on the cell surface at the root tip of the transgenic plant expressing YFP-AtABCG25 (FIG. 3C). Root tip cells are characterized by not containing large vacuoles (Shi H, et al.
  • Vesicle membranes were made from Sf9 insect cells (Spodoptera frugiperda) transfected with a viral vector incorporating AtABCG25 cDNA. Expression of AtABCG25 protein was confirmed by Western blotting using AtABCG25 antibody (FIG. 4A). We found that the incorporation of radioisotope-labeled ABA was significantly promoted upon addition of ATP (FIG. 4B). ATP-dependent uptake of ABA showed a saturation kinetics of Km value 230 nM and Vmax value 6.2 pmol / min / mg protein (FIG. 4D).
  • AtABCG25 protein conducts ABA transport and that it acts on (+) ABA rather than ( ⁇ ) ABA.
  • Overexpression of AtABCG25 and its effect on ABA responsiveness If AtABCG25 is an excretion factor for ABA transport, overexpression of AtABCG25 should affect ABA signaling.
  • T3 seeds obtained from the obtained transgenic lines were used to test for ABA inhibition of post-emergence growth. The rate of ABA inhibition of post-emergence growth is significantly reduced in three independent transgenic lines expressing the AtABCG25 transgene (FIGS.
  • AtABCG25 functions as an ABA efflux factor Support.
  • ABA acts directly on guard cells to induce stomatal closure (Schroeder JI, et al. (2001) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol Biol 52: 627-658). Therefore, the present inventors further examined phenotypes related to stomatal regulation of AtABCG25 overexpressing plants (aerial phenotypes). As a result, the present inventors have found that the temperature of the leaves of the transgenic plant is higher than that of the wild type plant (FIG. 5D), which indicates that water transpiration from the leaves is suppressed in the AtABCG25 overexpressing plant. It suggests that.
  • AtABCG25 is an ABA exporter. In AtABCG25 over-expressing cells, ABA may accumulate in the intercellular area around the guard cells.
  • AtABCG25 is an ABA transporter
  • AtABCG25 is a vascular tissue in which ABA is mainly biosynthesized in plants (Cheng WH, et al. (2002) Plant Cell 14: 2723-2743; Koiwai N, et al. (2004) Plant Physiol 134: 1697-1707; Endo A, et al. (2008) Plant Physiol 147: 1984-1993). I found. Furthermore, it has been found that the AtABCG25 protein fused with a fluorescent protein is localized in the plasma membrane in plant cells. Biochemical analysis showed that AtABCG25 has the ability to transport ABA molecules.
  • AtABCG25 shows insensitivity to exogenous ABA at the stage of seedlings.
  • plants overexpressing AtABCG25 showed high leaf temperature and delayed water transpiration from the cut leaves, suggesting that this factor affects stomatal regulation.
  • AtABCG25 is considered to be one of the functional factors of the ABA transport mechanism, and is probably a factor that promotes transport of ABA out of plant cells through the cell membrane. Yes. This finding will reveal the existence of an ABA transport mechanism in plant cells and provide new insights into the intercellular regulation of ABA transport in the ABA regulatory network.
  • no phenotype in aerial organs such as guard cells was found in the atabcg25 knockout mutant.
  • AtABCG25 is another factor supporting the function of AtABCG25.
  • the action of AtABCG25 in combination with other half-molecule ABC transporters is particularly interesting because it is known that the half-size ABC transporter acts as a dimer complex.
  • AtABCG25 is one of the functional transporters of ABA in Arabidopsis.
  • ABA is an important plant hormone and is thought to affect distant cells (Cheng WH, et al.
  • FIG. 13 shows pore opening measured by the SUMP (Suzuki's Universal Method of Printing) method for rosette leaves of 35S :: AtABCG25 transgenic plant line OE-41 and control plant (Col.) (each 4 weeks old). ( ⁇ m).
  • SUMP Sudzuki's Universal Method of Printing
  • FIG. 14 shows that in the AtABCG25 overexpressing plant (OE), the opening and closing of the stomatal area is similar to that of the wild type plant (WT) 2 It shows that it varies depending on the density and light / dark conditions.
  • WT wild type plant
  • AtABCG25 is associated with the abscisic acid (ABA) signaling pathway.
  • ABA abscisic acid
  • environmental stress tolerance can be imparted to plants by overexpressing a DNA containing a base sequence encoding an exogenous ABA transport protein in plants mainly in Arabidopsis plants. With other plant species including rice, a transformed plant having the same effect can be easily produced by the methods described in the specification and examples.
  • the present invention can be used particularly in industrial fields such as agriculture, forestry, and paper industry in order to provide environmental stress resistant plants.

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Abstract

この発明は、外因性のアブシジン酸(ABA)輸送タンパク質をコードするDNAを発現可能に含むことを特徴とする環境ストレス耐性の形質転換植物又は後代、その植物由来の細胞、組織又は種子、或いは、該植物の作出方法に関する。

Description

アブシジン酸輸送タンパク質を過剰発現する植物及びその作出方法
　本発明は、外因性のアブシジン酸（ＡＢＡ）輸送タンパク質をコードするＤＮＡを（過剰）発現可能に含むことを特徴とする環境ストレス耐性の形質転換植物、及びその作出方法に関する。
　植物ホルモンであるアブシジン酸（ＡＢＡ）は、胚及び種子の成熟又は発芽後成長などの植物成長や発達、並びに、環境の変化に適応するためのストレス応答、の種々の面で重要な役割を果している（非特許文献１）。これまでにＡＢＡシグナル伝達に関係する多くのシグナル関連分子が見出されている（非特許文献１~３）。ＡＢＡシグナル伝達機構では、複数の伝達経路の存在が示されており、これらの経路で多数の因子が直接的若しくは間接的に互いに影響しあっている（非特許文献２，３）。特に最近、様々な現象の解析からＡＢＡを受容する複数のレセプターが報告された（非特許文献４~８）。包括的なＡＢＡ調節機構の理解のためには、ＡＢＡレセプターによって誘発される細胞内シグナル伝達に加えて、細胞間におけるＡＢＡ機能についても統合的に調べられる必要がある。実際に、細胞間におけるＡＢＡ機能が植物体内に存在することは予想されており、例えば、ＡＢＡは主として維管束組織で産生されるが、その組織から離れた孔辺細胞に作用して気孔開閉が制御されていることが分かっている（非特許文献９~１４）。しかしながら、ＡＢＡの細胞間における輸送機構や、ＡＢＡ輸送の基になる輸送因子が何であるかについては全く不明である。
　ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ；ＡＴＰ−Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｃａｓｓｅｔｔｅ）トランスポーターは、原核生物から真核生物に至るまで、ＡＴＰ結合カセットをもつ高度に保存されたタンパク質ファミリーである（非特許文献１５）。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ＡＢＣトランスポーターのＡｔＡＢＣＧサブファミリー（従来、ＷＢＣサブファミリーとも呼称される）内のハーフサイズのタイプの遺伝子クラスターは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ＡＢＣトランスポーターの中で最も大きいサブファミリーであり、２８個の遺伝子からなる（非特許文献１６）。これまで、この中の３遺伝子については機能が報告されており、ＣＥＲ５／ＷＢＣ１２／ＡｔＡＢＣＧ１２とＣＯＦ１／ＷＢＣ１１／ＡｔＡＢＣＧ１１が、クチクラのワックスの輸送に必要であり（非特許文献１７~２２）、また、ＷＢＣ１９／ＡｔＡＢＣＧ１９は抗生物質耐性能を付与する因子として報告がある（非特許文献２３）が、他のＡｔＡＢＣＧサブファミリーに属する遺伝子の機能は全く分かっていない。
　特許文献１には、ＡＢＡを葉緑体に運搬する葉緑体移行性タンパク質をコードするＤＮＡを植物で発現し、乾燥ストレスなどの環境ストレス耐性を植物に付与することが記載されている。しかし、目的は類似するが、このタンパク質は、ＡＢＡを細胞膜を介して細胞外に排出することを可能にするタンパク質とは異なる。
特開２００７−２２２１２９号公報
Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ　ＲＲ，Ｇａｍｐａｌａ　ＳＳ，Ｒｏｃｋ　ＣＤ（２００２）Ａｂｓｃｉｓｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｉｎ　ｓｅｅｄｓ　ａｎｄ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　１４：Ｓ１５−Ｓ４５ Ｈｉｒａｙａｍａ　Ｔ，Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ　Ｋ（２００７）Ｐｅｒｃｅｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｂｓｃｉｓｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｉｇｎａｌｓ：ｋｅｙｓ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｖｅｒｓａｔｉｌｅ　ｐｌａｎｔ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ＡＢＡ．Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ　１２：３４３−３５１ Ｗａｓｉｌｅｗｓｋａ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．（２００８）Ａｎ　Ｕｐｄａｔｅ　ｏｎ　Ａｂｓｃｉｓｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔｓ　ａｎｄ　Ｍｏｒｅ．Ｍｏｌ　Ｐｌａｎｔ　１：１９８−２１７ Ｓｈｅｎ　ＹＹ，ｅｔ　ａｌ．（２００６）Ｔｈｅ　Ｍｇ−ｃｈｅｌａｔａｓｅ　Ｈ　ｓｕｂｕｎｉｔ　ｉｓ　ａｎ　ａｂｓｃｉｓｉｃ　ａｃｉｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｎａｔｕｒｅ　４４３：８２３−８２６ Ｌｉｕ　Ｘ，ｅｔ　ａｌ．（２００７）Ａ　Ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｉｓ　ａ　ｐｌａｓｍａ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｐｌａｎｔ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ａｂｓｃｉｓｉｃ　ａｃｉｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ　３１５：１７１２−１７１６ Ｐａｎｄｅｙ　Ｓ，Ｎｅｌｓｏｎ　ＤＣ，Ａｓｓｍａｎｎ　ＳＭ（２００９）Ｔｗｏ　ｎｏｖｅｌ　ＧＰＣＲ−ｔｙｐｅ　Ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｒｅ　ａｂｓｃｉｓｉｃ　ａｃｉｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．Ｃｅｌｌ　１３６：１３６−１４８ Ｍａ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．（２００９）Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ　ｏｆ　ＰＰ２Ｃ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｓ　ａｂｓｃｉｓｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｅｎｓｏｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ　３２４：１０６４−１０６８ Ｐａｒｋ　ＳＹ，ｅｔ　ａｌ．（２００９）Ａｂｓｃｉｓｉｃ　ａｃｉｄ　Ｉｎｈｉｂｉｔｓ　ｔｙｐｅ　２Ｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ　ｖｉａ　ｔｈｅ　ＰＹＲ／ＰＹＬ　ｆａｍｉｌｙ　ｏｆ　ＳＴＡＲＴ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ　３２４：１０６８−１０７１ Ｃｈｅｎｇ　ＷＨ，ｅｔ　ａｌ．（２００２）Ａ　Ｕｎｉｑｕｅ　Ｓｈｏｒｔ−Ｃｈａｉｎ　Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ／Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　ｉｎ　ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＧｌｕｃｏｓｅ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ａｎｄ　Ａｂｓｃｉｓｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　１４：２７２３−２７４３ Ｋｏｉｗａｉ　Ｎ，ｅｔ　ａｌ．（２００４）Ｔｉｓｓｕｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　Ａｂｓｃｉｓｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｅｎｚｙｍｅ，ＡＡＯ３，ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　１３４：１６９７−１７０７ Ｅｎｄｏ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．（２００８）Ｄｒｏｕｇｈｔ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　９−ｃｉｓ−ｅｐｏｘｙｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ　ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ　ｏｃｃｕｒｓ　ｉｎ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｐａｒｅｎｃｈｙｍａ　ｃｅｌｌｓ．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　１４７：１９８４−１９９３ Ｃｈｒｉｓｔｍａｎｎ　Ａ，Ｗｅｉｌｅｒ　ＥＷ，Ｓｔｅｕｄｌｅ　Ｅ，Ｇｒｉｌｌ　Ｅ（２００７）Ａ　ｈｙｄｒａｕｌｉｃ　ｓｉｇｎａｌ　ｉｎ　ｒｏｏｔ−ｔｏ−ｓｈｏｏｔ　ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ　ｏｆ　ｗａｔｅｒ　ｓｈｏｒｔａｇｅ．Ｐｌａｎｔ　Ｊ　５２：１６７−１７４ Ｓｃｈａｃｈｔｍａｎ　ＤＰ，Ｇｏｏｄｇｅｒ　ＪＱＤ（２００８）Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｒｏｏｔ　ｔｏ　ｓｈｏｏｔ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｕｎｄｅｒ　ｄｒｏｕｇｈｔ．Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ　１３：２８１−２８７ Ｏｋａｍｏｔｏ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．（２００９）Ｈｉｇｈ　ｈｕｍｉｄｉｔｙ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ＡＢＡ　８’−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ　ｉｎ　ｓｔｏｍａｔａ　ａｎｄ　ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ　ｔｏ　ｒｅｇｕｌａｔｅ　ｌｏｃａｌ　ａｎｄ　ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ＡＢＡｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　１４９：８２５−８３４ Ｈｉｇｇｉｎｓ　ＣＦ（１９９２）ＡＢＣ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ：ｆｒｏｍ　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ｔｏ　ｍａｎ．Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　８：６７−１１３ Ｖｅｒｒｉｅｒ　ＰＪ，ｅｔ　ａｌ．（２００８）Ｐｌａｎｔ　ＡＢＣ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ−ａ　ｕｎｉｆｉｅｄ　ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｕｐｄａｔｅｄ　ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ．Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ１３：１５１−１５９ Ｐｉｇｈｉｎ　ＪＡ，ｅｔ　ａｌ．（２００４）Ｐｌａｎｔ　ｃｕｔｉｃｕｌａｒ　ｌｉｐｉｄ　ｅｘｐｏｒｔ　ｒｅｑｕｉｒｅｓ　ａｎ　ＡＢＣ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３０６：７０２−７０４ Ｂｉｒｄ　Ｄ，ｅｔ　ａｌ．（２００７）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ＡＢＣＧ１１／ＷＢＣ１１，ａｎ　ＡＴＰ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｃａｓｓｅｔｔｅ（ＡＢＣ）ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　ｔｈａｔ　ｉｓ　ｒｅｑｕｉｒｅｄ　ｆｏｒ　ｃｕｔｉｃｕｌａｒ　ｌｉｐｉｄ　ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｐｌａｎｔ　Ｊ　５２：４８５−４９８ Ｐａｎｉｋａｓｈｖｉｌｉ　Ｄ，ｅｔ　ａｌ．（２００７）Ｔｈｅ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ＤＥＳＰＥＲＡＤＯ／ＡｔＷＢＣ１１　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　ｉｓ　ｒｅｑｕｉｒｅｄ　ｆｏｒ　ｃｕｔｉｎ　ａｎｄ　ｗａｘ　ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　１４５：１３４５−１３６０ Ｕｋｉｔｓｕ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．（２００７）Ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＣＯＦ１，ａｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｍｕｔａｎｔ　ｏｆ　ａｎ　ＡＢＣ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　ｇｅｎｅ．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ４８：１５２４−１５３３ Ｌｕｏ　Ｂ，Ｘｕｅ　ＸＹ，Ｈｕ　ＷＬ，Ｗａｎｇ　ＬＪ，Ｃｈｅｎ　ＸＹ（２００７）Ａｎ　ＡＢＣ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　ｇｅｎｅ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ，ＡｔＷＢＣ１１，ｉｓ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｃｕｔｉｃｌｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｒｇａｎ　ｆｕｓｉｏｎ．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　４８：１７９０−１８０２ Ｓａｍｕｅｌｓ　Ｌ，Ｋｕｎｓｔ　Ｌ，Ｊｅｔｔｅｒ　Ｒ（２００８）Ｓｅａｌｉｎｇ　ｐｌａｎｔ　ｓｕｒｆａｃｅｓ：ｃｕｔｉｃｕｌａｒ　ｗａｘ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｂｙｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｃｅｌｌｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌ　５９：６８３−７０７ Ｍｅｎｔｅｗａｂ　Ａ，Ｓｔｅｗａｒｔ　ＣＮＪｒ（２００５）Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　ＡＢＣ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　ｃｏｎｆｅｒｓ　ｋａｎａｍｙｃｉｎ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｏ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ．Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　２３：１１７７−１１８０
　上記のとおり、アブシジン酸（ＡＢＡ）は、植物の生命にとって危険なストレスへの応答、種子の成熟及び老化に関与する最も重要な植物ホルモンの一つである。ＡＢＡは、主に維管束組織で産生され、孔辺細胞などの種々の細胞においてホルモン応答を誘発する。このＡＢＡ応答はＡＢＡ産生細胞からのＡＢＡの排出や細胞間ＡＢＡシグナル伝達経路を必要とするが、原形質膜を介するＡＢＡの輸送機構は依然として未知であった。
　本発明者らは、アブラナ科（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物を例として示し、ＡＢＡ輸送とＡＢＡ応答の原因であるトランスポーターを見出すことを目的とする。
　今回、本発明者らは、ＡＢＡ感受性の変異体スクリーニングによって、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのＡＢＣ（ＡＴＰ結合カセット）トランスポーター遺伝子の１つであるＡｔＡＢＣＧ２５を単離した。ＡｔＡＢＣＧ２５は、主として維管束組織中で発現している。蛍光タンパク質を融合したＡｔＡＢＣＧ２５タンパク質は、植物細胞内の原形質膜に局在した。ＡｔＡＢＣＧ２５を発現させた昆虫細胞から抽出した膜小胞を用いて、ＡｔＡＢＣＧ２５タンパク質がＡＴＰ依存的にＡＢＡを輸送することが示された。ＡｔＡＢＣＧ２５を過剰発現する植物は、葉の温度が高く、気孔の調節に影響を与えていることが示された。これらの結果は、ＡｔＡＢＣＧ２５タンパク質がＡＢＡの輸送体であって細胞間ＡＢＡシグナル伝達経路に関与することを強く示している。ＡＢＡ輸送機構の存在は、植物組織間や植物全体の中での環境ストレスに対するＡＢＡ応答の能動的な制御の存在を明らかにするものである。
　本明細書では、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＡｔＡＢＣＧ２５タンパク質及びそれと同等の機能をもつ他の植物由来ホモログ（オーソログ含む。）タンパク質を、総称的に、アブシジン酸（ＡＢＡ）輸送タンパク質という。
　今回シロイヌナズナで見出された知見は、普遍的な現象として、ＡＢＡ輸送機構を有するあらゆる植物に適用可能である。
　したがって、本発明は、要約すると、以下の特徴を含む。
（１）　外因性のアブシジン酸（ＡＢＡ）輸送タンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に含むことを特徴とする、ここで、該ＡＢＡ輸送タンパク質はＡＢＡを細胞膜を介して細胞外に排出させる生物学的活性をもつタンパク質である、環境ストレス耐性の形質転換植物。
（２）　ＡＢＡ輸送タンパク質をコードするＤＮＡが、以下の（ａ）~（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチド（ＤＮＡ）である、上記（１）に記載の形質転換植物。
　（ａ）シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）由来の配列番号２に示されるアミノ酸配列又はイネ由来の配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡ
　（ｂ）他の植物由来の（ａ）の該タンパク質のホモログのアミノ酸配列でありかつＡＢＡ輸送活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ
　（ｃ）該配列番号２又は配列番号２０のアミノ酸配列又は該ホモログのアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有しかつＡＢＡ輸送活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ
　（ｄ）該配列番号２又は配列番号２０のアミノ酸配列又は該ホモログのアミノ酸配列において１若しくは複数の、好ましくは１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有しかつＡＢＡ輸送活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ
（３）　配列番号２又は配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡがそれぞれ、配列番号１又は配列番号１９に示されるＡＢＡ輸送タンパク質コード配列を含むＤＮＡである、上記（２）に記載の形質転換植物。
（４）　環境ストレス耐性が、乾燥ストレス耐性である、上記（１）~（３）のいずれかに記載の形質転換植物。
（５）　植物が双子葉又は単子葉植物である、上記（１）~（４）のいずれかに記載の形質転換植物。
（６）　上記（１）~（５）のいずれかに記載の形質転換植物の環境ストレス耐性後代。
（７）　上記（１）~（５）のいずれかに記載の形質転換植物又は上記（６）に記載の後代の細胞、組織又は種子。
（８）　外因性のアブシジン酸（ＡＢＡ）輸送タンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡを発現可能に含むことを特徴とする環境ストレス耐性の形質転換植物の作出方法であって、該ＤＮＡを植物細胞又はカルスに発現可能なように導入し、該植物細胞又はカルスから植物体を再生することを含む、ここで、該ＡＢＡ輸送タンパク質はＡＢＡを細胞膜を介して細胞外に排出させる生物学的活性をもつタンパク質である、上記方法。
（９）　植物又はその細胞に、外因性のＡＢＡ輸送タンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡを発現可能に含むように導入し、それによって植物に環境ストレス耐性を付与することを含む、ここで、該ＡＢＡ輸送タンパク質はＡＢＡを細胞膜を介して細胞外に排出させる生物学的活性をもつタンパク質である、植物に環境ストレス耐性を付与する方法。
（１０）　上記ＤＮＡが請求項２又は３に定義されるＤＮＡである、上記（８）又は（９）に記載の方法。
　本発明により、植物におけるＡＢＡ輸送機構に関与するトランスポーターが明らかになり、このトランスポーター、すなわちＡＢＡ輸送タンパク質、をコードする塩基配列を含むＤＮＡを過剰発現する植物は乾燥ストレスなどの環境ストレスに対する耐性を有するという格別の作用効果が付与される。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００９−２８９４５７号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
この図は、ＡｔＡＢＣＧ２５遺伝子及びａｔａｂｃｇ２５変異体アレルの同定を示す。（Ａ）は、９６ウエルマルチタイタープレートアッセイによるＡＢＡ感受性変異体の単離を示す。変異体（ａｔａｂｃｇ２５−１，ａｔａｂｃｇ２５−２）は、野生型（Ｎｏｓ，Ｌｅｒ）と比べて１．０μＭ　ＡＢＡ溶液に対しより感受性である。このタイタープレートは長日性条件下の生育室内で７日間インキュベートしたものである。（Ｂ）は、ＡｔＡＢＣＧ２５遺伝子構造及び２つのａｔａｂｃｇ２５アレルの挿入突然変異部位を示す。四角のボックスはエクソンを表し、黒バーはイントロンを表す。ａｔａｂｃｇ２５−１及びａｔａｂｃｇ２５−２内のトランスポゾン挿入は、三角で示されている。（Ｃ）は、ＲＴ−ＰＣＲ分析による野生型植物と変異体中のＡｔＡＢＣＧ２５転写体を示す。野生型（ＷＴ）と２つのａｔａｂｃｇ２５変異体（ａｔａｂｃｇ２５）、すなわちＮｏｓｓｅｎ（Ｎｏｓ），Ｌａｎｄｓｂｅｒｇ（Ｌｅｒ），ａｔａｂｃｇ２５−１（−１）及びａｔａｂｃｇ２５−２（−２）からＲＮＡを調製した。常時発現している遺伝子のコントロールとしてＡｃｔｉｎ２（ＡＣＴ２）を使用した。（Ｄ）~（Ｆ）は、ａｔａｂｃｇ２５−１のＡＢＡ感受性表現型を示す。野生型（ＷＴ）及びａｔａｂｃｇ２５−１変異体（２５−１）について、いくつかの異なる濃度のＡＢＡで、種子の発芽（Ｄ）及び発芽後の成長（Ｅ）を行う個体数を、２日目（Ｄ）及び４日目（Ｅ）でカウントした。値は、（独立の３回の実験から得られた）５０粒の種子を用いた時の平均±ｓ．ｄ．を表す。１．０μＭ　ＡＢＡの存在中で発芽させた野生型（ＷＴ）（Ｆ，左）及びａｔａｂｃｇ２５−１（ａｔａｂｃｇ２５−１）（Ｆ，右）の幼植物体の写真を撮った。各５０粒の種子を蒔き、１８日間プレート上で生育させた。 この図は、植物器官のＡｔＡＢＣＧ２５遺伝子発現パターンを示す。（Ａ）は、ＲＴ−ＰＣＲ分析による植物器官でのＡｔＡＢＣＧ２５発現パターンを示す。野生型植物の幼植物体（Ｓｅ），根（Ｒ），葉（Ｌ），茎（Ｓ），花（Ｆ）及び実（Ｆｒ）からＲＮＡを調製した。ＡＣＴ２はコントロールとして使用された。（Ｂ）~（Ｇ）は、１２日齢の植物（Ｂ~Ｄ）及び５週齢の葉（Ｅ~Ｇ）を、ＡＢＡ未処理（Ｂ，Ｅ）、水処理後（Ｃ，Ｆ）及び１０μＭ　ＡＢＡ処理後（Ｄ，Ｇ）にＧＵＳ染色に付した結果を示す。スケールバーは、（Ｂ）~（Ｇ）で２ｍｍである。 この図は、ＡｔＡＢＣＧ２５タンパク質の細胞内局在を示す。（Ａ）及び（Ｂ）は、タマネギ表皮での一過性発現の結果を示す。ＹＦＰ−ＡｔＡＢＣＧ２５融合タンパク質（Ａ）及びＹＦＰのみ（Ｂ）における黄色蛍光シグナルが観察された。（Ｃ）及び（Ｄ）は、形質転換Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物での細胞内局在を示す。根端細胞（Ｃ）中で、並びに、２０％（ｗ／ｖ）スクロースによる１０分間の原形質分離後の根端細胞（Ｄ）中で、ＹＦＰ−ＡｔＡＢＣＧ２５融合タンパク質からの黄色蛍光シグナルが観察された。蛍光像（左）と明視野像（中央）を重ねあわせた像を右に示す。スケールバーは５０μｍを示す。 この図は、ＡｔＡＢＣＧ２５遺伝子産物による放射性同位体標識ＡＢＡの取り込みを示す。（Ａ）は、Ｓｆ９細胞でのＡｔＡＢＣＧ２５タンパク質発現を示す。ＡｔＡＢＣＧ２５を発現するＳｆ９膜と発現させていないＳｆ９膜（それぞれ１０μｇ／レーン）においてウエスタンブロッティングを行った。矢印は、ＡｔＡＢＣＧ２５タンパク質に相当する。（Ｂ）は、ＡＴＰの存在（黒丸）又は非存在（白丸）下でのＡｔＡＢＣＧ２５発現性膜小胞によるＡＢＡのＡＴＰ依存性輸送を示す。（Ｃ）は、ＡＢＡ取り込みの量的依存性を示す。表示のＡＢＡ濃度で１５秒間のＡＴＰ依存性ＡＢＡ取り込みが測定された。挿入図は、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットを示す。（Ｄ）は、ＡＢＡ取り込みのエネルギー依存性を示す。表示のヌクレオチド４ｍＭの存在下でアッセイを行った。いくつかの実験は、ＡＴＰに加えて４ｍＭの表示のヌクレオチド又は１ｍＭのバナジン酸塩（ｖａｎａｄａｔｅ）の存在下で行われた。ＡＴＰの非存在下でのＡＢＡ取り込みも示した（Ｎｏ　ＡＴＰ）。（Ｅ）は、ＡＢＡ取り込みのＣｉｓ阻害を示す。ＡＴＰと、表示の濃度の化合物類との存在下でのＡＢＡ取り込みを測定した。フル活性（１００％）は、１５秒での８．３ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質に相当する（灰色バー）。各値は、３回の測定の平均±ｓ．ｄ．を表す。ここで、ＧＡ，ジベレリン酸；ＩＡＡ，インドール酢酸；ＪＡ，ジャスモン酸；ＰＡＨ，ｐ−アミノ馬尿酸塩；ＳＡ，サリチル酸；ＴＥＡ，テトラエチルアンモニウム、である。 この図は、ＡｔＡＢＣＧ２５過剰発現植物の特徴を示す。（Ａ）は、ＡｔＡＢＣＧ２５過剰発現植物でのＡｔＡＢＣＧ２５発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。対照植物（Ｃｏｎｔ−１，２）及び３種類の３５Ｓ：：ＡｔＡＢＣＧ２５トランスジェニック系統（ＯＥ−０４，ＯＥ−１４及びＯＥ−４１）からＲＮＡを調製した。コントロールとしてＡＣＴ２を使用した。（Ｂ）及び（Ｃ）は、ＡｔＡＢＣＧ２５過剰発現植物の発芽後成長のＡＢＡ感受性を示す。対照（Ｃｏｎｔ−１及びＣｏｎｔ−２）の幼植物体と、３５Ｓ：：ＡｔＡＢＣＧ２５トランスジーンを発現する３種類のトランスジェニック系統（ＯＥ−０４，ＯＥ−１４　ａｎｄ　ＯＥ−４１）の幼植物体を、異なる濃度のＡＢＡの存在下で７日間生育した（Ｂ）。値は、（独立の３回の実験から得た）５０粒の種子の平均±ｓ．ｄ．を表す。１．０μＭ　ＡＢＡの存在下で発芽した幼植物体の写真を取った。それぞれ５０粒の種子を蒔き、１５日間プレート上で生育させた（Ｃ）。（Ｄ）は、ＡｔＡＢＣＧ２５過剰発現植物のサーモグラフィー画像である。対照植物（Ｃｏｎｔ−１−１及びＣｏｎｔ−１−２）とＡｔＡＢＣＧ２５過剰発現植物（ＯＥ−０４−１，ＯＥ−０４−２，ＯＥ−１４−１，ＯＥ−１４−２，ＯＥ−４１−１及びＯＥ−４１−２）の４週齢の植物を、赤外線サーモグラフィー装置を用いて画像化した（このとき、大気温度２２℃±２℃；相対湿度６０~７０％であった。）。 この図は、ａｔａｂｃｇ２５−３及びａｔａｂｃｇ２５−４変異体アレル及び表現型を示す。（Ａ）は、さらに２つのａｔａｂｃｇ２５アレルの挿入突然変異部位を示す。ａｔａｂｃｇ２５−３（ＳＡＬＫ＿０９８８２３）及びａｔａｂｃｇ２５−４（ＳＡＬＫ＿１２８３３１）中のＴ−ＤＮＡ挿入体を黒の三角で示す。（Ｂ）は、ＲＴ−ＰＣＲ分析による、野生型植物及びａｔａｂｃｇ２５−３、ａｔａｂｃｇ２５−４変異体中のＡｔＡＢＣＧ２５転写物を示す。野生型（Ｃｏｌ）と、２種類のａｔａｂｃｇ２５変異体（ａｔａｂｃｇ２５−３及びａｔａｂｃｇ２５−４）の幼植物体からＲＮＡを調製した。コントロールとしてアクチン２（ＡＣＴ２）を用いた。（Ｃ）及び（Ｄ）は、ａｔａｂｃｇ２５−３とａｔａｂｃｇ２５−４のＡＢＡ感受性表現型を示す。異なる濃度のＡＢＡ中、１１日目の発芽後成長した個体数をカウントした（Ｃ）。値は、（独立した３回の実験から得た）５０粒の種子の平均±ｓ．ｄ．として示されている。０．５μＭ　ＡＢＡの存在中で発芽した野生型とａｔａｂｃｇ２５変異体の写真を撮った（Ｄ）。それぞれ５０粒の種子を蒔き、１６日間プレート上で生育させた。 この図は、エンハンサー−トラップ系統ａｔａｂｃｇ２５−２のＧＵＳ染色を示す。ａｔａｂｃｇ２５−２（ＣＳＨＬ＿ＥＴ７１３４）変異体は、ＡｔＡＢＣＧ２５の元来のプロモーター又はエンハンサーの制御下で発現を検出するためのＧＵＳレポーター遺伝子を含むＤｓ挿入エレメントを有する。（Ａ）では、２週齢植物がＧＵＳ染色のために使用された。（Ｂ）には、染色された３週齢の植物の根の拡大図を示した。（Ｃ）には、染色された３週齢の植物のロゼット葉を示した。Ｔｅｃｈｎｏｖｉｔ　７１００　Ｐａｌｓｔｉｃ　Ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｋｕｌｚｅｒ）を用いて縦に切片化した。ここで、Ｘｙは木質部を表す。また、スケールバーは、（Ａ）１ｍｍ、（Ｂ，Ｃ）５０μｍである。 この図は、ＡｔＡＢＣＧ２５タンパク質の細胞内局在を示す。タマネギ表皮での一過的発現を示している。黄色の蛍光シグナルは、ＹＦＰ−ＡｔＡＢＣＧ２５融合タンパク質からのものである。蛍光像（左）と明視場像（中央）を重ね合わせた像を右に示す。下側のパネルは、囲んだ領域の拡大である。スケールバーは５０μｍである。 この図は、ＡｔＡＢＣＧ２５過剰発現植物の水分蒸散率を示す。３種類の３５Ｓ：：ＡｔＡＢＣＧ２５トランスジェニック系統（ＯＥ−０４，ＯＥ−１４及びＯＥ−４１）と野生型植物（Ｃｏｌ）の６~７週齢の葉を使用した。ＡｔＡＢＣＧ２５過剰発現植物中の水分蒸散量を、新鮮な葉の初期重量のパーセンテージとして測定した。値は、（独立の３つの植物から切り取った）５枚の葉の平均±ｓ．ｄ．として示した。 この図は、ＡｔＡＢＣＧ２５過剰発現植物の乾燥耐性を示す。（Ａ）は、乾燥処理前のＡｔＡＢＣＧ２５過剰発現植物のサーモグラフィー画像である。対照植物（Ｃｏｎｔ−１及びＣｏｎｔ−１）とＡｔＡＢＣＧ２５過剰発現植物（ＯＥ−０４　ＯＥ−１４）の６週齢の植物を、赤外線サーモグラフィー装置を用いて画像化した。対照植物に比べて、ＡｔＡＢＣＧ２５過剰発現植物は葉温が高い。（Ｂ）は、乾燥処理後の植物体の写真である。６週齢の植物を、１４日間水切り処理し、再吸水５日後の植物体である。 この図は、ＡｔＡＢＣＧサブファミリーに属するＡｔＡＢＣＧ９（ＷＢＣ９）、ＡｔＡＢＣＧ１４（ＷＢＣ１４）、ＡｔＡＢＣＧ２１（ＷＢＣ２１）、ＡｔＡＢＣＧ２２（ＷＢＣ２３）、ＡｔＡＢＣＧ２５（ＷＢＣ２６）、ＡｔＡＢＣＧ２６（ＷＢＣ２７）、ＡｔＡＢＣＧ２７（ＷＢＣ２８）及びＯｓ１１ｇ０７６００タンパク質のアミノ酸配列の系統樹を示す。アミノ酸配列のアラインメントは、遺伝情報処理ソフトウエアＧｅｎｅｔｙｘ（Ｇｅｎｅｔｙｘ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）及びコマンドＭｕｌｔｉｐｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ（多重配列解析）を用いて行った。 この図は、ＡｔＡＢＣＧ２５（シロイヌナズナ；上段）及びＯｓ１１ｇ０７６００（イネ；下段）タンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを示す。図中、ボックスは、２つの配列間での共通（又は、同一）のアミノ酸残基を示す。 この図は、３５Ｓ：：ＡｔＡＢＣＧ２５トランスジェニック植物系統ＯＥ−４１及び対照植物（Ｃｏｌ．）（各４週齢）のロゼット葉について、ＳＵＭＰ（Ｓｕｚｕｋｉ’ｓ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｍｅｔｈｏｄ　Ｏｆ　Ｐｒｉｎｔｉｎｇ）法で測定した気孔開度（μｍ）を示すグラフである。Ｎはサンプル数を示す。図の結果は、ＡｔＡＢＣＧ２５過剰発現植物の成熟葉では、対照植物と比べて気孔開度が少ないことを示している。 この図は、ＡｔＡＢＣＧ２５過剰発現植物（ＯＥ）において、野生型植物（ＷＴ）と同様に、気孔の開閉がＣＯ２濃度及び明暗条件によって変化することを示す。（Ａ）は、携帯用光合成測定装置（ＬＩ−６４００型；ＬＩ−ＣＯＲ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって計数した５週齢植物のロゼット葉の気孔伝導度（ｍｏｌ　Ｈ２Ｏ／ｍ２ｓ）を示す。ＣＯ２濃度は、図示したように３０分ごとに調節された。（Ｂ）は、図示したように明所（昼）２時間、暗所（夜）８時間、及び明所（昼）２時間の間に計数された気孔伝導度を示す。 この図は、ＡｔＡＢＣＧ２５がアブシジン酸（ＡＢＡ）シグナル経路に関連していることを遺伝学的に証明したデータである。（Ａ）から（Ｄ）の図に関して、ＡｔＡＢＣＧ２５過剰発現植物（ＯＥ）、野生型植物（ＷＴ）、ｎｃｅｄ３欠損変異型植物（ｎｃｅｄ３−２）、ならびに、ＡｔＡＢＣＧ２５過剰発現型植物×ｎｃｅｄ３欠損変異型植物（ｎｃｅｄ３−２／ＯＥ）（各５週齢）のポット配置（Ａ）、植物体（Ｃ）、ＲＴ−ＰＣＲによるＡｔＡＢＣＧ２５，ＮＣＥＤ３及びＡＣＴ２（対照）遺伝子の発現（Ｂ）、ならびに、赤外線カメラ（Ｎｅｏ　Ｔｈｅｒｍｏ　ＴＶＳ−７００）による植物体のサーモグラフィー画像（Ｄ）をそれぞれ示す。ここで、ＮＣＥＤは、９−ｃｉｓ−ｅｐｏｘｙｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ　ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅを表す。ＮＣＥＤ３はＡＢＡ合成のキー遺伝子（９−ｃｉｓ−ｖｉｏｌａｘａｎｔｈｉｎからｘａｎｔｈｏｘｉｎの生合成を触媒する酵素の遺伝子）であり、ＮＣＥＤ３の欠損変異型（ｎｃｅｄ３−２）では気孔を閉じるのに支障が出るため、葉の温度が上がらない（図１５Ｄ）。この欠損変異型（ｎｃｅｄ３−２）とＡｔＡＢＣＧ２５過剰発現型（ＯＥ）との掛け合わせ（ｎｃｅｄ３−２／ＯＥ）では、葉の温度が上がらないため（図１５Ｄ）、ＡＢＡシグナル経路においてＡｔＡＢＣＧ２５がＮＣＥＤ３の下流にあることが証明された。
　本発明は、第１の態様において、外因性のアブシジン酸（ＡＢＡ）輸送タンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に含むことを特徴とする環境ストレス耐性の形質転換植物、及びその作出方法を提供する。
　植物ホルモンであるＡＢＡは、背景技術の項で説明したように、胚及び種子の成熟又は発芽後成長などの植物成長や発達、並びに、環境の変化に適応するためのストレス応答、の種々の面で重要な役割を果している（Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ　ＲＲ，Ｇａｍｐａｌａ　ＳＳ，Ｒｏｃｋ　ＣＤ（２００２）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　１４：Ｓ１５−Ｓ４５）。今回、本発明者らが見出した新規の知見は、多数の遺伝子が存在するＡＢＣトランスポーターのなかのＡＢＣＧサブファミリーの遺伝子のなかに、植物においてＡＢＡの輸送に直接関わるタンパク質因子が存在し、それを同定したことである。この知見は、植物としてアブラナ科（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）を用いて得られたものであるが、本発明はＡＢＡ輸送機構をもつすべての植物に適用されるべきである。そのような植物には、双子葉植物及び単子葉植物が包含される。
　本明細書で使用される「アブシジン酸（ＡＢＡ）輸送機構」という用語は、植物細胞中のＡＢＡがＡＢＡ輸送タンパク質によって細胞膜を介して細胞外に排出される機構を指し、排出されたＡＢＡが細胞間のＡＢＡシグナル伝達経路に関与する。したがって、特開２００７−２２２１２９号公報（日本）に記載される葉緑体移行性タンパク質は、本発明のＡＢＡ輸送タンパク質ではない。
　本明細書で使用される「アブシジン酸（ＡＢＡ）輸送タンパク質」という用語は、植物細胞中でＡＢＡを細胞膜を介して細胞外に排出する機能（若しくは、働き）をもつタンパク質を指す。
　本発明によれば、植物においてＡＢＡ輸送タンパク質をコードするＤＮＡを発現（若しくは、過剰発現）させるときには、環境ストレス、好ましくは乾燥ストレス、に対し耐性を付与することができる。環境ストレスには、乾燥ストレスの他に、例えば塩ストレス、低温ストレス、浸透圧ストレスなどを挙げることができる。いずれのストレスについても、植物体内でＡＢＡ輸送機構を介するＡＢＡ応答によって該ストレスが制御される。
　本発明で使用されるＡＢＡ輸送タンパク質は、あらゆる植物由来の、かつ、ＡＢＡ輸送活性をもつあらゆるタンパク質である。本明細書で使用される「ＡＢＡ輸送活性」という用語は、植物細胞内で産生されたＡＢＡを細胞膜を介して細胞外に排出させる生物学的活性をいう。この活性は、後述の実施例に記載される小胞輸送アッセイ法によって測定される。簡単に説明すると、ＡＢＡ輸送タンパク質候補をコードするＤＮＡをバキュロウイルス発現用ベクターに組み込んだのち、該ベクターをＳｆ９昆虫細胞内に導入し、細胞膜を分離する。この細胞膜にはＡＢＡ輸送タンパク質候補が発現しているが、この膜には内側と外側が反転した反転膜小胞も含んでおり、放射性同位体ラベルしたＡＢＡを小胞内に取り込んだのち、迅速ろ過技術を用いてろ過、洗浄し、フィルターに吸着した放射能を測定し、排出活性を取り込み量として測定する。
　上記のＡＢＡ輸送タンパク質には、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）由来の配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、他の植物由来のそのホモログ（本明細書では、「オーソログ」を含む。）、該タンパク質又は該ホモログの変異体であってＡＢＡ輸送活性をもつ変異体が包含される。変異体は、元の（すなわち、変異前の）タンパク質のアミノ酸配列中に１つ若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（若しくは、挿入）を含むが、依然としてＡＢＡ輸送活性を保持しているべきである。このような変異体は、部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ利用の変異導入法などの遺伝子工学的手法によって作製することができる。遺伝子工学的手法は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，１９８９，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９４，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓなどに具体的に記載されており、上記変異体の作製のために利用できる。
　実際にＡＢＡ輸送タンパク質を植物内で過剰発現させるために、上記タンパク質、上記ホモログ又は上記変異体をコードするＤＮＡを植物細胞内に発現可能な形態で導入する必要がある。ＤＮＡの細胞内への導入のために、植物細胞の形質転換技術として知られるいずれの方法も使用できる。そのような方法には、例えばアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）法、パーティクルガン（遺伝子銃）法、ウイルスベクター、フローラルディップ法、リーフディスク法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法などが含まれる。
　ＡＢＡ輸送タンパク質をコードするＤＮＡは、本発明の実施形態によれば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）由来の配列番号２又はイネ由来の配列番号２０に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ、他の植物由来のそのホモログでありかつＡＢＡ輸送活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ、並びに、該配列番号２又は配列番号２０のアミノ酸配列又は該ホモログのアミノ酸配列と３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、９７％以上、９９％以上の同一性を有しかつＡＢＡ輸送活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ、及び該配列番号２又は配列番号２０のアミノ酸配列又は該ホモログのアミノ酸配列において１若しくは複数の、好ましくは１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有しかつＡＢＡ輸送活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡからなる群から選択される。
　ここで、置換は、保存的アミノ酸置換が望ましい。保存的アミノ酸置換とは、例えば構造的、電気的、極性もしくは疎水性などの性質が類似したアミノ酸間の置換を意味する。このような性質は、例えばアミノ酸側鎖の類似性で分類することも可能である。塩基性側鎖を有するアミノ酸は、リシン、アルギニン、ヒスチジンからなり、酸性側鎖を有するアミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸からなり、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システインなどを含み、疎水性側鎖を有するアミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンなどを含み、分岐側鎖を有するアミノ酸はトレオニン、バリン、イソロイシンからなり、ならびに、芳香族側鎖を有するアミノ酸は、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、ヒスチジンからなる。
　上記の配列番号２（シロイヌナズナ）又は配列番号２０（イネ）に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡの例は、配列番号１（シロイヌナズナ）又は配列番号１９（イネ）に示されるＡＢＡ輸送タンパク質コード配列を含むＤＮＡである。
　シロイヌナズナ由来の該ＤＮＡの塩基配列は、遺伝子番号Ａｔ１ｇ７１９６０、登録番号（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｏ．）ＡＹ０５０８１０（ｃＤＮＡ）及びＡＡＫ９２７４５（タンパク質）でＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）に登録されている。ここには、該ＤＮＡによってコードされるタンパク質が推定上のＡＢＣトランスポータータンパク質であることが記載されているが、その当時、ＡＢＡトランスポーターとしての機能を有することについては知られていなかった。
　さらにまた、配列番号１又は配列番号１９に示されるＡＢＡ輸送タンパク質コード配列を含むＤＮＡの塩基配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡであって、該ＤＮＡによってコードされるタンパク質がＡＢＡ輸送活性を有している前記ＤＮＡも本発明で使用可能である。このような相同のＤＮＡは、例えば、配列番号１又は配列番号１９に示す塩基配列と約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７％以上、又は約９９％以上の同一性を有し、かつ、該ＤＮＡによってコードされるタンパク質がＡＢＡ輸送活性をもつ、そのようなＤＮＡを包含する。シロイヌナズナ由来のＡＢＡ輸送タンパク質のホモログをコードするＤＮＡは、このようなＤＮＡに含まれるだろう。
　ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、約４２~５５℃、２~６×ＳＳＣでのハイブリダイゼーションののち、５０~６５℃、０．１~１×ＳＳＣ、０．１~０．２％　ＳＤＳでの１回もしくは複数回の洗浄からなる条件を含むが、このような条件は、鋳型核酸のＧＣ含量、イオン強度、温度などによって変化するため、上記の特定の条件に制限されないものとする。ここで、１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ　クエン酸Ｎａ、ｐＨ７．０からなる。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度、ｐＨでの特定の配列の融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように設定される。ここで、Ｔｍは、鋳型配列に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で鋳型配列にハイブリダイズする温度をいう。
　本明細書で使用される「ＤＮＡ」という用語は、ゲノムＤＮＡ、遺伝子又はｃＤＮＡを表す。
　本明細書で使用する「同一性」という用語は、例えば２つのアミノ酸配列又は塩基配列を、それらが最大の一致率となるようにギャップを導入するか又はギャップを導入しないで整列させたとき、アミノ酸又は塩基の総数（もしくは位置の総数；ただしギャップも含む）に対する同一アミノ酸又は塩基の数（もしくは、位置）の割合（％）を意味する。配列間の％同一性の決定や、ホモログ配列の検索又は相同性検索は、ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴＮ，ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＸなど）、ＦＡＳＴＡなどの公知のアルゴリズムを利用することによって行うことができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ＳＦ，Ｗ　Ｇｉｓｈ，Ｗ　Ｍｉｌｌｅｒ，ＥＷ　Ｍｙｅｒｓ，ａｎｄ　ＤＪ　Ｌｉｐｍａｎ．Ｂａｓｉｃ　ｌｏｃａｌ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｓｅａｒｃｈ　ｔｏｏｌ．Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　２１５（３）：４０３−１０，１９９０）。
　本明細書で使用する「数個」という用語は、アミノ酸又はヌクレオチドに対して使用され、一般に、２~１０の範囲の整数を指し、好ましくは２~５の範囲の整数である。また、本明細書でアミノ酸又はヌクレオチドに対して使用する「複数」という用語は、２以上の整数を指し、例えば２~７０の整数、２~６０の整数、２~５０の整数、２~４０の整数、２~３０の整数、２~２０の整数、２~１０の整数などを含む。
　本発明で使用しうる「ホモログ」は、シロイヌナズナ以外の植物由来の、ＡＢＡ輸送活性を有するすべてのＡＢＡ輸送ポリペプチドを包含する。このようなホモログは、植物ゲノムを公開する、例えば、ＮＣＢＩ（米国）、ＥＢＩ（欧州）、ＫＡＯＳ（かずさＤＮＡ研究所、日本）、ＩＲＧＳＰ（国際イネゲノム塩基配列解析プロジェクト、日本）、ＧｒａｉｎＧｅｎｅｓ（米国）、ＰＧＤＩＣ（米国）、ＦｏｒｅｓｔＧＥＮ（森林総合研究所、日本）、ＲＡＰ−ＤＢ（農林水産省、日本）、Ｒｉｃｅ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｊｅｃｔ　Ｄａｔａｂａｓｅ（ＮＳＦ、米国）などのｗｅｂサイトにアクセスすることによって入手することができる。
　上記ホモログは、植物が有するＡＢＡ輸送活性をもつ天然ポリペプチドであり、双子葉植物、単子葉植物などの（ＡＢＡ輸送機構をもつ）植物のいずれに由来していてもよい。例えば、イネ（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ）のホモログは、遺伝子番号Ｏｓ１１ｇ０１７７４００、登録番号ＮＭ＿００１０７２４１８（ｐａｒｔｉａｌ　ｃＤＮＡ）及びＮＰ＿００１０６５８８６（以上、日本国農林水産省ＲＡＰ−ＤＢの登録番号）、或いは遺伝子番号Ｏｓ１１ｇ０７６００（米国ＮＳＦのＲｉｃｅ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｊｅｃｔ登録番号）であり、ミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）のホモログは、遺伝子番号ＬｊＳＧＡ＿１１１５９５．１、登録番号ＢＡＢＫ０１０７８０７３（ｇｅｎｏｍｅ　ｓｈｏｔｇｕｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ）である（ＤＮＡ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００６）１３，２０５−２２８）。
　シロイヌナズナ由来のＡＢＡ輸送タンパク質ＡｔＡＢＣＧ２５（配列番号２）とイネ由来のＡＢＡ輸送タンパクＯｓ１１ｇ０７６００（配列番号２０）は、ＡＢＣＧ（ＷＢＣ）ファミリーメンバーの系統樹（図１１）及びアラインメント（図１２）からも極めて近縁関係にあることが解る。
　さらにまた、ＡＢＡ輸送タンパク質は、共通の機能ドメイン、すなわちＡＴＰ結合サイト、膜領域などを有している。例えば、ＡｔＡＢＣＧ２５（ＷＢＣ２６）のアミノ酸配列（配列番号２）の場合、ＡＴＰ結合サイトはアミノ酸７１位（プロリン）~２９０位（グリシン）に位置し、膜領域はアミノ酸４０８位（ロイシン）~５９４位（チロシン）に位置する。
　植物の形質転換のために、目的のＤＮＡを植物組織（例えば、葉、茎、根、花弁、花粉、種子、カルス、など）のｃＤＮＡライブラリー又はゲノムＤＮＡライブラリーから選抜し、適するベクター（例えばファージ、プラスミドなど）に組み込む。ＤＮＡ及びベクターは、例えば遺伝子組換え技術によって製造することができる。遺伝子組換え技術は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，１９８９，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９４，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓなどに記載される手法を利用することができる。
　また、上記に関連して、上記のｃＤＮＡライブラリー又はゲノムＤＮＡライブラリーから、例えば配列番号１又は配列番号１９に記載の塩基配列、その部分配列又はそれらの相補的配列を含むＤＮＡを（標識化）プローブ又はプライマーとして用いて、ホモログＤＮＡを得ることができる。
　形質転換の対象となる植物としては、特に限定されないが、例えば、双子葉植物及び単子葉植物、非限定的に、例えばアブラナ科、イネ科、ナス科、マメ科、ヤナギ科等に属する植物（下記参照）が挙げられる。
　アブラナ科：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｒａｐａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ）、キャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｏｌｅｒａｃｅａ　ｖａｒ．ｃａｐｉｔａｔａ）、ナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｒａｐａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ）、ナノハナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｒａｐａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ）、ハクサイ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｒａｐａ　ｖａｒ．ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ）、チンゲンサイ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｒａｐａ　ｖａｒ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、カブ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｒａｐａ　ｖａｒ．ｒａｐａ）、ノザワナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｒａｐａ　ｖａｒ．ｈａｋａｂｕｒａ）、ミズナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｒａｐａ　ｖａｒ．ｌａｎｃｉｎｉｆｏｌｉａ）、コマツナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｒａｐａ　ｖａｒ．ｐｅｒｕｖｉｒｉｄｉｓ）、パクチョイ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｒａｐａ　ｖａｒ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、ダイコン（Ｂｒａｓｓｉｃａ　Ｒａｐｈａｎｕｓ　ｓａｔｉｖｕｓ）、ワサビ（Ｗａｓａｂｉａ　ｊａｐｏｎｉｃａ）など。
　ナス科：タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ）、ナス（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｅｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ　ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ　ａｎｎｕｕｍ）、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ）など。
　マメ科：ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ）、エンドウ（Ｐｉｓｕｍ　ｓａｔｉｖｕｍ）、ソラマメ（Ｖｉｃｉａ　ｆａｂａ）、フジ（Ｗｉｓｔｅｒｉａ　ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ）、ラッカセイ（Ａｒａｃｈｉｓ．ｈｙｐｏｇａｅａ）、ミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ　ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ　ｖａｒ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）、アズキ（Ｖｉｇｎａ　ａｎｇｕｌａｒｉｓ）、アカシア（Ａｃａｃｉａ）など。
　キク科：キク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ　ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ　ａｎｎｕｕｓ）など。
　ヤシ科：アブラヤシ（Ｅｌａｅｉｓ　ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ、Ｅｌａｅｉｓ　ｏｌｅｉｆｅｒａ）、ココヤシ（Ｃｏｃｏｓ　ｎｕｃｉｆｅｒａ）、ナツメヤシ（Ｐｈｏｅｎｉｘ　ｄａｃｔｙｌｉｆｅｒａ）、ロウヤシ（Ｃｏｐｅｒｎｉｃｉａ）など。
　ウルシ科：ハゼノキ（Ｒｈｕｓ　ｓｕｃｃｅｄａｎｅａ）、カシューナットノキ（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ　ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、ウルシ（Ｔｏｘｉｃｏｄｅｎｄｒｏｎ　ｖｅｒｎｉｃｉｆｌｕｕｍ）、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ　ｉｎｄｉｃａ）、ピスタチオ（Ｐｉｓｔａｃｉａ　ｖｅｒａ）など。
　ウリ科：カボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ　ｍａｘｉｍａ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ　ｍｏｓｃｈａｔａ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ　ｐｅｐｏ）、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ　ｓａｔｉｖｕｓ）、カラスウリ（Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓ　ｃｕｃｕｍｅｒｏｉｄｅｓ）、ヒョウタン（Ｌａｇｅｎａｒｉａ　ｓｉｃｅｒａｒｉａ　ｖａｒ．ｇｏｕｒｄａ）など。
　バラ科：アーモンド（Ａｍｙｇｄａｌｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、バラ（Ｒｏｓａ）、イチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ）、サクラ（Ｐｒｕｎｕｓ）、リンゴ（Ｍａｌｕｓ　ｐｕｍｉｌａ　ｖａｒ．ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）など。
　ナデシコ科：カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ　ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）など。
　ヤナギ科：ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ　ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ、Ｐｏｐｕｌｕｓ　ｎｉｇｒａ、Ｐｏｐｕｌｕｓ　ｔｒｅｍｕｌａ）など。
　フトモモ科：ユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｃａｍａｌｄｕｌｅｎｓｉｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｒａｎｄｉｓ）など。
　イネ科：トウモロコシ（Ｚｅａ　ｍａｙｓ）、イネ（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ）、タケ（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ　ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ）、ネピアグラス（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ　ｐｕｐｕｒｅｕｍ）、エリアンサス（Ｅｒｉａｎｔｈｕｓ　ｒａｖｅｎａｅ）、ミスキャンタス（ススキ）（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ　ｖｉｒｇａｔｕｍ）、ソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ）、スイッチグラス（Ｐａｎｉｃｕｍ）など。
　ユリ科：チューリップ（Ｔｕｌｉｐａ）、ユリ（Ｌｉｌｉｕｍ）など。
　簡単に説明すると、例えば、植物組織（好ましくは、維管束又は葉脈を含む組織）由来のｃＤＮＡライブラリー（ファージを利用する公知の手法で作製可能である。）から、公知の配列（例えば配列番号１又は配列番号１９）を基にして作製したプライマーを使用するＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によってＡＢＡ輸送タンパク質をコードするＤＮＡを増幅することができる。該ＤＮＡを、例えばアガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製したのち、適当な発現ベクターに過剰発現可能な形態で挿入する。ＰＣＲ手順やプライマー等に関するＰＣＲ技術は、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９４，上記）に記載されるような公知の手法を用いることができる。
　ベクターの例は、バイナリーベクターまたはその他のベクターである。バイナリーベクターは、アグロバクテリウムＴ−ＤＮＡのライトボーダー（ＲＢ）とレフトボーダー（ＬＢ）の２つの約２５ｂｐボーダー配列を含み、両ボーダー配列の間に、外来ＤＮＡが挿入される。バイナリーベクターは、例えばｐＢＩ系（例えば、ｐＢＩ１０１，ｐＢＩ１０１．２，ｐＢＩ１０１．３，ｐＢＩ１２１，ｐＢＩ２２１（以上Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社））、ｐＧＡ４８２、ｐＧＡＨ、ｐＢＩＧなどである。その他のベクターには、例えば中間系プラスミドｐＬＧＶ２３Ｎｅｏ、ｐＮＣＡＴ、ｐＭＯＮ２００など、またはＧＡＴＥＷＡＹカセットを含むｐＨ３５ＧＳ（Ｋｕｂｏら，２００５，Ｇｅｎｅｓ　＆　Ｄｅｖ．１９：１８５５−１８６０）などが含まれる。外来ＤＮＡの５’末端には、プロモーターが連結される。プロモーターの例は、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子プロモーター、トウモロコシユビキチンプロモーター、オクトピン合成酵素遺伝子プロモーター、イネアクチンプロモーターなどを含む。また、外来ＤＮＡの３’末端にはターミネーター（例えばノパリン合成酵素遺伝子ターミネーターなど）が挿入される。ベクターにはさらに、形質転換細胞を選抜するために必要な選択マーカーが挿入される。選択マーカーの例は、薬剤耐性遺伝子であるカナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴＩＩ）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｔｐ）、ビアラホス耐性遺伝子（ｂａｒ）などである。
　上記のようにして構築したベクターを植物に導入する形質転換法としては、アグロバクテリウム、パーティクルガン（遺伝子銃）、エレクトロポレーション、ウイルスベクター、フローラルディップ法、リーフディスク法などが例示される。植物の形質転換技術や組織培養技術に関しては、例えば島本功、岡田清孝監修、植物細胞工学シリーズ１５、モデル植物の実験プロトコル、遺伝学的手法からゲノム解析まで、秀潤社（２００１年）に記載されている。
　バイナリーベクター−アグロバクテリウム系を利用する方法では、植物細胞、カルスまたは植物組織片を準備し、これにアグロバクテリウムを感染させて、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを植物細胞内に導入する。形質転換においては、培地にフェノール化合物（アセトシリンゴン）を添加してもよく、特に単子葉植物においては、該細胞は効率よく形質転換されうる。また、アグロバクテリウムとしては、アグロバクテリウムチュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）菌株（例えばＣ５８，ＬＢＡ４４０４，ＥＨＡ１０１，ＥＨＡ１０５，Ｃ５８Ｃ１ＲｉｆＲなど）が使用されうる。
　形質転換用培地は、固体培地であり、例えばＭＳ培地、Ｂ５培地、ＤＫＮ培地、Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ　＆　Ｓｋｏｏｇ培地などの植物培養用培地を基本培地として、これに１~５％のマルトース、蔗糖、グルコース、ソルビトールなどの糖類、及び０．２~１％の寒天、アガロース、ゲルライト、ゲランガムなどの多糖類固化剤を添加することができる。培地には、オーキシン類、サイトカイニン類、抗生物質（例えばカナマイシン、ハイグロマイシン、カルベニシリンなど）、アセトシリンゴンなどを添加することができる。培地のｐＨは適宜選択しうるものとし、例えばｐＨ５~７である。また、形質転換後に、例えば転写活性化を誘導する物質、例えばステロイドホルモン、を培地に添加することもできる。
　具体的には、アグロバクテリウムの菌液を調製し、この菌液に植物カルス又は組織（例えば葉片、根、茎片、成長点など）を浸漬し、水分を除いたのち、固体培地に置床して共存培養する。カルスは、植物細胞塊であり、植物組織片又は完熟種子などからカルス誘導培地を用いて誘導することができる。形質転換されたカルス又は組織片を選択マーカーに基づいて選択し、その後、カルスについては、再分化培地にて幼植物体に再分化させることができる。一方、植物片については、植物片からカルスを誘導して幼植物体に再分化させるか、或いは植物片からプロトプラストを調製し、カルス培養を経て幼植物体に再分化させることができる。このようにして得られた幼植物体を発根後に土壌に移し植物体に再生する。
　また、フローラルディップ法を使用する場合には、例えばＣｌｏｕｇｈとＢｅｎｔ（Ｐｌａｎｔ　Ｊ．１６，７３５−７４３（１９９８））らによって記載されるように、例えばアグロバクテリウムの菌液を調製し、この菌液に未熟な花芽が発達するまで生育させた形質転換対象の植物宿主の花芽を短時間浸漬し、覆いをして一晩湿度を保つ。翌日覆いを取り、植物をそのまま生育させて種子を収穫する。形質転換された個体は、適切な選択マーカー例えば抗生物質を加えた固体培地上に収穫した種子を播種することで選択することができる。このようにして選択した個体を土壌に移し生育させることにより、形質転換植物（「トランスジェニック植物」ともいう）の次世代の種子を得ることができる。
　形質転換植物を野生型と交雑させることによって、或いは自家受粉させることによって、形質転換植物と同様の新規形質をもつ後代を作出することができる。
　上記の方法で作出された形質転換植物またはその後代は、ＡＢＡ輸送タンパク質をコードするＤＮＡを過剰発現可能に含み、乾燥ストレスなどの環境ストレスに対し耐性を示すことを特徴とする。
　本明細書で使用する「発現可能に」という用語は、外因性のＡＢＡ輸送タンパク質をコードするＤＮＡを含まない対照植物と比べて、該ＤＮＡを、より高いレベルで発現することができることを意味する。発現は、構成的発現、誘導的発現及び自律的発現のいずれでもよい。目的の該ＤＮＡが、環境ストレス条件下で絶えず強制的に発現されることが好ましい。
　本発明はまた、第２の態様において、そのような形質転換植物またはその後代だけでなく、それらの細胞または組織あるいは種子をも提供する。
　本発明はさらに、第３の態様において、外因性のＡＢＡ輸送タンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に含むことを特徴とする環境ストレス耐性の形質転換植物の作出方法であって、該ＤＮＡを植物細胞又はカルスに発現可能なように導入し、該植物細胞又はカルスから植物体を再生することを含む方法を提供する。ここで、該ＡＢＡ輸送タンパク質はＡＢＡを細胞膜を介して細胞外に排出させる生物学的活性をもつタンパク質である。
　この方法で形質転換するための手法は、上で説明したとおりである。
　本発明はさらに、第４の態様において、植物又はその細胞に、外因性のＡＢＡ輸送タンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に含むように導入し、それによって植物に環境ストレス耐性を付与することを含む、植物に環境ストレス耐性を付与する方法を提供する。ここで、該ＡＢＡ輸送タンパク質はＡＢＡを細胞膜を介して細胞外に排出させる生物学的活性をもつタンパク質である。
　この方法で形質転換するための手法は、上で説明したとおりである。
　環境ストレスとしては、例えば乾燥ストレス、塩ストレス、低温ストレス、浸透圧ストレスなどを挙げることができる。これは、ＡＢＡが、このような環境ストレスを植物が受けたときに作用することが知られているからである。特に、乾燥ストレス耐性をもつ植物を本発明により提供することができるため、このような植物を砂漠化した土地などの乾燥地帯に植えることが可能になるだろう。
　本発明を以下の実施例でさらに説明するが、これは単なる例示にすぎないため、本発明の技術範囲はこれらの実施例によって制限されないものとする。
材料と方法
植物材料と生育条件
　植物は１％（ｗ／ｖ）スクロース及び０．８％（ｗ／ｖ）寒天を含有するＭＳ培地か又は土壌中で、２２℃、１６時間明期／８時間暗期サイクルで生育した。ＮｏｓｓｅｎエコタイプのＤｓトランスポゾンタグライン（Ｋｕｒｏｍｏｒｉ　Ｔ，ｅｔ　ａｌ．（２００４）Ｐｌａｎｔ　Ｊ　３７：８９７−９０５）からａｔａｂｃｇ２５−１（１５−０１９５−１）変異体を単離した。ａｔａｂｃｇ２５−２（ＣＳＨＬ＿ＥＴ７１３４）アレルは、ＬａｎｄｓｂｅｒｇエコタイプのＤｓトランスポゾンタグラインであり、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した（Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎ　Ｖ，ｅｔ　ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ９：１７９７−１８１０）。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物のゲノムＤＮＡは、自動ＤＮＡ単離システムＰＩ−５０ａｌｐｈａ（Ｋｕｒａｂｏ）を用いて調製した。また、ＰＣＲによるジェノタイピングは、ＥｘＴａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ）を用いて行った。ａｔａｂｃｇ２５−１の遺伝子型を決定するために、次のプライマーを使用した：１５−０１９５＿５’（５’−ＴＧＴＡＡＴＧＧＧＴＡＡＴＧＣＧＡＴＡＡＡＡ−３’（配列番号３））、１５−０１９５＿３’（５’−ＡＴＣＴＴＴＧＧＴＡＴＴＧＡＡＡＣＣＡＴＧＣ−３’（配列番号４））、及びＤｓ５−３（５’−ＴＡＣＣＴＣＧＧＧＴＴＣＧＡＡＡＴＣＧＡＴ−３’（配列番号５））。ａｔａｂｃｇ２５−２の遺伝子型を決定するために、次のプライマーを使用した：ＥＴ７１３４＿３’（５’ＣＡＣＧＧＣＴＴＡＴＧＡＴＡＣＡＴＴＧＣＴＡＡ−３’（配列番号６））、ＥＴ７１３４＿５’（５’−ＧＡＧＴＧＴＧＴＡＣＡＴＡＣＣＧＧＡＣＧ−３’（配列番号７））及びＤｓ５−３。野生型アレルの存在は、前記挿入部位に隣接する配列に対する遺伝子特異的なプライマー（１５−０１９５＿５’と１５−０１９５＿３¢、或いは、ＥＴ７１３４＿３’とＥＴ７１３４＿５’）を使用するＰＣＲによって検出し、また、その変異型アレルは、Ｄｓ境界域プライマーと遺伝子特異的プライマーの１つとの組合せ（Ｄｓ５−３と１５−０１９５＿５’、或いは、Ｄｓ５−３とＥＴ７１３４＿５’）によって検出した。発芽と緑化（ｇｒｅｅｎｉｎｇ）アッセイのために、滅菌した５０粒の種子を、１％スクロースと種々の濃度のＡＢＡを含有する０．５ｘＭＳ培地プレートに播いた。４℃で４日間、低温処理（ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を行ったのち、胚軸の突出に基づいて発芽をカウントし、完全に緑色の伸長した子葉によって発芽後成長（ｇｒｅｅｎｉｎｇ）をカウントした。独立の３回の実験によって平均と標準偏差（ｓ．ｄ．）を決定した。
遺伝子発現を調べる実験とＧＵＳ染色
　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物からのＲＮＡ抽出には、ＲＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＴ−ＰＣＲは、次のプライマー：ＡｔＡＢＣＧ２５＿ＲＴ−ＰＣＲ＿５’（５’−ＴＴＴＧＧＴＴＣＴＴＧＡＴＧＡＧＣＣＴＡＣＴ−３’（配列番号８））及びＡｔＡＢＣＧ２５＿ＲＴ−ＰＣＲ＿３’（５’−ＡＡＧＴＡＣＴＣＣＣＣＡＡＡＡＧＡＴＧＧＡＴ−３’（配列番号９））を使用し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　Ｏｎｅ　Ｓｔｅｐ　ＲＴ−ＰＣＲ　ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ）を用いて行った。コントロールとしてのＡｃｔｉｎ２転写物は、次のプライマー：Ａｃｔｉｎ２ＲＴ−Ｆ（５’−ＧＡＣＣＴＧＣＣＴＣＡＴＣＡＴＡＣＴＣＧ−３’（配列番号１０））及びＡｃｔｉｎ２ＲＴ−Ｒ（５’−ＴＴＣＣＴＣＡＡＴＣＴＣＡＴＣＴＴＣＴ　ＴＣＣ−３’（配列番号１１））を用いて増幅された。ＧＵＳ染色は、標準プロトコル（Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎ　Ｖ，ｅｔ　ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ９：１７９７−１８１０）に準じて行った。ＧＵＳ染色された植物の観察は、ＳＺ６１実体顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）下で行い、ＤＳ−Ｌ１　ＣＣＤデジタルカメラ（Ｎｉｋｏｎ）を用いてデジタル画像を撮った。より微細な画像は、ＢＸ６０アップライト顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）とＶＢ−７０１０　ＣＣＤカメラ（Ｋｅｙｅｎｃｅ）を用いて写真にした。ＡｔＡＢＣＧ２５プロモーターからのＧＵＳ発現を調べるための形質転換系統については、２ｋｂのＡｔＡＢＣＧ２５プロモーター領域を、次のプロモーター：ＡｔＡＢＣＧ２５ｐｒｏ＿Ｆｏｒｗａｒｄ（５’−ＣＡＣＣＡＴＣＣＡＴＡＴＴＴＴＴＡＴＣＣＴＧＡＴＣＧＴＧＴＴ−３’（配列番号１２））及びＡｔＡＢＣＧ２５ｐｒｏ＿Ｒｅｖｅｒｓｅ（５’−ＡＡＡＧＣＴＧＡＣＡＴＴＡＧＴＧＴＴＣＣＴＴＴＧＴＡ−３’（配列番号１３））とＫＯＤプラスポリメラーゼ（Ｔｏｙｏｂｏ）を使用することによって増幅し、ｐＥＮＴＲ／Ｄ／ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化し、そして、ＧＵＳ融合ベクターｐＢＧＧＵＳ（Ｋｕｂｏ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．（２００５）Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ　１９：１８５５−１８６０）中に組み込んで作製した。ＡＢＡ処理のために、５週齢のｐＡｔＡＢＣＧ２５：：ＧＵＳトランスジェニック植物の葉を１０μＭ　ＡＢＡ中に２４時間浸した。
細胞内局在
　ＡｔＡＢＣＧ２５（Ａｔ１ｇ７１９６０）遺伝子の全長ｃＤＮＡを、ＲＩＫＥＮ　ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ　Ｃｅｎｔｅｒから得た。２００６ｂｐのＡｔＡＢＣＧ２５　ｃＤＮＡを、ＫＯＤプラスポリメラーゼと次のプライマー：ＡｔＡＢＣＧ２５＿Ｆｏｒｗａｒｄ（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＴＣＡＧＣＴＴＴＴＧＡＣＧＧＣ−３’（配列番号１４））及びＡｔＡＢＣＧ２５＿Ｒｅｖｅｒｓｅ（５’−ＣＣＴＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＴＴＡＴＴＴＡＡＴＧＴＴ−３’（配列番号１５））を用いて増幅し、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター中にクローン化した。このクローン（ｐＥＮＴＲ−ＡｔＡＢＣＧ２５）の配列を確認し、ＬＲクロナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＹＦＰ融合タンパク質ベクターｐＨ３５ＹＧ（Ｋｕｂｏ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．（２００５）Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ１９：１８５５−１８６０）中に組み込んだ。一過性の発現を調べるために、タマネギ（Ａｌｌｉｕｍ　ｃｅｐａ）の内部表面をＭＳ培地に置き、ヘリウム遺伝子銃（ｈｅｌｉｕｍ　ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ　ｄｅｖｉｃｅ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　ＰＤＳ−１０００）を用い、このとき１３５０ｐｓｉ（１０．７ＭＰａ）の圧力で１．５ｍｇの１μｍ金粒子上にコートした０．１５μｇのプラスミドＤＮＡを、説明書に従って使用した。約１６時間のインキュベーションの後に、タマネギの表皮を剥ぎ取り、ＬＳＭ　５１０　ＭＥＴＡ共焦点レーザー走査型顕微鏡（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ）下で黄色蛍光を調べた。本発明者らはさらに、ｐＨ３５ＹＧからなるＹＦＰ融合タンパク質構築ベクターを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ仲介形質転換系を用いてＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓに導入した。その後、トランスジェニック植物の根を０．５Ｍマンニトールで２０分間処理して細胞の原形質分離を行った。
ＡｔＡＢＣＧ２５を発現するＳｆ９昆虫細胞からの膜小胞の調製とイムノブロッティング
　ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＴＭ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ　ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を用いて組換えバキュロウイルスを作製した。Ｓｆ９昆虫細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）をウイルスに感染させ、ＳＦ９００−ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、２７℃で７２時間、振とう型インキュベーター内で培養した。細胞を、１，１００×ｇ、１０分の遠心分離により回収し、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，３ｍＭ　ＣａＣｌ２，２ｍＭ　ＭｇＣｌ２，０．１ｍＭ　ＥＧＴＡ及び１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中、窒素キャビテーションによって破壊した。破壊されなかった細胞、核破片及びミトコンドリアは、２，６００×ｇ、１０分の遠心分離でペレット化された。上清は、１００，０００×ｇで３０分間遠心分離にかけられ、そのペレットは、７０ｍＭ　ＫＣｌ，７．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ　ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）中に再懸濁された。膜小胞は、使用するまで、ディープフリーザー中で凍結保存された。ＢＣＡ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用い、またコントロールとしてウシ血清アルブミンを用いてタンパク質濃度を測定した。Ｓｆ９細胞中のＡｔＡＢＣＧ２５タンパク質産生をウエスタンブロット分析によって確認するために、抗ＡｔＡＢＣＧ２５抗体を、合成ペプチド（Ｏｐｅｒｏｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をウサギに免疫することによって得た。この合成ペプチドは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ＡｔＡＢＣＧ２５タンパク質の３種類の１２~１４アミノ酸残基で、すなわち、６９~８２位（ＱＫＰＳＤＥＴＲＳＴＥＥＲＴ）、１３２~１４３位（ＧＫＩＴＫＱＴＬＫＲＴＧ）及び３２８~３４０位（ＧＶＴＥＲＥＫＰＮＶＲＱＴ）から設計されたものからなった。４％ＳＤＳを用いて膜タンパク質を可溶解化し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。タンパク質をポリビニリデンジフルオライド膜に転写し、ウサギ抗ＡｔＡＢＣＧ２５抗体と西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ロバ抗ウサギＩｇＧを用いて精査した。化学ルミネッセンス検出システム（ＥＣＬ−ｐｌｕｓ，Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、オートラジオグラフィーフィルムに露出することによって特異的免疫反応性のタンパク質を検出した。
小胞輸送アッセイ
　迅速ろ過技術（Ｏｔｓｕｋａ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　１０２：１７９２３−１７９２８）を用いて膜輸送実験を行った。簡単に説明すると、１５μｇの膜タンパク質、４ｍＭアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）及び１μＭ　ＡＢＡを含有し、その中に２２ｎＭ　ＤＬ−ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−［Ｇ−３Ｈ］アブシジン酸（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含む１００μＬの輸送培地（７０ｍＭ　ＫＣｌ，７．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ　ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．０）を２７℃でインキュベートした。輸送培地を０．４５μｍニトロセルロースフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通してろ過し、氷冷した停止バッファー（７０ｍＭ　ＫＣｌ，７．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ　ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．０）６ｍＬで洗浄した。フィルター上に残った放射能を液体シンチレーションカウンター（Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ２８００ＴＲｓ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて測定した。ベクターのみを含むＳｆ９細胞からの膜小胞をコントロールとして用いた。
過剰発現Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物及びサーモグラフィー画像化
　３５Ｓ：：ＡｔＡＢＣＧ２５プラスミドを作製するために、ＡｔＡＢＣＧ２５の全長ｃＤＮＡを含むクローン（ｐＥＮＴＲ−ＡｔＡＢＣＧ２５）を過剰発現ベクターｐＧＷＢ２中に組み込んだ。このベクターでは、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ部位をｐＢＥ２１１３Ｎ（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ　Ｉ，ｅｔ　ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　３７：４９−５９）の３５Ｓプロモーターによって置換した。３５Ｓ：：ＡｔＡＢＣＧ２５プラスミドをエレクトロポレーションによってＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＧＶ３１０１中に導入し、フローラルディッピング法によってトランスジェニック植物を作製した。Ｔ２植物体のうち過剰発現する系統を、ＲＴ−ＰＣＲで調べることによって選択した。自家受粉後、Ｔ３種子を次の実験のために使用した。Ｎｅｏ　Ｔｈｅｒｍｏ　ＴＶＳ−７００赤外線カメラ（Ｎｉｐｐｏｎ　Ａｖｉｏｎｉｃｓ）を用いてサーモグラフィー画像を得た。その後、画像をＰＥ　Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌソフトウエア（Ｎｉｐｐｏｎ　Ａｖｉｏｎｉｃｓ）によって解析した。水を充分に与えた条件（２２℃，６０~７０％相対湿度，１６時間の明期（ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄ））下、土壌で植物を生育した。
過剰発現Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物の乾燥ストレスアッセイ
　植物育成室で同じバットの中で、土壌で生育させた６週齢の植物体を、水の入っていないバットに移し変え、その後１４日間水を与えずに水切り処理した。その後、再吸水させて５日後の植物を観察して生育率を測定した。
結果と考察
ＡｔＡＢＣＧ２５遺伝子とａｔａｂｃｇ２５変異体アレルの同定
　ＡＢＡ応答に関連した新規の変異体を得る目的で、本発明者らは、トランスポゾンタグラインコレクションからＡＢＡ関連変異体を選別した。これまで、本発明者らは、Ａｃｔｉｖａｔｏｒ（Ａｃ）／Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（Ｄｓ）系を用いてＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの約１２，０００のトランスポゾンタグ化系統を作出し、全系統においてＤｓエレメントに隣接する配列を決定した（Ｋｕｒｏｍｏｒｉ　Ｔ，ｅｔ　ａｌ．（２００４）Ｐｌａｎｔ　Ｊ　３７：８９７−９０５）。この中から、本発明者らは、システム化された表現型分析（フェノーム解析）を行うために、Ｄｓトランスポゾンが遺伝子コード領域内に挿入されたホモ挿入系統を選別した（Ｋｕｒｏｍｏｒｉ　Ｔ，ｅｔ　ａｌ．（２００６）Ｐｌａｎｔ　Ｊ　４７：６４０−６５１）。約２，０００個のホモ挿入系統に関して、９６ウエルマルチタイタープレートを用いるハイスループットスクリーニング法を行い、発芽及び幼植物体の段階でＡＢＡ感受性表現型を示す１つの変異体系統を単離した（図１Ａ）。Ｄｓ挿入部分のゲノム配列によれば、この単離した系統（１５−０１９５−１）は、Ａｔ１ｇ７１９６０遺伝子の遺伝子コード領域（ＯＲＦ）の第２イントロン中にＤｓエレメントが挿入されていた（図１Ｂ）。
　Ａｔ１ｇ７１９６０遺伝子は、ＡｔＡＢＣＧ２５（ＡｔＷＢＣ２６としても報告がある）をコードし、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓゲノム中でＡＢＣ（ＡＴＰ結合カセット）トランスポーターのＡＢＣＧサブファミリーのメンバーである（Ｖｅｒｒｉｅｒ　ＰＪ，ｅｔ　ａｌ．（２００８）Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ１３：１５１−１５９）。最初に得られた上記変異体をａｔａｂｃｇ２５−１と称した。ａｔａｂｃｇ２５−２と称した変異体ＣＳＨＬ＿ＥＴ７１３４は、ＡｔＡＢＣＧ２５の第３エクソン中にＤｓ挿入体を有しており、マルチタイタープレートアッセイでａｔａｂｃｇ２５−１と同じ表現型を示した（図１Ａ）。Ｔ−ＤＮＡ挿入系統から、さらに２つのアレルもＡＢＡ感受性表現型を示し（図６）、このことはＡｔＡＢＣＧ２５の変異がＡＢＡ感受性表現型の原因であることを示している。ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）分析により、ａｔａｂｃｇ２５−２のホモ挿入変異系統は検出可能な量の転写体を全く含まないことを示し、したがってこの変異体は遺伝子ノックアウト体であることが明示された（図１Ｃ）。ａｔａｂｃｇ２５−１も同様にノックアウト変異体であるがＲＴ−ＰＣＲにより非常にかすかなバンドを示した（図１Ｃ）。これはおそらく、比較的長いイントロンのなかに挿入変異があるためであろう（図１Ｂ）。すべてのａｔａｂｃｇ２５変異体が、成長の初期段階の間にＡＢＡ感受性表現型を示した（図１Ｄ~１Ｆ及び図６）。
植物器官のＡｔＡＢＣＧ２５遺伝子発現パターン
　ＡｔＡＢＣＧ２５の遺伝子発現パターンを調べる目的で、ＲＴ−ＰＣＲを行って野生型組織での発現パターンを確定した。野生型の幼植物体、根、茎、葉、花及び実からＲＮＡを抽出した。ＡｔＡＢＣＧ２５の転写物は上記のすべての組織から増幅することができた（図２Ａ）。さらに組織特異的発現を分析するために、約２ｋｂのＡｔＡＢＣＧ２５プロモーター（ｐＡｔＡＢＣＧ２５）領域を用いてＧＵＳレポーターの発現を調べた。ｐＡｔＡＢＣＧ２５：：ＧＵＳトランスジェニック植物を作製し、形質転換体のＧＵＳ活性が主として胚軸、根、及び葉の葉脈内で検出された（図２Ｂ~２Ｇ）。ＡｔＡＢＣＧ２５のＡＢＡ誘導性をチェックするために、ｐＡｔＡＢＣＧ２５：：ＧＵＳトランスジェニック植物をＡＢＡ溶液で処理し、ＧＵＳ染色した。形質転換体のＧＵＳレポーターの発現レベルは、ＡＢＡ処理によって増大した（図２Ｂ~２Ｇ）。さらに、エンハンサー−トラップ系（Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎ　Ｖ，ｅｔ　ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ　９：１７９７−１８１０）としてＤｓエレメント中にＧＵＳレポーター遺伝子を含むａｔａｂｃｇ２５−２変異体を染色した。ａｔａｂｃｇ２５−２のＧＵＳシグナルは維管束組織内で観察され（図７Ａ）、並びに、根の中心部の維管束に沿って検出された（図７Ｂ）。染色した葉の断面が見えるように切断すると、シグナルは葉脈に近い領域に蓄積していた（図７Ｃ）。興味深いことに、ＡＢＡを生合成する酵素類は維管束にある細胞（ｖａｓｃｕｌａｒ　ｐａｒｅｎｃｈｙｍａ　ｃｅｌｌｓ）内で発現しており、それらの遺伝子発現は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいてストレス条件下で増加した（Ｃｈｅｎｇ　ＷＨ，ｅｔ　ａｌ．（２００２）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　１４：２７２３−２７４３；Ｋｏｉｗａｉ　Ｎ，ｅｔ　ａｌ．（２００４）Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　１３４：１６９７−１７０７；Ｅｎｄｏ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．（２００８）Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　１４７：１９８４−１９９３）。これらの結果から、ＡｔＡＢＣＧ２５が、その生合成の部位でＡＢＡ応答に重要な役割を果たしていることが示唆された。
ＡｔＡＢＣＧ２５タンパク質の細胞内局在
　ＡｔＡＢＣＧ２５タンパク質の細胞内局在を調べるために、本発明者らは、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターの制御下で産生されるＡｔＡＢＣＧ２５タンパク質と黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）との融合ベクターを構築した。ＡｔＡＢＣＧ２５の遺伝子コード領域（ＯＲＦ）を、３５Ｓ：：ＹＦＰの下流に配置した。３５Ｓ：：ＹＦＰ−ＡｔＡＢＣＧ２５組換え遺伝子を、パーティクルガン法により、タマネギ表皮細胞内で一過的に発現させた。融合タンパク質の細胞内局在を、該タマネギ細胞内の黄色蛍光シグナルを共焦点画像化によって視覚化した。ＹＦＰ−ＡｔＡＢＣＧ２５組換えタンパク質の黄色蛍光は、タマネギ表皮細胞内の細胞表面の周囲に存在していた（図３Ａ及び図８）が、実験対照としてのＹＦＰのみのシグナルは該細胞内全体に広がっていた（図３Ｂ）。次に、３５Ｓ：：ＹＦＰ−ＡｔＡＢＣＧ２５組換えベクターをＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ野生型植物中に形質転換した。一過的発現実験の結果と同じく、ＹＦＰ−ＡｔＡＢＣＧ２５を発現するトランスジェニック植物の根端の細胞表面にシグナルが観察された（図３Ｃ）。根端細胞は大きな液胞を含まないことが特徴であり（Ｓｈｉ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．（２００２）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　１４：４６５−４７７）、黄色蛍光は、原形質膜上の、しかしトノプラスト又は細胞質ではないというＹＦＰ−ＡｔＡＢＣＧ２５の局在を反映している。ＹＦＰ−ＡｔＡＢＣＧ２５が細胞壁に局在する可能性を排除するために、高浸透圧条件下の原形質分離（ｐｌａｓｍｏｌｙｓｉｓ）後に根端細胞を観察した。マンニトール処理により原形質分離された根端細胞中の蛍光は、細胞壁から離れて観察された（図３Ｄ）。これらの結果は、ＡｔＡＢＣＧ２５タンパク質が原形質膜に局在するタンパク質であることを示唆した。
ＡｔＡＢＣＧ２５遺伝子産物の機能解析
　ＡｔＡＢＣＧ２５が細胞膜を介してＡＢＡを輸送することができる可能性を追求するために、本発明者らは、小胞輸送アッセイを試みた。再生された膜はインサイド−アウト（反転）膜小胞を含んでいるので、本来排出する活性を、取り込まれたシグナルとして検出することが可能である。小胞膜は、ＡｔＡＢＣＧ２５　ｃＤＮＡが組み込まれたウイルスベクターによってトランスフェクトされたＳｆ９昆虫細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）から作成された。ＡｔＡＢＣＧ２５抗体を使用するウエスタンブロッティングによってＡｔＡＢＣＧ２５タンパク質の発現を確認した（図４Ａ）。本発明者らは、放射性同位体ラベルしたＡＢＡの取り込みがＡＴＰの添加の際に有意に促進されることを見出した（図４Ｂ）。ＡＢＡのＡＴＰ依存性取り込みは、Ｋｍ値２３０ｎＭ及びＶｍａｘ値６．２ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇタンパク質の飽和速度（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を示した（図４Ｄ）。これに対して、ＡＤＰもＡＭＰもともにＡＢＡの取り込みを促進させなかった（図４Ｄ）。さらに、ＡＤＰはＡＴＰ依存性のＡＢＡ取り込みを阻害したが、ＡＭＰは阻害作用を示さなかった（図４Ｄ）。ＡＢＣトランスポーターの有効な阻害剤であるバナジン酸塩もまた、ＡＴＰ依存性のＡＢＡ取り込みを阻害した（図４Ｄ）。Ｃｉｓ−阻害を行って基質特異性を評価した（図４Ｅ）。本発明者らは、ＡＴＰ依存性のＡＢＡ取り込みが１０倍濃度の（＋）ＡＢＡにより抑制されるが、（−）ＡＢＡには影響されないことを見出した。種々の植物ホルモンが、アニオン性又はカチオン性化合物と同様に、ＡＴＰ依存性のＡＢＡ取り込みにほとんど、或いは、全く阻害作用を示さなかった（図４Ｅ）。これらの結果を合わせると、ＡｔＡＢＣＧ２５タンパク質がＡＢＡ輸送を行っており、かつ、該タンパク質が（−）ＡＢＡではなくむしろ（＋）ＡＢＡに作用することを示している。
ＡｔＡＢＣＧ２５の過剰発現及びＡＢＡ応答性に対する影響
　もしＡｔＡＢＣＧ２５がＡＢＡ輸送の排出因子であるとすれば、ＡｔＡＢＣＧ２５の過剰発現がＡＢＡシグナル伝達に影響を与えるはずである。この考えを評価するために、本発明者らは、３５Ｓ：：ＡｔＡＢＣＧ２５構築ベクターを有するトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物を作製した（図５Ａ）。ＡＢＡ応答性を調べるために、取得したトランスジェニック系統から得たＴ３種子を用いて、発芽後成長のＡＢＡ阻害について試験した。発芽後成長のＡＢＡ阻害の割合は、ＡｔＡＢＣＧ２５トランスジーンを発現する３種類の独立のトランスジェニック系統において有意に減少し（図５Ｂ及び５Ｃ）、このことは、ＡｔＡＢＣＧ２５がＡＢＡ排出因子として機能するという仮説を支持している。
　ＡＢＡは、孔辺細胞に直接作用して気孔閉鎖を誘導する（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ　ＪＩ，ｅｔ　ａｌ．（２００１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　５２：６２７−６５８）。したがって、本発明者らはさらに、ＡｔＡＢＣＧ２５過剰発現植物の気孔調節に関係する表現型（ａｅｒｉａｌ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ）を調べた。その結果、本発明者らは、トランスジェニック植物の葉の温度が野生型植物のものより高いことを見出し（図５Ｄ）、このことは、ＡｔＡＢＣＧ２５過剰発現植物では、葉からの水分蒸散が抑制されたことを示唆している。本発明者らはまた、トランスジェニック植物から切り取った葉の水分損失が野生型植物のものより遅いことを見出した（図９）。さらに、乾燥処理を行うことで、対照植物（６個対中１個体、１６．７％）よりＡｔＡＢＣＧ２５過剰発現植物（１０個対中８個体、８０．０％）の方が、乾燥処理後の植物体の生育率が高いことを見出した（図１０）。これらの結果は、ＡｔＡＢＣＧ２５がＡＢＡ輸送体（ｅｘｐｏｒｔｅｒ）であるという考えと一致する。ＡｔＡＢＣＧ２５過剰発現細胞ではその孔辺細胞の周りの細胞壁間領域（ａｐｏｐｌａｓｔｉｃ　ａｒｅａ）にＡＢＡが蓄積する可能性がある。
ＡｔＡＢＣＧ２５はＡＢＡのトランスポーターである
　この研究のなかで、本発明者らは、ＡＢＡ感受性についてのスクリーニングによってａｔａｂｃｇ２５変異体を初めて単離し、ＡｔＡＢＣＧ２５が、ＡＢＡが植物内で主に生合成される維管束組織（Ｃｈｅｎｇ　ＷＨ，ｅｔ　ａｌ．（２００２）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　１４：２７２３−２７４３；Ｋｏｉｗａｉ　Ｎ，ｅｔ　ａｌ．（２００４）Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ１３４：１６９７−１７０７；Ｅｎｄｏ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．（２００８）Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　１４７：１９８４−１９９３）で主として発現されることを見出した。さらに、蛍光タンパク質を融合したＡｔＡＢＣＧ２５タンパク質が植物細胞内の原形質膜に局在することを見出した。生化学的分析により、ＡｔＡＢＣＧ２５がＡＢＡ分子を輸送する能力をもつことが示された。また、ＡｔＡＢＣＧ２５を過剰発現した植物は、幼植物体の段階で、外因性ＡＢＡに対し非感受性を示した。さらに、ＡｔＡＢＣＧ２５を過剰発現する植物は、葉の温度が高く、切り取った葉からの水分蒸散を遅らせることを示し、この因子が気孔の調節に影響することが示唆された。これらの結果から、ＡｔＡＢＣＧ２５がＡＢＡ輸送機構の機能的な因子の１つであると考えられ、おそらく、細胞膜を介して植物細胞の外にＡＢＡを輸送させることを促進させる因子であることを示している。この知見は、植物細胞にＡＢＡ輸送機構が存在することを明らかにし、ＡＢＡ調節ネットワークにおけるＡＢＡ輸送の細胞間調節に対し新しい洞察を与えるだろう。
　ＡｔＡＢＣＧ２５過剰発現植物と対照的に、孔辺細胞などの地上部器官（ａｅｒｉａｌ　ｏｒｇａｎｓ）における表現型は、ａｔａｂｃｇ２５ノックアウト変異体では全く見られなかった。本発明者らは、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓはＡｔＡＢＣＧ２５の機能を補助する別の因子をもつだろうと推定した。重複遺伝子のほかに、他のハーフサイズ（ｈａｌｆ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ）ＡＢＣトランスポーターと組み合わせたＡｔＡＢＣＧ２５の作用が特に興味深いが、その理由は、ハーフサイズＡＢＣトランスポーターがダイマー複合体として働くことが分かっているからである（Ｓａｍｕｅｌｓ　Ｌ，ｅｔ　ａｌ．（２００８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌ　５９：６８３−７０７；Ｇｒａｆ　ＧＡ，ｅｔ　ａｌ．（２００３）Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２７８：４８２７５−４８２８２）。本発明者らの結果は、ＡｔＡＢＣＧ２５がＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいてＡＢＡの機能的なトランスポーターの１つであることを支持している。ＡＢＡは重要な植物ホルモンであり、遠隔の細胞に影響を及ぼすと考えられる（Ｃｈｅｎｇ　ＷＨ，ｅｔ　ａｌ．（２００２）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　１４：２７２３−２７４３；Ｋｏｉｗａｉ　Ｎ，ｅｔ　ａｌ．（２００４）Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　１３４：１６９７−１７０７；Ｅｎｄｏ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．（２００８）Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　１４７：１９８４−１９９３；Ｃｈｒｉｓｔｍａｎｎ　Ａ，Ｗｅｉｌｅｒ　ＥＷ，Ｓｔｅｕｄｌｅ　Ｅ，Ｇｒｉｌｌ　Ｅ（２００７）Ｐｌａｎｔ　Ｊ　５２：１６７−１７４；Ｓｃｈａｃｈｔｍａｎ　ＤＰ，Ｇｏｏｄｇｅｒ　ＪＱＤ（２００８）Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ　１３：２８１−２８７；Ｏｋａｍｏｔｏ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．（２００９）Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　１４９：８２５−８３４）が、ＡＢＡ輸送の原因となる遺伝子は、あらゆる植物でこれまで同定されていなかった。ＡｔＡＢＣＧ２５を同定することは、植物でのＡＢＡ輸送系を理解するための手がかりとなるし、また、ストレス応答や植物体の発達における植物器官同士の間のＡＢＡシグナル伝達を調べるための新しい見識となるだろう。
　さらに、上記の知見を支持する又は補強するための実験を行い、その結果を図１３~図１５に示した。
　図１３は、３５Ｓ：：ＡｔＡＢＣＧ２５トランスジェニック植物系統ＯＥ−４１及び対照植物（Ｃｏｌ．）（各４週齢）のロゼット葉について、ＳＵＭＰ（Ｓｕｚｕｋｉ’ｓ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｍｅｔｈｏｄ　Ｏｆ　Ｐｒｉｎｔｉｎｇ）法で測定した気孔開度（μｍ）を示す。この図の結果は、ＡｔＡＢＣＧ２５過剰発現植物の成熟葉では、対照植物と比べて気孔開度が少ないことを示している。
　図１４は、ＡｔＡＢＣＧ２５過剰発現植物（ＯＥ）において、野生型植物（ＷＴ）と同様に、気孔の開閉がＣＯ２濃度及び明暗条件によって変化することを示す。
　図１５は、ＡｔＡＢＣＧ２５がアブシジン酸（ＡＢＡ）シグナル経路に関連していることを遺伝学的に証明したデータである。この実験によってＡＢＡシグナル経路においてＡｔＡＢＣＧ２５がＮＣＥＤ３の下流にあることが証明された。
　上記の実施例では、シロイヌナズナ植物を中心に植物で外因性のＡＢＡ輸送タンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡを過剰発現させることで、植物に環境ストレス耐性を付与することができることを証明したが、イネをはじめとする他の植物種でも、明細書及び実施例に記載した手法によって同様の効果を有する形質転換植物を容易に作出することができる。
　本発明は、環境ストレス耐性の植物を提供するため、とりわけ農業、林業、製紙業などの産業分野で利用可能である。
配列番号３~１５：プライマー
配列番号１６~１８：合成ペプチド
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (10)

  1. 　外因性のアブシジン酸（ＡＢＡ）輸送タンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に含むことを特徴とする、ここで、該ＡＢＡ輸送タンパク質はＡＢＡを細胞膜を介して細胞外に排出させる生物学的活性をもつタンパク質である、環境ストレス耐性の形質転換植物。
  2. 　ＡＢＡ輸送タンパク質をコードするＤＮＡが、以下の（ａ）~（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチド（ＤＮＡ）である、請求項１に記載の形質転換植物。
    （ａ）シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）由来の配列番号２に示されるアミノ酸配列又はイネ由来の配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡ
    （ｂ）他の植物由来の（ａ）の該タンパク質のホモログのアミノ酸配列でありかつＡＢＡ輸送活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ
    （ｃ）該配列番号２又は配列番号２０のアミノ酸配列又は該ホモログのアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有しかつＡＢＡ輸送活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ
    （ｄ）該配列番号２又は配列番号２０のアミノ酸配列又は該ホモログのアミノ酸配列において１若しくは複数の、好ましくは１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有しかつＡＢＡ輸送活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ
  3. 　配列番号２又は配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡがそれぞれ、配列番号１又は配列番号１９に示されるＡＢＡ輸送タンパク質コード配列を含むＤＮＡである、請求項２に記載の形質転換植物。
  4. 　環境ストレス耐性が、乾燥ストレス耐性である、請求項１~３のいずれか１項に記載の形質転換植物。
  5. 　植物が双子葉又は単子葉植物である、請求項１~４のいずれか１項に記載の形質転換植物。
  6. 　請求項１~５のいずれか１項に記載の形質転換植物の環境ストレス耐性後代。
  7. 　請求項１~５のいずれか１項に記載の形質転換植物又は請求項６に記載の後代の細胞、組織又は種子。
  8. 　外因性のＡＢＡ輸送タンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡを発現可能に含むことを特徴とする環境ストレス耐性の形質転換植物の作出方法であって、該ＤＮＡを植物細胞又はカルスに発現可能なように導入し、該植物細胞又はカルスから植物体を再生することを含む、ここで、該ＡＢＡ輸送タンパク質はＡＢＡを細胞膜を介して細胞外に排出させる生物学的活性をもつタンパク質である、上記方法。
  9. 　植物又はその細胞に、外因性のＡＢＡ輸送タンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡを発現可能に含むように導入し、それによって植物に環境ストレス耐性を付与することを含む、ここで、該ＡＢＡ輸送タンパク質はＡＢＡを細胞膜を介して細胞外に排出させる生物学的活性をもつタンパク質である、植物に環境ストレス耐性を付与する方法。
  10. 前記ＤＮＡが請求項２又は３に定義されるＤＮＡである、請求項８又は９に記載の方法。
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