WO2011077402A2 - Polymere amphiphile fonctionnalise par la methionine - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to novel amphiphilic polymers with a hydrophilic backbone and bearing hydrophobic groups including methionine groups.
  • amphiphilic polymers are capable, according to their chemical structures, of forming nanoparticles of variable size in an aqueous medium.
  • polymers whose skeleton is linear, hydrophilic and bearing hydrophobic side groups can easily form nanoparticles in water.
  • These nanoparticles depending on the base material used for their manufacture, can be biocompatible and possibly biodegradable. They find applications especially in the field of medicine for the vectorization of drugs.
  • TECNOLOGIES describes polymers of glutamic acid comprising alpha-tocopherol grafts which form in water nanoparticles capable of associating insulin.
  • formulations produced with these nanoparticles and proteins such as interferon alpha or interleukin 2 allow, after a subcutaneous injection in humans, obtain measurable plasma concentrations for a duration of at least one week.
  • amphiphilic polymers based on pullulan and comprising cholesterol grafts assemble in an aqueous medium to form nanoparticles that are capable of reversibly associating proteins such as insulin (Akiyoshi et al. J. Controlled Release 1998, 54, 313-320).
  • Other analogous polymers based on chitosan or dextran have been developed in particular in order to obtain films or implants of hydrogels (WO 00/14155).
  • amphiphilic polymers in the field of protein and peptide formulation are numerous.
  • amphiphilic polymer / protein formulations that are stable in aqueous medium for at least two years at 5 ° C. is a major challenge, especially with regard to the vulnerability of certain therapeutic proteins to oxidation.
  • certain amino acids such as methionine, cysteine, histidine or tryptophan, components of many proteins or enzymes, can oxidize during the formulation thereof, or even over time.
  • this oxidation phenomenon can have adverse consequences on the biological activity of the active ingredients containing these amino acids (Cleland et al., Crit Rev. Ther., Drug Carrier Systems 1993, 10, 307-377).
  • Takruri US Pat. No. 5,272,1305 proposed in 1993 to use the proteins or enzymes containing methionine in their sequence by formulating them with methionine.
  • This concept is now well known to those skilled in the art of stabilizing formulations containing proteins.
  • patent application WO 2008/145323 describes an interferon alpha formulation containing from 2 to 75 mM methionine and the application US 2003/0104996 describes formulations of erythropoietin (EPO) or hyperglycosylated erythropoietin (NESP). whose degradation is limited by the addition of a quantity of methionine up to 50 mM.
  • EPO erythropoietin
  • NESP hyperglycosylated erythropoietin
  • the amount of methionine to be associated with the protein or enzyme to ensure that it is stable to oxidation is of course liable to vary according to the nature of the protein, its concentration, the pH and other elements of the formulation.
  • this protein or peptide is already implemented in a form associated with an amphiphilic polymer as defined above, the effectiveness of methionine can be impaired.
  • the added methionine can lose its effectiveness because it can not be distributed homogeneously and perennially in the implant or the freeze.
  • the present invention aims precisely to compensate for the aforementioned shortcomings.
  • the present invention aims to provide a new type of amphiphilic polymer, capable of being used as a carrier of an active agent, and more particularly of the protein, peptide or enzyme type naturally sensitive to a phenomenon of oxidation, and which is precisely able to guarantee such an asset stability against this phenomenon.
  • polymers are additionally associative and, as such, can be used as delivery vectors. active ingredients, and therefore manifest an ability to associate easily with many active ingredients and to release them in vivo.
  • the present invention aims, according to one of its aspects, an amphiphilic polymer having a hydrophilic backbone, characterized in that said backbone carries at least one methionine side group or one of its derivatives and hydrophobic side groups. separate from said methionine or one of its derivatives.
  • the methionine group (s) and / or hydrophobic groups are arranged randomly.
  • the present invention relates to the use of a polymer as defined above for the vectorization of active principles, PA, in particular proteins, or peptides sensitive to oxidation.
  • nanoparticles comprising at least one polymer according to the invention, in association or not with an active principle.
  • the present invention aims a composition containing a polymer according to the invention and an active ingredient, organized or not in the state of nanoparticles.
  • methionine will, unless otherwise specified, be used to designate either the methionine residue or a derivative thereof, especially as defined below.
  • association or “associate” used to describe the interaction between one or more active ingredients and the polymers considered according to the invention mean, in particular, that the the active ingredients are bound to the polymer (s), in particular by a hydrophobic and / or electrostatic interaction, and / or are solubilized by the polymer (s).
  • lateral or “lateral” means that the hydrophobic groups and methionines are arranged to include pendant groups or “grafts" at the level of the linear backbone.
  • the term "random" is meant to mean that the monomer unit or units of the amphiphilic polymer of the invention carrying the methionine group (s) and the group carrier (s). (s) hydrophobic (s) are distributed unevenly within the hydrophilic backbone, regardless of the nature of the adjacent units.
  • the merit of the applicant company it is the merit of the applicant company to have developed a new family of amphiphilic polymers capable of forming stable nanoparticulate systems and whose hydrophilic skeleton comprises firstly one or more grafts lateral methionine, and on the other hand several distinct hydrophobic side groups of methionine.
  • methionine in the form of graft (s) at an amphiphilic polymer makes it possible to confer on said polymer a significant antioxidant activity, without otherwise affecting its ability, on the one hand to associate with an active ingredient and, on the other hand, to organize in the state of nanoparticles when it is placed in the presence of an aqueous medium.
  • the polymer considered according to the invention is advantageously suited to an adjustment in terms of antioxidant activity with regard to its degree of methionine grafting.
  • This possibility of modulating the degree of grafting of methionine is particularly appreciable in that it makes it possible to adjust the antioxidant activity of the polymer according to the invention as a function of the sensitivity to oxidation of the protein or peptide. to be stabilized by said polymer.
  • amphiphilic polymer considered according to the invention has a hydrophilic backbone.
  • the polymers considered according to the invention have a polymeric backbone soaked in water, especially at a pH of between 5 and 8.
  • This backbone may especially be chosen from a polymer or copolymer belonging to the family of polyamino acids, polysaccharides, polyacrylates or polymethacrylates. Are particularly suitable for this purpose,
  • polyamino acids such as poly (glutamic acid) (alpha or gamma type), poly (aspartic acid) (alpha or alpha / beta type), polylysines (alpha type) or copolymers formed by combinations of these same amino acids,
  • polysaccharides such as dextran or one of its derivatives such as carboxymethyl dextran or hydroxyethyl dextran or pullulans.
  • the hydrophilic backbone of the amphiphilic polymer of the invention is a polyamino acid chosen from polyglutamic acid, polyaspartic acid, polylysines, or their copolymers.
  • polymers that can be used according to the invention for example of the poly (alpha-L-glutamic acid), poly (alpha-D-glutamic acid), poly (gamma-L-glutamic acid) and poly (alpha-L) type can be used.
  • -lysine of variable masses are commercially available.
  • the polymers capable of forming the hydrophilic backbone of the amphiphilic polymers of the invention may also be obtained by methods known to those skilled in the art.
  • an alpha-type sodium polyglutamate can be carried out via the polymerization of N-carboxy-amino acid anhydrides (NCA), as described, for example, in the article "Biopolymers, 1976,” 1869 and HR Kricheldorf's "Alpha-Aminoacid-N-Carboxy Anhydride and related Heterocycles" Springer Verlag (1987)
  • the polymers are then hydrolysed under appropriate conditions to obtain the polymer in its acid form.
  • linear polymers having a hydrophilic backbone are grafted at the same time or sequentially with the hydrophobic group (s) and the methionine (s) or methionine derivative (s).
  • hydrophobic groups and methionine groups are grafted at the same time or sequentially with the hydrophobic group (s) and the methionine (s) or methionine derivative (s).
  • the polymers of the invention are grafted with at least one group for methionine (GM) and pendant hydrophobic groups different from methionine (GH).
  • methionine derivative is intended more particularly to designate substitution derivatives, especially at the level of the amine or carboxylic function of methionine.
  • methionine amide or the ethyl ester of methionine.
  • methionine has two reactive functions - carboxylic acid and primary amine - and according to the coupling reaction implemented, one or the other of the functions must be protected.
  • the methionine that can be used in the polymers of the invention may be of L, D configuration or a racemic mixture.
  • the binding function is amide or ester type.
  • the methionine group once grafted onto the polymer, generally has one of the following three structures:
  • Ra represents a hydroxyl group (optionally deprotonated), NH 2 , OMe, OEt, NHCH 3 or N (CH 3 ) 2 ,
  • Rb and Rc independently represent a hydrogen atom, a methyl or an ethyl, with when one of the groups Rb and Rc is a hydrogen atom, then the other group represents an acyl group of Ci to C 6 , and the configuration of the methionine may be L, D or a racemic mixture.
  • hydrophobic groups are, in practice and without being limiting, chosen from the group comprising alcohols and amines, these compounds being able to be easily functionalized by one skilled in the art, and their grafting implementing analogous reactions those required for the methionine derivative.
  • the hydrophobic group (GH) comprises from 5 to 30 carbon atoms.
  • hydrophobic groups are advantageously and judiciously selected from the group comprising:
  • alkylaryls or arylalkyls optionally containing at least one unsaturation and / or at least one heteroatom
  • the C 10 to C 30 (poly) cyclic compounds optionally comprising at least one unsaturation and / or at least one heteroatom.
  • hydrophobic groups may be, for example, groups chosen from the group comprising:
  • hydrophobic amino acid such as leucine, valine, phenylalanine, tryptophan or tyrosine or a derivative thereof.
  • the hydrophobic group is an amino acid
  • it may be a derivative corresponding to one of the structures below (IV), (V) or (VI) in which Ra, Rb and Rc correspond to the definitions given above and Rd corresponds to to an amino acid residue depending on the type of polymer and the grafting reaction carried out.
  • the methionine (s) or methionine derivative (s) and / or the hydrophobic groups may be bonded to the polymeric backbone via a spacer allowing them to be connected to the polymer chain.
  • This spacer is advantageously divalent and belongs to the group comprising, in particular, the amino acid units, the aminoalcohol derivatives, the diamine derivatives, the diol derivatives and the hydroxy acid derivatives.
  • the hydrophilic backbone of the amphiphilic polymer is a sodium poly (L) glutamate
  • the hydrophobic group is a tocopheryl group of synthetic origin and, preferably, the methionine derivative is methionine amide. or the ethyl ester of methionine.
  • amphiphilic polymers of the invention can be schematized by the fact that they are formed of a sequence of general structure (I) below:
  • A represents monomeric units of the hydrophilic polymer chain
  • GM represents methionine or one of its derivatives
  • GH represents a hydrophobic group
  • E and E ' represent a spacer group with n and p representing independently of each other 0 or 1,
  • the hydrophobic groups GH and the methionine groups GM being distributed randomly.
  • the molar percentage of hydrophobic groups is represented by the ratio c / (a + b + c) and the molar percentage of methionine group is represented by the ratio b / (a + b + c).
  • the molar grafting rate in hydrophobic units in the polymers according to the invention advantageously varies from 2 to 30%, and preferably from 5 to 20%.
  • the molar grafting rate, in methionine unit (s) in the polymers according to the invention varies from 0.5 to 20%.
  • molar ratio a / a + b + c it varies between 40 and 97.5%.
  • the polymers according to the invention have a molar mass by weight which is between 2,000 and 200,000 g / mol, and preferably between 5,000 and 100,000 g / mol.
  • the polymers according to the invention may also carry at least one graft of polyethylene glycol type.
  • the molar mass of the polyethylene glycol is 1000 to 5000 Da.
  • the group of polyethylene glycol type can be represented schematically according to one of the following structures:
  • the molar percentage of polyethylene glycol grafting ranges from 1 to 10%.
  • This motif may be directly linked or not to the hydrophilic skeleton of the polymer according to the invention.
  • the grafting of its amine function can be carried out easily by coupling it with a carboxylic function present on the backbone of the amphiphilic polymer, in the presence of a coupling agent such as carbodiimide and a catalyst such as dimethylaminopyridine.
  • a coupling agent such as carbodiimide and a catalyst such as dimethylaminopyridine.
  • This reaction can be carried out in an organic solvent or in an aqueous phase.
  • a water-soluble carbodiimide will preferably be used.
  • the carboxylic function can be left free or protected by a group forming an ester or amide bond.
  • the pendant hydrophobic groups may be linked to the polymer via an amide, ester, carbonate or carbamate function, depending on the nature of the activatable function of the polymer and that of the graft.
  • the bond is of the amide or ester type as for the methionine derivative.
  • the grafting of the methionine derivative and the hydrophobic group can be done simultaneously.
  • a coupling reaction is carried out between the hydrophobic group comprising an amine or alcohol reactive functional group and the polymer comprising carboxylic acid functions in the presence of a condensing agent such as diisopropylcarbodiimide and a catalyst such as dimethylaminopyridine.
  • This reaction can be carried out in a solvent such as dimethylformamide (DMF), dimethylsulfoxide (DMSO) or N-methylpyrrolidone (NMP).
  • DMF dimethylformamide
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • NMP N-methylpyrrolidone
  • Coupling reagents such as chloroformates can also be used for the formation of amide bonds (see, for example, Bodanszky's “Principles of Peptide Synthesis” Springer Verlag 1984 for examples of coupling agents).
  • the degree of grafting is chemically controlled by the stoichiometry of the constituents and reactants and / or the reaction time.
  • the hydrophobic groups considered are then carrying carboxylic acid groups.
  • the bonds formed after coupling are in particular ester, amide, carbonate or carbamate bonds.
  • amphiphilic polymers may comprise both hydrophobic groups GH and methionine groups GM, and how to obtain them according to procedures indicated in the literature.
  • a cholesterol-grafted pullulan-type polymer can be synthesized according to the procedure described in US Pat. No. 6,566,516.
  • a derivative having a reactive isocyanate is then prepared by reacting a diisocyanate with a methionine whose acid function is protected by an -NH 2 (amide) or an -OMe (ester).
  • This procedure is conventional and is described in Example 1 of the same patent.
  • the grafting may be carried out according to the procedure described in Example 2.
  • a dextran polymer grafted with a lauroyl group and a methionine derivative can be obtained by reacting the dextran polymer with the acid chloride of lauric acid and the acid chloride of N-acetylmethionine in N-methylpyrrolidone.
  • the procedure for obtaining dextran grafted with the lauroyl group is described in US Pat. No. 5,750,678 (Example 1).
  • a polyacrylate comprising stearylamine and methionine amide can be prepared according to the procedure described in US Pat. No. 6,607,714 having the methionine amide present in the desired amount during the grafting step.
  • a poly (gamma) glutamate comprising an ester of phenylalanine and a methionine ester may also be prepared according to the protocol described by Matsusaki et al. Chem. Letters 2004, 33, 398-399.
  • a mixture of an ethyl ester of methionine and an ethyl ester of phenylalanine in the presence of a water-soluble carbodiimide can be grafted simultaneously onto a poly (gamma-glutamic acid) in water.
  • a polylysine comprising a stearoyl group, N-acetylmethionine and a polyethylene glycol chain may be prepared according to the procedure described by Brown et al., Bioconjugate Chem 2000, 11, 880-891.
  • the methionine derivative to be grafted onto the polylysine contains the hydroxysuccinimide group on the carboxylate and an acetyl on the amine function.
  • the active ingredients, PA that may be associated with a polymer according to the invention are chosen from proteins, or peptides, that is to say PAs that are sensitive to the phenomenon oxidation.
  • methionines are particularly susceptible to oxidation.
  • proteins such as growth hormone, interferons, clotting factor proteins such as factor VII, factor VIII and factor IX, ⁇ , GCSF and monoclonal antibodies are known to be easily oxidized. These proteins may optionally comprise at least one polyethylene glycol chain.
  • the active ingredient is chosen from the group comprising: proteins, glycoproteins, proteins linked to one or more polyalkylene glycol chains [preferably polyethylene glycol (PEG): “PEGylated proteins”].
  • PEG polyethylene glycol
  • the polymers considered according to the invention in association or not with an AP, especially as defined above, are capable of spontaneously forming nanoparticles when they are dispersed in an aqueous medium with a pH ranging from 5 to 8. , especially in water.
  • nanoparticles In general, the formation of nanoparticles is due to a self-association between a multitude of polymer chains with segregation of hydrophobic groups in nanodomains.
  • a nanoparticle may contain one or more hydrophobic nanodomains.
  • the size of the polymer nanoparticles may vary from 1 to 1000 nm, in particular from 5 to 500 nm, especially from 10 to 300 nm, and more particularly from 10 to 200 nm, or even from 10 to 100 nm.
  • amphiphilic polymers of the invention are likely to be used in several ways depending on the nature of the hydrophobic groups, their molar percentage of methionine and their degree of polymerization. Methods for shaping a polymer for the encapsulation of an active ingredient in the various forms contemplated by the invention are known to those skilled in the art.
  • the invention is directed to a composition, in particular a pharmaceutical, cosmetic, dietetic or phytosanitary composition
  • a composition in particular a pharmaceutical, cosmetic, dietetic or phytosanitary composition
  • at least one polymer as defined above and at least one active ingredient, in particular capable of oxidation.
  • active ingredient in particular capable of oxidation.
  • It is more particularly a protein, a peptide or an enzyme sensitive to oxidation.
  • the protein, the peptide or the enzyme contains at least one methionine in its sequence.
  • this polymer which may or may not be associated with an AP, may be in the form of nanoparticles.
  • the composition of the invention may be in the form of a gel, a solution, a suspension, an emulsion, micelles, nanoparticles, microparticles, a implant, a powder, a suspension, a lyophilizate or a film, and preferably in the form of nanoparticles, microparticles, gels or films.
  • the composition is a stable colloidal suspension of nanoparticles and / or microparticles and / or micelles in an aqueous phase.
  • Microparticles can be obtained by various methods such as coacervation in the presence of an aggregating agent (divalent or trivalent ions or polyelectrolytes), precipitation by change of pH or ionic strength, extraction / evaporation, atomization or freeze-drying. .
  • an aggregating agent divalent or trivalent ions or polyelectrolytes
  • precipitation by change of pH or ionic strength
  • extraction / evaporation atomization or freeze-drying.
  • composition according to the invention since it is pharmaceutical, can be administered orally, pulmonally, parenterally, nasally, vaginally, ocularly, subcutaneously, intravenously, intramuscularly, intradermally, intraperitoneally, intracerebrally or buccally.
  • the composition may optionally contain an excipient for adjusting the pH and / or osmolarity and / or to improve the stability and / or as an antimicrobial agent.
  • excipients are well known to those skilled in the art (see Injectable Drug Development, P.K. Gupta et al., Interpharm Press, Denver, Colorado 1999).
  • FIG. 1 Graphical representation of the levels of oxidized protein measured at T0 and after 2 months T (2 months) at 5 ° C., according to Example 5, for a formulation of interferon alpha-2b formulated with the polymer of the example 1 according to the invention (formulation 5), and for a comparative formulation of interferon alpha-2b formulated with methionine (reference formulation).
  • a polyglutamate grafted statistically with 5% of racemic alpha-tocopherol is synthesized according to the procedure described in application WO 03/104303 (Example 1). 5 g of the polymer in its polyacid form is dissolved at 70 ° C. in 77 ml of DMF. After dissolution of the solid, the resulting solution is cooled to 0 ° C. 108 ml of isobutyl chloroformate and 92 ml of N-methylmorpholine are added, followed by the white suspension obtained is stirred at 0 ° C. for 10 min.
  • methionine ethyl ester hydrochloride (MetOEt.HCl) are dissolved in 8.2 ml of NMP and then 349 ml of triethylamine are added. This mixture is added to the activated polymer suspension, and the reaction mixture is stirred at 0 ° C for 1 hour. After adding 1 ml of concentrated HCl (35%) and then 50 ml of water, the mixture is neutralized with 1N sodium hydroxide. The solution obtained is diafiltrated against salt water (0.9%) and then with water, and concentrated to a volume of about 150 ml. The molar grafting rate of the ethyl ester of methionine, determined by HPLC after acid hydrolysis of the polymer, is 1.7% of the monomer units.
  • the percentage of AlaVE determined by proton NMR in TFA-d is 6% and that of grafted methioninamide determined by HPLC after hydrolysis is 5.5% of the monomer units.
  • the formulation is prepared by simply mixing a polymer solution 1 adjusted to pH (HCl or NaOH) and osmolality (NaCl) to about pH 7.0 and 300 mOsm / Kg and a protein solution to obtain a final concentration of 0.7 mg / ml in growth hormone and 22 mg / ml in polymer 1. Under these conditions, the formulation containing polymer 1 has an equivalent methionine concentration of about 2.4 mM. The polymer solution was previously filtered through a 0.2 ⁇ filter. The formulation finally obtained is stirred overnight at room temperature and then divided, a portion being placed in a refrigerator at 5 ° C.
  • methionine residues are sensitive to oxidation in growth hormone: methionine in position 14 and methionine in position 125. These two degradation products are taken into account in the quantification of oxidation.
  • the formulation (formulation 5) is prepared by simple mixing of a polymer solution of Example 1 adjusted in pH and osmolality (at about pH 6.5 and 300 mOsm / kg) and a protein solution, for obtain a final concentration of 0.3 mg / mL interferon alpha 2b and 22 mg / mL polymer. Under these conditions, the formulation containing polymer 1 has an equivalent methionine concentration of about 2.4 mM. The polymer solution was previously filtered through a 0.2 ⁇ filter. The finally obtained formulation is stirred overnight at room temperature and then placed in a refrigerator at 5 ° C.
  • a solution of the protein with an equivalent concentration of methionine for comparison (reference formulation) is prepared under similar conditions.
  • the oxidized form ratio (corresponding to the oxidation of methionine at position 111) is measured by liquid chromatography (HPLC) according to the following chromatographic conditions: YMC column C30 (Interchim, 250 ⁇ 4.6 mm, 3 ⁇ ), flow rate: 1 mL / min, fuorimetric detection: excitation at 280 nm and emission at 340 nm, column temperature of 20 ° C, water / acetonitrile / TFA as eluent.
  • a microparticulate formulation is prepared according to Example 18 of the application WO 2007/141344, that is to say, from a polymer PO polyglutamate grafted with alpha-tocopherol, IFN and methionine in free form.
  • a microparticulate formulation is prepared under similar conditions from the IFN and the polymer of Example 1 according to the invention, comprising alpha-tocopherol grafts and methionine grafts. The amount of methionine is measured in the microparticles. The results are reported in the following Table 2.

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Abstract

La présente invention concerne des nouveaux polymères amphiphiles comportant des groupements hydrophobes et des groupements méthionine. Elle vise en outre des compositions à profil de libération régulée comportant de tels polymères, associés de manière non covalente à un actif, notamment un actif tel qu'un peptide ou une protéine comportant dans leur séquence au moins un acide aminé sensible à l'oxydation.

Description

Polymère amphiphile fonctionnalisé par la méthionine
La présente invention concerne des nouveaux polymères amphiphiles à squelette hydrophile et porteurs de groupements hydrophobes dont des groupements méthionine.
D'une manière générale, les polymères amphiphiles sont capables selon leurs structures chimiques de former des nanoparticules de taille variable en milieu aqueux. Ainsi, des polymères dont le squelette est linéaire, hydrophile et porteur de groupements hydrophobes latéraux, peuvent former aisément des nanoparticules dans l'eau. Ces nanoparticules, selon le matériau de base utilisé pour leur fabrication, peuvent être biocompatibles et éventuellement biodégradables. Elles trouvent des applications notamment dans le domaine de la médecine pour la vectorisation des médicaments.
Dans ce domaine, la société déposante développe depuis une dizaine d'années des systèmes nanoparticulaires et microparticulaires à base de polyaminoacides comportant divers groupements hydrophobes et dénommés Medusa®.
Ainsi, la demande de brevet WO 2003/104303 de la société FLAMEL
TECFÎNOLOGIES décrit des polymères d'acide glutamique comportant des greffons d'alpha-tocophérol qui forment dans l'eau des nanoparticules capables d'associer l'insuline. Dans la publication YP. Chan et al. Expert Opin. Drug. Deliv.2007, 4(4) 441-451, il est décrit que des formulations produites avec ces nanoparticules et des protéines telles que l'interféron alpha ou l'interleukine 2 permettent, après une injection sous-cutanée chez l'homme, d'obtenir des concentrations plasmatiques mesurables pendant une durée au moins égale à une semaine. De même, il est connu que des polymères amphiphiles, à base de pullulane et comportant des greffons de cholestérol s'assemblent en milieu aqueux pour former des nanoparticules qui sont aptes à associer de façon réversible des protéines telles que l'insuline (Akiyoshi et al. J. Controlled Release 1998, 54, 313-320). D'autres polymères analogues à base de chitosan ou dextran ont été développés notamment afin d'obtenir des films ou des implants d'hydrogels (WO 00/14155).
Comme il ressort de ce qui précède, les applications des polymères amphiphiles dans le domaine de la formulation des protéines et des peptides sont nombreuses.
Malheureusement, l'obtention de formulations polymère amphiphile/protéine stables en milieu aqueux pendant au moins deux ans à 5 °C de meure un défi majeur, notamment au regard de la vulnérabilité de certaines protéines thérapeutiques vis-à-vis de l'oxydation. En effet, il est aujourd'hui largement reconnu que certains acides aminés tels que la méthionine, la cystéine, l'histidine ou le tryptophane, composants de nombreuses protéines ou enzymes, peuvent s'oxyder lors de la formulation de celles-ci, voire au cours du temps. Pour des raisons évidentes, ce phénomène d'oxydation peut avoir des conséquences néfastes sur l'activité biologique des principes actifs contenant ces acides aminés (Cleland et al. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems 1993, 10, 307-377).
Pour prévenir cette oxydation indésirable, Takruri (US 5,272,135) a proposé en 1993, de mettre en œuvre les protéines ou enzymes, comportant de la méthionine dans leur séquence, en les formulant avec de la méthionine. Ce concept est aujourd'hui bien connu de l'homme de l'art exerçant dans le domaine de la stabilisation des formulations contenant des protéines. Par exemple, la demande de brevet WO 2008/145323 décrit une formulation d'interféron alpha contenant de 2 à 75 mM de méthionine et la demande US 2003/0104996 décrit des formulations d'érythropoïétine (EPO) ou d'érythropoïétine hyperglycosylée (NESP) dont la dégradation est limitée par l'ajout d'une quantité de méthionine allant jusqu'à 50 mM.
Néanmoins, cette alternative pour prévenir l'oxydation n'est pas totalement satisfaisante.
Ainsi, la quantité de méthionine à associer à la protéine ou enzyme pour garantir à celle-ci une stabilité à l'égard de l'oxydation est bien entendu susceptible de varier selon la nature de la protéine, sa concentration, le pH et d'autres éléments de la formulation. D'autre part, lorsque cette protéine ou ce peptide est déjà mis en œuvre sous une forme associée avec un polymère amphiphile tel que défini précédemment, l'efficacité de la méthionine peut être altérée. Enfin, dans le cas particulier d'un implant ou d'un gel obtenu à partir d'un tel polymère amphiphile, la méthionine ajoutée peut perdre de son efficacité car elle ne peut pas être distribuée de façon homogène et pérenne dans l'implant ou le gel.
La présente invention vise précisément à suppléer aux insuffisances précitées.
Plus précisément, la présente invention a pour objectif de proposer un nouveau type de polymère amphiphile, susceptible d'être mis en œuvre à titre de véhicule d'un actif, et plus particulièrement de type protéine, peptide ou enzyme naturellement sensible à un phénomène d'oxydation, et qui soit précisément apte à garantir à un tel actif une stabilité contre ce phénomène.
Un autre objectif essentiel de la présente invention est que ces polymères soient en outre à caractère associatif et, à ce titre, puissent être utilisés comme vecteurs de principes actifs, et donc manifestent une capacité à s'associer facilement avec de nombreux principes actifs et à les libérer in vivo.
En conséquence, la présente invention vise, selon l'un de ses aspects, un polymère amphiphile comportant un squelette hydrophile, caractérisé en ce que ledit squelette est porteur d'au moins un groupement latéral méthionine ou un de ses dérivés et de groupements latéraux hydrophobes distincts de ladite méthionine ou l'un de ses dérivés.
De préférence, le ou les groupements méthionine et/ou groupements hydrophobes sont disposés de façon aléatoire.
Selon un autre de ses aspects, la présente invention concerne l'utilisation d'un polymère tel que défini ci-dessus pour la vectorisation de principes actifs, PA, notamment des protéines, ou peptides sensibles à l'oxydation.
Selon encore un autre de ses aspects, elle concerne des nanoparticules comprenant au moins un polymère conforme à l'invention, en association ou non avec un principe actif.
Selon encore un autre de ses aspects, la présente invention vise une composition contenant un polymère conforme à l'invention et un principe actif, organisés ou non à l'état de nanoparticules.
Dans le cadre de la présente description, le terme « méthionine » sera, sans précision contraire, utilisé pour désigner soit le résidu méthionine soit un dérivé de celui-ci notamment tel que défini ci-après.
Au sens de l'invention et dans tout le présent exposé, les termes « association » ou « associer » employés pour qualifier l'interaction entre un ou plusieurs principes actifs et les polymères considérés selon l'invention signifient, en particulier, que le ou les principes actifs sont liés au(x) polymère(s) notamment par une interaction hydrophobe et/ou électrostatique, et/ou sont solubilisés par le ou les polymères.
Au sens de la présente invention, le terme « latéral » ou « latéraux » signifie que les groupements hydrophobes et méthionines sont disposés de manière à figurer des groupements pendants ou encore « des greffons » au niveau du squelette linéaire.
Au sens de la présente invention, on entend signifier par « aléatoire » que l'unité ou les unités monomères du polymère amphiphile de l'invention porteuse(s) de groupement(s) méthionine et celle(s) porteuse(s) de groupement(s) hydrophobe(s) sont réparties de manière irrégulière au sein du squelette hydrophile, indépendamment de la nature des unités adjacentes. Comme il ressort de ce qui suit, il est du mérite de la société déposante d'avoir mis au point une nouvelle famille de polymères amphiphiles, aptes à former des systèmes nanoparticulaires stables et dont le squelette hydrophile comporte d'une part un ou plusieurs greffons latéraux méthionine, et d'autre part plusieurs groupements latéraux hydrophobes distincts de la méthionine.
Le document WO 2008/094144 décrit déjà un polymère hydrophile de type polyaspartique portant des greffons méthionine et/ou cystéine. Ce type de polymère est toutefois dénué de greffons hydrophobes distincts de la méthionine comme requis selon l'invention. Par ailleurs, il n'y est proposé qu'à des fins de traitement de surface de nanoparticules. Ce document n'est donc aucunement concerné par l'activité antioxydante de la méthionine et encore moins par la valorisation potentielle de celle-ci à des fins de mise au point d'un véhicule polymérique apte à préserver une stabilité contre l'oxydation à des actifs précisément sensibles à ce phénomène.
Contre toute attente, les inventeurs ont constaté que la présence de méthionine à l'état de greffon(s) au niveau d'un polymère amphiphile permet de conférer audit polymère une activité antioxydante significative, sans par ailleurs affecter son aptitude, d'une part à s'associer à un principe actif et, d'autre part, à s'organiser à l'état de nanoparticules lorsqu'il est mis en présence d'un milieu aqueux.
Qui plus est, le polymère considéré selon l'invention, se prête avantageusement à un ajustement en terme d'activité antioxydante au regard de son taux de greffage en méthionine. Cette possibilité de moduler le taux de greffage de la méthionine est particulièrement appréciable au regard du fait qu'elle permet d'ajuster l'activité antioxydante du polymère selon l'invention en fonction de la sensibilité à l'oxydation de la protéine ou du peptide devant être stabilisé(e) par ledit polymère.
POLYMERE AMPHIPHILE
- Squelette hydrophile
Comme précisé ci-dessus, le polymère amphiphile considéré selon l'invention possède un squelette hydrophile.
Avantageusement, les polymères considérés selon l'invention possèdent un squelette polymérique so lubie dans l'eau, notamment à un pH compris entre 5 et 8.
Ce squelette peut notamment être choisi parmi un polymère ou copolymère appartenant à la famille des polyaminoacides, des polysaccharides, des polyacrylates ou des polyméthacrylates. Conviennent à ce titre tout particulièrement,
- les polyaminoacides tels que les poly(acide glutamique) (de type alpha ou gamma), les poly(acide aspartique) (de type alpha ou alpha/beta), les polylysines (de type alpha) ou des copolymères formés par combinaisons de ces mêmes acides aminés,
- les poly(acide acrylique) ou poly(acide méthacrylique), et
- les polysaccharides tels que le dextran ou l'un de ses dérivés tels que le carboxyméthyl dextran ou l'hydroxyéthyl dextran ou des pullulanes.
Selon un mode de réalisation particulier, le squelette hydrophile du polymère amphiphile de l'invention est un polyaminoacide choisi parmi les poly(acide glutamique), les poly(acide aspartique), les polylysines, ou leurs copolymères.
Un certain nombre de polymères utilisables selon l'invention, par exemple de type poly( acide alpha-L-glutamique), poly(acide alpha-D-glutamique), poly(acide gamma- L-glutamique) et poly(alpha-L-lysine) de masses variables sont disponibles commercialement.
Les polymères susceptibles de former le squelette hydrophile des polymères amphiphiles de l'invention peuvent en outre être obtenus par des méthodes connues de l'homme de l'art.
Par exemple, la synthèse d'un polyglutamate de sodium de type alpha, peut être réalisée via la polymérisation d'anhydrides de N-carboxy-aminoacides (NCA), comme décrite, par exemple, dans l'article "Biopolymers, 1976, 15, 1869 et dans l'ouvrage de H.R. Kricheldorf "alpha-Aminoacid-N-carboxy Anhydride and related Heterocycles" Springer Verlag (1987). Le dérivé de NCA est de préférence NCA-Glu-0-R3 (R3 = méthyle, éthyle ou benzyle). Les polymères sont ensuite hydrolysés dans des conditions appropriées pour obtenir le polymère sous sa forme acide. Ces méthodes sont inspirées de la description donnée dans le brevet FR 2 801 226 de la société déposante.
Ces polymères possèdent comme groupements activables des fonctions carboxyliques, aminés ou alcools. On peut donc envisager sans difficulté leur greffage.
D'une manière générale, les polymères linéaires à squelette hydrophile sont greffés en même temps ou en séquentiel par le ou les groupements hydrophobes et la ou les méthionine(s) ou dérivé(s) de méthionine. - Groupements hydrophobes et groupements méthionine
Suivant une caractéristique essentielle de l'invention, les polymères de l'invention sont greffés d'au moins un groupement pendant méthionine (GM) et de groupements hydrophobes pendants différents de la méthionine (GH).
- Groupement méthionine (GM)
Au sens de la présente invention, l'expression « dérivé de méthionine » entend plus particulièrement désigner les dérivés de substitution, notamment au niveau de la fonction aminé ou carboxylique de la méthionine.
Il s'agit par exemple de la méthionine amide ou de l'ester éthylique de la méthionine.
Ces composés sont plus particulièrement avantageux pour réaliser une réaction de couplage via la fonction aminé de la méthionine.
Il est évident que la méthionine comporte deux fonctions réactives - acide carboxylique et aminé primaire - et selon la réaction de couplage mise en œuvre, l'une ou l'autre des fonctions doit être protégée.
La méthionine utilisable dans les polymères de l'invention peut être de configuration L, D ou un mélange racémique.
Selon le type de greffage, la fonction de liaison est de type amide ou ester. Le groupement méthionine, une fois greffé sur le polymère, possède généralement l'une des trois structures ci-dessous :
Figure imgf000007_0001
(I) (H) (m)
dans lesquelles :
- Ra représente un groupement hydroxy (éventuellement déprotoné), NH2, OMe, OEt, NHCH3 ou N(CH3)2,
- Rb et Rc représentent indépendamment un atome d'hydrogène, un méthyle ou un éthyle, avec lorsque l'un des groupements Rb et Rc est un atome d'hydrogène, alors l'autre groupement représente un groupement acyle de Ci à C6, et la configuration de la méthionine pouvant être L, D ou un mélange racémique.
- Groupements hydrophobes (GH)
Les groupements hydrophobes sont, en pratique et sans que cela ne soit limitatif, choisis dans le groupe comprenant les alcools et les aminés, ces composés pouvant être fonctionnalisés facilement par l'homme de l'art, et leur greffage mettant en œuvre des réactions analogues à celles requises pour le dérivé de la méthionine.
Suivant une caractéristique préférée, le groupement hydrophobe (GH) comporte de 5 à 30 atomes de carbone.
Ces groupements hydrophobes (GH) sont avantageusement et judicieusement sélectionnés dans le groupe comprenant :
- les alkyles linéaires ou ramifiés en C5 à C30 comportant éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome,
- les alkylaryles ou arylalkyles en Cs à C30 comportant éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome, et
- les (poly)cy cliques en C10 à C30 comportant éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome.
Plus particulièrement, les groupements hydrophobes (GH) peuvent être, par exemple, des groupements choisis dans le groupe comprenant :
- le dodécanoxy, le tétradécanoxy, l'héxadécanoxy, l'octadécanoxy, l'oleyloxy, le tocophéryle ou le cholestéryle, l'aminohexyle, l'aminohéxadécyle et Paminooctadécyle,
- le lauryle, le myristyle, le palmityle et le stéaryle,
- un acide aminé hydrophobe tel que la leucine, la valine, la phénylalanine, le tryptophane ou la tyrosine ou un de leurs dérivés.
Quand le groupement hydrophobe est un acide aminé, il peut être un dérivé correspondant à l'une des structures ci-dessous (IV), (V) ou (VI) dans lesquelles Ra, Rb et Rc correspondent aux définitions données précédemment et Rd correspond à un résidu d'acide aminé selon le type de polymère et la réaction de greffage mise en œuvre.
Figure imgf000009_0001
(IV) (V) (VI)
Alternativement, la ou les méthionine(s) ou dérivé(s) de méthionine et/ou les groupements hydrophobes peuvent être lié(e)(s) au squelette polymérique via un espaceur permettant de les relier à la chaîne de polymère. Cet espaceur est avantageusement divalent et appartient au groupe comportant notamment les unités acide aminé, les dérivés des aminoalcools, les dérivés des diamines, les dérivés diols et les dérivés des hydroxyacides.
Selon un mode particulier de l'invention, le squelette hydrophile du polymère amphiphile est un poly(L)glutamate de sodium, et le groupement hydrophobe un groupement tocophéryle d'origine synthétique et, de préférence, le dérivé de la méthionine est la méthionine amide ou l'ester éthylique de la méthionine.
En conséquence, les polymères amphiphiles préférés de l'invention peuvent être schématisés par le fait qu'ils sont formés d'une séquence de structure générale (I) suivante :
Figure imgf000009_0002
dans laquelle,
- A représente des unités monomériques de la chaîne de polymère hydrophile,
- GM représente la méthionine ou un de ses dérivés,
- GH représente un groupement hydrophobe, et
- E et E' représentent un groupement espaceur avec n et p représentant indépendamment l'un de l'autre 0 ou 1,
avec a, b et c étant des entiers différents de zéro,
les groupements hydrophobes GH et les groupes méthionines GM étant répartis de façon aléatoire. Avantageusement, le pourcentage molaire en groupements hydrophobes est figuré par le rapport c/(a+b+c) et le pourcentage molaire en groupement méthionine est figuré par le rapport b/(a+b+c).
Le taux de greffage molaire en motifs hydrophobes dans les polymères selon l'invention, varie avantageusement de 2 à 30 %, et de préférence de 5 à 20 %.
Le taux de greffage molaire, en motif(s) méthionine dans les polymères selon l'invention, varie de 0,5 à 20 %.
Pour ce qui est du rapport molaire a/a+b+c, il varie entre 40 et 97,5 %.
Avantageusement, les polymères selon l'invention ont une masse molaire en poids qui se situe entre 2 000 et 200 000 g/mole, et de préférence entre 5 000 et 100 000 g/mole.
Selon une autre variante, les polymères selon l'invention peuvent être également porteurs d'au moins un greffon de type polyéthylène glycol.
De préférence, la masse molaire du polyéthylène glycol est de 1 000 à 5 000 Da. Le groupement de type polyéthylène glycol peut être représenté schématiquement selon l'une des structures suivantes :
Figure imgf000010_0001
De préférence, le pourcentage molaire de greffage en polyéthylèneglycol varie de 1 à 10 %. Ce motif peut être directement lié ou non au squelette hydrophile du polymère selon l'invention. PROCEDE DE PREPARATION DU POLYMERE AMPHIPHILE
Pour ce qui est de la méthionine, le greffage de sa fonction aminé peut être réalisé aisément par couplage de celle-ci avec une fonction carboxylique présente sur le squelette du polymère amphiphile, en présence d'un agent de couplage tel qu'un carbodiimide et d'un catalyseur tel que la diméthylaminopyridine. Cette réaction peut être réalisée dans un solvant organique ou en phase aqueuse. Dans le deuxième cas, on utilisera de préférence un carbodiimide hydrosoluble. La fonction carboxylique peut être laissée libre ou protégée par un groupement formant une liaison ester ou amide.
Ainsi, lorsque le polymère possède des fonctions aminés ou alcools, le greffage de la méthionine se fait alors via la fonction carboxylique, en ayant protégé au préalable la fonction aminé de la méthionine par un groupement acyle ou par diméthylation. Ces réactions sont bien connues de l'homme de l'art et l'ouvrage de G. Hermanson (Bioconjugate Techniques 2eme édition 2008, Elsevier), par exemple, décrit ces méthodologies.
Pour leur part, les groupements hydrophobes (GH) pendants peuvent êtres liés au polymère via une fonction amide, ester, carbonate ou carbamate, selon la nature de la fonction activable du polymère et celle du greffon.
De préférence, la liaison est de type amide ou ester comme pour le dérivé méthionine. Dans ce cas, le greffage du dérivé méthionine et du groupement hydrophobe peut se faire simultanément.
Pour l'obtention d'un polyaminoacide greffé avec des groupements hydrophobes, on réalise une réaction de couplage entre le groupement hydrophobe comportant une fonction réactive aminé ou alcool et le polymère comportant des fonctions acide carboxylique en présence d'un agent de condensation tel que le diisopropylcarbodiimide et d'un catalyseur tel que la diméthylaminopyridine. Cette réaction peut se faire dans un solvant tel que le diméthylformamide (DMF), le diméthylsulfoxyde (DMSO) ou la N-méthylpyrrolidone (NMP). Idéalement le greffage de la méthionine est réalisé en même temps. Les liaisons formées sont des liaisons ester ou amide.
Les réactifs de couplage tels que les chloroformiates peuvent également être utilisés pour la formation de liaisons amides (voir par exemple l'ouvrage de Bodanszky « Principles of Peptide Synthesis » Springer Verlag 1984 pour des exemples d'agents de couplages). Le taux de greffage est contrôlé chimiquement par la stœchiométrie des constituants et réactifs et/ou le temps de réaction.
S'agissant d'un polymère comportant des groupements aminés tels que la polylysine ou le dextran comportant par ailleurs des groupements alcool, les groupements hydrophobes considérés sont alors porteurs de groupements acide carboxylique. Les liaisons formées après couplage sont notamment des liaisons ester, amide, carbonate ou carbamate.
A titre d'exemples, nous décrivons ci-après plusieurs types de polymères amphiphiles pouvant comporter à la fois des groupements hydrophobes GH et des groupements méthionine GM, et la façon de les obtenir selon des modes opératoires indiqués dans la littérature.
Pour ce qui le concerne, un polymère de type pullulane greffé par le cholestérol peut être synthétisé selon le mode opératoire décrit dans le brevet US 6,566,516. On prépare ensuite un dérivé ayant un isocyanate réactif en faisant réagir un diisocyanate avec une méthionine dont la fonction acide est protégée par un -NH2 (amide) ou un -OMe (ester). Ce mode opératoire est classique et est décrit dans l'exemple 1 du même brevet. Le greffage peut être réalisé selon le mode opératoire décrit dans l'exemple 2.
Enfin, un polymère de type dextran greffé par un groupement lauroyle et un dérivé de la méthionine peut être obtenu en faisant réagir le polymère dextran avec le chlorure d'acide de l'acide laurique et le chlorure d'acide de la N-acétylméthionine dans la N-méthylpyrrolidone. Le mode opératoire pour l'obtention de dextran greffé par le groupement lauroyle est décrit dans le brevet US 5,750,678 (exemple 1).
De même, un polyacrylate comportant la stéarylamine et la méthionine amide peut être préparé selon le mode opératoire décrit dans le brevet US 6,607,714 en ayant la méthionine amide présente en quantité désirée lors de l'étape de greffage.
Un poly(gamma)glutamate comportant un ester de la phénylalanine et un ester de la méthionine peut être également préparé selon le protocole décrit par Matsusaki et al. Chem. Letters 2004, 33, 398-399. On peut greffer simultanément sur un acide poly(gamma-glutamique) dans l'eau un mélange d'un ester éthylique de la méthionine et un ester éthylique de la phénylalanine en présence d'un carbodiimide soluble dans l'eau.
Enfin, une polylysine comportant un groupement stéaroyle, la N-acétylméthionine et une chaîne polyéthylène glycol peut être préparée selon le mode opératoire décrit par Brown et al., Bioconjugate Chem 2000, 11, 880-891. Dans ce mode de réalisation, le dérivé méthionine à greffer sur la polylysine contient le groupement hydroxysuccinimide sur le carboxylate et un acétyle sur la fonction aminé. PRINCIPE ACTIF (PA)
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les principes actifs, PA, susceptibles d'être associés à un polymère selon l'invention sont choisis parmi les protéines, ou peptides, c'est-à-dire des PA sensibles au phénomène d'oxydation.
Plus particulièrement, ce sont des peptides ou des protéines comportant dans leur séquence au moins une méthionine. En effet, les méthionines sont particulièrement susceptibles à l'oxydation.
Dans cette catégorie, les protéines telles que l'hormone de croissance, les interférons, les protéines facteurs de coagulation telles que le facteur VII, facteur VIII et facteur IX, ΓΕΡΟ, le GCSF et les anticorps monoclonaux sont connues pour être facilement oxydées. Ces protéines peuvent éventuellement comporter au moins une chaîne polyéthylène glycol.
Les techniques d'association d'un ou de plusieurs PA à un polymère amphiphile selon l'invention, sont décrites notamment dans le brevet US 6,630,171.
Elles consistent à incorporer au moins un principe actif dans le milieu liquide contenant des polymères de l'invention chargés en, ou associés avec, un ou plusieurs principe(s) actif(s). Cette incorporation peut être réalisée de la manière suivante : mise en solution aqueuse du polymère, puis ajout du principe actif, sous forme solide ou en solution aqueuse.
De préférence, le principe actif est choisi dans le groupe comprenant : les protéines, les glycoprotéines, les protéines liées à une ou plusieurs chaînes polyalkylèneglycol [de préférence polyéthylène glycol (PEG): "protéines-PEGylées"].
NANOPARTICULES
Avantageusement, les polymères considérés selon l'invention en association ou non avec un PA, notamment tel que défini ci-dessus, sont aptes à former spontanément des nanoparticules lorsqu'ils sont mis en dispersion dans un milieu aqueux de pH allant de 5 à 8, notamment dans l'eau.
D'une manière générale, la formation de nanoparticules est due à une auto-association entre une multitude de chaînes de polymères avec ségrégation des groupements hydrophobes dans des nanodomaines. Une nanoparticule peut contenir un ou plusieurs nanodomaines hydrophobes. La taille des nanoparticules de polymère peut varier de 1 à 1 000 nm, en particulier de 5 à 500 nm, notamment de 10 à 300 nm, et plus particulièrement de 10 à 200 nm, voire de 10 à 100 nm.
APPLICATIONS
Comme précisé ci-dessus, les polymères amphiphiles de l'invention sont susceptibles d'être utilisés de plusieurs façons selon la nature des groupements hydrophobes, leur pourcentage molaire en méthionine et leur degré de polymérisation. Les méthodes de mise en forme d'un polymère pour l'encapsulation d'un principe actif sous les diverses formes visées par l'invention sont connues de l'homme de l'art.
Pour plus de détails, on pourra consulter, par exemple, ces quelques références particulièrement pertinentes :
- formulation d'une protéine avec un polyaminoacide comportant des groupements hydrophobes sous formes de nanoparticules ou de microparticules : WO 00/30618, WO 2005/051418, WO 2007/141344, WO 2008/025425, WO 2008/135561,
- formulation d'une protéine avec un pullulane comportant un groupement hydrophobe tel que le cholestérol : US 6,566,516.
Selon un autre de ses aspects, l'invention vise une composition notamment pharmaceutique, cosmétique, diététique ou phytosanitaire comprenant au moins un polymère tel que défini ci-dessus et au moins un principe actif, notamment susceptible d'oxydation. Il s'agit plus particulièrement d'une protéine, d'un peptide ou d'une enzyme sensible à l'oxydation.
En particulier, la protéine, le peptide ou l'enzyme contient au moins une méthionine dans sa séquence.
Selon une variante de réalisation, ce polymère associé ou non à un PA, peut être à l'état de nanoparticules.
Selon un mode de réalisation, la composition de l'invention peut se présenter sous la forme d'un gel, d'une solution, d'une suspension, d'une émulsion, de micelles, de nanoparticules, de microparticules, d'un implant, d'une poudre, d'une suspension, d'un lyophilisât ou d'un film, et de préférence sous la forme de nanoparticules, microparticules, gels ou films.
Avantageusement, elle est apte à assurer un profil de libération régulée dudit actif en fonction du temps. Suivant l'une de ses formes particulièrement préférées, la composition, chargée ou non en principe(s) actif(s), est une suspension colloïdale stable de nanoparticules et/ou de microparticules et/ou de micelles dans une phase aqueuse.
Des microparticules peuvent être obtenues par diverses méthodes telles que la coacervation en présence d'un agent d'agrégation (ions divalents ou trivalents ou polyélectrolytes), précipitation par changement de pH ou de la force ionique, extraction/évaporation, par atomisation ou par lyophilisation.
La composition selon l'invention, dès lors qu'elle est pharmaceutique, peut être administrée par voie orale, pulmonaire, parentérale, nasale, vaginale, oculaire, sous- cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intradermique, intra péritonéale, intracérébrale ou buccale.
Selon un autre mode de réalisation, la composition peut éventuellement contenir un excipient pour l'ajustement du pH et/ou de l'osmolarité et/ou pour améliorer la stabilité et/ou comme agent antimicrobien. Ces excipients sont bien connus de l'homme de l'art (se référer à l'ouvrage : Injectable Drug Developement, P.K. Gupta et al. Interpharm Press, Denver, Colorado 1999).
Les exemples et figure figurant ci-après sont présentés à titre illustratif et non limitatif du domaine de l'invention.
Figure 1 : Représentation graphique des taux en protéine oxydée mesurés à T0 et après 2 mois T(2 mois) à 5°C, selon l'exemple 5, pour une formulation d'interféron alpha-2b formulé avec le polymère de l'exemple 1 conforme à l'invention (formulation 5), et pour une formulation comparative d'interféron alpha-2b formulé avec la méthionine (formulation de référence).
EXEMPLE 1
Synthèse d'un poly glutamate de sodium comportant des greffons d'alpha- tocophérol et de la méthionine
Un polyglutamate greffé statistiquement avec 5 % d'alpha-tocophérol racémique est synthétisé selon le mode opératoire décrit dans la demande WO 03/104303 (exemple 1). 5 g du polymère sous sa forme polyacide est mis en solution à 70° C dans 77 mL de DMF. Après dissolution du solide, la solution obtenue est refroidie à 0°C. 108 mL de chloroformiate d'isobutyle et 92 ml de N-méthylmorpholine sont ajoutés, puis la suspension blanche obtenue est agitée à 0°C pendant 10 min. En parallèle, 536 mg de chlorhydrate de l'ester éthylique de la méthionine (MetOEt.HCl) sont mis en solution dans 8,2 mL de NMP puis 349 mL de triéthylamine sont ajoutés. Ce mélange est ajouté à la suspension de polymère activé, et le mélange réactionnel est agité à 0°C pendant 1 h. Après ajout d' I mL d'HCl concentré (35 %) puis 50 mL d'eau, le mélange est neutralisé avec de la soude IN. La solution obtenue est diafîltrée contre de l'eau salée (0,9 %) puis de l'eau, et concentrée jusqu'à un volume d'environ 150 mL. Le taux de greffage molaire de l'ester éthylique de la méthionine, déterminé par HPLC après hydrolyse acide du polymère, est de 1,7 % des unités monomères.
EXEMPLE 2
Synthèse d'un polyacrylate de sodium comportant des greffons d'alpha- tocophérol et de la méthionine. Étape 1 : Purification du polyacide acrylique commercial (Degacryl 4779L)
75 g de solution de DEGACRYL 4779L (vendu par la société Evonik) sont dilués avec 1425 g d'eau puis diafïltrés contre 8 volumes d'eau. La solution obtenue est ensuite lyophilisée. La masse moléculaire moyenne Mn, mesurée par chromatographie d'exclusion stérique, est de 33,6 kDa en équivalent PMMA (polyméthacrylate de méthyle) et l'indice de polydispersité est de 2,4.
Étape 2 : Synthèse de l'ester alanine α-tocophérol (AlaVE)
À une solution de 21,1 g de N-Boc alanine, 40 g d'a-tocophérol et 0,57 g de diméthylaminopyridine (DMAP) dans 400 mL de dichlorométhane sont ajoutés goutte à goutte 22 mL de Ν,Ν'-Diisopropylcarbodiimide (DIPC). Après agitation à 20°C pendant 22 h, le mélange réactionnel est successivement lavé avec une solution d'HCl 0,1 N, de l'eau, une solution à 5 % de bicarbonate de sodium et enfin de l'eau. La phase organique est évaporée à sec et l'huile obtenue est solubilisée dans 400 mL d'une solution 4 M d'HCl dans le dioxanne. Après 4 h d'agitation à température ambiante, le mélange réactionnel est évaporé à sec et cristallisé dans l'éthanol. Le chlorhydrate d'AlaVE (33,8 g d'une poudre blanche) ainsi préparé est analysé par RMN du proton dans le CDC13 et présente un spectre conforme à sa structure chimique. Étape 3 : Greffage de l'AlaVE et de la méthioninamide sur le polyacide acrylique purifié
2,25 g d'AlaVE sont solubilisés dans 58 mL de DMF et 0,58 mL de triéthy lamine. En parallèle, 19 mg de chlorhydrate de méthioninamide sont solubilisés dans 2 mL de DMF et 0,27 mL de triéthy lamine. 5 g de DEGACRYL purifié (étape 1) sont mis en solution dans 125 mL de Ν,Ν-diméthylformamide (DMF) et 0,25 g de 4- diméthylaminopyridine (DMAP). Cette solution est refroidie à 15°C, et on ajoute successivement la suspension d'AlaVE/triéthylamine, la solution de MetNH2/NEt3, puis 1,66 mL de Ν,Ν'-Diisopropylcarbodiimide (DIPC). Le mélange réactionnel est agité une nuit à 15°C. Après ajout d'une solution d'HCl 35 % (0,56 mL) dilué dans 6 mL de DMF, le mélange réactionnel est neutralisé avec de la soude 1 N dans 200 mL d'eau. La solution obtenue est purifiée par diafîltration et concentrée jusqu'à un volume d'environ 200 mL.
Le pourcentage d'AlaVE déterminé par RMN du proton dans du TFA-d est de 6 % et celui de méthioninamide greffée déterminé par HPLC après hydrolyse est de 5,5 % des unités monomères.
EXEMPLE 3
Synthèse d'un polyglutamate de sodium comportant des greffons d'octadécylamine et de la méthionine
5 g d'un polyglutamate de DP 100 sont solubilisés à 80°C dans 110 mL de
DMF. Après dissolution du solide, une solution de 95 mg de 4-diméthylaminopyridine (DMAP) dans 1 mL de DMF est ajoutée, le mélange est agité à 80°C pendant 18 h, puis refroidi à 15°C. A une solution de 286 mg de chlorhydrate de méthioninamide dans 5 mL de DMF sont ajoutés 220 \L de triéthylamine et la solution est agitée à température ambiante. Une solution de 1,04 g d'octadécylamine dans 11 mL de DMF, la solution précédente, 189 mg de DMAP dans 1 mL de DMF, puis 1,26 mL de diisopropylcarbodiimide (DIPC) sont successivement ajoutés à la solution de polyglutamate dans le DMF. Le mélange réactionnel est agité à 15°C pendant 24 h, puis la réaction est arrêtée en ajoutant une solution de 0,3 mL d'HCl concentré (35 %), 0,3 mL d'eau et 5 mL de DMF. La solution est versée dans 500 mL d'eau et neutralisée avec de la soude 1 N. La solution obtenue est diafîltrée contre de l'eau salée (0,9 %) puis de l'eau, et concentrée. Les taux de greffage molaire de l'octadécylamine et de la méthioninamide, déterminés par RMN du proton dans le TFA-d, sont respectivement de 10 et 4 % des unités monomères.
EXEMPLE 4
Etude de la stabilité de l'hormone de croissance formulée avec le polymère de l'exemple 1
La formulation est préparée par simple mélange d'une solution de polymère 1 ajustée en pH (HC1 ou NaOH) et en osmolalité (NaCl) à environ pH 7,0 et 300 mOsm/Kg et d'une solution de protéine, pour obtenir une concentration finale de 0,7 mg/mL en hormone de croissance et 22 mg/mL en polymère 1. Dans ces conditions, la formulation contenant le polymère 1 a une concentration équivalente en méthionine d'environ 2,4 mM. La solution de polymère a préalablement été filtrée à travers un filtre de 0,2 μιη. La formulation finalement obtenue est agitée pendant une nuit à température ambiante puis est divisée, une partie étant placée dans un réfrigérateur à 5°C. On mesure par chromatographie liquide (HPLC) le taux d'hormone de croissance oxydée dans les échantillons selon les conditions suivantes : Colonne Symmetry300 Cl 8 (Waters ; 150 x 4,6 mm ; 3,5 μιη), débit : 0,8 mL/min, détection UV : 220 nm, température de la colonne de 55°C, tampon phosphate de potassium 25 mM pH=6,5 / Propanol - 1 comme éluant.
Deux résidus méthionine sont sensibles à l'oxydation dans l'hormone de croissance : la méthionine en position 14 et la méthionine en position 125. Ces deux produits de dégradation sont pris en compte dans la quantification de l'oxydation.
Les taux en protéine oxydée mesurés à T0 et après 2 mois T(2 mois) à 5°C sont donnés dans le tableau 1 suivant :
TABLEAU 1
Figure imgf000018_0001
EXEMPLE 5
Etude de la stabilité de l'interféron alpha 2b formulé avec le polymère de l'exemple 1 La formulation (formulation 5) est préparée par simple mélange d'une solution de polymère de l'exemple 1 ajustée en pH et en osmolalité (à environ pH 6,5 et 300 mOsm/Kg) et d'une solution de protéine, pour obtenir une concentration finale de 0,3 mg/mL en interféron alpha 2b et 22 mg/mL en polymère. Dans ces conditions, la formulation contenant le polymère 1 a une concentration équivalente en méthionine d'environ 2,4 mM. La solution de polymère a préalablement été filtrée à travers un filtre de 0,2 μιη. La formulation finalement obtenue est agitée pendant une nuit à température ambiante puis placée dans un réfrigérateur à 5°C.
On prépare dans des conditions similaires une solution de la protéine avec une concentration équivalente de méthionine pour comparaison (formulation de référence). On mesure par chromatographie liquide (HPLC), le taux de forme oxydée (correspondant à l'oxydation de la méthionine en position 111) selon les conditions chromatographiques suivantes : Colonne YMC C30 (Interchim ; 250 x 4,6 mm ; 3 μιη), débit : 1 mL/min, détection f uorimétrique : excitation à 280 nm et émission à 340 nm, température de la colonne de 20°C, eau/acétonitrile/TFA comme éluant.
Les taux en protéine oxydée mesurés à T0 et après 2 mois T(2 mois) à 5°C sont reportés sur la figure 1.
Des exemples 4 et 5, on peut conclure que l'utilisation d'un polymère selon l'invention permet de réduire plus efficacement le taux de protéine oxydée lors de la formulation et/ou de maintenir un taux faible dans le temps.
EXEMPLE 6
Préparation de microparticules à partir du polymère de l'exemple 1 et un polymère de l 'art antérieur ne contenant pas de méthionine liée.
Pour certaines applications, la fabrication d'une formulation comportant des microparticules de polymères et un principe actif est préférée (par exemple dans la demande WO 2007/141344 de la demanderesse). On fabrique une formulation microparticulaire selon l'exemple 18 de la demande WO 2007/141344, autrement dit, à partir d'un polymère PO polyglutamate greffé par l'alpha-tocophérol, de l'IFN et de la méthionine sous forme libre.
On prépare dans des conditions similaires, une formulation microparticulaire à partir de l'IFN et du polymère de l'exemple 1 conforme à l'invention, comprenant des greffons d'alpha-tocophérol et des greffons méthionine. On dose la quantité de méthionine dans les microparticules. Les résultats sont reportés dans le tableau 2 suivant.
TABLEAU 2
Figure imgf000020_0001
II est donc démontré qu'il y a une perte importante de la méthionine dans la formulation de microparticules selon la demande WO 2007/141344, qui n'est pas observée lorsque le polymère 1 conforme à l'invention est utilisé. De plus, l'utilisation d'un polymère selon l'invention permet une distribution homogène de la méthionine dans les particules, quelle que soit leur taille.

Claims

REVENDICATIONS
1. Polymère amphiphile comportant un squelette hydrophile, caractérisé en ce que ledit squelette est porteur d'au moins un groupement latéral méthionine ou un de ses dérivés, et de groupements latéraux hydrophobes distincts de ladite méthionine ou l'un de ses dérivés.
2. Polymère selon la revendication précédente, dans laquelle le ou les groupements méthionine et/ou groupements hydrophobes sont disposés de façon aléatoire.
3. Polymère selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que son squelette hydrophile est un polymère ou copolymère appartenant à la famille des polyaminoacides, des polysaccharides, des polyacrylates ou des polyméthacrylates .
4. Polymère selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que son squelette hydrophile est un polyamino acide choisi parmi les poly(acide glutamique), les poly(acide aspartique), les polylysines ou leurs copolymères.
5. Polymère selon l'une quelconque des revendications précédentes possédant un taux de greffage molaire en méthionine variant de 0,5 à 20 %.
6. Polymère selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le ou les groupement(s) méthionine possède(nt) l'une des structures suivantes :
Figure imgf000021_0001
(I) (II) (III) dans lesquelles :
- Ra représente un groupement hydroxy, NH2, OMe, OEt, NHCH3 ou N(CH3)2,
- Rb et Rc représentent indépendamment un atome d'hydrogène, un méthyle ou un éthyle, avec lorsque l'un des groupements Rb et Rc est un atome d'hydrogène, alors l'autre groupement représente un groupement acyle de Ci à C6, et la configuration de la méthionine pouvant être L, D ou un mélange racémique.
7. Polymère selon l'une quelconque des revendications précédentes possédant un taux de greffage molaire en groupements hydrophobes variant de 2 à 30 %.
8. Polymère selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le groupement hydrophobe est choisi parmi les groupes comprenant :
- les alkyles linéaires ou ramifiés en C5 à C30 comportant éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome,
- les alkylaryles ou arylalkyles en Cs à C30 comportant éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome,
- les (poly)cycliques en C10 à C30 comportant éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome.
9. Polymère selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que son squelette hydrophile est un poly(L)glutamate de sodium et le groupement hydrophobe un groupement tocophéryle d'origine synthétique.
10. Polymère selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le dérivé de la méthionine est la méthionine amide ou l'ester éthylique de la méthionine.
1 1. Polymère selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il présente une masse molaire en poids allant de 2 000 à 200 000 g/mole, de préférence de 5 000 à 100 000 g/mole.
12. Polymère selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est en outre porteur d'au moins un greffon de type polyéthylène glycol, et plus particulièrement mis en œuvre avec un pourcentage molaire de greffage variant de 1 à 10 %.
13. Polymère selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est apte à former spontanément, lorsqu'il est mis en dispersion dans un milieu aqueux de pH allant de 5 à 8, notamment l'eau, des nanoparticules.
14. Nanoparticules d'un polymère selon l'une quelconque des revendications précédentes dont la taille varie de 1 à 1000 nm, en particulier de 5 à 500 nm, notamment de 10 à 300 nm, et plus particulièrement de 10 à 200 nm, voire de 10 à 100 nm.
15. Composition caractérisée en ce qu'elle contient un polymère selon les revendications 1 à 13 et au moins, à titre d'actif, une protéine ou peptide sensible à l'oxydation.
16. Composition selon la revendication précédente caractérisée en ce que la protéine ou peptide contient au moins une méthionine dans sa séquence.
17. Composition selon la revendication 15 ou 16 caractérisée en ce qu'elle se présente sous la forme de nanoparticules, microparticules, gels ou films.
18. Composition selon l'une quelconque des revendications 15 à 17, apte à assurer un profil de libération régulée dudit actif en fonction du temps.
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