WO2011060950A1 - Screening-verfahren für wirkstoffe für die prophylaxe und therapie neurodegenerativer erkrankungen - Google Patents

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cell
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Anja Harmeier
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Definitions

  • the present invention relates to a screening method for drugs for the prophylaxis and therapy of neurodegenerative diseases, preferably Alzheimer's disease, wherein the drugs inhibit the transport of Aß42 into the cell, preferably the nucleus.
  • Alzheimer's disease is a neurodegenerative disease and is the most common form of dementia.
  • the most important pathological feature of Alzheimer's disease is amyloid plaques (De Groot et al., FEBS J. 273 (2006), p. 658) -668).
  • the amyloid plaques consist of extracellular aggregates of the amyloid ⁇ -peptide (A ⁇ ), which is a cleavage product of the amyloid precursor protein (APP).
  • Soluble A ⁇ peptides are a specific feature of AD.
  • the soluble forms can oligomerize and are then detectable as dimers, tetramers, and up to dodecamers and higher aggregates and can then further aggregate into fibrils. These fibrils are found e.g. in the amyloid plaques in the brain of patients.
  • oligomeric forms The toxicity of the oligomeric forms is measured as cell death and inhibition of long term potentiation (LTP) in cell culture systems and animal models.
  • LTP long term potentiation
  • the resulting hypotheses suggest that (a) oligomers form so-called pores via hydrophobic interaction with lipids in cell membranes, which destroy the membranes and unbalance the ion balance, or (b) cell death via a receptor-mediated mechanism (Walsh et al., (2007), J. Neurochem. 101, pp. 172-1184).
  • the technical problem underlying the present invention is to provide methods of identifying active substances which are suitable for the prophylaxis or therapy of Alzheimer's disease or other neurogenic diseases.
  • a ⁇ peptides can be taken up in the cell and exert their toxic effect there.
  • both A ⁇ 42 and A ⁇ 42G33A are not only taken up by the cells but are transported directly into the cell nucleus.
  • the inventors were able to detect A ⁇ 42 both in the nucleus and in the cytoplasm.
  • the experimental data demonstrate that the toxic peptide A ⁇ 42 accumulates in the nucleus of human neuroblastoma cells and can exert a transcriptional regulatory function.
  • Aß42 acts specifically suppressing the transcription of LRP1 and KAU, but activating the transcription of APP.
  • non-toxic peptide A ⁇ 42G33A has no influence on the expression of the mRNA levels of the genes investigated. From the familial cases of AD studied it is known that an increased production of Aß42 and a changed ratio of the Aß species Aß40 and Aß42 may be responsible for AD. It is unclear why Aß42 plays a key role in neuronal loss and results in cognitive deficits. It is believed that Aß42 may also affect other genes than those shown for learning and memory play a crucial role and thus represent therapeutic goals. Due to the new finding that Aß42 occupies a regulatory function in the nucleus, new approaches to the diagnosis and therapy of Alzheimer's disease are possible.
  • a ⁇ 42 binds to certain regions of the DNA, promoters. This results in the recruitment of the histone acetyltransferase Tip60 and the adapter protein Fe65 and presumably to the complex formation with these proteins and the DNA (FIG. 4).
  • the interaction of Aß42 on the promoters of LRP1 and KAU was identified as a specific event since no interaction with Aß42 could be detected at the Hesl promoter.
  • diagnosis (evidence of accumulation of A ⁇ 42 in the nucleus (e.g., via biopsies));
  • FIG. 1 Time-dependent accumulation of A) A ⁇ 42 and B) A ⁇ 42G33A in the nucleus of human neuroblastoma cells
  • Quantitation was by ELISA as a relative amount to the value at 0 hours, taken as 1.0, i. without addition of synthetic peptide.
  • FIG. 2 mRNA expression after incubation with A ⁇ 42
  • cDNA was generated from isolated mRNA.
  • mRNA expression of LRP1 and KAI1 showed a significant decrease after 4 and 6 h incubation of the cells with Aß42. After 8 h Incubation, there was a significant increase of APP. The mRNA levels of BACEl and Hesl were not affected.
  • FIG. 3 mRNA expression after incubation with A ⁇ 42G33A
  • cDNA was generated from isolated mRNA.
  • Aß42G33A has no influence on the mRNA expression of LRP1, KAU, Hesl, APP and BACEl.
  • FIG. 4 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) of DNA fragments of the promoters of LRP, KAU and Hesl
  • Input used DNA.
  • Controls algG, ap50.
  • (B) LRP1 promoter after 0.5 h incubation with A ⁇ 42, A ⁇ 42 could be detected on the promoter. After 1 h Tip60 and Fe65 were detected. After 8 h of incubation with A ⁇ 42 Tip60 and Fe65 could no longer be detected on the promoter, A ⁇ 42 remains on the promoter.
  • (C) KAU promoter after incubation with A ⁇ 42 for lh, this was detected on the promoter. The co-repressor N-CoR was no longer detected. After 2 h of incubation, Tip60 and Fe65 were detected. After 6 h incubation Tip60 and Fe65 could no longer be detected on the promoter, the co-repressor N-CoR was not detected, Aß42 remains on the promoter.
  • FIG. 5 mRNA expression after incubation with Ab40, Ab42 and Aß42G33A.
  • the present invention relates to a method for the screening of active substances for the prophylaxis and / or therapy of a neurodegenerative disease, the method comprising the following steps:
  • Drug candidate is suitable for the prophylaxis / therapy of a neurodegenerative disease.
  • steps (a) and (b) can be determined by a person skilled in the art by routine experiments and are generally between 20 minutes and several hours (uptake into the cell) or detection by cell fractionation (hours to one day , Centrifugation and then ELISA or Western blot, about 1 day). These are work processes that are standardized in the laboratory and do not apply only to the experiments described here.
  • a ⁇ 42 and the drug candidate can be administered simultaneously or sequentially (with a time delay), e.g. the drug candidate before Aß42.
  • neurodegenerative disease includes any form of neurodegenerative diseases or dementias such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's chorea, amyotrophic lateral sclerosis, Lewy body dementia, Pick's disease (frontotemporal dementia), Progressive supranuclear palsy, corticobasal
  • the cells used in the method of the invention may be derived from a variety of sources, e.g. Mammals (e.g., rodents, humans, primates, etc.) chickens, etc.
  • Mammals e.g., rodents, humans, primates, etc.
  • the cells used in the method of the invention are mammalian cells, with human cells being preferred.
  • neuronal cells Especially preferred are neuronal cells, with neuroblastoma cells being most preferred.
  • An example of a particularly preferred neuroblastoma cell is an SH-SY5Y cell.
  • suitable cell lines are all cell lines commonly used in the laboratory, e.g. CHO, HEK293, COS7, fibroblasts or N2a.
  • the cells used in the screening method according to the invention may be part of a non-human organism (animal model), a tissue or in cell culture.
  • Non-neuronal cells may be primary cell cultures or cell lines derived therefrom.
  • the non-neuronal cells and the neuronal cells may be autologous, allogeneic or xenogeneic.
  • the cells can be cultured in well-known growth media.
  • mammalian cells may be maintained in an in vitro culture in various nutrient media suitable for mammalian cells, for example neurobasal or L15 media (Life Technologies, Rockville, Maryland), which may be supplemented by various compounds, e.g. Antibiotics, vitamins, trophic factors, fetal serum, etc.
  • the cells are in neurobasal medium, supplemented by nutrients and
  • the cells can last several days or weeks without losing their properties. Preferably, they are used shortly after their preparation, ie preferably within one week of preparation.
  • the cells are exposed to the candidate compound (s) between 1 nM and 1 mM, for Aß42 concentration in the range nano- to micromolar concentrations, which is below the LD concentration for the respective cell line (depending on the particular laboratory eg with SY5Y cells at about ⁇ ).
  • each compound can be tested in parallel at different concentrations.
  • various additives and / or vectors and / or products which help the compounds to enter the cells may be added, eg liposomes, cationic lipids or polymers, penetratin, Tat PDT, peptides from adenoviruses (eg Penton ) or other viruses, etc.
  • the contacting may be carried out in known carriers, e.g. Plates, tubes, pistons and the like. In general, the contacting takes place in plates with numerous holes, which make it possible to perform numerous experiments in parallel.
  • Typical carriers are. e.g. iciter plates, in particular the 384-hole
  • contacting cells refers to contacting cells that are present as an organism, ie, as a non-human organism, preferably mammals, or, for example, as a cell culture maintained under conditions of uptake of the drug candidate (and A ⁇ 42) into the cells.
  • a ⁇ 42 in the presence of A ⁇ 42 under conditions permitting its uptake by the cells also involves the uptake of A ⁇ 42 into the cell nucleus, where (a) A ⁇ 42 can be introduced externally, for example via the culture medium, or (b) is present in the cytoplasm after expression of a heterologous nucleic acid encoding A ⁇ 42 with which the cell previously transformed.
  • the determination of the cellular or subcellular localization of A ⁇ 42 in the cells can be made by routine methods, e.g. using ligands binding specifically to A ⁇ 42, preferably antibodies, after previous ones
  • drug candidate refers to previously known or unknown substances, wherein the substances to be investigated are in no way limited, ie, they can be very different test compounds, which may be naturally occurring and synthetic, organic or inorganic compounds and polymers (eg, oligopeptides, polypeptides, oligonucleotides, and polynucleotides), small molecules, antibodies, sugars, fatty acids, nucleotides, and nucleotide analogs, analogs of naturally occurring structures (eg, peptide imitators, nucleic acid analogues, etc.) and other compounds act.
  • test compounds may be naturally occurring and synthetic, organic or inorganic compounds and polymers (eg, oligopeptides, polypeptides, oligonucleotides, and polynucleotides), small molecules, antibodies, sugars, fatty acids, nucleotides, and nucleotide analogs, analogs of naturally occurring structures (eg, peptide imitators, nucleic acid analogues
  • Test compounds may also find use in extracts of natural products. Such extracts may come from different sources, e.g. Fungi, actinomycetes, algae, insects, protozoa, plants and bacteria. Activity-containing extracts can then be further analyzed for isolation of the active ingredient.
  • sources e.g. Fungi, actinomycetes, algae, insects, protozoa, plants and bacteria.
  • Activity-containing extracts can then be further analyzed for isolation of the active ingredient.
  • test compound may be a single compound or a mixture.
  • test compounds can also be screened on a large scale.
  • the test compounds are part of a substance library.
  • the test compounds may be added to a culture medium, injected into a cell, etc.
  • test compound in question may be isolated therefrom, or the original sample, if containing a mixture of different compounds, may be fractionated to determine the number of different compounds per sample to reduce. The process according to the invention is then repeated with the individual fractions.
  • the isolated by means of the screening method according to the invention compounds are suitable as therapeutic agents for the treatment, prevention, control or alleviation of a neurological disease, preferably AD, or these can serve as so-called "lead structures" for the development of analogous compounds, ie, active ingredients which have additional desired properties, for example, the blood-brain barrier can pass well, or lose certain unwanted side effects or a higher half-life (clearing rate)
  • analogous compounds ie, active ingredients which have additional desired properties, for example, the blood-brain barrier can pass well, or lose certain unwanted side effects or a higher half-life (clearing rate)
  • such optimized compounds may have a stabilized electron configuration and molecular conformation wherein the key functional groups may be presented substantially as in the parent compound
  • the analogous compounds have spatial electronic properties comparable to the binding region of the parent compound smaller, have, for example, only a molecular weight below 2 kD, preferably less than 1 kD
  • the preparation / identification of such analogous compounds can be carried out by conventional methods
  • the localization of Aß42 in the cell nucleus is determined. This can be done by conventional detection methods, eg ELISA, Western blot, fluorescence cytometry. The determination of the localization is preferably carried out after the cells have been fractionated subcellularly before method step (b) and the individual cell fractions, eg the fraction containing cell nuclei, are tested separately for the presence of Aß42.
  • the detection of A ⁇ 42 is based on the binding of a specific ligand, which is preferably provided with a detectable marker. Most preferred is an immunological method.
  • the presence / concentration of A ⁇ 42 can be determined by contacting the sample with an anti-A ⁇ 42 antibody or a fragment thereof and then determining the binding of the anti-A ⁇ 42 antibody or fragment thereof to A ⁇ 42.
  • the suitable antibodies may be monoclonal, polyclonal or synthetic antibodies or fragments thereof.
  • fragment means all parts of the monoclonal antibody (eg Fab, Fv or "single chain Fv" fragments) which have the same epitopic specificity as the complete antibody. The preparation of such fragments is known to the person skilled in the art.
  • the antibodies are monoclonal antibodies.
  • the antibodies may be prepared according to standard procedures, preferably A ⁇ 42 or a synthetic fragment thereof serving as immunogen. This polypeptide or peptide or the fragment thereof can be generated, for example, by obtaining the corresponding gene, cloning and recombinant expression. Methods for obtaining monoclonal antibodies are known in the art.
  • the A ⁇ 42 concentration is determined via a primary monoclonal anti-A ⁇ 42 antibody and a commercially available secondary biotin-conjugated antibody and streptavidin-peroxidase.
  • the cell sample is immobilized.
  • the cell sample may also be absorbed to the wall of a plastic dish by conventional methods such that A ⁇ 42 is its Binding specificity, such as for a specific antibody, does not lose.
  • the anti-A ⁇ 42 antibody or fragment thereof is immobilized, that is to say e.g. absorbed on the wall of a plastic shell without losing its binding specificity for Aß42.
  • Detection of binding of the antibody or fragment thereof may be by conventional methods, e.g. Western blot, ELISA, radioimmunoassay (RIA) etc., with RIA and ELISA being preferred.
  • Western blot e.g. Western blot, ELISA, radioimmunoassay (RIA) etc.
  • RIA radioimmunoassay
  • the (reduced) localization of Aß42 in the nucleus is indirectly determined by its gene regulatory effects, wherein preferably the gene regulatory activity (a) is an inhibition of the expression of LRP1 and / or KAU, and / or (b) is an increase in the expression of APP.
  • the change in expression can be determined by conventional methods, for example at mRNA level. The RNA concentration can be measured using specific probes / primers using Northern blot, RT-PCR, etc. On the other hand, the change in expression can also be measured at the protein level using detection methods such as those described above for the detection of A ⁇ 42.
  • the present invention also relates to the use of a ligand specifically binding to A ⁇ 42, preferably an antibody as described above or a fragment thereof for the preparation of a diagnostic agent for determining the presence of a neurodegenerative disease or for determining the risk to develop a neurodegenerative disease.
  • concentration of A ⁇ 42 in a patient cell preferably in the cell nucleus, is determined and compared with a control derived from a healthy patient, preferably a collective of healthy patients from whom an average value was determined.
  • the sample can be taken from the patient by conventional methods, for example via a biopsy or from cerebrospinal fluid and / or blood.
  • the present invention also relates to the use of a gene expression of LRP1 and / or KAU enhancing and / or the gene expression of APP inhibitory compound for the manufacture of a medicament for the prophylaxis and / or therapy of a neurodegenerative disease.
  • Suitable agents for modulating these genes can be identified by those skilled in the art by routine methods.
  • the inhibition of gene expression can be carried out, for example, via siRNA, antisense RNA, ribozymes, etc.
  • the gene products can also be inactivated, e.g. via neutralizing antibodies.
  • gene expression modulating agents are preferably present in combination with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • suitable carriers include, for example, phosphate buffered saline, water, emulsions, for example, oil / water emulsions, wetting agents, sterile solutions, etc.
  • Administration may be oral or, preferably, parenteral. Methods for parenteral administration include topical, intraarterial, intramuscular, subcutaneous, intramedullary, intrathecal, intraventricular, intravenous, intraperitoneal or intranasal administration. The appropriate dosage will be determined by the attending physician and will depend on various factors, such as age, gender, weight of the patient, stage of the neurogenic disease, mode of administration, etc.
  • Both toxic A ⁇ 42 and non-toxic AB42G33A are accumulated in the nucleus of hvim neuroblastoma cells.
  • both A ⁇ 42 and Aß42G33A are not only taken up by the cells but are transported directly into the cell nucleus. Furthermore, shorter A ⁇ species, such as A ⁇ 38 and Aß40 but also the longer form Aß43 are transported into the cell nucleus. It is an active transport process that can be inhibited at 4 ° C.
  • both the toxic A ⁇ 42 and the non-toxic Aß42G33A form accumulate in the nucleus of human neuroblastoma cells.
  • a ⁇ 42 and Aß42G33A were detected in the cell nucleus by means of ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) (FIG. 1). The graph shows that both peptides accumulate in the nucleus of SH-SY5Y cells in a time-dependent manner.
  • Aß42 exerts a transcriptional regulatory function in the nucleus
  • mRNA was isolated from SH-SY5Y cells and generated by RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) cDNA from this mRNA and amplified with the real-time PCR method in several cycles.
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • a fluorophore is used whose intensity is proportional to the amount of reaction product produced so as to measure and determine the amplificate directly during the reaction.
  • a ⁇ 42 can exert a transcriptional regulatory function in the cell nucleus, as demonstrated by the examples LRPl, KAU and APP.
  • Chromatin immunoprecipitation experiments showed that Aß42 binds to certain regions of the DNA Promoters, binds. This results in the recruitment of the histone acetyltransferase Tip60 and the adapter protein Fe65 and presumably to the complex formation with these proteins and the DNA (FIG. 4). The interaction of Aß42 on the promoters of LRP1 and KAU was identified as a specific event since no interaction with Aß42 could be detected at the Hesl promoter.

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Abstract

Beschrieben wird ein Screening-Verfahren nach Wirkstoffen für die Prophylaxe und Therapie neurodegenerativer Erkrankungen, vorzugsweise der Alzheimer Krankheit, wobei die Wirkstoffe den Transport von Aß42 in die Zelle, vorzugsweise den Zellkern, hemmen. Beschrieben werden auch darauf basierende diagnostische und therapeutische Anwendungen.

Description

Screening-Verfahren für Wirkstoffe für die Prophylaxe und Therapie neurodegenerativer Erkrankungen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Screening-Verfahren für Wirkstoffe für die Prophylaxe und Therapie neurodegenerativer Erkrankungen, vorzugsweise der Alzheimer Krankheit, wobei die Wirkstoffe den Transport von Aß42 in die Zelle, vorzugsweise den Zellkern, hemmen.
Die Alzheimer Krankheit (AD) ist eine neurodegenerative Erkrankung und stellt die häufigste Form der Demenzerkrankungen dar. Als wichtigstes pathologisches Merkmal für die Alzheimer Krankheit sind die amyloiden Plaques anzusehen (De Groot et al., FEBS J. 273 (2006), S. 658-668). Die amyloiden Plaques bestehen aus extrazellulären Aggregaten des Amyloid-ß-Peptids (Aß) , welches ein Spaltprodukt des Amyloid Vorläuferproteins (APP) ist. Lösliche Aß Peptide stellen ein spezifisches Merkmal der AD dar. Die löslichen Formen können oligomerisieren und sind dann als Dimere, Tetramere und bis zu Dodecameren und höheren Aggregaten nachweisbar und können dann weiter zu Fibrillen aggregieren. Diese Fibrillen finden sich z.B. in den amyloiden Plaques im Gehirn von Patienten.
Stand der Forschung ist, dass vor allem die löslichen Formen des Aß mit einer Länge von 42 Resten (Aß42) und hier vor allem die Aß42 Dimere, Trimere und Tetramere, für den Neuronenverlust und damit den kognitiven Leistungsverlust verantwortlich sind, nicht jedoch Fibrillen oder Plaques. Ein Bezug zu den pathologischen Merkmalen (Plaques und Neurofibrillenbündel ) auf molekularer Ebene konnte nicht direkt gezeigt werden. In einem Review-Artikel von Shaw et al. (Shaw et al., Nature Reviews, Vol. 6, April 2007, S. 295- 303) werden mögliche Mechanismen und Biomarker für Alzheimer diskutiert . Trotz zahlreicher in vi tro-Studien ist bis heute der molekulare Mechanismus der Entstehung der Toxizität unentdeckt geblieben. Die Toxizität der oligomeren Formen wird als Zelltod und Inhibition der "Long-Term-Potentiation (LTP) " in Zellkultursystemen und Tiermodellen gemessen. Die daraus entwickelten Hypothesen nehmen an, dass (a) Aß Oligomere über hydrophobe Wechselwirkung mit Lipiden in Zellmembranen sog. Poren bilden, die die Membranen zerstören und den Ionenhaushalt aus dem Gleichgewicht bringen, bzw. (b) über einen Rezeptor-vermittelten Mechanismus den Zelltod verursachen (Walsh et al. (2007), J. Neurochem. 101, S.1172- 1184)
Münter et al . (Münter et al . (2007), EMBO J. 26, S. 1702-1712) konnten zeigen, dass APP drei konsekutiv aufeinanderfolgende GxxxG (Glycin, drei beliebige Aminosäuren außer Prolin, Glycin) Dimerisierungsmotive enthält, wobei besonders die Motive an den Aß Positionen G29 und G33 eine essentielle Rolle in der Prozessierung des APP spielt. Es konnte gezeigt werden, dass durch Punktmutation der Glycine zu einem Alanin nicht mehr vornehmlich Aß42 gebildet wird, sondern es zu einem seguentiellen Weiterschneidens des Peptides kommt, wobei kürzere Aß Spezies wie Aßl-38 und Aßl-34 entstehen. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass dieser toxische Effekt aufgehoben werden kann, wenn das Glycin an Aß Position 33 zu einem Alanin oder Isoleucin mutiert wird. Diese Erkenntnisse bieten gute Ansätze für die Entwicklung von Strategien zur Prophylaxe bzw. Therapie der Alzheimer Krankheit. Aufgrund der Dringlichkeit der Möglichkeit der effizienten
Behandlung/Prophylaxe der Alzheimer Krankheit ist es jedoch wichtig, nach weiteren therapeutischenn Konzepten Ausschau zu halten . Somit liegt der vorliegenden Erfindung das technische Problem zugrunde, Verfahren zur Identifizierung von Wirkstoffen bereitzustellen, die für eine Prophylaxe bzw. Therapie der Alzheimer Krankheit bzw. anderer neurogenerativer Erkrankungen geeignet sind.
Die Lösung dieses technischen Problems wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erzielt.
Von den Erfindern wurde gefunden, dass Aß Peptide in die Zelle aufgenommen werden können und dort ihre toxische Wirkung ausüben. In den zu der vorliegenden Erfindung führenden Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass sowohl Aß42 als auch Aß42G33A nicht nur von den Zellen aufgenommen werden, sondern unmittelbar in den Zellkern transportiert werden. Mit Hilfe konfokaler Laser Scanning Mikroskopie und elektronenmikrospkopischer Aufnahmen konnten die Erfinder Aß42 sowohl im Zellkern, als auch im Cytoplasma, nachweisen. Die experimentellen Daten belegen, dass das toxische Peptid Aß42 im Zellkern humaner Neuroblastoma Zellen akkumuliert und eine transkriptions-regulatorische Funktion ausüben kann. An den untersuchten Beispielen konnte nachgewiesen werden, dass Aß42 spezifisch supprimierend auf die Transkription von LRP1 und KAU, aber aktivierend auf die Transkription von APP wirkt. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass das nicht toxische Peptid Aß42G33A keinen Einfluss auf die Expression der mRNA- Spiegel der untersuchten Gene hat. Aus den untersuchten familiären Fällen der AD ist bekannt, dass eine vermehrte Produktion von Aß42 und ein verändertes Verhältnis der Aß- Spezies Aß40 und Aß42 für die AD ursächlich sein können. Ungeklärt ist, warum Aß42 eine Schlüsselrolle beim Neuronenverlust einnimmt und daraus kognitive Defizite entstehen. Es wird davon ausgegangen, dass Aß42 auch andere als die gezeigten Gene beeinflussen kann, die für das Lernen und das Gedächtnis eine entscheidende Rolle spielen und damit therapeutische Ziele darstellen. Aufgrund des neuen Befundes, dass Aß42 im Zellkern eine regulatorische Funktion einnimmt, werden neue Ansätze zur Diagnostik bzw. Therapie der Alzheimer Krankheit möglich.
So wird von den Erfindern gezeigt, dass Aß42 an bestimmte Regionen der DNA, an Promotoren, bindet. Dabei kommt es zur Rekrutierung der Histon-Acetyltransferase Tip60 und des Adapterproteins Fe65 und vermutlich zur Komplexbildung mit diesen Proteinen und der DNA (Figur 4) . Die Interaktion von Aß42 an den Promotoren von LRP1 und KAU wurde als ein spezifisches Ereignis identifiziert, da am Hesl Promotor keine Interaktion mit Aß42 nachgewiesen werden konnte.
Nach einer Illumina-Studie mit einem HT12-v3 Chip konnte gezeigt werden, dass noch weitere Gene durch das neurotoxische Ab42 beeinflusst werden. Unter anderem konnten Gene zweier Genfamilien und ein Transkriptionsfaktor identifiziert werden (ID 1-3; IGFBP 3/5 und LM04 ) , die durch den Einfluss von Aß42 nach 8h Inkubation signifikant hochreguliert wurden (Figur 5) .
Die in der vorliegenden Erfindung gewonnenen Erkenntnisse finden unter anderem die folgenden Anwendungsmöglichkeiten:
(1) Screening nach Genen, die für das Lernen und das Gedächtnis unerlässlich sind und die durch Aß42 oder andere in den Kern importierte Aß-Formen reguliert werden.
(2) Screening nach zytoplasmatischen Transportmolekülen, die den späteren Kernimport von Aß42 oder andere in den Kern importierte Aß-Formen ermöglichen.
(3) Identifizierung von Inhibitoren für den Kernimport von Aß42, um die Gen-regulatorische Wirkung von Aß42 oder andere in den Kern importierter Aß-Formen zu verhindern.
Kürzlich konnte für die autosomal-dominant vererbte Polyglutamin-Erkrankung, bei der sich Polyglutaminaggregate im Kern bilden, gezeigt werden, dass Aggregate im Zellkern weitaus toxischer sind als Aggregate, die im Zytosol lokalisiert sind (Iwata et al . (2009), Journal Biol. Chem. 284, S. 9796-9803) . Am Abbau der Aggregate im Kern sind Ubiquitin- Ligasen wie Sanlp und UHRF-2 beteiligt, die die Poly-Q induzierte Toxizität wieder aufheben. Analog dazu ergibt sich für die vorliegende Erfindung:
(4) Aktivierung des Ubiquitin-Proteasom-Systems , das am Abbau von amyloiden Aggregaten von Aß42 analog zu pQ Aggregaten im Kern beteiligt ist.
Die vorliegenden Erkenntnisse sind auch von Nutzen für:
(a) Diagnose (Nachweis der Akkumulation von Aß42 im Zellkern (z.B. über Biopsien)); und
(b) Therapie (Verhinderung der Aufnahme von Aß42 (oder anderen Gen-regulatorischen Formen von Aß) in die Zelle, bzw. den Kern, Verhinderung bzw. gezielte Beeinflussung der Genregulatorischen Wirkungen von Aß42 (oder anderen Genregulatorischen Formen von Aß) , Aktivierung von Abbaumechanismen im Zellkern, die auf Aß42 wirksam sind) .
Kurze Beschreibung der Figuren
Figur 1; Zeitabhängige Akkumulation von A) Aß42 und B) Aß42G33A im Zellkern humaner Neuroblastoma Zellen
Die Quantifizierung erfolgte mittels ELISA als relative Menge gegenüber dem Wert bei 0 Stunden angenommen als 1.0, d.h. ohne Zugabe von synthetischem Peptid.
Figur 2: mRNA Expression nach Inkubation mit Aß42
Mittels RT-PCR wurde cDNA aus isolierter mRNA generiert. mRNA- Expression von LRP1 und KAIl zeigte eine signifikante Abnahme nach 4 und 6 h Inkubation der Zellen mit Aß42. Nach 8 h Inkubation kam es zu einer signifikanten Zunahme von APP. Die mRNA-Spiegel von BACEl und Hesl wurden nicht beeinflusst.
Figur 3: mRNA Expression nach Inkubation mit Aß42G33A
Mittels RT-PCR wurde cDNA aus isolierter mRNA generiert. Aß42G33A hat keinen Einfluss auf die mRNA Expression von LRP1, KAU, Hesl, APP und BACEl.
Figur 4: Chromatinimmunopräzipitation (ChIP) von DNA- Fragmenten der Promotoren von LRP, KAU und Hesl
Input: eingesetzte DNA. Kontrollen: algG, ap50.
(A) Hesl Promotor: es konnte zu keiner Zeit eine Interaktion von Aß und dem Promotor nachgewiesen werden.
(B) LRP1 Promotor: nach 0,5 h Inkubation mit Aß42 konnte Aß42 an dem Promotor detektiert werden. Nach 1 h wurden Tip60 und Fe65 detektiert. Nach 8 h Inkubation mit Aß42 konnten Tip60 und Fe65 nicht mehr auf dem Promotor detektiert werden, Aß42 verbleibt auf dem Promotor.
(C) KAU Promotor: nach lh Inkubation mit Aß42 wurde dieses auf dem Promotor detektiert. Der Co-Repressor N-CoR wurde nicht mehr detektiert. Nach 2 h Inkubation wurden Tip60 und Fe65 detektiert. Nach 6 h Inkubation konnten Tip60 und Fe65 nicht mehr auf dem Promotor detektiert werden, der Co- Repressor N-CoR wurde nicht detektiert, Aß42 verbleibt auf dem Promotor .
Figur 5: mRNA Expression nach Inkubation mit Ab40, Ab42 und Aß42G33A.
Aus isolierter mRNA wurde mittels RT-PCR cDNA generiert und diese mittels qRT-PRC analysiert. Ab42 führt zu einer signifikanten Zunahme der mRNA von ID1-3, IGFBP3/ 5 und LM04 nach 8h Inkubation, wogegen Ab40 und Aß42G33A keinen Einfluss auf die mRNA Expression haben. Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Screenen von Wirkstoffen zur Prophylaxe und/oder Therapie einer neurodegenerativen Erkrankung, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
(a) Inkontaktbringen von Zellen in Gegenwart von (i) Aß42 und (ii) eines Wirkstoffkandidaten unter Bedingungen, die deren Aufnahme durch die Zellen erlauben; und
(b) Bestimmung der zellulären oder subzellulären Lokalisation von Aß42 in den Zellen;
wobei eine verringerte zelluläre oder subzelluläre Lokalisation von Aß42 im Vergleich zu einer Kontrolle ohne Wirkstoffkandidaten darauf hinweist, dass der
Wirkstoffkandidat für die Prophylaxe/Therapie einer neurodegenerativen Erkrankung geeignet ist.
Die optimalen Zeiten zwischen den Schritten (a) und (b) können vom Fachmann durch Routine-Experimente bestimmt werden und liegen in der Regel zwischen 20 min und mehreren Stunden (Aufnahme in die Zelle) bzw der Nachweis über Zellfraktionierung (Stunden bis zu einem Tag, Zentrifugation und anschl ELISA bzw Western blot, ca. 1 Tag). Hier handelt es sich um Arbeitsabläufe, die im Labor standardisiert sind und nicht nur für die hier beschriebenen Experimente gelten.
Bei dem erfindungsgemäßen Screening-Verfahren können Aß42 und der Wirkstoffkandidat gleichzeitig oder nacheinander (mit zeitlicher Verzögerung) verabreicht werden, z.B. der Wirkstoffkandidat vor Aß42.
Der hier verwendete Begriff „neurodegenerative Erkrankung" umfasst jede Form neurodegenerativer Erkrankungen oder Demenzerkrankungen, beispielsweise Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson, Chorea Huntington, Amyotrophe Lateralsklerose, Lewy-Körperchen-Demenz , Morbus Pick ( Frontotemporale Demenz) , Progressive supranukleäre Blickparese, Kortikobasale
Degeneration, und Multiple Sklerose (MS) .
Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Zellen können aus verschiedenen Quellen stammen, z.B. Säuger (z.B. Nagetiere, Menschen, Primaten usw.) Hühner etc. Vorzugsweise handelt es sich bei den in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Zellen um Säugerzellen, wobei humane Zellen bevorzugt sind.
Besonders bevorzugt sind neuronale Zellen, wobei Neuroblastoma-Zellen am meisten bevorzugt sind. Ein Beispiel für eine besonders bevorzugte Neuroblastoma-Zelle ist eine SH- SY5Y-Zelle. Weitere geeignete Zelllinien sind alle im Labor gebräuchlichen Zelllinien, z.B. CHO, HEK293, COS7, Fibroblasten oder N2a.
Die in dem erfindungsgemäßen Screening-Verfahren Verwendung findenden Zellen können Bestandteil eines nicht-menschlichen Organismus sein (Tiermodell) , eines Gewebes oder in Zellkultur vorliegen. Bei nicht-neuronalen Zellen kann es sich um primäre Zellkulturen handeln oder Zell-Linien, die davon abgeleitet sind. Die nicht-neuronalen Zellen und die neuronalen Zellen können autolog, allogen oder xenogen sein.
Die Zellen können in allgemein bekannten Wachstumsmedien kultiviert werden. Säugerzellen können beispielsweise in einer in-vitro-Kultur in verschiedenen Nährmedien, die für Säugetierzellen geeignet sind, gehalten werden, beispielsweise Neurobasal- oder L15-Medien (Life Technologies, Rockville, Maryland) , die durch verschiedene Verbindungen ergänzt werden können, z.B. Antibiotika, Vitamine, trophische Faktoren, fetales Serum usw.. Vorzugsweise werden die Zellen in Neurobasalmedium, ergänzt durch Nährstoffe und
Wachstumsfaktoren, kultiviert. Die Zellen können mehrere Tage oder Wochen erhalten werden, ohne ihre Eigenschaften zu verlieren. Vorzugsweise werden sie kurz nach ihrer Herstellung verwendet, d.h. vorzugsweise innerhalb einer Woche nach der Herstellung .
Im Allgemeinen werden die Zellen der/den Kandidaten- Verbindung (en) zwischen 1 nM und 1 mM ausgesetzt, für Aß42 gelten Konzentration im Bereich nano- bis mikromolarer Konzentrationen, die für die jeweilige Zelllinie unterhalb der LD Konzentration liegt (abhängig vom jeweiligen Labor zB bei SY5Y Zellen bei etwa ΙΟμ ) . Weiterhin kann jede Verbindung parallel bei verschiedenen Konzentrationen getestet werden. Es können auch, falls erforderlich, verschiedene Zusätze und/oder Vektoren und/oder Produkte, die den Verbindungen helfen, in die Zellen einzudringen, hinzugefügt werden, z.B Liposome, kationische Lipide oder Polymere, Penetratin, Tat PDT, Peptide von Adenoviren (z.B. Penton) oder anderen Viren usw.
Das Inkontaktbringen kann in bekannten Trägern durchgeführt werden, z.B. Platten, Rohre, Kolben und dergleichen. Im Allgemeinen erfolgt das Inkontaktbringen in Platten mit zahlreichen Löchern, die es ermöglichen, parallel zahlreiche Versuche durchzuführen. Typische Träger sind. z.B. ikrotiterplatten, insbesondere das 384-Löcher-
Mikrotiterplatten-Format , das leicht zu handhaben ist.
Der hier verwendete Ausdruck „Inkontaktbringen von Zellen" bezieht sich auf das Inkontaktbringen von Zellen, die als Organismus, d.h. als nicht-humaner Organismus, vorzugsweise Säuger vorliegen oder beispielsweise als Zellkultur, die unter Bedingungen gehalten bzw. gezüchtet wird, die die Aufnahme des Wirkstoffkandidaten (und Aß42) in die Zellen erlauben.
Der hier verwendete Ausdruck „in Gegenwart von Aß42 unter Bedingungen, die dessen Aufnahme durch die Zellen erlauben" beinhaltet auch die Aufnahme von Aß42 in den Zellkern, wobei hier (a) Aß42 von außen, beispielsweise über das Kulturmedium zugeführt werden kann, oder (b) im Cytoplasma nach Expression einer heterologen Nukleinsäure anwesend ist, die für Aß42 kodiert, mit der die Zelle vorher transformiert wurde.
Die Bestimmung der zellulären oder subzellulären Lokalisation von Aß42 in den Zellen kann durch Routineverfahren erfolgen, z.B. anhand spezifisch an Aß42 bindender Liganden, vorzugsweise Antikörper, nach vorangegangener
Zellfraktionierung, z.B durch ELISA, Western blot oder durch mikroskopische Techniken über Fluoreszenzmarkierung zusammen etwa mit den entsprechenden Markern wie kernspezifische Proteine oder DNA, sowie weiterer, nachstehend noch näherer beschriebener Verfahren. Hinsichtlich der vorstehend erwähnten Verfahren sowie noch nachfolgend genannten Verfahren, die allesamt Routineverfahren sind, wird auf Standardwerke der Labortechnik verwiesen, z.B. „Molecular Biomethods Handbook", Edit.: J. Walker, Ralph Rapley, Humana Press, 2nd. Edition, 2008, oder Janeway „Immunologie", Spektrum Verlag, 7. Auflage, 2009.
Der hier verwendete Ausdruck „Wirkstoffkandidat" betrifft bisher bekannte oder unbekannte Substanzen, wobei die zu untersuchenden Substanzen in keiner Weise beschränkt sind, d.h., es kann sich um sehr unterschiedliche Testverbindungen handeln. Dabei kann es sich um natürlich vorkommende und synthetische, organische oder anorganische Verbindungen sowie um Polymere (z.B. Oligopeptide, Polypeptide, Oligonucleotide und Polynukleotide) , kleine Moleküle, Antikörper, Zucker, Fettsäuren, Nucleotide und Nuukleotid-Analoga, Analoga natürlich vorkommender Strukturen (z.B. Peptid-„Imitatoren" , Nukleinsäure-Analoga etc.) und weitere Verbindungen handeln. Als Ausgangsmaterial für möglicherweise nützliche
Testverbindungen können auch Extrakte natürlicher Produkte Verwendung finden. Solche Extrakte können aus verschiedenen Quellen stammen, z.B. Pilzen, Actinomyceten, Algen, Insekten, Protozoen, Pflanzen und Bakterien. Aktivität aufweisende Extrakte können dann zur Isolation des aktiven Wirkstoffs weiter analysiert werden.
Bei der Testverbindung kann es sich um eine einzelne Verbindung oder ein Gemisch handeln. Somit können die Testverbindungen auch im großen Maßstab gescreent werden. Somit sind in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Screening-Verfahrens die Testverbindungen Bestandteil einer Substanzbibliothek. Dabei können, je nach Ausgestaltung des Verfahrens, die Testverbindungen zu einem Kulturmedium gegeben werden, in eine Zelle injiziert werden, etc .
Wenn eine Probe mit einer nützlichen Testverbindung oder einem Gemisch im erfindungsgemäßen Screening-Verfahren identifiziert wurde, kann daraus entweder die fragliche Testverbindung isoliert werden oder die ursprüngliche Probe kann - falls sie ein Gemisch unterschiedlicher Verbindungen enthält fraktioniert werden, um so die Anzahl unterschiedlicher Verbindungen pro Probe zu reduzieren. Das erfindungsgemäße Verfahren wird dann mit den einzelnen Fraktionen wiederholt.
Assayformate zur Identifizierung positiver Testverbindungen sind allgemein bekannt und können - falls erforderlich - vom Fachmann nach Bedarf modifiziert werden.
Die mittels des erfindungsgemäßen Screening-Verfahrens isolierten Verbindungen sind als therapeutische Wirkstoffe für die Behandlung, Prävention, Kontrolle oder Linderung einer neurologischen Erkrankung, vorzugsweise AD, geeignet oder diese können als sog. „Leitstrukturen" zur Entwicklung analoger Verbindungen dienen, d.h., Wirkstoffen, die zusätzliche gewünschte Eigenschaften aufweisen, z.B. die Blut/Hirn-Schranke gut passieren können, bzw. bestimmte unerwünschte Nebenwirkungen verlieren oder eine höhere Halbwertszeit (Clearing-Rate) aufweisen.. Außerdem können solche optimierten Verbindungen eine stabilisierte Elektronenkonfiguration und molekulare Konformation aufweisen, wobei die funktionellen Schlüsselgruppen im Wesentlichen wie bei der Ausgangsverbindung präsentiert werden können. Vorzugsweise haben die analogen Verbindungen räumliche elektronische Eigenschaften, die mit der Bindungsregion der Ausgangverbindung vergleichbar sind, sind jedoch kleiner, weisen z.B. nur noch ein Molekulargewicht unter 2 kD, vorzugsweise unter 1 kD auf. Die Herstellung/Identifizierung solcher analoger Verbindungen kann durch übliche Verfahren erfolgen, z.B. SCF-Analyse oder CI-Analyse. Die pharmakologischen Eigenschaften dieser analogen Verbindungen können ebenfalls mittels bekannter Verfahren bestimmt werden. Solche Wirkstoffe können z.B. den Import von Aß42 in die Zelle, vorzugsweise den Zellkern hemmen, um so z.B. die Genregulatorische Wirkung von Aß42 oder andere in den Kern importierter Aß-Formen zu verhindern.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Lokalisation von Aß42 im Zellkern bestimmt. Dies kann durch gängige Nachweisverfahren erfolgen, z.B. ELISA, Western Blot, Fluoreszenz-Cytometrie . Vorzugsweise erfolgt die Bestimmung der Lokalisation nachdem vor Verfahrensschritt (b) die Zellen subzellulär fraktioniert wurden und die einzelnen Zellfraktionen, z.B. die Zellkerne enthaltende Fraktion, getrennt auf Anwesenheit von Aß42 getestet werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens basiert der Nachweis von Aß42 auf der Bindung eines spezifischen Liganden, der vorzugsweise mit einem nachweisbaren Marker versehen ist. Am meisten bevorzugt ist ein immunologisches Verfahren. So kann die Anwesenheit/Konzentration von Aß42 dadurch bestimmt werden, dass man die Probe mit einem anti-Aß42-Antikörper oder einem Fragment davon in Berührung bringt und sodann die Bindung des anti-Aß42-Antikörpers oder des Fragments davon an Aß42 bestimmt. Bei den dafür geeigneten Antikörpern kann es sich um monoklonale, polyklonale oder synthetische Antikörper oder Fragmente davon handeln. In diesem Zusammenhang bedeutet der Begriff „Fragment" alle Teile des monoklonalen Antikörpers (z.B. Fab-, Fv- oder „Single chain Fv"-Fragmente) , welche die gleiche Epitopspezifität wie der vollständige Antikörper aufweisen. Die Herstellung solcher Fragmente ist dem Fachmann bekannt. Vorzugsweise handelt es sich bei den Antikörpern um monoklonale Antikörper. Die Antikörper können gemäß Standardverfahren hergestellt werden, wobei vorzugsweise Aß42 oder ein synthetisches Fragment davon als Immunogen dienen. Dieses Polypeptid oder Peptid bzw. das Fragment davon können z.B. durch Gewinnung des entsprechenden Gens, Klonierung und rekombinante Expression erzeugt werden. Verfahren zur Gewinnung monoklonaler Antikörper sind dem Fachmann bekannt.
In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Aß42-Konzentration über einen primären monoklonalen anti-Aß42-Antikörper und einen im Handel erhältlichen sekundären Biotin-konj ugierten Antikörper und Streptavidin-Peroxidase bestimmt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Zellprobe immobilisiert. Die Zellprobe kann auch an die Wand einer Plastikschale über übliche Verfahren so absorbiert sein, dass Aß42 seine Bindungsspezifität, etwa für einen spezifischen Antikörper, nicht verliert.
In einer weiteren bevorzugten, alternativen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind der anti-Aß42-Antikörper oder das Fragment davon immobilisiert, d.h., dass er z.B. an der Wand einer Plastikschale absorbiert ist ohne seine Bindungsspezifität für Aß42 zu verlieren.
Der Nachweis der Bindung des Antikörpers oder des Fragments davon kann über übliche Verfahren erfolgen, z.B. Western-Blot , ELISA, Radioimmunassay (RIA) etc., wobei RIA und ELISA bevorzugt sind.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die (verringerte) Lokalisation von Aß42 im Zellkern indirekt durch dessen Genregulatorische Wirkungen bestimmt wird, wobei vorzugsweise die Gen-regulatorische Wirkung (a) eine Hemmung der Expression von LRP1 und/oder KAU ist, und/oder (b) eine Erhöhung der Expression von APP ist. Die Veränderung der Expression kann durch gängige Verfahren bestimmt werden, beispielsweise auf mRNA-Ebene. Dabei kann die RNA-Konzentration unter Verwendung spezifischer Sonden/Primer mittels Northern-Blot , RT-PCR etc. gemessen werden. Andererseits kann die Veränderung der Expression auch auf Protein-Ebene gemessen werden, wobei Nachweisverfahren angewendet werden wie sie beispielsweise vorstehend für den Nachweis von Aß42 beschrieben wurden.
Die vorliegende Erfindung betrifft schließlich auch die Verwendung eines spezifisch an Aß42 bindenden Liganden, vorzugsweise eines wie vorstehend beschriebenen Antikörpers oder eines Fragments davon zur Herstellung eines Diagnosemittels zur Bestimmung des Vorliegens einer neurodegenerativen Erkrankung oder zur Bestimmung des Risikos eine neurodegenerativen Erkrankung zu entwickeln. Dabei wird die Konzentration von Aß42 in einer Patientenzelle, vorzugsweise im Zellkern, bestimmt und mit einer Kontrolle, die von einem gesunden Patienten stammt, vorzugsweise einem Kollektiv gesunder Patienten aus dem ein Mittelwert bestimmt wurde, verglichen. Die Probe kann über gängige Verfahren von dem Patienten entnommen werden, beispielsweise über eine Biopsie oder aus Liquor und/ oder Blut.
Da in den zu der vorliegenden Erfindung führenden Experimenten gezeigt werden konnte, dass davon auszugehen ist, dass Aß42 seine schädlichen Wirkungen durch (a) Verringerung der Genexpression von LRP1 und/oder KAU und/oder (b) Erhöhung der Genexpression von APP entfaltet, betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung einer die Genexpression von LRP1 und/oder KAU erhöhenden und/oder die Genexpression von APP hemmenden Verbindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und/oder Therapie einer neurodegenerativen Erkrankung. Geeignete Wirkstoffe zur Modulation dieser Gene, deren Sequenz bekannt ist, kann der Fachmann durch Routineverfahren identifizieren. Die Hemmung der Genexpression kann beispielsweise über siRNA, antisense-RNA, Ribozyme etc. erfolgen. Andererseits können auch die Genprodukte inaktiviert werden, z.B. über neutralisierende Antikörper.
Für eine Therapie liegen solche, die Genexpression modulierenden Wirkstoffe vorzugsweise in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger vor. Zu geeigneten Trägern zählen beispielsweise Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen etc.. Die Verabreichung kann oral oder, vorzugsweise, parenteral erfolgen. Zu den Verfahren für die parenterale Verabreichung gehören die topische, intraarterielle, intramuskuläre, subkutane, intramedulläre, intrathekale, intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale oder intranasale Verabreichung. Die geeignete Dosierung wird von dem behandelnden Arzt bestimmt und hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise von dem Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht des Patienten, dem Stadium der neurogenerativen Erkrankung, der Art der Verabreichung etc..
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Sowohl das toxische Aß42 als auch die nicht: toxische Form AB42G33A werden im Zellkern hvimaner Neuroblastoma Zellen akkumulier .
Ausgehend von der Hypothese, dass Aß Peptide in die Zelle aufgenommen werden können und dort ihre toxische Wirkung ausüben, konnte gezeigt werden, dass sowohl Aß42 als auch Aß42G33A nicht nur von den Zellen aufgenommen werden, sondern unmittelbar in den Zellkern transportiert werden. Des Weiteren werden auch kürzere Aß Spezies, wie Aß38 und Aß40 aber auch die längere Form Aß43 in den Zellkern transportiert. Es handelt sich um einen aktiven Transportprozess , der bei 4°C inhibiert werden kann. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass sowohl das toxische Aß42 als auch die nicht-toxische Form Aß42G33A im Zellkern humaner Neuroblastoma Zellen akkumulieren. Mittels ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) wurden Aß42 und Aß42G33A im Zellkern nachgewiesen (Figur 1) . Der grafischen Darstellung ist zu entnehmen, dass beide Peptide zeitabhängig im Zellkern von SH-SY5Y-Zellen akkumulieren .
Beispiel 2
Aß42 übt im Zellkern eine transkriptions-regulatorische
Funktion aus Aufgrund des neuen Befunds, dass sowohl Aß42 als auch AB42G33A im Zellkern nachzuweisen sind und dort zeitabhängig akkumulieren, wurde untersucht, ob Aß42 und Aß42G33A eine Genregulatorische Wirkung haben. Deshalb wurde mRNA aus SH-SY5Y- Zellen isoliert und mittels RT-PCR (Reverse Transkription- Polymerase Ketten Reaktion) cDNA aus dieser mRNA generiert und mit der real-time PCR Methode in mehreren Zyklen amplifiziert . Bei dieser speziellen Methode der PCR wird ein Fluorophor benutzt, dessen Intensität proportional zur Menge des entstandenen Reaktionsprodukts ist, um so das Amplifikat direkt während der Reaktion zu messen und zu bestimmen. Es konnte gezeigt werden, dass die Inkubation der Zellen mit dem toxischen Peptid Aß42 zu einer signifikanten Abnahme der mRNA zweier bestimmter Gene führte, LRPl und KAU, und es zu einem signifikanten Anstieg der mRNA des APPs kam. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Aß42 keinen Einfluss auf den mRNA Expressionsspiegel von BACE1 hat. Als Kontrolle wurde der Expressionsspiegel der mRNA von Hesl gemessen, der durch Aß42 nicht beeinflusst wurde (Figur 2).
Untersuchungen der mRNA Expressionsspiegel von Neurobastoma Zellen, die mit dem nicht toxischen Peptid Aß42G33A behandelt wurden, ergaben, dass es zu keiner Varianz der mRNA Expression kam (Figur 3) . Darüber hinaus konnte auch gezeigt werden, dass sowohl die kürzeren Aß-Spezies, wie Aß38 und Aß40, als auch die längere Form Aß43 ebenfalls keinen Einfluss auf die mRNA Expression der untersuchten Gene zeigten.
Dieses Ergebnis führt zu dem Schluss, dass Aß42 im Zellkern eine transkriptions-regulatorische Funktion ausüben kann, wie anhand der Beispiele LRPl, KAU und APP gezeigt werden konnte.
Mit Chromatinimmunopräzipitations-Experimenten (ChIP) konnte gezeigt werden, dass Aß42 an bestimmte Regionen der DNA, an Promotoren, bindet. Dabei kommt es zur Rekrutierung der Histon-Acetyltransferase Tip60 und des Adapterproteins Fe65 und vermutlich zur Komplexbildung mit diesen Proteinen und der DNA (Figur 4). Die Interaktion von Aß42 an den Promotoren von LRP1 und KAU wurde als ein spezifisches Ereignis identifiziert, da am Hesl Promotor keine Interaktion mit Aß42 nachgewiesen werden konnte.
Nach einer Illumina-Studie mit einem HT12-v3 Chip konnte gezeigt werden, dass noch weitere Gene durch das neurotoxische Ab42 beeinflusst werden. Unter anderem konnten Gene zweier Genfamilien und ein Transkriptionsfaktor identifiziert werden (ID 1-3; IGFBP 3/5 und LM04), die durch den Einfluss von Aß42 nach 8h Inkubation signifikant hochreguliert wurden (Figur 5) . In dieser Studie wurden die nicht toxischen Peptide Ab40 und Ab42G33A als Kontrollpeptide verwendet und die Daten
miteinander verglichen. Auch hier konnte gezeigt werden, dass die nicht toxischen Ab-Peptide keinen Einfluss auf die
Genregulation haben.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Screenen von Wirkstoffen zur Prophylaxe und/oder Therapie einer neurodegenerativen Erkrankung, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
(a) Inkontaktbringen von Zellen in Gegenwart von (i) Aß42 und (ii) eines Wirkstoffkandidaten unter Bedingungen, die deren Aufnahme durch die Zellen erlauben; und
(b) Bestimmung der zellulären oder subzellulären Lokalisation von Aß42 in den Zellen;
wobei eine verringerte zelluläre oder subzelluläre Lokalisation von Aß42 im Vergleich zu einer Kontrolle ohne Wirkstoffkandidaten darauf hinweist, dass der
Wirkstoffkandidat für die Prophylaxe/Therapie einer neurodegenerativen Erkrankung geeignet ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zellen neuronale Zellen sind.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Zellen Neuroblastoma- Zellen sind.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Neuroblastoma-Zellen SH-SY5Y-Zellen sind.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Lokalisation von Aß42 im Zellkern bestimmt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei vor Schritt (b) die Zellen subzellulär fraktioniert werden und der Nachweis von Aß42 in der Zellkernfraktion erfolgt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Nachweis ein immunologischer Nachweis ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei die verringerte Lokalisation von Aß42 im Zellkern indirekt durch dessen Gen-regulatorische Wirkungen bestimmt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Gen-regulatorische Wirkung (a) eine Hemmung der Expression von LRP1 und/oder KAU ist, und/oder (b) eine Erhöhung der Expression von APP ist.
10. Verwendung eines spezifisch an Aß42 bindenden Liganden zur Herstellung eines Diagnosemittels zur Bestimmung einer neurodegenerativen Erkrankung oder zur Bestimmung des Risikos eine neurodegenerativen Erkrankung zu entwickeln.
11. Verwendung nach Anspruch 10, wobei der Ligand ein Antikörper ist.
12. Ligand nach Anspruch 10 oder 11 zur Anwendung in einem Verfahren zur Diagnose einer neurodegenerativen Erkrankung.
13. Verwendung einer die Genexpression von LRPl und/oder KAU erhöhenden und/oder die Genexpression von APP hemmenden Verbindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und/oder Therapie einer neurodegenerativen Erkrankung.
14. Die Genexpression von LRPl und/oder KAIl erhöhende und/oder die Genexpression von APP hemmende Verbindung zur Anwendung in einem Verfahren zur Prävention und/oder Therapie einer neurodegenerativen Erkrankung.
15. Verfahren oder Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die neurodegenerative Erkrankung die Alzheimer Krankheit ist.
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