WO2011069501A1 - Kompetitionsassay zur detektion von nukleinsäureoligomer-hybridisierungsereignissen - Google Patents

Kompetitionsassay zur detektion von nukleinsäureoligomer-hybridisierungsereignissen Download PDF

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WO2011069501A1
WO2011069501A1 PCT/DE2010/075152 DE2010075152W WO2011069501A1 WO 2011069501 A1 WO2011069501 A1 WO 2011069501A1 DE 2010075152 W DE2010075152 W DE 2010075152W WO 2011069501 A1 WO2011069501 A1 WO 2011069501A1
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nucleic acid
acid oligomers
signal
detection
oligomers
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PCT/DE2010/075152
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Inventor
Gerhard Hartwich
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Friz Biochem Gesellschaft Für Bioanalytik Mbh
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting nucleic acid oligomer hybridization events.
  • nucleic acids In disease diagnosis, microbiological diagnostics, toxicological testing, genetic research and development, as well as in the agricultural and pharmaceutical sectors, the direct detection of very small amounts of nucleic acids has become indispensable. Increasingly, detection techniques using array technology using so-called DNA chips have become available which enable surface-sensitive detection of nucleic acid oligomer hybridization events. With the help of this sensitive method, nucleic acids can be detected with a very low detection limit.
  • a library of known DNA sequences (“probe oligonucleotides”) is fixed in an ordered grid on a surface, so that the position of each individual DNA sequence is known.
  • target oligonucleotides fragments of active genes whose sequences are complementary to specific probe oligonucleotides on the chip exist in the assay solution, then the target oligonucleotides can be identified by detection of the corresponding on-chip hybridization events.
  • WO 99/51778 A1 describes an electrochemical method for the detection of nucleic acid oligomer hybridization events.
  • the association events are evidenced by the change in the electrochemical properties of the probe molecules associated with the association.
  • WO 2007/143669 A2 discloses a method for the electrochemical detection of nucleic acids by means of probes which are bound to a microarray surface.
  • competitor molecules may be present which compete with the target nucleic acids for binding sites on the immobilized probes.
  • the object of the present invention is to provide a method for detecting nucleic acid oligomer hybridization events which combines high detection sensitivity with easy sample handling.
  • dNTP deoxyribonucleoside triphosphate a mix of dATP
  • dCTP deoxycytidine triphosphate
  • dGTP deoxyguanosine triphosphate
  • dTTP deoxythymidine triphosphate
  • Nucleic acid nucleic acid of unspecified base length e.g.
  • Oligomer Nucleic Acid Octamer A nucleic acid of any type
  • Oligomer equivalent to nucleic acid oligomer Oligomer equivalent to nucleic acid oligomer.
  • Oligonucleotide equivalent to oligomer or nucleic acid oligomer e.g. a DNA, PNA or RNA fragment of unspecified base length.
  • Oligo Abbreviation for oligonucleotide Oligo Abbreviation for oligonucleotide.
  • Nucleic Acid At least two covalently linked nucleotides or at least two covalently linked pyrimidine (e.g., cytosine, thymine or uracil) or purine bases (e.g., adenine or guanine).
  • the term nucleic acid refers to any "backbone" of the covalently linked pyrimidine or purine bases, e.g. to the sugar-phosphate backbone of the DNA, cDNA or RNA, to a peptide backbone of the PNA or to analogous structures (e.g., phosphoramide, thio-phosphate or dithio-phosphate backbone).
  • An essential feature of a nucleic acid according to the present invention is that it can bind naturally occurring cDNA or RNA sequence-specific.
  • Template nucleic acid molecule equivalent to
  • Sample sample nucleic acid, sample DNA or template.
  • hybridization step also: annealing
  • thermostable polymerase e.g. Taq polymerase (which was originally isolated from a thermophilic organism Thermus aquaticus) whose optimum working temperature is in a range of 70 ° C to 74 ° C and which is also tolerant to temperatures of up to 100 ° C and more.
  • the two single strands hybridize such that the base A (or C) of one strand forms hydrogen bonds with the base T (or G) of the other strand (in the case of RNA, T is replaced by uracil). Any other base pairing does not form hydrogen bonds, distorts the structure, and is referred to as a "mismatch.”
  • Nucleic acid oligomers hybridize the two single strands, wherein the nucleotide sequence of one strand is complementary to the nucleotide sequence of the other strand, so that the base A (or C) of one strand with the base T (or G) of the other strand hydrogen bonds formed (in RNA T is replaced by uracil).
  • redox-active Designates the property of a unit under certain circumstances to donate electrons to a suitable oxidant or to take up electrons from a suitable reducing agent.
  • linkers are commercially available as alkyl, alkenyl, alkynyl, heteroalkyl, hetero-alkenyl or hetero-alkynyl chain, wherein the chain is derivatized in two places with (identical or different) reactive groups. These groups form a covalent chemical bond in simple / known chemical reactions with the corresponding reaction partner.
  • the reactive groups may also be photoactivatable, ie the reactive groups are activated only by light of specific or arbitrary wavelength.
  • Nonspecific nt, ie, nt complementary to other bases can also be used as linker / spacer, in particular in the case of the attachment of probe oligos to a surface.
  • the present invention relates to a method of detecting nucleic acid oligomer hybridization events comprising the steps of providing a modified surface, wherein the modification comprises attaching at least one type of probe nucleic acid oligomer, providing a sample with target nucleic acid oligomers, providing a solution having at least one Type of signal nucleic acid oligomers, wherein the signal nucleic acid oligomers are modified with at least one detection label, the signal nucleic acid oligomers have a complementary or substantially complementary to the probe nucleic acid oligomers section and the signal nucleic acid oligomers to the target nucleic acid oligomers complementary or largely complementary section providing a reaction solution for carrying out a nucleic acid amplification, wherein the reaction solution comprises at least nucleotides and at least one type of nucleic acid acid polymerase, mixing and contacting with the modified surface of the solution with signal nucleic acid oligomers, the sample with target nucleic acid oligomers and the reaction solution for
  • the method according to the invention is based on the idea of combining the high sensitivity of a surface-sensitive detection method with a preceding amplification of the target oligonucleotides. Thereby, the limit for the detection of the target nucleic acid oligomers originally present in the sample can be shifted to extremely small concentrations. Ideally, detection of a single target nucleic acid oligomer is possible.
  • a "substantially complementary structure" is understood as meaning sequence sections in which a maximum of 20% of the base pairs form mismatches. the base pairs form mismatches.
  • a "substantially complementary structure” is a sequence segment in which a maximum of 10% of the base pairs form mismatches, and very particularly preferably sequence segments in which a maximum of 5% of the base pairs form mismatches then it is a complementary structure.
  • the method according to the invention enables the detection of nucleic acid oligomer hybridization events with simultaneously proceeding amplification of the target nucleic acid oligomers, wherein probe and signal nucleic acid oligomers have largely complementary sections and at the same time the signal nucleic acid oligomers have a section complementary to the target nucleic acid oligomers.
  • the entire process is carried out in a single reaction vessel and thus represents a "closed tube” application.
  • the amplification of the target nucleic acid oligomers increases their amount and thus their concentration present in the reaction mixture in the course of carrying out the process.
  • concentration ratios of signal nucleic acid oligomers to target nucleic acid oligomers are critical.
  • a method in which surface-sensitive detection and at the same time an amplification are carried out must therefore fulfill certain conditions which allow accurate and error-free detection of nucleic acid oligomer hybridization events.
  • signal nucleic acid oligomers which have a complementary or substantially complementary to the target nucleic acid oligomers portion and at the same time a complementary to the probe nucleic acid oligomers or substantially complementary section, the signal nucleic acid oligomers with both the target nucleic acid oligomers as also hybridize with the probe nucleic acid oligomers. It is a competition assay in which target nucleic acid oligomers and probe nucleic acid oligomers compete for the signal nucleic acid oligomers.
  • Hybridization events are more likely and occur at higher rates when all binding partners are free in solution. Boundary surface reactions, namely, binding events between a free-solvent binding partner and a second binding partner immobilized on a surface are usually slower and less likely to occur. Therefore, hybridization of the free-in-solution target and signal nucleic acid oligomers is much more likely and occurs faster than hybridization of the signal nucleic acid oligomers with the surface-bound probe nucleic acid oligomers. The increase in concentration of the target nucleic acid oligomers due to their amplification enhances this effect so that any increase in the amount of target nucleic acid oligomers makes capture of the signal nucleic acid oligomers more likely.
  • Hybridization events of signal nucleic acid oligomers with the immobilized on the surface probe nucleic acid oligomers are characterized with increasing target nucleic acid oligomer concentration less and less, whereby the measurement signal of the surface-sensitive detection decreases.
  • the probe nucleic acid oligomers may have a greater number of bases than the signal nucleic acid oligomers and comprise a sequence segment having a complementary or substantially complementary structure to the target nucleic acid oligomers.
  • This section which does not have a complementary or substantially complementary structure to a section of the signal nucleic acid oligomers, is referred to in the context of the present invention as a target docking section.
  • the target nucleic acid oligomers In the presence of a target docking section, the target nucleic acid oligomers first hybridize with the target docking section to the probe nucleic acid oligomers and displace in this way particularly fast and efficiently pre-bound signal nucleic acid oligomers.
  • a decrease in the signal intensity over time is detected in the presence of the target being sought and, above all, when the concentration is increased by amplification.
  • the signal nucleic acid oligomers may also comprise a larger number of bases than the probe nucleic acid oligomers and comprise at least one target docking section, wherein the target docking section does not have a complementary or substantially complementary structure to a section of the probe nucleic acid oligomers and wherein the target nucleic acid oligomers in addition to its complementary to the signal nucleic acid oligomers Section have another to the target docking section complementary or largely complementary section.
  • the target nucleic acid oligomers first hybridize with the target docking section to the signal nucleic acid oligomers and displace in this way particularly fast and efficiently previously bound probe nucleic acid oligomers.
  • the amplification of the target nucleic acid oligomers is carried out by a PCR or by an isothermal amplification. If the amplification takes place via a PCR, the provided reaction solution additionally contains at least one type of primer. Isothermal amplification is carried out at a constant temperature, for example at 60 ° C, and depending on the chosen conditions substantially both a linear and an exponential increase of the synthesized nucleic acid molecules is possible.
  • a Rolling Circle Amplification (RCA), a Linear Rolling Circle Amplification (LRCA) or a Primer Generation Rolling Circle Amplification (PG-RCA) are available.
  • RCA Rolling Circle Amplification
  • LRCA Linear Rolling Circle Amplification
  • PG-RCA Primer Generation Rolling Circle Amplification
  • PCR is a fundamental method for molecular biology that essentially replicates DNA molecules and also allows rapid and sensitive detection of nucleic acids.
  • the Polymerase Chain Reaction (PCR) is based on a recurring cycle of three steps occurring at different temperatures, namely denaturation, hybridization and extension. In the denaturation, the reaction mixture is heated to a temperature greater than 90 ° C, preferably 94 ° C to 95 ° C. As a result, the two complementary strands of a double-stranded DNA separate, the DNA is "melted” or denatured and is present in single strands.
  • the denaturation is a very fast process and is usually completed within seconds.
  • the temperature is lowered to a so-called “annealing temperature”.
  • annealing temperature depends on the length and sequence of the primers and can be determined from these properties specifically for each primer.As a rule, the "annealing temperatures” in a range of 55 ° C to 65 ° C, can but also lower or higher depending on the application.
  • the combination of primer and template DNA is most stable if all the bases in the primer are complementary are and will be destabilized by the presence of a so-called mismatch, which in relation to the "annealing temperature” means that in the case of fully complementary primers it can be chosen to be higher than, for example for primers with a mismatch. By choosing the "annealing temperature” more or less stringent hybridization conditions can also be created.
  • the polymerases begin to grow additional complementary nucleotides and thus to synthesize the opposite strand.
  • the link between primers (or newly synthesized backbone) and template is further enhanced with each nucleotide added.
  • the hybridization takes little time and takes place within seconds.
  • the temperature is further increased, preferably to 70 ° C to 74 ° C, which is the ideal Working temperature for the polymerases used in the rule, which grow additional nucleotides to the resulting DNA strands.
  • 70 ° C to 74 ° C which is the ideal Working temperature for the polymerases used in the rule, which grow additional nucleotides to the resulting DNA strands.
  • the loose connections between primers and those template DNA segments that are not completely complementary also break again.
  • the extension step is the step of the PCR, which usually involves the greatest amount of time.
  • the working or reaction rate of the polymerase is time-limited, that is, the shorter the optimal temperature of about 70 ° C to 74 ° C, the shorter the newly synthesized DNA strands remain.
  • a time interval in the range of minutes (from one to several minutes) for DNA extension is selected.
  • Each repetition of the above three steps doubles the number of copied DNA molecules. After 20 cycles, about one million molecules are formed from a single DNA double strand.
  • a special PCR application the so-called real-time PCR allows the detection and quantification of target nucleic acid molecules in real time, ie during the PCR reaction.
  • Real-time PCR is gaining in popularity in the labs, not least because it's fast and precise at the same time.
  • the determination of the amount of DNA at the end of a PCR can namely for many reasons not directly conclusions about the number of originally present molecules because z. B. at the beginning and at the end of the PCR, the conditions for the polymerases are not necessarily optimal and therefore the amplification does not run smoothly over the entire reaction time. Therefore, the quantification at the end of a PCR can be very inaccurate.
  • the detection limits for specific applications can be further optimized.
  • pre-amplifying the sample nucleic acid by means of PCR for example, the number of targets is increased to such an extent that reliable, reliable and accurate detection is possible, for example with DNA chips.
  • the mixture of signal nucleic acid oligomers, target nucleic acid oligomers and reaction solution in contact with the modified surface must undergo thermocyclization to effect amplification.
  • three different temperatures must be applied consecutively, which allow the three steps of a PCR, namely denaturation, hybridization and extension.
  • the denaturation is usually carried out at a temperature of about 95 ° C
  • the temperature for the hybridization is chosen application-specific, but is usually in a range of about 55 ° C to 65 ° C, while the extension at a temperature of about 72 ° C to 74 ° C is performed.
  • At least the signal nucleic acid oligomers have at their 3 " end a modification which prevents the addition of nucleotides by the nucleic acid polymerase
  • a synthesis starting point for the polymerase which could then extend the signal nucleic acid oligomer using the target nucleic acid oligomer as template, by appropriate modification the 3 " ends of the signal nucleic acid oligomers, or by using one or more dideoxynucleotides as last, terminal nucleotides at the 3 " end, ensures that there is no undesirable extension of the signal nucleic acid oligomers during the step of amplification.
  • the probe nucleic acid oligomers have a modification at their 3 " end which prevents attachment of nucleotides by the nucleic acid polymerase, provided that the probe nucleic acid oligomers are bonded to the surface via their 5 " end the 3 'end free of charge.
  • the signal nucleic acid oligomers have at their 3 " end a modification or dideoxynucleotides as last, terminal nucleotides at the 3 " end in order in each case to prevent attachment of nucleotides by the nucleic acid polymerase.
  • the signal nucleic acid oligomers have at least one "non-matchende” base at the 3 ' end, which also prevents extension of the signal nucleic acid oligomers by the polymerase.
  • the method according to the invention for the detection of nucleic acid oligomer hybridization events can therefore be used in a particularly advantageous manner Combination with a device for performing a PCR can be used.
  • the device for carrying out a PCR in this case comprises at least one sample cell with a cavity for receiving a sample and at least three independently adjustable temperature control units, which define three spatially separate temperature zones.
  • At least one means for carrying out a relative movement between the sample cell and the tempering units is provided, wherein the means for carrying out a relative movement is designed and set up such that the sample can be moved through the three spatially separated temperature zones due to the relative movement between the sample cell and the tempering units ,
  • the sample cell comprises a configured and designed for the detection of nucleic acid oligomer hybridization events sensor which is formed in the space provided for receiving the sample cavity of the sample cell.
  • a sensor designed and designed for surface-sensitive detection of nucleic acid oligomer hybridization events.
  • the sensor consists essentially of a modified surface, wherein the modification consists in the connection of at least one type of probe nucleic acid oligomers.
  • surface refers to any support material which is suitable for binding derivatized or non-derivatized probe nucleic acid oligomers covalently or via other specific interactions, directly or after appropriate chemical modification.
  • the solid support may be made of conductive or non-conductive material. Methods for immobilizing nucleic acid oligomers on a surface are known to those skilled in the art.
  • the sensor present in the sample cell provides the modified surface required for the method according to the invention.
  • the device for carrying out a PCR has a fourth temperature control unit which defines a fourth temperature zone spatially separated from the three temperature zones, very particular advantages result.
  • the fourth temperature control unit of the device it becomes possible to subregions of the sample cell, in particular the area in which the sensor is located in one fourth temperature zone, which differs from the temperatures required for carrying out the PCR and at the same time represents an optimal temperature for the surface-sensitive detection of nucleic acid hybridization events, position.
  • the fourth temperature zone is set to a temperature of about 50 ° C. which is favorable for this type of detection.
  • the detection step preferably takes place directly after the denaturation step of the PCR amplification.
  • the temperature of about 95 ° C. prevailing during denaturing all the bonds or hybridizations of nucleic acid molecules are loosened, i. all nucleic acid oligomers are present as a single strand and signal and target nucleic acid oligomers are free in solution.
  • the probability and therefore the speed of hybridization of signal and target nucleic acid oligomers thereby becomes higher than a hybridization of signal and probe nucleic acid oligomers.
  • the signal intensity of the surface-sensitive detection decreases with each PCR cycle.
  • the reaction solution provided for the amplification of the target nucleic acid oligomers additionally contains at least one type of primer by means of PCR.
  • the primers are preferably chosen so that they are complementary to the target nucleic acid oligomers, but not to the probe and signal nucleic acid oligomers.
  • the step of amplification is carried out at least 5 times, in particular at least 10 times and preferably at least 20 times.
  • the detection of the signal nucleic acid oligomers can take place after any number of amplification cycles.
  • the second detection can be carried out, for example, after two or three or four cycles, the next detection of the signal nucleic acid oligomers after a further, ten further or further 20 cycles, the subsequent detection after four further cycles, eight further cycles or twelve further cycles, etc Any conceivable combination of detection steps and amplification cycles is possible.
  • the concentration of the signal nucleic acid oligomers in the produced mixture between 10 "15 mol / l and 10" 5 mol / l, preferably between 10 "13 mol / l and 10" 7 mol / l and more preferably between 10 " 11 mol / l and 10 "7 mol / l.
  • the choice of the concentration ranges and / or the exact adjustment of the concentration of the signal nucleic acid oligomers is such that a stable and uniform measurement over the entire detection period is possible and depends inter alia on which detection label the signal nucleic acid oligomers used.
  • the optimal concentration ranges may differ for signal nucleic acid oligomers with a redox-active detection label and those with a fluorescent label. Likewise, especially with fluorescence-labeled signal nucleic acid oligomers, the number of fluorophores present can influence the optimal concentration.
  • the preferred concentration of signal nucleic acid oligomers depends on the size of the test sites and on the occupancy density with which the probe nucleic acid oligomers are bound to the chip surface.
  • the concentration of the target nucleic acid oligomers in the produced mixture up to 10 is preferably "9 / mol l, preferably up to 10" 11 mol / l, more preferably up to 10 "13 mol / l.
  • the target nucleic acid oligomers undergo a continuous change in the concentration of the target nucleic acid oligomers, with the number of desired amplification cycles also being different depending on the type of application. It makes sense to adjust the number of cycles and the concentration of the target nucleic acid oligomers to one another. The specified limits ensure reliable measurement throughout the entire process.
  • the preferred concentration of the target nucleic acid oligomers depends on the size of the test sites and the occupancy density with which the probe nucleic acid oligomers are bound to the chip surface.
  • the detection of the signal nucleic acid oligomers is effected by a surface-sensitive detection method, since in this case only the signal nucleic acid oligomers bound to the surface are detected. Spectroscopic, electrochemical and electrochemiluminescent methods are preferred in this context.
  • condition are set or measures taken to at least predominantly dissociation of probe nucleic acid oligomers and signal - Lead nucleic acid oligomers.
  • Such dehybridization of the surface-bound double-stranded hybrids substantially returns the modified surface to its original state.
  • a separate dehybridization step is not necessary since the dehybridization takes place automatically during a PCR cycle.
  • At least predominant dissociation of probe nucleic acid oligomers and signal nucleic acid oligomers is meant in the context of the present invention that at least 50% of the surface bonded double-stranded hybrids dissociate, preferably at least 75%, more preferably at least 90% and most preferably at least 98%.
  • TIRF total internal reflection fluorescence
  • SPR surface plasmon resonance
  • the modification of the provided modified surface is the attachment of several types of probe nucleic acid oligomers.
  • the different types of probe nucleic acid oligomers are bound to the modified surface in spatially substantially separated regions.
  • the modified surface preferably has at least 2 spatially substantially separated regions, more preferably at least 4 and in particular at least 12 such spatially substantially separated regions. Most preferably, the modified surface has at least 32, in particular at least 64, most preferably at least 96 spatially substantially separated areas.
  • the provided modified surface has an area of 1 ⁇ m 2 to 1 mm 2 , preferably an area of 10 ⁇ m 2 to 100 ⁇ m 2 , more preferably an area of approximately 50 ⁇ m 2 .
  • the surface area of the modified surface depends, on the one hand, on the number of different types of probe nucleic acid oligomers bound to the modified surface in spatially substantially separated regions. The more spatially substantially separated areas the modified surface should provide, the larger its area must be selected. On the other hand, however, for example, by altering the coverage with probe nucleic acid oligomers, the area of the modified surface can be adjusted within a reasonable range. As a rule, an occupation density of approximately 6 ⁇ 10 12 probe nucleic acid oligomers per cm 2 surface is used. Deviations from this guideline may make larger or smaller areas useful.
  • the present invention also includes a kit for carrying out the method according to the invention.
  • the kit contains at least one modified surface as specified in the present invention and an effective amount of signal nucleic acid oligomers as defined in the present invention.
  • the term "surface” refers to any support material which is suitable for binding derivatized or non-derivatized probe nucleic acid oligomers covalently or via other specific interactions, directly or after appropriate chemical modification.
  • the solid support may be made of conductive or non-conductive material.
  • conductive surface is understood to mean any support having an electrically conductive surface of any thickness, in particular surfaces of platinum, palladium, gold, cadmium, mercury, nickel, zinc, carbon, silver, copper, iron, lead , Aluminum and manganese.
  • any doped or non-doped semiconductor surfaces of any thickness can be used. All semiconductors can be used as pure substances or as mixtures. As non-limiting examples are carbon, silicon, germanium, cc at this point Tin, Cu (l) - and Ag (l) halides of any crystal structure called.
  • Also suitable are all binary compounds of any composition and any structure of the elements of groups 14 and 16, the elements of groups 13 and 15, and the elements of groups 15 and 16.
  • ternary compounds of any composition and any structure of the elements of Groups 1 1, 13 and 16 or the elements of groups 12, 13 and 16 are used.
  • the names of the groups of the Periodic Table of the Elements refer to the 1985 IUPAC Recommendation.
  • the preferred material is glass, modified glass or silicon.
  • the modification may e.g. by silanization and leads in all cases to functional groups which are suitable in coupling reactions according to functionalized probe
  • Nucleic acid oligomers bind. This modification includes surface buildup structures using polymers such as dextran polymers which allow for variation of layer thickness and surface finish. Further derivatization possibilities for the final binding of the probe nucleic acid oligomers consist, for example, in the application of a thin (about 10-200 nm) metallization layer, in particular a gold metallization layer, which can additionally be coated with (thiol-functionalized) polymers, in particular dextranes.
  • the glass can also be functionalized with biotin after silanization (eg amino-functionalized glass surface after silanization and coupling of the carboxylic acid biotin via a biotin active ester such as biotin-N-succinimidylester) or alternatively coated with immobilized on dextran lysine or dextran biotin.
  • biotin after silanization eg amino-functionalized glass surface after silanization and coupling of the carboxylic acid biotin via a biotin active ester such as biotin-N-succinimidylester
  • biotinylated glass surfaces thus produced are then treated with avidin or streptavidin and can then be used to attach biotinylated probe nucleic acid oligomers. Binding of nucleic acid oligomers to the surface
  • the probe nucleic acid oligomers may be e.g. covalently bound to the surface via hydroxyl, epoxide, amino or carboxy groups of the support material with thiol, hydroxy, amino or carboxyl groups naturally present on the nucleic acid oligomer or attached by derivatization to the probe nucleic acid oligomer.
  • the probe nucleic acid oligomer can be bound directly or via a linker / spacer to the surface atoms or molecules of a surface.
  • the probe nucleic acid oligomer may be anchored by the methods commonly used in immunoassays, such as e.g.
  • probe nucleic acid oligomers for non-covalent immobilization on avidin or streptavidin-modified surfaces.
  • the chemical modification of the probe nucleic acid oligomers with a surface anchor group can already be introduced in the course of the automated solid-phase synthesis or else in separate reaction steps.
  • the nucleic acid oligomer is linked directly or via a linker / spacer with the surface atoms or molecules of a surface of the type described above. This binding can be carried out in various ways known to those skilled in the art. In this context, reference is made to WO 00/42217 A1.
  • the probe nucleic acid oligomers of the present invention consist of nucleotides in a particular nucleotide sequence (sequence) and are immobilized on a surface.
  • Target nucleic acid oligomers are defined as molecules which interact specifically with the probe nucleic acid oligomers or with the signal nucleic acid oligomers to form a double-stranded hybrid.
  • Target nucleic acid oligomers within the meaning of the present invention are therefore nucleic acid oligomers which act as complex binding partners of the complementary probe nucleic acid oligomer or signal nucleic acid oligomer.
  • Nucleic acid oligomers act.
  • the target nucleic acid oligomers whose Presence is to be detected by the present invention have at least one sequence region whose sequence is complementary or at least substantially complementary to a portion of the probe nucleic acid oligomers or the signal nucleic acid oligomers.
  • the target nucleic acid oligomers are present in the sample either as a single strand (ss) or as a double strand (ds).
  • the target nucleic acid oligomers are at least partially present as a single strand. This can e.g. be achieved by ds-target nucleic acid oligomers (thermally or by other measures known in the art) are dehybridized or that care is taken in the preparation of the target nucleic acid oligomers that the target nucleic acid oligomers z.T. exist as single strands. This is achieved for example by asymmetric PCR.
  • a nucleic acid oligomer or ns-oligomer is a compound of at least two covalently linked nucleotides or of at least two covalently linked pyrimidine (eg cytosine, thymine or uracil) or purine bases (eg adenine or guanine), preferably a DNA , RNA or PNA fragment.
  • pyrimidine eg cytosine, thymine or uracil
  • purine bases eg adenine or guanine
  • nucleic acid refers to any "backbone" of the covalently linked pyrimidine or purine bases, such as the sugar-phosphate backbone of the DNA, cDNA or RNA, to a peptide backbone of the PNA, or to analogous backbone structures, such as a thio-phosphate, a dithio-phosphate or a phosphoramide backbone.
  • An essential feature of a nucleic acid according to the present invention is the sequence-specific binding of naturally occurring DNA, or RNA or derived (transcribed or amplified) structures such as cDNA or amplified cDNA or amplified RNA (aRNA). Detection label / marker (marker molecule)
  • the signal nucleic acid oligomers are provided by derivatization with one or more detectable labels.
  • This label allows the detection of the complexing events between the signal nucleic acid oligomer and the surface-bound probe nucleic acid oligomers.
  • the label can directly or as in the case of enzyme-catalyzed reactions indirectly provide a detection signal.
  • Preferred detection labels are fluorophores and redox-active substances.
  • fluorescent dyes such as e.g. Texas red, rhodamine dyes, fluorescein, etc. (see Molecular Probes catalog).
  • redox molecules are used as labels.
  • redox label transition metal complexes in particular those of copper, iron, ruthenium, osmium or titanium with ligands such as pyridine, 4,7-dimethylphenanthroline, 9,10-phenanthrenquinonediimine, porphyrins and substituted porphyrin derivatives can be used.
  • riboflavin of quinones such as pyrroloquinolinoquinone, ubiquinone, anthraquinone, naphthoquinone or menaquinone or derivatives thereof, of metallocenes and metallocene derivatives such as ferrocenes and ferrocene derivatives, cobaltocenes and cobaltocene derivatives, of porphyrins, methylene blue, daunomycin, dopamine derivatives, hydroquinone Derivatives (para- or ortho-dihydroxy-benzene derivatives, para- or ortho-dihydroxy-anthraquinone derivatives, para- or ortho-dihydroxy-naphthoquinone derivatives) and similar compounds possible.
  • quinones such as pyrroloquinolinoquinone, ubiquinone, anthraquinone, naphthoquinone or menaquinone or derivatives thereof
  • Indirect labels can also be used in the processes according to the invention.
  • the term "indirect labels” is understood to mean those in which the actually detectable form of the label is first formed via an enzyme-catalyzed reaction The detectable form of the label can then be detected on the surface Examples of such indirect labels are known to those skilled in the literature
  • alkaline phosphatase (AP) in connection with the substrate p-aminophenyl phosphate is known here as an indirect marker bound to the signal nucleic acid oligomer
  • an electrochemical detection of the signal nucleic acid oligomer can be effected by adding p-aminophenyl phosphate at the time of detection.
  • the electrochemically inactive p-aminophenyl phosphate serves as a substrate of the enzyme AP and is converted into p-aminophenol. After diffusion to a conductive surface, p-aminophenol can now be detected electrochemically, since this form of the substrate (ie after conversion at the AP) is electrochemically active.
  • AP can also be used for chromogenic detection (eg with 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl phosphate in conjunction with nitroblue tetrazolium chloride).
  • Detection methods allow the distinction between marker molecules associated with a surface and those dissolved in the supernatant. Detection methods are electrochemical, spectroscopic and electrochemiluminescent methods. (i) Surface Sensitive Electrochemical Detection
  • the kinetics of the electrochemical processes can in principle be used to distinguish between redox-active detection labels adsorbed on a surface and dissolved in the supernatant.
  • Surface adsorbed detection labels are generally more rapidly electrochemically reacted (e.g., oxidized or reduced) as the redox-active, volume phase detection label since the latter must first diffuse to the (electrode) surface prior to electrochemical conversion.
  • electrochemical surface-sensitive methods include cyclic voltammetry, amperometry and chronocoulometry.
  • the method of chronocoulometry makes it possible to distinguish near-surface redox-active components of (identical) redox-active components in the bulk phase and is, for example, in Steel, AB, Herne, TM and Tarlov MJ: Electrochemical Quantitation of DNA Immobilized on Gold, Analytical Chemistry, 1998, Vol. 70, 4670-4677 and references cited therein.
  • the use of chronocoulometry in a displacement assay for the detection of nucleic acid oligomer hybridization events is described in detail in WO 03/018834 A2, which is hereby incorporated by reference.
  • the optical measurement method used to detect fluorescently labeled signal nucleic acid oligomers is total internal reflection fluorescence (TIRF, see Sutherland and Dahne, 1987, J. Immunol., Meth., 74, 253-265).
  • TIRF total internal reflection fluorescence
  • Fluorescent molecules located near the interface between a solid waveguide medium, typically glass, and a liquid medium or immobilized on the liquid-facing surface of the waveguide medium may be excited by the evanescent field protruding from the waveguide and emit detectable fluorescent light.
  • Repressed or supernatant-dissolved fluorescently labeled complexing agents are not detected by the evanescent field (or only insofar as they are in the range of the penetration depth of the evanescent field) and thus provide (almost) no contribution to the measured signal.
  • the penetration depth of the evanescent field is typically 100 to 200 nm, but can be increased to several 100 nm by a thin metallization layer (about 10 to 200 nm), in particular a gold metallization layer.
  • the layer thickness of the probe-modified carrier surface is adapted to the penetration depth of the evanescent field, for example by correspondingly long probe nucleic acid oligomers, by immobilization of the probe nucleic acid oligomers via a correspondingly long linker between the surface and probe oligonucleotide, by coupling the carboxylic acid biotin (via a biotin active such as biotin-N-succinimidylester) on amino-derivatized surfaces and coupling of avidin or streptavidin to the biotinylated surfaces thus produced with subsequent attachment of biotinylated probe nucleic acid oli
  • 1A a schematic representation of the measuring principle of the detection of 1 B nucleic acid oligomer hybridization events according to the method of the invention
  • 2 shows a schematic representation of a sample cell with integrated sensor
  • FIG. 3 shows a perspective view of a device for carrying out a PCR reaction with simultaneous detection of nucleic acid oligomer hybridization events
  • 5A a plot of the measurement results of the detection of 5B, 5C, nucleic acid oligomer hybridization events at 24 test sites 5D during a PCR (Multiplex Real-Time PCR).
  • FIGS. 1A, 1B schematically show the measuring principle of the detection of nucleic acid oligomer hybridization events during a PCR, namely an electrically detected real-time PCR, wherein in FIG. 1A the state at the beginning or before the start of the PCR and in FIG B is the state of an advanced PCR reaction outlined.
  • signal nucleic acid oligomers 2 with covalently bonded ferrocenes 3 are added to a PCR reaction batch containing target nucleic acid oligomers 1.
  • the signal nucleic acid oligomers 2 are complementary, on the one hand, to the probe nucleic acid oligomers 5 immobilized on a test site 4 of a DNA chip and, on the other hand, to the target nucleic acid oligomers 1.
  • the covalently bonded ferrocenes 3 of the signal nucleic acid oligomers 2 can be used for electrochemical detection of the signal nucleic acid oligomers 2 bound / hybridized to the test sites 4 (electrodes) since ferrocene is reversibly oxidizable and reducible.
  • test sites 4 electrodes
  • ferrocene is reversibly oxidizable and reducible.
  • the free-in-solution signal nucleic acid oligomers 2 are present in a concentration which produces no measurable additional signal at the test site 4 or they can on the basis of their time characteristic - free signal nucleic acid oligomers 2 must first diffuse to the test site 4 and can then be oxidized or - be discriminated by bound at the test site 4, hybridized with probe nucleic acid oligomers signal nucleic acid oligomers. Thermal dehybridization (heating of the DNA chip and the adjacent solution to 95 ° C.) leads to diffusion of all signal nucleic acid oligomers 2 bound to the test site. Test site 4 is restored in its original form with free probe nucleic acid oligomers 5.
  • This condition exists at least for the period in which the temperature after thermal dehybridization is above the melting temperature of the hybrid of probe and signal nucleic acid oligomers 25.
  • a lowering of the temperature at the test site 4 of the DNA chip to or below the melting temperature of the hybrid 25 allows a new measurement.
  • the number of target nucleic acid oligomers 1 increases exponentially.
  • appropriate temperature control melting of the PCR products, lowering the temperature to a range below the melting temperature of a hybrid of signal and target nucleic acid oligomers 12, then optionally further lowering the temperature to a range below the melting temperature of the hybrid Signal and probe nucleic acid oligomers 25
  • the concentration of the free signal nucleic acid oligomers 2 decreases markedly, which leads to a slower hybridization of the signal nucleic acid oligomers 2 at the test site 4 and to a reduced degree of hybridization between probe and signal nucleic acid oligomers 25.
  • a signal nucleic acid oligomer 2 can be destroyed (separation of label and oligosequence), which, in addition to the consumption of free signal nucleic acid oligomers 2 leads to a permanent consumption of the signal nucleic acid oligomers 2 by the (correct) amplification process and thus the signal at the test site 4 of the DNA chip even more strongly influenced by the hybridization to the target nucleic acid oligomers 12.
  • the method according to the invention for detecting nucleic acid oligomer hybridization events can be used in combination with a device 30 for carrying out a PCR.
  • a specific embodiment of the device 30 is shown in FIG.
  • the device 30 for carrying out the PCR comprises a sample cell 10 with a cavity for receiving the sample and three independently adjustable temperature control units, which define three spatially separate temperature zones. For the sake of clarity, only the temperature control units 7a and 7c are shown in FIG.
  • a means R for carrying out a relative movement between the sample cell and the temperature control units is provided, wherein the means R for performing a relative movement is designed and arranged so that the sample due to the relative movement between the sample cell 10 and the Temperature units is moved through the three spatially separated temperature zones.
  • sample cell 10 is a means for performing rotational movements, namely a rotatable axis R.
  • a specific embodiment of the sample cell 10 is shown in FIG.
  • the sample cell 10 has an approximate diameter of 20 mm and a thickness of 1 mm.
  • the existing in the sample cell 10 cavity 8 has a depth of about 0.5 mm and two filling holes 1 1 for charging with the PCR reaction mixture.
  • the sample cell 10 comprises a sensor 20 set up and designed for the detection of nucleic acid oligomer hybridization events, namely a DNA chip which is formed in the cavity 8 of the sample cell 10.
  • the DNA chip 20 present in the sample cell 10 provides the modified surface required for the method according to the invention and has a sensor field 20a which is in contact with the reaction solution via a bridge channel 8.1.
  • the DNA chip 20 has a plated-through hole, so that the electrical contacting of the DNA chip, which is necessary for the measurement value recording, can be accomplished from outside via spring contacts 9 (see FIG. 2) which are formed in the rotatable axis R.
  • the three independent tempering units of the device 30 each have a temperature-controllable block 6 of a good thermal conductivity material, in the specific example of aluminum.
  • a temperature-controllable block 6 of a good thermal conductivity material, in the specific example of aluminum.
  • PID controller platinum resistance for temperature measurement and suitable control electronics (PID controller)
  • the temperature-controllable blocks 6 are brought to the temperature necessary for the PCR reaction.
  • the first temperature control unit 7a defines a first temperature zone of 95.degree. C.
  • the second temperature control unit 7c defines a second temperature zone of 55.degree. C.
  • the third temperature control unit (not shown) defines a third temperature zone of 72.degree.
  • Each temperature-controllable block 6 contains a gap 13 into which the sample cell 10 is introduced.
  • the device 30 has a fourth temperature control unit 7d, which defines a fourth temperature zone spatially separated from the other temperature zones.
  • the rotatable axis R also represents the fourth temperature control unit 7d, wherein two cylindrical, temperature-controllable blocks 6 are arranged above and below the sample cell 10 in the region of the DNA chip.
  • the fourth temperature-regulating unit 7d of the device makes it possible to position partial regions of the sample cell, in particular the region in which the sensor is located, in a fourth temperature zone, which provides an optimum temperature for the surface-sensitive detection of nucleic acid hybridization events.
  • the area in which the sample cell is heated to a certain temperature can be set.
  • a 2: 1: 1 ratio of the 72 ° C range to the 95 ° C and 55 ° C ranges was chosen.
  • CMOS-based DNA chip for electrochemical detection of hybridization between probe and signal nucleic acid oligomers is described, for example, in Augustyniak, M .; Paul, C; Brederlow, R .; Persike, N .; Hartwich, G .; Schmitt-Landsiedel, D .; Thewes, R. (2006), Solid State Circuits, 2006 IEEE International Conference Digest of Technical Papers, 59-68 A 24x16 CMOS-Based Chronoculometric DNA Microarray.
  • PCR polymerase is added and the solution filled into the sample cell 10 as shown in FIG.
  • the reaction mixture present in the sample cell 10 is heated in the device 30, as shown in FIG. 2, to 95 ° C. for 3 minutes, then cooled and a first measurement is carried out on the integrated DNA chip 20.
  • the DNA chip 20 carries at one of the provided test sites probe nucleic acid oligomers which are complementary to the signal nucleic acid oligomers and at another test site probes which are complementary to the control signal nucleic acid oligomers.
  • This first measurement takes place at 62 ° C, about 4 ° C below the melting temperature of the hybrid of probe and signal nucleic acid oligomers under the conditions in the reaction solution and well below the melting temperature of the hybrid of target and signal nucleic acid oligomers (the signal Nucleic acid oligomer has more matching bases to the target nucleic acid oligomer than to the probe nucleic acid oligomer).
  • the melting temperature of the hybrid of control probe nucleic acid oligomer and control signal nucleic acid oligomer under the conditions in U.S. Pat Reaction solution is identical to the melting temperature of the hybrid of probe and signal nucleic acid oligomers.
  • the result of this normalization measurement is shown in FIG. 4A.
  • the measurement at the control test site is marked with K.
  • the curves shown in Figures 4A, 4B, 4C represent the integral oxidation current of the ferrocene labels from the signal nucleic acid oligomers hybridized to the probe nucleic acid oligomers versus time and thus reflect the degree of hybridization or hybridization efficiency, respectively.
  • the hybridization efficiency in turn depends on the concentration of free signal nucleic acid oligomers and thus indirectly on the concentration or the amount of target nucleic acid oligomers.
  • the temperature-controllable blocks of the device 30 are set to 96 ° C (melting), 55 ° C (annealing) and 72 ° C (elongation) and the sample cell 10 is rotated at a speed of 2 Revolutions per minute (ie 2 cycles per minute) in the temperature-controlled blocks.
  • the nearly centrically aligned sensor array 20a of the DNA chip 20 is held at about 50 ° C. via a further temperature-controllable block, in order then to be heated first to 95 ° C. before re-measurement, in order to obtain the signal nucleic acid oligomers which have undergone a previous measurement are hybridized to the probe nucleic acid oligomers, dehybrid ensue of these again.
  • FIGS. 4B and 4C show results of further measurements after 10 or 20 cycles of the PCR. A slight, approximately 20% decrease in the efficiency of hybridization (of the maximum signal of the electrochemical measurement) is observed at the control test site (indicated by K in the graphs), whereas the hybridization efficiency at the actual detection site increases with increasing efficiency As expected, the amplification rate of the target nucleic acid oligomers decreases (approximately by a factor of 6).
  • FIG. 5 shows the result of such a closed tube multiplex real-time PCR with electrical detection at 24 test points of a DNA chip.
  • FIG. 5 shows two measurement curves for each test site, namely those of the first measurement before the start of the PCR (5.1) and that of the measurement after 25 cycles of the PCR (5.2). The curves represent the current flow (indicated in nA) at the respective test site.
  • the two measurements are essentially identical for almost all test sites, ie the corresponding subtypes (indicated in the respective graphs with the addition “low” or “high”) were not present.
  • the subtypes HPV_6low (see FIG. 5C), HPV_16high and HPV_18high (see FIG. 5D) could be detected; at the test site for HPV_1 1 low (see FIG. 5C) the slight decrease after 25 cycles to a suboptimal test site is per se low signal strength attributed.

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Detektion von Nukleinsäureoligomer-Hybridisierungsereignissen umfassend die Schritte Bereitstellen einer modifizierten Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung wenigstens einer Art von Sonden-Nukleinsäureoligomeren besteht, Bereitstellen einer Probe mit Target-Nukleinsäureoligomeren, Bereitstellen einer Lösung mit wenigstens einer Art von Signal-Nukleinsäureoligomeren, wobei die Signal-Nukleinsäureoligomere mit zumindest einem Detektionslabel modifiziert sind, die Signal-Nukleinsäureoligomere einen zu den Sonden-Nukleinsäureoligomeren komplementären oder weitgehend komplementären Abschnitt besitzen und die Signal-Nukleinsäureoligomere einen zu den Target-Nukleinsäureoligomeren komplementären oder weitgehend komplementären Abschnitt besitzen, Bereitstellen einer Reaktionslösung zur Durchführung einer Nukleinsäureamplifikation, wobei die Reaktionslösung zumindest Nukleotide und wenigstens eine Art von Nukleinsäure-Polymerase enthält, Vermischen und Inkontaktbringen mit der modifizierten Oberfläche von der Lösung mit Signal-Nukleinsäureoligomeren, der Probe mit Target-Nukleinsäureoligomeren und der Reaktionslösung zur Durchführung einer Nukleinsäureamplifikation, wobei die Signal-Nukleinsäureoligomere in dem hergestellten Gemisch in einer Konzentration von 10-17 mol/l bis 10-3 mol/l vorliegen und die Target-Nukleinsäureoligomere in dem hergestellten Gemisch in einer Konzentration von bis zu 10-7 mol/l vorliegen, erste Detektion der Signal-Nukleinsäureoligomere durch eine oberflächensensitive Methode, Amplifizierung der Target-Nukleinsäureoligomere mittels Nukleinsäureamplifikation, zweite Detektion der Signal-Nukleinsäureoligomere durch eine oberflächensensitive Methode und Vergleich der bei der ersten Detektion der Signal-Nukleinsäureoligomere erhaltenen Werte mit den bei der zweiten Detektion der Signal-Nukleinsäureoligomere erhaltenen Werte.

Description

Kompetitionsassay zur Detektion von Nukleinsäureoligomer- Hybridisierungsereignissen
Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion von Nukleinsäureoligomer-Hybridisierungsereignissen.
Stand der Technik
In der Krankheitsdiagnose, der mikrobiologischen Diagnostik, bei toxikologischen Testverfahren, in der genetischen Forschung und Entwicklung, sowie auf dem Agrar- und pharmazeutischen Sektor ist ein Direktnachweis kleinster Mengen von Nukleinsäuren mittlerweile unumgänglich. Zunehmend finden Detektionsverfahren mittels Array-Technologie unter Verwendung sogenannter DNA-Chips Anwendung, die eine oberflächensensitive Detektion von Nukleinsäureoligomer- Hybridisierungsereignissen ermöglichen. Mit Hilfe dieser empfindlichen Methode können Nukleinsäuren mit einer sehr geringen Nachweisgrenze detektiert werden. Zur Genanalyse auf einem Chip wird beispielsweise auf einer Oberfläche eine Bibliothek bekannter DNA-Sequenzen ("Sonden-Oligonukleotide") in einem geordneten Raster fixiert, so dass die Position jeder individuellen DNA-Sequenz bekannt ist. Existieren in der Untersuchungslösung Fragmente aktiver Gene ("Target-Oligonukleotide"), deren Sequenzen zu bestimmten Sonden- Oligonukleotiden auf dem Chip komplementär sind, so können die Target- Oligonukleotide durch Nachweis der entsprechenden Hybridisierungsereignisse auf dem Chip identifiziert werden.
Verfahren zur oberflächensensitiven Detektion von Nukleinsäureoligomer- Hybridisierungsereignissen sind hinreichend bekannt. So beschreibt beispielsweise die WO 99/51778 A1 ein elektrochemisches Verfahren zur Detektion von Nukleinsäureoligomer-Hybridisierungsereignissen. Bei einem solchen elektrochemischen Verfahren werden die Assoziationsereignisse anhand der mit der Assoziation einhergehenden Änderung der elektrochemischen Eigenschaften der Sonden-Moleküle nachgewiesen.
Die WO 2007/143669 A2 offenbart ein Verfahren zum elektrochemischen Nachweis von Nukleinsäuren mittels Sonden, die an eine Mikroarray-Oberfläche gebunden sind. In dem Echzeit-Verfahren der WO 2007/143669 A2 können Kompetitor-Moleküle anwesend sein, die mit den Target-Nukleinsäuren um Bindungsstellen an den immobilisierten Sonden konkurrieren.
Bekannt ist außerdem der Nachweis von Target-Nukleinsäuren mit hybridisierenden Ferrocen-Signal-Molekülen, wobei die immobilisierten Fänger- Sonden an einen anderen Bereich der Target-Nukleinsäure binden (Lucarelli, F. et al., Anal. Chim. Acta, 2008, 609 (2), 139-159). Daneben werden kompetitive Hybridisierungsassays beschrieben, wobei Fänger-Sonden auf Goldoberflächen und Target-Nukleinsäuren um Nanopartikel-gebundene Signal-Oligonukleotide konkurrieren.
Daneben sind aus dem Stand der Technik verschiedene Ansätze zur elektrochemischen Detektion einer Echtzeit-PCR bekannt (Yeung, S. W. et al. in Anal. Chem. 2008, 80, 363 - 368; Defever, T. et al. in J. Am. Chem. Soc. 2009, 131 (32), 1 1433-1 1441 ; Henry, O. Y. et al. in Biosens Bioelectron. 2009, 24(7), 2064-2070; Fang, T. H. Defever, T. et al. in Biosens Bioelectron. 2009, 24(7), 2131 - 2136).
Eine Verbesserung der Detektionsgrenze solcher Nachweisverfahren stellt für alle denkbaren Einsatzgebiete einen Fortschritt in der Anwendbarkeit dar. Darstellung der Erfindung
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Detektion von Nukleinsäureoligomer-Hybridisierungsereignissen zu schaffen, welches eine hohe Detektionssensitivität mit einer einfachen Probenhandhabung kombiniert.
Diese Aufgabe wird durch das Verfahren gemäß unabhängigem Patentanspruch 1 gelöst. Weitere vorteilhafte Details, Aspekte und Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen, der Beschreibung, den Figuren und den Beispielen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Abkürzungen und Begriffe benutzt:
PCR Polymerase-Kettenreaktion
A Adenin
G Guanin
C Cytosin
T Thymin
u Uracil
Base A, G, T, C oder U
bp Basenpaar
dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat; eine Mischung aus dATP
(Desoxyadenosintriphosphat), dCTP (Desoxycytidin- triphosphat), dGTP (Desoxyguanosintriphosphat) und dTTP (Desoxythymidintriphosphat) als Bausteine für die DNA- Synthese; äquivalent zu Nukleotide.
Nukleinsäure- Nukleinsäure nicht näher spezifizierter Basenlänge (z.B.
Oligomer Nukleinsäure-Oktamer: Eine Nukleinsäure mit beliebigem
Rückgrat, bei der 8 Pyrimidin- oder Purin-Basen kovalent aneinander gebunden sind).
ns-Oligomer Nukleinsäure-Oligomer
Oligomer Äquivalent zu Nukleinsäure-Oligomer.
Oligonukleotid Äquivalent zu Oligomer oder Nukleinsäure-Oligomer, also z.B. ein DNA-, PNA- oder RNA-Fragment nicht näher spezifizierter Basenlänge.
Oligo Abkürzung für Oligonukleotid.
Basenabfolge Äquivalent zu Sequenz.
Nukleotide Äquivalent zu dNTP und äquivalent zu Base.
Sequenz Genaue Abfolge der einzelnen Basen A, C, G, T (oder U) innerhalb eines Nukleinsäuremoleküls.
Nukleinsäure Wenigstens zwei kovalent verbundene Nukleotide oder wenigstens zwei kovalent verbundene Pyrimidin- (z.B. Cytosin, Thymin oder Uracil) oder Purin-Basen (z.B. Adenin oder Guanin). Der Begriff Nukleinsäure bezieht sich auf ein beliebiges "Rückgrat" der kovalent verbundenen Pyrimidin- oder Purin-Basen, wie z.B. auf das Zucker-Phosphat Rückgrat der DNA, cDNA oder RNA, auf ein Peptid- Rückgrat der PNA oder auf analoge Strukturen (z.B. Phosphoramid-, Thio-Phosphat- oder Dithio-Phosphat- Rückgrat). Wesentliches Merkmal einer Nukleinsäure im Sinne der vorliegenden Erfindung ist es, dass sie natürlich vorkommende cDNA oder RNA sequenzspezifisch binden kann.
Matrize Als„Vorlage" dienendes Nukleinsäuremolekül; äquivalent zu
Probe, Proben-Nukleinsäure, Proben-DNA oder Template.
DNA Desoxyribonukleinsäure
RNA Ribonukleinsäure
Template Proben-Nukleinsäure, die mittels der PCR amplifiziert wird; äquivalent zu Matrize
Kurzes, einzelsträngiges Oligonukleotid mit einer Basenabfolge komplementär zu einem Abschnitt der Proben-Nukleinsäure, das der Polymerase als Startpunkt für die Synthese dient; der Primer lagert sich in einem sog. Hybridisierungsschritt (auch: Annealing) an komplementäre Abschnitte der in Einzelsträngen vorliegenden Proben- Nukleinsäure an, wodurch ein kurzer, doppelsträngiger DNA-Abschnitt zur Verfügung steht, an dem die Polymerase ansetzt und durch Anfügen weiterer komplementärer Nukleotide den zweiten DNA-Strang synthetisiert.
Enzym, das doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle synthetisiert, indem es einen vorliegenden Einzelstrang als Matrize nutzt und nach dessen Sequenz die Nukleotide für den komplementären Strang aneinanderfügt. In der PCR Methode wird eine thermostabile Polymerase, z.B. Taq- Polymerase (die ursprünglich aus einem thermophilen Organismus Thermus aquaticus isoliert wurde) eingesetzt, deren optimale Arbeitstemperatur in einem Bereich von 70°C bis 74°C liegt und die auch gegenüber Temperaturen von bis zu 100°C und mehr tolerant ist.
Zur Ausbildung der Watson Crick Struktur doppelsträngiger Oligonukleotide hybridisieren die beiden Einzelstränge derart, dass die Base A (bzw. C) des einen Strangs mit der Base T (bzw. G) des anderen Strangs Wasserstoffbrücken ausbildet (bei RNA ist T durch Uracil ersetzt). Jede andere Basenpaarung bildet keine Wasserstoffbrücken aus, verzerrt die Struktur und wird als "Mismatch" bezeichnet.
Single Strand (Einzelstrang)
double Strand (Doppelstrang)
Aufeinanderfolge von Denaturierung, Hybridisierung (auch Annealing) und Verlängerung
komplementär Zur Ausbildung der Watson-Crick Struktur doppelsträngiger
Nukleinsäureoligomere hybridisieren die beiden Einzelstränge, wobei die Nukleotidabfolge des einen Strangs komplementär zur Nukleotidabfolge des anderen Strangs ist, so dass die Base A (bzw. C) des einen Strangs mit der Base T (bzw. G) des anderen Strangs Wasserstoffbrücken ausbildet (bei RNA ist T durch Uracil ersetzt).
Perfekter Match Hybrid aus zwei komplementären Nukleinsäure-Oligomeren, bei dem kein Mismatch auftritt.
redoxaktiv Bezeichnet die Eigenschaft einer Einheit unter bestimmten äußeren Umständen an ein geeignetes Oxidationsmittel Elektronen abzugeben oder von einem geeigneten Reduktionsmittel Elektronen aufzunehmen.
Linker, Spacer Molekulare Verbindung zwischen zwei Molekülen bzw.
zwischen einem Oberflächenatom, Oberflächenmolekül oder einer Oberflächenmolekülgruppe und einem anderen Molekül. In der Regel sind Linker als Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Hetero-Alkyl-, Hetero-Alkenyl- oder Hetero-Alkinyl kette käuflich zu erwerben, wobei die Kette an zwei Stellen mit (gleichen oder verschiedenen) reaktiven Gruppen derivatisiert ist. Diese Gruppen bilden in einfachen/bekannten chemischen Reaktionen mit dem entsprechenden Reaktionspartner eine kovalente chemische Bindung aus. Die reaktiven Gruppen können auch photoaktivierbar sein, d.h. die reaktiven Gruppen werden erst durch Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge aktiviert. Auch unspezifische nt, i.e. nicht zu anderen Basen komplementäre nt, können als Linker/Spacer verwendet werden, insbesondere bei der Anbindung von Sonden-Oligos an eine Oberfläche. Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion von Nukleinsäureoligomer-Hybridisierungsereignissen, das die Schritte Bereitstellen einer modifizierten Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung wenigstens einer Art von Sonden-Nukleinsäureoligomeren besteht, Bereitstellen einer Probe mit Target-Nukleinsäureoligomeren, Bereitstellen einer Lösung mit wenigstens einer Art von Signal-Nukleinsäureoligomeren, wobei die Signal- Nukleinsäureoligomere mit zumindest einem Detektionslabel modifiziert sind, die Signal-Nukleinsäureoligomere einen zu den Sonden-Nukleinsäureoligomeren komplementären oder weitgehend komplementären Abschnitt besitzen und die Signal-Nukleinsäureoligomere einen zu den Target-Nukleinsäureoligomeren komplementären oder weitgehend komplementären Abschnitt besitzen, Bereitstellen einer Reaktionslösung zur Durchführung einer Nukleinsäureamplifikation, wobei die Reaktionslösung zumindest Nukleotide und wenigstens eine Art von Nukleinsäure-Polymerase enthält, Vermischen und Inkontaktbringen mit der modifizierten Oberfläche von der Lösung mit Signal- Nukleinsäureoligomeren, der Probe mit Target-Nukleinsäureoligomeren und der Reaktionslösung zur Durchführung einer Nukleinsäureamplifikation, wobei die Signal-Nukleinsäureoligomere in dem hergestellten Gemisch in einer Konzentration von 10"17 mol/l bis 10"3 mol/l vorliegen und die Target-Nukleinsäureoligomere in dem hergestellten Gemisch in einer Konzentration von bis zu 10"7mol/l vorliegen, erste Detektion der Signal-Nukleinsäureoligomere durch eine oberflächensensitive Methode, Amplifizierung der Target-Nukleinsäureoligomere mittels Nukleinsäureamplifikation, zweite Detektion der Signal-Nukleinsäureoligomere durch eine oberflächensensitive Methode und Vergleich der bei der ersten Detektion der Signal-Nukleinsäureoligomere erhaltenen Werte mit den bei der zweiten Detektion der Signal-Nukleinsäureoligomere erhaltenen Werte umfasst.
Dem erfindungsgemäßen Verfahren liegt die Idee zu Grunde, die hohe Empfindlichkeit einer oberflächensensitiven Detektionsmethode mit einer vorangegangenen Amplifizierung der Target-Oligonukleotide zu kombinieren. Dadurch kann die Grenze für den Nachweis der ursprünglich in der Probe vorhandenen Target-Nukleinsäureoligomeren zu extrem kleinen Konzentrationen verschoben werden. Im Idealfall ist der Nachweis eines einzigen Target- Nukleinsäureoligomers möglich. Unter einer „weitgehend komplementären Struktur" werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Sequenzabschnitte verstanden, bei denen maximal 20% der Basenpaare Mismatches ausbilden. Bevorzugt handelt es sich bei einer „weitgehend komplementären Struktur" im Rahmen der vorliegenden Erfindung um Sequenzabschnitte, bei denen maximal 15% der Basenpaare Mismatches ausbilden. Besonders bevorzugt handelt es sich bei einer „weitgehend komplementären Struktur" um Sequenzabschnitte, bei denen maximal 10% der Basenpaare Mismatches ausbilden und ganz besonders bevorzugt um Sequenzabschnitte, bei denen maximal 5% der Basenpaare Mismatches ausbilden. Idealerweise liegen überhaupt keine Mismatches vor, wobei es sich dann um eine komplementäre Struktur handelt.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Detektion von Nukleinsäureoligomer-Hybridisierungsereignissen bei gleichzeitig ablaufender Amplifikation der Target-Nukleinsäureoligomere, wobei Sonden- und Signal- Nukleinsäureoligomere weitgehend komplementäre Abschnitte aufweisen und zugleich die Signal-Nukleinsäureoligomere einen zu den Target- Nukleinsäureoligomeren komplementären Abschnitt aufweisen. Das gesamte Verfahren wird dabei in einem einzigen Reaktionsgefäß durchgeführt und stellt somit eine„closed tube" Anwendung dar.
Durch die Amplifizierung der Target-Nukleinsäureoligomere erhöht sich deren Menge und damit ihre im Reaktionsansatz vorhandene Konzentration im Verlauf der Durchführung des Verfahrens. Für eine genaue und zuverlässige Detektion von Nukleinsäurehybridisierungsereignissen sind die Konzentrationsverhältnisse von Signal-Nukleinsäureoligomeren zu Target-Nukleinsäureoligomeren entscheidend. Ein Verfahren, bei dem eine oberflächensensitive Detektion und gleichzeitig eine Amplifizierung vorgenommen werden, muss daher bestimmte Rahmenbedingungen erfüllen, die eine genaue und fehlerfreie Detektion von Nukleinsäureoligomer-Hybridisierungsereignissen ermöglichen.
Überraschenderweise lassen sich hervorragende Ergebnisse erzielen, wenn die Signal-Nukleinsäureoligomere in einem Konzentrationsbereich von 10"17 mol/l bis 10"3 mol/l vorliegen und gleichzeitig die Target-Nukleinsäureoligomere eine Konzentration von 10"7 mol/l nicht überschreiten. Durch die Kombination dieser Bedingungen können während des gesamten Verfahrens korrekte, reproduzierbare Meßergebnisse erzielt werden. Die Änderung der Konzentration der Target- Nukleinsäureoligomere durch deren Amplifizierung bleibt dabei für mindestens 30 Amplifizierungszyklen in einem Rahmen, der eine sichere Detektion erlaubt.
Wie bereits erwähnt, kann durch das erfindungsgemäße Verfahren in einem geschlossenen System eine oberflächensensitive Detektion von Nukleinsäurehybridisierungsereignissen bei einer simultan ablaufenden Nukleinsäureamplifikation durchgeführt werden. Dadurch werden mit der vorliegenden Erfindung unnötige Pipettierschritte, Flüssigkeitstransfers und/oder mehrfaches Öffnen und Schließen von Reaktionsgefäßen obsolet, wodurch vor allem Kontaminationsgefahren aber auch Verwechslungsgefahren der Proben bzw. Reaktionsansätze durch die ausführende Person ausgeschlossen sind. Nicht zuletzt sinkt die Arbeitsintensität oder die "hands-on-time" bei der Durchführung von Tests, was vor allem in Labors mit hohem Probendurchsatz von besonderer Wichtigkeit ist.
Da in den erfindungsgemäßen Verfahren Signal-Nukleinsäureoligomere verwendet werden, die einen zu den Target-Nukleinsäureoligomeren komplementären oder weitgehend komplementären Abschnitt und gleichzeitig einen zu den Sonden- Nukleinsäureoligomeren komplementären oder weitgehend komplementären Abschnitt besitzen, können die Signal-Nukleinsäureoligomere sowohl mit den Target-Nukleinsäureoligomeren als auch mit den Sonden-Nukleinsäureoligomeren hybridisieren. Es handelt sich um ein Kompetitionsassay, bei dem Target- Nukleinsäureoligomere und Sonden-Nukleinsäureoligomere um die Signal- Nukleinsäureoligomere konkurrieren.
Hybridisierungsereignisse sind wahrscheinlicher und erfolgen mit höherer Geschwindigkeit, wenn sich alle Bindungspartner frei in Lösung befinden. Reaktionen an Grenzflächen, nämlich Bindungsereignisse zwischen einem frei in Lösung vorliegenden Bindungspartner und einem zweiten, an einer Oberfläche immobilisierten Bindungspartner, laufen meist langsamer und mit geringerer Wahrscheinlichkeit ab. Daher ist eine Hybridisierung der frei in Lösung vorliegenden Target- und Signal- Nukleinsäureoligomere sehr viel wahrscheinlicher und erfolgt schneller als eine Hybridisierung der Signal-Nukleinsäureoligomere mit den an der Oberfläche gebundenen Sonden-Nukleinsäureoligomeren. Durch den Konzentrationsanstieg der Target-Nukleinsäureoligomere aufgrund ihrer Amplifizierung wird dieser Effekt verstärkt, sodass mit jeder Steigerung der Menge an Target- Nukleinsäureoligomeren ein "Abfangen" der Signal- Nukleinsäureoligomere wahrscheinlicher wird. Hybridisierungsereignisse von Signal- Nukleinsäureoligomeren mit den an der Oberfläche immobilisierten Sonden- Nukleinsäureoligomeren werden dadurch mit zunehmender Target- Nukleinsäureoligomer-Konzentration immer weniger, wodurch das Meßsignal der oberflächensensitiven Detektion abnimmt.
Die Sonden-Nukleinsäureoligomere können eine größere Anzahl an Basen als die Signal-Nukleinsäureoligomere aufweisen und einen Sequenzabschnitt umfassen, der eine zu den Target-Nukleinsäureoligomeren komplementäre oder weitgehend komplementäre Struktur besitzt. Dieser Abschnitt, der keine zu einem Abschnitt der Signal-Nukleinsäureoligomere komplementäre oder weitgehend komplementäre Struktur besitzt, wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Target- Andockabschnitt bezeichnet. Bei Anwesenheit eines Target-Andockabschnittes hybridisieren die Target-Nukleinsäureoligomere zunächst mit dem Target- Andockabschnitt an die Sonden-Nukleinsäureoligomere und verdrängen auf diese Weise besonders schnell und effizient vorher gebundene Signal- Nukleinsäureoligomere. Bei der Detektion der Signal-Nukleinsäureoligomere stellt man bei Anwesenheit des gesuchten Targets und vor allem bei Konzentrationsanstieg durch Amplifizierung wiederum eine Abnahme der Signalintensität mit der Zeit fest.
Auch die Signal-Nukleinsäureoligomere können eine größere Anzahl an Basen als die Sonden-Nukleinsäureoligomere aufweisen und zumindest einen Target- Andockabschnitt umfassen, wobei der Target-Andockabschnitt keine zu einem Abschnitt der Sonden-Nukleinsäureoligomere komplementäre oder weitgehend komplementäre Struktur aufweist und wobei die Target-Nukleinsäureoligomere zusätzlich zu ihrem zu den Signal-Nukleinsäureoligomeren komplementären Abschnitt einen weiteren zu dem Target-Andockabschnitt komplementären oder weitgehend komplementären Abschnitt besitzen. Die Target- Nukleinsäureoligomere hybridisieren zunächst mit dem Target-Andockabschnitt an die Signal-Nukleinsäureoligomere und verdrängen auf diese Weise besonders schnell und effizient vorher gebundene Sonden-Nukleinsäureoligomere. Bei der Detektion der Signal-Nukleinsäureoligomere stellt man bei Anwesenheit des gesuchten Targets und vor allem bei Konzentrationsanstieg durch Amplifizierung wiederum eine Abnahme der Signalintensität mit der Zeit fest. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Amplifizierung der Target-Nukleinsäureoligomere durch eine PCR oder durch eine isothermale Amplifikation. Sofern die Amplifizierung über eine PCR erfolgt, enthält die bereitgestellte Reaktionslösung zusätzlich zumindest eine Art von Primer. Eine isothermale Amplifikation erfolgt bei konstanter Temperatur, beispielsweise bei 60°C, wobei in Abhängigkeit der gewählten Bedingungen im wesentlichen sowohl eine lineare als auch eine exponentielle Zunahme der synthetisierten Nukleinsäuremoleküle möglich ist. So stehen beispielsweise eine Rolling Circle Amplification (RCA), eine Linear Rolling Circle Amplification (LRCA) oder eine Primer Generation Rolling Circle Amplification (PG-RCA) zur Verfügung. Vor allem in der zuletzt genannten Methode ist die Zugabe externer Primer nicht notwendig, da die Primer hierbei von selbst sukzessive während der Reaktion generiert werden. Die entsprechenden notwendigen Enzyme und Substanzen und die genauen Reaktionsbedingungen für eine isothermale Amplifizierung sind dem Fachmann bekannt und werden hier nicht näher erläutert.
Alternativ zu der isothermalen Amplifikation kann eine Amplifikation der Nukleinsäureoligomere durch eine PCR erfolgen. Bei der PCR handelt es sich um eine für die Molekularbiologie grundlegende Methode, die im wesentlichen der Vervielfältigung von DNA-Molekülen dient und ebenfalls einen schnellen und empfindlichen Nachweis von Nukleinsäuren erlaubt. Die Polymerase- Kettenreaktion (PCR) beruht auf einem immer wiederkehrenden Zyklus aus drei, bei unterschiedlichen Temperaturen ablaufenden Schritten, nämlich Denaturierung, Hybridisierung und Verlängerung. Bei der Denaturierung wird das Reaktionsgemisch auf eine Temperatur größer 90°C, vorzugsweise 94°C bis 95°C erhitzt. Dadurch trennen sich die beiden komplementären Stränge einer doppelsträngigen DNA, die DNA wird „aufgeschmolzen" bzw. denaturiert und liegt in Einzelsträngen vor. Die Denaturierung ist ein sehr schneller Prozess und ist in der Regel innerhalb von Sekunden abgeschlossen.
Bei der Hybridisierung (auch„Annealing") wird die Temperatur auf eine sogenannte „Annealing-Temperatur" herabgesetzt. Bei dieser Temperatur verbinden sich die Primer mit der DNA, sie hybridisieren. Die „Annealing-Temperatur" richtet sich dabei nach Länge und Sequenz der Primer und kann aus diesen Eigenschaften spezifisch für jeden Primer bestimmt werden. In der Regel liegen die„Annealing- Temperaturen" in einem Bereich von 55°C bis 65°C, können anwendungsspezifisch jedoch auch niedriger oder höher eingestellt werden.
Ebenfalls Einfluss auf die „Annealing-Temperatur" hat der Anteil der Basen im Primer, die in der vorliegenden Basenabfolge tatsächlich komplementär zum Template-DNA-Abschnitt sind. Die Verbindung von Primer und Template-DNA ist am stabilsten, wenn alle Basen im Primer komplementär sind und wird durch Vorhandensein eines sogenannten Mismatch destabilisiert. Im Bezug auf die „Annealing-Temperatur" bedeutet dies, dass sie im Falle vollständig komplementärer Primer höher gewählt werden kann als z.B. bei Primern mit einem Mismatch. Durch die Wahl der„Annealing-Temperatur" können außerdem mehr oder weniger stringente Bedingungen für die Hybridisierung geschaffen werden.
An den Stellen, an denen der Primer gebunden ist, beginnen die Polymerasen weitere komplementäre Nukleotide anzubauen und damit den Gegenstrang zu synthetisieren. Die Verbindung zwischen Primern (bzw. neu synthetisiertem Gegenstrang) und Template wird mit jedem angefügten Nukleotid weiter gestärkt. Die Hybridisierung hat einen geringen Zeitbedarf und erfolgt innerhalb von Sekunden.
Für die Verlängerung, dem an das „Annealing" anschließenden Schritt, wird die Temperatur weiter erhöht, vorzugsweise auf 70°C bis 74°C. Das ist die ideale Arbeitstemperatur für die in der Regel verwendeten Polymerasen, welche weitere Nukleotide an die entstehenden DNA-Stränge anbauen. Im angegebenen Temperaturbereich brechen zudem die losen Verbindungen zwischen Primern und solchen Template-DNA-Abschnitten wieder auf, die nicht vollständig komplementär sind.
Der Verlängerungsschritt ist derjenige Schritt der PCR, der in der Regel den größten Zeitbedarf mit sich bringt. So ist beispielsweise die Arbeits- bzw. Reaktionsgeschwindigkeit der Polymerase zeitlimitierend, das heißt je kürzer die optimale Temperatur von etwa 70°C bis 74°C herrscht, desto kürzer bleiben auch die neu synthetisierten DNA-Stränge. In der Regel reichen auch im Verlängerungsschritt mehrere Sekunden aus, jedoch wird in Standard-PCR- Verfahren bei sehr langen zu synthetisierenden DNA-Molekülen eine Zeitspanne im Minutenbereich (von einer bis zu mehreren Minuten) zur DNA-Verlängerung gewählt.
Bei jeder Wiederholung obiger drei Schritte verdoppelt sich die Anzahl an kopierten DNA-Molekülen. Nach 20 Zyklen entstehen auf diese Weise aus einem einzigen DNA-Doppelstrang etwa eine Million Moleküle.
Eine besondere PCR-Anwendung, die sogenannte Real-Time-PCR erlaubt die Detektion und Quantifizierung von Target-Nukleinsäuremolekülen in Echtzeit, also während der PCR-Reaktion. Die Real-Time-PCR erfreut sich in den Labors zunehmender Beliebtheit, nicht zuletzt deshalb, weil sie schnell und dabei gleichzeitig präzise ist. Die Bestimmung der DNA-Menge am Ende einer PCR lässt nämlich aus vielerlei Gründen nicht direkt Rückschlüsse auf die Zahl der ursprünglich vorliegenden Moleküle zu, da z. B. am Anfang als auch am Ende der PCR die Bedingungen für die Polymerasen nicht unbedingt optimal sind und daher die Amplifikation nicht über die ganze Reaktionszeit gleichmäßig läuft. Daher kann die Quantifizierung am Ende einer PCR sehr ungenau sein.
Wesentlich genauere Quantifizierungen sind möglich, wenn die Anzahl gebildeter DNA-Moleküle schon während der Reaktion, also beispielsweise nach jedem einzelnen Zyklus erfasst wird. Diese Quantifizierung geschieht in der Regel über eine Fluoreszenzmarkierung der neu synthetisierten DNA-Moleküle. Insbesondere in der medizinischen Diagnostik aber auch in der Targetsuche und in der Grundlagenforschung ist eine Mengenbestimmung der Proben-DNA unumgänglich, weshalb in diesen Fällen ein besonders ausgeprägter Bedarf an Quantifizierungsmöglichkeiten in Echtzeit besteht.
Durch ein Zusammenwirken der beiden oben beschriebenen Methoden, nämlich der oberflächensensitiven Detektion und der PCR, können die Nachweisgrenzen für spezielle Anwendungen weiter optimiert werden. Durch eine Voramplifikation der Probennukleinsäure mittels PCR wird beispielsweise die Zahl der Targets in einem Maße erhöht, dass eine sichere, zuverlässige und genaue Detektion beispielsweise mit DNA-Chips möglich wird. Alternativ kann mit Hilfe von oberflächensensitiven Detektionsmethoden der Verlauf einer PCR in Echtzeit analysiert und die Menge an Targetnukleinsäuremolekülen quantifiziert werden.
Im Falle einer Amplifizierung mittels PCR muss das mit der modifizierten Oberfläche in Kontakt stehende Gemisch aus Signal-Nukleinsäureoligomeren, Target-Nukleinsäureoligomeren und Reaktionslösung zur Durchführung einer Amplifikation einer Thermozyklisierung unterzogen werden. Dazu müssen in immer wiederkehrenden Zyklen drei verschiedenen Temperaturen aufeinanderfolgend angelegt werden, die die drei Schritte einer PCR, nämlich Denaturierung, Hybridisierung und Verlängerung erlauben. Die Denaturierung erfolgt in der Regel bei einer Temperatur von rund 95°C, die Temperatur für die Hybridisierung wird anwendungsspezifisch gewählt, liegt in der Regel jedoch in einem Bereich von etwa 55°C bis 65°C, während die Verlängerung bei einer Temperatur von rund 72°C bis 74°C durchgeführt wird.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform weisen wenigstens die Signal-Nukleinsäureoligomere an ihrem 3"-Ende eine Modifikation auf, die ein Anfügen von Nukleotiden durch die Nukleinsäure-Polymerase verhindern. Durch Hybridisierung der Signal-Nukleinsäureoligomere mit den Target- Nukleinsäureoligomeren liegt ein Synthese-Startpunkt für die Polymerase vor, die dann unter Verwendung des Target-Nukleinsäureoligomers als Matrize das Signal- Nukleinsäureoligomer verlängern könnte. Durch eine entsprechende Modifikation der 3"-Enden der Signal-Nukleinsäureoligomere oder durch Einsatz eines oder mehrerer Didesoxynukleotide als letzte, abschließende Nukleotide am 3"-Ende wird sichergestellt, dass keine unerwünschte Verlängerung der Signal- Nukleinsäureoligomere während des Schrittes der Amplifizierung stattfindet.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weisen die Sonden- Nukleinsäureoligomere an ihrem 3"-Ende eine Modifikation auf, die ein Anfügen von Nukleotiden durch die Nukleinsäure-Polymerase verhindern. Sofern die Sonden-Nukleinsäureoligomere über ihr 5"-Ende an die Oberfläche gebunden sind, steht das 3"-Ende frei zur Verfügung. Durch Hybridisierung der Signal- Nukleinsäureoligomere mit den Sonden-Nukleinsäureoligomeren liegt ein Synthese-Startpunkt für die Polymerase vor, die dann unter Verwendung des Signal-Nukleinsäureoligomers als Matrize das Sonden-Nukleinsäureoligomer verlängern könnte. Durch eine entsprechende Modifikation der 3"-Enden der Sonden-Nukleinsäureoligomere oder durch Einsatz eines oder mehrerer Didesoxynukleotide als letzte, abschließende Nukleotide am 3"-Ende wird sichergestellt, dass keine unerwünschte Verlängerung der Sonden- Nukleinsäureoligomere während des Schrittes der Amplifizierung stattfindet. Sofern die Sonden-Nukleinsäureoligomere über ihr 3"-Ende an die Oberfläche gebunden sind, und Signal-Nukleinsäureoligomere an die Sonden- Nukleinsäureoligomere hybridisiert vorliegen, steht wiederum das 3"-Ende der Signal-Nukleinsäureoligomere als Anknüpfungspunkt für neue, zusätzliche Nukleotide durch die Polymerase zur Verfügung. Wie bereits erwähnt ist es vorteilhaft, wenn die Signal-Nukleinsäureoligomere an ihrem 3"-Ende eine Modifikation oder Didesoxynukleotide als letzte, abschließende Nukleotide am 3"- Ende aufweisen, um jeweils ein Anfügen von Nukleotiden durch die Nukleinsäure- Polymerase zu verhindern. Besonders bevorzugt weisen die Signal- Nukleinsäureoligomere am 3'-Ende mindestens eine„nicht-matchende" Base auf, wodurch ebenfalls eine Verlängerung der Signal-Nukleinsäureoligomere durch die Polymerase verhindert wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Detektion von Nukleinsäureoligomer- Hybridisierungsereignissen kann daher in ganz besonders vorteilhafter Weise in Kombination mit einer Vorrichtung zur Durchführung einer PCR eingesetzt werden. Die Vorrichtung zur Durchführung einer PCR umfasst dabei wenigstens eine Probenzelle mit einem Hohlraum zur Aufnahme einer Probe und mindestens drei unabhängig voneinander regulierbare Temperiereinheiten, die drei räumlich voneinander getrennte Temperaturzonen definieren. Es ist mindestens ein Mittel zur Durchführung einer Relativbewegung zwischen Probenzelle und den Temperiereinheiten vorgesehen, wobei das Mittel zur Durchführung einer Relativbewegung so ausgelegt und eingerichtet ist, dass die Probe aufgrund der Relativbewegung zwischen Probenzelle und den Temperiereinheiten durch die drei räumlich voneinander getrennten Temperaturzonen bewegt werden kann.
Die Probenzelle umfasst einen zur Detektion von Nukleinsäureoligomer- Hybridisierungsereignissen eingerichteten und ausgelegten Sensor, der in dem zur Aufnahme der Probe vorgesehenen Hohlraum der Probenzelle ausgebildet ist. Besonders bevorzugt handelt es sich um einen zur oberflächensensitiven Detektion von Nukleinsäureoligomer-Hybridisierungsereignissen eingerichteten und ausgelegten Sensor. Der Sensor besteht dabei im wesentlichen aus einer modifizierten Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung wenigstens einer Art von Sonden-Nukleinsäureoligomeren besteht. Mit dem Begriff "Oberfläche" wird jedes Trägermaterial bezeichnet, das geeignet ist direkt oder nach entsprechender chemischer Modifizierung derivatisierte oder nicht-derivatisierte Sonden- Nukleinsäureoligomere kovalent oder über andere spezifische Wechselwirkungen zu binden. Der feste Träger kann aus leitfähigem oder nicht leitfähigem Material bestehen. Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsäureoligomeren an einer Oberfläche sind dem Fachmann bekannt.
Der in der Probenzelle vorhandene Sensor stellt die für das erfindungsgemäße Verfahren erforderliche modifizierte Oberfläche bereit. Weist die Vorrichtung zur Durchführung einer PCR eine vierte Temperiereinheit auf, die eine vierte räumlich von den drei Temperaturzonen getrennte Temperaturzone definiert, so ergeben sich ganz besondere Vorteile. Durch die vierte Temperiereinheit der Vorrichtung wird es möglich, Teilbereiche der Probenzelle, insbesondere den Bereich, in dem sich der Sensor befindet in einer vierten Temperaturzone, die sich von den zur Durchführung der PCR erforderlichen Temperaturen unterscheidet und gleichzeitig eine für die oberflächensensitive Detektion von Nukleinsäure-Hybridisierungsereignissen optimale Temperatur darstellt, zu positionieren. Beispielsweise wird die vierte Temperaturzone auf eine für diese Art der Detektion günstige Temperatur von rund 50°C eingestellt.
Bevorzugt erfolgt der Detektionsschritt direkt nach dem Denaturierungsschritt der PCR-Amplifizierung. Durch die während der Denaturierung herrschende Temperatur von rund 95°C werden alle Bindungen bzw. Hybridisierungen von Nukleinsäuremolekülen gelöst, d.h. alle Nukleinsäureoligomere liegen als Einzelstrang vor und Signal- und Target-Nukleinsäureoligomere befinden sich frei in Lösung. Wie bereits erläutert, wird dadurch die Wahrscheinlichkeit und damit die Geschwindigkeit einer Hybridisierung von Signal- und Target- Nukleinsäureoligomere höher als eine Hybridisierung von Signal- und Sonden- Nukleinsäureoligomeren. Bei Anwesenheit von Target-Nukleinsäureoligomeren sinkt die Signalintensität der oberflächensensitiven Detektion dabei mit jedem PCR-Zyklus.
Wie bereits erwähnt, enthält die bereitgestellte Reaktionslösung für die Amplifizierung der Target-Nukleinsäureoligomere mittels PCR zusätzlich zumindest eine Art von Primer. Die Primer werden dabei bevorzugt so gewählt, dass sie zwar zu den Target-Nukleinsäureoligomeren, nicht aber zu den Sonden- und Signal- Nukleinsäureoligomeren komplementär sind. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird nach der ersten Detektion der Signal-Nukleinsäureoligomere und vor der Durchführung der zweiten Detektion der Schritt der Amplifizierung zumindest 5 mal, insbesondere zumindest 10 mal und bevorzugt zumindest 20 mal durchgeführt. Je nach Art der Anwendung ist es sinnvoll und ausreichend, nicht nach jedem Amplifizierungsschritt, nämlich z.B. nach jedem PCR-Zyklus eine Detektion der Signal-Nukleinsäureoligomere durchzuführen und damit die Menge der neu entstandenen Target-Nukleinsäureoligomere zu bestimmen. Grundsätzlich kann die Detektion der Signal-Nukleinsäureoligomere nach einer beliebigen Anzahl an Amplifizierungszyklen erfolgen. So kann die zweite Detektion beispielsweise nach zwei oder drei oder vier Zyklen erfolgen, die nächste Detektion der Signal-Nukleinsäureoligomere nach einem weiteren, zehn weiteren oder 20 weiteren Zyklen, die darauffolgende Detektion nach vier weiteren Zyklen, acht weiteren Zyklen oder zwölf weiteren Zyklen, usw. Es ist jede denkbare Kombination von Detektionsschritten und Amplifizierungszyklen möglich.
Gemäß bevorzugten Ausführungsformen beträgt die Konzentration der Signal- Nukleinsäureoligomere in dem hergestellten Gemisch zwischen 10"15 mol/l und 10"5 mol/l, bevorzugt zwischen 10"13 mol/l und 10"7 mol/l und besonders bevorzugt zwischen 10"11 mol/l und 10"7 mol/l. Die Wahl der Konzentrationsbereiche und/oder die exakte Einstellung der Konzentration der Signal-Nukleinsäureoligomere erfolgt so, dass eine stabile und gleichmäßige Messung über den gesamten Detektionszeitraum möglich ist und hängt unter anderem davon ab, welches Detektionslabel die eingesetzten Signal-Nukleinsäureoligomere tragen. Die optimalen Konzentrationsbereiche können sich für Signal-Nukleinsäureoligomere mit einem redoxaktiven Detektionslabel und solche mit einem Fluoreszenzlabel unterscheiden. Ebenso kann vor allem bei fluoreszenzmarkierten Signal- Nukleinsäureoligomeren die Anzahl der vorhandenen Fluorophore Einfluss auf die optimale Konzentration nehmen.
Bei Verwendung eines DNA-Chips hängt die bevorzugte Konzentration der Signal- Nukleinsäureoligomere zudem von der Größe der Test-Sites und von der Belegungsdichte, mit der die Sonden-Nukleinsäureoligomere an die Chip- Oberfläche gebunden sind, ab.
Vorzugsweise beträgt die Konzentration der Target-Nukleinsäureoligomere in dem hergestellten Gemisch bis zu 10"9 mol/l, bevorzugt bis zu 10"11 mol/l, besonders bevorzugt bis zu 10"13 mol/l. Durch die während des erfindungsgemäßen Verfahrens stattfindende Amplifizierung der Target-Nukleinsäureoligomere findet eine kontinuierliche Veränderung der Konzentration der Target- Nukleinsäureoligomere statt. Dabei kann zusätzlich je nach Anwendungsart die Anzahl der gewünschten Amplifizierungszyklen unterschiedlich sein. Sinnvollerweise werden dabei die Zyklenzahl und die Konzentration der Target- Nukleinsäureoligomere aneinander angepasst. Durch die angegebenen Grenzen wird eine zuverlässige Messung während des gesamten Ablaufs des Verfahrens gewährleistet.
Bei Verwendung eines DNA-Chips hängt die bevorzugte Konzentration der Target- Nukleinsäureoligomere zudem von der Größe der Test-Sites und von der Belegungsdichte, mit der die Sonden-Nukleinsäureoligomere an die Chip- Oberfläche gebunden sind, ab.
Die Detektion der Signal-Nukleinsäureoligomere erfolgt durch eine oberflächensensitive Detektionsmethode, da in diesem Fall ausschließlich die an die Oberfläche gebundenen Signal-Nukleinsäureoligomere detektiert werden. Bevorzugt sind in diesem Zusammenhang spektroskopische, elektrochemische und elektrochemolumineszente Methoden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden nach der ersten Detektion der Signal-Nukleinsäureoligomere durch eine oberflächensensitive Detektionsmethode und vor einer zweiten Detektion der Signal-Nukleinsäureoligomere durch eine oberflächensensitive Detektionsmethode Bedingungen eingestellt oder Maßnahmen ergriffen, die zur zumindest überwiegenden Dissoziation von Sonden-Nukleinsäureoligomeren und Signal- Nukleinsäureoligomeren führen. Eine solche Dehybridisierung der an die Oberfläche gebundenen Doppelstranghybride führt die modifizierte Oberfläche im wesentlichen in ihren ursprünglichen Zustand zurück. Erfolgt die Amplifizierung der Target-Nukleinsäureoligomere durch eine PCR und liegen die zur Durchführung der einzelnen PCR-Schritte erforderlichen Temperaturen auch an der modifizierten Oberfläche an, so ist kein separater Dehybridisierungsschritt erforderlich, da die Dehybridisierung automatisch während eines PCR-Zyklus erfolgt.
Unter einer „zumindest überwiegenden Dissoziation von Sonden- Nukleinsäureoligomeren und Signal-Nukleinsäureoligomeren" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung verstanden, dass zumindest 50% der an die Oberfläche gebundenen Doppelstranghybride dissoziieren, bevorzugt zumindest 75%, besonders bevorzugt zumindest 90% und insbesondere bevorzugt zumindest 98%.
Zur elektrochemischen Detektion werden bevorzugt Amperometrie, Chronocoulometrie, Impedanzmessung oder Scanning Electrochemical Microscopy (SECM) eingesetzt. Als spektroskopisches Verfahren wird besonders eine Detektion der Fluoreszenz, insbesondere der Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) oder eine Detektion über Surface Plasmon Resonance (SPR) bevorzugt.
Gemäß bevorzugten Ausführungsformen besteht die Modifikation der bereitgestellten modifizierten Oberfläche in der Anbindung von mehreren Arten von Sonden-Nukleinsäureoligomeren. Die verschiedenen Arten von Sonden- Nukleinsäureoligomeren sind dabei in räumlich im wesentlichen abgetrennten Bereichen an die modifizierte Oberfläche gebunden. Die modifizierte Oberfläche besitzt bevorzugt zumindest 2 räumlich im wesentlichen abgetrennte Bereiche, besonders bevorzugt zumindest 4 und insbesondere zumindest 12 solche räumlich im wesentlichen abgetrennte Bereiche. Ganz besonders bevorzugt weist die modifizierte Oberfläche zumindest 32, insbesondere zumindest 64, ganz besonders bevorzugt zumindest 96 räumlich im wesentlichen abgetrennte Bereiche auf.
Besondere Vorteile ergeben sich durch bevorzugte Ausführungsformen, in denen die bereitgestellte modifizierte Oberfläche eine Fläche von 1 μπι2 bis zu 1 mm2, bevorzugt eine Fläche von 10 μηη2 bis zu 100 μηη2, besonders bevorzugt eine Fläche von rund 50 μηη2 aufweist.
Die Fläche der modifizierten Oberfläche richtet sich zum einen nach der Anzahl der verschiedenen Arten von Sonden-Nukleinsäureoligomeren, die in räumlich im wesentlichen abgetrennten Bereichen an die modifizierte Oberfläche gebunden sind. Je mehr räumlich im wesentlichen abgetrennte Bereiche die modifizierte Oberfläche zur Verfügung stellen soll, desto größer muss ihre Fläche gewählt werden. Andererseits kann jedoch beispielsweise durch Veränderung der Belegungsdichte mit Sonden-Nukleinsäureoligomeren die Fläche der modifizierten Oberfläche innerhalb eines angemessenen Rahmens angepasst werden. In der Regel wird mit einer Belegungsdichte von rund 6 x 1012 Sonden-Nukleinsäureoligomeren pro cm2 Oberfläche gearbeitet. Durch Abweichungen von diesem Richtwert können größere oder kleinere Flächen sinnvoll sein.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch einen Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Der Kit enthält dabei zumindest eine modifizierte Oberfläche, wie sie in der vorliegenden Erfindung spezifiziert ist und eine effektive Menge an Signal-Nukleinsäureoligomeren wie sie in der vorliegenden Erfindung definiert sind.
Die Oberfläche
Mit dem Begriff "Oberfläche" wird jedes Trägermaterial bezeichnet, das geeignet ist direkt oder nach entsprechender chemischer Modifizierung derivatisierte oder nicht- derivatisierte Sonden-Nukleinsäureoligomere kovalent oder über andere spezifische Wechselwirkungen zu binden. Der feste Träger kann aus leitfähigem oder nicht leitfähigem Material bestehen.
(i) leitfähige Oberflächen Unter dem Begriff "leitfähige Oberfläche" wird jeder Träger mit einer elektrisch leitfähigen Oberfläche beliebiger Dicke verstanden, insbesondere Oberflächen aus Platin, Palladium, Gold, Cadmium, Quecksilber, Nickel, Zink, Kohlenstoff, Silber, Kupfer, Eisen, Blei, Aluminium und Mangan. Daneben können auch beliebige dotierte oder nicht dotierte Halbleiteroberflächen beliebiger Dicke verwendet werden. Sämtliche Halbleiter können als Reinsubstanzen oder als Gemische Verwendung finden. Als nicht einschränkend gemeinte Beispiele seien an dieser Stelle Kohlenstoff, Silizium, Germanium, cc- Zinn, Cu(l)- und Ag(l)-Halogenide beliebiger Kristallstruktur genannt. Geeignet sind ebenfalls sämtliche binären Verbindungen beliebiger Zusammensetzung und beliebiger Struktur aus den Elementen der Gruppen 14 und 16, den Elementen der Gruppen 13 und 15, sowie den Elementen der Gruppen 15 und 16. Daneben können ternäre Verbindungen beliebiger Zusammensetzung und beliebiger Struktur aus den Elementen der Gruppen 1 1 , 13 und 16 oder den Elementen der Gruppen 12, 13 und 16 verwendet werden. Die Bezeichnungen der Gruppen des Periodensystems der Elemente beziehen sich auf die lUPAC-Empfehlung von 1985.
(ii) nichtleitende Oberflächen
Bei den nichtleitenden Oberflächen wird als Material Glas, modifiziertes Glas oder Silizium bevorzugt. Die Modifizierung kann z.B. durch Silanisierung erfolgen und führt in allen Fällen zu funktionellen Gruppen, die geeignet sind, in Kopplungsreaktionen entsprechend funktionalisierte Sonden-
Nukleinsäureoligomere zu binden. Diese Modifizierung schließt Schichtaufbauten auf der Oberfläche unter Verwendung von Polymeren wie z.B. Dextranpolymeren, die eine Variation der Schichtdicke und Oberflächenbeschaffenheit erlauben, mit ein. Weitere Derivatisierungsmöglichkeiten zur letztendlichen Anbindung der Sonden-Nukleinsäureoligomeren bestehen z.B. im Aufbringen einer dünnen (ca. 10 - 200 nm) Metallisierungsschicht, insbesondere einer Gold-Metallisierungsschicht, die zusätzlich mit (Thiol-funktionalisierten) Polymeren, insbesondere Dextranen, belegt sein kann. Daneben kann das Glas nach der Silanisierung auch mit Biotin funktionalisiert werden (z.B. aminofunktionalisierte Glasoberfläche nach der Silanisierung und Kopplung der Carbonsäure Biotin über einen Biotinaktivester wie Biotin-N-succinimidylester) oder alternativ mit an Dextran-Lysin oder Dextran immobilisierten Biotin überzogen werden. Die so erzeugten biotinylierten Glasoberflächen werden anschließend mit Avidin oder Streptavidin behandelt und können dann zur Anbindung von biotinylierten Sonden-Nukleinsäureoligomeren verwendet werden. Bindung von Nukleinsäureoligomeren an die Oberfläche
Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsäureoligomeren an einer Oberfläche sind dem Fachmann bekannt. Die Sonden-Nukleinsäureoligomere können z.B. kovalent über Hydroxyl-, Epoxid-, Amino- oder Carboxygruppen des Trägermaterials mit natürlicherweise am Nukleinsäureoligomer vorhandenen oder durch Derivatisierung am Sonden-Nukleinsäureoligomer angebrachten Thiol-, Hydroxy-, Amino- oder Carboxylgruppen an die Oberfläche gebunden werden. Das Sonden-Nukleinsäureoligomer kann direkt oder über einen Linker/Spacer an die Oberflächenatome oder -molekülen einer Oberfläche gebunden werden. Daneben kann das Sonden-Nukleinsäureoligomer durch die bei Immunoassays üblichen Methoden verankert werden wie z.B. durch Verwendung von biotinylierten Sonden- Nukleinsäureoligomeren zur nicht-kovalenten Immobilisierung an Avidin oder Streptavidin-modifizierten Oberflächen. Die chemische Modifikation der Sonden- Nukleinsäureoligomere mit einer Oberflächen-Ankergruppe kann bereits im Verlauf der automatisierten Festphasensynthese oder aber in gesonderten Reaktionsschritten eingeführt werden. Dabei wird auch das Nukleinsäureoligomer direkt oder über einen Linker/Spacer mit den Oberflächenatomen oder -molekülen einer Oberfläche der oben beschriebenen Art verknüpft. Diese Bindung kann auf verschiedene dem Fachmann bekannte Arten durchgeführt werden. In diesem Zusammenhang wird auf die WO 00/42217 A1 verwiesen.
Sonden-, Target- und Signal-Nukleinsäureoligomere
Die Sonden-Nukleinsäureoligomere der vorliegenden Erfindung bestehen aus Nukleotiden in einer bestimmten Nukleotidabfolge (Sequenz) und liegen an einer Oberfläche immobilisiert vor. Als Target-Nukleinsäureoligomere werden Moleküle bezeichnet, die spezifisch mit den Sonden-Nukleinsäureoligomeren oder mit den Signal-Nukleinsäureoligomeren unter Ausbildung eines Doppelstrang-Hybrids wechselwirken. Target-Nukleinsäureoligomere im Sinne der vorliegenden Erfindung sind also Nukleinsäureoligomere, die als Komplexbindungspartner des komplementären Sonden-Nukleinsäureoligomers bzw. Signal-
Nukleinsäureoligomers fungieren. Die Target-Nukleinsäureoligomere, deren Vorhandensein anhand der vorliegenden Erfindung detektiert werden soll, weisen zumindest einen Sequenzbereich auf, dessen Sequenz komplementär oder zumindest weitgehend komplementär zu einem Abschnitt der Sonden- Nukleinsäureoligomere bzw. der Signal-Nukleinsäureoligomere ist.
Die Target-Nukleinsäureoligomere liegen in der Probe entweder als Einzelstrang (ss) oder als Doppelstrang (ds) vor. In einer bevorzugten Ausführungsform liegen die Target-Nukleinsäureoligomere zumindest teilweise als Einzelstrang vor. Dies kann z.B. dadurch erreicht werden, dass ds-Target-Nukleinsäureoligomere (thermisch oder durch sonstige, dem Fachmann bekannte Maßnahmen) dehybridisiert werden oder dass bei der Aufbereitung der Target- Nukleinsäureoligomere darauf geachtet wird, dass die Target- Nukleinsäureoligomere z.T. als Einzelstränge vorliegen. Dies wird beispielsweise durch eine asymmetrische PCR erreicht.
Als Nukleinsäureoligomer oder ns-Oligomer wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Verbindung aus wenigstens zwei kovalent verbundenen Nukleotiden oder aus wenigstens zwei kovalent verbundenen Pyrimidin- (z.B. Cytosin, Thymin oder Uracil) oder Purin-Basen (z.B. Adenin oder Guanin), bevorzugt ein DNA-, RNA- oder PNA-Fragment, verwendet. Der Begriff Nukleinsäure bezieht sich auf ein beliebiges "Rückgrat" der kovalent verbundenen Pyrimidin- oder Purin-Basen, wie z.B. auf das Zucker-Phosphat Rückgrat der DNA, cDNA oder RNA, auf ein Peptid-Rückgrat der PNA oder auf analoge Rückgrat- Strukturen, wie z.B. ein Thio-Phosphat-, ein Dithio-Phosphat- oder ein Phosphoramid-Rückgrat. Wesentliches Merkmal einer Nukleinsäure im Sinne der vorliegenden Erfindung ist die sequenzspezifische Bindung natürlich vorkommender DNA, oder RNA bzw. daraus abgeleitete (transkribierte oder amplifizierte) Strukturen wie cDNA oder amplifizierte cDNA oder amplifizierte RNA (aRNA). Detektions-Label / Markierung (Markermolekül)
Die Signal-Nukleinsäureoligomere sind durch Derivatisierung mit einem oder mehreren detektierbaren Label ausgestattet. Dieses Label ermöglicht die Detektion der Komplexierungsereignisse zwischen dem Signal-Nukleinsäureoligomeren und den oberflächengebundenen Sonden-Nukleinsäureoligomeren. Das Label kann direkt oder wie im Falle enzym-katalysierter Reaktionen indirekt ein Detektionssignal liefern. Bevorzugte Detektionslabel (Markermoleküle) sind Fluorophore und redoxaktive Substanzen.
Bei den Fluorophoren können kommerziell erhältliche Fluoreszenzfarbstoffe wie z.B. Texas Rot, Rhodamin-Farbstoffe, Fluorescein etc. verwendet werden (vgl. Molecular Probes Katalog). Im Falle der Detektion durch elektrochemische Methoden werden Redoxmoleküle als Label eingesetzt.
Als Redoxlabel können Übergangsmetall-Komplexe, insbesondere solche des Kupfers, Eisens, Rutheniums, Osmiums oder Titans mit Liganden wie Pyridin, 4,7- Dimethylphenanthrolin, 9,10-Phenanthrenquinondiimin, Porphyrine und substituierte Porphyrin-Derivate verwendet werden. Daneben ist der Einsatz von Riboflavin, von Chinonen wie Pyrrollochinolinochinon, Ubichinon, Anthrachinon, Naphthochinon oder Menachinon bzw. Derivaten davon, von Metallocenen und Metallocenderivaten wie Ferrocenen und Ferrocenderivaten, Cobaltocenen und Cobaltocenderivaten, von Porphyrinen, Methylenblau, Daunomycin, Dopamin- Derivaten, Hydrochinon-Derivaten (para- oder ortho-Dihydroxy-Benzol-Derivaten, para- oder ortho-Dihydroxy-Anthrachinon-Derivaten, para- oder ortho-Dihydroxy- Naphthochinon-Derivaten) und ähnlichen Verbindungen möglich.
In den erfindungsgemäßen Verfahren können auch indirekte Label verwendet werden. Unter dem Begriff „indirekte Label" werden solche verstanden, bei denen die eigentlich detektierbare Form des Labels erst über eine enzymkatalysierte Reaktion entsteht. Die detektierbare Form des Labels kann dann an der Oberfläche detektiert werden. Beispiele für solche indirekten Label sind dem Fachmann aus der Literatur bekannt, exemplarisch sei hier alkalische Phosphatase (AP) in Verbindung mit dem Substrat p-Aminophenylphosphat genannt. Liegt AP als indirekter Marker an das Signal-Nukleinsäureoligomer gebunden vor, so kann eine elektrochemische Detektion des Signal-Nukleinsäureoligomers dadurch erfolgen, dass zum Zeitpunkt der Detektion p-Aminophenylphosphat zugegeben wird. Das elektrochemisch inaktive p-Aminophenylphosphat dient als Substrat des Enzyms AP und wird in p-Aminophenol umgewandelt. p-Aminophenol kann nun, nach Diffusion zu einer leitfähigen Oberfläche, elektrochemisch detektiert werden, da diese Form des Substrats (also nach Umsetzung am AP) elektrochemisch aktiv ist. Alternativ kann AP auch zur chromogenen Detektion verwendet werden (z.B. mit 5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat in Verbindung mit Nitroblau- Tetrazoliumchlorid).
Oberflächensensitive Detektionsmethoden Oberflächensensitive Detektionsmethoden erlauben die Unterscheidung zwischen an eine Oberfläche assoziierten und im Überstand gelösten Markermolekülen. Als Detektionsmethode eigenen sich elektrochemische, spektroskopische und elektrochemolumineszente Verfahren. (i) Oberflächensensitive elektrochemische Detektion
Bei elektrochemischen Methoden kann anhand der Kinetik der elektrochemischen Prozesse prinzipiell zwischen an eine Oberfläche adsorbierten und im Überstand gelösten redoxaktiven Detektionslabel unterschieden werden. Oberflächenadsorbierte Detektionslabel werden im allgemeinen schneller elektrochemisch umgesetzt (z.B. oxidiert oder reduziert) als redoxaktive Detektionslabel aus der Volumenphase, da letztere vor der elektrochemischen Umsetzung erst zur (Elektroden-) Oberfläche diffundieren müssen. Als Beispiele für elektrochemische oberflächensensitive Methoden seien die Cyclovoltammetrie, die Amperometrie und die Chronocoulometrie genannt.
Die Methode der Chronocoulometrie z.B. erlaubt es, oberflächennahe redoxaktive Komponenten von (identischen) redoxaktiven Komponenten in der Volumenphase zu unterscheiden und ist z.B. in Steel, A.B., Herne, T.M. und Tarlov M.J.: Electrochemical Quantitation of DNA Immobilized on Gold, Analytical Chemistry, 1998, Vol. 70, 4670 - 4677 und darin zitierten Literaturstellen beschrieben. Der Einsatz der Chronocoulometrie in einem Verdrängungsassay zur Detektion von Nukleinsäureoligomerhybridisierungsereignissen ist detailliert in der WO 03/018834 A2 beschrieben, auf die hiermit in diesem Zusammenhang Bezug genommen wird.
(ii) Oberflächensensitive Fluoreszenz-Detektion
Als optische Messmethode zur Detektion von fluoreszenzmarkierten Signal- Nukleinsäureoligomeren kann die Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF, vgl. Sutherland und Dahne, 1987, J. Immunol. Meth., 74, 253 - 265) dienen. Dabei können Fluoreszenzmoleküle, die sich in der Nähe der Grenzfläche zwischen einem festen Wellenleitermedium, typischerweise Glas, und einem flüssigen Medium befinden bzw. auf der der Flüssigkeit zugewandten Oberfläche des Wellenleitermediums immobilisiert sind, durch das evaneszente Feld, das aus dem Wellenleiter herausragt, angeregt werden und detektierbares Fluoreszenzlicht emittieren. Verdrängte bzw. im Überstand gelöste fluoreszenzgelabelte Komplexbildner werden vom evaneszenten Feld nicht erfasst (bzw. nur insofern als sie sich im Bereich der Eindringtiefe des evaneszenten Feldes befinden) und liefern somit (nahezu) keinen Beitrag zum gemessenen Signal. Die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes beträgt typischerweise 100 bis 200 nm, kann aber durch eine dünne Metallisierungsschicht (ca. 10 bis 200 nm), insbesondere eine Goldmetallisierungsschicht, auf mehrere 100 nm erhöht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Fluoreszenzdetektion der verdrängten, Fluorophor-markierten Signal-Nukleinsäureoligomere wird die Schichtdicke der Sonden-modifizierten Trägeroberfläche an die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes angepasst z.B. durch entsprechend lange Sonden-Nukleinsäureoligomere, durch Immobilisierung der Sonden-Nukleinsäureoligomere über entsprechend lange Linker zwischen Oberfläche und Sonden- Oligonukleotid, durch Kopplung der Carbonsäure Biotin (über einen Biotinaktivester wie Biotin-N-succinimidylester) an aminoderivatisierte Oberflächen und Kopplung von Avidin oder Streptavidin an die so erzeugten biotinylierten Oberflächen mit anschließender Anbindung von biotinylierten Sonden- Nukleinsäureoligomeren oder durch Immobilisierung einer entsprechend dicken Schicht an funktionalisiertem Polymer und Anbindung des Sonden- Nukleinsäureoligomeren an das Polymer, z.B. (a) durch Aufbringen einer dünnen (ca. 10 - 200 nm) Metallisierungsschicht, insbesondere einer Gold- Metallisierungsschicht, die mit einem (Thiol-funktionalisierten) Polymer, insbesondere Dextranen oder Polylysin, belegt sein kann, welches wiederum zur Anbindung der Sonden-Nukleinsäureoligomere verwendet wird oder (b) durch Aufbringen einer Polymerschicht aus Polylysin-, Dextran-Lysin- oder von Dextran-immobilisiertem Biotin und Kopplung von Avidin oder Streptavidin an die so erzeugten biotinylierten Oberflächen mit anschließender Anbindung von biotinylierten Sonden- Nukleinsäureoligomeren.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen im Zusammenhang mit den Figuren näher erläutert werden. Es wird aber ausdrücklich darauf hingewiesen, dass die Erfindung nicht auf die angegebenen Beispiele beschränkt sein soll. Es zeigen
Fig. 1A, eine schematische Darstellung des Messprinzips der Detektion von 1 B Nukleinsäureoligomer-Hybridisierungsereignissen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, Fig. 2 eine schematische Darstellung einer Probenzelle mit integriertem Sensor,
Fig. 3 eine perspektivische Darstellung einer Vorrichtung zur Durchführung einer PCR-Reaktion bei gleichzeitiger Detektion von Nukleinsäureoligomer-Hybridisierungsereignissen,
Fig. 4A, eine Auftragung der Messergebnisse der Detektion von 4B, 4C Nukleinsäureoligomer-Hybridisierungsereignissen während einer PCR
(Real-Time PCR),
Fig. 5A, eine Auftragung der Messergebnisse der Detektion von 5B, 5C, Nukleinsäureoligomer-Hybridisierungsereignissen an 24 Teststellen 5D während einer PCR (Multiplex-Real-Time PCR).
Beispiel 1: Messprinzip der Detektion von Nukleinsäureoligomer- Hybridisierungsereignissen
Die Figuren 1A, 1 B zeigen schematisch das Messprinzip der Detektion von Nukleinsäureoligomer-Hybridisierungsereignissen während einer PCR, nämlich einer elektrisch detektierten Real-Time PCR, wobei in Fig. 1A der Zustand zu Beginn bzw. vor dem Start der PCR und in Fig. 1 B der Zustand bei einer fortgeschrittenen PCR-Reaktion skizziert ist.
Zu einem PCR-Reaktionsansatz, der Target-Nukleinsäureoligomere 1 enthält, werden Signal-Nukleinsäureoligomere 2 mit kovalent gebundenen Ferrocenen 3 gegeben. Die Signal-Nukleinsäureoligomere 2 sind zum einen zu den Sonden- Nukleinsäureoligomeren 5, die auf einer Teststelle 4 eines DNA-Chips immobilisiert sind, und zum anderen zu den Target-Nukleinsäureoligomeren 1 komplementär. Zu Beginn der PCR-Reaktion, wie in Fig. 1A dargestellt, befinden sich nur wenige Target-Nukleinsäureoligomere 1 im Reaktionsansatz, die Signal- Nukleinsäureoligomere 2 sind in deutlichem Überschuss vorhanden und können in hohem Maße an die an der DNA-Chip-Teststelle 4 immobilisierten Sonden- Nukleinsäureoligomere 5 unter Ausbildung von Sonden-/Signal- Nukleinsäureoligomer-Hybriden 25 gebunden werden. In der Regel ist - bei geeigneter Konzentration der Signal-Nukleinsäureoligomere 2 in Lösung - eine Sättigung der Hybridisierung von Sonden- und Signal-Nukleinsäureoligomeren 25 innerhalb weniger Minuten erreicht.
Die kovalent gebundenen Ferrocene 3 der Signal-Nukleinsäureoligomere 2 können zur elektrochemischen Detektion der an den Teststellen 4 (Elektroden) gebundenen/hybridisierten Signal-Nukleinsäureoligomere 2 benutzt werden, da Ferrocen reversibel oxidier- und reduzierbar ist. Bei Anlegen einer entsprechenden Spannung an die Teststelle 4 wird ein dem Anteil an hybridisierten Sonden- und Signal-Nukleinsäureoligomeren 25 entsprechender Strom gemessen. Die frei in Lösung befindlichen Signal-Nukleinsäureoligomere 2 sind in einer Konzentration vorhanden, die kein messbares Zusatzsignal an der Teststelle 4 erzeugt bzw. sie können anhand ihrer Zeitcharakteristik - freie Signal-Nukleinsäureoligomere 2 müssen zunächst an die Teststelle 4 diffundieren und können erst dann oxidiert bzw. reduziert werden - von an der Teststelle 4 gebundenen, mit Sonden- Nukleinsäureoligomeren hybridisierten Signal-Nukleinsäureoligomeren diskriminiert werden. Eine thermische Dehybridisierung (Aufheizen des DNA-Chips und der angrenzenden Lösung auf 95°C) führt zum Abdiffundieren aller an der Teststelle gebundenen Signal-Nukleinsäureoligomere 2. Die Teststelle 4 ist in ihrer ursprünglichen Form mit freien Sonden- Nukleinsäureoligomeren 5 wiederhergestellt. Dieser Zustand liegt zumindest für den Zeitraum vor, in dem die Temperatur nach der thermischen Dehybridisierung über der Schmelztemperatur des Hybrids aus Sonden- und Signal-Nukleinsäureoligomeren 25 liegt. Ein Absenken der Temperatur an der Teststelle 4 des DNA-Chips auf bzw. unter die Schmelztemperatur des Hybrids 25 ermöglicht eine erneute Messung.
Mit zunehmendem Fortgang der PCR-Reaktion, wie in Fig. 1 B dargestellt, nimmt die Zahl der Target-Nukleinsäureoligomere 1 exponentiell zu. Bei geeigneter Temperaturführung (Aufschmelzen der PCR-Produkte, Absenken der Temperatur auf einen Bereich unter der Schmelztemperatur eines Hybrids aus Signal- und Target-Nukleinsäureoligomeren 12, danach gegebenenfalls weiteres Absenken der Temperatur auf einen Bereich unterhalb der Schmelztemperatur des Hybrids aus Signal- und Sonden-Nukleinsäureoligomeren 25) kommt es in der Volumenphase zu einer schnellen Hybridisierung aus Target- und Signal-Nukleinsäureoligomeren 12 (wenige Sekunden). Die Konzentration der freien Signal-Nukleinsäureoligomere 2 nimmt deutlich ab, was an der Teststelle 4 zu einer im Vergleich zu einer Messung bei Reaktionsstart verlangsamten Anhybridisierung der Signal- Nukleinsäureoligomere 2 und zu einem reduzierten Hybridisierungsgrad zwischen Sonden- und Signal-Nukleinsäureoligomeren 25 führt.
Daneben kann durch geschicktes Ausnutzen der geeigneten Exonukleaseaktivität der Polymerase und Anbindung der Markierung am geeigneten Ende des Signal- Nukleinsäureoligomers 2 pro Amplikon und Zyklus ein Signal-Nukleinsäureoligomer 2 zerstört werden (Trennung von Markierung und Oligosequenz), was, neben dem Verbrauch freier Signal-Nukleinsäureoligomere 2 durch die Hybridisierung an die Target-Nukleinsäureoligomere 12, zu einem permanenten Verbrauch der Signal- Nukleinsäureoligomere 2 durch den (korrekten) Amplifikationsvorgang führt und so das Signal an der Teststelle 4 des DNA-Chips noch stärker beeinflusst.
Beispiel 2:
Detektion von Nukleinsäureoligomer-Hybridisierungsereignissen in Kombination mit einer Vorrichtung zur Durchführung von PCR-Reaktionen
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Detektion von Nukleinsäureoligomer- Hybridisierungsereignissen kann in Kombination mit einer Vorrichtung 30 zur Durchführung einer PCR anzuwenden. Eine spezielle Ausführungsform der Vorrichtung 30 ist in der Figur 2 gezeigt. Die Vorrichtung 30 zur Durchführung der PCR umfasst eine Probenzelle 10 mit einem Hohlraum zur Aufnahme der Probe und drei unabhängig voneinander regulierbare Temperiereinheiten, die drei räumlich voneinander getrennte Temperaturzonen definieren. In der Figur 2 sind aus Übersichtsgründen nur die Temperiereinheiten 7a und 7c dargestellt. Ebenso ist in der Vorrichtung 30 ein Mittel R zur Durchführung einer Relativbewegung zwischen Probenzelle und den Temperiereinheiten vorgesehen, wobei das Mittel R zur Durchführung einer Relativbewegung so ausgelegt und eingerichtet ist, dass die Probe aufgrund der Relativbewegung zwischen Probenzelle 10 und den Temperiereinheiten durch die drei räumlich voneinander getrennten Temperaturzonen bewegt wird. Im speziellen Beispiel handelt es sich um ein Mittel zur Durchführung von Drehbewegungen, nämlich um eine rotierbare Achse R. Eine spezielle Ausführungsform der Probenzelle 10 ist in der Figur 3 dargestellt. Die Probenzelle 10 weist einen ungefähren Durchmesser von 20 mm und eine Dicke von 1 mm auf. Der in der Probenzelle 10 vorhandene Hohlraum 8 weist eine Tiefe von ca. 0,5 mm und zwei Einfüllöffnungen 1 1 zum Beschicken mit dem PCR- Reaktionsgemisch auf. Ebenso umfasst die Probenzelle 10 einen zur Detektion von Nukleinsäureoligomer-Hybridisierungsereignissen eingerichteten und ausgelegten Sensor 20, nämlich einen DNA-Chip, der in dem Hohlraum 8 der Probenzelle 10 ausgebildet ist.
Der in der Probenzelle 10 vorhandene DNA-Chip 20 stellt die für das erfindungsgemäße Verfahren erforderliche modifizierte Oberfläche bereit und weist ein Sensorfeld 20a auf, welches über einen Brückenkanal 8.1 mit der Reaktionslösung in Kontakt steht. Der DNA-Chip 20 verfügt über eine Durchkontaktierung, so dass die für die Messwerterfassung notwendige elektrische Kontaktierung des DNA-Chips von außen über Federkontakte 9 (siehe Fig. 2), die in der rotierbaren Achse R ausgebildet sind, bewerkstelligt werden kann.
Die drei unabhängigen Temperiereinheiten der Vorrichtung 30 weisen jeweils einen temperierbaren Block 6 aus einem gut wärmeleitfähigen Material, im speziellen Beispiel aus Aluminium auf. Mittels Peltierelementen bzw. Heizmatten, Platinwiderstand zur Temperaturmessung und einer geeigneten Regelelektronik (PID-Regler) werden die temperierbaren Blöcke 6 auf die für die PCR-Reaktion nötige Temperatur gebracht. Im vorliegenden Beispiel wird mit der ersten Temperiereinheit 7a eine erste Temperaturzone von 95°C, mit der zweiten Temperiereinheit 7c eine zweite Temperaturzone von 55°C und mit der dritten Temperiereinheit (nicht gezeigt) eine dritte Temperaturzone von 72°C definiert. Jeder temperierbare Block 6 enthält einen Spalt 13, in den die Probenzelle 10 eingeführt wird. Im vorliegenden Beispiel weist die Vorrichtung 30 eine vierte Temperiereinheit 7d auf, die eine vierte, räumlich von den anderen Temperaturzonen getrennte Temperaturzone definiert. Im speziellen Fall stellt die rotierbare Achse R zugleich die vierte Temperiereinheit 7d dar, wobei zwei zylinderförmige, temperierbare Blöcke 6 ober- und unterhalb der Probenzelle 10 im Bereich des DNA-Chips angeordnet sind. Durch die vierte Temperiereinheit 7d der Vorrichtung wird es möglich, Teilbereiche der Probenzelle, insbesondere den Bereich, in dem sich der Sensor befindet in einer vierten Temperaturzone, die eine für die oberflächensensitive Detektion von Nukleinsäure-Hybridisierungsereignissen optimale Temperatur bereitstellt, zu positionieren.
Durch eine geeignete Wahl der Blockgeometrie kann der Bereich, in dem die Probenzelle auf eine bestimmte Temperatur erwärmt wird, festgelegt werden. Im vorliegenden Beispiel wurde ein Verhältnis von 2:1 :1 des Bereiches mit 72°C zu den Bereichen mit 95°C und 55°C gewählt. Zwischen den Blöcken ist jeweils ein Luftspalt, um einen Wärmeübertrag zwischen den Blöcken zu verhindern. Durch Variation der Rotationsfrequenz kann die Zeit, in der die kritischen Temperaturen für die PCR-Reaktion an der Probenzelle 10 anliegen, variiert werden.
Beispiel 3:
DNA-Chip und Sondenimmobilisierung
Eine elektrochemische Messvariante von Hybridisierungsereignissen und die Sondenimmobilisierung auf dem DNA-Chip ist in P. Liepold, T. Kratzmüller, N. Persike, M. Bandilla, M. Hinz, H. Wieder, H. Hillebrandt, E. Ferrer, G. Hartwich (2008) , Analytical and Bioanalytical Chemistry, Vol. 391 , S. 1759-1772, Electrically Detected Displacement Assay (EDDA): A Practical Approach to Nucleic Acid Testing in Clinical or Medical Diagnosis beschrieben. Ein CMOS-basierter DNA- Chip für die elektrochemische Detektion der Hybridisierung zwischen Sonden- und Signal-Nukleinsäureoligomeren ist z.B. in Augustyniak, M.; Paulus, C; Brederlow, R.; Persike, N.; Hartwich, G.; Schmitt-Landsiedel, D.; Thewes, R. (2006), Solid- State Circuits, 2006 IEEE International Conference Digest of Technical Papers, 59 - 68 A 24x16 CMOS-Based Chronocoulometric DNA Microarray beschrieben.
Beispiel 4:
Durchführung einer Real-Time PCR
Der Mastermix für die PCR Reaktion zur Amplifikation einer Zielsequenz, nämlich Target-Nukleinsäureoligomere von Campylobacter jejuni (Template-Menge ca. 103 Kopien, isoliert aus Campylobacter jejuni Reinkultur) enthält entsprechende Primer (10 μΜ), den dNTP-Mix (je dNTP 25 μΜ) und MgAc (3 mM) in einem Standard PCR-Puffer (5 x Bicine Puffer, 250 mM Bicine/KOH, pH 8.2; 575 mM K-Acetat, 40% Glycerol (v/v), Bicine = N,N-Bis(2-hydroxyethyl)Glycin). Zu diesem Mastermix wird das Template und Signal-Nukleinsäureoligomere (50nM), die komplementär zu einem Teilbereich der Target-Nukleinsäureoligomere sind, sowie Kontroll-Signal- Nukleinsäureoligomere (50 nM), die vollständig nicht-komplementär zu DNA- Sequenzen der Template-Lösung sind, gegeben. Unmittelbar vor Start der PCR- Reaktion wird PCR-Polymerase zugefügt und die Lösung in die Probenzelle 10, wie in der Figur 3 gezeigt, gefüllt.
Vor Start der PCR wird das in der Probenzelle 10 vorliegende Reaktionsgemisch in der Vorrichtung 30, wie in der Figur 2 gezeigt, 3 min auf 95°C erhitzt, anschließend abgekühlt und eine erste Messung am integrierten DNA-Chip 20 durchgeführt. Der DNA-Chip 20 trägt an einer der bereitgestellten Teststellen Sonden- Nukleinsäureoligomere, die komplementär zu den Signal-Nukleinsäureoligomeren sind und an einer weiteren Teststelle Sonden, die komplementär zu den Kontroll- Signal-Nukleinsäureoligomeren sind. Diese erste Messung findet bei 62°C statt, ca. 4°C unter der Schmelztemperatur des Hybrids aus Sonden- und Signal- Nukleinsäureoligomeren unter den Bedingungen in der Reaktionslösung und deutlich unter der Schmelztemperatur des Hybrids aus Target- und Signal- Nukleinsäureoligomeren (das Signal-Nukleinsäureoligomer hat mehr matchende Basen zum Target-Nukleinsäureoligomer als zum Sonden-Nukleinsäureoligomer). Die Schmelztemperatur des Hybrids aus Kontroll-Sonden-Nukleinsäureoligomer und Kontroll-Signal-Nukleinsäureoligomer unter den Bedingungen in der Reaktionslösung ist identisch zur Schmelztemperatur des Hybrids aus Sonden- und Signal-Nukleinsäureoligomeren. Das Ergebnis dieser Normierungsmessung ist in der Figur 4A gezeigt. Die Messung an der Kontrollteststelle ist mit K gekennzeichnet.
Die in den Figuren 4A, 4B, 4C dargestellten Kurven stellen den integralen Oxidationsstrom der Ferrocenmarkierungen von den an die Sonden- Nukleinsäureoligomere hybridisierten Signal-Nukleinsäureoligomere in Abhängigkeit von der Zeit dar und spiegeln somit den Hybridisierungsgrad bzw. die Hybridisierungseffizienz wider. Die Hybridisierungseffizienz ist wiederum abhängig von der Konzentration freier Signal-Nukleinsäureoligomere und somit indirekt von der Konzentration bzw. der Menge an Target-Nukleinsäureoligomeren.
Nach der Normierungsmessung wird die PCR-Reaktion gestartet, die temperierbaren Blöcke der Vorrichtung 30 werden dazu auf 96°C (Aufschmelzen), 55°C (Annealing) und 72°C (Elongation) eingestellt und die Probenzelle 10 wird mit einer Rotationsgeschwindigkeit von 2 Umdrehungen pro Minute (i.e. 2 Zyklen pro Minute) in den temperierbaren Blöcken gedreht. Das nahezu zentrisch ausgerichtete Sensorfeld 20a des DNA-Chips 20 wird über einen weiteren temperierbaren Block bei ca. 50°C gehalten, um dann - vor einer erneuten Messung - zunächst auf 95°C aufgeheizt zu werden, um die Signal- Nukleinsäureoligomere, die während einer vorausgegangenen Messung an die Sonden-Nukleinsäureoligomere hybridisiert sind, von diesen wieder zu dehybridisieren. Die Temperatur wird schließlich erneut auf 62°C eingestellt, um eine weitere Messung der Hybridisierung von Signal-Nukleinsäureoligomeren an die freien Sonden-Nukleinsäureoligomere zu ermöglichen. Während einer Messung des Hybridisierungsvorgangs am DNA-Chip 20 wird die Probenzelle 10 in der Regel nicht gedreht. In den Figuren 4B und 4C sind Ergebnisse weiterer Messungen nach 10 bzw. 20 Zyklen der PCR dargestellt. Man beobachtet eine leichte, etwa 20%ige Abnahme der Hybridisierungseffizienz (des Maximalsignals der elektrochemischen Messung) an der Kontrollteststelle (in den Graphen mit K gekennzeichnet), wohingegen die Hybridisierungseffizienz an der eigentlichen Detektionsteststelle mit zunehmender Amplifikationsrate der Target-Nukleinsäureoligomere, wie erwartet, signifikant abnimmt (etwa um den Faktor 6).
Beispiel 5:
Durchführung einer Multiplex Real-Time PCR
Die Versuchsführung erfolgt wie im Beispiel 3 beschrieben, jedoch ohne Zugabe von Target-Nukleinsäureoligomeren von Campylobacter jejuni. Verwendet wurde ein DNA Chip 20 mit 24 Teststellen zur Erfassung von Target- Nukleinsäureoligomeren verschiedener Subtypen des Humanen Papilloma Virus in einer Probe. Die Figur 5 zeigt das Ergebnis einer solchen closed tube Multiplex Real-Time PCR mit elektrischer Detektion an 24 Teststellen eines DNA-Chips. In der Figur 5 sind für jede Teststelle zwei Messkurven, nämlich die der ersten Messung vor Start der PCR (5.1 ) und die der Messung nach 25 Zyklen der PCR (5.2) gezeigt. Die Kurven geben dabei den Stromfluss (angegeben in nA) an der jeweiligen Teststelle wieder. Die beiden Messungen sind für nahezu alle Teststellen im wesentlichen identisch, d.h. die entsprechenden Subtypen (in den jeweiligen Graphen mit dem Zusatz „low" bzw. „high" indiziert) waren nicht vorhanden. Die Subtypen HPV_6low (siehe Fig. 5C), HPV_16high und HPV_18high (siehe Fig. 5D) konnten nachgewiesen werden, bei der Teststelle für HPV_1 1 low (siehe Fig. 5C) ist die leichte Abnahme nach 25 Zyklen auf eine suboptimale Teststelle mit per se geringer Signalstärke zurückzuführen.
Bezugszeichenliste
1 Target-Nukleinsäureoligomer
2 Signal-Nukleinsäureoligomer
3 Ferrocen
4 Teststelle
5 Sonden-Nukleinsäureoligomer
6 temperierbarer Block
7a Temperiereinheit
7c Temperiereinheit
7d Temperiereinheit
8 Hohlraum
8.1 Brückenkanal
9 Federkontakte
10 Probenzelle
1 1 Einfüllöffnungen
12 Hybrid aus Target- und Signal-Nukleinsäureoligomer
13 Spalt
20 Sensor
20a Sensorfeld
25 Hybrid aus Signal- und Sonden-Nukleinsäureoligomer
30 Vorrichtung zur Durchführung einer PCR
R rotierbare Achse
K Messkurve Kontrollteststelle

Claims

Patentansprüche
Verfahren zur Detektion von Nukleinsäureoligomer-Hybridisierungsereignissen umfassend die Schritte a) Bereitstellen einer modifizierten Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung wenigstens einer Art von Sonden-Nukleinsäureoligomeren besteht,
b) Bereitstellen einer Probe mit Target-Nukleinsäureoligomeren,
c) Bereitstellen einer Lösung mit wenigstens einer Art von Signal- Nukleinsäureoligomeren, wobei die Signal-Nukleinsäureoligomere mit zumindest einem Detektionslabel modifiziert sind, die Signal- Nukleinsäureoligomere einen zu den Sonden-Nukleinsäureoligomeren komplementären oder weitgehend komplementären Abschnitt besitzen und die Signal-Nukleinsäureoligomere einen zu den Target- Nukleinsäureoligomeren komplementären oder weitgehend komplementären Abschnitt besitzen,
d) Bereitstellen einer Reaktionslösung zur Durchführung einer Nukleinsäureamplifikation, wobei die Reaktionslösung zumindest Nukleotide und wenigstens eine Art von Nukleinsäure-Polymerase enthält, e) Vermischen und Inkontaktbringen mit der modifizierten Oberfläche von
- der Lösung mit Signal-Nukleinsäureoligomeren,
- der Probe mit Target-Nukleinsäureoligomeren und
- der Reaktionslösung zur Durchführung einer Nukleinsäureamplifikation, wobei die Signal-Nukleinsäureoligomere in dem hergestellten Gemisch in einer Konzentration von 10"17 mol/l bis 10"3 mol/l vorliegen und die Target- Nukleinsäureoligomere in dem hergestellten Gemisch in einer Konzentration von bis zu 10"7mol/l vorliegen,
f) erste Detektion der Signal-Nukleinsäureoligomere durch eine oberflächensensitive Detektionsmethode,
g) Amplifizierung der Target-Nukleinsäureoligomere mittels Nukleinsäureamplifikation,
h) zweite Detektion der Signal-Nukleinsäureoligomere durch eine oberflächensensitive Methode, i) Vergleich der in Schritt h) erhaltenen Werte mit den in Schritt f) erhaltenen Werten.
Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die Amplifizierung der Target- Nukleinsäureoligomere in Schritt g) durch eine PCR erfolgt und die in Schritt d) bereitgestellte Reaktionslösung zusätzlich zumindest eine Art von Primer enthält, oder die Amplifizierung der Target-Nukleinsäureoligomere in Schritt g) durch eine isothermale Amplifikation erfolgt.
Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 1 und 2, wobei vor einer Durchführung des Schrittes h) der Schritt g) zumindest 5 mal, insbesondere zumindest 10 mal, bevorzugt zumindest 20 mal durchgeführt wird.
Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Konzentration der Signal-Nukleinsäureoligomere in dem in Schritt e) hergestellten Gemisch zwischen 10"15 mol/l und 10"5 mol/l, bevorzugt zwischen 10"13 mol/l und 10"7 mol/l, besonders bevorzugt zwischen 10"11 mol/l und 10"7 mol/l beträgt.
Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Konzentration der Target-Nukleinsäureoligomere in dem in Schritt e) hergestellten Gemisch bis zu 10"9 mol/l, bevorzugt bis zu 10"11 mol/l, besonders bevorzugt bis zu 10"13 mol/l I beträgt.
Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei als oberflächensensitive Detektionsmethode eine spektroskopische, elektrochemische oder elektrochemolumineszente Detektionsmethode eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die elektrochemische Detektion durch Amperometrie, Chronocoulometrie, Impedanzmessung oder Scanning Electrochemical Microscopy (SECM) erfolgt und wobei die spektroskopische Detektion durch Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRF) oder Surface Plasmon Resonance (SPR) erfolgt.
8. Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Modifikation der in Schritt a) bereitgestellten modifizierten Oberfläche in der Anbindung von mehreren Arten von Sonden-Nukleinsäureoligomeren besteht und die verschiedenen Arten von Sonden-Nukleinsäureoligomeren in räumlich im wesentlichen abgetrennten Bereichen an die modifizierte Oberfläche gebunden sind.
Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die in Schritt a) bereitgestellte modifizierte Oberfläche eine Fläche von 1 μηη2 bis zu 1 mm2, bevorzugt eine Fläche von 10 μηη2 bis zu 100 μηη2, besonders bevorzugt eine Fläche von rund 50 μηη2 aufweist.
10. Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei nach der ersten Detektion der Signal-Nukleinsäureoligomere durch eine oberflächensensitive Detektionsmethode und vor einer zweiten Detektion der Signal-Nukleinsäureoligomere durch eine oberflächensensitive Detektionsmethode Bedingungen eingestellt oder Maßnahmen ergriffen werden, die zur zumindest überwiegenden Dissoziation von Sonden- Nukleinsäureoligomeren und Signal-Nukleinsäureoligomeren führen.
1 1 . Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 10 umfassend eine modifizierte Oberfläche wie in zumindest einem der Ansprüche 1 bis 10 definiert und eine effektive Menge an Signal- Nukleinsäureoligomeren wie in zumindest einem der Ansprüche 1 bis 10 definiert.
PCT/DE2010/075152 2009-12-07 2010-12-03 Kompetitionsassay zur detektion von nukleinsäureoligomer-hybridisierungsereignissen WO2011069501A1 (de)

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