WO2011071088A1 - スーパーオキシド製造方法、スーパーオキシド消去能評価方法、スーパーオキシド製造装置およびスーパーオキシド消去能評価装置 - Google Patents

スーパーオキシド製造方法、スーパーオキシド消去能評価方法、スーパーオキシド製造装置およびスーパーオキシド消去能評価装置 Download PDF

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WO2011071088A1
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superoxide
determination
spectrum
spin
electron donor
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博匡 藤井
俊志 郡
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北海道公立大学法人 札幌医科大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01B—NON-METALLIC ELEMENTS; COMPOUNDS THEREOF; METALLOIDS OR COMPOUNDS THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASS C01C
    • C01B15/00—Peroxides; Peroxyhydrates; Peroxyacids or salts thereof; Superoxides; Ozonides
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J19/08—Processes employing the direct application of electric or wave energy, or particle radiation; Apparatus therefor
    • B01J19/12—Processes employing the direct application of electric or wave energy, or particle radiation; Apparatus therefor employing electromagnetic waves

Definitions

  • the present invention relates to a superoxide production method, a superoxide elimination ability evaluation method, a superoxide production apparatus, and a superoxide elimination ability evaluation apparatus.
  • Superoxide (superoxide, superoxide anion, superoxide anion radical) is a substance in which one electron is added to an oxygen molecule, and is represented by a chemical formula of (.O 2 ⁇ ). That is, superoxide is a kind of radical (free radical, free radical) having unpaired electrons.
  • An unpaired electron is an unpaired electron located in the outermost orbital of a molecule or atom, and radicals generally react or oxidize or reduce other substances in an attempt to eliminate this unpaired electron. It is a high substance.
  • Superoxide is a kind of active oxygen. Active oxygen refers to a derivative of oxygen in which oxygen becomes chemically active and generally exhibits a very unstable and strong oxidizing power. Superoxide is the most frequently generated active oxygen in the living body, and is always produced by enzymes such as xanthine oxidase, NAD (P) H oxidase, and aldehyde oxidase in the energy metabolism system, nucleic acid metabolism system, immune system, and the like. Moreover, the production
  • superoxide generated excessively in the living body is activated oxygen having a stronger oxidizing power than superoxide, such as hydrogen peroxide and hydroxy radical ( ⁇ OH ⁇ ), due to a spontaneous disproportionation reaction.
  • superoxide causes oxidative degeneration of various substances such as nucleic acids, enzymes, and cell membranes. Therefore, superoxide is considered as one of the starting materials for oxidative damage in living organisms, and is considered to cause diseases and aging. Yes. Therefore, research on the effects of superoxide on the living body and the search for substances that suppress the activity of superoxide have been carried out recently, and there is a need for technology that generates superoxide without generating extra radicals. It has been.
  • non-patent document 1 a method of generating hypoxanthine by causing xanthine oxidase to act
  • a method of dissolving potassium superoxide (KO 2 ) in water a method of dissolving potassium superoxide (KO 2 ) in water
  • Patent Document 1 A method of generating an electric current between the anode and the redox polymer-supported cathode (Patent Document 1), a method of generating an aluminum anodic oxide film immersed in water by irradiating ultraviolet light (Patent Document 2), and a mixed gas
  • Patent Document 3 A method of applying a high voltage to a sealed discharge tube (Patent Document 3), a method using a pulse radiolysis method (Non-Patent Document 3), a method of irradiating light to a flavin and an electron donor (Non-Patent Document 4) To 7).
  • JP 2002-273433 A JP 2003-112053 A JP-A-10-152306
  • Non-Patent Document 1 causes a decrease or loss of enzyme activity, stable superoxide generation cannot be ensured.
  • Non-Patent Document 2 super It is difficult to control the amount of oxide generated.
  • other molecules such as hydroxy radicals and hydrated electrons are generated simultaneously with the generation of superoxide, so that superoxide cannot be selectively generated.
  • the methods disclosed in Patent Document 1 and Patent Document 2 also generate super radicals and other molecules such as hydroxy radicals, hydrogen peroxide, or ozone at the same time. Cannot be generated automatically.
  • Non-Patent Documents 4 to 7 also generate other molecules such as radicals derived from electron donors (electron donor radicals, interfering radicals, TH radicals) simultaneously with superoxide, Again, superoxide cannot be selectively generated. Furthermore, since the method disclosed in Non-Patent Document 3 requires a device for irradiating radiation, it cannot be said to be a simple method. However, the method disclosed in Patent Document 3 also requires a high voltage. At the same time, the inside of the discharge tube must be set to a negative pressure, and it is not a simple method.
  • the present invention has been made in order to solve such problems, and a method and an object for selectively and stably producing superoxide or a radical containing superoxide at a high purity in a simple and stable manner.
  • an apparatus for selectively generating superoxide or a radical containing superoxide with high purity, and producing it simply and stably, and the superoxide of the target sample An object of the present invention is to provide an apparatus for simply evaluating the erasing ability.
  • the inventors of the present invention irradiate light on a determination solution containing a flavin, an electron donor, a spin trap agent, and an aqueous solvent to produce a superoxide spin adduct, an electron donor radical (interfering radical, TH ⁇
  • an electron donor radical interfering radical, TH ⁇
  • a spectrum is obtained by electron spin resonance, and this spectrum and the standard spectrum of a superoxide spin adduct (superoxide standard)
  • the generation of electron donor radicals is obtained by obtaining the concentration of the flavin by determining whether the spectrum is similar to the spectrum and irradiating the raw material solution containing the obtained concentration of flavin, electron donor and aqueous solvent with light.
  • (1) Superoxide production method having the following steps (a), (b), (c), (d), (e), (f) and (g); (A) a determination solution preparation step for preparing a determination solution containing a flavin, an electron donor, a spin trap agent, and an aqueous solvent; (B) a determination spin adduct / radical generation step of irradiating the determination solution with light to generate a superoxide spin adduct, an electron donor radical spin adduct and / or an electron donor radical; (C) a spectrum acquisition step for determination for acquiring a spectrum by detecting the spin adduct of the generated superoxide, the spin adduct of the electron donor radical and / or the electron donor radical by electron spin resonance; (D) a similarity determination step of determining whether a standard spectrum of a superoxide spin adduct is similar to the determination spectrum; (E) a flavin concentration acquisition step of acquiring a similar flavin concentration by the similarity determination; (F) a raw material
  • step (h) When the flavin is riboflavin, it has the following step (h) instead of the steps (a), (b), (c), (d), (e) and (f): 1) Superoxide production method according to (H) A raw material solution preparation step of preparing a raw material solution containing riboflavin, an electron donor and an aqueous solvent so that the concentration C ( ⁇ mol / L) of riboflavin is 0.1 ⁇ C ⁇ 15.
  • the flavin concentration acquisition step is a flavin concentration acquisition step of acquiring a flavin concentration that is similar by the similarity determination so that the purity of the superoxide in the generated radical is 75.6 to 100%. Or the superoxide production method according to (2).
  • a method for evaluating the superoxide scavenging ability of a sample comprising: (a), (b), (c), (d), (e), (i), (j), (k) and The method comprising the step of (l); (A) a determination solution preparation step for preparing a determination solution containing a flavin, an electron donor, a spin trap agent, and an aqueous solvent; (B) a determination spin adduct / radical generation step of irradiating the determination solution with light to generate a superoxide spin adduct, an electron donor radical spin adduct and / or an electron donor radical; (C) a spectrum acquisition step for determination for acquiring a spectrum by detecting the spin adduct of the generated superoxide, the spin adduct of the electron donor radical and / or the electron donor radical by electron spin resonance; (D) a similarity determination step of determining whether a standard spectrum of a superoxide spin adduct is similar to the determination spectrum; (E) a
  • the flavin concentration acquisition step is a flavin concentration acquisition step of acquiring the concentration of flavin that is similar by the similarity determination so that the purity of the superoxide in the generated radical is 75.6 to 100%. ) Or the method according to (8).
  • a superoxide production apparatus comprising the following means (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi) and (vii); (I) a determination solution preparation means for preparing a determination solution containing a flavin, an electron donor, a spin trap agent and an aqueous solvent; (Ii) a determination spin adduct / radical generation means for generating a superoxide spin adduct, an electron donor radical spin adduct and / or an electron donor radical by irradiating the determination solution with light; (Iii) A spectrum acquisition means for determination for acquiring a spectrum by detecting the spin adduct of the generated superoxide, the spin adduct of the electron donor radical and / or the electron donor radical by electron spin resonance, (Iv) Similarity determining means for determining whether or not the standard spectrum of the superoxide spin adduct is similar to the determination spectrum; (V) flavin concentration acquisition means for acquiring the concentration of flavins that are similar by the similarity
  • the flavin concentration acquisition means is a flavin concentration acquisition means for acquiring a flavin concentration that is similar by the similarity determination so that the purity of the superoxide in the generated radical is 75.6 to 100%.
  • the superoxide production apparatus according to (14).
  • the flavin concentration acquisition means is a flavin concentration acquisition means for acquiring the concentration of flavin that is similar by the similarity determination so that the purity of the superoxide in the generated radical is 75.6 to 100%. ) Or (20).
  • (25) Superoxide in vivo production method having the following steps (A), (B), (C), (D), (E), (F) and (G); (A) A raw material administration step of administering an arbitrary amount of flavin, electron donor and spin trap agent into a biological sample or the body of a non-human animal, (B) Superoxide spin adduct, electron donor radical spin adduct and / or a portion where the administered flavin, electron donor and spin trap agent are present in the biological sample or non-human animal body.
  • a determination spin adduct / radical generation step for generating an electron donor radical (C) A spectrum acquisition step for determination, in which the generated superoxide spin adduct, electron donor radical spin adduct and / or electron donor radical is detected by electron spin resonance to acquire a spectrum; (D) a similarity determination step of determining whether the standard spectrum of the superoxide spin adduct is similar to the determination spectrum; (E) Optimum flavin acquisition step of acquiring an optimal amount of flavins similar by the similarity determination, (F) Optimal raw material administration step of administering the obtained optimal amount of flavin and electron donor into the body of the biological sample or non-human animal, (G) A generation step in which superoxide is generated by irradiating light to a site where the administered flavin and electron donor are present in the biological sample or non-human animal body.
  • a determination spin adduct / radical generation step for generating an electron donor radical (C) A spectrum acquisition step for determination, in which the generated superoxide spin adduct, electron donor radical spin adduct and / or electron donor radical is detected by electron spin resonance to acquire a spectrum; (D) a similarity determination step of determining whether the standard spectrum of the superoxide spin adduct is similar to the determination spectrum; (E) Optimum flavin acquisition step of acquiring an optimal amount of flavins similar by the similarity determination, (H) an evaluation specimen administration step of administering an evaluation specimen containing the obtained optimal amount of flavin, electron donor, spin trap agent and superoxide scavenging ability into a biological sample or a non-human animal body; (I) an in vivo spin adduct generation step of generating a spin adduct by irradiating light to the administered evaluation specimen in the biological sample or the non-human animal body; (J) an in vivo spectrum acquisition step of acquiring a spectrum by a
  • the present invention it is possible to selectively generate superoxide or a high-purity superoxide-containing radical in vitro and in vivo and easily and stably produce it. Evaluation and research on the involvement of superoxide can be performed accurately and simply, and the search for treatments / prevention methods for diseases and aging phenomena involving superoxide and the elucidation of the progression mechanism can be promoted.
  • the superoxide scavenging ability of a target sample can be easily evaluated in vitro and in vivo, a search for an antioxidant substance that is truly effective for a living body and various substances can be performed. It is possible to accurately, conveniently and quickly evaluate the antioxidant ability of the.
  • FIG. 10 It is a figure which shows the evaluation solution preparation means 10 in this embodiment. It is a figure which shows the spectrum obtained by performing the measurement by electron spin resonance (ESR) after irradiating visible light to the SOD non-addition water system solution and the SOD addition water system solution.
  • spectrum A shows a spectrum obtained from an SOD-free aqueous solution
  • spectrum B shows a spectrum obtained from an SOD-added aqueous solution.
  • the vertical axis represents the amount of radicals generated
  • the horizontal axis represents the riboflavin concentration.
  • the vertical axis represents signal intensity
  • the horizontal axis represents visible light irradiation time or time after stopping visible light irradiation.
  • production inhibition rate by SOD in the case where superoxide is generated by light irradiation of riboflavin and in the case where superoxide is generated by xanthine oxidase.
  • the vertical axis represents the radical generation inhibition rate
  • the horizontal axis represents the added SOD concentration.
  • the superoxide production method includes the following steps (a), (b), (c), (d), (e), (f) and (g);
  • A a determination solution preparation step for preparing a determination solution containing a flavin, an electron donor, a spin trap agent, and an aqueous solvent
  • B a determination spin adduct / radical generation step of irradiating the determination solution with light to generate a superoxide spin adduct, an electron donor radical spin adduct and / or an electron donor radical
  • D a similarity determination step of determining whether a standard spectrum of a superoxide spin adduct is similar to the determination spectrum
  • E a flavin concentration acquisition step of acquiring a similar flavin concentration by the similarity determination;
  • the “radical containing high purity and superoxide” is a set of radicals composed of superoxide and an electron donor radical (interfering radical, TH ⁇ radical), and superoxide occupies the set.
  • a radical whose ratio (purity of superoxide) is sufficiently large compared to the ratio occupied by radicals other than superoxide, and its purity is preferably 70% or more and less than 100%, preferably 75.6% or more and less than 100%. Is more preferably 83.3% or more and less than 100%.
  • the purity of superoxide in a radical containing superoxide can be calculated according to a conventional method. For example, first, a radical containing superoxide is generated in an aqueous solution and measured by electron spin resonance. A spectrum similar to the oxide standard spectrum is obtained, and the amount of superoxide generated is measured based on this spectrum. Next, radicals are generated after adding superoxide dismutase (SOD), an enzyme that specifically eliminates superoxide, to an aqueous solution having the same composition as when the amount of superoxide generated is measured. A spectrum is obtained by measurement, and the amount of electron donor radical (interfering radical, TH.radical) generated is measured based on this spectrum. Subsequently, the purity of the superoxide can be calculated from the measured superoxide generation amount and the amount of electron donor radical (interfering radical, TH ⁇ radical) generation by the following equation 1.
  • SOD superoxide dismutase
  • ESR electron spin resonance
  • a sample is placed in a magnetic field, microwaves are irradiated to resonate unpaired electrons of radicals contained in the sample, and the absorption energy generated when the sample is resonated is measured.
  • the absorption energy is measured while changing the magnetic field, and a series of absorption energy changes are acquired as a spectrum. Since the shape of the spectrum is determined depending on the type of radical, the radical contained in the sample can be identified by observing the shape of the acquired spectrum.
  • the standard spectrum of a superoxide spin adduct is a superoxide spin adduct, a high-purity radical containing a superoxide, or a high-purity radical containing a superoxide.
  • This refers to a spectrum obtained by performing measurement by electron spin resonance or a spectrum assumed to be obtained by measurement by electron spin resonance for a mixture of a spin adduct and a radical.
  • the superoxide standard spectrum can be obtained, for example, by computer simulation, and the one described in the previous report (MASATO K. et al., Free Radical Research, Vol. 40, No. 11, pp. 1166-1172, 2006) is used.
  • it can be obtained by generating a high-purity radical containing superoxide with xanthine oxidase and performing measurement by electron spin resonance.
  • the determination solution can be prepared by dissolving a flavin, an electron donor, and a spin trap agent in an aqueous solvent. It may contain substances.
  • Flavin is a group of derivatives having a substituent at the 10-position of dimethylisoalloxazine. As shown in the following formulas 2 and 3, when flavin is irradiated with light in the presence of an electron donor, it is excited to a higher energy level, takes one electron from the electron donor, and becomes a flavin radical. At the same time, since the electron donor deprived of one electron has an unpaired electron, it becomes an electron donor radical (interfering radical, TH.radical) (Formula 2). Subsequently, the flavin radical adds one electron to the oxygen molecule and generates superoxide (Formula 3).
  • the above reaction can be used to produce superoxide or a radical containing superoxide with high purity.
  • the flavin that can be used in the present invention include riboflavin, flavin mononucleotide (FMN), isoalloxazine, alloxazine, lumichrome, lumiflavin, flavin-adenine dinucleotide (FAD), galactoflavin, D-araboflavin, lysoflavin and their Arbitrary combinations and the like can be mentioned, but riboflavin, FMN, or a mixture thereof can be preferably used.
  • the electron donor used in the present invention may be any substance having a low redox potential that gives electrons to the excited flavin, and examples thereof include oxygen-containing compounds, nitrogen-containing compounds, phosphorus-containing compounds, and sulfur-containing compounds. Nitrogen-containing compounds are preferred. Examples of such nitrogen-containing compounds include ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), methionine, tetramethylethylenediamine (TMD, TMED), and EDTA can be preferably used.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • TMD tetramethylethylenediamine
  • TMED tetramethylethylenediamine
  • a spin trap agent is a reagent that forms a stable spin adduct by covalent bonding (adduct) with an unstable radical that changes to another substance in a short time. Since superoxide is also an unstable radical, it is difficult to detect it directly by electron spin resonance, but it can be detected by generating a spin adduct.
  • the spin trapping agent used in the present invention is not particularly limited as long as it generates at least a superoxide and a spin adduct.
  • CYPMPO 5,5-Dimethyl-2-oxo-2 ⁇ 5- [1,3,2] dioxphosphinan- 2-yl) -2-methyl-3,4-dihydro-2H-pyrrole 1-oxide
  • DMPO 5,5-Dimethyl-1-pyrroline N-oxide
  • DEPMPO 5-Diethylphosphoryl 5-methyl-1- pyrroline N-oxide
  • M 3 PO 2,5,5-triethyl-1-pyrroline N-Oxide
  • T PO 3,3,5,5-Tetramethyl-1-pyrroline N-Oxide
  • the aqueous solvent used in the present invention is not particularly limited as long as it has a function of keeping the pH of the solution containing the aqueous solvent constant.
  • phosphate buffer, acetate buffer, citrate buffer, borate buffer , Tartrate buffer solution, Tris buffer solution and the like, and phosphate buffer solution can be preferably used.
  • the light source that can be used in the present invention include a xenon lamp, a fluorescent lamp, a halogen lamp, a krypton lamp, a sodium lamp, a mercury lamp, and a metal halide lamp.
  • the type of light (wavelength), light intensity, and irradiation time used in the present invention are not particularly limited, and the type of light source, the positional relationship between the light source and the target to be irradiated, the amount of target to be irradiated, and the target to be irradiated.
  • the concentration can be appropriately set according to conditions such as the necessary amount of superoxide generated as a result of irradiation.
  • the spin trapping agent in the determination solution forms a spin adduct with an electron donor radical (interfering radical, TH radical)
  • the spin adduct of the electron donor radical (interfering radical, TH radical) Produces.
  • high homology means at least 70% homology, preferably 80% or more homology, more preferably 85% homology, more preferably 90% or more homology, still more preferably Refers to homology of 95% or more.
  • step (e): flavin concentration acquisition step the flavin concentration that is similar by similarity determination can be acquired so that the purity of the superoxide in the generated radical is in the range of 75.6 to 100%.
  • radicals are irradiated by irradiating light to a raw material solution containing riboflavin, an electron donor and an aqueous solvent so that the riboflavin concentration C ( ⁇ mol / L) is 0.1 ⁇ C ⁇ 15.
  • the produced radical can be produced so that the purity of the superoxide is 75.6% to 100%. Furthermore, when a radical was generated by irradiating light to a raw material solution containing riboflavin, an electron donor and an aqueous solvent so that the concentration C ( ⁇ mol / L) of riboflavin was 0.1 ⁇ C ⁇ 10, it was generated. The radicals can be produced so that the purity of superoxide is 83.3% to 100%.
  • the superoxide scavenging ability evaluation method is a method for evaluating the superoxide scavenging ability of a sample, and includes the following (a), (b), (c), (d), (e), Having steps (i), (j), (k) and (l);
  • A a determination solution preparation step for preparing a determination solution containing a flavin, an electron donor, a spin trap agent, and an aqueous solvent;
  • B a determination spin adduct / radical generation step of irradiating the determination solution with light to generate a superoxide spin adduct, an electron donor radical spin adduct and / or an electron donor radical;
  • C a spectrum acquisition step for determination for acquiring a spectrum by detecting the spin adduct of the generated superoxide, the spin adduct of the electron donor radical and / or the electron donor radical by electron spin resonance;
  • D a similarity determination step of determining whether a standard spectrum of a superoxide spin
  • the evaluation solution can be prepared by dissolving a flavin, an electron donor, a spin trap agent, and a sample for evaluating superoxide elimination ability in an aqueous solvent.
  • the concentration of flavin in the evaluation solution is adjusted to be the concentration obtained in step (e).
  • the evaluation solution may contain other substances as long as the characteristics are not impaired.
  • Examples of the sample for evaluating the superoxide scavenging ability in the present invention include compounds such as foods, plant extracts, cosmetic compositions, and pharmaceutical compositions.
  • the sample to be evaluated is evaluated as “having an erasing ability” by erasing the superoxide before the superoxide changes into a spin adduct.
  • the evaluation of the superoxide scavenging ability of a sample was conducted when the signal intensity of the spectrum for evaluation was smaller than the signal intensity of the superoxide standard spectrum. It has an erasing ability.
  • the sample is evaluated as “not superoxide-erasing ability”, assuming that the superoxide is not erased. Is done.
  • the signal intensity in the evaluation spectrum is the same as the signal intensity in the superoxide standard spectrum.
  • the signal intensity of the evaluation spectrum is almost the same as the signal intensity of the superoxide standard spectrum.
  • An evaluation solution preparation step of preparing an evaluation solution including
  • the superoxide production apparatus comprises the following means (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi) and (vii); (I) a determination solution preparation means for preparing a determination solution containing a flavin, an electron donor, a spin trap agent and an aqueous solvent; (Ii) a determination spin adduct / radical generation means for generating a superoxide spin adduct, an electron donor radical spin adduct and / or an electron donor radical by irradiating the determination solution with light; (Iii) A spectrum acquisition means for determination for acquiring a spectrum by detecting the spin adduct of the generated superoxide, the spin adduct of the electron donor radical and / or the electron donor radical by electron spin resonance, (Iv) Similarity determining means for determining whether or not the standard spectrum of the superoxide spin adduct is similar to the determination spectrum; (V) flavin concentration acquisition means
  • FIG. 1 is a conceptual diagram illustrating the basic configuration of a superoxide production apparatus 1 according to this embodiment.
  • the superoxide production apparatus 1 mainly includes a determination solution preparation means 2, a determination spin adduct / radical generation means 3, a determination spectrum acquisition means 4, a similarity determination means 5, and a flavin.
  • the concentration acquisition means 6, the raw material solution preparation means 7, and the generation means 8 are configured.
  • the determination solution preparation means 2 only needs to have a configuration and a function capable of appropriately preparing a determination solution containing a flavin, an electron donor, a spin trap agent, and an aqueous solvent.
  • a determination injection tube 22 inserted into the determination solution storage unit 23 is formed, and a determination having an injection amount adjusting function according to the number of substances to be injected.
  • a configuration including a plurality of containers 21 for use can be exemplified.
  • an appropriate amount of flavin is supplied from each determination injection tube 22 of the determination container 21 having an injection amount adjusting function, each of which contains a flavin, an electron donor, a spin trap agent, and an aqueous solvent.
  • the electron donor, the spin trap agent, and the aqueous solvent can be injected into the determination solution storage unit 23, and as a result, the determination solution can be prepared.
  • the determination solution preparation unit 2 is configured to be controllable by a control signal output from a control signal output unit 62 described later.
  • maintains a liquid can be mentioned, for example.
  • the material constituting the container is preferably a material having high transparency, water resistance, corrosion resistance, and chemical resistance. Examples of such a material include glass and plastic.
  • the determination spin adduct / radical generation means 3 only needs to have a configuration and a function capable of appropriately irradiating the determination solution with light.
  • a configuration comprising a light source.
  • Mercury lamps and metal halide lamps are examples of such a configuration comprising a light source.
  • the spectrum acquisition means 4 for determination includes a spin adduct of superoxide obtained by irradiating the determination solution with light, a spin adduct of electron donor radicals (interfering radicals, TH radicals) and / or an electron donor radical. It is only necessary to have a configuration or function capable of detecting (interfering radicals, TH ⁇ radicals) by electron spin resonance and acquiring the spectrum. Examples of such a configuration include an electromagnet 41, a microwave oscillator 42, a crystal diode detector 43, an amplifier 44, and a recorder 45 as shown in FIG.
  • the determination solution storage unit 23 is placed in the magnetic field formed by the electromagnet 41, and the microwave oscillator 42 irradiates microwaves to resonate unpaired electrons of the spin adduct contained in the determination solution.
  • the generated absorption energy is detected by the crystal diode detector 43, and the detected signal is amplified by the amplifier 44 and then recorded by the recorder 45, whereby the determination spectrum can be obtained.
  • a configuration conforming to a commercially available ESR measurement device such as JES-RE1X (JEOL Ltd.) may be adopted.
  • the similarity determination means 5 only needs to have a configuration and a function capable of determining whether or not the acquired determination spectrum is similar to the superoxide standard spectrum.
  • a configuration including an input unit 51 for inputting spectrum data and a display unit 52 for displaying the input spectrum can be given.
  • the data of the superoxide standard spectrum and the determination spectrum are input to the input unit 51, and these spectra are displayed on the display unit 52 to determine whether or not they are similar by comparing their shapes. be able to.
  • the flavin concentration acquisition unit 6 can acquire the concentration of flavin related to the determination solution. What is necessary is just to have a structure and a function. That is, according to the flavin concentration acquisition means 6, when the similarity determination means 5 determines that the superoxide standard spectrum and the determination spectrum are not similar, the determination solution preparation means 2 again changes the flavin concentration. Thereafter, the determination process by the determination spin adduct / radical generation means 3 ⁇ the determination spectrum acquisition means 4 ⁇ the similarity determination means 5 is repeated until a determination spectrum similar to the superoxide standard spectrum is obtained. Therefore, the desired flavin concentration can be finally obtained.
  • the flavin concentration acquisition means 6 can acquire the flavin concentration that is similar by similarity determination so that the purity of the superoxide in the generated radical is in the range of 75.6 to 100%.
  • the similarity determination means 5 and the flavin concentration acquisition means 6 described above may be configured by, for example, a personal computer. Specifically, as shown in FIG. 2, a storage unit R for storing the similarity determination program and the flavin concentration acquisition process described above, various data necessary for the similarity determination, and the like, and the storage unit R And arithmetic processing means C that acquires various data from the spectrum acquisition means 4 for determination and performs arithmetic processing.
  • a storage unit R for storing the similarity determination program and the flavin concentration acquisition process described above, various data necessary for the similarity determination, and the like
  • arithmetic processing means C that acquires various data from the spectrum acquisition means 4 for determination and performs arithmetic processing.
  • the storage means R is composed of ROM (ReadReOnlymMemory), RAM (Random Access Memory), HDD (Hard Disk Drive), flash memory, and the like, and stores various data, and the arithmetic processing means C performs arithmetic processing. It functions as a working area when performing.
  • the storage unit R has a similarity determination program installed therein.
  • the arithmetic processing means C makes a computer function as each component mentioned later by executing the similarity determination program.
  • the usage form of the similarity determination program is not limited to the above configuration, but may be stored in a recording medium such as a CD-ROM, and directly started and executed from this recording medium.
  • the storage means R stores standard spectrum data that serves as a reference for similarity determination.
  • this standard spectrum data is a database of data obtained by computer simulation or previous reports, for example.
  • the arithmetic processing means C is composed of a CPU (Central Processing Unit) and the like, and by executing a similarity determination program installed in the storage means R, as shown in FIG.
  • the unit 53, the standard spectrum data acquisition unit 54, the spectrum comparison determination unit 55, the flavin concentration acquisition unit 61, and the control signal output unit 62 are configured to function.
  • each of these components will be described in more detail.
  • the determination spectrum data acquisition unit 53 acquires the determination spectrum acquired by the determination spectrum acquisition means 4 as data.
  • the determination spectrum recorded in the recorder 45 may be converted into digital data and input from the input unit 51 including a predetermined interface.
  • the standard spectrum data acquisition unit 54 reads out and acquires standard spectrum data stored in the storage means R.
  • the spectrum comparison / determination unit 55 compares the determination spectrum with the standard spectrum to determine whether or not they are similar. Specifically, the spectrum comparison determination unit 55 acquires the determination spectrum data acquired by the determination spectrum data acquisition unit 53 and the standard spectrum data acquired by the standard spectrum data acquisition unit 54, compares the two, It is determined whether or not both are similar based on a predetermined similarity condition. Then, the determination result is output to the control signal output unit 62.
  • the flavin concentration acquisition unit 61 acquires the flavin concentration of the determination solution prepared by the determination solution preparation means 2.
  • the flavin concentration acquisition part 61 acquires the flavin density
  • concentration measuring device as data, when it determines with the spectrum comparison determination part 55 being similar.
  • the control signal output unit 62 outputs a control signal to the determination solution preparation means 2 and the raw material solution preparation means 7.
  • the control signal output unit 62 in the present embodiment receives a determination result that is not similar from the spectrum comparison determination unit 55, the control signal output unit 62 changes the flavin concentration and re-adjusts the determination solution preparation unit 2.
  • the control signal is transmitted.
  • the control signal indicating that the raw material solution is prepared with the flavin concentration acquired by the flavin concentration acquisition unit 61 is transmitted to the raw material solution preparation means 7.
  • the raw material solution preparation means 7 only needs to have a configuration and a function capable of appropriately preparing a raw material solution containing a flavin, an electron donor, and an aqueous solvent.
  • a raw material injection tube 72 that can be inserted into the raw material solution storage portion 73 is provided, and the raw material for the raw material is provided with an injection amount adjusting function according to the number of substances to be injected.
  • a configuration including a plurality of containers 71 can be given.
  • an appropriate amount of flavin, electron donor, and aqueous system are supplied from each raw material injection pipe 72 of the raw material container 71 having an injection amount adjustment function, each containing flavin, an electron donor, and an aqueous solvent.
  • a solvent is injected into the raw material solution storage unit 73 to prepare a raw material solution.
  • the structure similar to the solution storage part 23 for determination mentioned above can be mentioned, for example.
  • the raw material solution preparation means 7 is configured to be controllable by the control signal output from the control signal output unit 62 described above.
  • the generation means 8 only needs to have a configuration and a function capable of appropriately irradiating light to the raw material solution.
  • Examples of such a configuration include the above-described determination spin adduct / radical.
  • a configuration similar to that of the generation unit 3 can be given.
  • the determination solution preparation means 2 may be configured to also serve as the raw material solution preparation means 7, and the determination spin adduct / radical generation means 3 may also be configured to serve as the generation means 8. It is good also as a separate structure.
  • the present invention also provides a superoxide scavenging ability evaluation apparatus.
  • the superoxide scavenging ability evaluation apparatus is an apparatus for evaluating the superoxide scavenging ability of a sample, and includes the following (i), (ii), (iii), (iv), (v), (ix), Having means (x), (xi) and (xii);
  • a determination spin adduct / radical generation means for generating a superoxide spin adduct, an electron donor radical spin adduct and / or an electron donor radical by irradiating the determination solution with light;
  • a spectrum acquisition means for determination for acquiring a spectrum by detecting the spin adduct of the generated superoxide, the spin adduct of the electron donor radical and / or the electron donor radical by electron spin resonance
  • FIG. 7 is a conceptual diagram illustrating the basic configuration of the superoxide scavenging ability evaluation apparatus 9 of the present embodiment.
  • the superoxide scavenging ability evaluation device 9 mainly includes a determination solution preparation means 2, a determination spin adduct / radical generation means 3, a determination spectrum acquisition means 4, and a similarity determination means 5.
  • the same or corresponding components as those of the superoxide production device 1 described above are denoted by the same reference numerals, and the description thereof is omitted.
  • the evaluation solution preparation means 10 only needs to have a configuration and a function capable of appropriately preparing an evaluation solution containing a flavin, an electron donor, a spin trap agent, a sample for evaluating superoxide elimination ability, and an aqueous solvent. .
  • a configuration for example, as shown in FIG. 9, an evaluation container having an evaluation injection tube 102 inserted into the evaluation solution storage unit 103 and having an injection amount adjusting function according to the number of substances to be injected is provided.
  • a configuration including a plurality of 101 can be given.
  • each evaluation injection tube 102 of the evaluation container 101 having an injection amount adjusting function, each containing a flavin, an electron donor, a spin trap agent, a sample for evaluating superoxide elimination ability, and an aqueous solvent.
  • an appropriate amount of flavin, an electron donor, a spin trap agent, a sample for evaluating superoxide elimination ability, and an aqueous solvent are injected into the evaluation solution storage unit 103 to prepare an evaluation solution.
  • the evaluation solution storage part 103 the structure similar to the solution storage part 23 for determination mentioned above can be mentioned, for example.
  • the evaluation solution preparation means 10 is configured to be controllable by a control signal output from the control signal output unit 62.
  • the evaluation spin adduct generation unit 11 only needs to have a configuration and a function capable of appropriately irradiating the evaluation solution with light.
  • a configuration similar to the above-described determination spin adduct / radical generation means 3 can be exemplified.
  • the spectrum acquisition means for evaluation 12 only needs to have a configuration and a function capable of acquiring a spectrum by detecting a spin adduct obtained by irradiating the evaluation solution with light by electron spin resonance.
  • the structure similar to the spectrum acquisition means 4 for determination mentioned above can be mentioned, for example.
  • the comparative evaluation means 13 only needs to have a configuration and a function capable of evaluating the superoxide elimination ability by comparing the superoxide standard spectrum and the evaluation spectrum.
  • the structure similar to the similarity determination means 5 mentioned above can be mentioned, for example.
  • the superoxide erasing ability can be evaluated by comparing the shape of the superoxide standard spectrum displayed on the display unit 52 with the shape of the evaluation spectrum.
  • the comparative evaluation means 13 can be configured by a personal computer or the like.
  • the storage means R separately stores a comparative evaluation program for executing a comparative evaluation process.
  • the arithmetic processing means C has an evaluation spectrum data acquisition unit 131 and a spectral comparison evaluation unit 132 in addition to the components of the arithmetic processing means C in the superoxide production apparatus 1 described above, and functions. It has become.
  • control signal output unit 62 when it is determined that the spectrum comparison determination unit 55 is similar, the control signal output unit 62 outputs a control signal indicating that the evaluation solution is prepared based on the flavin concentration acquired by the flavin concentration acquisition unit 61. The data is transmitted to the preparation means 10.
  • the evaluation spectrum data acquisition unit 131 acquires the evaluation spectrum acquired by the evaluation spectrum acquisition means 12 as data.
  • the spectrum comparison / evaluation unit 132 compares the evaluation spectrum with the standard spectrum to evaluate the superoxide erasing ability. Specifically, the spectrum comparison / evaluation unit 132 acquires the evaluation spectrum data acquired by the evaluation spectrum data acquisition unit 131 and the standard spectrum data acquired by the standard spectrum data acquisition unit 54, and compares them. Superoxide scavenging ability is evaluated according to a predetermined evaluation standard.
  • the determination solution preparation means 2 is also configured as the evaluation solution preparation means 10, and the determination spin adduct / radical generation means 3 is also configured as the evaluation spin adduct generation means 11.
  • the determination spectrum acquisition unit 4 may also serve as the evaluation spectrum acquisition unit 12, and the similarity determination unit 5 may also serve as the comparison evaluation unit 13 or may be a separate configuration.
  • the superoxide erasing ability evaluation apparatus 9 of the present embodiment may be configured to also serve as the superoxide production apparatus 1.
  • the superoxide in vivo production method according to the present invention is a method in which the superoxide production method according to the present invention is applied to a biological sample or a non-human animal body.
  • the amount of flavin (optimum amount) is obtained instead of obtaining the concentration of flavin, and the portion where the administered flavin and electron donor are present is irradiated with light to generate superoxide This is different from the superoxide production method according to the present invention.
  • a raw material administration step of administering an arbitrary amount of flavin, electron donor and spin trap agent into a biological sample or the body of a non-human animal (B) Superoxide spin adduct, electron donor radical spin adduct and / or electron donor by irradiating light in the biological sample or non-human animal body where the administered flavin and electron donor are present Spin adduct for determination / radical generation process for generating radicals, (C) A spectrum acquisition step for determination, in which the generated superoxide spin adduct, electron donor radical spin adduct and / or electron donor radical is detected by electron spin resonance to acquire a spectrum; (D) a similarity determination step of determining whether the standard spectrum of the superoxide spin adduct is similar to the determination spectrum; (E) Optimum flavin acquisition step of acquiring an optimal amount of flavins similar by the similarity determination, (F) and (G); (A) A raw material administration step of administering an arbitrary amount of flavin, electron donor and spin trap agent into a
  • a biological sample separated and collected from animals including humans, particularly mammals can be used.
  • biological samples separated and collected from affected mammals, old mammals, laboratory animals, etc. Can be used.
  • a solid sample such as a tissue section or a cell is desirable.
  • non-human animals can include animals other than humans, such as cattle, monkeys (monkeys minus humans), pigs, goats, dogs, cats, guinea pigs, rabbits, hamsters. , Mammals such as rats and mice, poultry such as chickens and turkeys, reptiles, amphibians and fish.
  • a method for administering a substance such as flavin and an electron donor into a biological sample or a non-human animal can be performed according to a conventional method.
  • a method for administering to a biological sample flavin and electron donor
  • methods for administering a membrane-encapsulated liposome or microinjection method to a non-human animal include oral administration methods and subcutaneous injection methods.
  • the body fluid includes not only extracellular fluid but also intracellular fluid.
  • tissue fluid such as interstitial fluid, intercellular fluid, interstitial fluid, serous cavity fluid, brain
  • spinal fluid joint fluid
  • body cavity fluid such as aqueous humor, digestive fluid, urine, semen, vaginal fluid, amniotic fluid, and milk.
  • the superoxide in vivo scavenging ability evaluation method according to the present invention is a method to which the superoxide scavenging ability evaluation method according to the present invention is applied in the body of a biological sample or non-human animal.
  • Use of body fluids as an aqueous solvent, acquisition of flavin amount (optimum amount) instead of obtaining flavin concentration, and administered flavin and electron donor, or administered flavin, electron donor, spin The method differs from the superoxide production method according to the present invention in that a superoxide is generated or a spin adduct is generated by irradiating an evaluation specimen including a trap agent and a sample for evaluating superoxide elimination ability with light.
  • a raw material administration step of administering an arbitrary amount of flavin, electron donor and spin trap agent into a biological sample or the body of a non-human animal (B) Superoxide spin adduct, electron donor radical spin adduct and / or electron donor by irradiating light in the biological sample or non-human animal body where the administered flavin and electron donor are present Spin adduct for determination / radical generation process for generating radicals, (C) A spectrum acquisition step for determination, in which the generated superoxide spin adduct, electron donor radical spin adduct and / or electron donor radical is detected by electron spin resonance to acquire a spectrum; (D) a similarity determination step of determining whether the standard spectrum of the superoxide spin adduct is similar to the determination spectrum; (E) Optimum flavin acquisition step of acquiring an optimal amount of flavins similar by the similarity determination, (H
  • a sample for evaluating flavin, electron donor, spin trap agent and superoxide scavenging ability is directly administered to a biological sample or a non-human animal body, and the specimen to be evaluated is placed in the biological sample or non-human animal body. It may be prepared.
  • Example 1 Measurement by electron spin resonance of radicals generated by irradiating an aqueous solution containing riboflavin, EDTA, and CYPMPO by means of electron spin resonance Riboflavin as a redox reaction catalyst, EDTA as an electron donor, and CYPMPO as a spin trap agent An aqueous solution was prepared, and this was irradiated with light to generate radicals, and the generated radicals were identified and quantified by electron spin resonance (ESR).
  • ESR electron spin resonance
  • aqueous solution Riboflavin, EDTA, and CYPMPO (Radical Research Co., Ltd.) were added to a phosphate buffer solution of 50 mmol / L and pH 7.4 to give 1 ⁇ mol / L, 5 mmol / L, and 10 mmol / L, respectively.
  • a solution (a SOD-free aqueous solution) was prepared.
  • SOD superoxide dismutase
  • an enzyme that specifically eliminates superoxide was added at 10 U / mL, and an SOD-added aqueous solution was separately prepared.
  • Example (2) Measurement by ESR
  • the aqueous solutions (the SOD-free aqueous solution and the SOD-added aqueous solution) prepared in Example (1) were respectively introduced into the sample tubes of an electron spin resonance apparatus JES-RE1X (JEOL Ltd.).
  • the sample tube was irradiated with 1500 lux of visible light using a xenon lamp for 30 seconds, and then measured by ESR under the following measurement conditions to obtain a spectrum.
  • the spectrum of the SOD-free aqueous solution was designated as spectrum A
  • the spectrum of the SOD-added aqueous solution was designated as spectrum B.
  • the result is shown in FIG.
  • the shape of the spectrum A in FIG. 10 and the shape of the superoxide standard spectrum in the upper diagram of FIG. It was confirmed that the signal intensity of the standard spectrum hardly changed. Moreover, it was confirmed that the shape of the spectrum B of FIG. 10 and the shape of the EDTA radical standard spectrum of the lower figure of FIG. 11 are the same. Further, as shown in FIG. 10, it was confirmed that the signal intensity of the spectrum B was smaller than the signal intensity of the spectrum A, and the peak observed in the spectrum A was not observed in the spectrum B.
  • the peak seen in the spectrum A is derived from the spin adduct of superoxide, and that a large amount of superoxide was generated in the SOD-free aqueous solution.
  • the peak seen in the spectrum B is derived from the EDTA radical, and since the peak seen in the spectrum A is not seen in the spectrum B, a small amount of EDTA radical is generated in the SOD-added aqueous solution, It was shown that no superoxide was generated.
  • the aqueous solution according to this example generates two types of radicals, superoxide and electron donor radicals (interfering radicals, TH radicals), and selectively generates superoxide. It has been clarified that the generation of superoxide can be suppressed by adding a substance having superoxide elimination ability to this aqueous solution.
  • oxidation-reduction reaction catalyst and electron donor By changing the oxidation-reduction reaction catalyst or electron donor, radicals are generated by light irradiation, and radicals generated by ESR are identified and quantified to generate superoxide. Suitable redox reaction catalysts and electron donors were investigated.
  • Riboflavin, TMD, and CYPMPO were added to a phosphate buffer solution of 50 mmol / L and pH 7.4 so as to be 10 ⁇ mol / L, 10 mmol / L, and 10 mmol / L, respectively, to prepare an aqueous solution.
  • TMD was replaced with methionine
  • an aqueous solution was prepared in the same manner as in Example (1), and measurement by ESR was performed to obtain a spectrum.
  • the obtained spectrum is shown in FIG.
  • FMN, EDTA, and CYPMPO were added to a phosphate buffer solution of 50 mmol / L and pH 7.4 to give 5 ⁇ mol / L, 5 mmol / L, and 10 mmol / L, respectively, thereby preparing an aqueous solution.
  • An aqueous solution was prepared in the same manner as in Example (1) by replacing riboflavin with fluorescein and TMD with methionine, and a spectrum was obtained by measurement by ESR. The obtained spectrum is shown in FIG.
  • riboflavin is used as the redox reaction catalyst and TMD is used as the electron donor
  • riboflavin is used as the redox reaction catalyst and as the electron donor.
  • methionine is used, FMN is used as the oxidation-reduction reaction catalyst, TMD is used as the electron donor, fluorescein is used as the oxidation-reduction reaction catalyst, and methionine is used as the electron donor.
  • Example 3 Examination of relationship between riboflavin concentration and amount of superoxide generated and purity of superoxide Generation of superoxide and electron donor radicals (interfering radicals, TH radicals) by changing the concentration of riboflavin in the aqueous solution The amount change was confirmed.
  • Example 1 (1) In the aqueous solutions prepared in Example 1 (1) (SOD-added aqueous solution and SOD-free aqueous solution), the riboflavin concentrations were 0.1 ⁇ mol / L, 0.5 ⁇ mol / L, 1 ⁇ mol / L, and 2.5 ⁇ mol / respectively. Aqueous solutions were prepared so as to be L, 5 ⁇ mol / L, 10 ⁇ mol / L, 15 ⁇ mol / L, 25 ⁇ mol / L, and 50 ⁇ mol / L.
  • radicals generated in each aqueous solution were identified or the amount of generated radicals was quantified. That is, the generated EDTA radical (interfering radical) amount was quantified based on the spectrum of the SOD-added aqueous solution, and the generated superoxide amount was quantified based on the spectrum of the SOD-free added aqueous solution. The amount of superoxide was quantified when it was determined that it had a spectrum shape unique to superoxide based on the shape of the superoxide standard spectrum (upper figure in FIG. 11). Further, based on the numerical results, the purity of superoxide in the radicals generated in the aqueous solution of each riboflavin concentration was calculated by the following equation 4. The result is shown in FIG.
  • EDTA radicals interfering radicals
  • the purity of superoxide Were determined to be 87.5%, about 83.3%, and about 76.5%, respectively.
  • the signal derived from the EDTA radical (interfering radical) was strong, so the amount of generated superoxide was not quantified and the purity of superoxide was not calculated. .
  • Example 4 Confirmation of relationship between light irradiation time and superoxide generation amount Time from light irradiation start to superoxide generation, time from light irradiation stop to superoxide generation stop, light irradiation time and superoxide generation amount Confirmed the relationship.
  • aqueous solution Riboflavin, EDTA, and CYPMPO (Radical Research Co., Ltd.) were added to a phosphate buffer solution of 50 mmol / L and pH 7.4 so as to be 1 ⁇ mol / L, 3 mmol / L, and 10 mmol / L, respectively.
  • a solution was prepared.
  • the prepared aqueous solution was divided into 16 samples, which were designated as Sample 1 to Sample 16, respectively.
  • Example 2 Measurement by ESR
  • the aqueous solution prepared in Example (1) was sequentially introduced into a sample tube of an electron spin resonance apparatus JES-RE1X (JEOL Ltd.) and irradiated with visible light after changing the irradiation time.
  • a spectrum was obtained by measuring by ESR.
  • the irradiation time of visible light in each sample is shown below.
  • the ESR observation magnetic field was fixed at 335.7 mT (the same magnetic field as the magnetic field in which the peak derived from superoxide was confirmed in Example 1), and the measurement by ESR was performed.
  • Other light irradiation conditions and measurement conditions by ESR were the same as in Example 1 (2).
  • Visible light irradiation time sample 1 30 seconds before the start of irradiation (-30)
  • Sample 2 15 seconds before the start of irradiation (-15)
  • Sample 3 0 seconds before the start of irradiation (0)
  • Sample 4 Irradiation time 5 seconds (5)
  • Sample 5 irradiation time 10 seconds (10)
  • Sample 6 irradiation time 15 seconds (15)
  • Sample 7 irradiation time 20 seconds (20)
  • Sample 8 irradiation time 30 seconds (30)
  • Sample 9 irradiation time 45 seconds (45)
  • Sample 10 irradiation time 60 seconds (60)
  • Sample 11 irradiated for 60 seconds, 5 seconds after irradiation stopped (+5)
  • Sample 12 irradiated for 60 seconds, 10 seconds after irradiation stopped (+10)
  • Sample 13 irradiated for 60 seconds, 20 seconds after irradiation stopped (+20)
  • Sample 14 60 seconds irradiation, 30 seconds after irradiation stop
  • the signal intensity of the obtained spectrum was plotted on the vertical axis, and the visible light irradiation time was plotted on the horizontal axis. The result is shown in FIG.
  • Example 1 (1) Determination of radical generation amount by light irradiation of riboflavin SOD addition so that SOD concentrations of the SOD-added aqueous solution in Example 1 (1) are 0.5 U / mL, 1 U / mL, and 1.5 U / mL, respectively.
  • An aqueous solution and an SOD-free aqueous solution were prepared.
  • Each prepared aqueous solution was measured by ESR in the same manner as in Example 1 (2) to obtain a spectrum. Based on the obtained spectrum, the amount of radicals generated was quantified.
  • Example 2 After adding xanthine oxidase to the prepared SOD-free aqueous solution and SOD-added aqueous solution to 0.2 U / mL, respectively, measurement by ESR was performed in the same manner as in Example 1 (2), and the spectrum was obtained. Obtained. Subsequently, the amount of radicals generated was quantified based on the obtained spectrum. The measurement by ESR was performed 60 seconds after adding xanthine oxidase.
  • the radical generation inhibition rate by SOD represents the purity of superoxide. That is, in the generated radical, the higher the superoxide purity, the higher the radical generation inhibition rate by SOD.

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Abstract

【課題】　スーパーオキシドまたは高純度でスーパーオキシドを含有するラジカルを選択的に発生させ、簡便かつ安定的に製造する方法、対象となる試料のスーパーオキシド消去能を簡便に評価する方法、スーパーオキシドまたは高純度でスーパーオキシドを含有するラジカルを選択的に発生させ、簡便かつ安定的に製造する装置および対象となる試料のスーパーオキシド消去能を簡便に評価する装置を提供する。 【解決手段】　本発明に係るスーパーオキシド製造方法は、（ａ）判定用溶液調製工程、（ｂ）判定用スピンアダクト／ラジカル生成工程、（ｃ）判定用スペクトル取得工程、（ｄ）相似判定工程、（ｅ）フラビン濃度取得工程、（ｆ）原料溶液調製工程、（ｇ）発生工程を有する。

Description

スーパーオキシド製造方法、スーパーオキシド消去能評価方法、スーパーオキシド製造装置およびスーパーオキシド消去能評価装置
　本発明は、スーパーオキシド製造方法、スーパーオキシド消去能評価方法、スーパーオキシド製造装置およびスーパーオキシド消去能評価装置に関する。
　スーパーオキシド（スーパーオキサイド、スーパーオキシドアニオン、スーパーオキシドアニオンラジカル）は酸素分子に電子が１個付加した物質であり、（・Ｏ２ －）の化学式で表される。すなわち、スーパーオキシドは不対電子をもつ、ラジカル（フリーラジカル、遊離基）の一種である。不対電子とは、分子や原子の最外殻軌道に位置する、対になっていない電子をいい、ラジカルは一般に、この不対電子を解消しようとして他の物質を酸化ないし還元する、反応性の高い物質である。
　また、スーパーオキシドは活性酸素の一種である。活性酸素とは、酸素が化学的に活性になり、一般的に非常に不安定で強い酸化力を示す、酸素の誘導体をいう。スーパーオキシドは生体内において最も多く発生する活性酸素であり、エネルギー代謝系、核酸代謝系、免疫系などにおいて、キサンチンオキシダーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ、アルデヒドオキシダーゼなどの酵素により常時生成される。また、喫煙、抗癌剤、紫外線、除草剤、ストレス、排気ガスなどの刺激に曝されることにより、スーパーオキシドの生成は促進される。生成されたスーパーオキシドは、免疫系において、侵入した病原微生物に対する殺菌作用を発揮することが知られており、生体防御に重要な役割を果たしている。
　一方、生体内で過剰に生成されたスーパーオキシドは、自発的な不均化反応により、過酸化水素やヒドロキシラジカル（・ＯＨ－）といった、スーパーオキシドに比べてより強力な酸化力を有する活性酸素に変化する。その結果、スーパーオキシドは、核酸や酵素、細胞膜など、さまざまな物質の酸化変性を引き起こすことから、生体における酸化障害の出発物質のひとつとされ、疾病や老化の原因となっていると考えられている。そこで、昨今、スーパーオキシドによる生体への影響についての研究や、スーパーオキシドの活性を抑制する物質の探索などが行われており、余計なラジカルを発生させずにスーパーオキシドを発生させる技術などが求められている。
　従来、スーパーオキシドを発生させる方法として、例えば、ヒポキサンチンにキサンチンオキシダーゼを作用させて発生させる方法（非特許文献１）、超酸化カリウム（ＫＯ２）を水に溶解させる方法（非特許文献２）、陽極とレドックスポリマー担持陰極との間に電流を流して発生させる方法（特許文献１）、水に浸漬したアルミニウム陽極酸化皮膜に紫外線を照射して発生させる方法（特許文献２）、混合気体を封入した放電管に高電圧をかけて発生させる方法（特許文献３）、パルスラジオリシス法を用いた方法（非特許文献３）、フラビンおよび電子供与体に光を照射する方法（非特許文献４～７）などを挙げることができる。
特開２００２－２７３４３３号公報 特開２００３－１１２０５３号公報 特開平１０－１５２３０６号公報
Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ Ｅ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、第１６巻、第６７６－６８５頁、１９７９年 Ｈａｒｂｏｕｒ ＪＲ．ら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、第８２巻、第１３７９－１３９９頁、１９７８年 Ｒｅｄｐａｔｈ ＪＬ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ｓｔｕｄ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｍｅｄ．第３３巻、第３０９－３１５頁、１９７８年 Ｍａｓｓｅｙ Ｖ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第３２巻、第５７９－６３８頁、１９６３年 Ｍａｓｓｅｙ Ｖ．ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、第８４巻、第１号、第５－２１頁、１９７７年 Ｃ．Ｂｅａｕｃｈａｍら、Ａｎａｌｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第４４巻、第２７６－２８７頁、１９７１年 Ｈ．Ｐ．Ｍｉｓｉｒａら、ＡＢＢ、第１８１巻、第３０８－３１２頁、１９７７年
　しかしながら、非特許文献１に開示された方法では、酵素活性の低下や喪失を生ずることから、安定したスーパーオキシドの発生を担保することができず、非特許文献２に開示された方法では、スーパーオキシドの発生量を制御することが困難である。また、非特許文献３に開示された方法では、スーパーオキシドの発生と同時に、ヒドロキシラジカルや水和電子などの他の分子も同時に発生してしまうため、スーパーオキシドを選択的に発生させることができない。この点、特許文献１および特許文献２に開示された方法も、スーパーオキシドと同時に、ヒドロキシラジカル、過酸化水素、あるいはオゾンなどの他の分子も同時に発生してしまうため、同様にスーパーオキシドを選択的に発生させることができない。非特許文献４～７に開示された方法もまた、スーパーオキシドと同時に電子供与体に由来するラジカル（電子供与体ラジカル、妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）などの他の分子が発生してしまうため、やはりスーパーオキシドを選択的に発生させることができない。さらに、非特許文献３に開示された方法では、放射線を照射する装置を要することから、簡便な方法とはいえないが、この点、特許文献３に開示された方法もまた、高電圧を要するとともに放電管内部を陰圧にしなければならず、同様に簡便な方法とはいえない。
　本発明は、このような問題点を解決するためになされたものであって、スーパーオキシドまたは高純度でスーパーオキシドを含有するラジカルを選択的に発生させ、簡便かつ安定的に製造する方法、対象となる試料のスーパーオキシド消去能を簡便に評価する方法、スーパーオキシドまたは高純度でスーパーオキシドを含有するラジカルを選択的に発生させ、簡便かつ安定的に製造する装置および対象となる試料のスーパーオキシド消去能を簡便に評価する装置を提供することを目的とする。
　本発明者らは、鋭意研究の結果、フラビン、電子供与体、スピントラップ剤および水系溶媒を含む判定用溶液に光を照射してスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカル（妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）のスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカル（妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）を生成させた後、電子スピン共鳴によりスペクトルを取得し、このスペクトルとスーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトル（スーパーオキシド標準スペクトル）とが相似するか否かの判定によりフラビンの濃度を取得して、取得した濃度のフラビン、電子供与体および水系溶媒を含む原料溶液に光を照射することにより、電子供与体ラジカルの発生量を抑えて、スーパーオキシドまたは高純度でスーパーオキシドを含有するラジカルを選択的に発生させ、簡便かつ安定的に製造できることを見出すとともに、同様にして取得した濃度のフラビン、電子供与体、スピントラップ剤、スーパーオキシド消去能を評価する試料および水系溶媒を含む評価溶液を調製して光を照射した後、電子スピン共鳴によりスペクトルを取得し、このスペクトルとスーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルとを比較することにより、前記試料のスーパーオキシド消去能を評価できることを見出し、下記の各発明を完成した。
（１）下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）の工程を有するスーパーオキシド製造方法；
（ａ）フラビン、電子供与体、スピントラップ剤および水系溶媒を含む判定用溶液を調製する判定用溶液調製工程、
（ｂ）前記判定用溶液に光を照射してスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを生成させる判定用スピンアダクト／ラジカル生成工程、
（ｃ）前記生成させたスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する判定用スペクトル取得工程、
（ｄ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記判定用スペクトルとが相似するか否かを判定する相似判定工程、
（ｅ）前記相似判定により相似するフラビンの濃度を取得するフラビン濃度取得工程、
（ｆ）前記取得した濃度のフラビン、電子供与体および水系溶媒を含む原料溶液を調製する原料溶液調製工程、
（ｇ）前記原料溶液に光を照射してスーパーオキシドを発生させる発生工程。
（２）フラビンがリボフラビンである場合において、前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）の工程に代えて下記（ｈ）の工程を有する、（１）に記載のスーパーオキシド製造方法；
（ｈ）リボフラビンの濃度Ｃ（μｍｏｌ／Ｌ）が０．１＜Ｃ≦１５となるようにリボフラビン、電子供与体および水系溶媒を含む原料溶液を調製する原料溶液調製工程。
（３）フラビン濃度取得工程が、前記相似判定により相似するフラビンの濃度を、生成するラジカルにおいてスーパーオキシドの純度が７５．６～１００％となるように取得するフラビン濃度取得工程である、（１）または（２）に記載のスーパーオキシド製造方法。
（４）電子供与体がＥＤＴＡである、（１）から（３）のいずれかに記載のスーパーオキシド製造方法。
（５）スピントラップ剤がＣＹＰＭＰＯである、（１）から（４）のいずれかに記載のスーパーオキシド製造方法。
（６）水系溶媒がリン酸緩衝液である、（１）から（５）のいずれかに記載のスーパーオキシド製造方法。
（７）試料のスーパーオキシド消去能を評価する方法であって、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）および（ｌ）の工程を有する、前記方法；
（ａ）フラビン、電子供与体、スピントラップ剤および水系溶媒を含む判定用溶液を調製する判定用溶液調製工程、
（ｂ）前記判定用溶液に光を照射してスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを生成させる判定用スピンアダクト／ラジカル生成工程、
（ｃ）前記生成させたスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する判定用スペクトル取得工程、
（ｄ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記判定用スペクトルとが相似するか否かを判定する相似判定工程、
（ｅ）前記相似判定により相似するフラビンの濃度を取得するフラビン濃度取得工程、
（ｉ）前記取得した濃度のフラビン、電子供与体、スピントラップ剤、スーパーオキシド消去能を評価する試料および水系溶媒を含む評価溶液を調製する評価溶液調製工程、
（ｊ）前記評価溶液に光を照射してスピンアダクトを生成させる評価用スピンアダクト生成工程、
（ｋ）前記評価用スピンアダクトを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する評価用スペクトル取得工程、
（ｌ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記評価用スペクトルとを比較してスーパーオキシド消去能を評価する比較評価工程。
（８）フラビンがリボフラビンである場合において、前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｉ）の工程に代えて下記（ｍ）の工程を有する、（７）に記載の方法；
（ｍ）リボフラビンの濃度Ｃ（μｍｏｌ／Ｌ）が０．１＜Ｃ≦１５となるようにリボフラビン、電子供与体、スピントラップ剤、スーパーオキシド消去能を評価する試料および水系溶媒を含む評価溶液を調製する評価溶液調製工程。
（９）フラビン濃度取得工程が、前記相似判定により相似するフラビンの濃度を、生成するラジカルにおいてスーパーオキシドの純度が７５．６～１００％となるように取得するフラビン濃度取得工程である、（７）または（８）に記載の方法。
（１０）電子供与体がＥＤＴＡである、（７）から（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）スピントラップ剤がＣＹＰＭＰＯである、（７）から（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）水系溶媒がリン酸緩衝液である、（７）から（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）下記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）の手段を備えるスーパーオキシド製造装置；
（ｉ）フラビン、電子供与体、スピントラップ剤および水系溶媒を含む判定用溶液を調製する判定用溶液調製手段、
（ｉｉ）前記判定用溶液に光を照射してスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを生成させる判定用スピンアダクト／ラジカル生成手段、
（ｉｉｉ）前記生成させたスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する判定用スペクトル取得手段、
（ｉｖ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記判定用スペクトルとが相似するか否かを判定するための相似判定手段、
（ｖ）前記相似判定により相似するフラビンの濃度を取得するフラビン濃度取得手段、
（ｖｉ）前記取得した濃度のフラビン、電子供与体および水系溶媒を含む原料溶液を調製する原料溶液調製手段、
（ｖｉｉ）前記原料溶液に光を照射してスーパーオキシドを発生させる発生手段。
（１４）フラビンがリボフラビンである場合において、前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）の手段に代えて下記（ｖｉｉｉ）の手段を備える、（１３）に記載のスーパーオキシド製造装置；
（ｖｉｉｉ）リボフラビンの濃度Ｃ（μｍｏｌ／Ｌ）が０．１＜Ｃ≦１５となるように、リボフラビン、電子供与体および水系溶媒を含む原料溶液を調製する原料溶液調製手段。
（１５）フラビン濃度取得手段が、前記相似判定により相似するフラビンの濃度を、生成するラジカルにおいてスーパーオキシドの純度が７５．６～１００％となるように取得するフラビン濃度取得手段である、（１３）または（１４）に記載のスーパーオキシド製造装置。
（１６）電子供与体がＥＤＴＡである、（１３）から（１５）のいずれかに記載のスーパーオキシド製造装置。
（１７）スピントラップ剤がＣＹＰＭＰＯである、（１３）から（１６）のいずれかに記載のスーパーオキシド製造装置。
（１８）水系溶媒がリン酸緩衝液である、（１３）から（１７）のいずれかに記載のスーパーオキシド製造装置。
（１９）試料のスーパーオキシド消去能を評価する装置であって、下記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｉｘ）、（ｘ）、（ｘｉ）および（ｘｉｉ）の手段を有する、前記装置；
（ｉ）フラビン、電子供与体、スピントラップ剤および水系溶媒を含む判定用溶液を調製する判定用溶液調製手段、
（ｉｉ）前記判定用溶液に光を照射してスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを生成させる判定用スピンアダクト／ラジカル生成手段、
（ｉｉｉ）前記生成させたスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する判定用スペクトル取得手段、
（ｉｖ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記判定用スペクトルとが相似するか否かを判定するための相似判定手段、
（ｖ）前記相似判定により相似するフラビンの濃度を取得するフラビン濃度取得手段、
（ｉｘ）前記取得した濃度のフラビン、電子供与体、スピントラップ剤、スーパーオキシド消去能を評価する試料および水系溶媒を含む評価溶液を調製する評価溶液調製手段、
（ｘ）前記評価溶液に光を照射してスピンアダクトを生成させる評価用スピンアダクト生成手段、
（ｘｉ）前記評価用スピンアダクトを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する評価用スペクトル取得手段、
（ｘｉｉ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記評価用スペクトルとを比較してスーパーオキシド消去能を評価するための比較評価用手段。
（２０）フラビンがリボフラビンである場合において、前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｉｘ）の手段に代えて下記（ｘｉｉｉ）の手段を備える、（１９）に記載の装置；
（ｘｉｉｉ）リボフラビンの濃度Ｃ（μｍｏｌ／Ｌ）が０．１＜Ｃ≦１５となるようにリボフラビン、電子供与体、スピントラップ剤、スーパーオキシド消去能を評価する試料および水系溶媒を含む評価溶液を調製する評価溶液調製手段。
（２１）フラビン濃度取得手段が、前記相似判定により相似するフラビンの濃度を、生成するラジカルにおいてスーパーオキシドの純度が７５．６～１００％となるように取得するフラビン濃度取得手段である、（１９）または（２０）に記載の装置。
（２２）電子供与体がＥＤＴＡである、（１９）から（２１）のいずれかに記載の装置。
（２３）スピントラップ剤がＣＹＰＭＰＯである、（１９）から（２２）のいずれかに記載の装置。
（２４）水系溶媒がリン酸緩衝液である、（１９）から（２３）のいずれかに記載の装置。
（２５）下記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）および（Ｇ）の工程を有するスーパーオキシドｉｎ ｖｉｖｏ製造方法；
（Ａ）任意量のフラビン、電子供与体およびスピントラップ剤を生体試料または非ヒト動物の体内に投与する原料投与工程、
（Ｂ）前記生体試料または非ヒト動物の体内において前記投与したフラビン、電子供与体およびスピントラップ剤が存在する箇所に光を照射してスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを生成させる判定用スピンアダクト／ラジカル生成工程、
（Ｃ）前記生成させたスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する判定用スペクトル取得工程、
（Ｄ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記判定用スペクトルとが相似するか否かを判定する相似判定工程、
（Ｅ）前記相似判定により相似するフラビンの至適量を取得するフラビン至適量取得工程、
（Ｆ）前記取得した至適量のフラビンおよび電子供与体を前記生体試料または非ヒト動物の体内に投与する至適原料投与工程、
（Ｇ）前記生体試料または非ヒト動物の体内において前記投与したフラビンおよび電子供与体が存在する箇所に光を照射してスーパーオキシドを発生させる発生工程。
（２６）電子供与体がＥＤＴＡである、（２５）に記載のスーパーオキシドｉｎ ｖｉｖｏ製造方法。
（２７）スピントラップ剤がＣＹＰＭＰＯである、（２５）または（２６）に記載のスーパーオキシドｉｎ ｖｉｖｏ製造方法。
（２８）ｉｎ ｖｉｖｏにおいて試料のスーパーオキシド消去能を評価する方法であって、下記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｈ）、（Ｉ）、（Ｊ）および（Ｋ）の工程を有する、スーパーオキシドｉｎ ｖｉｖｏ消去能評価方法；
（Ａ）任意量のフラビン、電子供与体およびスピントラップ剤を生体試料または非ヒト動物の体内に投与する原料投与工程、
（Ｂ）前記生体試料または非ヒト動物の体内において前記投与したフラビン、電子供与体およびスピントラップ剤が存在する箇所に光を照射してスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを生成させる判定用スピンアダクト／ラジカル生成工程、
（Ｃ）前記生成させたスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する判定用スペクトル取得工程、
（Ｄ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記判定用スペクトルとが相似するか否かを判定する相似判定工程、
（Ｅ）前記相似判定により相似するフラビンの至適量を取得するフラビン至適量取得工程、
（Ｈ）前記取得した至適量のフラビン、電子供与体、スピントラップ剤およびスーパーオキシド消去能を評価する試料を含む評価検体を生体試料または非ヒト動物の体内に投与する評価検体投与工程、
（Ｉ）前記生体試料または非ヒト動物の体内において前記投与した評価検体に光を照射してスピンアダクトを生成させるｉｎ ｖｉｖｏスピンアダクト生成工程、
（Ｊ）前記スピンアダクトを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得するｉｎ ｖｉｖｏスペクトル取得工程、
（Ｋ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記取得したスペクトルとを比較してスーパーオキシド消去能を評価するｉｎ ｖｉｖｏ比較評価工程。
（２９）電子供与体がＥＤＴＡである、（２８）に記載のスーパーオキシドｉｎ ｖｉｖｏ消去能評価方法。
（３０）スピントラップ剤がＣＹＰＭＰＯである、（２８）または（２９）に記載のスーパーオキシドｉｎ ｖｉｖｏ消去能評価方法。
　本発明によれば、生体外および生体内において、スーパーオキシドまたは高純度でスーパーオキシドを含有するラジカルを選択的に発生させ、簡便かつ安定的に製造することができることから、疾患や老化現象などにおけるスーパーオキシドの関与についての評価や研究を正確かつ簡便に行うことが可能となり、スーパーオキシドが関与する疾患や老化現象などの治療法・予防法の探索や進行メカニズムの解明を促進することができる。また、本発明によれば、生体外および生体内において、対象となる試料のスーパーオキシド消去能を簡便に評価することができることから、生体にとって真に有効な抗酸化物質の探索や、種々の物質が有する抗酸化能の評価を正確、簡便かつ迅速に行うことができる。
本発明に係るスーパーオキシド製造装置の一実施形態を示す図である。 本実施形態のスーパーオキシド製造装置１における各構成部の機能を示す機能ブロック図である。 本実施形態における判定用溶液調製手段２を示す図である。 本実施形態における判定用スペクトル取得手段４を示す図である。 本実施形態における相似判定手段５を示す図である。 本実施形態における原料溶液調製手段７を示す図である。 本発明に係るスーパーオキシド消去能評価装置の一実施形態を示す図である。 本実施形態のスーパーオキシド消去能評価装置９における各構成部の機能を示す機能ブロック図である。 本実施形態における評価溶液調製手段１０を示す図である。 ＳＯＤ無添加水系溶液およびＳＯＤ添加水系溶液に可視光を照射した後、電子スピン共鳴（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｓｐｉｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；ＥＳＲ）による測定を行い、得られたスペクトルを示す図である。図中、スペクトルＡはＳＯＤ無添加水系溶液から得られたスペクトルを示し、スペクトルＢは、ＳＯＤ添加水系溶液から得られたスペクトルを示す。 スーパーオキシドとＣＹＰＭＰＯからなるスピンアダクトの、コンピューターシミュレーションにより得られたスペクトル（スーパーオキシド標準スペクトル）を示す図（上図）、およびＥＤＴＡラジカルの、コンピューターシミュレーションにより得られたスペクトル（ＥＤＴＡラジカル標準スペクトル）を示す図（下図）である。 酸化還元反応触媒としてリボフラビンを、かつ電子供与体としてテトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＤ）を用いて調製した水系溶液に可視光を照射した後、ＥＳＲによる測定を行い、得られたスペクトルを示す図である。 酸化還元反応触媒としてリボフラビンを、かつ電子供与体としてメチオニンを用いて調製した水系溶液に可視光を照射した後、ＥＳＲによる測定を行い、得られたスペクトルを示す図である。 酸化還元反応触媒としてＦＭＮを、かつ電子供与体としてＥＤＴＡを用いて調製した水系溶液に可視光を照射した後、ＥＳＲによる測定を行い、得られたスペクトルを示す図である。 酸化還元反応触媒としてＦＭＮを、かつ電子供与体としてＴＭＤを用いて調製した水系溶液に可視光を照射した後、ＥＳＲによる測定を行い、得られたスペクトルを示す図である。 酸化還元反応触媒としてフルオレセインを、かつ電子供与体としてメチオニンを用いて調製した水系溶液に可視光を照射した後、ＥＳＲによる測定を行い、得られたスペクトルを示す図である。 リボフラビンの濃度を変えた水系溶液に可視光を照射して、発生したラジカルの特定および定量を行い、発生したラジカルにおけるスーパーオキシドの純度を算出した結果を示す図である。図中、縦軸は発生したラジカル量を、横軸はリボフラビン濃度をそれぞれ示す。 可視光の照射時間を変えた水系溶液について、ＥＳＲによる測定により得られたスペクトルのシグナル強度を示す図である。図中、縦軸はシグナル強度を、横軸は可視光照射時間ないし可視光照射停止後の時間を示す。 リボフラビンの光照射によりスーパーオキシドを発生させた場合およびキサンチンオキシダーゼによりスーパーオキシドを発生させた場合における、ＳＯＤによるラジカル発生阻害率を示す図である。図中、縦軸はラジカル発生阻害率を、横軸は加えたＳＯＤ濃度を示す。
　以下、本発明に係るスーパーオキシド製造方法、スーパーオキシド消去能評価方法、スーパーオキシド製造装置およびスーパーオキシド消去能評価装置について詳細に説明する。
　まず、本発明に係るスーパーオキシド製造方法は、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）の工程を有する；
（ａ）フラビン、電子供与体、スピントラップ剤および水系溶媒を含む判定用溶液を調製する判定用溶液調製工程、
（ｂ）前記判定用溶液に光を照射してスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを生成させる判定用スピンアダクト／ラジカル生成工程、
（ｃ）前記生成させたスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する判定用スペクトル取得工程、
（ｄ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記判定用スペクトルとが相似するか否かを判定する相似判定工程、
（ｅ）前記相似判定により相似するフラビンの濃度を取得するフラビン濃度取得工程、
（ｆ）前記取得した濃度のフラビン、電子供与体および水系溶媒を含む原料溶液を調製する原料溶液調製工程、
（ｇ）前記原料溶液に光を照射してスーパーオキシドを発生させる発生工程。
　本実施形態において「高純度でスーパーオキシドを含有するラジカル」とは、スーパーオキシドと電子供与体ラジカル（妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）とからなるラジカルの集合であって、その集合においてスーパーオキシドが占める割合（スーパーオキシドの純度）がスーパーオキシド以外の種類のラジカルが占める割合と比較して十分に大きいラジカルをいい、その純度は、７０％以上１００％未満が好ましく、７５．６％以上１００％未満がより好ましく、８３．３％以上１００％未満がさらに好ましい。
　なお、スーパーオキシドを含有するラジカルにおけるスーパーオキシドの純度は、常法に従い算出することができ、例えば、まず、水系溶液においてスーパーオキシドを含有するラジカルを発生させて電子スピン共鳴による測定を行い、スーパーオキシド標準スペクトルと相似するスペクトルを得て、このスペクトルに基づいてスーパーオキシド発生量を測定する。次に、スーパーオキシド発生量を測定した場合と同様の組成の水系溶液にスーパーオキシドを特異的に消去する酵素であるスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）を添加した上でラジカルを発生させて電子スピン共鳴による測定によりスペクトルを取得し、このスペクトルに基づいて電子供与体ラジカル（妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）発生量を測定する。続いて、測定したスーパーオキシド発生量と電子供与体ラジカル（妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）発生量とから、次式１によりスーパーオキシドの純度を算出することができる。
　ここで、電子スピン共鳴（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｓｐｉｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；ＥＳＲ）とは、ラジカルの同定および定量に用いられる方法の一種である。電子スピン共鳴では、サンプルを磁場の中に置き、マイクロ波を照射して前記サンプルに含まれるラジカルの不対電子を共鳴させ、共鳴したときに起こる吸収エネルギーを測定する。磁場を変化させながらこの吸収エネルギーの測定を行い、一連の吸収エネルギー変化をスペクトルとして取得する。ラジカルの種類によりスペクトルの形状が決定されるため、取得されたスペクトルの形状を観察することにより、前記サンプルに含まれるラジカルを同定することができる。
（式１）：スーパーオキシドの純度（％）＝｛スーパーオキシド発生量／（スーパーオキシド発生量＋電子供与体ラジカル（妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）発生量）｝×１００
　本発明において、スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトル（スーパーオキシド標準スペクトル）とは、スーパーオキシドのスピンアダクト、高純度でスーパーオキシドを含有するラジカルのスピンアダクトまたは高純度でスーパーオキシドを含有するラジカルのスピンアダクトとラジカルとの混合物について、電子スピン共鳴による測定を行って得られるスペクトルまたは電子スピン共鳴による測定を行った場合に得られると想定されるスペクトルをいう。スーパーオキシド標準スペクトルは、例えば、コンピューターシミュレーションにより得ることができ、既報（ＭＡＳＡＴＯ Ｋ．ら、Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第４０巻、第１１号、第１１６６－１１７２頁、２００６年）に記載のものを用いることができる他、キサンチンオキシダーゼにより高純度でスーパーオキシドを含有するラジカルを発生させて電子スピン共鳴による測定を行うことにより得ることもできる。
　工程（ａ）：判定用溶液調製工程において、判定用溶液は、フラビン、電子供与体およびスピントラップ剤を水系溶媒に溶解することにより調製することができ、その特徴を損なわない限りにおいて、他の物質を含んでもよい。
　フラビンは、ジメチルイソアロキサジンの１０位に置換基をもつ一群の誘導体である。次式２および３に示すように、フラビンは電子供与体の共存下で光を照射されると、エネルギー順位の高い状態へ励起され、電子供与体から１電子を奪い、フラビンラジカルとなる。同時に、１電子を奪われた電子供与体は不対電子を有することとなるため、電子供与体ラジカル（妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）となる（式２）。続いてフラビンラジカルは酸素分子に１電子を付加し、スーパーオキシドを発生させる（式３）。
（式２）：フラビン＋電子供与体＋光→フラビンラジカル＋電子供与体ラジカル
（式３）：フラビンラジカル＋酸素分子→スーパーオキシド＋フラビン
　本発明によれば、上記の反応を利用してスーパーオキシドまたは高純度でスーパーオキシドを含有するラジカルを製造することができる。本発明において用いることができるフラビンとしては、例えば、リボフラビン、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、イソアロキサジン、アロキサジン、ルミクロム、ルミフラビン、フラビン－アデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、ガラクトフラビン、Ｄ－アラボフラビン、リキソフラビンおよびそれらの任意の組み合わせなどを挙げることができるが、リボフラビン、ＦＭＮ、またはこれらの混合物を好適に用いることができる。
　また、本発明において用いる電子供与体は、励起されたフラビンに電子を与える、低い酸化還元電位を有する物質であればよく、酸素含有化合物、窒素含有化合物、リン含有化合物、硫黄含有化合物を挙げることができ、窒素含有化合物が好ましい。そのような窒素含有化合物としては、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、メチオニン、テトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＤ，ＴＭＥＤ）などを挙げることができるが、ＥＤＴＡを好適に用いることができる。
　スピントラップ剤は、短時間で他の物質に変化する不安定なラジカルと共有結合（アダクト）して、安定なスピンアダクトを生成する試薬である。スーパーオキシドも不安定なラジカルであるため、直接、電子スピン共鳴により検出することは困難であるが、スピンアダクトを生成させることにより検出が可能となる。本発明において用いるスピントラップ剤は、少なくともスーパーオキシドとスピンアダクトを生成するものであればよく、例えば、２－（５，５－Ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏ－２λ５－［１，３，２］ｄｉｏｘａｐｈｏｓｐｈｉｎａｎ－２－ｙｌ）－２－ｍｅｔｈｙｌ－３，４－ｄｉｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｅ １－ｏｘｉｄｅ（ＣＹＰＭＰＯ）、５，５－Ｄｉｍｅｔｈｙｌ－１－ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ Ｎ－ｏｘｉｄｅ(ＤＭＰＯ)、５－Ｄｉｅｔｈｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ５－ｍｅｔｈｙｌ－１－ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ Ｎ－ｏｘｉｄｅ(ＤＥＰＭＰＯ)、２，５，５－ｔｒｉｅｔｈｙｌ－１－ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ Ｎ－Ｏｘｉｄｅ(Ｍ３ＰＯ)、３，３，５，５－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－１－ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ Ｎ－Ｏｘｉｄｅ(ＴＭＰＯ)などを挙げることができるが、ＣＹＰＭＰＯを好適に用いることができる。
　また、本発明において用いる水系溶媒は、水系溶媒を含む溶液のｐＨを一定に保つ機能を有する限り特に限定されず、例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液などを挙げることができるが、リン酸緩衝液を好適に用いることができる。
　工程（ｂ）：判定用スピンアダクト／ラジカル生成工程において、判定用溶液への光の照射は、適当な光源を用いて行うことができる。本発明において用いることができる光源としては、例えば、キセノンランプ、蛍光ランプ、ハロゲンランプ、クリプトンランプ、ナトリウムランプ、水銀ランプ、メタルハライドランプなどを挙げることができる。なお、本発明において用いる光の種類（波長）、光の強さ、照射時間は特に限定されず、光源の種類、光源と照射する対象との位置関係、照射する対象の量、照射する対象の濃度、照射した結果発生するスーパーオキシドの必要量などの条件に応じて、適宜設定することができる。
　また、工程（ｂ）：判定用スピンアダクト／ラジカル生成工程において、判定用溶液に光を照射すると、上記（式２）に示す反応により電子供与体ラジカル（妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）が、上記（式３）に示す反応によりスーパーオキシドがそれぞれ生成する。生成したスーパーオキシドは、判定用溶液中のスピントラップ剤と共有結合することから、スーパーオキシドのスピンアダクトを生成させることができる。また、判定用溶液中のスピントラップ剤が電子供与体ラジカル（妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）とスピンアダクトを形成するものである場合は、電子供与体ラジカル（妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）のスピンアダクトが生成する。
　工程（ｃ）：判定用スペクトル取得工程において、スーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカル（妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）のスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカル（妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）の電子スピン共鳴による検出およびスペクトル（判定用スペクトル）の取得は、常法に従い行うことができ、例えば、ＪＥＳ－ＲＥ１Ｘ（日本電子社）などの市販のＥＳＲ測定装置を用いて行うことができる。なお、電子供与体ラジカル（妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）は、一般に比較的安定で寿命が長いため、スピンアダクトを形成した場合のみならず、スピンアダクトを形成していない場合も電子スピン共鳴により検出することができる。
　工程（ｄ）：相似判定工程において、スーパーオキシド標準スペクトルと判定用スペクトルとが相似するか否かの判定は、例えば、スーパーオキシド標準スペクトルと判定用スペクトルとを並べて、または重ねて表示したうえで目視することにより行うことができる他、形状比較プログラムなどを用いてコンピューター処理をすることにより行うこともできる。
　ここで、本発明において、複数のスペクトルが「相似する」または「相似関係にある」という場合は、複数のスペクトルが互いに縮小または拡大の関係にある場合のみならず、複数のスペクトルの形状について相同性が高い場合が含まれる。ここにいう、「高い相同性」とは、少なくとも７０％以上相同性をいい、好ましくは８０％以上相同性、より好ましくは８５％相同性、さらに好ましくは９０％以上相同性、よりさらに好ましくは９５％以上相同性をいう。
　工程（ｅ）：フラビン濃度取得工程において、フラビンの濃度は、工程（ｄ）によりスーパーオキシド標準スペクトルと相似すると判定される判定用スペクトルが得られた場合に、その判定用溶液に係るフラビンの濃度を取得することができる構成や機能を有していればよい。すなわち、工程（ｅ）によれば、工程（ｄ）においてスーパーオキシド標準スペクトルと判定用スペクトルとが相似しないと判定された場合には、再度、工程（ａ）においてフラビンの濃度を変えた判定用溶液が調製され、以下、工程（ｂ）→（ｃ）→（ｄ）を行うというように、必要に応じて工程（ａ）～（ｄ）による判定処理をスーパーオキシド標準スペクトルに相似する判定用スペクトルが得られるまで繰り返されるため、最終的に所望のフラビンの濃度を取得することができる。
　なお、工程（ｅ）：フラビン濃度取得工程では、相似判定により相似するフラビンの濃度を、生成するラジカルにおいてスーパーオキシドの純度が７５．６～１００％の範囲となるように取得することができる。
　工程（ｆ）：原料溶液調製工程において、原料溶液は、フラビンおよび電子供与体を水系溶媒に溶解することにより調製することができる。原料溶液におけるフラビンの濃度は、工程（ｅ）において取得した濃度となるように調製する。なお、本発明において、原料溶液には、その特徴を損なわない限りにおいて、他の物質を含んでもよい。
　工程（ｇ）：発生工程において、原料溶液への光の照射は、上述した工程（ｂ）における判定用溶液への光の照射と同様の方法により行うことができる。
　なお、本発明に係るスーパーオキシド製造方法において、フラビンがリボフラビンである場合は、上述の工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）に代えて、工程（ｈ）：「リボフラビンの濃度Ｃ（μｍｏｌ／Ｌ）が０．１＜Ｃ≦１５となるようにリボフラビン、電子供与体および水系溶媒を含む原料溶液を調製する原料溶液調製工程」を有することができる。後述の実施例に示すように、リボフラビンの濃度Ｃ（μｍｏｌ／Ｌ）が０．１＜Ｃ≦１５となるようにリボフラビン、電子供与体および水系溶媒を含む原料溶液に光を照射してラジカルを生成した場合は、生成したラジカルにおいて、スーパーオキシドの純度が７５．６％～１００％となるように製造することができる。さらに、リボフラビンの濃度Ｃ（μｍｏｌ／Ｌ）が０．１＜Ｃ≦１０となるようにリボフラビン、電子供与体および水系溶媒を含む原料溶液に光を照射してラジカルを生成した場合は、生成したラジカルにおいて、スーパーオキシドの純度が８３．３％～１００％となるように製造することができる。
　次に、本発明に係るスーパーオキシド消去能評価方法は、試料のスーパーオキシド消去能を評価する方法であって、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）および（ｌ）の工程を有する；
（ａ）フラビン、電子供与体、スピントラップ剤および水系溶媒を含む判定用溶液を調製する判定用溶液調製工程、
（ｂ）前記判定用溶液に光を照射してスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを生成させる判定用スピンアダクト／ラジカル生成工程、
（ｃ）前記生成させたスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する判定用スペクトル取得工程、
（ｄ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記判定用スペクトルとが相似するか否かを判定する相似判定工程、
（ｅ）前記相似判定により相似するフラビンの濃度を取得するフラビン濃度取得工程、
（ｉ）前記取得した濃度のフラビン、電子供与体、スピントラップ剤、スーパーオキシド消去能を評価する試料および水系溶媒を含む評価溶液を調製する評価溶液調製工程、
（ｊ）前記評価溶液に光を照射してスピンアダクトを生成させる評価用スピンアダクト生成工程、
（ｋ）前記評価用スピンアダクトを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する評価用スペクトル取得工程、
（ｌ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記評価用スペクトルとを比較してスーパーオキシド消去能を評価する比較評価工程。
　なお、工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）については、本発明に係るスーパーオキシド製造方法と同様である。
　工程（ｉ）：評価溶液調製工程において、評価溶液は、フラビン、電子供与体、スピントラップ剤およびスーパーオキシド消去能を評価する試料を水系溶媒に溶解することにより調製することができる。評価溶液におけるフラビンの濃度は、工程（ｅ）において取得した濃度となるように調製する。なお、本発明において、評価溶液には、その特徴を損なわない限りにおいて、他の物質を含んでもよい。
　本発明におけるスーパーオキシド消去能を評価する試料としては、例えば、食品や植物抽出物、化粧料組成物、医薬組成物などの化合物を挙げることができる。この評価の対象となる試料は、スーパーオキシドがスピンアダクトに変化する前にスーパーオキシドを消去することにより、「消去能を有する」との評価がなされる。
　工程（ｊ）：評価用スピンアダクト生成工程において、評価溶液への光の照射は、上述した工程（ｂ）や（ｇ）における判定用溶液への光の照射と同様の方法により行うことができる。
　工程（ｋ）：評価用スペクトル取得工程において、評価用スピンアダクトの電子スピン共鳴による検出およびスペクトル（評価用スペクトル）の取得は、上述した工程（ｃ）における方法と同様の方法により行うことができる。
　工程（ｌ）：比較評価工程において、スーパーオキシド標準スペクトルと評価用スペクトルとの比較は、例えば、上述した工程（ｄ）における方法と同様の方法により行うことができる。また、試料のスーパーオキシド消去能の評価は、評価用スペクトルのシグナル強度が、スーパーオキシド標準スペクトルのシグナル強度と比較して小さくなる場合は、スーパーオキシドが消去されたとして、その試料は「スーパーオキシド消去能を有する」と評価される。一方、評価用スペクトルのシグナル強度がスーパーオキシド標準スペクトルのシグナル強度と比較してほとんど変わらない場合は、スーパーオキシドが消去されていないとして、その試料は「スーパーオキシド消去能を有さない」と評価される。すなわち、評価用スペクトルにおけるシグナル強度の減少と試料の抗酸化能とは比例関係にあり、試料が抗酸化能を有する物質である場合、評価用スペクトルのシグナル強度はスーパーオキシド標準スペクトルのシグナル強度と比較して減少し、試料が抗酸化能を有さない物質である場合、評価用スペクトルのシグナル強度はスーパーオキシド標準スペクトルのシグナル強度と比較してほとんど変わらないこととなる。
　なお、本発明に係るスーパーオキシド消去能評価方法において、フラビンがリボフラビンである場合は、上述の工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｉ）に代えて、工程（ｍ）：「リボフラビンの濃度Ｃ（μｍｏｌ／Ｌ）が０．１＜Ｃ≦１５となるようにリボフラビン、電子供与体、スピントラップ剤、スーパーオキシド消去能を評価する試料および水系溶媒を含む評価溶液を調製する評価溶液調製工程」を有することができる。
　次に、本発明は、スーパーオキシド製造装置を提供する。本発明に係るスーパーオキシド製造装置は、下記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）の手段を備える；
（ｉ）フラビン、電子供与体、スピントラップ剤および水系溶媒を含む判定用溶液を調製する判定用溶液調製手段、
（ｉｉ）前記判定用溶液に光を照射してスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを生成させる判定用スピンアダクト／ラジカル生成手段、
（ｉｉｉ）前記生成させたスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する判定用スペクトル取得手段、
（ｉｖ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記判定用スペクトルとが相似するか否かを判定するための相似判定手段、
（ｖ）前記相似判定により相似するフラビンの濃度を取得するフラビン濃度取得手段、
（ｖｉ）前記取得した濃度のフラビン、電子供与体および水系溶媒を含む原料溶液を調製する原料溶液調製手段、
（ｖｉｉ）前記原料溶液に光を照射してスーパーオキシドを発生させる発生手段。
　本発明に係るスーパーオキシド製造装置の一実施形態について、図面を用いて説明する。図１は、本実施形態のスーパーオキシド製造装置１の基本構成を説明する概念図である。図１に示すように、スーパーオキシド製造装置１は、主として、判定用溶液調製手段２と、判定用スピンアダクト／ラジカル生成手段３と、判定用スペクトル取得手段４と、相似判定手段５と、フラビン濃度取得手段６と、原料溶液調製手段７と、発生手段８とから構成されている。
　判定用溶液調製手段２は、フラビン、電子供与体、スピントラップ剤および水系溶媒を含む判定用溶液を適切に調製することができる構成や機能を有していればよい。そのような構成としては、例えば、図３に示すように、判定用溶液収容部２３に挿通する判定用注入管２２が形成され、注入する物質の数に応じて注入量調節機能を備えた判定用容器２１を複数備える構成などを挙げることができる。このような構成の場合、フラビン、電子供与体、スピントラップ剤および水系溶媒がそれぞれ収容された、注入量調節機能を備えた判定用容器２１の各判定用注入管２２から、適切な量のフラビン、電子供与体、スピントラップ剤および水系溶媒を判定用溶液収容部２３に注入することができ、その結果、判定用溶液を調製することができる。
　なお、判定用溶液調製手段２は、後述する制御信号出力部６２から出力される制御信号によって制御可能に構成されている。また、判定用溶液収容部２３の構成としては、例えば、液体を保持する形体を有する容器からなる構成を挙げることができる。本発明において、容器を構成する素材としては、透明性、耐水性、耐食性、耐薬品性が高いものが好ましく、そのような素材としては、例えば、ガラス、プラスチックなどを挙げることができる。
　次に、判定用スピンアダクト／ラジカル生成手段３は、判定用溶液に対して適切に光を照射することができる構成や機能を有していればよい。そのような構成としては、例えば、光源からなる構成を挙げることができ、例えば、上述したスーパーオキシド製造方法の（ｂ）の工程において例示したキセノンランプ、蛍光ランプ、ハロゲンランプ、クリプトンランプ、ナトリウムランプ、水銀ランプ、メタルハライドランプなどがある。
　次に、判定用スペクトル取得手段４は、判定用溶液に光を照射して得られるスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカル（妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）のスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカル（妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）を電子スピン共鳴により検出してそのスペクトルを取得することができる構成や機能を有していればよい。そのような構成としては、例えば、図４に示すように、電磁石４１、マイクロ波発振器４２、クリスタルダイオード検出器４３、増幅器４４および記録計４５などを挙げることができる。この構成の場合、電磁石４１により形成した磁場の中に判定用溶液収容部２３を置き、マイクロ波発振器４２によりマイクロ波を照射して判定用溶液に含まれるスピンアダクトの不対電子を共鳴させ、生じた吸収エネルギーをクリスタルダイオード検出器４３で検出し、検出した信号を増幅器４４で増幅した後、記録計４５で記録することにより判定用スペクトルを取得することができる。また、例えばＪＥＳ－ＲＥ１Ｘ（日本電子社）などの市販のＥＳＲ測定装置に準拠した構成としてもよい。
　次に、相似判定手段５は、前記取得した判定用スペクトルがスーパーオキシド標準スペクトルに相似するか否かを判定することができる構成や機能を有していればよい。そのような構成としては、例えば、図５に示すように、スペクトルのデータを入力する入力部５１と入力したスペクトルを表示する表示部５２とからなる構成を挙げることができる。この構成の場合、スーパーオキシド標準スペクトルおよび判定用スペクトルのデータを入力部５１に入力し、これらのスペクトルを表示部５２に表示して、その形状を比較することにより相似するか否かを判定することができる。
　次に、フラビン濃度取得手段６は、相似判定手段５によりスーパーオキシド標準スペクトルと相似すると判定される判定用スペクトルが得られた場合に、当該判定用溶液に係るフラビンの濃度を取得することができる構成や機能を有していればよい。すなわち、フラビン濃度取得手段６によれば、相似判定手段５においてスーパーオキシド標準スペクトルと判定用スペクトルとが相似しないと判断された場合には、再度、判定用溶液調製手段２においてフラビンの濃度を変えた判定用溶液が調製され、以下、判定用スピンアダクト／ラジカル生成手段３→判定用スペクトル取得手段４→相似判定手段５による判定処理をスーパーオキシド標準スペクトルに相似する判定用スペクトルが得られるまで繰り返されるため、最終的に所望のフラビンの濃度を取得することができる。
　なお、フラビン濃度取得手段６は、相似判定により相似するフラビンの濃度を、生成するラジカルにおいてスーパーオキシドの純度が７５．６～１００％の範囲となるように取得することができる。
　上述した相似判定手段５およびフラビン濃度取得手段６は、例えば、パーソナルコンピューターなどによって構成してもよい。具体的には、図２に示すように、上述した相似判定処理およびフラビン濃度取得処理を実行する相似判定プログラムや相似判定に必要な各種のデータ等を記憶する記憶手段Ｒと、この記憶手段Ｒや判定用スペクトル取得手段４から各種のデータを取得して演算処理する演算処理手段Ｃとから構成されている。以下、各構成手段について説明する。
　記憶手段Ｒは、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）、ＨＤＤ（Ｈａｒｄ Ｄｉｓｋ Ｄｒｉｖｅ）、フラッシュメモリなどによって構成されており、各種のデータを記憶するとともに、演算処理手段Ｃが演算処理を行う際のワーキングエリアとして機能するものである。
　本実施形態では、図２に示すように、記憶手段Ｒには、相似判定プログラムがインストールされている。そして、演算処理手段Ｃが、相似判定プログラムを実行することにより、コンピューターを後述する各構成部として機能させるようになっている。なお、相似判定プログラムの利用形態は、上記構成に限られるものではなく、ＣＤ－ＲＯＭ等の記録媒体に記憶させておき、この記録媒体から直接起動して実行してもよい。
　また、記憶手段Ｒには、相似判定する際の基準となる標準スペクトルのデータが記憶されている。この標準スペクトルデータは、上述したように、例えば、コンピューターシミュレーションや既報によって得られたものをデータベース化したものである。
　次に、演算処理手段Ｃは、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）などから構成されており、記憶手段Ｒにインストールされた相似判定プログラムを実行することにより、図２に示すように、判定用スペクトルデータ取得部５３と、標準スペクトルデータ取得部５４と、スペクトル比較判定部５５と、フラビン濃度取得部６１と、制御信号出力部６２として機能するようになっている。以下、これら各構成部についてより詳細に説明する。
　判定用スペクトルデータ取得部５３は、判定用スペクトル取得手段４によって取得された判定用スペクトルをデータとして取得するものである。例えば、記録計４５に記録された判定用スペクトルをデジタルデータに変換し、所定のインターフェースからなる入力部５１から入力するようにしてもよい。
　標準スペクトルデータ取得部５４は、記憶手段Ｒに記憶されている標準スペクトルのデータを読み出して取得するものである。
　スペクトル比較判定部５５は、判定用スペクトルと標準スペクトルとを比較して相似するか否かを判定するものである。具体的には、スペクトル比較判定部５５は、判定用スペクトルデータ取得部５３が取得した判定用スペクトルデータと、標準スペクトルデータ取得部５４が取得した標準スペクトルデータとを取得し、両者を比較し、所定の相似条件に基づいて両者が相似するか否かを判定する。そして、当該判定結果を制御信号出力部６２へ出力するようになっている。
　フラビン濃度取得部６１は、判定用溶液調製手段２によって調製された判定用溶液のフラビン濃度を取得するものである。本実施形態では、フラビン濃度取得部６１は、スペクトル比較判定部５５によって、相似していると判定された場合、所定の濃度測定器によって測定した判定用溶液のフラビン濃度をデータとして取得する。
　制御信号出力部６２は、判定用溶液調製手段２や原料溶液調製手段７に制御信号を出力するものである。本実施形態における制御信号出力部６２は、スペクトル比較判定部５５から相似していないとの判定結果を受けた場合、判定用溶液調製手段２に対して、フラビン濃度を変更して再調整する旨の制御信号を送信する。一方、相似するとの判定結果を受けた場合、フラビン濃度取得部６１が取得したフラビン濃度によって原料溶液を調製する旨の制御信号を原料溶液調製手段７に対して送信する。
　次に、原料溶液調製手段７は、フラビン、電子供与体および水系溶媒を含む原料溶液を適切に調製することができる構成や機能を有していればよい。そのような構成としては、例えば、図６に示すように、原料溶液収容部７３に挿通可能な原料用注入管７２を備え、注入する物質の数に応じて注入量調節機能を備えた原料用容器７１を複数備える構成などを挙げることができる。この構成の場合、フラビン、電子供与体および水系溶媒がそれぞれ収容された、注入量調節機能を備えた原料用容器７１の各原料用注入管７２から、適切な量のフラビン、電子供与体および水系溶媒が原料溶液収容部７３に注入され、原料溶液が調製される。原料溶液収容部７３の構成としては、例えば、上述した判定用溶液収容部２３と同様の構成を挙げることができる。
　なお、原料溶液調製手段７は、上述した制御信号出力部６２から出力された制御信号によって制御可能に構成されている。
　次に、発生手段８は、原料溶液に対して適切に光を照射することができる構成や機能を有していればよく、そのような構成としては、例えば、上述した判定用スピンアダクト／ラジカル生成手段３と同様の構成を挙げることができる。
　なお、本実施形態のスーパーオキシド製造装置１において、フラビンがリボフラビンである場合は、手段（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）に代えて、手段（ｖｉｉ）：「リボフラビンの濃度Ｃ（μｍｏｌ／Ｌ）が０．１＜Ｃ≦１５となるように、リボフラビン、電子供与体および水系溶媒を含む原料溶液を調製する原料溶液調製手段７」を備える構成とすることができる。
　なお、本実施形態のスーパーオキシド製造装置１において、判定用溶液調製手段２は原料溶液調製手段７を兼ねる構成とし、判定用スピンアダクト／ラジカル生成手段３は発生手段８を兼ねる構成としてもよく、別個の構成としてもよい。
　また、本発明は、スーパーオキシド消去能評価装置を提供する。本発明に係るスーパーオキシド消去能評価装置は試料のスーパーオキシド消去能を評価する装置であって、下記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｉｘ）、（ｘ）、（ｘｉ）および（ｘｉｉ）の手段を有する；
（ｉ）フラビン、電子供与体、スピントラップ剤および水系溶媒を含む判定用溶液を調製する判定用溶液調製手段、
（ｉｉ）前記判定用溶液に光を照射してスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを生成させる判定用スピンアダクト／ラジカル生成手段、
（ｉｉｉ）前記生成させたスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する判定用スペクトル取得手段、
（ｉｖ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記判定用スペクトルとが相似するか否かを判定するための相似判定手段、
（ｖ）前記相似判定により相似するフラビンの濃度を取得するフラビン濃度取得手段、
（ｉｘ）前記取得した濃度のフラビン、電子供与体、スピントラップ剤、スーパーオキシド消去能を評価する試料および水系溶媒を含む評価溶液を調製する評価溶液調製手段、
（ｘ）前記評価溶液に光を照射してスピンアダクトを生成させる評価用スピンアダクト生成手段、
（ｘｉ）前記評価用スピンアダクトを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する評価用スペクトル取得手段、
（ｘｉｉ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記評価用スペクトルとを比較してスーパーオキシド消去能を評価するための比較評価用手段。
　なお、工程（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）については、本発明に係るスーパーオキシド製造装置と同様である。
　本発明に係るスーパーオキシド消去能評価装置の一実施形態について、図面を用いて説明する。図７は、本実施形態のスーパーオキシド消去能評価装置９の基本構成を説明する概念図である。図７に示すように、スーパーオキシド消去能評価装置９は、主として、判定用溶液調製手段２と、判定用スピンアダクト／ラジカル生成手段３と、判定用スペクトル取得手段４と、相似判定手段５と、フラビン濃度取得手段６と、評価溶液調製手段１０と、評価用スピンアダクト生成手段１１と、評価用スペクトル取得手段１２と、比較評価用手段１３とから構成されている。なお、スーパーオキシド消去能評価装置９の構成のうち、上述したスーパーオキシド製造装置１の構成と同等または相当する構成については同一の符号を付し、再度の説明を省略する。
　評価溶液調製手段１０は、フラビン、電子供与体、スピントラップ剤、スーパーオキシド消去能を評価する試料および水系溶媒を含む評価溶液を適切に調製することができる構成や機能を有していればよい。そのような構成としては、例えば、図９に示すように、評価溶液収容部１０３に挿通する評価用注入管１０２を備え、注入する物質の数に応じて注入量調節機能を備えた評価用容器１０１を複数備える構成などを挙げることができる。この構成の場合、フラビン、電子供与体、スピントラップ剤、スーパーオキシド消去能を評価する試料および水系溶媒がそれぞれ収容された、注入量調節機能を備えた評価用容器１０１の各評価用注入管１０２から、適切な量のフラビン、電子供与体、スピントラップ剤、スーパーオキシド消去能を評価する試料および水系溶媒が評価溶液収容部１０３に注入され、評価溶液が調製される。評価溶液収容部１０３の構成としては、例えば、上述した判定用溶液収容部２３と同様の構成を挙げることができる。なお、評価溶液調製手段１０は、制御信号出力部６２から出力される制御信号によって制御可能に構成されている。
　次に、評価用スピンアダクト生成手段１１は、評価溶液に対して適切に光を照射することができる構成や機能を有していればよい。そのような構成としては、例えば、上述した判定用スピンアダクト／ラジカル生成手段３と同様の構成を挙げることができる。
　次に、評価用スペクトル取得手段１２は、評価溶液に光を照射して得られるスピンアダクトを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得することができる構成や機能を有していればよい。そのような構成としては、例えば、上述した判定用スペクトル取得手段４と同様の構成を挙げることができる。
　次に、比較評価用手段１３は、スーパーオキシド標準スペクトルと評価用スペクトルとを比較してスーパーオキシド消去能を評価することができる構成や機能を有していればよい。そのような構成としては、例えば、上述した相似判定手段５と同様の構成を挙げることができる。この構成の場合、表示部５２に表示されたスーパーオキシド標準スペクトルの形状と、評価用スペクトルの形状とを比較することにより、スーパーオキシド消去能を評価することができる。
　なお、本実施形態のスーパーオキシド消去能評価装置９においては、相似判定手段５およびフラビン濃度取得手段６の他に、比較評価用手段１３をパーソナルコンピューターなどによって構成することができる。
　具体的には、図８に示すように、記憶手段Ｒには、別途、比較評価処理を実行するための比較評価プログラムが格納されている。一方、演算処理手段Ｃは、上述したスーパーオキシド製造装置１における演算処理手段Ｃの各構成部の他に別途、評価用スペクトルデータ取得部１３１と、スペクトル比較評価部１３２を有し、機能するようになっている。
　ただし、本実施形態においては、スペクトル比較判定部５５が相似すると判定した場合、制御信号出力部６２は、フラビン濃度取得部６１が取得したフラビン濃度によって評価溶液を調製する旨の制御信号を評価溶液調製手段１０に送信するようになっている。
　また、評価用スペクトルデータ取得部１３１は、評価用スペクトル取得手段１２によって取得された評価用スペクトルをデータとして取得するものである。
　スペクトル比較評価部１３２は、評価用スペクトルと標準スペクトルとを比較して、スーパーオキシド消去能を評価するものである。具体的には、スペクトル比較評価部１３２は、評価用スペクトルデータ取得部１３１が取得した評価用スペクトルデータと、標準スペクトルデータ取得部５４が取得した標準スペクトルデータとを取得し、両者を比較して所定の評価基準に従ってスーパーオキシド消去能を評価するようになっている。
　なお、本実施形態のスーパーオキシド消去能評価装置９において、フラビンがリボフラビンである場合は、上述の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉｉｉ）の手段に代えて、手段（ｘｉｉ）：「リボフラビンの濃度Ｃ（μｍｏｌ／Ｌ）が０．１＜Ｃ≦１５となるようにリボフラビン、電子供与体、スピントラップ剤、スーパーオキシド消去能を評価する試料および水系溶媒を含む評価溶液を調製する評価溶液調製手段１０」を備える構成とすることができる。
　本実施形態のスーパーオキシド消去能評価装置９において、判定用溶液調製手段２は評価溶液調製手段１０を兼ねる構成とし、判定用スピンアダクト／ラジカル生成手段３は評価用スピンアダクト生成手段１１を兼ねる構成とし、判定用スペクトル取得手段４は評価用スペクトル取得手段１２を兼ねる構成とし、相似判定手段５は比較評価用手段１３を兼ねる構成としてもよく、別個の構成としてもよい。また、本実施形態のスーパーオキシド消去能評価装置９はスーパーオキシド製造装置１を兼ねる構成としてもよい。
　次に、本発明に係るスーパーオキシドｉｎ ｖｉｖｏ製造方法は、生体試料または非ヒト動物の体内において本発明に係るスーパーオキシド製造方法を適用した方法であり、生体試料または非ヒト動物の体液を水系溶媒として利用している点、フラビンの濃度を取得する代わりにフラビンの量（至適量）を取得する点、および投与したフラビンおよび電子供与体が存在する箇所に光を照射してスーパーオキシドを発生させる点で本発明に係るスーパーオキシド製造方法と異なっている。具体的には、下記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）および（Ｇ）の工程を有する；
（Ａ）任意量のフラビン、電子供与体およびスピントラップ剤を生体試料または非ヒト動物の体内に投与する原料投与工程、
（Ｂ）前記生体試料または非ヒト動物の体内において前記投与したフラビンおよび電子供与体が存在する箇所に光を照射してスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを生成させる判定用スピンアダクト／ラジカル生成工程、
（Ｃ）前記生成させたスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する判定用スペクトル取得工程、
（Ｄ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記判定用スペクトルとが相似するか否かを判定する相似判定工程、
（Ｅ）前記相似判定により相似するフラビンの至適量を取得するフラビン至適量取得工程、
（Ｆ）前記取得した至適量のフラビンおよび電子供与体を前記生体試料または非ヒト動物の体内に投与する至適原料投与工程、
（Ｇ）前記生体試料または非ヒト動物の体内において前記投与したフラビンおよび電子供与体が存在する箇所に光を照射してスーパーオキシドを発生させる発生工程。
　本発明における生体試料としては、ヒトを含む動物、特に哺乳類から分離・採取された生体試料を用いることができ、例えば、罹患した哺乳類や老齢の哺乳類、実験動物などから分離・採取した生体試料を用いることができる。その形態としては、例えば、組織切片、細胞などの固形試料が望ましい。また、本発明において非ヒト動物としては、ヒト以外の動物を挙げることができ、例えば、ウシ、サル（サル目からヒトを除いたもの）、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ハムスター、ラット、マウスなどの哺乳類、ニワトリや七面鳥などの家禽、は虫類、両生類、魚類などを挙げることができる。
　本発明において、フラビンおよび電子供与体などの物質を生体試料または非ヒト動物の体内に投与する方法は、常法に従い行うことができ、例えば、生体試料に投与する方法としては、フラビンおよび電子供与体を封入したリポソームを膜融合させる方法やマイクロインジェクション法などを、非ヒト動物に投与する方法としては、経口投与法や皮下注射法などを挙げることができる。
　また、体液としては、細胞外液のみならず細胞内液が含まれ、細胞外液としては血液やリンパ液の他、組織間液、細胞間液、間質液などの組織液、漿膜腔液、脳脊髄液、関節液、眼房水などの体腔液、消化液、尿、精液、膣液、羊水、乳汁などが含まれる。
　次に、本発明に係るスーパーオキシドｉｎ ｖｉｖｏ消去能評価方法は、生体試料または非ヒト動物の体内において本発明に係るスーパーオキシド消去能評価方法を適用した方法であり、生体試料または非ヒト動物の体液を水系溶媒として利用している点、フラビンの濃度を取得する代わりにフラビンの量（至適量）を取得する点、および投与したフラビンおよび電子供与体、もしくは投与したフラビン、電子供与体、スピントラップ剤およびスーパーオキシド消去能を評価する試料を含む評価検体に光を照射して、スーパーオキシドを発生させる、またはスピンアダクトを生成させるという点で本発明に係るスーパーオキシド製造方法と異なっている。具体的には、下記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）および（Ｇ）の工程を有する；
（Ａ）任意量のフラビン、電子供与体およびスピントラップ剤を生体試料または非ヒト動物の体内に投与する原料投与工程、
（Ｂ）前記生体試料または非ヒト動物の体内において前記投与したフラビンおよび電子供与体が存在する箇所に光を照射してスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを生成させる判定用スピンアダクト／ラジカル生成工程、
（Ｃ）前記生成させたスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する判定用スペクトル取得工程、
（Ｄ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記判定用スペクトルとが相似するか否かを判定する相似判定工程、
（Ｅ）前記相似判定により相似するフラビンの至適量を取得するフラビン至適量取得工程、
（Ｈ）前記取得した至適量のフラビン、電子供与体、スピントラップ剤およびスーパーオキシド消去能を評価する試料を含む評価検体を生体試料または非ヒト動物の体内に投与する評価検体投与工程、
（Ｉ）前記生体試料または非ヒト動物の体内において前記投与した評価検体に光を照射してスピンアダクトを生成させるｉｎ ｖｉｖｏスピンアダクト生成工程、
（Ｊ）前記スピンアダクトを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得するｉｎ ｖｉｖｏスペクトル取得工程、
（Ｋ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記取得したスペクトルとを比較してスーパーオキシド消去能を評価するｉｎ ｖｉｖｏ比較評価工程。
　工程（Ｈ）：評価検体投与工程において、評価検体を投与する際、投与する前に、フラビン、電子供与体、スピントラップ剤およびスーパーオキシド消去能を評価する試料から評価検体を調製してもよく、また、フラビン、電子供与体、スピントラップ剤およびスーパーオキシド消去能を評価する試料を、それぞれ直接生体試料または非ヒト動物の体内に投与し、生体試料内または非ヒト動物の体内において評価検体を調製してもよい。
　また、評価検体には、その特徴を損なわない限りにおいて、フラビン、電子供与体、スピントラップ剤、スーパーオキシド消去能を評価する試料に加え、緩衝液や溶媒、賦形剤などの他の物質を含んでもよい。
　以下、本発明に係るスーパーオキシド製造方法、スーパーオキシド消去能評価方法、スーパーオキシド製造装置およびスーパーオキシド消去能評価装置について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
＜実施例１＞リボフラビン、ＥＤＴＡ、ＣＹＰＭＰＯを含む水系溶液に光を照射して発生させたラジカルの電子スピン共鳴による測定
　酸化還元反応触媒としてリボフラビン、電子供与体としてＥＤＴＡ、スピントラップ剤としてＣＹＰＭＰＯを含む水系溶液を調製し、これに光を照射してラジカルを発生させ、発生したラジカルを、電子スピン共鳴（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｓｐｉｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；ＥＳＲ）により同定および定量した。
（１）水系溶液の調製
　５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液にリボフラビン、ＥＤＴＡ、ＣＹＰＭＰＯ（ラジカルリサーチ社）をそれぞれ１μｍｏｌ／Ｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように加え、水系溶液（ＳＯＤ無添加水系溶液）を調製した。調製した水系溶液に、スーパーオキシドを特異的に消去する酵素であるスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）（Ｓｉｇｍａ社）を１０Ｕ／ｍＬとなるように加え、ＳＯＤ添加水系溶液を別途調製した。
（２）ＥＳＲによる測定
　本実施例（１）で調製した水系溶液（ＳＯＤ無添加水溶液およびＳＯＤ添加水溶液）を電子スピン共鳴装置ＪＥＳ－ＲＥ１Ｘ（日本電子社）の試料管にそれぞれ導入した。この試料管にキセノンランプを用いて１５００ルックスの可視光を３０秒間照射した後、以下に示す測定条件でＥＳＲによる測定を行ってスペクトルを得た。ＳＯＤ無添加水系溶液のスペクトルをスペクトルＡとし、ＳＯＤ添加水系溶液のスペクトルをスペクトルＢとした。その結果を図１０に示す。なお、スーパーオキシドとＣＹＰＭＰＯからなるスピンアダクトの、コンピューターシミュレーションにより得られたスペクトル（スーパーオキシド標準スペクトル；Ｍ．Ｋａｍｉｂａｙａｓｈｉら、Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第４０巻、第１１号、第１１６６－１１７２頁、２００６年）およびラジカル化したＥＤＴＡ（ＥＤＴＡラジカル）の、コンピューターシミュレーションにより得られたスペクトル（ＥＤＴＡラジカル標準スペクトル）を図１１に示す。
　ＥＳＲによる測定の条件
出力： ６ｍＷ
磁場掃引幅： ± ７．５ｍＴ
測定時間： ２分間
変調幅： ０．１ｍＴ
時定数： ０．１秒
　図１０および図１１に示すように、図１０のスペクトルＡの形状と図１１上図のスーパーオキシド標準スペクトルの形状とはほとんど同じであること、およびスペクトルＡのシグナル強度と比較して、スーパーオキシド標準スペクトルのシグナル強度はほとんど変わらないことが確認された。また、図１０のスペクトルＢの形状と図１１下図のＥＤＴＡラジカル標準スペクトルの形状とはほとんど同じであることが確認された。また、図１０に示すように、スペクトルＡのシグナル強度と比較してスペクトルＢのシグナル強度は小さく、スペクトルＡでみられるピークがスペクトルＢではみられないことが確認された。
　このことから、スペクトルＡでみられるピークはスーパーオキシドのスピンアダクトに由来することが示され、ＳＯＤ無添加水系溶液において、スーパーオキシドが多量に発生したことが示された。また、スペクトルＢでみられるピークはＥＤＴＡラジカルに由来することが示され、スペクトルＡでみられたピークがスペクトルＢではみられないことからも、ＳＯＤ添加水系溶液において少量のＥＤＴＡラジカルが発生し、スーパーオキシドが発生しなかったことが示された。
　以上のことから、本実施例に係る水系溶液により、スーパーオキシドおよび電子供与体ラジカル（妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）の２種類のラジカルを発生させて、そのうちのスーパーオキシドを選択的に発生させることができることが明らかとなり、この水系溶液にスーパーオキシド消去能を有する物質を加えることにより、スーパーオキシドの発生を抑制することが明らかとなった。
＜実施例２＞酸化還元反応触媒および電子供与体の検討
　酸化還元反応触媒あるいは電子供与体を変えて、光照射によりラジカルを発生させ、ＥＳＲにより発生したラジカルの同定および定量を行い、スーパーオキシド発生に好適な酸化還元反応触媒および電子供与体を検討した。
（１）電子供与体としてテトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＤ）を用いた場合のスーパーオキシド発生
　実施例１で用いたＥＤＴＡの代わりにテトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＤ）を電子供与体として水系溶液を調製し、光を照射することによりラジカルを発生させ、ＥＳＲにより発生したラジカルの同定および定量を行った。
　５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液にリボフラビン、ＴＭＤ、ＣＹＰＭＰＯ（ラジカルリサーチ社）をそれぞれ１０μｍｏｌ／Ｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように加え、水系溶液を調製した。
　この水系溶液について実施例１（２）と同様の操作によりＥＳＲによる測定を行い、スペクトルを得た。得られたスペクトルを図１２に示す。
　図１１上図および図１２に示すように、図１１上図のスーパーオキシド標準スペクトルの形状と図１２のスペクトルの形状とは異なることが確認された。
（２）電子供与体としてメチオニンを用いた場合のスーパーオキシド発生
　実施例１で用いたＥＤＴＡの代わりに、メチオニンを電子供与体として用いて水系溶液を調製し、光を照射することによりラジカルを発生させ、ＥＳＲにより発生したラジカルの同定および定量を行った。
　ＴＭＤをメチオニンに換えて本実施例（１）と同様の操作により水系溶液を調製し、ＥＳＲによる測定を行い、スペクトルを得た。得られたスペクトルを図１３に示す。
　図１１上図および図１３に示すように、図１１上図のスーパーオキシド標準スペクトルの形状と図１３のスペクトルの形状とは異なることが確認された。
（３）酸化還元反応触媒としてフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を用いた場合のスーパーオキシド発生
　実施例１で用いたリボフラビンの代わりにフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を酸化還元反応触媒として水系溶液を調製し、光を照射することによりラジカルを発生させ、ＥＳＲにより発生したラジカルの同定および定量を行った。
　５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液にＦＭＮ、ＥＤＴＡ、ＣＹＰＭＰＯ（ラジカルリサーチ社）をそれぞれ５μｍｏｌ／Ｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように加え、水系溶液を調製した。
　この水系溶液について実施例１（２）と同様の操作によりＥＳＲによる測定を行い、スペクトルを得た。得られたスペクトルを図１４に示す。
　図１１および図１４に示すように、図１１上図のスーパーオキシド標準スペクトルの形状と図１４のスペクトルの形状とが相似関係にある一方で、図１１下図のＥＤＴＡラジカル標準スペクトルの形状と図１４のスペクトルの形状とは異なることが確認された。
（４）酸化還元反応触媒としてフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を用い、かつ電子供与体としてテトラエチレンジアミン（ＴＭＤ）を用いた場合のスーパーオキシド発生
　実施例１で用いたリボフラビンの代わりにフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を酸化還元反応触媒として、またＥＤＴＡの代わりにテトラエチレンジアミン（ＴＭＤ）を電子供与体として、それぞれを用いて水系溶液を調製し、光を照射することによりラジカルを発生させ、ＥＳＲにより発生したラジカルの同定および定量を行った。
　リボフラビンをＦＭＮに換えて本実施例（１）と同様の操作により水系溶液を調製し、ＥＳＲによる測定を行い、スペクトルを得た。得られたスペクトルを図１５に示す。
　図１１上図および図１５に示すように、図１１上図のスーパーオキシド標準スペクトルの形状と図１５のスペクトルの形状とは異なることが確認された。
（５）酸化還元反応触媒としてフルオレセインを用い、かつ電子供与体としてメチオニンを用いた場合のスーパーオキシド発生
　実施例１で用いたリボフラビンの代わりにフルオレセインを酸化還元反応触媒として、またＥＤＴＡの代わりにメチオニンを電子供与体として、それぞれを用いて水系溶液を調製し、光を照射することによりラジカルを発生させ、ＥＳＲにより発生したラジカルの同定および定量を行った。
　リボフラビンをフルオレセインに、ＴＭＤをメチオニンにそれぞれ換えて、本実施例（１）と同様の操作により水系溶液を調製し、ＥＳＲによる測定を行い、スペクトルを得た。得られたスペクトルを図１６に示す。
　図１１上図および図１６に示すように、図１１上図のスーパーオキシド標準スペクトルの形状と図１６のスペクトルの形状とは異なることが確認された。
　以上、本実施例（１）から（５）の結果より、酸化還元反応触媒としてリボフラビンを用い、かつ電子供与体としてＴＭＤを用いた場合、酸化還元反応触媒としてリボフラビンを用い、かつ電子供与体としてメチオニンを用いた場合、酸化還元反応触媒としてＦＭＮを用い、かつ電子供与体としてＴＭＤを用いた場合および酸化還元反応触媒としてフルオレセインを用い、かつ電子供与体としてメチオニンを用いた場合のいずれと比較しても、酸化還元反応触媒としてリボフラビンあるいはＦＭＮを用い、かつ電子供与体としてＥＤＴＡを用いた場合の方が、電子供与体ラジカル（妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）の発生を抑えて、高純度でスーパーオキシドを含有するラジカルを得ることができることが明らかとなった。
＜実施例３＞リボフラビン濃度とスーパーオキシド発生量およびスーパーオキシドの純度との関係の検討
　水系溶液におけるリボフラビンの濃度を変えることにより、スーパーオキシドおよび電子供与体ラジカル（妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）の発生量の変化を確認した。
　実施例１（１）で調製した水系溶液（ＳＯＤ添加水系溶液およびＳＯＤ無添加水系溶液）において、リボフラビン濃度が、それぞれ０．１μｍｏｌ／Ｌ、０．５μｍｏｌ／Ｌ、１μｍｏｌ／Ｌ、２．５μｍｏｌ／Ｌ、５μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌ、１５μｍｏｌ／Ｌ、２５μｍｏｌ／Ｌ、５０μｍｏｌ／Ｌとなるように水系溶液を調製した。
　これらの水系溶液それぞれについて実施例１（２）と同様の操作によりＥＳＲによる測定を行い、スペクトルを得た。
　これらのスペクトルに基づき、それぞれの水系溶液において発生したラジカルの同定ないし発生したラジカル量の数値化を行った。すなわち、ＳＯＤ添加水系溶液のスペクトルに基づいて、発生したＥＤＴＡラジカル（妨害ラジカル）量の数値化を行い、ＳＯＤ無添加水系溶液のスペクトルに基づいて、発生したスーパーオキシド量の数値化を行った。なお、スーパーオキシド量の数値化は、スーパーオキシド標準スペクトル（図１１上図）の形状に基づいて、スーパーオキシド固有のスペクトル形状を有しているとの判断をした場合に行った。また、数値化した結果に基づき、次式４により、各リボフラビン濃度の水系溶液において発生したラジカルにおけるスーパーオキシドの純度を算出した。その結果を図１７に示す。
（式４）：スーパーオキシドの純度（％）＝［発生したスーパーオキシド量／｛発生したスーパーオキシド量＋発生したＥＤＴＡラジカル（妨害ラジカル量）｝］×１００
　図１７に示すように、リボフラビン濃度が０．１μｍｏｌ／Ｌの水系溶液では、スーパーオキシドおよびＥＤＴＡラジカル（妨害ラジカル）のいずれも発生しないことが確認され、リボフラビン濃度が０．５μｍｏｌ／Ｌ、１μｍｏｌ／Ｌおよび２．５μｍｏｌ／Ｌの水系溶液では、スーパーオキシドが発生するのに比較して、ＥＤＴＡラジカル（妨害ラジカル）はほとんど発生せず、スーパーオキシドの純度は約８８．９％であることが確認された。また、リボフラビン濃度が５μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌおよび１５μｍｏｌ／Ｌの水系溶液では、スーパーオキシドが多量に発生するのに比較して、ＥＤＴＡラジカル（妨害ラジカル）はほとんど発生せず、スーパーオキシドの純度はそれぞれ８７．５％、約８３．３％および約７６．５％であることが確認された。なお、リボフラビン濃度が２５μｍｏｌ／Ｌおよび５０μｍｏｌ／Ｌの水系溶液ではＥＤＴＡラジカル（妨害ラジカル）に由来するシグナルが強くなるため、発生したスーパーオキシド量の数値化およびスーパーオキシドの純度の算出は行わなかった。
　以上の結果より、リボフラビン濃度Ｃ（μｍｏｌ／Ｌ）が０．１＜Ｃ＜２５である水系溶液、特にリボフラビン濃度Ｃ（μｍｏｌ／Ｌ）が０．５≦Ｃ≦１５である水系溶液では、電子供与体ラジカル（妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）はほとんど発生せず、スーパーオキシドが多量に発生することが明らかとなった。
＜実施例４＞光照射時間とスーパーオキシド発生量との関係の確認
　光照射開始からスーパーオキシド発生までの時間、光照射停止からスーパーオキシド発生停止までの時間および光照射時間とスーパーオキシド発生量との関係を確認した。
（１）水系溶液の調製
　５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液にリボフラビン、ＥＤＴＡ、ＣＹＰＭＰＯ（ラジカルリサーチ社）をそれぞれ１μｍｏｌ／Ｌ、３ｍｍｏｌ／Ｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように加え、水系溶液を調製した。調製した水系溶液を１６サンプルに分け、それぞれ試料１～試料１６とした。
（２）ＥＳＲによる測定
　本実施例（１）で調製した水系溶液を電子スピン共鳴装置ＪＥＳ－ＲＥ１Ｘ（日本電子社）の試料管に順次導入し、照射時間を変えて可視光を照射した後、ＥＳＲによる測定を行うことによりスペクトルを得た。各試料における可視光の照射時間を以下に示す。ＥＳＲの観測磁場は３３５．７ｍＴ（実施例１においてスーパーオキシド由来のピークが確認された磁場と同じ磁場）に固定して、ＥＳＲによる測定を行った。その他の光照射条件およびＥＳＲによる測定の条件は実施例１（２）と同様にした。
可視光照射時間
試料１：照射開始前３０秒（－３０）
試料２：照射開始前１５秒（－１５）
試料３：照射開始前０秒（０）
試料４：照射時間５秒（５）
試料５：照射時間１０秒（１０）
試料６：照射時間１５秒（１５）
試料７：照射時間２０秒（２０）
試料８：照射時間３０秒（３０）
試料９：照射時間４５秒（４５）
試料１０：照射時間６０秒（６０）
試料１１：６０秒照射し、照射停止後５秒（＋５）
試料１２：６０秒照射し、照射停止後１０秒（＋１０）
試料１３：６０秒照射し、照射停止後２０秒（＋２０）
試料１４：６０秒照射し、照射停止後３０秒（＋３０）
試料１５：６０秒照射し、照射停止後６０秒（＋６０）
試料１６：６０秒照射し、照射停止後１２０秒（＋１２０）
　得られたスペクトルのシグナル強度を縦軸に、可視光照射時間を横軸に表してグラフ化した。その結果を図１８に示す。
　図１８に示すように、光照射開始後すぐにシグナルが確認され、シグナル強度は可視光照射時間に比例して大きくなることが確認された。換言すれば、産生されたスーパーオキシドのスピンアダクトの量が光照射時間に比例して増加することを示している。また、光照射の停止とともに、シグナル強度が時間に比例して緩やかに小さくなることが確認された。すなわち、産生されたスーパーオキシドのスピンアダクトの量が時間に比例して徐々に減少することを示している。
　以上の結果より、光照射の開始とともにスーパーオキシドが発生し、光照射の停止とともにスーパーオキシドの発生も停止することが明らかとなった。また、光を照射している間は、継続的、安定的にスーパーオキシドが発生することが確認された。
＜比較例１＞リボフラビンの光照射により発生させたラジカルにおけるスーパーオキシドの純度とキサンチンオキシダーゼにより発生させたラジカルにおけるスーパーオキシドの純度との比較
　リボフラビンの光照射によりスーパーオキシドを発生させた場合と、キサンチンオキシダーゼによりスーパーオキシドを発生させた場合とで、ＳＯＤによるラジカルの発生阻害の程度を比較することにより、リボフラビンの光照射により発生させたラジカルにおけるスーパーオキシドの純度について検討した。
（１）リボフラビンの光照射によるラジカル発生量の定量
　実施例１（１）におけるＳＯＤ添加水系溶液のＳＯＤ濃度がそれぞれ０．５Ｕ／ｍＬ、１Ｕ／ｍＬ、１．５Ｕ／ｍＬとなるようにＳＯＤ添加水系溶液とＳＯＤ無添加水系溶液とを調製した。
　調製したそれぞれの水系溶液について、実施例１（２）と同様の操作によりＥＳＲによる測定を行い、スペクトルを得た。この得られたスペクトルに基づいて、ラジカルの発生量を定量した。
（２）キサンチンオキシダーゼによるラジカル発生量の定量
　５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液にヒポキサンチン、ＣＹＰＭＰＯ（ラジカルリサーチ社）およびジエチレントリアミノ五酢酸（ＤＥＴＡＰＡＣ）を、それぞれ０．３９ｍｍｏｌ／Ｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ、０．１ｍｍｏｌ／Ｌとなるように加えて水系溶液（ＳＯＤ無添加水系溶液）を調製した。さらに、この水系溶液にＳＯＤ（Ｓｉｇｍａ社）をそれぞれ０．５Ｕ／ｍＬ、１Ｕ／ｍＬ、１．５Ｕ／ｍＬとなるように加えることにより、ＳＯＤ添加水系溶液を別途調製した。
　調製したＳＯＤ無添加水系溶液およびＳＯＤ添加水系溶液に、それぞれキサンチンオキシダーゼを０．２Ｕ／ｍＬとなるように加えた後、実施例１（２）と同様の操作によりＥＳＲによる測定を行い、スペクトルを得た。続いて、得られたスペクトルに基づいてラジカルの発生量を定量した。ＥＳＲによる測定は、キサンチンオキシダーゼを加えた後、６０秒経過後に行った。
　本実施例（１）および（２）のラジカル発生量の定量結果に基づいて、ＳＯＤによるラジカル発生阻害率を、次式５により算出した。その結果を図１９に示す。
（式５）：ＳＯＤによるラジカル発生阻害率＝（Ｓ０－Ｓ）／Ｓ
　Ｓ０：ＳＯＤを加えない場合のラジカル発生量
　Ｓ：ＳＯＤを加えた場合のラジカル発生量
　なお、ＳＯＤは電子供与体ラジカル（妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）には作用せず、スーパーオキシドのみを分解することから、ＳＯＤによるラジカル発生阻害率は、スーパーオキシドの純度を表している。すなわち、発生したラジカルにおいて、スーパーオキシドの純度が高いほどＳＯＤによるラジカル発生阻害率は高くなる。
　図１９に示すように、リボフラビンの光照射によりスーパーオキシドを発生させた場合と、キサンチンオキシダーゼによりスーパーオキシドを発生させた場合とを比較した場合、加えたＳＯＤ濃度にかかわらず、ラジカル発生阻害率はほぼ同値を示すことが確認された。
　キサンチンオキシダーゼにより発生させたラジカルにおけるスーパーオキシドの純度は高いことが知られていることから、以上の結果より、本実施例における反応条件でリボフラビンの光照射によりラジカルを発生させた場合、高純度でスーパーオキシドを含有するラジカルが得られることが明らかとなった。
　１　スーパーオキシド製造装置
　２　判定用溶液調製手段
　３　判定用スピンアダクト／ラジカル生成手段
　４　判定用スペクトル取得手段
　５　相似判定手段
　６　フラビン濃度取得手段
　７　原料溶液調製手段
　８　発生手段
　９　スーパーオキシド消去能評価装置
　１０　評価溶液調製手段
　１１　評価用スピンアダクト生成手段
　１２　評価用スペクトル取得手段
　１３　比較評価用手段
　２１　注入量調節機能を備えた判定用容器
　２２　判定用注入管
　２３　判定用溶液収容部
　４１　電磁石
　４２　マイクロ波発振器
　４３　クリスタルダイオード検出器
　４４　増幅器
　４５　記録計
　５１　入力部
　５２　表示部
　５３　判定用スペクトルデータ取得部
　５４　標準スペクトルデータ取得部
　５５　スペクトル比較判定部
　６１　フラビン濃度取得部
　６２　制御信号出力部
　７１　注入量調節機能を備えた原料用容器
　７２　原料用注入管
　７３　原料溶液収容部
　１０１　注入量調節機能を備えた評価用容器
　１０２　評価用注入管
　１０３　評価溶液収容部
　１３１　評価用スペクトルデータ取得部
　１３２　スペクトル比較評価部
　Ｃ　　　演算処理手段
　Ｒ　　　記憶手段

Claims (24)

  1. 　下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）の工程を有するスーパーオキシド製造方法；
    （ａ）フラビン、電子供与体、スピントラップ剤および水系溶媒を含む判定用溶液を調製する判定用溶液調製工程、
    （ｂ）前記判定用溶液に光を照射してスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを生成させる判定用スピンアダクト／ラジカル生成工程、
    （ｃ）前記生成させたスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する判定用スペクトル取得工程、
    （ｄ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記判定用スペクトルとが相似するか否かを判定する相似判定工程、
    （ｅ）前記相似判定により相似するフラビンの濃度を取得するフラビン濃度取得工程、
    （ｆ）前記取得した濃度のフラビン、電子供与体および水系溶媒を含む原料溶液を調製する原料溶液調製工程、
    （ｇ）前記原料溶液に光を照射してスーパーオキシドを発生させる発生工程。
  2. 　フラビンがリボフラビンである場合において、前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）の工程に代えて下記（ｈ）の工程を有する、請求項１に記載のスーパーオキシド製造方法；
    （ｈ）リボフラビンの濃度Ｃ（μｍｏｌ／Ｌ）が０．１＜Ｃ≦１５となるようにリボフラビン、電子供与体および水系溶媒を含む原料溶液を調製する原料溶液調製工程。
  3. 　フラビン濃度取得工程が、前記相似判定により相似するフラビンの濃度を、生成するラジカルにおいてスーパーオキシドの純度が７５．６～１００％となるように取得するフラビン濃度取得工程である、請求項１または請求項２に記載のスーパーオキシド製造方法。
  4. 　電子供与体がＥＤＴＡである、請求項１から請求項３のいずれかに記載のスーパーオキシド製造方法。
  5. 　スピントラップ剤がＣＹＰＭＰＯである、請求項１から請求項４のいずれかに記載のスーパーオキシド製造方法。
  6. 　水系溶媒がリン酸緩衝液である、請求項１から請求項５のいずれかに記載のスーパーオキシド製造方法。
  7. 　試料のスーパーオキシド消去能を評価する方法であって、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）および（ｌ）の工程を有する、前記方法；
    （ａ）フラビン、電子供与体、スピントラップ剤および水系溶媒を含む判定用溶液を調製する判定用溶液調製工程、
    （ｂ）前記判定用溶液に光を照射してスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを生成させる判定用スピンアダクト／ラジカル生成工程、
    （ｃ）前記生成させたスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する判定用スペクトル取得工程、
    （ｄ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記判定用スペクトルとが相似するか否かを判定する相似判定工程、
    （ｅ）前記相似判定により相似するフラビンの濃度を取得するフラビン濃度取得工程、
    （ｉ）前記取得した濃度のフラビン、電子供与体、スピントラップ剤、スーパーオキシド消去能を評価する試料および水系溶媒を含む評価溶液を調製する評価溶液調製工程、
    （ｊ）前記評価溶液に光を照射してスピンアダクトを生成させる評価用スピンアダクト生成工程、
    （ｋ）前記評価用スピンアダクトを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する評価用スペクトル取得工程、
    （ｌ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記評価用スペクトルとを比較してスーパーオキシド消去能を評価する比較評価工程。
  8. 　フラビンがリボフラビンである場合において、前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｉ）の工程に代えて下記（ｍ）の工程を有する、請求項７に記載の方法；
    （ｍ）リボフラビンの濃度Ｃ（μｍｏｌ／Ｌ）が０．１＜Ｃ≦１５となるようにリボフラビン、電子供与体、スピントラップ剤、スーパーオキシド消去能を評価する試料および水系溶媒を含む評価溶液を調製する評価溶液調製工程。
  9. 　フラビン濃度取得工程が、前記相似判定により相似するフラビンの濃度を、生成するラジカルにおいてスーパーオキシドの純度が７５．６～１００％となるように取得するフラビン濃度取得工程である、請求項７または請求項８に記載の方法。
  10. 　電子供与体がＥＤＴＡである、請求項７から請求項９のいずれかに記載の方法。
  11. 　スピントラップ剤がＣＹＰＭＰＯである、請求項７から請求項１０のいずれかに記載の方法。
  12. 　水系溶媒がリン酸緩衝液である、請求項７から請求項１１のいずれかに記載の方法。
  13. 　下記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）の手段を備えるスーパーオキシド製造装置；
    （ｉ）フラビン、電子供与体、スピントラップ剤および水系溶媒を含む判定用溶液を調製する判定用溶液調製手段、
    （ｉｉ）前記判定用溶液に光を照射してスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを生成させる判定用スピンアダクト／ラジカル生成手段、
    （ｉｉｉ）前記生成させたスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する判定用スペクトル取得手段、
    （ｉｖ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記判定用スペクトルとが相似するか否かを判定するための相似判定手段、
    （ｖ）前記相似判定により相似するフラビンの濃度を取得するフラビン濃度取得手段、
    （ｖｉ）前記取得した濃度のフラビン、電子供与体および水系溶媒を含む原料溶液を調製する原料溶液調製手段、
    （ｖｉｉ）前記原料溶液に光を照射してスーパーオキシドを発生させる発生手段。
  14. 　フラビンがリボフラビンである場合において、前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）の手段に代えて下記（ｖｉｉｉ）の手段を備える、請求項１３に記載のスーパーオキシド製造装置；
    （ｖｉｉｉ）リボフラビンの濃度Ｃ（μｍｏｌ／Ｌ）が０．１＜Ｃ≦１５となるように、リボフラビン、電子供与体および水系溶媒を含む原料溶液を調製する原料溶液調製手段。
  15. 　フラビン濃度取得手段が、前記相似判定により相似するフラビンの濃度を、生成するラジカルにおいてスーパーオキシドの純度が７５．６～１００％となるように取得するフラビン濃度取得手段である、請求項１３または請求項１４に記載のスーパーオキシド製造装置。
  16. 　電子供与体がＥＤＴＡである、請求項１３から請求項１５のいずれかに記載のスーパーオキシド製造装置。
  17. 　スピントラップ剤がＣＹＰＭＰＯである、請求項１３から請求項１６のいずれかに記載のスーパーオキシド製造装置。
  18. 　水系溶媒がリン酸緩衝液である、請求項１３から請求項１７のいずれかに記載のスーパーオキシド製造装置。
  19. 　試料のスーパーオキシド消去能を評価する装置であって、下記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｉｘ）、（ｘ）、（ｘｉ）および（ｘｉｉ）の手段を有する、前記装置；
    （ｉ）フラビン、電子供与体、スピントラップ剤および水系溶媒を含む判定用溶液を調製する判定用溶液調製手段、
    （ｉｉ）前記判定用溶液に光を照射してスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを生成させる判定用スピンアダクト／ラジカル生成手段、
    （ｉｉｉ）前記生成させたスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する判定用スペクトル取得手段、
    （ｉｖ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記判定用スペクトルとが相似するか否かを判定するための相似判定手段、
    （ｖ）前記相似判定により相似するフラビンの濃度を取得するフラビン濃度取得手段、
    （ｉｘ）前記取得した濃度のフラビン、電子供与体、スピントラップ剤、スーパーオキシド消去能を評価する試料および水系溶媒を含む評価溶液を調製する評価溶液調製手段、
    （ｘ）前記評価溶液に光を照射してスピンアダクトを生成させる評価用スピンアダクト生成手段、
    （ｘｉ）前記評価用スピンアダクトを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する評価用スペクトル取得手段、
    （ｘｉｉ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記評価用スペクトルとを比較してスーパーオキシド消去能を評価するための比較評価用手段。
  20. 　フラビンがリボフラビンである場合において、前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｉｘ）の手段に代えて下記（ｘｉｉｉ）の手段を備える、請求項１９に記載の装置；
    （ｘｉｉｉ）リボフラビンの濃度Ｃ（μｍｏｌ／Ｌ）が０．１＜Ｃ≦１５となるようにリボフラビン、電子供与体、スピントラップ剤、スーパーオキシド消去能を評価する試料および水系溶媒を含む評価溶液を調製する評価溶液調製手段。
  21. 　フラビン濃度取得手段が、前記相似判定により相似するフラビンの濃度を、生成するラジカルにおいてスーパーオキシドの純度が７５．６～１００％となるように取得するフラビン濃度取得手段である、請求項１９または請求項２０に記載の装置。
  22. 　電子供与体がＥＤＴＡである、請求項１９から請求項２１のいずれかに記載の装置。
  23. 　スピントラップ剤がＣＹＰＭＰＯである、請求項１９から請求項２２のいずれかに記載の装置。
  24. 　水系溶媒がリン酸緩衝液である、請求項１９から請求項２３のいずれかに記載の装置。
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