WO2011012780A1 - Utilisation de l'acide rosmarinique et de ses dérivés pour traiter la ciguatéra - Google Patents

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hydrogen atom
alkyl
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disorders
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Dominique Laurent
Serge Pauillac
Mireille Chinain
Taiana Darius
Shilpa Kumar-Roine
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Institut De Recherche Pour Le Developpement
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Definitions

  • the present invention relates to the use of rosmarinic acid and its derivatives for the manufacture of a medicament for the treatment of fish poisoning by food, in particular ciguatera.
  • Ciguatera is a form of ichthyosarcotoxism, that is, food poisoning by the flesh of fish contaminated with ciguatoxins (CTX) of the Gambierdiscus spp. Benthic microalgae found in coral reefs.
  • CX ciguatoxins
  • Ciguatoxins enter the food chain through coral grazing fish and herbivores grazing algae on which Gambierdiscus toxicus is attached. These fish are then the prey of omnivorous and carnivorous fish; toxins are accumulated along the food chain.
  • large predatory fish such as barracuda, moray eels, grouper or jacks are the most likely to cause poisoning.
  • Ciguatoxins are liposoluble polyethers, thermostable, low molecular weight, they are among the most powerful marine biotoxins since it is barely a microgram to kill a man.
  • the purification and detection techniques by chromatography made it possible to isolate 39 different ciguatoxins. They vary according to their geographical origin (23 Pacific ciguatoxins or P-CTX, 12 Caribbean ciguatoxins or C-CTX and 4 Indian Ocean ciguatoxins or I-CTX), according to the fish species and according to their position in the food chain . Their molecular structures are not all yet elucidated.
  • Ciguatoxins are neurotoxins whose action on potential-dependent sodium channels is responsible for the clinical manifestations observed during intoxication.
  • CTXs act by keeping the sodium channels open at potential values where normally they should be closed, resulting in spontaneous and repetitive onset of action potentials.
  • the opening of the sodium channels is responsible for a massive influx of sodium ions into the cell, causing swelling; this phenomenon is particularly visible at the Ranvier nodes and at the axonal endings.
  • Nerve manifestations result from this action of toxins, both on the motor and sensory nerves and on the neuro-motor junctions.
  • the Cardiac and digestive manifestations of the disease are also dependent on the action of ciguatoxins on the sympathetic and parasympathetic nervous system.
  • ciguatoxins is meant in particular, ciguatoxins of the Pacific or P-CTX-I to 23 of type 1 (Murata et al., 1989. J. Am Chem Soc., 111: 8929-31):
  • Mannitol is a compound that has been studied for the treatment of ciguatera; administered 48 to 72 hours after intoxication, mannitol is described as being able to relieve neurological and muscular disorders (Palafox et al, 1988, JAMA 259, 2740-2742, Blythe et al, 1994, Mem. , 465-470).
  • blind clinical trials with mannitol and saline could not demonstrate a beneficial effect of mannitol on ciguatera symptoms after 24 hours (Schnorf et al., 2002, Neurol 58, 1155-1163). ); its effectiveness is therefore controversial.
  • Tournefortia argentea Lf it was later named Argusia argentea (Lf) Heine and remained under this name until recently when it was renamed Tournefortia before being called Heliotropium in 2003 after molecular studies. It has also been listed under the scientific names Messerschmidia argentea (Lf) Johnston, T. arborea Blanco, T. sarmentosa sensu Non Christian Lam. and T.
  • H. foertherianum also inhibits the swelling of human erythrocytes or frogs caused by ciguatoxin (Boydron et al, 2001, Meetings in Toxinology: Exploring, Exploiting Toxins and Controlling Producing Organisms, Scientific and Medical Editions Elsevier, Paris, pp. 63 -6 and Boydron et al, 2002, Meetings in Toxinology: Toxins and Biomedical Research, Elsevier Scientific and Medical Publications, Paris, pp.
  • the inventors continued research on H. foertherianum with the aim of identifying the substance capable of combating the symptoms of ciguatoxins.
  • Structural analysis of the product is carried out by proton and carbon NMR and mass spectrometry; it allowed us to identify rosmarinic acid.
  • the present invention thus relates to compounds of general formula
  • R 1 to R 10 represent, independently of one another:
  • Ci-C 6 acyl C 2 -C 6 alkyl or an aryl radical of C 3 -C 10;
  • o a radical -COOZ 5 or a radical with Z 5 and Z 6 selected, independently of one another, from a hydrogen atom and a C 1 -C 6 alkyl radical; o a -CN function;
  • two adjacent radicals selected from R 1 to R 5 or from R 6 to R 10 may together form a ring selected from the group consisting of phenyl, naphthyl, furanyl, thiophenyl, pyrrolyl and triazolyl;
  • Xi to Xi 2 represent, independently of one another, a carbon atom or a nitrogen atom
  • Z'i selected from the group consisting of hydrogen, alkyl CpC 6, a C 2 -C 6 acyl radical and an aryl radical C 3 -CiO ;
  • a radical with Z ' 2 and Z' 3 selected, independently of each other, from the group consisting of a hydrogen atom, an oxygen atom, a nitrogen atom, a C 1 -C 6 alkyl radical a C 2 -C 6 acyl radical and a C 3 -C 10 aryl radical;
  • radical -COOZ ' 4 or a radical with Z ' 4 selected from the group consisting of a hydrogen atom and a C 2 -C 6 acyl radical and Z' 5 selected from the group consisting of a hydrogen atom, a C 2 -C 6 acyl radical; and a C 3 -C 10 aryl radical;
  • Z represents an oxygen atom or a chain -NZ 7 -, with Z 7 selected from the group consisting of a hydrogen atom, a C 1 -C 6 alkyl radical and an aryl radical;
  • W 1 and W 2 represent, independently of one another:
  • the present invention also relates to the use of the compounds as defined above for the preparation of a pharmaceutical composition intended for the prevention and / or treatment of disorders caused by poisoning with ciguatoxins.
  • the compounds of general formula (I) that are the subject of the present invention are especially used after having been isolated, for example, from plant extracts; they can also be obtained isolated after a chemical synthesis.
  • Halogen atom means the chemical elements of group VII of the Periodic Table of Elements, in particular fluorine, chlorine, bromine and iodine.
  • C1-C alkyl-alkyl radical means a linear or branched hydrogen-carbon radical of 1 to 6 carbon atoms.
  • C 2 -C 6 acyl radical is meant a radical R JL R ', comprising 2 to 6 carbon atoms, R being an alkyl chain with m carbon atoms, m between 0 and 4, and R' a radical alkyl with n carbon atoms, n between 1 and 5, and such that m + n is between 1 and 5.
  • chain or alkyl radical is meant respectively a linear or branched chain or a hydrogenocarbon radical.
  • C 3 -C 10 aryl radical is meant a mono- or bicyclic aromatic radical of 3 to 10 carbon atoms.
  • the aryl radicals in C 3 -C O are selected from the group consisting of pyrrole, thiophene, furan, oxazole, isoxazole, thiazole, imidazole, pyrazole pyridinyl, pyrimidinyl, guanyl, naphthyl, quinolinyl, indolyl, benzofuranyl, benzothiophenyl.
  • glycosyl radical is meant a monomer or dimer of residues glycosyl, mannosyl, glucuronyl, glucosamine and mannosamine.
  • the compounds of general formula (I) are such that:
  • - Xi to Xj 2 represent a carbon atom
  • Y 1 and Y 2 represent a hydrogen atom.
  • a compound of general formula (I) which is preferred according to the invention is rosmarinic acid.
  • Rosmarinic acid ((R) -a - [[3- (3,4-Dihydroxyphenyl) -1-oxo-2E-propenyl] oxy] -3,4-dihydroxybenzenepropanoic acid, molecular weight 360 and crude chemical formula Ci S Hi 6 O 8 ) is a polyphenolic compound of structure:
  • Rosmarinic acid can also be produced by a biotechnological plant cell culture method (Hippolyte et al., 1992, 1. Plant Cell Rep.11, 109-112) or be isolated from plants (Lu et al., 1999 Phytochemistry 51, 91-94, Zgorka et al., J. J. Pharmaceut, Biomed 26, 79-87.).
  • This compound is known to present biological activities of interest: antiviral, antibacterial, anti-inflammatory and antioxidant (Petersen et al, 2003,
  • the compounds of general formula (I) can be synthesized by peptide coupling (obtaining ester and amide analogues) between carboxylic acid units and alcohol / amine units as described by See-Hyoung Park et al. (Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 2003, 12 (20), 3455-3459). Disorders caused by poisoning with ciguatoxins are of several types:
  • Neurological signs that specifically target the central nervous system include cerebellar syndromes (cerebellar ataxia may be observed with disturbances of coordination and balance), central nervous system involvement, chronic fatigue (asthenia, lethargy, sleep disturbances with nightmares, early awakenings, intolerance to exercise, lack of motivation, various pains, etc.), headaches, dizziness, dizziness, visual or auditory hallucinations
  • Those targeting the peripheral nervous system most commonly include paresthesia (tingling, numbness, tingling) that are observed mainly in the extremities, the face (perioral, labial, lingual, pharyngeal); dysaesthesia, which are also frequent and considered as one of the most suggestive signs of ciguatera: the patient complains of burning sensations or electric shocks when in contact with cold objects; Ataxia can also be mentioned.
  • paresthesia tingling, numbness, tingling
  • dysaesthesia which are also frequent and considered as one of the most suggestive signs of ciguatera: the patient complains of burning sensations or electric shocks when in contact with cold objects; Ataxia can also be mentioned.
  • myalgia myalgia
  • arthralgia especially large joints, especially the knees, ankles, shoulders and elbows.
  • Pruritus is one of the main symptoms of ciguatera, so much so that it gave its name to the disease in New Caledonia: "the guitar". It is the palms of the hands and the soles of the feet that are most often affected. Pruritus can sometimes be generalized, especially after ingestion of alcohol or following a significant physical exercise, ie when the cutaneous blood flow is increased. The itching can be very severe and cause scratching lesions with their lot of complications: excoriations, abscesses, cellulitis, scars, lichenification.
  • the compounds and / or the pharmaceutical compositions according to the invention are more particularly intended to treat diffuse abdominal pain and / or nausea and vomiting and / or diarrhea and / or cerebellar syndrome and / or chronic fatigue and / or headache and / or vertigo and / or dizziness and / or visual or auditory hallucinations and / or paresthesia and / or dysesthesia and / or disorders of swallowing and / or convulsions and / or disturbances of consciousness and / or coma and / or respiratory function paralysis and / or sinus bradycardia less than 60 / min and / or arterial hypotension and / or orthostatic hypotension and / or myalgia and / or arthralgia and / or pruritus and / or rash.
  • the amount of compound of general formula (I) and in particular rosmarinic acid to be administered to the mammal depends in particular on the severity of the pathology and symptoms to be treated, resulting in particular from the amount of ciguatoxin absorbed and the route by which it has been, it finally depends on the age and weight of the individual to be treated.
  • rosmarinic acid is not very toxic, it can be administered in high concentration.
  • the daily dose of rosmarinic acid or its derivative is between 0.1 mg and 1 g, preferably between 5 and 500 mg, taken in 1 to 3 times.
  • composition comprising a compound of general formula (I) may be suitable for oral, parenteral, pulmonary, ocular, nasal administration.
  • the present invention will be better understood using the additional description which follows, which refers to examples of isolation and characterization of rosmarinic acid as the active ingredient of H. foertherianum and the evaluation of its activity against the effects of ciguatoxins; and the appended figures in which:
  • FIG. 1 is a graph showing the cellular viability of neuroblastomas in the presence of ciguatoxins contained in samples of toxic giant clam (GPS59) at 100 ⁇ g / ml with or without rosmarinic acid (in a range of 10 to 1000 ⁇ g / ml).
  • Figure 2 is the competition curve between radioligand ([ 3 H] -PbTx-
  • the active ingredient of / f. foertherianum was isolated by bioguided chemical fractionation.
  • Yellified leaves to H. foertherianum were harvested at the foot of a tree in the coastal region of New Caledonia (Anse Vata, Nouméa).
  • the remedy is prepared according to the method usually used (Laurent et al, 1993). Briefly, 200 g of yellowing leaves are boiled in 1 liter of water for 30 minutes. The solution (about 750 ml) is then filtered and lyophilized to give 7.934 g of crude extract. 7.8 g are then redissolved in water and partitioned with n-butanol. 500 mg of the butanol phase are chromatographed on a silica column and eluted with 6 mixtures of dichloromethane and methanol of increasing polarity. The active principle (approximately 360 mg) is eluted mainly (90%) at CH 2 Cl 2 MeOH.
  • the structural analysis of the product is carried out by proton and carbon NMR using a Brucker ARX400 spectrometer.
  • the mass spectrum is obtained on a Perkin Elmer API Sciex triple quadrupole spectrophotometer equipped with electrospray.
  • the compound was identified as rosmarinic acid by comparison of mass spectral and NMR data with those of a control compound and those of the literature.
  • LD50 of rosmarinic acid was determined after injection of intravenous (iv) solution at 531 mg / kg in mice (Sigma-Aldrich record, derived from Petersen, 2003. Reference: Parnham, MJ, Kesselring, K., 1985. Rosmarinic Acid Drugs of the Future 10, 756-757.
  • the salmon lamb sample (Refl5) supplied by the Louis Malardé Institute, was collected at Mururoa (Tuamotu Archipelago, French Polynesia).
  • the giant clam sample (GPS59) was collected at Raivavae (Austral Islands, French Polynesia). The toxicity of these two samples was previously confirmed on mouse, by a cytotoxicity test on neuroblastomas and radioligand tests with P-CTX-3.
  • 96-well plates are prepared with a number of 50,000 cells in 100 ⁇ l of medium per well. Outer wells are not used, to avoid variations in response due to edge effects. The cells are incubated for 24 hours at 37 ° C. with 5% CO 2 to give them time to adhere.
  • Ouabain is an inhibitor of Na / K ATPase, and veratridine, an activator of sodium channels.
  • the joint action of these two products induces a high intracellular level of sodium and causes an alteration of the morphology of the cells which significantly reduces their viability.
  • the induction by these two compounds of sensitization to the toxins acting on the sodium channels makes it possible to visualize the cytotoxicity of the toxins.
  • LST loach
  • GSP clam
  • the acid rosmarinique is added at different concentrations (final concentration per well between 10 and 1000 ⁇ g / ml).
  • Each well is supplemented with the culture medium in order to obtain a final volume of 200 ⁇ l.
  • the cells are thus incubated at 37 ° C. and 5% CO 2 for 18 h.
  • the wells are emptied of their medium and the plate is allowed to dry on absorbent paper in order to carry out the MethylThiazolyldiphenyl-Tetrazolium (MTT) bromide test.
  • MTT MethylThiazolyldiphenyl-Tetrazolium
  • the MTT assay is based on the ability of viable cells (mitochondrial succinate dehydrogenase) enzymes to convert the yellow tetrazolium salt to PBS insoluble formazan crystals.
  • the formed formazan crystals are dissolved by means of 150 ⁇ l of DMSO (dimethylsulfoxide) for each well. After homogenization, the plates are read with a UV plate reader at 490 nm. Then data is transferred and processed in Excel® and analyzed with GraphPad software
  • the graph of FIG. 1 shows the cytotoxicity measured by the cellular viability of a toxic fatty clam extract (GPS59) at 100 ⁇ g / ml in the presence or absence of rosmarinic acid at different concentrations (10 to 1000 ⁇ g / ml).
  • This graph clearly shows the protective effect of rosmarinic acid, the effect of this compound significantly increases cell viability from 50 ⁇ g / ml. Similar results were observed with toxic salmoneal loach extract. On the basis of these results, it can be estimated that the IC50 of rosmarinic acid (concentration of rosmarinic acid to reduce by 50% the cell mortality caused by ciguatoxins and associated toxins) is between 0.5 and 1 mg / ml. IV.2. Displacement of the 3 H "
  • Rat brain synaptosomes are prepared as previously described by Dechraoui et al. (1999, Toxicon 37 (1): 125-43). The protein concentration of the synaptosomal preparations is determined in duplicate by the Bradford method with bovine serum albumin as standard (Bradford, M.M., 1976, Anal Biochem 72: 248-254).
  • the final concentration of protein is of the order of 120 ⁇ g / ml.
  • the ligand-receptor interaction detection test is carried out in a tube with a final concentration of 1,1 nM tritiated [ 3 H] PbTx-3, according to the protocol of Darius et al. (Darius et al, 2007 Toxicon 50 (5), 612-626). Radioactivity is determined using a Perkin Elmer Microbeta Trilux 1450 scintillation counter in 2 ml counting vials of a Betaplate scintillation liquid (Perkin Elmer).
  • the non-specific interaction is evaluated by measuring the radioactivity in the presence of a saturating [ 3 H] PbTx-3 (0.67 mM) concentration and subtracted from the total interaction to lead to the specific interaction.
  • Ciguatoxin P-CTX-3C obtained from a clonal culture of Gambierdiscus polynesiensis is known to have a better affinity to the site of action than Brevetoxins; it has been used as an internal standard for sample calibration (Chinain et al, 1999, Darius et al, 2007).
  • Two quality control tubes of radioligand experiments are used at each experiment; they are composed of a toxic extract of Gambierdiscus polynesiensis with a known concentration of P-CTX-3C ciguatoxin equivalent to 3.1 ⁇ g.
  • L 5 IC 50 is defined as the concentration of extract capable to induce 50% inhibition of the interaction with [ 3 H] PbTx-3 and is expressed in equivalent mg / ml of extract.
  • Figure 2 shows the competition curve between the radioligand ([ 3 H] -
  • the level of rosmarinic acid is estimated at 1.2 mg / g of fresh leaves of Heliotropium foertherianum; for leaves of about 10 grams, a dozen mg of rosmarinic acid and for a remedy based on a decoction of 4 to 5 leaves, about fifty mg of this product.

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Abstract

La présente invention se rapporte ainsi ô l'acide rosmarinique et ses dérivés, représentés par les composés de formule générale (I), pour leur utilisation pour la prévention et/ou le traitement des désordres provoqués par les intoxications aux ciguatoxines et pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à la prévention et/ou au traitement des désordres provoqués par les intoxications aux ciguatoxines.

Description

Utilisation de l'acide rosmarinique et de ses dérivés pour traiter la ciguatéra
La présente invention a pour objet l'utilisation de l'acide rosmarinique et de ses dérivés pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des intoxications alimentaires par les poissons, en particulier la ciguatéra.
La ciguatéra est une forme d'ichtyosarcotoxisme, c'est-à-dire une intoxication alimentaire par les chairs de poissons contaminés par les ciguatoxines (CTX) de la micro-algue benthique Gambierdiscus spp présente dans les récifs coralliens.
Il s'agit d'une des formes d'intoxication par les poissons les plus communes dans les régions du Pacifique, de l'Océan Indien et des Caraïbes.
Les ciguatoxines pénètrent la chaîne alimentaire par l'intermédiaire des poissons brouteurs de corail et des herbivores qui broutent les algues sur lesquelles sont fixées Gambierdiscus toxicus. Ces poissons sont ensuite les proies des poissons omnivores puis carnivores ; les toxines sont ainsi accumulées le long de la chaîne alimentaire. Parmi les 400 espèces potentiellement infectées, les grands poissons prédateurs comme le barracuda, la murène, le mérou ou encore les carangues sont les plus susceptibles de provoquer un empoisonnement.
Les ciguatoxines sont des polyéthers liposolubles, thermostables, de faible poids moléculaire, elles font partie des plus puissantes biotoxines marines puisqu'il suffit d'à peine un microgramme pour tuer un homme.
Les techniques de purification et de détection par chromatographie ont permis d'isoler 39 ciguatoxines différentes. Elles varient selon leur origine géographique (23 ciguatoxines du Pacifique ou P-CTX, 12 ciguatoxines des Caraïbes ou C-CTX et 4 ciguatoxines de l'Océan Indien ou I-CTX), selon les espèces pisciaires et selon leur position dans la chaîne alimentaire. Leurs structures moléculaires ne sont pas toutes encore élucidées.
Les ciguatoxines sont des neurotoxines dont l'action sur les canaux sodiques dépendants du potentiel est responsable des manifestations cliniques observées au cours d'une intoxication. Les CTX agissent en maintenant ouverts les canaux sodiques à des valeurs de potentiel où normalement ils devraient être fermés, avec pour conséquence l'apparition spontanée et répétitive de potentiels d'action. L'ouverture des canaux sodiques est responsable d'un afflux massif d'ions sodium dans la cellule, entraînant un gonflement ; ce phénomène est particulièrement visible au niveau des nœuds de Ranvier et des terminaisons axonales.
Les manifestations nerveuses découlent donc de cette action des toxines, aussi bien sur les nerfs moteurs que sensitifs et sur les jonctions neuro-motrices. Les manifestations cardiaques et digestives de la maladie sont elles aussi dépendantes de l'action des ciguatoxines sur le système nerveux sympathique et parasympathique.
Par ciguatoxines, on entend en particulier, les ciguatoxines du Pacifique ou P-CTX-I à 23 de type 1 (Murata et al. 1989. J. Am. Chem. Soc. 111: 8929-31) :
Figure imgf000003_0001
et de type 2 (Satake et α/. 1993. Tetrahedron Letter. 34: 7P75-75) :
Figure imgf000003_0002
les ciguatoxines des Caraïbes ou C-CTX-I à 12 (Lewis et al. 1998. J. Am. Chem. Soc. 120: 5914-20) :
Figure imgf000003_0003
et les ciguatoxines de l'Océan Indien ou I-CTX-1 à 4 (Hamilton et al. 2002. Toxicon 40: 685-93). II n'existe à ce jour aucun traitement de la ciguatera ; la médecine occidentale ne proposant que des médications soulageant les symptômes : antiémétiques et anti-diarrhéiques en cas de désordres gastro-intestinaux ; antihistaminiques contre les prurits et analgésiques en cas de troubles musculo-squelettiques.
Le mannitol est un composé qui a été étudié pour le traitement de la ciguatera ; administré 48 à 72 heures après l'intoxication, le mannitol est décrit comme capable de soulager les désordres neurologiques et musculaires (Palafox et al, 1988, JAMA 259, 2740-2742 ; Blythe et al, 1994, Mem. Queensl. Mus. 34, 465-470). Des essais cliniques menés en aveugle avec du mannitol et une solution saline n'ont cependant pas pu montrer un effet bénéfique du mannitol sur les symptômes de la ciguatera au bout de 24 heures (Schnorf et al. 2002, Neurol. 58, 1155-1163) ; son efficacité est donc controversée.
Deux produits sont actuellement étudiés pour le traitement de la ciguatera :
- deux anticorps monoclonaux anticiguatoxine dont l'administration simultanée neutralise in vitro et in vivo l'action de la ciguatoxine C-TX3C (Inoue et al; 2009, Toxicon doi : 10.1016/j.toxicon.2009.02.17) ;
- le brevenal, isolé du dinoflagellé producteur des brevetoxines Karenia brevis (Bourdelais et al, 2005, J. Nat Prod. 68(1), 2-6) :
Figure imgf000004_0001
Brevenal
C'est un puissant inhibiteur des effets neurotoxiques induits par les ciguatoxines et un traitement potentiel pour la ciguatera (Bourdelais et al, 2004 Molecular Neurobiology, 24(4), 553-563 ; Mattei et al, 2008, cells. PLoS ONE 3(10) 1-9). Ce composé est cependant difficile à synthétiser et ne peut être obtenu qu'en faible quantité à partir de cultures de Karenia brevis.
La pharmacopée traditionnelle est plus riche de remèdes que la médecine occidentale : dans le Pacifique, de nombreux remèdes traditionnels à base de plantes sont employés pour traiter la ciguatera.
Des enquêtes ethno-pharmacologiques menées principalement en Nouvelle-Calédonie et au Vanuatu ont permis de dresser une liste de près d'une centaine de plantes utilisées dans la médecine traditionnelle (Bourdy et al, 1992, J. Ethnopharmacology 36, 163-174 ; Laurent et al, 1993, ORSTOM Editions, Paris, pp. 51-116). En Nouvelle- Calédonie, l'usage de ces remèdes est extrêmement populaire et la majorité de la population préfère s'adresser à des guérisseurs plutôt que de consulter des médecins. Parmi ces remèdes, la décoction de feuilles ^ Heliotropium foertherianum Diane & Hilger est répandue dans de nombreuses îles du Pacifique sud (Nouvelle-Calédonie, Polynésie française, Vanuatu, Tonga, Micronésie) et même dans les îles Ryukyu du Japon. Selon une enquête menée auprès de la population de Nouméa, plus de 40% des 500 personnes interrogées utilisent cette plante pour se soigner (Amade & Laurent, 1992, eds Gopalakrishnakone P. and Tan C.K., 2, 503-508).
Largement répandue en Polynésie, Micronésie et Mélanésie et aussi présente dans l'Océan Indien, Heliotr opium foertherianum est une plante côtière de la famille des Boraginaceae. Originellement appelée Tournefortia argentea L.f., elle fut nommée ensuite Argusia argentea (L.f.) Heine et resta sous ce nom jusqu'à récemment où elle fut renommée Tournefortia avant d'être appelée Heliotropium en 2003 après des études moléculaires. Elle a aussi été répertoriée sous les noms scientifiques de Messerschmidia argentea (L.f.) Johnston, T. arborea Blanco, T. sarmentosa sensu Christian non Lam. et T. sericea Charn¬ ues études in vivo et in vitro sur les extraits de feuilles d' Heliotropium foertherianum ont démontré l'efficacité de cette plante pour lutter contre les symptômes de la ciguatera. Evalué sur un test de perte pondérale de la souris intoxiquée par du foie de murène contenant des eiguatoxines, l'extrait de feuilles ά7H. foertherianum a provoqué une diminution de la réduction corporelle induite (Amade & Laurent, 1992). Cet extrait a aussi montré des effets identiques au mannitol sur des axones isolés de grenouille traités avec de la ciguatoxine du Pacifique. En effet, cet extrait inhibe les décharges de potentiels d'action spontanées et répétitives provoquées par Ie blocage des canaux sodium en position ouverte par les eiguatoxines et la rentrée de sodium qui en résulte. Il inhibe également le gonflement des nœuds de Ranvier des axones myélines engendré par la rentrée d'eau répondant au changement osmotique (Benoit et ah, 2000, Cybium 24, 33-40). H. foertherianum inhibe également le gonflement des érythrocytes humains ou de grenouille provoqué par la ciguatoxine (Boydron et al, 2001, Rencontres en toxinologie : Explorer, exploiter les toxines et maîtriser les organismes producteurs, Editions scientifiques et médicales Elsevier, Paris, pp. 63-6 et Boydron et al, 2002, Rencontres en toxinologie : Toxines et recherches biomédicales, Editions scientifiques et médicales Elsevier, Paris, pp. 101-104). Par la suite, en utilisant des neuroblastomes murins (neuro-2a), il a été montré que les extraits de feuilles de cette plante exerçaient un effet protecteur contre l'action cytotoxique des ciguatoxines et des brévétoxines (Boydron-Le Garrec et al, 2005, Toxicon 46, 625-634). Les brévétoxines appartiennent à une autre classe de biotoxines marines qui ressemblent aux ciguatoxines par leur structure polyéthérée et qui se lient sur le même site des canaux sodium voltage dépendants.
Les Inventeurs ont poursuivi les travaux de recherche sur H. foertherianum dans le but d'identifier la substance capable de lutter contre les symptômes des ciguatoxines.
A partir d'une préparation du remède selon la méthode habituellement utilisée (Laurent et al, 1993) : 200 grammes de feuilles jaunies sont mises à bouillir dans 1 litre d'eau durant 30 minutes, les Inventeurs ont isolé par fractionnement chimique bioguidé le principe actif ά' H. foertherianum.
L'analyse structurale du produit est effectuée par RMN du proton et du carbone et spectrographie de masse ; elle a permis d'identifier l'acide rosmarinique.
La présente invention se rapporte ainsi aux composés de formule générale
(I) :
Figure imgf000006_0001
dans laquelle :
R1 à R1O représentent, indépendamment les uns des autres :
o un atome d'hydrogène ou un atome d'halogène ;
o un radical alkyle en Ci-C6, un radical acyle en C2-C6 ou un radical aryle en C3-C10 ;
o un radical -O-Zi avec Z1 sélectionné dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène, un radical alkyle en Ci-C6, un radical acyle en C2-C6, un radical aryle en C3- Ci0 et un radical glycosyle ;
o un radical -S-Z2 avec Z2 sélectionné dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène et un radical alkyle en Ci-C6 ; o un radical
Figure imgf000007_0001
avec Z3 et Z4 sélectionnés, indépendamment l'un de l'autre, dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène, un atome d'oxygène, un atome d'azote, un radical alkyle en Ci-C6, un radical acyle en C2-C6, un radical aryle en C3-Cj0 et un radical glycosyle ;
o un radical -COOZ5 ou un radical
Figure imgf000007_0002
avec Z5 et Z6 sélectionnés, indépendamment l'un de l'autre, parmi un atome d'hydrogène et un radical alkyle en C]-C6 ; o une fonction -CN ;
étant entendu que deux radicaux adjacents choisis parmi Ri à R5 ou parmi R6 à Rio peuvent former ensemble un cycle sélectionné dans le groupe constitué par le phényle, le naphthyle, le furanyle, le thiophényle, le pyrrolyle et le triazolyle ;
Xi à Xi2 représentent, indépendamment les uns des autres, un atome de carbone ou un atome d'azote ;
Yi et Y2, représentent, indépendamment l'un de l'autre :
o un atome d'hydrogène ou un atome d'halogène ;
o un radical alkyle en Ci-C6 ou un radical aryle en C3-Ci0,
o un radical— O-Z'i avec Z'i sélectionné dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène, un radical alkyle en CpC6, un radical acyle en C2-C6 et un radical aryle en C3-CiO ;
o un radical
Figure imgf000007_0003
avec Z'2 et Z'3 sélectionnés, indépendamment l'un de l'autre, dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène, un atome d'oxygène, un atome d'azote, un radical alkyle en Ci-C6, un radical acyle en C2-C6 et un radical aryle en C3-C10 ;
o un radical -COOZ'4 ou un radical
Figure imgf000007_0004
avec Z'4 sélectionné dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène et un radical acyle en C2-C6 et Z'5 sélectionné dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène, un radical acyle en C2-C6 et un radical aryle en C3-C 10 ;
o une fonction -CN ; Z représente un atome d'oxygène ou une chaine -NZ7-, avec Z7 sélectionné dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène, un radical alkyle en C1-C6 et un radical aryle en ;
W1 et W2 représentent, indépendamment l'un de l'autre :
o un atome d'hydrogène ;
o une fonction -NO2, -N3 ou -CN ;
o un radical -COOZ" 1 ou un radical
Figure imgf000008_0001
avec Z"j sélectionné dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène et un radical alkyle en Cj-C6 et Z"2 sélectionné dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène, un radical alkyle en C1-C6 et un radical aryle en C3-Ci0 ;
leur énantiomères (R,S) et leur sels pharmaceutiquement acceptables,
pour leur utilisation pour la prévention et/ou le traitement des désordres provoqués par les intoxications aux ciguatoxines ; la présente invention se rapporte également à l'utilisation des composés tels que définis ci-dessus pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à la prévention et/ou au traitement des désordres provoqués par les intoxications aux ciguatoxines.
Les composés de formule générale (I) objets de la présente invention sont notamment utilisés après avoir été isolés par exemple d'extraits de plante ; ils peuvent également être obtenus isolés après une synthèse par voie chimique.
Par atome d'halogène, on entend les éléments chimiques du groupe VII du tableau périodique des éléments, notamment, le fluor, le chlore, le brome et l'iode.
Par radical alkyl en C] -CO, on entend un radical hydrogénocarboné, linéaire ou ramifié, de 1 à 6 atomes de carbone.
O
Par radical acyle en C2-C6, on entend un radical R JL R ,' comprenant 2 à 6 atomes de carbone, R étant une chaîne alkyle avec m atomes de carbone, m compris entre 0 et 4, et R' un radical alkyle avec n atomes de carbone, n compris entre 1 et 5, et tels que m+n est compris entre 1 et 5. Par chaîne ou radical alkyl, on entend respectivement une chaîne ou un radical hydrogénocarboné, linéaire ou ramifié.
Par radical aryle en C3-CiO, on entend un radical aromatique mono- ou bicyclique de 3 à 10 atomes de carbone. De préférence les radicaux aryles en C3-CiO sont sélectionnés dans le groupe constitué par les radicaux pyrrole, thiophène, furane, oxazole, isoxazole, thiazole, imidazole, pyrazole pyridinyle, pyrimidinyle, guanyle, naphthyle, quinoleinyle, indolyle, benzofuranyle, benzothiophényle.
Par radical glycosyle, on entend un monomère ou dimère de résidus glycosyle, mannosyle, glucuronyle, glucosamine et mannosamine.
De préférence, les composés de formule générale (I) sont tels que :
- Xi à Xj2 représentent un atome de carbone ; et/ou
- Yi et Y2 représentent un atome d'hydrogène.
Un composé de formule générale (I) préféré selon l'invention est l'acide rosmarinique.
L'acide rosmarinique (acide (R)-a-[[3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-l-oxo-2E- propenyl]oxy]-3,4-dihydroxy-benzenepropanoique, masse moléculaire 360 et formule chimique brute CiSHi6O8) est un composé polyphénolique de structure :
Figure imgf000009_0001
Acide rosmarinique
La synthèse chimique de l'acide rosmarinique a été décrite par Zinsmeister (Zinsmeister H.D. ét al, 1991, Angew. Chem.103, 134-151).
L'acide rosmarinique peut également être produit par procédé biotechnologique de culture de cellules végétales (Hippolyte et al, 1992, 1. Plant CeIl Rep.11, 109- 112) ou encore être isolé à partir de plantes (Lu et al. , 1999. Phytochemistry 51 , 91-94; Zgorka et al. 2001. J. Pharmaceut. Biomed. 26, 79-87.).
Ce composé est connu pour présenter des activités biologiques d'intérêt : antivirales, antibactériennes, anti-inflammatoire et antioxydante (Petersen et al, 2003,
Phytochemistry 62, 121-125) ; il est couramment utilisé dans les industries alimentaire et cosmétique. Il n'a cependant jamais été décrit comme susceptible d'avoir un effet bénéfique sur les intoxications alimentaires telles que la ciguatera.
Les composés de formule générale (I) peuvent être synthétisés par couplage de type peptidique (obtention d'analogues esters et amides) entre des unités acide carboxylique et des unités alcool/amine tel que décrit par See-Hyoung Park et al. (Bioorganic and Médicinal Chemistry Letters 2003, 12 (20), 3455-3459). Les désordres provoqués par les intoxications aux ciguatoxines sont de plusieurs ordres :
- Les désordres digestifs :
Ils sont les premiers à apparaître ; ils peuvent être isolés ou d'emblée associés à des signes nerveux. Les symptômes les plus souvent rencontrés sont des douleurs abdominales diffuses, des nausées et vomissements et des diarrhées, le plus souvent aqueuses. D'autres symptômes peuvent survenir tels que ténesme et hoquet.
- Les désordres du système nerveux central et/ou périphérique :
Ils apparaissent en quelques jours, voire en quelques heures, ce sont les signes qui peuvent persister le plus longtemps (quelques semaines, parfois des mois). Ils peuvent toucher l'ensemble du système nerveux.
Les signes neurologiques qui visent plus particulièrement le système nerveux central comprennent les syndromes cérébelleux (une ataxie cérébelleuse peut être observée avec des troubles de la coordination et de l'équilibre), des atteintes du système nerveux central, une fatigue chronique (asthénie, léthargie, troubles du sommeil avec cauchemars, réveils précoces, intolérance à l'exercice, manque de motivation, douleurs variées...), céphalées, vertiges, étourdissements, hallucinations visuelles ou auditives
Ceux visant le système nerveux périphérique comprennent le plus fréquemment des paresthésies (picotements, engourdissements, fourmillements) qui sont observées surtout au niveau des extrémités, du visage (péri-orales, labiales, linguales, pharyngées) ; les dysesthésies qui sont également fréquentes et considérées comme un des signes les plus évocateurs de la ciguatera : le patient se plaint de sensations de brûlure ou de décharges électriques au contact d'objets froids ; on peut également citer l' ataxie.
D'autres signes liés à des désordres neurologiques peuvent être observés : troubles de la déglutition, convulsions, troubles de la conscience, coma, paralysie de la fonction respiratoire.
Les désordres cardiovasculaires :
Ils sont habituellement considérés comme faisant toute la gravité de l'intoxication. Lorsqu'ils sont présents, ils surviennent de façon précoce mais ils durent rarement plus d'une semaine. On observe le plus souvent : une bradycardie sinusale inférieure à 60/mn, une hypotension artérielle, une hypotension orthostatique pouvant persister jusqu'à quatre semaines.
- Les désordres musculo-squelettiques : Parmi eux, peuvent être cités : les myalgies, les arthralgies (surtout des grosses articulations, particulièrement les genoux, les chevilles, les épaules et les coudes).
- Les désordres cutanés :
Le prurit constitue l'un des principaux symptômes de la ciguatera, à tel point qu'il a donné son nom à la maladie en Nouvelle-Calédonie : « la gratte ». Ce sont les paumes des mains et les plantes des pieds qui sont les plus souvent atteintes. Le prurit peut parfois être généralisé, notamment après l'ingestion d'alcool ou suite à un exercice physique important, c'est à dire lorsque le flux sanguin cutané est augmenté. Les démangeaisons peuvent être très sévères et occasionner des lésions de grattage avec leur lot de complications : excoriations, abcès, cellulites, cicatrices, lichenification.
D'autres désordres cutanés peuvent être observés tels que des éruptions cutanées : lésions éruptives non spécifiques érythémato-papuleuses, avec parfois une desquamation lors de la phase de guérison.
Ainsi les composés et/ou les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont plus particulièrement destinés à traiter des douleurs abdominales diffuses et/ou des nausées et vomissements et/ou des diarrhées et/ou un syndrome cérébelleux et/ou une fatigue chronique et/ou des céphalées et/ou des vertiges et/ou des étourdissements et/ou des hallucinations visuelles ou auditives et/ou des paresthésies et/ou dysesthésies et/ou des troubles de la déglutition et/ou des convulsions et/ou des troubles de la conscience et/ou le coma et/ou une paralysie de la fonction respiratoire et/ ou une bradycardie sinusale inférieure à 60/mn et/ou une hypotension artérielle et/ou une hypotension orthostatique et/ou des myalgies et/ou des arthralgies et/ou du prurit et/ou des éruptions cutanées.
La quantité de composé de formulé générale (I) et notamment d'acide rosmarinique à administrer au mammifère dépend notamment de la gravité de la pathologie et des symptômes à traiter, résultant notamment de la quantité de ciguatoxine absorbée et de la voie par laquelle elle l'a été, elle dépend enfin de l'âge et du poids de l'individu à traiter.
L'acide rosmarinique étant peu toxique, il peut être administré à forte concentration. A titre d'exemple et sans caractère limitatif, la dose journalière d'acide rosmarinique ou de son dérivé est comprise entre 0,1 mg et 1 g, de préférence entre 5 et 500 mg, par prise en 1 à 3 prises.
La composition pharmaceutique comprenant un composé de formule générale (I) pourra être adaptée à une administration par voie orale, parentérale, pulmonaire, oculaire, nasale.... La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples d'isolement et de caractérisation de l'acide rosmarinique comme principe actif de d'H. foertherianum et à l'évaluation de son activité contre les effets des ciguatoxines ; ainsi qu'aux figures annexées dans lesquelles :
FIGURES
La Figure 1 est un graphe représentant la viabilité cellulaire de neuroblastomes en présence de ciguatoxines contenues dans des échantillons de bénitier toxique (GPS59) à 100 μg/ml avec ou sans acide rosmarinique (dans une gamme de 10 à lOOO μg/ml).
La Figure 2 est la courbe de compétition entre le radioligand ([3H]-PbTx-
3) et l'acide rosmarinique sur les canaux sodiques d'une préparation de membranes de cerveau de rats. Cette courbe montre le déplacement de la brévétoxine marquée [3H]PbTx-3 de son site d'action par l'acide rosmarinique.
Il va de soi toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE
I- Isolement du produit
Le principe actif d'/f. foertherianum a été isolé par fractionnement chimique bioguidé.
Des feuilles jaunies à'H. foertherianum ont été récoltées au pied d'un arbre dans la région cotière de Nouvelle-Calédonie (Anse Vata, Nouméa). Le remède est préparé selon la méthode habituellement utilisée (Laurent et al, 1993). Brièvement, 200 g de feuilles jaunies sont mises à bouillir dans 1 litre d'eau durant 30 minutes. La solution (environ 750 ml) est ensuite filtrée et lyophilisée pour donner 7,934 g d'extrait brut. 7,8 g sont ensuite redissous dans l'eau et partitionnés avec du n-butanol. 500 mg de la phase butanolique sont chromatographiés sur colonne de silice et élues avec 6 mélanges de dichlorométhane et de méthanol de polarité croissante. Le principe actif (environ 360 mg) est élue principalement (90%) au CH2Cl2MeOH.
II- Analyse du produit
L'analyse structurale du produit est effectuée par RMN du proton et du carbone en utilisant un spectromètre Brucker ARX400. Le spectre de masse est obtenu sur un spectrophotomètre Perkin Elmer API Sciex triple quadripole équipé en électrospray. Le composé a été' identifié comme étant l'acide rosmarinique par comparaison des données de spectre de masse et de RMN avec celles d'un composé témoin et celles de la littérature.
III- Toxicité de l'acide rosmarinique
La DL50 de l'acide rosmarinique a été déterminée après injection d'une solution à 531 mg/kg en intraveineuse (iv) chez la souris (Fiche Sigma-Aldrich, valeur tirée de Petersen, 2003. Référence : Parnham, M.J., Kesselring, K., 1985. Rosmarinic acid. Drugs ofthe Future 10, 756-757.
Il ressort de ces résultats qu'à cette concentration, l'acide rosmarinique ne manifeste pas de toxicité.
IV- Activité de l'acide rosmarinique
IV.1. Inhibition de la cvtotoxicité provoquée par des extraits de loche toxique ou de bénitiers toxiques sur des cultures cellulaires de neuroblastomes
L'échantillon de loche saumonée (Refl5), fourni par l'Institut Louis Malardé, a été récolté à Mururoa (Archipel des Tuamotu, Polynésie française). L'échantillon de bénitier (GPS59) a été récolté à Raivavae (Archipel des Australes, Polynésie française). La toxicité de ces deux échantillons a été préalablement confirmée sur souris, par un test de cytotoxicité sur neuroblastomes et des tests radioligand avec P-CTX-3.
Les échantillons sont conservés à 4°C. L'acide rosmarinique provient de chez Sigma.
Des plaques 96 puits sont préparées avec un nombre de 50 000 cellules dans 100 μL de milieu par puits. Les puits extérieurs ne sont pas utilisés, pour éviter les variations de réponse dues aux effets de bord. Les cellules sont incubées pendant 24h à 37°C avec 5% de CO2 pour leur laisser le temps d'adhérer.
Un mélange Ouabaine (glycoside cardiotonique qui intervient dans la perméabilité cellulaire en inhibant la pompe Na/K) et vératridine (alcaloïde polycyclique qui entraine une activation persistante des canaux sodiques), ci-après désigné O/V, dans lequel les deux actifs sont présents respectivement à une concentration finale de 0,33 et 0,033 mM dans 20 μl, est ajouté dans les puits.
La ouabaïne est un inhibiteur de l'ATPase Na /K , et la vératridine, un activateur des canaux sodium. L'action conjointe de ces deux produits induit un niveau intracellulaire élevé de sodium et provoque une altération de la morphologie des cellules qui diminue nettement leur viabilité. L'induction, par ces deux composés, d'une sensibilisation aux toxines agissant sur les canaux sodium, permet de visualiser la cytotoxicité des toxines. Sont ensuite ajoutés les extraits de loche (LST) ou de bénitier (GSP)5 dissous au préalable dans du milieu de culture à la concentration voulue (concentration finale par puits de 250, 125 et 100 μg/ml), enfin, l'acide rosmarinique est ajouté à différentes concentrations (concentration finale par puits comprise entre 10 à 1000 μg/ml). Chaque puits est complété par le milieu de culture afin d'obtenir un volume final de 200 μl.
Toutes les plaques possèdent un contrôle de milieu standard (cellules seules) et un contrôle avec des cellules en présence du mélange O/V. L'acide rosmarinique est testé seul avec Ie mélange O/V pour enregistrer des effets de cytotoxicité ou de prolifération cellulaire ainsi que d'éventuelles interférences de coloration due à de fortes concentrations de produits, qui pourra entraîner de faux positifs à la lecture au spectrophotomètre .
Chaque échantillon est testé en 3 réplicats avec et sans acide rosmarinique mais toujours en présence du mélange O/V.
Les cellules sont ainsi incubées à 37°C et 5% de CO2 pendant 18h.
Après l'incubation, les puits sont vidés de leur milieu et la plaque est laissée à sécher sur papier absorbant en vue de réalisée le test au bromure de MethylThiazolyldiphenyl-Tetrazolium (MTT).
Le test au MTT est basé sur la capacité des enzymes (succinate- déshydrogénases mitochondriales) des cellules viables de convertir le sel jaune de tétrazolium en cristaux de formazan insolubles dans le PBS. Une solution de MTT à
0,8 mg/ml est préparée dans du PBS (tampon phosphate salin) ; 50 μl de cette solution est ajouté dans chacun des puits.
Après incubation pendant une heure trente, les cristaux de formazan formés sont dissous grâce à 150 μL de DMSO (diméthylsulfoxyde) pour chaque puits. Après homogénéisation, les plaques sont lues avec un lecteur de plaque UV à 490 nm. Puis les données sont transférées et traitées sous Excel® et analysées avec le logiciel GraphPad
Prism® (version 4).
Le graphe de la Figure 1 montre la cytotoxicité mesurée par la viabilité cellulaire d'un extrait de bénitier toxique (GPS59) à 100 μg/ml en présence ou non d'acide rosmarinique à différentes concentrations (10 à 1000 μg/ml). Ce graphe montre bien l'effet protecteur de l'acide rosmarinique, l'effet de ce composé augmente significativement la viabilité cellulaire dès 50 μg/ml. Des résultats similaires ont été observés l'extrait de loche saumonnée toxique. Sur la base de ces résultats, on peut estimer que l'IC50 de l'acide rosmarinique (concentration d'acide rosmarinique pour diminuer de 50% la mortalité cellulaire provoquée par les ciguatoxines et toxines associées) se situe entre 0,5 et 1 mg/ml. IV.2. Déplacement de la brévétoxine marquée l"3H"|PbTx-3 de son site d'action (canaux sodiques voltage-dépendants)
Des synaptosomes de cerveau de rats sont préparés comme préalablement décrit par Dechraoui et al. (1999, Toxicon. 37(l):125-43). La concentration en protéine des préparations synaptosomales est déterminée en duplicat par la méthode de Bradford avec la sérumalbumine bovine comme standard (Bradford, M. M., 1976, Anal. Biochem. 72:248- 254).
La concentration finale en protéine est de l'ordre de 120 μg/ml.
Après incubation de ces préparations avec de la brévétoxine tritiée [3H]PbTx-3, on observe un maximum de 10 % de la radioactivité totale.
Le test de détection de l'interaction ligand-récepteur est mené dans un tube avec une concentration finale en brévétoxine tritiée [3H]PbTx-3 de 1,1 nM, suivant le protocole de Darius et al. (Darius et al, 2007 Toxicon 50(5), 612-626). La radioactivité est déterminée en utilisant un compteur à scintillation Perkin Elmer Microbeta Trilux 1450 dans des fioles de comptage de 2 ml d'un liquide à scintillation Betaplate (Perkin Elmer).
L'interaction non- spécifique est évaluée par mesure de la radioactivité en présence d'une concentration saturante de [3H]PbTx-3 (0,67 mM) et soustraite à l'interaction totale pour conduire à l'interaction spécifique.
La ciguatoxine P-CTX-3C (obtenue d'une culture clonale de Gambierdiscus polynesiensis) est connue pour présenter une meilleure affinité au site d'action que les brévétoxines ; elle a été utilisée comme standard interne pour la calibration de l'échantillon (Chinain et al, 1999 ; Darius et al, 2007).
Deux tubes de contrôles de qualité des expérimentations de radioligand sont utilisés à chaque expérimentation ; ils sont composés d'un extrait toxique de Gambierdiscus polynesiensis avec une concentration connue en ciguatoxine P-CTX-3C équivalente à 3,1 pg.
Huit dilutions en duplicate ont été testées à partir de 2 concentrations d'acide rosmarinique à 5 et 20 mg/ml.
Les courbes sigmoïdales et les valeurs d'IC50 sont obtenues en utilisant le logiciel Graphpad Prism v4.0. L5IC50 est définie comme la concentration d'extrait capable d'induire 50% d'inhibition de l'interaction avec [3H]PbTx-3 et elle est exprimée en mg equivalent/ml d'extrait.
La Figure 2 représente la courbe de compétition entre le radioligand ([3H]-
PbTx-3) et l'acide rosmarinique sur les canaux sodiques d'une préparation de membranes de cerveau de rats. On constate en présence d'acide rosmarinique à 5 et 20 mg/ml une diminution de la radioactivité mesurée indiquant un remplacement de la brévétoxine tritiée sur les canaux sodiques par l'acide rosmarinique.
On peut ainsi calculer la valeur de l'IC50 : 0,88 mg/ml et la valeur du Ki à 1,43 x 10"3 M
V- Estimation de la quantité de principe actif ingéré par l'homme lors d'un traitement par ie remède traditionnel
Le taux d'acide rosmarinique est estimé à 1,2 mg/g de feuilles fraîches d'Heliotropium foertherianum ; soit pour des feuilles d'environ 10 grammes, une douzaine de mg d'acide rosmarinique et pour un remède basé sur une décoction de 4 à 5 feuilles, une cinquantaine de mg de ce produit.
II s'agit là d'une valeur indicative, la posologie d'un remède traditionnel étant très variable ; de plus, le contenu en substance active du remède peut également varier selon que l'on utilise les plantes de bord de mer ou de l'intérieur des terres.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composés isolés de formule générale (I) :
Figure imgf000017_0001
dans laquelle :
R1 à R1O représentent, indépendamment les uns des autres :
o un atome d'hydrogène ou un atome d'halogène ;
o un radical alkyle en Ci-C6, un radical acyle en C2-C6 ou un radical aryle en C3-C10 ;
o un radical— 0-Z1 avec Zi sélectionné dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène, un radical alkyle en C1-C6, un radical acyle en C2-C65 un radical aryle en C3- C10 et un radical glycosyle ;
o un radical -S-Z2 avec Z2 sélectionné dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène et un radical alkyle en Ci-C6 ;
o un radical
Figure imgf000017_0002
avec Z3 et Z4 sélectionnés, indépendamment l'un de l'autre, dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène, un atome d'oxygène, un atome d'azote, un radical alkyle en Cj-C6, un radical acyle en C2-C6, un radical aryle en C3-Ci0 et un radical glycosyle ;
o
Figure imgf000017_0003
avec Z5 et Z6 sélectionnés, indépendamment l'un de l'autre, parmi un atome d'hydrogène et un radical alkyle en Ci-C6 ; o une fonction -CN ;
étant entendu que deux radicaux adjacents choisis parmi Ri à R5 ou parmi R6 à Ri0 peuvent former ensemble un cycle sélectionné dans le groupe constitué par le phényle, le naphthyle, le furanyle, le thiophényle, le pyrrolyle et le triazolyle ;
Xi à X12 représentent, indépendamment les uns des autres, un atome de carbone ou un atome d'azote ; Yi et Y2, représentent, indépendamment l'un de l'autre :
o un atome d'hydrogène ou un atome d'halogène ;
o un radical alkyle en C1-C6 ou un radical aryle en C3-C1O,
o un radical -O-Z'i avec Z'j sélectionné dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène, un radical alkyle en Cj-C6, un radical acyle en C2-C6 et un radical aryle en C3-CiO ;
o un radical
Figure imgf000018_0001
et Z'3 sélectionnés, indépendamment l'un de l'autre, dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène, un atome d'oxygène, un atome d'azote, un radical alkyle en C1-C6, un radical acyle en C2-C6 et un radical aryle en C3-C(O ;
o un radical -COOZ'4 ou un radical
Figure imgf000018_0002
avec Z'4 sélectionné dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène et un radical acyle en C2-C6 et Z'5 sélectionné dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène, un radical acyle en C2-C6 et un radical aryle en C3-CiO ;
o une fonction -CN ;
- Z représente un atome d'oxygène ou une chaîne -NZ7-, avec Z7 sélectionné dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène, un radical alkyle en Cj-C6 et un radical aryle en C3-C10 ;
Wi et W2 représentent, indépendamment l'un de l'autre :
o un atome d'hydrogène ;
o une fonction -NO2, -N3 ou -CN ;
o un radical -COOZ" 1 ou un radical
Figure imgf000018_0003
avec Z" 1 sélectionné dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène et un radical alkyle en Cj-C6 et Z"2 sélectionné dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène, un radical alkyle en Cj-C6 et un radical aryle en C3-C10 ;
leur énantiomères (R3S) et leur sels pharmaceutiquement acceptables,
pour leur utilisation pour la prévention et/ou le traitement des désordres provoqués par les intoxications aux ciguatoxines.
2. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est tel que : X1 à Xi2 représentent un atome de carbone et/ou Y1 et Y2 représentent un atome d'hydrogène.
3. Composé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que ledit composé est l'acide rosmarinique.
4. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les ciguatoxines sont choisies parmi les ciguatoxines du Pacifique ou P-CTX-I à 23, les ciguatoxines des Caraïbes ou C-CTX-I à 12 et les ciguatoxines de l'Océan Indien ou I-CTX-1 à 4.
5. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdits désordres provoqués par les intoxications aux ciguatoxines sont des désordres digestifs et/ou des désordres des systèmes nerveux central et/ou périphérique et/ou des désordres cardiovasculaires et/ou des désordres musculo-squelettiques et/ou des désordres cutanés.
6. Composé selon la revendication 5, caractérisé en ce que lesdits désordres sont des douleurs abdominales diffuses et/ou des nausées et vomissements et/ou des diarrhées et/ou un syndrome cérébelleux et/ou une fatigue chronique et/ou des céphalées et/ou des vertiges et/ou des étourdissements et/ou des hallucinations visuelles ou auditives et/ou des paresthésies et/ou dysesthésies et/ou des troubles de la déglutition et/ou des convulsions et/ou des troubles de la conscience et/ou le coma et/ou une paralysie de la fonction respiratoire et/ ou une bradycardie sinusale inférieure à 60/mn et/ou une hypotension artérielle et/ou une hypotension orthostatique et/ou des myalgies et/ou des arthralgies et/ou du prurit et/ou des éruptions cutanées.
7. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que son utilisation est telle que sa dose journalière est comprise entre 0,1 mg et 1 g par prise en 1 à 3 prises.
8. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est utilisé pour la préparation d'une composition pharmaceutique adaptée à une administration par voie orale, parentérale, pulmonaire, oculaire, nasale.
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