WO2011024791A1 - レチノイン酸存在下でのｔ細胞集団の製造方法 - Google Patents

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cells
cell
cell population
gene
retinoic acid
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敬章 片山
研輔 酒井
広文 吉岡
高蔵　晃
蝶野　英人
尚紀 齊藤
峰野　純一
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タカラバイオ株式会社
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    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a cell population containing memory T-like cells useful in the medical field, particularly in immunotherapy.
  • the present invention also relates to a method for producing a cell population containing T cells into which a desired gene is introduced with high efficiency, which is useful in the medical field.
  • the present application claims priority to Japanese Patent Application No. 2009-194444 filed on August 25, 2009 and Japanese Patent Application No. 2009-287258 filed on December 18, 2009. Yes, the entire contents of Japanese Patent Application No. 2009-194444 and Japanese Patent Application No. 2009-287258 are incorporated in the present application.
  • lymphocytes The living body is protected from foreign substances mainly by immune response, and the immune system is composed of various cells and soluble factors that it produces. Among them, leukocytes, particularly lymphocytes, play a central role. These lymphocytes are divided into two main types, B lymphocytes (hereinafter sometimes referred to as B cells) and T lymphocytes (hereinafter sometimes referred to as T cells). It recognizes specifically and acts on this to protect the living body.
  • B lymphocytes hereinafter sometimes referred to as B cells
  • T lymphocytes T lymphocytes
  • T cells In the periphery, most of the T cells are CD4 positive T cells having a CD (Cluster of Differentiation) 4 marker and CD8 positive T cells having a CD8 marker. Most of the CD4 positive T cells are called helper T (hereinafter referred to as Th) cells, which are involved in assisting antibody production and induction of various immune responses, and Th1 is different in the type of cytokine produced by antigen stimulation. Differentiate into type or Th2 type. The majority of CD8 positive T cells are cytotoxic T cells that exhibit cytotoxic activity upon antigen stimulation [Tc: cytotoxic T lymphocyte (cytotoxic T lymphocyte), also known as killer T cells, hereinafter referred to as CTL. Tcl type that produces type I cytokines such as interferon- ⁇ (IFN- ⁇ ) and interleukin-2 (IL-2), or type II such as IL-4 and IL-10 Differentiate into Tc2 type that produces cytokines.
  • IFN- ⁇ interferon- ⁇
  • IL-2 inter
  • MHC class I molecules encoded by major histocompatibility complex (hereinafter abbreviated as MHC) (in the case of humans, human leukocyte antigen class I molecules, hereinafter referred to as HLA class I molecules).
  • MHC major histocompatibility complex
  • HLA class I molecules human leukocyte antigen class I molecules
  • TCR T cell receptor
  • Immunotherapy includes the transfer of lymphokine-activated cells, NKT cells, ⁇ T cells, etc. obtained by culturing in various ways from CTLs or peripheral blood lymphocytes induced outside the body, antigen-specific CTLs in the body Dendritic cell transfer therapy, peptide vaccine therapy, and Th1 cell therapy that are expected to be induced, and immunogene therapy methods in which genes that can be expected to have various effects are introduced outside the body and transferred into the body are known.
  • Lymphokine activated cells have cytotoxic activity obtained by adding IL-2 to peripheral blood (peripheral blood leukocytes) including lymphocytes, umbilical cord blood, tissue fluid, etc., and culturing in vitro for several days. It is a functional cell population. At this time, proliferation of LAK cells is further accelerated by culturing with the addition of an anti-CD3 antibody. The LAK cells thus obtained have non-specific cytotoxic activity against various cancer cells and other targets.
  • fibronectin is a problem regarding how to maintain cytotoxic activity when antigen-specific CTLs induced outside the body are expanded and how efficiently lymphocytes can be expanded outside the body. Or the effect by using the fragment has been examined (for example, patent documents 1-3).
  • Memory T cells are distinguished from naive T cells by analysis of their cell surface antigens. Furthermore, memory T cells can be distinguished from naive T cells by their functional differences. That is, memory T cells can differentiate into effector cells earlier with weaker antigen stimulation than naive T cells (Non-patent Document 1). Furthermore, effector cells differentiated from memory T cells are functionally different from naive T cells in that one cell can simultaneously produce a plurality of cytokines. However, the molecular mechanism of memory T cell differentiation is unknown. Memory T cells include two different cell populations called central memory T cells and effector memory T cells due to differences in homing ability or effector function (Non-patent Document 2).
  • Non-Patent Documents 3 and 4 In recent years, it has been reported that in immunotherapy, a much higher therapeutic effect can be expected when na ⁇ ve T cells or central memory T cells in an undifferentiated state are administered to a living body than effector T cells that have already been terminally differentiated.
  • TCR gene that recognizes a target antigen for example, by introducing a TCR gene that recognizes a target antigen into T cells such as CTLs, it can be expected that a specific cytotoxic activity is imparted to the target antigen. Based on this, gene therapy using TCR genes targeting various antigens such as MART1, gp100, and mHAG HA-2 antigen has been attempted.
  • receptors to be introduced into T cells human-derived TCRs, TCRs derived from organisms other than humans, and antigen recognition sites of antibodies that recognize target antigens, molecular groups that associate with TCRs to form antigen recognition complexes
  • Gene therapy has been attempted with genes that encode chimeric receptors (eg CD3), T cell surface antigens (eg CD8, CD28) and combinations of these, and portions thereof.
  • retroviral vectors for example, replication-defective retroviral vectors.
  • a retrovirus vector is a preferable gene introduction means for gene therapy in which gene expression over a long period of time is desired because it efficiently introduces a target foreign gene into a cell and stably integrates it into its chromosomal DNA.
  • Fibronectin is a huge glycoprotein with a molecular weight of 250,000 that exists in the blood of animals, on the cell surface, and in the extracellular matrix of tissues, and is known to have various functions.
  • a gene introduction method using a functional substance such as fibronectin or a fragment thereof enables gene introduction with high efficiency without co-culture of retrovirus-producing cells and target cells (for example, Patent Document 4). ).
  • the improvement in gene transfer efficiency by this method is thought to be due to the fact that the functional substance co-arranges the retrovirus and the target cell in close proximity and the opportunity for interaction between the two increases.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a cell population containing a high amount of memory T-like cells characterized by culturing in the presence of retinoic acids, which is suitable for use in medicine such as immunotherapy of cancer, and the method.
  • the object is to provide a cell population effective for administration to a living body.
  • the present inventors cultivated a cell population containing T cells or T cell progenitor cells in vitro using retinoic acids and CD3 ligand, The present inventors have found that not only a desired gene can be introduced and expressed at high efficiency in the cell population obtained in the culture process, but also a cell population containing a high amount of memory T-like cells can be obtained. It was.
  • the first aspect of the present invention includes the step of culturing a cell population containing T cells or T cell progenitor cells in vitro using retinoic acids and CD3 ligand. To a method for producing a cell population containing memory T-like cells.
  • the method of culturing a cell population containing T cells or T cell progenitor cells in vitro is one of the steps selected from (1) to (3) Are also included in the method for producing a cell population containing memory T-like cells of the present invention.
  • culturing a cell population containing T cells or T cell progenitor cells in the presence of retinoic acids and CD3 ligand (1) culturing a cell population containing T cells or T cell progenitor cells in the presence of retinoic acids and CD3 ligand; (2) culturing a cell population containing T cells or T cell progenitor cells in the presence of retinoic acids and CD3 ligand, and then culturing the cell population in the absence of retinoic acids and CD3 ligand, or (3) A step of culturing a cell population containing T cells or T cell progenitor cells in the presence of CD3 ligand and in the absence of retinoic acids, and then culturing the cell population in the presence of retinoic acids.
  • the step of culturing a cell population containing T cells or T cell progenitor cells in vitro may be performed in the presence of fibronectin or a fragment thereof or a mixture thereof.
  • the cell population containing T cells or T cell progenitor cells may be peripheral blood mononuclear cells, and further comprises a step of selectively recovering memory T-like cells from the obtained cell population.
  • a cell population for cell therapy that can rapidly differentiate into cells having cytotoxic activity in response to weak antigen stimulation.
  • the second aspect of the present invention relates to the cell population produced in the first aspect of the present invention.
  • a third aspect of the present invention relates to a method for producing a cell population into which a desired gene has been introduced, comprising the following steps: (A) a step of culturing a cell population containing T cells or T cell progenitor cells in vitro using retinoic acids and a CD3 ligand, and (b) in the middle of step (a) or in step (a) A step of introducing a desired gene into a cell population after completion.
  • the third aspect of the present invention includes a production method carried out by any of the following steps (1) to (3): (1) culturing a cell population containing T cells or T cell progenitor cells in the presence of retinoic acids and CD3 ligand, and introducing a desired gene into the obtained cells; (2) After culturing a cell population containing T cells or T cell progenitor cells in the presence of retinoic acids and CD3 ligand and introducing a desired gene into the obtained cell population, retinoic acids and CD3 ligand Culturing the cell population in the absence, or (3) culturing a cell population containing T cells or T cell progenitor cells in the presence of CD3 ligand and in the absence of retinoic acids, and obtaining the resulting cell population A step of culturing the cell population in the presence of retinoic acids after introducing a desired gene.
  • the step of culturing a cell population containing T cells or T cell progenitor cells in vitro may be performed in the presence of fibronectin or a fragment thereof or a mixture thereof.
  • a method in which a desired gene is introduced by a retroviral vector, or a method in which a desired gene is introduced in the presence of fibronectin, a fragment thereof, or a mixture thereof is also a cell population into which the desired gene of the present invention has been introduced. It is included in the manufacturing method.
  • the desired gene may be a gene encoding a receptor that recognizes an antigen, and the receptor that recognizes an antigen may be a T cell receptor.
  • a method in which the cell population containing T cells or T cell progenitor cells is a peripheral blood mononuclear cell is also included in the method for producing a cell population into which a desired gene of the present invention has been introduced.
  • a cell population for cell medicine in which the ratio of memory T-like cells is increased and a desired gene is introduced and expressed at high efficiency.
  • the fourth aspect of the present invention relates to a T cell population into which a desired gene has been introduced, obtained by the third aspect of the present invention.
  • a method for producing a population of cells is provided.
  • the cell population obtained by the production method is extremely useful for the treatment of diseases caused by cell therapy.
  • FIG. 1 It is a figure which shows the measurement result of the perforin production cell rate of a CD8 single positive cell. It is a figure which shows the specific cytotoxic activity with respect to the MAGE-A4 origin peptide p143 of a gene transfer cell. It is a figure which shows the tetramer positive cell ratio of the CD8 single positive cell, ie, the transgene expression rate. It is the figure which showed the expression level of the tetramer in the tetramer positive and CD8 single positive cell by the value of average fluorescence intensity. It is a figure which shows the copy number of the transgene in a gene transfer cell. It is a figure which shows distribution of the cell surface marker of the CD4 single positive cell of the 10th day.
  • FIG. 1 shows the measurement result of the perforin production cell rate of a CD8 single positive cell. It is a figure which shows the specific cytotoxic activity with respect to the MAGE-A4 origin peptide p143 of a gene transfer cell. It is
  • FIG 3 is a graph showing the measurement results of IL-4 production and IFN- ⁇ non-producing cell rate, IL-4 production and IFN- ⁇ producing cell rate, and IL-4 non-producing and IFN- ⁇ producing cell rate of CD4 single positive cells. . It is a figure which shows the measurement result of IL-4 production of a CD4 single positive cell, and an IFN-gamma production cell rate. It is a figure which shows the ratio of the IL-4 production and IFN- ⁇ non-producing cell rate (Th2) of the CD4 single positive cell and the IL-4 non-producing and IFN- ⁇ producing cell rate (Th1).
  • retinoic acid is also called vitamin A acid, which is either all-trans-retinoic acid in which all double bonds in the chain are trans or 9-cis-retinoic acid in which the 9-position has a cis structure. Good. Other retinoic acid isomers and retinoic acid derivatives can also be used in the present invention. The above-mentioned retinoic acid, retinoic acid isomers and retinoic acid derivatives or their salts are generically referred to herein as retinoic acids. Furthermore, in the present invention, one type of retinoic acid may be used, or a plurality of types may be used in combination.
  • T cells are also called T lymphocytes, mean cells derived from the thymus among lymphocytes involved in immune responses, and include differentiated T cells and undifferentiated T cells.
  • T cells include helper T cells, suppressor T cells, killer T cells, naive T cells, memory T cells, ⁇ T cells that express ⁇ and ⁇ chain TCRs, and ⁇ T cells that express ⁇ and ⁇ chain TCRs. Etc. are known.
  • the “cell population containing T cells or T cell progenitor cells” is not particularly limited, but includes peripheral blood mononuclear cells (PBMC), naive T cells, hematopoietic stem cells, umbilical cords Examples include blood mononuclear cells.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • naive T cells hematopoietic stem cells
  • umbilical cords examples include blood mononuclear cells.
  • various cell populations derived from blood cells containing T cells can be used in the present invention. These cells may be activated in vivo (in vivo) or ex vivo (ex vivo) by cytokines such as IL-2. As these cells, those collected from a living body or those obtained through in vitro culture may be used as they are, or may be used after being cryopreserved.
  • a cell population obtained by various induction operations or separation operations from a cell population obtained from a living body for example, a cell such as PBMC is obtained by separating into CD8 + (positive) or CD4 + (positive) cells. Any given cell population can be used.
  • a material containing the cells for example, blood such as peripheral blood or umbilical cord blood, or blood from which components such as red blood cells or plasma are removed, bone marrow fluid, or the like is used. You can also.
  • Memory T cells are a specific type of T cells that can recognize foreign invaders such as bacteria or viruses encountered in previous infections or vaccinations. During the second encounter with the intruder, the memory T cells initiate a strong immune response faster than when the immune system first responded to the intruder.
  • Memory T cells contain two different cell populations, a central memory T cell and an effector memory T cell, due to differences in homing ability or effector function (Non-patent Document 2).
  • Central memory T cells are thought to exhibit properties as memory stem cells and exhibit self-renewal capacity by high-level phosphorylation of an important transcription factor known as STAT5.
  • Central memory T cells are negative for CD45RA but positive for both CCR7 and L-selectin (CD62L). Effector memory T cells are also negative for CCR7 and CD62L in addition to CD45RA.
  • Memory T cells are distinguished from naive T cells by analysis of their cell surface antigens.
  • Naive T cells are positive for cell surface antigen markers CD45RA, CCR7 and CD62L, whereas memory T cells consisting of central memory T effector memory T cells are negative for CD45RA.
  • memory T cells can be distinguished from naive T cells from the viewpoint of being able to initiate an immune response rapidly as described above.
  • memory T-like cells include both central memory T-like cells and effector memory T-like cells.
  • production of a cell population containing memory T-like cells means induction of memory T-like cells from progenitor cells capable of differentiating into memory T-like cells and proliferation (expansion culture) of memory T-like cells. ). According to the present invention, a cell population containing a high ratio of memory T-like cells can be obtained.
  • fibronectin and fragments thereof may be isolated from nature, artificially prepared, or recombinantly prepared by genetic engineering, that is, non-natural. Fibronectin and its fragments are described in, for example, Ruoslati E. [Ruoslahti E. et al. , Et al. , Journal of Biological Chemistry, Vol. 256, No. 14, pp. 7277-7281 (1981)], manufactured in a substantially pure form from a naturally occurring substance. can do.
  • Ruoslati E. Ruoslahti E. et al. , Et al. , Journal of Biological Chemistry, Vol. 256, No. 14, pp. 7277-7281 (1981)
  • substantially pure fibronectin or fibronectin fragment means that they are essentially free of other proteins that are naturally present with fibronectin.
  • the above fibronectin and fragments thereof can be used in the present invention alone or in combination with a plurality of types.
  • the domain structure of fibronectin is divided into seven, and the amino acid sequence includes three kinds of similar sequences, and the whole is constituted by repetition of these sequences. Three similar sequences are called type I, type II and type III, respectively.
  • the 12th, 13th and 14th (hereinafter referred to as III-12, III-13 and III-14, respectively) are contained in the heparin binding domain.
  • a region called IIICS exists on the C-terminal side of the heparin-binding domain.
  • IIICS has a region called CS-1, which consists of 25 amino acids and has binding activity to VLA-4.
  • the fibronectin fragment that can be used in the present invention may be a fragment containing any domain of III-7, 8, 9, 11, 12, 13 or CS-1, and is a fragment in which a plurality of domains are repeatedly linked. There may be.
  • a fragment containing a cell adhesion domain containing a ligand for VLA-5, a heparin binding domain, a CS-1 domain that is a ligand for VLA-4, and the like is used in the present invention.
  • Examples of the recombinant fragment include CH-271 (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing) described in Journal of Biochemistry, Vol.
  • CH- Examples include 296 (SEQ ID NO: 2 in the sequence listing), H-271 (SEQ ID NO: 3 in the sequence listing), H-296 (SEQ ID NO: 4 in the sequence listing), or derivatives or modifications thereof.
  • the aforementioned CH-296 is commercially available under the name of Retronectin (registered trademark, manufactured by Takara Bio Inc.).
  • active ingredient means retinoic acids, CD3 ligand, fibronectin or a fragment thereof or a mixture thereof, other costimulatory factors, appropriate compounds that can be contained in a medium used for culturing cells, proteins , Cytokines or other components.
  • the method for producing a cell population containing a memory T-like cell of the present invention comprises a step of culturing a cell population containing a T cell in vitro using retinoic acids and a CD3 ligand. is there. According to the present invention, it is possible to produce a cell population containing memory T-like cells in vitro. Furthermore, the memory T-like cells contained in the cell population obtained by the method have the ability to rapidly differentiate into cells having cytotoxic activity (cytotoxic lymphocytes) in response to weak antigen stimulation. It is suitable for use in immunotherapy.
  • cytotoxic activity cytotoxic lymphocytes
  • memory T-like cells are usually cultured in a medium containing a predetermined component in the presence of the effective component of the present invention.
  • the number of cells at the start of the culture used in the present invention is not particularly limited. For example, 10 to 1 ⁇ 10 8 cells / mL, preferably 10 2 to 5 ⁇ 10 7 cells / mL, more preferably Is 10 3 to 2 ⁇ 10 7 cells / mL.
  • the medium used in the method for producing a cell population containing a memory T-like cell of the present invention is not particularly limited as long as it contains an active ingredient, and is mixed with components suitable for the maintenance and growth of T cells or their precursor cells.
  • a commercially available medium or a modification thereof may be used. These media may contain appropriate proteins, cytokines or other components in addition to the original components.
  • a medium containing IL-2 can be used in the production method of the present invention.
  • the concentration of IL-2 in the medium is not particularly limited. For example, it is preferably 0.1 to 1 ⁇ 10 5 IU / mL, more preferably 1 to 1 ⁇ 10 4 IU / mL.
  • the concentration of the retinoic acid used in the present invention as an active ingredient in the medium is not particularly limited, but when all-trans-retinoic acid is used, for example, preferably 0.01 to 10 4 nM, more preferably is 0.1 ⁇ 10 3 nM in the case of using the 9-cis-retinoic acid, for example, preferably, 0.1 ⁇ 10 5 nM, and more preferably from 1 ⁇ 10 4 nM.
  • the CD3 ligand used in the present invention as an active ingredient is not particularly limited as long as it is a substance having a binding activity to CD3, and examples thereof include anti-CD3 antibody, ConA, PHA, PMA + ionomycin and the like.
  • an anti-CD3 monoclonal antibody such as OKT3 [Science, 206, 347-349 (1979)] is used in the present invention.
  • the concentration of the CD3 ligand in the medium is not particularly limited. For example, when an anti-CD3 monoclonal antibody is used, 0.001 to 100 ⁇ g / mL, particularly 0.01 to 100 ⁇ g / mL is preferable.
  • an anti-CD3 antibody may be added to the medium.
  • fibronectin or a fragment thereof or a mixture thereof may be added as an active ingredient.
  • concentration of fibronectin or a fragment thereof or a mixture thereof in the culture is not particularly limited, but for example, 0.001 to 500 ⁇ g / mL, particularly 0.01 to 500 ⁇ g / mL is suitable. Cultivation in the presence of fibronectin or a fragment thereof or a mixture thereof may be carried out only in a part of the culturing step in the present invention, or the whole cultivation may be carried out in the presence of the above components.
  • a lymphocyte stimulating factor such as lectin can also be added to the medium.
  • concentration of the component in the medium is not particularly limited as long as a desired effect is obtained.
  • a costimulatory can be introduced by adding other costimulatory factors such as CD28 ligand.
  • costimulatory factors include a desired antigen, glucocorticoid-induced TNF-related receptor ligand (GITRL), anti-CD28 antibody, anti-CD80 antibody, and anti-CD86 antibody.
  • CD3 ligand and fibronectin or a fragment thereof or a mixture thereof are not only dissolved and coexisting in a medium, but also suitable solid phases such as petri dishes, flasks, bags, etc. It may be used by immobilizing it on cell culture equipment (including both open and closed systems), or cell culture carriers such as beads, membranes, and slide glasses.
  • the material of the solid phase is not particularly limited as long as it can be used for cell culture.
  • the component is immobilized on the device, the device is prepared so that when the medium is placed in the device, the ratio is the same as the desired concentration when the component is dissolved in the medium.
  • the amount of the component to be fixed is not particularly limited as long as a desired effect is obtained.
  • the carrier is used by immersing it in a culture solution in a cell culture equipment during cell culture.
  • the amount of medium to be placed in the equipment so that the ratio is the same as the desired concentration when the component is dissolved in the medium.
  • the amount of immobilization of the component is not particularly limited as long as a desired effect is obtained.
  • the immobilization of the components is performed according to a known method, for example, a fibronectin fragment immobilization method described in WO 97/18318 and WO 00/09168. be able to.
  • active ingredients other than “CD3 ligand” and “fibronectin or a fragment thereof or a mixture thereof” may be immobilized on a cell culture device or a cell culture carrier.
  • the medium used in the present invention may contain cytokines, appropriate proteins or other components in addition to the above active ingredients.
  • cytokines include IL-7, IL-15, IL-21 and the like.
  • a lymphocyte stimulating factor such as lectin can also be added.
  • a medium containing no serum or plasma can be used, but serum or plasma may be added to the medium.
  • the amount added to these media is not particularly limited, but a content of more than 0 to 20% by volume, preferably more than 0 to 5% by volume is exemplified, and serum or plasma used depending on the culture stage The amount of can be changed.
  • the serum or plasma concentration can be decreased in stages and used.
  • the origin of serum or plasma may be either self (meaning that the origin is the same as the cell to be cultured) or non-self (meaning that the origin is different from the cell to be cultured). From this point of view, self-derived ones are preferably used.
  • the number of cells at the start of the culture used in the present invention is not particularly limited, but is preferably 10 to 1 ⁇ 10 8 cells / mL, more preferably 10 2 to 5 ⁇ 10 7 cells / mL, for example. More preferably, 10 3 to 2 ⁇ 10 7 cells / mL are exemplified.
  • the conditions normally used for cell culture can be used. For example, it can be cultured in conditions such as 37 °C, 5% CO 2.
  • operations such as dilution by adding a fresh medium to the cell culture medium at an appropriate time interval, exchanging the medium, and exchanging the cell culture equipment can be performed.
  • a cell culture equipment used in the manufacturing method of the cell population of this invention For example, a petri dish, a flask, a bag, a large culture tank, a bioreactor etc. can be used.
  • a bag a CO 2 gas permeable bag for cell culture can be used.
  • a large culture tank can be used.
  • cultivation can be implemented in any of an open system or a closed system, it is preferable to culture by a closed system from a viewpoint of the safety
  • the timing of adding retinoic acids to the cell culture medium containing T cells or T cell progenitor cells is preferably from the beginning of the culture.
  • the culturing step in the presence of retinoic acids and CD3 ligand is carried out for at least 1 day, more preferably 2 to 7 days, still more preferably 2 to 5 days from the beginning of the culture.
  • retinoic acids may be decomposed in the culture solution, retinoic acids may be newly added after an appropriate time.
  • the conditions used for normal cell culture can be used.
  • it can be cultured under conditions such as 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the medium can be replaced with a fresh one at an appropriate time interval.
  • the cell population obtained by the production method of the present invention has a high content of cells that do not express CD45RA but express CCR7 and / or CD62L, and cells that are negative for both CCR7 and CD62L.
  • CD45RA, CCR7 and CD62L are all cell surface antigen markers for lymphocytes. That is, cells contained in a high ratio in the cell population obtained by the production method of the present invention can be classified as memory T-like cells. As described in Non-Patent Documents 3 and 4 above, memory T cells have a high survival rate, cell proliferation effect, tumor accumulation effect and tumor-specific effector cell production rate when administered to a living body. It is described that it is useful in the field of cell medicine.
  • the production method of the present invention can increase the ratio of memory T-like cells.
  • the increase in the ratio of memory T-like cells is obtained by culturing in the presence of the active ingredient used in the method of the present invention when culturing is performed under the same conditions except for the presence or absence of the active ingredient of the present invention.
  • the ratio of memory T-like cells in the obtained cell population is high compared to culture in the absence of the active ingredient.
  • a cell population having a high ratio of memory T-like cells of 5% or more, more preferably 10% or more can be obtained as compared to the case in the absence of the aforementioned components.
  • the cell population obtained by the production method of the present invention contains a high amount of Tc2-type and / or Th2-type phenotype cells.
  • the cell population obtained by the production method of the present invention may be further cultured in a medium containing or not containing retinoic acids. Usually, this culture is carried out in the absence of CD3 ligand.
  • the total number of culture days is preferably 4 to 14 days, more preferably 5 to 14 days, and even more preferably 7 to 14 days.
  • cells other than memory T-like cells are usually also mixed.
  • cells are collected from the cell population by centrifugation or the like, and can be used, for example, as the memory T-like cells obtained by the production method of the present invention.
  • the active ingredient or the like is immobilized on a cell culture device or the like, contamination of the active ingredient or the like into the obtained memory T-like cells can be prevented.
  • the production method of the present invention may further include a step of separating memory T-like cells from the cell population. That is, in the present invention, a cell population enriched with memory T-like cells is prepared by subjecting cells other than memory T-like cells to memory T-like cells in the cell population containing memory T-like cells. And can be used. For example, a step of removing CD45RA positive cells may be included. Separation of memory T-like cells can be performed according to a known method. For example, using a flow cytometer, memory T-like cells are separated by selectively recovering CD3-positive and CD45RA-negative cells that are sorted by co-staining with fluorescently labeled anti-CD3 antibody and anti-CD45RA antibody. be able to.
  • the cell population containing a high amount of memory T-like cells in the present invention may include a cell population containing only memory T-like cells.
  • a method for producing a cell population into which a desired gene has been introduced using the “method for producing a cell population” described above includes the following steps: (1) a step of culturing a cell population containing T cells or T cell progenitor cells in vitro using retinoic acids and CD3 ligand; and (2) a desired gene was obtained in step (1). Introducing into a cell population.
  • the efficiency of gene transfer into T cells is improved by performing the gene transfer operation after the first step. That is, the cell population produced by the method of the present invention is a cell population containing a high ratio of T cells into which a desired gene has been introduced.
  • the present invention is particularly useful for the production of cells for gene therapy.
  • the desired gene to be introduced into the T cell is not particularly limited, and any gene desired to be introduced into the cell can be selected from a self-derived gene or a foreign gene.
  • a gene for example, a gene encoding an antisense nucleic acid, siRNA (small interfering RNA) or ribozyme can be used in addition to a gene encoding a protein (for example, an enzyme, cytokines, receptors, etc.).
  • an appropriate marker gene that enables selection of the transfected cell may be introduced together with the gene.
  • the desired gene to be introduced may have been obtained from nature, or may have been genetically engineered, or may be a DNA molecule of different origin bound by a known means such as ligation. Also good. Furthermore, it may have a sequence in which a mutation is introduced into a natural sequence depending on the purpose.
  • a gene encoding an enzyme related to resistance to a drug used for treatment of a patient such as cancer can be introduced into lymphocytes to impart drug resistance to the lymphocytes.
  • lymphocytes If such lymphocytes are used, it is possible to combine adoptive immunotherapy and drug therapy, thereby obtaining a higher therapeutic effect.
  • An example of the drug resistance gene is a multidrug resistance gene.
  • a gene that imparts sensitivity to a specific drug can be introduced into lymphocytes to impart sensitivity to the drug. In such a case, it becomes possible to remove lymphocytes after transplantation into a living body by administration of the drug.
  • a gene that confers sensitivity to a drug is a thymidine kinase gene.
  • one embodiment of the present invention includes introduction of a gene encoding a receptor that recognizes a desired antigen.
  • the gene includes a gene encoding a T cell receptor (TCR) that recognizes the surface antigen of the target cell, or a chimeric receptor having an antigen recognition site of an antibody against the surface antigen of the target cell and including an intracellular region of the TCR The gene which codes is illustrated.
  • a cell population containing T cells into which this gene has been introduced is a cell population containing T cells that recognize a desired antigen.
  • the cell population is a cell population with high specificity for a desired antigen as compared to a cell population into which a gene encoding a receptor is not introduced, and is specific to a desired antigen when stimulated by the desired antigen. It is useful for use in immunotherapy because it can respond to the disease.
  • the first step is performed according to the above-mentioned “Method for producing a cell population containing memory T-like cells”.
  • the culture in the first step is performed for at least 1 day or more, more preferably 2 to 7 days, and further preferably 2 to 5 days, and then the second step described later is performed.
  • the obtained cell population has an increased ratio of memory T-like cells, a decreased ratio of cells that specifically produce IFN- ⁇ , and IL-4. And a cell population containing a high content of Tc2 type and / or Th2 type cells with an improved ratio of cells producing perforin.
  • This cell population is very suitable for use in the field of cell medicine because it is useful for immune response to parasitic infections through enhancement of humoral immunity and GVHD reduction and GVL enhancement in organ transplantation.
  • the rate of causing graft-versus-host disease is compared with Tc1 cells or Th1 cells. Therefore, the cell population of the present invention is useful [Fowler D. et al. H. 1 other, Leukemia and Lymphoma, Vol. 38, pp. 221-234 (2000)].
  • the second step is a step of introducing a desired gene into the cells obtained in the first step.
  • the number of desired genes to be introduced into the cell is not limited, and may be one gene or a plurality of genes (for example, 1 to 9 genes).
  • an appropriate gene such as a gene encoding a T cell surface antigen can be introduced simultaneously, in advance or later, depending on the cell to be introduced.
  • the means for introducing a desired gene is not particularly limited, and an appropriate one can be selected and used by a known gene introduction method.
  • the gene introduction method any of a method using a viral vector and a method not using the vector can be used in the present invention. Much literature has already been published about the details of these methods.
  • the viral vector is not particularly limited, and is a known viral vector commonly used in gene transfer methods, such as retroviral vectors (including lentiviral vectors and pseudotype vectors), adenoviral vectors, adeno-associated viral vectors, and simian.
  • retroviral vectors including lentiviral vectors and pseudotype vectors
  • adenoviral vectors adeno-associated viral vectors
  • simian adeno-associated viral vectors
  • Viral vectors, vaccinia virus vectors, Sendai virus vectors and the like can be used.
  • retroviral vectors, adenoviral vectors or lentiviral vectors are used.
  • those lacking replication ability are preferable so that they cannot self-replicate in infected cells.
  • the present invention is not limited as a gene introduction method without using a viral vector, for example, a method using a carrier such as a liposome or a ligand-polylysine, a calcium phosphate method, an electroporation method, a particle gun method or the like is used. be able to. In this case, a foreign gene incorporated into plasmid DNA, linear DNA or RNA is introduced.
  • Retrovirus vectors and lentiviral vectors can stably incorporate a foreign gene inserted into the chromosomal DNA of a cell into which the vector is introduced, and are used for gene therapy and other purposes. Since the vector can infect cells that are dividing and proliferating, it is particularly suitable for gene transfer by the production method of the present invention.
  • the desired gene can be used by being inserted into a vector or a plasmid so that it can be expressed under the control of an appropriate promoter, for example.
  • promoters or other regulatory elements that cooperate with the transcription initiation site such as enhancer sequences or terminator sequences, may be present in the vector.
  • vectors examples include MFG vectors, ⁇ -SGC vectors (International Publication No. 92/07943 pamphlet), pBabe [Morgenstern J., et al. P. , Land H. Retrovirus vectors such as Nucleic Acids Research, Volume 18, No. 12, pages 3587-3596 (1990)], pLXIN (Clontech), pDON-AI (Takara Bio)
  • lentiviral vectors [human immunodeficiency virus (HIV) -derived vectors, simian immunodeficiency virus (SIV) -derived vectors, etc.], or vectors obtained by modifying these.
  • vectors are also known packaging cell lines such as PG13 (ATCC CRL-10686), PG13 / LNc8 (ATCC CRL-10585), PA317 (ATCC CRL-9078), GP + E-86 (ATCC CRL-9642).
  • packaging cell lines such as PG13 (ATCC CRL-10686), PG13 / LNc8 (ATCC CRL-10585), PA317 (ATCC CRL-9078), GP + E-86 (ATCC CRL-9642).
  • a cell line such as ⁇ CRIP described in GP + envAm12 (ATCC CRL-9641), Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, Vol. 85, pp. 6460-6464 (1988)can be prepared as packaged virus particles.
  • retrovirus-producing cells can be prepared using 293 cells or 293T cells with high transfection efficiency.
  • a retrovirus produced by pseudotype packaging having an envelope derived from a virus different from that from which the genome of the retrovirus is derived can also be used.
  • a pseudo-type retrovirus having a protein that can function as an envelope or envelope derived from Moloney murine leukemia virus (MoMLV), gibbon leukemia virus (GaLV), vesicular stomatitis virus (VSV), or feline endogenous virus (feline endogenous virus) can be used.
  • a retrovirus having a protein having a sugar chain modified on its surface, produced using a retrovirus-producing cell into which an enzyme gene involved in sugar chain synthesis has been introduced can also be used in the present invention.
  • Said viruses can be prepared using packaging cells that express the respective envelope.
  • Various packaging cells have been reported and some are commercially available. These known packaging cells can be used in the present invention.
  • the functional substance having retrovirus binding activity used in the method is not particularly limited, and examples thereof include fibronectin heparin-II binding region, fibroblast growth factor, type V collagen, and the above-mentioned polypeptide.
  • the fibronectin fragment preferably has a heparin-II binding region in the molecule, and such a fragment is also described in WO95 / 26200 and WO97 / 18318.
  • CH-296 which is a fibronectin fragment having a heparin-II binding region
  • Retronectin registered trademark, manufactured by Takara Bio Inc.
  • substances functionally equivalent to these functional substances for example, functional substances having a heparin-binding site can also be used.
  • a mixture of the functional substance, a polypeptide containing the functional substance, a polymer of the functional substance, a derivative of the functional substance, and the like can also be used.
  • a functional substance having target cell binding activity may be used in combination.
  • the substance is useful for improving the efficiency of gene introduction into target cells or for carrying out gene introduction specific to target cells.
  • the functional substance having the target cell binding activity is not particularly limited.
  • it is a substance having a ligand that binds to the target cell.
  • a cell adhesive protein fibronectin, laminin, collagen, etc.
  • fragments thereof hormones, cytokines, antibodies to cell surface antigens, polysaccharides, glycoproteins, glycolipids, glycoproteins, sugar chains derived from glycolipids, metabolites of target cells, and the like.
  • a polypeptide containing the functional substance a polymer of the functional substance, a derivative of the functional substance, a functional equivalent of the functional substance, and the like can also be used.
  • the functional substance having the target cell binding activity can be used by being immobilized on a solid phase in the same manner as the functional substance having a retrovirus binding activity.
  • what has a target cell binding activity together as said functional substance which has the said retrovirus binding activity can also be used.
  • gene transfer into a cell population containing T cells can be efficiently performed by the method of the present invention in which gene transfer is performed after culturing in the presence of the above-mentioned active ingredient containing retinoic acids. It becomes.
  • the method of the present invention does not require any special equipment or apparatus, and is effective for various retroviral vectors and target cells. Furthermore, since the method is suitable for use in a closed system, it is very useful in clinical applications such as gene therapy.
  • the method for producing a cell population of the present invention may further include a step of culturing the gene-transferred cell obtained in the second step as the third step.
  • the above steps may be performed by a normal cell culture method, for example, a known T cell culture method.
  • the cells may be cultured in
  • the total number of culture days is preferably 4 to 14 days. When the total number of culture days is less than 4 days, it is not possible to obtain a sufficient number of cells for use in general immunotherapy. In addition, when the total number of culture days exceeds 14 days, the cell growth rate decreases. In the present invention, the total number of culture days is more preferably 5 to 14 days, still more preferably 7 to 14 days.
  • Method for producing cell population containing memory T-like cells-2 The present inventors have surprisingly produced the above-mentioned “Method for Producing Cell Population Containing Memory T-like Cells-1” by the above-mentioned method by culturing at different retinoic acid addition times. It was found that a cell population containing a high amount of Tc1 type and / or Th1 type cell can be produced instead of a cell population containing a high content of Tc2 type and / or Th2 type cells.
  • the manufacturing method includes the following steps.
  • step (1) a step of culturing a cell population containing T cells or T cell progenitor cells in the presence of CD3 ligand and in the absence of retinoic acid, and (2) cells obtained in step (1) Culturing the population in vitro in the presence of retinoic acids.
  • the first step is a step of culturing a cell population containing T cells or T cell progenitor cells in the presence of CD3 ligand in vitro, and retinoic acids used as an active ingredient Except for the use, the procedure is carried out according to the above-mentioned “Method for producing cell population containing memory T-like cells-1”.
  • the culture in the first step is performed in the second step, ie, the first step, which will be described later, after being performed for at least 1 day or more, more preferably 2 to 7 days, and even more preferably 2 to 5 days. And culturing the cell population in vitro in the presence of retinoic acids.
  • the culture in the second step is performed for at least 1 day or more, more preferably 2 to 10 days, and further preferably 3 to 9 days.
  • the cell population obtained has an increased ratio of memory T-like cells, a decreased ratio of cells that specifically produce IL-4, and an increased ratio of cells that produce IFN- ⁇ and perforin.
  • the second step may be performed according to a normal cell culture method, for example, a known T cell culture method, except that it is performed in the presence of retinoic acids.
  • a normal cell culture method for example, a known T cell culture method, except that it is performed in the presence of retinoic acids.
  • Cells may be cultured under the same conditions as those described above.
  • retinoic acids may be decomposed in the culture solution, retinoic acid may be newly added after an appropriate period of time, or the medium may be replaced with a fresh one at an appropriate time interval. Good.
  • gene-transfected cells can be produced by adding a gene introduction operation at an appropriate time in the process.
  • the gene transfer operation can be performed at any time within a range that does not affect the cell culture.
  • the gene transfer operation may be performed between the first step and the second step, and after gene transfer is performed on the cell population obtained in the first step, the same medium is used.
  • the day culture may be continued, and then retinoic acids may be added to the medium.
  • the total culture days are preferably 4 to 14 days.
  • the total number of culture days is less than 4 days, it is not possible to obtain a sufficient number of cells for use in general immunotherapy.
  • the total number of culture days exceeds 14 days, the cell growth rate decreases.
  • the total number of culture days is more preferably 5 to 14 days, still more preferably 7 to 14 days.
  • the cell population produced by the method contains Tc1-type and / or Th1-type memory T-like cells at a high ratio.
  • the Tc1 type or Th1 type cell population exerts an effect through enhancement of cellular immunity, and thus is useful for immune responses against intracellular parasites and tumor immunity.
  • the expression of the transgene is increased by adding retinoic acid after gene introduction.
  • a cell population containing T cells or T cell progenitor cells is cultured using a CD3 ligand and retinoic acids and controlling the addition timing of retinoic acids.
  • Tc2 and / or Th2 type, or Tc1 and / or Th1 type memory T-like cells are cultured using a CD3 ligand and retinoic acids and controlling the addition timing of retinoic acids.
  • the present invention can also be used to produce a cell population containing Tc2 and / or Th2 type or Tc1 and / or Th1 type memory T-like cells into which a desired gene has been introduced.
  • the production method of the present invention can include a step of separating the cell population into arbitrary subcell populations before or after each step. For example, as described above, since the cell population obtained by culturing in the presence of the active ingredient of the present invention contains a high proportion of memory T-like cells, cells expressing a desired surface antigen marker are further added. By separating and obtaining, a memory T-like cell or a T cell population containing a higher amount of memory T-like cells can be obtained. Moreover, in the production of a cell population into which a gene has been introduced, cells expressing a desired gene may be isolated and obtained during or after the production method of the present invention.
  • the separation operation is not particularly limited, and for example, separation can be performed by a known method using a cell sorter, magnetic beads, a column, or the like.
  • separation can be performed by a known method using a cell sorter, magnetic beads, a column, or the like.
  • a subcell population composed of cells expressing the introduced gene may be selected.
  • T cells from the cell population produced by the method of the present invention can be maintained as stable T cells.
  • a cell population can be newly obtained by further culturing the cell population obtained by the method of the present invention by the method of the present invention or a known method.
  • the method of the present invention is a novel T cell expansion culture method for adoptive immunotherapy including stimulation with retinoic acids and CD3 ligand and, if desired, introduction of a desired gene, which can be obtained by the method of the present invention.
  • the resulting cell population can be effectively transplanted and maintained in vivo. That is, the method of the present invention enables the provision of a more useful cell population for cell therapy that can be maintained at a high concentration for a long period of time in a transplanted living body, and all gene therapy methods based on T cells. It can be widely applied to.
  • the method for producing a cell or cell population includes a step of culturing the cell or cell population, and each step of induction (activation), expansion culture, separation of the cell or cell population, or a combination thereof.
  • the method which can further include the process which was further included.
  • the cell population produced by the method of the present invention has properties suitable for immunotherapy as described above.
  • the cell population into which the gene has been introduced produced by the method of the present invention is a cell population having a desired effect according to the desired gene introduced. For example, when a gene encoding a receptor that recognizes a desired antigen is introduced, the cell population into which the gene is introduced is compared with the cells presenting the antigen recognized by the receptor encoded by the introduced receptor gene. Since it can exhibit cytotoxic activity, it is useful for the treatment of various diseases.
  • the disease to which the above cell population is administered is not particularly limited, but for example, cancer (leukemia, solid tumor, etc.), hepatitis, autoimmune disease, influenza, virus such as HIV, bacteria, fungus And infectious diseases (for example, tuberculosis, MRSA infection, VRE infection, deep mycosis).
  • the cell population produced by the method of the present invention can also be used for donor lymphocyte infusion, immunotherapy, adoptive immunotherapy, etc. for the purpose of preventing infection after bone marrow transplantation or irradiation, and remission of relapsed leukemia.
  • the present invention provides a medicament (therapeutic agent) for the above-mentioned diseases containing the cell population obtained by the method of the present invention as an active ingredient.
  • the therapeutic agent containing the cell population is particularly suitable for use in immunotherapy.
  • immunotherapy T cells suitable for treatment of a patient are administered, for example, by injection or infusion into the patient's vein, artery, subcutaneous, intraperitoneal, etc.
  • the therapeutic agent is very useful for use in the aforementioned diseases or donor lymphocyte infusion.
  • the therapeutic agent is a known organic or inorganic carrier, excipient suitable for parenteral administration, using the T cell population prepared by the method of the present invention as an active ingredient according to a method known in the pharmaceutical field, It can be mixed with a stabilizer and prepared as an instillation or injection.
  • Various conditions relating to the therapeutic agent such as the content of the cell population of the present invention and the dosage of the therapeutic agent in the therapeutic agent can be appropriately determined according to known immunotherapy.
  • the content of the T cell population of the present invention in medicine is not particularly limited. For example, it is preferably 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 11 cells / mL, more preferably 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ .
  • Examples include 10 10 cells / mL, and more preferably 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 9 cells / mL.
  • the dose of the medicament of the present invention is not particularly limited. For example, it is preferably 1 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 12 cells / day, more preferably 1 ⁇ 10 7 to 5 per day for an adult. Examples include x10 11 cells / day, more preferably 1 ⁇ 10 8 to 2 ⁇ 10 11 cells / day.
  • immunotherapy with the therapeutic agent can be used in combination with a known drug treatment by administration of a drug, radiation therapy, or a surgical operation.
  • the present invention also provides a method for treating or preventing the above-mentioned diseases, which comprises administering to a subject an effective amount of a cell population obtained by the above-described method.
  • the subject in the present specification is not particularly limited, but is preferably a living body having the above-mentioned disease (for example, human patient or non-human) to which the T cell population produced by the method of the present invention is administered. Animal).
  • the therapeutic agent of the present invention comprising a cell population into which a gene encoding a T cell receptor has been introduced as an active ingredient is intended for expressing an HLA molecule that is the same as the HLA molecule expressed by the cell population or up to a tridentate mismatch. Can be administered.
  • the effective amount refers to the T cells that exert a therapeutic or prophylactic effect when the T cell population is administered to the subject as compared to a subject not administered the T cell population.
  • the amount of the population can be appropriately set depending on the administration form, administration method, purpose of use, age, weight or symptoms of the subject, and is not constant, but preferably can be set similarly to the above-mentioned medicine. .
  • the administration method There is no limitation on the administration method, and for example, it may be administered by drip, injection or the like, similar to the above-mentioned medicine.
  • the present invention provides a diagnostic agent containing the cell population as an active ingredient. For example, by analyzing and screening cells obtained from a patient with the diagnostic agent of the present invention, it is possible to estimate the therapeutic effect, select an effective transgene, and the like.
  • the present invention provides at least a cell population obtained by the production method of the present invention described above, selected from the group consisting of an antigen, a CD3 ligand, a CD28 ligand, a cytokine, a chemokine, and a cell having the ability to produce a cytokine.
  • a cell population containing activated T cells can be produced.
  • the present invention provides a cell population obtained by the above production method. The cell population containing activated T cells obtained in this way can be used as an active ingredient of a medicament, as with the T cell population obtained by the production method described above.
  • stimulation by a stimulating factor is not particularly limited as long as the cell population obtained by the above-described production method of the present invention can be activated by the stimulation factor, but for example, the production method of the present invention
  • the cultivation is carried out in the presence of a T cell population obtained by the above and a stimulating factor.
  • the antigen to be presented is not particularly limited as long as the peptide is presented on a cell that expresses an MHC molecule, or can be recognized by the T cell and can efficiently activate the T cell.
  • examples of the CD3 ligand and CD28 ligand include the aforementioned CD3 ligand and CD28 ligand.
  • the cytokine is not particularly limited as long as it can act on and activate T cells.
  • IL-2 IFN- ⁇ , TGF- ⁇ , IL-15, IL-7 , IFN- ⁇ , IL-12, CD40L, IL-27 and the like.
  • the chemokine is not particularly limited as long as it acts on T cells and exhibits migration activity, and examples thereof include RANTES, CCL21, MIP1 ⁇ , MIP1 ⁇ , CCL19, CXCL12, IP-10, MIG and the like.
  • the cells having the ability to produce cytokines are not particularly limited as long as they have the ability to produce the aforementioned cytokines.
  • the activated lymphocyte population which has cytokine production ability can be manufactured by giving costimulation by the anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody with respect to the cell population obtained by the manufacturing method of this invention.
  • T cell population obtained by the production method of the present invention By applying antigen stimulation to the T cell population obtained by the production method of the present invention, useful antigen-specific CTL having extremely high cytotoxic activity and high antigen recognition ability can be induced. Moreover, the said culture
  • the T cell population produced in this way is a very useful T cell population with a high therapeutic effect for a long period of time in vivo.
  • the present invention also provides the use of the cell population obtained by the above-described method for producing a medicament.
  • the manufacturing method of the said pharmaceutical is performed like the above-mentioned pharmaceutical.
  • the disease to which the drug is administered is not particularly limited, and is the same as that for the aforementioned drug.
  • Example 1 Culture in the Presence of Retinoic Acid PBS so that the fibronectin fragment [RetroNectin (registered trademark), manufactured by Takara Bio Inc.] is 5 ⁇ g / mL, and the anti-CD3 antibody (OKT3, Janssen Pharma Inc.) is 5 ⁇ g / mL Dissolved in.
  • This lysate was added to a surface untreated 12-well plate in an amount of 1 mL / well and left at 37 ° C. for 5 hours. Further, the anti-CD3 antibody alone was dissolved in PBS to 5 ⁇ g / mL, and similarly added to a surface untreated 12-well plate at 1 mL / well, and left at 37 ° C. for 5 hours. After standing, each lysate was removed and each plate was washed twice with PBS at a volume of 2 mL / well to prepare fibronectin fragment / anti-CD3 antibody adhesion plate and anti-CD3 antibody adhesion plate.
  • PBMC Human peripheral blood mononuclear cells
  • PBMC Human peripheral blood mononuclear cells
  • GT-T503 medium Takara Bio
  • HSA human serum albumin
  • fungizone Bristol Myers
  • 10 nM retinoic acid Wako Pure Chemical Industries
  • a cell suspension containing no retinoic acid was prepared as a control and added to the plate in the same manner.
  • Each plate was cultured for 4 days at 37 ° C. in a CO 2 incubator.
  • the measurement result of the cell surface marker is shown in FIG.
  • the ratio of memory T cells in CD8 alone positive cells in cultured cells was measured by staining the cells with anti-CD8 antibody, anti-CD45RA antibody and anti-CCR7 antibody.
  • naive T-like cells are CD45RA + / CCR7 +
  • central memory T-like cells are CD45RA- / CCR7 +
  • effector memory T-like cells are CD45RA- / CCR7-.
  • the effector T-like cells are CD45RA + / CCR7 ⁇ .
  • the bars represent the percentage (%) of CD45RA + / CCR7 +, CD45RA ⁇ / CCR7 +, CD45RA ⁇ / CCR7 ⁇ and CD45RA + / CCR7 ⁇ in CD8 single positive cells from the left.
  • OKT is anti-CD3 antibody stimulation alone
  • RA-OKT is retinoic acid / anti-CD3 antibody stimulation
  • RNT is fibronectin fragment / anti-CD3 antibody stimulation
  • RA-RNT is retinoic acid / fibronectin fragment. / Shows anti-CD3 antibody stimulation.
  • FIG. 1 shows that the ratio of central memory T-like cells and effector memory T-like cells is increased by a combination of anti-CD3 antibody single stimulation and fibronectin fragment / anti-CD3 antibody stimulation and retinoic acid stimulation.
  • Example 2 TCR gene-introduced cells As in Example 1- (1) to (4) of WO2008 / 111506 pamphlet, cloning of MAGE-A4-specific TCR gene, construction of vector and production of producer cell A series of operations were performed to prepare an MS-bPa virus solution.
  • the RNA copy number of this virus solution was 2.55 ⁇ 10 11 copies / mL.
  • TCR gene-introduced cell Fibronectin fragment was dissolved in PBS so as to be 25 ⁇ g / mL and anti-CD3 antibody was adjusted to 5 ⁇ g / mL.
  • the lysate was added to a surface culture treated 12-well plate in an amount of 0.4 mL / well and left at 37 ° C. for 5 hours.
  • an anti-CD3 antibody (OKT3, Janssen Pharma Co., Ltd.) was dissolved in PBS so as to be 5 ⁇ g / mL, and this lysate was similarly added in an amount of 0.4 mL / well to the surface-treated 12-well plate, And left for 5 hours.
  • each lysate was removed, and each plate was washed twice with GT-T503 medium (manufactured by Takara Bio Inc.) at a volume of 2 mL / well, and a fibronectin fragment / anti-CD3 antibody adhesion plate or anti-CD3 Antibody adhesion plates were prepared.
  • GT-T503 medium manufactured by Takara Bio Inc.
  • PBMCs prepared from healthy individuals with informed consent were obtained using 1% autologous plasma, 720 IU / mL IL-2, 0.2% HSA, 2.5 ⁇ g / mL to be 0.18 ⁇ 10 6 cells / mL. It was suspended in GT-T503 medium containing mL fungizone and 10 nM retinoic acid, and added to a fibronectin fragment / anti-CD3 antibody adhesion plate or anti-CD3 antibody adhesion plate at 2.65 mL / well. At this time, a plate to which a cell suspension not containing retinoic acid was added was prepared as a control. Each plate was cultured for 4 days at 37 ° C. in a CO 2 incubator.
  • a virus-binding plate for gene transfer was prepared as follows. Fibronectin fragment was dissolved in PBS to 20 ⁇ g / mL, and this lysate was added to a surface untreated 24-well plate at 0.5 mL / well and left at 4 ° C. for 3 days. After standing, the lysate was removed, washed twice with PBS at a volume of 1 mL / well, 0.9 mL of MS-bPa virus solution was added to the wells, and centrifuged at 32 ° C., 2000 ⁇ g for 2 hours. After centrifugation, the virus solution was removed, and the plate was washed three times with PBS containing 1.5% HSA at a volume of 1 mL / well to prepare a virus-binding plate.
  • the gene transfer operation was performed as follows. To the virus-binding plate, the above PBMC stimulated with anti-CD3 antibody alone or fibronectin fragment / anti-CD3 antibody for 4 days was added to 0.8 ⁇ 10 6 cells, 2.0 mL / well, and overnight in a CO 2 incubator And cultured at 37 ° C. The cultured cells are suspended in GT-T-RetroIII medium (Takara Bio Inc.) containing 5 mM sodium butyrate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) so as to be 0.68 ⁇ 10 6 cells / 1.9 mL / well. The cells were plated on a new virus-binding plate and cultured at 37 ° C. for 4 hours in a CO 2 incubator.
  • the recovered cells were treated with 1% autologous plasma, 720 IU / mL IL-2, 0.2% HSA, 2.5 ⁇ g / mL fungizone and 10 nM retinoic acid so that the concentration was 0.1 ⁇ 10 6 cells / mL.
  • the cells were cultured at 37 ° C in a CO 2 incubator. At this time, using a cell suspension containing no retinoic acid as a control, the same gene transfer operation and cell culture after gene transfer were performed.
  • the cells were seeded at 0.1 ⁇ 10 6 cells / mL on the 7th day and cultured until the 10th day.
  • Cell growth rate was measured on days 4, 5, 7 and 10 and cell surface markers before transfer to virus-binding plates on day 4, cell surface markers, introduced TCR expression and introduction on day 10 The gene copy number was measured.
  • the measurement results of the cell proliferation rate are shown in FIG.
  • the vertical axis in FIG. 2 indicates the growth ratio (%) relative to the number of cells at the start of culture, and the horizontal axis indicates the number of days of culture. From FIG. 2, the cell proliferation rate of fibronectin fragment / anti-CD3 antibody stimulation was higher than that of anti-CD3 antibody single stimulation regardless of the presence or absence of retinoic acid stimulation.
  • FIG. 3 shows the measurement results of cell surface markers of CD8 single positive cells in cultured cells on the fourth day after the start of PBMC stimulation.
  • FIG. 3 shows the measurement of cell surface markers of CD8 single positive cells in cultured cells on the seventh day.
  • the results are shown in FIG.
  • the memory T cell ratio was measured by staining cells with anti-CD8 antibody, anti-CD45RA antibody and anti-CCR7 antibody.
  • the bar represents the ratio (%) of CD45RA + / CCR7 +, CD45RA ⁇ / CCR7 +, CD45RA ⁇ / CCR7 ⁇ and CD45RA + / CCR7 ⁇ in CD8 positive cells from the left.
  • FIG. 3 and FIG. 4 revealed that the ratio of central memory T-like cells and effector memory T-like cells increased in combination with retinoic acid stimulation for both anti-CD3 antibody single stimulation and fibronectin fragment / anti-CD3 antibody stimulation. .
  • Gene transfer efficiency was measured by measuring the expression of MAGE-A4-specific TCR by a tetramer assay.
  • a polypeptide in which a sequence serving as a substrate for biotin protein ligase BirA and ⁇ 2-microglobulin added to the C-terminus of HLA-A2402 heavy chain were expressed in Escherichia coli as an insoluble inclusion body.
  • the inclusion bodies were refolded in vitro in the presence of P143 peptide to form HLA-A2402 / ⁇ 2-microglobulin / P143 complex.
  • Biotin protein ligase (manufactured by Avidity) was allowed to act on the resulting complex, and tetramers were prepared using phycoerythrin-labeled streptavidin (Straptavidin-PE, manufactured by Invitrogen). After starting PBMC stimulation, the cells on day 10 were mixed with tetramer and reacted at 37 ° C. for 30 minutes, and then reacted with APC-Cy7-labeled anti-human CD8 antibody (Becton Dickinson) at 4 ° C. for 20 minutes. It was. After washing the cells after completion of the reaction, flow cytometry analysis was performed using FACScan (Becton Dickinson).
  • Tetramer measurement results are shown in FIG.
  • the vertical axis represents the tetramer positive cell rate (%) in CD8 single positive cells.
  • MAGE-A4-specific TCR-expressing cell rate was observed when both anti-CD3 antibody single stimulation and fibronectin fragment / anti-CD3 antibody stimulation were combined with retinoic acid stimulation.
  • the number of proviral copies of the transgene in the transgenic cell was calculated using the Provision Copy Number Detection Primer Set. Measured with Human (manufactured by Takara Bio Inc.). The measurement results are shown in FIG. The vertical axis in FIG. 6 represents the copy number of the transgene in the transgenic cell.
  • both the anti-CD3 antibody single stimulation and the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody stimulation showed an increase in copy number correlated with an increase in gene transfer efficiency by the addition of retinoic acid.
  • Retrovirus vector plasmid pDON-AI-ZsGreen was prepared by the following procedure. First, the ZsGreen expression vector pZsGreen-N1 (Clontech) was cleaved with restriction enzyme NotI, smoothed using DNA blunting kit (Takara Bio), and further digested with restriction enzyme BamHI to give about 720 bp of ZsGreen. A gene fragment was obtained.
  • a retroviral vector plasmid pDON-AI (manufactured by Takara Bio Inc.) is digested with restriction enzymes BamHI and HpaI, and a ZsGreen DNA fragment is used with DNA Ligation Kit Mighty Mix (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • the inserted ZsGreen expression recombinant retroviral vector pDON-AI-ZsGreen was obtained.
  • Transient virus production was carried out using the pDON-AI-ZsGreen vector and Retrovirus Packaging Kit Eco (manufactured by Takara Bio Inc.) to obtain ecotropic DON-AI-ZsGreen virus.
  • Ecotropic DON-AI-ZsGreen virus was infected into GALV retrovirus packaging cells PG13 (ATCC CRL-10686) in the presence of polybrene to obtain transgenic cells PG13 / DON-AI-ZsGreen.
  • PG13 / DON-AI-ZsGreen were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, manufactured by Sigma) containing 10% fetal bovine serum (Invitrogen Corporation), where grown to semi-confluent, fresh of 0.1mL / cm 2 The medium was exchanged with DMEM containing 10% fetal bovine serum, and after 24 hours, the supernatant was filtered through a 0.45 ⁇ m filter (Millipore) to obtain a GALV / DON-AI-ZsGreen virus solution.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • the obtained virus solution was aliquoted and stored in a ⁇ 80 ° C. freezer, and used for the preparation of the following gene-transferred cells.
  • the titer of the virus solution was 6.76 ⁇ 10 5 cfu / mL.
  • PBMCs prepared from healthy individuals with informed consent were 0.2 ⁇ 10 6 cells / mL.
  • the suspension was suspended in GT-T503 medium containing mL fungizone and 10 nM retinoic acid, and added to a fibronectin fragment / anti-CD3 antibody adhesion plate or anti-CD3 antibody adhesion plate at 2.6 mL / well.
  • a plate to which a cell suspension not containing retinoic acid was added was prepared as a control. Each plate was cultured for 4 days at 37 ° C. in a CO 2 incubator.
  • a virus-binding plate for gene transfer was prepared as follows. The fibronectin fragment was dissolved in PBS to 20 ⁇ g / mL, and this lysate was added to a surface untreated 24-well plate at 0.5 mL / well and left overnight at 4 ° C. After standing, the solution was removed and washed twice with PBS at a volume of 1 mL / well, and 1 mL of the GALV / DON-AI-ZsGreen virus solution prepared in (1) above was added to the well, and 32 ° C., 2000 ⁇ Centrifuged for 2 hours at g. After centrifuging, the virus solution was removed and washed 3 times each with 2 mL / well using PBS containing 1.5% HSA to prepare a virus-binding plate.
  • the gene transfer operation was performed as follows. GT-T containing 5 mM sodium butyrate so that the above-mentioned PBMC stimulated with anti-CD3 antibody alone or fibronectin fragment / anti-CD3 antibody for 4 days was 0.8 ⁇ 10 6 cells, 0.80 mL / well on a virus-binding plate. -Suspended in RetroIII medium and incubated for 4 hours at 37 ° C in a CO 2 incubator.
  • PBMC stimulated for 4 days was suspended in the GALV / DON-AI-ZsGreen virus solution prepared in (1) so as to be 1.0 ⁇ 10 6 cells / mL, and polybrene (Hexadimethine Bromide, SIGMA) was suspended in this suspension.
  • -ALDRICH was added to a final concentration of 8 ⁇ g / mL, added to a 24-well plate in an amount of 2 mL / well, and centrifuged at 1000 ° C. at 32 ° C. for 1 hour. After centrifugation, the virus solution was removed, seeded in a surface-treated 12-well plate at 0.53 ⁇ 10 6 cells, 2.65 mL / well, and cultured at 37 ° C. for 2 days.
  • the cell growth rate was measured on the 4th and 7th days, and the cell surface marker, the ZsGreen positive cell rate, and the copy number of the transgene were measured on the 7th day.
  • the percentage of ZsGreen positive cells was measured on the sixth day.
  • FIG. 7 The results of cell growth rate measurement are shown in FIG. In FIG. 7, the vertical axis represents the growth ratio (%) relative to the number of cells at the start of culture, and the horizontal axis represents the number of days of culture. From FIG. 7, both the anti-CD3 antibody single stimulation and the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody stimulation showed a high cell growth rate regardless of the presence or absence of retinoic acid.
  • FIG. 8 shows the results of measurement using anti-CD4 antibody, anti-CD8 antibody, anti-CD45RA antibody and anti-CCR7 antibody for cell surface markers in CD8 single positive and CD4 single positive cells in cultured cells.
  • the bar represents the ratio (%) of CD45RA + / CCR7 +, CD45RA ⁇ / CCR7 +, CD45RA ⁇ / CCR7 ⁇ and CD45RA + / CCR7 ⁇ in the CD8 single positive and CD4 single positive cells from the left. From FIG. 8, it was revealed that the central memory T-like cell ratio and the effector memory T-like cell ratio increased in combination with retinoic acid stimulation for both anti-CD3 antibody single stimulation and fibronectin fragment / anti-CD3 antibody stimulation.
  • the ZsGreen positive cell rate was measured. After the start of PBMC stimulation, the cells on day 7 are used for gene transfer using a virus-binding plate for gene transfer, the cells on day 6 are used for gene transfer using the polybrene method, PE-Cy7-labeled anti-human CD4 antibody, APC The cells were washed with a Cy7-labeled anti-human CD8 antibody (Becton Dickinson) at 4 ° C. for 20 minutes, and after washing the cells, flow cytometry analysis was performed using FACScan (Becton Dickinson). The measurement results are shown in FIGS. In addition, the vertical axis
  • both the anti-CD3 antibody single stimulation and the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody stimulation were 1.5 times in the retinoic acid addition condition compared to the no-addition condition.
  • the ZsGreen positive cell rate was increased.
  • the gene introduction by the polybrene method shown in FIG. 10 there was not much difference in the introduction efficiency regardless of retinoic acid stimulation for both anti-CD3 antibody single stimulation and fibronectin fragment / anti-CD3 antibody stimulation.
  • 9 and 10 show highly efficient gene transfer by a combination of retinoic acid stimulation and a gene transfer method using a fibronectin fragment.
  • FIG. 11 shows the results of measuring the copy number of the transgene in the gene-introduced cells introduced using the virus-binding plate for gene introduction.
  • the vertical axis represents the copy number of the transgene in the transgenic cell.
  • Example 4 Measurement of antitumor activity of TCR gene-introduced cells Cloning of MAGE-A4-specific TCR gene and construction of vector in the same manner as in Example 1- (1) to (4) of WO 2008/111506 pamphlet Then, a series of operations for producing producer cells was performed to prepare an MS-bPa virus solution. The RNA copy number of this virus solution was 2.55 ⁇ 10 11 copies / mL.
  • a virus-binding plate for gene transfer was prepared as follows. Fibronectin fragment was dissolved in PBS to 20 ⁇ g / mL, and this lysate was added to a surface untreated 24-well plate at 0.5 mL / well and left at 4 ° C. for 4 days. After standing, the lysate was removed and washed twice with PBS at a volume of 1 mL / well, then 0.9 mL of MS-bPa virus solution was added to the wells, and centrifuged at 2000 ° C. at 32 ° C. for 2 hours. After centrifuging, the virus solution was removed, and the plate was washed 3 times each with 1% / well using PBS containing 1.5% HSA to prepare a virus-binding plate.
  • the gene transfer operation was performed as follows. GT-T- containing 5 mM sodium butyrate at 0.8 ⁇ 10 6 cells and 2.0 mL / well of the above-mentioned PBMC stimulated with anti-CD3 antibody alone or fibronectin fragment / anti-CD3 antibody for 4 days on a virus-binding plate It was suspended in Retro III medium and cultured overnight at 37 ° C. in a CO 2 incubator. 1% autologous plasma, 720 IU / mL IL-2, 0.2% HSA, 2.5 ⁇ g / mL fungizone and 10 nM retinoin so that the cells after culture were 0.8 ⁇ 10 6 cells, 1.0 mL / well.
  • the cells were seeded on a 12-well plate for cell culture so as to be 0.1 ⁇ 10 6 cells / mL on the 8th day, and the cells were cultured until the 11th day.
  • cytotoxicity analysis for the introduced TCR-specific peptide was performed.
  • the expression of introduced TCR in CD8 single positive cells and the rate of IL-4 and perforin producing cells were measured.
  • Tetramer measurement results are shown in FIG. In FIG. 12, the vertical axis represents the tetramer positive rate (%).
  • the vertical axis represents the tetramer positive rate (%).
  • the IL-4 and perforin producing cell rate for the MAGE-A4-derived peptide p143 of the transgenic cells was measured.
  • Day 11 cells and MAGE-A4-derived peptide-bound T2A24 cells [Clinical Cancer Research, Vol. 11, pp. 5581-5589 (2005)] were co-cultured for 2 hours at a ratio of 1: 1 to Brefeldin A After adding (Sigma-Aldrich), the cells were further cultured for 2 hours, and the reaction was stopped with 10 volumes of cooled PBS.
  • APC-Cy7-labeled anti-human CD8 antibody (Becton Dickinson) was added to these cells, and staining was performed at 4 ° C. for 20 minutes.
  • FIG. 13 shows the results of the IL-4 production and IFN- ⁇ non-producing cell ratio
  • FIG. 14 shows the results of the perforin producing cell ratio. That is, the vertical axis in FIG.
  • IFNg IFNg
  • the memory T-like cells of the present invention are classified as Tc2-type cells.
  • the cytotoxicity of the transfected cells against the MAGE-A4-derived peptide p143 was analyzed. After suspending T2A24 cells co-cultured with the peptide for 3 hours in RPMI 1640 medium containing 10% FBS (fetal bovine serum, fetal bovine serum, manufactured by SAFC) to 0.5 ⁇ 10 6 cells / mL, the final concentration Calcein-AM (manufactured by Dotite) was added to a concentration of 25 ⁇ M, and the suspension was cultured at 37 ° C. for 1 hour. The cells were washed with a medium not containing Calcein-AM and then mixed with 10 times the amount of K562 cells (ATCC CCL-243) to obtain Calcein-labeled target cells.
  • FBS fetal bovine serum, fetal bovine serum, manufactured by SAFC
  • K562 cells were used to eliminate nonspecific cytotoxic activity by NK cells mixed in responder cells. After serially diluting with RPMI1640 medium containing 10% FBS so as to obtain 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 6 cells / mL of cells on day 10 after the start of culture as effector cells, each of the 96-well cell culture plates The wells were dispensed at 100 ⁇ L / well, and Calcein-labeled target cells prepared at 1 ⁇ 10 5 / mL were added at 100 ⁇ L / well. The plate containing the cell suspension was centrifuged at 180 ⁇ g for 2 minutes and then incubated at 37 ° C. for 4 hours in a CO 2 incubator.
  • the plate containing the cell suspension was centrifuged at 180 ⁇ g for 2 minutes, and 100 ⁇ L of the culture supernatant was collected from each well and released into the culture supernatant by a fluorescent plate reader (485 nm / 538 nm). The amount of calcein was measured. “Specific cytotoxic activity (%)” was calculated according to the following formula 1.
  • the minimum release amount is the Calcein release amount of the well containing only the target cells and K562 cells, and indicates the Calcein spontaneous release amount from the target cells.
  • the maximum release amount indicates the amount of Calcein released when the cells are completely destroyed by adding 0.1% surfactant Triton X-100 (manufactured by Nacalai Tesque) to the target cells.
  • FIG. 15 shows the results of cytotoxicity analysis of the transfected cells against MAGE-A4-derived peptide p143.
  • the horizontal axis of FIG. 15 shows the ratio (E / T ratio) of PBMC collected on the 10th day after the start of culture and MAGE-A4 pulsed T2A24 cells.
  • Example 5 Effect of retinoic acid addition time on characteristics of TCR gene-introduced cells Cloning of MAGE-A4-specific TCR gene in the same manner as in Examples 1- (1) to (4) of WO 2008/111506 pamphlet Then, a series of operations of vector construction and production of producer cells were performed to prepare an MS-bPa virus solution. The RNA copy number of this virus solution was 2.55 ⁇ 10 11 copies / mL.
  • TCR gene-introduced cell An anti-CD3 antibody adhesion plate was prepared in the same manner as in Example 2- (1).
  • a virus-binding plate for gene transfer was prepared as follows. Fibronectin fragment was dissolved in PBS to 20 ⁇ g / mL, and this lysate was added to a surface untreated 12-well plate at 1 mL / well and left at 4 ° C. for 4 days. After standing, the lysate was removed and washed twice with PBS at a rate of 2 mL / well, and then 1.8 mL of MS-bPa virus solution was added to the well, and the mixture was added at 32 ° C., 2000 ⁇ g for 1.5 hours Centrifuged. After centrifuging, the virus solution was removed, and the plate was washed 3 times each with 1% / well using PBS containing 1.5% HSA to prepare a virus-binding plate.
  • the gene transfer operation was performed as follows. In a virus-binding plate, 1% autologous plasma, 720 IU / mL IL-2, 0.2% HSA so that PBMC stimulated with anti-CD3 antibody for 4 days was 1.6 ⁇ 10 6 cells, 4.0 mL / well. And suspended in GT-T503 medium containing 2.5 ⁇ g / mL fungizone and 10 nM retinoic acid, and the suspension was incubated overnight at 37 ° C. in a CO 2 incubator. At this time, the same gene transfer operation and cell culture after gene transfer were performed using PBMC which was added with a cell suspension not containing retinoic acid in a control plate and stimulated with anti-CD3 antibody for 4 days. .
  • transgenic cells after overnight culture are collected and contain 1% autologous plasma, 720IU / mL IL-2, 0.2% HSA and 2.5 ⁇ g / mL fungizone, with or without the addition of 10 nM final concentration retinoic acid
  • the obtained suspension is spread on a 12-well plate for cell culture in an amount of 4.0 mL / well, and in a CO 2 incubator.
  • the cells were cultured at 37 ° C. for 3 days.
  • Cells were harvested on day 8 after the start of PBMC stimulation, followed by 1% autologous plasma with or without the addition of 10 nM retinoic acid, 720 IU / mL IL-2, 0.2% HSA and 2.5 ⁇ g / After suspending in GT-T503 medium containing mL fungizone to a concentration of 0.1 ⁇ 10 6 cells / mL, the suspension was plated on a 12-well plate for cell culture and cultured until the 11th day. On the 11th day, cell surface markers in the cells positive for CD8 alone and the expression cell rate of the introduced TCR, the measurement of the production cell rate of IL-4, IFN- ⁇ and perforin against the introduced TCR-specific peptide, and the cytotoxicity analysis went.
  • RR is a cell group in which retinoic acid is added and cultured from the start of PBMC stimulation to the 11th day
  • R- is the gene transfer from the start of PBMC stimulation (5 days).
  • a group of cells cultured with retinoic acid added, “O-” indicates a group of cells cultured without adding retinoic acid from the start of PBMC stimulation to the 11th day.
  • the vertical axis represents the tetramer positive rate (%) in CD8 single positive cells.
  • the tetramer positive cell rate was highest in “RR” cultured with retinoic acid added throughout, followed by “OR” cultured with retinoic acid added after gene transfer, and then retinoic acid added until gene transfer.
  • FIG. 17 shows the measurement results of cell surface markers of CD8 single positive cells
  • FIG. 18 shows the measurement results of cell surface markers of CD8 single positive and tetramer positive cells.
  • the memory T cell ratio was measured by staining cells with anti-CD8 antibody, anti-CD45RA antibody and anti-CD62L antibody.
  • the bars from the left are CD45RA + / CD62L + (naive T-like cells), CD45RA ⁇ / CD62L + (central memory T-like cells), CD45RA ⁇ / CD62L ⁇ (effector memory T-like cells) and It represents the percentage (%) of CD45RA + / CD62L- (effector T-like cells).
  • FIG. 17 and FIG. 18 revealed that the ratio of central memory T-like cells and effector memory T-like cells increased when retinoic acid was added compared to the case of no addition (O-).
  • Example 4- (1) the rate of IL-4 and perforin producing cells for the MAGE-A4-derived peptide p143 of the transfected cells was measured.
  • FIG. 19 shows the results of IL-4 production or non-production and IFN- ⁇ production or non-production cell ratio in CD8 single positive cells.
  • FIG. 19 shows IL-4 production and IFN- ⁇ non-production cell ratio (Tc2) and IL-4
  • Tc1 The ratio of the ratio of non-producing and IFN- ⁇ producing cells (Tc1) is shown in FIG. 20, and the result of the perforin producing cell ratio in CD8 alone positive cells is shown in FIG.
  • the bars indicate the ratio (%) of IL-4 producing and IFN- ⁇ non-producing, IL-4 non-producing and IFN- ⁇ producing, IL-4 producing and IFN- ⁇ producing cells from the left. To express.
  • FIG. 19 shows IL-4 production and IFN- ⁇ non-producing cell ratio (Tc2) and IL-4
  • Tc1 The ratio of the ratio of non-producing and IFN- ⁇ producing cells (Tc1) is shown in FIG. 20
  • Tc1 The ratio of the ratio of non-producing and IFN- ⁇ producing cells
  • the bars indicate Tc1 / Tc2 and Tc2 / Tc1 from the left, and the scale on the vertical axis corresponds to Tc1 / Tc2 on the left side (0 to 70) and on the right side (0 to 0.6). ) Corresponds to Tc2 / Tc1.
  • the memory T-like cells produced according to the present invention can be induced to Tc1-type or Tc2-type CTL by adjusting the addition timing of retinoic acid, and retinoic acid is added. As a result, it was revealed that a cell population exhibiting a higher perforin-producing cell rate can be produced.
  • FIG. 22 shows the analysis results of cytotoxicity of the transfected cells against the MAGE-A4-derived peptide p143.
  • FIG. 22 shows the cytotoxic rate when PBMC collected on the 11th day after the start of culture and T2A24 cells pulsed with MAGE-A4 were co-cultured at a ratio of 1: 1.
  • the cytotoxic activity (%) with and without the addition of retinoic acid was compared.
  • the cells against specific target cells of the retinoic acid-stimulated cell group ("RR", "OR”, “R-"
  • the cytotoxic activity was higher than that of the cell group without retinoic acid stimulation (“O-"), and it was observed that antitumor activity was increased by retinoic acid stimulation.
  • Example 6 Gene Transfer Efficiency and Transgene Expression Effect by Addition of Retinoic Acid Cloning of MAGE-A4-specific TCR gene, vector as in Examples 1- (1) to (4) of WO 2008/111506 pamphlet
  • the MS-bPa virus solution was prepared by performing a series of operations for constructing and producing producer cells.
  • the RNA copy number of this virus solution was 2.55 ⁇ 10 11 copies / mL.
  • TCR gene-introduced cells As in Example 5- (1), preparation of an anti-CD3 antibody adhesion plate, culture of PBMC before gene introduction, preparation of a virus-binding plate for gene introduction, 4 with anti-CD3 antibody A series of operations of TCR gene introduction into PBMCs stimulated for one day and cell culture after TCR gene introduction were performed to prepare TCR gene-introduced cells.
  • the expression cell rate, expression level and provirus copy number of the introduced TCR were measured.
  • Example 2- (1) the expression of MAGE-A4-specific TCR was measured by a tetramer assay. Tetramer measurement results are shown in FIGS. In FIG. 23, the vertical axis represents the tetramer positive rate (%). In FIG. 24, the vertical axis indicates the tetramer expression level in tetramer positive and CD8 single positive cells using the value of average fluorescence intensity. As a result, the tetramer positive cell rate was highest in “RR” cultured with retinoic acid added throughout, followed by “OR” cultured with retinoic acid added after gene transfer, and then retinoic acid added until gene transfer.
  • the proviral copy number of the transgene in the cultured cells was determined using the Provide Copy Number Detection Primer Set. It measured using Human (made by Takara Bio Inc.). The measurement results are shown in FIG. The vertical axis in FIG. 25 indicates the copy number of the transgene in the cultured cells.
  • R- the Provide Copy Number Detection Primer Set. It measured using Human (made by Takara Bio Inc.).
  • the measurement results are shown in FIG.
  • the vertical axis in FIG. 25 indicates the copy number of the transgene in the cultured cells.
  • Example 2-An anti-CD3 antibody adhesion plate was prepared in the same manner as in (1).
  • PBMC stimulated with anti-CD3 antibody alone for 4 days without retinoic acid and PBMC stimulated with anti-CD3 antibody alone in the presence of retinoic acid for 4 days were 0.1 ⁇ 10 6 cells, 2.0 mL / well, respectively.
  • the suspension was suspended in a medium containing 1% autologous plasma, 720 IU / mL IL-2, 0.2% HSA, 2.5 ⁇ g / mL fungizone and 10 nM retinoic acid.
  • the cells were plated again on a well plate and cultured at 37 ° C. for 3 days in a CO 2 incubator.
  • PBMC stimulated with anti-CD3 antibody alone without adding retinoic acid for 4 days was suspended in a medium containing no retinoic acid at the same cell concentration and cultured in the same manner as a control.
  • each PBMC is suspended in a medium containing retinoic acid at a final concentration of 10 nM so as to be 0.1 ⁇ 10 6 cells / mL, 2.0 mL / well.
  • the cells were plated on 12-well plates and further cultured until the 10th day.
  • the same operation was performed using a medium containing no retinoic acid, and the same culture was performed up to the 10th day.
  • the cell surface markers in CD4 single positive cells in each culture and the percentage of cells producing IL-4 and IFN- ⁇ in CD4 single positive cells in response to PMA + ionomycin stimulation were measured.
  • the ratio of IL-4 and IFN- ⁇ producing cells to PMA + ionomycin stimulation of the cultured cells was measured.
  • PMA with a final concentration of 10 ng / mL and ionomycin with a final concentration of 1 ⁇ g / mL were added to the cultured cells on day 10, and cultured for 1 hour.
  • Brefeldin A manufactured by Sigma-Aldrich
  • further cultured for 3 hours was stopped with 10 times the amount of cooled PBS.
  • FITC-labeled anti-human CD4 antibody (Becton Dickinson) was added to these cells, and staining was performed at room temperature for 15 minutes.
  • RR is a cell group in which retinoic acid was added and cultured throughout the period from the start of PBMC stimulation to the 10th day
  • OR is retinoic acid from the start of the PBMC stimulation to the 4th day.
  • a cell group in which retinoic acid was added without cultivating and then cultured, and a cell group (control) in which “O-” was cultured without adding retinoic acid from the start of PBMC stimulation until the 10th day were shown.
  • FIG. 26 shows the measurement results of cell surface markers of CD4 single positive cells.
  • the memory T cell ratio was measured by staining cells with anti-CD4 antibody, anti-CD45RA antibody and anti-CD62L antibody.
  • the bars from the left are CD45RA + / CD62L + (naive T-like cells), CD45RA ⁇ / CD62L + (central memory T-like cells), CD45RA ⁇ / CD62L ⁇ (effector memory T-like cells) and CD45RA + / CD62L.
  • FIG. 27 shows the results of IL-4 production or non-production and the rate of IFN- ⁇ production or non-production in CD4 single positive cells.
  • FIG. 27 shows the results of IL-4 production and IFN- ⁇ production cell rate in CD4 single positive cells. Is shown in FIG.
  • FIG. 29 shows the ratio between the IL-4 producing and IFN- ⁇ non-producing cell rate (Th2) and the IL-4 non-producing and IFN- ⁇ producing cell rate (Th1).
  • the bars indicate the ratio (%) of IL-4 producing and IFN- ⁇ non-producing, IL-4 producing and IFN- ⁇ producing, IL-4 non-producing and IFN- ⁇ producing cells from the left. To express.
  • FIG. 27 shows the results of IL-4 production or non-production and the rate of IFN- ⁇ production or non-production in CD4 single positive cells.
  • FIG. 29 shows the ratio between the IL-4 producing and IFN- ⁇ non-producing cell rate (Th2) and the IL-4 non-producing and IFN- ⁇ producing cell rate (Th1).
  • the bars represent the ratio (%) of IL-4 producing and IFN- ⁇ producing cells from the left.
  • the bars indicate Th1 / Th2 and Th2 / Th1 from the left, and the scale on the vertical axis corresponds to Th1 / Th2 on the left side (0 to 1.4), and the right side (0 to 3). .5) corresponds to Th2 / Th1.
  • a method of producing a cell population can be provided.
  • the cell population obtained by the production method is extremely useful for the treatment of diseases caused by cell therapy.
  • SEQ ID NO: 1 Fibronectin fragment named CH-271.
  • SEQ ID NO: 2 Fibronectin fragment named CH-296.
  • SEQ ID NO: 3 Fibronectin fragment named H-271.
  • SEQ ID NO: 4 Fibronectin fragment named H-296.

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Abstract

　本発明によれば、レチノイン酸類及びＣＤ３リガンドを使用して、Ｔ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を生体外で培養する工程を含むことを特徴とする、メモリーＴ様細胞を含有する細胞集団を製造する方法が提供される。更に、本発明によれば、メモリーＴ様細胞の比率が増加し、所望の遺伝子が高効率で導入され高発現している細胞集団を製造する方法が提供される。

Description

レチノイン酸存在下でのＴ細胞集団の製造方法
　本発明は、医療分野、特に免疫療法において有用な、メモリー（ｍｅｍｏｒｙ）Ｔ様細胞を含有する細胞集団を製造する方法に関する。また、本発明は、医療分野において有用な、所望の遺伝子が高効率で導入されたＴ細胞を含有する細胞集団を製造する方法に関する。
　なお、本願は、２００９年８月２５日出願の日本国特許出願第２００９－１９４４４４号及び２００９年１２月１８日出願の日本国特許出願第２００９－２８７２５８号に対して優先権を主張するものであり、日本国特許出願第２００９－１９４４４４号及び日本国特許出願第２００９－２８７２５８号の全内容を本願に組み込むものである。
　生体は主として免疫応答により異物から守られており、免疫システムはさまざまな細胞とそれが作り出す可溶性の因子によって成り立っている。なかでも中心的な役割を果たしているのが白血球、特にリンパ球である。このリンパ球はＢリンパ球（以下、Ｂ細胞と記載することがある）とＴリンパ球（以下、Ｔ細胞と記載することがある）という２種類の主要なタイプに分けられ、いずれも抗原を特異的に認識し、これに作用して生体を防御する。
　Ｔ細胞は、末梢ではＣＤ（Ｃｌｕｓｔｅｒ　ｏｆ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）４マーカーを有するＣＤ４陽性Ｔ細胞、及びＣＤ８マーカーを有するＣＤ８陽性Ｔ細胞が大部分を占める。ＣＤ４陽性Ｔ細胞の大部分は、ヘルパーＴ（以下、Ｔｈと記載する）細胞と呼ばれ、抗体産生の補助や種々の免疫応答の誘導に関与し、抗原刺激により産生するサイトカインの種類が異なるＴｈ１型あるいはＴｈ２型などに分化する。ＣＤ８陽性Ｔ細胞の大部分は、抗原刺激により細胞傷害活性を示す細胞傷害性Ｔ細胞［Ｔｃ：細胞傷害性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｔ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）、別名をキラーＴ細胞といい、以下、ＣＴＬと記載することがある］と呼ばれ、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）などのタイプＩサイトカインを産生するＴｃ１型、あるいはＩＬ－４、ＩＬ－１０などのタイプＩＩサイトカインを産生するＴｃ２型に分化する。
　ＣＴＬには、主要組織適合遺伝子複合体（ｍａｊｏｒ　ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｃｏｍｐｌｅｘ；以下、ＭＨＣと略す）にコードされるＭＨＣクラスＩ分子（ヒトの場合、ｈｕｍａｎ　ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　ａｎｔｉｇｅｎ　クラスＩ分子と呼ばれ、以下、ＨＬＡクラスＩ分子と略す）と抗原との結合物である複合体を特異的なＴ細胞レセプター（Ｔ　ｃｅｌｌ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ；以下、ＴＣＲと略す）によって認識し、その複合体を細胞表面に提示している細胞を傷害することのできるものがある。
　外科手術、化学療法、放射線療法に次ぐ第４のがんの治療法として、免疫療法が近年関心を集めている。免疫療法はヒトが本来有する免疫力を利用するため、患者への肉体的負担が他の治療法と比べて軽いと言われている。免疫療法には体外で誘導したＣＴＬや末梢血リンパ球などから種々の方法で拡大培養して得られるリンフォカイン活性化細胞、ＮＫＴ細胞、γδＴ細胞などを移入する療法、体内での抗原特異的ＣＴＬの誘導を期待する樹状細胞移入療法やペプチドワクチン療法、Ｔｈ１細胞療法、更にこれら細胞に種々の効果を期待できる遺伝子を体外で導入して体内に移入する免疫遺伝子治療法などが知られている。
　リンフォカイン活性化細胞（ＬＡＫ細胞）は、リンパ球を含む末梢血液（末梢血白血球）、臍帯血、組織液などにＩＬ－２を加えて、数日間試験管内で培養することにより得られる細胞傷害活性を持つ機能的細胞集団である。この際、抗ＣＤ３抗体を加えて培養することにより、ＬＡＫ細胞の増殖は更に加速する。このようにして得られたＬＡＫ細胞は非特異的にさまざまながん細胞及びその他のターゲットに対して傷害活性を有する。
　前記のＬＡＫ細胞を移入する免疫療法において、体外で誘導した抗原特異的ＣＴＬを拡大培養する際に細胞傷害活性をいかに維持するか、リンパ球を体外でいかに効率よく拡大培養できるかなどの問題について、フィブロネクチン又はそのフラグメントを使用することによる効果が検討されてきた（例えば、特許文献１～３）。
　メモリーＴ細胞は、その細胞表面抗原の解析からナイーブＴ細胞と区別される。更に、メモリーＴ細胞は、その機能の違いからもナイーブＴ細胞と区別することができる。すなわち、メモリーＴ細胞はナイーブＴ細胞と比べて、より弱い抗原刺激でより早くエフェクター細胞へ分化することができる（非特許文献１）。更に、メモリーＴ細胞から分化したエフェクター細胞は、１つの細胞が複数のサイトカインを同時に産生することができる点で、機能的にもナイーブＴ細胞と異なっている。しかし、メモリーＴ細胞分化の分子機構は不明である。
　メモリーＴ細胞は、ホーミング能又はエフェクター機能の違いから、セントラルメモリーＴ細胞及びエフェクターメモリーＴ細胞といわれる異なる２つの細胞集団を含んでいる（非特許文献２）。
　近年、免疫療法では、すでに終末分化したエフェクターＴ細胞よりも、より未分化な状態のナイーブＴ細胞又はセントラルメモリーＴ細胞を生体に投与した方がはるかに高い治療効果が期待できると報告されている（例えば非特許文献３、４）。
　免疫遺伝子治療法について、例えば目的の抗原を認識するＴＣＲ遺伝子を、ＣＴＬをはじめとするＴ細胞に導入することにより、目的の抗原に特異的な細胞傷害活性を付与することが期待できる。これに基づき、ＭＡＲＴ１、ｇｐ１００、ｍＨＡＧ　ＨＡ－２抗原など、様々な抗原を標的としたＴＣＲ遺伝子による遺伝子治療が試みられている。更に、Ｔ細胞に導入するレセプターとして、ヒト由来のＴＣＲ、ヒト以外の生物由来のＴＣＲ、ならびに目的の抗原を認識する抗体の抗原認識部位、ＴＣＲと会合して抗原認識複合体を形成する分子群（例えばＣＤ３）、Ｔ細胞表面抗原（例えばＣＤ８、ＣＤ２８）及びこれらの一部を組み合わせたキメラレセプターをコードする遺伝子による遺伝子治療が試みられている。
　遺伝子導入には種々のベクターが使用されているが、これまでにヒトでの臨床への応用が研究されてきた遺伝子治療の多くは、組換えレトロウイルスベクター（例えば、複製能欠損レトロウイルスベクター）を用いるものである。レトロウイルスベクターは目的の外来遺伝子を細胞内に効率的に導入し、その染色体ＤＮＡ中に安定に組み込むので、特に長期にわたる遺伝子発現が望まれる遺伝子治療にとって好ましい遺伝子導入手段である。
　フィブロネクチンは動物の血液中、細胞表面、組織の細胞外マトリックスに存在する分子量２５万の巨大な糖タンパク質であり、多彩な機能を持つことが知られている。フィブロネクチン、そのフラグメントなどの機能性物質を用いた遺伝子導入方法は、レトロウイルス産生細胞と標的細胞との共培養を行わずに高効率で遺伝子導入を行うことを可能にする（例えば、特許文献４）。該方法による遺伝子導入効率の向上は、機能性物質がレトロウイルスと標的細胞とを近接した状態に共配置し、両者の相互作用の機会が増加することに起因すると考えられている。
　このようにレトロウイルスを用いた遺伝子導入においては、レトロウイルスの標的細胞への感染の結果として遺伝子の導入が起こる。しかしながら、レトロウイルスによる遺伝子導入効率は、実際の臨床への応用を考えた場合には今なお満足できるものではなく、感染効率のさらなる向上が強く望まれている。
　すでに、ビタミンＡ代謝産物であるレチノイン酸がＴ細胞に小腸組織へのホーミング特異性をインプリントする生理的因子であることが報告されている（特許文献５）。しかし、Ｔ細胞をレチノイン酸存在下で培養することにより、培養された細胞への遺伝子導入効率が向上することについては、記載も示唆もされていない。
国際公開第０３／０１６５１１号パンフレット 国際公開第０３／０８０８１７号パンフレット 国際公開第２００５／０１９４５０号パンフレット 国際公開第００／０１８３６号パンフレット 特開２００５－３３６０６２号公報
ネイチャー　イムノロジー（Ｎａｔ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、第１巻、第４７～５３頁、２０００年 ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第４０１巻、第７０８～７１２頁、１９９９年 ジャーナル　オブ　クリニカル　インベスティゲーション（Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．）、第１１５巻、第６号、第１６１６～１６２６頁、２００５年 ジャーナル　オブ　イムノロジー（Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、第１７５巻、第２号、第７３９～７４８頁、２００５年
　本発明の目的は、がんの免疫療法などの医療での使用に適した、レチノイン酸類存在下での培養を特徴とするメモリーＴ様細胞を高含有する細胞集団の製造方法、ならびに当該方法で得られる、生体への投与に有効な細胞集団を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意努力した結果、レチノイン酸類及びＣＤ３リガンドを使用して、Ｔ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を生体外で培養することにより、前記培養工程で得られた細胞集団に、所望の遺伝子が高効率で導入され高発現されることのみならず、メモリーＴ様細胞を高含有する細胞集団が得られることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち本発明を概説すれば、本発明の第１の態様は、レチノイン酸類及びＣＤ３リガンドを使用して、Ｔ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を生体外で培養する工程を含むことを特徴とするメモリーＴ様細胞を含有する細胞集団の製造方法に関する。
　本発明の第１の態様において、Ｔ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を生体外で培養する工程が、（１）～（３）から選択される工程のいずれかである製造方法も、本発明のメモリーＴ様細胞を含有する細胞集団の製造方法に包含される。
（１）レチノイン酸類及びＣＤ３リガンドの存在下でＴ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を培養する工程、
（２）レチノイン酸類及びＣＤ３リガンドの存在下でＴ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を培養し、次いで、レチノイン酸類及びＣＤ３リガンドの非存在下で該細胞集団を培養する工程、又は
（３）ＣＤ３リガンド存在下かつレチノイン酸類非存在下でＴ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を培養し、次いで、レチノイン酸類の存在下で該細胞集団を培養する工程。
　本発明の第１の態様において、Ｔ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を生体外で培養する工程が、フィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物の存在下で行われてもよい。また、Ｔ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団が末梢血単核細胞であってもよく、更に、得られた細胞集団からメモリーＴ様細胞を選択的に回収する工程を含む製造方法も、本発明のメモリーＴ様細胞を含有する細胞集団の製造方法に包含される。
　本発明の第１の態様により、弱い抗原刺激にも応答して迅速に細胞傷害活性を有する細胞に分化することができる細胞医療用の細胞集団が提供される。
　本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様で製造された細胞集団に関する。
　本発明の第３の態様は、下記工程を包含することを特徴とする、所望の遺伝子が導入された細胞集団の製造方法に関する：
（ａ）レチノイン酸類及びＣＤ３リガンドを使用して、Ｔ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を生体外で培養する工程、及び
（ｂ）工程（ａ）の途中又は工程（ａ）の終了後に細胞集団に所望の遺伝子を導入する工程。
　本発明の第３の態様は、下記工程（１）～（３）のいずれかにより実施される製造方法を包含する：
（１）レチノイン酸類及びＣＤ３リガンドの存在下でＴ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を培養し、得られた細胞に所望の遺伝子を導入する工程、
（２）レチノイン酸類及びＣＤ３リガンドの存在下でＴ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を培養し、得られた細胞集団に所望の遺伝子を導入した後で、レチノイン酸類及びＣＤ３リガンドの非存在下で該細胞集団を培養する工程、又は
（３）ＣＤ３リガンド存在下かつレチノイン酸類非存在下でＴ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を培養し、得られた細胞集団に所望の遺伝子を導入した後で、レチノイン酸類の存在下で該細胞集団を培養する工程。
　本発明の第３の態様において、Ｔ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を生体外で培養する工程が、フィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物の存在下で行われてもよい。また、所望の遺伝子がレトロウイルスベクターによって導入される方法、あるいはフィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物の存在下に所望の遺伝子が導入される方法も、本発明の所望の遺伝子が導入された細胞集団の製造方法に包含される。更に、所望の遺伝子が抗原を認識するレセプターをコードする遺伝子であってもよく、抗原を認識するレセプターがＴ細胞レセプターであってもよい。また、Ｔ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団が末梢血単核細胞である方法も、本発明の所望の遺伝子が導入された細胞集団の製造方法に包含される。
　本発明の第３の態様により、メモリーＴ様細胞の比率が増加し、所望の遺伝子が高効率で導入され高発現した、細胞医療用の細胞集団が提供される。
　本発明の第４の態様は、本発明の第３の態様により得られる、所望の遺伝子が導入されたＴ細胞集団に関する。
　本発明により、免疫療法への使用に適したメモリーＴ様細胞を含有する細胞集団を製造する方法、及び、メモリーＴ様細胞の比率が増加し、所望の遺伝子が高効率で導入され高発現している細胞集団を製造する方法が提供される。当該製造方法により得られる細胞集団は、細胞医療による疾患の治療に極めて有用である。
第４日目の細胞表面マーカーの分布を示す図である。 細胞増殖率を示す図である。 第４日目の細胞表面マーカーの分布を示す図である。 第７日目の細胞表面マーカーの分布を示す図である。 ＣＤ８陽性細胞の導入遺伝子の発現率を示す図である。 遺伝子導入細胞における導入遺伝子のコピー数を示す図である。 細胞増殖率を示す図である。 第７日目の細胞表面マーカーの分布を示す図である。 第７日目の遺伝子導入用ウイルス結合プレートを用いた導入法での導入遺伝子の発現率を示す図である。 第６日目のポリブレンを用いた導入法での導入遺伝子の発現率を示す図である。 遺伝子導入細胞における導入遺伝子のコピー数を示す図である。 ＣＤ８単独陽性細胞の導入遺伝子の発現率を示す図である。 ＣＤ８単独陽性細胞のＩＬ－４産生かつＩＦＮ－γ非産生細胞率の測定結果を示す図である。 ＣＤ８単独陽性細胞のｐｅｒｆｏｒｉｎ産生細胞率の測定結果を示す図である。 遺伝子導入細胞の各Ｅ／Ｔ　ｒａｔｉｏでのＭＡＧＥ－Ａ４由来ペプチドｐ１４３に対する特異的細胞傷害活性を示す図である。 ＣＤ８単独陽性細胞のテトラマー陽性細胞割合、すなわち導入遺伝子の発現率を示す図である。 第１１日目のＣＤ８単独陽性細胞の細胞表面マーカーの分布を示す図である。 第１１日目のテトラマー陽性かつＣＤ８単独陽性細胞の細胞表面マーカーの分布を示す図である。 ＣＤ８単独陽性細胞のＩＬ－４産生又は非産生、及びＩＦＮ－γ産生又は非産生細胞率の測定結果を示す図である。 ＣＤ８単独陽性細胞のＩＬ－４産生かつＩＦＮ－γ非産生細胞率（Ｔｃ２）とＩＬ－４非産生かつＩＦＮ－γ産生細胞率（Ｔｃ１）の比を示す図である。 ＣＤ８単独陽性細胞のｐｅｒｆｏｒｉｎ産生細胞率の測定結果を示す図である。 遺伝子導入細胞のＭＡＧＥ－Ａ４由来ペプチドｐ１４３に対する特異的細胞傷害活性を示す図である。 ＣＤ８単独陽性細胞のテトラマー陽性細胞割合、すなわち導入遺伝子の発現率を示す図である。 テトラマー陽性かつＣＤ８単独陽性細胞におけるテトラマーの発現量を平均蛍光強度の値で示した図である。 遺伝子導入細胞における導入遺伝子のコピー数を示す図である。 第１０日目のＣＤ４単独陽性細胞の細胞表面マーカーの分布を示す図である。 ＣＤ４単独陽性細胞のＩＬ－４産生かつＩＦＮ－γ非産生細胞率、ＩＬ－４産生かつＩＦＮ－γ産生細胞率、ＩＬ－４非産生かつＩＦＮ－γ産生細胞率の測定結果を示す図である。 ＣＤ４単独陽性細胞のＩＬ－４産生、ＩＦＮ－γ産生細胞率の測定結果を示す図である。 ＣＤ４単独陽性細胞のＩＬ－４産生かつＩＦＮ－γ非産生細胞率（Ｔｈ２）とＩＬ－４非産生かつＩＦＮ－γ産生細胞率（Ｔｈ１）の比を示す図である。
　本発明において、「レチノイン酸」は、ビタミンＡ酸とも呼ばれ、鎖部の二重結合がすべてｔｒａｎｓのａｌｌ－ｔｒａｎｓ－レチノイン酸又は９位がｃｉｓ構造をとる９－ｃｉｓ－レチノイン酸のいずれでもよい。また、その他のレチノイン酸異性体及びレチノイン酸誘導体も本発明において使用することができる。前記のレチノイン酸、レチノイン酸異性体及びレチノイン酸誘導体又はそれらの塩を、本明細書ではレチノイン酸類と総称する。さらに、本発明において、使用するレチノイン酸類は１種類でもよく、複数種類を組み合わせて使用してもよい。
　Ｔ細胞とは、Ｔリンパ球とも呼ばれ、免疫応答に関与するリンパ球のうち胸腺に由来する細胞を意味し、分化したＴ細胞及び未分化なＴ細胞を含む。Ｔ細胞としては、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、キラーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、α鎖とβ鎖のＴＣＲを発現するαβＴ細胞、γ鎖とδ鎖のＴＣＲを発現するγδＴ細胞などが知られている。本明細書において「Ｔ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団」としては、特に本発明を限定するものではないが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナイーブＴ細胞、造血幹細胞、臍帯血単核球などが例示される。また、Ｔ細胞を含有する血球系細胞由来の種々の細胞集団を本発明に使用できる。これらの細胞はＩＬ－２などのサイトカインにより生体内（イン・ビボ）又は生体外（エクス・ビボ）で活性化されていても良い。これらの細胞は生体から採取されたもの、あるいは生体外での培養を経て得られたものをそのまま使用してもよく、凍結保存した後に使用してもよい。また、例えば生体から得られた細胞集団から種々の誘導操作又は分離操作を経て得られた細胞集団、例えば、ＰＢＭＣ等の細胞をＣＤ８＋（陽性）又はＣＤ４＋（陽性）細胞に分離して得られたいずれの細胞集団も使用することができる。更に、本発明の細胞集団の製造方法では、前記細胞を含有する材料、例えば、末梢血液、臍帯血などの血液、又は血液から赤血球もしくは血漿などの成分を除去したもの、骨髄液などを使用することもできる。
　メモリーＴ細胞は、前の感染又はワクチン接種にて遭遇したバクテリア又はウイルスのような外来の侵入者を認識できるＴ細胞の特定のタイプである。侵入者との２回目の遭遇の際に、メモリーＴ細胞は、免疫系が最初に侵入者に応答した時よりも早く強く免疫応答を開始する。また、メモリーＴ細胞はホーミング能又はエフェクター機能の違いから、セントラルメモリーＴ細胞とエフェクターメモリーＴ細胞といった異なる２つの細胞集団を含んでいる（非特許文献２）。セントラルメモリーＴ細胞は、メモリー幹細胞としての性質を示すと考えられ、ＳＴＡＴ５として知られる重要な転写因子の高レベルリン酸化によって自己複製能を示す。セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＡが陰性であるが、ＣＣＲ７及びＬ－セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）が共に陽性である。エフェクターメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＡに加えてＣＣＲ７及びＣＤ６２Ｌも陰性である。
　メモリーＴ細胞は、その細胞表面抗原の解析からナイーブＴ細胞と区別される。ナイーブＴ細胞は、細胞表面抗原マーカーであるＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７及びＣＤ６２Ｌがいずれも陽性であるのに対し、セントラルメモリーＴ細胞及びエフェクターメモリーＴ細胞からなるメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＡが陰性である。更に、メモリーＴ細胞は、前記のとおり迅速に免疫応答を開始できる点からもナイーブＴ細胞と区別することができる。
　本発明において、「メモリーＴ様細胞」は、セントラルメモリーＴ様細胞及びエフェクターメモリーＴ様細胞の両方を包含する。
　本発明において、「メモリーＴ様細胞を含有する細胞集団の製造」とは、メモリーＴ様細胞への分化能を有する前駆細胞からのメモリーＴ様細胞の誘導及びメモリーＴ様細胞の増殖（拡大培養）を含む概念を意味する。本発明により、メモリーＴ様細胞を高い比率で含有する細胞集団を得ることができる。
　本発明において、「フィブロネクチン」及びそのフラグメントは、天然から単離されたもの、人為的に作製されたもの、又は遺伝子工学的に調製された組換え体、すなわち非天然のもののいずれでもよい。フィブロネクチン及びそのフラグメントは、例えば、ルオスラーティ　Ｅ．ら〔Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ　Ｅ．，　ｅｔ　ａｌ．、ジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリー（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．）、第２５６巻、第１４号、第７２７７～７２８１頁（１９８１）〕の開示に基づき、天然起源の物質から実質的に純粋な形態で製造することができる。また、フィブロネクチンフラグメントを調製するための情報であるフィブロネクチンをコードする核酸配列及びフィブロネクチンのアミノ酸配列については、ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００２０２６、ＮＰ＿００２０１７にそれぞれ開示されている。本明細書において、実質的に純粋なフィブロネクチン又はフィブロネクチンフラグメントとは、これらが天然においてフィブロネクチンと一緒に存在する他のタンパク質を本質的に含有していないことを意味する。上記のフィブロネクチン及びそのフラグメントは、それぞれ単独で、もしくは複数の種類のものを混合して本発明に使用することができる。
　フィブロネクチンのドメイン構造は７つに分けられ、そのアミノ酸配列中には３種類の類似の配列が含まれており、これら各配列の繰返しで全体が構成されている。３種類の類似の配列は、それぞれＩ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型と呼ばれている。フィブロネクチン中には１４個のＩＩＩ型の配列が存在するが、そのうち、８番目、９番目、１０番目（以下、それぞれＩＩＩ－８、ＩＩＩ－９及びＩＩＩ－１０と称する）は細胞結合ドメインに、また１２番目、１３番目及び１４番目（以下、それぞれＩＩＩ－１２、ＩＩＩ－１３及びＩＩＩ－１４と称する）はヘパリン結合ドメインに含有されている。また、ヘパリン結合ドメインのＣ末端側にはＩＩＩＣＳと呼ばれる領域が存在する。ＩＩＩＣＳには２５残基のアミノ酸からなる、ＶＬＡ－４に対して結合活性を有するＣＳ－１と呼ばれる領域が存在する。本発明に使用できるフィブロネクチンフラグメントは、ＩＩＩ－７、８、９、１１、１２、１３又はＣＳ－１のいずれかのドメインを含むフラグメントであればよく、更に複数のドメインが繰り返し連結されたフラグメントであってもよい。例えば、ＶＬＡ－５へのリガンドを含む細胞接着ドメイン、ヘパリン結合ドメイン、ＶＬＡ－４へのリガンドであるＣＳ－１ドメインなどを含有するフラグメントが本発明に使用される。前記組換えフラグメントとしては、例えば、ジャーナル　オブ　バイオケミストリー（Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第１１０巻、第２８４～２９１頁（１９９１）に記載されたＣＨ－２７１（配列表の配列番号１）、ＣＨ－２９６（配列表の配列番号２）、Ｈ－２７１（配列表の配列番号３）、Ｈ－２９６（配列表の配列番号４）、又はこれらの誘導体もしくは改変物が例示される。前記のＣＨ－２９６はレトロネクチン（登録商標、タカラバイオ社製）の名称で市販されている。
　本明細書において、「有効成分」とは、レチノイン酸類、ＣＤ３リガンド、フィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物、その他の副刺激因子、細胞の培養に用いられる培地中に含まれ得る適当な化合物、タンパク質、サイトカイン類あるいはその他の成分を示す。
　以下、本発明を具体的に説明する。
１．メモリーＴ様細胞を含有する細胞集団の製造方法－１
　本発明のメモリーＴ様細胞を含有する細胞集団の製造方法は、レチノイン酸類及びＣＤ３リガンドを使用して、Ｔ細胞を含有する細胞集団を生体外で培養する工程を含むことを特徴とする方法である。本発明によれば生体外でメモリーＴ様細胞を含有する細胞集団を製造することが可能である。更に、当該方法により得られる細胞集団に含有されるメモリーＴ様細胞は、弱い抗原刺激にも応答して迅速に細胞傷害活性を有する細胞（細胞傷害性リンパ球）へ分化する能力を有しており、免疫療法などへの利用に好適である。
　本発明の方法において、メモリーＴ様細胞の培養は、通常、本発明の有効成分の存在下、所定の成分を含む培地中で行なわれる。本発明において使用される培養開始時の細胞数としては、特に限定はないが、例えば、１０～１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、好適には１０２～５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好適には１０３～２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬが例示される。
　本発明のメモリーＴ様細胞を含有する細胞集団の製造方法において使用される培地は有効成分を含有する限り特に限定はなく、Ｔ細胞又はその前駆細胞の維持、生育に適した成分などを混合して作製された公知の培地を使用することができ、例えば、市販の培地又はその改変物であってもよい。これらの培地はその本来の構成成分以外に適当なタンパク質、サイトカイン類又はその他の成分を含んでいてもよい。好適には、本発明の製造方法において、ＩＬ－２を含有する培地が使用され得る。ＩＬ－２の培地中の濃度は特に限定されないが、例えば、好適には０．１～１×１０５ＩＵ／ｍＬ、より好適には１～１×１０４ＩＵ／ｍＬである。
　有効成分として本発明に使用されるレチノイン酸類の培地中の濃度は、特に限定されないが、ａｌｌ－ｔｒａｎｓ－レチノイン酸を使用する場合、例えば、好適には、０．０１～１０４ｎＭ、より好適には０．１～１０３ｎＭであり、９－ｃｉｓ－レチノイン酸を使用する場合、例えば、好適には、０．１～１０５ｎＭ、より好適には１～１０４ｎＭである。
　また、有効成分として本発明に使用されるＣＤ３リガンドとしては、ＣＤ３に結合活性を有する物質であれば特に限定されないが、例えば、抗ＣＤ３抗体、ＣｏｎＡ、ＰＨＡ、ＰＭＡ＋イオノマイシンなどが例示される。特に好適には、抗ＣＤ３モノクローナル抗体、例えば、ＯＫＴ３［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２０６巻、第３４７－３４９頁（１９７９）］が本発明にて使用される。ＣＤ３リガンドの培地中の濃度は、特に限定されないが、例えば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体を使用する場合、０．００１～１００μｇ／ｍＬ、特に０．０１～１００μｇ／ｍＬが好適である。リンパ球上のレセプターを活性化する目的で、抗ＣＤ３抗体を培地に添加してもよい。
　更に、有効成分としてフィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物を添加してもよい。フィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物の培養中の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．００１～５００μｇ／ｍＬ、特に０．０１～５００μｇ／ｍＬが好適である。フィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物存在下での培養は、本発明において培養工程の一部のみで実施してもよく、培養全体を前記成分の存在下で実施してもよい。また、このほかに、レクチンなどのリンパ球刺激因子を培地に添加することもできる。当該成分の培地中の濃度は、所望の効果が得られる限り、特に限定されるものではない。
　また、本発明において、必要に応じて、ＣＤ２８リガンドなどのその他の副刺激因子を添加することによって副刺激を導入することもできる。その他の副刺激因子として、例えば、所望の抗原、ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ＴＮＦ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｌｉｇａｎｄ（ＧＩＴＲＬ）、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体などが例示される。
　なお、これらの成分のうち、「ＣＤ３リガンド」及び「フィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物」は、培地中に溶解して共存させる以外に、適切な固相、例えば、シャーレ、フラスコ、バッグなどの細胞培養用器材（開放系のもの又は閉鎖系のもののいずれも含む）、又はビーズ、メンブレン、スライドガラスなどの細胞培養用担体に固定化して使用してもよい。それらの固相の材質は細胞培養に使用可能なものであれば特に限定されるものではない。該成分を、例えば、前記器材に固定化する場合、培地を該器材に入れた際に、該成分を培地中に溶解して用いる場合の所望の濃度と同様の割合となるように、器材に入れる培地量に対して各成分の一定量を固定化するのが好適であるが、当該成分の固定化量は所望の効果が得られる限り、特に限定されるものではない。前記担体は、細胞培養時に細胞培養用器材中の培養液に浸漬して使用される。前記成分を前記担体に固定化する場合、該担体を培地に入れた際に、該成分を培地中に溶解して用いる場合の所望の濃度と同様の割合となるように、器材に入れる培地量に対して各成分の一定量を固定化するのが好適であるが、当該成分の固定化量は所望の効果が得られる限り、特に限定されるものではない。いずれの場合においても、前記成分の固定化は、公知の方法、例えば、国際公開第９７／１８３１８号パンフレット及び国際公開第００／０９１６８号パンフレットに記載されたフィブロネクチンフラグメントの固定化方法に準じて行なうことができる。更に「ＣＤ３リガンド」及び「フィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物」以外の有効成分を、細胞培養用器材又は細胞培養用担体に固定化してもよい。
　前記の種々の成分や、本発明の有効成分から選択されるものを固相に固定化しておけば、本発明の方法によりメモリーＴ様細胞を得た後で該Ｔ細胞と固相とを分離するのみで、有効成分等と該Ｔ細胞を容易に分離することができ、該Ｔ細胞への有効成分などの混入を防ぐことができる。
　本発明に使用される培地は、前記の有効成分に加えて、サイトカイン類、適当なタンパク質又はその他の成分を含んでいてもよい。サイトカイン類としては、例えば、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１などが例示される。また、レクチンなどのリンパ球刺激因子を添加することもできる。
　本発明には血清又は血漿を含有しない培地を使用することもできるが、培地に血清又は血漿を添加してもよい。これらの培地中への添加量は特に限定はされないが、０超～２０容量％、好適には０超～５容量％の含有量が例示され、また、培養段階に応じて使用する血清又は血漿の量を変更することができる。例えば、血清又は血漿濃度を段階的に減らして使用することもできる。なお、血清又は血漿の由来としては、自己（培養する細胞と由来が同じであることを意味する）又は非自己（培養する細胞と由来が異なることを意味する）のいずれでもよいが、安全性の観点から、自己由来のものが好適に使用される。
　本発明において使用される培養開始時の細胞数としては、特に限定はされないが、例えば、好適には１０～１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好適には１０２～５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、更に好適には１０３～２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬが例示される。また、培養条件に特に限定はなく、細胞培養に通常使用される条件を使用することができる。例えば、３７℃、５％ＣＯ２などの条件で培養することができる。また、適当な時間間隔をおいて細胞培養液に新鮮な培地を加えて希釈する、培地を交換する、細胞培養用器材を交換するなどの操作を行うことができる。
　本発明の細胞集団の製造方法において使用される細胞培養用器材として、特に限定されないが、例えば、シャーレ、フラスコ、バッグ、大型培養槽、バイオリアクターなどを使用することができる。なお、バッグとしては、細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを使用することができる。また、工業的に大量の細胞集団を製造する場合には、大型培養槽を使用することができる。また、培養は開放系又は閉鎖系のいずれにおいても実施することができるが、得られる細胞集団の安全性の観点から、閉鎖系で培養を行うことが好ましい。
　レチノイン酸類をＴ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞培養液へ添加する時期は、培養開始時からが好ましい。例えばレチノイン酸類及びＣＤ３リガンドの存在下での培養工程は、培養開始時から少なくとも１日以上、より好ましくは２～７日間、更に好ましくは２～５日間実施される。また、レチノイン酸類は培養液中で分解される可能性もあるので、適当時間経過後に新たにレチノイン酸類を添加してもよい。
　また、培養条件に特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を使用することができる。例えば、３７℃、５％ＣＯ２などの条件下で培養することができる。また、適当な時間間隔をおいて培地を新鮮なものに交換することができる。
　本発明の製造方法で得られる細胞集団は、ＣＤ４５ＲＡを発現しないが、ＣＣＲ７及び／又はＣＤ６２Ｌを発現する細胞、ならびにＣＣＲ７及びＣＤ６２Ｌが共に陰性である細胞の含有率が高い。ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７及びＣＤ６２Ｌはいずれも、リンパ球の細胞表面抗原マーカーである。すなわち、本発明の製造方法により得られる細胞集団に高比率に含まれる細胞は、メモリーＴ様細胞に分類することができる。前述の非特許文献３及び４に記載のとおり、メモリーＴ細胞は生体に投与した際の生体内での生存率、細胞増殖効果、腫瘍への集積効果及び腫瘍特異的エフェクター細胞の産生率が高く、細胞医療分野において有用であることが記載されている。つまり、本発明の製造方法は、メモリーＴ様細胞の比率を上昇させることができる。ここでメモリーＴ様細胞比率の上昇とは、本発明の有効成分の有無以外は同等の条件で培養を実施した場合に、本発明の方法に使用される有効成分の存在下での培養により得られた細胞集団のメモリーＴ様細胞比率が、前記の有効成分の非存在下での培養と比較して高いことを意味する。好適には、前記の成分の非存在下の場合と比較して５％以上、より好ましくは１０％以上メモリーＴ様細胞の比率が高い細胞集団を得ることができる。また、本発明の製造方法で得られる細胞集団は、Ｔｃ２型及び／又はＴｈ２型の表現型の細胞を高含有する。
　本発明の製造方法で得られる細胞集団について、レチノイン酸類を含有する培地又は含有しない培地でさらに培養を行ってもよい。通常、この際の培養は、ＣＤ３リガンドの非存在下で実施される。
本発明において、総培養日数は、好適には４～１４日間であり、より好適には５～１４日間、更に好適には７～１４日間である。
　本発明のメモリーＴ様細胞を含有する細胞集団の製造方法により得られた細胞集団中には、通常、メモリーＴ様細胞以外の細胞も混在している。本発明では、該細胞集団から遠心分離などにより細胞を回収し、本発明の製造方法により得られたメモリーＴ様細胞として、例えば、そのまま使用することができる。しかも、前記有効成分などを細胞培養用器材などに固定化しておけば、得られたメモリーＴ様細胞への該有効成分などの混入を防ぐことができる。
　また、本発明の製造方法は、該細胞集団からメモリーＴ様細胞を分離する工程をさらに含んでもよい。すなわち、本発明において、メモリーＴ様細胞を含有する細胞集団中のメモリーＴ様細胞以外の細胞とメモリーＴ様細胞との分離操作を施すことにより、メモリーＴ様細胞が濃縮された細胞集団を調製し、使用することができる。例えば、ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞を除去する工程を含んでいてもよい。メモリーＴ様細胞の分離は公知の方法に従って実施することができる。例えば、フローサイトメーターを用いて、蛍光標識した抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ４５ＲＡ抗体で共染色することにより区分されるＣＤ３陽性かつＣＤ４５ＲＡ陰性細胞を選択的に回収することによって、メモリーＴ様細胞を分離することができる。また、本発明の製造方法より得られた細胞集団から、メモリーＴ様細胞以外の細胞を除去することにより、メモリーＴ様細胞を高含有する細胞集団を得ることができる。また、本発明におけるメモリーＴ様細胞を高含有する細胞集団には、メモリーＴ様細胞のみの細胞集団も包含され得る。
　本発明によれば、「上記の細胞集団の製造方法」を利用して所望の遺伝子が導入された細胞集団を製造する方法が提供される。当該方法は、以下の工程を包含する：
（１）レチノイン酸類及びＣＤ３リガンドを使用して、Ｔ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を生体外で培養する工程、及び
（２）所望の遺伝子を工程（１）で得られた細胞集団に導入する工程。
　第１の工程の後に遺伝子導入操作を実施することにより、Ｔ細胞への遺伝子導入の効率が向上する。すなわち、本発明の方法により製造される細胞集団は所望の遺伝子が導入されたＴ細胞を高比率で含む細胞集団である。本発明は遺伝子治療用細胞の製造に特に有用である。
　本発明においてＴ細胞に導入される所望の遺伝子は特に限定はなく、自己由来の遺伝子又は外来遺伝子から前記細胞に導入することが望まれる任意の遺伝子を選ぶことができる。このような遺伝子としては、例えば、タンパク質（例えば、酵素、サイトカイン類、レセプター類など）をコードするもの以外に、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ）又はリボザイムをコードするものが使用できる。また、遺伝子導入された細胞の選択を可能にする適当なマーカー遺伝子を上記遺伝子と一緒に導入してもよい。
　導入される所望の遺伝子は天然より得られたものでも、又は遺伝子工学的に作製されたものでもよく、あるいは起源を異にするＤＮＡ分子がライゲーションなどの公知の手段によって結合されたものであってもよい。更に、目的に応じて天然の配列に変異が導入された配列を有するものであってもよい。
　本発明の方法によれば、例えば、癌などの患者の治療に使用される薬剤に対する耐性に関連する酵素をコードする遺伝子をリンパ球に導入して該リンパ球に薬剤耐性を付与することができる。そのようなリンパ球を用いれば、養子免疫療法と薬剤療法とを組み合わせることができ、それにより、より高い治療効果を得ることが可能となる。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、多剤耐性遺伝子（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｇｅｎｅ）が例示される。一方、前記の態様とは逆に、特定の薬剤に対する感受性を付与するような遺伝子をリンパ球に導入して、該薬剤に対する感受性を付与することもできる。かかる場合、生体に移植した後のリンパ球を当該薬剤の投与によって除去することが可能となる。薬剤に対する感受性を付与する遺伝子としては、例えば、チミジンキナーゼ遺伝子が例示される。
　特に限定はされないが、本発明の一態様として、所望の抗原を認識するレセプターをコードする遺伝子の導入が例示される。当該遺伝子としては、標的細胞の表面抗原を認識するＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）をコードする遺伝子、又は標的細胞の表面抗原に対する抗体の抗原認識部位を有し、かつＴＣＲの細胞内領域を含むキメラレセプターをコードする遺伝子が例示される。この遺伝子が導入されたＴ細胞を含む細胞集団は、所望の抗原を認識するＴ細胞を含有している細胞集団である。当該細胞集団は、レセプターをコードする遺伝子が導入されていない細胞集団と比較して、所望の抗原に対する特異性の高い細胞集団であり、所望の抗原の刺激を受けた際に所望の抗原に特異的に反応することができることから、免疫療法への利用に有用である。
　本発明の遺伝子が導入された細胞集団の製造方法において、第１の工程は、前記の「メモリーＴ様細胞を含有する細胞集団の製造方法」に従って実施される。第１の工程の培養は少なくとも１日以上、より好ましくは２～７日間、更に好ましくは２～５日間実施された後で、後述の第２の工程が実施される。
　本発明の遺伝子が導入された細胞集団の製造方法において、得られる細胞集団は、メモリーＴ様細胞の比率が増加し、抗原特異的にＩＦＮ－γを産生する細胞比率が低下し、ＩＬ－４及びｐｅｒｆｏｒｉｎを産生する細胞比率が向上したＴｃ２型及び／又はＴｈ２型の細胞を高含有する細胞集団である。この細胞集団は液性免疫の増強を介して寄生虫感染に対する免疫応答ならびに臓器移植におけるＧＶＨＤの軽減及びＧＶＬの増強に有用であることから、細胞医療分野への使用に極めて適している。特に、同種造血幹細胞移植後の再発白血病を対象としたドナーリンパ球輸注療法において、副作用として発症する移植片対宿主病（Ｇｒａｆｔ　ｖｅｒｓｕｓ　ｈｏｓｔ　ｄｉｓｅａｓｅ：ＧＶＨＤ）をひき起こす率がＴｃ１細胞あるいはＴｈ１細胞と比して低いとされているので、本発明の細胞集団は有用である［Ｆｏｗｌｅｒ　Ｄ．　Ｈ．　他１名、ロイケミア　アンド　リンフォーマ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ　ａｎｄ　Ｌｙｍｐｈｏｍａ）、第３８巻、第２２１～２３４頁（２０００）］。
　本発明の細胞集団の製造方法において、第２の工程は、第１の工程で得られた細胞に所望の遺伝子を導入する工程である。なお、細胞に導入する所望の遺伝子の数に限定はなく、１個の遺伝子であっても良く、複数の遺伝子（例えば、１～９個の遺伝子）であっても良い。例えば、導入する細胞に応じてＴ細胞表面抗原をコードする遺伝子などの適当な遺伝子を、同時に、前もって、又は後で導入することができる。例えば、γδＴ細胞にαβＴＣＲ遺伝子を導入する場合、ＣＤ８をコードする遺伝子を同時に導入することが好ましい。
　本発明において、所望の遺伝子の導入手段に特に限定はなく、公知の遺伝子導入方法により適切なものを選択して使用することができる。前記の遺伝子導入方法としては、ウイルスベクターを使用する方法、該ベクターを使用しない方法のいずれも本発明にて使用できる。それらの方法の詳細については、すでに多くの文献が公表されている。
　前記ウイルスベクターに特に限定はなく、遺伝子導入方法に通常使用される公知のウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクター、シュードタイプベクターを包含する）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが使用できる。特に好適には、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はレンチウイルスベクターが使用される。上記ウイルスベクターとしては、感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させたものが好適である。
　ウイルスベクターを使用しない遺伝子導入方法として、本発明を限定するものではないが、例えば、リポソーム、リガンド－ポリリジンなどの担体を使用する方法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などを使用することができる。この場合、プラスミドＤＮＡ、直鎖状ＤＮＡ又はＲＮＡに組み込まれた外来遺伝子が導入される。
　レトロウイルスベクターならびにレンチウイルスベクターは、当該ベクターが導入される細胞の染色体ＤＮＡ中に該ベクターに挿入されている外来遺伝子を安定に組み込むことができ、遺伝子治療等の目的に使用されている。当該ベクターは分裂、増殖中の細胞に感染しうることから、本発明の製造方法にて遺伝子導入を行うのに特に好適である。
　所望の遺伝子は、例えば、適当なプロモーターの制御下に発現されるようにベクター又はプラスミドなどに挿入して使用することができる。また、効率のよい遺伝子の転写を達成するために、プロモーター又は転写開始部位と協同する他の調節要素、例えば、エンハンサー配列又はターミネーター配列がベクター内に存在していてもよい。また、相同組換えにより導入対象のＴ細胞の染色体へ挿入することを目的として、例えば、該染色体における遺伝子の所望の標的挿入部位の両側にある塩基配列に各々相同性を有する塩基配列からなるフランキング配列の間に前記の遺伝子を配置してもよい。
　本発明に使用できるベクターとして、例えば、ＭＦＧベクター、α－ＳＧＣベクター（国際公開第９２／０７９４３号パンフレット）、ｐＢａｂｅ［Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ　Ｊ．　Ｐ．、Ｌａｎｄ　Ｈ．、ヌクレイック　アシッズ　リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第１８巻、第１２号、第３５８７～３５９６頁（１９９０）］、ｐＬＸＩＮ（クロンテック社製）、ｐＤＯＮ－ＡＩ（タカラバイオ社製）などのレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター［ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来ベクター、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）由来ベクターなど］、又はこれらを改変したベクターが例示される。
　また、これらのベクターは公知のパッケージング細胞株、例えば、ＰＧ１３（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１０６８６）、ＰＧ１３／ＬＮｃ８（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１０６８５）、ＰＡ３１７（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－９０７８）、ＧＰ＋Ｅ－８６（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－９６４２）、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－９６４１）、プロシーディングス　オブ　ザ　ナショナル　アカデミー　オブ　サイエンシーズ　オブ　ザ　ＵＳＡ、第８５巻、第６４６０～６４６４頁（１９８８）に記載のψＣＲＩＰなどの細胞株を使用することにより、該ベクターがパッケージングされたウイルス粒子として調製することができる。また、トランスフェクション効率の高い２９３細胞又は２９３Ｔ細胞を用いてレトロウイルス産生細胞を作製することもできる。
　本発明には、当該レトロウイルスのゲノムが由来するものとは異種のウイルス由来のエンベロープを有する、シュードタイプ（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）パッケージングによって作製されたレトロウイルスも使用することができる。例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）又はネコ内在性ウイルス（ｆｅｌｉｎｅ　ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　ｖｉｒｕｓ）由来のエンベロープ又はエンベロープとして機能しうるタンパク質を有するシュードタイプレトロウイルスを使用することができる。更に、糖鎖合成に関与する酵素遺伝子などを導入したレトロウイルス産生細胞を用いて作製された、糖鎖修飾を受けたタンパクをその表面に有するレトロウイルスも本発明に使用できる。前記のウイルスは、それぞれのエンベロープを発現するパッケージング細胞を使用して調製することができる。パッケージング細胞はすでに種々のものが報告されており、市販されているものもある。本発明には、これらの公知のパッケージング細胞を使用することができる。
　レトロウイルスベクターを使用して遺伝子導入を行う場合、レトロウイルス結合活性を有する機能性物質を使用して遺伝子導入効率を向上させることができる。当該方法に使用されるレトロウイルス結合活性を有する機能性物質は、特に限定されるものではなく、例えば、フィブロネクチンのヘパリン－ＩＩ結合領域、線維芽細胞増殖因子、Ｖ型コラーゲン、前記のポリペプチドのフラグメント、ポリリジン、ＤＥＡＥ－デキストランなどがある。フィブロネクチンフラグメントは分子内にヘパリン－ＩＩ結合領域を有するものが好適であり、そのようなフラグメントは国際公開第９５／２６２００号パンフレット、国際公開第９７／１８３１８号パンフレットにも記載されている。ヘパリン－ＩＩ結合領域を有するフィブロネクチンフラグメントであるＣＨ－２９６は、レトロネクチン（登録商標、タカラバイオ社製）の名称で市販されている。またこれらの機能性物質と機能的に同等な物質、例えば、ヘパリン結合性部位を有する機能性物質も使用することができる。また、該機能性物質の混合物、該機能性物質を含有するポリペプチド、該機能性物質の重合体、該機能性物質の誘導体なども使用することができる。
　また、本発明にて、標的細胞結合活性を有する機能性物質を併用してもよい。当該物質は標的細胞への遺伝子導入効率の向上、又は標的細胞特異的な遺伝子導入の実施に有用である。標的細胞結合活性を有する機能性物質は、特に限定されるものではないが、例えば、標的細胞に結合するリガンドを有する物質であり、該リガンドとして、細胞接着性のタンパク質（フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲンなど）もしくはそのフラグメント、ホルモン、サイトカイン、細胞表面の抗原に対する抗体、多糖類、糖タンパク質、糖脂質、糖タンパク質、糖脂質由来の糖鎖、標的細胞の代謝物などが挙げられる。また、該機能性物質を含有するポリペプチド、該機能性物質の重合体、該機能性物質の誘導体、該機能性物質の機能的同等物などを使用することもできる。標的細胞結合活性を有する機能性物質は、レトロウイルス結合活性を有する機能性物質と同様に、固相に固定化して使用され得る。更に、前記のレトロウイルス結合活性を有する機能性物質として、標的細胞結合活性を併せ持つものを使用することもできる。
　以上説明したように、レチノイン酸類を含む前記の有効成分の存在下で培養した後で遺伝子導入を行う本発明の方法により、Ｔ細胞を含有する細胞集団への遺伝子導入を効率よく行うことが可能となる。また、本発明の方法は、特別な設備、装置を必要とせず、また、多種のレトロウイルスベクター及び標的細胞について有効である。更に、当該方法は閉鎖系での利用に適していることから、遺伝子治療などの臨床用途で非常に有用である。
　本発明の細胞集団の製造方法は、第３の工程として、第２の工程で得られた遺伝子導入細胞を培養する工程をさらに包含してもよい。
　前記の工程は、通常の細胞培養の方法、例えば、公知のＴ細胞の培養方法により実施してもよい。前記の第１の工程と同一の条件、あるいは前記方法で有効成分として使用されたレチノイン酸類もしくはＣＤ３リガンドのいずれか又は両方の使用を除いて、第１の工程で使用されたものと同様の条件で細胞の培養を行ってもよい。
　本発明の細胞集団の製造方法において、総培養日数は、好適には４～１４日間とすることが好ましい。なお、総培養日数が４日未満の場合は、一般的な免疫療法に使用するには満足のできる細胞数を得ることができない。また、総培養日数が１４日間を超えると細胞増殖率が低下する。本発明において、総培養日数は、より好適には５～１４日間、更に好適には７～１４日間である。
２．メモリーＴ様細胞を含有する細胞集団の製造方法－２
　本発明者らは、驚くべきことに、前記の「メモリーＴ様細胞を含有する細胞集団の製造方法－１」とはレチノイン酸添加時期を変えて培養を行うことによって、前記方法で製造されるＴｃ２型及び／又はＴｈ２型の細胞を高含有する細胞集団ではなく、Ｔｃ１型及び／又はＴｈ１型の細胞を高含有する細胞集団を製造することができることを見出した。当該製造方法は以下の工程を包含する。
（１）Ｔ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を、ＣＤ３リガンドの存在下かつレチノイン酸類非存在下に生体外で培養する工程、及び
（２）工程（１）で得られた細胞集団を、レチノイン酸類存在下に生体外で培養する工程。
　当該製造方法において、第１の工程は、Ｔ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を、ＣＤ３リガンドの存在下に生体外で培養する工程であり、有効成分として使用されるレチノイン酸類の使用を除いて、前記の「メモリーＴ様細胞を含有する細胞集団の製造方法－１」に準じて実施される。第１の工程の培養は、少なくとも１日以上、より好ましくは２～７日間、更に好ましくは２～５日間実施された後で、後出の第２の工程、すなわち第１の工程で得られた細胞集団を、レチノイン酸類存在下に生体外で培養する工程を包含する。第２の工程の培養は少なくとも１日以上、より好ましくは２～１０日間、更に好ましくは３～９日間実施される。
　当該製造方法において、得られる細胞集団は、メモリーＴ様細胞の比率が増加し、抗原特異的にＩＬ－４を産生する細胞比率が低下し、かつＩＦＮ－γ及びｐｅｒｆｏｒｉｎを産生する細胞比率が向上したＴｃ１型及び／又はＴｈ１型の細胞を高含有する細胞集団である。これらの細胞集団は、腫瘍に対する強い細胞傷害活性を有し、さらに細胞性免疫を活性化することから、細胞医療分野への使用に極めて適している。
　前記の第２の工程は、レチノイン酸類存在下に実施すること以外は通常の細胞培養の方法、例えば、公知のＴ細胞の培養方法に従って実施すればよい。前記の「メモリーＴ様細胞を含有する細胞集団の製造方法－１」に記載されたものと同一の条件、あるいは前記方法で有効成分として使用されたＣＤ３リガンドの使用を除いて前記方法で使用されたものと同様の条件で細胞の培養を行ってもよい。また、レチノイン酸類は培養液中で分解される可能性もあるので、適当時間経過後に新たにレチノイン酸を添加してもよく、適当な時間間隔をおいて培地を新鮮なものに交換してもよい。
　当該製造方法においても、その工程中の適当な時期に遺伝子導入の操作を加えることにより、遺伝子導入細胞の製造を実施することができる。遺伝子導入の操作は、細胞の培養に影響を与えない範囲で任意の時期に実施することができる。例えば、遺伝子導入の操作を前記の第１の工程と第２の工程の間に実施してもよく、第１の工程で得られた細胞集団に遺伝子導入を実施した後に同じ培地で１～２日培養を継続し、その後、培地にレチノイン酸類を添加してもよい。遺伝子導入方法に特に限定はなく、前記の「メモリーＴ様細胞を含有する細胞集団の製造方法－１」について記載されたものと同じ方法を使用することができる。
　当該製造方法において、総培養日数は、好適には４～１４日間とすることが好ましい。なお、総培養日数が４日未満の場合は、一般的な免疫療法に使用するには満足のできる細胞数を得ることができない。また、総培養日数が１４日間を超えると細胞増殖率が低下する。本発明において、総培養日数は、より好適には５～１４日間、更に好適には７～１４日間である。
　下記実施例に記載のとおり、当該方法で製造された細胞集団は、Ｔｃ１型及び／又はＴｈ１型のメモリーＴ様細胞を高い比率で含有している。Ｔｃ１型又はＴｈ１型細胞集団は、細胞性免疫の増強を介した作用を発揮することから、細胞内寄生体に対する免疫応答及び腫瘍免疫に有用である。さらに、実施例６に記載のとおり、レチノイン酸を遺伝子導入後に添加することにより、導入遺伝子の発現が上昇する。
　以上のとおり、本発明により、ＣＤ３リガンド及びレチノイン酸類を使用し、かつレチノイン酸類の添加時期を調節してＴ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団の培養を実施することを特徴とする、Ｔｃ２及び／又はＴｈ２型あるいはＴｃ１及び／又はＴｈ１型のメモリーＴ様細胞を含有する細胞集団の製造方法が提供される。さらに、本発明は、所望の遺伝子が導入されたＴｃ２及び／又はＴｈ２型あるいはＴｃ１及び／又はＴｈ１型のメモリーＴ様細胞を含有する細胞集団の製造にも利用することができる。
　更に、本発明の製造方法は、各工程の前又は後で、細胞集団を任意の亜細胞集団に分離する工程を包含することもできる。たとえば、前述のとおり本発明の有効成分の存在下で培養して得られた細胞集団には高比率にメモリーＴ様細胞が含有されていることから、所望の表面抗原マーカーを発現する細胞を更に分離、取得することにより、メモリーＴ様細胞又はメモリーＴ様細胞を更に高含有するＴ細胞集団を取得することが出来る。また、遺伝子導入された細胞集団の製造において、本発明の製造方法の途中で、又はその終了後に所望の遺伝子を発現する細胞を分離、取得してもよい。分離操作としては、特に限定はないが、例えば、セルソーター、磁気ビーズ、カラムなどを用いて公知の手法で分離することが出来る。また、適切な手段がある場合、導入された遺伝子を発現する細胞からなる亜細胞集団を選択してもよい。
　また、本発明の方法により製造された細胞集団からＴ細胞をクローン化することにより、安定したＴ細胞として維持することもできる。また、本発明の方法により得られた細胞集団を用いて、本発明の方法や公知の方法により更に培養することで細胞集団を新たに得ることもできる。
　本発明の方法は、レチノイン酸類及びＣＤ３リガンドによる刺激、及び、所望により、所望の遺伝子の導入工程を含む、養子免疫療法のための新規のＴ細胞拡大培養方法であり、本発明の方法により得られる細胞集団は、生体内へ有効に移植され保持され得る。すなわち、本発明の方法は、移植された生体内で、長期に渡り、高濃度に持続可能で、より有用な細胞医療用の細胞集団の提供を可能とし、Ｔ細胞に基づく全ての遺伝子治療方法に広く適用することが可能である。
　なお、本明細書において細胞又は細胞集団の製造方法は、細胞又は細胞集団を培養する工程を含み、当該細胞又は細胞集団の誘導（活性化）、拡大培養、分離の各工程、又はこれらを組み合わせた工程をさらに包含し得る方法を指す。
３．本発明の細胞集団、医薬、治療方法もしくは予防方法又は使用
　本発明の方法により製造される細胞集団は、前記のように、免疫療法に適した性質を有している。また、本発明の方法により製造される遺伝子導入された細胞集団は、導入された所望の遺伝子に応じて、所望の効果を有する細胞集団である。例えば、所望の抗原を認識するレセプターをコードする遺伝子を導入する場合、該遺伝子が導入された細胞集団は導入されたレセプター遺伝子によりコードされるレセプターが認識する抗原を提示している細胞に対して細胞傷害活性を示すことができることから、種々の疾患の治療に有用である。前記の細胞集団を投与される疾患として、特に限定されるものではないが、例えば、がん（白血病、固形腫瘍など）、肝炎、自己免疫疾患、インフルエンザ、ＨＩＶなどのウイルス、細菌、真菌が原因となる感染性疾患（例えば、結核、ＭＲＳＡ感染症、ＶＲＥ感染症、深在性真菌症）などが例示される。また、本発明の方法により製造される細胞集団は、骨髄移植又は放射線照射後の感染症予防、再発白血病の寛解を目的としたドナーリンパ球輸注、免疫療法、養子免疫療法などにも利用できる。
　更に本発明は、本発明の方法で得られた細胞集団を有効成分として含有する前記疾患のための医薬（治療剤）を提供する。当該細胞集団を含有する前記治療剤は、免疫療法への使用に特に適している。免疫療法において、患者の治療に適したＴ細胞が、例えば、注射又は点滴により患者の静脈、動脈、皮下、腹腔内などに投与される。当該治療剤は、前述の疾患又はドナーリンパ球輸注での使用において非常に有用である。当該治療剤は、製薬分野で公知の方法に従い、例えば、本発明の方法により調製された当該Ｔ細胞集団を有効成分として、公知の非経口投与に適した有機又は無機の担体、賦形剤、安定剤などと混合され、点滴剤、注射剤として調製され得る。なお、治療剤における本発明の細胞集団の含有量、治療剤の投与量といった当該治療剤に関する諸条件は、公知の免疫療法に従って適宜決定され得る。例えば、医薬における本発明のＴ細胞集団の含有量として、特に限定はないが、例えば、好適には１×１０３～１×１０１１ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好適には１×１０４～１×１０１０ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、更に好適には１×１０５～１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬが例示される。また、本発明の医薬の投与量として、特に限定はないが、例えば、成人一日あたり、好適には１×１０６～１×１０１２ｃｅｌｌｓ／日、より好ましくは、１×１０７～５×１０１１ｃｅｌｌｓ／日、更に好ましくは１×１０８～２×１０１１ｃｅｌｌｓ／日が例示される。更に、当該治療剤による免疫療法と、公知の薬剤投与による薬剤治療、放射線治療又は外科的手術による治療との併用を行なうこともできる。
　本発明はまた、対象に、前述の方法により得られる細胞集団の有効量を投与することを含む、前記の疾患の治療方法又は予防方法を提供する。本明細書中において対象とは、特に限定されるものではないが、好ましくは、本発明の方法により製造されるＴ細胞集団を投与される前記の疾患を有する生体（例えば、ヒト患者又は非ヒト動物）を示す。なお、Ｔ細胞レセプターをコードする遺伝子を導入された細胞集団を有効成分とする本発明の治療剤は、前記細胞集団の発現するＨＬＡ分子と同一又は３座不一致までのＨＬＡ分子を発現する対象に投与され得る。
　また、本明細書中において有効量とは、前記Ｔ細胞集団を上記対象に投与した場合に、該Ｔ細胞集団を投与していない対象と比較して、治療又は予防効果を発揮する該Ｔ細胞集団の量である。具体的な有効量は、投与形態、投与方法、使用目的、対象の年齢、体重又は症状などによって適宜設定され得るものであり、一定ではないが、好ましくは、上記の医薬と同様に設定され得る。投与方法に限定はなく、例えば、上記の医薬と同様に、点滴、注射などにより投与すればよい。
　更に、本発明は、当該細胞集団を有効成分として含有する診断薬を提供する。例えば、患者から得られた細胞を本発明の診断薬により解析、スクリーニングすることにより、治療効果の推測、有効な導入遺伝子の選択などが可能である。
　また、本発明は、前述の本発明の製造方法により得られる細胞集団に対して、抗原、ＣＤ３リガンド、ＣＤ２８リガンド、サイトカイン、ケモカイン及びサイトカインを産生する能力を有する細胞からなる群より選択される少なくとも１つの刺激因子により刺激を与えることにより、活性化されたＴ細胞を含む細胞集団を製造することができる。更に本発明は、前記の製造方法で得られた細胞集団を提供する。このようにして得られる活性化されたＴ細胞を含む細胞集団は、前述の製造方法により得られるＴ細胞集団と同様に、医薬の有効成分として使用できる。本明細書において、刺激因子による刺激とは、当該刺激因子により前述の本発明の製造方法により得られる細胞集団が活性化され得るものであれば特に限定はないが、例えば、本発明の製造方法により得られるＴ細胞集団と刺激因子の共存下で培養を実施することが例示される。
　ここで、提示される抗原としては、ＭＨＣ分子を発現する細胞上にペプチドが提示されるか、又はＴ細胞により認識されＴ細胞を効率よく活性化できるものであれば特に限定はないが、例えば、ペプチド、糖ペプチド、腫瘍細胞抽出物、腫瘍細胞超音波処理物、腫瘍細胞熱水処理物、ウイルスなどの核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）、細菌、タンパク質などが例示される。また、ＣＤ３リガンド及びＣＤ２８リガンドとして、前述されたＣＤ３リガンド及びＣＤ２８リガンドが例示される。
　また、本明細書において、サイトカインとは、Ｔ細胞に作用し活性化し得るものであれば特に限定はないが、例えば、ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＴＧＦ－β、ＩＬ－１５、ＩＬ－７、ＩＦＮ－α、ＩＬ－１２、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ－２７などが例示される。さらに、ケモカインとは、Ｔ細胞に作用し遊走活性を示すものであれば特に限定はないが、例えば、ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ２１、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＣＣＬ１９、ＣＸＣＬ１２、ＩＰ－１０、ＭＩＧなどが例示される。
　本明細書において、サイトカインを産生する能力を有する細胞は、前述のサイトカインを産生し得る能力を有する細胞であれば特に限定はない。
　なお、本発明の製造方法で得られる細胞集団に対して、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体による共刺激を与えることで、サイトカイン産生能を有する活性化されたリンパ球集団を製造することができる。
　本発明の製造方法により得られるＴ細胞集団に対して抗原刺激を負荷することで、細胞傷害活性が極めて高く、抗原認識能も高い有用な抗原特異的ＣＴＬを誘導することができる。また、当該培養は、上記刺激因子以外に、前述のフィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物、あるいはＴ細胞の培養に使用される公知成分の存在下で培養を実施することができる。このようにして製造されたＴ細胞集団は、生体内で長期に渡り、治療効果が高く極めて有用なＴ細胞集団である。
　また、本発明は、医薬製造のための前述の方法により得られる細胞集団の使用も提供する。当該医薬の製造方法は、前述の医薬と同様に行われる。当該医薬の投与される疾患についても、特に限定はないが、前述の医薬と同様である。
　以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
　また、本明細書に記載の操作のうち、基本的な操作については２００１年、コールド　スプリング　ハーバー　ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー　クローニング：ア　ラボラトリー　マニュアル第３版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　３ｒｄ　ｅｄ．）に記載の方法によった。
実施例１　レチノイン酸存在下での培養
　フィブロネクチンフラグメント［レトロネクチン（登録商標）、タカラバイオ社製］を５μｇ／ｍＬ、及び抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、ヤンセンファーマ株式会社）を５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解した。この溶解液を表面未処理１２ウェルプレートに１ｍＬ／ウェルの量で加え、３７℃で５時間放置した。また、抗ＣＤ３抗体単独を５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解し、同様に表面未処理１２ウェルプレートに１ｍＬ／ウェルで加え、３７℃で５時間放置した。放置後、それぞれの溶解液をとり除き、ＰＢＳを用い２ｍＬ／ウェルの量で各プレートを２回ずつ洗浄し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体接着プレート及び抗ＣＤ３抗体接着プレートを調製した。
　インフォームドコンセントが得られた健常人から調製したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を０．２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１％自己血漿、７２０ＩＵ／ｍＬ　ＩＬ－２、０．２％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、２．５μｇ／ｍＬファンギゾン（ブリストルマイヤーズ社製）及び１０ｎＭレチノイン酸（和光純薬社製）を含むＧＴ－Ｔ５０３培地（タカラバイオ社製）に懸濁し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体接着プレート又は抗ＣＤ３抗体接着プレートに２．６ｍＬ／ウェルとなるように加えた。この時、コントロールとしてレチノイン酸を含まない細胞懸濁液を調製して同様にプレートに加えた。各プレートをＣＯ２インキュベーター中、３７℃で４日間培養した。
　培養４日後に細胞を回収し、細胞表面マーカーの測定を行った。
　細胞表面マーカーの測定結果を図１に示す。培養細胞中のＣＤ８単独陽性細胞中のメモリーＴ細胞比率を、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体及び抗ＣＣＲ７抗体で細胞を染色して測定した。細胞表面マーカーに関して、ナイーブＴ様細胞はＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＣＲ７＋であり、セントラルメモリーＴ様細胞はＣＤ４５ＲＡ－／ＣＣＲ７＋であり、エフェクターメモリーＴ様細胞はＣＤ４５ＲＡ－／ＣＣＲ７－である。更に、エフェクターＴ様細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＣＲ７－である。図１の各刺激条件において、棒は左からＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＣＲ７－及びＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＣＲ７－のＣＤ８単独陽性細胞中の割合（％）を表す。また、図１～１５の各図において、ＯＫＴは抗ＣＤ３抗体単独刺激、ＲＡ－ＯＫＴはレチノイン酸／抗ＣＤ３抗体刺激、ＲＮＴはフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体刺激、ＲＡ－ＲＮＴはレチノイン酸／フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体刺激を示す。
　図１より、抗ＣＤ３抗体単独刺激及びフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体刺激とレチノイン酸刺激との組み合わせでセントラルメモリーＴ様細胞及びエフェクターメモリーＴ様細胞比率が増加することが明らかになった。
実施例２　ＴＣＲ遺伝子導入細胞
　国際公開第２００８／１１１５０６号パンフレットの実施例１－（１）～（４）と同様に、ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＴＣＲ遺伝子のクローニング、ベクターの構築及びプロデューサー細胞の作製の一連の操作を行い、ＭＳ－ｂＰａウイルス液の調製を行った。本ウイルス液のＲＮＡコピー数は、２．５５×１０１１コピー／ｍＬであった。
（１）ＴＣＲ遺伝子導入細胞の調製
　フィブロネクチンフラグメントを２５μｇ／ｍＬ、抗ＣＤ３抗体を５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解した。この溶解液を表面処理（ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ）１２ウェルプレートに０．４ｍＬ／ウェルの量で加え、３７℃で５時間放置した。また、抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、ヤンセンファーマ株式会社）を５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解し、この溶解液を同様に表面処理１２ウェルプレートに０．４ｍＬ／ウェルの量で加え、３７℃で５時間放置した。放置後、それぞれの溶解液をとり除き、ＧＴ－Ｔ５０３培地（タカラバイオ社製）を用い、２ｍＬ／ウェルの量で各プレートを２回ずつ洗浄し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体接着プレート又は抗ＣＤ３抗体接着プレートを調製した。
　インフォームドコンセントが得られた健常人から調製したＰＢＭＣを、０．１８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１％自己血漿、７２０ＩＵ／ｍＬ　ＩＬ－２、０．２％ＨＳＡ、２．５μｇ／ｍＬファンギゾン及び１０ｎＭレチノイン酸を含むＧＴ－Ｔ５０３培地に懸濁し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体接着プレート又は抗ＣＤ３抗体接着プレートに２．６５ｍＬ／ウェルとなるように加えた。この時、コントロールとして、レチノイン酸を含まない細胞懸濁液を加えたプレートを調製した。各プレートをＣＯ２インキュベーター中、３７℃で４日間培養した。
　遺伝子導入用ウイルス結合プレートを以下のように調製した。
　フィブロネクチンフラグメントを２０μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解し、この溶解液を表面未処理２４ウェルプレートに０．５ｍＬ／ウェルで加え、３日間、４℃に放置した。放置後、溶解液を除去し、ＰＢＳを用いて１ｍＬ／ウェルの量で２回ずつ洗浄し、ＭＳ－ｂＰａウイルス液０．９ｍＬをウェルに加え、３２℃、２０００×ｇ、２時間遠心した。遠心後ウイルス液を除去し、１．５％ＨＳＡ含有ＰＢＳを用いて１ｍＬ／ウェルの量で３回ずつ洗浄し、ウイルス結合プレートを調製した。
　遺伝子導入操作を下記のように行った。ウイルス結合プレートに、抗ＣＤ３抗体単独又はフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体で４日間刺激した上記ＰＢＭＣを０．８×１０６ｃｅｌｌｓ、２．０ｍＬ／ウェルとなるように加え、一晩、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で培養した。培養後の細胞を０．６８×１０６ｃｅｌｌｓ／１．９ｍＬ／ウェルとなるように５ｍＭ酪酸ナトリウム（和光純薬社製）を含むＧＴ－Ｔ－ＲｅｔｒｏＩＩＩ培地（タカラバイオ社製）に懸濁し、新たなウイルス結合プレートに撒き、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で４時間培養した。培養終了後、回収した細胞を０．１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１％自己血漿、７２０ＩＵ／ｍＬ　ＩＬ－２、０．２％ＨＳＡ、２．５μｇ／ｍＬファンギゾン及び１０ｎＭレチノイン酸を含むＧＴ－Ｔ５０３培地に懸濁し、細胞培養用１２ウェルプレートに撒き直した後で、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で培養した。この時、コントロールとしてレチノイン酸を含まない細胞懸濁液を用いて、同様の遺伝子導入操作及び遺伝子導入後の細胞の培養を行った。
　ＰＢＭＣの刺激開始後、第７日目に０．１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように細胞を撒き、１０日目まで培養した。第４、５、７及び１０日目に細胞増殖率を測定し、第４日目にウイルス結合プレートに移す前の細胞表面マーカーを、第１０日目に細胞表面マーカー、導入ＴＣＲの発現及び導入遺伝子のコピー数を測定した。
　細胞増殖率の測定結果を図２に示す。図２の縦軸は培養開始時の細胞数に対する増殖比率（％）、横軸は培養日数を示す。図２より、レチノイン酸刺激の有無に関係なく、抗ＣＤ３抗体単独刺激と比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体刺激の細胞増殖率が高かった。
　ＰＢＭＣの刺激開始後、第４日目の培養細胞中のＣＤ８単独陽性細胞の細胞表面マーカーの測定結果を図３に、第７日目の培養細胞中のＣＤ８単独陽性細胞の細胞表面マーカーの測定結果を図４に示す。メモリーＴ細胞比率を抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体及び抗ＣＣＲ７抗体で細胞を染色して測定した。図３及び図４の各刺激条件において、棒は左からＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＣＲ７－及びＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＣＲ７－のＣＤ８陽性細胞中の割合（％）を表す。図３及び図４より、抗ＣＤ３抗体単独刺激及びフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体刺激共に、レチノイン酸刺激との組み合わせでセントラルメモリーＴ様細胞及びエフェクターメモリーＴ様細胞比率が増加することが明らかになった。
　ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＴＣＲの発現をテトラマーアッセイにより測定することにより、遺伝子導入効率の測定を行った。
　国際公開第２００８／１１１５０６号パンフレットの記載に従い、ＨＬＡ－Ａ２４０２重鎖のＣ末端にビオチンプロテインリガーゼＢｉｒＡの基質となる配列を付加したポリペプチド及びβ２－ミクログロブリンを不溶性封入体として大腸菌に発現させた。前記の封入体をＰ１４３ペプチドの存在下、インビトロでリフォールディングさせることにより、ＨＬＡ－Ａ２４０２／β２－ミクログロブリン／Ｐ１４３複合体を形成させた。得られた複合体にビオチンプロテインリガーゼ（アビディティー社製）を作用させ、フィコエリスリン標識ストレプトアビジン（Ｓｔｒａｐｔａｖｉｄｉｎ－ＰＥ、インビトロジェン社製）を用いてテトラマーを調製した。
　ＰＢＭＣの刺激開始後、第１０日目の細胞をテトラマーと混合して３７℃、３０分間反応させた後、ＡＰＣ－Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ８抗体（ベクトンディッキンソン社製）で４℃、２０分間反応させた。反応終了後の細胞を洗浄した後、ＦＡＣＳｃａｎｔ（べクトンディッキンソン社製）を用いてフローサイトメトリー解析を行った。
　テトラマー測定結果を図５に示す。縦軸がＣＤ８単独陽性細胞中のテトラマー陽性細胞率（％）を示す。その結果、抗ＣＤ３抗体単独刺激及びフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体刺激共に、レチノイン酸刺激との組み合わせにより、ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＴＣＲの発現細胞率の上昇が見られた。
　遺伝子導入細胞における導入遺伝子のプロウイルスコピー数をＰｒｏｖｉｒｕｓ　Ｃｏｐｙ　Ｎｕｍｂｅｒ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｓｅｔ．　Ｈｕｍａｎ（タカラバイオ社製）で測定した。その測定結果を図６に示す。図６の縦軸は、遺伝子導入細胞における導入遺伝子のコピー数である。その結果、抗ＣＤ３抗体単独刺激及びフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体刺激共に、レチノイン酸の添加により、遺伝子導入効率の上昇と相関したコピー数の上昇が見られた。
実施例３　ＺｓＧｒｅｅｎ遺伝子導入細胞の調製
（１）ウイルス液の調製
　レトロウイルスベクタープラスミドｐＤＯＮ－ＡＩ－ＺｓＧｒｅｅｎを、以下の手順で作製した。まず、ＺｓＧｒｅｅｎ発現ベクターｐＺｓＧｒｅｅｎ－Ｎ１（クロンテック社製）を制限酵素ＮｏｔＩで切断し、ＤＮＡ　ｂｌｕｎｔｉｎｇ　ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて平滑化処理後、更に制限酵素ＢａｍＨＩで消化して約７２０ｂｐのＺｓＧｒｅｅｎ遺伝子断片を得た。次に、レトロウイルスベクタープラスミドｐＤＯＮ－ＡＩ（タカラバイオ社製）を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｐａＩで消化して得られたベクターに、ＺｓＧｒｅｅｎ　ＤＮＡ断片をＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｍｉｇｈｔｙ　Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いて挿入し、ＺｓＧｒｅｅｎ発現組換えレトロウイルスベクターｐＤＯＮ－ＡＩ－ＺｓＧｒｅｅｎを得た。
　ｐＤＯＮ－ＡＩ－ＺｓＧｒｅｅｎベクター及びＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓ　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ　Ｋｉｔ　Ｅｃｏ（タカラバイオ社製）を用いた一過性のウイルス産生を行い、エコトロピックＤＯＮ－ＡＩ－ＺｓＧｒｅｅｎウイルスを獲得した。エコトロピックＤＯＮ－ＡＩ－ＺｓＧｒｅｅｎウイルスを、ＧＡＬＶレトロウイルスパッケージング細胞ＰＧ１３（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１０６８６）にポリブレン存在下で感染させ、遺伝子導入細胞ＰＧ１３／ＤＯＮ－ＡＩ－ＺｓＧｒｅｅｎを獲得した。ＰＧ１３／ＤＯＮ－ＡＩ－ＺｓＧｒｅｅｎを１０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、シグマ社製）で培養し、セミコンフルエントまで生育したところで、０．１ｍＬ／ｃｍ２の新鮮な１０％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭで培地を交換し、２４時間後に上清を０．４５μｍフィルター（ミリポア社製）でろ過して、ＧＡＬＶ／ＤＯＮ－ＡＩ－ＺｓＧｒｅｅｎウイルス液を得た。得られたウイルス液を小分けして分注し、－８０℃フリーザーで保存し、以下の遺伝子導入細胞の調製に供した。本ウイルス液の力価は、６．７６×１０５ｃｆｕ／ｍＬであった。
（２）ＺｓＧｒｅｅｎ遺伝子導入細胞の調製
　実施例１記載の操作により、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体接着プレート及び抗ＣＤ３抗体接着プレートを調製した。
　インフォームドコンセントが得られた健常人から調製したＰＢＭＣを０．２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、１％自己血漿、７２０ＩＵ／ｍＬ　ＩＬ－２、０．２％ＨＳＡ、２．５μｇ／ｍＬファンギゾン及び１０ｎＭレチノイン酸を含むＧＴ－Ｔ５０３培地に懸濁し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体接着プレート又は抗ＣＤ３抗体接着プレートに２．６ｍＬ／ウェルとなるように加えた。この時、コントロールとしてレチノイン酸を含まない細胞懸濁液を加えたプレートを調製した。各プレートを、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で４日間培養した。
　遺伝子導入用ウイルス結合プレートは以下のように作製した。
　フィブロネクチンフラグメントを２０μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解し、この溶解液を表面未処理２４ウェルプレートに０．５ｍＬ／ウェルで加え、一晩４℃に放置した。放置後、溶液を除去しＰＢＳを用いて１ｍＬ／ウェルの量で２回ずつ洗浄し、上記（１）で調製したＧＡＬＶ／ＤＯＮ－ＡＩ－ＺｓＧｒｅｅｎウイルス液１ｍＬをウェルに加え、３２℃、２０００×ｇで、２時間遠心した。遠心後にウイルス液を除去し、１．５％ＨＳＡ含有ＰＢＳを用いて２ｍＬ／ウェルの量で３回ずつ洗浄し、ウイルス結合プレートを作製した。
　遺伝子導入操作を下記のように行った。ウイルス結合プレートに、抗ＣＤ３抗体単独又はフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体で４日間刺激した上記ＰＢＭＣを０．８×１０６ｃｅｌｌｓ、０．８０ｍＬ／ウェルとなるように、５ｍＭ酪酸ナトリウムを含むＧＴ－Ｔ－ＲｅｔｒｏＩＩＩ培地に懸濁して加え、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で４時間培養した。培養後の細胞を０．１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１％自己血漿、７２０ＩＵ／ｍＬ　ＩＬ－２、０．２％ＨＳＡ、２．５μｇ／ｍＬファンギゾン及び１０ｎＭレチノイン酸を含むＧＴ－Ｔ５０３培地に懸濁し、得られた懸濁液を１２ウェルプレートに撒き、３７℃で３日間培養した。この時、コントロールとしてレチノイン酸を含まない細胞懸濁液を用いて、同様の遺伝子導入操作及び遺伝子導入後の細胞の培養を行った。更に、遺伝子導入用ウイルス結合プレートを用いないポリブレン法による遺伝子導入を、ＺｓＧｒｅｅｎウイルス液を用いて行った。４日間刺激したＰＢＭＣを上記（１）で調製したＧＡＬＶ／ＤＯＮ－ＡＩ－ＺｓＧｒｅｅｎウイルス液に１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように懸濁し、この懸濁液にポリブレン（Ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ　Ｂｒｏｍｉｄｅ、ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を終濃度８μｇ／ｍＬになるように添加し、２４ウェルプレートに２ｍＬ／ウェルの量で加え、３２℃、１０００×ｇで１時間遠心した。遠心後にウイルス液を除去し、０．５３×１０６ｃｅｌｌｓ、２．６５ｍＬ／ウェルとなるように表面処理１２ウェルプレートに播き、３７℃で２日間培養した。
　遺伝子導入用ウイルス結合プレートを用いた遺伝子導入について、第４及び７日目に細胞増殖率を測定し、第７日目に細胞表面マーカー、ＺｓＧｒｅｅｎ陽性細胞率及び導入遺伝子のコピー数を測定した。ポリブレン法による遺伝子導入を行った細胞に関して、第６日目にＺｓＧｒｅｅｎ陽性細胞率を測定した。
　細胞増殖率測定の結果を図７に示す。図７の縦軸は培養開始時の細胞数に対する増殖比率（％）、横軸は培養日数を示す。図７より、抗ＣＤ３抗体単独刺激及びフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体刺激共に、レチノイン酸の有無に関係なく、細胞増殖率が高かった。
　培養細胞中のＣＤ８単独陽性及びＣＤ４単独陽性細胞中の細胞表面マーカーについて、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体及び抗ＣＣＲ７抗体を用いて測定した結果を図８に示す。図８の各刺激条件において、棒は左からＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＣＲ７－及びＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＣＲ７－のＣＤ８単独陽性及びＣＤ４単独陽性細胞中の割合（％）を表す。図８より、抗ＣＤ３抗体単独刺激及びフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体刺激共に、レチノイン酸刺激との組み合わせでセントラルメモリーＴ様細胞比率及びエフェクターメモリーＴ様細胞比率が増加することが明らかになった。
　ＺｓＧｒｅｅｎ陽性細胞率を測定した。
　ＰＢＭＣの刺激開始後、遺伝子導入用ウイルス結合プレートを用いた遺伝子導入では第７日目の細胞を、ポリブレン法による遺伝子導入では第６日目の細胞を、ＰＥ－Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ４抗体、ＡＰＣ－Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ８抗体（ベクトンディッキンソン社製）で４℃で２０分間反応させ、細胞を洗浄した後、ＦＡＣＳｃａｎｔ（べクトンディッキンソン社製）を用いてフローサイトメトリー解析を行った。測定結果を図９及び図１０に示す。なお図９及び図１０の縦軸はＣＤ８単独陽性及びＣＤ４単独陽性細胞中のＺｓＧｒｅｅｎ陽性細胞率（％）を表す。その結果、図９に示す遺伝子導入用ウイルス結合プレートを用いた遺伝子導入では、抗ＣＤ３抗体単独刺激及びフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体刺激共にレチノイン酸添加条件において、無添加条件と比べて１．５倍のＺｓＧｒｅｅｎ陽性細胞率の上昇が見られた。一方、図１０に示すポリブレン法による遺伝子導入では、抗ＣＤ３抗体単独刺激及びフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体刺激共にレチノイン酸刺激に関わらず導入効率の差はあまり見られなかった。図９及び図１０より、レチノイン酸刺激及びフィブロネクチンフラグメントを用いた遺伝子導入法の組み合わせによる高効率な遺伝子導入が示された。
　遺伝子導入用ウイルス結合プレートを用いて導入した遺伝子導入細胞における導入遺伝子のコピー数の測定結果を図１１に示す。図１１において、縦軸は遺伝子導入細胞における導入遺伝子のコピー数である。その結果、抗ＣＤ３抗体単独刺激及びフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体刺激共に、レチノイン酸添加条件において、無添加条件の約２倍のコピー数を示し、コピー数は遺伝子導入効率に相関していた。
実施例４　ＴＣＲ遺伝子導入細胞の抗腫瘍活性の測定
　国際公開第２００８／１１１５０６号パンフレットの実施例１－（１）～（４）と同様に、ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＴＣＲ遺伝子のクローニング、ベクターの構築及びプロデューサー細胞の作製の一連の操作を行い、ＭＳ－ｂＰａウイルス液の調製を行った。本ウイルス液のＲＮＡコピー数は、２．５５×１０１１コピー／ｍＬであった。
（１）ＴＣＲ遺伝子導入細胞の調製
　実施例２－（１）と同様の操作により、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体接着プレート及び抗ＣＤ３抗体接着プレートを調製した。
　インフォームドコンセントが得られた健常人のＰＢＭＣを０．２０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、１％自己血漿、７２０ＩＵ／ｍＬ　ＩＬ－２、０．２％ＨＳＡ、２．５μｇ／ｍＬファンギゾン及び１０ｎＭレチノイン酸を含むＧＴ－Ｔ５０３培地に懸濁し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体接着プレート又は抗ＣＤ３抗体接着プレートに２．６５ｍＬとなるように加えた。この時、コントロールとしてレチノイン酸を含まない細胞懸濁液を加えたプレートを調製した。各プレートをＣＯ２インキュベーター中、３７℃で４日間培養した。
　遺伝子導入用ウイルス結合プレートを以下のように作製した。
　フィブロネクチンフラグメントを２０μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解し、この溶解液を表面未処理２４ウェルプレートに０．５ｍＬ／ウェルで加え、４日間、４℃で放置した。放置後、溶解液を除去しＰＢＳを用いて１ｍＬ／ウェルの量で２回ずつ洗浄した後、ＭＳ－ｂＰａウイルス液０．９ｍＬをウェルに加え、３２℃、２０００×ｇで２時間遠心した。遠心後にウイルス液を除去し、１．５％ＨＳＡ含有ＰＢＳを用いて１ｍＬ／ウェルの量で３回ずつ洗浄し、ウイルス結合プレートを作製した。
　遺伝子導入操作を下記のように行った。ウイルス結合プレートに、抗ＣＤ３抗体単独又はフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体で４日間刺激した上記ＰＢＭＣを０．８×１０６ｃｅｌｌｓ、２．０ｍＬ／ウェルとなるように５ｍＭ酪酸ナトリウムを含むＧＴ－Ｔ－ＲｅｔｒｏＩＩＩ培地に懸濁し、一晩、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で培養した。培養後の細胞を０．８×１０６ｃｅｌｌｓ、１．０ｍＬ／ウェルとなるように、１％自己血漿、７２０ＩＵ／ｍＬ　ＩＬ－２、０．２％ＨＳＡ、２．５μｇ／ｍＬファンギゾン及び１０ｎＭレチノイン酸を含むＧＴ－Ｔ５０３培地に懸濁して新たなウイルス結合プレートに撒き、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で４時間培養した。培養終了後、細胞を回収して０．１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように細胞培養用１２ウェルプレートに撒き直し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で３日間培養した。この時、コントロールとしてレチノイン酸を含まない細胞懸濁液を用いて、同様の遺伝子導入操作及び遺伝子導入後の細胞の培養を行った。
　ＰＢＭＣの刺激開始後、第８日目に０．１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように細胞培養用１２ウェルプレートに撒き、１１日目まで細胞を培養した。第１０日目に導入ＴＣＲ特異的ペプチドに対する細胞傷害性解析を行った。第１１日目にＣＤ８単独陽性細胞中の導入ＴＣＲの発現ならびにＩＬ－４及びｐｅｒｆｏｒｉｎの産生細胞率を測定した。
　実施例２－（１）と同様に、ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＴＣＲの発現をテトラマーアッセイにより測定した。
　テトラマー測定結果を図１２に示す。図１２において縦軸はテトラマー陽性率（％）である。その結果、抗ＣＤ３抗体単独刺激及びフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体刺激の両群共に、レチノイン酸刺激によりＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＴＣＲの発現上昇、すなわち遺伝子導入効率の上昇が見られた。
　遺伝子導入細胞のＭＡＧＥ－Ａ４由来ペプチドｐ１４３に対するＩＬ－４及びｐｅｒｆｏｒｉｎ産生細胞率を測定した。第１１日目の細胞とＭＡＧＥ－Ａ４由来ペプチド結合Ｔ２Ａ２４細胞［クリニカル　キャンサー　リサーチ、第１１巻、第５５８１～５５８９頁（２００５）］を１：１の比で２時間共存培養し、ブレフェルディンＡ（シグマアルドリッチ社製）を添加後、更に２時間細胞を培養し、１０倍量の冷却したＰＢＳで反応を止めた。これらの細胞にＡＰＣ－Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ８抗体（ベクトンディッキンソン社製）を加え、４℃で２０分間染色を行った。次いで、イントラプレップ（ベックマンコールター社製）を用いて細胞を固定・浸透化した後に、ＰＥ－Ｃｙ７標識抗ヒトＩＦＮ－γ抗体（ベクトンディッキンソン社製）、ＡＰＣ標識抗ヒトｐｅｒｆｏｒｉｎ抗体（ベクトンディッキンソン社製）及びＰＥ標識抗ヒトＩＬ－４抗体（ベックマンコールター社製）を加えて、室温で２０分間の染色を行った。細胞を洗浄後、ＦＡＣＳｃａｎｔ（べクトンディッキンソン社製）を用いてフローサイトメトリー解析を行った。ＩＬ－４産生かつＩＦＮ－γ非産生細胞率の結果を図１３に、ｐｅｒｆｏｒｉｎ産生細胞率の結果を図１４に示す。すなわち図１３の縦軸はＩＬ－４産生かつＩＦＮ－γ非産生細胞率（％）、図１４の縦軸はｐｅｒｆｏｒｉｎ産生細胞率（％）を示す。
また、図１３、１９、２７及び２８の各図において、ＩＦＮ－γはＩＦＮｇと記載する。
　その結果、抗ＣＤ３抗体単独刺激及びフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体刺激共に、レチノイン酸刺激によりＩＬ－４産生かつＩＦＮ－γ非産生細胞率及びｐｅｒｆｏｒｉｎ産生細胞率の上昇が見られた。これらの結果より、本発明のメモリーＴ様細胞はＴｃ２型細胞に分類される。
　遺伝子導入細胞のＭＡＧＥ－Ａ４由来ペプチドｐ１４３に対する細胞傷害性の解析を行った。３時間、ペプチドと共培養したＴ２Ａ２４細胞を０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ，ウシ胎児血清、ＳＡＦＣ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁後、終濃度２５μＭとなるようにＣａｌｃｅｉｎ－ＡＭ〔ドータイト（Ｄｏｔｉｔｅ）社製〕を添加し、懸濁物を３７℃で１時間培養した。細胞をＣａｌｃｅｉｎ－ＡＭを含まない培地にて洗浄後、１０倍量のＫ５６２細胞（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－２４３）と混合し、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞とした。なお、Ｋ５６２細胞を、レスポンダー細胞中に混入するＮＫ細胞による非特異的細胞傷害活性を排除するために用いた。培養開始後第１０日目の細胞をエフェクター細胞として１×１０５～１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で段階希釈した後で、９６穴細胞培養プレートの各ウェルに１００μＬ／ウェルずつ分注しておき、これらに１×１０５／ｍＬに調製したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞を１００μＬ／ウェルずつ添加した。上記細胞懸濁液の入ったプレートを１８０×ｇで２分間遠心後、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で４時間インキュベートした。４時間後、細胞懸濁液の入ったプレートを１８０×ｇで２分間遠心し、各ウェルから培養上清１００μＬを採取し、蛍光プレートリーダー（４８５ｎｍ／５３８ｎｍ）によって培養上清中に放出されたＣａｌｃｅｉｎ量を測定した。「特異的細胞傷害活性（％）」は以下の数１にしたがって算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
 　上式において、最小放出量は標的細胞及びＫ５６２細胞のみ含有するウェルのＣａｌｃｅｉｎ放出量であり、標的細胞からのＣａｌｃｅｉｎ自然放出量を示す。また、最大放出量は、標的細胞に０．１％界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（ナカライテスク社製）を加えて細胞を完全破壊した際のＣａｌｃｅｉｎ放出量を示している。
　遺伝子導入細胞のＭＡＧＥ－Ａ４由来ペプチドｐ１４３に対する細胞傷害性解析の結果を図１５に示す。図１５の横軸は、培養開始後第１０日目に回収したＰＢＭＣとＭＡＧＥ－Ａ４パルスしたＴ２Ａ２４細胞の比（Ｅ／Ｔ　ｒａｔｉｏ）を示す。その結果、抗ＣＤ３抗体単独刺激及びフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体刺激共にレチノイン酸刺激の有り無しでの細胞傷害活性（％）を比較したところ、レチノイン酸刺激群の特異的標的細胞に対する細胞傷害活性が高く、抗腫瘍活性が上昇することが認められた。
実施例５　レチノイン酸添加時期によるＴＣＲ遺伝子導入細胞の特性への影響
　国際公開第２００８／１１１５０６号パンフレットの実施例１－（１）～（４）と同様に、ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＴＣＲ遺伝子のクローニング、ベクターの構築及びプロデューサー細胞の作製の一連の操作を行い、ＭＳ－ｂＰａウイルス液の調製を行った。本ウイルス液のＲＮＡコピー数は、２．５５×１０１１コピー／ｍＬであった。
（１）ＴＣＲ遺伝子導入細胞の調製
　実施例２－（１）と同様の操作により、抗ＣＤ３抗体接着プレートを調製した。
　インフォームドコンセントが得られた健常人のＰＢＭＣを０．２０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、１％自己血漿、７２０ＩＵ／ｍＬ　ＩＬ－２、０．２％ＨＳＡ、２．５μｇ／ｍＬファンギゾン及び１０ｎＭレチノイン酸を含むＧＴ－Ｔ５０３培地に懸濁し、得られた懸濁液を抗ＣＤ３抗体接着プレートに２．６５ｍＬとなるように加えた。この時、コントロールとして、レチノイン酸を含まない細胞懸濁液を加えたプレートを調製した。各プレートをＣＯ２インキュベーター中、３７℃で４日間培養した。
　遺伝子導入用ウイルス結合プレートを以下のように作製した。
　フィブロネクチンフラグメントを２０μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解し、この溶解液を表面未処理１２ウェルプレートに１ｍＬ／ウェルで加え、４日間で４℃に放置した。放置後、溶解液を除去し、ＰＢＳを用いて２ｍＬ／ウェルの量で２回ずつ洗浄した後、ＭＳ－ｂＰａウイルス液１．８ｍＬをウェルに加え、３２℃、２０００×ｇで１．５時間遠心した。遠心後にウイルス液を除去し、１．５％ＨＳＡ含有ＰＢＳを用いて１ｍＬ／ウェルの量で３回ずつ洗浄し、ウイルス結合プレートを作製した。
　遺伝子導入操作は下記のように行った。ウイルス結合プレートに、抗ＣＤ３抗体で４日間刺激したＰＢＭＣを１．６×１０６ｃｅｌｌｓ、４．０ｍＬ／ウェルとなるように、１％自己血漿、７２０ＩＵ／ｍＬ　ＩＬ－２、０．２％ＨＳＡ、２．５μｇ／ｍＬファンギゾン及び１０ｎＭレチノイン酸を含むＧＴ－Ｔ５０３培地で懸濁して加え、懸濁液を一晩、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で培養した。この時、コントロール用プレート中の、レチノイン酸を含まない細胞懸濁液を加えて抗ＣＤ３抗体で４日間刺激したＰＢＭＣを用いて、同様の遺伝子導入操作及び遺伝子導入後の細胞の培養を行った。
　一晩培養後の上記遺伝子導入細胞を回収し、１０ｎＭの終濃度レチノイン酸を添加または非添加した１％自己血漿、７２０ＩＵ／ｍＬ　ＩＬ－２、０．２％ＨＳＡ及び２．５μｇ／ｍＬファンギゾン含むＧＴ－Ｔ５０３培地に０．１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁後、得られた懸濁物を４．０ｍＬ／ウェルの量で細胞培養用１２ウェルプレートに撒き、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で３日間培養した。
　ＰＢＭＣの刺激開始後、第８日目に細胞を回収し、引き続き終濃度１０ｎＭレチノイン酸を添加または非添加した１％自己血漿、７２０ＩＵ／ｍＬ　ＩＬ－２、０．２％ＨＳＡ及び２．５μｇ／ｍＬファンギゾン含むＧＴ－Ｔ５０３培地に０．１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁後、懸濁物を細胞培養用１２ウェルプレートに撒き、１１日目まで培養した。第１１日目にＣＤ８単独陽性細胞中の細胞表面マーカー及び導入したＴＣＲの発現細胞率、導入ＴＣＲ特異的ペプチドに対するＩＬ－４、ＩＦＮ－γ及びｐｅｒｆｏｒｉｎの産生細胞率の測定ならびに細胞傷害性解析を行った。
　また、図１６～２５の各図において、「ＲＲ」がＰＢＭＣの刺激開始から１１日目まで終始レチノイン酸を添加し培養した細胞群、「Ｒ－」がＰＢＭＣの刺激開始から遺伝子導入（５日目）までレチノイン酸を添加し遺伝子導入後レチノイン酸を添加せずに培養した細胞群、「ＯＲ」がＰＢＭＣの刺激開始から遺伝子導入（５日目）までレチノイン酸を添加せずに遺伝子導入後レチノイン酸を添加し培養した細胞群、「Ｏ－」がＰＢＭＣの刺激開始から１１日目まで終始レチノイン酸を添加せずに培養した細胞群を示す。
　実施例２－（１）と同様に、ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＴＣＲの発現をテトラマーアッセイにより測定した。
　テトラマー測定結果を図１６に示す。図１６において縦軸はＣＤ８単独陽性細胞中のテトラマー陽性率（％）である。その結果、テトラマー陽性細胞率は、終始レチノイン酸を添加し培養した「ＲＲ」が最も高く、次に遺伝子導入後レチノイン酸を添加し培養した「ＯＲ」、その次に遺伝子導入までレチノイン酸を添加し培養した「Ｒ－」、最も低かったのがレチノイン酸を添加せず培養した「Ｏ－」であった。「Ｒ－」が「Ｏ－」より高い陽性率であったことから、レチノイン酸添加によって遺伝子導入効率が上昇することが明らかとなった。「ＯＲ」が「Ｏ－」より高い陽性率であったこと、また「ＲＲ」が「Ｒ－」より高い陽性率であったことから、レチノイン酸添加によって導入遺伝子の発現も上昇することが明らかとなった。
　ＣＤ８単独陽性細胞の細胞表面マーカーの測定結果を図１７に、ＣＤ８単独陽性かつテトラマー陽性細胞の細胞表面マーカーの測定結果を図１８に示す。メモリーＴ細胞比率を抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体及び抗ＣＤ６２Ｌ抗体で細胞を染色して測定した。図１７及び図１８の各細胞群において、棒は左からＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ６２Ｌ＋（ナイーブＴ様細胞）、ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＤ６２Ｌ＋（セントラルメモリーＴ様細胞）、ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＤ６２Ｌ－（エフェクターメモリーＴ様細胞）及びＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ６２Ｌ－（エフェクターＴ様細胞）の割合（％）を表す。図１７及び図１８より、レチノイン酸を添加した場合、非添加（Ｏ－）の場合と比べて、セントラルメモリーＴ様細胞及びエフェクターメモリーＴ様細胞比率が増加することが明らかになった。
　実施例４－（１）と同様の操作により、遺伝子導入細胞のＭＡＧＥ－Ａ４由来ペプチドｐ１４３に対するＩＬ－４及びｐｅｒｆｏｒｉｎ産生細胞率を測定した。
　ＣＤ８単独陽性細胞中のＩＬ－４産生又は非産生、及びＩＦＮ－γ産生又は非産生細胞率の結果を図１９に、ＩＬ－４産生かつＩＦＮ－γ非産生細胞率（Ｔｃ２）とＩＬ－４非産生かつＩＦＮ－γ産生細胞率（Ｔｃ１）の比を図２０に、ＣＤ８単独陽性細胞中のｐｅｒｆｏｒｉｎ産生細胞率の結果を図２１に示す。図１９の各細胞群において、棒は左からＩＬ－４産生かつＩＦＮ－γ非産生、ＩＬ－４非産生かつＩＦＮ－γ産生、ＩＬ－４産生かつＩＦＮ－γ産生細胞の割合（％）を表す。図２０の各細胞群において、棒は左からＴｃ１／Ｔｃ２及びＴｃ２／Ｔｃ１をそれぞれ示し、縦軸の目盛りは、左側（０～７０）がＴｃ１／Ｔｃ２に対応し、右側（０～０．６）がＴｃ２／Ｔｃ１に対応する。
　その結果、図１９よりタイプＩＩサイトカインであるＩＬ－４の産生細胞率が最も高いのは「ＲＲ」であり、タイプＩサイトカインであるＩＦＮ－γの産生細胞率が最も高いのは「ＯＲ」であった。また、非添加の「Ｏ－」と比べると、「Ｒ－」、「ＲＲ」および「ＯＲ」においてＩＬ－４産生かつＩＦＮ－γ産生細胞の割合が高かった。図２０よりＴｃ２とＴｃ１との比において「ＯＲ」より「Ｒ－」が高いことから、遺伝子導入前の培養時にレチノイン酸が存在することがＴｃ２型ＣＴＬを誘導するために重要であることが明らかになった。また、ｐｅｒｆｏｒｉｎ産生細胞率は「ＯＲ」、「ＲＲ」、「Ｒ－」、「Ｏ－」の順番で高かった。以上の結果より、本発明により製造されるメモリーＴ様細胞は、レチノイン酸の添加時期を調節することにより、Ｔｃ１型もしくはＴｃ２型ＣＴＬにそれぞれ誘導することが可能であり、また、レチノイン酸を添加することによって、より高いｐｅｒｆｏｒｉｎ産生細胞率を示す細胞集団を製造できることが明らかとなった。
　培養開始後第１１日目の細胞をエフェクター細胞として１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で段階希釈後、９６穴細胞培養プレートの各ウェルに１００μＬ／ウェルずつ分注して用いた以外は、実施例４－（１）と同様に、遺伝子導入細胞のＭＡＧＥ－Ａ４由来ペプチドｐ１４３に対する細胞傷害性の解析を行った。
　遺伝子導入細胞のＭＡＧＥ－Ａ４由来ペプチドｐ１４３に対する細胞傷害性の解析結果を図２２に示す。図２２は、培養開始後第１１日目に回収したＰＢＭＣとＭＡＧＥ－Ａ４パルスしたＴ２Ａ２４細胞を１：１の比で共培養した時の細胞傷害率を示す。その結果、レチノイン酸添加の有り無しでの細胞傷害活性（％）を比較したところ、レチノイン酸刺激有りの細胞群（「ＲＲ」、「ＯＲ」、「Ｒ－」）の特異的標的細胞に対する細胞傷害活性がレチノイン酸刺激無しの細胞群（「Ｏ－」）より高く、レチノイン酸刺激により抗腫瘍活性が上昇することが認められた。
実施例６　レチノイン酸添加による遺伝子導入効率と導入遺伝子発現効果
　国際公開第２００８／１１１５０６号パンフレットの実施例１－（１）～（４）と同様に、ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＴＣＲ遺伝子のクローニング、ベクターの構築及びプロデューサー細胞の作製の一連の操作を行い、ＭＳ－ｂＰａウイルス液の調製を行った。本ウイルス液のＲＮＡコピー数は、２．５５×１０１１コピー／ｍＬであった。
（１）ＴＣＲ遺伝子導入細胞の調製
　実施例５－（１）と同様に、抗ＣＤ３抗体接着プレートの調製、遺伝子導入前のＰＢＭＣの培養、遺伝子導入用ウイルス結合プレートの作製、抗ＣＤ３抗体で４日間刺激したＰＢＭＣへのＴＣＲ遺伝子導入操作及びＴＣＲ遺伝子導入後の細胞の培養の一連の操作を行い、ＴＣＲ遺伝子導入細胞の調製を行った。
　ＰＢＭＣの刺激開始から第１１日目に、導入したＴＣＲの発現細胞率、発現量及びプロウイルスコピー数を測定した。
　また、実施例２－（１）と同様に、ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＴＣＲの発現をテトラマーアッセイにより測定した。
　テトラマー測定結果を図２３と図２４に示す。図２３において、縦軸はテトラマー陽性率（％）である。図２４において、縦軸はテトラマー陽性かつＣＤ８単独陽性細胞におけるテトラマーの発現量を平均蛍光強度の値を用いて示している。その結果、テトラマー陽性細胞率は、終始レチノイン酸を添加し培養した「ＲＲ」が最も高く、次に遺伝子導入後にレチノイン酸を添加し培養した「ＯＲ」、その次に遺伝子導入までレチノイン酸を添加し遺伝子導入後レチノイン酸を添加せずに培養した「Ｒ－」、最も低かったのがレチノイン酸を添加せず培養した「Ｏ－」の順番であった。また、ＣＤ８単独陽性かつテトラマー陽性細胞におけるテトラマー発現量すなわち平均蛍光強度もこれに相関した結果であった。つまり、製造工程においてレチノイン酸を添加することにより、特に遺伝子導入後にレチノイン酸を添加した細胞群（「ＯＲ」、「ＲＲ」）は非添加の細胞群「Ｏ－」と比べて、導入遺伝子の陽性細胞率と発現量が上昇した細胞を得ることができた。
　培養細胞における導入遺伝子のプロウイルスコピー数を、Ｐｒｏｖｉｒｕｓ　Ｃｏｐｙ　Ｎｕｍｂｅｒ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｓｅｔ．　Ｈｕｍａｎ（タカラバイオ社製）を用いて測定した。その測定結果を図２５に示す。図２５の縦軸は培養細胞における導入遺伝子のコピー数を示す。その結果、レチノイン酸を添加せず遺伝子導入を行った「Ｏ－」に比べ、レチノイン酸を添加し遺伝子導入を行った「Ｒ－」の方がプロウイルスコピー数の上昇が認められた。つまり、レチノイン酸を遺伝子導入前に添加することにより、遺伝子導入効率が上昇することが明らかとなった。
　一方、遺伝子導入（５日目）まで同一のウェルで培養した細胞群（「Ｏ－」及び「ОＲ」又は「Ｒ－」及び「ＲＲ」）におけるプロウイルスコピー数の差が僅かであるのに対し、図２３と図２４の結果より遺伝子導入後にレチノイン酸を添加した細胞群（「ＯＲ」、「ＲＲ」）ではレチノイン酸を添加しなかった細胞群（「Ｏ－」及び「Ｒ－」）よりテトラマー陽性細胞率及びその発現量が高かった。つまり、レチノイン酸を遺伝子導入後に添加することにより導入遺伝子の発現が上昇することが明らかとなった。
実施例７　レチノイン酸添加によるＣＤ４単独陽性細胞の特性への影響
　実施例２－（１）と同様の操作により、抗ＣＤ３抗体接着プレートを調製した。
　インフォームドコンセントが得られた健常人のＰＢＭＣを０．２０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、１％自己血漿、７２０ＩＵ／ｍＬ　ＩＬ－２、０．２％ＨＳＡ、２．５μｇ／ｍＬファンギゾン及び１０ｎＭレチノイン酸を含むＧＴ－Ｔ５０３培地に懸濁し、該懸濁液を抗ＣＤ３抗体接着プレートに２．６５ｍＬとなるように加えた。この時、レチノイン酸を含まない細胞懸濁液を加えたプレートも調製した。各プレートをＣＯ２インキュベーター中、３７℃で４日間培養した。
　レチノイン酸を加えずに抗ＣＤ３抗体単独で４日間刺激したＰＢＭＣ、及びレチノイン酸存在下で抗ＣＤ３抗体単独で４日間刺激したＰＢＭＣを各々０．１×１０６ｃｅｌｌｓ、２．０ｍＬ／ウェルとなるように、１％自己血漿、７２０ＩＵ／ｍＬ　ＩＬ－２、０．２％ＨＳＡ、２．５μｇ／ｍＬファンギゾン及び１０ｎＭのレチノイン酸を含む培地に懸濁し、得られた懸濁液を細胞培養用１２ウェルプレートに撒き直し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で３日間培養した。この時、レチノイン酸を加えずに抗ＣＤ３抗体単独で４日間刺激したＰＢＭＣを、レチノイン酸を含有しない培地に同じ細胞濃度で懸濁し、コントロールとして同様に培養した。
　ＰＢＭＣの刺激開始後、第７日目に０．１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、２．０ｍＬ／ウェルとなるように最終濃度１０ｎＭのレチノイン酸を含む培地に懸濁して各々のＰＢＭＣを細胞培養用１２ウェルプレートに撒き、更に１０日目まで培養した。上記のコントロールは、レチノイン酸を含有しない培地を用いて同じ操作を行い、１０日目まで同様の培養を行った。
　第１０日目に各培養物中のＣＤ４単独陽性細胞中の細胞表面マーカー及びＰＭＡ＋イオノマイシン刺激に対するＣＤ４単独陽性細胞中のＩＬ－４並びにＩＦＮ－γの産生細胞率を測定した。
　
　培養細胞のＰＭＡ＋イオノマイシン刺激に対するＩＬ－４及びＩＦＮ－γ産生細胞率を測定した。第１０日目の培養細胞に最終濃度１０ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ及び最終濃度１μｇ／ｍＬのイオノマイシンを加えて、１時間培養し、ブレフェルディンＡ（シグマアルドリッチ社製）を添加後、更に３時間培養し、１０倍量の冷却したＰＢＳで反応を止めた。これらの細胞にＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ４抗体（ベクトンディッキンソン社製）を加え、室温で１５分間の染色を行った。次いで、イントラプレップ（ベックマンコールター社製）を用いて細胞を固定・浸透化した後に、ＰＥ－Ｃｙ７標識抗ヒトＩＦＮ－γ抗体（ベクトンディッキンソン社製）及びＰＥ標識抗ヒトＩＬ－４抗体（ベックマンコールター社製）を加えて、室温で２０分間の染色を行った。細胞を洗浄した後で、ＦＡＣＳｃａｎｔ（べクトンディッキンソン社製）を用いてフローサイトメトリー解析を行った。
また、図２６～２９の各図において、「ＲＲ」がＰＢＭＣの刺激開始から１０日目まで終始レチノイン酸を添加し培養した細胞群、「ＯＲ」がＰＢＭＣの刺激開始から４日目までレチノイン酸を添加せずにその後レチノイン酸を添加し培養した細胞群、及び「Ｏ－」がＰＢＭＣの刺激開始から１０日目まで終始レチノイン酸を添加せずに培養した細胞群（コントロール）をそれぞれ示す。
　ＣＤ４単独陽性細胞の細胞表面マーカーの測定結果を図２６に示す。メモリーＴ細胞比率を抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体及び抗ＣＤ６２Ｌ抗体で細胞を染色して測定した。図２６の各細胞群において、棒は左からＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ６２Ｌ＋（ナイーブＴ様細胞）、ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＤ６２Ｌ＋（セントラルメモリーＴ様細胞）、ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＤ６２Ｌ－（エフェクターメモリーＴ様細胞）及びＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ６２Ｌ－（エフェクターＴ様細胞）の割合（％）を表す。図２６より、レチノイン酸を添加した場合、非添加（Ｏ－）の場合と比べて、セントラルメモリーＴ様細胞及びエフェクターメモリーＴ様細胞比率が増加することが明らかになった。
　ＣＤ４単独陽性細胞中のＩＬ－４産生又は非産生、及びＩＦＮ－γ産生又は非産生細胞率の結果を図２７に、ＣＤ４単独陽性細胞中のＩＬ－４産生、ＩＦＮ－γ産生細胞率の結果を図２８に示す。また、ＩＬ－４産生かつＩＦＮ－γ非産生細胞率（Ｔｈ２）とＩＬ－４非産生かつＩＦＮ－γ産生細胞率（Ｔｈ１）との比を図２９に示す。図２７の各細胞群において、棒は左からＩＬ－４産生かつＩＦＮ－γ非産生、ＩＬ－４産生かつＩＦＮ－γ産生、ＩＬ－４非産生かつＩＦＮ－γ産生細胞の割合（％）を表す。図２８の各細胞群において、棒は左からＩＬ－４産生、ＩＦＮ－γ産生細胞の割合（％）を表す。図２９の各細胞群において、棒は左からＴｈ１／Ｔｈ２及びＴｈ２／Ｔｈ１をそれぞれ示し、縦軸の目盛りは、左側（０～１．４）がＴｈ１／Ｔｈ２に対応し、右側（０～３．５）がＴｈ２／Ｔｈ１に対応する。
　その結果、図２８よりタイプＩＩサイトカインであるＩＬ－４の産生細胞率が高いのは「ＲＲ」「ОＲ」であり、タイプＩサイトカインであるＩＦＮ－γの産生細胞率が最も高いのは「ＯＲ」であった。また、非添加の「Ｏ－」と比べると、「ＲＲ」および「ＯＲ」においてＩＬ－４産生かつＩＦＮ－γ産生細胞の割合が高かった。図２９より、Ｔｈ２/Ｔｈ１比が「ＯＲ」より「ＲＲ」の方が高いことから、ＰＢＭＣの刺激開始から４日目までの培養時にレチノイン酸が存在することがＴｈ２型ヘルパーＴ細胞を誘導するのに重要であることが明らかになった。以上の結果から、レチノイン酸の添加時期を調節することにより、ＣＤ８単独陽性細胞と同様に、タイプＩＩサイトカイン産生又はタイプＩサイトカイン産生のＣＤ４単独陽性細胞を誘導できることが示された。
　本発明により、免疫療法への使用に適したメモリーＴ様細胞を含有する細胞集団を製造する方法、及び、メモリーＴ様細胞の比率が増加し、所望の遺伝子が高効率で導入され高発現した細胞集団を製造する方法が提供できる。当該製造方法により得られる細胞集団は、細胞医療による疾患の治療に極めて有用である。
SEQ ID NO:1; Fibronectin fragment named CH-271.
SEQ ID NO:2; Fibronectin fragment named CH-296.
SEQ ID NO:3; Fibronectin fragment named H-271.
SEQ ID NO:4; Fibronectin fragment named H-296. 

Claims (15)

  1. 　レチノイン酸類及びＣＤ３リガンドを使用してＴ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を生体外で培養する工程を含むことを特徴とする、メモリーＴ様細胞を含有する細胞集団の製造方法。
  2. 　Ｔ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を生体外で培養する工程が、（１）～（３）から選択される工程のいずれかである、請求項１記載の製造方法：
    （１）レチノイン酸類及びＣＤ３リガンドの存在下でＴ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を培養する工程、
    （２）レチノイン酸類及びＣＤ３リガンドの存在下でＴ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を培養し、次いで、レチノイン酸類及びＣＤ３リガンドの非存在下で該細胞集団を培養する工程、又は
    （３）ＣＤ３リガンド存在下かつレチノイン酸類非存在下でＴ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を培養し、次いで、レチノイン酸類の存在下で該細胞集団を培養する工程。
  3. 　Ｔ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を生体外で培養する工程が、フィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物の存在下で行われる、請求項１又は２記載の製造方法。
  4. 　Ｔ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団が末梢血単核細胞である、請求項１～３いずれか１項に記載の製造方法。
  5. 　得られた細胞集団からメモリーＴ様細胞を選択的に回収する工程をさらに含む、請求項１～４いずれか１項に記載の製造方法。
  6. 　請求項１～５いずれか１項に記載の方法で製造された細胞集団。
  7. 　下記工程を包含することを特徴とする、所望の遺伝子が導入された細胞集団の製造方法：
    （ａ）請求項１記載の方法により、Ｔ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を培養する工程、及び
    （ｂ）工程（ａ）の途中又は工程（ａ）の終了後に、該細胞集団に所望の遺伝子を導入する工程。
  8. 　下記工程（１）～（３）のいずれかにより実施される、請求項７記載の製造方法：
    （１）レチノイン酸類及びＣＤ３リガンドの存在下でＴ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を培養し、得られた細胞に所望の遺伝子を導入する工程、
    （２）レチノイン酸類及びＣＤ３リガンドの存在下でＴ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を培養し、得られた細胞集団に所望の遺伝子を導入した後で、レチノイン酸類及びＣＤ３リガンドの非存在下で該細胞集団を培養する工程、又は
    （３）ＣＤ３リガンド存在下かつレチノイン酸類非存在下でＴ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を培養し、得られた細胞集団に所望の遺伝子を導入した後で、レチノイン酸類の存在下で該細胞集団を培養する工程。
  9. 　Ｔ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を生体外で培養する工程が、フィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物の存在下で行われる、請求項７又は８記載の製造方法。
  10. 　所望の遺伝子がレトロウイルスベクターによって導入される、請求項７～９いずれか１項に記載の製造方法。
  11. 　フィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物の存在下で所望の遺伝子が導入される、請求項１０記載の方法。
  12. 　所望の遺伝子が抗原を認識するレセプターをコードする遺伝子である、請求項７～１１いずれか１項に記載の製造方法。
  13. 　抗原を認識するレセプターがＴ細胞レセプターである、請求項１２記載の製造方法。
  14. 　Ｔ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団が末梢血単核細胞である、請求項７～１３いずれか１項に記載の製造方法。
  15. 　請求項７～１４いずれか１項に記載の製造方法により得られる、所望の遺伝子が導入されたＴ細胞集団。
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