WO2011061615A1 - Complexes polysaccharide / bmp solubles a ph physiologique - Google Patents

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Rémi SOULA
Olivier Soula
Gérard Soula
Richard Charvet
David Duracher
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Adocia
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Definitions

  • the present invention relates to the field of the formulation of Bone Morphogenetic Proteins, BMP-7 and BMP-2.
  • Bone Morphogenetic Proteins are growth factors involved in the mechanisms of formation of bone and cartilage. BMPs also referred to as Osteogenic Proteins (OPs) were initially characterized by Urist in 1965 (Urist MR Science 1965; 150,893). These proteins isolated from cortical bone have the ability to induce bone formation in a large number of animals (Urist MR Science 1965, 150, 893).
  • BMPs are expressed as propeptides which, after post-translational processing, have a length of between 104 and 139 residues. They have a great homology of sequences between them and have similar three-dimensional structures. In particular, they have 6 cysteine residues involved in intramolecular disulfide bonds forming a "cysteine knot" (Scheufler C. 2004 J. Mol Biol 1999, 287, 103, Schlunegger MP, J. Mol Biol 1993, 231, 445). Some of them have a 7th cysteine also involved in an intermolecular disulfide bridge at the origin of dimer formation (Scheufler C. 2004 J. Mol Biol 1999: 287: 103).
  • the BMPs In their active form, the BMPs assemble into homodimers or heterodimers as described by Israel et al. (Israel DI, Growth Factors, 1996, 13 (3-4), 291). Dimeric BMPs interact with BMPR transmembrane receptors (Mundy et al., Growth Factors, 2004, 22 (4), 233). This recognition is at the origin of a cascade of intracellular signaling involving Smad proteins in particular resulting in the activation or repression of target genes.
  • the recombinant human BMP-2 dibotermin alfa according to the international nonproprietary name, is formulated in the products marketed under the name of InFUSE® in the United States and InductOs® in Europe.
  • This product is prescribed in the fusion of the lumbar vertebrae and bone regeneration of the tibia for so-called non-union fractures.
  • InFUSE® for fusion of the lumbar vertebrae, the surgical procedure consists, first of all, in soaking a sponge of collagen with a solution of rhBMP-2, then place the sponge in a hollow cage, LT Cage, previously implanted between the vertebrae.
  • BMP-7 eptotermin alpha according to the international nonproprietary name, plays a direct and indirect role in the differentiation of mesenchymal cells causing their differentiation into osteoblasts (Cheng H., J. Bone and Joint Surgery, 2003, 85A, 1544). -1552).
  • human recombinant BMP-7 is the basis of two products: OP-1 Implant for open tibia fractures and OP-1 Putty for lumbar vertebral fusion.
  • OP-1 Implant consists of a powder containing rhBMP-7 and collagen to be taken up in 0.9% saline solution. The paste obtained is then applied to the fracture during a surgical procedure.
  • OP-1 Putty comes in the form of two powders: one containing rhBMP-7 and collagen, the other carboxymethylcellulose (CMC).
  • CMC carboxymethylcellulose
  • the paste thus obtained is applied to the site to be treated.
  • BMP-7 products have received limited approval from the FDA since they have the status of a humanitarian product. The major reasons for this limited approval are a slightly lower performance than autograft as the standard gold standard and a high production of antibodies against BMP-7.
  • BMP-7 plays an important role in the growth and repair of cartilage.
  • Animal studies demonstrate that ⁇ -1 allows cartilage repair among the various cartilage lesion patterns, in addition to cartilage lesions, osteoarthritis lesions, and degenerative lesions of intervertebral disks (Chubinskaya, S. et al., Int. .Orthop 2007, 31 (6), 773-781.).
  • BMP-7 is a morphogen essential to the conversion of mesenchymal cells into epithelial cells during kidney development. This property has found a potential therapeutic application for the repair of kidneys damaged by chronic kidney fibrosis (Zeisberg, M. et al., J Biol Chem 2005, 280 (9), 8094-8100.), (Sugimoto H. et al. Faseb 2007, 21, 256-264).
  • liver regeneration Korean, K. et al., Gut 2007, 56, 706-714; Gessner, OA et al. Journal of gastroenterology and hepatology 2008, 23, 1024-1035
  • cornea Saika S. et al., Laboratory Investigation 2005, 85, 474-486
  • myocardial infarction Zeisberg EM et al., Nature Medicine 2007,13, No. 8, 952-961
  • chronic obstructive pulmonary disease Myllârniemi M.
  • BMP-2 As regards BMP-2, the dissolution of lyophilizates of BMP-2 and the stability of the injectable formulations have already been mentioned in application PCT / EP2008 / 059832. To date, the number of systemic applications of BMP-2 described in the literature is limited but some have been mentioned such as cardiac regeneration (Bone Morphogenetic Proteins: From Local to Systemic Therapeutics, Eds S. Vukicevic and Sampath, 2008, Birkhauser, p 317-337).
  • Another solution proposed for the low solubility of BMP-7 at neutral pH described in US2007 / 0015701 is to covalently graft one or more polyethylene glycol chains on BMP-7 (Zalipsky, Samuel et al. al., US2007 / 0015701 A1). This solution is also not satisfactory insofar as BMP-7 is chemically modified, which can lead to significant changes in its biological activity compared to the natural protein.
  • these complexes have the advantage of being stable under physiological conditions, but also vis-à-vis a significant dilution in serum.
  • polysaccharides also have the property of being lyoprotective and allow to maintain the integrity of BMP-2 and BMP-7 avoiding aggregation phenomena during freeze-drying processes.
  • the present invention relates to a polysaccharide / BMP complex, the BMP being selected from the group consisting of BMP-2 and BMP-7, soluble at physiological pH, characterized in that the mass ratio polysaccharide / BMP is less than 15, the polysaccharide being chosen from the group of polysaccharides comprising carboxyl functional groups, at least one of which is substituted by at least one hydrophobic radical, denoted by Ah:
  • said hydrophobic radical Ah being a residue of a hydrophobic compound chosen from hydrophobic alcohols or acids comprising a linear, branched or cyclic alkyl chain comprising at least 6 carbon atoms, said hydrophobic radical Ah being linked to a linking arm R by a G function resulting from the coupling between at least one reactive function of said hydrophobic compound and a reactive function of the precursor of the linking arm R '.
  • linker R being bound to the polysaccharide by a link F resulting from the coupling between a reactive function of the precursor of the linker arm R 'and a carboxyl function of the anionic polysaccharide, R being an at least divalent radical consisting of a chain comprising between 1 and 15 carbons, optionally branched and / or unsaturated, optionally comprising one or more heteroatoms, such as O, N and / or S, and resulting from a precursor R 'having at least two reactive functions, at least one being an amine function and the other identical or different being chosen from the group consisting of alcohol, acid or amine functions.
  • F being an amide function
  • G being either an amide, ester or carbamate function
  • the carboxyl functions of the unsubstituted anionic polysaccharide being in the form of a cationic carboxylate, preferably alkaline, such as Na + or K +.
  • polysaccharide comprising carboxyl functional groups being amphiphilic at neutral pH
  • BMP being selected from the group consisting of human recombinant BMP-2 and BMP-7 and homologues thereof.
  • the BMP is selected from the group consisting of human recombinant BMP-2 and homologues thereof.
  • the BMP is selected from the group consisting of human recombinant BMP-7 and homologues thereof.
  • the mass ratio polysaccharide / BMP is less than 10.
  • the mass ratio polysaccharide / BMP is less than 5.
  • the mass ratio polysaccharide / BMP is less than 3.
  • the polysaccharides comprising carboxyl functional groups are synthetic polysaccharides obtained from neutral polysaccharides, on which at least 15 carboxyl functional groups per 100 saccharide units have been grafted, of general formula I.
  • the natural polysaccharides being chosen from the group of polysaccharides whose bonds between the glycoside monomers comprise (1,6) bonds, L being a bond resulting from the coupling between a precursor of the linker Q and a function -OH of the polysaccharide and being either an ester, carbamate or ether function,
  • i represents the mole fraction of the L-Q substituents per saccharide unit of the polysaccharide
  • R 1 and R 2 which are identical or different, are chosen from the group consisting of -H, linear or branched C radical alkyl
  • R'i and R ' 2 identical or different are selected from the group consisting of -H and a linear or branched C1 to C3 alkyl group.
  • i is between 0.1 and 3.
  • i is between 0.2 and 1.5.
  • the polysaccharide is selected from the group consisting of polysaccharides whose bonds between the glycoside monomers comprise (1,6) bonds. In one embodiment, the polysaccharide is selected from the group consisting of dextran and pullulan.
  • the polysaccharide selected from the group consisting of polysaccharides whose bonds between the glycoside monomers comprise (1,6) bonds is dextran.
  • the polysaccharide is chosen from the group consisting of polysaccharides whose bonds between the glycoside monomers comprise (1,6) bonds and (1,4) bonds.
  • the polysaccharide whose bonds between the glycoside monomers comprise (1,6) bonds and (1,4) bonds is a pullulan.
  • the polysaccharide according to the invention is characterized in that the L-Q radical is chosen from the group consisting of the following radicals, L having the meaning given above:
  • the polysaccharide according to the invention is characterized in that the radical L-Q is chosen from the group consisting of the following radicals, L having the meaning given above:
  • the polysaccharide according to the invention is characterized in that the L-Q radical is chosen from the group consisting of the following radicals, L having the meaning given above:
  • polysaccharide is chosen from the polysaccharides of formula IV:
  • - Ah being a residue of a hydrophobic compound selected from alcohols, or hydrophobic acids comprising a linear, branched or cyclic alkyl chain comprising at least 6 carbon atoms, product of the coupling between a hydroxyl or acidic function of the hydrophobic compound and a function reactive precursor R 'of R,
  • G being either an ester function, a carbamate function or an amide function
  • R being an at least divalent radical consisting of a chain comprising between 1 and 15 carbons, optionally branched and / or unsaturated, optionally comprising one or more heteroatoms, such as O, N or / and S, resulting from a precursor R ' having at least two reactive functions, at least one being an amino function and the other identical or different being selected from the group consisting of alcohol, acid or amino functions,
  • n 2 representing the mole fraction of the carboxyl functions of the polysaccharide substituted with FRG-Ah and is between 0.01 and 0.7
  • the polysaccharide carboxyls are cationic, alkaline carboxylates, preferably as Na + or K + .
  • n 2 is between 0.02 and 0.5.
  • n 2 is between 0.05 and 0.3.
  • n 2 is between 0.1 and 0.2.
  • n x is equal to 1 and the precursor of the group R, R 'comprises two reactive functions.
  • F is an amide function
  • G is an ester function
  • R ' is an amino acid
  • Ah is a hydrophobic alcohol residue.
  • F is an amide function
  • G is a carbamate function
  • R ' is a diamine
  • Ah is a hydrophobic alcohol residue.
  • F is an amide function
  • G is an amide function
  • R ' is a diamine
  • Ah is a hydrophobic acid residue.
  • the precursor of the group R, R 'comprising two reactive functions is characterized in that it is chosen from amino acids.
  • the amino acids are chosen from alpha amino acids.
  • the alpha amino acids are chosen from alpha natural amino acids.
  • the natural alpha amino acids are chosen from leucine, alanine, isoleucine, glycine, phenylalanine, valine, proline and aspartic acid.
  • the precursor of the group R, R 'comprising two reactive functions is characterized in that it is chosen from diamines.
  • the diamines are chosen from the group consisting of ethylene diamine and lysine and its derivatives.
  • the precursor of the group R, R ' is characterized in that it is chosen from alcoholamines.
  • the alcoholamines are selected from the group consisting of ethanolamine, 2-amino-propanol, isopropanolamine, 3- amino-1,2-propanediol, diethanolamine, diisopropanolamine, tromethamine (Tris) and 2- (2-aminoethoxy) ethanol.
  • the alcohol amines are selected from the group consisting of reduced amino acids.
  • the reduced amino acids are chosen from the group consisting of alaninol, ie valinol, leucinol, isoleucinol, prolinol and phenylalaninol.
  • the alcoholamines are chosen from the group consisting of the charged amino acids.
  • the charged amino acids are selected from the group consisting of serine and threonine.
  • ni is equal to 2 and the precursor of the group R, R 'comprises three reactive functions.
  • the precursor comprising three reactive functions R ' is selected from amino acids carrying two amino functions.
  • Amino acids carrying two amino functional groups are chosen from the group consisting of lysine, 5-hydroxylysine, 2,4-diaminobutyric acid, 2,3-diaminopropionic acid, ornithine and p-aminopropane. -aminophénylalanine.
  • the precursor comprising at least three reactive functions R ' is chosen from amino acids carrying an alcohol function.
  • amino acids carrying an alcohol function are chosen from the group consisting of serine, threonine and tyrosine, homoserine and alpha-methylserine.
  • the precursor comprising three reactive functions R ' is chosen from alcoholamines.
  • the alcohols are chosen from the group consisting of tromethamine (Tris), ie 3-amino-1,2-propanediol, triethanolamine, hydroxymethyltyrosine, tyrosinol, serinol (2-amino-1,2- propanediol) and threoninol.
  • Tris tromethamine
  • ie 3-amino-1,2-propanediol triethanolamine
  • hydroxymethyltyrosine tyrosinol
  • serinol (2-amino-1,2- propanediol)
  • threoninol threoninol.
  • the precursor comprising three reactive functions R ' is chosen from triamines.
  • the triamines are selected from the group consisting of 2- (aminomethyl) -2-methyl-1,3-propanediamine and tris- (2-aminoethyl) amine.
  • the hydrophobic alcohol is chosen from alcohols consisting of an unsaturated or saturated, branched or unbranched alkyl chain comprising from 6 to 18 carbons.
  • the hydrophobic alcohol is chosen from alcohols consisting of an unsaturated or saturated, branched or unbranched alkyl chain comprising more than 18 carbons.
  • the hydrophobic alcohol is octanol.
  • the hydrophobic alcohol is dodecanol.
  • the hydrophobic alcohol is 2-ethylbutanol.
  • the fatty alcohol is selected from meristyl, cetyl, stearyl, cetearyl, butyl, oleyl and lanolin.
  • the hydrophobic alcohol is selected from cholesterol derivatives.
  • the cholesterol derivative is cholesterol
  • the hydrophobic alcohol is selected from menthol derivatives.
  • the hydrophobic alcohol is menthol in its racemic form.
  • the hydrophobic alcohol is the D-isomer of menthol.
  • the hydrophobic alcohol is the L-isomer of menthol.
  • the hydrophobic alcohol is chosen from tocopherols.
  • the tocopherol is alpha tocopherol.
  • alpha tocopherol is the racemic alpha tocopherol.
  • the tocopherol is the D isomer of alpha tocopherol.
  • the tocopherol is the L isomer of alpha tocopherol.
  • the hydrophobic alcohol is chosen from alcohols bearing an aryl group.
  • the aryl group-bearing alcohol is chosen from benzyl alcohol and phenethyl alcohol.
  • the hydrophobic alcohol is chosen from unsaturated fatty alcohols in the group consisting of geraniol, ⁇ -citronellol and farnesol.
  • the hydrophobic alcohol is 3,7-dimethyl-1-octanol.
  • the hydrophobic acid is selected from fatty acids.
  • the fatty acids are chosen from the group consisting of acids consisting of an unsaturated or saturated, branched or unbranched alkyl chain comprising from 6 to 50 carbons.
  • the fatty acids are chosen from the group consisting of linear fatty acids.
  • the linear fatty acids are selected from the group consisting of caproic acid, oenanthic acid, caprylic acid, capric acid, nonanoic acid, decanoic acid, undecanoic acid, dodecanoic acid, palmitic acid, stearic acid, arachidic acid, behenic acid, tricosanoic acid, lignoceric acid, heptacosanoic acid, octacosanoic acid and melissic acid.
  • the fatty acids are selected from the group consisting of unsaturated fatty acids.
  • the unsaturated fatty acids are chosen from the group consisting of myristoleic acid, palmitoleic acid, oleic acid, elaidic acid, linoleic acid, alpha-alpha acid and the like. linoleic acid, arachidonic acid, eicosapentaenoid acid, erucic acid and docosahexaenoic acid.
  • the fatty acids are chosen from the group consisting of bile acids and their derivatives.
  • the bile acids and their derivatives are selected from the group consisting of cholic acid, dehydrocholic acid, deoxycholic acid and chenodeoxycholic acid.
  • the invention relates to a polysaccharide / BMP-2 complex selected from the group consisting of the following complexes:
  • the invention relates to a polysaccharide / BMP-7 complex selected from the group consisting of the following complexes:
  • the invention also relates to a therapeutic composition characterized in that it comprises an amphiphilic polysaccharide-BMP-7 complex according to the invention.
  • the invention also relates to a therapeutic composition characterized in that it comprises an amphiphilic polysaccharide-BMP-2 complex according to the invention.
  • therapeutic composition is meant a composition that can be used in human or veterinary medicine.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is a composition with local application which may be in the form of a solute, a gel, a cream, a lyophilisate, a powder or paste.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is a composition for systemic application for intravenous or subcutaneous administration which may be in the form of a solute.
  • composition according to the invention when in the form of a paste or a cement, it is for example obtained from products such as carboxymethylcelluloses (CMC), tricalcium phosphate and collagen.
  • CMC carboxymethylcelluloses
  • tricalcium phosphate tricalcium phosphate
  • excipients can be used in this invention to adjust the parameters of the formulation as a buffer to adjust the pH, an agent to adjust the isotonicity, preservatives such as methyl parahydroxybenzoate, parahydroxybenzoate propyl, m-cresol, or phenol or an antioxidant such as L-lysine hydrochloride.
  • the therapeutic composition is characterized in that it allows an administration of about 10 mg / ml of BMP-7 or BMP-2.
  • the therapeutic composition is characterized in that it allows an administration of about 5 mg / ml of BMP-7 or BMP-2.
  • the therapeutic composition is characterized in that it allows an administration of about 2 mg / ml of BMP-7 or BMP-2.
  • the therapeutic composition is characterized in that it allows an administration of about 1 mg / ml of BMP-7 or BMP-2. According to the invention, the therapeutic composition is characterized in that it allows an administration of about 0.2 mg / ml of BMP-7 or BMP-2.
  • the present invention also relates to the use of an amphiphilic polysaccharide-BMP-7 or amphiphilic polysaccharide-BMP-2 complex according to the invention for the preparation of a therapeutic composition intended to induce bone formation. vivo.
  • the present invention also relates to the use of an amphiphilic polysaccharide-BMP-7 or amphiphilic polysaccharide-BMP-2 complex according to the invention for the preparation of a therapeutic composition intended to induce the regeneration of cartilage.
  • the present invention also relates to the use of an amphiphilic polysaccharide-BMP-7 complex according to the invention for the preparation of a therapeutic composition intended to induce the regeneration of the kidney.
  • the present invention also relates to the use of an amphiphilic polysaccharide-BMP-7 complex according to the invention for the preparation of a therapeutic composition intended to induce the regeneration of the liver.
  • the present invention also relates to the use of an amphiphilic polysaccharide-BMP-7 complex according to the invention for the preparation of a therapeutic composition intended to induce the regeneration of the cornea.
  • the present invention also relates to the use of an amphiphilic polysaccharide-BMP-7 complex according to the invention for the preparation of a therapeutic composition intended to treat cerebrovascular accidents.
  • the present invention also relates to the use of an amphiphilic polysaccharide-BMP-7 complex according to the invention for the preparation of a therapeutic composition for treating myocardial infarction.
  • the present invention also relates to the use of an amphiphilic polysaccharide-BMP-7 complex according to the invention for the preparation of a therapeutic composition intended to treat peripheral arterial diseases.
  • the present invention also relates to the use of an amphiphilic polysaccharide-BMP-7 complex according to the invention for the preparation of a therapeutic composition intended to treat chronic obstructive pulmonary diseases.
  • the present invention also relates to the use of an amphiphilic polysaccharide-BMP-7 complex according to the invention for the preparation of a therapeutic composition for treating critical ischemia of the lower limbs.
  • It also relates to a therapeutic treatment method for human or veterinary use, characterized in that it consists in administering to the treatment site a therapeutic composition comprising the amphiphilic polysaccharide-BMP-7 or amphiphilic polysaccharide-BMP-2 complex according to US Pat. 'invention.
  • It also relates to a therapeutic treatment method for human or veterinary use characterized in that it consists in administering intravenously a therapeutic composition comprising the amphiphilic polysaccharide-BMP-7 complex according to the invention.
  • It also relates to a therapeutic treatment method for human or veterinary use characterized in that it consists in administering subcutaneously a therapeutic composition comprising the amphiphilic polysaccharide-BMP-7 complex according to the invention.
  • compositions according to the invention are either in liquid form, in aqueous solution, or in powder form, or in the form of lyophilisate, implant or film. They further comprise conventional pharmaceutical excipients well known to those skilled in the art.
  • compositions may advantageously comprise, in addition, excipients for formulating them in the form of gel, sponge, solution for injection, oral solution, lyoc, etc.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition according to the invention as described above, characterized in that it is administrable in stent form, film or "coating" of implantable biomaterials, implant.
  • the invention relates to a pharmaceutical liquid formulation containing BMP-7 at Img / mL at physiological pH, the composition of which is as follows:
  • the octanol glycinate, para-toluenesulfonic acid salt is obtained according to the process described in the patent (Kenji, M et al., US4826818).
  • the degree of substitution of the hydroxyl functions by methylcarboxylate functions is 1.04 per saccharide unit.
  • the sodium dextranmethylcarboxylate solution is passed through Purolite resin (anionic) to obtain the acid dextran-methylcarboxylic acid which is then lyophilized for 18 hours.
  • the octanol glycinate solution is added and the medium maintained at 10 ° C. for 45 minutes. The medium is then heated to 50 ° C. At 30 ° C, an aqueous solution of imidazole at 600 g / L and 40 mL of water are added. After stirring for 1 hour at 50 ° C., the solution obtained is ultrafiltered on a 10 kD PES membrane against 6 volumes of 0.9% NaCl solution, 3 volumes of 0.01 N sodium hydroxide solution, 8 volumes of 0.9% NaCl solution and then 3 volumes of NaCl solution. volumes of water. The concentration of Polymer solution is determined by dry extract. A fraction solution was lyophilized and analyzed by NMR in D 2 X H 0 to determine the rate of acid functions converted octanol glycinate amide.
  • the molar fraction of acids modified with octanol glycinate per saccharide unit is 0.21.
  • the octanol glycinate, para-toluenesulfonic acid salt is obtained according to the process described in the patent (Kenji, M et al., US4826818).
  • the molar fraction of acids modified with octanol glycinate per saccharide unit is 0.16.
  • Dodecanol glycinate, paratoluenesulfonic acid salt is obtained according to the process described in the patent (Kenji, M et al., US4826818).
  • Example 2 By a method similar to that described in Example 1 from a dextran with a weight average molar mass of 10 kDa, a sodium dextranemethylcarboxylate modified with dodecanol glycinate is obtained.
  • Example 2 By a method similar to that described in Example 1 from a dextran of weight average molar mass of 10 kDa, a sodium dextranmethylcarboxylate modified with isohexanol leucinate is obtained.
  • the molar fraction of the acids modified with isohexanol leucinate per saccharide unit is 0.18.
  • Octanol phenylalaninate, para-toluenesulfonic acid salt is obtained according to the process described in the patent (Kenji, M et al., US4826818).
  • Octanol glycinate, para-toluenesulfonic acid salt is obtained according to the process described in the patent (Kenji, M et al., US4826818).
  • Sodium dextransuccinate is obtained from a dextran of average molar mass by weight of 10 kDa (Pharmacosmos) according to the method described in the article by Sanchez Chaves et al. (Sanchez Charves, Manuel et al., Polymer 1998, 39 (13), 2751-2757).
  • the rate of acid functions per glycoside unit is 1.4 by NMR tt in NaOD / D 2 0.
  • a sodium dextransuccinate modified with octanol glycinate is obtained.
  • the molar fraction of acids modified with dodecanol glycinate per saccharide unit is 0.10.
  • Octanol valinate, para-toluenesulfonic acid salt is obtained according to the process described in the patent (Kenji, M et al., US4826818).
  • the molar fraction of acids modified with octanol valinate per saccharide unit is 0.08.
  • the dihexanol aspartate, para-toluenesulfonic acid salt is obtained according to the process described in the patent (Kenji, M et al., US4826818).
  • a method similar to that described in Example 1 from a 40 kDa weight average molecular weight dextran a sodium dextranmethylcarboxyate modified with dihexanol aspartate is obtained.
  • the molar fraction of the acids modified with dihexanol aspartate per saccharide unit is 0.075.
  • Dodecanol glycinate a para-toluenesulfonic acid salt, is obtained according to the process described in the patent (Kenji, M et al., US4826818).
  • Example 2 By a method similar to that described in Example 1 from a 40 kDa weight average molecular weight dextran, a sodium dextranemethylcarboxyate modified with dodecanol glycinate is obtained.
  • the molar fraction of acids modified with dodecanol glycinate per saccharide unit is 0.1.
  • Octanol eucinate, para-toluenesulfonic acid salt is obtained according to the process described in the patent (Kenji, M et al., US4826818).
  • the cholesterol leucinate, para-toluenesulfonic acid salt is obtained according to the process described in the patent (Kenji, M et al., US4826818).
  • the molar fraction of the acids modified with cholesterol leucinate per saccharide unit is 0.03.
  • Octanol phenylalaninate, para-toluenesulfonic acid salt is obtained according to the process described in the patent (Kenji, M et al., US4826818).
  • the molar fraction of acids modified with octanol phenylalaninate per saccharide unit is 0.2.
  • the molar fraction of the acids modified with phenylalaninate of 3,7-dimethyl-1-octanol per saccharide unit is 0.1.
  • the 2- (2-amino-ethoxy) ethyl octanoate, para-toluenesulfonic acid salt is obtained according to the process described in the patent (Kenji, M et al., US4826818).
  • the molar fraction of the acids modified with 2- (2-amino-ethoxy) ethyl octanoate per saccharide unit is 0.2.
  • N-octanoyl-phenylalanine is obtained according to the method described in the publication (Pal, A et al., Tetrahedron 2007, 63, 7334-7348) from the ethyl ester of L-phenylalanine, sodium salt.
  • N- [2 - ((2-octanoylamino-3-phenyl) propanoylamino)] ethanamine, hydrochloric acid salt is obtained according to the methods described in the publications (Paul, R et al., J. Org Chem., 1962, 27, 2094-2099 and Dale, DJ et al., Org., Process Res., Dev., 2002, 6, 767-772) from N-octanoyl-phenylalanine and ethylenediamine ( Roth).
  • the molar fraction of the acids modified with N- [2- (2-octanoylamino-3-phenyl) propanoylamino)] ethanamine per saccharide unit is 0.1.
  • N- (2-aminoethyl) octanamide is obtained according to the process described in US2387201 (1945) from ethylenediamine (Roth) and caprylic acid (Sigma).
  • N- (2-aminoethyl) dodecanamide is obtained according to the process described in US2387201 (1945) from ethylenediamine (Roth) and dodecanoic acid (Sigma).
  • Didocecanol aspartate, para-toluenesulfonic acid salt is obtained according to the process described in the patent (Kenji, M et al., US4826818).
  • the molar fraction of acids modified with didodecanol aspartate per saccharide unit is 0.05.
  • N- (2-aminoethyl) dodecanamide is obtained according to the method described in US2387201 (1945).
  • the degree of substitution of the hydroxyl functions by N-methylcarboxylate carbamate functions is 1.08 per saccharide unit.
  • the solution of sodium N-methylcarboxylate dextran carbamate is passed over a Purolite resin (anionic) to obtain the N-methylcarboxylic acid dextran carbamate which is then lyophilized for 18 hours.
  • N-methylcarboxylic acid dextran carbamate 5 g are solubilized in DMF at 50 g / l and then cooled to 0 ° C. 2.22 g (22 mmol) of NMM and 2.38 g (22 mmol) of EtOCOCI are then added. After 10 min of reaction, 0.45 g (1.8 mmol) of N- (2-aminoethyl) dodecanamide is added and the medium maintained at 10 ° C. for 45 minutes. The medium is then heated to 50 ° C. At 30 ° C, an aqueous solution of imidazole at 600 g / L and 25 mL of water are added.
  • the solution obtained is ultrafiltered on a 10 kD PES membrane against 0.1N NaOH, 0.9% NaCl and water.
  • concentration of the polymer solution is determined by dry extract.
  • a fraction of solution is lyophilized and analyzed by 1H NMR in D 2 O to determine the rate of acidic functions converted to N- (2-aminoethyl) dodecanamide amide.
  • the molar fraction of the acids modified with N- (2-aminoethyl) dodecanamide per saccharide unit is 0.1.
  • Isohexanol phenylalaninate, paratoluenesulfonic acid salt is obtained according to the process described in the patent (Kenji, M et al., US4826818).
  • the molar fraction of the acids modified with benzyl phenylalaninate per saccharide unit is 0.45.
  • Example 24 Counterexample 1, synthesis of dextranemethylcarboxylate unmodified by a hydrophobic group
  • the sodium dextranemethylcarboxylate is obtained as described in the first part of Example 1 from a 40 kDa weight average molar mass dextran.
  • the molar fraction of the acids modified with a hydrophobic group is zero.
  • Dodecanol alaninate, para-toluenesulfonic acid salt is obtained according to the process described in the patent (Kenji, M et al., US4826818).
  • a solution of sodium dextranmethylcarboxylate obtained as described in Example 1 is passed on a Purolite resin (anionic) to obtain the acid dextranmethylcarboxylic which is then freeze-dried for 18 hours.
  • the medium is then maintained at 4 ° C. for 15 minutes.
  • the medium is then heated to 30 ° C.
  • a solution of imidazole (3.2 g in 9.3 ml of water) is added to the reaction medium.
  • the polymer solution is ultrafiltered on a 10 kD PES membrane against 10 volumes of 0.9% NaCl solution and then 5 volumes of water.
  • the concentration of the polymer solution is determined by dry extract.
  • a fraction of solution is lyophilized and analyzed by 1H NMR in D20 to determine the level of acid functional groups modified with dodecanol alaninate.
  • Example 26 Affinity of BMP-7 for a Polymer by Co-electrophoresis
  • the gel is transferred to a PVDF membrane placed in a capillary transfer apparatus for 2 hours at room temperature (Apelex system).
  • the membrane is saturated with PBST containing 5% BSA for 45 minutes at room temperature and then incubated with BMP-7 primary antibodies (overnight at 4 ° C) and finally incubated with secondary antibodies, rabbit anti goat HRP ( 1 hour at room temperature).
  • the revelation is by reaction of the HRP on the Opti-4CIM. Revelation is stopped when the staining is sufficient since the reaction product absorbs in the visible.
  • BMP-7 When BMP-7 forms a complex with the polymer, the complex is detected as a single spot 0.7 cm from the deposit (migration to the anode). When BMP-7 is alone or does not form a complex with the polymer, it is detected at the location of the deposit and thus has not migrated.
  • BMP-7 Bone Morphogenetic Protein 7
  • the polymers described in this application are used in this test.
  • the test consists in using a solution of BMP-7 at acidic pH, for example a 10 mM lactate buffer at pH 3.
  • BMP-7 is at an initial concentration of 2.47 mg / ml.
  • 2.02 ml of this BMP-7 solution are mixed with 2.7 ml of a 18.5 mg / ml polymer solution containing 18 mM phosphate buffer at pH 7.4.
  • After mixing the final pH is adjusted to physiological pH by adding a mixture of IN sodium hydroxide and water to obtain a final formulation volume of 5 mL.
  • the formulations are analyzed by visual observation, turbidity and dynamic scattering of light to detect the presence of aggregates.
  • BMP-7 Bone Morphogenetic Protein 7
  • Counterexample 2 leucine-modified sodium dextranemethylcarboxylate
  • the test consists in using a solution of BMP-7 at acidic pH, for example a 10 mM lactate buffer at pH 3.
  • BMP-7 is at an initial concentration of 2.47 mg / ml.
  • 2.02 mL of this BMP-7 solution are mixed with 2.7 mL of a 7.3 mg / mL solution of polymer containing 18 mM phosphate buffer pH 7.4.
  • After mixing the final pH is adjusted to physiological pH by adding a mixture of IN sodium hydroxide and water to obtain a final formulation volume of 5 mL.
  • the formulations are analyzed by visual observation, turbidity and dynamic scattering of light to detect the presence of aggregates.
  • a solubilization test of BMP-7 was developed in order to demonstrate the solubilizing power of various polymers at physiological pH and for polymer / BMP-7 mass ratios of 1.
  • the test consists of using a solution of BMP-7 at acidic pH, for example a 10 mM lactate buffer at pH 3.
  • BMP-7 is at an initial concentration of 2.47 mg / ml.
  • 2.02 ml of this BMP-7 solution are mixed with 2.8 ml of a 1.8 mg / ml polymer solution containing 18 mM phosphate buffer at pH 7.4.
  • After mixing the final pH is adjusted to physiological pH by adding a mixture of IN sodium hydroxide and water to obtain a final formulation volume of 5 mL.
  • the formulations are analyzed by visual observation, turbidity and dynamic scattering of light to detect the presence of aggregates. The results show that Polymer 1 and Polymer 5 make it possible to completely solubilize BMP-7 at physiological pH for a weight ratio polymer / BMP-7 of 1.
  • BMP-2 Bone Morphogenetic Protein 2
  • sucrose Sigma
  • glycine Sigma
  • glutamic acid Sigma
  • sodium chloride Riedel-de-Ha ⁇ n
  • polysorbate 80 Fluka
  • the test consists of introducing exactly 14.5 mg of lyophilizate containing 0.62 mg of BMP-2 into a 1 mL vial. The lyophilizate is then taken up in 410 ⁇ l of a solution to reach a final BMP-2 concentration of 1.5 mg / ml at physiological pH. The visual appearance of the solution is noted after 15 minutes of stirring at reduced speed on a roller.
  • BMP-2 Bone Morphogenetic Protein 2
  • sucrose Sigma
  • glycine Sigma
  • glutamic acid Sigma
  • sodium chloride Riedel-de-Ha ⁇ n
  • polysorbate 80 Fluka
  • polymers according to the invention are used in this test.
  • a polymer described in patent application FR0702316 is also implemented in this test, sodium dextranethyl ethyl carboxylate modified with ethyl phenylalaninate.
  • the test consists of introducing exactly 4 mg of lyophilizate containing 0.168 mg of BMP-2.
  • the lyophilizate is then taken up in 210 ⁇ l of an aqueous solution to reach a final BMP-2 concentration of 0.8 mg / ml at physiological pH, the final concentration of polymer being 5 mg / ml.
  • Example 27 the formulation obtained in Example 27 with the polymer 5 was freeze-dried. This lyophilisate is then reconstituted with water for injection at the initial concentration. This solution is then analyzed and compared to the initial solution by dynamic diffusion of the light. The analysis shows that the two solutions are identical and therefore lyophilization did not induce aggregation of the protein.
  • the objective of this test is to solubilize at physiological pH BMP-7 at a concentration greater than 1 mg / ml.
  • a volume of 5.5 ml of a solution of BMP-7 at 2 mg / ml and acidic pH is mixed with 5.5 ml of a solution of polymer 2 at a concentration of 6.9 mg / ml. to obtain a solution of BMP-7 at 1 mg / mL and 3.45 mg / mL of polymer 1.
  • This solution is then lyophilized by a conventional freeze-drying process.
  • the solution is then reconstituted with a 10 mM phosphate buffer solution and adjusted to physiological pH by adding an IN sodium hydroxide solution in order to obtain a formulation where the concentration of BMP-7 is 5 mg / ml and the concentration in polymer is 17.3 mg / mL.
  • Example 34 Stability of the BMP-7 formulation at dilution.
  • This test is intended to simulate the injection of a formulation in a biological medium such as for example in the case of administration to humans or animals by a subcutaneous or intravenous route. Indeed, after injection the formulation is diluted with a biological fluid having a pH of 7.4.
  • a formulation of BMP-7 in acidic pH (pH 3) at 1 mg / ml is injected into a PBS buffer at pH 7.4 with a dilution factor of 10. During the injection a turbidity of the solution is observed resulting from the precipitation of the protein. This aggregation of BMP-7 in PBS is confirmed by a dynamic light scattering measurement.
  • Example 4.2 if a formulation as described in Example 4.2 with one of the polymers 1 to 11 is used at a comparable concentration of BMP-7 (ie 1 mg / ml) no turbidity is observed.
  • BMP-7 ie 1 mg / ml
  • the formulation B P-7 / polymer therefore has the advantage of being soluble and liquid at physiological pH but also of being able to withstand dilution at physiological pH by preventing aggregation phenomena which can be particularly advantageous in the context of the development of a pharmaceutical product for injection.
  • the posterolateral lumbar fusion model (arthrodesis at the L5-L6 level) was performed on rabbits according to the experimental protocol described in patent WO 2010/058106.
  • the rabbits were divided into two groups of 4 rabbits each, the first group was implanted with two collagen sponges containing BMP-7 alone (650 ⁇ g), Implant 1, the second group was implanted with two collagen sponges containing a BMP-7 complex with a polymer (650 ⁇ g BMP-7), Implant 2.
  • the implant 1 was prepared by depositing 800 ⁇ l of a solution of BMP-7 in a 5% lactose buffer, pH 3.5 at a concentration of 0.81 mg / ml, ie one dose of BMP-7. 7 of 650 ⁇ g in a crosslinked type-I collagen sponge with a volume of 2250 ⁇ L.
  • the implant 2 was obtained after successive impregnations of a cross-linked type I collagen sponge with a volume of 2250 ⁇ l per 400 ⁇ l of a solution containing BMP-7 at 1.63 mg / ml. mL, or 650 ⁇ g of BMP-7, Polymer 1 at 20 mg / mL, or 8 mg of Polymer 1 of 0.23 M sodium phosphate, or 92 pmol, and 0.62 M sodium bicarbonate, 248 pmol, then 400 ⁇ l of a solution containing 0.38 M calcium chloride, ie 153 pmol. Each solution is left for 15 minutes in contact with the sponge after addition. After these times of impregnation, the sponge is ready for implantation.
  • Serum collections were performed before implantation (day 0) and days 10, 32, 39 and 68 after surgery on all animals.
  • the samples were stored at -80 ° C.
  • the concentration of rabbit IgG antibodies directed against rhBMP-7 in rabbits collected was measured by ELISA according to the protocol described in the article (Mire-Sluis, AR et al., J. Immunol.Methods 2004 , 289 (1-2), 1-16.) - rhBMP-7 at 2 ⁇ g / mL in Phosphate Buffer Saline (PBS) is adsorbed on the test plate at 4 ° C overnight.
  • PBS Phosphate Buffer Saline
  • the plate is washed twice with PBS, saturated with a solution of PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA), washed 3 times with PBS containing 0.06% Tween20.
  • the rabbits will be diluted 1/40 in PBS containing 0.1% BSA and 0.06% Tween20.
  • the positive control is an anti-rhBMP-7 antibody solution of isotype IgG produced in the rabbit (Peprotech supplier reference 500-P198).
  • the negative control is a mixture of 20 will be healthy and untreated rabbits.
  • the detection antibody is a rabbit anti-IgG antisera produced in the donkey coupled to alkaline phosphatase (cliniscience supplier reference 6440-05).
  • the antibody detection threshold of this test is 160 ng / mL with 5% false positives.
  • the intraplate and interplate variabilities are less than 5%.
  • the results show a large increase in the anti-rhBMP-7 IgG level measured for two rabbits (rabbits 12 and 14), a moderate transient increase for 1 rabbit (rabbit 11) and an absence of response for a rabbit ( rabbit 13) for the composition Cl.
  • the anti-rhBMP-7 IgG level observed with the composition C2 is below the detection threshold at all times, see table below and FIGS. 1 and 2.
  • Table 1 Concentration of anti-rhBMP-7 IgG measured in the rabbit sera at several times after implantation of two collagen sponges imbibed with the composition C1 or the composition C2,

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Abstract

L'invention concerne un complexe polysaccharide/BMP, la BMP étant choisi dans le groupe constitué par la BMP-2 et la BMP-7, soluble à pH physiologique, caractérisé en ce que le ratio massique polysaccharide/BMP est inférieur à 15, le polysaccharide étant choisi dans le groupe des polysaccharides comportant des groupes fonctionnels carboxyles dont un au moins est substitué par au moins un radical hydrophobe, noté Ah : - ledit radical hydrophobe Ah étant un reste d'un composé hydrophobe choisi parmi les alcool ou acide hydrophobes comportant une chaîne alkyle linéaire, ramifiée ou cyclique comportant au moins 6 atomes de carbone, ledit radical hydrophobe Ah étant lié à un bras de liaison R par une fonction G résultant du couplage entre au moins une fonction réactive dudit composé hydrophobe et une fonction réactive du précurseur du bras de liaison R'. ledit bras de liaison R étant lié au polysaccharide par une liaison F résultant du couplage entre une fonction réactive du précurseur du bras de liaison R' et une fonction carboxyle du polysaccharide anionique, R étant un radical au moins divalent constitué d'une chaîne comprenant entre 1 et 15 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée, éventuellement comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et résultant d'un précurseur R' ayant au moins deux fonctions réactives, l'une au moins étant une fonction aminé et les autres identiques ou différentes étant choisies dans le groupe constitué par les fonctions alcool, acide ou aminé. F étant une fonction amide, - G étant soit une fonction amide, ester ou carbamate, - les fonctions carboxyles du polysaccharide anionique non substituées étant sous forme de carboxylate de cation, alcalin de préférence comme Na+ ou K+. ledit polysaccharide comportant des groupes fonctionnels carboxyles étant amphiphile à pH neutre, la BMP étant choisie dans le groupe constitué par les BMP-2 et BMP-7 recombinantes humaines et leurs homologues. Elle concerne également l'utilisation de ces complexes pour la préparation de formulations pharmceutiques.

Description

Complexes polysacc aride / BMP solubles à pH physiologique
[0001] La présente invention concerne le domaine de la formulation des Bone Morphogenetic Proteins, BMP-7 et BMP-2.
[0002] Les Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) sont des facteurs de croissance impliqués dans les mécanismes de formation de l'os et du cartilage. Les BMPs appelées également Osteogenic Proteins (OPs) ont été initialement caractérisées par Urist en 1965 (Urist MR. Science 1965; 150, 893). Ces protéines isolées à partir d'os cortical ont la capacité d'induire la formation d'os chez un grand nombre d'animaux (Urist MR. Science 1965; 150, 893).
[0003] Les BMPs sont exprimées sous forme de propeptides qui, après maturation post-traductionnelle, ont une longueur comprise entre 104 et 139 résidus. Elles possèdent une grande homologie de séquences entre elles et ont des structures tridimensionnelles similaires. En particulier, elles possèdent 6 résidus cystéine impliqués dans des ponts disulfure intramoléculaires formant un « cysteine knot » (Scheufler C. 2004 J. Mol. Biol. 1999; 287, 103 ; Schlunegger MP,J. Mol. Biol. 1993; 231, 445). Certaines d'entre elles possèdent une 7e cystéine impliquée également dans un pont disulfure intermoléculaire à l'origine de la formation du dimère (Scheufler C. 2004 J. Mol. Biol. 1999; 287 : 103.).
[0004] Sous leur forme active, les BMPs s'assemblent en homodimères, voire en hétérodimères comme cela a été décrit par Israël et al. (Israël DI, Growth Factors. 1996; 13(3-4), 291). Les BMPs dimériques interagissent avec les récepteurs transmembranaires de type BMPR (Mundy et al. Growth Factors, 2004, 22 (4), 233). Cette reconnaissance est à l'origine d'une cascade de signalisation intracellulaire impliquant notamment les protéines Smad aboutissant ainsi à l'activation ou à la répression des gènes cibles.
[0005] Certaines BMPs recombinantes humaines et notamment la rhBMP-2 et la rhBMP-7 ont clairement montré une capacité à induire la formation d'os in vivo chez l'homme et ont été approuvées pour certaines applications médicales.
[0006] Ainsi, la BMP-2 recombinante humaine, dibotermine alfa selon la dénomination commune internationale, est formulée dans les produits commercialisés sous le nom de InFUSE® aux Etats-Unis et de InductOs® en Europe. Ce produit est prescrit dans la fusion des vertèbres lombaires et la régénération osseuse du tibia pour les fractures dites non-union. Dans le cas d'InFUSE® pour la fusion des vertèbres lombaires, l'intervention chirurgicale consiste tout d'abord, à imbiber une éponge de collagène avec une solution de rhBMP-2, puis à placer l'éponge dans une cage creuse, LT Cage, préalablement implantée entre les vertèbres.
[0007] La BMP-7, eptotermine alpha selon la dénomination commune internationale, joue un rôle direct et indirect sur la différenciation des cellules mésenchymateuses provoquant leur différenciation en ostéoblastes (Cheng H., J. Bone and Joint Surgery, 2003, 85A, 1544-1552). Ainsi, la BMP-7 recombinante humaine constitue la base de deux produits : OP-1 Implant pour les fractures ouvertes du tibia et OP-1 Putty pour la fusion des vertèbres lombaires. OP-1 Implant se compose d'une poudre contenant de la rhBMP-7 et du collagène à reprendre dans une solution saline à 0,9%. La pâte obtenue est ensuite appliquée au niveau de la fracture lors d'une intervention chirurgicale. OP-1 Putty se présente sous la forme de deux poudres : l'une contenant la rhBMP-7 et du collagène, l'autre de la carboxyméthylcellulose (CMC). Au cours d'une intervention chirurgicale, la CMC est reconstituée avec une solution saline 0,9% et mélangée avec la rhBMP-7 et le collagène. La pâte ainsi obtenue est appliquée sur le site à traiter. Néanmoins, ces produits à base de BMP-7 n'ont fait l'objet que d'une approbation limitée de la part de la FDA puisqu'ils ont le statut de produit humanitaire. Les raisons majeures de cette approbation limitée sont une performance légèrement inférieure à l'autogreffe considérée comme le traitement de référence (Gold Standard) et une forte production d'anticorps dirigés contre la BMP-7.
[0008] Outre le rôle de la BMP-7 dans la croissance osseuse, il a été démontré que la BMP-7 joue un rôle important dans la croissance et la réparation du cartilage. Les études animales démontrent que ΟΡ-1 permet une réparation cartilagineuse parmi les différents modèles de lésions de ce cartilage, outre les lésions cartilagineuses, les lésions d'arthrose et les lésions de dégénérescence des disques intervertébraux (Chubinskaya, S. et al., Int.Orthop. 2007, 31 (6), 773-781.).
[0009] Enfin, un autre rôle majeur avéré de la BMP-7 est relatif à la croissance rénale puisque la BMP-7 est un morphogène essentiel à la conversion des cellules mésenchymateuses en cellules épithéliales au cours du développement des reins. Cette propriété a trouvé une application thérapeutique potentielle pour la réparation des reins endommagés par la fibrose chronique du rein (Zeisberg, M. et al., J Biol Chem 2005, 280 (9), 8094-8100.), (Sugimoto H . et al. Faseb 2007, 21, 256- 264).
[00010] De nombreuses autres applications ont été décrites dans la littérature comme son utilisation pour la régénération du foie (Kinoshita, K. et al. Gut 2007, 56, 706-714 ; Gessner, O.A. et al. Journal of gastroenterology and hepatology 2008, 23, 1024-1035), de la cornée (Saika S. et al. Laboratory Investigation 2005,85, 474-486), et également pour traiter les accidents vasculaires cérébraux (Chang C-F et al,, Stroke 2003,34, 558-564), l'infarctus du myocarde (Zeisberg E. M. et al. Nature médecine 2007,13,N°8, 952-961), les maladies pulmonaires obstructives chroniques (Myllârniemi M. et al. Am J respir Crit Care Med 2008, 177, 321-329), les lésions de la moelle épinière (De Rivero Vaccari, J. P. et al. Neuroscience letters 2009, 465, 226-229), la maladie de Parkinson (Harvey B.K. et al. Brain Research 2004, 1022, 88-95), ainsi que les ischémies critiques des membres inférieurs (Moreno-Miralles I. et al. Curr Opi Hematol 2009, 16, 195- 201 ; David L. et al. Cytokines & Growth Factors reviews 2009, 20, 203-212).
[00011] Cependant, pour toutes ces applications, il est nécessaire de résoudre le problème de la faible solubilité de la BMP-7 à pH physiologique qui conduit à l'agrégation de cette protéine. La faible solubilité de la BMP-7 dans les conditions physiologiques et la formation d'agrégats rendent problématique son emploi pour les applications locales dans la mesure où la biodisponibilité de la protéine active est réduite. Cette faible solubilité de la BMP-7 dans les conditions physiologiques est encore plus problématique pour les applications systémiques de la BMP-7, que ce soit par voie intraveineuse ou sous-cutanée, puisque la précipitation de la BMP- 7 au site d'injection peut conduire à des effets secondaires. De plus, il est connu que la formation d'agrégats de protéines conduit à une réaction immunologique impliquant la formation d'anticorps.
[00012] Dans le cas de la BMP-7, l'apparition de ces réactions immunologiques sont dépendantes du site d'administration de la formulation. Ainsi les réactions immunologiques sont observées lors de l'utilisation de la BMP-7 pour la fusion postero-latérale des vertèbres lombaires, l'injection intra-articulaire et l'injection sous-cutanée. En revanche, aucune réaction n'est observée lorsque la BMP-7 est injectée par voie intraveineuse ou dans le disque intervertébral (OP-1 Immunogenicity Report, FDA StrykerBiotech Briefing for 31 March 2009 Advisory Committee Meeting). Ces réactions immunologiques lors de l'utilisation de la BMP-7 pour des applications de régénération sont décrites dans l'article de Hwang C-J et al. (J Neurosurg Spine 13 :484-493,2010 and J Neurosurg 10 :443-451,2009). Les patients ainsi traités avec la BMP-7 et développant des anticorps anti-BMP-7 pouvant neutraliser l'activité biologique présentent le risque de voir l'efficacité du traitement diminuer. De plus ces anticorps peuvent potentiellement réagir également avec la BMP-7 endogène et neutraliser son activité, augmentant ainsi le risque d'effets secondaires.
[00013] S'agissant de la BMP-2, la mise en solution des lyophilisats de BMP-2 et la stabilité des formulations injectables ont déjà été évoquées dans la demande PCT/EP2008/059832. A ce jour, le nombre d'applications systémiques de la BMP-2 décrites dans la littérature est limité mais certaines ont été mentionnées telles que la régénération cardiaque (Bone Morphogenetic Proteins : From local to systemic therapeutics, Eds S. Vukicevic and . Sampath, 2008, Birkhauser, p 317-337).
[00014] De plus, il apparaît nécessaire d'obtenir des formulations efficaces contenant une quantité minimale de BMP-2 et BMP-7, ceci afin d'éviter les effets secondaires générés par des concentrations importantes de cette protéine et également en raison du prix de cette protéine.
[00015] Une des solutions pour répondre à la problématique de la faible solubilité de la BMP-7 à pH neutre développée par la société Centocor consiste à modifier la structure primaire de la BMP-7 (Swencki-Underwood, B. ef al., Protein Expr.Purlf. 2008, 57 (2), 312-319.). Cependant, cette solution n'est pas satisfaisante puisqu'elle conduit à une potentielle toxicité de la nouvelle protéine modifiée et qu'elle induit une modification des interactions entre la BMP-7 et ses récepteurs pouvant conduire à une modification de l'activité biologique.
[00016] Une autre solution proposée à la faible solubilité de la BMP-7 à pH neutre décrite dans la demande de brevet US2007/0015701 consiste à greffer de manière covalente une ou plusieurs chaînes de polyéthylèneglycol sur la BMP-7 (Zalipsky, Samuel et al., US2007/0015701 A1 ). Cette solution n'est pas non plus satisfaisante dans la mesure où la BMP-7 est modifiée chimiquement ce qui peut conduire à des modifications significatives de son activité biologique par rapport à la protéine naturelle.
[00017] La demanderesse avait déjà décrit une solution dans la demande PCT/EP2008/059832 permettant de résoudre les problèmes similaires de solubilité à pH physiologique avec la BMP-2 sans avoir recours à des modifications chimiques de la BMP-2. Cette solution consistait à employer un polysaccharide amphiphile comprenant un groupe hydrophobe choisi dans le groupe constitué par les acides aminés hydrophobes d'origine naturelle, choisis dans le groupe constitué par le tryptophane, la tyrosine, la phénylalanine, la leucine ou l'isoleucine ou leurs dérivés alcools, esters, décarboxylés ou amides. [00018] De façon surprenante, la demanderesse a mis en évidence que certains polysaccharides outre le fait qu'ils forment des complexes avec la BMP-2 et la BMP- 7, permettent de solubiliser ces facteurs de croissance à pH physiologique avec un faible ratio massique polysaccharide/BMP.
[00019] Ils permettent en outre de réduire l'immunogénéicité des formulations de BMP-7.
[00020] De plus, ces complexes présentent l'avantage d'être stables dans les conditions physiologiques, mais également vis-à-vis d'une dilution importante dans du sérum.
[00021] Ces polysaccharides possèdent en outre la propriété d'être lyoprotecteurs et permettent de maintenir l'intégrité de la BMP-2 et de la BMP-7 en évitant les phénomènes d'agrégation lors des processus de lyophilisation.
[00022] La présente invention concerne un complexe polysaccharide/BMP, la BMP étant choisi dans le groupe constitué par la BMP-2 et la BMP-7, soluble à pH physiologique, caractérisé en ce que le ratio massique polysaccharide/BMP est inférieur à 15, le polysaccharide étant choisi dans le groupe des polysaccharides comportant des groupes fonctionnels carboxyles dont un au moins est substitué par au moins un radical hydrophobe, noté Ah :
ledit radical hydrophobe Ah étant un reste d'un composé hydrophobe choisi parmi les alcools ou acides hydrophobes comportant une chaîne alkyle linéaire, ramifiée ou cyclique comportant au moins 6 atomes de carbone, ledit radical hydrophobe Ah étant lié à un bras de liaison R par une fonction G résultant du couplage entre au moins une fonction réactive dudit composé hydrophobe et une fonction réactive du précurseur du bras de liaison R'.
ledit bras de liaison R étant lié au polysaccharide par une liaison F résultant du couplage entre une fonction réactive du précurseur du bras de liaison R' et une fonction carboxyle du polysaccharide anionique, R étant un radical au moins divalent constitué d'une chaîne comprenant entre 1 et 15 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée, éventuellement comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et résultant d'un précurseur R' ayant au moins deux fonctions réactives, l'une au moins étant une fonction aminé et les autres identiques ou différentes étant choisies dans le groupe constitué par les fonctions alcool, acide ou aminé. F étant une fonction amide,
G étant soit une fonction amide, ester ou carbamate,
les fonctions carboxyles du polysaccharide anionique non substituées étant sous forme de carboxylate de cation, alcalin de préférence comme Na+ ou K+.
ledit polysaccharide comportant des groupes fonctionnels carboxyles étant amphiphile à pH neutre,
la BMP étant choisie dans le groupe constitué par les BMP-2 et BMP-7 recombinantes humaines et leurs homologues.
[00023] Dans un mode de réalisation, la BMP est choisie dans le groupe constitué par les BMP-2 recombinantes humaines et leurs homologues.
[00024] Dans un mode de réalisation, la BMP est choisie dans le groupe constitué par les BMP-7 recombinantes humaines et leurs homologues.
[00025] Dans un mode de réalisation, le ratio massique polysaccharide/BMP est inférieur à 10.
[00026] Dans un mode de réalisation, le ratio massique polysaccharide/BMP est inférieur à 5.
[00027] Dans un mode de réalisation, le ratio massique polysaccharide/BMP est inférieur à 3.
[00028] Dans un mode de réalisation, les polysaccharides comportant des groupes fonctionnels carboxyles sont des polysaccharides synthétiques obtenus à partir de polysaccharides neutres, sur lesquels au moins 15 groupes fonctionnels carboxyles pour 100 unités saccharidiques ont été greffés, de formule générale I.
Polysaccharide
Q
I
- les polysaccharides naturels étant choisis dans le groupe des polysaccharides dont les liaisons entre les monomères glycosidiques comprennent des liaisons (1,6), - L étant une liaison résultant du couplage entre un précurseur du bras de liaison Q et une fonction -OH du polysaccharide et étant soit une fonction ester, carbamate ou éther,
- i représente la fraction molaire des substituants L-Q par unité saccharidique du polysaccharide
- Q étant choisi parmi les radicaux de formule générale II :
Figure imgf000009_0001
dans laquelle :
1 < a+b+c < 6 et,
0 < a < 3,
0 < b < 3
0 < c≤ 3
Ri et R2, identiques ou différents sont choisis dans le groupe constitué par -H, alkyle linéaire ou ramifié en C radical
Figure imgf000009_0002
de formule III dans laquelle
1 < d < 3 et
R'i et R'2 identiques ou différents sont choisis dans le groupe constitué par -H et un groupe alkyle linéaire ou ramifié en Cl à C3.
[00029] Dans un mode de réalisation a+b+c < 5
[00030] Dans un mode de réalisation a+b+c < 4
[00031] Dans un mode de réalisation, i est compris entre 0,1 et 3.
[00032] Dans un mode de réalisation, i est compris entre 0,2 et 1,5.
[00033] Dans un mode de réalisation le polysaccharide est choisi dans le groupe constitué par les polysaccharides dont les liaisons entre les monomères glycosidiques comprennent des liaisons (1,6). [00034] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est choisi dans le groupe constitué par le dextrane et le pullulane.
[00035] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide choisi dans le groupe constitué par les polysaccharides dont les liaisons entre les monomères glycosidiques comprennent des liaisons (1,6) est le dextrane.
[00036] Dans un mode de réalisation le polysaccharide est choisi dans le groupe constitué par les polysaccharides dont les liaisons entre les monomères glycosidiques comprennent des liaisons (1,6) et des liaisons (1,4).
[00037] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide dont les liaisons entre les monomères glycosidiques comprennent des liaisons (1,6) et des liaisons (1,4) est un pullulane.
[00038] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est caractérisé en ce que le radical L-Q est choisi dans le groupe constitué par les radicaux suivants, L ayant la signification donnée ci-dessus :
Figure imgf000010_0001
[00039] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est caractérisé en ce que le radical L-Q est choisi dans le groupe constitué par les radicaux suivants, L ayant la signification donnée ci-dessus :
Figure imgf000010_0002
[00040] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est caractérisé en ce que le radical L-Q est choisi dans le groupe constitué par les radicaux suivants, L ayant la signification donnée ci-dessus :
Figure imgf000010_0003
[00041] Dans un mode de réalisation le polysaccharide est choisi parmi les polysaccharides de formule IV:
Figure imgf000011_0001
- Ah étant un reste d'un composé hydrophobe choisi parmi les alcools, ou acides hydrophobes comportant une chaîne alkyle linéaire, ramifiée ou cyclique comportant au moins 6 atomes de carbone, produit du couplage entre une fonction hydroxyle ou acide du composé hydrophobe et une fonction réactive du précurseur R' de R,
F étant une fonction amide,
G étant soit une fonction ester, soit une fonction carbamate, soit une fonction amide,
R étant un radical au moins divalent constitué d'une chaîne comprenant entre 1 et 15 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée, éventuellement comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, résultant d'un précurseur R' ayant au moins deux fonctions réactives, l'une au moins étant une fonction aminé et les autres identiques ou différentes étant choisies dans le groupe constitué par les fonctions alcool, acide ou aminé,
ni étant égal à 1 ou 2,
n2 représentant la fraction molaire des fonctions carboxyles du polysaccharide substituées par F-R-G-Ah et est compris entre 0,01 et 0,7, et,
lorsque la fonction carboxyle du polysaccharide n'est pas substituée par F-R-G-Ah, alors le ou les groupes fonctionnels carboxyles du polysaccharide sont des carboxylates de cation, alcalin de préférence comme Na+ ou K+.
[00042] Dans un mode de réalisation n2 est compris entre 0,02 et 0, 5.
[00043] Dans un mode de réalisation n2 est compris entre 0,05 et 0,3.
[00044] Dans un mode de réalisation n2 est compris entre 0,1 et 0,2.
[00045] Dans un mode de réalisation nx est égal à 1 et le précurseur du groupement R, R' comprend deux fonctions réactives.
[00046] Dans un mode de réalisation, F est une fonction amide, G est une fonction ester, R' est un acide aminé et Ah est un reste d'alcool hydrophobe.
[00047] Dans un mode de réalisation, F est une fonction amide, G est une fonction carbamate, R' est une diamine et Ah est un reste d'alcool hydrophobe.
[00048] Dans un mode de réalisation, F est une fonction amide, G est une fonction amide, R' est une diamine et Ah est un reste d'acide hydrophobe.
[00049] Dans un mode de réalisation, le précurseur du groupement R, R' comprenant deux fonctions réactives est caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les acides aminés.
[00050] Dans un mode de réalisation, les acides aminés sont choisis parmi les alpha acides aminés.
[00051] Dans un mode de réalisation, les alpha acides aminés sont choisis parmi les alpha acides aminés naturels.
[00052] Dans un mode de réalisation, les alpha acides aminés naturels sont choisis parmi la leucine, l'alanine, l'isoleucine, la glycine, la phénylalanine, la valine, la proline, l'acide aspartique.
[00053] Dans un mode de réalisation, le précurseur du groupement R, R' comprenant deux fonctions réactives est caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les diamines.
[00054] Dans un mode de réalisation, les diamines sont choisies dans le groupe constitué par l'éthylène diamine et la lysine et ses dérivés.
[00055] Dans un mode de réalisation, le précurseur du groupement R, R' est caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les alcoolamines.
[00056] Dans un mode de réalisation, les alcoolamines sont choisies dans le groupe constitué par l'éthanolamine, l'amino-2-propanol, l'isopropanolamine, le 3- amino-l,2-propanediol, la diéthanolamine, la diisopropanolamine, la trométhamine (Tris) et le 2-(2-aminoéthoxy)éthanol.
[00057] Dans un mode de réalisation, les alcoolamines sont choisies dans le groupe constitué par les acides aminés réduits.
[00058] Dans un mode de réalisation les acides aminés réduits sont choisis dans le groupe constitué par l'alaninol, ie valinol, le leucinol, l'isoleucinol, le prolinol et le phénylalaninol.
[00059] Dans un mode de réalisation, les alcoolamines sont choisies dans le groupe constitué par les acides aminés chargés.
[00060] Dans un mode de réalisation, les acides aminés chargés sont choisis dans le groupe constitué par la sérine et la thréonine.
[00061] Dans un mode de réalisation ni est égal à 2 et le précurseur du groupement R, R' comprend trois fonctions réactives.
[00062] Dans un mode de réalisation, le précurseur comprenant trois fonctions réactives R' est choisi parmi les acides aminés porteurs de deux fonctions aminés.
[00063] Les acides aminés porteurs de deux fonctions aminés sont choisis dans le groupe constitué par la lysine, la 5-hydroxylysine, l'acide 2,4-diaminobutyrique, l'acide 2,3-diaminopropionique, l'ornithine et la p-aminophénylalanine.
[00064] Dans un mode de réalisation, le précurseur comprenant au moins trois fonctions réactives R' est choisi parmi les acides aminés porteurs d'une fonction alcool.
[00065] Les acides aminés porteurs d'une fonction alcool sont choisis dans le groupe constitué par la serine, la thréonine et la tyrosine, l'homosérine et l'alpha- méthylsérine.
[00066] Dans un mode de réalisation, le précurseur comprenant trois fonctions réactives R' est choisi parmi les alcoolamines.
[00067] Les alcoolamines sont choisies dans le groupe constitué par la trométhamine (Tris), ie 3-amino-l,2-propanediol, la triéthanolamine, l'hydroxyméthyltyrosine, le tyrosinol, le sérinol (2-amino-l,2-propanediol) et le thréoninol.
[00068] Dans un mode de réalisation, le précurseur comprenant trois fonctions réactives R' est choisi parmi les triamines. [00069] Dans un mode de réalisation les triamines sont choisies dans le groupe constitué par la 2-(aminométhyl)-2-méthyl-l,3-propanediamine et la tris-(2- aminoéthyl)amine. [00070] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les alcools constitués d'une chaîne alkyle insaturée ou saturée, ramifiée ou non ramifiée, comprenant de 6 à 18 carbones.
[00071] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les alcools constitués d'une chaîne alkyle insaturée ou saturée, ramifiée ou non ramifiée, comprenant plus de 18 carbones.
[00072] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est l'octanol.
[00073] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est le dodécanol.
[00074] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est le 2-éthylbutanol.
[00075] Dans un mode de réalisation, l'alcool gras est choisi parmi le méristyl, le cétyl, le stéaryl, le cétéaryl, le butyl, l'oléyl, la lanoline.
[00076] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les dérivés du cholestérol.
[00077] Dans un mode de réalisation, le dérivé du cholestérol est le cholestérol.
[00078] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les dérivés du menthol.
[00079] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est le menthol sous sa forme racémique.
[00080] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est l'isomère D du menthol.
[00081] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est l'isomère L du menthol.
[00082] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les tocophérols.
[00083] Dans un mode de réalisation, le tocophérol est l'alpha tocophérol.
[00084] Dans un mode de réalisation, l'alpha tocophérol est le racémique de l'alpha tocophérol.
[00085] Dans un mode de réalisation, le tocophérol est l'isomère D de l'alpha tocophérol.
[00086] Dans un mode de réalisation, le tocophérol est l'isomère L de l'alpha tocophérol. [00087] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les alcools porteurs de groupe aryle.
[00088] Dans un mode de réalisation, l'alcool porteur de groupe aryle est choisi parmi l'alcool benzylique, l'alcool phenéthylique.
[00089] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les alcools gras insaturés dans le groupe constitué par le géraniol, le β-citronellol et le farnesol.
[00090] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est le 3,7-diméthyl-l- octanol.
[00091] Dans un mode de réalisation, l'acide hydrophobe est choisi parmi les acides gras.
[00092] Dans un mode de réalisation, les acides gras sont choisis dans le groupe constitué par les acides constitués d'une chaîne alkyle insaturée ou saturée, ramifiée ou non ramifiée, comprenant de 6 à 50 carbones.
[00093] Dans un mode de réalisation, les acides gras sont choisis dans le groupe constitué par les acides gras linéaires.
[00094] Dans un mode de réalisation, les acides gras linéaires sont choisis dans le groupe constitué par l'acide caproïque, l'acide oenanthique, l'acide caprylique, l'acide caprique, l'acide nonanoïque, l'acide décanoïque, l'acide undécanoïque, l'acide dodécanoïque, l'acide palmitique, l'acide stéarique, l'acide arachidique, l'acide béhénique, l'acide tricosanoïque, l'acide lignocérique, l'acide heptacosanoïque, l'acide octacosanoïque et l'acide mélissique.
[00095] Dans un mode de réalisation, les acides gras sont choisis dans le groupe constitué par les acides gras insaturés.
[00096] Dans un mode de réalisation, les acides gras insaturés sont choisis dans le groupe constitué par l'acide myristoléique, l'acide palmitoléique, l'acide oléique, l'acide élaidique, l'acide linoléique, l'acide alpha-linoléique, l'acide arachidonique, l'acide eicosapentaenoïique, l'acide erucique et l'acide docosahexaenoïque.
[00097] Dans un mode de réalisation, les acides gras sont choisis dans le groupe constitué par les acides de la bile et leurs dérivés.
[00098] Dans un mode de réalisation, les acides de la bile et leurs dérivés sont choisis dans le groupe constitué par l'acide cholique, l'acide déhydrocholique, l'acide désoxycholique et l'acide chénodésoxycholique. Dans un mode de réalisation l'invention concerne un complexe polysaccharide/BMP-2 choisi dans le groupe constitué par les complexes suivants :
Dextraneméthylcarboxyiate de sodium 40 kDa modifié par le phénylalaninate d'octanol/B P-2, Ratio Massique=10
- Dextraneméthylcarboxyiate de sodium 40 kDa modifié par l'aspartate de dihexanol/BMP-2, Ratio Massique= 10
- Dextraneméthylcarboxyiate 40 kDa modifié par le N-(2- aminoethyl)dodécanamide/BMP-2, Ratio Massique=10
Dextraneméthycarboylate 40 kDa modifié par le leucinate d'octanol, Ratio Massique=10
- Dextraneméthylcarboxyiate de sodium 40 kDa modifié par le glycinate de dodécanol, Ratio Massique=10
Dextraneméthylcarboxyiate de sodium 40 kDa modifié par le glycinate d'octanol/BMP-2, Ratio Massique=6,25
- Dextraneméthylcarboxyiate 40 kDa modifié par le phénylalaninate d'octanol/BMP-2, Ratio Massique=6,25
- Dextraneméthylcarboxyiate 40 kDa modifié par l'alaninate de dodécanol/BMP-2, Ratio Massique=6,25
Dans un mode de réalisation l'invention concerne un complexe polysaccharide/BMP-7 choisi dans le groupe constitué par les complexes suivants :
- Dextraneméthylcarboxyiate de sodium 40 kDa modifié par le glycinate d'octanol/BMP-7, Ratio Massique=10
- Dextraneméthylcarboxyiate de sodium 40 kDa modifié par le glycinate d'octanol/BMP-7, Ratio Massique=12,3
- Dextraneméthylcarboxyiate de sodium 10 kDa modifié par le glycinate d'octanol/BMP-7, Ratio Massique= 10 - Dextraneméthylcarboxylate de sodium 10 kDa modifié par le glycinate d'octanol/BMP-7, Ratio Massique=4
- Dextraneméthylcarboxylate de sodium 10 kDa modifié par le glycinate de dodécanol/BMP-7, Ratio Massique=10
- Dextraneméthylcarboxylate de sodium 10 kDa modifié par le leucinate d'isohexanol/BMP-7, Ratio Massique=10
- Dextraneméthylcarboxylate de sodium 40 kDa modifié par le phénylalaninate d'octanol/BMP-7, Ratio Massique= 10
- Dextraneméthylcarboxylate de sodium 40 kDa modifié par le phénylalaninate d'octanol/BMP-7, Ratio Massique=4
Dextraneméthylcarboxylate de sodium 40 kDa modifié par le valinate d'octanol/BMP-7, Ratio Massique=10
- Dextraneméthylcarboxylate de sodium 40 kDa modifié par l'ester laurate d'éthanolamine/BMP-7 Ratio Massique=10
- Dextraneméthylcarboxylate de sodium 40 kDa modifié par l'aspartate de dihexanol/BMP-7, Ratio Massique=10
Dextranemethylcarboxylate 10 kDa modifié par le leucinate de cholesterol/BMP-7, Ratio Massique=10
- Dextranemethylcarboxylate 10 kDa modifié par le phénylalaninate d'octanol/BMP-7, Ratio Massique=10
- Dextranemethylcarboxylate 10 kDa modifié par le phénylalaninate de 3,7- diméthyl-l-octanol/BMP-7, Ratio Massique= 10
- Dextranemethylcarboxylate 10 kDa modifié par le 2-(2-amino-ethoxy)ethyl octanoate/BMP-7, Ratio Massique= 10 Dextranemethylcarboxylate lOkDa modifié par le 2-(2-amino-ethoxy)ethyl dodecanoate/BMP-7, Ratio Massique=10
- Dextranemethylcarboxylate 10 kDa modifié par la N-[2-((2-octanoylamino- 3-phenyl)propanoylamino)]éthanamine/BMP-7, Ratio Massique=10
- Dextranmethylcarboxylate 10 kDa modifié par la N~[2-((2-octanoylamino-3- phenyl)propanoylamino)]éthanamine/BMP-7, Ratio Massique=4
- Dextranemethylcarboxylate 10 kDa modifié par le N-(2- aminoethyl)octanamide/BMP-7, Ratio Massique=10
- Dextranemethylcarboxylate 40 kDa modifié par le N-(2- aminoethyl)dodécanamide/BMP-7, Ratio Massique=10
Dextraneméthylcarboxylate 40 kDa modifié par le N-(2- aminoethyl)dodécanamide/BMP-7, Ratio Massique=4
- Dextraneméthylcarboxylate 10 kDa de sodium modifié par l'aspartate de didodécanol/BMP-7, Ratio Massique=10 - N-méthylcarboxylate de sodium dextrane carbamate 10 kDa modifié par le N-(2-aminoethyl)dodécanamide/BMP-7, Ratio Massique=4
- Dextranemethylcarboxylate 10 kDa modifié par le phénylalaninate d'isohexanol/BMP-7, Ratio Massique=10
- Dextranemethylcarboxylate 10 kDa modifié par le phénylalaninate de benzyle/BMP-7, Ratio Massique=10
Dextranemethylcarboxylate 10 kDa modifié par le phénylalaninate d'isohexanol/BMP-7, Ratio Massique=10
[00099] L'invention concerne également une composition thérapeutique caractérisée en ce qu'elle comprend un complexe polysaccharide amphiphile-BMP-7 selon l'invention. [000100] L'invention concerne également une composition thérapeutique caractérisée en ce qu'elle comprend un complexe polysaccharide amphiphile-BMP-2 selon l'invention.
[000101] On entend par composition thérapeutique une composition utilisable en médecine humaine ou vétérinaire.
[000102] Dans un mode de réalisation la composition pharmaceutique selon l'invention est une composition à application locale pouvant se présenter sous la forme d'un soluté, d'un gel, d'une crème, d'un lyophilisât, d'une poudre ou d'une pâte.
[000103] Dans un mode de réalisation la composition pharmaceutique selon l'invention est une composition à application systémique pour une administration par voie intraveineuse ou sous-cutanée pouvant se présenter sous la forme d'un soluté.
[000104] La nature des excipients susceptibles d'être formulés avec le complexe polysaccharide amphiphile-BMP selon l'invention est choisie en fonction de sa forme de présentation selon les connaissances générales du galéniste.
[000105] Ainsi, lorsque la composition selon l'invention est sous la forme d'une pâte ou d'un ciment, celle-ci est par exemple obtenue à partir de produits tels que les carboxyméthylcelluloses (CMC), le tricalcium phosphate et le collagène.
[000106] D'autres excipients peuvent être utilisés dans cette invention afin d'ajuster les paramètres de la formulation comme un tampon pour ajuster le pH, un agent permettant d'ajuster l'isotonicité, des conservateurs comme le parahydroxybenzoate de méthyle, le parahydroxybenzoate de propyle, le m-crésol, ou le phénol ou encore un agent anti-oxydant comme le chlorhydrate de L-lysine.
[000107] Selon l'invention, la composition thérapeutique est caractérisée en ce qu'elle permet une administration d'environ 10 mg/ml de BMP-7 ou de BMP-2.
[000108] Selon l'invention, la composition thérapeutique est caractérisée en ce qu'elle permet une administration d'environ 5 mg/ml de BMP-7 ou de BMP-2.
[000109] Selon l'invention, la composition thérapeutique est caractérisée en ce qu'elle permet une administration d'environ 2 mg/ml de BMP-7 ou de BMP-2.
[000110] Selon l'invention, la composition thérapeutique est caractérisée en ce qu'elle permet une administration d'environ 1 mg/ml de BMP-7 ou de BMP-2. [000111] Selon l'invention, la composition thérapeutique est caractérisée en ce qu'elle permet une administration d'environ 0,2 mg/ml de BMP-7 ou de BMP-2.
[000112] La présente invention concerne également l'utilisation d'un complexe polysaccharide amphiphile-BMP-7 ou polysaccharide amphiphile-BMP-2 selon l'invention pour la préparation d'une composition thérapeutique destinée à induire la formation d'os in-vivo.
[000113] La présente invention concerne également l'utilisation d'un complexe polysaccharide amphiphile-BMP-7 ou polysaccharide amphiphile-BMP-2 selon l'invention pour la préparation d'une composition thérapeutique destinée à induire la régénération du cartilage.
[000114] La présente invention concerne également l'utilisation d'un complexe polysaccharide amphiphile-BMP-7 selon l'invention pour la préparation d'une composition thérapeutique destinée à induire la régénération du rein.
[000115] La présente invention concerne également l'utilisation d'un complexe polysaccharide amphiphile-BMP-7 selon l'invention pour la préparation d'une composition thérapeutique destinée à induire la régénération du foie.
[000116] La présente invention concerne également l'utilisation d'un complexe polysaccharide amphiphile-BMP-7 selon l'invention pour la préparation d'une composition thérapeutique destinée à induire la régénération de la cornée.
[000117] La présente invention concerne également l'utilisation d'un complexe polysaccharide amphiphile-BMP-7 selon l'invention pour la préparation d'une composition thérapeutique destinée à traiter les accidents vasculaires cérébraux.
[000118] La présente invention concerne également l'utilisation d'un complexe polysaccharide amphiphile-BMP-7 selon l'invention pour la préparation d'une composition thérapeutique destinée à traiter l'infarctus du myocarde.
[000119] La présente invention concerne également l'utilisation d'un complexe polysaccharide amphiphile-BMP-7 selon l'invention pour la préparation d'une composition thérapeutique destinée à traiter (es maladies artérielles périphériques.
[000120] La présente invention concerne également l'utilisation d'un complexe polysaccharide amphiphile-BMP-7 selon l'invention pour la préparation d'une composition thérapeutique destinée à traiter les maladies pulmonaires obstructives chroniques.
[000121] La présente invention concerne également l'utilisation d'un complexe polysaccharide amphiphile-BMP-7 selon l'invention pour la préparation d'une composition thérapeutique destinée à traiter les ischémies critiques des membres inférieurs.
[000122] Elle concerne également une méthode de traitement thérapeutique à usage humain ou vétérinaire caractérisée en ce qu'elle consiste à administrer au site de traitement une composition thérapeutique comprenant le complexe polysaccharide amphiphile-BMP-7 ou polysaccharide amphiphile-BMP-2 selon l'invention.
[000123] Elle concerne également une méthode de traitement thérapeutique à usage humain ou vétérinaire caractérisée en ce qu'elle consiste à administrer par voie intraveineuse une composition thérapeutique comprenant le complexe polysaccharide amphiphile-BMP-7 selon l'invention.
[000124] Elle concerne également une méthode de traitement thérapeutique à usage humain ou vétérinaire caractérisée en ce qu'elle consiste à administrer par voie sous-cutanée une composition thérapeutique comprenant le complexe polysaccharide amphiphile-BMP-7 selon l'invention.
[000125] Les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont soit sous forme liquide, en solution aqueuse, soit sous forme de poudre, soit sous forme de lyophilisât, d'implant ou de film. Elles comportent en outre les excipients pharmaceutiques classiques bien connus de l'homme de l'art.
[000126] En fonction des pathologies et des modes d'administration les compositions pharmaceutiques pourront avantageusement comporter, en outre, des excipients permettant de les formuler sous forme de gel, d'éponge, de solution injectable, de solution buvable, de lyoc etc.
[000127] L'invention concerne également une composition pharmaceutique selon l'invention telle que décrite précédemment, caractérisée en ce qu'elle est administrable sous forme de stent, de film ou « coating » de biomatériaux implantables, d'implant.
[000128] Dans un mode de réalisation l'invention concerne une formulation liquide pharmaceutique contenant de la BMP-7 à Img/mL à pH physiologique dont la composition est la suivante :
Complexe polysaccharide/BMP-7 de ratio massique 4 correspondant à 1 mg/mL de BMP-7
10 mM de tampon phosphate
7.1 % de tréhalose (agent osmotique) Exemple 1 : Synthèse de dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par le glycinate d'octanol
Polymère 1
[000129] Le glycinate d'octanol, sel d'acide paratoluènesulfonique est obtenu selon le procédé décrit dans le brevet (Kenji, M et al., US4826818).
[000130] 8 g (soit 148 mmol de fonctions hydroxyles) de dextrane de masse molaire moyenne en poids d'environ 40 kg/mol (Fluka) sont solubilisés dans de l'eau à 42 g/L. A cette solution sont ajoutés 15 mL de NaOH 10 N (148 mmol NaOH). Le mélange est porté à 35°C puis 23 g (198 mmol) de chloroacétate de sodium sont ajoutés. La température du milieu réactionnel est portée à 60°C à 0,5°C/min puis maintenue à 60°C pendant 100 minutes. Le milieu réactionnel est dilué avec 200 mL d'eau, neutralisé à l'acide acétique et purifié par ultrafiltration sur membrane PES de 5 kD contre 6 volumes d'eau. La solution finale est dosée par extrait sec pour déterminer la concentration en polymère ; puis dosée par dosage acide/base dans de l'eau/acétone 50 / 50 (V/V) pour déterminer le degré de substitution en méthylcarboxylates.
[000131] D'après l'extrait sec : [polymère] = 31,5 mg/g
[000132] D'après le dosage acide/base : le degré de substitution des fonctions hydroxyles par des fonctions méthylcarboxylates est de 1,04 par motif saccharidique.
[000133] La solution de dextraneméthylcarboxylate de sodium est passée sur une résine Purolite (anionique) pour obtenir le dextraneméthylcarboxylique acide qui est ensuite lyophilisé pendant 18 heures.
[000134] 8 g de dextraneméthylcarboxylique acide (37 mmol fonctions méthylcarboxylique acide) sont solubilisés dans le DMF à 78 g/L puis refroidis à 0°C. 2,59 g de glycinate d'octanol, sel d'acide paratoluènesulfonique (7,2 mmol) est mis en suspension dans du DMF à 100 g/L. 0,73 g de triéthylamine (7,2 mmol) est ensuite ajouté à cette suspension. Une fois la solution de polymère à 0°C, 4,16 g (41 mmol) de NMM et 4,47 g (41 mmol) de EtOCOCI sont ensuite ajoutés. Après 10 min de réaction, la solution de glycinate d'octanol est ajoutée et le milieu maintenu à 10°C durant 45 minutes. Le milieu est ensuite chauffé à 50°C. A 30°C, une solution aqueuse d'imidazole à 600 g/L et 40 mL d'eau sont ajoutés. Après lh30 d'agitation à 50°C, la solution obtenue est ultrafiltrée sur membrane PES 10 kD contre 6 volumes de solution NaCI 0,9%, 3 volumes de soude 0,01N, 8 volumes de solution NaCI 0,9% puis 3 volumes d'eau. La concentration de la solution de polymère est déterminée par extrait sec. Une fraction de solution est lyophilisée et analysée par RMN XH dans D20 pour déterminer le taux de fonctions acides converties en amide de glycinate d'octanol.
[000135] D'après l'extrait sec : [Polymère 1] = 30,2 mg/g
[000136] D'après la RMN 1H : la fraction molaire des acides modifiés par le glycinate d'octanol par unité saccharidique est de 0,21.
Exemple 2 : Synthèse de dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par le glycinate d'octanol
Polymère 2
[000137] Le glycinate d'octanol, sel d'acide paratoluènesulfonique est obtenu selon le procédé décrit dans le brevet (Kenji, M et al., US4826818).
[000138] Par un procédé similaire à celui décrit à l'Exemple 1 à partir d'un dextran de masse molaire moyenne en poids de 10 kDa, un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par le glycinate d'octanol est obtenu.
[000139] D'après l'extrait sec : [Polymère 2] = 30,6 mg/g
[000140] D'après la RMN Η : la fraction molaire des acides modifiés par le glycinate d'octanol par unité saccharidique est de 0,16.
Exemple 3 : Synthèse de dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par le glycinate de dodécanol
Polymère 3
[000141] Le glycinate de dodécanol, sel d'acide paratoluènesulfonique est obtenu selon le procédé décrit dans le brevet (Kenji, M et al., US4826818).
[000142] Par un procédé similaire à celui décrit à l'Exemple 1 à partir d'un dextran de masse molaire moyenne en poids de 10 kDa, un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par le glycinate de dodécanol est obtenu.
[000143] D'après l'extrait sec : [Polymère 3] = 23,6 mg/g
[000144] D'après la RMN H : la fraction molaire des acides modifiés par le glycinate de dodécanol par unité saccharidique est de 0,10. Exemple 4 : Synthèse de dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par le leucinate d'ïsohexanol
Polymère 4
[000145] Le leucinate d'ïsohexanol, sel d'acide paratoluènesulfonique est obtenu selon le procédé décrit dans le brevet (Kenji, M et al., US4826818).
[000146] Par un procédé similaire à celui décrit à l'Exemple 1 à partir d'un dextran de masse molaire moyenne en poids de 10 kDa, un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par le leucinate d'ïsohexanol est obtenu.
[000147] D'après l'extrait sec : [Polymère 4] = 12,3 mg/g
[000148] D'après la MN H : la fraction molaire des acides modifiés par le leucinate d'ïsohexanol par unité saccharidique est de 0,18.
Exemple 5 : Synthèse de dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par le phénylalaninate d'octanol
Polymère 5
[000149] Le phénylalaninate d'octanol, sel d'acide paratoluènesulfonique est obtenu selon le procédé décrit dans le brevet (Kenji, M et al., US4826818).
[000150] Par un procédé similaire à celui décrit à l'Exemple 1 à partir d'un dextran de masse molaire moyenne en poids de 40 kDa, un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par le phénylalaninate d'octanol est obtenu.
[000151] D'après l'extrait sec : [Polymère 5] = 30,2 mg/g
[000152] D'après la RMN 1H : la fraction molaire des acides modifiés par le phénylalaninate d'octanol par unité saccharidique est de 0,10.
Exemple 6 : Synthèse de dextranesuccinate de sodium modifié par le glycinate d'octanol
Polymère 6
[000153] Le glycinate d'octanol, sel d'acide paratoluènesulfonique est obtenu selon le procédé décrit dans le brevet (Kenji, M et al., US4826818).
[000154] Un dextranesuccinate de sodium est obtenu à partir d'un dextrane de masse molaire moyenne en poids de 10 kDa (Pharmacosmos) selon la méthode décrite dans l'article de Sanchez Chaves et al. (Sanchez Charves, Manuel et al., Polymer 1998, 39(13), 2751-2757). Le taux de fonctions acides par unité glycosidique est de 1,4 d'après la RMN tt dans NaOD/D20. Par un procédé similaire à celui décrit à l'Exemple 1, un dextranesuccinate de sodium modifié par le glycinate d'octanol est obtenu.
[000155] D'après l'extrait sec : [Polymère 6] = 23,6 mg/g
[000156] D'après la RMN 1H : la fraction molaire des acides modifiés par le glycinate de dodécanol par unité saccharidique est de 0,10.
Exemple 7 : Synthèse de dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par le valinate d'octanol
Polymère 7
[000157] Le valinate d'octanol, sel d'acide paratoluènesulfonique est obtenu selon le procédé décrit dans le brevet (Kenji, M et al., US4826818).
[000158] Par un procédé similaire à celui décrit à l'Exemple 1 à partir d'un dextran de masse molaire moyenne en poids de 40 kDa, un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par le valinate d'octanol est obtenu.
[000159] D'après l'extrait sec : [Polymère 7] = 33,2 mg/g
[000160] D'après la RMN Η : la fraction molaire des acides modifiés par le valinate d'octanol par unité saccharidique est de 0,08.
Exemple S : Synthèse de dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par l'ester laurate d'éthanolamine
Polymère S
[000161] L'ester laurate d'éthanolamine, sel d'acide paratoluènesulfonique est obtenu selon le procédé décrit dans le brevet (Kenji, M et al., US4826818).
[000162] Par un procédé similaire à celui décrit à l'Exemple 1 à partir d'un dextran de masse molaire moyenne en poids de 40 kDa, un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par Tester laurate d'éthanolamine est obtenu.
[000163] D'après l'extrait sec : [Polymère 8] = 21,2 mg/g
[000164] D'après la RMN 1H : la fraction molaire des acides modifiés par l'ester laurate d'éthanolamine par unité saccharidique est de 0,09.
Exemple 9 : Synthèse de dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par l'aspartate de dihexanol
Polymère 9
[000165] L'aspartate de dihexanol, sel d'acide paratoluènesulfonique est obtenu selon le procédé décrit dans le brevet (Kenji, M et al., US4826818). [000166] Par un procédé similaire à celui décrit à l'Exemple 1 à partir d'un dextran de masse molaire moyenne en poids de 40 kDa, un dextraneméthylcarboxyiate de sodium modifié par l'aspartate de dihexanol est obtenu.
[000167] D'après l'extrait sec : [Polymère 9] = 31,1 mg/g
[000168] D'après la RMN 1H : la fraction molaire des acides modifiés par l'aspartate de dihexanol par unité saccharidique est de 0,075.
Exemple 10 : Synthèse de dextraneméthylcarboxyiate de sodium modifié par le glycinate de dodécanol
Polymère 10
[000169] Le glycinate de dodécanol, sel d'acide paratoluène sulfonique est obtenu selon le procédé décrit dans le brevet (Kenji, M et al., US4826818).
[000170] Par un procédé similaire à celui décrit à l'Exemple 1 à partir d'un dextran de masse molaire moyenne en poids de 40 kDa, un dextraneméthylcarboxyiate de sodium modifié par le glycinate de dodécanol est obtenu.
[000171] D'après l'extrait sec : [Polymère 10] = 25,3 mg/g
[000172] D'après la RMN 1H : la fraction molaire des acides modifiés par le glycinate de dodécanol par unité saccharidique est de 0,1.
Exemple 11 : Synthèse de dextraneméthylcarboxyiate de sodium modifié par le Ieucinate d'octanol
Polymère 11
[000173] Le Ieucinate d'octanol, sel d'acide paratoluènesulfonique est obtenu selon le procédé décrit dans le brevet (Kenji, M et al., US4826818).
[000174] Par un procédé similaire à celui décrit à l'Exemple 1 à partir d'un dextran de masse molaire moyenne en poids de 40 kDa, un dextraneméthylcarboxyiate de sodium modifié par le Ieucinate d'octanol est obtenu.
[000175] D'après l'extrait sec : [Polymère 11] = 32,9 mg/g
[000176] D'après la RMN 1H : la fraction molaire des acides modifiés par le
Ieucinate d'octanol par unité saccharidique est de 0,10. Exemple 12 : Synthèse de dextraneméthylcarboxylate modifié par le leucinate de cholestérol
Polymère 12
[000177] Le leucinate de cholestérol, sel d'acide paratoluènesulfonique est obtenu selon le procédé décrit dans le brevet (Kenji, M et al., US4826818).
[000178] Par un procédé similaire à celui décrit à l'Exemple 1 à partir d'un dextran de masse molaire moyenne en poids de 10 kDa, un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par le leucinate de cholestérol est obtenu.
[000179] D'après l'extrait sec : [Polymère 12] = 25,8 mg/g
[000180] D'après la RMN 1H : la fraction molaire des acides modifiés par le leucinate de cholestérol par unité saccharidique est de 0,03.
Exemple 13 : Synthèse de dextraneméthylcarboxylate modifié par le phénylalaninate d'octanol
Polymère 13
[000181] Le phénylalaninate d'octanol, sel d'acide paratoluènesulfonique est obtenu selon le procédé décrit dans le brevet (Kenji, M et al., US4826818).
[000182] Par un procédé similaire à celui décrit à l'Exemple 1 à partir d'un dextran de masse molaire moyenne en poids de 10 kDa, un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par le phénylalaninate d'octanol est obtenu.
[000183] D'après l'extrait sec : [Polymère 13] = 36,9 mg/g
[000184] D'après la RMN 1H : la fraction molaire des acides modifiés par le phénylalaninate d'octanol par unité saccharidique est de 0,2.
Exemple 14 : Synthèse de dextraneméthylcarboxylate modifié par le phénylalaninate de 3,7-diméthyl-l-octanol
Polymère 14
[000185] Le phénylalaninate de 3,7-diméthyl-l-octanol, sel d'acide paratoluènesulfonique est obtenu selon le procédé décrit dans le brevet (Kenji, M et al., US4826818)
[000186] Par un procédé similaire à celui décrit à l'Exemple 1 à partir d'un dextran de masse molaire moyenne en poids de 10 kDa, un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par le phénylalaninate de 3,7- diméthyl-l-octanol est obtenu. [000187] D'après l'extrait sec : [Polymère 14] = 24,3 mg/g
[000188] D'après la RMN 1H : la fraction molaire des acides modifiés par le phénylalaninate de 3,7-diméthyl-l-octanol par unité saccharidique est de 0,1.
Exemple 15 : Synthèse de dextraneméthylcarboxylate modifié par le 2-(2-amino-ethoxy)ethyl octanoate
Polymère 15
[000189] Le 2-(2-amino~ethoxy)ethyl octanoate, sel d'acide paratoluènesulfonique, est obtenu selon le procédé décrit dans le brevet (Kenji, M et al., US4826818).
[000190] Par un procédé similaire à celui décrit à l'Exemple 1 à partir d'un dextran de masse molaire moyenne en poids de 10 kDa, un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par le 2-(2-amino-ethoxy)ethyl octanoate est obtenu.
[000191] D'après l'extrait sec : [Polymère 15] = 20,3 mg/g
[000192] D'après la RMN 1H : la fraction molaire des acides modifiés par le 2-(2- amino-ethoxy)ethyl octanoate par unité saccharidique est de 0,2.
Exemple 16 : Synthèse de dextraneméthylcarboxylate modifié par le 2-(2-amino-ethoxy)ethyl dodecanoate.
Polymère 16
[000193] Le 2-(2-amino-ethoxy)ethyl dodecanoate, sel d'acide paratoluènesulfonique est obtenu selon le procédé décrit dans le brevet (Kenji, M et al., US4826818).
[000194] Par un procédé similaire à celui décrit à l'Exemple 1 à partir d'un dextran de masse molaire moyenne en poids de 10 kDa, un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par le 2-(2-amino-ethoxy)ethyl dodecanoate est obtenu.
[000195] D'après l'extrait sec : [Polymère 16] = 25,6 mg/g
[000196] D'après la RM 1H : la fraction molaire des acides modifiés par le 2-(2- amino-ethoxy)ethyl dodecanoate par unité saccharidique est de 0,1. Exemple 17 : Synthèse de dextranmethylcarboxylate modifié par la N-[2- ((2-octanoylamino-3-phenyl)propanoylamino)]éthanamine
Polymère 17
[000197] La N-octanoyl-phénylalanine est obtenu selon le procédé décrit dans la publication (Pal, A et al., Tetrahedron 2007, 63, 7334-7348) à partir de l'éthyle ester de la L-phénylalanine, sel d'acide chlorhydrique (Bachem) et de l'acide caprylique (Sigma).
[000198] La N-[2-((2-octanoylamino-3~phényl)propanoylamino)] éthanamine, sel d'acide chlorydrique, est obtenu selon les procédés décrits dans les publications (Paul, R et al., J. Org. Chem. 1962, 27, 2094-2099 et Dale, DJ. et al., Org. Process. Res. Dev. 2002, 6, 767-772) à partir de la N-octanoyl-phénylalanine et de l'éthylènediamine (Roth).
[000199] Par un procédé similaire à celui décrit à l'Exemple 1 à partir d'un dextran de masse molaire moyenne en poids de 10 kDa, un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par la N-[2-((2-octanoylamino-3- phenyl)propanoyiamino)]éthanamine est obtenu.
[000200] D'après l'extrait sec : [Polymère 17] = 19,9 mg/g
[000201] D'après la RMN 1H : la fraction molaire des acides modifiés par le N-[2- ((2-octanoylamino-3-phenyl)propanoylamino)]éthanamine par unité saccharidique est de 0,1.
Exemple 18 : Synthèse de dextranmethylcarboxylate modifié par le N-(2-aminoethyl)octanamide
Polymère 18
[000202] Le N-(2-aminoethyl)octanamide est obtenu selon le procédé décrit dans le brevet US2387201 (1945) à partir de l'éthylènediamine (Roth) et de l'acide caprylique (Sigma).
[000203] Par un procédé similaire à celui décrit à l'Exemple 1 à partir d'un dextran de masse molaire moyenne en poids de 10 kDa, un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par le N-(2-aminoethyl)octanamide est obtenu.
[000204] D'après l'extrait sec : [Polymère 18] = 24,8 mg/g
[000205] D'après la RMN 1H : la fraction molaire des acides modifiés par le N-(2- aminoethyl)octanamide par unité saccharidique est de 0,2. Exemple 19 : Synthèse de dextranméthylcarboxylate modifié par le N-(2-aminoethyl)dodécanamide
Polymère 19
[000206] Le N-(2-aminoethyl)dodécanamide est obtenu selon le procédé décrit dans le brevet US2387201 (1945) à partir de l'éthylènediamine (Roth) et de l'acide dodécanoïque (Sigma).
[000207] Par un procédé similaire à celui décrit à l'Exemple 1 à partir d'un dextran de masse molaire moyenne en poids de 40 kDa, un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par le N-(2- aminoethyl)dodécanamide est obtenu.
[000208] D'après l'extrait sec : [Polymère 19] = 15,7 mg/g
[000209] D'après la RMN 1H : la fraction molaire des acides modifiés par le N-(2- aminoethyl)dodecanamide par unité saccharidique est de 0,1. Exemple 20 : Synthèse de dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par l'aspartate de didodécanol
Polymère 20
[000210] L'aspartate de didocécanol, sel d'acide paratoluènesulfonique est obtenu selon le procédé décrit dans le brevet (Kenji, M et al., US4826818).
[000211] Par un procédé similaire à celui décrit à l'Exemple 1 à partir d'un dextran de masse molaire moyenne en poids de 10 kDa, un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par l'aspartate de didodécanol est obtenu.
[000212] D'après l'extrait sec : [Polymère 20] = 20 mg/g
[000213] D'après la RMN 1H : la fraction molaire des acides modifiés par l'aspartate de didodécanol par unité saccharidique est de 0,05.
Exemple 21: Synthèse de N-méthylcarboxylate de sodium dextrane carbamate modifié par le N-(2-amïnoethyl)dodécanamide
Polymère 21
[000214] Le N-(2-aminoethyl)dodécanamide est obtenu selon le procédé décrit dans le brevet US2387201 (1945).
[000215] 11,5 g (soit 0,21 mol de fonctions hydroxyles) de dextrane de masse molaire moyenne en poids d'environ 10 kg/mol (Bachem) sont solubilisés dans un mélange DMF/DMSO. Le mélange est porté à 130°C sous agitation et 13,75 g (0,11 mol) d'éthyle isocyanatoacétate sont progressivement introduits. Après lh de réaction, le milieu est dilué en eau et purifié par diafiltration sur membrane PES de 5 kD contre NaOH 0,1N, NaCI 0.9% et de l'eau. La solution finale est dosée par extrait sec pour déterminer la concentration en polymère ; puis dosée par dosage acide/base dans de l'eau/acétone 50 / 50 (V/V) pour déterminer le degré de substitution en charges carboxylates.
[000216] D'après l'extrait sec : [polymère] = 38,9 mg/g
[000217] D'après le dosage acide/base : le degré de substitution des fonctions hydroxyles par des fonctions N-méthylcarboxylates carbamates est de 1,08 par motif saccharidique.
[000218] La solution de N-méthylcarboxylate de sodium dextrane carbamate est passée sur une résine Purolite (anionique) pour obtenir le N-méthylcarboxylique acide dextrane carbamate qui est ensuite lyophilisé pendant 18 heures.
[000219] 5 g de N-méthylcarboxylique acide dextrane carbamate sont solubilisés dans le DMF à 50 g/L puis refroidis à 0°C. 2,22 g (22 mmol) de NMM et 2,38 g (22 mmol) de EtOCOCI sont ensuite ajoutés. Après 10 min de réaction, 0,45 g (1,8 mmol) de N-(2-aminoethyl)dodécanamide est ajouté et le milieu maintenu à 10°C durant 45 minutes. Le milieu est ensuite chauffé à 50°C. A 30°C, une solution aqueuse d'imidazole à 600 g/L et 25 mL d'eau sont ajoutés. Après lh30 d'agitation à 50°C, la solution obtenue est ultrafiltrée sur membrane PES 10 kD contre NaOH 0,1N, NaCI 0,9% et de l'eau. La concentration de la solution de polymère est déterminée par extrait sec. Une fraction de solution est lyophilisée et analysée par RMN 1H dans D20 pour déterminer le taux de fonctions acides converties en amide de N-(2-aminoethy!)dodécanamide.
[000220] D'après l'extrait sec : [Polymère 21] = 17,8 mg/g
[000221] D'après la RMN 1H : la fraction molaire des acides modifiés par le N-(2- aminoethyl)dodécanamide par unité saccharidique est de 0,1.
Exemple 22 : Synthèse de dextraneméthyicarboxylate modifié par le phénylalaninate d'ïsohexanol
Polymère 22
[000222] Le phénylalaninate d'ïsohexanol, sel d'acide paratoluènesulfonique est obtenu selon le procédé décrit dans le brevet (Kenji, M et al., US4826818).
[000223] Par un procédé similaire à celui décrit à l'Exemple 1 à partir d'un dextran de masse molaire moyenne en poids de 10 kDa, un dextraneméthyicarboxylate de sodium modifié par le phénylalaninate d'ïsohexanol est obtenu. [000224] D'après l'extrait sec : [Polymère 22] = 28,1 mg/g
[000225] D'après la RMN 1H : la fraction molaire des acides modifiés par le phénylalaninate d'isohexanol par unité saccharidique est de 0,2. Exemple 23 : Synthèse de dextranemethylcarboxylate modifié par le phénylalaninate de benzyle
Polymère 23
[000226] Par un procédé similaire à celui décrit à l'Exemple 1 à partir d'un dextran de masse molaire moyenne en poids de 10 kDa en utilisant le phénylalaninate de benzyle, sel d'acide chlorhydrique (Bachem), un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par le phénylalaninate de benzyle est obtenu.
[000227] D'après l'extrait sec : [Polymère 23] = 47,7 mg/g
[000228] D'après la RMN 1H : la fraction molaire des acides modifiés par le phénylalaninate de benzyle par unité saccharidique est de 0,45.
Exemple 24 : Contre-exemple 1, synthèse de dextraneméthylcarboxylate non modifié par un groupement hydrophobe
Polymère 24
[000229] Le dextraneméthylcarboxylate de sodium est obtenu comme décrit dans la première partie de l'Exemple 1 à partir d'un dextran de masse molaire moyenne en poids de 40 kDa. La fraction molaire des acides modifiés par un groupement hydrophobe est nulle.
Exemple 25 : Synthèse de dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par l'alaninate de dodécanol
Polymère 25
[000230] L'alaninate de dodécanol, sel d'acide paratoluènesulfonique est obtenu selon le procédé décrit dans le brevet (Kenji, M et al., US4826818).
[000231] Une solution de dextraneméthylcarboxylate de sodium obtenue comme décrite à l'exemple 1 est passée sur une résine Purolite (anionique) pour obtenir le dextraneméthylcarboxylique acide qui est ensuite lyophilisé pendant 18 heures.
[000232] 5 g de dextraneméthylcarboxylique acide (23,2 mmol fonction méthylcarboxylique acide) sont solubilisés dans le DMF à 45 g/L puis refroidis à 0°C. 1,99 g d' alaninate de dodécanol, sel d'acide paratoluènesulfonique (4,6 mmol) est mis en suspension dans du DMF à 100 g/L. 0,47 g de triéthylamine (4,6 mmol) est ensuite ajouté à cette suspension. Une fois la solution de polymère à 0°C, 2,35 g (23,2 mmol) de NMM et 2,52 g (23,2 mmol) de EtOCOCI sont ensuite ajoutés. Après 10 min de réaction, la suspension d'alaninate de dodécanol est ajoutée. Le milieu est ensuite maintenu à 4°C durant 15 minutes. Le milieu est ensuite chauffé à 30°C. Une fois à 30°C, une solution d'imidazole (3,2 g dans 9,3 mL d'eau) est ajoutée dans le milieu réactionnel. La solution de polymère est ultrafiltrée sur membrane PES 10 kD contre 10 volumes de solution NaCI 0,9% puis 5 volumes d'eau. La concentration de la solution de polymère est déterminée par extrait sec. Une fraction de solution est lyophilisée et analysée par RMN 1H dans D20 pour déterminer le taux de fonctions acides modifiées par l'alaninate de dodécanol.
[000233] D'après l'extrait sec : [polymère modifié] = 22 mg/g
[000234] D'après la RMN 1H : la fraction molaire des acides modifiés par l'alaninate de dodécanol par unité saccharidique est de 0,19.
Exemple 26 : Affinité de la BMP-7 pour un Polymère par coélectrophorèse.
Préparation du complexe BMP-7/Polvmère
[000235] 5 μΙ d'une solution de BMP-7 à 0,5 mg/ml sont ajoutés à 2,5 μΙ d'une solution de polymère (Pol) à 10 mg/ml et à 10 μΙ de tampon de migration 10X (Tris acétate pH 7). Cette solution est complétée à 100 μΙ par une solution de H20. Cette solution a une concentration en BMP-7 de 25 pg/ml et un ratio BMP-7/Pol de 1/10.
Mise en évidence du complexe BMP-7/Polymère
[000236] 2 μΙ de la solution de BMP-7 / Pol sont ensuite ajoutés à 8 μΙ d'eau et 2 μΙ de tampon de charge 5X (glycérol, tris-acétate et bleu de bromophénol dans de j'eau). Ces 12 μΙ contenant 50 ng de BMP-7 et 500 ng de Polymère sont déposés dans un puits d'un gel d'agarose 0,8%. La cuve d'électrophorèse est fermée et le générateur est réglé à 30V. La migration dure 1 heure.
[000237] Après migration, le gel est transféré sur une membrane de PVDF placée dans un appareil de transfert par capillarité pendant 2h à température ambiante (Système Apelex). La membrane est saturée avec du PBST contenant 5% de BSA pendant 45 minutes à température ambiante puis incubée avec des anticorps primaires de la BMP-7 (une nuit à 4°C) et enfin incubée avec des anticorps secondaires, rabbit anti goat HRP (1 heure à température ambiante). La révélation se fait par réaction de l'HRP sur le Opti-4CIM. La révélation est stoppée lorsque la coloration est suffisante puisque le produit de la réaction absorbe dans le visible.
[000238] Lorsque la BMP-7 forme un complexe avec le Polymère, le complexe est détecté sous forme d'un spot unique à 0,7 cm du dépôt (migration vers l'anode). Lorsque la BMP-7 est seule ou ne forme pas de complexe avec le polymère, elle est détectée à l'endroit du dépôt et n'a donc pas migré.
[000239] Les résultats sont résumés dans le tableau suivant.
Figure imgf000034_0001
Exemple 27 : Solubilisation de la BMP-7 à pH neutre à un ratio massique polymère/ BMP-7 de 10
[000240] Un essai de solubilisation de la Bone Morphogenetic Protein 7 (BMP-7) a été développé afin de mettre en évidence le pouvoir solubilisant de différents polymères à pH physiologique. La BMP-7 est soluble à pH acide et possède une limite de solubilité très basse à pH physiologique de l'ordre de quelques m i crog ra m mes/ m L.
[000241] Les polymères décrits dans cette demande sont mis en oeuvre dans ce test. Le test consiste à utiliser une solution de BMP-7 à pH acide, par exemple un tampon lactate lOmM à pH 3. La BMP-7 est à une concentration initiale de 2,47mg/ml. 2,02 mL de cette solution de BMP-7 sont mélangés à 2,7 mL d'une solution de polymère à 18,5 mg/mL contenant 18mM de tampon phosphate à pH 7,4. Après mélange le pH final est ajusté à pH physiologique par ajout d'un mélange de soude IN et d'eau pour obtenir un volume final de formulation de 5 mL. Les formulations sont analysées par observation visuelle, turbidité et diffusion dynamique de la lumière afin de détecter la présence d'agrégats.
[000242] Les résultats pour les différentes solutions sont rassemblés dans le tableau suivant.
Figure imgf000035_0001
[000243] Ce test permet de mettre en évidence l'amélioration de la solubilisation de la BMP-7 à pH physiologique par cette nouvelle famille de polymères. En revanche, le dextraneméthylcarboxylate de sodium non modifié même à une concentration de 30 mg/mL ne permet pas d'obtenir une solution limpide de BMP- 7. Exemple 28 : Solubilïsatïon de la BMP-7 à pH neutre à un ratio massique polymère/ BMP-7 de 4
[000244] Un essai de solubilisation de la Bone Morphogenetic Protein 7 (BMP-7) a été développé afin de mettre en évidence le pouvoir solubilisant de différents polymères à pH physiologique. La BMP-7 est soluble à pH acide et possède une limite de solubilité très basse à pH physiologique de l'ordre de quelques microgrammes/mL.
[000245] Les polymères décrits dans cette demande sont mis en œuvre dans ce test. A titre comparatif, deux polymères décrits dans la demande de brecet FR0702316 sont également mis en uvre :
Contre-exemple 1 : dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par la phénylalanine
Contre-exemple 2 : dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par la leucine [000246] Le test consiste à utiliser une solution de BMP-7 à pH acide, par exemple un tampon lactate lOmM à pH 3. La BMP-7 est à une concentration initiale de 2,47 mg/ml. 2,02 mL de cette solution de BMP-7 sont mélangés à 2,7 mL d'une solution de polymère à 7,3 mg/mL contenant 18 mM de tampon phosphate à pH 7,4. Après mélange le pH final est ajusté à pH physiologique par ajout d'un mélange de soude IN et d'eau pour obtenir un volume final de formulation de 5 mL. Les formulations sont analysées par observation visuelle, turbidité et diffusion dynamique de la lumière afin de détecter la présence d'agrégats.
[000247] Les résultats pour les différentes solutions sont rassemblés dans le tableau suivant.
Figure imgf000036_0001
[000248] Ce test permet de mettre en évidence l'amélioration de la solubilisation de la BMP-7 à pH physiologique par cette nouvelle famille de polymères. En revanche, le dextraneméthylcarboxylate de sodium non modifié même à une concentration de 30 mg/mL ne permet pas d'obtenir une solution limpide de BMP-7.
Exemple 29 : Solubilisation de la BMP-7 à pH neutre à un ratio massique polymère/ BMP-7 de 1
[000249] Un essai de solubilisation de la BMP-7 a été développé afin de mettre en évidence le pouvoir solubilisant de différents polymères à pH physiologique et pour des ratios massiques polymère/BMP-7 de 1.
[000250] Le test consiste à utiliser une solution de BMP-7 à pH acide, par exemple un tampon lactate lOmM à pH 3. La BMP-7 est à une concentration initiale de 2,47 mg/ml . 2,02 mL de cette solution de BMP-7 sont mélangés à 2,8 mL d'une solution de polymère à 1,8 mg/mL contenant 18 mM de tampon phosphate à pH 7,4. Après mélange le pH final est ajusté à pH physiologique par ajout d'un mélange de soude IN et d'eau pour obtenir un volume final de formulation de 5 mL. Les formulations sont analysées par observation visuelle, turbidité et diffusion dynamique de la lumière afin de détecter la présence d'agrégats. Les résultats montrent que le Polymère 1 et le Polymère 5 permettent de solubiliser complètement la BMP-7 à pH physiologique pour un ratio massique polymère/BMP- 7 de 1.
Exemple 30 : Solubilisation du lyophilisât de BMP-2 à un ratio massique polymère/ B P- 2 de 10
[000251] Un essai de solubilisation d'un lyophilisât de Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP-2) a été développé afin de mettre en évidence le pouvoir solubilisant de différents polymères à pH physiologique. La BMP-2 est solubilisée dans un tampon contenant du sucrose (Sigma), de la glycine (Sigma), de l'acide glutamique (Sigma), du chlorure de sodium (Riedel-de-Haën) et du polysorbate 80 (Fluka). Cette solution est ajustée à pH 4,5 par ajout de soude puis est lyophilisée. 283,2 mg de lyophilisât contiennent environ 12 mg de BMP-2. [000252] Les polymères décrits dans cette demande sont mis en œuvre dans ce test.
[000253] Le test consiste à introduire environ exactement 14,5 mg de lyophilisât contenant 0,62 mg de BMP-2 dans un flacon de 1 mL. Le lyophilisât est ensuite repris par 410 pL d'une solution pour atteindre une concentration finale en BMP-2 de 1.5 mg/mL à pH physiologique. L'aspect visuel de la solution est noté après 15 minutes d'agitation à vitesse réduite sur rouleau.
[000254] Les résultats pour différentes solutions avec la BMP-2 sont rassemblés dans le tableau suivant.
Figure imgf000038_0001
Exemple 31 : Solubiiisation d'un lyophilisât de BMP-2 à un ratio massique polymère/BMP-2 de 6,25
[000255] Un essai de solubiiisation d'un lyophilisât de Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP-2) a été développé afin de mettre en évidence le pouvoir solubilisant de différents polymères à pH physiologique. La BMP-2 est solubilisée dans un tampon contenant du sucrose (Sigma), de la glycine (Sigma), de l'acide glutamique (Sigma), du chlorure de sodium (Riedel-de-Haën) et du polysorbate 80 (Fluka). Le pH de cette solution est ajusté à pH 4,5 par ajout de soude puis est la solution lyophilisée. 283,2 mg de lyophilisât contiennent environ 12 mg de BMP-2.
[000256] Les polymères selon l'invention sont mis en œuvre dans ce test. A titre comparatif, un polymère décrit dans la demande de brevet FR0702316 est également mis en œuvre dans ce test, le dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par le phénylalaninate d'éthyle.
[000257] Le test consiste à introduire environ exactement 4 mg de lyophilisât contenant 0,168 mg de BMP-2. Le lyophilisât est ensuite repris par 210 sL d'une solution aqueuse pour atteindre une concentration finale en BMP-2 de 0,8 mg/mL à pH physiologique, la concentration finale de polymère étant de 5 mg/ml.
[000258] L'aspect visuel de la solution est noté après 5 minutes d'agitation à vitesse réduite sur rouleau.
[000259] Les résultats pour différentes solutions sont rassemblés dans le tableau suivant.
Figure imgf000039_0001
[000260] L'ajout d'eau conduit à une solution limpide de BMP-2 mais à pH acide.
[000261] Ce test permet de mettre en évidence l'amélioration de la solubilisation de la BMP-2 à pH physiologique par les polymères selon l'invention. En revanche, le dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par le phénylalaninate d'éthyle ne permet pas d'obtenir une solution limpide de BMP-2.
Exemple 32 : Effet lyoprotectant des polymères sur la BMP-7
[000262] Afin de tester la capacité des polymères à maintenir l'intégrité de la BMP-7, un test de lyophilisation de ces formulations a été mené. La lyophilisation est un processus stressant pour les protéines qui conduit souvent à une agrégation de la protéine durant le procédé. A titre d'exemple, la formulation obtenue à l'exemple 27 avec le polymère 5 a été lyophilisée. Ce lyophilisât est ensuite reconstitué par de l'eau pour injection à la concentration initiale. Cette solution est alors analysée et comparée à la solution initiale par diffusion dynamique de la lumière. L'analyse montre que les deux solutions sont identiques et donc que la lyophilisation n'a pas induit d'agrégation de la protéine.
Exemple 33 : Solubilisation de la BMP-7 à pH physiologique et à une concentration supérieure à 1 mg/ml
[000263] L'objectif de ce test est de solubiliser à pH physiologique la BMP-7 à une concentration supérieure à 1 mg/ml.
[000264] Un volume de 5,5 mL d'une solution de BMP-7 à 2 mg/ml et pH acide est mélangé à 5,5 mL d'une solution du polymère 2 à une concentration de 6,9 mg/mL afin d'obtenir une solution de BMP-7 à 1 mg/mL et 3,45 mg/mL en polymère 1. Cette solution est ensuite lyophilisée par un procédé classique de lyophilisation.
[000265] La solution est ensuite reconstituée par une solution de tampon phosphate lOmM et ajustée à pH physiologique par ajout d'une solution de soude IN afin d'obtenir une formulation ou la concentration en BMP-7 est de 5mg/mL et la concentration en polymère est de 17,3 mg/mL.
[000266] La solution ainsi obtenue est parfaitement limpide ne laissant pas présager la présence d'agrégats, ce que confirme l'analyse par diffusion dynamique de la lumière.
Exemple 34 : Stabilité de la formulation BMP-7 à la dilution.
[000267] Ce test a pour but de simuler l'injection d'une formulation dans un milieu biologique comme par exemple dans le cas d'une administration à l'homme ou à un animal par un voie sous cutanée ou intraveineuse. En effet, après injection la formulation subit une dilution avec un fluide biologique ayant un pH de 7,4.
[000268] Une formulation de BMP-7 en pH acide (pH 3) à 1 mg/ml est injectée dans un tampon PBS à pH 7,4 avec un facteur de dilution de 10. Lors de l'injection une turbidité de la solution est observée résultant de la précipitation de la protéine. Cette agrégation de la BMP-7 dans le PBS est confirmée par une mesure de diffusion dynamique de la lumière.
[000269] Dans ce même test, si l'on utilise une formulation comme décrite dans I'exemple4.2 avec un des polymères 1 à 11 à une concentration comparable de BMP-7 (i.e. 1 mg/ml) aucune turbidité n'est observée. La mesure par diffusion dynamique de la lumière démontre l'absence d'agrégats dans cet échantillon.
[000270] La formulation B P-7/polymère présente donc l'avantage d'être soluble et liquide à pH physiologique mais également d'être capable de résister à la dilution à pH physiologique en prévenant les phénomènes d'agrégation ce qui peut être particulièrement avantageux dans le cadre du développement d'un produit pharmaceutique pour injection.
(Exemple 35 : Immunogénïcïté de deux compositions de BMP-7
[000271] Il a été démontré que plusieurs espèces animales peuvent être prédictives de l'activité immunologique de la BMP-7. Parmi ces modèles précliniques figure le modèle de fusion postérolatérale chez le lapin. Ce modèle a été retenu pour évaluer la réduction de l'effet immunologique de la BMP-7 sous forme de complexe avec les polymères de l'invention(OP-l Immunogenicity Report, FDA StrykerBiotech Briefing for 31 March 2009 Advisory Committee Meeting).
[000272] Le modèle de fusion lombaire par voie postéro-latérale (arthrodèse au niveau L5-L6) a été réalisée sur des lapins selon le protocole expérimental décrit dans le brevet WO 2010/058106. Les lapins ont été divisés en deux groupes de chacun 4 lapins , le premier groupe a été implanté avec deux éponges de collagène contenant la BMP-7 seule (650 pg), Implant 1, le deuxième groupe a été implanté avec deux éponges de collagène contenant un complexe de BMP-7 avec un polymère (650 pg de BMP-7), Implant 2.
[000273] L'implant 1 a été préparé en déposant 800 pL d'une solution de BMP-7 dans un tampon lactose 5%, pH 3,5 à une concentration de 0,81 mg/mL, soit une dose de BMP-7 de 650 pg dans une éponge de collagène de type-I réticulée d'un volume de 2250 pL.
[000274] L'implant 2 a été obtenu après imprégnations successives d'une éponge de collagène de type-I réticulée d'un volume de 2250 pL par 400 pL d'une solution contenant de la BMP-7 à 1,63 mg/mL, soit 650 pg de BMP-7, le Polymère 1 à 20 mg/mL, soit 8 mg de Polymère 1 du phosphate de sodium à 0,23 M, soit 92 pmol, et du bicarbonate de sodium à 0,62 M, soit 248 pmol, puis par 400 pL d'une solution contenant du chlorure de calcium à 0,38 M, soit 153 pmol. Chaque solution est laissée 15 minutes en contact avec l'éponge après ajout. Après ces durées d'imprégnation, l'éponge est prête pour l'implantation. [000275] Des collections de sérum ont été réalisées avant implantation (jour 0) et à jours 10, 32, 39 et 68 après chirurgie sur tous les animaux. Les échantillons ont été conservés à -80°C. La concentration en anticorps de lapin de type IgG dirigés contre la rhBMP-7 dans les sera de lapins collectés a été mesurée par test ELISA selon le protocole décrit dans l'article (Mire-Sluis, A. R. et al., J Immunol.Methods 2004, 289 (1-2), 1-16.)- De la rhBMP-7 à 2pg/mL dans du Phosphate Buffer Saline (PBS) est adsorbée sur la plaque de test à 4°C pendant une nuit. La plaque est lavée 2 fois avec du PBS, saturée avec une solution de PBS contenant 1% de sérum albumine bovine (BSA), lavée 3 fois avec du PBS contenant 0,06% de tween20. Les sera de lapins dilués au 1/40 dans du PBS contenant 0.1% de BSA et 0,06% de tween20. Le contrôle positif est une solution d'anticorps anti-rhBMP-7 d'isotype IgG produit chez le lapin (fournisseur Peprotech référence 500-P198). Le contrôle négatif est un mélange de 20 sera de lapins sains et non traités. L'anticorps de détection est un antisera anti-IgG de lapin produit chez l'âne couplé à la phosphatase alkaline (fournisseur cliniscience référence 6440-05). Le seuil de détection d'anticorps de ce test est de 160 ng/mL avec pour 5% de faux positifs. Les variabilités intraplaque et interplaques sont inférieures à 5%.
[000276] Les résultats montrent une augmentation ample du taux d'IgG anti- rhBMP-7 mesurée pour deux lapins (lapins 12 et 14), une augmentation modérée transitoire pour 1 lapin (lapin 11) et une absence de réponse pour un lapin (lapin 13) pour la composition Cl. Le taux d'IgG anti-rhBMP-7 observé avec la composition C2 est inférieur au seuil de détection à tous les délais, voir tableau ci- dessous et figures 1 et 2.
Cl lapin 11 lapin 12 lapin 13 lapin 14 jour 0 <sd <sd <sd <sd
jour 10 <sd 434,12 <sd 1167,27 jour 32 480,18 1951,95 <sd 1499,10 jour 39 325,58 2483,66 <sd 1139,16 jour 68 <sd 1807,51 178,02 <sd
Figure imgf000043_0001
[000277] Tableau 1 : Concentration en IgG anti-rhBMP-7 mesurée dans le sera d lapins à plusieurs temps après implantation de 2 éponges de collagène imbibées d la composition Cl ou de la composition C2,

Claims

Revendications
1. Complexe polysaccharide/BMP, la BMP étant choisi dans le groupe constitué par la BMP-2 et la BMP-7, soluble à pH physiologique, caractérisé en ce que le ratio massique polysaccharide/BMP est inférieur à 15, le polysaccharide étant choisi dans le groupe des polysaccharides comportant des groupes fonctionnels carboxyles dont un au moins est substitué par au moins un radical hydrophobe, noté Ah :
ledit radical hydrophobe Ah étant un reste d'un composé hydrophobe choisi parmi les alcool ou acide hydrophobes comportant une chaîne alkyle linéaire, ramifiée ou cyclique comportant au moins 6 atomes de carbone, ledit radical hydrophobe Ah étant lié à un bras de liaison par une fonction G résultant du couplage entre au moins une fonction réactive dudit composé hydrophobe et une fonction réactive du précurseur du bras de liaison R'.
ledit bras de liaison R étant lié au polysaccharide par une liaison F résultant du couplage entre une fonction réactive du précurseur du bras de liaison R' et une fonction carboxyle du polysaccharide anionique, R étant un radical au moins divalent constitué d'une chaîne comprenant entre 1 et 15 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée, éventuellement comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et résultant d'un précurseur R' ayant au moins deux fonctions réactives, l'une au moins étant une fonction aminé et les autres identiques ou différentes étant choisies dans le groupe constitué par les fonctions alcool, acide ou aminé.
- F étant une fonction amide,
G étant soit une fonction amide, ester ou carbamate,
les fonctions carboxyles du polysaccharide anionique non substituées étant sous forme de carboxylate de cation, alcalin de préférence comme Na+ ou K+.
ledit polysaccharide comportant des groupes fonctionnels carboxyles étant amphiphile à pH neutre, la BMP étant choisie dans le groupe constitué par les BMP-2 et BMP-7 recombinantes humaines et leurs homologues.
2. Complexe polysaccharide/BMP selon la revendication 1, caractérisé en ce que la BMP est choisie dans le groupe constitué par les BMP-2 recombinantes humaines et leurs homologues.
3. Complexe polysaccharide/BMP selon la revendication 1, caractérisé en ce que la BMP est choisie dans le groupe constitué par les BMP-7 recombinantes humaines et leurs homologues.
4. Complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les polysaccharides comportant des groupes fonctionnels carboxyles sont des polysaccharides synthétiques obtenus à partir de polysaccharides neutres, sur lesquels au moins 15 groupes fonctionnels carboxyles pour 100 unités saccharidiques ont été greffés, de formule générale I.
Polysaccharide
Q
I
- les polysaccharides naturels étant choisis dans le groupe des polysaccharides dont les liaisons entre les monomères glycosidiques comprennent des liaisons (1,6),
- L étant une liaison résultant du couplage entre un précurseur du bras de liaison Q et une fonction -OH du polysaccharide et étant soit une fonction ester, carbamate ou éther,
- i représente la fraction molaire des substituants L-Q par unité saccharidique du polysaccharide
- Q étant choisi parmi les radicaux de formule générale II : ■(CH2)— (-C†-(CH2) COOH
a b c
II
dans laquelle :
1 < a+b+c < 6 et,
0 < a < 3,
0 < b < 3
0 < c < 3
Ri et R2, identiques ou différents sont choisis dans le groupe constitué par -H, alkyle linéaire ou ramifié en C radical
Figure imgf000046_0001
de formule III dans laquelle
1 < d < 3 et
R'x et R'2 identiques ou différents sont choisis dans le groupe constitué par -H et un groupe alkyle linéaire ou ramifié en Cl à C3.
5. Complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le polysaccharide est choisi dans le groupe constitué par les polysaccharides dont les liaisons entre les monomères glycosidiques comprennent des liaisons
(1,6).
6. Complexe selon la revendication 5, caractérisé en ce que le polysaccharide est choisi dans le groupe constitué par le dextrane et le pullulane
7. Complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le polysaccharide est choisi parmi les poiysaccharides de formule IV:
Figure imgf000047_0001
Ah étant un reste d'un composé hydrophobe choisi parmi les alcools, ou acides hydrophobes comportant une chaîne alkyle linéaire, ramifiée ou cyclique comportant au moins 6 atomes de carbone, produit du couplage entre une fonction hydroxyde ou acide du composé hydrophobe et une fonction réactive du précurseur R' de R,
F étant une fonction amide,
G étant soit une fonction ester, soit une fonction carbamate, soit une fonction amide,
R étant un radical au moins divalent constitué d'une chaîne comprenant entre 1 et 15 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée, éventuellement comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, résultant d'un précurseur R' ayant au moins deux fonctions réactives, l'une au moins étant une fonction aminé et les autres identiques ou différentes étant choisies dans le groupe constitué par les fonctions alcool, acide ou aminé,
nx étant égal à 1 ou 2,
n2 représentant la fraction molaire des fonctions carboxyles du polysaccharide substituées par F-R-G-Ah et est compris entre 0,01 et 0,7, et, lorsque la fonction carboxyle du polysaccharide n'est pas substituée par F- -G-Ah, alors le ou les groupes fonctionnels carboxyles du polysaccharide sont des carboxylates de cation, alcalin de préférence comme Na+ ou K+.
8. Complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que Ah est un alcool hydrophobe.
9. Complexe selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'alcool hydrophobe est choisi parmi les alcools constitués d'une chaîne alkyle insaturée ou saturée, ramifiée ou non ramifiée, comprenant de 6 à 18 carbones.
10. Complexe selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'alcool hydrophobe est l'octanol.
11. Complexe selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'alcool hydrophobe est le dodécanol.
12. Complexe selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'alcool hydrophobe est le 2-éthyIbutanol ou isohexanol.
13. Complexe selon selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que Ah est un acide hydrophobe.
14. Complexe selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'acide hydrophobe est choisi parmi les acides gras.
15. Complexe selon la revendication 14, caractérisé en ce que les acides gras sont choisis dans le groupe constitué par les acides constitués d'une chaîne alkyle insaturée ou saturée, ramifiée ou non ramifiée, comprenant de 6 à 50 carbones.
16. Complexe selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le ratio massique polymère/BMP est inférieur ou égal à 10.
17. Complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que le ratio massique polymère/BMP est inférieur ou égal à 5.
18. Complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par les complexes suivants : - Dextraneméthylcarboxylate de sodium 40 kDa modifié par le phénylalaninate d'octanol/BMP-2, Ratio Massique=10
Dextraneméthylcarboxylate de sodium 40 kDa modifié par l'aspartate de dihexanol/BMP-2, Ratio Massique=10
Dextraneméthylcarboxylate 10 kDa modifié par la N-[2-((2-octanoylamino- 3-phenyl)propanoylamino)]éthanamine/BMP-2, Ratio Massique=10
Dextraneméthylcarboxylate 40 kDa modifié par le N-(2- aminoethyl)dodécanamide/B P-2, Ratio Massique=10
Dextraneméthycarboylate 40 kDa modifié par le leucinate d'octanol, Ratio Massique=10 - Dextraneméthylcarboxylate de sodium 40 kDa modifié par le glycinate de dodécanol, Ratio Massique=10
Dextraneméthylcarboxylate de sodium 10 kDa modifié par le glycinate d'octanol/BMP-2, Ratio Massique=6,25
- Dextraneméthylcarboxylate 10 kDa modifié par le phénylalaninate d'octanol/BMP-2, Ratio Massique=6,25
Dextraneméthylcarboxylate 40 kDa modifié par l'alaninate de dodécanol/BMP-2, Ratio Massique=6,25
19. Complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par les complexes suivants
- Dextraneméthylcarboxylate de sodium 40 kDa modifié par le glycinate d'octanol/BMP-7, Ratio Massique=10
- Dextraneméthylcarboxylate de sodium 40 kDa modifié par le glycinate d'octanol/BMP-7, Ratio Massique=12,3
- Dextraneméthylcarboxylate de sodium 10 kDa modifié par le glycinate d'octanol/BMP-7, Ratio Massique=10
- Dextraneméthylcarboxylate de sodium 10 kDa modifié par le glycinate d'octanol/BMP-7, Ratio Massique=4
- Dextraneméthylcarboxylate de sodium 10 kDa modifié par le glycinate de dodécanol/BMP-7, Ratio Massique=10
- Dextraneméthylcarboxylate de sodium 10 kDa modifié par le leucinate d'isohexanol/BMP-7, Ratio Massique= 10
- Dextraneméthylcarboxylate de sodium 40 kDa modifié par le phénylalaninate d'octanol/BMP-7, Ratio Massique=10
- Dextraneméthylcarboxylate de sodium 40 kDa modifié par le phénylalaninate d'octanol/BMP-7, Ratio Massique=4
- Dextraneméthylcarboxylate de sodium 40 kDa modifié par le valinate d'octanol/BMP-7, Ratio Massique= 10
- Dextraneméthylcarboxylate de sodium 40 kDa modifié par l'ester laurate d'éthanolamine/BMP-7 Ratio Massi.que=10
Dextraneméthylcarboxylate de sodium 40 kDa modifié par l'aspartate de dihexanol/BMP-7, Ratio Massique=10
- Dextraneméthylcarboxylate 10 kDa modifié par le leucinate de cholesterol/BMP-7, Ratio Massique= 10 - Dextranemethylcarboxylate 10 kDa modifié par le phénylalaninate d'octanoi/BMP-7, Ratio Massique=10
Dextranemethylcarboxylate 10 kDa modifié par le phénylalaninate de 3,7- diméthyl-l-octanol/BMP-7, Ratio Massique=10
Dextranemethylcarboxylate 10 kDa modifié par le 2-(2-amino-ethoxy)ethyl octanoate/BMP-7, Ratio Massique=10 - Dextranemethylcarboxylate lOkDa modifié par le 2-(2-amino-ethoxy)ethyl dodecanoate/BMP-7, Ratio Massique= 10
- Dextranemethylcarboxylate 10 kDa modifié par la N-[2-((2-octanoylamino- 3-phenyl)propanoylamino)]éthanamine/BMP-7, Ratio Massique=10
- Dextranmethylcarboxylate 10 kDa modifié par la N-[2-((2-octanoylamino-3- phenyl)propanoylamino)]éthanamine/BMP-7, Ratio Massique=4
- Dextranemethylcarboxylate 10 kDa modifié par le N-(2- aminoethy!)octanamide/BMP-7, Ratio Massique=10
Dextraneméthylcarboxylate 40 kDa modifié par le l\l-(2- aminoethyl)dodécanamide/BMP-7, Ratio Massique=10
- Dextraneméthylcarboxylate 40 kDa modifié par le N-(2- aminoethyl)dodécanamide/BMP-7, Ratio Massique=4
- Dextraneméthylcarboxylate 10 kDa de sodium modifié par l'aspartate de didodécanol/BMP-7, Ratio assique=10
- N-méthylcarboxylate de sodium dextrane carbamate 10 kDa modifié par le N-(2-aminoethyl)dodécanamide/BMP-7, Ratio assique=4
Dextranemethylcarboxylate 10 kDa modifié par le phénylalaninate d'isohexanol/BMP-7, Ratio Massique= 10 - Dextranemethylcarboxylate 10 kDa modifié par le phénylalaninate de benzyle/BMP-7, Ratio Massique=10 Dextranemethylcarboxylate 10 kDa modifié par le phénylalaninate d'isohexanol/BMP-7, Ratio Massique=10
20. composition thérapeutique caractérisée en ce qu'elle comprend un complexe polysaccharide amphiphile-BMP-7 selon l'une quelconque des reveendications 1 à 17 et 19.
21. Composition thérapeutique caractérisée en ce qu'elle comprend un complexe polysaccharide amphiphile-BMP-2 selon l'une quelconque des reveendications 1 à 18.
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