WO2011054960A1 - Verfahren zur datengewinnung für die ermittlung der gesamthämoglobinmenge (thb-menge) eines lebewesens oder eines stoffwechselzustands eines lebewesens - Google Patents

Verfahren zur datengewinnung für die ermittlung der gesamthämoglobinmenge (thb-menge) eines lebewesens oder eines stoffwechselzustands eines lebewesens Download PDF

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WO2011054960A1
WO2011054960A1 PCT/EP2010/067066 EP2010067066W WO2011054960A1 WO 2011054960 A1 WO2011054960 A1 WO 2011054960A1 EP 2010067066 W EP2010067066 W EP 2010067066W WO 2011054960 A1 WO2011054960 A1 WO 2011054960A1
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marker
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determining
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PCT/EP2010/067066
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Walter Schmidt
Nicole Prommer
Wilhelm Bloch
Ralph Gäbler
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Invivo Gmbh
Deutsche Sporthochschule Köln
Universität Bayreuth
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
    • G01N33/721—Haemoglobin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2458/00—Labels used in chemical analysis of biological material
    • G01N2458/15—Non-radioactive isotope labels, e.g. for detection by mass spectrometry

Definitions

  • the present invention relates to a method for obtaining data suitable for the determination of the total amount of hemoglobin (tHb amount) of a living being or a metabolic state of a living being.
  • the blood volume of the human body and its partial volumes may be determined indirectly by restraining its cellular constituents, such as hemoglobin and whole erythrocytes, or its liquid constituents, such as albumins.
  • cellular labeling is used, as it can detect all common hemorrhagic disorders or changes due to external influences without dilution effects due to plasma volume changes distorting the results.
  • the markers used were radioactive substances injected into the bloodstream or carbon monoxide supplied via respiration. While radioactive markers are still used in the medical-clinical field, almost exclusively CO rebreathing is used in sports (see Gore CJ, Hopkins WG, Bürge CM (2005) Parameters: a meta Analysis J Appl Physiol 99: 1745-1758).
  • the object of the present invention is thus to provide a method of the type mentioned, which is less toxicologically questionable or harmless.
  • a marker is understood here and below to mean an element or a chemical compound which is used for monitoring metabolic processes or for determining the total amount of hemoglobin.
  • a basic idea of the invention is to supply an isotope of the nitrogen, be it in elemental form or in a compound containing the isotope, to a living being, either from the consequent short-term change in the concentration of this isotope in the body, be it in elemental form or in a chemical compound, or from the deviation of the isotopic ratio 15 N / 14 N or the deviation of the isotopologic ratio of isotopologues such as 15 NO and 14 NO, which contain the N-isotopes, from the natural ratio (the natural ratio of the concentrations of 15 NO to 14 NO is given as 3.67 * 10 3 ), possibly also over a certain period of time, to be able to draw conclusions about changes in the metabolic state or the total amount of hemoglobin in the animal. From a detected change in a metabolic state can then be derived, for example, by comparing the measured changes with other measurements in which comparable changes were found in comparable subjects and in which the measurements were assigned to a specific diagnosis, a diagnosis.
  • the natural isotopic ratio of 15 N / 14 N corresponds to that given above for 15 NO / 14 NO.
  • 15 N or 15 N labeled substances 15 NO, 15 N-labeled substrates
  • the use of minimal absolute amounts is sufficient to achieve a significant shift in the isotopic or isotopic ratio.
  • the subject / patient is minimally disturbed / impaired, if at all. Therefore, the quantification of the 15 N concentration or the isotope ratio as well as the isotopic ratio of the 15 N-based nitrogen compounds in samples, especially in the blood, as a sensitive indicator for the determination of physiological and pathological metabolic processes in the bloodstream.
  • the reaction constants for the two isotopes so that pathological processes and processes under load lead to a measurable change in the endogenous isotope ratio.
  • NO nitric oxide
  • NO is an important signaling molecule in the bloodstream of the human body is physiologically in the body and binds to the hemoglobin without, like the CO in competition with oxygen.
  • the 15 NO isotopologue but also the 14 NO isotopologue, which can be supplied via the respiration, binds completely to the hemoglobin and is therefore particularly suitable as a marker for the total amount of hemoglobin.
  • the invention thus enables a minimally invasive determination of the total amount of hemoglobin and the blood volume by a tracer gas, which in principle is the body's own, as the first marker, which is supplied in a very small amount as the second marker via the respiration. This ensures the applicability of the method to all patient groups and to healthy volunteers without any health risk, which has not been the case so far.
  • Another core of the invention is that the isotopois ratio of the 14 N 16 O and / or 15 N 16 O levels in body fluids (eg, blood, urine, saliva, sperm) or the exhaled air at at least two different times, measured on the subject (subject / patient / athlete / animal), even if no marker is given to the subject.
  • body fluids eg, blood, urine, saliva, sperm
  • changes of the respective NO-quantities / concentrations can be determined.
  • this is also feasible with all other isotophores of nitric oxide, as well as with the two nitrogen isotopes 14 N and 15 N as such.
  • the technique also allows new, previously unidentifiable analyzes of NO metabolism, NO formation, NO distribution and interaction between various endogenous and exogenous NO sources.
  • a release of the bound to the hemoglobin NO is carried out in a Ferricyanidates.
  • nitrite reduction to NO occurs in a potassium iodide solution (KI + HCl mixture).
  • Nitrate and nitrite are released in a vanadium chloride solution (V (III) CI 3 + HCl mixture at about 90 ° C).
  • V (III) CI 3 + HCl mixture at about 90 ° C.
  • NO can also be released from thiols.
  • the transport of the released NO from the respective solution into a detection cell is effected by a continuous gas flow.
  • the carrier gas is air or inert gas, flow 100 ml / min - 2 l / min.
  • the determination of the blood volume can be carried out exclusively via the release of 15 NO from Hb-NO with a Ferricyanidates.
  • the amount of NO released is quantified and provided with the time stamp of the sampling.
  • a number of subjects / athletes / patients can take blood samples within a narrow time frame (30-60 seconds between withdrawals) and quantify the temporal kinetics of the Hb- 15 NO change.
  • the release is carried out as described above by adding the blood sample (100 ⁇ - 1 ml) in a Ferricyanidates (glass container with about 10-50 ml Ferricyanidants).
  • the quantification takes place in an analyzer.
  • the measurement of the N-isotope concentration in a sample is preferably carried out, as in the NO isotopolone detection, in gaseous phase. Therefore, the isotopes or isotopologues are preferably converted into a NO isotopolog.
  • the conversion, release and measurement of the 14 N and / or 15 N components in or as gaseous nitrogen monoxide offers significant advantages over the measurement in the liquid phase.
  • an isotoppler-selective detection can be carried out, which is not possible in the liquid phase.
  • the conversion (reduction, substitution) takes place in the liquid or at the binding site.
  • a carrier gas such as nitrogen, noble gas, normal air, etc.
  • the expulsion from the liquid is advantageous by finely distributed gas bubbles.
  • the molecular detection method must have both a high sensitivity and a high selectivity.
  • solid-state lasers have been available for the first time for some years, making sufficient laser power available from semiconductor lasers in the mid-infrared.
  • the lasers have a frequency tunability that allows combined detection of the 14 NO and 15 NO isotopologues by Faraday rotation spectroscopy.
  • the lasers require cooling of the waste heat with liquid nitrogen.
  • Part of the laser radiation (beam splitter) serves to stabilize the detection frequency with a reference cell filled with NO. The proof is only given for one isotope. Changes in the isotope ratio are based on different reaction constants 14 N 16 0 to 15 N 16 0 in the body.
  • the exogenous 15 NO sources can be isolated from the endogenous NO sources with a natural isotopic ratio based on the changes in the isotope ratio 15 NO / 14 NO in the blood sample. Stimulation or inhibition of endogenous NO sources with natural Isotopologenrest by exogenous NO application 15 can also be determined by a change in the blood sample Isotopologenvasess These interactions are particularly relevant for the study of drugs. Labeling can be directly by administration of a 15 NO donor, e.g. 15 N-molsidomine, or via the administration of a reinforced substrate or a runner substance, z. B. 15L-arginine done. The quantification of the effect is again on the shift of the isotope ratio in the z. B. blood sample.
  • a 15 NO donor e.g. 15 N-molsidomine
  • the time of the first sampling is usually the time before administration of the marker.
  • the decisive factor is the number of samples within the relevant process duration, eg. B. Distribution process after egg natmen of 15 NO-marker gas, allergic reaction, infection, etc ..
  • the process duration can greatly va riieren.
  • at least 12-15 individual samples should be taken over the entire process duration.
  • the dynamics of the underlying processes can be determined by time series analysis.
  • a possible embodiment of the method according to the invention for determining the blood volume will be explained below.
  • the determination of the blood volume is according to a first blood sampling from a subject to which the concentration cl of the marker 15 is determined to N 16 0, the subjects N 16 0 administered a certain amount of the same marker gas 15 to the subject via the breathing of the subject so inhaled.
  • the inhalation can take place via a spirometer, as described in DE 102 22 750 C1. While the device described therein is intended for inhalation of CO, it may also be used to inhale N-isotope-based gases.
  • the spirometer consists of a mouthpiece, a C02, a H20 absorber, a Hauptabsperrventil, a gas supply and a gas reservoir (about 31). After dosing the gas reservoir with approx. 60-80 ml of 15 NO calibration gas (750 ppm 15NO in nitrogen), the reservoir is filled with pure oxygen to 31 total volume. The 15 NO concentration in the spirometer is checked. The test person / patient wraps the mouthpiece tightly with his lips. Nasal breathing is prevented with a nose clip.
  • the test subject exhales to a maximum. After opening the shut-off valve, the subject inhales deeply the 15 NO-oxygen mixture and lasts for a period of 10 s the air. Thereafter, the subject changes to his natural breathing Rhythm and performs the rebreathing of the 15NO-oxygen mixture for a period of 1min 50s. Shortly before reaching the 2-minute limit, the test subject exhales to the maximum and the supervisor closes the shut-off valve.
  • the 15NO concentration in the spirometer is determined after the end of rebreathing. At the time points previously determined, blood samples were taken after 15NO rebreathing. Either a direct measurement or a freezing of the samples with liquid nitrogen is carried out for a later measurement.
  • the 15 N 16 0 binds to the hemoglobin and the Hb amount can be determined by changing the Hb- 15 NO concentration.
  • this requires knowledge of the maximum amount of NO that can bind to the hemoglobin.
  • the maximum amount that can bind to the hemoglobin is determined by saturating a blood sample with NO.
  • the quantification of the amount of NO released from the saturated sample allows a determination of the maximum bound amount of NO.
  • the time of the second sampling is crucial, because the NO is distributed with a certain time constant (transport in the body), so that the second blood sample is taken in the blood after achieving a uniform distribution of absorbed Hb- 15 NO.
  • the increase and subsequently the decrease in the amount of Hb- 15 NO in the arterialized and venous blood in subjects is measured in preliminary experiments. After reaching equal NO concentrations in the arterialized and venous blood, the complete mixing of the absorbed NO in the blood is achieved. This requires a tight time schedule for the blood draws.
  • the first measurements for the determination of the blood volume with the Hb 15 NO 15 NO amount was performed to the manner known from the CO-rebreathing period until the setting of the corresponding Hb-CO-plateau value. A determination of the time until a plateau value for the Hb- 15 NO is reached is carried out empirically. In determining the blood volume, a measurement of the liberated 15 NO instead of the isotopic ratio is sufficient. The release of 15 NO was from 1 ml of whole blood.
  • ⁇ ⁇ ⁇ % (c2-cl) [difference in percent binding between basal Hb x NO and Hb x NO after x NO rebreathing]
  • K2 (ml x NO * (g Hb) "1 ) [maximum x NO amount per gram
  • xNO S ystem + lung (after rebreathing) x NO concentration (not absorbed into the body after rebreathing)
  • XNO exhaled (after rebreathing) x NO concentration after rebreathing alveolar * * alveolar ventilation time, and wherein X is N, preferably 15 N.
  • the correction factor K1 includes an adjustment of the measurements of air pressure and temperature at the time of concentration determination.
  • AHb x NO% describes the difference between the first measured concentration of marker gas in the blood sample (basal Hb x NO) before the subject was given the marker gas and the measured concentration of marker gas in the blood sample after marker gas was administered to the subject and a balance of NO content in venous and arterial blood has been established.
  • M x NO describes the amount of actually picked up by the blood markers gas, namely the amount of the initially present in the spirometer marker gas x NO adm minus the quantity x NO Sy stem + lungs of the remaining (after rebreathing) after administration of the marker gas in the spirometer and lung marker exhaled gas and less the amount of NO x (after rebreathing) of the marker after administration of the gas up to the time at which it has set an equal NO-concentrations in the arterialized and venous blood gas exhaled markers.
  • Factor K2 indicates the maximum 15 NO amount per gram of hemoglobin (ml 15 NO * (g Hb) "1 ), which must be determined experimentally (see above) .
  • the ventilation of the alveoli is referred to as alveolar ventilation
  • the amount of air exchanged in the respiratory system ie the tidal volume minus the dead space volume, is given in the formula as the x NO loss via respiration x NO concentration, the volume exchanged and the duration of respiration considered are relevant.
  • the correction parameters in particular the parameters X NOsystem + lung (after rebreathing) and X NO exhaled (after rebreathing) Or the factors Kl and K2 may be omitted under certain circumstances.
  • the blood volume can be calculated with the following formula:
  • Blood volume (in ml) amount of hemoglobin (in g) * 100 /
  • Hemoglobin concentration in g / ml * cell factor where the cell factor is usually given as 0.91.
  • the knowledge of the blood volume in addition to the amount of hemoglobin is extremely important in many clinical and sports medicine / sports science questions (eg hypervolemia in heart failure, dialysis monitoring, blood loss, fluid loss, training adjustments).
  • concentration changes of N-isotope-labeled markers when administering an isotope-containing marker to a subject can be measurements on the time course of the isotopic ratio 14 N / 15 N or the course of the ratio of isotopes containing this isotope, such as 15 NO or 14 NO, conclusions about metabolic conditions, even without the subject a marker was administered.
  • the determination of the isotopic ratio 14 N / 15 N in the body of a living being is characterized in that at least two different times the 14 N or 15 N content is examined in identical samples.
  • Samples may consist of exhaled air, blood, urine, saliva, cerebrospinal fluid and the components of the liquid components serum, erythrocytes, leucocytes, in which context it is also conceivable that serum is taken as a sample by a living being.
  • the investigated 14 N / 15 N-containing substances may in particular be nitric oxide (NO), nitrate, nitrite, Hb-NO, dissolved NO, nitrosothiols (RSNO), N-nitroso compounds (RNNO) and / or nitrosated / nitrosylated Be a species (RXNO).
  • NO nitric oxide
  • RSNO nitrosothiols
  • RNNO N-nitroso compounds
  • RXNO nitrosated / nitrosylated Be a species
  • the sampling dates depend on the examined clinical, pathological or sports science issues.
  • the time constants of the expected / observable changes in the isotope ratio may be in the range of minutes, but in the development of chronic diseases also in the range of a few years.
  • the changes in the isotopic ratio 14 N / 15 N are influenced by a variety of processes (food intake, diseases, menstrual cycle, sleep, stress, seasons / external influences, transport and diffusion processes in the body, etc.), which overlap. This results in temporally complex courses of the isotopic ratio over the observed period. Sampling may be continuous or semi-continuous (for example, in natural respiratory rhythm, with defined breathing protocol, via access to blood collection with NaCl irrigation, removal of capillary blood in earlobe, via microdosing pump).
  • the isotope ratio 14 N / 15 N can be used to the anabolic or catabolic metabolic state of the examined animal and its changes as a result of food intake, disease, training or similar. to determine.
  • Catabolic and anabolic processes of the brain differ between men and women. Furthermore, these processes change with age. Strong differences could be observed in advanced Alzheimer's disease.
  • the systemic response to tissue injury or infection is often due to certain changes in the metabolism or hormonal processes to maintain physiological homeostasis. Typically, this also involves a shift from energy storage to energy consumption of the system. Chronic heart failure is a complex catabolic condition with poor prognosis.
  • the essential feature of tumor cells compared to normal cells is an altered metabolism of the tumor cells, either as a trigger or as a consequence of tumor growth.
  • An increased glucose uptake is an advantage for the growth of tumor cells.
  • Intermediates of glycolytic ATP production are used by the tumor cells for anabolic reactions.
  • the entire metabolism (glycolysis and TCA cycle) is switched to increase the anabolic processes associated with cell growth and tumor spread. Catabolites and anabolic disorders of fat metabolism are widely described.
  • the clinical manifestations and symptoms are due to slight changes in individual steps of normal lipid metabolism.
  • the small changes in enzyme activity or enzyme function often lead either to accumulation of wrong metabolites, ie, not reusable by the body or the cell, or correspondingly to a deficiency of the necessary metabolites.
  • the measured changes in the isotope ratio also allow conclusions about the development of chronic diseases.
  • a temporal and / or spatial separation of the sampling and the sample analysis may be useful in particular for sampling for doping test purposes.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von für die Ermittlung der Gesamthämoglobinmenge (tHb-Menge) eines Lebewesens oder eines Stoffwechselzustands eines Lebewesens geeigneten Daten, folgende Verfahrensschritte aufweisend: a. Nehmen einer ersten Probe vom Lebewesen; b. Bestimmen der Konzentration (c1) mindestens eines ersten Markers, der ein N-Isotop als Element oder innerhalb einer chemischen Verbindung enthält, in der ersten Probe; c. nach Nehmen der ersten Probe Verabreichen eines zweiten Markers an das Lebewesen, wobei der zweite Marker eine definierte Menge des N-Isotopen, als Element und/oder innerhalb einer chemischen Verbindung, enthält; d. Nehmen mindestens einer zweiten Probe nach einem vorbestimmten Zeitintervall nach Verabreichen des zweiten Markers an das Lebewesen; e. Bestimmen der Konzentration (c2) mindestens des ersten Markers, der ein N-Isotop als Element oder innerhalb einer chemischen Verbindung enthält, in der zweiten Probe.

Description

Bezeichnung
Verfahren zur Datengewinnung für die Ermittlung der Gesamthämoglobinmenge (tHb-Menge) eines Lebewesens oder eines Stoffwechselzustands eines Lebewesens
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von für die Ermittlung der Gesamthämoglobinmenge (tHb-Menge) eines Lebewesens oder eines Stoffwechselzustands eines Lebewesens geeigneten Daten.
Die mit einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ermittelten Daten sind unter anderem verwendbar für
■ die Beurteilung von Blutbildungsstörungen und Blutverlusten, z.B. bei Dialyse, Operationen und Blutspende, ■ die Kontrolle einer Blutmanipulation im Sport,
■ die Ermittlung von Anpassungsprozessen an unterschiedliche Umweltbedingungen,
■ die Bestimmung des anabolen/katabolen Stoffwechselzustandes des Kör- pers.
Das Blutvolumen des menschlichen Körpers und seine Teilvolumina können indirekt durch Ma rkierung seiner/ihrer zellulären Bestandteile wie Hämoglobin und gesamte Erythrozyten oder seine/ihrer flüssigen Bestandteile, wie Albumine, be- stimmt werden . Von g rößerem praktischem Interesse ist die zelluläre Markierung, da hiermit alle gängigen Blutbildungsstörungen oder Veränderungen aufgrund von Außeneinflüssen ermittelt werden können, ohne dass Verdünnungseffekte durch Veränderungen des Plasmavolumens die Ergebnisse verfälschen . Bislang wurden als Marker radioaktive Substanzen, die in die Blutbahn injiziert wurden, oder Kohlenmonoxid benutzt, welches über die Atmung zugeführt wurde. Während im medizinisch-klinischen Bereich noch die radioa ktiven Marker eingesetzt werden, wird im Bereich des Sports nahezu ausschließlich die CO-Rückatmung verwandt (s. Gore CJ, Hopkins WG, Bürge CM (2005) Errors of measurment for blood volume Parameters : a meta-analysis. J Appl Physiol 99 : 1745- 1758) .
Beide Bestimmungsarten sind sehr genau, stehen aber wegen ihrer möglichen Nebenwirkungen in der Kritik. So können radioaktive Marker nur sehr dosiert und kaum wiederholt eingesetzt werden, bei der Anwendung von CO muss seine Toxizität beachtet werden, die davon herrührt, dass es die Sauerstofftransportka- pazität herabsetzt und damit insbesondere bei anämischen Patienten (Blutarmut) nur bedingt eingesetzt werden kann. Diese beiden Arten der Bestimmung der totalen Hämoglobinmenge und des Blutvolumens sind daher mit Risiken und legalen Problemen behaftet. Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht somit darin, ein Verfahren der eingangs genannten Art zur Verfügung zu stellen, das toxikologisch weniger bedenklich oder unbedenklich ist.
Diese Aufgabe wird mit einem Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen des Verfa hrens nach Patentanspruch 1 ergeben sich durch die Merkmale der Unteransprüche. Unter einem Marker wird hier und im Folgenden ein Element oder eine chemische Verbindung verstanden, das bzw. die zur Beobachtung von Stoffwechsel prozessen oder zur Bestimmung der Gesamthämoglobinmenge verwendet wird. Ein Grundgedanke der Erfindung besteht darin, ein Isotop des Stickstoffs, sei es in elementarer Form oder in einer das Isotop enthaltenden Verbindung, einem Lebewesen zuzuführen, um entweder aus der hierdurch bedingten kurzzeitigen Änderung der Konzentration dieses Isotops im Körper, sei es in elementarer Form oder in einer chemischen Verbindung, oder aus der Abweichung des Isotopen- Verhältnisses 15N/14N oder der Abweichung des Isotopologenverhältnisses von Isotopologen wie beispielsweise 15NO und 14NO, die die N-Isotopen enthalten, vom natürlichen Verhältnis (das natürliche Verhältnis der Konzentrationen von 15NO zu 14 NO wird mit 3,67 * 10 3 angegeben), gegebenenfalls auch im Verlauf über eine bestimmte Zeitdauer, Rückschlüsse auf Veränderungen des Stoffwechselzustands oder die Gesamthämoglobinmenge des Lebewesens ziehen zu können. Aus einer festgestellten Änderung eines Stoffwechselzustands kann dann beispielsweise durch Vergleich der gemessenen Änderungen mit anderen Messungen, bei denen vergleichbare Änderungen bei vergleichbaren Probanden festgestellt wurden und bei denen die Messungen einer bestimmten Diagnose zugeordnet wurden, auch eine Diagnose abgeleitet werden.
Das natürliche Isotopenverhältnis von 15N/14N entspricht dem oben angegebenen für 15NO/14NO. Bei einer exogenen Applikation von 15N oder von mit 15N markierten Substanzen (15NO, 15N-markierte Substrate) reicht der Einsatz minimaler absoluter Mengen (beispielsweise 15 μΙ) aus, um eine signifikante Verschiebung des Isotopen- bzw. Isotopologenverhältnisses zu erreichen. Dadurch wird der Proband/Patient wenn überhaupt nur minimal gestört/beeinträchtigt. Daher eignet sich die Quantifizierung der 15N-Konzentration bzw. das Isotopenverhältnis ebenso wie das Isotopologenverhältnis der auf 15N basierenden Stickstoffverbindungen in Proben, insbesondere im Blut, als empfindlicher Indikator zur Bestimmung physiologischer und pathologischer Stoffwechsel prozesse im Blutkreislauf. Für die beiden Isotope bestehen leichte Unterschiede der Reaktionskonstanten, so dass pathologische Prozesse sowie Prozesse unter Belastung zu einer messbaren Veränderung des endogenen Isotopenverhältnisses führen.
Als besonders geeigneter Marker kommt Stickstoffmonoxid (NO) in Betracht. NO ist ein wichtiges Signalmolekül im Blutkreislauf des menschlichen Körpers, welches sich physiologischer Weise im Körper befindet und an das Hämoglobin bindet, ohne wie das CO in Konkurrenz mit Sauerstoff zu treten. Insbesondere das 15NO Isotopolog (aber auch das 14NO-Isotopolog), welches über die Atmung zugeführt werden kann, bindet sich komplett an das Hämoglobin und ist daher insbesondere auch als Marker für die Gesamthämoglobinmenge geeignet.
Die Erfindung ermöglicht somit eine minimalinvasive Bestimmung der totalen Hämoglobinmenge und des Blutvolumens durch ein prinzipiell körpereigenes Tracergas als erstem Marker, welches in sehr geringer Menge als zweiter Marker über die Atmung zugeführt wird. Dadurch ist die Anwendbarkeit der Methode auf alle Patientenkollektive und auf gesunde Probanden ohne gesundheitliches Risiko gewährleistet, was bislang nicht der Fall war.
Ein weiterer Kern der Erfindung besteht darin, dass das Isotopologenverhältnis der 14N160 und/oder 15N160-Mengen in Körperflüssigkeiten (z. B. Blut, Urin, Speichel, Sperma) oder der exhalierten Luft zu mindestens zwei unterschiedlichen Zeitpunkten - bezogen auf die Probennahme am Lebewesen (Probanden/Patienten/Athleten/Tier) - gemessen werden, und zwar selbst dann, wenn dem Lebewesen kein Marker verabreicht wird . Durch diese Vorgehensweise können Änderungen der jeweiligen NO-Mengen/Konzentrationen ermittelt werden. Selbstverständlich ist dies auch mit allen anderen Isotopologen von Stickstoffmonoxid durchführbar, ebenso wie mit den beiden Stickstoff-Isotopen 14N und 15N als solches. Gemessene zeitliche Änderungen der Isotopenkonzentration bzw. der Isotopologenkonzentration lassen Rückschlüsse auf den Ablauf von physiologischen und pathologischen Prozessen (Zeit- und Reaktionskonstanten) des gesamten NO-Metabolismus zu. Diese Prozesse werden von Transport- und Verteilungsprozesse innerhalb des Körpers überlagert. Dabei werden alle möglichen Erscheinungsformen bzw. Bindungsmöglichkeiten des NO und seiner Abbauprodukte im Stoffwechsel (NO gebunden an Hämoglobin Hb-NO, gelöstes NO, Nitrosothiole (RSNO), N-Nitroso-Verbindungen (RNNO), nitrosierten/nitrosylierten Spezies (RXNO), Nitrat, Nitrit, etc.) berücksichtigt. Die unterschiedlichen Metaboliten im NO-Stoffwechsel können aus den Körperflüssigkeiten selektiv über chemische Reaktionen, wie sie aus der Literatur bekannt sind, freigesetzt werden. Die Technik erlaubt somit darüber hinaus neue, bisher nicht bestimmbare Analysen des NO Metabolismus, der NO Bildung, der NO Verteilung und der Wechselwirkung zwischen verschiedenen endogenen und exogenen NO Quellen. Eine Freisetzung des am Hämoglobin gebundenen NO erfolgt in einer Ferricyanidlösung. Für Nitrit erfolgt die Reduktion zu NO in ei ner Kaliumjodid Lösung (KI + HCl Gemisch). Nitrat und Nitrit werden in einer Vanadiumchloridlösung (V(III)CI3 + HCl Gemisch bei ca. 90°C) freigesetzt. Um z.B. die Nitratmenge einer Probe zu bestimmen, muss demnach die Differenz der freigesetzten NO-Mengen einer Kaliumjodid- sowie einer Vanadiumchlorid-Lösung gemessen werden. NO kann auch aus Thiolen freigesetzt werden.
Der Transport des freigesetzten NO aus der jeweiligen Lösung in eine Nachweiszelle erfolgt durch einen kontinuierlichen Gasstrom. Hier bietet sich als Trägergas Luft oder Edelgas, Fluss 100 ml/min - 2 l/min, an. Je nach Fragestellung kann auch die Ermittlung der freigesetzten NO-Menge nur eines Reaktionskanals ausreichen. Die Bestimmung des Blutvolumens kann z.B. ausschließlich über die Freisetzung des 15NO aus Hb-NO mit einer Ferricyanidlösung erfolgen. Die freigesetzte NO-Menge wird quantifiziert und mit dem Zeitstempel der Probennahme versehen.
Durch in zeitlichen Abständen aufeinander folgende Messungen erhält man Zeitreihen von NO-Konzentrationen in der jeweils untersuchten Körperflüssigkeit bzw. der Atemluft. Wenn die Kinetik des zu untersuchenden Prozesses über Vorversuche ermittelt wurde, reicht die Bestimmung der NO-Mengen oder -Konzentrationen zu zwei unterschiedlichen Zeitpunkten aus, und man kann die Reaktions- und Zeitkonstanten von Entstehungs- oder Abbauprozessen bestimmter Stoffwechsel re- aktionen des NO-Metabolismus quantifizieren. Die charakteristische Kinetik des zu untersuchenden Prozesses wird in Vorversuchen mit hoher zeitlicher Auflösung ermittelt. An den gemessenen zeitlichen Verlauf wird eine Funktion (Exponenti- alfunktion, Logistische Funktion, etc.) angefittet, die den zeitlichen Anstieg bzw. Abfall der gemessenen NO-Mengen geeignet wiedergibt. Hieraus kann die Zeitkonstante bestimmt werden.
Dadurch lässt sich eine Vielzahl physiologischer Informationen ermitteln bzw. lassen sich pathologische Veränderungen (Zeit- und Reaktionskonstanten) des NO-Metabolismus erfassen. Bei der Bestimmung des Blutvolumens sind alleine die Zeitkonstanten des Bindungsvorganges des 15NO Markergases an das Hämoglobin, die Verteilung des Hb-NO im Körper und der natürliche Abbau des Hb-NO im Blut ausschlaggebend. Der Bindungsvorgang des NO an das Hämoglobin ist nicht l imitierend und erfolgt verglichen mit den beiden anderen Prozessen instantan. Die beiden übrigen Vorgänge überlagern sich und bewirken nach der Einatmung des 15NO - Markergases die Ausbildung eines maximalen Plateauwertes, bevor die Abbauprozesse ein Sinken der Hb-NO-Konzentration im Blut bewirken.
In Vorversuchen können an einer Anzahl von Probanden/Athleten/Patienten Blutproben in einem engen Zeitraster (30-60 Sekunden Abstand zwischen den Entnahmen) entnommen und die zeitliche Kinetik der Hb-15NO-Änderung quantifiziert werden. Die Freisetzung erfolgt wie oben beschrieben durch eine Zugabe der Blutprobe (100 μΙ - 1 ml) in eine Ferricyanidlösung (Glasbehälter mit ca. 10-50 ml Ferricyanidlösung). Die Quantifizierung erfolgt in einem Analysegerät. Die Messung der N-Isotopenkonzentration in einer Probe erfolgt vorzugsweise, wie schon beim NO-Isotopologennachweis, in gasförmiger Phase. Daher werden die Isotopen bzw. Isotopologen vorzugsweise in einen NO-Isotopolog überführt.
Die Umwandlung, Freisetzung und Messung der 14N und/oder 15N-Komponenten in bzw. als gasförmiges Stickstoffmonoxid bietet wesentliche Vorteile gegenüber der Messung in der flüssigen Phase. Mit Hilfe empfindlicher Molekülnachweisverfahren wie Massenspektroskopie, Laserspektroskopie, etc., kann ein isotopologenselektiver Nachweis erfolgen, der in der flüssigen Phase nicht möglich ist. Im ersten Schritt erfolgt die Umwandlung (Reduktion, Substitution) in der Flüssigkeit bzw. an der Bindungsstelle. Mit Hilfe eines Trägergases, wie Stickstoff, Edelgas, normale Luft, etc., erfolgt die Austreibung aus der Flüssigkeit. Hierbei ist eine große Oberfläche durch fein verteilte Gasblasen vorteilhaft. Einer Schau mbildung aufgrund der Proteine in z.B. Vollblut kann/muss Rechnung getragen werden. Das Molekülnachweisverfahren muss sowohl eine hohe Sensitivität als auch eine hohe Selektivität besitzen.
Um ein 15N/14N Isotopenverhältnis empfindlich ermitteln zu können, sollte ein ausreichend schneller Wechsel zwischen zwei geeigneten Nachweisfrequenzen möglich sein, um sowohl die 14NO- als auch die 15NO-Konzentration abwechselnd innerhalb eines nahezu identischen Gasvolumens bestimmen zu können. Ein etabliertes Verfahren für den NO-Nachweis in der Wissenschaft und für klinische Anwendungen ist der Chemilumineszenznachweis (Firmen : Siewers, Ecophys) . In den letzten Jahren wurden hier die verschiedenen Freisetzungsverfahren etabliert, die für die vorliegende Erfindung eingesetzt werden können . Allerdings ist die Chemilumineszenzmethode nicht isotopologenselektiv.
Andere bekannte Verfahren, mit denen gleichzeitig isotopologenselektiv die 14NO und 15NO-Mengen einer Gasprobe ermittelt werden können, sind beispielsweise mittels Faraday-Modulationsspektroskopie (s. Appl . Physics B (2009) 96, S. 535-544), die Lasermagnetresonanz-(LMR)-Spektroskopie oder auch die Massenspektrometrie. Allerdings stellt ein Isotopologenverhältnis von etwa 1/300 zwischen 15NO und 14NO große Anforderungen an die Massenauflösung eines Massenspektrometers, da die beiden Isotopologe in benachbarten Massenkanälen nachgewiesen werden.
Mit Quantenkaskadenlasern stehen seit einigen Jahren erstmalig Festkörperlaser zur Verfügung, die ausreichende Laserleistung von Halbleiterlasern im mittleren Infrarot verfügbar machen . Die Laser weisen eine Frequenzabstimmbarkeit auf, die einen kombinierten Nachweis der 14NO- und 15NO-Isotopologe mittels Fara- day-Rotations-Spektroskopie gestatten. Die Laser erfordern eine Kühlung der Abwärme mit Flüssigstickstoff. Ein Teil der Laserstrahlung (Strahlteiler) dient der Stabilisierung der Nachweisfrequenz mit einer mit NO gefüllten Referenzzelle. Der Nachweis erfolgt jeweils nur für ein Isotopolog . Veränderungen des Isotopologenverhältnisses liegen unterschiedliche Reakti- onskonstanten 14N160 zu 15N160 im Körper zugrunde. Bei exogener Gabe ma rkierter Substanzen (15N160 als Gas, 15N-markiertes Substrat, 15N-markierter NO Donor) können die exogenen 15NO-Quellen von den endogenen NO-Quellen mit natürlichem Isotopologenverhältnis anhand der Veränderungen des Isotopologenverhältnis 15NO/14NO in der Blutprobe unterschieden werden. Eine Stimulierung oder Inhibierung der endogenen NO-Quellen mit natürlichem Isotopologenverhältnis durch exogene 15NO-Applikation kann ebenfalls durch eine Veränderung des Isotopologenverhältnisses in der Blutprobe ermittelt werden Diese Wechselwirkungen sind insbesondere für die Untersuchung von Wirkstoffen relevant. Eine Markierung kann direkt durch Gabe eines 15NO-Donors, z. B. 15N-Molsidomin, oder über die Gabe eines ma rkierten Substrates bzw. einer Vor- läufersubstanz, z. B. 15L-Arginin erfolgen . Die Quantifizierung des Effektes erfolgt wieder über die Verschiebung des Isotopologenverhältnisses in der z. B. Blutprobe.
Bei exogener Applikation ist der Zeitpunkt der ersten Probennahme in der Regel der Zeitpunkt vor Verabreichung des Markers.
Bei einer Erhöhung der Anzahl der Blutproben pro Zeit bis hin zu einer nahezu kontinuierlichen Entnahme kann die zeitliche Kinetik der beobachteten Prozesse detaillierter aufgelöst und quantifiziert werden . Entscheidend ist d ie Anzahl der Proben innerhalb der relevanten Prozessdauer, z. B. Verteilungsprozess nach Ei natmen von 15NO-Markergas, allergische Reaktion, Infektion, etc.. Die Prozessdauern können stark va riieren . Um das nicht-lineare Verhalten quantifizierbar zu machen, sollten jedoch mindestens 12- 15 Einzelproben über die gesamte Prozessdauer genommen werden. Mit ausreichend hoher zeitlicher Auflösung lässt sich die Dynamik der zugrunde liegenden Prozesse über Zeitreihenanalyse ermitteln.
Nachfolgend wird eine mögliche Ausführungsform des erfindungsgemä ßen Verfahrens zur Ermittlung des Blutvolumens erläutert. Zur Bestimmung des Blutvolumens wird nach einer ersten Blutprobennahme von einem Probanden, zu der die Konzentration cl des Markers 15N160 bestimmt wird, dem Probanden eine bestimmte Menge des gleichen Markergases 15N160 an den Probanden über die Atmung verabreicht, von dem Probanden also inhaliert.
Die Inhalation kann über ein Spirometer erfolgen, wie es in der DE 102 22 750 Cl beschrieben ist. Die darin beschriebene Vorrichtung ist zwar zum Inhalieren von CO gedacht, lässt sich aber ebenso zum Inhalieren von N-Isotop-basierten Gasen verwenden . Das Spirometer besteht aus einem Mundstück, einem C02-, einem H20-Absorber, einem Hauptabsperrventil, einer Gaszuführung sowie einem Gasreservoir (ca . 31) . Nach Zudosierung des Gasreservoirs mit ca . 60-80 ml 15NO Eichgas (750 ppm 15NO in Stickstoff) wird das Reservoir mit reinem Sauerstoff auf 31 Gesamtvolumen aufgefüllt. Die 15NO-Konzentration im Spirometer wird überprüft. Der Proband/Patient umschließt das Mundstück fest mit den Lippen. Die Nasenatmung wird mit einer Nasenklammer verhindert. Auf Anweisung der Aufsichtsperson atmet der Proband maximal aus. Nach Öffnen des Absperrventils atmet der Proband tief das 15NO-Sauerstoffgemisch ein und hält für einen Zeitraum von 10 s die Luft an. Danach wechselt der Proband in seinen natürlichen Atem- rhythmus und führt für eine Zeitdauer von 1min 50s die Rückatmung des 15NO-Sauerstoffgemisch durch. Kurz vor Erreichen der 2 Minutengrenze atmet der Proband maximal aus und die Aufsichtsperson schließt das Absperrventil. Die 15NO-Konzentration im Spirometer wird nach Ende der Rückatmung ermittelt. Zu den vorher ermittelten Zeitpunkten wurden nach der 15NO-Rückatmung Blutproben abgenommen. Entweder erfolgt eine direkte Messung oder ein Einfrieren der Proben mit flüssigem Stickstoff für eine spätere Messung .
Das 15N160 bindet an das Hämoglobin und über die Veränderung der Hb-15NO Konzentration lässt sich die Hb-Menge bestimmen. Hierfür ist einerseits die Kenntnis der maximalen NO-Menge, die an das Hämoglobin binden kann, erforderlich. Die maximale Menge, die an das Hämoglobin binden kann, wird ermittelt, indem eine Blutprobe mit NO gesättigt wird. Die Quantifizierung der freigesetzten NO Menge aus der gesättigten Probe gestattet eine Ermittlung der maximalen gebundenen NO-Menge. Andererseits ist der Zeitpunkt der zweiten Probennahme entscheidend, da sich das NO mit einer bestimmten Zeitkonstante (Transport im Körper) verteilt, so dass die zweite Blutprobe nach Erreichen einer gleichmäßigen Verteilung des aufgenommenen Hb-15NO im Blut genommen wird. Wie oben beschrieben, wird in Vorversuchen die Zunahme und im weiteren Verlauf die Abnahme der Hb-15NO-Menge im arterialisierten und venösen Blut bei Probanden gemessen. Nach Erreichen gleicher NO-Konzentrationen im arterialisierten und venösen Blut ist die vollständige Mischung des aufgenommenen NO im Blut erreicht. Hierfür ist ein enges Zeitraster für die Blutentnahmen erforderlich. Bei den ersten Messungen zur Bestimmung des Blutvolumens mit 15NO wurde die Hb-15NO-Menge zu der aus der CO-Rückatmung bekannten Zeit bis zur Einstellung des entsprechenden Hb-CO-Plateauwertes durchgeführt. Eine Ermittlung der Zeitspanne bis zum Erreichen eines Plateauwertes für das Hb-15NO erfolgt empirisch. Bei der Bestimmung des Blutvolumens reicht auch eine Messung des freigesetzten 15NO anstelle des Isotopologenverhältnisses aus. Die Freisetzung des 15NO erfolgte aus 1 ml Vollblut.
Die Gesamthämoglobinmenge (tHb-Menge) aus den zuvor bestimmten Konzentrationen cl und c2 von erster und zweiter Probe bestimmt wird nach der Formel : tHb-Menge = Kl* Μ^θ θΟ^ΔΗ^ΝΟΎο*^) 1 und wobei Kl = aktueller Luftdruck*760 1:,<(l+(0.003661*aktuelle Tem- peratur in °C))_1
lunge (nach Rückatmung) +XN0 ausgeatmet (nach
Figure imgf000011_0001
ΔΗοχΝΟ% = (c2-cl) [Differenz der prozentualen Bindung zwischen dem basalen HbxNO und dem HbxNO nach xNO Rückatmung]
K2 = (ml xNO *(g Hb)"1) [maximale xNO Menge pro Gramm
Hämoglobin]
Menge des applizierten xNO Markergas
xNOSystem+ Lunge (nach Rückatmung) = xNO Konzentration (nach Rückatmung nicht in den Körper aufgenommen)
xNO ausgeatmet (nach Rückatmung) = xNO Konzentration alveolär nach Rückatmung * alveoläre Ventilation * Zeit, und wobei XN vorzugsweise 15N ist. Wie leicht zu erkennen ist, beinhaltet der Korrekturfaktor Kl eine Anpassung der Messungen an Luftdruck und Temperatur zum Zeitpunkt der Konzentrationsbestimmung. AHbxNO% beschreibt die Differenz zwischen erster gemessener Konzentration des betrachteten Markergases in der Blutprobe (basaler HbxNO-Wert), bevor dem Probanden das Markergas verabreicht wurde, und der gemessenen Konzentration des Markergases in der Blutprobe, nachdem dem Probanden Markergas verabreicht wurde und sich ein Gleichgewicht des NO-Gehalts in venösem und arteriellem Blut eingestellt hat. MxNO beschreibt die Menge des tatsächlich vom Blut aufgenommenen Markergases, nämlich die Menge des zu Beginn im Spirometer vorhandenen Markergases xNOadm abzüglich der Menge xNOSystem+ Lunge (nach Rückatmung) des nach Verabreichung des Markergases im Spirometer und in der Lunge verbliebenen Markergases sowie abzüglich der Menge xNO ausgeatmet (nach Rückatmung) des nach der Verabreichung des Markergases bis zu dem Zeitpunkt, zu dem sich ein gleicher NO-Konzentrationen im arterialisierten und venösen Blut eingestellt hat, ausgeatmeten Markergases. Der Faktor K2 bezeichnet die maxi- male 15NO Menge pro Gramm Hämoglobin (ml 15NO *(g Hb)"1), die experimentell bestimmt werden muss (s.o.). Die Belüftung der Lungenbläschen wird als alveoläre Ventilation bezeichnet. Diese entspricht der bei der Atmung ausgetauschten Luftmenge, d.h. dem Atemzugsvolumen minus dem Totraumvolumen. In der Formel wird der xNO-Verlust über die Atmung angegeben, wobei die xNO-Konzentration, das ausgetauschte Volumen und die Dauer der betrachteten Atmung relevant sind.
Auf die Verwendung der Korrekturparameter, insbesondere der Parameter XNOsystem+ Lunge (nach Rückatmung) Und XNO ausgeatmet (nach Rückatmung) Oder die Faktoren Kl und K2 kann unter Umständen auch verzichtet werden.
Mittels der über die NO-Rückatmung bestimmten Hämoglobinmenge und der in etwa gleichzeitig gemessenen Hämoglobinkonzentration (Routinemethode) kann mit folgender Formel das Blutvolumen berechnet werden :
Blutvolumen (in ml) = Hämoglobinmenge (in g) * 100/
(Hämoglobinkonzentration in g/ml * Zellfaktor) wobei der Zellfaktor meist mit 0,91 angegeben wird. Die Kenntnis des Blutvolumen zusätzlich zur Hämoglobinmenge ist in vielen klinischen und sportmedizinischen/sportwissenschaftlichen Fragestellung außerordentlich wichtig (z.B. Hypervolämie bei Herzinsuffizienz, Dialyseüberwachung, Blutverlust, Flüssigkeitsverlust, Trainingsanpassungen). Neben der Bestimmung der Konzentrationsänderungen von N-Isotop-markierten Markern bei Verabreichung eines das Isotop enthaltenden Markers an einen Probanden lassen sich Messungen über den zeitlichen Verlauf des Isotopenverhältnisses 14N/15N bzw. des Verlaufs des Verhältnisses von diese Isotope enthaltenden Isotopologen, wie beispielsweise 15NO oder 14NO, Rückschlüsse auf Stoffwech- seizustände zu, auch ohne dass dem Probanden ein Marker verabreicht wurde.
Die Bestimmung des Isotopenverhältnisses 14N/15N im Körper eines Lebewesens ist dadurch gekennzeichnet, dass zu mindestens zwei verschiedenen Zeitpunkten der 14N bzw. 15N Anteil in identischen Proben untersucht wird. Proben können aus ausgeatmeter Luft, Blut, Urin, Speichel, Liquor sowie den Komponenten der flüssigen Bestandteile Serum, Erythrozyten, Leukozyten bestehen, wob ei in diesem Zusammenhang auch denkbar ist, dass Serum als Probe von einem Lebewesen genommen wird. Die untersuchten 14N/15N-haltigen Substanzen können insbesondere Stickstoffmonoxid (NO), Nitrat, Nitrit, Hb-NO, gelöstes NO, Nitrosothiole (RSNO), N-Nitroso-Verbindungen (RNNO) und/oder nitrosierten/nitrosylierten Spezies (RXNO)sein. Die Zeitpunkte der Probennahme hängen von den untersuchten klinischen, pathologischen oder sportwissenschaftlichen Fragestellungen ab. Die Zeitkonstanten der erwarteten/beobachtbaren Veränderungen des Isotopenverhältnisses können im Minutenbereich, aber bei der Entwicklung von chronischen Krankheiten auch im Bereich einiger Jahre liegen. Die Verä nderungen des Isotopenverhältnisses 14N/15N werden durch vielfältige Prozesse (Nahrungsaufnahme, Krankheiten, Monatszyklus, Schlaf, Stress, Jahreszeiten/externe Ei nflüsse, Transport- und Diffusionsprozesse im Körper, o.a.) beeinflusst, die sich überlagern. Dadurch entstehen zeitlich komplexe Verläufe des Isotopenverhält- nisses über den beobachteten Zeitraum. Die Probenahme kann kontinuierlich oder semikontinuierlich erfolgen (beispielsweise bei natürlichem Atemrhythmus, mit definiertes Atemprotokoll, über gelegten Zugang zur Blutentnahme mit NaCI-Spülung, Entnahme von Kapillarblut im Ohrläppchen, über Mikrodosierpumpe).
So kann das Isotopenverhältnis 14N/15N verwendet werden, um den anabolen bzw. katabolen Stoffwechselzustand des untersuchten Lebewesens und seine Veränderungen infolge von Nahrungsaufnahme, Krankheit, Training o.ä. zu bestimmen. Katabole und anabole Prozesse des Gehirns unterscheiden sich zwischen Männern und Frauen. Desweiteren treten in diesen Prozessen mit zunehmendem Alter Veränderungen auf. Starke Unterschiede konnten bei fortgeschrittener Alzheimer Erkrankungen beobachtet werden. Die systemische Reaktion auf Gewebeverletzung oder Infektion beruht häufig auf bestimmten Veränderungen der metabol ischen oder hormonellen Prozesse, um die physiologische Homöostase aufrecht zu erhalten. Typischerweise findet auch dabei ein Wechsel von Energiespeicherung zu Energieverbrauch des Systems statt. Chronisches Herzversagen (chronic heart failure) ist ein komplexer kataboler Zustand mit schlechter Verlaufsprognose.
Das wesentliche Merkmal von Tumorenzellen im Vergleich zu normalen Zellen besteht in einem veränderten Metabolismus der Tumorzellen, sei es als Auslöser oder als Folge des Tumorwachstums. Eine gesteigerte Glukoseaufnahme stellt für das Wachstum von Tumorzellen einen Vorteil dar. Zwischenprodukte der glykolytischen ATP Erzeugung werden von den Tumorzellen für anabole Reaktionen genutzt. Der gesamte Metabolismus (Glykolyse und TCA-Cycle) wird umge- stellt, um die anabolen Prozesse zu steigern, die mit Zellwachstum und Tumorstreuung verbunden sind. Katabole und anabole Störungen des Fettmetabolismus sind vielfältig beschrieben. Die klinischen Ausprägungen und Symptome bilden sich aufgrund von leichten Veränderungen einzelner Schritte des normalen Lipidmetabolismus. Die kleinen Veränderungen der Enzymtätigkeit oder Enzymfunktion führen häufig entweder zu Akkumulation von falschen Metaboliten, d.h. vom Körper oder der Zelle nicht weiter verwertbaren oder entsprechend zu einem Mangel an den notwendigen Metaboliten.
Die gemessenen Veränderungen des Isotopenverhältnisses lassen auch Rück- Schlüsse auf die Entstehung chronischer Krankheiten zu.
Alle diese Veränderungen lassen sich mit dem vorliegenden Verfahrens der Bestimmung des 14N/15N Isotopenverhältnisses frühzeitig erkennen. Voraussetzung für das Erkennen des 14N/15N Isotopenverhältnisses und damit des katabolen oder anabolen Stoffwechselzustandes ist die Kenntnis der Ausgangswerte des Isotopenverhältnisses und der ablaufenden Prozesse.
Eine zeitliche und/oder räumliche Trennung der Probennahme und der Probenanalyse kann insbesondere bei Probennahmen zu Dopingtestzwecken sinnvoll sein.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
Verfahren zur Gewinnung von für die Ermittlung der Gesamthämoglobinmenge (tHb-Menge) eines Lebewesens oder eines Stoffwechselzustands eines Lebewesens geeigneten Daten, folgende Ver- fahrensschritte aufweisend :
a. Nehmen einer ersten Probe vom Lebewesen;
b. Bestimmen der Konzentration (cl) mindestens eines ersten Markers, der einen N-Isotopen als Element oder innerhalb einer chemischen Verbi ndung enthält, der ersten Probe;
c. nach Nehmen der ersten Probe Verabreichen eines zweiten Markers an das Lebewesen, wobei der zweite Marker eine definierte Menge des N-Isotopen, als Element und/oder innerhalb einer chemischen Verbindung, enthält;
d. Nehmen mindestens einer zweiten Probe nach einem vorbestimmten Zeitintervall nach Verabreichen des zweiten Markers an das Lebewesen; e. Bestimmen der Konzentration (c2) mindestens des ersten Markers., der einen N-Isotopen als Element oder innerhalb einer chemischen Verbi ndung enthält, der zweiten Probe.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als erste und zweite Probe ausgeatmete Atemluft, Blut, Urin, Speichel oder Liquor genommen wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Marker und der zweite Marker ausgewählt sind aus der Menge von 14N, 15N, verschiedene Isotopologe des Stickstoffmonoxids (14N160, 15N160, 15N180, etc.), 14N enthaltende Nitritverbindungen, 14N enthaltende Nitratverbindungen, 15N enthaltende Nitritverbindungen, 15N enthaltende Nitratverbindungen, 14N und 15N enthaltene Nitrosothiole (RSNO), 14N und 15N enthaltene N-Nitroso-Verbindungen (RNNO), 14N und 15N enthaltene nitrosierten/nitrosylierten Spezies (RXNO), wobei der Marker vorzugsweise 15N oder eine 15N enthaltende Verbindung ist. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite Marker als NO-Markergas über die Atemluft verabreicht wird, oder anstelle eines NO-Markergases ein xN-markierter NO-Donor, ein XN markiertes Substrat des NO-Stoffwechsels oder ein xN-markierter Metabolit des NO-Stoffwechsels verabreicht wird, wobei XN vorzugsweise 15N ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der erste und der zweite Marker gleich sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass in Verfahrensschritt c. die definierte Menge des zweiten Markers entweder über die Atemluft, per Injektion oder oral verabreicht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die erste und zweite Probe Blutproben sind.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der erste und der zweite Marker das N-Isotop enthaltende Isotopologe des Stickstoffmonoxids (xNO) sind und Verfahrensschritte b. und e. folgende Verfahrensschritte aufweisen :
i. Freisetzen des am Hämoglobin gebundenen Stickstoffmonoxids der Blutprobe, vorzugsweise mittels einer Lösung, insbesondere einer Cyanidlösung, welche die am Hämoglobin gebundenen NO-Moleküle ersetzt; und/oder
ii. Quantifizieren der freigesetzten NO-Menge der Blutprobe in einer Analysevorrichtung .
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Gesamthämoglobinmenge (tHb-Menge) aus den zuvor bestimmten Konzentrationen (cl) und (c2) von erster und zweiter Probe bestimmt wird nach der Formel : tHb-Menge = Kl* MxNO* 100*(AHbxNO%*K2)"1 wobei
Kl = aktueller Luftdruck*760"1:,<(l+(0.003661*aktuelle Temperatur in °C))_1 M NO— NOadm ( NOSyStem+ lunge (nach Rückatmung) "'" NO ausgeatmet (nach
Rückatmung) )
AHbxNO% = (c2-cl) [Differenz der prozentualen Bindung zwischen dem basalen HbxNO und dem HbxNO nach xNO Rückatmung]
K2 = (ml xNO *(g Hb)"1) [maximale xNO Menge pro Gramm
Hämoglobin]
xNOadm = Menge des applizierten xNO Markergas
xNOSystem+ Lunge (nach Rückatmung) = xNO Konzentration (nach Rückatmung nicht in den Körper aufgenommen) xNO ausgeatmet (nach Rückatmung) = xNO Konzentration alveolär nach Rückatmung * alveoläre Ventilation * Zeit und wobei XN vorzugsweise 15N ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Proben gelagert werden und die Analyse zeitlich und/oder räumlich getrennt durchgeführt wird. 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Ermittlung der nicht-linearen Zusammenhänge der physiologischen Prozesse zwischen der beschriebenen ersten und zweiten Probennahme und/oder nach der zweiten Probennahme weitere Proben nimmt und deren Konzentrationen des ersten Markers bestimmt.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass in den Schritten b. und e. die Konzentration (cl', c2') mindestens eines weiteren ersten Markers, der ein anderes N-Isotop als Element oder innerhalb einer chemischen Verbindung enthält, und insbesondere die Verhält- nisse der Konzentrationen in der ersten Probe (cl/cl') und der zweiten Probe
(c2/c2') bestimmt, wobei vorzugsweise der erste Marker 15NO ist und der weitere erste Marker 14NO ist und in der ersten und der zweiten Probe jeweils das Isotopologenverhältnis 15NO/14NO bestimmt wird. 13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite Marker zusätzlich eine definierte Menge eines anderen N-Isotopen, als Element und/oder innerhalb einer chemischen Verbindung, enthält. Verwendung mindestens eines Markers, der ein N-Isotop und/oder mindestens eine das N-Isotop enthaltende Verbindung enthält, vorzugsweise eines 15NO-Markers, der an ein Lebewesen verabreicht wird, zur Bestimmung der Gesamthämoglobinmenge (tHb-Menge) im Blut des Lebewesens oder eines Stoffwechselzustandes des Lebewesens.
Verfahren zur Gewinnung von für die Ermittlung eines Stoffwechselzustands des Lebewesens geeigneter Daten, folgende Verfahrensschritte aufweisend : a. Nehmen einer ersten Probe vom Lebewesen;
b. Bestimmen der Konzentration (C1 I4N) mindestens eines Markers, der 14N als Element oder innerhalb einer chemischen Verbindung enthält, sowie der Konzentration (C1I5N) eines weiteren Markers, der 15N als Element oder innerhalb einer chemischen Verbindung enthält, der ersten Probe, und Bestimmen des Isotopenverhältnisses (C1I4N/C1I5N) ;
c. Nehmen mindestens einer zweiten Probe nach einem vorbestimmten Zeitintervall nach der ersten Probennahme;
d. Bestimmen der Konzentration (c214N) mindestens eines Markers, der 14N als Element oder innerhalb einer chemischen Verbindung enthält, sowie der Konzentration (c215N) eines weiteren Markers, der 15N als Element oder innerhalb einer chemischen Verbindung enthält, der ersten Probe, und Bestimmen des Isotopenverhältnisses (c214N/c215N).
WO 2011/054960 IATIONAL SEARCH REPORT InternationaPCT/EP2010/067066
PCT/EP2010/067066
Box No. II Observation^ here certain Claims were found unsearchable (Continuation of item 2 of first sheet)
This international search report has not been established in respect of certain claims under Article 17(2)(a).for the following reasons:
Claims Nos.:
because they relate to subject matter not required to be searched by this Authority, namely:
See Supplementary Sheet
Claims Nos.:
because they relate to parts of the international application that do not comply with the prescribed requirements to such extent that no meaningful international search can be carried out, specifically:
3- □ Claims Nos.:
because they are dependent claims and are not drafted in accordance with the second and third sentences of Rule 6.4(a).
Box No. III Observations where unity of invention is lacking (Continuation of item 3 of first sheet)
This International Searching Authority found multiple inventions in this international application, äs follows:
See Extra Sheet
1. I I As all required additional search fees were timely paid by the applicant, this international search report covers all searchable claims.
As all searchable claims could be searched without effort justifying additional fees, this Authority did not invite payment of additional fees.
3. □ As only some of the required additional search fees were timely paid by the applicant, this international search report covers only those Claims for which fees were paid, specifically claims Nos.:
No required additional search fees were timely paid by the applicant. Consequently, this international search report restricted to the invention first mentioned in the Claims; it is covered by Claims Nos.:
1-14
The additional search fees were accompanied by the applicant's protest and, where applicable, the payment of a protest fee.
The additional search fees were accompanied by the applicant's protest but the applicable protest fee was not paid within the time lirnit specified in the invitation.
Figure imgf000019_0001
No protest accompanied the payment of additional search fees.
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