WO2011063558A1

WO2011063558A1 - 木聚糖酶组合物及其制造方法

Info

Publication number: WO2011063558A1
Application number: PCT/CN2009/075103
Authority: WO
Inventors: 黄雅惠; 谢俊辉; 赖宣妤
Original assignee: 永丰馀造纸股份有限公司
Priority date: 2009-11-24
Filing date: 2009-11-24
Publication date: 2011-06-03
Also published as: EP2505642A4; CN102712913A; EP2505642A1; DK2505642T3; US20140212948A1; EP2505642B1; US20120214220A1; US8735118B2

Abstract

一种木聚糖酶组合物，以及该木聚糖酶组合物的制造方法，其中，该木聚糖酶组合物系包含一木聚糖酶及一稳定剂，且该木聚糖酶系厌气性真菌的木聚糖酶，该稳定剂系包含一多元醇，且以该木聚糖酶组合物的总重计，该多元醇的浓度为至少40重量%。

Description

木聚糖酶组合物及其制造方法

技术领域本发明系关于一种具增加稳定性的木聚糖酶组合物及其制造方法。背景技术酵素（或称酶）系一种蛋白质，其可作为一种生物催化剂，并可广泛应用于各种化学反应，以增进反应速率。酵素的失活会造成不希望的经济损失，盖因一旦酵素失去活性而丧失功能后，即无法执行原有的催化作用，使研究者或工厂经营者需要负担额外的费用，以增加酵素的使用量或购买新的酵素来替换，始能达到所欲的效率。因此，一种可避免酵素于储存期间或运输过程中，因环境因素（例如高温）而失去活性，或可提高酵素稳定性的方法或组合物，乃市场上所迫切需要的。

木聚糖酶（xylanase) 系糖水解酵素中分解半纤维素的主要酵素，其应用范围非常广泛，例如食品、动物饲料、纺织或造纸等。举例言之，木聚糖酶可用于处理鸡饲料，以分解饲料中的抗营养因子，从而促进饲料的可吸收性，以促进鸡的生长。此外，若将木聚糖酶加入至面团中，则可改进面团的机械强度，进而改善面粉制品的色泽及储存性。已有文献揭露一种增加好气性真菌的木聚糖酶酵素稳定性的方法，其系利用一种包含多元醇、盐类与杀菌成分的组合物，以提升酵素的储存性，此可参见文献： Fisk等人， 1992，采用试验设计改进木霉属的木糖醇的稳定和组合物的方法，有机化学研究， 47; 323-328 (Fisk et al. 1992. Development of A Method for the Stabilization and Formulation of Xylanase from Tri choderma Using Experimental Design. Studies in Organic Chemistry, 47: 323-328) , 该文献内容并于此处以供参考。但是，根据该文献，所提供的组合物的稳定效果（如稳定时间与适用温度）有限，于 48°C 下，在约 42 小时后，仅能使好气性木霉属 ( Trichoderma) 真菌的木聚糖酶的活性剩下约 80%的活性。此外，如酵素相关领域的人士所熟知，不同的酵素具有不同的性质，例如结构、耐热度、或最适储存条件等，且不同酵素与同一化合物或组合物的间的交互作用亦不相同。因此，文献已指出，对于不同酵素，同一种成分或组合物并无法提供相同的稳定效果，且多元醇未必具有稳定作用，此可参见文献： Asther等人， 1990, Increased thermal stability of B. licheni form i s alpha- amy lase in the presence of various additives. , 酶禾口微生物技术， 12: 902-905 (Asther et al. 1990. Increased thermal stability of B. licheni form i s alpha- amy lase in the presence of various additives. Enzyme and Microbial Technology. 12: 902-905)，该文献内容并于此处以供参考。就习知的木聚糖酶而言，于不同来源的木聚糖酶中，来自厌气性真菌 ( anaerobic fungi , 又称为瘤胃真菌 ( rumen fungi ) ) 的木聚糖酶系备受瞩目的，盖因厌气性真菌通常系生长于生存竞争压力高的瘤胃（如反刍动物与单胃草食性动物的消化道）中，故演化成可产生具高活性者，此可参见 Anthony爭 l 1994. Anaerobic fungi in herbivorous animals. Mycol. Res. 98: 129-152 (Anthony et al. 1994. Anaerobic fungi in herbivorous animals. Mycol. Res. 98: 129-152)。相较于一般木聚糖酶，厌气性真菌的木聚糖酶由于具有高酵素活性、高专一性及耐热性等优点，故其应用性更为广泛。因此，对于相关领域的人士而言，更需要一种可有效保存厌气性真菌的木聚糖酶，而使其不致于在储存过程中失去活性的方法。本发明即系针对厌气性真菌的木聚糖酶，提供一种增加酵素稳定性的组合物。本案发明人发现，利用包含特定成分及比例的多元醇的组合物，可达到大幅提升酵素储存性的功效。发明内容本发明的一目的在于提供一种具增加稳定性的木聚糖酶组合物，其系包含一木聚糖酶及一包含一多元醇的稳定剂。本发明的另一目的在于提供一种制造具增加稳定性的木聚糖酶组合物的方法，其系包含提供一木聚糖酶及一包含一多元醇的稳定剂，以及混合该木聚糖酶及该稳定剂，以形成该木聚糖酶组合物。本发明的第一目的在于提供一种制造具增加稳定性的木聚糖酶组合物的方法，包含：

提供一木聚糖酶；

提供一稳定剂，其系包含一多元醇；以及

混合该木聚糖酶及该稳定剂以形成一木聚糖酶组合物；其中，该木聚糖酶系厌气性真菌的木聚糖酶，且以该木聚糖酶组合物的总重计，该多元醇的浓度为至少 40重量％。本发明的第二目的在于提供一种木聚糖酶组合物，其系包含一木聚糖酶及一稳定剂，其中，该木聚糖酶系厌气性真菌的木聚糖酶，该稳定剂系包含一多元醇，且以该木聚糖酶组合物的总重计，该多元醇的浓度为至少 40重量％。本发明的详细技术及较佳实施方式，将描述于以下内容中，以供本发明所属领域具通常知识者据以明了本发明的特征。附图概述图 1 所示为木聚糖酶组合物中，含有不同浓度的不同多元醇的酵素稳定效果的条状图；以及图 2所示为于 50°C下，包含不同甘油浓度的木聚糖酶组合物的酵素稳定效果的曲线图。本发明的最佳实施方案除非文中有另外说明，于本说明书中（尤其是在后述专利申请范围中）所使用的「一」、「该」及类似用语应理解为包含单数及复数形式

于下文中，『酵素的稳定性』系定义为酵素对环境因子，尤其指温度的抗性或耐受性。一般而言，酵素稳定性的高低，可藉由在特定环境中，酵素活性的衰退速率而决定，若衰退速率愈慢，则酵素的稳定性愈 m。如上所述，木聚糖酶可应用于广泛的用途，例如食品、动物饲料、纺织或造纸等。就造纸的应用而言，已知于制造纸浆的过程中，若添加木聚糖酶于纸浆中，可有效降低磨浆动力，从而减少能量的损耗。此外，于纸浆漂白的过程中，通常须添加大量的含氯漂白剂，然而氯会导致高毒性的有机氯化物的生成，造成废液处理的问题。若在漂白过程前，先添加木聚糖酶以进行预处理，则可有效地减少含氯物质的使用量，有效减缓废液处理的问题。因此，若木聚糖酶可在高温下作用，且不具有纤维素分解的活性，则可增加处理纸浆的反应速率，且可避免纤维质纤维遭受破坏。此外，若木聚糖酶可专一性地水解半纤维素（即不水解纤维素）且耐热，则可更有效地改良造纸制程。鉴于厌气性真菌的木聚糖酶具有所欲的高专一性及耐热性，而有提高其稳定性的需求，故本发明提供一种木聚糖酶组合物，其包含一木聚糖酶及一稳定剂，其中，该木聚糖酶系厌气性真菌的木聚糖酶，例如 Neocal 1 imas tlx属、 Caecomyces属、或 Piromyces属、 Orpinomyces属、 Cyllamyces 属、 Ar eromyces 属等的真菌的木聚糖酶，较佳为 7^_OCa _fflas f属的真菌的木聚糖酶。于本发明的一较佳实施方式中，系使用来自 Neocallimastix frontalis的木聚糖酶来制备木聚糖酶组合物。此外，本发明组合物中的木聚糖酶可自天然木聚糖酶单离取得，或经由人工合成方法（例如基因工程或胜肽合成仪）获得。此外，针对所单离或合成的木聚糖酶，可利用分子生物技术进一步修饰其基因，以提升其活性、专一性及 /或稳定性。举例言之，当使用厌气性真菌 Neocallimastix ro^a s的木聚糖酶来制备本发明组合物时，可先对木聚糖酶基因进行去除锚固区（dockerin domain) 处理，再使其表现，以进一步提升木聚糖酶的稳定性与酵素活性。特定言之，可以如下方式去除木聚糖酶基因的锚固区：首先，利用聚合酶链锁反应（polymerase chain reaction, PCR ) 扩增 (amplify) Neocal 1 imas tix frontalis ¾ 木聚糖酶基因（约 1， 011 bp) ，再使用限制酶移除木聚糖酶基因的锚固区，并以连接酶加以接合；之后，以聚合酵素链锁反应扩增该经移除锚固区的木聚糖酶基因（约 729 bp) ，即可获得具高活性及稳定性的木聚糖酶的基因，此可参见中国台湾专利申请案公开第 200720435 号，该文献内容并于此处以供参考。本发明组合物的稳定剂系包含一多元醇。所谓『多元醇』系指任一具有二或多个羟基的化合物。举例言之，但不限于此，本发明组合物的多元醇可由一或多种 C₃至 C₁₂多元醇所组成，例如：丙二醇、甘油、赤藓糖（erythrose) 、山梨醇、葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、或乳糖等。较佳地，本发明组合物的多元醇系选自以下群组：甘油、山梨醇、蔗糖、及其组合。于本发明的木聚糖酶组合物中，以木聚糖酶组合物的总重计，多元醇的浓度为至少 40重量％，较佳为至少 50重量％，更佳为至少 60重量％，且最佳为至少 80重量％。于本发明的一实施例中，使用包含不同浓度的多元醇的木聚糖酶组合物来稳定木聚糖酶时，发现对于厌气性真菌的木聚糖酶而言，多元醇的稳定作用大致与其于组合物中的含量成正比，亦即，组合物中的多元醇含量愈高，所提供的稳定木聚糖酶的效果愈好。上述发现与既有文献的教示有极大的差异。举例言之，于： Fisk等人， 1992，采用试验设计改进木霉属的木糖醇的稳定和组合物的方法，有机化学研究， 47； 323-328 (Fisk et al. 1992. Development of A Method for the Stabilization and Formulation of Xy lanase from Trichoderma Using Experimental Design. Studies in Organic Che mis try, 47: 323-328)中，系教导利用多元醇来稳定好氧性木霉属 Trichoderma 真菌的木聚糖酶，其揭露组合物中的甘油含量为 40%时有最佳的稳定作用，而当甘油含量高于 40%时，所提供的稳定效果并不随着甘油含量的增加而增加，甚至有下降的趋势。换言之，根据先前技术的教导，多元醇的稳定作用并不与其含量成正比，且宜控制在不高于 40%。此外，亦有文献指出，多元醇对酵素的稳定作用与羟基数目有关，当羟基数目愈多时，稳定效果愈好，此可参见 Viswanathan 1995. Effects of polyols on heat inactivation of Aspergillus niger van Teighem inulinase. 应用微生物学通信； 21: 282-284 (Viswanathan et al. 1995. Effects of polyols on heat inactivation of Aspergillus niger van Teighem inul inase. Letters in Applied Microbiology, 21: 282-284)，该文献内容并于此处以供参考。然而，如下述实施例所示，相较于山梨醇（具六个羟基）及蔗糖（具八个羟基），甘油（具三个羟基）对于 / ^oca _fflas f ro^a s的木聚糖酶，可提供更佳的稳定作用。本发明的木聚糖酶组合物可另包含其它添加剂，只要该添加剂不会破坏木聚糖酶的活性且不会对组合物的稳定效果造成实质上不利的影响即可。于本发明的一实施方式中，除木聚糖酶与多元醇以外，另于木聚糖酶组合物中包含水，使该组合物呈一酵素液的形式（即，木聚糖酶溶于水中）。本发明的木聚糖酶组合物可应用于各种领域中，例如食品、动物饲料、纺织或造纸等。本发明亦提供一种制造具增加稳定性的木聚糖酶组合物的方法，其包含提供一木聚糖酶；提供一稳定剂，其系包含一多元醇；以及混合该木聚糖酶及该稳定剂，以形成一木聚糖酶组合物。其中，所涉及的木聚糖酶、稳定剂、多元醇与木聚糖酶组合物，均如上文中所描述者。本发明方法另可包含于以下的至少一者添加水：木聚糖酶、稳定剂及木聚糖酶组合物。特定言之，可使用水来调整本发明组合物中的成分的性质，而达成以下效果： 1) 可藉由混合木聚糖酶与水，使木聚糖酶呈一酵素液的形式，并控制木聚糖酶的活性单位； 2) 可混合稳定剂与水，以调整稳定剂中的多元醇的浓度；以及 3)可于木聚糖酶组合物中添加水，以作最终的调整。于本发明的一实施方式中，混合厌气性真菌 Neocallimastix a s的木聚糖酶与甘油，以制备一木聚糖酶组合物，且经由水分的使用来调整木聚糖酶的活性单位，并使甘油于组合物中的最终浓度为 90重量％。该组合物于 50°C下分别储存二周及八周，所含木聚糖酶仍可分别保有 97±4.8%及 59.6±4.7%的残留活性。因此，相较于先前技术，本发明木聚糖酶组合物，可于一般储存条件下（如常温下），甚或更严苛的环境中（如高温下），提供木聚糖酶更好的稳定效果，从而延长其储存期间。兹以下列具体实施方式以进一步例示说明本发明。其中该些实施方式仅提供作为说明，而非用以限制本发明的范畴。

[实施例 1] 制备木聚糖酶组合物

首先，配置包含不同浓度的甘油的木聚糖酶组合物，其系藉由添加甘油至一厌气性真菌

/"ro^a 's的木聚糖酶酵素液（木聚糖酶溶于水中，且活性约为 100, 000 活性单位（U) /毫升），并加以搅拌，使甘油的最终浓度，分别为 20重量％、 40重量％或 50重量％，以木聚糖酶组合物的总重计。

接着，再以相同方式及比例，配置包含 20重量％、 40重量％或 50重量％的山梨醇或蔗糖的木聚糖酶组合物。控制组（即包含 0 重量％的多元醇的木聚糖酶组合物）则系以水取代甘油、山梨醇及蔗糖来配置木聚糖酶组合物。测定组合物中的木聚糖酶的活性组合物中的木聚糖酶的活性系依下述原理测定：共同加热二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid, DNS) 溶液与经木聚糖酶水解所产生的还原糖后，可形成棕红色的氨基化合物，再利用比色法测量样品中的还原糖的含量，即可测得木聚糖酶的活性。详细的活性测定方法系根据 Georis的方法（此可参见 Georis 爭 . 1999. Sequence, overproduction and purification of the family 11 endo-beta-1, 4-xylanase encoded by the xy 11 gene of Streptomyces sp. S38. 基因； 237： 123-33. (Georis et al. 1999. Sequence, overproduction and purification of the family 11 endo-beta-1, 4-xylanase encoded by the xy 11 gene of Streptomyces sp. S38. Gene 237: 123-33. ) ) 。其中，取 90微升的 3重量％的木聚糖 (斯卑尔脱小麦木聚糖， oat spelts xylan, 溶解于 pH值为 8.0 的 25 毫摩尔浓度三轻甲基氨基甲焼 ( tris (hydroxymethyl) am inome thane 或 Tris) 缓冲液）作为酵素反应基质，并与 10微升的经适当调整浓度的上述木聚糖酶组合物均匀混合。于 60°C下，使混合物反应 5分钟后，再加入 125微升的二硝基水杨酸试剂，以终止反应，再于 98°C下反应 5分钟，以进行呈色反应。最后，以 540 纳米的波长测定吸光值，并计算还原糖的量，即测得组合物中的木聚糖酶的活性，其中， 1活性单位（U ) 系定义为每分钟每毫升释出 /水解 1微摩尔的还原糖所需的酵素量。测定木聚糖酶稳定性首先，于试验进行前，测定以上所配置的各种木聚糖酶组合物中的木聚糖酶的原始活性，并定义此原始活性数值为残留活性系 100%。接着，将各种木聚糖酶组合物置于 50°C的环境下达四周（即连续储存四星期）

四周过后，分别测定各种木聚糖酶组合物中的木聚糖酶活性，并计算出木聚糖酶的残留活性数值，其计算公式如下：

残留活性（Re s i dua l Ac t i v i ty ) % =经储存的木聚糖酶的活性数值 / 木聚糖酶的原始活性数值 X 100% 其中，若所测得木聚糖酶的残留活性愈高，则表示该木聚糖酶组合物的酵素稳定效果愈好。酵素稳定性的测试结果系如以下表 1及图 1所示。表 1

由图 1及表 1可知，在不添加稳定剂的组合物中，于 50°C下连续储存四星期后，木聚糖酶的残留活性为 0%，即木聚糖酶已完全失去活性。若于组合物中添加稳定剂，例如甘油、山梨醇或蔗糖等多元醇，则可明显提高木聚糖酶的残留活性，且其效果大致与多元醇的浓度成正比。此外，就多元醇而言，甘油对酵素的稳定性显现出最佳的提升效果，在 50°C下连续储存四星期后，包含 50重量％甘油的组合物系可使木聚糖酶的残留活性达 63. 7 ± 0. 9%。

[实施例 2 ] 首先，配置包含不同浓度的甘油的木聚糖酶组合物，其系藉由添加甘油至一厌气性真菌 WeocaJ 'fflas ^' /"ro ^a 's的木聚糖酶酵素液（木聚糖酶溶于水中，且活性约为 100， 000 活性单位 /毫升），并加以搅拌，使甘油的最终浓度，分别为 20重量％、 40重量％、 50重量％、 70重量％或 90重量％，以木聚糖酶组合物的总重计。控制组（即包含 0重量％的多元醇的木聚糖酶组合物）则系以水取代甘油来配置木聚糖酶组合物。接着，再以与实施例 1 相同的方法，测定以上所制得的各种组合物中的木聚糖酶的活性及稳定性。其中，将各种木聚糖酶组合物置于 50°C 的环境下达八周（即连续储存八星期），且每二星期取样一次，以测定各组合物中的木聚糖酶的活性，并计算其残留活性。酵素稳定性的测试结果系如以下表 2及图 2所示。表 2

70 101±5.4 81.1±6.3 73.7±5.2 58.4±2.6

90 97±4.8 76.8±3 73.8±5.3 59.6±4.7 由图 2及表 2可知，若不添加甘油于木聚糖酶组合物中，则在 50°C 下连续储存一星期后，木聚糖酶的残留活性仅剩约 1%; 若于木聚糖酶组合物中添加甘油，则可较久地维持木聚糖酶的活性。其中，在 50°C下连续储存八星期后，于包含不同浓度的甘油的木聚糖酶组合物中，其酵素残留活性由低至高依序为 20重量％: 0.2±0%； 40重量％: 20.7±0.6%； 50重量％_: 34.3 ±1.0%; 70重量％_: 58.4 + 2.6%；及 90重量％_: 59.6 + 4.7%

此外，自图 1、图 2、表 1及表 2可看出，随着多元醇浓度增加，木聚糖酶的残留活性数值愈高，此现象说明木聚糖酶组合物稳定木聚糖酶的效果大致与多元醇的浓度成正比。而当甘油浓度高于 70重量％以上时，此正比的关系则趋于和缓。实施例 1 及实施例 2证实，本发明的组合物可提供厌气性真菌的木聚糖酶优异的稳定性，因而可延长木聚糖酶的储存期间。上述实施例仅系用以例示说明本发明的原理及功效，而非用于限制本发明。任何熟于此项技艺的人士均可在不违背本发明的技术原理及精神的情况下，对上述实施例进行修改及变化。因此，本发明的权利保护范围应如后述的申请专利范围所列者。

Claims

权利要求

1 . 一种制造具增加稳定性的木聚糖酶组合物的方法，包含：

提供一木聚糖酶；

提供一稳定剂，其系包含一多元醇；以及

混合该木聚糖酶及该稳定剂以形成一木聚糖酶组合物；其中，该木聚糖酶系厌气性真菌的木聚糖酶，且以该木聚糖酶组合物的总重计，该多元醇的浓度为至少 40重量％。

2. 如权利要求 1 的方法，其中该木聚糖酶系 Neocallin s tix 的木聚糖酶。

3. 如权利要求 2 的方法，其中该木聚糖酶系 Neocallimas tix ro ^aJ s的木聚糖酶。

4. 如权利要求 1 的方法，其中该多元醇系由一或多种 C₃至 C₁₂多元醇所组成。

5. 如权利要求 1 的方法，其中该多元醇系选自以下群组：甘油、山梨醇、蔗糖、及其组合。

6. 如权利要求 5的方法，其中该多元醇系甘油。

7. 如权利要求 1 的方法，其中以该木聚糖酶组合物的总重计，该多元醇的浓度为至少 50重量％。

8. 如权利要求 7的方法，其中以该木聚糖酶组合物的总重计，该多元醇的浓度为至少 60重量％。

9. 如权利要求 8的方法，其中以该木聚糖酶组合物的总重计，该多元醇的浓度为至少 80重量％。

10. 一种木聚糖酶组合物，其系包含一木聚糖酶及一稳定剂，其中，该木聚糖酶系厌气性真菌的木聚糖酶，该稳定剂系包含一多元醇，且以该木聚糖酶组合物的总重计，该多元醇的浓度为至少 40重量％。

1 1 . 如权利要求 10 的组合物，其中该木聚糖酶系 Neocallimas tix 属的木聚糖酶。

12. 如权利要求 1 1 的组合物，其中该木聚糖酶系 Neocallimas tix fron talis的木聚糖酶。

13. 如权利要求 10的组合物，其中该多元醇系由一或多种 C₃至 C₁₂ 多元醇所组成。

14. 如权利要求 10 的组合物其中该多元醇系选自以下群组：甘油、山梨醇、蔗糖、及其组合。

15. 如权利要求 14的组合物，其中该多元醇系甘油。

16. 如权利要求 10的组合物，其中以该木聚糖酶组合物的总重计，该多元醇的浓度为至少 50重量％。

17. 如权利要求 16的组合物，其中以该木聚糖酶组合物的总重计，该多元醇的浓度为至少 60重量％。

18. 如权利要求 17的组合物，其中以该木聚糖酶组合物的总重计，该多元醇的浓度为至少 80重量％。