WO2011054992A1 - Procedimiento de modificación química de superficies de pentóxido de tántalo - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a method of chemical modification of surfaces based on tantalum pentoxide (at 2 0s).
  • the modification is applicable to any type of tantalum oxide surface, such as solid supports for immobilizing substances, such as nucleic acids or proteins, with application in the development of detection techniques based on optical waveguides.
  • DNA and RNA as well as antigen-antibody interactions with high sensitivity is increasingly interesting for the development of early diagnostic devices such as genomic, proteomic, disease detection, etc.
  • microarray based on the receptor-analyte interaction, is replacing traditional tests that use gels, filters and columns, with chips of different materials capable of storing tens of thousands of probes (acid sequences nucleicides, proteins, etc.), which provide information on levels of gene expression, protein synthesis, single nucleotide polymorphisms (Single Nucleotide Polymorphisms or SNPs), drugs, etc.
  • the surfaces used for microarrays should preferably be flat and uniform, so as to allow the anchoring of a large number, of the order of up to hundreds or thousands, of spatially arranged substances.
  • the detection and quantification of results is carried out by fluorescence or colorimetry and, to a lesser extent, by mass spectroscopy, using it functionalized substances with a suitable marker.
  • the most frequent markers are fluorophores with excitation wavelengths in the UV / visible and emissions between 500 and 800 nm.
  • the technologies that use flat waveguides are based on the excitation of the fluorescent marker through an evanescent field, so that the excitation and detection of the fluorophore is restricted to the sensor surface, while the signal due to substances not anchored or in solution, it is not detected.
  • This translates into a significant increase in the signal-to-noise ratio compared to conventional optical detection methods.
  • this technology takes advantage of the high intensity of the field and its confinement in the proximity of the waveguides, to provide a highly sensitive and selective detection.
  • the flat waveguides consist of a thin layer of a material with a high refractive index such as tantalum pentoxide or titanium oxide, deposited on a solid support, preferably transparent and with a low refractive index (such as glass or certain polymers).
  • a material with a high refractive index such as tantalum pentoxide or titanium oxide
  • oxide surfaces There are also alternative techniques for coating oxide surfaces, among which are: hydroxamic acids on oxides of copper, silver, titanium, aluminum, zirconium and iron (Folkers, JP, et al., Langmuir, 1995, 11, 813-824 ); carboxylic acids on aluminum oxides (Aronoff, Y.G., et al., J. Am. Chem.
  • tantalum pentoxide In the case of tantalum pentoxide, however, few surface modifications aimed at immobilization of probes are known. The best known is based on the use of an-substituted alean-phosphates and phosphonates, which have proven to be very effective compounds for the formation of SAMs on transition metal oxide surfaces such as titanium oxide (Tosatti, S. et. to the, Langmuir, 2002), niobium oxide and tantalum pentoxide (Textor, M. et al. Langmuir, 2000, 16, 3257-3271).
  • the functional groups located at the other end of the chain allow the modification of the surface properties (hydrophobicity, electric charge, etc.), as well as the adsorption or covalent binding of proteins.
  • Another interesting alternative is the adsorption of multifunctional polymers (polylysine, polyethylene glycol) that allow immobilizing the capture elements required for the tests.
  • the present invention relates to a new method for modifying at least one Tantalum pentoxide surface, characterized in that it comprises at least the following stages:
  • the surface of tantalum pentoxide will be deposited on at least one of the faces of a solid support, which will preferably consist of a transparent support with a low index of refraction, preferably glass or a polymeric compound, and more preferably glass substrates (chips).
  • said tantalum pentoxide surface will be deposited on at least one of the faces of a solid support, forming a layer of a few nanometers thick, preferably between 100 and 200 nm, and more preferably between 130 and 170nm
  • modified tantalum pentoxide characterized by comprising at least one group selected from a thiol group, an amino group, an aldehyde group and an isocyanate or isothiocyanate group.
  • the organosilane will preferably consist of 3-mercaptopropyl triethoxysilane.
  • the solution will comprise 1 to 3-mercaptopropyl triethoxysilane and from 2 to 5% water in a mixture 0.05 to 0.25M of acetic acid in methanol.
  • the solution will comprise 2 to 3% 3-mercaptopropyl triethoxysilane and 3 to 4% water in a 0.1 to 0.2M mixture of acetic acid in methanol.
  • tantalum pentoxide Once the surfaces of tantalum pentoxide have been immersed in this solution for a certain time, preferably 1 to 3 hours, and more preferably 1.5 hours, they will be washed with methanol and dried, preferably with pressurized air or by centrifugation.
  • the tantalum pentoxide surfaces so treated will be prepared for the immobilization of the receptors comprising thiol groups in their structure, by the formation of disulfide bridges.
  • the solution will comprise 1 to trimethoxysilylpropyl ethylenediamine and 2 to 5% water in a 0.05 to 0.25M mixture of acetic acid in methanol.
  • the solution will comprise 2 to 3% of 3-mercaptopropyl triethoxysilane and 3 to 4 ⁇ 6 of water in a 0.1 to 0.2M mixture of acetic acid in methanol.
  • the process may also comprise an additional step, after drying, of treating the surfaces of tantalum pentoxide with a solution comprising at least one compound with at least two aldehyde groups, preferably glutaraldehyde, or at least two isothiocyanate groups, preferably p-phenylenediothiocyanate.
  • this solution will comprise from 0.05 to 1%, and more preferably from 0.1 to 0.5%, glutaraldehyde in, preferably, a saline phosphate regulatory solution, more preferably, PBSlx, although it may also be a water solution without salts; or from 0.5 to 1% of p-phenylenedisothiocyanate in an aprotic solvent, preferably, in toluene.
  • this treatment will be carried out for a time of 1.5 to 5 hours, more preferably, for 2 hours.
  • the tantalum pentoxide surfaces thus treated will be washed with water and preferably dried by pressurized air.
  • the solution will comprise 1 to 3-isocyanatopropyl triethoxysilane and 0.01 to 0.1% water in an aprotic and preferably non-polar solvent, preferably selected from a group consisting of hexane , cyclohexane, toluene and xylene.
  • the solution will comprise 2 to 3% 3-isocyanate propyl triethoxysilane and 0.01% water in hexane or cyclohexane.
  • said biomolecules may be nucleic acids of different molecular weights, both single stranded and double stranded, containing at least one amino group or a thiol group. These nucleic acids may be immobilized by covalently binding with at least one isothiocyanate, isocyanate, aldehyde or thiol group of the modified tantalum pentoxide surface.
  • said biomolecules may consist of proteins or PNA molecules.
  • the immobilization will occur by forming covalent bonds between the surface of modified tantalum pentoxide and at least one lysine residue of the protein or by forming disulfide bridges between the surface of modified tantalum pentoxide and at least one cysteine residue of said protein.
  • Figure 1 shows the results of the immobilization of different concentrations (of 5-50 ⁇ g / ml) of GAR-Cy5 (goat antibody against rabbit labeled with Cy5) on the modified surface and on controls, where the Assay corresponds to the surface modified; Blank 1 to the surface without treatment; Blank 2 on the surface without amin-organosilane and Blank 3 on the surface without glutaraldehyde.
  • GAR-Cy5 goat antibody against rabbit labeled with Cy5
  • Figure 2 represents the fluorescence emission intensity for 5-50 ⁇ g / mL GAR-Cy5 on the modified surface and on controls, where El corresponds to the modified surface, Cl to the untreated surface; C2 to the surface without amin-organosilane and C3 to the surface without glutaraldehyde.
  • Figure 3 shows the results of the immobilization of GAR-Cy5 at different concentrations, on the surface treated with 3-isocyanatopropyltriethoxysilane and on an untreated surface control.
  • Figure 4 represents the net fluorescence emission intensity for increasing concentrations of GAR-Cy5, on the isocyanate modified surface and on an untreated surface control.
  • Figure 5 shows the results of the immobilization of GAR-Cy5 at different concentrations on the mercaptosilane treated surface and on an untreated surface control.
  • Figure 6 represents the intensity of net fluorescence emission for increasing concentrations of GAR-Cy5, on the modified surface with thiol group and on a control of the untreated surface.
  • Figure 7 shows the results of the oligonucleotide probe immobilization test on the surface treated with isocyanate (at probe concentrations of 1 and 5 ⁇ ).
  • Figure 8 shows the results of the hybridization test of the complementary chain to the immobilized probe on the surface treated with isocyanate (at probe concentrations of 10 and 25 ⁇ and at hybridization concentration of 50 nM).
  • a solution of 2.3% 3-mercaptopropyl triethoxysilane and 3.7% water was prepared in a 0.15M mixture of acetic acid in methanol.
  • the tantalum pentoxide surfaces deposited on one of the faces of a glass substrate support (chips) were immersed in said solution forming a 150nm thick layer. After 1.5 h, the chips were washed with methanol and dried with pressurized air.
  • the aminated probe was immobilized at different concentrations (1, 5, 10 and 25 ⁇ ) and after blocking with OVA 1% in PBSlx for 30 minutes, the chip was treated with a hybridization solution (6xSSC, 0.6% SDS, 0.1% salmon sperm DNA and 2% BSA) containing different concentrations of the chain complementary to the immobilized probe , marked with Cy5. After 2 hours of incubation and the corresponding washes, the fluorescence of the surface was recorded, observing efficacy in hybridization for concentrations up to 50 nM of the complementary chain, as shown in Figure 8.
  • the background fluorescence was also practically unchanged after chemical treatment, in relation to the background fluorescence of the untreated surface, decreasing 7.5% for the case of isocyanate, increasing 8% for glutaraldehyde and increasing 3.5% for mercaptan, which demonstrates the adequacy of the procedure for the object of the invention.

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Abstract

La presente invención se refiere a un nuevo procedimiento para la modificación de al menos una superficie de pentóxido de tántalo, caracterizado porque comprende, al menos, las siguientes etapas: a) la preparación de una disolución de al menos un organosilano que comprende en su estructura al menos un grupo seleccionado entre un grupo tiol, un grupo amino primario o secundario y un grupo isocianato o isotiocianato; b) la introducción en dicha disolución de la superficie de pentóxido de tántalo hasta obtenerse la superficie de pentóxido de tántalo modificada. Asimismo, será objeto de esta invención la aplicación de dichas superficies de pentóxido de tántalo modificadas, preferentemente, en dispositivos ópticos de detección basados en guias de onda y anclaje covalente de biomoléculas.

Description

Procedimiento de modificación química de superficies de pentóxido de tántalo
CAMPO TÉCNICO
La presente invención se refiere a un procedimiento de modificación química de superficies a base de pentóxido de tántalo ( a20s) . La modificación es aplicable a cualquier tipo de superficie de óxido de tántalo como, por ejemplo, soportes sólidos para inmovilizar sustancias, tales como ácidos nucleicos o proteínas, con aplicación en el desarrollo de técnicas de detección basadas en guías de onda ópticas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La detección de ADN y ARN, así como de interacciones antígeno-anticuerpo con elevada sensibilidad es cada vez más interesante para el desarrollo de dispositivos de diagnóstico precoz como por ejemplo, en genómica, proteómica, detección de enfermedades, etc.
La tecnología de micromatrices (del inglés, microarrays) , basada en la interacción receptor-analito, está reemplazando a los ensayos tradicionales que utilizan geles, filtros y columnas, por chips de diferentes materiales capaces de almacenar decenas de miles de sondas (secuencias de ácidos nucleicos, proteínas, etc.), que proporcionan información sobre los niveles de expresión génica, síntesis de proteínas, polimorfismos de un solo nucleótido (Single Nucleotide Polymorphisms o SNPs) , fármacos, etc.
Las superficies empleadas para microarrays deben ser, preferentemente, planas y uniformes, de modo que permitan el anclaje de un elevado número, del orden de hasta centenares o miles, de sustancias dispuestas espacialmente . La detección y cuantificación de resultados se efectúa mediante fluorescencia o colorimetría y, en menor medida, por espectroscopia de masas, utilizando para ello sustancias funcionalizadas con un marcador adecuado. Los marcadores más frecuentes son fluoróforos con longitudes de onda de excitación en el UV/visible y emisiones entre 500 y 800 nm.
En este sentido, las tecnologías que emplean guías de onda planas se basan en la excitación del marcador fluorescente a través de un campo evanescente, con lo que la excitación y detección del fluoróforo se restringe a la superficie sensora, mientras que la señal debida a sustancias no ancladas o en disolución, no es detectada. Esto se traduce en un incremento significativo de la relación señal/ruido en comparación con los métodos de detección óptica convencionales. En definitiva, esta tecnología aprovecha la alta intensidad del campo y su confinamiento en la proximidad de las guías de onda, para proporcionar una detección altamente sensible y selectiva.
Las guías de onda planas consisten en una fina capa de un material con elevado índice de refracción como pentóxido de tántalo u óxido de titanio, depositado en un soporte sólido, preferentemente transparente y con bajo índice de refracción (como vidrio o determinados polímeros) .
Adaptar esta tecnología para aplicaciones analíticas, requiere inmovilizar sondas receptoras del analito de interés sobre la superficie de la guía de onda. Así, para mantener una alta sensibilidad y selectividad en los ensayos, es necesario desarrollar modificaciones químicas de la superficie de pentóxido de tántalo que permitan:
• una inmovilización estable de los elementos de reconocimiento biológico (ácidos nucleicos, proteínas, hidratos de carbono, receptores de membrana, etc.);
• el mantenimiento de una capacidad bioreceptora similar a la presentada en disolución;
• maximizar el número posible de sitios activos; y
• minimizar las adsorciones inespecíficas .
Hasta el momento, la mayor parte de las modificaciones químicas de óxidos metálicos que se han llevado a cabo se han centrado en la formación de SAMs (del inglés, Self Assembled Monolayers) sobre óxido de silicio (en adelante, SiO) mediante silanización con clorosilanos (Wang, Y., Lieberman, M., Langmuir, 2003, 19, 1159), y organosilanos (Rozlosnik, . , et al., Langmuir, 2003, 19, 1182).
La formación de SAMs sobre SiO con alquiltriclorosilanos fue introducida por primera vez por Bigelow en el año 1946 (Bigelow, W. C, et al., J. Collold Sel., 1946, 1, 513) y posteriormente fue desarrollada por Maoz y Sagiv (Maoz, R., Sagiv, J. J. Collold Sel., 1984, 100, 465) . Desde entonces, la bibliografía recoge muchos trabajos acerca de la modificación química superficial de SiO principalmente mediante silanos, organometálicos y alcoholes (Bócking, T., et al., Langmuir, 2005, 21, 10522- 10529) .
En la última década, el empleo de esta química para la fabricación de biosensores ha sido muy desarrollada (Lee L. M., et al., Nanotechnology, 2006, 17, S29-S33).
Existen también técnicas alternativas para recubrir superficies de óxidos, entre las que cabe citar: ácidos hidroxámicos sobre óxidos de cobre, plata, titanio, aluminio, zirconio y hierro (Folkers, J.P., et al., Langmuir, 1995, 11, 813-824); ácidos carboxilicos sobre óxidos de aluminio (Aronoff, Y.G., et al., J. Am. Chem. Soc., 1997, 119, 259); ácidos fosfónicos sobre mica (Woodward, J. T., et al., Langmuir, 1996, 12, 3626), óxidos de circonio, titanio o silicio circonizado (Gao, W., et al., Langmuir, 1996, 12, 6429) y óxido de silicio (Midwood, K. S., et al., Langmuir, 2004, 20, 5501-5505).
En el caso del pentóxido de tántalo, sin embargo, se conocen pocas modificaciones superficiales dirigidas a la inmovilización de sondas. La más conocida se basa en el empleo de alean-fosfatos y alcan-fosfonatos ω-sustituidos , que han demostrado ser compuestos muy efectivos para la formación de SAMs sobre superficies de óxidos de metales de transición como óxido de titanio (Tosatti, S. et al, Langmuir, 2002) , óxido de niobio y pentóxido de tántalo (Textor, M. et al. Langmuir, 2000, 16, 3257-3271) .
Los grupos funcionales situados en el otro extremo de la cadena permiten la modificación de las propiedades de la superficie (hidrofobicidad, carga eléctrica, etc.), asi como la adsorción o unión covalente de proteínas.
Otra alternativa interesante consiste en la adsorción de polímeros multifuncionales (polilisina, polietilenglicol ) que permitan inmovilizar los elementos de captura requeridos para los ensayos.
El empleo de la alternativa de los fosfonatos está bien establecida para la fabricación de dispositivos basados en guías de onda planas. Sin embargo, para aplicaciones bioanalíticas, la búsqueda de nuevas alternativas para la superficie de a2Üs que mejoren las prestaciones de las hasta ahora empleadas basadas en fosfonatos, sigue teniendo una gran demanda.
Por tanto, es objeto de esta invención presentar un nuevo procedimiento de modificación de la superficie de pentóxido de tántalo con organosilanos , que permita la inmovilización de receptores para la realización de distintos tipos de ensayos como, por ejemplo, los basados en micromatrices (microarraying) de alta densidad (Rebecca L. et al., Chem. Biol . , 2007, 2 (1), 24-30).
Gracias a este procedimiento, es posible obtener superficies con baja fluorescencia de fondo y alta capacidad de carga de muestra y al mismo tiempo, se consiguen mejorar otros procedimientos ya conocidos respecto a la sencillez del procedimiento, así como al número de etapas necesarias para conseguir la inmovilización del receptor.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un nuevo procedimiento para la modificación de al menos una superficie de pentóxido de tántalo, caracterizado porque comprende, al menos, las siguientes etapas:
a) la preparación de una disolución de al menos un organosilano que comprende en su estructura al menos un grupo seleccionado entre un grupo tiol, un grupo amino primario o secundario y un grupo isocianato o isotiocianato;
b) la introducción en dicha disolución de la superficie de pentóxido de tántalo hasta obtenerse la superficie de pentóxido de tántalo modificada.
De manera particular, la superficie de pentóxido de tántalo se encontrará depositada sobre al menos una de las caras de un soporte sólido, el cual consistirá, de manera preferente, en un soporte transparente con bajo Índice de refracción, preferentemente vidrio o un compuesto polimérico, y más preferentemente sustratos de vidrio (chips) . En una realización preferida de la invención, dicha superficie de pentóxido de tántalo se encontrará depositada sobre al menos una de las caras de un soporte sólido, formando una capa de pocos nanómetros de espesor, preferentemente entre 100 y 200nm, y más preferentemente entre 130 y 170nm.
Gracias a este procedimiento es posible la obtención de al menos una superficie de pentóxido de tántalo modificada caracterizada por comprender al menos un grupo seleccionado entre un grupo tiol, un grupo amino, un grupo aldehido y un grupo isocianato o isotiocianato.
Introducción de grupos tiol
De manera particular, en el caso de que se tenga interés en la introducción de grupos tiol en la superficie del pentóxido de tántalo, el organosilano consistirá, preferentemente, en 3-mercaptopropil trietoxisilano . En una realización preferida del procedimiento, la disolución comprenderá de 1 a de 3-mercaptopropil trietoxisilano y de un 2 a un 5% de agua en una mezcla 0,05 a 0,25M de ácido acético en metanol.
De manera aún más preferida, la disolución comprenderá de 2 a un 3% de 3-mercaptopropil trietoxisilano y de un 3 a un 4% de agua en una mezcla 0,1 a 0,2M de ácido acético en metanol .
Una vez las superficies de pentóxido de tántalo hayan sido sumergidas en esta disolución durante un cierto tiempo, preferentemente de 1 a 3h, y más preferentemente l,5h, serán lavadas con metanol y se secarán, preferentemente con aire a presión o mediante centrifugación. Las superficies de pentóxido de tántalo asi tratadas estarán preparadas para la inmovilización de los receptores que comprendan grupos tiol en su estructura, mediante la formación de puentes disulfuro.
Introducción de grupos amino, aldehido e isotiocianato A su vez, en una realización particular en la que interese introducir grupos amino y aldehido en las superficies de pentóxido de tántalo, se preparará una disolución en la que el organosilano consistirá, preferentemente, en trimetoxisililpropil etilendiamina .
En una realización preferida del procedimiento, la disolución comprenderá de 1 a de trimetoxisililpropil etilendiamina y de un 2 a un 5% de agua en una mezcla 0,05 a 0,25M de ácido acético en metanol.
De manera aún más preferida, la disolución comprenderá de 2 a un 3% de 3-mercaptopropil trietoxisilano y de un 3 a un 4 ~6 de agua en una mezcla 0,1 a 0,2M de ácido acético en metanol.
Una vez las superficies de pentóxido de tántalo hayan sido sumergidas en esta durante un cierto tiempo, preferentemente de 1 a 3h, y más preferentemente l,5h, serán lavadas con metanol y se secarán, preferentemente mediante aire a presión. En este caso, el procedimiento podrá comprender, asimismo una etapa adicional, posterior al secado, de tratamiento de las superficies de pentóxido de tántalo con una disolución que comprenda al menos un compuesto con al menos dos grupos aldehido, preferentemente glutaraldehido, o al menos dos grupos isotiocianato, preferentemente, p- fenilendiisotiocianato . En una realización especialmente preferida de la invención, esta disolución comprenderá de un 0,05 a un 1%, y más preferentemente de un 0,1 a un 0,5% de glutaraldehido en, preferentemente, una solución reguladora de fosfato salino, más preferentemente, PBSlx, aunque también podrá tratarse de una disolución de agua sin sales; o de un 0,5 a un 1% de p-fenilendiisotiocianato en un disolvente aprótico, preferentemente, en tolueno.
Asimismo, de manera preferente, este tratamiento se llevará a cabo durante un tiempo de 1,5 a 5h, más preferentemente, durante 2h. Finalmente, las superficies de pentóxido de tántalo asi tratadas se lavarán con agua y se secarán, preferentemente, mediante aire a presión.
Introducción de grupos isocianato
Finalmente, en el caso de que se tenga interés en introducir grupos isocianato en las superficies de pentóxido de tántalo, se preparará una disolución en la que el organosilano consistirá, preferentemente, en 3- isocianatopropil trietoxisilano .
En una realización preferida del procedimiento, la disolución comprenderá de 1 a de 3-isocianatopropil trietoxisilano y de un 0,01 a un 0,1% de agua en un disolvente aprótico y preferentemente no polar, preferentemente seleccionado de un grupo que consiste en hexano, ciclohexano, tolueno y xileno.
De manera aún más preferida, la disolución comprenderá de 2 a un 3% de 3-isocianato propil trietoxisilano y un 0,01% de agua en hexano o ciclohexano. Una vez las superficies de pentóxido de tántalo hayan sido sumergidas en esta disolución durante un tiempo de 1 a 3h, preferentemente l,5h, serán lavadas con hexano o ciclohexano y se secarán, preferentemente, con aire a presión. Las superficies de pentóxido de tántalo asi tratadas estarán listas para la inmovilización de receptores conteniendo grupos amino, mediante la formación de enlaces urea, caracterizados por ser enlaces muy estables y de larga duración.
De esta manera, gracias al procedimiento de la presente invención, es posible desarrollar protocolos de derivatización sencillos y rápidos, proporcionando superficies homogéneas que mantienen las propiedades ópticas y mecánicas del soporte o superficie derivatizada . Estas características son clave para su posterior aplicación, preferentemente, en dispositivos ópticos de detección basados en guías de onda y anclaje covalente de biomoléculas , de manera preferente, en el desarrollo de ensayos genómicos o proteómicos.
En una realización particular de la invención, dichas biomoléculas podrán tratarse de ácidos nucleicos de diferentes pesos moleculares, tanto monocatenarios , como bicatenarios conteniendo al menos un grupo amino o un grupo tiol. Estos ácidos nucleicos podrán ser inmovilizados mediante su unión covalente con al menos un grupo isotiocianato, isocianato, aldehido o tiol de la superficie de pentóxido de tántalo modificada .
Asimismo, en una realización particular adicional de la invención, dichas biomoléculas podrán consistir en proteínas o moléculas PNAs . En este caso, la inmovilización se producirá mediante la formación de enlaces covalentes entre la superficie de pentóxido de tántalo modificada y al menos un residuo de lisina de la proteína o bien mediante la formación de puentes disulfuro entre la superficie de pentóxido de tántalo modificada y al menos un residuo de cisteina de dicha proteína.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La figura 1 muestra los resultados de la inmovilización de diferentes concentraciones (de 5-50 μg/ml) de GAR-Cy5 (anticuerpo de cabra contra conejo marcado con Cy5) sobre la superficie modificada y sobre controles, donde el Assay corresponde a la superficie modificada; el Blank 1 a la superficie sin tratamiento; el Blank 2 a la superficie sin amin-organosilano y el Blank 3 a la superficie sin glutaraldehído .
La figura 2 representa la intensidad de emisión de fluorescencia para 5-50 μg/mL GAR-Cy5 sobre la superficie modificada y sobre controles, donde El corresponde a la superficie modificada, Cl a la superficie sin tratamiento; C2 a la superficie sin amin-organosilano y C3 a la superficie sin glutaraldehído.
La figura 3 muestra los resultados de la inmovilización de GAR-Cy5 a diferentes concentraciones, sobre la superficie tratada con 3-isocianatopropiltrietoxisilano y sobre un control de la superficie sin tratar.
La figura 4 representa la intensidad de emisión de fluorescencia neta para concentraciones crecientes de GAR- Cy5, sobre la superficie modificada con isocianato y sobre un control de la superficie sin tratar.
La figura 5 muestra los resultados de la inmovilización de GAR-Cy5 a diferentes concentraciones sobre la superficie tratada con mercaptosilano y sobre un control de la superficie sin tratar.
La figura 6 representa la intensidad de emisión de fluorescencia neta para concentraciones crecientes de GAR- Cy5, sobre la superficie modificada con grupo tiol y sobre un control de la superficie sin tratar.
La figura 7 muestra los resultados del ensayo de inmovilización de la sonda de oligonucleótido sobre la superficie tratada con isocianato (a concentraciones de sonda de 1 y 5 μΜ) .
La figura 8 muestra los resultados del ensayo de hibridación de la cadena complementaria a la sonda inmovilizada sobre la superficie tratada con isocianato (a concentraciones de sonda de 10 y 25 μΜ y a concentración de hibridación de 50 nM) .
A continuación se recogen, a modo de ejemplo y con carácter no limitante, una serie de realizaciones particulares correspondientes a la presente invención.
En dichos ejemplos, la presencia de los grupos introducidos en la superficie de pentóxido de tántalo se comprobó empleando distintos ensayos de detección cualitativa en síntesis en fase sólida, así como técnicas de espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier (FITR) mediante reflectancia total atenuada (ATR) y medida del ángulo de contacto. Ej . 1. - Introducción de grupos tiol
En este ejemplo, se procedió a preparar una disolución de 3-mercaptopropil trietoxisilano al 2,3% y agua al 3,7% en una mezcla 0,15M de ácido acético en metanol. A continuación se sumergieron en dicha disolución las superficies de pentóxido de tántalo depositadas sobre una de las caras de un soporte de sustratos de vidrio (chips) formando una capa de 150nm de espesor. Al cabo de l,5h, los chips fueron lavados con metanol y se secaron con aire a presión .
Ej. 2.- Introducción de grupos amino y aldehidización En este ejemplo, se procedió a preparar una disolución de trimetoxisililpropil etilendiamina al 2,3% y agua al 3,7% en una mezcla 0,15M de ácido acético en metanol. A continuación se sumergieron en dicha disolución las superficies de pentóxido de tántalo depositadas sobre una de las caras de un soporte de sustratos de vidrio (chips) formando una capa de 150nm de espesor. Al cabo de l,5h, los chips fueron lavados con metanol y se secaron con aire a presión. Posteriormente, se trataron con una disolución al 0,1% de glutaraldehido en PBSlx, durante 2 horas. Finalmente, se lavaron con agua y se secaron con aire a presión .
Ej . 3.- Introducción de grupos isocianato
En este ejemplo, se procedió a preparar una disolución de 3-isocianato propil trietoxisilano al 2,3% y agua al 0,01% en hexano . A continuación se sumergieron en dicha disolución las superficies de pentóxido de tántalo depositadas sobre una de las caras de un soporte de sustratos de vidrio (chips) formando una capa de 150nm de espesor. Al cabo de l,5h, los chips fueron lavados con metanol y se secaron con aire a presión.
Ej. 4.- Efectividad del procedimiento
Para demostrar la efectividad del procedimiento en el anclaje de bioreceptores , se realizaron los siguientes ensayos :
• Inmovilización de anticuerpo marcado con Cy5 y lectura de la fluorescencia resultante;
· Realización de inmunoensayos utilizando Cy5 como trazador;
• Inmovilización de oligonucleótidos marcados con Cy5 y registro de la señal de fluorescencia;
• Hibridaciones con sondas inmovilizadas a través del correspondiente grupo funcional y la diana marcada con
Cy5 y lectura de la fluorescencia resultante.
Ej. 4.1.- Inmovilización de anticuerpos (I)
Con el material modificado con grupos isocianato se procedió a la inmovilización de anticuerpos de cabra contra conejo marcados con Cy5 (GAR-Cy5) . Para ello se prepararon distintas diluciones de GAR-Cy5 (5, 10, 25 y 50 yg/mL) y se depositaron sobre la superficie tratada siguiendo el procedimiento descrito para la inmovilización de oligonucleótidos .
Tras 2 h de incubación en cámara oscura y húmeda a temperatura ambiente, se lavó la superficie con PBSlx, se secó y se midió la fluorescencia con una cámara CCD, según se muestra en las figuras 3 y 4. Ej . 4.2.- Inmovilización de anticuerpos (II)
La inmovilización de los anticuerpos se llevó a cabo sobre soportes modificados con 3-mercaptopropil trietoxisilano empleando un anticuerpo modificado con Cy5, mediante la reacción de formación de puentes disulfuro. Se procedió de manera similar a lo descrito para el ejemplo anterior, obteniéndose los resultados que se muestran en las figuras 5 y 6.
Ej. 4.3.- Inmovilización de oligonucleótidos aminados Diferentes concentraciones (1, 5, 10 y 25 μΜ) de un oligonucleótido aminado en 3 'o 5 'y marcado con Cy5 en 5' o 3' fueron depositadas sobre las superficies funcionalizadas con isocianato con ayuda de un robot de impresión. Se crearon matrices de 2x3 puntos, con un 90% de humedad ambiente, depositando aproximadamente 50nL por punto. Tras 2h de incubación a temperatura ambiente en cámara oscura y húmeda, los chips se lavaron con PBSlx, se secaron, y se leyó la fluorescencia con una cámara CCD.
Este mismo procedimiento se empleó sobre chips sin tratamiento químico y se comparó la fluorescencia obtenida en ambos casos, según se muestra en la figura 7.
Ej. 4.4.- Hibridación en chip
Empleando la metodología de inmovilización del ejemplo 4.1, se inmovilizó la sonda aminada a distintas concentraciones (1, 5, 10 y 25 μΜ) y tras bloquear con OVA 1% en PBSlx durante 30 minutos, se trató el chip con una disolución de hibridación (6xSSC, 0,6% SDS, 0,1% DNA esperma de salmón y 2% BSA) conteniendo distintas concentraciones de la cadena complementaria a la sonda inmovilizada, marcada con Cy5. Después de 2h de incubación y los correspondientes lavados, se procedió a registrar la fluorescencia de la superficie, observándose eficacia en la hibridación para concentraciones de hasta 50 nM de la cadena complementaria, según se muestra en la figura 8.
Ej . 4.5.- Comparación de resultados
En todos los ejemplos anteriores se comprobó que el anclaje covalente de oligonucleótidos o anticuerpos proporciona mayor intensidad de fluorescencia y mejor relación señal/ruido que los oligonucleótidos anclados a la superficie mediante interacciones inespecificas de control, según se muestra en la figura 1.
Por otro lado, la fluorescencia de fondo también resultó prácticamente inalterada tras el tratamiento químico, en relación a la fluorescencia de fondo de la superficie sin tratar, disminuyendo un 7,5% para el caso del isocianato, aumentando un 8% para el glutaraldehído y aumentando un 3,5% para el mercaptano, lo que demuestra la adecuación del procedimiento para el objeto de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento de modificación de al menos una superficie de pentóxido de tántalo, caracterizado porque comprende, al menos, las siguientes etapas:
a) la preparación de una disolución de al menos un organosilano que comprende en su estructura al menos un grupo seleccionado entre un grupo tiol, un grupo amino primario o secundario y un grupo isocianato o isotiocianato ;
b) la introducción en dicha disolución de la superficie de pentóxido de tántalo hasta obtenerse la superficie de pentóxido de tántalo modificada.
2. Procedimiento, de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado porque la superficie de pentóxido de tántalo se encuentra depositada sobre al menos una cara de un soporte sólido.
3. Procedimiento, de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado porque el soporte sólido se trata de un soporte de vidrio.
4. Procedimiento, de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el organosilano se trata de 3-mercaptopropil trietoxisilano .
5. Procedimiento, de acuerdo a la reivindicación 4, caracterizado porque la disolución comprende de un 1 a un 4% de 3-mercaptopropil trietoxisilano y de un 2 a un 5% de agua en una mezcla 0,05 a 0,25M de ácido acético en metanol .
6. Procedimiento, de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el organosilano se trata de trimetoxisililpropil etilendiamina .
7. Procedimiento, de acuerdo a la reivindicación 6, caracterizado porque la disolución comprende de un 1 a un 4% de trimetoxisililpropil etilendiamina y de un 2 a un 5% de agua en una mezcla 0,05 a 0,25M de ácido acético en metanol .
8. Procedimiento, de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende una etapa posterior de lavado, seguida de una etapa adicional de secado.
9. Procedimiento, de acuerdo a la reivindicación 8, caracterizado porque cuando el organosilano comprende al menos un grupo amino primario o secundario, dicho procedimiento comprende una etapa adicional, posterior al secado, de tratamiento de la superficie de pentóxido de tántalo modificada con una disolución que comprende al menos un compuesto con al menos dos grupos aldehido o al menos dos grupos isotiocianato .
10. Procedimiento, de acuerdo a la reivindicación 9, caracterizado porque la disolución comprende de un 0,05 a un 1% de glutaraldehido en una solución reguladora de fosfato salino; o de un 0,5 a un 1% de p- fenilendiisotiocianato en un disolvente aprótico.
11. Procedimiento, de acuerdo a una de las reivindicaciones 9 ó 10, caracterizado porque dicho tratamiento se lleva a cabo durante un tiempo de 1 a 5 horas, tiempo tras el cual la superficie de pentóxido de tántalo es lavada y secada.
12, Procedimiento, de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el organosilano se trata de 3-isocianatopropil trietoxisilano .
13. Procedimiento, de acuerdo a la reivindicación 12, caracterizado porque la disolución comprende una disolución de un 1 a un 4% de 3-isocianatopropil trietoxisilano y de un 0,01 a un 0,1% de agua en un disolvente aprótico.
14. Procedimiento, de acuerdo a las reivindicaciones 12 o
13, caracterizado porque comprende una etapa posterior de lavado con hexano, seguida de una etapa adicional de secado .
15. Procedimiento, de acuerdo a las reivindicaciones 8 ó
14, caracterizado porque el secado se lleva a cabo mediante aire a presión.
16. Superficie de pentóxido de tántalo modificada caracterizada porque comprende al menos un grupo seleccionado entre un grupo tiol, un grupo amino, un grupo aldehido y un grupo isocianato o isotiocianato .
17. Uso de una superficie de pentóxido de tántalo modificada caracterizada porque comprende al menos un grupo seleccionado entre un grupo tiol, un grupo amino, un grupo aldehido y un grupo isocianato o isotiocianato, para la realización de ensayos.
18. Uso de una superficie de pentóxido de tántalo modificada, de acuerdo a la reivindicación 17, donde dichos ensayos se tratan de ensayos de hibridación.
19. Uso de una superficie de pentóxido de tántalo modificada, de acuerdo a la reivindicación 17, donde dichos ensayos se tratan de inmunoensayos .
20. Método de inmovilización de al menos una sustancia sobre una superficie de pentóxido de tántalo modificada caracterizada porque dicha superficie comprende al menos un grupo seleccionado entre un grupo amino, un grupo aldehido y un grupo isocianato o isotiocianato .
21. Método, de acuerdo a la reivindicación 20, caracterizado porque dicha sustancia es un ácido nucleico cuya inmovilización se produce mediante la formación de enlaces covalente entre la superficie de pentóxido de tántalo modificada y al menos un grupo amino de dicho ácido nucleico .
22. Método, de acuerdo a la reivindicación 20, caracterizado porque la sustancia es una proteina cuya inmovilización se produce mediante la formación de enlaces covalente entre la superficie de pentóxido de tántalo modificada y al menos un residuo de lisina de dicha proteina.
23. Método de inmovilización de al menos una sustancia sobre una superficie de pentóxido de tántalo modificada caracterizada porque dicha superficie comprende al menos un grupo tiol.
24. Método, de acuerdo a la reivindicación 23, caracterizado porque la sustancia es un ácido nucleico cuya inmovilización se produce mediante la formación de enlaces covalentes entre la superficie de pentóxido de tántalo modificada y al menos un grupo tiol de dicho ácido nucleico .
25. Método, de acuerdo a la reivindicación 24, caracterizado porque la sustancia es una proteina cuya inmovilización se produce mediante la formación de puentes disulfuro entre la superficie de pentóxido de tántalo modificada y al menos un residuo de cisteina de dicha proteina .
26. Soporte caracterizado porque comprende al menos una superficie de pentóxido de tántalo modificada, donde dicha superficie comprende al menos un grupo seleccionado entre un grupo tiol, un grupo amino, un grupo aldehido y un grupo isocianato o isotiocianato .
27. Soporte, de acuerdo a la reivindicación 26, caracterizado porque la superficie de pentóxido de tántalo depositada se encuentra formando una capa de 100 a 200nm de espesor .
28. Soporte, de acuerdo a una de las reivindicaciones 26 ó 27, caracterizado porque comprende, además, al menos una sustancia inmovilizada sobre dicho soporte.
29. Soporte, de acuerdo a la reivindicación 28, caracterizado porque dicha sustancia es una proteina o un ácido nucleico.
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