WO2011002070A1 - Ｇｄｆ７／ｂｍｐ１２蛋白質を含有する鉄過剰疾患または鉄濃度を低下させることが有効な疾患に対する治療用医薬組成物 - Google Patents

Abstract

　ＧＤＦ７を含む蛋白質または該蛋白質をコードする核酸を含むベクターを有効成分として含有する、鉄過剰疾患または鉄濃度を低下させることが有効な疾患に対する治療用医薬組成物。

Description

ＧＤＦ７／ＢＭＰ１２蛋白質を含有する鉄過剰疾患または鉄濃度を低下させることが有効な疾患に対する治療用医薬組成物

　本発明は、ＴＧＦβスーパーファミリーに属するリガンド蛋白質として知られるＧＤＦ（Ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ）７／ＢＭＰ（Ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ）１２を含む蛋白質を含有する鉄過剰疾患または鉄濃度を低下させることが有効な疾患に対する治療剤としての新規用途に関する。

　本発明は、ＧＤＦ７／ＢＭＰ１２発現ノックインマウス及びＧＤＦ７／ＢＭＰ１２を含む蛋白質を投与したマウスの特性解析から見出された知見に基づくものである。

　鉄はごく一部のバクテリアを除く全ての生物にとって必須元素の一つであり、多様な酸化還元反応に関与しているが、地球上で光合成が始まり酸素が作られるようになった後、鉄は酸化によって水に難溶性の三価鉄として存在するよう変化した。そのため生物は鉄を吸収するための様々な仕組みを発達させてきた。

　一方、鉄は細胞に対して酸化ストレスを引き起こし、そのため体内の鉄濃度は厳密に保たれる必要がある。尚体内の鉄ホメオスタシスの維持は十二指腸からの吸収により微調整され、主に消化管の粘膜細胞剥離によって鉄は排泄されるが、積極的に生体内の鉄を排泄する機構は知られていない。生体内で鉄が過剰になると酸化ストレスが引き起こされ、それに関連した様々な疾患が生じる。

　鉄過剰疾患として、生体内で鉄が過剰になる、原発性鉄過剰症（ＨＦＥ、ヘプシジン、フェロポルチン、トランスフェリン受容体２およびヘモジュベリン等の分子異常による遺伝性ヘモクロマトーシス）および続発性鉄過剰症（骨髄異形成症候群ＭＤＳ：ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ、再生不良性貧血ＡＡ：ａｐｌａｓｔｉｃ　ａｎｅｍｉａおよびサラセミアに伴う輸血性鉄過剰症）が知られている。

　鉄濃度を低下させることが有効な疾患として、鉄過剰が関与すると考えられている疾患である、遺伝性ヘモクロマトーシスによる肝臓癌、Ｂ型またはＣ型慢性肝炎、Ｂ型またはＣ型慢性肝炎による肝臓癌、アルコール性肝障害、非アルコール性脂肪性肝炎、腎不全、インスリン抵抗性と関連するメタボリックシンドローム（鉄過剰症では膵臓のβ細胞が鉄染色陽性となる）、不整脈（原発性または続発性鉄過剰症による主な死因）、神経性疾患（セルロプラスミン「フェロオキシダーゼ」欠損による、肝臓、大脳基底核、視床および小脳歯状核への鉄沈着が生じる無セルロプラスミン血症、フェリチン軽鎖に遺伝子異常があり脳の基底核に鉄沈着が認められる、舞踏病、ジストニア、パーキンソン病様症状を呈する優性遺伝性疾患のｎｅｕｒｏｆｅｒｒｉｔｉｏｎｏｐａｔｈｙ、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病およびＰａｒｋｉｎｓｏｎ病等）、アスベスト（特に鉄含量の多いクロシドライト・アモサイト）による中皮腫と肺癌、卵巣の子宮内膜症、卵巣癌並びに大腸癌などが報告されている（非特許文献１～５）。

　また、眼疾患（網膜弛緩、翼状片、ドライアイ、円錐角膜、白内障、ぶどう膜炎、加齢黄斑変性、糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜色素変性症、緑内障および視神経疾患等）、呼吸器疾患（急性肺障害等）、心疾患（心肥大および心不全など）、動脈硬化症、胃食道逆流症、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉによる胃癌、炎症性腸疾患、糖尿病、血液透析合併症（骨・関節周囲にβ２－ミクログロブリンの沈着を認める透析アミロイドーシス等）、皮膚疾患（皮膚癌等）、歯科疾患（歯周病および顎関節症等）および放射線障害、自己免疫疾患（自己免疫性リウマチ性疾患、自己免疫性溶血性貧血および全身性エリテマトーデス等）などが、酸化ストレスが関与する疾患として報告されている（非特許文献１）。

　一方、ほぼ全ての微生物において上記のように鉄は生存に必須の金属であり、感染した宿主の組織から鉄を積極的に獲得し増殖することが知られているが、宿主側はそれに対し微生物の鉄を奪うことによって抵抗性を高めている（非特許文献６および７）。

　以上のような知見から、鉄が原因となる酸化ストレスによる疾患並びに細菌、真菌、原虫およびウイルス等の治療で抗生物質等に対して抵抗性を示す治療抵抗性感染症の治療においても生体内の鉄をコントロールすることが重要な治療戦略になると考えられる。

　近年、サラセミア、鎌状赤血球貧血、骨髄異形成症候群、再生不良性貧血およびその他の貧血症で定期的に輸血を受けている患者の鉄過剰症による致命的な症状の出現を防ぐための経口鉄キレート剤（商品名：エクジェイド／Ｅｘｊａｄｅ、成分名：デフェラシロックス／ｄｅｆｅｒａｓｉｒｏｘ）がＮｏｖａｒｔｉｓ社から、２００５年に米国、２００６年に欧州および２００８年に日本で上市された。

　エクジェイドによって一日一回の服用で治療が可能となり、従来行われていた鉄キレート療法（商品名：デスフェラール／Ｄｅｓｆｅｒａｌ、一般名：デフェロキサミンメシル酸塩／ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ　ｍｅｓｉｌａｔｅ）に比べ投与の負担が大幅に改善された。

　しかしながらエクジェイドの市販開始後、２００７年にＦＤＡより急性腎不全症例（一部は死亡、死亡例の大半は複数の併存疾患を伴う患者）並びに無顆粒球症、好中球減少症および血小板減少症等の血球減少症（一部は死亡）が報告され、白血球破砕性血管炎、蕁麻疹および過敏反応（アナフィラキシー及び血管浮腫を含む）の副作用情報が追加された。

　この他、重要な安全性情報として、臨床試験で非進行性の血清クレアチニン上昇が認められた頻度は、ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ投与患者で１４％、エクジェイド投与患者で３８％であり、用量相関性が示唆された事が報告された（非特許文献８）。また、臨床試験において、間欠性の蛋白尿（尿中蛋白/クレアチニン比０．６ｍｇ／ｍｇ以上）が認められた頻度は、ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ　投与患者では７．２％であったのに対し、エクジェイド投与患者では１８．６％であった事が報告された（非特許文献８）。

　さらに、臨床試験において、来院時に２回連続して正常値上限の５倍を超える血清ＡＬＴ（ＧＰＴ）値の上昇が認められた患者が、ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ投与患者では５例（１．７％）であったのに対し、エクジェイド投与患者では１７例（５．７％）であった事、臨床試験において、エクジェイドの投与に伴い、聴覚障害（高周波難聴および聴力低下）及び視覚障害（水晶体混濁、白内障、眼圧上昇および網膜障害）が患者の１％未満で報告された事などが報告された（非特許文献８）。

　その後、２００８年４月にＨｅａｌｔｈ　Ｃａｎａｄａよりエクジェイドによる肝不全の症例（多くは肝硬変および多臓器不全等の重大な共存症のある患者で一部は死亡）が世界的に認められている事が報告され、エクジェイド治療期間中は肝機能検査を毎月行うよう推奨し、原因不明で持続的かつ進行的な血清トランスアミナーゼ上昇が認められる場合はエクジェイドによる治療を中断することが勧告された（非特許文献９）。

　更に２００８年９月にはＭｅｄｉｃｉｎｅｓ　ａｎｄ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒe　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ａｇｅｎｃｙ（英国ＭＨＲＡ）より小児と青年を含むエクジェイド使用患者において胃腸の潰瘍と出血及び腎尿細管障害[後天性ファンコニー症候群：ブドウ糖、リン酸塩、尿酸及び種々のイオンが腎近位尿細管から尿中に漏出する病態に加えて腎尿細管性アシドーシス（ＲＴＡ）を併発する場合もある]の症例が報告された（非特許文献１０）。

　鉄キレート剤は低分子であるため腎臓糸球体でろ過され、近位尿細管の管腔側におけるグルタチオンサイクルで産生されるシステインにより三価鉄から二価鉄に還元され、かつ血液内と異なりアルブミンなどのラジカルスカベンジャーとして働く高分子蛋白質が除かれているためフリーの二価鉄が生じ易く、該二価鉄がＦｅｎｔｏｎ反応によりヒドロキシルラジカル産生の触媒として働くことが腎尿細管障害発症のメカニズムの一つとして考えられている（非特許文献１）。

　以上のような重篤な副作用報告が上市後続いていることからより安全で副作用の少ない鉄過剰症に対する治療剤が求められている。

　近年、Ｃ型慢性肝炎に対する瀉血療法が、インターフェロン（ＩＮＦ）不応性患者の肝機能改善に有効であることが明らかとなり注目を集めている。瀉血療法では肝臓内の鉄が減少し、肝細胞内での鉄によるラジカル産生を介した細胞障害が改善されることでＡＬＴ値が改善されたと考えられている（非特許文献１１および１２）。

　また、ヒトＷｉｌｓｏｎ病と同じ遺伝子変異をもつＬＥＣラットに鉄欠乏食を与える事によって肝炎、肝癌の発症を予防されたことも報告されている（非特許文献１３）。

　しかしながら過剰鉄を除去するための瀉血療法は貧血状態、血小板減少、低アルブミン血漿の患者に適応することは難しく、抗酸化剤として用いられるビタミンＥなどの投与が臨床的に有効である証拠は乏しいのが現状である。このためより安全で副作用が少なく体内鉄濃度を低下させかつ有効性の高い肝機能改善薬が求められている。

　腎臓は体重の１％以下の重量でしかないが、体の１０％程度の酸素を消費しており、酸化ストレスの発生で重要な位置を占めていると考えられている。また慢性腎不全の腎代替療法としての血液透析は体外循環に伴う血球系の非特異的な活性化が酸化ストレスの亢進をもたらしていると考えられている。糖尿病合併症の末期合併症としての糖尿病腎症は、慢性腎不全の原疾患として極めて重要であり、年々増加している。

　慢性腎不全の糖尿病性腎症の発症には酸化ストレスが関与していると想定されているが、糖尿病性腎症モデルとしてはストレプトゾトシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ；ＳＴＺ）を投与したモデル動物が用いられ、酸化ストレスの亢進が認められる。

　活性酸素消去作用をもつＴｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ－１（ＴＲＸ１）を全身性に過剰発現させたマウス（ＴＲＸ１－Ｔｇ）にストレプトゾトシンを用いて糖尿病を誘発したところ、コントロールの腎組織では、蛋白尿、腎重量の増加、糸球体の細胞外基質の増加並びに酸化ストレスの指標である８－ＯｈｄＧ及びａｃｒｏｌｅｉｎの尿中排泄の増加が観察されたが、ＴＲＸ１－Ｔｇマウスではこれらの変化が認められなかった。以上から酸化ストレスが糖尿病性腎症の発症に強く関与していること、さらにはＴＲＸ１を誘導するような治療法の可能性が考えられるが、残念ながら実用化には至っていない（非特許文献１４）。

　虚血・再潅流による急性腎障害は、活性酸素種産生による典型的な酸化的組織障害モデルであり、ラットにヘムオキシゲナーゼ－１（Ｈｅｍｅ　Ｏｘｙｇｅｎａｓｅ－１；ＨＯ－１）発現を腎特異的に誘導する塩化スズ（ＳｎＣｌ_２）で前処置したところＨＯ－１発現誘導による酸化促進剤である遊離ヘムの除去によって虚血・再潅流後の腎機能改善が報告され、前述と同様腎機能の低下に酸化ストレスが強く関わっていることが示唆された。しかしながらＨＯ－１の発現誘導には種差があり、ヒトにおけるＨＯ－１誘導の意義について未だ不明の点があることからＨＯ－１発現をコントロールする薬剤の開発には更なる研究が必要とされている（非特許文献１５および１６）。

　以上のように、腎不全および腎障害の改善に酸化ストレス除去が有効である可能性が示されているが、臨床の現場では抗酸化食品の摂取等に留まっており酸化ストレスをコントロールする有効性の高い治療法は確立されていない。

　更に腎機能低下及び透析患者においては食事制限が一般的で食事による抗酸化物質の摂取も難しいため、安全で副作用が少なく体内鉄濃度を低下させ、かつ有効性の高い腎機能改善薬が求められている。

　細菌（大腸菌、サルモネラ菌、ウシ流産菌、炭疽菌、バークホルデリア・セパシア菌、ジフテリア菌およびビブリオ菌など）はシデロフォアと呼ばれる鉄キレート物質を分泌し、シデロフォア－鉄複合体の取り込みによって鉄吸収を行っている。

　近年、肝臓細胞からリポカリン２と呼ばれるシデロフォア－鉄複合体と特異的に結合する蛋白質の分泌が報告された。このシデロフォア－鉄複合とリポカリン２との結合は細菌の鉄吸収と生育を阻害する。

　またリポカリン２欠損マウスを用いた実験では大腸菌に感染したマウスはコントロールマウスと比べ極端な生存率の低下が報告され、これらの報告からも、鉄の供給を制限することが感染症の治療に有効であることが示唆されている（非特許文献１７）。

　ムコール症はフィコミコーシスとも呼ばれ、ケカビ目の真菌が起こす感染症である。ムコール症は胞子を吸いこむことによって起こり、主に鼻と脳を侵す重度の感染症で、場合によっては死に至り、コントロール不良な糖尿病患者など、免疫機能が低下している人に起こりやすい疾患である。肺に感染することも多く、まれに皮膚および消化管にも感染する。

　鼻と脳を侵すムコール症の症状としては、痛み、発熱および眼窩の感染（眼窩蜂巣炎）による眼球突出などがあり、鼻から膿が出て、口蓋、眼窩および副鼻腔周辺の顔の骨並びに２つの鼻孔を仕切っている壁の破壊も生じる。脳に感染すると、けいれん発作、部分麻痺および昏睡が起こる。肺のムコール症は、発熱およびせき、並びに時に呼吸困難を起こすことが知られている。

　ムコール症の治療には、一般にアムホテリシンＢを静脈内投与するか髄液の中に直接注射することが行われているがムコール症は死亡率の高い、非常に重い病気である。アムホテリシンＢが無効な難治性真菌症に対する確実な治療法は確立されていないが、鉄キレート剤の投与によって治療効果が認められたとの報告がなされている（非特許文献１８）。

　以上のように鉄の供給制限が感染症の治療においても有効である可能性が示されているが、現在臨床上安全で重篤な副作用の報告されていない鉄キレート剤は無く、安全で副作用が少なく、体内の鉄濃度を低下させ、かつ有効性の高い治療抵抗性感染症治療薬が求められている。

　Ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＭＰ、骨形成タンパク質)群は、ＴＧＦβスーパーファミリーに属し、異所性の骨成長や軟骨形成に対する誘導能を持つ分子として同定されてきた（非特許文献１９および２０）。

　また最近では、ＢＭＰファミリー分子は、種々の細胞の増殖、分化およびアポトーシスに関わり、組織、臓器の形態生成に重要であることが報告されている（非特許文献２１および２２）。

　ＢＭＰファミリー分子は一般に以下に記載のようなプロセスを経て細胞外に分泌される。まず最初に一本鎖の前駆体タンパク質（ｐｒｅ－ｐｒｏ体）として合成された後、シグナルペプチド領域が切断され、細胞内でＣ末端側に存在するシステイン残基がジスルフィド結合を介し二量体（ｐｒｏ二量体）を形成する。

　その後、ｆｕｒｉｎ様プロテアーゼにより、活性本体であるＣ末側（ｍａｔｕｒｅ二量体）とジスルフィド結合を持たないＮ末プロペプチド領域（ｐｒｏ－ｒｅｇｉｏｎ）に切断される。切断されたＮ末側のプロペプチド領域２分子はＣ末側のｍａｔｕｒｅ二量体１分子と非共有結合を介し複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ体）を形成し、その複合体の形で細胞から分泌されることが知られている（非特許文献２３）。

　また、一部のＢＭＰファミリー分子については、ｍａｔｕｒｅ二量体同様、Ｎ末プロペプチド領域が結合した複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ体）も、シグナル伝達能を有することが知られている（非特許文献２３）。

　２００２年、ヘプシジンは鉄代謝ホルモンとして血清鉄濃度の調節に働くことが報告されたが（非特許文献２４および２５）、生理的条件下でヘプシジンの発現制御を行っている分子はその後最近まで謎であった。

　Ｈｅｐ３Ｂ細胞株を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏ実験の結果からＴＧＦβスーパーファミリーに属するリガンド分子[ＢＭＰ（Ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ）２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１１、ＧＤＦ（Ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ）５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３およびａｃｔｉｖｉｎ　Ａ等]の中でも、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７およびＢＭＰ９がヘプシジン遺伝子の発現を誘導する分子であることが同定された（非特許文献２６）。

　更にこれらの分子存在下Ｈｅｍｏｊｕｖｅｌｉｎ（ＨＪＶ）の可溶化受容体であるＨＪＶ－ＦｃをＨｅｐ３Ｂ細胞株に添加することによってヘプシジン発現の抑制が観察される分子として、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５およびＢＭＰ６が見出された（非特許文献２６）。

　また同年ＴＧＦβスーパーファミリーに属するリガンド分子の一つであるＧＤＦ１５の血中濃度が正常人に比べサラセミア患者では平均値で１００倍程度増加すること、サラセミア患者由来の血清を正常ヒト肝臓由来初代培養株へ添加するとヘプシジン遺伝子の発現レベルが低下することが報告された（非特許文献２７）。

　その後２００８年、鉄欠乏食、通常食および鉄過剰食のいずれか１をマウスに与え、肝臓組織から抽出されたｍＲＮＡを用いた発現パターンの比較解析実験等より給餌に含まれる鉄含量が多いほどＢＭＰ６発現レベルが向上することが見出された（非特許文献２８）が血中ヘプシジン濃度を増加させ血清鉄濃度を減少させる機能を持った分子の同定は未解決の課題として残されていた。

　２００９年、ＢＭＰ６遺伝子欠損マウスによる解析実験及びＢＭＰ６組換え体のマウス個体への投与実験の結果（非特許文献２９および３０）からＴＧＦβスーパーファミリーに属するリガンド分子の一つであるＢＭＰ６が生体内においてヘプシジン濃度増加に作用し、血清鉄濃度を減少させる機能を持った分子であることが初めて報告された。

　本発明者らが注目したＴＧＦβスーパーファミリーに属するリガンド分子の一つであるＧＤＦ（Ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ）７［ＢＭＰ（Ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ）１２と同一分子であり、以降ＧＤＦ７と表記する]に関して、ヘプシジン発現制御や鉄代謝調節との関連性はこれまでなんら報告されていない。却ってＨｅｐ３Ｂ細胞株を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏ実験の報告ではヘプシジン発現制御との関連性が無い事を示すデーターが示されている（非特許文献２６）。

　ＧＤＦ７はＴＧＦβスーパーファミリーに属するリガンド分子の一つであり、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６およびＧＤＦ７の３種のＧＤＦ分子群で構成されるサブファミリーのなかでグリシンリッチなアミノ酸配列挿入が唯一認められる分子である（マウスで認められる違いであり、ヒトではこの様な違いは認められない）（非特許文献３１）。

　ＧＤＦ７を認識する特異的な受容体として、ＭＣ３Ｔ３細胞を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏ実験からタイプＩ受容体としてはＡＬＫ３、タイプＩＩ受容体としてはＢＭＰＲＩＩである可能性が報告されている（非特許文献３２）。

　ＧＤＦ７はマウス発生期の蓋板細胞に発現が認められ、作製されたＧＤＦ７欠損マウスの表現型として水頭症が観察されること等からＧＤＦ７は脊椎におけるインターニューロンの運命決定に強く関わっていることが示唆された（非特許文献３３）。

　骨芽細胞様骨肉腫細胞ＲＯＳ１７/２．８ＡＬＰを用いた実験においてＧＤＦ７は細胞増殖活性及びアルカリフォスファターゼ誘導活性を示すことが報告された（非特許文献３４）。

　またＧＤＦ７は腱と靭帯組織に対する形成促進作用が動物実験によって示されているが、更にヒト腱組織由来線維芽細胞に対しても増殖促進活性を示し、ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ　ｔｙｐｅＩとｔｙｐｅＩＩＩの発現を誘導することが示され、腱と靭帯組織の再生や治療への応用が期待されている（非特許文献３５、特許文献１）。

　以上の知見によりＧＤＦ７を生体内で高発現させた場合、腱及び靭帯組織の形成促進や骨形成に何らかの変化が認められる事が予測されたが、ＧＤＦ７が血清中の鉄濃度を特異的に減少させる作用を示すことを予測することは極めて困難であった。

国際公開第９５／１６０３５号

酸化ストレスの医学：２００８年６月１０日　診断と治療社　監修：吉川敏一、編集：内藤裕二、豊國伸哉 Ｉｒｏｎ　Ｏｖｅｒ　ｌｏａｄと鉄キレート療法：２００７年１１月　メディカルレビュー社　監修：堀田知光、押味和夫、編集：大屋敷一馬ら Ｋｏｈｇｏ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ　Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，２００７；１３（３５）：４６９９－４７０６ Ｎａｄａｄｕｒ，Ｓ．Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｄｉａｎ　Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．，２００８；１２８（４）：５３３－５４４ Ｔｏｙｏｋｕｎｉ，Ｓ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｓｃｉ．，２００９；１００（１）：９－１６ Ｌｕｎｄｒｉｇａｎ，Ｍ．Ｄ．，＆Ｋａｄｎｅｒ，Ｒ．Ｊ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８６；２６１（２３）：１０７９７－１０８０１ Ｈａｃｋａｍ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９８；１８８（２)：３５１－３６４ 医薬品安全性情報Ｖｏｌ．５　Ｎｏ．１３（２００７年０６月２８日）Ｒ０２ 医薬品安全性情報Ｖｏｌ．６　Ｎｏ．０７（２００８年０４月０３日）Ｒ０６ 医薬品安全性情報Ｖｏｌ．６　Ｎｏ．１８（２００８年０９月０４日）Ｒ０３ Ｈａｙａｓｈｉ，Ｈ．，ｅｔ　ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，１９９４；８９（７）：９８６－９８８ Ｋｉｍｕｒａ，Ｆ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．，２００５；５２（６２）：５６３－５６６ Ｋａｔｏ，Ｊ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９６；９８（４）：９２３－９２９ Ｈａｍａｄａ，Ｙ，，ｅｔ　ａｌ．，Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．，２００７；２２（６）：１５４７－１５５７ Ｔｏｄａ，Ｎ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ　Ｍｅｄ．，２００２；３０（７）：１５１２－１５２２ Ｓｈｉｂａｈａｒａ，Ｓ．，Ｔｏｈｏｋｕ　Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２００３；２００（４）：１６７－１８６ Ｆｌｏ，Ｔ．Ｈ．，Ｎａｔｕｒｅ　２００４；４３２（７０１９）：９１７－９２１ Ｒｅｅｄ，Ｃ．，ｅｔ　ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，２００６；５０（１１）：３９６８－３９６９ Ｕｒｉｓｔ，Ｍ．Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９６５；１５０：８９３－８９９ Ｗｏｚｎｅｙ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８；２４２：１５２８－１５３４ Ｈｏｇａｎ，Ｂ．Ｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．，１９９６；６：４３２－４３８ ｔｅｎ　Ｄｉｊｋｅ，Ｐ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，２００３；２１１：１０５－１１３ Ｂｒｏｗｎ， Ｍ．Ａ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００５；２８０（２６）：２５１１１－２５１１８ Ｎｉｃｏｌａｓ，Ｇ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ　Ｓ　Ａ．，２００２；９９（７）：４５９６－４６０１ Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，　Ｄ．Ａ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．，２００２；１００（１０）：３７７６－３７８１ Ｂａｂｉｔｔ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２００７；１１７（７）：１９３３－１９３９ Ｔａｎｎｏ，Ｔ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２００７；１３（９）：１０９６－１１０１ Ｋａｕｔｚ，Ｌ．，ｅｔ　ａｌ.,Ｂｌｏｏｄ．，２００８；１１２（４）：１５０３－１５０９ Ｍｅｙｎａｒｄ，Ｄ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２００９；４１（４）：４７８－４８１ Ａｎｄｒｉｏｐｏｕｌｏｓ，Ｂ．Ｊｒ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２００９；４１（４）：４８２－４８７ Ｓｔｏｒｍ，Ｅ．Ｅ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．，１９９４；３６８（６４７２）：６３９－６４３ Ｍａｚｅｒｂｏｕｒｇ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ.,２００５；２８０（３７）：３２１２２－３２１３２ Ｌｅｅ，Ｋ．Ｊ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．，１９９８；１２（２１）：３３９４－３４０７ Ｆｕｒｕｙａ，Ｋ．，ｅｔ　ａｌ.,Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９９；７２（２）：１７７－１８０ Ｆｕ，Ｓ．Ｃ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ．,２００３；７２（２６）：２９６５－２９７４

　鉄と酸化還元反応との関連については古くから知られていたが、酸化ストレスと様々な疾患との関連についての研究は比較的近年より盛んになった研究分野である。この様な背景により鉄過剰疾患または鉄濃度を低下させることが有効な疾患に対する治療の開発が近年重要な課題となり、これら疾患に対する治療剤の研究開発が精力的に行われている。

　現在最も一般的に使用される鉄過剰症治療薬の一つはエクジェイドであり、従来の治療方法に比べ大幅に治療上の負担が軽減された優れた薬剤であるが、最近その副作用が問題となっている。

　そのため、鉄過剰疾患または鉄濃度を低下させることが有効な疾患に対してさらに有効に作用し、副作用の少ない薬剤が強く望まれている。

　本発明者らは、哺乳動物においてＧＤＦ７遺伝子産物の生理的作用について鋭意研究を行った結果、驚くべきことに、ＧＤＦ７が血清中の鉄濃度を特異的に減少させる作用を有することを初めて見出した。

　また、本発明者らはＧＤＦ７蛋白質を過剰発現するマウスを作製し、ＧＤＦ７の過剰発現により血清鉄濃度の低下が誘導されることを見出した。

　このような知見に基づいて、ＧＤＦ７を含む蛋白質または該蛋白質をコードする核酸を含むベクターを有効成分とする医薬組成物を、鉄過剰疾患治療剤または鉄濃度を低下させることが有効な疾患に対する治療剤として提供できることが示された。

　すなわち、本発明は、以下の特徴を含む。
１．ＧＤＦ７を含む蛋白質または該蛋白質をコードする核酸を含むベクターを有効成分として含有する、鉄過剰疾患または鉄濃度を低下させることが有効な疾患に対する治療用医薬組成物。
２．ＧＤＦ７を含む蛋白質が化学修飾されている、前項１に記載の組成物。
３．化学修飾が、ポリエチレングリコールの結合である、前項２に記載の組成物。
４．化学修飾が、糖鎖の結合である、前項２に記載の組成物。
５．ＧＤＦ７を含む蛋白質が、組換え蛋白質である、前項１～４のいずれか１項に記載の組成物。
６．ＧＤＦ７を含む蛋白質が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４および配列番号１６のいずれか１で示されるアミノ酸配列を含む、前項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
７．ＧＤＦ７を含む蛋白質が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４および配列番号１６のいずれか１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ血清鉄濃度の低下活性を有する蛋白質である、前項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
８．ＧＤＦ７を含む蛋白質が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４および配列番号１６のいずれか１で示されるアミノ酸配列のうち、1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ血清鉄濃度の低下活性を有する蛋白質である、前項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
９．ＧＤＦ７を含む蛋白質をコードする核酸が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３および配列番号１５のいずれか１で示される塩基配列を含む、前項１に記載の組成物。
１０．ＧＤＦ７を含む蛋白質をコードする核酸が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３および配列番号１５のいずれか１で示される塩基配列と６０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ血清鉄濃度の低下活性を有する蛋白質をコードする核酸である、前項１に記載の組成物。
１１．ＧＤＦ７を含む蛋白質をコードする核酸が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３および配列番号１５のいずれか１で示される塩基配列のうち、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなり、かつ血清鉄濃度の低下活性を有する蛋白質をコードする核酸である、前項１に記載の組成物。
１２．ＧＤＦ７を含む蛋白質をコードする核酸が、前項９～１１のいずれか１項に記載の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ血清鉄濃度の低下活性を有する蛋白質をコードする核酸である、前項１に記載の組成物。
１３．ＧＤＦ７が哺乳動物由来である、前項１～１２のいずれか１項に記載の組成物。
１４．哺乳動物がヒトである、前項１３に記載の組成物。
１５．鉄過剰疾患が、遺伝性ヘモクロマトーシスまたは輸血によって引き起こされる鉄過剰症である、前項１～１４のいずれか１項に記載の組成物。
１６．鉄過剰疾患が、貧血症に伴う輸血によって引き起こされる鉄過剰症である、前項１５に記載の組成物。
１７．貧血症が、サラセミア、鎌状赤血球貧血、骨髄異形成症候群および再生不良性貧血のいずれか１である、前項１６に記載の組成物。
１８．鉄濃度を低下させることが有効な疾患が、Ｃ型慢性肝炎である、前項１～１４のいずれか１項に記載の組成物。
１９．Ｃ型慢性肝炎がインターフェロン不応性である、前項１８に記載の組成物。
２０．鉄濃度を低下させることが有効な疾患が、糖尿病性腎症、腎不全および腎障害のいずれか１である、前項１～１４のいずれか１項に記載の組成物。
２１．鉄濃度を低下させることが有効な疾患が、感染症である、前項１～１４のいずれか１項に記載の組成物。
２２．感染症が、大腸菌、サルモネラ菌、ウシ流産菌、炭疽菌、バークホルデリア・セパシア菌、ジフテリア菌、ビブリオ菌および真菌から選ばれるいずれか１による感染症である、前項２１に記載の組成物。
２３．感染症が、抗生物質に対して抵抗性を示す感染症である、前項２１または２２に記載の組成物。
２４．抗生物質に対して抵抗性を示す感染症が、ムコール症である、前項２３に記載の組成物。

　本発明により、血清鉄濃度または鉄飽和度を低下させることができる。従って、遺伝性ヘモクロマトーシスや輸血によって引き起こされる鉄過剰疾患や、Ｃ型慢性肝炎、糖尿病性腎症、腎不全および腎障害並びに抗生物質等に対して抵抗性を示す治療抵抗性感染症等の血清並びに器官および組織中の少なくともいずれか１の鉄濃度を低下させることが有効な疾患を、副作用を引き起こすことなく治療することが可能となる。

ｍＧＤＦ７投与による血清鉄濃度の変化を解析した結果を示すグラフである。（実施例３） ＵＳｍＧＤＦ７　Ｋ１キメラマウスによる腎負荷試験の結果（尿素窒素濃度）を示すグラフである。（実施例４） ＵＳｍＧＤＦ７　Ｋ１キメラマウスによる腎負荷試験の結果（クレアチニン濃度）を示すグラフである。（実施例４）

　以下、本発明を詳細に説明する。

　本発明は、ＧＤＦ７を含む蛋白質または該蛋白質をコードする核酸を含むベクターを有効成分として含有する、鉄過剰疾患または鉄濃度を低下させることが有効な疾患に対する治療用組成物を提供する。

　本発明は、ＧＤＦ７を含む蛋白質または該蛋白質をコードする核酸を含むベクターが哺乳動物において血清鉄濃度低下作用を有するという知見に基づいている。

　本発明者らは、ノックイン法を利用してマウスＥＳ細胞からＧＤＦ７を過剰発現するマウスを作製、またはＧＤＦ７を含む蛋白質をマウスに投与したところ、血清鉄濃度がコントロール個体に比べて有意に低下し、しかも驚くべきことに、クレアチニン濃度及びＧＰＴ濃度がコントロール個体に比べて低下することなく、また、腎臓及び肝臓の病理組織標本解析においてコントロール個体に比べて明らかな変化が見られない、即ち副作用が観察されないことを初めて見出した。

　従って、ＧＤＦ７を含む蛋白質または該蛋白質をコードする核酸を含むベクターを有効成分として含有する本発明の医薬組成物は、鉄過剰疾患または鉄濃度を低下させることが有効な疾患に対する治療のために使用することができる。

　以下において、本発明の医薬組成物について、さらに具体的に説明する。

　本発明は、ＧＤＦ７を含む蛋白質または該蛋白質をコードする核酸を含むベクターを有効成分として含有する、鉄過剰疾患または鉄濃度を低下させることが有効な疾患に対する治療用医薬組成物に関する。

　本発明に関わるＧＤＦ７またはＧＤＦ７と同一の分子であるＢＭＰ（Ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ)１２(以下、両者をまとめてＧＤＦ７と称する)のアミノ酸及び塩基配列の情報は、米国ＮＣＢＩにアクセスすることによって入手可能である。

　ＧＤＦ７は、ヒト、マウス、ラット、アカゲザル、ゼブラフィッシュ、ニシツメガエル等から単離され、配列情報が公開されている。例えばヒトＧＤＦ７は、アクセッション番号ＮＭ＿１８２８２８．１、ＮＭ＿１８２８２８．２、ＮＰ＿８７８２４８．１およびＮＰ＿８７８２４８．２等として米国ＮＣＢＩ(ＧｅｎＢａｎｋまたはＳｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ)に登録されている。また、マウスＧＤＦ７は、アクセッション番号ＮＭ＿０１３５２７．１、ＮＰ＿０３８５５５．１、Ｐ４３０２９等として、米国ＮＣＢＩ(ＧｅｎＢａｎｋまたはＳｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ)に登録されている。

　本発明において、ＧＤＦ７またはこれをコードする核酸の塩基配列は、その由来に限定されるものではないが、哺乳動物が好ましい。哺乳動物は、特に限定されないが、例えば霊長類、家畜動物、げっ歯類、有蹄類およびペット動物等が挙げられる。さらに好ましい哺乳動物は、ヒト及びマウスである。

　さらに、本発明におけるＧＤＦ７としては、例えば、ＧＤＦ７の活性本体であるｍａｔｕｒｅ体の他、シグナルペプチド領域を含む前駆体蛋白質(ｐｒｅ－ｐｒｏ体)およびシグナルペプチド領域を含まずＮ末プロペプチド領域及び活性本体を含むｐｒｏ体並びにｍａｔｕｒｅ体の二量体、該ｐｒｏ体の二量体および該ｐｒｏ体２分子が該ｍａｔｕｒｅ二量体１分子と非共有結合した複合体も包含される。

　本発明におけるＧＤＦ７としては、例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４および配列番号１６のいずれか１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。

ヒトＧＤＦ７のアミノ酸配列（配列番号２、ｐｒｅ－ｐｒｏ体、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿８７８２４８．２）：
MDLSAAAALCLWLLSACRPRDGLEAAAVLRAAGAGPVRSPGGGGGGGGGGRTLAQAAGAAAVPAAAVPRARAARRAAGSGFRNGSVVPHHFMMSLYRSLAGRAPAGAAAVSASGHGRADTITGFTDQATQDESAAETGQSFLFDVSSLNDADEVVGAELRVLRRGSPESGPGSWTSPPLLLLSTCPGAARAPRLLYSRAAEPLVGQRWEAFDVADAMRRHRREPRPPRAFCLLLRAVAGPVPSPLALRRLGFGWPGGGGSAAEERAVLVVSSRTQRKESLFREIRAQARALGAALASEPLPDPGTGTASPRAVIGGRRRRRTALAGTRTAQGSGGGAGRGHGRRGRSRCSRKPLHVDFKELGWDDWIIAPLDYEAYHCEGLCDFPLRSHLEPTNHAIIQTLLNSMAPDAAPASCCVPARLSPISILYIDAANNVVYKQYEDMVVEACGCR

ヒトＧＤＦ７のアミノ酸配列（配列番号４、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質のｐｒｏ体、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿８７８２４８．２のアミノ酸配列のうち２０番目～４５０番目のアミノ酸配列）：
RDGLEAAAVLRAAGAGPVRSPGGGGGGGGGGRTLAQAAGAAAVPAAAVPRARAARRAAGSGFRNGSVVPHHFMMSLYRSLAGRAPAGAAAVSASGHGRADTITGFTDQATQDESAAETGQSFLFDVSSLNDADEVVGAELRVLRRGSPESGPGSWTSPPLLLLSTCPGAARAPRLLYSRAAEPLVGQRWEAFDVADAMRRHRREPRPPRAFCLLLRAVAGPVPSPLALRRLGFGWPGGGGSAAEERAVLVVSSRTQRKESLFREIRAQARALGAALASEPLPDPGTGTASPRAVIGGRRRRRTALAGTRTAQGSGGGAGRGHGRRGRSRCSRKPLHVDFKELGWDDWIIAPLDYEAYHCEGLCDFPLRSHLEPTNHAIIQTLLNSMAPDAAPASCCVPARLSPISILYIDAANNVVYKQYEDMVVEACGCR

ヒトＧＤＦ７のアミノ酸配列（配列番号６、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質のｍａｔｕｒｅ体、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿８７８２４８．２のアミノ酸配列のうち３２２番目～４５０番目のアミノ酸配列）：
TALAGTRTAQGSGGGAGRGHGRRGRSRCSRKPLHVDFKELGWDDWIIAPLDYEAYHCEGLCDFPLRSHLEPTNHAIIQTLLNSMAPDAAPASCCVPARLSPISILYIDAANNVVYKQYEDMVVEACGCR

マウスＧＤＦ７のアミノ酸配列（配列番号８、ｐｒｅ－ｐｒｏ体、ＮＣＢＩアクセッション番号Ｐ４３０２９）：
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マウスＧＤＦ７のアミノ酸配列（配列番号１０、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質のｐｒｏ体、ＮＣＢＩアクセッション番号Ｐ４３０２９のアミノ酸配列のうち２０番目～４６１番目のアミノ酸配列）：
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マウスＧＤＦ７のアミノ酸配列（配列番号１２、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質のｍａｔｕｒｅ体、ＮＣＢＩアクセッション番号Ｐ４３０２９のアミノ酸配列のうち３１６番目～４６１番目のアミノ酸配列）：
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マウスＧＤＦ７のアミノ酸配列（配列番号１４、ｐｒｅ－ｐｒｏ体、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０３８５５５．１）：
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マウスＧＤＦ７のアミノ酸配列（配列番号１６、配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質のｐｒｏ体、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０３８５５５．１のアミノ酸配列のうち２０番目～４５３番目のアミノ酸配列）：
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マウスＧＤＦ７のアミノ酸配列（配列番号１２、配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質のｍａｔｕｒｅ体、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０３８５５５．１のアミノ酸配列のうち３０８番目～４５３番目の配列、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質のｍａｔｕｒｅ体のアミノ酸配列と同一）：
TALAGTRGAQGSGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGAGRGHGRRGRSRCSRKSLHVDFKELGWDDWIIAPLDYEAYHCEGVCDFPLRSHLEPTNHAIIQTLLNSMAPDAAPASCCVPARLSPISILYIDAANNVVYKQYEDMVVEACGCR

　本発明のＧＤＦ７には、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４および配列番号１６のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠失、置換あるいは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ血清鉄濃度の低下活性を有するポリペプチドも包含される。

　また、本発明のＧＤＦ７には、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４および配列番号１６のいずれか１で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、例えば、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドからなり、かつ血清鉄濃度の低下活性を有するポリペプチドも包含される。

　配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４および配列番号１６のいずれか１で示されるアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、例えば、次の方法により得ることができる。

　例えば、前記アミノ酸配列に基づいて合成した（相補的変異配列を含む）プライマーを使用するＰＣＲ法を利用した部位特異的突然変異誘発法（Ｋｕｎｋｅｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８５，８２：４８８－４９２；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ　ｅｄ．，１９８９，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒy　Ｐｒｅｓｓなど）などを用いて、例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４および配列番号１６のいずれか１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸に部位特異的変異を導入することにより得ることができる。

　また、変異導入用キット（例えば、宝酒造製）も市販されているので、指示書に従って変異を導入することもできる。

　Ｋｕｎｋｅｌらの部位特異的突然変異誘発法には、ＧＤＦ７を含む蛋白質をコードする核酸を含むプラスミドを鋳型にし、Ｔ４　ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼで予め５’末端をリン酸化したプライマー（相補的変異配列を含む）を該鋳型にアニーリングし、核酸合成を行ったのち、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼで末端同士を連結して、目的の変異を含む核酸を精製することを含む。

　また、公知の全合成の手法により目的の変異を含む核酸を取得することも可能である。

　欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは１個～数十個、例えば、１～２０個、より好ましくは１個～数個、例えば、１～５個のアミノ酸である。

　置換は、保存的置換および非保存的置換のいずれでもよいが、ＧＤＦ７を含む蛋白質のコンホメーションを実質的に変化させないためには保存的置換が好ましい。

　保存的置換は、構造的（例えば、分岐状および芳香族性等）、電気的（例えば、酸性、塩基性等）、極性および疎水性等の化学的・物理的性質の類似したアミノ酸間での置換をいう。

　分岐状アミノ酸には、バリン、ロイシンおよびイソロイシンが含まれる。芳香族アミノ酸には、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニンおよびヒスチジンが含まれる。

　酸性アミノ酸には、グルタミン酸およびアスパラギン酸が含まれる。塩基性アミノ酸には、リシン、アルギニンおよびヒスチジンが含まれる。

　極性アミノ酸には、セリン、トレオニン、グルタミンおよびアスパラギン、チロシン、システイン、グリシン、プロリンなどが含まれる。疎水性アミノ酸には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびメチオニンなどが含まれる。

　欠失は、１もしくは複数のアミノ酸残基を失うことである。付加は、１もしくは複数のアミノ酸残基を蛋白質のＮ末端またはＣ末端に結合することである。挿入は、蛋白質の内部に１もしくは複数のアミノ酸残基を結合することである。

　このうち、欠失と挿入は、ＧＤＦ７を含む蛋白質のコンホメーションを実質的に変化させないことを前提として行うことができる。そのために、１～５個程度のアミノ酸残基の欠失または挿入が好ましい。

　本発明における相同性は、２つのアミノ酸配列（または塩基配列）のアラインメントにおいて、同一のアミノ酸残基数（または塩基数）が最大となるように該２つの配列を整列させたときの配列間の一致度を意味する。

　相同性は、具体的には、総アミノ酸残基数（または総塩基数）に対する同一アミノ酸残基数（または同一塩基数）のパーセンテージ(％)で表わされる。ＦＡＳＴＡのようにギャップを導入する場合、ギャップの数も総アミノ酸残基数（または総塩基数）に加算する。

　８０％以上、好ましくは８５％以上の相同性を有する蛋白質は、例えばＮＣＢＩ（米国）、ＥＭＢＬ（欧州）などの配列データベースにアクセスし、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの配列相同性検索プログラムを利用して検索することが可能である（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら　Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０；１５：４０３－４１０； Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．とＡｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ　１９９０；８７：２２６４－２２６８等)。

　ＢＬＡＳＴは、配列を固定長のワードに区切り、ワード単位で類似する断片を検索し、これらを類似度が最大になるまで両方向に伸ばして局所的なアラインメントを行い、最後にこれらを結合して最終的なアラインメントを行う方法である。

　また、ＦＡＳＴＡは、連続して一致する配列の断片を高速に検索し、それらの断片の中で類似度の高いものに着目して局所的なアラインメントを行い、最後にギャップを考慮した上でこれらを結合しアラインメントを行う方法である。

　さらに本発明におけるＧＤＦ７を含む蛋白質は、異種ペプチド、異種ポリペプチドおよび異種蛋白質のいずれか１を、上記ＧＤＦ７のＮ末端またはＣ末端側に、必要であれば適当なペプチドリンカー（例えば、アミノ酸数１～２０）を介して、結合または融合してもよいことを意味する。

　異種蛋白質としては、例えば、哺乳動物由来免疫グロブリンＦｃ蛋白質およびその変異体等が好適に挙げられる。しかし、このような異種蛋白質が生体内に投与されると、拒絶反応を引き起こす可能性がある。該拒絶反応をできる限り回避するためにも、投与する哺乳動物が本来有する蛋白質を該異種蛋白質として使用することが好ましい。

　Ｆｃ蛋白質の中でも、ヒトへの使用を考慮すると、ヒト免疫グロブリンのＦｃ蛋白質が好ましい。また、免疫グロブリンのクラス及びサブクラスは、特に限定されないが、例えばＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２等が挙げられる。ヒトに使用するのであれば、ヒト免疫グロブリンのクラス及びサブクラスを使用することが望ましい。

　Ｆｃ蛋白質は、ＧＤＦ７を含む蛋白質の生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）での安定性を向上させることができる。ただし、この場合、Ｆｃ蛋白質は、その生物活性による生体内に及ぼす影響を避けるために、例えば、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）活性及び補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ）活性の少なくともいずれか等の生物活性を予め低下させることが好ましい。そのために、前記生物活性を抑制、低下または喪失させるための変異を導入することが好ましい。

　前記生物活性を抑制、低下または喪失させるための変異は、哺乳動物由来のＦｃ蛋白質のアミノ酸配列において、例えば１～１０個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個のアミノ酸残基のアミノ酸置換であって、ＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性の少なくともいずれかを低下させるような任意のアミノ酸置換である。

　本発明において、血清鉄濃度の低下活性は、血清生化学解析における血清鉄濃度（Ｆｅ）、または鉄飽和率（％；Ｆｅ／ＴＩＢＣ×１００）などの公知の鉄量の指標を用いて評価することができる。ここで、Ｆｅは血清鉄濃度（μg／ｄＬ）、ＴＩＢＣは単位血清中でトランスフェリンが結合することのできる鉄の最大量（μg／ｄＬ）を示す。

　本発明において、血清鉄濃度の低下活性を有するとは、該鉄量の指標においてコントロール群または無処置群に対して低下することである。例えば、該鉄量の指標を血清鉄濃度または鉄飽和度とし、コントロール群の血清鉄濃度または鉄飽和度をそれぞれ１００％とした場合に、血清鉄濃度または鉄飽和度が９０％以下であることが好ましく、８０％以下であることがより好ましい。

　本発明のＧＤＦ７を含む蛋白質は、当業者に公知の遺伝子組換え技術によって作製することができる。簡単に説明すると、該蛋白質の作製は、本発明の蛋白質をコードする核酸を用意し、この核酸を含む発現ベクターを構築し、該ベクターで原核または真核細胞を形質転換またはトランスフェクションし、得られた細胞の培養から目的の組換え蛋白質を回収することを含む。

　蛋白質の精製は、蛋白質の慣用の精製法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、有機溶媒沈殿、透析、電気泳動、クロマトフォーカシング、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよびＨＰＬＣ等を適宜組み合わせることによって実施可能である。

　ベクターに関しては、例えば、後述のベクターに関する説明および実施例等を参照することができる。

　また、遺伝子組換え技術は、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ　ｅｄ．，１９８９，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、本発明のために利用できる。

　さらに、ＧＤＦ７を含む蛋白質は、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）法およびｔ－ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ）法などの化学合成法によって製造することもできる。

　本発明におけるＧＤＦ7を含む蛋白質は、化学修飾されていてもよい。

　化学修飾は、特に限定されないが、例えば、グリコシル化、ペグ（ＰＥＧ）化、アセチル化、アミド化およびリン酸化等が挙げられる。中でも、グリコシル化およびペグ化が特に好ましい。

　ペグ化は、例えば該蛋白質のＮ末端アミノ基、リジン（Ｌｙｓ）のεアミノ基などのアミノ酸残基に１または複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を結合させることである。一般的には、アミノ酸の遊離アミノ基にＰＥＧ分子が結合する。

　ＰＥＧの平均分子量は、特に限定されないが、約３，０００～約５０，０００の範囲が好ましい。ＰＥＧを蛋白質に結合させるには、ＰＥＧの末端部分に、例えば、カルボキシル基、ホルミル（アルデヒド）基、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基、アミノ基、チオール基およびマレイイミド基等の活性基を導入し、該蛋白質のアミノ基、カルボキシル基、チオール基およびヒドロキシル基等の基と反応させる方法等が挙げられる。

　グリコシル化は、蛋白質のアスパラギン、セリンおよびトレオニン残基のいずれか１に糖鎖が結合することである。一般に、Ａｓｎ－Ｘ－Ｔｈｒ／Ｓｅｒ（ここで、ＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸残基である）の配列を認識して糖または糖鎖の結合が起こる。

　Ａｓｎ－Ｘ－Ｔｈｒ／Ｓｅｒの配列を含むように蛋白質のアミノ酸配列を改変するときは、天然型と異なる位置に糖または糖鎖を導入することもできる。通常、遺伝子組換え技術によって、組換え蛋白質をコードする核酸を、真核細胞（酵母細胞、動物細胞および植物細胞など）中で発現することによって、組換え蛋白質のグリコシル化を起こすことができる。

　本発明において、糖鎖の構造は、特に制限されないものとし、発現のために選択された細胞の種類によって糖鎖構造が異なると考えられる。ヒトにおける使用の場合、ヒト由来細胞、ヒト糖鎖を合成可能な酵母細胞およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等を利用しうる。また、周知の化学合成法を用いて該蛋白質に糖または糖鎖を導入することもできる。

　アセチル化およびアミド化の反応は、主に、蛋白質のＮ末端またはＣ末端で行うことが好ましい。これらの反応は、例えば、脂肪族アルコールおよび脂肪酸等のアルコール類並びにカルボン酸類を用いて行うことができる。アルキル部分の炭素数は、例えば、１～２０程度が好ましく、水溶性を損なわないおよび無毒性である等の条件を満たすことがより好ましい。

　本発明の組成物の有効成分として、ＧＤＦ７を含む蛋白質をコードする核酸を含むベクターも含まれる。

　本発明において、核酸には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれるものとする。また、ＤＮＡにはゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡが含まれ、ＲＮＡにはｍＲＮＡが含まれるものとする。

　ＧＤＦ７を含む蛋白質については、異種蛋白質との結合または融合された蛋白質を含めて、上記のＧＤＦ７を含む蛋白質に係る全ての記載をここでも引用する。したがって、本発明におけるＧＤＦ７を含む蛋白質をコードする核酸は、上記具体的に例示した、ＧＤＦ７をコードする核酸を包含する。

　ＧＤＦ７を含む蛋白質をコードする核酸としては、例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３および配列番号１５のいずれか１で示される塩基配列があげられる。

ヒトＧＤＦ７をコードする核酸の塩基配列（配列番号１、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるｐｒｅ－ｐｒｏ体をコードする遺伝子、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿１８２８２８．２記載の核酸配列のうち５７７番目～１９２９番目の配列）：
atggacctgagcgccgccgccgcgctgtgcctttggctgctgagcgcctgccgcccccgcgacgggctggaagcggccgccgtgctgcgagcggcgggggctgggccggtccggagcccagggggcggcggcggcggcggcggcggcgggcggactcttgcccaggctgcgggcgccgcggctgtcccggccgccgcggttccccgggcccgcgccgcgcgccgcgccgcgggctccggcttcaggaacggctcggtggtgccgcaccacttcatgatgtcgctttaccggagcctggccgggagggctccggccggggcagccgctgtctccgcctcgggccatggtcgcgcggacacgatcaccggcttcacagaccaggcgacccaagacgaatcggcagccgaaacaggccagagcttcctgttcgacgtgtccagccttaacgacgcagacgaggtggtgggtgccgagctgcgcgtgctgcgccggggatctccagagtcgggcccaggcagctggacttctccgccgttgctgctgctgtccacgtgcccgggcgccgcccgagcgccacgcctgctgtactcgcgggcagctgagcccctagtcggtcagcgctgggaggcgttcgacgtggcggacgccatgaggcgccaccgtcgtgaaccgcgccccccccgcgcgttctgcctcttgctgcgcgcagtggcaggcccggtgccgagcccgttggcactgcggcggctgggcttcggctggccgggcggagggggctctgcggcagaggagcgcgcggtgctagtcgtctcctcccgcacgcagaggaaagagagcttattccgggagatccgcgcccaggcccgcgcgctcggggccgctctggcctcagagccgctgcccgacccaggaaccggcaccgcgtcgccaagggcagtcattggcggccgcagacggaggaggacggcgttggccgggacgcggacagcgcagggcagcggcgggggcgcgggccggggccacgggcgcaggggccggagccgctgcagccgcaagccgttgcacgtggacttcaaggagctcggctgggacgactggatcatcgcgccgctggactacgaggcgtaccactgcgagggcctttgcgacttccctttgcgttcgcacctcgagcccaccaaccatgccatcattcagacgctgctcaactccatggcaccagacgcggcgccggcctcctgctgtgtgccagcgcgcctcagccccatcagcatcctctacatcgacgccgccaacaacgttgtctacaagcaatacgaggacatggtggtggaggcctgcggctgcaggtag

ヒトＧＤＦ７をコードする核酸の塩基配列（配列番号３、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるｐｒｏ体をコードする遺伝子、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿１８２８２８．２記載の核酸配列のうち６３４番目～１９２９番目の配列）：
cgcgacgggctggaagcggccgccgtgctgcgagcggcgggggctgggccggtccggagcccagggggcggcggcggcggcggcggcggcgggcggactcttgcccaggctgcgggcgccgcggctgtcccggccgccgcggttccccgggcccgcgccgcgcgccgcgccgcgggctccggcttcaggaacggctcggtggtgccgcaccacttcatgatgtcgctttaccggagcctggccgggagggctccggccggggcagccgctgtctccgcctcgggccatggtcgcgcggacacgatcaccggcttcacagaccaggcgacccaagacgaatcggcagccgaaacaggccagagcttcctgttcgacgtgtccagccttaacgacgcagacgaggtggtgggtgccgagctgcgcgtgctgcgccggggatctccagagtcgggcccaggcagctggacttctccgccgttgctgctgctgtccacgtgcccgggcgccgcccgagcgccacgcctgctgtactcgcgggcagctgagcccctagtcggtcagcgctgggaggcgttcgacgtggcggacgccatgaggcgccaccgtcgtgaaccgcgccccccccgcgcgttctgcctcttgctgcgcgcagtggcaggcccggtgccgagcccgttggcactgcggcggctgggcttcggctggccgggcggagggggctctgcggcagaggagcgcgcggtgctagtcgtctcctcccgcacgcagaggaaagagagcttattccgggagatccgcgcccaggcccgcgcgctcggggccgctctggcctcagagccgctgcccgacccaggaaccggcaccgcgtcgccaagggcagtcattggcggccgcagacggaggaggacggcgttggccgggacgcggacagcgcagggcagcggcgggggcgcgggccggggccacgggcgcaggggccggagccgctgcagccgcaagccgttgcacgtggacttcaaggagctcggctgggacgactggatcatcgcgccgctggactacgaggcgtaccactgcgagggcctttgcgacttccctttgcgttcgcacctcgagcccaccaaccatgccatcattcagacgctgctcaactccatggcaccagacgcggcgccggcctcctgctgtgtgccagcgcgcctcagccccatcagcatcctctacatcgacgccgccaacaacgttgtctacaagcaatacgaggacatggtggtggaggcctgcggctgcaggtag

ヒトＧＤＦ７をコードする核酸の塩基配列（配列番号５、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるｍａｔｕｒｅ体をコードする遺伝子、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿１８２８２８．２記載の核酸配列のうち１５４０番目～１９２９番目の配列）：
acggcgttggccgggacgcggacagcgcagggcagcggcgggggcgcgggccggggccacgggcgcaggggccggagccgctgcagccgcaagccgttgcacgtggacttcaaggagctcggctgggAcgactggatcatcgcgccgctggactacgaggcgtaccactgcgagggcctttgcgacttccctttgcgttcgcacctcgagcccaccaaccatgccatcattcagacgctgctcaactccatggcaccagacgcggcgccggcctcctgctgtgtgccagcgcgcctcagccccatcagcatcctctacatcgacgccgccaacaacgttgtctacaagcaatacgaggacatggtggtggaggcctgcggctgcaggtag

マウスＧＤＦ７をコードする核酸の塩基配列（配列番号７、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるｐｒｅ－ｐｒｏ体をコードする遺伝子）：
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マウスＧＤＦ７をコードする核酸の塩基配列（配列番号９、配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるｐｒｏ体をコードする遺伝子、配列番号７の核酸配列のうち５８番目～１３８６番目の配列）：
cgcgacgggctagaagctgccgcggtgctccgagcggcgggggctggaccagcctggagccccgggggcggcggcggcgggcggaccctcgcccgggctccaggcccttcagctctccaggccgctgcggttccgggtccccgagctgtgcgccgcgctgcgggttctggcttcaggaacggctcggtggtgccacaccacttcatgatgtcgctttacaggagcctggcggggagggctccggtcgcggcagcttcagggcacgggcgtgtggacacaatcaccggcttcacagaccaagcaactcaagacgaaacggcggcggccgagccaggccagagcttcctgttcgacgtatccagcctctccgaagccgatgaggtggtgaatgcggagctgcgcgtgctgcgccggaggtctccggaaccagacagggacagtgcgaccctccttccgcggctgctgctgtccacgtgcccggacgaggctggcacagctcacctgctgcactcccgggccgccgagcccctgggcggcgcgcgctgggaagcgttcgacgtgacggacgcggtgcagagccaccgccgctggccgcgagcctcccgcaagttctgcctggtgctgcgcgcggtgacggcctcggagagcagcccgctggccctgagacgactgggcttcggctggccgggcggtggcgacggcggcggcactgcggccgaggagcgcgcgctgttggtgatctcctcccgtacgcaaaggaaagagagtctgttccgggagatccgagcccaggcccgtgctctccgggccgctgcagagccgccaccggatccaggaccaggcgctgggtcacgcaaagccaacctgggcggtcgcaggcggcggcggactgcgctggctgggactcggggagcgcagggaagcggtggtggcggcggtggcggtggcggcggcggcggcggcggcggcggcggcggcggcggcgcaggcaggggccacgggcgcagaggccggagccgctgcagtcgcaagtcactgcacgtggactttaaggagctgggctgggacgactggatcatcgcgccattagactacgaggcataccactgcgagggcgtttgcgactttcctctgcgctcgcacctggagcctaccaaccacgccatcattcagacgctgctcaactccatggcgcccgacgctgcgccagcctcctgctgcgtgcccgcaaggctcagtcccatcagcattctctacatcgatgccgccaacaacgtggtctacaagcagtacgaagacatggtggtggaggcctgcggctgcaggtag

マウスＧＤＦ７をコードする核酸の塩基配列（配列番号１１、配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるｍａｔｕｒｅ体をコードする遺伝子、配列番号７の核酸配列のうち９４６番目～１３８６番目の配列）：
actgcgctggctgggactcggggagcgcagggaagcggtggtggcggcggtggcggtggcggcggcggcggcggcggcggcggcggcggcggcggcgcaggcaggggccacgggcgcagaggccggagccgctgcagtcgcaagtcactgcacgtggactttaaggagctgggctgggacgactggatcatcgcgccattagactacgaggcataccactgcgagggcgtttgcgactttcctctgcgctcgcacctggagcctaccaaccacgccatcattcagacgctgctcaactccatggcgcccgacgctgcgccagcctcctgctgcgtgcccgcaaggctcagtcccatcagcattctctacatcgatgccgccaacaacgtggtctacaagcagtacgaagacatggtggtggaggcctgcggctgcaggtag

マウスＧＤＦ７をコードする核酸の塩基配列（配列番号１３、配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなるｐｒｅ－ｐｒｏ体をコードする遺伝子、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１３５２７．１の核酸配列のうち２２番目～１３８３番目の配列）：
atggacctgagcgctgccgccgcgctgtgtctctggctgctgagcgcttgccgtccccgcgacgggctagaagctgccgcggtgctccgagcggcgggggctggaccagcctggagccccgggggcggcggcggcgggcggaccctcgcccgggctccaggcccttcagctctccaggccgctgcggttccgggtccccgagctgtgcgccgcgctgcgggttctggcttcaggaacggctcggtggtgccacaccacttcatgatgtcgctttacaggagcctggcggggagggctccggtcgcggcagcttcagggcacgggcgtgtggacacaatcaccggcttcacagaccaagcaactcaaggccagagcttcctgttcgacgtatccagcctctccgaagccgatgaggtggtgaatgcggagctgcgcgtgctgcgccggaggtctccggaaccagacagggacagtgcgaccctccttccgcggctgctgctgtccacgtgcccggacgaggctggcacagctcacctgctgcactcccgggccgccgagcccctgggcggcgcgcgctgggaagcgttcgacgtgacggacgcggtgcagagccaccgccgctggccgcgagcctcccgcaagttctgcctggtgctgcgcgcggtgacggcctcggagagcagcccgctggccctgagacgactgggcttcggctggccgggcggtggcgacggcggcggcactgcggccgaggagcgcgcgctgttggtgatctcctcccgtacgcaaaggaaagagagtctgttccgggagatccgagcccaggcccgtgctctccgggccgctgcagagccgccaccggatccaggaccaggcgctgggtcacgcaaagccaacctgggcggtcgcaggcggcggcggactgcgctggctgggactcggggagcgcagggaagcggtggtggcggcggtggcggtggcggcggcggcggcggcggcggcggcggcggcggcggcgcaggcaggggccacgggcgcagaggccggagccgctgcagtcgcaagtcactgcacgtggactttaaggagctgggcTgggacgactggatcatcgcgccattagactacgaggcataccactgcgagggcgtttgcgactttcctctgcgctcgcacctggagcctaccaaccacgccatcattcagacgctgctcaactccatggcgcccgacgctgcgccagcctcctgctgcgtgcccgcaaggctcagtcccatcagcattctctacatcgatgccgccaacaacgtggtctacaagcagtacgaagacatggtggtggaggcctgcggctgcaggtag

マウスＧＤＦ７をコードする核酸の塩基配列（配列番号１５、配列番号１６で示されるアミノ酸配列からなるｐｒｏ体をコードする遺伝子、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１３５２７．１の核酸配列のうち７９番目～１３８３番目の配列）：
cgcgacgggctagaagctgccgcggtgctccgagcggcgggggctggaccagcctggagccccgggggcggcggcggcgggcggaccctcgcccgggctccaggcccttcagctctccaggccgctgcggttccgggtccccgagctgtgcgccgcgctgcgggttctggcttcaggaacggctcggtggtgccacaccacttcatgatgtcgctttacaggagcctggcggggagggctccggtcgcggcagcttcagggcacgggcgtgtggacacaatcaccggcttcacagaccaagcaactcaaggccagagcttcctgttcgacgtatccagcctctccgaagccgatgaggtggtgaatgcggagctgcgcgtgctgcgccggaggtctccggaaccagacagggacagtgcgaccctccttccgcggctgctgctgtccacgtgcccggacgaggctggcacagctcacctgctgcactcccgggccgccgagcccctgggcggcgcgcgctgggaagcgttcgacgtgacggacgcggtgcagagccaccgccgctggccgcgagcctcccgcaagttctgcctggtgctgcgcgcggtgacggcctcggagagcagcccgctggccctgagacgactgggcttcggctggccgggcggtggcgacggcggcggcactgcggccgaggagcgcgcgctgttggtgatctcctcccgtacgcaaaggaaagagagtctgttccgggagatccgagcccaggcccgtgctctccgggccgctgcagagccgccaccggatccaggaccaggcgctgggtcacgcaaagccaacctgggcggtcgcaggcggcggcggactgcgctggctgggactcggggagcgcagggaagcggtggtggcggcggtggcggtggcggcggcggcggcggcggcggcggcggcggcggcggcgcaggcaggggccacgggcgcagaggccggagccgctgcagtcgcaagtcactgcacgtggactttaaggagctgggctgggacgactggatcatcgcgccattagactacgaggcataccactgcgagggcgtttgcgactttcctctgcgctcgcacctggagcctaccaaccacgccatcattcagacgctgctcaactccatggcgcccgacgctgcgccagcctcctgctgcgtgcccgcaaggctcagtcccatcagcattctctacatcgatgccgccaacaacgtggtctacaagcagtacgaagacatggtggtggaggcctgcggctgcaggtag

マウスＧＤＦ７をコードする核酸の塩基配列[配列番号１１、配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質のｍａｔｕｒｅ体(配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質)をコードする遺伝子、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１３５２７．１の核酸配列のうち９４３番目～１３８３番目の配列、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質のｍａｔｕｒｅ体(配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質)をコードする遺伝子と同一]：
actgcgctggctgggactcggggagcgcagggaagcggtggtggcggcggtggcggtggcggcggcggcggcggcggcggcggcggcggcggcggcgcaggcaggggccacgggcgcagaggccggagccgctgcagtcgcaagtcactgcacgtggactttaaggagctgggctgggacgactggatcatcgcgccattagactacgaggcataccactgcgagggcgtttgcgactttcctctgcgctcgcacctggagcctaccaaccacgccatcattcagacgctgctcaactccatggcgcccgacgctgcgccagcctcctgctgcgtgcccgcaaggctcagtcccatcagcattctctacatcgatgccgccaacaacgtggtctacaagcagtacgaagacatggtggtggaggcctgcggctgcaggtag

　本発明のＧＤＦ７をコードする核酸を含む遺伝子には、次の遺伝子も含まれる。

　配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３および配列番号１５のいずれか１で示される塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、かつ血清鉄濃度の低下活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含む遺伝子。

　配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３および配列番号１５のいずれか１で示される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有する塩基配列、好ましくは８０％以上の相同性を有する塩基配列、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ血清鉄濃度の低下活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含む遺伝子。

　配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３および配列番号１５のいずれか１で示される塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸からなり、かつ血清鉄濃度の低下活性を有するポリペプチドをコードする核酸なども本発明のＧＤＦ７をコードする核酸を含む遺伝子。

　ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸としては、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３および配列番号１５のいずれか１で示される塩基配列を有する核酸をプローブに用いた、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、サザンブロット・ハイブリダイゼーション法、またはＤＮＡマイクロアレイ法などにより得られるハイブリダイズ可能な核酸を意味する。

　具体的には、例えば、ハイブリダイズしたコロニー若しくはプラーク由来の核酸、または該配列を有するＰＣＲ産物若しくはオリゴＤＮＡを固定化したフィルターまたはスライドガラスを用いて、０．７～１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーション［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）、ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　１：Ｃｏｒｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，（１９９５）］を行った後、０．１～２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターまたはスライドグラスを洗浄することにより同定できる核酸を挙げることができる。

　ハイブリダイズ可能な核酸としては、例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３および配列番号１５で示される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有する核酸、好ましくは８０％以上の相同性を有する核酸、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する核酸を挙げることができる。

　真核生物の蛋白質をコードする核酸の塩基配列には、しばしば遺伝子の多型が認められる。本発明において用いられる核酸に、当該多型によって塩基配列に小規模な変異を生じた核酸も包含される。

　上記の核酸ホモログは、例えば、ヒトまたはマウス由来のＧＤＦ７をコードするｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡに基づいて作製したプライマーやプローブを使用する周知の技術によって、ヒト及びマウス以外の他の哺乳動物由来の、該遺伝子を発現することが公知の細胞や組織から調製したｃＤＮＡライブラリーから取得することができる。そのような技術には、ＰＣＲ法およびハイブリダイゼーション法（サザン法およびノーザン法など）などが含まれる。

　ＰＣＲ法は、ポリメラーゼ連鎖反応であり、これは、二本鎖ＤＮＡを一本鎖に解離するための変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）工程（約９４～９６℃、約３０秒～１分）、プライマーを鋳型の一本鎖ＤＮＡに結合するためのアニーリング(ａｎｎｅａｌｉｎｇ)工程（約５５～６８℃、約３０秒～１分）、ＤＮＡ鎖を伸長するための伸長(ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ)工程（約７２℃、約３０秒～１分）からなるサイクルを１サイクルとして約２５～４０サイクルを実施する。また、変性工程の前に、約９４～９５℃で約５～１２分の前加熱処理を行い、伸長工程の最終サイクル後に、さらに７２℃で約７～１５分の伸長反応を実施することができる。

　ＰＣＲは、市販のサーマルサイクラーにて、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ[例えば、ＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）など]、ＭｇＣｌ_２、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ)などを含有するＰＣＲバッファー中で、センス及びアンチセンスプライマー（サイズ：好ましくは約１７～３０塩基、より好ましくは２０～２５塩基）と鋳型ＤＮＡの存在下で行う。増幅されたＤＮＡは、アガロースゲル電気泳動で分離・精製（臭化エチジウム染色）することができる。

　ハイブリダイゼーションは、好ましくは約２０～１００塩基またはそれ以上の長さの標識プローブと二本鎖を形成して目的核酸を検出する技法である。選択性を高めるために、一般にストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行うことができる。

　ストリンジェントな条件は、例えば、約１～５×ＳＳＣ、室温～約４０℃でのハイブリダイゼーション、及びその後の、約０．１～１×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ、約４５～６５℃での洗浄からなる。ここで、１×ＳＳＣは、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、１５ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｎａ－クエン酸、ｐＨ７．０の溶液を指す。このような条件により、相同性が約８０％以上、好ましくは８５％以上の核酸を検出することが可能となる。

　また、ＧＤＦ７を含む蛋白質をコードする核酸の塩基配列には、シグナル配列をコードする塩基配列をさらに含むことができる。シグナル配列は、例えば、ヒト蛋白質由来のシグナル配列、ヒトＧＤＦ７由来のシグナル配列、ヒトＢＭＰ２由来のシグナル配列、ヒトＣＤ３３由来のシグナル配列、ヒト血清アルブミン由来のシグナル配列およびヒトプレプロトリプシン由来のシグナル配列等が挙げられる。

　ＧＤＦ７を含む蛋白質をコードする核酸は、ベクターに挿入され、本発明の医薬組成物の有効成分である蛋白質の製造のために使用されるか、またはベクター自体を製剤化して医薬組成物として使用される。

　本発明において、ベクターは特に限定されないが、例えば、プラスミド、ファージおよびウイルスなどが挙げられる。プラスミドとしては、具体的には、例えば、大腸菌由来プラスミド（例えばｐＲＳＥＴ、ｐＴＺ１９Ｒ、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８およびｐＵＣ１１９等）、枯草菌由来プラスミド（例えばｐＵＢ１１０およびｐＴＰ５等）、酵母由来プラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４およびＹＣｐ５０等）およびTiプラスミド等が挙げられる。

　ファージとしては、例えば、λファージ等が挙げられる。ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどの動物ウイルスベクター、並びにバキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクター等が挙げられる。

　さらに本発明におけるベクターには、目的の核酸を組み込むためのポリリンカーまたはマルチクローニングサイトを含んでもよく、また、該核酸を発現するためにいくつかの制御エレメントを含むことができる。

　制御エレメントとしては、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ付加シグナル、複製開始点、選択マーカー、リボソーム結合配列およびターミネーターなどが挙げられる。

　選択マーカーとしては、例えば、薬剤耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子およびピューロマイシン耐性遺伝子など）、栄養要求性相補遺伝子[例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、ＨＩＳ３遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子およびＵＲＡ３遺伝子等]等が挙げられる。

　プロモーターは、使用する宿主細胞内で機能を発揮できるものであればいかなるものでも良いが、宿主細胞に応じて異なる場合がある。

　宿主細胞としては、特に限定されないが、例えば、大腸菌等のエシェリヒア属、バチルス・ズブチリス等のバチルス属およびシュードモナス・プチダ等のシュードモナス属等の細菌；サッカロミセス・セレビシエおよびシゾサッカロミセス・ポンベ等のサッカロミセス属、カンジダ属並びにピキア属等の酵母；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＮＩＨ３Ｔ３およびＮＳ０等の動物細胞；Ｓｆ９およびＳｆ２１等の昆虫細胞；植物細胞等が挙げられる。

　大腸菌等の細菌を宿主とする場合、プロモーターとしては、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｐ_ＬプロモーターおよびＰ_Ｒプロモーター等が挙げられる。

　酵母を宿主とする場合、プロモーターとしては、例えば、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、およびＡＯＸ１プロモーター等が挙げられる。

　動物細胞を宿主とする場合、プロモーターとしては、例えば、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ヒトＣＭＶ初期遺伝子プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、メタロチオネインプロモーター、Ｉｇκプロモーターおよび多角体プロモーター等が挙げられる。

　植物細胞を宿主とする場合、プロモーターとしては、例えば、ＣａＭＶプロモーターおよびＴＭＶプロモーター等が挙げられる。

　宿主細胞へのベクターの導入方法としては、使用する宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、エレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９０；３：１３３）、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法（日本国特開平２－２２７０７５号公報）、アグロバクテリウム法、ウイルス感染法、リポソーム法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法およびリポフェクション法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８７；８４；７４１３）等が挙げられる。

　以上のようにして得られる、ＧＤＦ７を含む蛋白質をコードする核酸を組み込んだ組換えベクターを保有する微生物、または動物細胞などの由来の形質転換体を培地に培養し、培養物中にＧＤＦ７を含む蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、ＧＤＦ７を含む蛋白質を製造することができる。該形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。

　真核生物由来の細胞で発現させた場合には、糖または糖鎖が付加されたＧＤＦ７を含む蛋白質を得ることができる。

　組換えベクターを保有する微生物を培養する培地としては、例えば、微生物が資化しうる、炭素源、窒素源および無機塩類等を含有する培地を挙げられる。

　炭素源としては、例えば、グルコース、フラクトース、スクロースおよびデンプン等の炭水化物、酢酸およびプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノールおよびプロパノール等のアルコール類が挙げられる

　窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウムおよびリン酸アンモニウム等の無機酸および有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス並びにコーンスティープリカー等が挙げられる。

　無機物としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅および炭酸カルシウム等が用いられる。

　誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合には、イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド等を培地に添加してもよい。また、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合には、インドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。

　動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えば、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９６７；１９９：５１９）、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９５２；１２２：５０１）、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ培地、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９５９；８：３９６）、１９９培地（Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１９５０；７３：１）およびＩｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）培地、並びにこれら培地に牛胎児血清（例えば、ＦＢＳおよびＦＣＳ等）等を添加した培地等が挙げられる。

　培養は、通常ｐＨ６～８、３０～４０℃、５％ＣＯ_２存在下等の条件下で１～１４日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、またはペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。

　ＧＤＦ７を含む蛋白質をコードする核酸の発現方法としては、直接発現以外に、例えば、分泌生産および融合蛋白質発現などの方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］を用いることができる。

　ＧＤＦ７を含む蛋白質の生産方法としては、例えば、宿主細胞内に生産させる方法および宿主細胞外に分泌させる方法があり、使用する宿主細胞、および生産させるＧＤＦ７を含む蛋白質の構造を変えることにより、適切な方法を選択することができる。

　ＧＤＦ７を含む蛋白質が宿主細胞内に生産される場合、例えば、ポールソンらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８９；２６４：１７６１９）、ロウらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，１９８９；８６：８２２７、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖｅｌｏｐ．，１９９０；４：１２８８）、日本国特開平０５－３３６９６３号公報、および国際公開第９４／２３０２１号等に記載の方法を用いることにより、ＧＤＦ７を含む蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。

　また、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子などを用いた遺伝子増幅系（日本国特開平２－２２７０７５号）を利用してＧＤＦ７を含む蛋白質の生産量を上昇させることもできる。

　得られたＧＤＦ７を含む蛋白質は、例えば、以下のようにして単離、精製することができる。

　ＧＤＦ７を含む蛋白質が細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心分離等により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザーおよびダイノミル等を用いて細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。

　前記無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－セファロース、ＤＩＡＩＯＮ　ＨＰＡ－７５（三菱化学社製）などのレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（ファルマシア社製）などのレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロースなどのレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法および等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。

　ＧＤＦ７を含む蛋白質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、上記と同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離等を行うことにより、沈殿画分として該ＧＤＦ７を含む蛋白質の不溶体を回収する。

　回収したＧＤＦ７を含む蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析することにより、該ＧＤＦ７を含む蛋白質を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法によりポリペプチドの精製標品を得ることができる。

　ＧＤＦ７を含む蛋白質が細胞外に分泌された場合には、培養上清において該ＧＤＦ７を含む蛋白質を回収することができる。該培養物を上記と同様に遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。

　また、本発明におけるＧＤＦ７を含む蛋白質は、Ｆｍｏｃ法およびｔＢｏｃ法等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンストケムテック社製、パーキン・エルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジインストルメント社製、シンセセル－ベガ社製、パーセプチブ社製および島津製作所社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。

　本発明における、ＧＤＦ７を含む蛋白質をコードする核酸を含むベクターを治療用に使用する場合には、被験体のゲノムに組み込まれないベクターであって、細胞に感染するが複製が不能にされたウイルスベクターまたは非ウイルスベクターなどを用いることが好ましい。当該ベクターとしては、例えば、アデノ随伴ウイルスベクターおよびアデノウイルスベクターなどが挙げられる。

　ウイルスベクターとしては、例えば、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９３；６７：５９１１－５９２１、Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　１９９４；５：７１７－７２９、Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　１９９４；１：５１－５８、Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　１９９４；５：７９３－８０１およびＧｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　１９９４；１：１６５－１６９等に記載されているベクター、およびそれらの改良ベクターが挙げられる。

　非ウイルスベクターとしては、例えば、ヒト人工染色体ベクターが挙げられ、ヒト染色体由来のセントロメア及びテロメアを含む染色体断片から構成されるベクターが好ましい。ヒト染色体断片は、特に限定されないが、例えばヒト１４番染色体断片、ヒト２１番染色体断片などが挙げられる（国際公開第２００４／０３１３８５号、日本国特開２００７－２９５８６０号公報）。

　これらのベクターには、上記と同様に、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化部位、選択マーカーおよびレポーター遺伝子などを含んでいてもよい。

　ＧＤＦ７を含む蛋白質または該蛋白質をコードする核酸を含むベクターは、被験体の血中または組織に投与するか、または被験体から採取した組織または細胞にベクターを導入した後、該被験体の組織に戻す方法などにより、ベクターを被験体に投与することができる。

　本発明はＧＤＦ７を含む蛋白質または該蛋白質をコードする核酸を含むベクターを有効成分として含有する、鉄過剰疾患または鉄濃度を低下させることが有効な疾患に対する治療用医薬組成物を提供する。

　本発明における鉄過剰疾患としては、遺伝性ヘモクロマトーシスおよび輸血によって引き起こされる鉄過剰症が好ましく、貧血症に伴う輸血によって引き起こされる鉄過剰症がさらに好ましく、サラセミア、鎌状赤血球貧血、骨髄異形成症候群および再生不良性貧血に伴う輸血によって引き起こされる鉄過剰症がより好ましい。

　例えば、原発性鉄過剰症（例えば、ＨＦＥ、ヘプシジン、フェロポルチン、トランスフェリン受容体２およびヘモジュベリンなどの分子異常による遺伝性ヘモクロマトーシスなど)および続発性鉄過剰症(例えば、骨髄異形成症候群、再生不良性貧血、鎌状赤血球貧血およびサラセミアに伴う輸血性鉄過剰症など)などが挙げられる。

　本発明における鉄濃度を低下させることが有効な疾患としては、Ｃ型慢性肝炎が好ましく、インターフェロン不応性のＣ型慢性肝炎がさらに好ましい。

　また、本発明における鉄濃度を低下させることが有効な疾患としては、糖尿病性腎症、腎不全および腎障害が好ましい。

　さらに、本発明における鉄濃度を低下させることが有効な疾患としては、感染症が好ましく、大腸菌、サルモネラ菌、ウシ流産菌、炭疽菌、バークホルデリア・セパシア菌、ジフテリア菌、ビブリオ菌および真菌による感染症がさらに好ましく、抗生物質に対して抵抗性を示す感染症が特に好ましい。

　抗生物質に対して抵抗性を示す感染症としては、例えば、ムコール症が挙げられる。

　本発明の鉄濃度を低下させることが有効な疾患には、この他、鉄過剰が関与すると考えられている疾患である、例えば、遺伝性ヘモクロマトーシスによる肝臓癌、Ｂ型慢性肝炎、Ｂ型・Ｃ型慢性肝炎による肝臓癌、アルコール性肝障害、非アルコール性脂肪性肝炎、インスリン抵抗性と関連するメタボリックシンドローム、不整脈、神経性疾患（セルロプラスミン「フェロオキシダーゼ」欠損による肝臓・大脳基底核・視床・小脳歯状核への鉄沈着が生じる無セルロプラスミン血症、フェリチン軽鎖に遺伝子異常があり脳の基底核に鉄沈着が認められる舞踏病・ジストニア・パーキンソン病様症状を呈する優性遺伝性疾患のｎｅｕｒｏｆｅｒｒｉｔｉｏｎｏｐａｔｈｙ、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病およびＰａｒｋｉｎｓｏｎ病など）、アスベスト（特に鉄含量の多いクロシドライト・アモサイト）による中皮腫と肺癌、卵巣の子宮内膜症、卵巣癌および大腸癌等も包含される。

　また、鉄が原因となる酸化ストレスが関与する疾患である、例えば、眼疾患（網膜弛緩、翼状片、ドライアイ、円錐角膜、白内障、ぶどう膜炎、加齢黄斑変性、糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜色素変性症、緑内障および視神経疾患など）、呼吸器疾患（急性肺障害など）、心疾患（心肥大および心不全など）、動脈硬化症、胃食道逆流症、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉによる胃癌、炎症性腸疾患、糖尿病、血液透析合併症（骨・関節周囲にβ２－ミクログロブリンの沈着を認める透析アミロイドーシスなど）、皮膚疾患（皮膚癌など）、歯科疾患（歯周病および顎関節症など）、放射線障害および自己免疫疾患（自己免疫性リウマチ性疾患、自己免疫性溶血性貧血および全身性エリテマトーデスなど）等も、本発明の鉄濃度を低下させることが有効な疾患に包含される。

　本発明の組成物は、血清中の鉄濃度を特異的に減少させることによって、鉄過剰疾患または鉄濃度を低下させることが有効な疾患の治療を可能にする。さらに本発明の組成物は、副作用をほとんどまたはまったく引き起こさないという驚くべき利点を有している。

　本発明の組成物の形態（即ち、製剤）は、有効成分としてのＧＤＦ７を含む蛋白質または該蛋白質をコードする核酸を含むベクターのみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される1以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において公知の方法により製造した医薬製剤として提供される。

　投与経路は、特に限定されないが、例えば、経口投与、並びに口腔内、気道内、直腸内、皮下、局所、腹腔内、筋肉内および静脈内等の非経口投与が挙げられる。

　投与形態としては、例えば、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、溶液剤、懸濁剤、遅延放出製剤、腸溶性製剤、注射剤、点滴剤、座剤、経皮吸収剤、リポソーム、ナノ粒子封入製剤および噴霧剤等があげられる。

　経口投与に適当な製剤は、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、溶液剤、懸濁剤、遅延放出製剤および腸溶性製剤等である。

　乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、例えば、水、ショ糖、ソルビトールおよび果糖等の糖類、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油および大豆油などの油類、ｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、並びにストロベリーフレーバーおよびペパーミントなどのフレーバー類等を添加剤として用いて製造する。

　カプセル剤、錠剤、散剤および顆粒剤は、例えば、乳糖、ブドウ糖、ショ糖およびマンニトール等の賦形剤、デンプンおよびアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムおよびタルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロースおよびゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、並びにグリセリンなどの可塑剤等を添加剤等として用いて製造する。

　腸溶性製剤は、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸－メタクリル酸メチルコポリマー、メタクリル酸－アクリル酸エチルコポリマーおよびヒドロキシプロピルアセテートサクシネート等のポリマー用いて製造する。

　非経口投与に適当な製剤としては、例えば、注射剤、点滴剤、座剤、経皮吸収剤、リポソーム、ナノ粒子封入製剤および噴霧剤などである。

　注射剤は、例えば、塩溶液およびブドウ糖溶液並びにその両者の混合物からなる担体等を用いて製造する。

　座剤は、例えば、カカオ脂、水素化脂肪およびカルボン酸などの担体を用いて製造する。

　噴霧剤は、例えば、受容者の口腔または気道粘膜を刺激せず、かつ本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片を微細な粒子として分散させ、吸収を容易にさせる担体等を用いて製造する。

　担体としては、例えば、乳糖およびグリセリン等を用いる。また、エアロゾルおよびドライパウダー等として製造することもできる。

　さらに、上記非経口剤においても、経口投与に適当な製剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。

　また、製剤には、本発明の有効成分の他に、鉄過剰疾患または鉄濃度を低下させることが有効な疾患に対する他の治療剤を含有させてもよい。当該治療剤には、例えば、肝炎の治療剤として、グリチルリチン配合剤（強力ネオミノファーゲンシー：Ｓｔｒｏｎｇｅｒ　Ｎｅｏ　Ｍｉｎｏｐｈａｇｅｎ　Ｃ、アスファーゲン：Ａｓｐｈａｇｅｎ　注１０・２０ｍＬ、カロスゲン：Ｋａｌｏｓｇｅｎ　注２０ｍＬ、キョウミノチン：Ｋｙｏｍｉｎｏｔｉｎ 注５・２０ｍＬ、グリファーゲンＣ：Ｇｌｙｐｈａｇｅｎ　Ｃ　注５・２０ｍＬ、グリベルチン：Ｇｌｙｖｅｌｔｉｎ 注２０ｍＬ、グルコリンＳ：Ｇｕｌｕｃｏｌｉｎ　Ｓ　注２０ｍＬ、ケベラ　Ｓ：Ｋｅｂｅｒａ　Ｓ　注５・２０ｍＬ、デルマニンＣ２０：ＤｅｒｍａｎｉｎＣ２０　注２０ｍＬ、ニチファーゲン：Ｎｉｃｈｉｐｈａｇｅｎ　注５・２０ｍＬ、ネオファーゲンC：Ｎｅｏｐｈａｇｅｎ　Ｃ　注５・２０ｍＬ、ネオファーチル：Ｎｅｏｆａｔｉｌ　注２０ｍＬ、ノイファーゲン：Ｎｅｕｐｈａｇｅｎ　注５・２０ｍＬ、ヒシファーゲンＣ：Ｈｉｓｈｉｐｈａｇｅｎ　Ｃ　注２０ｍＬ、ホクファーゲン：Ｈｏｋｕｐｈａｇｅｎ　注２０ｍＬ、レミゲンＭ：ＬｅｍｉｇｅｎＭ　注２０ｍＬ）、肝臓加水分解物（クールレバ、ゴスペール・レバー、レナルチン、レバイデン、レバラミンおよびレバン）、プロトポルフィリン二ナトリウム（ドージンＰＭ、パンパール、Ｐ．Ｎ，プロットＳ、ピンプロン、プロトポルト、プロトリウム、プロマール、プロルモン、ポルトス、ポルフラジン、ヨウレバー、レバスダンおよびレバホン－Ｐ）等が挙げられる。

　また、糖尿病性腎症、腎不全および腎障害の治療剤として、例えば、降圧薬（アンジオテンシン変換酵素阻害薬およびアンジオテンシン受容体拮抗薬）および利尿薬等が挙げられる。

　感染症の治療剤として、例えば、抗菌薬［ペニシリン系（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎなど）、マクロライド系（ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎなど）、ニューキノロン系（ｔａｒｉｖｉｄなど）、テトラサイクリン系（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅなど）]、抗真菌薬［イミダゾール系（ｋｅｔｏｃｏｎａｚｏｌｅなど）、ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ　Ｂ］等が挙げられる。

　心疾患（心肥大、心不全など）の治療剤として、例えば、強心配糖体（ｄｉｇｉｔｏｘｉｎ、ｄｉｇｏｘｉｎ、Ｇ－ｓｔｒｏｐｈａｎｔｈｉｎ）、アドレナリンβ受容体作用薬（ｄｏｂｕｔａｍｉｎｅ、ｉｂｏｐａｍｉｎｅ、ｂｕｔｏｐａｍｉｎｅ）、ＡＣＥ阻害薬（ｃａｐｔｏｐｒｉｌ、Ｅｎａｌａｐｒｉｌ）、Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ　II受容体拮抗薬（ｌｏｓａｒｔａｎ、ｖａｌｓａｒｔａｎ、ｏｌｍｅｓａｒｔａｎ）、Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ　ＩＩＩ阻害薬（ａｍｒｉｎｏｎｅ、ｍｉｌｒｉｎｏｎｅ、ｏｌｐｒｉｎｏｎｅ）、血管拡張薬（ｎｉｔｒｏｐｒｕｓｓｉｄｅ、ｎｉｔｒｏｇｌｙｃｅｒｉｎ）、利尿薬（ｆｕｒｏｓｅｍｉｄｅ）およびアドレナリンβ受容体遮断薬（ｃａｒｖｅｄｉｌｏｌ、ｍｅｔｏｐｒｏｌｏｌおよびｂｉｓｏｐｒｏｌｏｌ）等が挙げられる。

　動脈硬化症の治療剤として、例えば、スタチン系高脂血症治療薬、フィブラート系高脂血症治療薬、アンジオテンシン受容体拮抗薬やアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬阻害、アルドステロン拮抗薬、アスピリン、塩酸ビオグリタゾンおよびメトホルミン等が挙げられる。

　Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ感染の治療剤として、例えば、プロトンポンプ阻害薬（ＰＰＩ）、アモキシシリン（ＡＭＰＣ）およびクラリスロマイシン（ＣＡＭ）等であり、

　炎症性腸疾患の治療剤として、例えば、プレドニンやＴＮＦ－α抗体等が挙げられる。また、糖尿病の治療剤として、例えば、ＧＬＰ－１等が挙げられる。

　自己免疫疾患（自己免疫性リウマチ性疾患、自己免疫性溶血性貧血、全身性エリテマトーデスなど）の治療剤として、例えば、抗ＴＮＦ－α抗体および抗ＩＬ－６抗体等が挙げられる。

　本発明のＧＤＦ７を含む蛋白質を有効成分とする場合、組成物は、製薬上許容される賦形剤、希釈剤等の担体、及び添加剤を含むことができる。

　担体としては、例えば、生理食塩水、グリセロール、エタノール、アーモンド油、植物油、スクロース、デンプンおよびラクトース等が挙げられる。

　添加剤としては、例えば、結合剤（例えば、α化トウモロコシデンプン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびポリビニルピロリドン等）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクおよびシリカ等）、分散剤（例えば、ポリビニルピロリドンおよびトウモロコシデンプン等）、懸濁剤（例えば、タルクおよびアラビアゴム等）、乳化剤（例えば、レシチンおよびアラビアゴム等）、崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプン、グリコール酸ナトリウムデンプンおよびクロスポピドン等）、緩衝剤（例えば、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩およびトリス塩等）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸およびトコフェロール等）、保存剤（例えば、ソルビン酸、p-ヒドロキシ安息香酸メチルおよびp-ヒドロキシ安息香酸プロピル等）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム等）並びに安定化剤（例えば、グリセロール等）等を含むことができる。

　医薬製剤の投与量は、患者の年齢、性別、体重、症状及び投与経路等に応じて適宜決定されるべきであり、以下に限定されないが、例えば、成人一日あたり約０．１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの範囲内が好ましく、約１μｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの範囲内がより好ましい。

　医薬製剤の投与は、治療中毎日投与してもよいし、数日間隔、２週間間隔または１ヶ月間隔等、時間間隔をとって投与してもよい。

　本発明のＧＤＦ７を含む蛋白質をコードする核酸を含むベクターを有効成分とする場合、該ベクターの投与は、遺伝子治療で行われる技術または手法と同様に実施できる。該ベクターは、被験体に直接投与（ｉｎ　ｖｉｖｏ法）してもよい。または、被験体から採取した細胞に導入し、目的のＧＤＦ７を含む蛋白質を発現する形質転換細胞を選択してからその細胞を被験体に投与してもよい（ｅｘ　ｖｉｖｏ法）。

　目的の組織または細胞に前記ベクターを投与するための遺伝子送達法としては、例えば、コロイド分散系、リポソーム誘導系および人工ウイルスエンベロープ等が挙げられる。

　遺伝子送達法において、送達系は、例えば、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、水中油型乳剤、ミセル、混合ミセルおよびリポソーム等を用いることができる。

　前記ベクターの直接投与には、例えば、静脈内注射（点滴を含む）、筋肉内注射、腹腔内注射および皮下注射等を用いることができる。また、該ベクターの細胞導入（形質転換）には、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法およびリポフェクション法等の公知の遺伝子導入法を用いて行うことができる。

　前記ベクターまたは前記形質転換体の使用量は、投与経路、投与回数および被験体の種類によって異なるが、当技術分野で慣例的な手法を用いて適宜決定することができる。

　本発明は、ＧＤＦ７の生体内機能を解析するためのＢ細胞特異的発現ノックインキメラマウス及びその作製法を通して見出されたものである。

　本発明における、マウスまたはヒトＧＤＦ７ノックイン（ＫＩ）キメラマウスの作製は、例えば確立されている方法（国際公開第２００６／７８０７２号）に従って作製することができる。例えば、マウスＢ細胞におけるより効率的な分泌発現を可能にするため、ＧＤＦ７の分泌シグナル配列をマウスＩｇκ遺伝子の分泌シグナル配列と置換する。

　ここでマウスＧＤＦ７をノックインする場合には、マウスＧＤＦ７蛋白質（配列番号８または配列番号１４）のＮ末端から１９番目のプロリンまでの領域を置換することが好ましく、ヒトＧＤＦ７をノックインする場合には、ヒトＧＤＦ７蛋白質（配列番号２）のＮ末端から１９番目のプロリンまでの領域を、置換することが好ましい。

　また、ノックインＥＳ細胞由来の細胞において挿入した核酸が発現するかどうかは、例えば、当該細胞由来のＲＮＡを用いたＲＴ－ＰＣＲ法およびノーザンブロット法など、更にはＧＤＦ７に対する抗体を用いた酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）およびウエスタンブロット法等を利用して検出することができる。

　マウスまたはヒトＧＤＦ７ノックインキメラマウス、及び外来ｃＤＮＡ発現ユニットが挿入されていないコントロールキメラマウスについて、各組織の病理解析、免疫組織化学解析、血清生化学検査、血球成分測定等を実施して、ＧＤＦ７の発現に起因する変化を特定できる。

　後述の実施例２－１において、コントロールキメラマウスに比較しマウスＧＤＦ７ノックインキメラマウス特異的な表現型として、血清鉄濃度の有意な低下が観察された。さらに、実施例２－１、実施例２－２及び実施例２－３において、腎機能、肝機能障害並びに好中球および血小板減少などの副作用の指標となる、血清サンプルに含まれるクレアチン濃度およびＧＰＴ濃度、Ｈ＆Ｅ染色した腎臓および肝臓の病理組織標本解析並びに末梢血サンプル中の好中球数および血小板数には、コントロールキメラマウスとの有意な変化は認められなかった。

　以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって限定されるものでない。

　なお、本願は、日本国においては、平成２０年（２００８年）度、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構「化合物等を活用した生物システム制御基盤技術開発」に係る委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願である。

［実施例１］
ＵＳｍＧＤＦ７　ＫＩキメラマウスの作製及びコントロールキメラマウスの作製
　国際公開第２００６／７８０７２号記載の実施例に従い、マウスＧＤＦ７－ｃＤＮＡ（開始コドンから終止コドンを含む１３８６ｂｐ、配列番号７）よりｐＵＳｍＧＤＦ７　ＫＩベクターを作製した。

　以下に、配列番号７及び８における、マウスＧＤＦ７シグナル配列、ｐｒｏ－ｒｅｇｉｏｎおよびｍａｔｕｒｅ体部分をそれぞれＮＣＢＩアクセッション番号Ｐ４３０２９の情報を元に、下線、囲み線およびイタリック体で示す。

　配列番号７：

　以下に、配列番号７がコードするアミノ酸配列（４６１アミノ酸、配列番号８）を示す。

　配列番号８：

　ｐＵＳｍＧＤＦ７　ＫＩベクターｍＧＤＦ７発現ユニットの開始コドンから終止コドンまでのポリヌクレオチド配列[マウスＧＤＦ７シグナル配列を、イントロン領域を含んだマウスＩｇκシグナル配列（囲み線の部分）に置換し、その下流にマウスＧＤＦ７　ｐｒｏ体配列を含む１６３０ｂｐ、配列番号１７]、及び該ｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列（４６２アミノ酸、囲み線の部分はマウスＩｇκシグナル配列を示す、配列番号１８）を以下に示す。

　イントロン領域を含んだマウスＩｇκシグナル配列情報はＧｅｎＢａｎｋより取得したＭＵＳＩＧＫＶＲ１（アクセッション番号Ｋ０２１５９）をもとに、その上流のゲノム配列をＵＣＳＣマウスゲノムデータベースより取得した。

　配列番号１７：

　配列番号１８：

　ｐＵＳｍＧＤＦ７　ＫＩベクターを用い、国際公開第２００６／７８０７２号の実施例に従いＢ細胞特異的にマウスＧＤＦ７を発現するＵＳｍＧＤＦ７　ＫＩキメラマウスを作製した。更に下記実施例２で用いられたマウスコントロール個体（コントロールキメラマウス）を、国際公開第２００６／７８０７２号の実施例１１に記載の方法に従い作製した。

［実施例２］
ＵＳｍＧＤＦ７　ＫＩキメラマウスの表現型解析

（実施例２－１．血清生化学解析）
　上記実施例１で作製された１６週齢ＵＳｍＧＤＦ７　ＫＩキメラマウス雌雄６匹ずつ、１６週齢コントロールキメラマウス雌（♀）個体６匹、雄（♂）個体７匹を剖検し、腹大静脈より血液を採取した。

　７１８０　Ａｕｔｏｍａｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅr（Ｈｉｔａｃｈｉ　Ｈｉｇｈ－Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ)を用い、血清サンプルに含まれる血清鉄濃度、ＴＩＢＣ、クレアチニン濃度、ＧＰＴ濃度を測定した。

　その結果、ＧＤＦ７発現個体由来血清鉄濃度の平均値は、雌（♀）個体で１３１μｇ／ｄＬ、雄（♂）個体で１６１μｇ／ｄＬであった。また、コントロール個体由来血清鉄濃度の平均値は、雌（♀）個体で２３６μｇ／ｄＬ、雄（♂）個体で２１０μｇ／ｄＬであった。このように、雌雄個体共にＧＤＦ７発現による血清鉄濃度の有意な低下が観察された。

　更に、ＧＤＦ７発現個体由来血清ＴＩＢＣの平均値は、雌（♀）個体で４５０μｇ／ｄＬ、雄（♂）個体で４２０μｇ／ｄＬであった。また、コントロール個体由来血清ＴＩＢＣの平均値は、雌（♀）個体で４６０μg／ｄＬ、雄（♂）個体で４２９μｇ／ｄＬであった。

　上記値からそれぞれ鉄飽和度を産出すると、ＧＤＦ７発現雌（♀）個体で２９％、ＧＤＦ７発現雄（♂）個体で３８％であった。また、コントロール雌（♀）個体で５１％、コントロー雄（♂）個体で４９％であった。このように、雌雄個体共にＧＤＦ７発現による鉄飽和度の有意な低下が観察された。

　クレアチニン濃度濃度およびＧＰＴも同様に測定を実施したが、コントロールと比較して有意な変化は認められなかった。

　以上の結果から、ＧＤＦ７を発現させることによって、腎機能や肝機能に副作用を及ぼすことなく血清鉄濃度及び鉄飽和度を低下させることが可能と考えられる。

（実施例２－２．病理解析）
　１６週齢ＵＳｍＧＤＦ７　ＫＩキメラマウス及び１６週齢コントロールキメラマウス剖検個体から得られた腎臓及び肝臓組織を用い、Ｈ＆Ｅ染色した腎臓及び肝臓の病理組織標本を作製した。

　ＧＤＦ７発現個体とコントロール個体由来の腎臓及び肝臓病理組織標本を比較したところ、明らかな変化は認められなかった。

（実施例２－３．末梢血血球解析）
　ＡＤＶＩＡ　１２０　ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ　ｓｙｓｔｅｍ　（Ｂａｙｅｒ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｌｔｄ．）を用い、８週齢、１５週齢ＵＳｍＧＤＦ７　ＫＩキメラマウス、及び８週齢、１５週齢コントロールキメラマウス個体由来の末梢血液サンプル中の好中球数及び血小板数を測定した。

　その結果、ＧＤＦ７発現個体とコントロール個体由来との血球数に有意な変化は認められなかった。

　以上の表現型解析結果から、生体内でＧＤＦ7を発現させることによって、経口鉄キレート剤エクジェイドで報告されている腎機能および肝機能障害、並びに好中球および血小板数減少などの副作用を引き起こすことなく、血清鉄濃度及び鉄飽和度の低下を誘導できる事が示された。

［実施例３］
ｍＧＤＦ７組換え体投与マウスの解析
　ｍＧＤＦ７組換え体による血清鉄量に対する効果を評価する目的で、マウスへの投与試験を行った。マウスはＣ５７ＢＬ／６－ｊ雌（日本クレア社から購入）を７週齢にて導入、馴化し、８週齢時点にて試験を実施した。

　ｍＧＤＦ７組換え体は市販製品（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社製、カタログＮｏ．７７９－Ｇ７）を用い、最終濃度１００μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳにて調製し、予め測定した各マウスの体重に従いそれぞれ１ｍｇ／ｋｇの濃度となるよう腹腔内投与を行った。

　投与は６個体に実施、同時にコントロールとして同容量のＰＢＳ投与群（６個体）を設定した。投与後６時間の時点にて剖検を実施し、腹大静脈より全採血を行い、遠心分離後、鉄量測定用血清サンプルとした。

　血清鉄量測定には、Ｌタイプワコー　Ｆｅ・Ｎ（和光純薬工業社製、カタログＮｏ．４６７－２１０９１、４６７－２１１９１）を使用し、添付文書に従い測定を行った。結果を図１に示す。

　図１に示すように、血清鉄濃度平均値はｃｏｎｔｒｏｌ群（ｓｈａｍ）：１１４．９μｇ／ｄＬ、ｍＧＤＦ７投与群：８６．３μｇ／ｄＬとなった。この結果から、ｍＧＤＦ７は有意に血清鉄量を抑制することが明らかとなった。

［実施例４］
ＵＳｍＧＤＦ７　ＫＩキメラマウスによる腎負荷試験
　ｍＧＤＦ７の腎臓への効果を検証する目的で、ＵＳｍＧＤＦ７　ＫＩキメラマウスに対し腎障害（アデニン食負荷による尿細管障害）を惹起させ血中生化学パラメータ［尿素窒素濃度（ＢＵＮ）、クレアチニン濃度（ＣＲＥＡ）］を測定する事によってその障害の程度を評価した。

　マウスは実施例１で得られたＵＳｍＧＤＦ７　ＫＩキメラマウス及びコントロールキメラマウスを使用した。餌としてＣＥ－２べース０．２５質量％アデニン含有食（以下、アデニン食と記す、日本クレア社製）を用意した。

　１９週齢時点から試験を開始し、雌雄各５匹ずつに対しアデニン食を摂取させ、１３日後に剖検を実施した。剖検では、腹大静脈より全採血を行い、遠心分離後、血清サンプルとした。

　ＢＵＮ測定には尿素窒素Ｂ－テストワコー（和光純薬工業社製、カタログＮｏ．２７９－３６２０１）を使用し、添付文書に従い測定を行った。その結果を図２に示す。

　ＣＲＥＡ測定にはＣＲＥ－ＥＮカイノス（カイノス社製、カタログＮｏ．ＤＲ－５２００）を使用し、添付文書に従い測定を行った。その結果を図３に示す。

　図２に示すように、アデニン食を最初に摂取させた日をｄａｙ０としたｄａｙ１３における尿素窒素濃度（ＢＵＮ）の平均値は、雌（♀）のコントロールキメラマウス：３６．３ｍｇ／ｄＬ、ＵＳｍＧＤＦ７　ＫＩキメラマウス：２８．０ｍｇ／ｄＬであった。また、雄（♂）のコントロールキメラマウス：１０９．２ｍｇ／ｄＬ、ＵＳｍＧＤＦ７　ＫＩキメラマウス：７３．９　ｍｇ／ｄＬであった。

　また、図３に示すように、アデニン食を最初に摂取させた日をｄａｙ０としたｄａｙ１３におけるクレアチニン濃度（ＣＲＥＡ）の平均値は、雌（♀）のコントロールキメラマウス：０．４５ｍｇ／ｄＬ、ＵＳｍＧＤＦ７　ＫＩキメラマウス：０．３４ｍｇ／ｄＬであった。また、雄（♂）のコントロールキメラマウス：１．０４ｍｇ／ｄＬ、ＵＳｍＧＤＦ７　ＫＩキメラマウス：０．７０ｍｇ／ｄＬであった。

　したがって、雌雄いずれにおいてもＢＵＮ・ＣＲＥＡ値の上昇が抑制される傾向が見られ、ｍＧＤＦ７の腎障害に対する保護的効果が示唆された。

　本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、その全文を参考として本明細書中にとり入れるものとする。

　本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２００９年７月２日付けで出願された米国仮出願（６１／２２２６６５号）に基づいており、その全体が引用により援用される。

　本発明により、血清鉄濃度または鉄飽和度を低下させることができる。従って、遺伝性ヘモクロマトーシスや輸血によって引き起こされる鉄過剰疾患、Ｃ型慢性肝炎、糖尿病性腎症、腎不全、腎障害および抗生物質等に対して抵抗性を示す治療抵抗性感染症等の血清並びに器官および組織中の少なくともいずれかにおける鉄濃度を低下させることが有効な疾患を、副作用を引き起こすことなく治療することが可能となる。

配列番号１７－人工配列の説明：マウスIgκシグナル－マウスＧＤＦ７　ｐｒｏ体ポリヌクレオチド配列
配列番号１８－人工配列の説明：マウスIgκシグナル－マウスＧＤＦ７　ｐｒｏ体ペプチド配列

Claims (24)

1. 　ＧＤＦ７を含む蛋白質または該蛋白質をコードする核酸を含むベクターを有効成分として含有する、鉄過剰疾患または鉄濃度を低下させることが有効な疾患に対する治療用医薬組成物。
2. 　ＧＤＦ７を含む蛋白質が化学修飾されている、請求項１に記載の組成物。
3. 　化学修飾が、ポリエチレングリコールの結合である、請求項２に記載の組成物。
4. 　化学修飾が、糖鎖の結合である、請求項２に記載の組成物。
5. 　ＧＤＦ７を含む蛋白質が、組換え蛋白質である、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。
6. 　ＧＤＦ７を含む蛋白質が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４および配列番号１６のいずれか１で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
7. 　ＧＤＦ７を含む蛋白質が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４および配列番号１６のいずれか１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ血清鉄濃度の低下活性を有する蛋白質である、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
8. 　ＧＤＦ７を含む蛋白質が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４および配列番号１６のいずれか１で示されるアミノ酸配列のうち、1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ血清鉄濃度の低下活性を有する蛋白質である、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
9. 　ＧＤＦ７を含む蛋白質をコードする核酸が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３および配列番号１５のいずれか１で示される塩基配列を含む、請求項１に記載の組成物。
10. 　ＧＤＦ７を含む蛋白質をコードする核酸が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３および配列番号１５のいずれか１で示される塩基配列と６０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ血清鉄濃度の低下活性を有する蛋白質をコードする核酸である、請求項１に記載の組成物。
11. 　ＧＤＦ７を含む蛋白質をコードする核酸が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３および配列番号１５のいずれか１で示される塩基配列のうち、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなり、かつ血清鉄濃度の低下活性を有する蛋白質をコードする核酸である、請求項１に記載の組成物。
12. 　ＧＤＦ７を含む蛋白質をコードする核酸が、請求項９～１１のいずれか１項に記載の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ血清鉄濃度の低下活性を有する蛋白質をコードする核酸である、請求項１に記載の組成物。
13. 　ＧＤＦ７が哺乳動物由来である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組成物。
14. 　哺乳動物がヒトである、請求項１３に記載の組成物。
15. 　鉄過剰疾患が、遺伝性ヘモクロマトーシスまたは輸血によって引き起こされる鉄過剰症である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の組成物。
16. 　鉄過剰疾患が、貧血症に伴う輸血によって引き起こされる鉄過剰症である、請求項１５に記載の組成物。
17. 　貧血症が、サラセミア、鎌状赤血球貧血、骨髄異形成症候群および再生不良性貧血のいずれか１である、請求項１６に記載の組成物。
18. 　鉄濃度を低下させることが有効な疾患が、Ｃ型慢性肝炎である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の組成物。
19. 　Ｃ型慢性肝炎がインターフェロン不応性である、請求項１８に記載の組成物。
20. 　鉄濃度を低下させることが有効な疾患が、糖尿病性腎症、腎不全および腎障害のいずれか１である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の組成物。
21. 　鉄濃度を低下させることが有効な疾患が、感染症である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の組成物。
22. 　感染症が、大腸菌、サルモネラ菌、ウシ流産菌、炭疽菌、バークホルデリア・セパシア菌、ジフテリア菌、ビブリオ菌および真菌から選ばれるいずれか１による感染症である、請求項２１に記載の組成物。
23. 　感染症が、抗生物質に対して抵抗性を示す感染症である、請求項２１または２２に記載の組成物。
24. 　抗生物質に対して抵抗性を示す感染症が、ムコール症である、請求項２３に記載の組成物。

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