WO2010146215A1 - Composición para la prevención o el tratamiento de procesos patólogicos relacionados con la angiogénesis y proliferación celular - Google Patents

Composición para la prevención o el tratamiento de procesos patólogicos relacionados con la angiogénesis y proliferación celular Download PDF

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José Manuel GARRIDO JIMÉNEZ
Indalecio SÁNCHEZ-MONTESINOS GARCÍA
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Universidad de Granada
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Fundacion Para La Investigacion Biosanitaria De Andalucia Oriental
Universidad de Granada
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    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca

Definitions

  • the present invention is within the field of biomedicine. Specifically, it refers to a composition comprising a statin and an activating agent of the vascular endothelium and its use for the preparation of a medicament, preferably, for the prevention or treatment of pathological processes associated with abnormal cell proliferation and pathological or unwanted angiogenesis such as cancer or arteriosclerosis.
  • Angiogenesis is the biological process, thanks to which blood vessels, ex novo, are generated from previous vascular structures. For this, it is necessary to maintain a synergistic coupling of the mechanisms of proliferation and morpho-functional organization.
  • the processes involved in the mechanisms of angiogenesis and vasculogenesis represent a fundamental role both in healing phenomena, as in the development of neoplasms or in diabetic retinopathy (Scholz et al. 2001. Angiogenesis; 4: 246-257; Shukla et al. 2007. Ann Thorac Surg; 84: 43-49; Tang et al. 2006. EurJ Cardiothorac Surg; 30: 353-360).
  • restenosis phenomena can occur after endovascular revascularization procedures (also used in peripheral arteriopathies) due to myo-endothelial proliferation phenomena or thrombosis phenomena of the treated arterial segment.
  • endovascular revascularization procedures also used in peripheral arteriopathies
  • myo-endothelial proliferation phenomena or thrombosis phenomena of the treated arterial segment have been tried to solve by multiple strategies, such as the application of stents that partially reduce the stenosis (reduce the scarring phenomena of elastic retraction), but that do not prevent restenosis due to myo-endothelial proliferation.
  • the latter is to avoid by other mechanisms such as pharmacological treatments (WO / 2003/026492).
  • Another pathology that is characterized by pathological or unwanted angiogenesis is cancer.
  • the neovascularization of the tumor allows nutrients to reach the proliferative cells of the tumor, allowing it to maintain its proliferative rate. It has been shown that the inhibition of this neovascularization causes the arrest in the development of the tumor.
  • the neo-vessels formed have an altered structure and function, with obvious distortions in the endothelial permeability barrier, facilitating tumor dissemination and symptomatology added to the edematization of tissues.
  • Statins are widely prescribed drugs for reduction of cholesterol in patients with hypercholesterolemia or cardiovascular diseases (Liao et al. 2004. Ann Rev Pharmacol Toxicol; 45: 89-118). They act primarily through the competitive inhibition of 3- hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) reductase, a limiting enzyme in the process of cholesterol synthesis. These statins also have other effects not dependent on the reduction of cholesterol levels (pleiotropic effects) such as the improvement of cardiovascular functionality (O'Driscoll et al. 1997. Circulation; 95: 1126-1131), the decrease in expression of proinflammatory cytokines (Masón et al. 2004. Circulation; 109: 1134-1141), or their effects on tumor growth and differentiation (Wong et al. 2002. Leukemia; 16; 508-519).
  • HMG-CoA 3- hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A
  • statins can reduce cancer death in patients with long treatments for cardiovascular diseases (Pedersen et al. 2000. Am J Cardiol; 86: 257-262). They also have the ability to inhibit tumor growth and activate the apoptosis of cancer cells (Causal et al. 2003. Endothelium; 10: 49-58) Cycle inhibition is produced by multiple dependent lineage mechanisms, such as through Ia inhibition of the activity of the cyclin dependent kinase-2 (CDK-2) together with the activation of CDK inhibitors.
  • CDK-2 cyclin dependent kinase-2
  • Apoptosis occurs preferentially in proliferative cells and occurs through the control of various signaling pathways, such as the activation of caspases, the inhibition of the bcl-2 antiapoptotic protein, or the Raf / MEK / ERK signaling pathway (Agarwal et al. 1999. Clin Cancer Res; 5: 2223-2299; Wu et al. 2004. Cancer Res; 64: 6461-6468). Furthermore, it has been demonstrated that the ability to inhibit protein geranylgeranylation is an indispensable element to produce statin death in acute myeloid leukemia cells (Xia et al. 2001. Leukemia; 15: 1398-1407).
  • statins are capable of inhibiting tumor growth by the overexpression of the p21 protein (Ukomadu et al. 2003. J Biol Chem; 278: 43586-43594).
  • Other effect anticancer that has been demonstrated by statins is the inhibition of the function of the epidermal growth factor receptor (EGFR) preventing the development of some lung tumors (Mantha et al. 2005. Clin Cancer Res; 11: 2398-2407 ).
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • statins may imply a marked decrease in the synthesis of VEGF-A, its specific FLT-1 receptor, as well as VEGF-C (Jones et al. 1999. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol; 276: 1345-1355).
  • statins have been shown to have a proangiogenic effect when administered at concentrations within the nanomolar or picomolar range, while at high concentrations, within the micromolar range, they demonstrate a clearly antiangiogenic effect (Dulak et al. 2005. Endothelium; 12: 233-241; Frick et al. 2003. Atherosclerosis; 170: 229-236).
  • LPA lysophosphatidic acid
  • angiogenesis 11: 301-310. This factor also induces the expression of VEGF-C, which promotes neovascularization (Lin et al. 2008. Ce // Signal; 20: 1804-1814). All this is endorsed by the fact that LPA receptor antagonists are being used as agents for the prevention of proliferative or carcinoma-associated diseases (US2008 / 0213274).
  • the modulation of angiogenesis and unwanted proliferation is shown both as a fundamental element when controlling various pathological conditions that, such as the development of solid tumors or arteriosclerosis, require both neovascularization and myo-endothelial proliferation for their development.
  • the present invention relates to a composition
  • a composition comprising a statin and an activating agent of the vascular endothelium and its use for the preparation of a medicament, preferably, for the prevention or treatment of pathological processes associated with angiogenesis and unwanted myo-endothelial proliferation as, for example, cancer or arteriosclerosis.
  • statins such as atorvastatin within the micromolar range to the endothelium, after activation with an endothelial activator such as lysophosphatidic acid, continues to produce the reversion of the endothelium to a physiological state similar to the treatment with the statin in an independent way.
  • This reversal is observed at the gene level, since there is a decrease in proliferative signals induced by lysophosphatidic acid, as well as in the indicative signals of endothelial dysfunction.
  • a first aspect of the invention refers to a composition (hereinafter, composition of the invention) comprising a statin, a salt or an ester thereof, and an endothelial activator.
  • Statins are a family of compounds that inhibit the enzyme 3- hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A (HMG-CoA) reductase. They also stimulate the absorption of cholesterol by the liver, which reduces the levels thereof, as well as triglycerides in the circulating blood.
  • the statin is selected from the list comprising: atorvastatin, fluvastatin, lovastatin, pitavastatin, pravastatin, simvastatin, or rosuvastatin.
  • the statin is atorvastatin.
  • Atorvastatin is a synthetic compound of formula (I). Atorvastatin salts and esters are also known to be used as well.
  • endothelial activator refers to a compound capable of triggering various concrete and recognizable processes in the endothelium called endothelial activation. These effects on endothelial cells generally consist of the overexpression of molecules such as VCAM, ICAM, E-selectin and von Willebrand factor, and a decrease in the production of cAMP. This entails a loss of the barrier function of the endothelium and alterations in the vasomotor tone.
  • endothelial activators are, for example, but not limited to TNF ⁇ , hemodynamic forces, as well as sphingosine-1-phosphate, and its analogues, or lysophosphatidic acid, an analogue or a salt of said acid.
  • the endothelial activator is selected from the list comprising TNF ⁇ , sphingosine-1-phosphate, an analogue thereof, or lysophosphatidic acid, an analogue or a salt of said acid.
  • the endothelial activator is lysophosphatidic acid, an analogue or a salt of said acid.
  • Lysophosphatidic acid of formula (II), is a bioactive phospholipid with activity in various cell types. It induces proliferative effects and cellular morphological changes. It also acts as a mediator in the synthesis processes of membrane phospholipids.
  • lysophosphatidic acid herein includes a family of compounds of formulation 1-acyl, 2-hydroxyl-sn-glycerol-3-phosphate, which have a chain of saturated fatty acids (16: 0, 18: 0) or unsaturated (18: 1, 18: 2, 20: 4).
  • analog refers to a chemical similar to another chemical in structure and / or function.
  • analogs of lysophosphatidic acid may be considered without limitation, saturated, unsaturated or polyunsaturated fatty esters or alkyl ethers.
  • Lysophosphatidic acid analogs can also be considered those compounds in which the phosphate group of lysophosphatidic acid is replaced by compounds of the list comprising, but not limited to, phosphoromimetics such as methylene, phosphonates, methylene phosphonates, phosphothioates, or phosphonothioates. Also similar are those compounds similar to lysophosphatidic acid where the hydroxy groups at positions sn-1 and sn-2 are replaced by fluorine or methoxy groups. Also included are those compounds that replace the O-acyl group in the sn-1 position with an O-alkyl group.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the composition of the invention for the preparation of a medicament.
  • composition of the present invention can be used, although not limited, to normalize the endothelial function in processes of angiogenesis, unwanted or abnormal cell proliferation (such as myo-endothelial proliferation in atherosclerosis) or in situations of dysfunction of the endothelial barrier . Therefore, a preferred embodiment of this aspect of the invention refers to the use of the composition of the invention for the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of a pathological process associated with angiogenesis, cell proliferation (myo- endothelial, etc.) abnormal or unwanted, or a dysfunction of the endothelial barrier.
  • abnormal myo-endothelial angiogenesis and proliferation or "unwanted” that vascular development that differs structurally, morphologically or functionally from the physiological development of the vessels and that is associated a pathological process This abnormal development leads to deterioration of normal tissue functions.
  • pathological processes related to the abnormal development of angiogenesis and myo-endothelial proliferation are many pathological processes related to the abnormal development of angiogenesis and myo-endothelial proliferation.
  • Endothelial barrier dysfunction means that situation in which the vascular endothelium partially or totally loses its functionality in maintaining the integrity of the vessels, causing an alteration in the permeability of the vessels. It is also characterized by an increase in vasoconstrictor signals such as the release of angiotensin Il or the increase in the expression of endothelin-1, and by the reduction of vasodilators such as the production of nitric oxide (NO) due to the decrease in expression and activity of the enzyme endothelial nitric oxide synthase (eNOS). It is also accompanied by the generation of a proinflammatory, proliferative and procoagulatory environment that favors atherogenesis.
  • vasoconstrictor signals such as the release of angiotensin Il or the increase in the expression of endothelin-1
  • vasodilators such as the production of nitric oxide (NO) due to the decrease in expression and activity of the enzyme endothelial nitric oxide synthase
  • a more preferred embodiment of this aspect of the invention refers to the use of the composition for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of a pathological process associated with angiogenesis, cell proliferation (such as myo-endothelial proliferation) abnormal or unwanted, or to a dysfunction of the endothelial barrier, selected from the list that includes arteriosclerosis, cancer, macular degeneration, neovascular glaucoma, endometriosis, rheumatoid arthritis, psoriasis, ocular herpes, trachoma, corneal graft neovascularization, viral interstitial keratitis, keratoconjunctivitis microbial, hypertrophic telangiectasia, vascular adhesions, angiofibroma, acne rosacea, retrolental fibroplasia, primary or secondary pulmonary hypertension, shock lung, systemic inflammatory response syndrome, fibrosis, proliferative vitreoretinopathy, leukemia,
  • Atherosclerosis which is characterized by thickening and dysfunction of the vessel walls.
  • the most common and most serious event is the formation of the atheroma plaque characterized by the accumulation of lipids at the subendothelial level. This event has been associated in a multitude of cases with myocardial, cerebral, musculoskeletal or splanchnic ischemia, so the decrease in plaque would be a desirable event.
  • the instability of the formed plaque can cause the release of highly thrombogenic lipids that produce acute cardiovascular events (myocardial infarction, acute ischemia of the lower limbs, acute splanchnic ischemia, cerebral infarctions, etc.).
  • the treatment with statins has shown a reducing effect on the formation of the atheroma plate, as well as stabilizing the plate.
  • the present combination could be used for example, but not limited to, for the prevention of the treatment of arteriosclerotic plaques, ischemic heart disease, strokes, ischemic colitis, aortic aneurysms, restenosis vascular, hypertrophic scarring or scleroderma, peripheral arteriopathies, etc.
  • vascular structures are also found.
  • the development of vascular structures is of vital importance for tumor progression. Due to the rapid tumor growth and the need of the vasculature to develop at said rate, the developed vessels have dysfunctions and there is no proper development of the endothelial barrier. In this sense, treatment with statins at high concentrations together with the addition of the endothelial activator would cause a stop of the vascular growth and therefore the arrest of the tumor growth.
  • the refunctionalization of vascular tissue allows the recovery of the endothelial barrier preventing the spread of tumor cells, and therefore the metastasis.
  • the present composition would be useful for the prevention and treatment of both solid tumors, such as tumors carried by the blood, such as, but not limited to, childhood bronchial adenomas, infantile cerebellar astrocytoma, cerebral astrocytoma and infantile malignant glioma, pleuropulmonary blastoma, Burkitt lymphoma, childhood colorectal cancer, anus cancer, head and neck cancer, nasal and paranasal sinus cancer, oral and lip cavity cancer, renal cell cancer, cervical cancer, colon cancer, cancer cervix, endometrial cancer, esophageal cancer, stomach cancer (gastric), salivary gland cancer, adult liver cancer (primary), hypopharyngeal cancer, small intestine cancer, laryngeal cancer, pathway cancer extrahepatic biliary, breast (breast) cancer, nasopharyngeal cancer, intraocular melanoma, eye cancer, retinoblastoma, oropharyngeal cancer,
  • An even more preferred embodiment of this aspect of the invention refers to the use of the composition for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of a pathological process associated with angiogenesis, abnormal or unwanted myo-endothelial proliferation, or processes pathological conditions associated with a dysfunction of the endothelial barrier, selected from the list that includes arteriosclerosis, restenosis of cardiovascular grafts, endovascular procedures, tumors of the Central Nervous System (CNS), solid tumors, hematopoietic tumors, pulmonary hypertension, lung shock or syndrome of systemic inflammatory response.
  • a pathological process associated with angiogenesis abnormal or unwanted myo-endothelial proliferation
  • pathological conditions associated with a dysfunction of the endothelial barrier selected from the list that includes arteriosclerosis, restenosis of cardiovascular grafts, endovascular procedures, tumors of the Central Nervous System (CNS), solid tumors, hematopoietic tumors, pulmonary hypertension, lung shock or syndrome of systemic inflammatory response.
  • a preferred embodiment of this aspect of the invention refers to the use of the composition in a form suitable for local administration.
  • statin Treatment of the endothelium with activators causes a characteristic response. This response is that which allows the statin to exert its physiological normalization effects avoiding the proapoptotic effect and producing an inhibition of myo-endothelial proliferation. Therefore, the use of statin in isolation on an already activated endothelium would exert the same effects as on an endothelium treated with an endothelial activator. Therefore, in another aspect of the invention the use of a statin, a salt or an ester thereof is described for the prevention and / or treatment of a pathological process associated with angiogenesis and / or abnormal myo-endothelial proliferation or unwanted when endothelial cells are activated (abnormal tumor neovases).
  • a preferred embodiment of this aspect of the invention refers to the use of a statin, salt or ester thereof for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of a pathological process associated with angiogenesis, abnormal myo-endothelial proliferation or unwanted, or a dysfunction of the endothelial barrier, selected from the list that includes but is not limited to arteriosclerosis, cancer, macular degeneration, neovascular glaucoma, endometriosis, rheumatoid arthritis, psoriasis, ocular herpes, trachoma, corneal graft neovascularization, keratitis viral interstitial, microbial keratoconjunctivitis, hypertrophic telangiectasia, vascular adhesions, angiofibroma, acne rosacea, retrolental fibroplasia, primary or secondary pulmonary hypertension, shock lung, systemic inflammatory response syndrome, fibrosis, proliferative vitreoretinopathy
  • a more preferred embodiment of this aspect of the invention refers to the use of the statin, salt or ester thereof for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of a pathological process associated with angiogenesis, abnormal myo-endothelial proliferation or unwanted, or pathological processes associated with a dysfunction of the endothelial barrier, selected from the list that includes arteriosclerosis, restenosis of cardiovascular grafts, endovascular procedures, tumors of the Central Nervous System (CNS), solid tumors, hematopoietic tumors, pulmonary hypertension, shock lung or systemic inflammatory response syndrome.
  • An even more preferred embodiment of this aspect of the invention refers to the use of the statin, salt or ester thereof in a form suitable for local administration.
  • endothelial activator and the statin are administered so that the endothelial activator acts on the tissue before the statin since in this way the best results are obtained. Therefore, the combined preparation of a vascular endothelial activator and a statin separately, sequentially would be useful in the preparation of a medicament.
  • Another aspect of the invention relates to a combined preparation (hereinafter, combined preparation of the invention) for sequential use comprising:
  • the statin is selected from the list comprising: atorvastatin, fluvastatin, lovastatin, pitavastatin, pravastatin, simvastatin, and rosuvastatin.
  • the selected statin is atorvastatin.
  • endothelial activators are, although not limited to, TNF ⁇ sphingosine-1-phosphate, an analogue thereof, or lysophosphatidic acid, an analogue or a salt of said acid.
  • the endothelial activator is lysophosphatidic acid, an analogue or a salt thereof.
  • combined preparation or also called “juxtaposition”, herein, means that the components of the combined preparation need not be present as a union, for example, in a composition, in order to be available for separate application. or sequential
  • juxtaposed implies that it is not necessarily a true combination, in view of the physical separation of the components.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the combined preparation of the invention for the preparation of a medicament.
  • the combined preparation of the present invention can be used, although not limited, to normalize the endothelial function in processes of angiogenesis, unwanted or abnormal myo-endothelial proliferation, or of dysfunction of the endothelial barrier. Therefore, a preferred embodiment of this aspect of the invention refers to the use of the combined preparation of the invention for the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of a pathological process associated with angiogenesis and / or my proliferation. - abnormal or unwanted endothelial.
  • a more preferred embodiment of this aspect of the invention refers to the use of the combined preparation of the invention for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of a pathological process associated with angiogenesis and / or unwanted myo-endothelial proliferation, selected from the list comprising, for example, but not limited to, arteriosclerosis, cancer, macular degeneration, neovascular glaucoma, endometriosis, rheumatoid arthritis, psoriasis, ocular herpes, trachoma, corneal graft neovascularization, viral interstitial keratitis, microbial keratoconjunctivitis, hypertrophic telangiectasia , vascular adhesions, angiofibroma, acne rosacea, retrolental fibroplasia, Primary or secondary pulmonary hypertension, shock lung, systemic inflammatory response syndrome, fibrosis, proliferative vitreoretinopathy, leukemia, ulcerative colitis,
  • An even more preferred embodiment of this aspect of the invention refers to the use of the combined preparation for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of a pathological process associated with angiogenesis, abnormal or unwanted myo-endothelial proliferation or a endothelial barrier dysfunction, selected from the list that includes arteriosclerosis, restenosis of cardiovascular grafts and / or endovascular procedures, tumors of the Central Nervous System (CNS), solid tumors, hematopoietic tumors, pulmonary hypertension, shock lung or inflammatory response syndrome systemic
  • a preferred embodiment of this aspect of the invention refers to the use of the combined preparation in a form suitable for local administration.
  • Another aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition comprising the composition of the invention.
  • Another aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition comprising the combined preparation of the invention.
  • the pharmaceutical composition further comprises a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a more preferred embodiment of this aspect of the invention refers to a pharmaceutical composition comprising the composition of the invention and, in addition, together with a pharmaceutically acceptable carrier, another active ingredient.
  • a more preferred embodiment of this aspect of the invention refers to a pharmaceutical composition comprising the combined preparation of the invention and, in addition, together with a pharmaceutically acceptable carrier, another active ingredient.
  • compositions of the present invention can be formulated for administration to an animal, and more preferably to a mammal, including man, in a variety of ways known in the state of the art.
  • they can be, without limitation, in aqueous or non-aqueous solutions, in emulsions or in suspensions.
  • non-aqueous solutions are, for example, but not limited to, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils, such as olive oil, or injectable organic esters, such as ethyl oleate.
  • aqueous solutions are, for example, but not limited to, water, alcoholic solutions in water, or saline media.
  • Aqueous solutions may be buffered or not, and may have additional active or inactive components.
  • Additional components include salts to modulate the ionic strength, preservatives including, but not limited to, antimicrobial agents, antioxidants, chelators, or the like, or nutrients, including glucose, dextrose, vitamins or minerals.
  • preservatives including, but not limited to, antimicrobial agents, antioxidants, chelators, or the like, or nutrients, including glucose, dextrose, vitamins or minerals.
  • nutrients including glucose, dextrose, vitamins or minerals.
  • the compositions can be prepared for administration in solid form.
  • compositions may be combined with various inert carriers or excipients, including but not limited to: binders, such as microcrystalline cellulose, gum tragacanth, or gelatin; excipients, such as starch or lactose; dispersing agents, such as alginic acid or corn starch; lubricants, such as magnesium stearate, glidants such as colloidal silicon dioxide; sweetening agents, such as sucrose or saccharin; or flavoring agents, such as peppermint or methyl salicylate.
  • binders such as microcrystalline cellulose, gum tragacanth, or gelatin
  • excipients such as starch or lactose
  • dispersing agents such as alginic acid or corn starch
  • lubricants such as magnesium stearate, glidants such as colloidal silicon dioxide
  • sweetening agents such as sucrose or saccharin
  • flavoring agents such as peppermint or methyl salicylate.
  • compositions and / or their formulations may be administered to an animal, including a mammal and, therefore, to man, in a variety of ways, including, but not limited to, parenteral, intraperitoneal, intravenous, intradermal, epidural, intraspinal, intrastromal. , intraarticular, intrasynovial, intrathecal, intralesional, intraarterial, intracardiac, intramuscular, intranasal, intracranial, subcutaneous, intraorbital, intracapsular, topical, through transdermal patches, rectal, vaginal or urethral, through the administration of a suppository, percutaneous, nasal spray , surgical implant, internal surgical paint, infusion pump or catheter.
  • compositions of the present invention are suitable for application by medical devices that allow their release in concentrations suitable for treatment. These devices must be suitable for the administration of the drug locally that allows the treatment not to be dispersed and act in the affected area. These medical devices can allow the release of the drug both jointly and sequentially, first releasing the endothelial activator and subsequently the statin.
  • the devices may, for example, but not be limited, carry the drugs inside or be coated therewith.
  • CE HUVEC grown in standard medium.
  • LPA HUVEC grown 90 minutes with 10 ⁇ M lysophosphatidic acid and then 24 hours in standard medium.
  • ATS HUVEC cultured with 1 ⁇ M Atorvastatin (ATS) for 24 hours.
  • LPA + ATS HUVEC cultured with 10 ⁇ M lysophosphatidic acid for 90 minutes and subsequently with 1 ⁇ M Atorvastatin for 24 hours.
  • the data is the mean ⁇ SEM. Experiments performed in triplicate by condition. * p ⁇ 0.05 vs. EC
  • FIG. 4 Shows the changes in the gene expression of endothelin-1 (A) and eNOS (B), genes involved in the endothelial function in HUVEC cells, analyzed by microarrays. The results are shown in fluorescent units.
  • CE HUVEC grown in standard medium.
  • LPA HUVEC grown 90 minutes with 10 ⁇ M lysophosphatidic acid and then 24 hours in standard medium.
  • ATS HUVEC cultured with 1 ⁇ M Atorvastatin (ATS) for 24 hours.
  • LPA + ATS HUVEC cultured with 10 ⁇ M lysophosphatidic acid for 90 minutes and subsequently with Atorvastatin 1 ⁇ M for 24 hours.
  • Figure 5 It shows the changes in the gene expression of genes involved in the permeability of the endothelial barrier in HUVEC cells analyzed by microarrays. The results are shown in fluorescent units.
  • CE HUVEC grown in standard medium.
  • LPA HUVEC grown 90 minutes with 10 ⁇ M lysophosphatidic acid and then 24 hours in standard medium.
  • ATS HUVEC cultured with 1 ⁇ M Atorvastatin (ATS) for 24 hours.
  • LPA + ATS HUVEC cultured with 10 ⁇ M lysophosphatidic acid for 90 minutes and subsequently with 1 ⁇ M Atorvastatin for 24 hours.
  • FIG. 6 Shows the changes in the gene expression of growth factors in HUVEC cells analyzed by microarrays. The results are shown in fluorescent units.
  • CE HUVEC grown in standard medium.
  • LPA HUVEC grown 90 minutes with 10 ⁇ M lysophosphatidic acid and then 24 hours in standard medium.
  • ATS HUVEC cultured with 1 ⁇ M Atorvastatin (ATS) for 24 hours.
  • LPA + ATS HUVEC cultured with 10 ⁇ M lysophosphatidic acid for 90 minutes and subsequently with 1 ⁇ M Atorvastatin for 24 hours.
  • Figure 7 It shows the changes in the gene expression of genes involved in the development of the cell cycle in HUVEC cells analyzed by microarrays. The results are shown in fluorescent units. EC:
  • HUVEC grown in standard medium LPA: HUVEC grown 90 minutes with 10 ⁇ M lysophosphatidic acid and subsequently 24 hours in standard medium.
  • ATS HUVEC cultured with 1 ⁇ M Atorvastatin (ATS) for 24 hours.
  • LPA + ATS HUVEC cultured with 10 ⁇ M lysophosphatidic acid for 90 minutes and subsequently with 1 ⁇ M Atorvastatin for 24 hours.
  • Figure 8 It shows the changes in the gene expression of genes involved in apoptosis in HUVEC cells analyzed by microarrays. The results are shown in CE: HUVEC fluorescent units grown in standard medium.
  • LPA HUVEC grown 90 minutes with 10 ⁇ M lysophosphatidic acid and then 24 hours in standard medium.
  • ATS HUVEC cultured with 1 ⁇ M Atorvastatin (ATS) for 24 hours.
  • LPA + ATS HUVEC cultured with 10 ⁇ M lysophosphatidic acid for 90 minutes and subsequently with 1 ⁇ M Atorvastatin for 24 hours.
  • HUVEC cells marketed by Sigma Aldrich were used. These cells were cultured in F12K medium (modified by Kaighn) with 2 mM glutamine + 1.5 g / l sodium bicarbonate + 0.10 mg / ml heparin + 0.03 mg / ml endothelial growth supplement (ECGS) + 20% fetal bovine serum (inactivated by heat shock at 56 0 C for 30 minutes). The culture medium is changed every 72 hours.
  • Incubation is carried out at a temperature of 37 0 C and in an atmosphere of 5% CO 2. 3 passes of the cells are made prior to experimental use. This cellular takeoff is carried out by means of three washes with PBS (sterile buffered solution), in order to eliminate the fetal bovine serum remains. Subsequently Trypsin-EDTA 0.03% is added (incubating at 37 0 C, 90% humidity and 5% CO2 for 5-10 minutes, examining the degree of cell individualization). Once the suspension and cell spherification are obtained, the neutralization of trypsin-EDTA is carried out by means of culture. Subsequently, a spin is carried out at 1000 rpm. for 10 minutes, to which the supernatant is removed, and the cell precipitate is diluted by adding new culture medium for reseeding in a 1: 2 ratio.
  • PBS sterile buffered solution
  • Microanalysis for performing, after the third pass, the cells were divided into 5 groups and incubated in wells of experimentation on microanalysis grids 37 0 C and 5% CO2 under the following conditions:
  • - LPA GROUP umbilical vein endothelial cells, from the third subculture, treated with 10 ⁇ M LPA for 90 minutes and subsequent incubation for 24 hours in standard medium.
  • ATS GROUP umbilical vein endothelial cells, from the third subculture, pharmacologically treated with 1 ⁇ M Atorvastatin (ATS) for 24 hours.
  • - GROUP E1 umbilical vein endothelial cells, from the third subculture, treated pharmacologically with 10 ⁇ M LPA for 90 minutes and subsequently with 1 ⁇ M ATS for 24 hours.
  • GROUP E2 umbilical vein endothelial cells, from the third subculture, pharmacologically treated with 1 ⁇ M ATS for 24 hours and subsequently with 10 ⁇ M LPA for 90 minutes.
  • EXAMPLE 2 Effects of treatment with lysophosphatidic acid of HUVEC cells prior to the administration of 1 ⁇ M atorvastatin on cell death
  • the sample of endothelial cells must be physically on the gold microanalysis grids. For this, it extends a thin layer of pioloform resin in ultrapure water and precisely placing the microanalysis grids and a 11 mm diameter coverslip on it. After the collection and drying of the grid-pioloform assembly, they are sterilized by irradiation with ultraviolet rays for 24 hours. Then, 2 grids are deposited in each experiment well and cell seeding is carried out.
  • Cell seeding is carried out according to the protocol followed in example 1.
  • the cells come from a third trypsinization of the culture.
  • the experimental trial (treatment with LPA, atorvastatin, both or without treatment) was carried out after 24 hours of culture, ensuring in this way, a correct adhesion and viability of the endothelial cells used.
  • microanalysis racks are washed in autoclaved double-distilled water at 4 ° C for 4 seconds, generating a gentle movement by means of a magnetic stirrer. Excess water is removed with rapid drying on filter paper.
  • microanalysis gratings are cryofixed, after removal of the corresponding grating covers.
  • the cellular material is fixed by freezing in liquid nitrogen, lowering its temperature from 37 ° C to -196 ° C, in less than 10 seconds.
  • Cryofixed endothelial cells are transferred to a high vacuum cryo-drying chamber, at 10 ⁇ 5 mbar pressure (Emitech K775 system) for the complete extraction of cellular water by sublimation, following a 6-stage protocol (Warley et al. 2000. J Microsc; 198: 116-123).
  • the sample is then covered with a carbon film, using an Emitech evaporator (Watfor, United Kingdom) provided with a graphite wire, which facilitates scanning of the electron beam.
  • Emitech evaporator (Watfor, United Kingdom) provided with a graphite wire, which facilitates scanning of the electron beam.
  • - P corresponds to the net counts of the characteristic signal of the element.
  • - B is the continuous radiation measured below the peak, that is, taken between the same energy levels of the characteristic signal.
  • - Z 2 / A is the average value of the squared atomic number divided by the atomic weight, corresponding a specific value for 20% dextran (standard standard) and cells (Warley, 1997. Practical Methods in Electron Microscopy).
  • the calibration standards were prepared according to the preset guidelines in the laboratory of analytical electron microscopy of the Department of Histology of the Faculty of Medicine of the University of Granada. (Crespo et al. 1993. Acta Otolaryngol; 113: 176-180; López-Escámez et al. 1994. Scanning Microsc Suppl; 8: 171-185) using various salts (NaHPO 4 , MgCI 2 , CaCI 2 H 2 O and K 2 SO 4 ) dissolved in organic matrix as a standard of analysis. For this, solutions of each salt were prepared at different concentrations in 20% dextran (300 kD).
  • the patterns were mounted on microporous membranes of the Millicell ® units and the same procedure was followed as was described for the preparation of endothelial cells.
  • the standards were analyzed in the electron microscope immediately after preparation to avoid contamination or chemical modification, obtaining between 15 and 20 spectra for each standard concentration, using the same analysis conditions previously considered, which were used for endothelial cells.
  • - (Pstd / Bstd) is the P / B ratio, where the background has been measured between the same energy range of the characteristic signal obtained from the analysis of the standards.
  • - K is the characteristic calibration constant for each element and instrumental configuration used.
  • Table 2 shows the standard pattern values expressed in moles / kg. of dry mass, for the different elements were the following:
  • Table 2 Standard standard values expressed in moles / kg. dry dough
  • the problem posed is solved by using the non-parametric Kruskal-Wallis test for multiple samples, which allows us to perform the global statistical analysis.
  • the preactivation of the endothelium by means of the preincubation of the cells with 10 ⁇ M LPA for 90 minutes prior to the administration of Atorvastatin causes a protection of the tissue against the damage generated by the atorvastatin at 1 ⁇ M concentration.
  • EXAMPLE 3 Effect of treatment with lysophosphatidic acid of HUVEC cells prior to the administration of 1 ⁇ M Atorvastatin on gene expression.
  • the cell culture and treatment protocol is the same followed in example 1.
  • the experimental groups used are:
  • GROUP A umbilical vein endothelial cells, from the third subculture, treated with 10 ⁇ M LPA for 90 minutes and subsequent incubation for 24 hours in standard medium.
  • - ATS1 GROUP umbilical vein endothelial cells, from the third subculture, pharmacologically treated with Atorvastatin
  • ATS 1 ⁇ M for 24 hours.
  • GROUP E1 umbilical vein endothelial cells, from the third subculture, treated pharmacologically with 10 ⁇ M LPA for 90 minutes and subsequently with 1 ⁇ M ATS for 24 hours.
  • GROUP E2 umbilical vein endothelial cells, from the third subculture, pharmacologically treated with 1 ⁇ M ATS for 24 hours and subsequently with 10 ⁇ M LPA for 90 minutes.
  • RNAs were transformed into cDNA by a reverse transcriptase (Superscript II, Life Technologies, Inc., Carlsbad, CA, USA) with an oligonucleotide rich in thymine tails (T7-polyT primer), which allowed Ia amplification of any messenger RNA present in the cell.
  • T7-polyT primer an oligonucleotide rich in thymine tails
  • the cRNAs corresponding to all cDNAs were synthesized by in vitro transcription, using biotin-labeled UTP and CTP (Enzo Diagnostics, Farmingdale, NY). Once synthesized, and to favor hybridization, these cRNAs were chemically fragmented by adding a high concentration of salts and high temperatures.
  • Figure 6 shows that the activation of the endothelium with LPA causes an increase in the expression of the vascular endothelial growth factor-A. This induction is reversed by treatment with atorvastatin. Atorvastatin itself also produces a decrease in the expression of both the growth factor of vascular endothelium C and the FLT-1 cell receptor that is maintained even with the pretreatment of cells with LPA. This indicates that atorvastatin is able to exert a negative regulation on autocrine and paracrine cell proliferation mechanisms that is not altered by pretreatment with LPA.
  • Figure 8 shows that cells treated with 1 ⁇ M atorvastatin alone or with subsequent application of LPA, have an increased expression of indicators of loss of viability such as caspase 3, caspase 6 caspase 7, Rac-1 and Cdc-42, with regarding untreated cells. This increase is limited or reversed to the physiological situation in cases in which the cells have been preincubated with APL prior to the use of atorvastatin. These data endorse the cell viability data obtained by microanalysis.
  • Another gene increased in the ATS and ATS + LPA groups is the programmed cell death gene 4 (PDCD-4), which has an important role in apoptosis. Its expression is also reduced by treatment with LPA prior to the administration of atorvastatin.
  • PDCD-4 programmed cell death gene 4

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Abstract

Composición que comprende una estatina y un agente activador del endotelio vascular. Dicha composición se puede utilizar para la elaboración de medicamentos o composiciones farmacéuticas, preferiblemente, para la prevención o el tratamiento de procesos patológicos asociados a proliferación celular anormal y angiogénesis patológica o no deseada como el cáncer o la arteriosclerosis.

Description

COMPOSICIÓN PARA LA PREVENCIÓN O EL TRATAMIENTO DE PROCESOS PATOLÓGICOS RELACIONADOS CON LA ANGIOGÉNESIS Y PROLIFERACIÓN CELULAR
La presente invención se encuentra dentro del campo de Ia biomedicina. Específicamente, se refiere a una composición que comprende una estatina y un agente activador del endotelio vascular y su uso para Ia elaboración de un medicamento, preferiblemente, para Ia prevención o el tratamiento de procesos patológicos asociados a proliferación celular anormal y angiogénesis patológica o no deseada como por ejemplo el cáncer o Ia arteriosclerosis.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
La angiogénesis es el proceso biológico, merced al cual, se generan vasos sanguíneos, ex novo, a partir de estructuras vasculares previas. Para ello, es necesario que se mantenga un acoplamiento sinérgico de los mecanismos de proliferación y organización morfo-funcional. Los procesos implicados en los mecanismos de angiogénesis y vasculogénesis representan un papel fundamental tanto en fenómenos de cicatrización, como en el desarrollo de neoplasias o en Ia retinopatía diabética (Scholz et al. 2001. Angiogénesis; 4:246-257; Shukla et al. 2007. Ann Thorac Surg; 84:43-49; Tang et al. 2006. EurJ Cardiothorac Surg; 30:353-360).
Existen multitud de patologías asociadas a alteraciones en Ia vascularización o a proliferación mio-endotelial, ya sea por exceso o por defecto. Uno de los problemas más comunes a este respecto, dentro del contexto histopatológico que representa Ia aterosclerosis, se da tras Ia realización de intervenciones quirúrgicas de revascularización (cirugía sobre estructuras vasculares). La cirugía para Ia eliminación de problemas obstructivos cardiovasculares puede fracasar a corto, medio o largo plazo debido, en muchos casos, a una sobreproliferación celular (proliferación mio-endotelial en los bordes anastomóticos) y a Ia aparición de enfermedad aterosclerótica del injerto, Io que provoca Ia reestenosis del vaso. Del mismo modo, pueden producirse fenómenos de reestenosis tras procedimientos endovasculares de revascularización (también utilizados en arteriopatías periféricas) debido a fenómenos de proliferación mio- endotelial o fenómenos de trombosis del segmento arterial tratado. Estos eventos patológicos se han tratado de solucionar mediante múltiples estrategias, como por ejemplo Ia aplicación de stents que reducen parcialmente Ia estenosis (reduce los fenómenos cicatriciales de retracción elástica), pero que no evitan Ia reestenosis por proliferación mio-endotelial. Esto último se trata de evitar mediante otros mecanismos como los tratamientos farmacológicos (WO/2003/026492).
Otra patología que se caracteriza por una angiogénesis patológica o no deseada es el cáncer. Para el desarrollo de Ia masa tumoral es necesario un aporte de nutrientes constante. La neovascularización del tumor permite que los nutrientes alcancen las células proliferativas del mismo, permitiendo mantener su tasa proliferativa. Se ha demostrado que Ia inhibición de esta neovascularización provoca Ia detención en el desarrollo del tumor. Además, los neovasos formados presentan una estructura y función alteradas, con distorsiones evidentes en Ia barrera de permeabilidad endotelial, facilitando Ia diseminación tumoral y Ia sintomatología añadida a Ia edematización de los tejidos.
En los últimos años ha ido aumentando el número de moduladores de Ia angiogénesis y Ia función endotelial estudiados para el tratamiento de estas patologías, entre ellas las estatinas y moduladores del receptor del ácido lisofosfatídico.
Las estatinas son unos fármacos ampliamente prescritos para Ia reducción del colesterol en pacientes con hipercolesterolemia o enfermedades cardiovasculares (Liao et al. 2004. Ann Rev Pharmacol Toxicol; 45:89- 118). Actúan fundamentalmente mediante Ia inhibición competitiva de Ia 3- hidroxi-3-metilglutaril coenzima A (HMG-CoA) reductasa, enzima limitante en el proceso de síntesis del colesterol. Estas estatinas presentan además otros efectos no dependientes de Ia reducción de los niveles de colesterol (efectos pleiotrópicos) como Ia mejora de Ia funcionalidad cardiovascular (O'Driscoll et al. 1997. Circulation; 95:1126-1131 ), el descenso en Ia expresión de citocinas proinflamatorias (Masón et al. 2004. Circulation; 109:1134-1141 ), o sus efectos sobre el crecimiento y diferenciación tumoral (Wong et al. 2002. Leukemia; 16;508-519).
Se ha demostrado que las estatinas pueden reducir Ia muerte por cáncer en pacientes con largos tratamientos para enfermedades cardiovasculares (Pedersen et al. 2000. Am J Cardiol; 86:257-262). Además presentan Ia capacidad de inhibir el crecimiento tumoral y activar Ia apoptosis de células cancerosas (Causal et al. 2003. Endothelium; 10:49-58) La inhibición del ciclo se produce por múltiples mecanismos estirpe dependientes, como por ejemplo a través de Ia inhibición de Ia actividad de Ia kinasa ciclina dependiente-2 (CDK-2) junto a Ia activación de inhibidores de CDK. La apoptosis se da preferentemente en células proliferativas y se da mediante el control de diversas rutas de señalización, como Ia activación de caspasas, Ia inhibición de Ia proteína antiapoptótica bcl-2, o Ia ruta de señalización Raf/MEK/ERK (Agarwal et al. 1999. Clin Cáncer Res; 5:2223- 2229; Wu et al. 2004. Cáncer Res; 64:6461-6468). Además se ha demostrado que Ia capacidad de inhibir Ia geranilgeranilación proteica es un elemento indispensable para producir Ia muerte por estatinas en células de leucemia mieloide aguda (Xia et al. 2001. Leukemia; 15:1398-1407). Por otro lado también se ha indicado que las estatinas son capaces de inhibir el crecimiento tumoral por Ia sobreexpresión de Ia proteína p21 (Ukomadu et al. 2003. J Biol Chem; 278:43586-43594). Otro efecto anticancerígeno que se ha demostrado por parte de las estatinas es Ia inhibición de Ia función del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) impidiendo el desarrollo de algunos tumores de pulmón (Mantha et al. 2005. Clin Cáncer Res; 11 :2398-2407).
La aplicación de estatinas al endotelio vascular, dependiendo de Ia dosis, puede implicar un marcado descenso de Ia síntesis de VEGF-A, de su receptor específico FLT-1 , así como de VEGF-C (Jones et al. 1999. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol; 276:1345-1355). A pesar de ello, las estatinas han demostrado tener un efecto proangiogénico cuando son administradas a concentraciones dentro del rango nanomolar o picomolar, mientras que a altas concentraciones, dentro del rango micromolar, demuestran un efecto claramente antiangiogénico (Dulak et al. 2005. Endothelium; 12: 233-241 ; Frick et al. 2003. Atherosclerosis; 170:229-236).
Otro modulador de Ia función endotelial es el ácido lisofosfatídico (LPA). Este se encuentra implicado en procesos celulares como Ia diferenciación o Ia inhibición de Ia apoptosis en diversos tipos celulares (Duriex et al. 1993. Trnds Pharmacol Sci; 14:249-254). Además este compuesto se ha demostrado como un elemento fundamental para el desarrollo vascular en ratones (van Meeteren et al. 2006. Mol CeII Biol; 26:5015-5022). Este factor también se encuentra implicado tanto en Ia proliferación como en Ia migración de células endoteliales (Lee et al. 2000. Am J Physiol CeII Physiol; 278:C612-C618), Io que demuestra su carácter proangiogénico (Rivera-López et al. 2008. Angiogenesis; 11 :301-310). Este factor además induce Ia expresión de VEGF-C, Io que promueve Ia neovascularización (Lin et al. 2008. Ce// Signal; 20:1804-1814). Todo esto se ve refrendado por el hecho de que antagonistas del receptor de LPA se están utilizando como agentes para Ia prevención de enfermedades proliferativas o asociadas a carcinomas (US2008/0213274). La modulación de Ia angiogénesis y proliferación no deseada se muestra por Io tanto como un elemento fundamental a Ia hora de controlar diversas afecciones patológicas que, como el desarrollo de tumores sólidos o Ia arteriosclerosis, necesitan tanto neovascularización como proliferación mio-endotelial para su desarrollo. Para controlar y tratar estas patologías se han desarrollado numerosos inhibidores de angiogénesis y moduladores endoteliales que han mostrado excelentes resultados en ensayos preclínicos. A pesar de estos prometedores resultados, los ensayos clínicos realizados con posterioridad no han terminado de confirmar las expectativas creadas en torno a estos tratamientos (Sivakumar et al. 2004. JAMA. 292:972-977). Por Io tanto, existe Ia necesidad de un tratamiento efectivo para prevenir y tratar las enfermedades relacionadas con el desarrollo anómalo de Ia angiogénesis y de Ia proliferación mio-endotelial.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a una composición que comprende una estatina y un agente activador del endotelio vascular y su uso para Ia elaboración de un medicamento, preferiblemente, para Ia prevención o el tratamiento de procesos patológicos asociados a angiogénesis y proliferación mio-endotelial no deseada como, por ejemplo, el cáncer o Ia arteriosclerosis.
En los ejemplos de Ia presente invención se demuestra como Ia estimulación del endotelio con un activador endotelial, provoca cambios hiperproliferativos en ese endotelio, dando lugar a una situación endotelial alterada. En esta situación alterada se observa un incremento de Ia expresión de genes relacionados con Ia proliferación celular, así como en Ia expresión de citocinas proinflamatorias. Por otro lado, Ia atorvastatina, utilizada en concentraciones del rango micromolar provoca, en el endotelio vascular, una modificación de Ia expresión génica que hace que el endotelio muestre un estado fisiológicamente normal. Por desgracia el uso de estatinas en el rango micromolar también conlleva un descenso en Ia viabilidad celular del endotelio con Ia consiguiente alteración del tejido.
En Ia presente invención se demuestra que Ia aplicación de estatinas como Ia atorvastatina dentro del rango micromolar al endotelio, previa activación con un activador endotelial como el ácido lisofosfatídico, sigue produciendo Ia reversión del endotelio a un estado fisiológico de forma similar al tratamiento con Ia estatina de forma independiente. Esta reversión se observa a nivel génico, ya que hay un descenso en las señales proliferativas inducidas por el ácido lisofosfatídico, así como en las señales indicadoras de disfunción endotelial. Sorprendentemente esta pre- incubación del endotelio con ácido lisofosfatídico produce una protección del efecto apoptótico producido por el tratamiento de forma independiente con estatinas en concentraciones micromolares. Por Io tanto esta coadición de compuestos provoca Ia reversión de un endotelio activado a uno con funciones fisiológicas normalizadas sin provocar su apoptosis pero frenando su cinética celular al disminuir significativamente su proliferación.
Por Io tanto este tratamiento reduce Ia toxicidad del uso de altas concentraciones de estatinas, manteniendo sus efectos beneficiosos.
De esta forma, un primer aspecto de Ia invención se refiere a una composición (de ahora en adelante, composición de Ia invención) que comprende una estatina, una sal o un éster de Ia misma, y un activador endotelial. Las estatinas son una familia de compuestos inhibidores de Ia enzima 3- hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) reductasa. Además estimulan Ia absorción de colesterol por parte del hígado, Io que reduce los niveles del mismo, así como de triglicéridos en Ia sangre circulante. En una realización preferida de este aspecto de Ia invención, Ia estatina se selecciona de Ia lista que comprende: atorvastatina, fluvastatina, lovastatina, pitavastatina, pravastatina, simvastatina, o rosuvastatina.
En una realización aún más preferida de este aspecto de Ia invención, Ia estatina es Ia atorvastatina. La atorvastatina es un compuesto sintético de fórmula (I). Las sales y esteres de atorvastatina también son conocidos por Io que también pueden ser empleados.
Figure imgf000008_0001
El término "activador endotelial", tal y como se utiliza en Ia presente descripción se refiere a un compuesto capaz de desencadenar diversos procesos concretos y reconocibles en el endotelio denominados activación endotelial. Estos efectos en las células endoteliales, consisten generalmente en Ia sobreexpresión de moléculas como VCAM, ICAM, E- selectina y el factor de Von Willebrand, y un descenso en Ia producción de AMPc. Esto conlleva una pérdida de Ia función de barrera del endotelio y a alteraciones en el tono vasomotor. Dentro de los activadores endoteliales, se encuentran, por ejemplo aunque sin limitarnos TNFα, fuerzas hemodinámicas, así como Ia esfingosina-1 -fosfato, y sus análogos, o el ácido lisofosfatídico, un análogo o una sal de dicho ácido.
En una realización preferida de este aspecto de Ia invención, el activador endotelial se selecciona de Ia lista que comprende TNFα, esfingosina-1- fosfato, un análogo de Ia misma, o ácido lisofosfatídico, un análogo o una sal de dicho ácido.
En una realización aún más preferida, el activador endotelial es el ácido lisofosfatídico, un análogo o una sal de dicho ácido.
El ácido lisofosfatídico, de fórmula (II), es un fosfolípido bioactivo con actividad en diversos tipos celulares. Induce efectos proliferativos y cambios morfológicos celulares. También actúa como mediador en los procesos de síntesis de fosfolípidos de membrana.
Figure imgf000009_0001
(II)
El término ácido lisofosfatídico en Ia presente memoria incluye una familia de compuestos de formulación 1-acil,2-hidroxil-sn-glicerol-3-fosfato, los cuales presentan una cadena de ácidos grasos saturados (16:0, 18:0) o insaturados (18:1 , 18:2, 20:4). El término "análogo" tal y como aquí se utiliza se refiere a una sustancia química similar a otra sustancia química en estructura y/o función. Por ejemplo, pueden considerarse análogos del ácido lisofosfatídico sin limitarse, esteres grasos saturados, insaturados o poliinsaturados o alquil- éteres. También pueden considerarse análogos del acido lisofosfatídico aquellos compuestos en los que el grupo fosfato del ácido lisofosfatídico se sustituye por compuestos de Ia lista que comprende, aunque sin limitarnos, fosforomiméticos como metileno, fosfonatos, metilen-fosfonatos, fosfotioatos, o fosfonotioatos. También se consideran análogos aquellos compuestos similares al ácido lisofosfatídico donde los grupos hidroxi en las posiciones sn-1 y sn-2 se sustituyen por flúor o grupos metoxi. También se incluyen aquellos compuestos que sustituyen el grupo O-acil en Ia posición sn-1 por un grupo O-alquil.
Otro aspecto de Ia invención se refiere al uso de Ia composición de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento.
La composición de Ia presente invención puede ser empleada, aunque sin limitarse, para normalizar Ia función endotelial en procesos de angiogénesis, proliferación celular no deseada o anormal (como Ia proliferación mio-endotelial en Ia aterosclerosis) o en situaciones de disfunción de Ia barrera endotelial. Por Io tanto, una realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al uso de Ia composición de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento para Ia prevención y/o el tratamiento de un proceso patológico asociado a angiogénesis, proliferación celular (mio-endotelial, etc.) anormal o no deseada, o a una disfunción de Ia barrera endotelial.
Se entiende por "angiogénesis y proliferación mio-endotelial anormal" o "no deseada" aquel desarrollo vascular que difiere estructural, morfológica o funcionalmente del desarrollo fisiológico de los vasos y que lleva asociado un proceso patológico. Este desarrollo anormal conlleva el deterioro de las funciones tisulares normales. Existen multitud de procesos patológicos relacionados con el desarrollo anormal de Ia angiogénesis y con Ia proliferación mio-endotelial.
Se entiende por "disfunción de Ia barrera endotelial" aquella situación en Ia que el endotelio vascular pierde parcial o totalmente su funcionalidad en el mantenimiento de Ia integridad de los vasos produciendo una alteración en Ia permeabilidad de los vasos. Se caracteriza también por un aumento de las señales vasoconstrictoras como Ia liberación de angiotensina Il o el aumento de Ia expresión de endotelina-1 , y por Ia reducción de las vasodilatadoras como Ia producción de Oxido nítrico (NO) por Ia disminución de Ia expresión y actividad de Ia enzima oxido nítrico sintasa endotelial (eNOS). Además va acompañado de Ia generación de un entorno proinflamatorio, proliferativo y procoagulatorio que favorece Ia aterogénesis.
Una realización más preferida de este aspecto de Ia invención, se refiere al uso de Ia composición para Ia elaboración de un medicamento para Ia prevención o el tratamiento de un proceso patológico asociado a angiogénesis, proliferación celular (como Ia proliferación mio-endotelial) anormal o no deseada, o a una disfunción de Ia barrera endotelial, seleccionado de Ia lista que incluye arteriosclerosis, cáncer, degeneración macular, glaucoma neovascular, endometriosis, artritis reumatoide, psoriasis, herpes ocular, tracoma, neovascularización de injerto de córnea, queratitis intersticial viral, queratoconjuntivitis microbiana, telangiectasia hipertrófica, adhesiones vasculares, angiofibroma, acné rosácea, fibroplasia retrolental, hipertensión pulmonar primaria o secundaria, pulmón de shock, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, fibrosis, vitreorretinopatía proliferativa, leucemia, colitis ulcerosa, retinopatía de Ia premadurez, queratoconjuntivitis epidémica, queratitis atópica, queratitis de los miembros superiores, queratitis seca del pterigio, síndrome de Sjogren, filectenulosis, sífilis, infecciones por Mycobacteria, quemaduras químicas, úlceras bacterianas, úlceras fúngicas, úlcera de Mooren, degeneración marginal de Terrien, queratólisis marginal, poliarteritis, escleritis, enfermedad de Stevens-Johnson, queratotomía radial, anemia de células falciformes, pseudoxantoma elástico, penfigoide, enfermedad de Paget, uveítis crónica, vitritis crónica, enfermedad de Lyme, enfermedad de Eales, enfermedad de Behcet, histoplasmosis ocular supuesta, enfermedad de Best, miopía, pozos del nervio óptico, enfermedad de Stargardt, pars planitis, desprendimiento crónico de retina, síndromes de hiperviscosidad, toxoplasmosis, complicaciones post-láser, rubeosis, artritis, sinovitis, osteomielitis, asma, dermatitis alérgica, síndrome de DiGeorge, neovascularización de injerto de córnea, verrugas, tumores, enfermedad obstructiva de Ia carótida, degeneración macular asociada a Ia edad, o retinopatía diabética.
Dentro de Ia angiogénesis y proliferación mio-endotelial anormal, uno de las patologías más importantes es Ia arterioesclerosis que se caracteriza por un engrosamiento y disfunción de las paredes de los vasos. Dentro de ésta, el evento más común y más grave es Ia formación de Ia placa de ateroma caracterizada por Ia acumulación de lípidos a nivel subendotelial. Este evento lleva asociado en multitud de casos isquemia miocárdica, cerebral, músculo-esquelética o esplácnica, por Io que Ia disminución de Ia placa sería un evento deseable. Además Ia inestabilidad de Ia placa formada puede producir Ia liberación de lípidos altamente trombogénicos que produzcan eventos cardiovasculares agudos (infarto de miocardio, isquemia aguda de miembros inferiores, isquemia aguda esplácnica, infartos cerebrales, etc.). El tratamiento con estatinas ha mostrado un efecto reductor de Ia formación de Ia placa de ateroma, así como estabilizador de Ia placa. Debido a los potentes efectos anti- arterioscleróticos de las estatinas a elevadas concentraciones (dentro del rango micromolar) y a Ia eliminación del efecto citotóxico por Ia preactivación con LPA, Ia presente combinación podría ser utilizada por ejemplo, pero sin limitarnos, para Ia prevención el tratamiento de placas arterioscleróticas, cardiopatías isquémicas, accidentes cerebrovasculares, colitis isquémica, aneurismas aórticos, reestenosis vascular, cicatrización hipertrófica o escleroderma, arteriopatías periféricas, etc.
Por otro lado, también se encuentran los tumores. Para Ia progresión tumoral es de vital importancia el desarrollo de estructuras vasculares. Debido al rápido crecimiento tumoral y Ia necesidad de Ia vasculatura para desarrollarse a dicho ritmo, los vasos desarrollados presentan disfunciones y no se da un correcto desarrollo de Ia barrera endotelial. En este sentido el tratamiento con estatinas a altas concentraciones junto con Ia adición del activador endotelial provocaría una detención del crecimiento vascular y por ello Ia detención del crecimiento tumoral. Además, Ia refuncionalización del tejido vascular permite Ia recuperación de Ia barrera endotelial impidiendo Ia diseminación de las células tumorales, y por ello Ia metástasis. Por ello Ia presente composición sería útil para Ia prevención y tratamiento tanto de tumores sólidos, como tumores transportados por Ia sangre, como por ejemplo, pero sin limitarnos, adenomas bronquiales infantiles, astrocitoma cerebeloso infantil, astrocitoma cerebral y glioma maligno infantil, blastoma pleuropulmonar, linfoma de Burkitt, cáncer colorrectal infantil, cáncer de ano, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cavidad nasal y de seno paranasal, cáncer de cavidad oral y de labio, cáncer de célula renal, cáncer de cérvix, cáncer de colon, cáncer de cuello del útero, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer de estómago (gástrico), cáncer de glándula salival, cáncer de hígado en adultos (primario), cáncer de hipofaringe, cáncer de intestino delgado, cáncer de laringe, cáncer de las vías biliares extrahepáticas, cáncer de mama (seno), cáncer de nasofaringe, melanoma intraocular, cáncer de ojo, retinoblastoma, cáncer orofaríngeo, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de paratiroides, cáncer de piel (melanoma), cáncer de piel (no melanoma), cáncer de próstata, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de recto, cáncer de testículo, cáncer de tiroides, cáncer de uretra, cáncer de vagina, cáncer de vejiga, cáncer de vesícula biliar, cáncer de vulva, cáncer epitelial de ovarios, cáncer escamoso de cuello con tumor primario oculto metastático, cáncer óseo, osteosarcoma, carcinoma basocelular, carcinoma de células de Merkel, carcinoma de Ia corteza suprarrenal, carcinoma tímico y timoma, leucemia, cáncer cerebro y médula espinal, tumor de swing, feocromocitoma, glioma, astrocitoma cerebral, tumores hipofisiarios, histiocitoma fibroso maligno óseo, linfoma de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, linfoma de células T, síndrome de Sézary, linfoma relacionado con el sida, macroglobulinemia de Waldenstrom, meduloblastoma, mesotelioma, pineoblastoma, tumor neuroectodérmico primitivo supratentorial, rabdomiosarcoma, cáncer rabdoideo/teratoideo atípico del sistema nervioso central, sarcoma de tejido blando, sarcoma de útero o uterino, síndromes mielodisplásicos, ependimoma, tumor de Wilms, tumor extracraneal de células germinales infantil, tumor extragonadal de células germinales, o macroglobulinemia de Waldenstrom.
Una realización aún más preferida de este aspecto de Ia invención, se refiere al uso de Ia composición para Ia elaboración de un medicamento para Ia prevención o el tratamiento de un proceso patológico asociado a angiogénesis, proliferación mio-endotelial anormal o no deseada, o a procesos patológicos asociados a una disfunción de Ia barrera endotelial, seleccionado de Ia lista que incluye arteriosclerosis, reestenosis de injertos cardiovasculares, procedimientos endovasculares, tumores del Sistema Nervioso Central (SNC), tumores sólidos, tumores hematopoyéticos, hipertensión pulmonar, pulmón de shock o síndrome de respuesta inflamatoria sistémica. Debido a las elevadas concentraciones (dentro del rango micromolar) en que se requiere administrar Ia estatina, resultaría interesante, aunque sin limitarse, que Ia administración de Ia composición se realizase de forma local preferentemente para su actuación sobre el tejido afectado. Por todo ello, una realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al uso de Ia composición en una forma adecuada para Ia administración local.
El tratamiento del endotelio con los activadores provoca una respuesta característica. Esta respuesta es Ia que permite a Ia estatina ejercer sus efectos de normalización fisiológica evitando el efecto proapoptótico y produciendo una inhibición de Ia proliferación mio-endotelial. Por tanto el uso de Ia estatina de forma aislada sobre un endotelio ya activado ejercería los mismos efectos que sobre un endotelio tratado con un activador endotelial. Por todo ello, en otro aspecto de Ia invención se describe el uso de una estatina, una sal o un áster de Ia misma para Ia prevención y/o el tratamiento de un proceso patológico asociado a angiogénesis y/o proliferación mio-endotelial anormal o no deseada cuando las células endoteliales están activadas (neovasos anormales tumorales).
Una realización preferida de este aspecto de Ia invención, se refiere al uso de una estatina, sal o áster de Ia misma para Ia elaboración de un medicamento para Ia prevención o el tratamiento de un proceso patológico asociado a angiogénesis, proliferación mio-endotelial anormal o no deseada, o a una disfunción de Ia barrera endotelial, seleccionado de Ia lista que incluye aunque sin limitarse, arteriosclerosis, cáncer, degeneración macular, glaucoma neovascular, endometriosis, artritis reumatoide, psoriasis, herpes ocular, tracoma, neovascularización de injerto de córnea, queratitis intersticial viral, queratoconjuntivitis microbiana, telangiectasia hipertrófica, adhesiones vasculares, angiofibroma, acné rosácea, fibroplasia retrolental, hipertensión pulmonar primaria o secundaria, pulmón de shock, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, fibrosis, vitreorretinopatía proliferativa, leucemia, colitis ulcerosa, retinopatía de Ia premadurez, queratoconjuntivitis epidémica, queratitis atópica, queratitis de los miembros superiores, queratitis seca del pterigio, síndrome de Sjogren, filectenulosis, sífilis, infecciones por Mycobacteria, quemaduras químicas, úlceras bacterianas, úlceras fúngicas, úlcera de Mooren, degeneración marginal de Terrien, queratólisis marginal, poliarteritis, escleritis, enfermedad de Stevens- Johnson, queratotomía radial, anemia de células falciformes, pseudoxantoma elástico, penfigoide, enfermedad de Paget, enfermedad obstructiva de Ia carótida, uveítis crónica, vitritis crónica, enfermedad de Lyme, enfermedad de Eales, enfermedad de Behcet, histoplasmosis ocular supuesta, enfermedad de Best, miopía, pozos del nervio óptico, enfermedad de Stargardt, pars planitis, desprendimiento crónico de retina, síndromes de hiperviscosidad, toxoplasmosis, complicaciones post-láser rubeosis, artritis, sinovitis, osteomielitis, asma, dermatitis alérgica, síndrome de DiGeorge, neovascularización de injerto de córnea, verrugas, tumores, enfermedad obstructiva de Ia carótida, degeneración macular asociada a Ia edad, o retinopatía diabética.
Una realización más preferida de este aspecto de Ia invención, se refiere al uso de Ia estatina, sal o éster de Ia misma para Ia elaboración de un medicamento para Ia prevención o el tratamiento de un proceso patológico asociado a angiogénesis, proliferación mio-endotelial anormal o no deseada, o procesos patológicos asociados a una disfunción de Ia barrera endotelial, seleccionado de Ia lista que incluye arteriosclerosis, reestenosis de injertos cardiovasculares, procedimientos endovasculares, tumores del Sistema Nervioso Central (SNC), tumores sólidos, tumores hematopoyéticos, hipertensión pulmonar, pulmón de shock o síndrome de respuesta inflamatoria sistémica. Una realización aún más preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al uso de Ia estatina, sal o áster de Ia misma en una forma adecuada para Ia administración local.
Resulta interesante que el activador endotelial y Ia estatina se administren de forma que el activador endotelial actúe sobre el tejido antes que Ia estatina ya que de esta forma se obtienen los mejores resultados. Por tanto Ia preparación combinada de un activador del endotelio vascular y una estatina por separado, de manera secuencial sería útil en Ia elaboración de un medicamento.
Por Io tanto, otro aspecto de Ia invención se refiere a una preparación combinada (de ahora en adelante, preparación combinada de Ia invención) para su uso secuencial que comprende:
a) primero, un activador endotelial, y b) segundo, una estatina, o una sal o un áster de Ia misma.
En una realización preferida de este aspecto de Ia invención, Ia estatina se selecciona de Ia lista que comprende: atorvastatina, fluvastatina, lovastatina, pitavastatina, pravastatina, simvastatina, y rosuvastatina. En una realización aún más preferida, Ia estatina seleccionada es Ia atorvastatina.
En otra realización preferida de este aspecto de Ia invención, entre los activadores endoteliales se encuentran, aunque sin limitarnos, TNFα esfingosina-1 -fosfato, un análogo de Ia misma, o el ácido lisofosfatídico, un análogo o una sal de dicho ácido.
En una realización aún más preferida, el activador endotelial es el ácido lisofosfatídico, un análogo o una sal del mismo. Debe enfatizarse que el término "preparación combinada" o también denominada "yuxtaposición", en esta memoria, significa que los componentes de Ia preparación combinada no necesitan encontrarse presentes como unión, por ejemplo, en una composición, para poder encontrarse disponibles para su aplicación separada o secuencial. De esta manera, Ia expresión "yuxtapuesta" implica que no resulta necesariamente una combinación verdadera, a Ia vista de Ia separación física de los componentes.
Otro aspecto de Ia invención se refiere al uso de Ia preparación combinada de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento.
La preparación combinada de Ia presente invención puede ser empleada, aunque sin limitarse, para normalizar Ia función endotelial en procesos de angiogénesis, proliferación mio-endotelial no deseada o anormal, o de disfunción de Ia barrera endotelial. Por Io tanto, una realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al uso de Ia preparación combinada de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento para Ia prevención y/o el tratamiento de un proceso patológico asociado a angiogénesis y/o proliferación mio-endotelial anormal o no deseada.
Una realización más preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al uso de Ia preparación combinada de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento para Ia prevención o el tratamiento de un proceso patológico asociado a angiogénesis y/o proliferación mio-endotelial no deseada, seleccionado de Ia lista que comprende por ejemplo, aunque sin limitarse, arterioesclerosis, cáncer, degeneración macular, glaucoma neovascular, endometriosis, artritis reumatoide, psoriasis, herpes ocular, tracoma, neovascularización de injerto de córnea, queratitis intersticial viral, queratoconjuntivitis microbiana, telangiectasia hipertrófica, adhesiones vasculares, angiofibroma, acné rosácea, fibroplasia retrolental, hipertensión pulmonar primaria o secundaria, pulmón de shock, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, fibrosis, vitreorretinopatía proliferativa, leucemia, colitis ulcerosa, retinopatía de Ia premadurez, queratoconjuntivitis epidémica, queratitis atópica, queratitis de los miembros superiores, queratitis seca del pterigio, síndrome de Sjogren, filectenulosis, sífilis, infecciones por Mycobacteria, quemaduras químicas, úlceras bacterianas, úlceras fúngicas, úlcera de Mooren, degeneración marginal de Terrien, queratólisis marginal, poliarteritis, escleritis, enfermedad de Stevens-Johnson, queratotomía radial, anemia de células falciformes, pseudoxantoma elástico, penfigoide, enfermedad de Paget, enfermedad obstructiva de Ia carótida, uveítis crónica, vitritis crónica, enfermedad de Lyme, enfermedad de Eales, enfermedad de Behcet, histoplasmosis ocular supuesta, enfermedad de Best, miopía, pozos del nervio óptico, enfermedad de Stargardt, pars planitis, desprendimiento crónico de retina, síndromes de hiperviscosidad, toxoplasmosis, complicaciones post-láser rubeosis, artritis, sinovitis, osteomielitis, asma, dermatitis alérgica, síndrome de DiGeorge, neovascularización de injerto de córnea, verrugas, tumores, enfermedad obstructiva de Ia carótida, degeneración macular asociada a Ia edad, o retinopatía diabética.
Una realización aún más preferida de este aspecto de Ia invención, se refiere al uso de Ia preparación combinada para Ia elaboración de un medicamento para Ia prevención o el tratamiento de un proceso patológico asociado a angiogénesis, proliferación mio-endotelial anormal o no deseada o a una disfunción de Ia barrera endotelial, seleccionado de Ia lista que incluye arteriosclerosis, reestenosis de injertos cardiovasculares y/o procedimientos endovasculares, tumores del Sistema Nervioso Central (SNC), tumores sólidos, tumores hematopoyéticos, hipertensión pulmonar, pulmón de shock o síndrome de respuesta inflamatoria sistémica. Una realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al uso de Ia preparación combinada en una forma adecuada para Ia administración local.
Otro aspecto de Ia invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende Ia composición de Ia invención. Otro aspecto de Ia invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende Ia preparación combinada de Ia invención. En una realización preferida de este aspecto de Ia invención Ia composición farmacéutica comprende, además, un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Una realización más preferida de este aspecto de Ia invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende Ia composición de Ia invención y, además, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, otro principio activo. Una realización más preferida de este aspecto de Ia invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende Ia preparación combinada de Ia invención y, además, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, otro principio activo.
Las composiciones de Ia presente invención pueden formularse para su administración a un animal, y más preferiblemente a un mamífero, incluyendo al hombre, en una variedad de formas conocidas en el estado de Ia técnica. Así, pueden estar, sin limitarse, en soluciones acuosas o no acuosas, en emulsiones o en suspensiones. Ejemplos de soluciones no acuosas son, por ejemplo, pero sin limitarse, propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, o esteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Ejemplos de soluciones acuosas, son por ejemplo, pero sin limitarse, agua, soluciones alcohólicas en agua, o medios salinos. Las soluciones acuosas pueden estar tamponadas o no, y pueden tener componentes activos o inactivos adicionales. Los componentes adicionales incluyen sales para modular Ia fuerza iónica, conservantes incluyendo, pero sin limitarse a, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes, o similares, o nutrientes, incluyendo glucosa, dextrosa, vitaminas o minerales. Alternativamente, las composiciones pueden prepararse para su administración en forma sólida. Las composiciones pueden combinarse con varios vehículos o excipientes inertes, incluyendo pero sin limitarse a: aglutinantes, tales como celulosa microcristalina, goma tragacanto, o gelatina; excipientes, tales como almidón o lactosa; agentes dispersantes, tales como ácido algínico o almidón de maíz; lubricantes, tales como estearato de magnesio, deslizantes tales como dióxido de silicio coloidal; agentes edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina; o agentes aromatizantes, tales como menta o salicilato de metilo.
Tales composiciones y/o sus formulaciones pueden administrarse a un animal, incluyendo un mamífero y, por tanto, al hombre, en una variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse, a parenteral, intraperitoneal, intravenosa, intradérmica, epidural, intraespinal, intraestromal, intraarticular, intrasinovial, intratecal, intralesional, intraarterial, intracardiaca, intramuscular, intranasal, intracraneal, subcutánea, intraorbital, intracapsular, tópica, mediante parches transdérmicos, vía rectal, vía vaginal o uretral, mediante Ia administración de un supositorio, percutánea, spray nasal, implante quirúrgico, pintura quirúrgica interna, bomba de infusión o vía catéter.
Las composiciones de Ia presente invención son aptas para su aplicación mediante dispositivos médicos que permitan su liberación en concentraciones adecuadas para el tratamiento. Estos dispositivos deben ser adecuados para Ia administración del fármaco de forma local que permita que el tratamiento no se disperse y actúe en Ia zona afectada. Estos dispositivos médicos pueden permitir Ia liberación del fármaco tanto de forma conjunta como de forma secuencial, liberando primero el activador endotelial y posteriormente Ia estatina. Los dispositivos pueden, por ejemplo, pero sin limitarse, llevar los fármacos en su interior o ir recubiertos de los mismos.
Dentro de estos dispositivos se pueden encontrar, por ejemplo, dispositivos de asistencia circulatoria, de procedimientos endovasculares y cirugía cardiovascular, y dentro de estos, por ejemplo, pero sin limitarse, stents, válvulas, anillos, suturas, parches o injertos vasculares.
A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Muestra Ia razón Y = Pstd/Bstd- Z2IA como una función de Cstd para los patrones de S, Na, P, K, Mg y Cl a 10 kV. Cada valor representa Ia media ± SD de 15 - 20 análisis. Los patrones de calibración fueron preparados de forma idéntica a las células cultivadas sobre rejillas de oro cubiertas con pioloformo. Las soluciones en dextrano al 20% con las diferentes concentraciones de las sales inorgánicas empleadas se depositaron sobre filtros de policarbonato (tamaño de poro de 0,4 μm) aislados de sus soportes de poliestireno, criofijadas en nitrógeno líquido, criodesecadas y analizadas en un microscopio Philips XL30 utilizando idénticas condiciones instrumentales y analíticas a las indicadas con anterioridad. Figura 2. Muestra los cambios en las concentraciones de iones en células HUVEC tratados "in vitro" analizados mediante microanálisis. CE: HUVEC cultivadas en medio standard. LPA: HUVEC cultivadas 90 minutos con ácido lisofosfatídico 10μM y posteriormente 24 horas en medio estándar. ATS: HUVEC cultivadas con Atorvastatina (ATS) 1 μM durante 24 horas. LPA+ATS: HUVEC cultivadas con ácido lisofosfatídico 10μM durante 90 minutos y posteriormente con Atorvastatina 1 μM durante 24 horas. ATS+LPA HUVEC cultivadas con Atorvastatina 1 μM durante 24 horas y posteriormente con LPA 10μM durante 90 minutos. Los datos son Ia media ± SEM. Experimentos realizados por triplicado por condición. *p<0,05 vs. CE
Figura 3. Muestra Ia relación concentración de potasio/ concentración de sodio (milimoles/kg peso seco) (indicador de viabilidad celular) en células HUVEC analizados mediante microanálisis. CE: HUVEC cultivadas en medio standard. LPA: HUVEC cultivadas 90 minutos con ácido lisofosfatídico 10μM y posteriormente 24 horas en medio estándar. ATS: HUVEC cultivadas con Atorvastatina (ATS) 1 μM durante 24 horas. LPA+ATS: HUVEC cultivadas con ácido lisofosfatídico 10μM durante 90 minutos y posteriormente con Atorvastatina 1 μM durante 24 horas. ATS+LPA HUVEC cultivadas con Atorvastatina 1 μM durante 24 horas y posteriormente con LPA 10μM durante 90 minutos.
Figura 4. Muestra los cambios en Ia expresión génica de endotelina-1 (A) y eNOS (B), genes implicados en Ia función endotelial en células HUVEC, analizadas mediante microarrays. Los resultados se muestran en unidades fluorescentes. CE: HUVEC cultivadas en medio standard. LPA: HUVEC cultivadas 90 minutos con ácido lisofosfatídico 10μM y posteriormente 24 horas en medio estándar. ATS: HUVEC cultivadas con Atorvastatina (ATS) 1 μM durante 24 horas. LPA+ATS: HUVEC cultivadas con ácido lisofosfatídico 10μM durante 90 minutos y posteriormente con Atorvastatina 1 μM durante 24 horas. ATS+LPA HUVEC cultivadas con Atorvastatina 1 μM durante 24 horas y posteriormente con LPA 10μM durante 90 minutos. *p<0,05 vs. CE
Figura 5. Muestra los cambios en Ia expresión génica de genes implicados en Ia permeabilidad de Ia barrera endotelial en células HUVEC analizadas mediante microarrays. Los resultados se muestran en unidades fluorescentes. CE: HUVEC cultivadas en medio standard. LPA: HUVEC cultivadas 90 minutos con ácido lisofosfatídico 10μM y posteriormente 24 horas en medio estándar. ATS: HUVEC cultivadas con Atorvastatina (ATS) 1 μM durante 24 horas. LPA+ATS: HUVEC cultivadas con ácido lisofosfatídico 10μM durante 90 minutos y posteriormente con Atorvastatina 1 μM durante 24 horas. ATS+LPA HUVEC cultivadas con Atorvastatina 1 μM durante 24 horas y posteriormente con LPA 10μM durante 90 minutos. *p<0,05 vs. CE
Figura 6. Muestra los cambios en Ia expresión génica de de factores de crecimiento en células HUVEC analizadas mediante microarrays. Los resultados se muestran en unidades fluorescentes. CE: HUVEC cultivadas en medio standard. LPA: HUVEC cultivadas 90 minutos con ácido lisofosfatídico 10μM y posteriormente 24 horas en medio estándar. ATS: HUVEC cultivadas con Atorvastatina (ATS) 1 μM durante 24 horas. LPA+ATS: HUVEC cultivadas con ácido lisofosfatídico 10μM durante 90 minutos y posteriormente con Atorvastatina 1 μM durante 24 horas. ATS+LPA HUVEC cultivadas con Atorvastatina 1 μM durante 24 horas y posteriormente con LPA 10μM durante 90 minutos. *p<0,05 vs. CE
Figura 7. Muestra los cambios en Ia expresión génica de genes implicados en el desarrollo del ciclo celular en células HUVEC analizadas mediante microarrays. Los resultados se muestran en unidades fluorescentes. CE:
HUVEC cultivadas en medio standard. LPA: HUVEC cultivadas 90 minutos con ácido lisofosfatídico 10μM y posteriormente 24 horas en medio estándar. ATS: HUVEC cultivadas con Atorvastatina (ATS) 1 μM durante 24 horas. LPA+ATS: HUVEC cultivadas con ácido lisofosfatídico 10μM durante 90 minutos y posteriormente con Atorvastatina 1 μM durante 24 horas. ATS+LPA HUVEC cultivadas con Atorvastatina 1 μM durante 24 horas y posteriormente con LPA 10μM durante 90 minutos. *p<0,05 vs. CE; T p<0,05 ATS vs. E1
Figura 8. Muestra los cambios en Ia expresión génica de genes implicados en apoptosis en células HUVEC analizadas mediante microarrays. Los resultados se muestran en unidades fluorescentes CE: HUVEC cultivadas en medio standard. LPA: HUVEC cultivadas 90 minutos con ácido lisofosfatídico 10μM y posteriormente 24 horas en medio estándar. ATS: HUVEC cultivadas con Atorvastatina (ATS) 1 μM durante 24 horas. LPA+ATS: HUVEC cultivadas con ácido lisofosfatídico 10μM durante 90 minutos y posteriormente con Atorvastatina 1 μM durante 24 horas. ATS+LPA HUVEC cultivadas con Atorvastatina 1 μM durante 24 horas y posteriormente con LPA 10μM durante 90 minutos. *p<0,05 vs. CE
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar Ia naturaleza de Ia presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a Ia invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran Ia invención sin limitar el campo de aplicación de Ia misma.
EJEMPLO 1. Cultivo de células HUVEC y protocolo de administración de ácido lisofosfatídico 10μM y atorvastatina 1μM. Para el estudio de los efectos de Ia activación endotelial, previa a Ia administración de estatinas, sobre Ia muerte celular, se utilizaron células HUVEC comercializadas por Sigma Aldrich. Estas células se cultivaron en medio F12K (modificado por Kaighn) con 2 mM glutamina + 1 ,5 g/l de bicarbonato sódico + 0,10 mg/ml de heparina + 0,03 mg/ml de suplemento de crecimiento endotelial (ECGS) + 20% de suero bovino fetal inactivado (mediante choque térmico a 560C durante 30 minutos). El cambio de medio de cultivo se realiza cada 72 horas. La incubación se lleva a cabo a una temperatura de 370C y en una atmósfera de 5% CO2. Se realizan 3 pases de las células previos a su utilización experimental. Este despegue celular se realiza mediante tres lavados con PBS (solución tamponada estéril), con objeto de eliminar los restos de suero fetal bovino. Posteriormente se añade Tripsina-EDTA 0,03% (incubando a 370C, 90% de humedad y 5% de CO2 durante 5-10 minutos, examinando el grado de individualización celular). Una vez obtenida Ia suspensión y esferización celular se procede a realizar Ia neutralización de Ia tripsina-EDTA mediante medio de cultivo. Posteriormente se lleva a cabo un centrifugado a 1000 rpm. durante 10 minutos, al cual se elimina el sobrenadante, y se diluye el precipitado celular añadiendo nuevo medio de cultivo para resembrar en proporción 1 :2.
Para Ia realización del microanálisis, tras el tercer pase, las células se dividen en 5 grupos y se incuban en pocilios de experimentación, sobre rejillas de microanálisis a 370C y 5% de CO2 en las siguientes condiciones:
- GRUPO CONTROL (CE): células endoteliales de vena umbilical, cultivadas en medio estándar
- GRUPO LPA: células endoteliales de vena umbilical, procedentes del tercer subcultivo, tratadas con LPA 10μM durante 90 minutos y posterior incubación durante 24 horas en medio estándar. GRUPO ATS: células endoteliales de vena umbilical, procedentes del tercer subcultivo, tratadas farmacológicamente con Atorvastatina (ATS) 1 μM durante 24 horas.
- GRUPO E1 : células endoteliales de vena umbilical, procedentes del tercer subcultivo, tratadas farmacológicamente con LPA 10μM durante 90 minutos y posteriormente con ATS 1 μM durante 24 horas.
GRUPO E2: células endoteliales de vena umbilical, procedentes del tercer subcultivo, tratadas farmacológicamente con ATS 1 μM durante 24 horas y posteriormente con LPA 10μM durante 90 minutos.
EJEMPLO 2. Efectos del tratamiento con Ácido lisofosfatídico de células HUVEC previo a Ia administración de atorvastatina 1μM sobre Ia muerte celular
Para Ia realización del estudio microanalítico Ia muestra de células endoteliales ha de estar físicamente sobre las rejillas de oro de microanálisis. Para ello extiende una fina capa de resina pioloform en agua ultrapura y colocando sobre Ia misma, de forma precisa, las rejillas de microanálisis y un cubreobjetos de 11 milímetros de diámetro. Tras Ia recogida y secado del montaje rejilla-pioloform, se esterilizan mediante irradiación con rayos ultravioleta durante 24 horas. A continuación se depositan 2 rejillas en cada pocilio de experimentación y se procede a Ia siembra celular.
La siembra celular se realiza según el protocolo seguido en el ejemplo 1. Las células proceden de una tercera tripsinización del cultivo.
El ensayo experimental, (tratamiento con LPA, atorvastatina, ambos o sin tratamiento) se llevó a cabo después de 24 horas de cultivo, asegurando de esta forma, una correcta adhesión y viabilidad de las células endoteliales utilizadas.
Posteriormente se lavan las rejillas de microanálisis en agua bidestilada autoclavada a 4°C durante 4 segundos, generando un suave movimiento mediante agitador imantado. El exceso de agua se elimina con un rápido secado en papel de filtro.
Posteriormente se criofijan las rejillas de microanálisis, previa retirada de los correspondientes cubrerrejillas. Se fija el material celular por congelación en nitrógeno líquido, descendiendo su temperatura desde los 37°C hasta los -196°C, en un tiempo inferior a 10 segundos.
Las células endoteliales criofijadas son transferidas a una cámara de criodesecación de alto vacío, a 10~5 mbar de presión (sistema Emitech K775) para Ia extracción completa del agua celular por sublimación, siguiendo un protocolo de 6 etapas (Warley et al. 2000. J Microsc; 198:116-123).
A continuación se cubre Ia muestra con una película de carbón, empleando para ello, en condiciones de alto vacío, un evaporador Emitech (Watfor, Reino Unido) provisto de un hilo de grafito, Io que facilita el barrido del haz de electrones.
La visualización de las muestras en el microscopio electrónico de barrido mediante electrones secundarios se realizó utilizando los siguientes parámetros analíticos:
- Voltaje del microscopio 10 kV
- Angulación de superficie 0o - Distancia de trabajo 10 mm Las condiciones instrumentales fijadas para Ia detección microanalítica fueron las siguientes:
- Voltaje del microscopio 10 kV
- Aumentos 10000 - Angulación de superficie (tilt) 0o
- Cuentas por segundo (CPS) registradas por el detector 500
- Tiempo de adquisición 200 s
- Tamaño del haz de electrones (spot size) 6 Distancia de trabajo 10mm - Área de análisis puntiforme y estática
De forma previa al estudio microanalítico, se realizó una minuciosa evaluación de las células endoteliales mediante microscopía electrónica de barrido, descartando aquellas que, por su especial cercanía o anclaje a Ia estructura metálica, pudieran generar una distorsión evidente de los patrones de microanálisis.
Para determinar cuantitativamente el contenido elemental de las células, se utilizó el método de Ia razón pico fondo -método P/B- con referencia a patrones de calibración de matriz orgánica previamente conocidos (Boekestein et al. 1980. Sean Electron Microsc; pt-2:321-334 y Boekestein et al. 1984. J Microsc; 134: 327-334; Roomans et al. 1988. J Electron Microsc Tech; 9:3-17; Statham 1998. Microsc Microanal; 4:605-615). La concentración de cada elemento se determinó de acuerdo con Ia siguiente ecuación:
Figure imgf000029_0001
donde: - Cgpc ΘS la concentración del elemento a cuantificar.
- P corresponde a las cuentas netas de Ia señal característica del elemento.
- B es Ia radiación continua medida debajo del pico, es decir, tomada entre los mismos niveles de energía de Ia señal característica.
- Z2/A es el valor medio del número atómico al cuadrado dividido por el peso atómico, correspondiente un valor específico para el dextrano al 20% (patrón estándar) y las células (Warley, 1997. Practical Methods in Electron Microscopy).
La preparación de los patrones de calibración se realizó de acuerdo con las pautas prefijadas en el laboratorio de microscopía electrónica analítica del Departamento de Histología de Ia Facultad de Medicina de Ia Universidad de Granada. (Crespo et al. 1993. Acta Otolaryngol; 113:176- 180; López-Escámez et al. 1994. Scanning Microsc Suppl; 8:171-185) utilizando diversas sales (NaHPO4, MgCI2, CaCI2 H2O y K2SO4) disueltas en matriz orgánica como patrón de análisis. Para ello, se prepararon soluciones de cada sal a diferentes concentraciones en dextrano al 20% (300 kD). Los patrones se montaron sobre membranas microporosas de las unidades Millicell® y se siguió el mismo procedimiento que se expuso para Ia preparación de las células endoteliales. Los patrones se analizaron en el microscopio electrónico inmediatamente después de su preparación para evitar su contaminación o modificación química, obteniéndose entre 15 y 20 espectros para cada concentración de patrón, utilizando las mismas condiciones de análisis previamente considerados, que se utilizaron para las células endoteliales.
El análisis de los patrones de dextrano al 20% que contienen concentraciones conocidas de sales de Na, Cl, Mg, P, S, K y Ca, permitió realizar Ia calibración de las concentraciones de los citados elementos frente a Ia señal P/B. La concentración de cada elemento en el estándar es directamente proporcional a Ia razón P/B de acuerdo con Ia siguiente fórmula:
Figure imgf000031_0001
donde:
- Cts es Ia concentración conocida del elemento en el patrón.
- (Pstd/Bstd) es Ia razón P/B, donde el fondo se ha medido entre el mismo rango de energía de Ia señal característica obtenida del análisis de los estándares. - K es Ia constante de calibración característica para cada elemento y configuración instrumental utilizada.
La relación entre Pstd/Bstd frente a Ia concentración de cada elemento se estudió mediante regresión lineal simple. Teniendo en cuenta que Ia denominada constante de calibración K, depende de Ia diferencia en el Z2/A (factor G) entre el estándar y Ia célula, se hace necesario utilizar Ia siguiente ecuación para valorar Ia influencia que este factor ejerce en el ajuste de Ia curva:
.' ' 22**
F
\ donde:
- Z2/A es el promedio del valor de Z2/A para todos los elementos presentes en el volumen analizado de estándar:
Figure imgf000031_0002
donde: - Z¡ es el número atómico del elemento i.
- A¡ es el peso atómico de dicho elemento.
- f¡ es Ia fracción de masa del elemento i expresada como masa elemental dividida entre Ia masa total (Hall y Gupta, 1986).
En Ia Tabla 1 se muestran las ecuaciones de regresión obtenidas para todos los elementos cuando Y= Pstd/Bstd - Z2Ik, calibrada frente a Cstd, para los elementos Na, Mg, P, S, Cl, K y Ca analizados a 10 kV.
Elemento
Na Y= 3 ,75 + 0,032x (r= 0,99 p<0,001 )
Mg Y= 1 ,07 + 0,052x (r= 0,98 p<0,001 )
P Y= 0,64 + 0,042x (r= 0,99 p<0,001 )
S Y= 1 ,38 + 0,052x (r= 0,97 p<0,001 )
Cl Y= 1 ,42 + 0,036x (r= 0,99 p<0,001 )
K Y= 3,32 + 0,054x (r= 0,99 p<0,001 )
Ca Y= 0,60 + 0,063x (r= 0,99 p<0,001 )
Tabla 1 : Ecuaciones de regresión obtenidas cuando Y = Pstd/Bstd - Z2/A se calibró frente a Cstd analizados a 10 kV. En Ia tabla 2 se muestran los valores del patrón estándar expresados en moles/kg. de masa seca, para los distintos elementos fueron los siguientes:
Na = 84,771 P = 69, 195
Mg = 52,881 Cl = 79 ,793
S = 54,45 K = 51 , 271
Tabla 2: Valores del patrón estándar expresados en moles/kg. masa seca.
• Para llevar a cabo el análisis estadístico de los datos obtenidos, planteamos el siguiente test de hipótesis:
o H0 → no existen diferencias estadísticamente significativas entre los valores de cada elemento en los distintos grupos de experimentación.
o Hi → existen diferencias estadísticamente significativas entre los valores de cada elemento en los distintos grupos de experimentación.
El problema planteado es resuelto mediante Ia utilización del test no paramétrico de Kruskal-Wallis para muestras múltiples, que nos permite realizar el análisis estadístico global.
A continuación realizamos el análisis estadístico de los distintos grupos de experimentación mediante comparaciones dos a dos. Para ello utilizamos el test no paramétrico de Mann-Whitney (W. Wilcoxon).
Los datos indican que el tratamiento con Atorvastatina 1 μM provoca un descenso de los indicadores de viabilidad celular (relación K/Na, concentración de cloro intracelular) (Figuras 2 y 3 respectivamente). El tratamiento del cultivo con ácido lisofosfatídico 10μM durante 90 minutos no indujo apenas variaciones en cuanto a Ia viabilidad celular con respecto al cultivo control. La adición al cultivo de ácido lisofosfatídico 10μM durante 90 minutos posteriormente a Ia incubación con atorvastatina 1 μM durante 24 horas, no produjo variaciones relacionadas con Ia supervivencia con respecto al tratamiento en solitario con Ia atorvastatina 1 μM. Por el contrario Ia preactivación del endotelio mediante Ia preincubación de las células con LPA 10μM durante 90 minutos de forma previa a Ia administración de Atorvastatina provoca una protección del tejido frente al daño generado por Ia atorvastatina a concentración 1 μM.
EJEMPLO 3. Efecto del tratamiento con Ácido lisofosfatídico de células HUVEC previo a Ia administración de Atorvastatina 1μM sobre Ia expresión génica.
El protocolo de cultivo y tratamiento de las células es el mismo seguido en el ejemplo 1. Los grupos experimentales utilizados son:
- GRUPO CONTROL (CE): células endoteliales de vena umbilical, cultivadas en medio estándar
GRUPO A: células endoteliales de vena umbilical, procedentes del tercer subcultivo, tratadas con LPA 10μM durante 90 minutos y posterior incubación durante 24 horas en medio estándar. - GRUPO ATS1 : células endoteliales de vena umbilical, procedentes del tercer subcultivo, tratadas farmacológicamente con Atorvastatina
(ATS) 1 μM durante 24 horas. - GRUPO E1 : células endoteliales de vena umbilical, procedentes del tercer subcultivo, tratadas farmacológicamente con LPA 10μM durante 90 minutos y posteriormente con ATS 1 μM durante 24 horas. GRUPO E2: células endoteliales de vena umbilical, procedentes del tercer subcultivo, tratadas farmacológicamente con ATS 1 μM durante 24 horas y posteriormente con LPA 10μM durante 90 minutos.
Para el análisis de expresión génica, se extrajo ARN total de cada una de las muestras a analizar utilizando el sistema Trizol (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD, EEUU) y purificación mediante el sistema comercial Qiagen RNeasy System (Qiagen, Mississauga, Ontario, Canadá). Una vez extraído el ARN, se comprobó Ia integridad y Ia calidad de éste mediante visualización directa del ARN ribosómico de 28 y 18S mediante electroforesis en geles de agarosa al 1 ,2% y tinción con bromuro de etidio.
Para el análisis, todos los ARN fueron transformados en ADNc mediante una transcriptasa inversa (Superscript II, Life Technologies, Inc., Carlsbad, CA, EEUU) con un oligonucleótido rico en colas de timina (T7-polyT primer), el cual permitió Ia amplificación de cualquier ARN mensajero presente en Ia célula. A continuación, se sintetizaron los ARNc correspondientes a todos los ADNc mediante transcripción in vitro, utilizando para ello UTP y CTP marcados con biotina (Enzo Diagnostics, Farmingdale, NY). Una vez sintetizados, y para favorecer Ia hibridación, estos ARNc se fragmentaron químicamente añadiendo una concentración elevada de sales y altas temperaturas. Finalmente, los ARNc marcados y fragmentados se hibridaron frente a los chips que constituyen el sistema de microarray Affymetrix Human Genome U 133 plus 2.0® de Ia casa comercial Affymetrix, durante 16 horas a 450C. Tras un proceso estandarizado y automatizado, los chips se lavaron y se escanearon para obtener valores absolutos de expresión génica expresados como unidades fluorescentes. Todos los valores de expresión se normalizaron utilizando el programa informático Affymetrix Microarray Suite 5.0 suministrado por Ia casa comercial Affymetrix. Los resultados representados en Ia figura 4A muestran que el tratamiento con LPA provoca un incremento en Ia tasa de expresión de endotelina-1 , Io que determina un claro patrón de disfunción endotelial. Este resultado se ve refrendado con Ia disminución de Ia expresión de Ia oxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) (figura 4B). Por otro lado, el tratamiento con atorvastatina induce un claro aumento en Ia expresión de eNOS que también se da en el caso de existir pretratamiento con LPA. Esto indica que Ia Atorvastatina induce una recuperación de Ia función endotelial, incluso con una preactivación del tejido endotelial.
En Ia figura 5 se observa que el tratamiento con atorvastatina potencia Ia sobreexpresión moléculas implicadas en las uniones intercelulares. Esto indica que Ia atorvastatina induce una potenciación de Ia barrera endotelial. Esta potenciación se da tanto en el caso de tratarse el tejido tratado únicamente con atorvastatina como en aquel activado por Ia preincubación con LPA. Esto indica que los efectos beneficiosos de mejoramiento de Ia barrera endotelial no son eliminados por Ia preactivación del tejido.
En Ia figura 6 se observa que Ia activación del endotelio con LPA provoca un aumento en Ia expresión del factor de crecimiento del endotelio vascular-A. Esta inducción se ve revertida por el tratamiento con atorvastatina. La atorvastatina por si misma también produce un descenso en Ia expresión tanto del factor de crecimiento del endotelio vascular C y en el receptor celular FLT-1 que se mantiene incluso con el pretratamiento de las células con LPA. Esto indica que Ia atorvastatina es capaz de ejercer una regulación negativa en los mecanismos de proliferación celular autocrinos y paracrinos que no se ve alterado por el pretratamiento con LPA. En Ia figura 7 se observa que en los grupos celulares tratados con atorvastatina, ya sea de forma independiente o con pre o post-incubación con LPA, se da una reducción en Ia expresión de los genes implicados en Ia progresión del ciclo celular como las ciclinas C1 , A1 , A2, B1 , B2, F y H. También se reduce Ia expresión de las ciclinas dependientes de Kinasas 1 , 2 y 4. Esto indica que el tratamiento con atorvastatina produce un bloqueo del ciclo celular que impide Ia proliferación de las células tratadas con el compuesto. Este efecto es independiente de Ia preactivación del endotelio con ácido lisofosfatídico.
En Ia figura 8 se observa que las células tratadas con atorvastatina 1 μM únicamente o con posterior aplicación de LPA, presentan una expresión aumentada de indicadores de perdida de viabilidad como caspasa 3, caspasa 6 caspasa 7, Rac-1 y Cdc-42, con respecto a las células sin tratar. Este aumento se ve limitado o revertido a Ia situación fisiológica en los casos en que las células han sido preincubadas con LPA previa al uso de atorvastatina. Estos datos refrendan los datos de viabilidad celular obtenidos por microanálisis. Otro gen aumentado en los grupos ATS y ATS+LPA es el gen de muerte celular programada 4 (PDCD-4), que tiene un importante papel en Ia apoptosis. Su expresión también se ve reducida por el tratamiento con LPA previo a Ia administración de atorvastatina.
Por Io tanto, aunando los resultados se observa que el tratamiento de células endoteliales con elevadas concentraciones de atorvastatina promueve Ia recuperación fisiológica de los tejidos endoteliales alterados. El problema se encuentra en que este tratamiento también promueve Ia apoptosis de gran parte de las células tratadas provocando Ia desorganización del tejido. La activación del endotelio con LPA previo al tratamiento con altas concentraciones de atorvastatina, provoca modificaciones en el endotelio que conllevan a una reducción de Ia muerte producida por este compuesto. Por el contrario esta protección no impide Ia recuperación del patrón de expresión fisiológico Io que Io convierte en un tratamiento adecuado para Ia recuperación de tejidos alterados.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Composición que comprende:
a) un activador endotelial, y b) una estatina, o una sal o un áster de Ia misma.
2. Composición según Ia reivindicación 1 donde Ia estatina se selecciona de Ia lista que comprende: pravastatina, simvastatina, fluvastatina, atorvastatina, pitavastatina, rosuvastatina o lovastatina.
3. Composición según las reivindicaciones 1 a 2 donde Ia estatina es atorvastatina.
4. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde el activador endotelial se selecciona de Ia lista que comprende TNFα, esfingosina-1 -fosfato, un análogo de Ia misma, o el ácido lisofosfatídico, un análogo o una sal de dicho ácido.
5. Composición según Ia reivindicación 4 donde el activador endotelial es el ácido lisofosfatídico, un análogo o una sal del mismo.
6. Uso de Ia composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para Ia elaboración de un medicamento.
7. Uso de Ia composición según Ia reivindicación 6 para Ia elaboración de un medicamento para Ia prevención y/o el tratamiento de un proceso patológico asociado a angiogénesis, proliferación mio-endotelial anormal o no deseada, o a una disfunción de Ia barrera endotelial.
8. Uso de Ia composición según Ia reivindicación 7 donde el proceso patológico asociado a angiogénesis, proliferación mio-endotelial anormal o no deseada, o a una disfunción de Ia barrera endotelial, es de Ia lista que comprende: arteriosclerosis, reestenosis de injertos cardiovasculares, procedimientos endovasculares, tumores del Sistema Nervioso Central (SNC), tumores sólidos, tumores hematopoyéticos, hipertensión pulmonar, pulmón de shock o síndrome de respuesta inflamatoria sistémica.
9. Uso de Ia composición según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 en una forma adecuada para Ia administración local.
10. Uso de una composición que comprende una estatina, o una sal o un áster de Ia misma para Ia elaboración de un medicamento para Ia prevención y/o el tratamiento de un proceso patológico asociado a angiogénesis, proliferación mio-endotelial anormal o no deseada, o a una disfunción de Ia barrera endotelial, cuando las células endoteliales están activadas.
11. Uso de Ia estatina según Ia reivindicación 10 donde el proceso patológico asociado a angiogénesis, proliferación mio-endotelial anormal o no deseada, o a una disfunción de Ia barrera endotelial es de Ia lista que comprende: arteriosclerosis, reestenosis de injertos cardiovasculares, procedimientos endovasculares, tumores del Sistema Nervioso Central (SNC), tumores sólidos, tumores hematopoyéticos, hipertensión pulmonar, pulmón de shock o síndrome de respuesta inflamatoria sistémica.
12. Uso de Ia estatina según cualquiera de las reivindicaciones 10 ó 11 en una forma adecuada para Ia administración local.
13. Preparación combinada para su uso secuencial que comprende: c) primero, un activador endotelial, y d) segundo, una estatina, o una sal o un éster de Ia misma.
14. Preparación combinada según Ia reivindicación 13 donde Ia estatina se selecciona de Ia lista que comprende: pravastatina, simvastatina, fluvastatina, atorvastatina, pitavastatina, rosuvastatina o lovastatina.
15. Preparación combinada según las reivindicaciones 13 ó 14 donde Ia estatina es atorvastatina.
16. Preparación combinada según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 15 donde el activador endotelial se selecciona de Ia lista que comprende TNFα, esfingosina-1 -fosfato, un análogo de Ia misma, o el ácido lisofosfatídico, un análogo o una sal de dicho ácido.
17. Preparación combinada según Ia reivindicación 16 donde el activador endotelial es el ácido lisofosfatídico, un análogo o una sal del mismo.
18. Uso de Ia preparación combinada según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17 para Ia elaboración de un medicamento.
19. Uso de Ia preparación combinada según Ia reivindicación 18 para Ia elaboración de un medicamento para Ia prevención y/o el tratamiento prevención de un proceso patológico asociado a angiogénesis, proliferación mio-endotelial anormal o no deseada, o a una disfunción de Ia barrera endotelial.
20. Uso de Ia preparación combinada según Ia reivindicación 19 donde el proceso patológico asociado a angiogénesis, proliferación mio-endotelial anormal o no deseada, o a una disfunción de Ia barrera endotelial es de Ia lista que comprende: arteriosclerosis, reestenosis de injertos cardiovasculares, procedimientos endovasculares, tumores del Sistema Nervioso Central (SNC), tumores sólidos, tumores hematopoyéticos, hipertensión pulmonar, pulmón de shock o síndrome de respuesta inflamatoria sistémica.
21. Uso de Ia preparación combinada según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 en una forma adecuada para Ia administración local.
22. Composición farmacéutica que comprende una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
23. Composición farmacéutica que comprende una preparación combinada según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 21.
24. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 22 ó 23 que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.
25. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24 que comprende además otro principio activo.
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