WO2011001882A1 - 緑膿菌に対して効果的に感染防御能を誘導するフラジェリン変異体 - Google Patents

緑膿菌に対して効果的に感染防御能を誘導するフラジェリン変異体 Download PDF

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WO2011001882A1
WO2011001882A1 PCT/JP2010/060707 JP2010060707W WO2011001882A1 WO 2011001882 A1 WO2011001882 A1 WO 2011001882A1 JP 2010060707 W JP2010060707 W JP 2010060707W WO 2011001882 A1 WO2011001882 A1 WO 2011001882A1
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flagellin
protein
acid sequence
mutant
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PCT/JP2010/060707
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文彦 武下
佐藤　衛
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公立大学法人横浜市立大学
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    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
    • C07K16/1214—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Pseudomonadaceae (F)
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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Definitions

  • the present invention relates to a flagellin mutant that effectively induces infection protection against Pseudomonas aeruginosa.
  • Non-patent Document 1 Pseudomonas aeruginosa is a clinically significant problem as a causative bacterium of opportunistic infections.
  • Various vaccines have been studied, but those that have reached clinical application have not yet been developed (Non-patent Document 1).
  • Non-patent Document 2 Patent Document 1
  • the flagellin mutant DNA vaccine uses the full-length ORF of flagellin, and when expressed in mammalian cells, the expression efficiency of the antigen protein is low. There have been no efforts to increase the immunogenicity of flagellin mutant DNA vaccines by increasing the amount of antigens in vivo by increasing the expression efficiency of antigenic proteins.
  • the present invention aims to enhance the immunogenicity of flagellin mutant DNA vaccines.
  • the present invention has been completed based on these findings.
  • the gist of the present invention is as follows. (1) A flagellin mutant in which a mutation has been introduced into at least one site in the Toll-like receptor 5 activation region of wild-type flagellin and the Toll-like receptor 5 activation ability has been reduced. A flagellin mutant with a mutation that enhances it.
  • the flagellin mutant according to (1) wherein the wild-type flagellin is derived from a flagellar pathogen.
  • the flagellin mutant according to (2), wherein the flagellar pathogen is Pseudomonas aeruginosa.
  • the flagellin mutant according to any one of (1) to (3), wherein the wild type flagellin is flagellin FlaA or FliC.
  • the flagellin mutant according to any one of (1) to (4), wherein the mutation that enhances stability as an antigen is a deletion of at least one amino acid.
  • the flagellin mutant according to (5), wherein the amino acid to be deleted is located on the N-terminal side and / or the C-terminal side.
  • the wild type flagellin is wild type flagellin FliC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and the Toll-like receptor 5 activation region is an amino acid sequence from the 71st amino acid to the 97th amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the flagellin variant according to (7) which has an amino acid sequence in which the 90th arginine in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with another amino acid.
  • the flagellin mutant according to (8), wherein the other amino acid is alanine or glycine.
  • the mutation that enhances the stability as an antigen is a deletion of at least one amino acid from the first amino acid to the 58th amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (7) to (9 ) Flagellin mutant according to any one of (11)
  • the mutation that enhances the stability as an antigen is a deletion of at least one amino acid from the 444th amino acid to the 487th amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (7) to (10 )
  • Flagellin mutant according to any one of (12) The flagellin mutant according to (1), which is the following protein (a), (b) or (c): (a) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, the 90th arginine is substituted with alanine, and the 58 amino acids from the first amino acid to the 58th amino acid and the 44 amino acids from the 444th amino acid to the 487th amino acid.
  • Flagellin mutant protein having an amino acid sequence lacking the amino acid of (b)
  • the amino acid sequence of the protein of (a) has an amino acid sequence in which one or several amino acids other than the 90th alanine are deleted, substituted or added, and has the ability to activate Toll-like receptor 5
  • It is encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA complementary to the DNA encoding the protein of (a), and the Toll-like receptor 5 activation ability has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • Flagellin mutant protein having an amino acid sequence lacking the amino acid of (b1) In the amino acid sequence of the protein of (a), it has an amino acid sequence in which one or several amino acids other than the 90th alanine are deleted, substituted or added, and has an antigen-specific antibody titer and / or infection Flagellin mutant protein that can induce stronger protection (c1) Flagellin mutation encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA complementary to the DNA encoding the protein of (a), and that can further induce antigen-specific antibody titer and / or infection protection
  • the flagellin mutant according to (15), wherein the DNA encoding the protein of body protein (16) (a) has the base sequence of SEQ ID NO: 7.
  • the vaccine according to (22), wherein the flagellar pathogen is Pseudomonas aeruginosa.
  • a pharmaceutical composition comprising the antibody according to (25).
  • the DNA vaccine of the present invention can strongly confer infection protection against Pseudomonas aeruginosa and can be applied as an improved vaccine.
  • FliC® R90A protein Purification and stability of FliC® R90A protein in E. coli expression system.
  • the GST-FliC R90A protein prepared in E. coli was purified with a GST column, stored at 4 ° C or -30 ° C, and the sample was analyzed by SDS-PAGE and CBB staining. Degradation of the FliCR90A protein was observed during purification, and progress was observed in all storage methods. This suggests that the FliC R90A protein produced in E. coli is very unstable. Left) Analysis of FliCFR90A protein degradation products by TOF-MS analysis.
  • FliC R90A protein in mammalian cells FliC R90A full length (1-487 aa) or deletion mutant (59-443aa) expression type plasmid (CMV-FliC R90A FL or CMV-FliC R90A del (59-443)) was prepared.
  • mice were immunized with FliC R90A expression plasmid twice by intramuscular injection electroporation (0 and 4 weeks later), and anti-FliC R90A-specific IgG2a antibody titer in serum was determined by ELISA 2 weeks after the final immunization. Quantified. It was revealed that a significantly higher antibody titer was induced in the group immunized with CMV-FliCR90A del (59-443) than in the group immunized with CMV-FliCR90A FL. This suggests that the deletion mutant (FliC R90A del (59-443)) antigen is more immunogenic than the full-length antigen. *, P ⁇ 0.05.
  • the present invention relates to a flagellin mutant in which a mutation is introduced into at least one site in the Toll-like receptor 5 activation region of wild-type flagellin, and the ability to activate Toll-like receptor 5 is reduced.
  • the present invention provides a flagellin mutant into which a mutation that enhances the above is introduced.
  • the flagellin mutant of the present invention is inactive against the Toll-like receptor 5, but preferably retains the antigenic properties of flagellin.
  • the “concept” of the mutation of flagellin includes not only a mutation in which one or several amino acids in the amino acid sequence of flagellin protein are deleted, substituted or added, but also a deletion of 10 or more amino acids.
  • Mutation for example, deletion of 58 amino acids from amino acid 1 to amino acid 58, deletion of 44 amino acids from amino acid 444 to amino acid 487 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; 58 amino acids from the first amino acid to the 58th amino acid and a deletion of 44 amino acids from the 444th amino acid to the 487th amino acid).
  • Flagella is an essential organ for bacterial movement, and many bacteria have it. Regarding pathogenic bacteria, flagella such as Pseudomonas aeruginosa, Salmonella (typhoid), Vibrio cholerae and Listeria are well studied. Bacterial flagella are formed by polymerizing a protein called flagellin. The type A flagellum expressed in Pseudomonas aeruginosa is composed of flagellin FlaA, and the type B flagella is composed of flagellin FliC. FlaA and FliC have about 60% homology, and some antigenicity overlaps. The specific immune response induced when one flagellin is immunized also reacts with the other flagellin. . Only the flagellins FlaA and FliC are known in Pseudomonas aeruginosa, but other bacteria express unique flagellins.
  • Toll-like receptor 5 is one member of the Toll-like receptor family possessed by mammals, and is a type I membrane protein expressed mainly on the cell membrane. In the extracellular region, leucine-rich repeats are important for interaction with flagellin, and the Toll / IL-1R domain existing in the intracellular region is thought to play an important role in signal transduction. Since Toll-like receptor 5-deficient mice had a weak response to flagellin, Toll-like receptor 5 was found to be a flagellin receptor.
  • Flagellin has been found to have a D1-3 region due to its three-dimensional structure.
  • the D1 region is composed of an ⁇ -helix structure existing in the vicinity of the NH 2 terminal and the COOH terminal, and is considered to be important for the activation of Toll-like receptor 5.
  • the 71-97 amino acid region was considered to be an important region for the structure of the Toll-like receptor activation region in Pseudomonas aeruginosa FliC.
  • NF-kB is activated through intracellular adapter molecules MyD88, IRAK1, and TRAF6.
  • human kidney-derived fibroblast cell line HEK293 is transfected with a Toll-like receptor 5 expression plasmid and an NF-kB-dependent luciferase expression plasmid and stimulated with flagellin, intracellular luciferase activity is enhanced depending on the flagellin concentration.
  • Wild-type flagellin may be derived from flagellar pathogens, preferably from Pseudomonas aeruginosa, more preferably flagellin FlaA and FliC derived from Pseudomonas aeruginosa, and even more preferably flagellin FliC derived from Pseudomonas aeruginosa.
  • the nucleotide sequence and amino acid sequence of wild-type flagellin FliC derived from Pseudomonas aeruginosa are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively.
  • the Toll-like receptor 5 activation region of flagellin cannot be uniquely determined.
  • the 71st amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 The amino acid region from to the 97th amino acid is considered to be the Toll-like receptor 5 activation region of wild type flagellin FliC.
  • a flagellin mutant in which a mutation was introduced into at least one site in the Toll-like receptor 5 activation region of wild-type flagellin and the Toll-like receptor 5 activation ability was reduced is the 90th arginine in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. May have an amino acid sequence substituted with another amino acid. Other amino acids may be those that do not destroy the three-dimensional structure of flagellin, and examples include alanine or glycine.
  • flagellin mutant in which a mutation has been introduced into at least one site in the Toll-like receptor 5 activation region of wild-type flagellin and the ability to activate Toll-like receptor 5 has been reduced, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
  • a flagellin mutant protein having an amino acid sequence in which the 90th arginine is substituted with alanine can be mentioned.
  • the flagellin mutant of the present invention is a flagellin mutant in which a mutation is introduced into at least one site in the Toll-like receptor 5 activation region of wild-type flagellin and the ability to activate Toll-like receptor 5 is reduced. Mutations that enhance the stability of these are introduced. Mutations that increase the stability as an antigen include mutations and proteolysis that increase the amount of protein expression compared to flagellin (including wild-type and known mutant types) in which the mutation is not introduced. Factors (eg, protease, temperature, time course, oxidizing environment, strong acid or strong basic environment), DNA or RNA degradation factors (eg, DNase, RNase, temperature, time course, oxidizing environment, strong acid or strong basic environment) Etc.) and so on.
  • Factors eg, protease, temperature, time course, oxidizing environment, strong acid or strong basic environment
  • DNA or RNA degradation factors eg, DNase, RNase, temperature, time course, oxidizing environment, strong acid or strong basic environment
  • mutations that enhance the stability as an antigen include deletion of at least one amino acid.
  • the amino acid to be deleted may be located on the N-terminal side and / or the C-terminal side.
  • deletion of at least one amino acid from the first amino acid to the 58th amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and the 444th amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
  • the number of amino acids to be lost is preferably 1 to 58, more preferably 30 to 58, and is deleted in the region from the 444th amino acid to the 487th amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the number of amino acids is preferably 1 to 44, more preferably 23 to 44.
  • flagellin mutant of the present invention examples include the following proteins (a), (b), and (c).
  • Flagellin mutant protein having an amino acid sequence lacking the amino acid of (b)
  • the amino acid sequence of the protein of (a) has an amino acid sequence in which one or several amino acids other than the 90th alanine are deleted, substituted or added, and has the ability to activate Toll-like receptor 5
  • It is encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA complementary to the DNA encoding the protein of (a), and the Toll-like receptor 5 activation ability has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the flagellin mutant protein (b), which is attenuated more than the wild type flagellin FliC and further has increased stability as an antigen, is one or several proteins other than the 90th alanine in the amino acid sequence of the protein (a). (Preferably, it has an amino acid sequence in which 1 or more and 10 or less amino acids are deleted, substituted or added, and Toll-like receptor 5 activation ability is SEQ ID NO: It is a flagellin mutant protein that is more attenuated than wild-type flagellin FliC having an amino acid sequence of 2, and further has improved stability as an antigen.
  • the DNA that hybridizes with the DNA complementary to the DNA encoding the protein of (a) under stringent conditions is the entire DNA complementary to the DNA encoding the protein of (a). Or at least 80% (preferably at least 95%, more preferably at least 98%) identity with a portion.
  • Hybridization is performed under stringent conditions.
  • the stability of the nucleic acid duplex or hybrid is expressed by the melting temperature Tm (the temperature at which the probe dissociates from the target DNA). This melting temperature is used to define stringent conditions. Assuming that the Tm drops by 1 ° C. due to a 1% mismatch, the temperature of the final wash of the hybridization reaction must be lowered.
  • the final washing temperature must be lowered by 5 ° C.
  • the Tm will vary between 0.5 and 1.5 ° C.
  • An example of stringent conditions is to hybridize in 5x °C SSC / 5x Denhardt solution / 1.0% SDS at 68 ° C and wash in 0.2x SSC / 0.1% SDS at room temperature.
  • An example of moderately stringent conditions is a wash in 3x SSC at 42 ° C.
  • the salt concentration or temperature can be varied to achieve an optimal level of identity between the probe and the target nucleic acid.
  • the amino acid sequence of the protein (a) is shown in SEQ ID NO: 8.
  • Examples of the DNA encoding the protein (a) include a DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 7.
  • the flagellin mutant of the present invention is preferably one that can induce antigen-specific antibody titer and / or infection protection more strongly than known flagellin mutants such as FliC R90A or wild type flagellin.
  • the antigen-specific antibody titer and infection protection of the flagellin mutant can be measured by the methods described in the Examples below.
  • the present invention also provides a flagellin variant that is a protein of the following (a), (b1) or (c1).
  • Flagellin mutant protein having an amino acid sequence lacking the amino acid of (b1) In the amino acid sequence of the protein of (a), it has an amino acid sequence in which one or several amino acids other than the 90th alanine are deleted, substituted or added, and has an antigen-specific antibody titer and / or infection Flagellin mutant protein that can induce stronger protection (c1) Flagellin mutation encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA complementary to the DNA encoding the protein of (a), and that can further induce antigen-specific antibody titer and / or infection protection
  • the protein of the body protein (b1) is one or several (preferably 1 or more and 10 or less, more preferably 1) other than the 90th alanine in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 8) of the protein of (a).
  • a flagellin mutant protein of the present invention having an amino acid sequence in which at least 5 amino acids have been deleted, substituted or added, and which can induce antigen-specific antibody titer and / or infection protection more strongly.
  • the body can induce antigen-specific antibody titers and / or infection protection more strongly than known flagellin variants such as FliC R90A or wild type flagellin. May those.
  • Antigen-specific antibody titers and protection against infection of flagellin variants can be measured by the method described in Examples set forth below.
  • a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA complementary to the DNA encoding the protein of (a) is ( It may be at least 80% (preferably at least 95%, more preferably at least 98%) identical to all or part of the DNA complementary to the DNA encoding the protein of a).
  • Hybridization is performed under stringent conditions.
  • the stability of the nucleic acid duplex or hybrid is expressed by the melting temperature Tm (the temperature at which the probe dissociates from the target DNA). This melting temperature is used to define stringent conditions. Assuming that the Tm drops by 1 ° C.
  • the temperature of the final wash of the hybridization reaction must be lowered.
  • the final washing temperature must be lowered by 5 ° C.
  • the Tm will vary between 0.5 and 1.5 ° C.
  • An example of stringent conditions is to hybridize in 5x °C SSC / 5x Denhardt solution / 1.0% SDS at 68 ° C and wash in 0.2x SSC / 0.1% SDS at room temperature.
  • An example of moderately stringent conditions is a wash in 3x SSC at 42 ° C.
  • the salt concentration or temperature can be varied to achieve an optimal level of identity between the probe and the target nucleic acid.
  • the flagellin mutant of the present invention can be produced by a known method.
  • a flagellin mutant is obtained by obtaining a DNA encoding a flagellin mutant as described below, introducing the obtained DNA into an appropriate expression vector, introducing the DNA into an appropriate host, and producing it as a recombinant protein.
  • a flagellin mutant is obtained by obtaining a DNA encoding a flagellin mutant as described below, introducing the obtained DNA into an appropriate expression vector, introducing the DNA into an appropriate host, and producing it as a recombinant protein.
  • Saigo Satoshi, Yoko Sano co-translation, CURRENT PROTOCOLS compact version Molecular Biology Experiment Protocol, I, II, III, Maruzen Co., Ltd .: Original, Ausubel, FM, etc., Short Protocols
  • the flagellin mutant of the present invention can also be produced according to a known peptide synthesis method.
  • the present invention relates to a flagellin mutant in which a mutation is introduced into at least one site in the Toll-like receptor 5 activation region of wild-type flagellin, and the ability to activate Toll-like receptor 5 is reduced.
  • a DNA encoding a flagellin mutant into which a mutation that enhances is introduced is provided.
  • the isolated DNA encoding the flagellin mutant of the present invention may be any DNA as long as it contains a base sequence encoding the flagellin mutant of the present invention.
  • the DNA encoding the flagellin variant of the present invention includes DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 (in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, the 90th arginine is substituted with alanine, A DNA encoding a flagellin mutant having an amino acid sequence from amino acid 58 to amino acid 58 and amino acid sequence from 44 amino acid to amino acid 487 (from amino acid 44 to amino acid 487).
  • the Toll-like receptor 5 activation ability is less attenuated than the wild-type flagellin FliC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, Examples thereof include DNA encoding a flagellin mutant protein with improved stability as an antigen.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA complementary to the DNA encoding the flagellin variant having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 is complementary to DNA encoding the flagellin variant having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8
  • Hybridization is performed under stringent conditions.
  • the stability of the nucleic acid duplex or hybrid is expressed by the melting temperature Tm (the temperature at which the probe dissociates from the target DNA). This melting temperature is used to define stringent conditions. Assuming that the Tm drops by 1 ° C. due to a 1% mismatch, the temperature of the final wash of the hybridization reaction must be lowered.
  • the final washing temperature must be lowered by 5 ° C.
  • the Tm will vary between 0.5 and 1.5 ° C.
  • An example of stringent conditions is to hybridize in 5x °C SSC / 5x Denhardt solution / 1.0% SDS at 68 ° C and wash in 0.2x SSC / 0.1% SDS at room temperature.
  • An example of moderately stringent conditions is a wash in 3x SSC at 42 ° C.
  • the salt concentration or temperature can be varied to achieve an optimal level of identity between the probe and the target nucleic acid.
  • the isolated DNA encoding the flagellin mutant of the present invention can be produced, for example, as follows.
  • Genomic DNA is extracted from Pseudomonas aeruginosa, and the flagellin coding region (487 residues) is amplified by PCR.
  • the obtained PCR product is DNA encoding wild type flagellin. Examples of the amino acid sequence of wild type flagellin FliC and the base sequence of the DNA encoding it are shown in SEQ ID NOs: 2 and 1, respectively.
  • a DNA encoding a flagellin mutant in which a mutation has been introduced into at least one site in the Toll-like receptor 5 activation region of wild-type flagellin and the ability to activate Toll-like receptor 5 has been reduced is the flagellin coding region (487 residues). It can be prepared by mutating the desired site of the group) by point mutagenesis. The 59-443aa region in the coding region of mutated flagellin (487 residues) is amplified by PCR. The obtained PCR product is DNA encoding the flagellin mutant of the present invention.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 an example of the base sequence of DNA encoding a flagellin mutant consisting of an amino acid sequence in which the 90th arginine is substituted with alanine is shown in SEQ ID NO: 3.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 the 90th arginine is substituted with alanine, and the 58 amino acids from the 1st amino acid to the 58th amino acid and the 44 amino acids from the 444th amino acid to the 487th amino acid are deleted.
  • An example of the base sequence of DNA encoding a flagellin variant consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 8) is shown in SEQ ID NO: 7.
  • SEQ ID NOs: 5 and 6 respectively show the base sequence and amino acid sequence of wild-type flagellin FlaA derived from Pseudomonas aeruginosa (PAK).
  • the homology of the amino acid sequences of wild type flagellin FliC and FlaA is about 60%.
  • the 90th arginine of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is considered to correspond to the 90th arginine of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • the first alanine and the 58th serine of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are considered to correspond to the first alanine and the 44th asparagine of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, respectively.
  • the 90th arginine in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 is substituted with another amino acid (for example, alanine, glycine, etc.), and 44 amino acids from the first amino acid to the 44th amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6
  • a flagellin mutant having an amino acid sequence in which the amino acids are deleted is also included in the present invention.
  • the present invention relates to a flagellin mutant in which a mutation is introduced into at least one site in the Toll-like receptor 5 activation region of wild-type flagellin, and the ability to activate Toll-like receptor 5 is reduced.
  • a recombinant vector containing DNA encoding the flagellin mutant of the present invention can be obtained by a known method (for example, the method described in MolecularMCloning 2nd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). It can be obtained by inserting a DNA encoding the flagellin mutant of the present invention into an appropriate expression vector.
  • Expression vectors include plasmids derived from E. coli (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13, pGACAG), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, pC194), yeast-derived plasmids (eg, pSH19, pSH15), ⁇ Bacteriophages such as phages, animal viruses such as retroviruses, adenoviruses, and vaccinia viruses, and insect pathogenic viruses such as baculoviruses can be used.
  • E. coli eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13, pGACAG
  • Bacillus subtilis eg, pUB110, pTP5, pC194
  • yeast-derived plasmids eg, pSH19, pSH15
  • Bacteriophages such as phages
  • a promoter, enhancer, splicing signal, poly A addition signal, selection marker, SV40 replication origin, etc. may be added to the expression vector.
  • the expression vector may be a fusion protein expression vector.
  • fusion protein expression vectors are commercially available: pGEX series (Amersham Pharmacia Biotech), pET CBD Fusion System 34b-38b (Novagen), pET Dsb Fusion Systems 39b and 40b (Novagen), pET GST Fusion System 41 and 42 (Novagen).
  • plasmid vaccine / virus vector vaccine When using a recombinant vector as a gene vaccine (plasmid vaccine / virus vector vaccine), it is preferable to prepare a plasmid vaccine by introducing a target gene into a pGACAG plasmid vector that has already been developed for gene vaccines.
  • the present invention also provides a flagellin mutant in which a mutation has been introduced into at least one site in the Toll-like receptor 5 activation region of wild-type flagellin and the ability to activate Toll-like receptor 5 has been reduced.
  • a transformant comprising a vector containing a DNA encoding a flagellin mutant into which a mutation that enhances stability is introduced.
  • a transformant can be obtained by introducing a recombinant vector containing a DNA encoding the flagellin mutant of the present invention into a host.
  • Hosts include bacterial cells (eg, Escherichia, Bacillus, Bacillus, etc.), fungal cells (eg, yeast, Aspergillus, etc.), insect cells (eg, S2 cells, Sf cells, etc.), animal cells (eg, CHO cells, COS cells, HeLa cells, C127 cells, 3T3 cells, BHK cells, HEK293 cells, etc.), plant cells and the like.
  • bacterial cells eg, Escherichia, Bacillus, Bacillus, etc.
  • fungal cells eg, yeast, Aspergillus, etc.
  • insect cells eg, S2 cells, Sf cells, etc.
  • animal cells eg, CHO cells, COS cells, HeLa cells, C127 cells, 3T3 cells, BHK cells, HEK293 cells, etc.
  • the transformant can be cultured in a medium, and a flagellin mutant can be collected from the culture.
  • the flagellin mutant When the flagellin mutant is secreted into the medium, the medium may be recovered, and the flagellin mutant may be separated from the medium and purified.
  • the flagellin mutant When the flagellin mutant is produced in the transformed cell, the cell is lysed, and the flagellin mutant is separated from the lysate and purified.
  • the flagellin mutant When the flagellin mutant is expressed in the form of a fusion protein with another protein (functioning as a tag), the fusion protein is separated and purified, and then treated with FactorXa or an enzyme (enterokinase).
  • the target flagellin mutant can be obtained by cleaving this protein.
  • Separation and purification of flagellin mutants can be performed by known methods.
  • Known separation and purification methods include methods that utilize differences in solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • Method utilizing difference method utilizing charge difference such as ion exchange chromatography, method utilizing specific affinity such as affinity chromatography, method utilizing hydrophobic difference such as reverse phase high performance liquid chromatography
  • the present invention relates to a flagellin mutant in which a mutation is introduced into at least one site in the Toll-like receptor 5 activation region of wild-type flagellin, and the ability to activate Toll-like receptor 5 is reduced.
  • a vaccine comprising a flagellin mutant into which a mutation that enhances the above is introduced, a DNA encoding the flagellin mutant, or a vector containing the DNA.
  • the vaccine of the present invention is effective against a flagellar pathogen, particularly against Pseudomonas aeruginosa.
  • the vaccine of the present invention is suitable for prevention of cystic fibrosis infection, easily infected patients (for example, patients using immunosuppressive drugs, patients using anticancer drugs, patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD), severe burns, etc.) It is effective in preventing infection and hospital infection.
  • cystic fibrosis infection for example, patients using immunosuppressive drugs, patients using anticancer drugs, patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD), severe burns, etc.
  • the flagellin mutant, the DNA encoding the flagellin mutant, and the vector containing the DNA are as described above.
  • the flagellin mutant, the DNA encoding the flagellin mutant or the vector containing the DNA is dissolved in, for example, a buffer solution such as PBS, physiological saline, sterilized water, and sterilized by filtration with a filter or the like as necessary. Later, it may be administered to the subject by injection. Moreover, you may add an additive (For example, an inactivation agent, a preservative, an adjuvant, an emulsifier etc.) etc. to this solution.
  • the flagellin variant can be administered intravenously, intramuscularly, abdominally, subcutaneously, intradermally, or may be administered nasally or orally.
  • the dosage of the flagellin mutant, the DNA encoding the flagellin mutant or the vector containing the DNA, the number and frequency of administration vary depending on the subject's symptom, age, body weight, administration method, dosage form, etc.
  • a flagellin variant of 0.01 to 1 mg / kg body weight, preferably 0.01 to 0.1 mg / kg body weight per adult may be administered at least once with a frequency that the desired effect persists.
  • the desired effect is usually obtained at least once at a dose of 1 to 100 mg, preferably 1 to 10 mg per adult. It may be given at a sustained frequency.
  • the vector is a virus, it may be administered at a dose of 10 9 to 10 12 virus particles, preferably 10 11 to 10 12 virus particles per adult, at a frequency at which the desired effect is sustained.
  • Plasmid vaccine should be administered after endotoxin is removed.
  • a method of enhancing the vaccine effect by a method of introducing into a cell by electroporation after intramuscular administration or a method of administering a complex with a transfection enhancer such as a liposome may be used in combination.
  • the present invention also provides antibodies induced against the flagellin mutant of the present invention.
  • the antibodies of the present invention can react effectively against a wide variety of Pseudomonas aeruginosa.
  • the antibody of the present invention can be obtained by administering an antigen or antigen epitope or DNA encoding the same to an animal using a conventional protocol.
  • the antibody of the present invention may be any of a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, a chimeric antibody, a single chain antibody, and a humanized antibody.
  • polyclonal antibody In order to produce a polyclonal antibody, it can be produced according to a known or similar method. For example, it can be produced by administering (immunizing) an immunizing antigen (protein antigen or plasmid DNA expressing it) to an animal, collecting an antibody-containing substance against the protein from the immunized animal, and performing separation and purification of the antibody. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration. Administration is usually about once every 2 to 6 weeks, about 2 to 10 times in total. Polyclonal antibodies can be collected from blood, ascites, etc., preferably from blood of immunized animals.
  • an immunizing antigen protein antigen or plasmid DNA expressing it
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration. Administration is usually about once every 2 to 6 weeks, about 2 to 10 times in total.
  • Polyclonal antibodies can be collected from blood,
  • Polyclonal antibodies can be separated and purified by immunoglobulin separation and purification methods (for example, salting-out method, alcohol precipitation method, isoelectric precipitation method, electrophoresis method, adsorption / desorption method using ion exchanger, ultracentrifugation method, gel filtration method, A specific purification method in which only an antibody is collected using an antigen-binding solid phase or an active adsorbent such as protein A or protein G, and the antibody is obtained by dissociating the binding.
  • an IgG fraction purified from serum is preferable.
  • Monoclonal antibodies can be prepared by the hybridoma method of G. Koehler and C. Milstein described in Nature (1975) 256: 495, Science (1980) 208: 692-. That is, after immunizing an animal, antibody-producing cells are isolated from the spleen of the immunized animal and fused with myeloma cells to prepare monoclonal antibody-producing cells. Cell lines that produce monoclonal antibodies that react with flagellins from various Pseudomonas aeruginosa strains and act against these broad-spectrum infections in a broad spectrum may be isolated. This cell line can be cultured, and the desired monoclonal antibody can be obtained from the culture. Purification of the monoclonal antibody can be performed according to the above-described method for separating and purifying immunoglobulin.
  • the antibody of the present invention can be used for treatment of infectious diseases against bacteria having flagella, particularly Pseudomonas aeruginosa.
  • the present invention also encompasses a pharmaceutical composition comprising this antibody.
  • the advantage of this medicine is that it does not have to wait until the host's immune system is activated and reaches a sufficiently high level of protection, and an immediate effect can be expected.
  • administration of an antibody can immediately recover the patient from the pathogen and the toxin produced by the pathogen.
  • the antibody of the present invention may be dissolved in a buffer solution such as PBS, physiological saline, sterilized water or the like, sterilized by filtration with a filter or the like as necessary, and then administered to a subject by injection.
  • a buffer solution such as PBS, physiological saline, sterilized water or the like, sterilized by filtration with a filter or the like as necessary, and then administered to a subject by injection.
  • additives for example, colorants, emulsifiers, suspending agents, surfactants, solubilizers, stabilizers, preservatives, antioxidants, buffering agents, tonicity agents, etc.
  • intravenous, intramuscular, intraperitoneal, subcutaneous, intradermal administration, and the like are possible, and nasal or oral administration may be used.
  • the dose, frequency and frequency of administration of the antibody of the present invention vary depending on the symptom, age, body weight, administration method, dosage form, etc. of the subject, but usually, for example, 1,000 to 10,000 mg / kg body weight per adult, preferably The antibody of 2,000 to 5,000 mg / kg body weight may be administered at least once at a frequency at which the desired effect is sustained.
  • FliC R90A FL a mutant (full-length protein) in which 90th arginine is substituted with alanine in the amino acid sequence of wild-type flagellin FliC derived from Pseudomonas aeruginosa (PA01) (see FIG. 2).
  • FliC R90A del (59-443): deletion mutant of only 54-443aa region in which the N-terminal region and C-terminal region of FliC R90A FL are deleted (see Fig. 2).
  • FliC R90A protein is unstable (prone to degradation)
  • Fig. 1 Insertion of FliC R90A ORF derived from Pseudomonas aeruginosa PAO1 into pGEX6T-2 vector (GE Healthcare Bioscience) to prepare GST and FliC R90A fusion protein expression plasmid pGEX6T-2-FliC R90A (Saha, S., Takeshita F., et. al. J Immunol 179: 1147 2007).
  • the BL21 strain transformed with pGEX6T-2-FliC R90A was cultured for 8 hours, then added to the Overnight Expression System (Novagen), and cultured with shaking at 30 ° C for 24 hours.
  • the cells were solubilized with BugBuster extraction reagent (Novagen), and the supernatant was recovered (lysate). After the GST-FliC R90A protein was adsorbed from the supernatant using a GST column (GSTrap FF, GE Healthcare Bioscience), thrombin was allowed to act and eluted (column). Samples were concentrated and stored at 4 ° C or -30 ° C. Samples were fractionated by SDS-PAGE and analyzed by CBB staining. * Indicates the predicted target protein fraction. From these results, it was clear that the FliC R90A protein (predicted molecular weight ⁇ 55 kDa) produced in E. coli is very unstable and can be degraded to a protein of ⁇ 40 kDa even when stored at 4 ° C.
  • FliC R90A protein is unstable (N-terminal 1-58 and C-terminal 444-487 are easily degraded) (Fig. 2) (FIG. 2 left)
  • the prepared sample was stored at 4 ° C., fractionated by SDS-PAGE, the target protein was collected and digested from the gel, and analyzed by TOF-MS. As a result, it was found that only the 59-443 aa region of FliCR 90A was present.
  • the FliC R90A amino acid sequence is shown.
  • the shaded region is the a helix region that is predicted to be located inside the flagellar structure, and the region surrounded by the frame is considered to have been digested.
  • FIG. 2 right CMV promoter-dependent expression vector (pGA) (Saha, S., Takeshita F., et al. J Immunol 179: 1147 2007), PCR-amplified FliC R90A full-length ORF or 59-443 aa The region was inserted to produce CMV-FliC R90A FL and CMV-FliC R90A del (59-443).
  • HEK293 cells were transfected with these plasmids, and after 48 hours, cell lysate was prepared, fractionated by SDS-PAGE, and transferred to a PVDF membrane.
  • the vaccine of the present invention can be used to prevent infection of flagellar disease specimens, for example, Pseudomonas aeruginosa.
  • SEQ ID NO: 1 shows the base sequence of wild-type flagellin FliC derived from Pseudomonas aeruginosa (PA01).
  • SEQ ID NO: 2 shows the amino acid sequence of wild-type flagellin FliC derived from Pseudomonas aeruginosa (PA01).
  • SEQ ID NO: 3 shows the base sequence of mutant flagellin FliC R90A.
  • SEQ ID NO: 5 shows the base sequence of wild-type flagellin FlaA derived from Pseudomonas aeruginosa (PAK).
  • SEQ ID NO: 6 shows the amino acid sequence of wild-type flagellin FlaA derived from Pseudomonas aeruginosa (PAK).
  • ⁇ SEQ ID NO: 7 shows the nucleotide sequence of deletion mutant flagellin FliC R90A del (59-443).

Abstract

　フラジェリン変異体DNAワクチンの免疫原性を高める。　野生型フラジェリンのToll様受容体５活性化領域における少なくとも１つの部位に変異が導入され、Toll様受容体５活性化能が減弱したフラジェリン変異体に、さらに、抗原としての安定性を高めるような変異が導入されているフラジェリン変異体。

Description

緑膿菌に対して効果的に感染防御能を誘導するフラジェリン変異体
　本発明は、緑膿菌に対して効果的に感染防御能を誘導するフラジェリン変異体に関する。
　緑膿菌は、日和見感染症の原因菌として、臨床上大きな問題となっている。様々なワクチンが検討されてきたが、臨床応用に至っているものは未だ開発されていない(非特許文献１)。
　本発明者らはワクチン抗原に対して誘導された抗体が宿主自身の菌体に対する免疫応答を中和し、むしろ感染を増悪させてしまうという問題をあきらかにし、中和抗体を誘導しないフラジェリン変異体FliC R90Aを抗原として用いることで、効果的に感染防御を誘導できることを確認した(非特許文献２、特許文献１)。
　前記フラジェリン変異体DNAワクチンでは、フラジェリンの全長ORFを用いており、哺乳動物細胞内で発現させた場合、抗原タンパクの発現効率は低い。抗原タンパクの発現効率を高めることで、生体内での抗原量を増強させ、最終的にフラジェリン変異体DNAワクチン免疫原性を高める取り組みはこれまでされてこなかった。
　本発明は、フラジェリン変異体DNAワクチンの免疫原性を高めることを目的とする。
　これまでの研究により、緑膿菌フラジェリンFliCのToll様受容体５(TLR5)活性化領域に変異（R90A）を導入した抗原を免疫することで、TLR5活性化を中和する抗体を誘導することなく、緑膿菌に対する防御的免疫応答を効率よく惹起でき得ることをあきらかとしている（J. Immunol., 179:1147, 2007、国際公開第WO2008/010478号パンフレット）。DNAワクチンは、哺乳動物において病原体由来の抗原を発現させるため、抗原遺伝子の種類により発現効率が低下し、免疫原性を低下させる原因の一つと考えられている。FliC R90A抗原を哺乳動物細胞で発現させると、様々な長さの抗原タンパクが発現し、抗原全長として効率よく発現できないもしくは内因性のプロテアーゼにより消化され不安定になっている可能性が示唆された（図1）。このため、N末端領域およびC末端領域をdeleteした54-443aa領域のみのdeletion変異体(FliC R90A del (54-443))を発現させることで、効率よく抗原タンパクを発現させることに成功した（図2）。全長発現型FliC R90A FL DNAワクチンとdeletion変異体発現型FliC R90A del (54-443) DNAワクチンを調製し、マウスに免疫してそれぞれの免疫原性を比較検討した。その結果、FliC R90A del (54-443)で免疫した群では有意に高い抗原特異的抗体価が誘導され（図3）、緑膿菌PAO1株を感染させた際には顕著な防御効果を示すことがあきらかとなった（図4）。本発明は、これらの知見に基づいて完成された。本発明の要旨は以下の通りである。
（１）野生型フラジェリンのToll様受容体５活性化領域における少なくとも１つの部位に変異が導入され、Toll様受容体５活性化能が減弱したフラジェリン変異体に、さらに、抗原としての安定性を高めるような変異が導入されているフラジェリン変異体。
（２）野生型フラジェリンが有鞭毛病原体由来である（１）記載のフラジェリン変異体。
（３）有鞭毛病原体が緑膿菌である（２）記載のフラジェリン変異体。
（４）野生型フラジェリンがフラジェリンFlaA又はFliCである（１）～（３）のいずれかに記載のフラジェリン変異体。
（５）抗原としての安定性を高めるような変異が、少なくとも1個のアミノ酸の欠失である（１）～（４）のいずれかに記載のフラジェリン変異体。
（６）欠失するアミノ酸がN末端側及び／又はC末端側に位置する（５）記載のフラジェリン変異体。
（７）野生型フラジェリンが配列番号２のアミノ酸配列を有する野生型フラジェリンFliCであり、Toll様受容体５活性化領域が配列番号２のアミノ酸配列中の71番目のアミノ酸から97番目までのアミノ酸の領域を含む（４）～（６）のいずれかに記載のフラジェリン変異体。
（８）配列番号２のアミノ酸配列における90番目のアルギニンが他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を有する（７）記載のフラジェリン変異体。
（９）他のアミノ酸がアラニン又はグリシンである（８）記載のフラジェリン変異体。
（１０）抗原としての安定性を高めるような変異が、配列番号２のアミノ酸配列中の1番目のアミノ酸から58番目のアミノ酸までの少なくとも１個のアミノ酸の欠失である（７）～（９）のいずれかに記載のフラジェリン変異体。
（１１）抗原としての安定性を高めるような変異が、配列番号２のアミノ酸配列中の444番目のアミノ酸から487番目のアミノ酸までの少なくとも１個のアミノ酸の欠失である（７）～（１０）のいずれかに記載のフラジェリン変異体。
（１２）以下の(a)、(b)若しくは(c)のタンパク質である（１）記載のフラジェリン変異体。
(a)配列番号２のアミノ酸配列において、90番目のアルギニンがアラニンに置換され、1番目のアミノ酸から58番目のアミノ酸までの58個のアミノ酸及び444番目のアミノ酸から487番目のアミノ酸までの44個のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列を有するフラジェリン変異体タンパク質
(b)(a)のタンパク質のアミノ酸配列において、90番目のアラニン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつToll様受容体５活性化能が配列番号２のアミノ酸配列を有する野生型フラジェリンFliCよりも減弱し、さらに、抗原としての安定性を高めたフラジェリン変異体タンパク質
(c)(a)のタンパク質をコードするDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされ、かつToll様受容体５活性化能が配列番号２のアミノ酸配列を有する野生型フラジェリンFliCよりも減弱し、さらに、抗原としての安定性を高めたフラジェリン変異体タンパク質
（１３）(a)のタンパク質をコードするDNAが配列番号７の塩基配列を有する（１２）記載のフラジェリン変異体。
（１４）抗原特異的抗体価及び/又は感染防御をより強く誘導できる（１）～（１３）のいずれかに記載のフラジェリン変異体。
（１５）以下の(a)、(b1)若しくは(c1)のタンパク質であるフラジェリン変異体。
(a)配列番号２のアミノ酸配列において、90番目のアルギニンがアラニンに置換され、1番目のアミノ酸から58番目のアミノ酸までの58個のアミノ酸及び444番目のアミノ酸から487番目のアミノ酸までの44個のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列を有するフラジェリン変異体タンパク質
(b1)(a)のタンパク質のアミノ酸配列において、90番目のアラニン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ抗原特異的抗体価及び/又は感染防御をより強く誘導できるフラジェリン変異体タンパク質
(c1)(a)のタンパク質をコードするDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされ、かつ抗原特異的抗体価及び/又は感染防御をより強く誘導できるフラジェリン変異体タンパク質
（１６）(a)のタンパク質をコードするDNAが配列番号７の塩基配列を有する（１５）記載のフラジェリン変異体。
（１７）（１）～（１６）のいずれかに記載のフラジェリン変異体をコードするＤＮＡ。
（１８）（１７）記載のＤＮＡを含有するベクター。
（１９）（１８）記載のベクターを含む形質転換体。
（２０）（１９）記載の形質転換体を培養することを含む、フラジェリン変異体の製造方法。
（２１）（１）～（１６）のいずれかに記載のフラジェリン変異体、（１７）記載のDNA又は（１８）記載のベクターを含むワクチン。
（２２）有鞭毛病原体に対するワクチンである（２１）記載のワクチン。
（２３）有鞭毛病原体が緑膿菌である（２２）記載のワクチン。
（２４）のう胞性繊維症感染予防及び／又は易感染性患者への感染予防のために用いられる（２１）～（２３）のいずれかに記載のワクチン。
（２５）（１）～（１６）のいずれかに記載のフラジェリン変異体に対して誘導された抗体。
（２６）（２５）記載の抗体を含む医薬組成物。
　本発明のDNAワクチンは緑膿菌に対して強力に感染防御能を賦与でき、改良型ワクチンとして応用できる可能性がある。
　本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2009‐155003の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
大腸菌発現系でのFliC R90Aタンパクの精製と安定性の検討。大腸菌で作製したGST-FliC R90AタンパクをGSTカラムで精製後、4°Cまたは-30°Cで保存し、サンプルをSDS-PAGE、CBB染色にて解析した。精製途中からFliCR90Aタンパクの分解が認められ、いずれの保存方法においてもその進行が認められた。このことから、大腸菌で作製したFliC R90Aタンパクは非常に不安定であることが示唆された。 左）TOF-MS解析によるFliC R90Aタンパクの分解産物の解析。前記大腸菌で作製したFliC R90Aタンパクを4°Cで保存後、SDS-PAGEで分画し、主要分解産物を単離後TOF-MSで解析した。その結果、枠で囲まれた領域（1-58 aaおよび444-487 aa）が分解・消化されていたことがあきらかとなった。右）哺乳動物細胞内でのFliC R90Aタンパクの安定性。FliC R90A全長（1-487 aa）または欠失変異体（59-443aa）発現型プラスミド（CMV-FliC R90A FLまたはCMV-FliC R90A del (59-443)）を作製した。これらプラスミドをHEK293細胞にトランスフェクションし、標的分子の発現を抗FliC R90A抗体を用いた免疫ブロッティング法により解析した。哺乳動物細胞内においても、FliCR90A全長タンパクは分解され不安定であること、欠失変異体（59-443aa）は安定して発現されることが確認された。 FliC R90A全長抗原（1-487 aa）または欠失変異体（59-443 aa）DNAワクチンの免疫原性の検討。BALB/cマウスにFliC R90A発現プラスミドを筋注エレクトロポレーション法で2回免疫（0および4週後）し、最終免疫の2週後に血清中の抗FliC R90A特異的IgG2a抗体価をELISA法により定量化した。CMV-FliCR90A del (59-443)を免疫した群において、CMV-FliCR90A FLを免疫した群と比べ、優位に高い抗体価が誘導されることがあきらかとなった。このことから、欠失変異体（FliC R90A del (59-443)）抗原は、全長抗原と比べ、免疫原性が高いことが示唆された。*、p < 0.05。 FliC R90A全長抗原（1-487 aa）または欠失変異体（59-443 aa）DNAワクチンの感染防御能誘導の検討。前記免疫したマウスに、緑膿菌PAO1株を経鼻感染させ（上段：2LD50、下段：4LD50量）、その後の生存率を観察した。4LD50量でチャレンジした際には、CMV-FliCR90A del (59-443)を免疫した群において、CMV-FliCR90A FLを免疫した群と比べ、生存率が高かった。このことから、欠失変異体（FliC R90A del (59-443)）抗原を免疫することで、全長抗原と比べ、効果的な感染防御的免疫応答を誘導できることが示唆された。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明は、野生型フラジェリンのToll様受容体５活性化領域における少なくとも１つの部位に変異が導入され、Toll様受容体５活性化能が減弱したフラジェリン変異体に、さらに、抗原としての安定性を高めるような変異が導入されているフラジェリン変異体を提供する。本発明のフラジェリン変異体は、Toll様受容体５に対して不活性であるが、フラジェリンの抗原特性を保持しているものであるとよい。本明細書において、フラジェリンの変異の「概念」には、フラジェリンタンパク質のアミノ酸配列中の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加した変異のみならず、１０個以上のアミノ酸が欠失した変異（例えば、配列番号２のアミノ酸配列において、1番目のアミノ酸から58番目のアミノ酸までの58個のアミノ酸の欠失、444番目のアミノ酸から487番目のアミノ酸までの44個のアミノ酸の欠失、1番目のアミノ酸から58番目のアミノ酸までの58個のアミノ酸と444番目のアミノ酸から487番目のアミノ酸までの44個のアミノ酸の欠失）なども含まれる。
　鞭毛は細菌の運動に必須の器官であり、多くの細菌が持っている。病原菌に関しては、緑膿菌、サルモネラ菌（チフス菌）、コレラ菌、リステリアなどの鞭毛がよく研究されている。細菌の鞭毛は、フラジェリンというタンパクが重合して構成される。緑膿菌属において発現しているA型の鞭毛はフラジェリンFlaAにより構成され、B型の鞭毛はフラジェリンFliCにより構成されている。FlaAとFliCでは約６０%の相同性を有し、抗原性も一部重複しており、一方のフラジェリンを免疫した際に誘導される特異的免疫応答は、他方のフラジェリンに対しても反応する。緑膿菌においてはフラジェリンFlaAとFliCのみが知られているが、他の細菌は固有のフラジェリンを発現している。
　Toll様受容体５は哺乳動物が保有しているToll様受容体ファミリーの一つであり、主として細胞膜上に発現しているI型膜タンパクである。細胞外領域はロイシンリッチリピートはフラジェリンとの相互作用に重要で、細胞内領域に存在するToll/IL-1Rドメインはシグナル伝達に重要な役割を果たしていると考えられている。Toll様受容体５欠損マウスはフラジェリンに対する応答が減弱することから、Toll様受容体５はフラジェリンの受容体であることが判明した。
　フラジェリンは、その立体構造からD１～３領域が存在していることが判明している。D１領域はNH2末端およびCOOH末端近傍に存在するαへリックス構造から構成され、Toll様受容体５の活性化に重要であると考えられている。変異体を用いた実験から、緑膿菌FliCにおいては７１～９７アミノ酸領域がToll様受容体活性化領域の構造に重要な領域と考えられた。
　Toll様受容体５にそのリガンドであるフラジェリンが作用し、活性化すると、細胞内アダプター分子MyD88、IRAK1、TRAF6を介してNF-kBを活性化することが知られている。ヒト腎由来線維芽細胞株HEK293にToll様受容体５発現プラスミドとNF-kB依存的ルシフェラーゼ発現プラスミドをトランスフェクションし、フラジェリンで刺激すると、フラジェリン濃度依存的に細胞内ルシフェラーゼ活性が増強する。この実験系を用いることでToll様受容体５活性化能を測定することができる。
　野生型フラジェリンは、有鞭毛病原体由来であるとよく、好ましくは緑膿菌由来であり、緑膿菌由来のフラジェリンFlaA及びFliCがより好ましく、緑膿菌由来のフラジェリンFliCがさらにより好ましい。
　緑膿菌（PAO1）由来の野生型フラジェリンFliCの塩基配列及びアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１及び２に示す。
　一般に、タンパク質は様々な高次構造をとっているので、フラジェリンのToll様受容体５活性化領域は一義的に決定できるものではないが、例えば、配列番号２のアミノ酸配列中の71番目のアミノ酸から97番目までのアミノ酸の領域は野生型フラジェリンFliCのToll様受容体５活性化領域と考えられる。
　野生型フラジェリンのToll様受容体５活性化領域における少なくとも１つの部位に変異が導入され、Toll様受容体５活性化能が減弱したフラジェリン変異体は、配列番号２のアミノ酸配列における90番目のアルギニンが他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を有するものであるとよい。他のアミノ酸は、フラジェリンの立体構造を破壊しないものであるとよく、アラニン又はグリシンを例示することができる。
　野生型フラジェリンのToll様受容体５活性化領域における少なくとも１つの部位に変異が導入され、Toll様受容体５活性化能が減弱したフラジェリン変異体の例としては、配列番号２のアミノ酸配列において、90番目のアルギニンがアラニンに置換されているアミノ酸配列を有するフラジェリン変異体タンパク質を挙げることができる。
　本発明のフラジェリン変異体は、野生型フラジェリンのToll様受容体５活性化領域における少なくとも１つの部位に変異が導入され、Toll様受容体５活性化能が減弱したフラジェリン変異体に、さらに、抗原としての安定性を高めるような変異が導入されているものである。抗原としての安定性を高めるような変異としては、その変異が導入されていないフラジェリン（野生型も既知の変異型も含む）と比較して、タンパク質の発現量が多くなるような変異、タンパク質分解要因（例えば、プロテアーゼ、温度、時間経過、酸化環境、強酸または強塩基性環境など）、DNAまたはRNAの分解要因（例えば、DNase、RNase、温度、時間経過、酸化環境、強酸または強塩基性環境など）などに対して安定性が高まるような変異などが挙げられる。抗原としての安定性を高めるような変異の例としては、少なくとも1個のアミノ酸の欠失を挙げることができる。欠失するアミノ酸はN末端側及び／又はC末端側に位置するとよい。抗原としての安定性を高めるような変異として、配列番号２のアミノ酸配列中の1番目のアミノ酸から58番目のアミノ酸までの少なくとも１個のアミノ酸の欠失、配列番号２のアミノ酸配列中の444番目のアミノ酸から487番目のアミノ酸までの少なくとも１個のアミノ酸の欠失、それらの組合せを例示することができ、配列番号２のアミノ酸配列中の1番目のアミノ酸から58番目のアミノ酸までの領域で欠失するアミノ酸の数は、好ましくは、1～58個、より好ましくは、30～58個であり、配列番号２のアミノ酸配列中の444番目のアミノ酸から487番目のアミノ酸までの領域で欠失するアミノ酸の数は、好ましくは、1～44個、より好ましくは、23～44個である。
　本発明のフラジェリン変異体の例としては、以下の(a)、(b)又は(c)のタンパク質を挙げることができる。
(a)配列番号２のアミノ酸配列において、90番目のアルギニンがアラニンに置換され、1番目のアミノ酸から58番目のアミノ酸までの58個のアミノ酸及び444番目のアミノ酸から487番目のアミノ酸までの44個のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列を有するフラジェリン変異体タンパク質
(b)(a)のタンパク質のアミノ酸配列において、90番目のアラニン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつToll様受容体５活性化能が配列番号２のアミノ酸配列を有する野生型フラジェリンFliCよりも減弱し、さらに、抗原としての安定性を高めたフラジェリン変異体タンパク質
(c)(a)のタンパク質をコードするDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされ、かつToll様受容体５活性化能が配列番号２のアミノ酸配列を有する野生型フラジェリンFliCよりも減弱し、さらに、抗原としての安定性を高めたフラジェリン変異体タンパク質
　(b)のタンパク質は、(a)のタンパク質のアミノ酸配列において、90番目のアラニン以外の１若しくは数個（好ましくは、１個以上10個以下、より好ましくは、１個以上5個以下のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつToll様受容体５活性化能が配列番号２のアミノ酸配列を有する野生型フラジェリンFliCよりも減弱し、さらに、抗原としての安定性を高めたフラジェリン変異体タンパク質である。
　(c)のタンパク質について、(a)のタンパク質をコードするDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAは、(a)のタンパク質をコードするDNAに相補的なDNAの全部又は一部と少なくとも80%（好ましくは、少なくとも95%、より好ましくは、少なくとも98%）の同一性があるとよい。ハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件下で行われる。核酸二本鎖又はハイブリッドの安定性は、融解温度Tm（プローブが標的DNAから解離する温度）で表される。この融解温度はストリンジェントな条件を定義するために用いられる。1%のミスマッチによりTmが１℃低下すると仮定すると、ハイブリダイゼーション反応の最終洗浄の温度を低くしなければならない。例えば、プローブと95%以上の同一性を有する配列を求める場合には、最終洗浄温度を５℃低くしなければならない。実際、1%のミスマッチにつき、0.5～1.5℃の間でTmが変わることになる。ストリンジェントな条件の例としては、5x SSC/5x デンハルト溶液/1.0% SDS中68℃でハイブリダイズさせ、0.2x SSC/0.1%SDS中室温で洗浄することである。中程度にストリンジェントな条件の例としては、3x SSC中42℃で洗浄することである。塩濃度や温度は、プローブと標的核酸との同一性の最適なレベルを達成するために変更されうる。このような条件に関するさらなる指針として、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; and Ausubel et al. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons. N.Y.)  at Unit 2.10を参照されたい。
　(a)のタンパク質のアミノ酸配列を配列番号８に示す。(a)のタンパク質をコードするDNAとしては、配列番号７の塩基配列を有するDNAを例示することができる。
　本発明のフラジェリン変異体は、FliC R90Aなどの既知のフラジェリン変異体又は野性型のフラジェリンに比べて、抗原特異的抗体価及び/又は感染防御をより強く誘導できるものであるとよい。フラジェリン変異体の抗原特異的抗体価及び感染防御は後述の実施例に記載の方法で測定することができる。
　また、本発明は、以下の(a)、(b1)若しくは(c1)のタンパク質であるフラジェリン変異体を提供する。
(a)配列番号２のアミノ酸配列において、90番目のアルギニンがアラニンに置換され、1番目のアミノ酸から58番目のアミノ酸までの58個のアミノ酸及び444番目のアミノ酸から487番目のアミノ酸までの44個のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列を有するフラジェリン変異体タンパク質
(b1)(a)のタンパク質のアミノ酸配列において、90番目のアラニン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ抗原特異的抗体価及び/又は感染防御をより強く誘導できるフラジェリン変異体タンパク質
(c1)(a)のタンパク質をコードするDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされ、かつ抗原特異的抗体価及び/又は感染防御をより強く誘導できるフラジェリン変異体タンパク質
　(b1)のタンパク質は、(a)のタンパク質のアミノ酸配列（配列番号８）において、90番目のアラニン以外の１若しくは数個（好ましくは、１個以上10個以下、より好ましくは、１個以上5個以下のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ抗原特異的抗体価及び/又は感染防御をより強く誘導できるフラジェリン変異体タンパク質である。本発明のフラジェリン変異体は、FliC R90Aなどの既知のフラジェリン変異体又は野性型のフラジェリンに比べて、抗原特異的抗体価及び/又は感染防御をより強く誘導できるものであるとよい。フラジェリン変異体の抗原特異的抗体価及び感染防御は後述の実施例に記載の方法で測定することができる。
　(c1)のタンパク質について、(a)のタンパク質をコードするDNA（例えば、配列番号７の塩基配列で表されるDNA）に相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAは、(a)のタンパク質をコードするDNAに相補的なDNAの全部又は一部と少なくとも80%（好ましくは、少なくとも95%、より好ましくは、少なくとも98%）の同一性があるとよい。ハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件下で行われる。核酸二本鎖又はハイブリッドの安定性は、融解温度Tm（プローブが標的DNAから解離する温度）で表される。この融解温度はストリンジェントな条件を定義するために用いられる。1%のミスマッチによりTmが１℃低下すると仮定すると、ハイブリダイゼーション反応の最終洗浄の温度を低くしなければならない。例えば、プローブと95%以上の同一性を有する配列を求める場合には、最終洗浄温度を５℃低くしなければならない。実際、1%のミスマッチにつき、0.5～1.5℃の間でTmが変わることになる。ストリンジェントな条件の例としては、5x SSC/5x デンハルト溶液/1.0% SDS中68℃でハイブリダイズさせ、0.2x SSC/0.1%SDS中室温で洗浄することである。中程度にストリンジェントな条件の例としては、3x SSC中42℃で洗浄することである。塩濃度や温度は、プローブと標的核酸との同一性の最適なレベルを達成するために変更されうる。このような条件に関するさらなる指針として、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; and Ausubel et al. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons. N.Y.)  at Unit 2.10を参照されたい。
　本発明のフラジェリン変異体は、公知の方法によって製造することができる。例えば、後述のようにしてフラジェリン変異体をコードするＤＮＡを得、得られたＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込んだ後、適当な宿主に導入し、組換え蛋白質として生産させることにより、フラジェリン変異体を製造することができる（例えば、西郷薫、佐野弓子共訳、ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳコンパクト版、分子生物学実験プロトコール、Ｉ、II、III、丸善株式会社：原著、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．等，　Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｔｈｉｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｉｎｃ．，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋを参照のこと）。
　あるいはまた、本発明のフラジェリン変異体は、公知のペプチド合成法に従って製造することもできる。
　本発明は、野生型フラジェリンのToll様受容体５活性化領域における少なくとも１つの部位に変異が導入され、Toll様受容体５活性化能が減弱したフラジェリン変異体に、さらに、抗原としての安定性を高めるような変異が導入されているフラジェリン変異体をコードするＤＮＡを提供する。
　本発明のフラジェリン変異体をコードする単離されたＤＮＡは、本発明のフラジェリン変異体をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。本発明のフラジェリン変異体をコードするＤＮＡとしては、配列番号７の塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号８のアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸配列において、90番目のアルギニンがアラニンに置換され、1番目のアミノ酸から58番目までの58個のアミノ酸及び444番目のアミノ酸から487番目までの44個のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列）を有するフラジェリン変異体をコードするDNA（例えば、配列番号７の塩基配列を有するＤＮＡ）に相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつToll様受容体５活性化能が配列番号２のアミノ酸配列を有する野生型フラジェリンFliCよりも減弱し、さらに、抗原としての安定性を高めたフラジェリン変異体タンパク質をコードするDNAなどを例示することができる。
　配列番号８のアミノ酸配列を有するフラジェリン変異体をコードするDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAは、配列番号８のアミノ酸配列を有するフラジェリン変異体をコードするDNAに相補的なDNAの全部又は一部と少なくとも80%（好ましくは、少なくとも95%、より好ましくは、少なくとも98%）の同一性があるとよい。ハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件下で行われる。核酸二本鎖又はハイブリッドの安定性は、融解温度Tm（プローブが標的DNAから解離する温度）で表される。この融解温度はストリンジェントな条件を定義するために用いられる。1%のミスマッチによりTmが１℃低下すると仮定すると、ハイブリダイゼーション反応の最終洗浄の温度を低くしなければならない。例えば、プローブと95%以上の同一性を有する配列を求める場合には、最終洗浄温度を５℃低くしなければならない。実際、1%のミスマッチにつき、0.5～1.5℃の間でTmが変わることになる。ストリンジェントな条件の例としては、5x SSC/5x デンハルト溶液/1.0% SDS中68℃でハイブリダイズさせ、0.2x SSC/0.1%SDS中室温で洗浄することである。中程度にストリンジェントな条件の例としては、3x SSC中42℃で洗浄することである。塩濃度や温度は、プローブと標的核酸との同一性の最適なレベルを達成するために変更されうる。このような条件に関するさらなる指針として、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; and Ausubel et al. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons. N.Y.)  at Unit 2.10を参照されたい。
　配列番号８のアミノ酸配列を有するフラジェリン変異体をコードするDNAとしては、配列番号７の塩基配列を有するDNAを例示することができる。
　本発明のフラジェリン変異体をコードする単離されたＤＮＡは、例えば、以下のようにして製造することができる。
　緑膿菌からゲノムＤＮＡを抽出し、フラジェリンのコード領域（487残基）をPCRによって増幅する。得られたPCR産物が野生型フラジェリンをコードするＤＮＡである。野生型フラジェリンFliCのアミノ酸配列及びそれをコードするＤＮＡの塩基配列の一例をそれぞれ配列番号２および１に示す。
　野生型フラジェリンのToll様受容体５活性化領域における少なくとも１つの部位に変異が導入され、Toll様受容体５活性化能が減弱したフラジェリン変異体をコードするＤＮＡは、フラジェリンのコード領域（487残基）の所望の部位を点突然変異誘発法により変異させることにより作製することができる。変異させたフラジェリンのコード領域（487残基）中の59-443aa領域をPCRによって増幅する。得られたPCR産物が本発明のフラジェリン変異体をコードするＤＮＡである。
　配列番号２のアミノ酸配列において、９０番目のアルギニンがアラニンに置換されているアミノ酸配列からなるフラジェリン変異体をコードするＤＮＡの塩基配列の一例を配列番号３に示す。
　配列番号２のアミノ酸配列において、90番目のアルギニンがアラニンに置換され、1番目のアミノ酸から58番目までの58個のアミノ酸及び444番目のアミノ酸から487番目までの44個のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列（配列番号８）からなるフラジェリン変異体をコードするDNAの塩基配列の一例を配列番号７に示す。
　配列番号５及び６は、それぞれ、緑膿菌(PAK)由来の野生型フラジェリンFlaAの塩基配列及びアミノ酸配列を示す。野生型フラジェリンFliCとFlaAのアミノ酸配列の相同性は約60%である。配列番号２のアミノ酸配列の９０番目のアルギニンは、配列番号６のアミノ酸配列の９０番目のアルギニンに相当すると考えられる。配列番号２のアミノ酸配列の1番目のアラニン、５８番目のセリンは、それぞれ、配列番号６のアミノ酸配列の1番目のアラニン、44番目のアスパラギンに相当すると考えられる。従って、配列番号６のアミノ酸配列の９０番目のアルギニンが他のアミノ酸（例えば、アラニン、グリシンなど）に置換され、配列番号６のアミノ酸配列中の1番目のアミノ酸から44番目のアミノ酸までの44個のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列を有するフラジェリン変異体も本発明に含まれる。
　本発明は、野生型フラジェリンのToll様受容体５活性化領域における少なくとも１つの部位に変異が導入され、Toll様受容体５活性化能が減弱したフラジェリン変異体に、さらに、抗原としての安定性を高めるような変異が導入されているフラジェリン変異体をコードするＤＮＡを含有するベクターを提供する。
　本発明のフラジェリン変異体をコードするＤＮＡを含有する組換えベクターは、公知の方法（例えば、Molecular Cloning２nd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989に記載の方法）により、本発明のフラジェリン変異体をコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入することにより得られる。
　発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３， pGACAG）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，アデノウイルス、ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫病原ウイルスなどを用いることができる。
　発現ベクターには、プロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、SV40複製オリジンなどを付加してもよい。
　また、発現ベクターは、融合タンパク質発現ベクターであってもよい。種々の融合タンパク質発現ベクターが市販されており、pGEXシリーズ（アマシャムファルマシアバイオテク社）、pET CBD Fusion System 34b-38b（Novagen社）、pET Dsb Fusion Systems 39b and 40b（Novagen社）、pET GST Fusion System 41 and 42（Novagen社）などを例示することができる。
　組換えベクターを遺伝子ワクチン（プラスミドワクチン・ウイルスベクターワクチン）として使用する場合には、すでに遺伝子ワクチン用に開発したpGACAGプラスミドベクターに標的遺伝子を導入しプラスミドワクチンを作製するとよい。
　また、本発明は、野生型フラジェリンのToll様受容体５活性化領域における少なくとも１つの部位に変異が導入され、Toll様受容体５活性化能が減弱したフラジェリン変異体に、さらに、抗原としての安定性を高めるような変異が導入されているフラジェリン変異体をコードするＤＮＡを含有するベクターを含む形質転換体を提供する。
　本発明のフラジェリン変異体をコードするＤＮＡを含有する組換えベクターを宿主に導入することにより、形質転換体を得ることができる。
　宿主としては、細菌細胞（例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、枯草菌など）、真菌細胞（例えば、酵母、アスペルギルスなど）、昆虫細胞（例えば、S2細胞、Sf細胞など）、動物細胞（例えば、CHO細胞、COS細胞、HeLa細胞、C127細胞、3T3細胞、BHK細胞、HEK293細胞など）、植物細胞などを例示することができる。
　組換えベクターを宿主に導入するには、Molecular Cloning２nd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989に記載の方法（例えば、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン法、トランスフェクション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、エレクロトポレーション法、形質導入法、スクレープローディング法、ショットガン法など）または感染により行うことができる。
　形質転換体を培地で培養し、培養物からフラジェリン変異体を採取することができる。フラジェリン変異体が培地に分泌される場合には、培地を回収し、その培地からフラジェリン変異体を分離し、精製すればよい。フラジェリン変異体が形質転換された細胞内に産生される場合には、その細胞を溶解し、その溶解物からフラジェリン変異体を分離し、精製すればよい。
　フラジェリン変異体が別のタンパク質（タグとして機能する）との融合タンパク質の形態で発現される場合には、融合タンパク質を分離及び精製した後に、FactorXaや酵素（エンテロキナーゼ）処理をすることにより、別のタンパク質を切断し、目的とするフラジェリン変異体を得ることができる。
　フラジェリン変異体の分離及び精製は、公知の方法により行うことができる。公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度の差を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
　本発明は、野生型フラジェリンのToll様受容体５活性化領域における少なくとも１つの部位に変異が導入され、Toll様受容体５活性化能が減弱したフラジェリン変異体に、さらに、抗原としての安定性を高めるような変異が導入されているフラジェリン変異体、前記フラジェリン変異体をコードするDNA又は前記DNAを含有するベクターを含むワクチンも提供する。本発明のワクチンは、有鞭毛病原体に対するワクチン、特に緑膿菌に対して有効である。本発明のワクチンは、のう胞性線維症感染予防、易感染性患者（例えば、免疫抑制薬使用患者、抗がん薬使用患者、慢性閉塞性肺疾患(COPD)患者、重度のやけど患者など）への感染予防、院内感染予防などに有効である。
　フラジェリン変異体、前記フラジェリン変異体をコードするDNA及び前記DNAを含有するベクターは前述の通りである。
　フラジェリン変異体、前記フラジェリン変異体をコードするDNA又は前記DNAを含有するベクターは、例えば、PBSなどの緩衝液、生理食塩水、滅菌水などに溶解し、必要に応じてフィルターなどで濾過滅菌した後、注射により被験者に投与されるとよい。また、この溶液には、添加剤（例えば、不活化剤、保存剤、アジュバント、乳化剤など）などを添加してもよい。フラジェリン変異体は、静脈、筋肉、腹腔、皮下、皮内などに投与することができ、また、経鼻、経口投与してもよい。
　フラジェリン変異体、前記フラジェリン変異体をコードするDNA又は前記DNAを含有するベクターの投与量、投与の回数及び頻度は、被験者の症状、年齢、体重、投与方法、投与形態などにより異なるが、例えば、通常、成人一人当たり０．０１～１mg/kg体重、好ましくは、０．０１～０．１mg/kg体重のフラジェリン変異体を、少なくとも１回、所望の効果が持続する頻度で投与するとよい。フラジェリン変異体をコードするDNA又は前記DNAを含有するベクターを投与する場合には、例えば、通常、成人一人当たり１～１００mg、好ましくは、１～１０mgの投与量で少なくとも１回、所望の効果が持続する頻度で投与するとよい。ベクターがウイルスの場合には、成人一人当たり１０９～１０１２ウイルス粒子、好ましくは１０１１～１０１２ウイルス粒子の投与量で少なくとも１回、所望の効果が持続する頻度で投与するとよい。
　プラスミドワクチンはエンドトキシン除去した後投与するとよい。
　筋肉内投与後エレクトロポレーション法で細胞内に導入する方法やリポソームなどトランスフェクション増強剤との複合体を作製後投与する方法によりワクチン効果を高める方法も併用するとよい。
　本発明は、本発明のフラジェリン変異体に対して誘導された抗体も提供する。本発明の抗体は多種多様の緑膿菌に対して効果的に反応することができる。
　本発明の抗体は、慣用のプロトコールを用いて、抗原若しくは抗原エピトープ又はそれらをコードするDNAを動物に投与することにより得られる。
　本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体のいずれであってもよい。
　ポリクローナル抗体を作製するには、公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質抗原またはこれを発現するプラスミドDNA）を動物に投与（免疫）し、該免疫動物からタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２～６週毎に１回ずつ、計約２～１０回程度行なわれる。ポリクローナル抗体は、免疫動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。ポリクローナル抗体の分離精製は、免疫グロブリンの分離精製法（例えば、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法）に従って行なうことができる。ポリクローナル抗体としては、血清から精製したIgG画分が好ましい。
　モノクローナル抗体は、Nature (1975) 256: 495、Science (1980) 208: 692-に記載されている、G. Koehler及びC. Milsteinのハイブリドーマ法により作製することができる。すなわち、動物を免疫した後、免疫動物の脾臓から抗体産生細胞を単離し、これを骨髄腫細胞と融合させることによりモノクローナル抗体産生細胞を調製する。多様な緑膿菌株由来のフラジェリンに反応し、これら緑膿菌株に対し広いスペクトラムで感染防御的に作用するモノクローナル抗体を産生する細胞系を単離するとよい。この細胞系を培養し、培養物から所望のモノクローナル抗体を取得することができる。モノクローナル抗体の精製は、上記の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
　一本鎖抗体を作製する技法は、米国特許第4,946,778号に記載されている。
　ヒト化抗体を作製する技法は、Biotechnology 10, 1121-, 1992; Biotechnology 10, 169-, 1992に記載されている。
　本発明の抗体は、鞭毛を有する細菌、特に、緑膿菌に対する感染症の治療に利用することができる。本発明は、この抗体を含む医薬組成物も包含する。この医薬の利点は、宿主の免疫系が活性化され、十分に高い防御レベルに達するまで待つ必要がなく、即座に効果が期待できることである。特に、感染が成立している場合や疾患が成立している場合に、抗体を投与すると、病原体や病原体が生産する毒素から患者を即座に回復させることができる。例えば、本発明の抗体をPBSなどの緩衝液、生理食塩水、滅菌水などに溶解し、必要に応じてフィルターなどで濾過滅菌した後、注射により被験者に投与するとよい。また、この溶液には、添加剤（例えば、着色剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、溶解補助剤、安定化剤、保存剤、酸化防止剤、緩衝剤、等張化剤など）などを添加してもよい。投与経路としては、静脈、筋肉、腹腔、皮下、皮内投与などが可能であり、また、経鼻、経口投与してもよい。
　本発明の抗体の投与量、投与の回数及び頻度は、被験者の症状、年齢、体重、投与方法、投与形態などにより異なるが、例えば、通常、成人一人当たり1,000～10,000 mg/kg体重、好ましくは、　2,000～5,000 mg/kg体重の抗体を、少なくとも１回、所望の効果が持続する頻度で投与するとよい。
　以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
略語の説明：
FliC R90A FL：緑膿菌(PA01)由来の野生型フラジェリンFliCのアミノ酸配列中、90番目のアルギニンがアラニンに置換された変異体（全長タンパク）(図２参照)。
FliC R90A del(59-443)：FliC R90A FLのN末端領域およびC末端領域をdeleteした54-443aa領域のみのdeletion変異体（図２参照）。
〔実施例１〕
FliC R90A proteinは不安定である（分解されやすい）（図１）
　pGEX6T-2ベクター（GE Healthcare Bioscience）に緑膿菌PAO1由来FliC R90A ORFを挿入し、GSTとFliC R90A融合タンパク発現プラスミドpGEX6T-2-FliC R90Aを作製した（Saha, S., Takeshita F., et al. J Immunol 179:1147 2007）。pGEX6T-2-FliC R90Aで形質転換したBL21株を、8時間培養後、Overnight Expression System (Novagen)に添加し、30°Cにて24時間振とう培養した。BugBuster extraction reagent (Novagen)にて菌体を可溶化し、上清を回収した（lysate）。上清からGSTカラム (GSTrap FF, GE Healthcare Bioscience)を用いて、GST-FliC R90Aタンパクを吸着後、トロンビンを作用させ、溶出した（column）。サンプルを濃縮後、4°Cもしくは-30°Cで保存した。サンプルをSDS-PAGEにて分画後、CBB染色により解析した。*は予想標的タンパク分画を示す。この結果から、大腸菌で作製したFliC R90Aタンパク（予想分子量～55 kDa）は、非常に不安定であり、4°C保存でも～40 kDaのタンパクまで分解されることがあきらかとなった。
FliC R90A proteinは不安定である（N末端1-58とC末端444-487は分解されやすい）（図２）
（図２左）前記調製したサンプルを4°Cで保存後、SDS-PAGEにて分画、ゲルから標的タンパクを回収・消化し、TOF-MS解析した。その結果、FliCR 90Aの59-443 aa領域のみとなっていることが判明した。示してあるのは、FliC R90Aのアミノ酸配列で、シェードがかかった領域は、鞭毛構造において内側に位置すると予想されるaヘリックス領域、枠で囲まれた領域は消化されたと考えられる領域。
（図２右）CMVプロモーター依存的な発現ベクター（pGA）（Saha, S., Takeshita F., et al. J Immunol 179:1147 2007）に、PCRで増幅したFliC R90A全長ORFまたは59-443 aa領域を挿入し、CMV-FliC R90A FLおよびCMV-FliC R90A del (59-443)を作製した。HEK293細胞に、これらプラスミドをトランスフェクションし、48時間後にcell lysateを調製し、SDS-PAGEにて分画後PVDF膜に転写した。BALB/cマウスに、pGACAG FliC R90A DNAワクチンで免疫し、採取した血清からIgG分画を精製して調製した抗FliCR90A抗体（Saha, S., Takeshita F., et al. J Immunol 179:1147 2007）を用いて免疫ブロッティング法により標的タンパク発現を解析した。CMV-FliCR90A FLで発現されたFliC R90Aタンパクは細胞内で分解され、様々な長さの分解産物が検出された。CMV-FliC R90A del (59-443)で発現されたタンパクは、単一のバンドとして検出され、顕著な分解産物は認められなかった。このことから、FliC R90A del (59-443)は細胞内で効率よく発現し、安定な抗原であることがあきらかとなった。
FliC R90A-del (59-443) DNAワクチンは特異的抗体価を強く誘導する（図３）
　BALB/cマウス、オス8週齢に、1匹あたり100 ugのpGAベクター、CMV-FliC  R90A FLまたはCMV-FliC R90A del (59-443)を筋注エレクトロポレーション法で免疫した（n = 20）。4週間後にブースター免疫を行い、その2週後に血清を採取し、リコンビナントFliC R 90Aタンパクを標的としたELISA法により、抗原特異的IgG2a抗体価を測定した（Saha, S., Takeshita F., et al. J Immunol 179:1147 2007）。横軸に希釈倍率、縦軸に吸光度（O.D. = 405 nm）を示す。CMV-FliC R90A del (59-443)で免疫することにより、従来型のワクチンCMV-FliC R90A FLに比べて、優位に高い抗FliC R90A特異的抗体価を誘導できることがあきらかとなった。＊、p < 0.05。
FliC R90A-del (59-443) DNAワクチンは緑膿菌に対する感染防御を強く誘導する（図４）
　前記免疫したマウスに、最終免疫より2週間後、緑膿菌PAO1株を経鼻感染させ（2 LD50（上段）または4 LD50（下段）量、それぞれn = 10）、その後のマウスの生存率を観察した。CMV-FliC R90A del (59-443)またはCMV-FliC R90A FLで免疫した群において、感染防御効果が認められた。しかし、高い感染価（4 LD50）でチャレンジした実験においては、CMV-FliC R90A del (59-443)で免疫した群において、CMV-FliC R90A FLで免疫した群にくらべて高い感染防御効果を認めた。このことから、新規CMV-FliC R90A del (59-443)ワクチンは、従来型のCMV-FliC R90A FLワクチンに比べて、効果的に緑膿菌に対する防御的免疫応答を惹起でき得ることがあきらかとなった。
結論
　FliC R90Aのdeletion変異体FliC R90A-del (59-443)DNAワクチンは、接種動物細胞内で効率よく発現され、高い抗原特異的抗体価と緑膿菌に対する効果的感染防御応答を誘導することから、改良型ワクチン抗原として応用の可能性が示唆された。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
　本発明のワクチンは、有鞭毛病検体、例えば、緑膿菌の感染予防に利用することができる。
＜配列番号１＞
配列番号１は、緑膿菌(PA01)由来の野生型フラジェリンFliCの塩基配列を示す。
＜配列番号２＞
配列番号２は、緑膿菌(PA01)由来の野生型フラジェリンFliCのアミノ酸配列を示す。
＜配列番号３＞
配列番号３は、変異型フラジェリンFliC R90Aの塩基配列を示す。
＜配列番号４＞
配列番号４は、変異型フラジェリンFliC R90Aのアミノ酸配列を示す。
＜配列番号５＞
配列番号５は、緑膿菌(PAK)由来の野生型フラジェリンFlaAの塩基配列を示す。
＜配列番号６＞
配列番号６は、緑膿菌(PAK)由来の野生型フラジェリンFlaAのアミノ酸配列を示す。
＜配列番号７＞
配列番号７は、deletion変異型フラジェリンFliC R90A del(59-443)の塩基配列を示す。
＜配列番号８＞
配列番号８は、deletion変異型フラジェリンFliC R90A del(59-443)のアミノ酸配列を示す。
Holder IA. Pseudomonas immunotherapy: a historical overview. Vaccine2004;22(7):831-9 J. Immunol.,179:1147, 2007
国際公開第WO2008/010478号パンフレット

Claims (26)

  1. 野生型フラジェリンのToll様受容体５活性化領域における少なくとも１つの部位に変異が導入され、Toll様受容体５活性化能が減弱したフラジェリン変異体に、さらに、抗原としての安定性を高めるような変異が導入されているフラジェリン変異体。
  2. 野生型フラジェリンが有鞭毛病原体由来である請求項１記載のフラジェリン変異体。
  3. 有鞭毛病原体が緑膿菌である請求項２記載のフラジェリン変異体。
  4. 野生型フラジェリンがフラジェリンFlaA又はFliCである請求項１～３のいずれかに記載のフラジェリン変異体。
  5. 抗原としての安定性を高めるような変異が、少なくとも1個のアミノ酸の欠失である請求項１～４のいずれかに記載のフラジェリン変異体。
  6. 欠失するアミノ酸がN末端側及び／又はC末端側に位置する請求項５記載のフラジェリン変異体。
  7. 野生型フラジェリンが配列番号２のアミノ酸配列を有する野生型フラジェリンFliCであり、Toll様受容体５活性化領域が配列番号２のアミノ酸配列中の71番目のアミノ酸から97番目までのアミノ酸の領域を含む請求項４～６のいずれかに記載のフラジェリン変異体。
  8. 配列番号２のアミノ酸配列における90番目のアルギニンが他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を有する請求項７記載のフラジェリン変異体。
  9. 他のアミノ酸がアラニン又はグリシンである請求項８記載のフラジェリン変異体。
  10. 抗原としての安定性を高めるような変異が、配列番号２のアミノ酸配列中の1番目のアミノ酸から58番目のアミノ酸までの少なくとも１個のアミノ酸の欠失である請求項７～９のいずれかに記載のフラジェリン変異体。
  11. 抗原としての安定性を高めるような変異が、配列番号２のアミノ酸配列中の444番目のアミノ酸から487番目のアミノ酸までの少なくとも１個のアミノ酸の欠失である請求項７～１０のいずれかに記載のフラジェリン変異体。
  12. 以下の(a)、(b)若しくは(c)のタンパク質である請求項１記載のフラジェリン変異体。
    (a)配列番号２のアミノ酸配列において、90番目のアルギニンがアラニンに置換され、1番目のアミノ酸から58番目のアミノ酸までの58個のアミノ酸及び444番目のアミノ酸から487番目のアミノ酸までの44個のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列を有するフラジェリン変異体タンパク質
    (b)(a)のタンパク質のアミノ酸配列において、90番目のアラニン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつToll様受容体５活性化能が配列番号２のアミノ酸配列を有する野生型フラジェリンFliCよりも減弱し、さらに、抗原としての安定性を高めたフラジェリン変異体タンパク質
    (c)(a)のタンパク質をコードするDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされ、かつToll様受容体５活性化能が配列番号２のアミノ酸配列を有する野生型フラジェリンFliCよりも減弱し、さらに、抗原としての安定性を高めたフラジェリン変異体タンパク質
  13. (a)のタンパク質をコードするDNAが配列番号７の塩基配列を有する請求項１２記載のフラジェリン変異体。
  14. 抗原特異的抗体価及び/又は感染防御をより強く誘導できる請求項１～１３のいずれかに記載のフラジェリン変異体。
  15. 以下の(a)、(b1)若しくは(c1)のタンパク質であるフラジェリン変異体。
    (a)配列番号２のアミノ酸配列において、90番目のアルギニンがアラニンに置換され、1番目のアミノ酸から58番目のアミノ酸までの58個のアミノ酸及び444番目のアミノ酸から487番目のアミノ酸までの44個のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列を有するフラジェリン変異体タンパク質
    (b1)(a)のタンパク質のアミノ酸配列において、90番目のアラニン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ抗原特異的抗体価及び/又は感染防御をより強く誘導できるフラジェリン変異体タンパク質
    (c1)(a)のタンパク質をコードするDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされ、かつ抗原特異的抗体価及び/又は感染防御をより強く誘導できるフラジェリン変異体タンパク質
  16. (a)のタンパク質をコードするDNAが配列番号７の塩基配列を有する請求項１５記載のフラジェリン変異体。
  17. 請求項１～１６のいずれかに記載のフラジェリン変異体をコードするＤＮＡ。
  18. 請求項１７記載のＤＮＡを含有するベクター。
  19. 請求項１８記載のベクターを含む形質転換体。
  20. 請求項１９記載の形質転換体を培養することを含む、フラジェリン変異体の製造方法。
  21. 請求項１～１６のいずれかに記載のフラジェリン変異体、請求項１７記載のDNA又は請求項１８記載のベクターを含むワクチン。
  22. 有鞭毛病原体に対するワクチンである請求項２１記載のワクチン。
  23. 有鞭毛病原体が緑膿菌である請求項２２記載のワクチン。
  24. のう胞性繊維症感染予防及び／又は易感染性患者への感染予防のために用いられる請求項２１～２３のいずれかに記載のワクチン。
  25. 請求項１～１６のいずれかに記載のフラジェリン変異体に対して誘導された抗体。
  26. 請求項２５記載の抗体を含む医薬組成物。
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