WO2011052346A1 - 圧力式均一直径ベシクル生成装置 - Google Patents

圧力式均一直径ベシクル生成装置 Download PDF

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WO2011052346A1
WO2011052346A1 PCT/JP2010/067382 JP2010067382W WO2011052346A1 WO 2011052346 A1 WO2011052346 A1 WO 2011052346A1 JP 2010067382 W JP2010067382 W JP 2010067382W WO 2011052346 A1 WO2011052346 A1 WO 2011052346A1
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phase separation
separation fluid
generating
aqueous solution
micro
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PCT/JP2010/067382
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昌治 竹内
智瑛 倉員
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国立大学法人東京大学
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    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/04—Making microcapsules or microballoons by physical processes, e.g. drying, spraying
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes

Definitions

  • the present invention relates to an apparatus and a method for generating a bilayer vesicle, and more specifically, to an apparatus and a method for generating a bilayer vesicle using a microchannel having a partition wall that is elastically deformed by pressure.
  • a vesicle consisting of a single layer of amphiphilic molecular membrane, fully encapsulated in the desired volume containing the desired polymer compound, as a microscopic scale chemical reactor, as a drug delivery vehicle, or for various environmental stimuli Use as a responding biosensor is expected.
  • single-layer phospholipid vesicles having a uniform size in the range of 1 ⁇ m to 100 ⁇ m have almost the same dimensions as actual living cells, and are in great demand as a model system for complex functions of biological membranes.
  • the vesicle generating apparatus of Patent Document 1 includes a microfluidic device, and the microfluidic device includes one or more structures.
  • the structure is made of polydimethylsiloxane (PDMS) mounted on a glass surface, and a fine structure including a main flow path and a plurality of micro diverticulas opening in the main flow path is provided by fine processing.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a structure of a vesicle generating apparatus described in Patent Document 1.
  • a micro diverticulum 2 is opened facing the main flow channel 1, and the micro diverticulum 2 communicates with the atrioventricular chamber 4 via the communication narrow path 3.
  • the chamber 4 is provided with a pressure generator 5.
  • the pressure generating unit 5 expands the fine bubbles 8 generated by the laser light 7 focused on the aluminum thin film 6 arranged in a pattern on the bottom surface of the atrioventricular chamber 4.
  • the liquid is pushed out from the chamber 4 to the communication channel 3 by the pressure.
  • the communication channel 3 is narrow and long, a flow resistance is generated. Therefore, the communication channel 3 slows down the liquid flow from the atrioventricular chamber 4 toward the minute diverticulum 2.
  • a shearing portion 9 is provided on the wall surface of the main channel on the downstream side of the opening of the micro diverticulum 2 with respect to the liquid flow in the main channel 1.
  • the depth (the dimension in the direction perpendicular to the plane of FIG. 1) mounted on the glass surface of the main channel, the microdiverticulum, and all other polydimethylsiloxane structures is 17 ⁇ m.
  • the width of the opening to the wall surface of the main channel 1 of the micro diverticulum 2 is 20 ⁇ m.
  • the width of the communication channel 3 is 6 ⁇ m, and the distance between the opening surface of the communication channel 3 to the minute diverticulum 2 and the opening surface of the communication channel 3 to the chamber 4, that is, the length of the communication channel 3 is 100 ⁇ m.
  • the height of the shearing portion 9 from the main channel wall surface is 10 ⁇ m.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing one embodiment of the vesicle generation method described in Patent Document 1.
  • the first aqueous solution, the water-insoluble organic solution containing the amphiphilic molecules constituting the vesicle membrane, and the second aqueous solution are passed through the vesicle generator of Patent Document 1 in this order (FIG. 2A). Or H).
  • the first aqueous solution becomes a vesicle internal solution.
  • the first aqueous solution flowing through the main channel enters the micro diverticulum through the opening of each micro diverticulum of the structure of Patent Document 1, and fills the atrioventricular passage through the communicating narrow channel (FIG. 2A).
  • the organic solution is caused to flow through the main channel.
  • the organic solution for example, when an organic solution in which lipid is dissolved with hexadecane 17 is used, polydimethylsiloxane is not dissolved, but it has a property of getting wet on the surface of polydimethylsiloxane, and the organic solution is added to the polydimethylsiloxane resin. Is absorbed and the polydimethylsiloxane resin swells and deforms. Thereby, the said organic solution penetrate
  • the organic solution Since the organic solution is wetted on the polydimethylsiloxane surface, the organic solution layer is suspended on the opposite side wall surfaces of the micro diverticulum 2 to seal the micro diverticulum. Since the polydimethylsiloxane swells and deforms, the communication path is further narrowed, so that the organic solution does not enter the communication path. Finally, the organic solution in the main channel is washed away by flowing the second aqueous solution through the main channel. The organic solution phase-separates between the first and second aqueous solutions to form an organic solution layer separated by an interface (FIG. 2C).
  • the tip of the organic solution layer is extended beyond the shearing means by the first aqueous solution, and the tip is successively bound and cut into vesicles (FIG. 2H).
  • the vesicle containing the first aqueous solution flows through the second aqueous solution downstream of the main flow path.
  • FIG. 3A shows a first aqueous solution (indicated as “Water” with thin hatching), an organic solution (indicated as “Oil”), a second channel in the main channel of the vesicle generating device described in Patent Document 1.
  • FIG. 2 is a perspective view showing a state in which an aqueous solution (denoted as “Water” in dark hatching) is sequentially flowed, and (B) to (H) are microscopic views in one embodiment of the structure of the vesicle generating device of Patent Document 1
  • the first aqueous solution pushes air and enters the fine diverticulum and is introduced (FIG. 3B).
  • a second aqueous solution enters the fine diverticulum and a layer of the organic solution is formed in the fine diverticulum (Fig. 3D).
  • the molecule of the amphiphilic molecule dissolved in the organic solution layer is composed of a rod-like hydrophobic atomic group and a spherical hydrophilic atomic group, and is hydrophilic at the interface between the first and second aqueous solutions and the organic solution layer.
  • the atomic groups are oriented so as to contact the aqueous solution (FIGS. 3C and D).
  • a shearing portion 9 is provided on the wall surface of the main channel on the downstream side of the opening of the micro diverticulum with respect to the liquid flow in the main channel.
  • an overhanging portion 10 is provided on the peripheral edge of the opening where the micro diverticulum faces the main flow channel, and the wall surface of the diverticulum projects to narrow the inner diameter. Since the overhang 10 locally increases the surface area of the inner surface of the diverticulum, a larger volume of organic solution layer can be suspended over the opening of the microdiverticulum.
  • the vesicle generating apparatus described in Patent Document 1 was able to generate a large amount of uniform monolayer bilayer vesicles with a size in the range of 1 ⁇ m to 100 ⁇ m.
  • the apparatus described in Patent Document 1 in order to generate pressure in the chamber, it is necessary to move the laser beam to each chamber of the vesicle generating apparatus one after another to focus the laser beam on the aluminum thin film. .
  • Such advanced technology for accurately manipulating the laser beam is very expensive, and is an obstacle to the spread of uniform single-layer bilayer vesicle generation technology.
  • it is difficult to produce a large number of vesicles because it is not possible to focus laser light on a plurality of aluminum thin films in the chamber at the same time.
  • the present invention provides an apparatus for producing a bilayer vesicle.
  • the bilayer membrane vesicle production apparatus of the present invention includes a plurality of structures including a main channel, a plurality of micro diverticulas opening in the main channel, and atrioventricular chambers adjacent to the micro diverticulums via deformable partition walls. Including.
  • the deformable partition wall may be an elastic partition wall.
  • the deformable partition wall may be a displaceable partition wall.
  • the structure may include a shearing means.
  • a phase separation fluid reservoir is provided on the wall of the micro diverticulum, the phase separation fluid reservoir suspends a phase separation fluid layer, and the phase separation fluid layer comprises: There is a case where the space between the main flow path and the micro diverticulum is sealed.
  • a plurality of phase separation fluid reservoirs are provided on a wall surface of the micro diverticulum, and the plurality of phase separation fluid reservoirs suspend a plurality of phase separation fluid layers,
  • the phase separation fluid layer may seal between the main flow path and the microdiverticulum.
  • the phase separation fluid reservoir may be an overhang extending from the side wall surface of the micro diverticulum into the micro diverticulum.
  • the atrioventricular chamber may be provided with a pressure generating unit.
  • the atrioventricle may be connected to an external pressure source.
  • the external pressure source may be a syringe pump.
  • the external pressure source may be a high pressure gas cylinder.
  • the phase separation fluid passing through the main flow channel may flow in one direction, and the shearing means may be provided on the downstream side of the opening of the micro diverticulum.
  • the liquid passing through the main flow path may flow in two directions, the forward and reverse directions, and the shearing means may be provided on the downstream side of the flow in the two directions.
  • the atrioventricular chamber may be connected to an external supply source of an aqueous solution, and the aqueous solution may be supplied to the micro diverticulum via the communication channel.
  • the structure includes one or more aqueous solution flow paths, and the aqueous solution flow paths include at least two of the plurality of phase separation fluid reservoirs. There is a case where the opening of the wall of the micro diverticulum provided between the individual and the external source of each of the plurality of aqueous solutions are communicated.
  • the structure includes a sub-flow channel, and the sub-flow channel is connected to an external supply source of a phase separation fluid, and the phase separation fluid passes through the sub-flow channel. There are cases where the phase separation fluid reservoir is supplied.
  • the microdiverticulum may be arranged two-dimensionally.
  • the microdiverticulum may be arranged three-dimensionally.
  • the phase separation fluid layer may form an interface with an aqueous solution.
  • the phase separation fluid may be an organic solution containing amphiphilic molecules.
  • the phase separation fluid may be a gas or an organic solution that does not contain amphiphilic molecules, and the aqueous solution may contain amphiphilic molecules.
  • the structure is made of polydimethylsiloxane, and the organic solution may swell and deform polydimethylsiloxane.
  • a method for producing a bilayer vesicle according to the present invention includes a main flow channel, a plurality of micro diverticulums opening in the main flow channel, and a structure that includes the micro diverticulum and an atrioventricle adjacent to each other via an elastic partition, And providing a second aqueous solution and a phase separation fluid, flowing the first aqueous solution into the main flow path of the structure, and introducing the first aqueous solution into the micro diverticulum, Flowing the phase separation fluid through the main flow path of the structure, introducing the phase separation fluid into at least a part of the microdiverticulum, flowing a second aqueous solution through the main flow path of the structure, Removing the phase separation fluid in the channel, the phase separation fluid forming a phase separation fluid layer, the phase separation fluid layer being suspended on the side wall surface of the microdiverticulum, and the phase separation fluid layer being Apply pressure to the
  • the elastic partition wall is deformed so as to protrude into the micro diverticulum, and the first aqueous solution is swept away, so that the phase separation fluid layer tip enters the main channel from the opening of the micro diverticulum.
  • Stretching the separation fluid layer, and a liquid flow of the second aqueous solution in the main channel is surrounded by the phase separation fluid layer and the phase separation fluid layer by shearing the phase separation fluid layer And cleaving the first aqueous solution as a vesicle.
  • the deformable partition wall may be an elastic partition wall.
  • the deformable partition wall may be a displaceable partition wall.
  • the phase separation fluid may be an organic solution containing amphiphilic molecules.
  • the first and second aqueous solutions may contain amphiphilic molecules
  • the phase separation fluid may be a gas or an organic solution that does not contain amphiphilic molecules.
  • the amphiphilic molecule contained in the first aqueous solution may have a composition different from that of the amphiphilic molecule contained in the second aqueous solution.
  • the structure includes a shearing unit, and the shearing unit may shear the phase separation fluid layer together with a liquid flow of the second aqueous solution in the main channel. .
  • a phase separation fluid reservoir is provided on a wall surface of the micro diverticulum, the phase separation fluid reservoir suspends a phase separation fluid layer, and the phase separation fluid layer comprises: There is a case where the space between the main flow path and the micro diverticulum is sealed.
  • the phase separation fluid reservoir may be an overhang extending from the side wall surface of the micro diverticulum into the micro diverticulum.
  • applying pressure to the atrioventricle may be executed by a microactuator.
  • applying pressure to the atrioventricular chamber may be performed by being connected to an external pressure source.
  • the external pressure source may be a syringe pump.
  • the external pressure source may be a high pressure gas cylinder.
  • the liquid passing through the main channel may flow in one direction, and the shearing means may be provided on the downstream side of the opening of the micro diverticulum.
  • the liquid passing through the main flow path may flow in two directions, the forward and reverse directions, and the shearing means may be provided on the downstream side of the flow in the two directions.
  • the structure includes a sub-flow channel, the sub-flow channel is connected to an external supply source of a phase separation fluid, and the phase separation fluid passes through the sub-flow channel. There are cases where the phase separation fluid reservoir is supplied.
  • the present invention provides a method for producing a bilayer vesicle of N layers (N is an integer of 2 or 3 or more).
  • N is an integer of 2 or 3 or more.
  • a structure including a main flow channel, a plurality of micro diverticulums opening in the main flow channel, and atrioventricles adjacent to each other through the micro diverticulum and an elastic partition wall A first to (N + 1) th aqueous solution and a first to an Nth phase separation fluid; and a first aqueous solution is allowed to flow through the main flow path of the structure, thereby providing a first aqueous solution.
  • a second aqueous solution is allowed to flow through the main flow path of the body, the first phase separation fluid in the main flow path is removed, and the first phase separation fluid is sandwiched between the first and second aqueous solutions.
  • the first phase separation fluid layer is suspended from the side wall surface of the micro diverticulum.
  • flowing an m-th phase separation fluid (m is an integer from 2 to N-1) through the main flow path of the structure, so that the m-th phase separation fluid is introduced into at least a part of the micro diverticulum.
  • the mth phase separation fluid being the mth and Forming a m-th phase separation fluid layer sandwiched between the (m + 1) -th aqueous solutions, the m-th phase separation fluid layer being suspended on the side wall surface of the microdiverticulum, and the main flow path of the structure Flowing the Nth phase separation fluid into the at least part of the microdiverticulum, and flowing the N + 1th aqueous solution into the main flow path of the structure, The Nth phase separation fluid in the main flow path is removed, and the phase separation fluid is Forming an Nth phase separation fluid layer sandwiched between an Nth and (N + 1) th aqueous solution, the Nth phase separation fluid layer being suspended on the side wall surface of the micro diverticulum, In a state where the phase separation fluid layer is suspended on the side wall surface of the micro diverticulum, by
  • the m-th phase separation fluid (m is an integer from 2 to N-1) flows through the main flow path of the structure, and the m-th phase separation fluid is introduced into at least a part of the micro diverticulum.
  • the present invention provides a bilayer vesicle produced by the bilayer vesicle production apparatus of the present invention.
  • the present invention provides a single-layer bilayer vesicle produced by the bilayer vesicle production method of the present invention.
  • the present invention provides an N-layer bilayer vesicle produced by the N-layer bilayer vesicle production method of the present invention.
  • the same membrane protein may be embedded in the bilayer vesicle of the present invention.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising the bilayer vesicle of the present invention.
  • the present invention provides a cosmetic composition comprising the bilayer vesicle of the present invention.
  • the present invention provides a food composition comprising the bilayer vesicle of the present invention.
  • a vesicle refers to a bimolecular film enclosing a fluid.
  • a bimolecular membrane refers to a membrane composed of two amphiphilic molecules.
  • Bilayer vesicles can be observed with an optical microscope and can be of any shape and size as long as they can be handled by microchannel technology, but they have a spherical or pancake shape.
  • the vesicle is preferably a vesicle having a diameter of 1 ⁇ m to 100 ⁇ m and completely enclosed, and more preferably a vesicle having a diameter of 5 ⁇ m to 40 ⁇ m.
  • the size of a vesicle means a distance from one point on the surface of the vesicle to another point farthest from the surface of the vesicle measured with an optical microscope calibrated with a micrometer.
  • an optical microscope calibrated with a micrometer For pancake vesicles, it refers to the square root of the fluorescently labeled area of an image taken under a microscope.
  • the phase separation fluid is an organic solution or a gas.
  • the organic solution contains amphiphilic molecules that are components of the bilayer membrane.
  • the phase separation fluid of Patent Document 1 is a gas
  • the first and second aqueous solutions of Patent Document 1 contain amphiphilic molecules.
  • the amphiphilic molecules contained in the first and second aqueous solutions of Patent Document 1 may have the same composition or different compositions.
  • the amphiphilic molecule of Patent Document 1 is a molecule that can be dissolved in both water and oil, and is a molecule in which a hydrophilic atomic group and a hydrophobic atomic group coexist in the molecule.
  • the amphiphilic molecule of Patent Document 1 includes, for example, phospholipids such as phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, sphingomyelin, glycolipids such as cerebroside and ganglioside, long-chain alcohols, and long-chain carboxylic acids. , Soaps and synthetic detergents, but not limited to these.
  • the first aqueous solution is enclosed in a vesicle. Therefore, the first aqueous solution can be selected as a solution having the same composition as the desired vesicle solution.
  • an enzyme, a coenzyme, a substrate, a high energy phosphate compound, an electron donor, etc. constituting a transcription, translation, respiration, assimilation, catabolism, information transmission and other reaction systems can be selected alone or in any combination.
  • the first is a cell-free expression system containing RNA polymerase and transcription factor necessary for transcription and translation, aminoacyl-tRNA and ribosome, and DNA encoding a transcription unit containing a promoter and a structural gene. May be contained in liquid. Fluorescent labeling is preferably performed to identify the generated vesicles.
  • a viscous polymer such as polyvinylpyrrolidone or sodium alginate is added to the first aqueous solution.
  • the polymer is a reversibly gelling polymer such as sodium alginate.
  • Sodium alginate gels in the presence of calcium ions.
  • the inside of the vesicle can be gelled by adding a factor that reversibly gels the polymer, such as calcium, to the second aqueous solution or the liquid outside the vesicle after the produced vesicle is recovered. .
  • the vesicle internal solution can be freely reversibly gelled.
  • the gelling factor can be removed by, for example, dilution or addition of EDTA or GEDTA (EGTA), which is a specific chelating agent for calcium ions.
  • EDTA EDTA
  • GEDTA GEDTA
  • the chemical reaction system in the vesicle proceeds efficiently by molecular crowding or excluded volume effect. Further, in order to stably maintain the shape of the vesicle, it is useful when the generated vesicle is transported or stored for a long time.
  • the organic solution is a component of the bilayer membrane, phospholipids such as phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, sphingomyelin, etc., glycolipids such as cerebroside, ganglioside, etc., cholesterol It is preferable to contain other compounds, membrane proteins, and organic solvents that can dissolve them, such as hexadecacene, squalene, and the like.
  • the structure of the present invention is made of polydimethylsiloxane
  • the second aqueous solution of the present invention is an external solution of the vesicle, in order to stably maintain the shape of the vesicle, it has a solution composition that is isotonic with the liquid in the vesicle, that is, the first aqueous solution.
  • a solution composition that is isotonic with the liquid in the vesicle, that is, the first aqueous solution.
  • bovine serum albumin or polyvinylpyrrolidone may be added to prevent vesicles from being electrostatically adsorbed to the container or to stabilize the vesicles.
  • Main structure microdiverticulum, deformable partition wall, elastic partition wall, displaceable partition wall, atrioventricular chamber, shearing means, shearing section, fluid reservoir, overhanging section and auxiliary section included in the structure of the vesicle generating apparatus of the present invention
  • the connection between the flow path, the external supply source of the aqueous solution and / or the external pressure source, and the structure is not limited to the shape shown in the accompanying drawings, and may have any shape.
  • the vesicle production method of the present invention uses not only the method for forming a bimolecular film disclosed in the present specification, but also a bimolecular film formed by another method including Japanese Patent Application No. 2005-220002. May be formed.
  • the main flow path of the structure of the present invention flows so that an aqueous solution, an organic solution and / or a gas supplied from the outside of the structure are introduced into all the micro diverticulas inside the structure. Finally, it is discharged to a drain connected to the outside of the structure.
  • the aqueous solution, organic solution, and / or gas that have flowed through the structure form a layer in the micro diverticulum in the order of flow through the main flow path.
  • the shearing means included in the structure of the vesicle generator according to the present invention includes a tongue-shaped object (hereinafter referred to as “tongue-shaped”) including an organic solution layer deformed by a liquid flow in the main flow path and a first aqueous solution. It may be provided at a position away from the opening of the minute diverticulum, provided that the body can be in contact with the body.
  • the shearing means refers to means for concentrating the shearing force that binds the tongue-like body together with the flow of the main flow path.
  • the shearing unit may concentrate the shearing force by ultrasonic waves, electricity, or the like, in addition to the shearing part which is the physical structure of the structure of the present invention.
  • the dimension of the shearing part and the distance from the opening are the properties of the shape and size of the opening, the viscoelasticity of the aqueous solution and organic solution used, the surface tension, and the side wall surface of the micro diverticulum that suspends the organic solution layer and the shearing part.
  • the shearing part may be a ridge, protrusion, or base that is continuous with the wall surface of the main channel.
  • a structure that supports Alternatively, a structure such as a bridge, a beam, or a rod supported by protrusions, legs, or columns from the wall surface of one or more main flow paths may be used.
  • the shearing part of the present invention may be provided downstream of the opening of the micro diverticulum with respect to the liquid flow in the main channel.
  • the shearing part of the present invention may be provided on the wall surface of the main channel on the same side as the opening of the micro diverticulum, but may be provided on the wall surface of the main channel facing the opening of the micro diverticulum.
  • the liquid passing through the main channel may flow in only one direction (forward direction), but may also flow in the direction opposite to the forward direction (reverse direction).
  • one shearing portion of the present invention is provided on each side of the opening of the micro diverticulum along the longitudinal direction of the main flow path.
  • the two shear portions may have different positions and / or shapes, and vesicles of different sizes can be generated by switching the direction of the liquid flow in the main flow path.
  • phase separation fluid, organic solution or gas of the present invention is introduced into each of the micro diverticulums by flowing the second aqueous solution through the main channel next to the first aqueous solution and then flowing the second aqueous solution through the main channel.
  • the phase separation fluid reservoir of the present invention may be of any structure or shape, provided that a larger volume of organic solution or gas can adhere to the side wall surface of the microdiverticulum.
  • the side wall surface of the micro diverticulum may be subjected to a chemical surface treatment having a high affinity with an organic solution or gas, or the concave surface and / or the convex portion may be provided on the side wall surface to increase the surface area.
  • a chemical surface treatment having a high affinity with an organic solution or gas
  • the concave surface and / or the convex portion may be provided on the side wall surface to increase the surface area.
  • the phase separation fluid reservoir of the present invention switches the functional state of the phase separation fluid reservoir by remotely controlling the affinity of the phase separation fluid of the present invention with the side wall of the microdiverticulum by optical, electrical or other techniques. Preferably it is possible.
  • the generation of the vesicle according to the present invention occurs when the tip of the tongue is pressed against the shearing means and is cut and bundled. Since the vesicle of the present invention is a monolayer bilayer vesicle, the organic solution does not disappear immediately after the vesicle is separated from the tongue. However, the organic solution is consumed when a large amount of vesicles are produced. Therefore, in the present invention, a sub flow path may be provided to replenish the organic solution.
  • the sub-flow path may form an organic solution flow path along the wall surface of the main flow path even after the second aqueous solution is flowed by surface-treating a part of the wall surface of the main flow path.
  • a three-dimensional flow path is provided separately from the path by a fine processing technique.
  • generation apparatus provided with the subchannel for replenishment of an organic solution can continue producing
  • the first aqueous solution of the present invention is also consumed when large amounts of vesicles are produced. Therefore, in the present invention, the first aqueous solution may be replenished from an external supply source.
  • an m + 1th aqueous solution is placed between the mth phase separation fluid reservoir and the m + 1st phase separation fluid reservoir.
  • An opening for replenishing from an external source may be provided.
  • By remotely switching the functional state of each phase separation fluid reservoir it is possible to control which layer is suspended by which phase separation fluid reservoir. Then, the aqueous solution between specific layers can be replenished from the outside. Thereby, the composition of the aqueous solution in the middle of each layer of the N-layer bilayer vesicle can be controlled.
  • the micro diverticulum and the atrioventricle included in the structure of the vesicle generator of the present invention are adjacent to each other via a deformable partition wall. That is, the deformable partition wall is hermetically and liquid-tightly sealed between the micro diverticulum and the atrioventricular chamber, and is deformed so as to protrude toward the micro diverticulum when the pressure in the atria chamber increases. Wake up.
  • the deformable partition included in the structure of the vesicle generator of the present invention may be an elastic partition or a displaceable partition.
  • the elastic partition wall includes a case where the partition wall has a continuous structure with the structure, and at least one of the side surface, the top surface, and the bottom surface of the micro diverticulum is continuous, and the remaining surface includes the micro diverticulum and the atrioventricle. There is a case where sliding is performed on condition that the liquid-tight and air-tight sealing is performed.
  • the displaceable septum slides on the side, top and bottom surfaces of the micro diverticulum, provided that the micro diverticulum and the atrioventricle are sealed fluid-tight and air-tight.
  • a plurality of atrioventricular chambers may be arranged per micro diverticulum included in the structure of the vesicle generating apparatus of the present invention, and a plurality of wall surfaces surrounding the single micro diverticulum may be a deformable partition wall.
  • the chamber that drives each of a plurality of deformable partition walls surrounding one minute diverticulum by pressure change may be connected to an external pressure source by a separate pressure supply path.
  • the chamber that drives the side partition walls The chambers are collectively connected to a single pressure line, and the chambers that drive the top and bottom bulkheads are collectively connected to a single pressure line.
  • the atrioventricular chamber that drives can be connected to a single pressure supply path.
  • an atrioventricular chamber that drives a partition wall on a specific surface of a plurality of micro diverticulums may be connected to one pressure supply path.
  • the pressure in the chamber may be raised by any means known to those skilled in the art.
  • the chamber may be pressurized by any fluid including gas and liquid.
  • the chamber is preferably connected to an external pressure source via a pressure supply path, but the pressure may be increased by an actuator provided in the chamber.
  • the external pressure source includes a syringe pump and a high pressure gas cylinder, but is not limited thereto.
  • the micro diverticulum and the atrioventricle may have any shape and arrangement as long as the elastic partition walls separating the micro diverticulum and the micro diverticulum can be elastically deformed to push the fluid in the micro diverticulum toward the main flow path. Absent.
  • the dimensions and pressure of the micro diverticulum and atrioventricle described in the following examples are determined in relation to the composition and manufacturing method of polydimethylsiloxane used in the structure. Those skilled in the art who know the principles of the present invention can change the dimensions and pressure of the microdiverticulum and atrioventricle depending on the material of the structure.
  • the vesicle generating device, structure, phase separation fluid, air, organic solution, and aqueous solution of the present invention are subjected to sterilization treatment if necessary, or manufactured with materials and manufacturing methods that are not biotoxic. Or prepared.
  • the vesicle generating apparatus of the present invention includes an optical microscope for operating a laser beam and observing a vesicle generating process, a pump for feeding a liquid passing through a main channel, for example, a syringe pump, and a channel. It may be accompanied by auxiliary equipment including, but not limited to, a valve for switching, a controller for an electrical circuit for driving or controlling an actuator of the structure of the present invention, and a temperature controller.
  • the structure of the present invention can be formed into a three-dimensional structure by removing a sacrificial layer by combining conventional fine processing techniques such as photolithography and etching (EE Text Sensor Micromachine Engineering, edited by Hiroyuki Fujita, Ohm (2005)).
  • conventional fine processing techniques such as photolithography and etching
  • the stamp transfer method Japanese Patent Application No. 2007-10867 specification and Onoe, H. et al., Journal of Micromechanics and Microengineering, 17: 1818-1827 (2007)
  • a structure having a three-dimensional shape can be created by combining the conventional fine processing technique and the stamp transfer method.
  • the structure of the present invention may be a molded product produced using a mold having a three-dimensional shape created by combining conventional fine processing techniques and / or the above-mentioned imprint transfer method alone or in combination.
  • the molded article may be made using materials including, but not limited to, plastics, ceramics and hydrogels, and composite materials thereof.
  • it refers to a case where a plurality of minute diverticulums are formed on a single glass substrate and arranged to face each other across the main channel.
  • it refers to a case where the micro diverticulum is arranged so as to be rotationally symmetric with respect to the direction of flow of the fluid in the main channel.
  • FIG. 1 The schematic diagram of the structure of one embodiment of the vesicle production
  • FIG. The schematic diagram which shows one embodiment of the vesicle production
  • FIG. The partial expansion schematic diagram which shows the mode of a deformation
  • the photomicrograph which shows the time passage of the vesicle production
  • the vesicle generator of one embodiment of the present invention includes a microfluidic device, and the microfluidic device includes one or more structures of the present invention.
  • the structure is made of polydimethylsiloxane (PDMS) mounted on a glass surface, and a fine structure including a main flow path and a plurality of micro diverticulas opening in the main flow path is provided by fine processing.
  • a pump and a flow switch are connected to the microfluidic device, and the type of liquid and / or gas flowing from the external source to the main flow channel, the flow rate and / or pressure, the uniform flow, the pulsating flow, and other non-flows. It is possible to freely set the flow as if it were a uniform flow.
  • FIG. 4 shows an external appearance photograph (a) of one embodiment of the vesicle generating apparatus of the present invention and a schematic diagram (b) of the configuration of one embodiment of the structure of the vesicle generating apparatus of the present invention.
  • an aqueous solution, an organic solution and / or a gas are flowed from an external source to the main flow path via a pump and a flow path switch, so that all the minute structures of the structure body are flown.
  • FIG. 4B is a schematic diagram of the structure of the vesicle generating apparatus according to one embodiment of the present invention.
  • a micro diverticulum 22 is opened facing the main channel 21, and the micro diverticulum 22 is adjacent to the atrioventricular chamber 24 through an elastic partition wall 23.
  • a pressure feeding path 25 extends from the chamber 24 and is connected to the external pressure source.
  • the elastic partition wall 23 seals between the micro diverticulum 22 and the atrioventricular chamber 24 in an air-tight and liquid-tight manner, and when the pressure in the atrioventricular chamber 24 is increased by the gas from the external pressure source, the elastic partition wall 23 is directed toward the micro diverticulum 22. Cause elastic deformation to protrude.
  • the elastic partition wall 23 pushes the fluid in the minute diverticulum 22 toward the main channel by the pressure increase in the atrioventricular chamber 24.
  • the micro diverticulum 22 has a depth of 60 ⁇ m
  • the elastic partition wall 23 separating the micro diverticulum 22 and the atrioventricular chamber 24 has a width of 100 ⁇ m.
  • FIGS. 5 (a-1) and (a-2) are micrographs of a micro diverticulum and an atrioventricle in one embodiment of the structure of the vesicle generating apparatus of the present invention.
  • a broken line shows the outline of the communicating path 32 from the main flow path 31 and the micro diverticulum 33.
  • the thickness of the elastic partition wall 34 that is, the distance between the micro diverticulum 33 and the atrioventricular chamber 35 is 30 ⁇ m.
  • FIG. 5 (b-1) is a schematic diagram of a cross section including the A-A ′ line shown in FIG. 5 (a-1) and perpendicular to the plane of FIG. 5 (a-1). As shown in FIG.
  • the height of the micro diverticulum 33, elastic partition wall 34 and atrioventricular chamber 35 is 100 ⁇ m
  • the height of the main flow path 31 is 15 ⁇ m
  • the communication path between the main flow path 31 and the micro diverticulum 33 32 has an orifice shape whose height is 15 ⁇ m, which is the same as that of the main channel 31, but whose width is narrower than the width of 100 ⁇ m of the opening to the micro diverticulum 33.
  • FIGS. 5 (a-2) and 5 (b-2) show how the elastic partition wall 34 is elastically deformed to protrude toward the micro diverticulum 33 by increasing the pressure in the atrioventricular chamber 35, respectively. It is the microscope picture and cross-sectional schematic diagram which show.
  • the height of the main flow path 31 and the communication path 32 is 15 ⁇ m, which is lower than the height of the micro diverticulum 33 and the atrioventricular chamber 35 of 100 ⁇ m. Then it is greatly amplified.
  • FIG. 5C is a graph showing the relationship between the air supply volume and the pressure.
  • the vertical axis of the graph is the pressure (kPa) in the chamber, and the horizontal axis is the air supply volume (mL).
  • the vesicle generating apparatus of this example was provided with 42 micro diverticulas and atrioventricular chambers, and the total volume in the apparatus was 360 nL.
  • the pressure was measured by inserting a pressure sensor between the syringe and the device when air was sent by the syringe.
  • the pressure in the chamber can be increased to 15 to 110 kPa simply by feeding 0.5 to 2.5 mL of air as a pressure source.
  • 5D is a graph showing the relationship between the pressure in the chamber and the deformation of the elastic partition wall.
  • the vertical axis of the graph represents the displacement (unit: ⁇ m) compared with the pressure before the pressurization, and the tip of the elastic partition deformed by pressurization and protruded into the micro diverticulum, and the horizontal axis represents the pressure (kPa) in the chamber. is there.
  • 5 (c) and 5 (d) in the vesicle generating apparatus of this example, the elasticity is increased from 10 ⁇ m to 30 ⁇ m with respect to the depth of 60 ⁇ m of the microdiverticulum by sending 1.0 mL to 2.5 mL of air.
  • the partition wall could be deformed.
  • the volume of the vesicle is adjusted by adjusting the pressure applied to the microdiverticulum and the flow rate of the second aqueous solution flowing through the main channel.
  • Calcein was added to the first aqueous solution.
  • the organic solution hexadecane containing 10 mg / mL of the amphiphilic molecule diphytanol phosphatidylcholine (DPhPC) was used.
  • DPhPC amphiphilic molecule diphytanol phosphatidylcholine
  • BASF block copolymer surfactant pluronic F88
  • FIG. 6A is a photomicrograph showing a state where the first aqueous solution that has flowed through the main channel fills the microdiverticulum.
  • FIG. 6B is a photomicrograph showing a state in which the organic solution that has flowed into the main channel following the first aqueous solution fills the communication path from the main channel to the microdiverticulum.
  • a broken line shows the outline of the communicating path from a main flow path, and a micro diverticulum.
  • FIG. 6 (c) shows that the second aqueous solution that has flowed into the main flow path after the organic solution fills the main flow path, and the organic solution is in the communication path, and the first and second aqueous solutions.
  • FIG. 6D is a graph showing the relationship between the pressure supply and the volume of the liquid pushed out from the chamber.
  • the horizontal axis of the graph represents the pressure (kPa) in the chamber, and the vertical axis represents the volume ( ⁇ L) of the liquid pushed out from the chamber.
  • the volume was calculated by approximating the amount of water flowing back into the micro diverticulum when the liquid was pushed out and the syringe returned, by the product of the area of the inflowing liquid observed under the microscope and the height of the micro diverticulum.
  • a pressure of about 15 to 48 kPa to the atrioventricular chamber, a volume of about 1.5 to 6 ⁇ L can be pushed out of the micro diverticulum into the main channel.
  • a pressure generating means that can be realized at a relatively low cost, such as an air injection operation in the order of mL.
  • FIG. 7 is a photomicrograph showing the time course of vesicle generation according to the present invention.
  • calcein was added to the first aqueous solution to visualize the vesicles.
  • the time lapse t of each frame in FIGS. 7A to 7D is expressed in seconds.
  • the broken line in FIG. 7A shows the outline of the communication path from the main flow path and the minute diverticulum.
  • one vesicle was generated in about 1.6 seconds.

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Abstract

　従来技術のベシクル生成装置より廉価な圧力発生手段を用いて、より簡便に生体細胞とほぼ同じ寸法の二分子膜ベシクルを生成することができる技術を開発する。　本発明は二分子膜ベシクルの生成装置を提供する。本発明の二分子膜ベシクルの生成装置は、主流路と、該主流路に開口する複数の微小憩室と、変形可能な隔壁を介して前記微小憩室に隣接する房室とを含む構造体を複数含む。本発明は二分子膜ベシクルの生成方法を提供する。本発明のベシクルの生成方法は、前記相分離流体の層が前記微小憩室の側壁面に懸架された状態で、前記房室に圧力を加えることにより、前記変形可能な隔壁が前記微小憩室内に突出するように変形して第１の水性溶液を押し流して、前記相分離流体層の先端が前記微小憩室の開口から前記主流路に入るように前記相分離流体層を伸張させるステップとを含む。

Description

圧力式均一直径ベシクル生成装置
　本発明は、二分子膜ベシクルの生成装置及び生成方法に関し、より具体的には、圧力によって弾性変形する隔壁を備えたマイクロ流路を用いる二分子膜ベシクルの生成装置及び生成方法に関する。
　所望の高分子化合物を含む所望の体積が完全に封入された、単一層の両親媒性分子膜からなるベシクルは、顕微鏡スケールの化学リアクタとして、医薬品の送達ビークルとして、あるいは、さまざまな環境刺激に応答するバイオセンサーとしての用途が期待される。特に１μｍないし１００μｍの範囲でサイズが均一な単一層のリン脂質ベシクルは、実際の生体細胞とほぼ同じ寸法を有し、生体膜の複雑な機能のモデル系として需要が大きい。そして生体細胞を構成している要素の機能を一つ一つ組み合わせて人工細胞を作成することによって、さらに高度な生命現象及びその分子機序を理解し応用することが可能になる。
　特許文献１に示すとおり、本発明の発明者らは、１μｍないし１００μｍの範囲のサイズで均一な単一層の二分子膜ベシクルを大量に生成する装置を開発した。特許文献１のベシクル生成装置は、マイクロ流体デバイスを含み、該マイクロ流体デバイスは１個又は２個以上の構造体を含む。前記構造体は、ガラス面にマウントされたポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）でできており、主流路と、該主流路に開口する複数の微小憩室とを含む微細構造が微細加工により設けられる。前記マイクロ流体デバイスには、ポンプ及び流路スイッチが連結され、前記主流路に流す液体の種類と、流速と、均一流か、脈流その他の不均一流かのような流し方とを自由に設定することができる。図１は特許文献１に記載のベシクル生成装置の構造体の模式図である。主流路１に面して微小憩室２が開口し、微小憩室２は連通細路３を介して房室４と連絡する。房室４には圧力発生部５が設けられる。特許文献１に記載の発明の１つの実施態様では、圧力発生部５は、房室４の底面にパターン状に配置されたアルミニウム薄膜６に合焦したレーザ光７によって発生した微細気泡８の膨張のために圧力を発生する。前記圧力によって房室４から連通細路３に液体が押し出される。しかし、連通細路３は狭く長いため流動抵抗を生じさせる。そのため、連通細路３は、房室４から微小憩室２に向かう液流を緩徐化する。主流路１の液流に関して微小憩室２の開口の下流側の主流路の壁面には剪断部９が設けられる。特許文献１の１つの実施態様では、主流路、微小憩室、その他全てのポリジメチルシロキサン構造のガラス面にマウントされた深さ（図１の平面と垂直な方向の寸法）は１７μｍである。微小憩室２の主流路１の壁面への開口の幅は２０μｍである。連通細路３の幅は６μｍで、連通細路３の微小憩室２への開口面と、連通細路３の房室４への開口面との距離、すなわち、連通細路３の長さは１００μｍである。剪断部９の主流路壁面からの高さは１０μｍである。
　図２は特許文献１に記載のベシクル生成方法の１つの実施態様を示す模式図である。まず、第１の水性溶液と、ベシクル膜を構成する両親媒性分子を含む水不溶性の有機溶液と、第２の水性溶液とをこの順序で特許文献１のベシクル生成装置に通過させる（図２ＡないしＨ）。第１の水性溶液はベシクル内液となる。主流路を流れる第１の水性溶液は、特許文献１の構造体のそれぞれの微小憩室の開口から微小憩室に侵入し、連通細路を通って房室を満たす（図２Ａ）。つぎに、有機溶液を主流路に流す。ここで有機溶液として、例えば、ヘキサデカン１７で脂質を溶解した有機溶液を用いる場合には、ポリジメチルシロキサンを溶解しないが、ポリジメチルシロキサン表面で濡れる性質を有し、ポリジメチルシロキサン樹脂に当該有機溶液が吸収され、ポリジメチルシロキサン樹脂が膨潤変形する。これにより、特許文献１の構造体の微小憩室２の内部に、前記有機溶液が侵入する（図２Ｂ）。前記有機溶液はポリジメチルシロキサン表面で濡れるので、有機溶液層は微小憩室２の相対する側壁面に懸架されて微小憩室を封止する。なお、ポリジメチルシロキサンが膨潤変形するため、連通細路もさらに狭くなるので、前記有機溶液は連通細路内には侵入しない。最後に、第２の水性溶液を主流路に流すことによって主流路内の有機溶液を押し流して除去する。前記有機溶液は、第１及び第２の水性溶液との間で相分離し界面で隔てられた有機溶液層を形成する（図２Ｃ）。その後、房室内の圧力発生部で圧力を発生させて、微小憩室内の第１の水性溶液が有機溶液層を微小憩室の開口に向けて押す。房室内の圧力発生部で発生した圧力は連通細路によって緩徐化されているので有機溶液層は微小憩室の側壁面に懸架されたまま微小憩室の開口の外に向けて断面が凸状に変形する（図２Ｄ）。このとき凸状に変形した有機溶液層の先端部では層が薄くなる。主流路では第２の水性溶液が一定速度で流れている（図２では左から右への向き）ので、有機溶液層の先端がさらに伸張して微小憩室の開口から主流路に入ると、該先端部が主流路の液流に押されて主流路の下流（図２では右）向きに屈曲する（図２Ｅ）。第１の水性溶液によって押された有機溶液層の先端が剪断手段を越えて伸張すると、主流路の液流により前記有機溶液層が前記剪断手段に押しつけられる（図２Ｆ）。そして、有機溶液層の先端が括れて切断される（図２Ｇ）。その後も第１の水性溶液によって前記有機溶液層の先端が前記剪断手段を越えて伸張して、順次前記先端が括れてベシクルとして切断される（図２Ｈ）。その結果、第１の水性溶液を内部に含むベシクルが第２の水性溶液を主流路の下流に向かって流れる。
　図３の（Ａ）は特許文献１に記載のベシクル生成装置の主流路に第１の水性溶液（薄いハッチングの「Ｗａｔｅｒ」と表記）と、有機溶液（「Ｏｉｌ」と表記）と、第２の水性溶液（濃いハッチングの「Ｗａｔｅｒ」と表記）とを順次流す様子を示す斜視図であり、（Ｂ）ないし（Ｈ）は特許文献１のベシクル生成装置の構造体の１つの実施態様における微小憩室の開口付近での有機溶液層の変形の様子を示す部分拡大模式図である。第１の水性溶液は空気を押し出して微細憩室の中に侵入し、導入される（図３Ｂ）。有機溶液が前記微細憩室の中に導入された後（図Ｃ）、第２の水性溶液が前記微細憩室の中に侵入し、該微細憩室の中に前記有機溶液の層が形成される（図３Ｄ）。前記有機溶液層に溶けた両親媒性分子の分子は棒状の疎水性原子団と球状の親水性原子団とからなり、第１及び第２の水性溶液と前記有機溶液層との界面では親水性原子団が水性溶液に接するように配向する（図３Ｃ、Ｄ）。主流路の液流に関して微小憩室の開口の下流側の主流路の壁面には剪断部９が設けられる。微小憩室が主流路に面する開口周縁には憩室の壁面が張り出して内径を狭くする張出部１０が設けられる場合がある。張出部１０は憩室の内面の表面積を局所的に増大させるため、より大きい体積の有機溶液の層を微小憩室の開口に懸架することができる。有機溶液層は伸張に伴って微小憩室の壁面及び／又は張出部の周辺から伸張の先端に向かって薄くなり、最終的には全ての両親媒性分子が第１又は第２の水性溶液に接するように配向した二分子膜が形成される（図３Ｅ）。
　特許文献１に詳しく説明されるとおり、特許文献１に記載のベシクル生成装置は、１μｍないし１００μｍの範囲のサイズで均一な単一層の二分子膜ベシクルを大量に生成することができた。しかし、特許文献１に記載の装置では、房室内で圧力を発生させるために、レーザ光をベシクル生成装置の各房室に次々と移動させて、アルミニウム薄膜にレーザ光を合焦させなければならない。このように正確にレーザ光束を操作する高度な技術は非常に高価であり、均一な単一層の二分子膜ベシクル生成技術を普及するうえで障害となる。また、同時に複数の房室のアルミニウム薄膜にレーザ光を合焦させることはできないので、多数のベシクルを生成することが困難である。
国際出願ＰＣＴ／ＪＰ２００９／０６４４２７号明細書
　そこで、より廉価な圧力発生手段を用いて、より多くのベシクルを生成することができる技術を開発する必要がある。
　本発明は二分子膜ベシクルの生成装置を提供する。本発明の二分子膜ベシクルの生成装置は、主流路と、該主流路に開口する複数の微小憩室と、変形可能な隔壁を介して前記微小憩室に隣接する房室とを含む構造体を複数含む。
　本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記変形可能な隔壁は弾性隔壁の場合がある。
　本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記変形可能な隔壁は変位可能な隔壁の場合がある。
　本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記構造体は剪断手段を含む場合がある。
　本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記微小憩室の壁面には相分離流体リザーバーが設けられ、該相分離流体リザーバーは相分離流体の層を懸架し、該相分離流体の層は、前記主流路と前記微小憩室との間を封止する場合がある。
　本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記微小憩室の壁面には複数の相分離流体リザーバーが設けられ、該複数の相分離流体リザーバーは複数の相分離流体の層を懸架し、該複数の相分離流体の層は、前記主流路と前記微小憩室との間を封止する場合がある。
　本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記相分離流体リザーバーは前記微小憩室の側壁面から該微小憩室内に伸びる張出部の場合がある。
　本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記房室には圧力発生部が設けられる場合がある。
　本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記房室は外部圧力源に接続される場合がある。
　本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記外部圧力源はシリンジポンプの場合がある。
　本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記外部圧力源は高圧ガスボンベの場合がある。
　本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記主流路を通過する相分離流体は１つの向きに流れ、前記剪断手段は前記微小憩室の開口の下流側に設けられる場合がある。
　本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記主流路を通過する液体は順逆２つの向きに流れ、前記剪断手段は前記２つの向きの流れのそれぞれの下流側に設けられる場合がある。
　本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記房室は水性溶液の外部供給源に接続され、該水性溶液は前記連通細路を介して前記微小憩室に供給される場合がある。
　本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記構造体は１個又は２個以上の水性溶液の流路を含み、該水性溶液の流路は、前記複数の相分離流体リザーバーのうち少なくとも２個の間に設けられた前記微小憩室の壁面の開口と、前記複数の水性溶液のそれぞれの外部供給源とを連絡する場合がある。
　本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記構造体は副流路を含み、該副流路は相分離流体の外部供給源に接続され、該相分離流体は前記副流路を介して前記相分離流体リザーバーに供給される場合がある。
　本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記微小憩室は２次元的に配置される場合がある。
　本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記微小憩室は３次元的に配置される場合がある。
　本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記相分離流体の層は水性溶液との間で界面を形成する場合がある。
　本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記相分離流体は両親媒性分子を含む有機溶液の場合がある。
　本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記相分離流体は気体か、両親媒性分子を含まない有機溶液かであり、前記水性溶液は両親媒性分子を含む場合がある。
　本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記構造体はポリジメチルシロキサンでできており、前記有機溶液はポリジメチルシロキサンを膨潤変形させる場合がある。
　本発明は二分子膜ベシクルの生成方法を提供する。本発明の二分子膜ベシクルの生成方法は、主流路と、該主流路に開口する複数の微小憩室と、該微小憩室と弾性隔壁を介して隣接する房室とを含む構造体と、第１及び第２の水性溶液と、相分離流体とを用意するステップと、前記構造体の主流路に第１の水性溶液を流して、第１の水性溶液を前記微小憩室に導入するステップと、前記構造体の主流路に前記相分離流体を流して、該相分離流体を前記微小憩室の少なくとも一部に導入するステップと、前記構造体の主流路に第２の水性溶液を流して、前記主流路内の前記相分離流体を除去し、前記相分離流体が相分離流体層を形成し、該相分離流体層は前記微小憩室の側壁面に懸架されるステップと、前記相分離流体層が前記微小憩室の側壁面に懸架された状態で、前記房室に圧力を加えることにより、前記弾性隔壁が前記微小憩室内に突出するように変形して第１の水性溶液を押し流して、前記相分離流体層の先端が前記微小憩室の開口から前記主流路に入るように前記相分離流体層を伸張させるステップと、前記主流路内の第２の水性溶液の液流が前記相分離流体層を剪断することによって、前記相分離流体層と、該相分離流体層に包囲された第１の水性溶液とが括れてベシクルとして切断されるステップとを含む。
　本発明の二分子膜ベシクルの生成方法において、前記変形可能な隔壁は弾性隔壁の場合がある。
　本発明の二分子膜ベシクルの生成方法において、前記変形可能な隔壁は変位可能な隔壁の場合がある。
　本発明の二分子膜ベシクルの生成方法において、前記相分離流体は両親媒性分子を含む有機溶液の場合がある。
　本発明の二分子膜ベシクルの生成方法において、第１及び第２の水性溶液は両親媒性分子を含み、前記相分離流体は気体か、両親媒性分子を含まない有機溶液かの場合がある。
　本発明の二分子膜ベシクルの生成方法において、第１の水性溶液が含む両親媒性分子は第２の水性溶液が含む両親媒性分子と異なる組成の場合がある。
　本発明の二分子膜ベシクルの生成方法において、前記構造体は剪断手段を含み、該剪断手段は前記主流路内の第２の水性溶液の液流とともに前記相分離流体層を剪断する場合がある。
　本発明の二分子膜ベシクルの生成方法において、前記微小憩室の壁面には相分離流体リザーバーが設けられ、前記相分離流体リザーバーは相分離流体の層を懸架し、該相分離流体の層は、前記主流路と前記微小憩室との間を封止する場合がある。
　本発明の二分子膜ベシクルの生成方法において、前記相分離流体リザーバーは前記微小憩室の側壁面から該微小憩室内に伸びる張出部の場合がある。
　本発明の二分子膜ベシクルの生成方法において、前記房室に圧力を加えることは、マイクロアクチュエータによって実行される場合がある。
　本発明の二分子膜ベシクルの生成方法において、前記房室に圧力を加えることは、外部圧力源に接続されることによって実行される場合がある。
　本発明の二分子膜ベシクルの生成方法において、前記外部圧力源はシリンジポンプの場合がある。
　本発明の二分子膜ベシクルの生成方法において、前記外部圧力源は高圧ガスボンベの場合がある。
　本発明の二分子膜ベシクルの生成方法において、前記主流路を通過する液体は１つの向きに流れ、前記剪断手段は前記微小憩室の開口の下流側に設けられる場合がある。
　本発明の二分子膜ベシクルの生成方法において、前記主流路を通過する液体は順逆２つの向きに流れ、前記剪断手段は前記２つの向きの流れのそれぞれの下流側に設けられる場合がある。
　本発明の二分子膜ベシクルの生成方法において、前記構造体は副流路を含み、該副流路は相分離流体の外部供給源に接続され、該相分離流体は前記副流路を介して前記相分離流体リザーバーに供給される場合がある。
　本発明はＮ層（Ｎは２又は３以上の整数）の二分子膜ベシクルの生成方法を提供する。特許文献１のＮ層の二分子膜ベシクルの生成方法において、主流路と、該主流路に開口する複数の微小憩室と、該微小憩室と弾性隔壁を介して隣接する房室とを含む構造体と、第１ないし第Ｎ＋１番目の水性溶液と、第１ないし第Ｎ番目の相分離流体とを用意するステップと、前記構造体の主流路に第１の水性溶液を流して、第１の水性溶液を前記微小憩室に導入するステップと、前記構造体の主流路に第１の相分離流体を流して、第１の相分離流体を前記微小憩室の少なくとも一部に導入するステップと、前記構造体の主流路に第２の水性溶液を流して、前記主流路内の第１の相分離流体を除去し、第１の相分離流体が第１及び第２の水性溶液で挟まれた第１の相分離流体層を形成し、第１の相分離流体層は前記微小憩室の側壁面に懸架されるステップと、前記構造体の主流路に第ｍ番目（ｍは２からＮ－１までの整数）の相分離流体を流して、第ｍ番目の相分離流体を前記微小憩室の少なくとも一部に導入するステップと、前記構造体の主流路に第ｍ＋１番目の水性溶液を流して、前記主流路内の第ｍ番目の相分離流体を除去し、第ｍ番目の相分離流体が第ｍ番目及び第ｍ＋１番目の水性溶液で挟まれた第ｍ番目の相分離流体層を形成し、第ｍ番目の相分離流体層は前記微小憩室の側壁面に懸架されるステップと、前記構造体の主流路に第Ｎ番目の相分離流体を流して、第Ｎ番目の相分離流体を前記微小憩室の少なくとも一部に導入するステップと、前記構造体の主流路に第Ｎ＋１番目の水性溶液を流して、前記主流路内の第Ｎ番目の相分離流体を除去し、前記相分離流体が第Ｎ番目及び第Ｎ＋１番目の水性溶液で挟まれた第Ｎ番目の相分離流体層を形成し、第Ｎ番目の相分離流体層は前記微小憩室の側壁面に懸架されるステップと、前記Ｎ個の相分離流体層が前記微小憩室の側壁面に懸架された状態で、前記房室に圧力を加えることにより、前記房室を経て前記微小憩室に第１の水性溶液が押し流されて、前記Ｎ個の相分離流体層の先端が前記微小憩室の開口から前記主流路に入るように前記Ｎ個の相分離流体層を伸張させるステップと、前記主流路内の第Ｎ＋１番目の水性溶液の液流が前記Ｎ個の相分離流体層を剪断することによって、前記Ｎ個の相分離流体層と、該Ｎ個の相分離流体層に包囲された第１ないし第Ｎ番目の水性溶液とが括れてベシクルとして切断されるステップとを含む。ここで、前記構造体の主流路に第ｍ番目（ｍは２からＮ－１までの整数）の相分離流体を流して、第ｍ番目の相分離流体を前記微小憩室の少なくとも一部に導入するステップと、前記構造体の主流路に第ｍ＋１番目の水性溶液を流して、前記主流路内の第ｍ番目の相分離流体を除去し、第ｍ番目の相分離流体が第ｍ番目及び第ｍ＋１番目の水性溶液で挟まれた第ｍ番目の相分離流体層を形成し、第ｍ番目の相分離流体層は前記微小憩室の側壁面に懸架されるステップとは、ｍの値を２、３、４、・・・、Ｎ－１としてＮ－２回繰り返して実施される。
　本発明は、本発明の二分子膜ベシクルの生成装置によって生成される、二分子膜ベシクルを提供する。
　本発明は、本発明の二分子膜ベシクルの生成方法によって生成される単一層の二分子膜ベシクルを提供する。
　本発明は、本発明のＮ層の二分子膜ベシクルの生成方法によって生成されるＮ層の二分子膜ベシクルを提供する。
　本発明の二分子膜ベシクルは、同一の膜タンパク質が埋め込まれている場合がある。
　本発明は、本発明の二分子膜ベシクルを含む医薬品組成物を提供する。
　本発明は、本発明の二分子膜ベシクルを含む化粧料組成物を提供する。
　本発明は、本発明の二分子膜ベシクルを含む食品組成物を提供する。
　本発明において、ベシクルとは、流体を内封した二分子膜をいう。二分子膜とは両親媒性分子２個からなる膜をいう。二分子膜ベシクルは光学顕微鏡で観察することができ、マイクロ流路技術によって取り扱うことができることを条件にいかなる形状及び大きさのベシクルであってもかまわないが、球形又はパンケーキ状の形状をとり、直径が１μｍないし１００μｍで、内部が完全に封入されたベシクルであることが好ましく、直径が５μｍないし４０μｍのベシクルであることがより好ましい。
　本発明においてベシクルのサイズとは、ほぼ球形のベシクルについては、マイクロメータで較正された光学顕微鏡で測定されたベシクルの表面の１点からもっとも離れた別の点までの距離をいう。パンケーキ状のベシクルについては顕微鏡下で撮影された画像の蛍光標識された面積の平方根をいう。
　本発明において相分離流体は、有機溶液又は気体である。特許文献１の相分離流体が有機溶液のとき、該有機溶液は二分子膜の構成成分である両親媒性分子を含む。特許文献１の相分離流体が気体の場合には、特許文献１の第１及び第２の水性溶液は両親媒性分子を含む。特許文献１の第１及び第２の水性溶液に含まれる両親媒性分子は同じ組成の場合と、異なる組成の場合がある。特許文献１の両親媒性分子は、水と油のいずれにも溶解することができる分子であって、分子内に親水性原子団と疎水性原子団とが共存する分子をいう。特許文献１の両親媒性分子は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン等のリン脂質と、セレブロシド、ガングリオシド等の糖脂質と、長鎖アルコールと、長鎖カルボン酸と、石鹸と、合成洗剤とを含むがこれらに限られない。
　本発明において第１の水性溶液はベシクル内に封入される。したがって、第１の水性溶液は所望のベシクル内液と同じ組成の溶液を選択できる。例えば、転写、翻訳、呼吸、同化、異化、情報伝達その他の反応系を構成する酵素、補酵素、基質、高エネルギーリン酸化合物、電子供与体等を単独又は任意の組み合わせで選択することができる。以下の実施例に示すとおり、転写及び翻訳に必要なＲＮＡポリメラーゼ及び転写因子と、アミノアシルｔＲＮＡ及びリボソームとを含む無細胞発現系と、プロモーター及び構造遺伝子を含む転写ユニットをコーディングしたＤＮＡとが第１液に含まれる場合がある。生成されたベシクルを識別するために蛍光標識を行うことが好ましい。
　第１の水性溶液にポリビニルピロリドンやアルギン酸ナトリウムのような粘稠性ポリマーを添加する場合もある。前記ポリマーがアルギン酸ナトリウムのような可逆的にゲル化するポリマーの場合もある。アルギン酸ナトリウムはカルシウムイオン存在下でゲル化する。カルシウムのようにポリマーを可逆的にゲル化させる因子を、第２の水性溶液か、生成されたベシクルを回収した後のベシクル外液かに添加することにより、ベシクル内部をゲル化させることができる。ベシクル外液から前記ゲル化させる因子を除去することによって、自在にベシクル内液を可逆的にゲル化することができる。前記ゲル化させる因子の除去は、例えば、希釈か、カルシウムイオンに対する特異的キレート剤であるＥＤＴＡやＧＥＤＴＡ（ＥＧＴＡ）の添加かによって行うことができる。ベシクル内部に粘稠なポリマー又はゲルが存在すると、ベシクル内での化学反応系が分子クラウディング又は排除体積効果によって効率よく進行する。また、ベシクルの形状を安定に保持するため、生成したベシクルを輸送したり、長期保存する際に有用である。
　本発明において有機溶液は、二分子膜の構成成分である、リン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン等と、糖脂質、例えば、セレブロシド、ガングリオシド等と、コレステロールその他の化合物と、膜タンパク質と、これらを溶解させることのできる有機溶媒、例えば、ヘキサデカセン、スクアレン等を含むのが好ましい。本発明の構造体がポリジメチルシロキサンでできている場合には、ポリジメチルシロキサンに吸収され、膨潤変形させることができるヘキサデカセンを溶媒として用いることが好ましい。
　本発明の第２の水性溶液は、ベシクルの外液であるから、ベシクルの形状を安定に保持するためにはベシクル内液、すなわち、第１の水性溶液と等張性の溶液組成を有することが好ましい。また静電気的に容器にベシクルが吸着することを防いだり、ベシクルを安定化するために、ウシ血清アルブミン、ポリビニルピロリドンを添加する場合がある。
　本発明のベシクルの生成装置の構造体に含まれる、主流路、微小憩室、変形可能な隔壁、弾性隔壁、変位可能な隔壁、房室、剪断手段、剪断部、流体リザーバー、張出部及び副流路と、水性溶液の外部供給源及び／又は外部圧力源と前記構造体との接続は添付する図面に示された形状に限定されず、いかなる形状のものであってもかまわない。本発明のベシクル生成方法は、本明細書に開示された２分子膜の形成方法だけでなく、特願２００５－２２０００２号明細書をはじめとする他の方法で形成された２分子膜を用いて形成される場合がある。
　本発明の構造体の主流路は、構造体の外部から供給される水性溶液、有機溶液及び／又は気体を、構造体内部の全ての微小憩室に導入するように流す。最終的には構造体の外部に接続されたドレンに排出される。構造体を流れた水性溶液、有機溶液及び／又は気体は、主流路を流れた順に前記微小憩室内で層を形成する。
　本発明のベシクルの生成装置の構造体に含まれる剪断手段は、主流路の液流よって変形した有機溶液層と第１の水性溶液とを含む舌状の断面形状の物体（以下、「舌状体」という。）が接触することが可能なことを条件として、微小憩室の開口から離れた位置に設けてもかまわない。剪断手段は、主流路の流れとともに舌状体を括る剪断力を集中させる手段をいう。剪断手段は、本発明の構造体の物理的構造である剪断部の他、超音波、電気等によって剪断力を集中させるものであってもかまわない。剪断部の寸法及び開口からの距離は、開口の形状及び大きさ、用いる水性溶液及び有機溶液の粘弾性、表面張力等の物性や、有機溶液層を懸架する微小憩室の側壁面及び剪断部の濡れ特性等に応じて当業者が適切に設計することができる。剪断部は、主流路の壁面と連続した凸条、突起又は台の場合がある。剪断部が微小憩室の開口と連続した構造、例えば、微小憩室の開口の狭窄又はノズルや、主流路の下流側の開口が主流路内に伸びて、主流路に侵入した舌状体の下流側を支持する構造の場合がある。あるいは、１個又は２個以上の前記主流路の壁面からの突起、脚又は柱によって支持される橋、梁又は棒のような構造であってもかまわない。本発明の剪断部は主流路の液流に関して微小憩室の開口の下流側に設けられる場合がある。本発明の剪断部は微小憩室の開口と同側の主流路の壁面に設けられる場合があるが、微小憩室の開口に向き合う主流路の壁面に設けられる場合がある。本発明において、主流路を通過する液体は１つの向き（順方向）のみに流れる場合があるが、順方向と反対の向き（逆方向）にも流れる場合がある。その場合には本発明の剪断部は主流路の長手方向に沿って微小憩室の開口の両側に１個ずつ設けられる。２個の剪断部は位置及び／又は形状が異なる場合があり、主流路の液流の向きを切り替えることによって異なるサイズのベシクルを生成することができる。
　本発明の相分離流体、有機溶液又は気体は第１の水性溶液の次に主流路に流され、その後、第２の水性溶液を主流路に流すことによって、微小憩室のそれぞれに導入される。微小憩室に張出部その他の相分離流体リザーバーを微小憩室の開口付近に設けることによって、より大きい体積の有機溶液を懸架することが可能になる。本発明の相分離流体リザーバーは、より大きい体積の有機溶液又は気体が微小憩室の側壁面に付着することができることを条件としていかなる構造又は形状のものであってもかまわない。例えば、微小憩室の側壁面に有機溶液又は気体との親和性の高い化学的な表面処理を施す場合があり、あるいは、前記側壁面に凹部及び／又は凸部を設けて表面積を増大させるものであってもよく、図３に示される張出部に限定されない。本発明の相分離流体リザーバーは、光学的、電気的その他の手法によって本発明の相分離流体の微小憩室の側壁面との親和性を遠隔制御して、相分離流体リザーバーの機能の状態を切り替え可能であることが好ましい。
　本発明のベシクルの生成は前記舌状体の先端が剪断手段に押しつけられて括れて切断されることによって起こる。本発明のベシクルは単一層の二分子膜ベシクルであるから、舌状体からベシクルが分離してもすぐには有機溶液はなくならない。しかし、大量のベシクルが生成すると有機溶液は消費される。そこで、本発明では有機溶液を補給するために副流路を設ける場合がある。副流路は、主流路の壁面の一部を表面処理して第２の水性溶液を流した後でも主流路の壁面に沿って有機溶液の流路が形成される場合があり、あるいは、主流路とは別に立体的な流路を微細加工技術によって設ける場合がある。有機溶液の補給のための副流路を備えたベシクル生成装置は、長期安定的に同一品質のベシクルを生成しつづけることができる。同様に、本発明の第１の水性溶液も大量のベシクルが生成すると消費される。そこで、本発明では第１の水性溶液を外部供給源から補給する場合がある。Ｎ個の相分離流体リザーバーを備えたＮ層の二分子膜ベシクルの生成装置では、第ｍ番目の相分離流体リザーバーと第ｍ＋１番目の相分離流体リザーバーとの間に第ｍ＋１番目の水性溶液を外部供給源から補給するための開口を設ける場合がある。各相分離流体リザーバーの機能状態を遠隔的に切り替えることによって、どの層がどの相分離流体リザーバーによって懸架されるかを制御することができる。すると、特定の層の間の水性溶液を外部から補給することができる。これにより、Ｎ層の二分子膜ベシクルの各層の中間の水性溶液の組成を制御することができる。
　本発明のベシクルの生成装置の構造体に含まれる微小憩室と房室とは、変形可能な隔壁を介して隣接する。すなわち前記変形可能な隔壁は、前記微小憩室と前記房室との間を気密及び液密に封止し、かつ、該房室内の圧力が上昇すると、前記微小憩室に向けて突出するように変形を起こす。
　本発明のベシクルの生成装置の構造体に含まれる変形可能な隔壁は、弾性隔壁か、変位可能な隔壁かの場合がある。前記弾性隔壁には、隔壁が構造体と連続した一体構造をなす場合と、微小憩室の側面、頂面及び底面のうち少なくとも１つの面が連続し、残りの面については微小憩室及び房室を液密かつ気密に密封することを条件として摺動する場合とがある。前記変位可能な隔壁は、微小憩室の側面、頂面及び底面の全てについて、微小憩室及び房室を液密かつ気密に密封することを条件として摺動する。
　さらに、本発明のベシクルの生成装置の構造体に含まれる微小憩室１個あたり複数の房室が配置され、１個の微小憩室を取り囲む複数の壁面が変形可能な隔壁であってもかまわない。１個の微小憩室を取り囲む複数の変形可能な隔壁のそれぞれを圧力変化で駆動する房室は、個別の送圧路で外部圧力源に接続されてもかまわないし、例えば側面の隔壁を駆動する房室はまとめて１本の送圧路に接続され、頂面及び底面の隔壁を駆動する房室はまとめて１本の送圧路に接続される、というようにグループ化して複数の面の側壁を駆動する房室が１本の送圧路に接続されてもかまわない。さらに、複数の微小憩室の特定の面の隔壁を駆動する房室が１本の送圧路に接続されてもかまわない。
　前記房室内の圧力は、当業者に周知のいかなる手段によって上昇させてもかまわない。前記房室内は、気体及び液体を含むいかなる流体によって与圧されてもかまわない。前記房室は送圧路を介して外部圧力源に接続されることが好ましいが、前記房室内に設けられたアクチュエータによって圧力を上昇させてもかまわない。前記外部圧力源は、シリンジポンプ及び高圧ガスボンベを含むが、これらに限定されない。
　前記微小憩室及び房室は、両者を隔てる前記弾性隔壁が弾性変形を起こすことによって前記微小憩室内の流体を主流路に向けて押し出すことができることを条件として、いかなる形状及び配置であってもかまわない。以下の実施例で説明される微小憩室及び房室の寸法と、圧力とは、構造体に用いられるポリジメチルシロキサンの組成及び製法との関係で定められる。本発明の原理を知る当業者は、構造体の材料に応じて、前記微小憩室及び房室の寸法と、圧力とを変更させることができる。
　本発明のベシクル生成装置と、構造体と、相分離流体と、空気と、有機溶液と、水性溶液とは、必要に応じて、無菌処理を施したり、生体毒性のない素材及び製造方法で製作又は調製される。
　本発明のベシクル生成装置は、レーザ光を操作したり、ベシクル生成過程を観察するための光学顕微鏡と、主流路を通過する液体を送液するためのポンプ、例えば、シリンジポンプと、流路を切り替えるためのバルブと、本発明の構造体のアクチュエータを駆動又は制御するための電気回路の制御装置と、温度制御装置とを含むが、これらに限られない付属設備を伴う場合がある。
　本発明の構造体は、例えば、光リソグラフィ、エッチング等の従来の微細加工技術を組合せて、犠牲層の除去により立体的な構造とすることができる（ＥＥ　Ｔｅｘｔ　センサ・マイクロマシン工学、藤田博之編著、オーム社（２００５））。代替策として、押印転写法（特願２００７－１０８６７号明細書及びＯｎｏｅ，　Ｈ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ　ａｎｄ　Ｍｉｃｒｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　１７：　１８１８－１８２７　（２００７））を利用する場合がある。また、従来の微細加工技術と前記押印転写法とを組み合わせて立体的な形状を有する構造体を作成することもできる。
　本発明の構造体は、従来の微細加工技術及び／又は前記押印転写法を、単独で、あるいは、組み合わせて作成された立体的な形状を有する鋳型を使って作成される成形品の場合がある。前記成形品は、プラスチック、セラミック及びハイドロゲルと、これらの複合材料とを含むが、これらに限定されない材料を用いて作成される場合がある。
　本発明において「微小憩室が２次元的に配置される」とは、主流路と微小憩室とが単一の平面上に配置されることをいう。例えば、単一のガラス基板上に作成され、主流路を挟んで相対するように複数の微小憩室が配置される場合をいう。
　本発明において「微小憩室が３次元的に配置される」とは、主流路と微小憩室とが配置される平面が２個又は３個以上あることをいう。例えば、微小憩室が主流路の流体の流れる方向軸に回転対称となるように配置される場合をいう。
特許文献１のベシクル生成装置の１つの実施態様の構造体の模式図。 特許文献１のベシクル生成方法の１つの実施態様を示す模式図。 特許文献１のベシクル生成装置の構造体の１つの実施態様における微小憩室の開口付近での有機溶液層の変形の様子を示す部分拡大模式図。 本発明のベシクル生成装置の１つの実施態様の外観写真（ａ）と、本発明のベシクル生成装置の構造体の１つの実施態様の構成の模式図（ｂ）。 本発明のベシクル生成装置の構造体の１つの実施態様における微小憩室及び房室の顕微鏡写真（（ａ－１）及び（ａ－２））と、模式図（（ｂ－１）及び（ｂ－２））と、送気容積と圧力との関係のグラフ（ｃ）と、送圧と弾性隔壁の変形との関係のグラフ（ｄ）。 本発明のベシクル生成装置の構造体の１つの実施態様における微小憩室及び房室の顕微鏡写真（（ａ）、（ｂ）及び（ｃ））と、送圧と生成されたベシクルの容積との関係のグラフ（ｄ）。 本発明のベシクル生成の時間経過を示す顕微鏡写真。
　１、２１、３１　　主流路
　２、２２、３３　　微小憩室
　３　　連通細路
　４、２４、３５　　房室
　５　　圧力発生部
　６　　アルミニウム薄膜
　７　　レーザ光束
　８　　微細気泡
　９　　剪断部
　１０　　張出部
　１１　　副流路
　１２　　第１の水性溶液の表面に配向した両親媒性分子
　１３　　気体の層
　１４　　第２の水性溶液の表面に配向した両親媒性分子
　２３、３４　　隔壁
　２５、３６　　送圧路
　３２　　連通路
　以下に実施例を示すが、これらは実施態様の例示を意図しており本発明の範囲を限定することは意図しない。
　１．圧力変化によって弾性隔壁が変形する構造体の作製
　本発明の１つの実施態様のベシクル生成装置はマイクロ流体デバイスを含み、該マイクロ流体デバイスは１個又は２個以上の本発明の構造体を含む。前記構造体は、ガラス面にマウントされたポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）でできており、主流路と、該主流路に開口する複数の微小憩室とを含む微細構造が微細加工により設けられる。前記マイクロ流体デバイスには、ポンプ及び流路スイッチが連結され、外部供給源から前記主流路に流す液体および／または気体の種類と、流速及び／又は圧力と、均一流か、脈流その他の不均一流かのような流し方とを自由に設定することができる。
　図４は、本発明のベシクル生成装置の１つの実施態様の外観写真（ａ）と、本発明のベシクル生成装置の構造体の１つの実施態様の構成の模式図（ｂ）とを示す。図４を参照して、前記ベシクル生成装置には、外部供給源から、ポンプ及び流路スイッチを介して水性溶液、有機溶液および／または気体を前記主流路に流して、構造体の全ての微小憩室に導入するためのチュービングと、主流路からドレンに排出するためのチュービングと、外部圧力源からの高圧気体を送圧路経由で房室に送るためのチュービングとが接続される（図４（ａ））。図４（ｂ）は本発明の１つの実施態様のベシクル生成装置の構造体の模式図である。主流路２１に面して微小憩室２２が開口し、微小憩室２２は弾性隔壁２３を介して房室２４と隣接する。房室２４から送圧路２５が伸びて、前記外部圧力源に接続される。弾性隔壁２３は、微小憩室２２と房室２４との間を気密及び液密に封止し、かつ、前記外部圧力源からの気体で房室２４内の圧力が上昇すると、微小憩室２２に向けて突出するように弾性変形を起こす。弾性隔壁２３は、房室２４の圧力上昇により微小憩室２２内の流体を主流路に向けて押し出す。本発明の１つの実施態様では、微小憩室２２の奥行きは６０μｍ、微小憩室２２と房室２４を隔てる弾性隔壁２３の幅は１００μｍである。
　図５（ａ－１）及び（ａ－２）は、本発明のベシクル生成装置の構造体の１つの実施態様における微小憩室及び房室の顕微鏡写真である。破線は、主流路３１からの連通路３２と、微小憩室３３との輪郭を示す。図５（ａ－１）に示すとおり、弾性隔壁３４の厚さ、すなわち、微小憩室３３と房室３５との距離は３０μｍである。図５（ｂ－１）は、図５（ａ－１）に示すＡ－Ａ’直線を含み、図５（ａ－１）の面に垂直な断面の模式図である。図５（ｂ－１）に示すとおり、微小憩室３３、弾性隔壁３４及び房室３５の高さは１００μｍで、主流路３１の高さは１５μｍで、主流路３１と微小憩室３３との連絡路３２は、高さは主流路３１と同じ１５μｍであるが、幅は、微小憩室３３への開口部の幅１００μｍより主流路３１への開口部の幅が狭いオリフィス状である。図５（ａ－２）及び（ｂ－２）は、それぞれ、房室３５の圧力を上昇させることにより、弾性隔壁３４が微小憩室３３に向けて突出するように弾性変形を起こしている様子を示す顕微鏡写真及び断面模式図である。本実施例では、主流路３１と、連絡路３２との高さは１５μｍで、微小憩室３３及び房室３５の高さ１００μｍに比べて低いため、房室３５内の圧力変化が、連絡路３２では大きく増幅される。
　図５（ｃ）は、送気容積と圧力との関係のグラフである。グラフの縦軸は房室内の圧力（ｋＰａ）で、横軸は送気容積（ｍＬ）である。本実施例のベシクル生成装置には、４２個の微小憩室及び房室が設けられ、前記装置内の全体積は、３６０ｎＬであった。また、前記圧力は、シリンジで空気を送り込む際、該シリンジと、前記装置との間に圧力センサを挟んで測定された。図５（ｃ）から明らかなとおり、圧力源として空気を０．５ないし２．５ｍＬ送り込むだけで、房室内の圧力を１５ないし１１０ｋＰａまで上昇させることができる。また、図５（ｄ）は房室内の圧力と弾性隔壁の変形との関係のグラフである。グラフの縦軸は、加圧によって前記弾性隔壁が変形して前記微小憩室に突出した先端が、加圧前と比較した変位（単位μｍ）を表し、横軸は房室内の圧力（ｋＰａ）である。図５（ｃ）及び（ｄ）から、本実施例のベシクル生成装置では、１．０ｍＬから２．５ｍＬの空気を送り込むことによって、前記微小憩室の奥行き６０μｍに対して、１０μｍから３０μｍまで前記弾性隔壁を変形させることができた。
　２．ベシクルの生成
　実施例１に説明した本発明の１つの実施態様のベシクル生成装置において、微小憩室に加える圧力と、主流路を流れる第２の水性溶液の流速とを調整することにより、ベシクルの体積を制御することができた。第１の水性溶液にカルセインが添加された。有機溶液として、両親媒性分子ジフィタノールフォスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）を１０ｍｇ／ｍＬ含むヘキサデカンが用いられた。第２の水性溶液には、０．０５体積％のブロックコポリマー界面活性剤ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ８８（商標、ＢＡＳＦ）が添加された。図６（ａ）は、主流路に流された第１の水性溶液が微小憩室を満たした状態を示す顕微鏡写真である。図６（ｂ）は、第１の水性溶液に続いて主流路に流された有機溶液が、主流路から微小憩室への連絡路を満たした状態を示す顕微鏡写真である。破線は、主流路からの連通路と、微小憩室との輪郭を示す。図６（ｃ）は、前記有機溶液に続いて主流路に流された第２の水性溶液が主流路を満たして、前記有機溶液は前記連絡路内にあって、第１及び第２の水性溶液に挟まれた層をなしている状態を示す顕微鏡写真である。図６（ａ）ないし（ｃ）のそれぞれの横には、第１及び第２の水性溶液と、前記有機溶液とを「ｗａｔｅｒ」と、「ｏｉｌ」とで表し、主流路の流れの向きを矢印で示した模式図を示す。図６（ｄ）は、送圧と、房室より押し出された液体の容積との関係のグラフである。該グラフの横軸は房室内の圧力（ｋＰａ）を表し、縦軸は房室より押し出された液体の容積（μＬ）を表す。前記容積は、液体を押し出し、シリンジを戻した際に微小憩室に逆流した水量を、顕微鏡下で観察される流入した液体の面積と微小憩室の高さとの積で近似して算出された。図６（ｄ）に示すとおり、約１５ないし４８ｋＰａの圧力を房室に加えることによって、約１．５ないし６μＬの容積を前記微小憩室から前記主流路へ押し出すことができる。すなわち、本実施例では、ｍＬオーダーの空気の注入操作という比較的安価に実現可能な圧力発生手段によって、細胞とほぼ同じ大きさの多数のベシクルを生成することができた。
　図７は本発明のベシクル生成の時間経過を示す顕微鏡写真である。ここではベシクルを可視化するために第１の水性溶液にカルセインが添加された。図７（ａ）ないし（ｄ）の各コマの時間経過ｔが秒単位で表される。図７（ａ）の破線は、主流路からの連通路と、微小憩室との輪郭を示す。本実施例のベシクル生成装置では、約１．６秒で１個のベシクルが生成された。

Claims (20)

  1. 　主流路と、該主流路に開口する複数の微小憩室と、変形可能な隔壁を介して前記微小憩室に隣接する房室とを含む構造体を複数含むことを特徴とする、両親媒性分子による二分子膜ベシクルの生成装置。
  2. 　前記変形可能な隔壁は弾性隔壁であることを特徴とする、請求項１に記載の二分子膜ベシクルの生成装置。
  3. 　前記変形可能な隔壁は変位可能な隔壁であることを特徴とする、請求項１に記載の二分子膜ベシクルの生成装置。
  4. 　前記構造体は剪断手段を含むことを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか１つに記載の二分子膜ベシクルの生成装置。
  5. 　前記微小憩室の壁面には相分離流体リザーバーが設けられ、該相分離流体リザーバーは相分離流体の層を懸架し、該相分離流体の層は、前記主流路と前記微小憩室との間を封止することを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか１つに記載の二分子膜ベシクルの生成装置。
  6. 　前記微小憩室の壁面には複数の相分離流体リザーバーが設けられ、該複数の相分離流体リザーバーは複数の相分離流体の層を懸架し、該複数の相分離流体の層は前記主流路と前記微小憩室との間を封止することを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか１つに記載の二分子膜ベシクルの生成装置。
  7. 　前記相分離流体リザーバーは前記微小憩室の側壁面から該微小憩室内に伸びる張出部であることを特徴とする、請求項５又は６に記載の二分子膜ベシクルの生成装置。
  8. 　前記房室には圧力発生部が設けられることを特徴とする、請求項１ないし７のいずれか１つに記載の二分子膜ベシクルの生成装置。
  9. 　前記房室は外部圧力源に接続されることを特徴とする、請求項１ないし７のいずれか１つに記載の二分子膜ベシクルの生成装置。
  10. 　前記主流路を通過する流体は１つの向きに流れ、前記剪断手段は前記微小憩室の開口の下流側に設けられることを特徴とする、請求項２ないし９のいずれか１つに記載の二分子膜ベシクルの生成装置。
  11. 　前記主流路を通過する流体は順逆２つの向きに流れ、前記剪断手段は前記２つの向きの流れのそれぞれの下流側に設けられることを特徴とする、請求項２ないし９のいずれか１つに記載の二分子膜ベシクルの生成装置。
  12. 　前記構造体は１個又は２個以上の水性溶液の流路を含み、該水性溶液の流路は、前記複数の相分離流体リザーバーのうち少なくとも２個の間に設けられた前記微小憩室の壁面の開口と、前記複数の水性溶液のそれぞれの外部供給源とを連絡することを特徴とする、請求項４ないし１１のいずれか１つに記載の二分子膜ベシクルの生成装置。
  13. 　前記構造体は副流路を含み、該副流路は相分離流体の外部供給源に接続され、該相分離流体は前記副流路を介して前記相分離流体リザーバーに供給されることを特徴とする、請求項３ないし１２のいずれか１つに記載の二分子膜ベシクルの生成装置。
  14. 　前記微小憩室は２次元的に配置されることを特徴とする、請求項１ないし１３のいずれか１つに記載の二分子膜ベシクルの生成装置。
  15. 　前記微小憩室は３次元的に配置されることを特徴とする、請求項１ないし１３のいずれか１つに記載の二分子膜ベシクルの生成装置。
  16. 　前記相分離流体の層は水性溶液との間で界面を形成することを特徴とする、請求項３ないし１５のいずれか１つに記載の二分子膜ベシクルの生成装置。
  17. 　前記相分離流体は両親媒性分子を含む有機溶液であることを特徴とする、請求項３ないし１６のいずれか１つに記載の二分子膜ベシクルの生成装置。
  18. 　前記相分離流体は、気体か、両親媒性分子を含まない有機溶液かであり、前記水性溶液は両親媒性分子を含むことを特徴とする、請求項１６に記載の二分子膜ベシクルの生成装置。
  19. 　前記構造体はポリジメチルシロキサンでできており、前記有機溶液はポリジメチルシロキサンを膨潤変形させることを特徴とする、請求項１ないし１８のいずれか１つに記載の二分子膜ベシクルの生成装置。
  20. 　二分子膜ベシクルの生成方法であって、
    　主流路と、該主流路に開口する複数の微小憩室と、変形可能な隔壁を介して前記微小憩室に房室とを含む構造体と、第１及び第２の水性溶液と、相分離流体とを用意するステップと、
    　前記構造体の主流路に第１の水性溶液を流して、第１の水性溶液を前記微小憩室に導入するステップと、
    　前記構造体の主流路に前記相分離流体を流して、該相分離流体を前記微小憩室の少なくとも一部に導入するステップと、
    　前記構造体の主流路に第２の水性溶液を流して、前記主流路内の前記相分離流体を除去し、前記相分離流体が相分離流体層を形成し、該相分離流体層は前記微小憩室の側壁面に懸架されるステップと、
    　前記相分離流体層が前記微小憩室の側壁面に懸架された状態で、前記房室に圧力を加えることにより、前記弾性隔壁が前記微小憩室内に突出するように変形して第１の水性溶液を押し流して、前記相分離流体層の先端が前記微小憩室の開口から前記主流路に入るように前記相分離流体層を伸張させるステップと、
    　前記主流路内の第２の水性溶液の液流が前記相分離流体層を剪断することによって、前記相分離流体層と、該相分離流体層に包囲された第１の水性溶液とが括れてベシクルとして切断されるステップとを含むことを特徴とする、二分子膜ベシクルの生成方法。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003084001A (ja) * 2001-09-14 2003-03-19 Kawamura Inst Of Chem Res 微小バルブ機構を有するマイクロ流体デバイス、マイクロ流体デバイスの微小バルブ機構駆動装置、及び流量調節方法
JP2004351417A (ja) * 2001-02-23 2004-12-16 Japan Science & Technology Agency エマルションの製造装置
JP2006272196A (ja) * 2005-03-29 2006-10-12 Toshiba Corp 複合型微粒子の製造方法及び複合型微粒子の製造装置
JP2006281071A (ja) * 2005-03-31 2006-10-19 Ube Ind Ltd マイクロデバイス
JP2007187470A (ja) * 2006-01-11 2007-07-26 Ricoh Co Ltd 微小流路構造体およびそれを用いた乳化方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004351417A (ja) * 2001-02-23 2004-12-16 Japan Science & Technology Agency エマルションの製造装置
JP2003084001A (ja) * 2001-09-14 2003-03-19 Kawamura Inst Of Chem Res 微小バルブ機構を有するマイクロ流体デバイス、マイクロ流体デバイスの微小バルブ機構駆動装置、及び流量調節方法
JP2006272196A (ja) * 2005-03-29 2006-10-12 Toshiba Corp 複合型微粒子の製造方法及び複合型微粒子の製造装置
JP2006281071A (ja) * 2005-03-31 2006-10-19 Ube Ind Ltd マイクロデバイス
JP2007187470A (ja) * 2006-01-11 2007-07-26 Ricoh Co Ltd 微小流路構造体およびそれを用いた乳化方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARC A. UNGER: "Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography", SCIENCE, vol. 288, 7 April 2000 (2000-04-07), pages 113 - 116 *

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