WO2011026206A1 - SEQÜÊNCIA DE ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADA, VETOR DE EXPRESSÃO, COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA SINÉRGICA QUE COMPREENDE UM VETOR DE EXPRESSÃO QUE CODIFICA A PROTEÍNA E7 DO VÍRUS DO PAPILOMA HUMANO (HPV) FUSIONADA À PROTEÍNA gD DO VÍRUS HERPES HUMANO TIPO 1 (HSV-1) E UM VETOR DE EXPRESSÃO QUE CODIFICA UMA CITOCINA E SEUS USOS - Google Patents

SEQÜÊNCIA DE ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADA, VETOR DE EXPRESSÃO, COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA SINÉRGICA QUE COMPREENDE UM VETOR DE EXPRESSÃO QUE CODIFICA A PROTEÍNA E7 DO VÍRUS DO PAPILOMA HUMANO (HPV) FUSIONADA À PROTEÍNA gD DO VÍRUS HERPES HUMANO TIPO 1 (HSV-1) E UM VETOR DE EXPRESSÃO QUE CODIFICA UMA CITOCINA E SEUS USOS Download PDF

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    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Definitions

  • the present invention relates to synergistic immunogenic compositions comprising an expression vector encoding the HSV gD protein fused HPV E7 protein, an expression vector encoding a cytokine and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention also relates to isolated nucleic acid sequences encoding the HSV gD protein fused HPV E7 protein and comprise codons optimized for expression in mammalian cells, preferably human cells.
  • the present invention also relates to expression vectors encoding nucleic acid sequences of the present invention.
  • the present invention also relates to the use of one or more synergistic immunogenic compositions of the present invention in the manufacture of a vaccine for the prevention and / or treatment of papillomavirus-induced tumors in animals or humans.
  • the present invention also relates to vaccines comprising one or more synergistic immunogenic compositions of the present invention.
  • the present invention further relates to methods for preventing or treating papillomavirus-induced tumors comprising administering one or more synergistic immunogenic compositions of the present invention to animals or humans in need thereof.
  • Cervical cancer is the third leading cause of cancer death in women worldwide causing 200,000 deaths per year (PISANI P. PARKIN DM, BRAY F. AND FERLAY J. (1999). cancers in 1990. Int. J. Cancer 83: 18-29).
  • Epidemiological data show a clear relationship between human papilloma virus (HPV) infection and the development of cervical cancer, and the HPV genome can be detected in more than 99% of cases of this cancer. More than 100 types of HPV have been described, and about 20 have shown a propensity to infect anogenital tract tissues. Some types of HPV cause benign warts and lesions and are rarely found in invasive carcinomas, being called low-risk genotypes such as HPV-6 and HPV-11.
  • HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, and HPV-45 genotypes are often found in cervical tumor tissues and are called high-risk genotypes (WALBOOMERS, JM, JACOBS MV, MANOS MM).
  • WALBOOMERS JM, JACOBS MV, MANOS MM.
  • E6 and E7 proteins from high-risk genotypes are able to degrade p53 and inactivate pRb, cell cycle regulatory proteins, interfering with cell growth and multiplication (HOWLEY PM (1991) Role of the human papillomaviruses in human cancer. Cancer Res. 51: 5019s- 5022s).
  • HPV-16 is found in 50% to 60% of cervical cancer cases and can be considered the main etiological agent of the disease (BOSCH FX, MANOS MM, MUNOZ N., SHERMAN M., JANSEN AM, PETO J., SCHIFFMAN MH, MORENO V., KURMAN R., SHAH KV (1995) Prevalence of human papillomavirus in cervical cancer: a worldwide perspective.International biological study on cervical cancer (IBSCC) Study Group J Natl Cancer Inst. 87 (11): 796-802).
  • Therapeutic cancer vaccines appear as an alternative to surgical and radiotherapeutic processes.
  • Several groups have described the development of vaccines that target HPV-16-induced cancer cells. Antigen-specific immunotherapy studies show that HPV-induced tumors can be controlled and sometimes eliminated by response-mediated activation. T cells specific for E7 and E6 proteins (LING M., KANAYAMA M., RODEN R., et al. (2000). Preventive and therapeutic vaccines for human papillomavirus-associated cervical cancers. J Biomed Sci. 7 (5): 341 -356).
  • HPV-16 DNA vaccines that use the oncoprotein E7 gene in its native form induce low levels of CD8 + T cell activation and therefore do not protect animals against challenge using HPV-16 transformed cells (HUNG CF, MONIE A ., ALVAREZ RD, et al. (2007) DNA vaccines for cervical cancer: from bench to bedside Exp. Mol. Med. 39: 679-689 .; KANODIA S., DA SILVA DM, KAST WM (2008) Recent advances in strategies for immunotherapy of human papillomavirus-induced lesions Int J Cancer 15; 122 (2): 247-59).
  • DNA vaccines capable of expressing HPV-16 oncoproteins E6 and E7 on the cell surface of transfected cells have recently been developed (LASARO, M. 0., DINIZ, M. 0., ARTURO, R., ERTL, H. C, FERREIRA, LCS, (2005) Anti-tumor DNA vaccines based on the expression of human papillomavirus-16 E6 / E7 genetically fused with the glycoprotein D from herpes simplex virus-1. Microbes and Infection 7: 1541-1550).
  • oncoproteins E6 and E7 were genetically fused to herpes simplex virus type 1 (HSV-1) glycoprotein D (gD).
  • HSV-1 herpes simplex virus type 1
  • gD glycoprotein D
  • the E7 protein was inserted into permissible sites near the C-terminal end of the herpes simplex virus type-1 (HSV-1) gD protein and its cloned vector gene suitable for expression in eukaryotic cells. This vector was named pgDE7.
  • patent application O2008027394 which describes chimeric gD protein constructs and HPV-16 oncoproteins E5, E6 and E7 was either published in the form of DNA vaccine or viral vectors.
  • GD-fused E7 constructs enhance immune responses against E7 protein, particularly CD8 + T lymphocyte mediated responses, and prophylactic protection to tumors expressing E7 protein.
  • the strategy of cloning heterologous sequences in the gene encoding the gD protein used in this study was the same as that previously described by LASARO et al. 2005 (LASARO, MO, DINIZ, MO, ARTURO, R., ERTL, H.
  • HSV-1 gD protein is an exposed surface protein anchored to the membrane of infected cells through a small sequence located near the C-terminal region.
  • HPV-16 oncoproteins would be expressed in the extracellular medium, drastically reducing the oncogenic risks of transfected cells.
  • the gD protein has the ability to increase the immunogenicity of E7, and other fused proteins, by competing with the BTLA (B and T lymphocyte attenuator) receptor for the Herpes virus entry receptor (HVEM) interaction site. mediator), reducing the co-inhibitory effects of BTLA on T and B lymphocytes (LASARO MO, TATSIS., HENSLEY SE, WHITBECK JC, LIN SW, RUX JJ, COHEREN GH, EISENBERG RJ, ERTL HC (2008) Targeting of antigen to the herpesvirus entry mediator augments primary adaptive immune responses Nat Med. 14 (2): 205-12).
  • BTLA B and T lymphocyte attenuator
  • HVEM Herpes virus entry receptor
  • the vector expressing the gD-fused E7 protein under four-dose vaccine regimen, promoted the activation of E7-specific CD8 + T cells and preventively protected all animals prophylactically challenged with tumor cells.
  • administration of the vaccine to animals that already contained tumor cells was able to regress tumors in 40% of the animals and slow the evolution of tumors in unprotected animals (LASARO, M. 0., DINIZ, MO, ARTURO, R., ERTL, H. C, FERREIRA, LCS, (2005) Anti-tumor DNA vaccines based on the expression of human papillomavirus-16 E6 / E7 oncoproteins genetically fused with the glycoprotein D from herpes simplex virus-1. Microbes and Infection 7: 1541-1550).
  • HSV-1 glycoprotein D fused HPV-16 proteins E5, E6, and E7 was also described in patent application WO / 2008/027394. Published data involving this construct demonstrate that one dose of the vaccine generates complete prophylactic protection for tumor formation (LASARO MO, TATSIS N., HENSLEY SE, HITBECK JC, LIN SW, RUX JJ, WHERRY EJ, COHEN GH, EISENBERG RJ, ERTL HC (2008) Targeting of antigen to herpesvirus entry mediator augments primary adaptive immune responses Nat Med. 14 (2): 205-12).
  • the vaccine only partially protects the tumor cell challenge in a therapeutic treatment regimen by keeping 70% of mice free of tumors following a 3-dose vaccination regimen (DINIZ, MO, LASARO, MO, ERTL, HC, FERREIRA, LCS (2010) Immune responses and therapeutic anti-tumor effects of an experimental DNA vaccine encoding the human papillomavirus type-16 (HPV-16) oncoproteins genetically fused to the herpes virus glycoprotein D. (gD) Clinical and Vaccine Immunology, Ahead of print ).
  • pgDE7 and pgDE7E6E5 vaccine plasmids demonstrate anti-tumor therapeutic effect but are not effective in eradicating tumor cells in 100% of the tested animals.
  • cytokines related to T cell activation or proliferation can be used, such as IL-2 (interleukin-2), IL-12. (interleukin-12) and GM-CSF (Granulocyte and macrophage colony stimulating factor). Plasmids encoding these cytokines are potent adjuvants capable of enhancing the humoral and cytotoxic immune response in animal models (BAROUCH, DH, A. CRAIU, J. KURODA, JE SCHMITZ, XX ZHENG, S., SANTRA, JD FROST, GR KRIVULKA, MA LIFTON, CL CRABBS , G.
  • HEIDECKER (2007) Induction of specific immune responses by severe acute respiratory syndrome coronavirus spike DNA vaccine with or without interleukin-2 immunization using different vaccination routes in mice Clinical and vaccine immunol 14: 894-901; BL CHIANG, YL LEE, WK CHI, WC LIN, YT CHEN, and MH TAO. (1998) Development of Thl and Th2 populations and the nature of immune responses to hepatitis B virus DNA vaccines can be modulated by codelivery of various cytokine genes. J. Immunol 160: 1320-1329).
  • interleukin-2 is a potent cytokine produced by activated T cells, capable of activating multiple compartments of the immune system and acting on clonal T cell proliferation (WALDMANN TA (2006) The biology of interleukin-2 and interleukin-15: implications for cancer therapy and vaccine design (Nat Rev Immunol. 6: 595-601).
  • IL-2 is one of the most widely used systemic adjuvants for peptide-based vaccines. Its clinical use has been approved by the FDA for the treatment of metastatic kidney cancer and malignant melanoma and is capable of inducing clinical responses in 15% of patients with these cancers (ROSENBERG SA, YANG JC, TOPALIAN SL, SCHWARTZENTRUBER DJ, WEBER JS, PARKINSON DR, et al (1994) Treatment of 283 consecutive patients with metastatic melanoma or renal cell cancer using high-dose bolus interleukin 2. JAMA 271 (12): 907-13).
  • Bovine interleukins 2 and 4 expressed in recombinant bovine herpesvirus 1 are biologically active secreted glycoproteins. J. Gene Virol. 77: 2231-2240), hepatitis C virus (GEISSLER, M., A. GESIEN, K. TOKUSHIGE, AND JR ANDS. (1997). Enhancement of cellular and humoral immune responses to hepatitis C core protein virus using DNA-based vaccines augmented with cytokine-expressing plasmids J.
  • IL-2 has also been used to increase the HSV-1 glycoprotein D (gD) immune response used as an antigen in DNA vaccines (LI WR, NIU B, ANG JW, FENG ZJ, WANG DX. (2006) Coexpression of interleukin-2 enhancements to the immunization effect of a DNA vaccine expressing herpes simplex 1 glycoprotein D. Acta Virol. 50: 251-6).
  • gD HSV-1 glycoprotein D
  • Cytokine IL-12 also has a history of application in the treatment of tumors. Cytokine IL-12 has shown marked anti-tumor and anti-metastatic activity in numerous animal models (MAZZOLINI G, PRIETO J, MELERO I. (2003) Gene therapy of cancer with interleukin-12. Curr. Pharm. Des. 9 ( 24): 1981-91; RIEZEBOS-BRILMAN A, REGTSA J, CHEN M, WILSCHUTA J, DAEMENA T. (2009) Vaccine 27: 701-707). IL-12's ability to induce antigen-specific immune response is mainly related to its ability to polarize antigen-specific responses.
  • Interleukin 12 induces stable priming for interferon gamma (IFN- gamma) production during differentiation of human T helper (Th) cells and transient IFN-gamma production in established Th2 cell clones J. Exp. Med. 179: 1273-1283; TSUNG K, MEKO JB, PEPLINSKI GR, TSUNG YL, NORTON J.A. (1997) IL-12 induces T helper-directed antitumor response (J. Immunol. 158: 3359-3365).
  • IFN- gamma interferon gamma
  • Th human T helper
  • IL-12 also promotes maturation of cytotoxic and NK T cells and acts as a secondary signal to the antigen in increasing the population of effector and memory CD8 + T cells (WATFORD WT, MORIGUCHI M, MORINOBU A, O 'SHEA J J (2003) The biology of IL-12: coordinating innate and adaptive immune responses Cytokine Growth Factor Rev. 14: 361-368) (CURTSINGER JM, JOHNSON CM, MESCHER M F. (2003) CD8 T clonal cell expansion and development of eVector function require prolonged exposure to antigen, costimulation, and signal cytokine J.
  • IL-12 is also able to facilitate antigen presentation by increasing expression of MHC class I and II molecules associated with IL-12's ability to promote IFN- ⁇ expression (WEISS JM, SUBLESKI JJ, WIGGINTON JM , WILTROUT R H. (2007) Expert Opin. Biol. Ther. 7; 1705-1721.)
  • GM-CSF is able to initiate proliferation, differentiation and activation of macrophages, neutrophils and various antigen presenting cells (APCs), important activity in the therapeutic control of different tumors (AKIMOTO H, ABE J, TSUNODA R, AOYAGI M, HIRAKA AK , HAMADA H.
  • GM-CSF When used in combination with DNA or protein vaccines, GM-CSF enhances antigen presentation by attracting dendritic cells to the vaccination site (TOUBAJI A, HILL S, TERABE M, QIAN J, FLOYD T, SIMPSON MR, BERZOFSKY JA, KHLEIF S. N. (2007) Vaccine 25: 5882-5891).
  • Murine model assays demonstrate that GM-CSF induces specific T cell responses (AHLERS JD, DUNLOP N, ALLING D, NARA PL, BERZOFSKY J A.
  • Cytokine-adjuvant steering of the immune response to HIV-1 vaccine constructs granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and TNF-alpha synergize with IL-12 to enhance induction of cytotoxic T lymphocytes (J. Immunol. 158: 3947-3958).
  • GM-CSF is used in clinical trials as an adjuvant in peptide-based vaccines (WEBER J, SONDAK VK, SCOTLAND R, PHILLIP R, WANG F, RUBIO TB, GROSHEN SG, GEE C, JEFFERY GG, SIAN S, LEE P. P.
  • MAGE-A1-, MAGE-A10- , and gplOO-derived peptides are immunogenic when combined with granulocyte macrophage colony-stimulating factor and montanide ISA-51 adjuvant and administered as part of a multipeptide vaccine for melanoma (J. Immunol. 174: 3080-3086) and for treatments of various types. of tumors (SPITLER LE, GROSSBARD ML, ERNSTOFF MS, SILVER G, JACOBS M, HAYES FA, SOONG S J. (2000) Adjuvant therapy of stage III and IV ma lignant melanoma using granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. J. Clin. Oncol.
  • DNA vaccines Several clinical studies using DNA vaccines have failed to reproduce the immunological effects found in mice or even non-human primates. Although such assays demonstrate the safety of DNA vaccines, it has become apparent that modifications must be made to the formulations to increase immune responses in humans.
  • One way to increase the immunogenicity of DNA vaccines involves the use of various adjuvants. Some of these adjuvants aim to improve the expression efficiency of coded antigens, either by methods that promote greater cell transfection efficiency or by optimizing expression through changes in target gene codons (KUTZLER MA AND WEINER D. (2008) DNA vaccines: ready for prime time (Nat See Genet. 9 (10): 776-88). In this latter approach the nucleotide sequences of the target genes are modified so that, during translation in the transfected cells, the most abundant types of carrier RNA for a given amino acid are employed resulting in increased antigen production and hence induction of higher specific immune responses.
  • An important procedure to ensure the safety of human papillomavirus control vaccines is the modification of amino acids critical for the cancerous action of the E6 and particularly E7 oncoproteins.
  • Such a procedure involves the modification of amino acids in the region between amino acids 19 to 26 of the E7 protein, whose residues lead to inactivation of pRB protein in epithelial cells with consequent loss of control of cell division and uncontrolled growth characteristic of papillomavirus associated neoplasms.
  • the present invention aims to provide synergistic immunogenic compositions comprising an expression vector encoding the HSV gD protein fused HPV E7 protein, an expression vector encoding a cytokine and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention aims to provide synergistic immunogenic compositions comprising an expression vector encoding the HSV gD protein fused HPV E7 protein, an expression vector encoding a cytokine and a pharmaceutically acceptable carrier wherein the HPV is HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33 or HPV-45, HSV is HSV-1 or HSV-2, cytokine is IL-2, IL-12 or GM-CSF and the pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is PLGA saline, liposomes, lipid emulsions and / or microparticles.
  • nucleic acid sequences encoding the HSV gD protein fused HPV E7 protein comprise codons optimized for expression in mammalian cells, preferably human cells in which the sequence is further mutated. prevent the interaction of HPV E7 protein with cellular protein Rb and where HPV is HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, or HPV-45, HSV is HSV-1 or HSV-2.
  • Another object of the present invention is methods of preventing or treating papillomavirus tumors comprising administering one or more synergistic immunogenic compositions of the present invention to animals or humans in need thereof.
  • Figure 1 schematically shows the plasmid vectors used in the Examples of the present invention.
  • Figure IA depicts the pgDE7 vector encoding the genetically fused HPV-16 E7 protein to the HSV-1 gD protein and contains an ampicillin resistance gene and Rous sarcoma virus-derived promoter for vaccine antigen expression.
  • 1B is the pIL-2 vector encoding murine IL-2 cytokine.
  • Figure 1C is represented the vector pVaxgDE7 which 1 encodes the genetically fused HPV-16 E7 protein to the HSV-1 gD protein and contains the kanamycin resistance gene and cytomegalovirus-derived promoter for vaccine antigen expression.
  • Figure 1D shows the pgDE7h vector that has kanamycin resistance gene and encodes the genetically fused HPV-16 E7 protein to the HSV-1 gD protein and whose gene sequence has codons optimized for the expression system in human cells.
  • Figure 2 shows the therapeutic protection assay of C57BL / 6 mice challenged with TC-1 tumor cells and immunized with a dose of each of the pgD, pIL-2 and pgDE7 vectors alone, or three doses of the pgDE7 vector, or one, two or three doses of immunogenic composition 1 (pgDE7 + pIL-2) (Protective effect).
  • Figure 3 shows a therapeutic protection assay of C57BL / 6 mice challenged with TC-1 tumor cells and immunized with a 100 ⁇ g dose of the pIL-2 vector or a dose of the immunogenic composition 1 (pgDE7 + pIL-2) administered. at concentrations of 100 g, 50 ⁇ g, 25pg or 10 ⁇ g DNA / 100 ⁇ ⁇ ⁇ (Protective effect).
  • Figure 4 shows a therapeutic protection assay of C57BL / 6 mice challenged with TC-1 tumor cells and immunized with either a 100pg dose of the pIL-2 vector or a dose of immunogenic composition 1 (pgDE7 + pIL-2) administered at the concentration. 50 ⁇ g DNA / ⁇ ⁇ ⁇ administered on the same day (day 0), 3, 7, 10 or 14 days after challenge (Protective effect).
  • Figure 5 shows tumor growth in C57BL / 6 mice challenged with TC-1 tumor cells and immunized with a dose of each of the pIL-2 and pDE7 vectors alone or with a dose of the immunogenic composition 1 (pgDE7 + pIL-2).
  • Figure 6 shows a therapeutic protection trial. 1 of C57BL / 6 mice challenged with TC-1 tumor cells and immunized with a dose of each of the pIL-2 and pVaxgDE7 vectors alone or with a dose of immunogenic composition 2 (pVaxgDE7 + pIL-2) at 50pg DNA concentration / 100 ⁇ , / dose administered 3 days after challenge (Protective effect).
  • Figure 7 shows a therapeutic protection assay of C57BL / 6 mice challenged with TC-1 tumor cells and immunized with a dose of pIL-2, pgDE7 or pgDE7h vectors (alone at 50 ⁇ g DNA / 100 L / dose administered 3). days after challenge (Protective effect).
  • Figure 8 shows the minimum amount of pgDE7h vector required for maximal anti-tumor therapeutic efficacy of immunogenic composition 3 (pgDE7h + pIL-2).
  • a therapeutic protection assay of C57BL / 6 mice challenged with TC-1 tumor cells and immunized with either a dose of either pIL-2 and pgDE7h alone or a dose of immunogenic composition 3 (pgDE7h + pIL-2) is shown.
  • various DNA / dose concentrations administered 3 days after challenge is shown.
  • Animals were immunized with a dose of 50pg DNA / 100 L / dose pIL-2 vector, or pgDE7h vector, or immunogenic composition 3 (pgDE7h + pIL-2) and 25 ⁇ g DNA / 100 L / dose pgDE7h vector or immunogenic composition 3 (pgDE7h + pIL-2) (Fig. 8A), or a dose of 10vq DNA / 100 L / dose of pgDE7h vector or immunogenic composition 3 (pgDE7h + pIL-2) or a dose 5 g DNA / 100 L / dose of the pgDE7h vector or immunogenic composition 3 (pgDE7h + pIL-2) (Fig. 8B).
  • the present invention provides synergistic immunogenic compositions for prevention and treatment of papillomavirus tumors in animals and humans.
  • the synergistic immunogenic compositions of the present invention comprise an expression vector encoding the HSV gD protein fused HPV E7 protein, a cytokine encoding expression vector, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the expression vector encoding the HPV E7 protein fused to the HSV gD protein encodes an HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33 or HPV-45 E7 sequence. Even more preferably, the E7 sequence is from HPV-16.
  • the expression vector encoding the HPV E7 protein fused to the HSV gD protein encodes an HSV-1 or HSV-2 gD sequence. Even more preferably, the gD sequence is from HSV-1.
  • the expression vector encoding the HSV gD protein fused HPV E7 protein encodes a nucleic acid sequence whose codons are optimized for expression in mammalian cells. Even more preferably codons are optimized for expression in human cells.
  • the expression vector encoding the HPV gD protein fused to the HSV gD protein encodes a nucleic acid sequence whose codons are optimized for expression in mammalian or human cells and whose sequence is mutated to prevent interaction of the E7 protein. of HPV with cellular protein Rb.
  • sequence is mutated at positions 24 and 26 of E7.
  • E7 positions 24 and 26 are mutated to a glycine.
  • the E7 protein coding sequence could be readily exchanged for sequences coding for other oncoproteins encoded by another human or animal papillomavirus, such as the E5, E6 and E2 proteins.
  • the expression vector encoding a cytokine encodes IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 or GM-CSF as well as other cytokines that may act synergistically on the antitumor effects of the composition. immunogenic.
  • the expression vector encoding a cytokine encodes IL-2.
  • the cytokine IL-2 may be human or other mammalian species.
  • the immunogenic compositions of the present invention may comprise purified proteins derived from the sequences encoded by the expression vectors encoding the HSV gD protein fused HPV protein and the cytokine encoding expression vector of interest as described in the present invention. .
  • synergistic immunogenic compositions of the present invention are prepared using good laboratory practices and good manufacturing practices, free from endotoxins and suitable for use in preclinical and / or clinical testing.
  • the synergistic immunogenic compositions of the present invention may be prepared using various pharmaceutically acceptable carriers.
  • the term "pharmaceutically acceptable” means a non-toxic, inert solid, semi-solid liquid excipient, diluent, auxiliary formulation of any kind, or simply a sterile aqueous medium such as saline.
  • Examples of materials that may serve as pharmaceutically acceptable carriers are sugars such as lactose, glucose and sucrose, starches such as cornstarch and potato starch, cellulose and derivatives thereof such as sodium carboxymethylcellulose, ethyl cellulose and cellulose acetate, cyclodextrin; oils such as peanut oil, cottonseed oil, sunflower oil, sesame oil, olive oil, corn and soybean oil; glycols such as propylene glycol, polyols such as glycerin glycol, sorbitol, mannitol and polyethylene; esters such as ethyl laurate, ethyl oleate, agar; buffering agents such as aluminum hydroxide and magnesium hydroxide; alginic acid; pyrogen free water; isotonic saline, Ringer's solution; ethyl alcohol and phosphate buffer solutions as well as other compatible non-toxic substances used in pharmaceutical formulations.
  • sugars such as lactose, glucose and sucrose, star
  • the carrier is saline.
  • the carrier further comprises sustained or controlled release non-viral delivery systems such as liposomes, lipid emulsions, biodegradable particles consisting of glycolic acid poly lactate (PLGA) and chitosan, as well as the use of other adjuvants directed to increased therapeutic and preventive efficacy of the composition.
  • sustained or controlled release non-viral delivery systems such as liposomes, lipid emulsions, biodegradable particles consisting of glycolic acid poly lactate (PLGA) and chitosan, as well as the use of other adjuvants directed to increased therapeutic and preventive efficacy of the composition.
  • PLGA microspheres composed of lactic and glycolic acid polymers (PLGA) have the potential to act as phagocytic cell transfection mediators such as macrophages and dendritic cells, and protect DNA against biological degradation by endonucleases by increasing the transfection rate.
  • PLGA microspheres are composed of biodegradable and biocompatible material, are harmless, are phagocytized by APCs cells and are already approved by the US FDA for human use.
  • PLGA microspheres have great applicability for DNA vaccine vectorization as they can be designed to release amounts of the plasmid continuously and / or rapidly.
  • the rate of hydrolysis of such polymers depends on: their chemical composition, the proportion of monomers; chain size and particle size and degradation times ranging from 2 weeks to 24 months can be obtained.
  • the combination of pore diffusion and erosion of the polymeric matrix allows to control the release rate of encapsulated DNA or antigen in the microspheres. This property allowed the group to create the single-dose vaccine concept where the formulation composed of microspheres of different size, porosity and polymeric composition released E7 and IL-2 containing plasmids at time intervals that would mimic the booster doses of a single dose. vaccine.
  • Other advantages of using these systems for plasmids E7 and IL-2 are: easy administration; high stability as they are lyophilized and can be reconstituted just prior to administration.
  • Liposomes are aggregates of phospholipids in bilayer structures containing a central aqueous volume surrounded by one or more concentric lamellae, forming unilamellar or multilamellar particles, with diameters of the order of tens of nanometers to tens of microns.
  • liposomes encapsulate part of the aqueous medium in which they are dispersed.
  • the bilayer is capable of accommodating hydrophobic molecules and behaves as a semipermeable membrane with respect to the encapsulated material in the aqueous volume of the vesicles.
  • liposomes can be cationic, anionic or neutral. However, regarding the use of negatively charged biomolecules (such as DNA and some proteins), encapsulation of these molecules into cationic liposomes is more efficient due to the electrostatic liposome-biomolecule interaction.
  • Cationic liposomes are commonly used to carry negative molecules such as DNA and facilitate their input to the cell.
  • Such liposomes may contain only cationic lipid or a mixture with neutral lipids such as La-dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) and cholesterol. Initially stearylamine was used as a cationic lipid, however, the studies did not continue due to its cytotoxicity.
  • DOPE La-dioleoyl phosphatidylethanolamine
  • quaternary ammonium salts such as 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium propane (DOTAP) and dimethyldioctadecyl ammonium bromide
  • DOTAP 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium propane
  • dimethyldioctadecyl ammonium bromide dimethyldioctadecyl ammonium bromide
  • liposome-encapsulated DNA vaccines administered the same route protect the biomolecule from nucleases and proteases and are preferably captured by antigen presenting cells, enhancing the immune response. It is reported that the main pathway of cell entry is endocytosis, and the least usual (only 2%), by fusing the liposome with the cell membrane and releasing its contents directly to the cytosol (TROMBONE APF, SILVA CL, ALMEIDA LP , ROSADA RS, LIMA KM, OLIVER C, JAMUR MC AND RABBIT CASTLE A (2007) .Tissue distribution of DNA-Hsp65 / TDM-loaded PLGA microspheres and uptake by phagocytic cells.
  • DRV Dehydrated-Rehydrated Vesicles
  • compositions of the present invention may be administered by any biologically acceptable method, i.e. any embodiment that can produce effective levels of the active compounds without causing clinically undesirable adverse effects.
  • modes of administration include oral, rectal, sublingual, topical, nasal, transdermal or parenteral routes.
  • parenteral includes subcutaneous, intravenous, epidural, irrigation, intramuscular, release, or infusion pumps. Particularly in this invention the intramuscular route is referred to for administration of the compositions claimed herein.
  • Doses may be applied in amounts ranging from 0.1 pg DNA to 100 pg DNA per dose in the mouse model, and in humans or other mammalian species with doses ranging from 0.1 pg DNA to 5 ⁇ g. mg DNA per dose.
  • the proposed immunogenic composition is based on the combination of two vectors (one encoding cytokine and the other encoding the hybrid protein gD / E7).
  • This novel composition has unexpected and enhanced immunological and anti-tumor properties that provide preventive and therapeutic protection against papillomavirus tumors.
  • the combination of the two vectors revealed unexpected synergistic properties that confer unique antitumor effects to the immunogenic compositions of the present invention that cannot be achieved with formulations based only on vectors expressing the HPV fusion protein to the HSV gD protein already described in the prior art.
  • HSV gD protein fused HPV E7 protein comprising codons optimized for expression in mammalian cells, preferably human cells.
  • the present invention also provides isolated nucleic acid sequences encoding the HSV gD protein fused HPV E7 protein and comprise codons optimized for expression in mammalian cells, preferably human cells.
  • This artificial gene sequence promotes increased immunogenicity of the E7 and gD proteins and represents a fundamental step towards enhancing the preventive and therapeutic efficacy of the immunogenic compositions of the present invention.
  • this sequence may be further mutated to prevent the interaction of the HPV E7 protein with the pRb protein involved in controlling the cell multiplication cycle.
  • Such changes aim to eliminate any residual oncogenic activity of the E7 protein, preventing chimeric protein expression from interfering with the cell cycle of transfected cells and enhancing the safety of the nucleic acid sequence and compositions comprising it.
  • mutations in the E7 protein coding sequence are preferably at the amino acids of positions 24 and 26 of E7. Even more preferably the E7 position 24 cysteine is mutated to a glycine and the E7 position 26 glutamic acid is mutated to a glycine.
  • the isolated nucleic acid sequences encoding the HSV gD protein fused HPV E7 protein and comprising codons optimized for expression in mammalian cells encode HPV-16 E7 protein, HPV-18, HPV-31, HPV-33 and HPV-45. Even more preferably the isolated nucleic acid sequences encode the HPV-16 E7 protein.
  • the isolated nucleic acid sequences encoding the HSV gD protein fused HPV E7 protein and comprising codons optimized for expression in mammalian cells encode HSV-1 or HSV-2 gD. Even more preferably the isolated nucleic acid sequences encode the HSV-1 gD protein.
  • the present invention further provides expression vectors encoding nucleic acid sequences of the present invention.
  • Another aspect of the present invention is the use of one or more synergistic immunogenic compositions of the present invention in the manufacture of a vaccine for the prevention, control or treatment of papillomavirus-induced tumors in animals or humans.
  • a further aspect of the present invention is methods of preventing papillomavirus-induced tumors comprising administering one or more animal or human synergistic immunogenic compositions of the present invention in need thereof.
  • Further aspect of the present invention is methods of controlling or treating papillomavirus-induced tumors comprising administering one or more synergistic immunogenic compositions of the present invention to animals or humans in need thereof.
  • the animals are pets (dogs, cats) or animals of agricultural interest, such as cattle, horses, pigs, goats and sheep.
  • Example 1 Construction of the nucleic acid sequence encoding the HPV-16 E7 protein fused to the HSV-1 gD protein with codons optimized for expression in mammalian cells.
  • NotI (6 first bases) and BglII (6 last bases) restriction enzyme cloning sites were inserted to enable cloning of the sequence into plasmid pUMVC3, marketed by Aldevron, and licensed for clinical trials.
  • the murine interleukin 2 (IL-2) gene was PCR amplified and cloned into the pcDNA3.1 vector (Invitrogen).
  • the pgDE7 vector was constructed by amplifying the E7 protein gene from the entire HPV-16 genome using specific primers designed based on the GeneBank deposited sequence (GI: 9627100) and including sites for the Apal enzyme in the E7 primers.
  • Plasmid pRE4 containing the HSV-1 glycoprotein D gene kindly provided by Dr. G. Cohen of the University of Pennsylvania, was used for the cloning of the gD-fused E7 gene.
  • plasmid pgDE7h SEQ. ID. 2
  • gDE7h SEQ. ID. 1
  • HSV-1 HSV-1 with the codon sequence optimized for expression in mammalian cells, particularly humans, at the N1 and ⁇ coRV sites of plasmid pUMVC3.
  • the electrocompetent cells used for transformation with the pRE4 vector were Escherichia coli JM 110 bacteria. Restriction, binding, agarose gel electrophoresis, DNA fragment purification, and electroporation treatments followed routine laboratory procedures. All plasmids were propagated in Escherichia coli DH5a in LB medium supplemented with ampicillin (100 ⁇ g / mL) or kanamycin (100 ⁇ g / mL) and purified by double cesium chloride density gradient followed by ethanol precipitation and resuspension in sterile water.
  • the DNA content of the samples was determined by spectrophotometer at 260nm and confirmed by visual inspection on ethidium bromide stained 1% agarose gel using DNA fragments of known concentrations (Invitrogen).
  • the plasmids were kept at -20 ° C until the time of use, when the concentration will be adjusted to l ⁇ g / ⁇ L in PBS.
  • pgDE7 pgD gDE7 (carries the HPV-16 E7 gene fused to the HSV-1 gD gene)
  • pVAXgDE7 pVax gDE7 (carries the HPV-16 E7 gene fused to the HSV-1 gD gene)
  • pgDE7h pUMVC3 gDE7h load the synthetic gene encoding the HPV-16 E7 gene fused to the HSV-1 gD gene and has codon sequence optimized for expression in mammalian cells
  • the immunogenic compositions of the present invention were prepared using the plamids described in Table 1 above.
  • compositions with increasing amounts of DNA were prepared.
  • the TC-1 tumor cell line is derived from primary C57B1 / 6 pulmonary epithelial cells transformed with v-Has-ras and the HPV-16 E6 and E7 genes (kindly provided by Dr. TC Wu, Johns Hopkins University , USA).
  • TC-1 cells were cultured in MS medium supplemented with 2mM L-glutamine, 1mM sodium pyruvate, 2mM nonessential amino acids, 10mM HEPES buffer, 50 U / mL penicillin / streptomycin, 10% fetal bovine serum (SFB) and maintained at 37 ° C and 5% CO 2 .
  • MS medium supplemented with 2mM L-glutamine, 1mM sodium pyruvate, 2mM nonessential amino acids, 10mM HEPES buffer, 50 U / mL penicillin / streptomycin, 10% fetal bovine serum (SFB) and maintained at 37 ° C and 5% CO 2 .
  • FFB fetal bovine serum
  • mice were inoculated subcutaneously with TC-1 tumor cells prepared as described in
  • Example 4 at a concentration of 5x10 10 cells / animal. The cells were resuspended in 100 ⁇ of serum free medium and inoculated in a dorsolateral region of the animal. To determine the effect of immunogenic compositions on regression of established tumors, mice were challenged with TC-1 cells and eight hours later the vaccine protocol was initiated.
  • the immunogenic compositions described in Example 3 were administered intramuscularly. Groups of 5-10 animals were vaccinated with the immunogenic compositions or intramuscular DNA vaccines. The doses of each composition (10 ⁇ g to 100 ⁇ g of DNA diluted in 100 L PBS) were inoculated into the anterior tibial muscle of each paw (50 ⁇ per paw).
  • Animals challenged with TC-1 tumor cells were immunized with one dose of each of the pgD, pIL-2 and pgDE7 vectors alone, or three doses of the pgDE7 vector, or one, two or three doses of immunogenic composition 1 (pgDE7 + pIL). -2) administered intramuscularly at a dose concentration of 100 ⁇ g ⁇ / ⁇ , ⁇ .
  • Vaccine protocols began on the same day of the TC-1 tumor cell challenge.
  • the compositions comprising the pgD and pIL-2 vectors alone were not able to keep mice free of tumors.
  • the pgDE7 vector alone generated 70% protection after three doses and no significant protection with one or two doses.
  • immunogenic composition 1 comprising pgDE7 and pIL-2 vectors was able to protect 100% of mice from tumor development by inoculating one, two or three doses of the composition revealing that the combination of both vectors into a single immunogenic formulation has an unexpected synergistic effect (Figure 2).
  • mice challenged with TC-1 tumor cells were immunized with either a 100 ⁇ g dose of pIL-2 vector or a dose of pharmaceutical composition 1 (pgDE7 and pIL-2). administered in the amount of 100pg, 50 ⁇ g, 25 ⁇ or 10pg DNA / 100 ⁇ L / dose.
  • Vaccine regimens began on the same day of the TC-1 tumor cell challenge.
  • the immunogenic pharmaceutical composition comprising the vectors pgDE7 and pIL-2 was able to protect 100% of mice from single dose tumor development by inoculating 100 ⁇ g, 50g and 25pg 100 / 100 ⁇ ] _, / ⁇ 3 ⁇ . Inoculation of 10 ⁇ g of protected 50% of mice from tumor development and the pIL-2 vector alone was unable to keep mice free of tumors (Figure 3).
  • mice challenged with TC-1 tumor cells were immunized with either a 100 g dose of the pIL-2 vector or a dose of immunogenic composition 1 (pgDE7 + pIL-2) administered at a concentration of 50 ⁇ g DNA / 100 ⁇ / dose administered therein. day (day 0) or 3, 7, 10, or 14 days after the challenge.
  • the immunogenic composition comprising the pgDE7 and pIL-2 vectors was able to protect 100% of the single dose mice by inoculating 50 ⁇ g DNA / dose when the vaccine was administered on the same day or up to 3 days after challenge.
  • the pharmaceutical composition was inoculated on days 7, 10 and 14, the protection values obtained were reduced to 60%, 40% and 0% of the treated mice, respectively.
  • the pIL-2 vector alone was not able to confer any anti-tumor protection to the mice ( Figure 4).
  • the immunogenic composition comprising the pgDE7 and pIL-2 vectors protected all mice and no tumor development was observed.
  • the pIL-2 vector alone was not able to keep mice free of tumors. In this case the tumors reached sizes larger than 1 cm in diameter 32 days after challenge. Non-immunized animals reached tumors of the same size approximately after 36 days. While mice immunized with a single dose of the pgDE7 vector developed tumors with an average size of 0.35 cm at the end of the observation period of the experiment (42 days).
  • Animals challenged with TC-1 tumor cells were immunized with a dose of each of the pIL-2 and pVaxgDE7 vectors alone or with a dose of immunogenic composition 2 (pVaxgDE7 + pIL-2) at a concentration of 50 ⁇ g DNA / 100 L / dose administered 3 days after challenge.
  • the composition The immunogenic immunoglobulin comprising pVaxgDE7 and pIL-2 vectors was able to protect 100% of mice from single dose tumor development. Under the same conditions, vectors pIL-2 and pVaxgDE7 alone were not able to keep mice free of tumors. These results demonstrate that the pgDE7 and pVaxgDE7 vectors have similar anti-tumor efficacy. This result shows that the pVaxgDE7 vector has the same anti-tumor effect as the pgDE7 vector when combined with the pIL-2 vector ( Figure 6).
  • Plasmid pgDE7h which comprises the artificial sequence of HPV-16 E7 and HSV-1 gD genes optimized for better expression in human cells, protected 100% of mice against the development of single-dose tumors while in them Under experimental conditions, plasmid pgDE7 and vector pIL-2 alone were unable to keep mice free of tumors.
  • the pgDE7h vector When administered alone, the pgDE7h vector was able to protect all animals inoculated with tumor cells at a concentration of only 50 g DNA / 100pL / dose. At a concentration of 25 g DNA / 100pL / dose only 40% of mice treated with 25 ⁇ q of the vector were tumor free. Administration of 10 q or 5 g DNA / 100pL / dose of plasmid pgDE7h was not able to maintain tumor free mice. On the other hand, immunogenic composition 3 (pgDE7h + pIL-2) was able to protect all mice from tumor development when administered at the same concentrations of (50pg, 25g and 10pg DNA / 100pL / dose).
  • immunogenic composition 3 (pgDE7h + pIL-2) was able to protect 80% of the animals against tumor development.
  • the pIL-2 vector alone was not able to keep mice free of tumors at different concentrations tested.
  • compositions 1 pgDE7 + IL-2
  • 2 pVAXgDE7 + pIL-2
  • 3 pgDE7h + pIL-2
  • TC-1 administered intramuscularly in amounts ranging from 25 ⁇ g to 100 ⁇ g DNA / 100 L / dose.
  • compositions as well as other formulations comprising simultaneously plasmids expressing HSV gD protein fused HPV E7 protein and cytokine encoding plasmids, represent a unique anti-tumor therapeutic strategy.

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Abstract

A presente invenção refere-se a composições imunogênicas sinérgicas que compreendem um vetor de expressão que codifica a proteína E7 de HPV fusionada à proteína gD de HSV, um vetor de expressão que codifica uma citocina e um veículo farmaceuticamente aceitável. A presente invenção refere-se também a seqüências de ácido nucléico isoladas e vetores que codificam a proteína E7 de HPV fusionada à proteína gD de HSV e compreendem códons otimizados para a expressão em células de mamífero, preferencialmente células humanas. A presente invenção refere-se ainda a vacinas e métodos de prevenção ou tratamento de tumores induzidos por papilomavírus que compreendem a administração de uma ou mais composições imunogênicas sinérgicas da presente invenção a animais ou humanos que delas necessitem.

Description

Relatório descritivo da Patente de Invenção para: "SEQUÊNCIA DE ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADA, VETOR DE EXPRESSÃO, COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA SINÉRGICA QUE COMPREENDE UM VETOR DE EXPRESSÃO QUE CODIFICA A PROTEÍNA E7 DO VÍRUS DO PAPILOMA HUMANO (HPV) FUSIONADA À PROTEÍNA gD DO VÍRUS HERPES HUMANO TIPO 1 (HSV-1) E UM VETOR DE EXPRESSÃO QUE CODIFICA UMA CITOCINA E SEUS USOS"
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a composições imunogênicas sinérgicas que compreendem um vetor de expressão que codifica a proteína E7 de HPV fusionada à proteína gD de HSV, um vetor de expressão que codifica uma citocina e um veículo farmaceuticamente aceitável.
A presente invenção refere-se também a sequências de ácido nucléico isoladas que codificam a proteína E7 de HPV fusionada à proteína gD de HSV e compreendem códons otimizados para a expressão em células de mamífero, preferencialmente células humanas.
A presente invenção refere-se também a vetores de expressão que codificam sequências de ácido nucléico da presente invenção.
A presente invenção refere-se também ao uso de uma ou mais composições imunogênicas sinérgicas da presente invenção na manufatura de uma vacina para prevenção e/ou tratamento de tumores induzidos por papilomavírus em animais ou humanos. A presente invenção refere-se também a vacinas que compreendem uma ou mais composições imunogênicas sinérgicas da presente invenção.
A presente invenção refere-se ainda a métodos de prevenção ou tratamento de tumores induzidos por papilomavírus que compreendem a administração de uma ou mais composições imunogênicas sinérgicas da presente invenção a animais ou humanos que delas necessitem.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO .
O câncer de colo de útero é a terceira principal causa de morte por câncer em mulheres de todo o mundo causando 200.000 mortes por ano (PISANI P. PARKIN D.M., BRAY F. AND FERLAY J. (1999) Estimates of the worldwide mortality from 25 cancers in 1990. Int. J. Câncer 83:18-29). Dados epidemiológicos mostram uma clara relação entre a infecção pelo vírus do papiloma humano (HPV) e o desenvolvimento de câncer do colo do útero, sendo que o genoma de HPV pode ser detectado em mais.de 99% dos casos deste tipo de câncer. Mais de 100 tipos de HPV foram descritos, e cerca de 20 têm mostrado propensão a infectar os tecidos do trato anogenital. Alguns tipos de HPV causam verrugas e lesões benignas e raramente são encontrados em carcinomas invasivos, sendo chamados de genótipos de baixo risco, como o HPV-6 e o HPV-11. Os genótipos do HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33 e HPV-45 são frequentemente encontrados em tecidos tumorais do colo do útero, sendo chamados de genótipos de alto risco (WALBOOMERS, J.M., JACOBS M.V., MANOS M.M. et al (1999) Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical câncer worldwide. J. Pathol. 198:12-19). As proteínas E6 e E7 dos genótipos de alto risco são capazes degradar p53 e inativar pRb, proteínas reguladoras do ciclo celular, interferindo no crescimento e multiplicação celular (HOWLEY P.M. (1991) Role of the human papillomaviruses in human câncer. Câncer Res. 51:5019s- 5022s) . Entre os genótipos de alto risco, destaca-se o HPV- 16 encontrado em 50% a 60% dos casos de câncer do colo do útero, podendo ser considerado o principal agente etiológico da doença (BOSCH F.X., MANOS M.M., MUNOZ N., SHERMAN M. , JANSEN A.M., PETO J. , SCHIFFMAN M.H., MORENO V., KURMAN R., SHAH K.V. (1995) Prevalence of human papillomavirus in cervical câncer: a worldwide perspective. International biological study on cervical câncer (IBSCC) Study Group. J Natl Câncer Inst. 87 (11) : 796-802) . Como o câncer cervical é causado por um tipo de infecção virai, seria esperado que uma vacina capaz de gerar anticorpos neutralizantes que bloqueiem a entrada do vírus reduzisse a incidência deste tipo de câncer a longo prazo. Duas vacinas profiláticas baseadas em VLPs (Virus like particles) formados pela proteína LI dos tipos virais HPV-6, -11, -16 e 18 (Gardasil) ou somente dos HPV-16 e -18 (Cervarix) estão disponíveis no mercado. Entretanto, caso a infecção já tenha sido estabelecida, outro tipo de vacina faz-se necessária, pois os anticorpos neutralizantes não são capazes de eliminar o vírus ou inibir o crescimento de tumores. Novas abordagens terapêuticas anti-tumorais são continuamente investigadas e dentre elas, a imunoterapia ou à utilização de vacinas terapêuticas representa uma forma de crescente relevância. O conhecimento dos mecanismos imunológicos tem permitido que essas abordagens sejam continuamente aprimoradas e se traduzam em progressos clínicos contínuos. Diante disso, a relevância da pesquisa de vacinas terapêuticas contra o câncer cervical, deve ser enfatizada, uma vez que centenas de milhões de pessoas estão infectadas pelo vírus e que poderão desenvolver tumores no futuro, já que o HPV é geralmente contraído por mulheres jovens mas o câncer se manifesta apenas depois dos 50 anos de idade (LEPIQUE A.P., RABACHINE T., VILLA L.L. (2009) HPV vaccination: the beginning of the end of cervical câncer? - A Review. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 104 (1) : 1-10) .
As vacinas terapêuticas contra o câncer surgem como uma alternativa a processos cirúrgicos e radioterápicos . Diversos grupos têm descrito o desenvolvimento de vacinas que trazem como alvo as células cancerosas induzidas por HPV-16. Estudos de imunoterapia antígeno-especifica mostram que tumores induzidos pelo HPV podem ser controlados e por vezes eliminados por ativação de resposta mediada por células T especificas contra as proteínas E7 e E6 (LING M., KANAYAMA M. , RODEN R. , et al. (2000) Preventive and therapeutic vaccines for human papillomavirus-associated cervical cancers. J Biomed Sei. 7 (5) : 341-356) . Vacinas de DNA contra o HPV-16 que utilizam o gene da oncoproteína E7 na sua forma nativa induzem baixos níveis de ativação de células T CD8+ e consequentemente não protegem animais contra o desafio utilizando células transformadas pelo HPV- 16 (HUNG C. F., MONIE A., ALVAREZ R. D., et al. (2007) DNA vaccines for cervical câncer: from bench to bedside. Exp. Mol. Med. 39:679-689.; KANODIA S., DA SILVA D.M., KAST W.M. (2008) Recent advances in strategies for immunotherapy of human papillomavirus-induced lesions. Int J Câncer. 15; 122 (2 ): 247-59) . Estratégias alternativas de apresentação antigênica, como o direcionamento da expressão a compartimentos celulares específicos, são capazes de aumentar as respostas imunológicas específicas e proteger animais contra o HPV-16 (JI H., WANG T.L., CHEN C.H., et al. (1999) Targeting human papillomavirus type 16 E7 to the endosomal/lysosomal compartment enhances the antitumor immunity of DNA vaccines against murine human papillomavirus type 16 E7-expressing tumors. Hum Gene Ther. 10:2727-2740.; RODRIGUEZ F. , AN L.L., HARKINS S., et al. (1998) DNA immunization with minigenes: low frequency of memory eytotoxie T lymphocytes and inefficient antiviral protection are rectified by ubiquitination. J Virol. 72 (6) : 5174-5181. ; CHENG W.F., HUNG C.F., CHAI C.Y., et al. (2001) Tumor-specific immunity and antiangiogenesis generated by a DNA vaccine encoding calreticulin linked to a tumor antigen. J. Clin. Invest. 108:669-678.; CHU N.R., WU H.B., WU T., et al. (2000) Immunotherapy of a human papillomavirus (HPV) type 16 E7-expressing tumour by administration of fusion protein comprising Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin (BCG) hsp65 and HPV16 E7. Clin Exp Immunol. 121:216-225.; HUNG C.F., TSAI Y.C., HE L . , et al. (2007) DNA vaccines encoding Ii-PADRE gnerates potent PADRE-specific CD4 (+) T-cell immune responses and enhances vaccine potency. Mol. Ther. 15:1211-1219).
Recentemente foram desenvolvidas vacinas de DNA capazes de expressar as oncoproteinas E6 e E7 do HPV-16 na superfície celular das células transfectadas (LASARO, M. 0., DINIZ, M. 0., ARTURO, R. , ERTL, H. C, FERREIRA, L. C. S., (2005) Anti-tumor DNA vaccines based on the expression of human papillomavirus-16 E6/E7 oncoproteins genetically fused with the glycoprotein D from herpes simplex virus-1. Microbes and Infection. 7:1541-1550).
Neste estudo, as oncoproteinas E6 e E7 foram fusionadas geneticamente à glicoproteina D (gD) do vírus do herpes simplex tipo 1 (HSV-1) . A proteína E7 foi inserida em sítios permissíveis próximos a extremidade C-terminal da proteína gD do vírus herpes simplex tipo-1 (HSV-1) e o respectivo gene clonado em vetor apropriado para expressão em células eucariotas. Este vetor foi denominado pgDE7.
Posteriormente foi também publicado o pedido de patente O2008027394 que descreve construções quiméricas da proteína gD e as oncoproteinas E5, E6 e E7 do HPV-16 seja na forma de vacina de DNA ou vetores virais. As construções de E7 fusionado a gD aumentam as respostas imunes contra a proteína E7, particularmente respostas mediadas por linfócitos T CD8+, e a proteção profilática a tumores que expressem a proteína E7. A estratégia de clonagem de sequências heterólogas no gene que codifica a proteína gD usada neste estudo foi a mesma daquela descrita anteriormente por LASARO et al. 2005 (LASARO, M. O., DINIZ, M. O., ARTURO, R., ERTL, H. C, FERREIRA, L. C. S., (2005) Anti-tumor DNA vaccines based on the expression of human papillomavirus-16 E6/E7 oncoproteins genetically fused with the glycoprotein D from herpes simplex virus-1. Microbes and Infection. 7:1541-1550). A proteína gD do HSV-1 é uma proteína que apresenta superfície exposta, ficando ancorada à membrana das células infectadas através de uma sequência pequena localizada próxima à região C-terminal. Desta forma, as oncoproteínas do HPV-16 estariam sendo expressas no meio extracelular, reduzindo drasticamente os riscos oncogênicos das células transfectadas . Além disso, a proteína gD tem a capacidade de aumentar a imunogenecidade de E7, e de outras proteínas a ela fusionadas, por exercer uma competição com o receptor BTLA (B and T lymphocyte attenuator) pelo sítio de interação do receptor HVEM (Herpes vírus entry mediator) , reduzindo os efeitos co- inibitórios de BTLA em linfócitos T e B (LASARO M.O., TATSIS . , HENSLEY S.E., WHITBECK J.C., LIN S.W., RUX J.J., WHERRY E.J., COHEN G.H., EISENBERG R.J., ERTL H.C. (2008) Targeting of antigen to the herpesvirus entry mediator augments primary adaptive immune responses. Nat Med. 14 (2) :205-12) .
Assim, o vetor que expressa a proteína E7 fusionada à gD (pgDE7), em regime vacinai de quatro doses, promoveu a ativação de células T CD8+ específicas contra E7 e protegeu preventivamente todos os animais desafiados profilaticamente com células tumorais. Além disso, a administração da vacina em animais que já continham as células tumorais foi capaz de regredir os tumores em 40% dos animais e retardar a evolução dos tumores nos animais não protegidos (LASARO, M. 0., DINIZ, M. O., ARTURO, R., ERTL, H. C, FERREIRA, L. C. S., (2005) Anti-tumor DNA vaccines based on the expression of human papillomavirus-16 E6/E7 oncoproteins genetically fused with the glycoprotein D from herpes simplex virus-1. Microbes and Infection. 7:1541-1550) .
Um vetor que expressa as proteínas E5, E6 e E7 do HPV- 16 fusionadas à glicoproteína D do HSV-1 (pgDE7E6E5) foi também descrito no pedido de patente WO/2008/027394. Os dados já publicados envolvendo essa construção demonstram que uma dose da vacina gera proteção profilática completa à formação de tumores (LASARO M.O., TATSIS N . , HENSLEY S.E., HITBECK J.C., LIN S.W., RUX J.J., WHERRY E.J., COHEN G.H., EISENBERG R.J., ERTL H.C. (2008) Targeting of antigen to the herpesvirus entry mediator augments primary adaptive immune responses. Nat Med. 14 (2 ) : 205-12 ) . Entretanto, em estudos adicionais utilizando este vetor, observou-se que o mesmo não é eficaz na proteção camundongos que foram previamente inoculados com as células tumorais, que consiste no principal objetivo de uma vacina terapêutica contra câncer. Neste caso, a vacina apenas confere proteção parcial ao desafio com células tumorais em um regime de tratamento terapêutico mantendo 70% dos camundongos livres de tumores após um regime vacinai de 3 doses (DINIZ, M.O., LASARO, M.O., ERTL, H.C., FERREIRA, L.C.S. (2010) Immune responses and therapeutic anti-tumor effects of an experimental DNA vaccine encoding the human papillomavirus type-16 (HPV-16) oncoproteins genetically fused to the herpes virus glycoprotein D (gD) . Clinicai and Vaccine Immunology, Ahead of print) .
Desta forma, considerando-se camundongos que já continham previamente células tumorais, os plasmideos vacinais pgDE7 e pgDE7E6E5 demonstram efeito terapêutico anti-tumoral mas não são efetivos na erradicação das células tumorais em 100% dos animais testados.
Como estratégia alternativa para aumentar a resposta induzida por uma vacina de DNA, além da fusão a genes de proteínas heterólogas, podem ser utilizadas citocinas relacionadas à ativação ou proliferação de células T, como a IL-2 (interleucina-2) , IL-12 ( interleucina-12 ) e GM-CSF (Fator estimulante de colónias de granulócitos e macrófagos) . Plasmideos que codificam estas citocinas são potentes adjuvantes capazes de aumentar a resposta imune humoral e citotóxica em modelo animal (BAROUCH, D. H., A. CRAIU, . J. KURODA, J. E. SCHMITZ, X. X. ZHENG, S., SANTRA, J. D. FROST, G. R. KRIVULKA, M. A. LIFTON, C. L. CRABBS, G. HEIDECKER (2007) Induction of specific immune responses by severe acute respxratory syndrome coronavirus spike DNA vaccine with or without interleukin-2 immunization using different vaccination routes in mice. Clinicai and vaccine immunol. 14:894-901; CHO , Y. H., B. L. CHIANG, Y. L. LEE, W. K. CHI, W. C. LIN, Y. T. CHEN, AND M. H. TAO. (1998) Development of Thl and Th2 populations and the nature of immune responses to hepatitis B virus DNA vaccines can be modulated by codelivery of various cytokine genes. J. Immunol. 160:1320-1329).
Nesse contexto, a interleucina-2 (IL-2) é uma citocina potente produzida por células T ativadas, capaz de ativar múltiplos compartimentos do sistema imune e atua na proliferação clonal de células T (WALDMANN T.A. (2006) The biology of interleukin-2 and interleukin-15 : implications for câncer therapy and vaccine design. Nat Rev Immunol. 6: 595-601) .
IL-2 é um dos adjuvantes sistémicos mais amplamente utilizados para vacinas baseadas em peptideos. Seu uso clinico foi aprovado pelo FDA para o tratamento de câncer renal metastático e melanoma maligno, sendo capaz de induzir respostas clinicas em 15% dos pacientes com estes tipos de cânceres (ROSENBERG S.A., YANG J.C., TOPALIAN S.L., SCHWARTZENTRUBER D.J., WEBER J.S., PARKINSON D.R., et al (1994) . Treatment of 283 consecutive patients with metastatic melanoma or renal cell câncer using high-dose bolus interleukin 2. JAMA. 271 (12) : 907-13) . Alguns estudos que empregam plasmideos que contém o gene da IL-2 têm obtido aumentos significativos nas respostas imunológicas contra o herpes bovino tipo I (KUHNLE, G., R. A. COLLINS, J. E. SCOTT, AND G. M. KEIL. (1996) . Bovine interleukins 2 and 4 expressed in recombinant bovine herpesvirus 1 are biologically active secreted glycoproteins. J. Gene Virol. 77:2231-2240), vírus de hepatite C (GEISSLER, M. , A. GESIEN, K. TOKUSHIGE, AND J. R. ANDS. (1997). Enhancement of cellular and humoral immune responses to hepatitis C virus core protein using DNA-based vaccines augmented with cytokine-expressing plasmids. J. Immunol. 158:1231-1237), vírus da imunodeficiência adquirida humana (MOORE, A. C, W. P. KONG, B. K. CHAKRABARTI, AND J. N. GARY. (2002) . Effects of antigen and genetic adjuvants on immune responses to human immunodeficiency virus DNA vaccines in mice. J. Virol. 76:243-250), e contra tumores que expressam o HER2/Neu (LIN CC, CHOU CW, SHIAU AL, TU CF, KO TM, CHEN YL, et al. (2004) Therapeutic HER2/Neu DNA vaccine inhibits mouse tumor naturally overexpressing endogenous neu. Molec Therapy .10:290-301).
A co-expressão de IL-2 também tem sido utilizada para aumentar a resposta imune à glicoproteína D (gD) do HSV-1 utilizada como antígeno em vacinas de DNA (LI WR, NIU B, ANG JW, FENG ZJ,WANG DX. (2006) Coexpression of interleukin-2 enhances the immunization effect of a DNA vaccine expressing herpes simplex 1 glycoprotein D. Acta Virol. 50:251-6) .
A citocina IL-12 também apresenta histórico de aplicação no tratamento de tumores. A citocina IL-12 tem demonstrado acentuada atividade anti-tumoral e anti- metastática em numerosos modelos animais (MAZZOLINI G, PRIETO J, MELERO I. (2003) Gene therapy of câncer with interleukin-12. Curr. Pharm. Des. 9 (24) : 1981-91; RIEZEBOS- BRILMAN A, REGTSA J, CHEN M, WILSCHUTA J, DAEMENA T. (2009) Vaccine. 27:701-707). A capacidade de IL-12 de induzir resposta imune antígeno-específica está relacionada principalmente a sua habilidade de polarizar as resposta imunológicas para um padrão Thl (HSIEHC S, MACATONIA S E, TRIPP C S, WOLF S F, O' GARRA A, MURPHY K M. (1993). Development of TH1 CD4+ T cells through IL-12 produced by Listeria-induced macrophages. Science. 260:547-549; MANETTI R, GEROSA F, GIUDIZI M G, BIAGIOTTI R, PARRONCHI P, PICCINNI M P, SAMPOGNARO S, MAGGI E, ROMAGNANI S, TRINCHIERI G, (1993) Interleukin 12 induces stable priming for interferon gamma (IFN-gamma) production during differentiation of human T helper (Th) cells and transient IFN-gamma production in established Th2 cell clones. J. Exp. Med. 179:1273-1283; TSUNG K, MEKO J B, PEPLINSKI G R, TSUNG Y L, NORTON J A. (1997) IL-12 induces T helper 1- directed antitumor response. J. Immunol. 158:3359-3365).
A IL-12 também promove a maturação de células T citotóxicas e NK e atua como um sinal secundário ao antigeno no aumento da população de células T CD8+ efetoras e de memória (WATFORD W T, MORIGUCHI M, MORINOBU A, O' SHEA J J. (2003) The biology of IL-12: coordinating innate and adaptive immune responses. Cytokine Growth Factor Rev. 14:361-368) (CURTSINGER J M, JOHNSON C M, MESCHER M F. (2003) CD8 T cell clonal expansion and development of eVector function require prolonged exposure to antigen, costimulation, and signal 3 cytokine. J. Immunol. 171:5165- 5171; VALENZUELA J O, HAMMERBECK C D, MESCHER M F. Cutting edge: Bcl-3 up-regulation by signal 3 cytokine (IL-12) prolongs survival of antigen-activated CD8 T cells. J. Immunol. 174:600-604).
A IL-12 também é capaz de facilitar a apresentação de antigenos através do aumento na expressão de moléculas de MHC classe I e II associado à capacidade de IL-12 de promover a expressão de IFN-γ (WEISS J M, SUBLESKI J J, WIGGINTON J M, WILTROUT R H. (2007) Expert Opin. Biol. Ther. 7;1705-1721. ) GM-CSF é capaz de iniciar a proliferação, diferenciação e ativação de macrófagos, neutrófilos e várias células apresentadoras de antigenos (APCs) , atividade importante no controle terapêutico de diferentes tumores ( AKIMOTO H, ABE J, TSUNODA R, AOYAGI M, HIRAKA A K, HAMADA H. (1996) Intensified antitumor immunity by a cancer vaccine that produces granulocyte-macrophage colony- stimulating factor plus interleukin 4. Cancer Res. 56:1828- 1833; JAGER E, RINGHOFFER , DIENES H P, ARAND M, KARBACH J, JAGER D, ILSE ANN C, HAGEDORN M, OESCH F, KNUTH A. (1996) Granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor enhances immune responses to melanoma-associated peptides in vivo. Int. J. Cancer. 67:54-62; JONES T, STERN A, LIN R. (1994) Potential role of granulocyte-macrophage colony- stimulating factor as vaccine adjuvant. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 13:S47-S53; DISIS M L, BERNHARD H, SHIOTA F M, HAND S L, GRALO J R, HUSEBY E S, GILLIS S, CHEEVER M A. (1996) Granulocyte-macrophage colony- stimulating factor: an effective adjuvant for protein and peptide-based vaccines. Blood. 88:202-210).
Quando usado em combinação com vacinas de DNA ou de proteínas, o GM-CSF aumenta a apresentação antigênica atraindo células dendríticas para o sítio de vacinação (TOUBAJI A, HILL S, TERABE M, QIAN J, FLOYD T, SIMPSON M R, BERZOFSKY J A, KHLEIF S N. (2007) Vaccine. 25:5882-5891). Ensaios em modelo murino demonstram que GM-CSF induz respostas de células T específicas (AHLERS J D, DUNLOP N, ALLING D , NARA P L, BERZOFSKY J A. (1997) Cytokine- adjuvant steering of the immune response phenotype to HIV-1 vaccine constructs: granulocyte-macrophage colony- stimulating factor and TNF-alpha synergize with IL-12 to enhance induction of cytotoxic T lymphocytes. J. Immunol. 158:3947-3958) . Além disso, GM-CSF é utilizado em ensaios clínicos como adjuvante em vacinas baseadas em peptídeos (WEBER J, SONDAK V K, SCOTLAND R, PHILLIP R, WANG F, RUBIO V, STUGE T B, GROSHEN S G, GEE C, JEFFERY G G, SIAN S, LEE P P. (2003) Granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor added to a multipeptide vaccine for resected Stage II melanoma. Câncer. 97:186-200; CHIANESE-BULLOCK K A, PRESSLEY J, GARBEE C, HIBBITTS S, MURPHY C, YAMSHCHIKOV G, PETRONI G R, BISSONETTE E A, NEESE P Y, GROSH W W, MERRILL P, FINK R, WOODSON E M, WIERNASZ C J, PATTERSON J W, SLINGLUFF C L. (2005) MAGE-A1-, MAGE-A10-, and gplOO-derived peptides are immunogenic when combined with granulocyte macrophage colony-stimulating factor and montanide ISA-51 adjuvant and administered as part of a multipeptide vaccine for melanoma. J. Immunol. 174:3080-3086) e para tratamentos de diversos tipos de tumores (SPITLER L E, GROSSBARD M L, ERNSTOFF M S, SILVER G, JACOBS M, HAYES F A, SOONG S J. (2000) Adjuvant therapy of stage III and IV malignant melanoma using granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. J. Clin. Oncol. 18:1614 -1621; CORREALE P, CUSI M G, TSANG K Y, DEL VECCHIO M T, MARSILI S, PLACA M L, INTRIVICI C, AQUINO A, MICHELI L, NENCINI C, FERRARI F, GIORGI G, BONMASSAR E, FRANCINI G. (2005) Chemo- immunotherapy of metastatic colorectal carcinoma with gemcitabine plus FOLFOX 4 followed by subcutaneous granulocyte macrophage colony-stimulating factor and interleukin- 2 induces strong immunologic and antitumor activity in metastatic cólon câncer patients. J. Clin. Oncol. 23:8950-8958; CARTRON G, ZHAO-YANG L, BAUDARD M, KANOUNI T, ROUILLÉ V, QUITTET P, KLEIN B, ROSSI J F. (2008) Granulocyte-macrophage colony stimulating factor potentiates rituximab in patients with relapsed follicular lymphoma: Results of a phase II study. J. Clin. Oncol. 26:2725-2731; HONKOOP A H, LUYKX-DE BAKKER S A, HOEKMAN K, MEYER S, MEYER O W, VAN GROENINGEN C J, VAN DIEST PJ, BOVEN E, VAN DER WALL E, GIACCONE G, WAGSTAFF J, PINEDO H M. (1999) Prolonged neoadjuvant chemotherapy with GM-CSF in locally advanced breast câncer. The Oncologist. 4:106 - 111) .
Diversos estudos clínicos utilizando vacinas de DNA fracassaram por não reproduzirem os efeitos imunológicos encontrados em camundongos ou mesmo em primatas não humanos. Embora tais ensaios demonstrem a segurança das vacinas de DNA, ficou evidente que modificações devem ser feitas nas formulações para aumentar as respostas imunológicas em humanos. Uma forma de aumentar a imunogenicidade das vacinas de DNA envolve o uso de adjuvantes variados. Alguns destes adjuvantes visam melhorar a eficiência de expressão dos antígenos codificados, seja por métodos que promovam uma maior eficiência de transfecção celular seja por meio da otimização da expressão através de mudanças nos códons do gene alvo (KUTZLER MA AND WEINER D. (2008) DNA vaccines: ready for prime time? Nat Ver Genet . 9 (10) : 776-88) . Nesta última abordagem as sequências de nucleotídeos dos genes alvo são modificadas de modo que, durante a tradução nas células transfectadas, sejam empregados os tipos mais abundantes de RNA transportador para um determinado aminoácido resultando em um aumento na produção do antígeno e, consequentemente, indução de maiores respostas imunológicas específicas.
Um procedimento importante para garantir a segurança de vacinas voltadas para o controle de tumores causados pelos vírus do papiloma humano é a modificação de aminoácidos críticos para a ação cancerígena das oncoproteínas E6 e, particularmente, E7. Tal procedimento envolve a modificação de aminoácidos na região compreendida entre os aminoácidos 19 a 26 da proteína E7, cujos resíduos levam à inativação da proteína pRB em células epiteliais com consequente perda do controle da divisão celular e crescimento descontrolado característico das neoplasias associadas ao vírus do papiloma.
OBJETIVOS DE INVENÇÃO
A presente invenção tem por objetivo prover composições imunogênicas sinérgicas que compreendem um vetor de expressão que codifica a proteína E7 de HPV fusionada à proteína gD de HSV, um vetor de expressão que codifica uma citocina e um veículo farmaceuticamente aceitável .
Em particular a presente invenção tem por objetivo prover composições imunogênicas sinérgicas que compreendem um vetor de expressão que codifica a proteína E7 de HPV fusionada à proteína gD de HSV, um vetor de expressão que codifica uma citocina e um veículo farmaceuticamente aceitável em que o HPV é HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33 ou HPV-45, o HSV é HSV-1 ou HSV- 2, a citocina é IL-2, IL-12 ou GM-CSF e o veículo farmaceuticamente aceitável é salina, lipossomos, emulsões lipídicas e/ou micropartículas de PLGA.
Constitui um outro objetivo da presente invenção prover sequências de ácido nucléico isoladas que codificam a proteína E7 de HPV fusionada à proteína gD de HSV e compreendem códons otimizados para a expressão em células de mamífero, preferencialmente células humanas.
Em particular constitui um objetivo da presente invenção prover sequências de ácido nucléico isoladas que codificam a proteína E7 de HPV fusionada à proteína gD de HSV e compreendem códons otimizados para a expressão em células de mamífero, preferencialmente células humanas em que a sequência é adicionalmente mutada de forma impedir a interação da proteína E7 de HPV com a proteína celular Rb e em que o HPV é HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33 ou HPV-45, o HSV é HSV-1 ou HSV- 2.
Constitui outro objetivo da presente invenção prover vetores de expressão que codificam sequências de ácido nucléico da presente invenção.
Constitui outro objetivo da presente invenção o uso de uma ou mais composições imunogênicas sinérgicas da presente invenção na manufatura de uma vacina para prevenção e/ou tratamento de tumores induzidos por papilomavirus em animais ou humanos.
Constitui outro objetivo da presente invenção prover vacinas que compreendem uma ou mais composições imunogênicas sinérgicas da presente invenção.
Constitui outro objetivo da presente invenção métodos de prevenção ou tratamento de tumores causados por papilomavirus que compreende administrar uma ou mais composições imunogênicas sinérgicas da presente invenção a animais ou humanos que delas necessitem.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
As figuras a seguir fazem parte do presente relatório e estão aqui incluídas a fim de ilustrar determinados aspectos da invenção. O objeto da presente invenção pode ser melhor entendido com referência a uma ou mais dessas figuras, em combinação com a descrição detalhada da modalidade preferida aqui apresentada.
A Figura 1 mostra esquematicamente os vetores plasmidiais utilizados nos Exemplos da presente invenção. Na Figura IA está representado o vetor pgDE7 que codifica a proteína E7 do HPV-16 geneticamente fusionada à proteína gD do HSV-1 e contém um gene de resistência à ampicilina e promotor derivado do vírus do sarcoma de Rous para expressão do antígeno vacinai Na Figura 1B está representado o vetor pIL-2 que codifica a citocina IL-2 murina. Figura 1C está representado o vetor pVaxgDE7 que 1 codifica a proteína E7 do HPV-16 geneticamente fusionada à proteína gD do HSV-1 e contém o gene de resistência à canamicina e promotor derivado do citomegalovírus para a expressão do antígeno vacinai. Na Figura 1D está representado o vetor pgDE7h que possui gene de resistência à canamicina e codifica a proteína E7 do HPV-16 geneticamente fusionada à proteína gD do HSV-1 e cujos sequência gênica possui códons otimizados para o sistema de expressão em células humanas.
A Figura 2 mostra o ensaio de proteção terapêutica de camundongos C57BL/6 desafiados com células tumorais TC-1 e imunizados com uma dose de cada um dos vetores pgD, pIL-2 e pgDE7 isoladamente, ou três doses do vetor pgDE7, ou uma, duas ou três doses da composição imunogênica 1 (pgDE7+pIL- 2) (Efeito protetor) .
A Figura 3 mostra um ensaio de proteção terapêutica de camundongos C57BL/6 desafiados com células tumorais TC-1 e imunizados com uma dose de lOO^g do vetor pIL-2 ou uma dose da composição imunogênica 1 (pgDE7+pIL-2 ) administrada nas concentrações de 100 g, 50μg, 25pg ou 10μg DNA /100 μΙ^θΞθ (Efeito protetor) .
A Figura 4 mostra um ensaio de proteção terapêutica de camundongos C57BL/6 desafiados com células tumorais TC-1 e imunizados com uma dose de 100pg do vetor pIL-2 ou uma dose da composição imunogênica 1 (pgDE7+pIL-2 ) administrada na concentração de 50μg DNA /ΙΟΟμΙ^οεε administrada no mesmo dia (dia 0), 3, 7, 10 ou 14 dias após o desafio (Efeito protetor) . A Figura 5 mostra o crescimento de tumores em camundongos C57BL/6 desafiados com células tumorais TC-1 e imunizados com uma dose de cada um dos vetores pIL-2 e pDE7 isoladamente ou com uma dose da composição imunogênica 1 (pgDE7+pIL-2 ) na concentração de 50μg de DNA/100 μΐι/dose administradas 3 dias após o desafio (Variação do tamanho do tumor) . A Figura 6 mostra um ensaio de proteção terapêutica 1 de camundongos C57BL/6 desafiados com células tumorais TC-1 e imunizados com uma dose de cada um dos vetores pIL-2 e pVaxgDE7 isoladamente ou com uma dose da composição imunogênica 2 (pVaxgDE7+pIL-2 ) na concentração de 50pg de DNA/100 μΐ,/dose administradas 3 dias após o desafio (Efeito protetor) . A Figura 7 mostra um ensaio de proteção terapêutica de camundongos C57BL/6 desafiados com células tumorais TC-1 e imunizados com uma dose dos vetores pIL-2, pgDE7 ou pgDE7h (isoladamente na concentração de 50μg de DNA/100 L/dose administradas 3 dias após o desafio. (Efeito protetor) .
A Figura 8 mostra a quantidade mínima do vetor pgDE7h necessária à eficácia terapêutica anti-tumoral máxima da composição imunogênica 3 (pgDE7h+pIL-2 ) . É mostrado um ensaio de proteção terapêutica de camundongos C57BL/6 desafiados com células tumorais TC-1 e imunizados com uma dose de cada um dos vetores pIL-2 e pgDE7h isoladamente ou uma dose da composição imunogênica 3 (pgDE7h+pIL-2 ) em diversas concentrações de DNA /dose administradas 3 dias após o desafio. Os animais foram imunizados com uma dose de 50pg DNA/100 L/dose do vetor pIL-2, ou do vetor pgDE7h, ou da composição imunogênica 3 (pgDE7h+pIL-2 ) e com uma dose de 25μg DNA/100 L/dose do vetor pgDE7h ou da composição imunogênica 3 (pgDE7h+pIL-2 ) (Fig. 8A) , ou uma dose de 10vq DNA/100 L/dose do vetor pgDE7h ou da composição imunogênica 3 (pgDE7h+pIL-2 ) ou uma dose de 5 g DNA/100 L/dose do vetor pgDE7h ou da composição imunogênica 3 (pgDE7h+pIL-2) (Fig. 8B) .
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Das composições imunogênicas sinérgicas
A presente invenção fornece composições imunogênicas sinérgicas para prevenção e tratamento de tumores causados por papilomavírus em animais e humanos. As composições imunogênicas sinérgicas da presente invenção compreendem um vetor de expressão que codifica a proteína E7 de HPV fusionada à proteína gD de HSV, um vetor de expressão que codifica uma citocina e um veículo farmaceuticamente aceitável.
Preferencialmente, o vetor de expressão que codifica a proteína E7 de HPV fusionada à proteína gD de HSV codifica uma a sequência de E7 de HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33 ou HPV-45. Ainda mais preferencialmente, a sequência de E7 é de HPV-16.
Preferencialmente, o vetor de expressão que codifica a proteína E7 de HPV fusionada à proteína gD de HSV codifica uma sequência de gD de HSV-1 ou HSV-2. Ainda mais Preferencialmente, a sequência de gD é de HSV-1.
Em outra modalidade o vetor de expressão que codifica a proteína E7 de HPV fusionada à proteína gD de HSV codifica uma sequência de ácido nucléico cujos códons são otimizados para a expressão em células de mamífero. Ainda mais preferencialmente códons são otimizados para a expressão em células humanas.
Preferencialmente o vetor de expressão que codifica a a proteína E7 de HPV fusionada à proteína gD de HSV codifica uma sequência de ácido nucléico cujos códons são otimizados para a expressão em células de mamífero ou humanas e cuja sequência é mutada de forma impedir a interação da proteína E7 de HPV com a proteína celular Rb.
Ainda mais preferencialmente a sequência é mutada nas posições 24 e 26 de E7. Preferencialmente as posições 24 e 26 de E7 são mutadas para uma glicina.
Em outra modalidade, a sequência que codifica a proteína E7 poderia ser facilmente trocada por sequências que codificam para outras oncoproteínas codificadas por outro vírus do papiloma, humano ou de outros animais, como as proteínas E5, E6 e E2. Em outra modalidade, o vetor de expressão que codifica uma citocina, codifica a IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 ou GM- CSF assim como outras citocinas que possam atuar sinergicamente sobre os efeitos anti-tumorais da composição imunogênica. Preferencialmente o vetor de expressão que codifica uma citocina, codifica a IL-2. A citocina IL-2 pode ser humana ou de outras espécies de mamíferos.
Em outra modalidade as composições imunogênicas da presente invenção podem compreender proteínas purificadas derivadas das sequências codificadas pelos vetores de expressão que codificam a proteína E7 de HPV fusionada à proteína gD de HSV e pelo vetor de expressão que codifica a citocina de interesse conforme descrito na presente invenção .
As composições imunogênicas sinérgicas da presente invenção são preparadas usando boas práticas de laboratório e de boas práticas de fabricação, livres de endotoxinas e adequadas para o uso em testes pré-clínicos e/ou clínicos.
As composições imunogênicas sinérgicas da presente invenção podem ser preparadas utilizando-se diversos veículos farmaceuticamente aceitáveis.
Conforme usado na presente invenção, o emprego do termo "farmaceuticamente aceitável" significa um sólido não-tóxico, inerte, excipiente líquido semi-sólido, diluente, formulação auxiliar de qualquer tipo, ou simplesmente um meio aquoso estéril, tal como salina. Alguns exemplos dos materiais que podem servir como veículos farmaceuticamente aceitáveis são açúcares, tais como lactose, glicose e sacarose, os amidos, tais como amido de milho e o amido de batata, a celulose e os seus derivados, tais como a carboximetilcelulose de sódio, a etilcelulose e o acetato de celulose, ciclodextrina; óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de girassol, óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de milho e óleo de semente de soja; glicóis, tais como propilenoglicol, polióleos, tais como glicerinaglicol, sorbitol, manitol e de polietileno; ésteres, tais como o laurato etílico, oleato etílico, ágar; agentes tamponantes, tais como o hidróxido de alumínio e hidróxido de magnésio; ácido algínico; água livre de pirogênio; salina isotônica, solução de Ringer; soluções tampões de álcool etílico e fosfato, assim como outras substâncias não tóxicas compatíveis usadas em formulações farmacêuticas.
Preferencialmente o veículo é salina.
Em outra modalidade o veículo compreende adicionalmente sistemas de entrega não-virais, de liberação sustentada ou controlada como lipossomos, emulsões lipídicas, partículas biodegradáveis, constituídas de ácido glicólico poli-lactato (PLGA) e quitosana, assim como o emprego de outros adjuvantes voltados para o aumento da eficácia terapêutica e preventiva da composição.
Atualmente, os sistemas não-virais são os mais utilizados para a entrega de ativos farmacêuticos, dentre os quais se destacam as microesferas de PLGA e os lipossomas. As microesferas compostas por polímeros de ácido lático e glicólico (PLGA) possuem potencial para atuar como mediadores de transfecção de células fagocíticas como macrófagos e células dendríticas, além de proteger o DNA contra degradação biológica por endonucleases aumentando a taxa de transfecção. As microesferas de PLGA são compostas de material biodegradável e biocompatível, são inócuas, são fagocitadas por células APCs e já são aprovadas pelo FDA dos EUA para uso humano. As microesferas de PLGA apresentam grande aplicabilidade para vetorização de vacinas de DNA, uma vez que pode ser projetada para liberar quantidades do plasmídeo de forma contínua e/ou rápida. A velocidade de hidrólise de tais polímeros depende: de sua composição química, da proporção dos monômeros; do tamanho da cadeia e do tamanho das partículas, podendo-se obter tempos de degradação que variam entre 2 semanas a 24 meses aproximadamente. A combinação da difusão através de poros e da erosão da matriz polimérica permite controlar a taxa de liberação do DNA ou do antígeno encapsulado nas microesferas . Esta propriedade permitiu a criação pelo grupo do conceito de vacina de dose única onde a formulação composta por microesferas de tamanho, porosidade e composição polimérica diferentes, libera os plasmídeos contendo E7 e IL-2 em intervalos de tempo que mimetizariam as doses de reforço de uma vacina. Outras vantagens na utilização desses sistemas para os plasmídeos E7 e IL-2 são: fácil administração; alta estabilidade, uma vez que são liofilizadas e podem ser reconstituídas imediatamente antes da administração.
Os lipossomas, ou vesículas de fosfolipídios, são agregados de fosfolipídios em estruturas de bicamada, contendo um volume aquoso central circundado por uma ou várias lamelas concêntricas, formando partículas unilamelares ou multilamelares, com diâmetros da ordem de dezenas de nanômetros a dezenas de micra. Durante sua formação, os lipossomas encapsulam parte do meio aquoso em que se encontram dispersos. A bicamada é capaz de acomodar moléculas hidrofóbicas e comporta-se como uma membrana semipermeável com relação ao material encapsulado no volume aquoso das vesículas. Com relação às características eletroquímicas , os lipossomas podem ser catiônicos, aniônicos ou neutros. Porém, no que se refere ao uso de biomoléculas com carga negativa (como DNA e algumas proteínas), a encapsulação dessas moléculas em lipossomas catiônicos é mais eficiente devido à interação eletrostática lipossoma-biomolécula .
Os lipossomas catiônicos são usados geralmente para carrear moléculas negativas como o DNA e facilitar a sua entrada na célula. Esses lipossomas podem conter somente o lipídio catiônico ou uma mistura com lipídios neutros, como o, L-a-dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE) e colesterol. Inicialmente utilizava-se a estearilamina como lipídio catiônico, porém, os estudos não prosseguiram devido à sua citotoxicidade . Atualmente vários outros lipídios catiônicos foram produzidos, dentre os quais, os sais quaternários de amónio, como o 1,2-dioleoil -3- trimetilamônio-propano (DOTAP) e o brometo de dimetildioctadecil amónio, são os mais usados devido à citotoxicidade reduzida (de la Torre LG, Rosada RS, Trombone APF, Frantzb FG, Coelho-Castelo AAM, Silva CL, and Santana MHA (2009) . The synergy between structural stability and DNA-binding controls the antibody production in EPC/DOTAP/DOPE liposomes and DOTAP/DOPE lipoplexes. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 73, 175-184) .
Ao contrário do que ocorre com vacinas administradas desprotegidas por via intramuscular, as vacinas de DNA encapsuladas em lipossomas e administradas pela mesma via, protegem a biomolécula de nucleases e proteases e são preferencialmente capturadas por células apresentadoras de antígenos, potencializando a resposta imune. É descrito que o principal caminho de entrada na célula é a endocitose, e o menos usual (apenas 2%), por fusão do lipossoma com a membrana celular e liberação do seu conteúdo diretamente para o citossol (TROMBONE APF, SILVA CL, ALMEIDA LP, ROSADA RS, LIMA KM, OLIVER C, JAMUR MC AND COELHO-CASTELO A (2007) .Tissue distribution of DNA-Hsp65/TDM-loaded PLGA microspheres and uptake by phagocytic cells. Genetics Vaccine and Therapy, 5:9) (PAULA L, SILVA CL, CARLOS D, MATIAS-PERES C,SORGI CA, SOARES EG, SOUZA, PRM, BLADÉS, CRZ, GALLETI FCS, BONATO VLD, GONÇALVES EDC, SILVA EVG AND FACCIOLI LH (2007). Genetics Vaccine and Therapy, 5:2) Resultados prévios do grupo mostram que os plasmídeos contendo E7 e IL-12 são eficientemente encapsulados, ou seja, complexado nas bicamadas internas das vesículas, aqui
t designado por DRV(DNA), ou localizado na sua superfície externa, DRV-DNA. Nessas siglas, o prefixo DRV (Dehydrated- Rehydrated Vesicles) refere-se a vesículas preparadas pelo método da desidratação-rehidratação .
As composições da presente invenção podem ser administradas por qualquer modo biologicamente aceitável, i.e. qualquer modalidade que possa produzir níveis eficazes dos compostos ativos sem causar efeitos adversos clinicamente indesejáveis. Tais modos de administração incluem as vias oral, retal, sublingual, tópica, nasal, transdermal ou parenteral. O termo "parenteral" inclui subcutânea, intravenosa, epidural, irrigação, intramuscular, bombas de liberação, ou de infusão. Particularmente, nesta invenção a via intramuscular é referida para administração das composições aqui reivindicadas .
As doses podem ser aplicadas em quantidades que podem variar entre 0,1 pg de DNA a 100 pg de DNA por dose no modelo murinho, e em humanos ou outras espécies de mamíferos com doses que podem variar entre 0,1 pg de DNA a 5 mg de DNA por dose .
Em suma, a composição imunogênica proposta está baseada na combinação de dois vetores (um que codifica para citocina e o outro que codifica para a proteína híbrida gD/E7). Esta composição inédita apresenta propriedades imunológicas e anti-tumorais aumentadas e inesperadas que conferem proteção preventiva e terapêutica contra tumores causados por papilomavírus .
A combinação dos dois vetores revelou propriedades sinérgicas inesperadas que conferem efeitos anti-tumorais únicos às composições imunogênicas da presente invenção que não podem ser alcançados com formulações baseadas apenas em vetores que expressam as proteínas do HPV fusionadas à proteina gD do HSV já descritos no estado da técnica.
Das sequências que codificam a proteina E7 de HPV fusionada à proteina gD de HSV compreendendo códons otimizados para a expressão em células de mamífero, preferencialmente células humanas .
A presente invenção fornece também sequências de ácido nucléico isoladas que codificam a proteina E7 de HPV fusionada à proteina gD de HSV e compreendem códons otimizados para a expressão em células de mamífero, preferencialmente células humanas.
Esta sequência gênica artificial promove o aumento da imunogenicidade das proteínas E7 e gD e representa um passo fundamental para o incremento da eficácia preventiva e terapêutica das composições imunogênicas da presente invenção .
Em uma outra modalidade esta sequência pode ser adicionalmente mutada de forma impedir a interação da proteína E7 de HPV com a proteína pRb envolvida no controle do ciclo de multiplicação celular. Tais mudanças visam eliminar qualquer atividade oncogênica residual da proteína E7, evitando que a expressão da proteína quimérica possa interferir no ciclo celular das células transfectadas e aumentam a segurança da sequência de ácidos nucléicos e das composições que a compreendam.
O estudo do mapeamento da região de interação entre E7 e Rb in vitro revelou que a troca alguns aminoácidos na região corresponde ao domínio de interação com a proteína pRB, particularmente resíduos situados entre as posições 20 ao 26. Em particular, a troca do aminoácido cisteína na posição 24 por uma serina diminui significativamente a ligação de E7 de HPV-16 à pRb. De forma semelhante, a troca do ácido glutâmico na posição 26 por uma glutamxna reduziu a capacidade da proteína E7 ligar-se à pRB (MÍJNGER K, WERNESS B A, DYSON N, PHELPS W C, HARLOW E, HOWLEY P M. (1989) Complex formation of human papillomavirus E7 proteins with the retinoblastoma tumor suppressor gene product. EMBO J. 8:4099-4105).
Assim, as mutações na sequência que codifica a proteína E7 são preferencialmente nos aminoácidos das posições 24 e 26 de E7. Ainda mais preferencialmente a cisteína da posição 24 de E7 é mutada para uma glicina e o ácido glutâmico da posição 26 de E7 é mutado para uma glicina.
Preferencialmente as sequências de ácido nucléico isoladas que codificam a proteína E7 de HPV fusionada à proteína gD de HSV e que compreendem códons otimizados para a expressão em células de mamífero, codificam a proteína E7 de HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33 e HPV-45. Ainda mais preferencialmente as sequências de ácido nucléico isoladas codificam a proteína E7 de HPV-16.
Preferencialmente as sequências de ácido nucléico isoladas que codificam a proteína E7 de HPV fusionada à proteína gD de HSV e que compreendem códons otimizados para a expressão em células de mamífero codificam a gD de HSV-1 ou HSV-2. Ainda mais preferencialmente as sequências de ácido nucléico isoladas codificam a proteína gD de HSV-1.
A presente invenção provê ainda vetores de expressão que codificam sequências de ácido nucléico da presente invenção .
Do uso das composições imunogênicas e das sequências de ácido nucleio da presente invenção .
Constitui um aspecto da presente invenção o uso de um vetor de expressão que codifica a proteína E7 de HPV fusionada à proteína gD de HSV e de um vetor de expressão que codifica uma citocina para a prevenção e tratamento de tumores induzidos por diferentes papilomavírus em animais ou humanos . Constitui outro aspecto da presente invenção o uso de uma ou mais composições imunogênicas sinérgicas, da presente invenção na manufatura de uma vacina para prevenção, controle ou tratamento de tumores induzidos por papilomavirus em animais ou humanos.
Constitui ainda um aspecto da presente invenção métodos de prevenção de tumores induzidos por papilomavirus caracterizado por compreender administrar uma ou mais composições imunogênicas sinérgicas da presente invenção animais ou humanos que delas necessitem.
Constitui ainda um aspecto da presente invenção métodos de controle ou tratamento de tumores induzidos por papilomavirus que compreendem a administração de uma ou mais composições imunogênicas sinérgicas da presente invenção a animais ou humanos que delas necessitem.
Como aqui definido, preferencialmente os animais são animais de estimação (cães, gatos) ou animais de interesse agropecuário, como bovinos, equinos, suínos, caprinos e ovinos .
EXEMPLOS
Para permitir uma melhor compreensão da presente invenção e demonstrar claramente os avanços técnicos obtidos são agora apresentados como exemplos os resultados dos diferentes ensaios efetuados com relação a esta invenção.
Exemplo 1 : Construção da sequência de ácidos nucléicos que codifica para a proteína E7 do HPV-16 fusionada à proteína gD do HSV-1 com códons otimizados para a expressão em células de mamífero .
Foi construída uma sequência de ácidos nucléicos que codifica para a proteína E7 do HPV-16 fusionada à gD do HSV-1 contendo códons otimizados para a expressão em células de mamífero, em particular células humanas. Aproximadamente 50% das bases nitrogenadas da sequência híbrida (gD e E7) foram modificadas sem alterar a sequência da proteína codificada.
Nessa sequência foram inseridos os sítios de clonagem das enzimas de restrição NotI (6 primeiras bases) e BglII (6 últimas bases) para possibilitar a clonagem da sequência no plasmídeo pUMVC3, comercializado pela firma Aldevron, e licenciado para testes clínicos.
Além disso, nessa sequência foram realizadas duas mutações pontuais para impedir a interação da proteína E7 de HPV-16 com a proteína celular Rb, evitando assim o potencial oncogênico de E7. Tais mutações consistiram na troca de uma cisteína por uma glicina na posição 24 de E7 e de um ácido glutâmico por uma glicina na posição 26 de E7. Esta sequência está descrita na SEQ. ID. 1.
Exemplo 2 : Construção e purificação dos vetores plasmidiais .
Para a construção do vetor pIL-2 o gene da interleucina 2 (IL-2) murino foi amplificado por PCR e clonado no vetor pcDNA3.1 (Invitrogen) . O vetor pgDE7 foi construído através da amplificação do gene da proteína E7 a partir do genoma total do HPV-16 utilizando iniciadores específicos desenhados com base na sequência depositada no GeneBank (GI: 9627100) e incluindo sítios para a enzima Apal nos iniciadores de E7. O plasmídeo pRE4 que contém o gene da glicoproteína D do HSV-1, gentilmente cedido pelo Dr. G. Cohen da Universidade da Pensilvânia, foi utilizado para a clonagem do gene de E7 fusionado ao gene gD. Para a construção do vetor pVaxgDE7 o gene gDE7 foi retirado do vetor pgDE7 através de digestão com a enzima de restrição ífindlll e clonado no vetor pVaxl (Invitrogen) . A construção do plasmídeo pgDE7h (SEQ. ID. 2) foi realizada após clonagem do gene sintético gDE7h (SEQ. ID. 1), que contém a sequência dos gene da E7 do HPV-16 fusionado ao gene da gD de HSV-1 com a sequência de códons otimizada para expressão em células de mamífero, em particular seres humanos, nos sítios de N el e £coRV do plasmídeo pUMVC3. As células eletrocompetentes utilizadas para a transformação com o vetor pRE4 foram bactérias Escherichia coli JM 110. Os tratamentos com enzimas de restrição, ligação, eletroforese em gel de agarose, purificação dos fragmentos de DNA e eletroporação seguiram procedimentos de rotina laboratorial. Todos os plasmídeos foram propagados em Escherichia coli DH5a em meio LB suplementado com ampicilina (100μg/mL) ou canamicina ( 100μg/mL) e purificados por duplo gradiente de densidade de cloreto de césio seguido de precipitação com etanol e ressuspensão em água estéril. O conteúdo de DNA das amostras foi determinado em espectofotômetro a 260nm e confirmado por inspeção visual em gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo usando fragmentos de DNA com concentrações conhecidas ( Invitrogen) . Os plasmídeos foram mantidos a - 20°C até o momento de uso, quando a concentração será ajustada para lμg/μL em PBS.
A Tabela 1 resume os vários plasmídeos utilizados neste estudo:
Tabela 1.
Plasmídeo Plasmídeo de Origem Gene (s) clonado (s) pIL2 pcDNA3.1 IL-2
pgD pRE4 gD
pgDE7 pgD gDE7 (carrega o gene de E7 do HPV- 16 fusionado ao gene de gD de HSV-1)
pVAXgDE7 pVax gDE7 (carrega o gene de E7 do HPV-16 fusionado ao gene de gD de HSV-1)
pgDE7h pUMVC3 gDE7h (carrega o gene sintético que codifica o gene E7 de HPV-16 fusionado ao gene de gD de HSV-1 e possui sequência de códons otimizada para expressão em células de mamíferos
Exemplo 3 : Composições imunogênicas
As composições imunogênicas da presente invenção foram preparadas utilizando os plamídeos descritos na Tabela 1 acima .
A Tabela 2 resume as composições preparadas:
Tabela 2.
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Para cada composição prepararam-se 10 composições com quantidades crescentes de DNA. Para cada composição adicionou-se de 100μg, 50μg, 25μg ou 10μg de DNA diluído em
ΙΟΟμΕ de solução salina (PBS) .
Exemplo 4 : Preparação das células tumorais
A linhagem celular tumoral TC-1 é derivada de células primárias do epitélio pulmonar de C57B1/6 transformadas com v-Has-ras e com os genes de E6 e E7 de HPV-16 (gentilmente cedida pelo Dr. T.C. Wu, Universidade Johns Hopkins, EUA) .
As células TC-1 foram cultivadas em meio D EM suplementado com 2mM L-glutamina, 1 mM piruvato de sódio, 2 mM aminoácidos não essenciais, lOmM tampão HEPES, 50 U/mL penicilina/streptomicina, 10% de soro fetal bovino (SFB) e mantidas a 37°C e 5% de C02. No dia do desafio tumoral as células são tratadas com tripsina, lavadas duas vezes, e ressuspendidas em meio sem soro em concentrações apropriadas para a inoculação.
Exemplo 5 : Imunização dos camundongos e desafio com as células tumorais
Os experimentos de imunização foram realizados com camundongos fêmeas C57BL/6 com idade entre 6-8 semanas adquiridos do Biotério de Camundongos Isogênicos do Departamento de Imunologia da USP, manuseados segundo as normas estabelecidas pela comissão de ética do ICB-USP.
Os camundongos foram inoculados por via subcutânea com das células tumorais TC-1 preparadas conforme descrito no
4
Exemplo 4 na concentração de 5x 10 células/animal. As células foram ressuspendidas em 100 μΐ, de meio' sem soro e inoculadas em uma região dorso-lateral do animal. Para determinar o efeito das composições imunogênicas na regressão de tumores já estabelecidos, os camundongos foram desafiados com as células TC-1 e oito horas depois teve inicio o protocolo vacinai.
As composições imunogênicas descritas no Exemplo 3 foram administradas por via intramuscular. Grupos de 5-10 animais foram vacinados com as composições imunogênicas ou vacinas de DNA por via intramuscular. As doses de cada composição (10μg a 100 μg de DNA diluído em lOO L de PBS) foram inoculadas no músculo tibial anterior de cada pata (50μΙ, por pata) .
O acompanhamento da evolução dos tumores nos ensaios de regressão tumoral foi feito três vezes a cada semana por um período mínimo de 60 dias. Os tumores quando presentes foram medidos com o auxílio de um paquímetro e os animais que apresentaram tumores maiores que 1.5cm de diâmetro foram sacrificados.
a) Ensaio de proteção terapêutica de camundongos C57BL/6 desafiados com células tumorais TC-1 imunizados com uma dose de cada um dos vetores pgD, pIL-2 e pgDE7 isoladamente ou uma, duas ou três doses da composição imunogênica 1 (pgDE7+pIL-2) (Efeito protetor) .
Os animais desafiados com células tumorais TC-1 foram imunizados com uma dose de cada um dos vetores pgD, pIL-2 e pgDE7 isoladamente, ou três doses do vetor pgDE7, ou uma, duas ou três doses da composição imunogênica 1 (pgDE7+pIL-2 ) administrada pela via intramuscular numa concentração por dose de 100 μg ΏΝΑ/ΙΟΟμΙ, οεθ . Os protocolos vacinais tiveram inicio no mesmo dia do desafio com células tumorais TC-1. As composições gue compreendem os vetores pgD e pIL-2 isoladamente não foram capazes de manter os camundongos livres de tumores. O vetor pgDE7 sozinho gerou 70% de proteção após três doses do mesmo e ausência de proteção significativa com uma ou duas doses. Entretanto a composição imunogênica 1 compreendendo os vetores pgDE7 e pIL-2 foi capaz de proteger 100% dos camundongos do desenvolvimento de tumor com a inoculação de uma, duas ou três doses da composição revelando que a combinação de ambos os vetores em uma única formulação imunogênica apresenta uma efeito sinérgico inesperado (Figura 2) .
b) Ensaio de proteção terapêutica de camundongos C57BL/6 desafiados com células tumorais TC-1 e imunizados com uma dose de 10(^g do vetor pIL-2 ou uma dose da composição imunogênica 1 (pgDE7+pIL-2) administrada nas concentrações de lOO g, 5( g, 25 g ou l(^g DNA/100 μΐι/dose (Efeito protetor) .
Os animais desafiados com células tumorais TC-1 foram imunizados com uma dose de 100μg do vetor pIL-2 ou uma dose da composição farmacêutica 1 (pgDE7 e pIL-2) administradas na quantidade de lOOpg, 50μg, 25μς ou 10pg DNA/100μL/dose . Os regimes vacinais tiveram inicio no mesmo dia do desafio com células tumorais TC-1. A composição farmacêutica imunogênica compreendendo os vetores pgDE7 e pIL-2 foi capaz de proteger 100% dos camundongos do desenvolvimento de tumor em dose única com a inoculação de 100μg, 50 g e 25pg ΟΝΑ/100μ]_,/ θ3θ . A inoculação de 10μg de
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protegeu 50% dos camundongos do desenvolvimento de tumores e o vetor pIL-2 isoladamente não foi capaz de manter os camundongos livres tumores (Figura 3) .
c) Ensaio de proteção terapêutica de camundongos C57BL/6 desafiados com células tumorais TC-1 e imunizados com uma dose de lOOpg do vetor pIL-2 ou uma dose da composição imunogênica 1 (pgDE7+pIL-2) administrada na concentração de 5(^g DNA/10(^L/dose administrada no mesmo dia (dia 0) ou 3, 7 , 10 ou 14 dias após o desafio (Efeito protetor) .
Os animais desafiados com células tumorais TC-1 foram imunizados com uma dose de 100 g do vetor pIL-2 ou uma dose da composição imunogênica 1 (pgDE7+pIL-2 ) administrada na concentração de 50μg DNA/100 μΐι/dose administrada no mesmo dia (dia 0) ou 3, 7, 10 ou 14 dias após o desafio. A composição imunogênica compreendendo os vetores pgDE7 e pIL-2 foi capaz de proteger 100% dos camundongos em dose única com a inoculação de 50μg de DNA/dose quando a vacina foi administrada no mesmo dia ou até 3 dias após o desafio. Quando a composição farmacêutica foi inoculada nos dias 7, 10 e 14, os valores de proteção obtidos foram de reduzidos para 60%, 40% e 0% dos camundongos tratados, respectivamente. O vetor pIL-2 isoladamente não foi capaz de conferir qualquer proteção anti-tumoral aos camundongos (Figura 4).
d) Ensaio de proteção terapêutica de camundongos C57BL/6 desafiados com células tumorais TC-1 e imunizados com uma dose de cada um dos vetores pIL-2 e pDE7 isoladamente ou com uma dose da composição imunogênica 1 (pDE7+pIL-2) na concentração de 50 g de DNA/100 μΐι/dose administradas 3 dias após o desafio (Variação do tamanho do tumor) . Os animais desafiados com células tumorais TC-1 foram imunizados com uma dose de cada um dos vetores pIL-2 e pDE7 isoladamente ou com uma dose da composição imunogênica 1 (pgDE7+pIL-2 ) na concentração de 5C^g de DNA/100 μΐ,/dose administradas 3 dias após o desafio. A composição imunogênica compreendendo os vetores pgDE7 e pIL-2 protegeu todos os camundongos e não se observa o desenvolvimento de tumores. O vetor pIL-2 isoladamente não foi capaz de manter os camundongos livres tumores. Neste caso os tumores atingiram tamanhos superiores a 1 cm de diâmetro 32 dias após o desafio. Animais não imunizados atingiram tumores com o mesmo tamanho aproximadamente após 36 dias. Enquanto que camundongos imunizados com uma única dose do vetor pgDE7 desenvolverem tumores com tamanho médio de 0,35 cm ao final do período de observação do experimento (42 dias) . Esses resultados demonstram de forma clara um efeito sinérgico inesperado nos animais imunizados com a composições imunogênica compreendendo os vetores pIL2 e pgDE7 (Figura 5) .
Ensaio de proteção terapêutica de camundongos C57BL/6 desafiados com células tumorais TC-1 e imunizados com uma dose de cada um dos vetores pIL-2 e pVaxgDE7 isoladamente ou com uma dose da composição imunogênica 2 (pVaxgDE7+pIL- 2) na concentração de 50μg de DNA/100 μΐι/dose administradas 3 dias após o desafio (Efeito protetor) . Os animais desafiados com células tumorais TC-1 foram imunizados com uma dose de cada um dos vetores pIL-2 e pVaxgDE7 isoladamente ou com uma dose da composição imunogênica 2 (pVaxgDE7+pIL-2 ) na concentração de 50μg de DNA/100 L/dose administradas 3 dias após o desafio. A composição imunogênica compreendendo os vetores pVaxgDE7 e pIL-2 foi capaz de proteger 100% dos camundongos do desenvolvimento de tumor em dose única. Nas mesmas condições os vetores pIL-2 e pVaxgDE7 isoladamente não foram capazes de manter os camundongos livres tumores. Esses resultados demonstram que os vetores pgDE7 e pVaxgDE7 possuem eficácias anti- tumorais semelhantes. Este resultado mostra que o vetor pVaxgDE7 apresenta o mesmo efeito anti-tumoral do vetor pgDE7 quando combinado com o vetor pIL-2 (Figura 6).
e) Ensaio de proteção terapêutica de camundongos C57BL/6 desafiados com células tumorais TC-1 e imunizados com uma dose de cada um dos vetores pIL-2 e pgDE7 ou pgDE7h isoladamente na concentração de 50pg de DNA/100 μΐι/dose administradas 3 dias após o desafio (Efeito protetor) . Os animais desafiados com células tumorais TC-1 foram imunizados com uma dose de cada um dos vetores pIL-2, pgDE7 ou pgDE7h isoladamente na concentração de 50μg de DNA/100 pL/dose administradas 3 dias após o desafio. 0 plasmideo pgDE7h, que compreende a sequência artificial dos genes de E7 do HPV-16 e de gD do HSV-1 otimizada para melhor expressão em células humanas, protegeu 100% dos camundongos contra o desenvolvimento de tumores em dose única enquanto que, nas mesmas condições experimentais, o plasmideo pgDE7 e o vetor pIL-2 isoladamente não foram capazes de manter os camundongos livres tumores. Estes resultados demonstram que o vetor pgDE7h possui efeito anti-tumoral superior ao obtido com os vetores pgDE7 e pVAXgDE7. Os resultados indicam que o vetor pgDE7h apresenta efeito anti-tumoral aumentado em relação ao vetor pgDE7 mesmo quando administrado sem o vetor pIL-2 (Figura 7) .
f) Ensaio de proteção terapêutica de camundongos C57BL/6 desafiados com células tumorais TC-1 e imunizados com uma dose de cada um dos vetores pIL-2 e pgDE7h isoladamente ou com a composição imunogênica 3 (pgDE7h+pIL-2) (Efeito protetor) . Os animais desafiados com células tumorais TC-1 foram imunizados com uma dose de cada um dos vetores pIL-2 e pgDE7 isoladamente ou uma dose da composição imunogênica 3 (pgDE7h+pIL-2 ) em diversas concentrações de DNA /dose administradas 3 dias após o desafio. A Figura 8 mostra a quantidade mínima do vetor pgDE7h necessária à eficácia terapêutica anti-tumoral máxima da composição imunogênica 3 (pgDE7h+pIL-2 ) . Os animais foram imunizados com uma dose de 50 g DNA/100 L/dose do vetor pIL-2, ou do vetor pgDE7h, ou da composição imunogênica 3 (pgDE7h+pIL-2 ) e com uma dose de 25pg DNA/100 L/dose do vetor pgDE7h ou da composição imunogênica 3 (pgDE7h+pIL-2 ) (Fig. 8A) , ou uma dose de 10pg DNA/100 μΐι/dose do vetor pgDE7h ou da composição imunogênica 3 (pgDE7h+pIL-2 ) ou uma dose de 5pg DNA/100 L/dose do vetor pgDE7h ou da composição imunogênica 3 (pgDE7h+pIL-2) (Fig. 8B) . Quando administrado isoladamente, o vetor pgDE7h foi capaz de proteger todos os animais inoculados com as células tumorais apenas na concentração de 50 g DNA/100pL/dose . Na concentração de 25 g DNA/100pL/dose apenas 40% dos camundongos tratados com 25μq do vetor ficaram livres de tumores. A administração de 10 q ou 5 g DNA/100pL/dose do plasmídeo pgDE7h não foi capaz de manter camundongos livres de tumor. Por outro lado, a composição imunogênica 3 (pgDE7h+pIL-2 ) foi capaz de proteger todos os camundongos do desenvolvimento de tumores quando administrada nas mesmas concentrações de (50pg, 25 g e 10pg de DNA/100pL/dose) Quando administrada na concentração de 5 g DNA/100 L/dose, composição imunogênica 3 (pgDE7h+pIL-2 ) foi capaz de proteger 80% dos animais contra o desenvolvimento de tumores. O vetor pIL-2 isoladamente não foi capaz de manter os camundongos livres tumores nas diferentes concentrações testadas. Estes resultados confirmam os efeitos sinérgicos inesperados advindos da combinação dos vetores pIL-2 e pgDE7h em uma composição imunogênica com propriedades anti-tumorais superiores às composições imunogênicas 1 e 2.
Os resultados apresentados nos Exemplos acima demonstram que a composições imunogênicas 1 (pgDE7 + IL-2) , 2 (pVAXgDE7 + pIL-2) e 3 (pgDE7h + pIL-2) proveram os camundongos com proteção terapêutica total a desafios feitos com as células TC-1 em regime de 1,2 ou 3 doses administrada pela via intramuscular em quantidades que variaram entre 25μg a 100\iq de DNA/100 L/dose .
Vale salientar que a combinação dos vetores que codificam para a proteína E7 com o vetor que codifica IL-2 apresentou efeito sinérgico inesperado uma vez que a administração separada de cada vetor não foi capaz de promover o efeito protetor e, no caso do vetor que codifica para a citocina, apresenta efeito inverso (Figura 5) . É também importante notar que a composição imunogênica 3, que compreende o vetor pgDE7h descrito na presente invenção, que compreende uma sequência genética modificada para expressão otimizada do E7 em células de mamífero, aumentou de forma pronunciada os efeitos terapêuticos desta composição com relação às composições 1 e 2 que compreendem vetores que codificam a sequência natural de E7. Além disto, a combinação do vetor que codifica para a IL-2 com o vetor pgDE7h promoveu efeito sinérgico evidente e aumentou ainda mais o efeito terapêutico anti-tumoral do vetor humanizado. As composições propostas, assim como outras formulações que compreendam simultaneamente plasmideos que expressam a proteína E7 de HPV fusionada à proteína gD de HSV e plasmideos que codifiquem citocinas, representa uma estratégia terapêutica anti-tumoral única.

Claims

REIVINDICAÇÕES
1. Sequência de ácido nucléico isolada que codifica a proteína E7 de HPV fusionada à proteína gD de HSV caracterizada por compreender códons otimizados para a expressão em células de mamífero.
2. Sequência de ácido nucléico isolada de acordo com a reivindicação 1 caracterizada por possuir códons otimizados para a expressão em células humanas.
3. Sequência de ácido nucléico isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2 caracterizada por ser mutada de forma impedir a interação da proteína E7 de HPV com a proteína celular Rb.
4. Sequência de ácido nucléico isolada de acordo com a a reivindicação 3 caracterizada pelo fato de que os amino ácidos das posições 24 e 26 de E7 são mutados .
5. Sequência de ácido nucléico isolada de acordo com a reivindicação 4 caracterizada pelo fato de que a cisteína da posição 24 de E7 é mutada por uma glicina.
6. Sequência de ácido nucléico isolada de acordo com a reivindicação 4 caracterizada pelo fato de que o ácido glutâmico da posição 26 de E7 é mutado por uma glicina.
7. Sequência de ácido nucléico isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 caracterizada pelo fato de o HPV ser HPV-16.
8. Sequência de ácido nucléico isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 caracterizada pelo fato de o HPV ser HPV-18.
9. Sequência de ácido nucléico isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 caracterizada pelo fato de o HPV ser HPV-31.
10. Sequência de ácido nucléico isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 caracterizada pelo fato de o HPV ser HPV-33.
11. Sequência de ácido nucléico isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 caracterizada pelo fato de o HPV ser HPV-35.
12. Sequência de ácido nucléico isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11 caracterizada pelo fato de o HSV ser HSV-1.
13. Sequência de ácido nucléico isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11 caracterizada pelo fato de o HSV ser HSV-2.
14. Sequência de ácido nucléico isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13 caracterizada pelo fato de ser a SEQ ID. No.l.
15. Vetor de expressão caracterizado por codificar qualquer uma das sequências de ácido nucléico isoladas conforme definidas nas reivindicações 1 a 14.
16. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 15 caracterizado por ser a SEQ ID no. 2.
17. Composição imunogênica sinérgica caracterizada pelo fato de compreender um vetor de expressão que codifica a proteína E7 de HPV fusionada à proteína gD de HSV, um vetor de expressão que codifica uma citocina e um veículo farmaceuticamente aceitável.
18. Composição imunogênica sinérgica de acordo com a reivindicação 17 caracterizada pelo fato de o HPV ser HPV- 16.
19. Composição imunogênica sinérgica de acordo com a reivindicação 17 caracterizada pelo fato de o HPV ser HPV- 18.
20. Composição imunogênica sinérgica de acordo com a reivindicação 17 caracterizada pelo fato de o HPV ser HPV- 31.
21. Composição imunogênica sinérgica de acordo com a reivindicação 17 caracterizada pelo fato de o HPV ser HPV- 33.
22. Composição imunogênica sinérgica de acordo com a reivindicação 17 caracterizada pelo fato de o HPV ser HPV- 45.
23. Composição imunogênica sinérgica de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 22 caracterizada pelo fato de o HSV ser HSV-1.
24. Composição imunogênica sinérgica de acordo com a qualquer uma das reivindicações 17 a 22 caracterizada pelo fato de o HSV ser HSV-2.
25. Composição imunogênica sinérgica de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 24 caraterizada pelo fato de que vetor de expressão que codifica a proteína E7 do HPV fusionada à proteína gD de HSV codifica uma sequência de ácido nucléico isolada conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.
26. Composição imunogênica sinérgica de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 24 caraterizada pelo fato de que vetor de expressão que codifica a proteína E7 do HPV fusionada à proteína gD de HSV é um vetor conforme definido em qualquer uma das reivindicações 14 ou 15.
27. Composição imunogênica sinérgica de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 26 caracterizada pelo fato da citocina ser IL-2.
28. Composição imunogênica sinérgica de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 26 caracterizada pelo fato da citocina ser IL-12.
29. Composição imunogênica sinérgica de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 26 caracterizada pelo fato da citocina ser GM-CSF.
30. Composição imunogênica sinérgica de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 29 caracterizada pelo fato de que o veículo farmaceuticamente aceitável é salina.
31. Composição imunogênica sinérgica de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 30 caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente sistemas de liberação sustentada ou controlada, como lipossomos, emulsões lipidicas e/ou micropartículas de PLGA.
32. Composição imunogênica sinérgica de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 31 caracterizada por ser para uso em animais.
33. Composição imunogênica sinérgica de acordo com a reivindicação 32 caracterizada por ser para uso em humanos.
34. Composição imunogênica sinérgica de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 33 caracterizada por ser para administração pelas vias oral, retal, sublingual, tópica, nasal, transdermal, parenteral, subcutânea, intradérmica, mucosa ou intramuscular, intradérmica, mucosa ou intramuscular intravenosa, epidural, irrigação, intramuscular, por bombas de liberação, ou de infusão.
35. Composição imunogênica sinérgica de acordo com A reivindicação 34 caracterizada por ser para administração intramuscular .
36. Uso de uma ou mais composições imunogênicas sinérgicas, conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 17 a 35, caracterizado pelo fato de ser na manufatura de uma vacina para prevenção de tumores induzidos por papilomavirus em animais ou humanos.
37. Uso de uma ou mais composições imunogênicas sinérgicas, conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 17 a 35, caracterizado pelo fato de ser na manufatura de uma vacina para controle de tumores induzidos por papilomavirus em animais ou humanos.
38. Vacina caracterizada por compreender uma ou mais composições imunogênicas sinérgicas conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 17 a 35.
39. Método de prevenção de tumores induzidos por papilomavirus caracterizado por compreender administrar uma ou mais composições imunogênicas sinérgicas conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 17 a 35 a animais ou humanos que delas necessitem.
40. Método de tratamento de tumores induzidos por papilomavirus caracterizado por compreender administrar uma ou mais composições imunogênicas sinérgicas conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 17 a 35 a animais ou humanos que delas necessitem.
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